BRPI0709560A2 - uso de uma proteìna mutante de trans-sialidade de trypanosoma enzimaticamente inativa, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

<B>USO DE UMA PROTEìNA MUTANTE DE TRANS-SIALIDASE DE TRYPANOSOMA ENZIMATICAMENTE INATIVA, E COMPOSIçãO FARMACêUTICA.<D> A presente invenção refere-se a uma nova vacina contra infecção por Trypanosorna cruzi, útil na prevenção e/ou tratamento da doença de Chagas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a uma enzima trans-sialidase mutante recombinante que pode ser útil como vacina eficiente, sem efeitos colaterais.

Description

USO DE UMA PROTEÍNA MUTANTE DE TRANS-SIALIDASE DETRYPANOSOMA ENZIMATICAMENTE INATIVA, E COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA

A presente invenção refere-se a uma nova vacinacontra infecção causada por Trypanosoma cruzi, útil paraprevenção e/ou tratamento da doença de Chagas. Maisespecificamente, a presente invenção refere-se a uma enzimatrans-sialidase mutante recombinante que pode ser utilizadacomo uma vacina eficiente, sem efeitos colaterais, em que avacina protege tanto contra parasitemia quanto contra osdanos em tecidos causados pelos parasitas.

Uma das doenças mais comuns na América do Sul e naAmérica Central é a doença de Chagas ou TripanossomiaseAmericana. Esta doença é causada pelo parasita flageladoTrypanosoma cruzi e é disseminada pelo inseto sugador desangue Triatoma infestans. Quando o parasita se estabelecena ferida criada pela mordida do inseto, ele espalha-seatravés do corpo e invade células hospedeiras. No interiorde uma célula hospedeira, o parasita transforma-se em umamastigoto não infeccioso capaz de se multiplicar muitorapidamente. Quando a quantidade de parasitas no interiorda célula é de cerca de 500, o parasita transforma-se denovo para o estágio tripomastigoto infeccioso. Em poucotempo, a célula rompe-se, liberando os parasitas no sangue,de onde os mesmos podem infectar novas células. A doençatem 3 fases. A primeira fase é a fase aguda, que ocorreimediatamente após a infecção e apresenta sintomas apenasleves. A segunda fase é a fase latente, que pode ter umaduração de 3-10 anos e é assintomática. A terceira fase é afase crônica, durante a qual todos os tecidos infectados sedeterioram devido a uma Iise celular em larga escala quecausa eventualmente a morte do paciente. 70% dos pacientescom doença de Chagas falecem de ataque cardíaco causado pordanos graves no coração.

O mecanismo molecular pelo qual o parasita infectaas células hospedeiras é muito complexo e tem constituído otópico de muito projetos de pesquisa ao longo dos anos.Esta pesquisa demonstrou que o T. cruzi expressa um ácidosiálico muito específico transferindo enzima capaz declivar ácidos siálicos com ligação a-2,3 e transferir osmesmos para resíduos de galactose β-1,4 terminal: a trans-sialidase (TS). A enzima é ancorada na membrana celular doparasita por uma âncora GTI., mas é igualmente liberada nosangue após a clivagem por uma enzima lipase do parasita. Atrans-sialidase desempenha um papel essencial no ciclo deinfecção do T. cruzi devido ao fato de tornar possível ainvasão das células hospedeiras. Foi demonstrado através deexperimentos que quando a atividade de trans-sialidase éinibida (por exemplo mediante utilização de linhagenscelulares mutantes que não possuem ácido siálico em suasuperfície (Ciavaglia e outros, 1993; Ming e outros, 1993 eSchenicman e outros, 1993) ou mediante bloqueio dasmoléculas aceptoras na superfície do parasita (Yoshida eoutros, 1989; Schenkman e outros, 1991 e Ruiz e outros,1993) a invasão das células hospedeiras pelo parasita éinibida. Adicionalmente, a trans-sialidase tambémdesempenha um papel no mecanismo de defesa do parasitacontra o sistema imune humano visto ser utilizada paracobrir a superfície do parasita com moléculas de ácidosiálico tornando muito difícil para o sistema imune dohospedeiro detectar o parasita.

Devido ao fato de a enzima trans-sialidase ter um papel tão importante no ciclo de infecção e defesa, oparasita desenvolveu vários métodos para proteger a enzimacontra o sistema imune do hospedeiro. Em primeiro lugar, oparasita expressa mais de 200 trans-sialidases das quaissomente cerca de 15 são ativas (El-saied e outros, 2005). Isto torna muito difícil para o sistema imune inibir ainvasão de células hospedeiras pelo parasita em um ciclo deinfecção normal, particularmente devido ao fato de osparasitas e suas trans-sialidases residirem somente por umtempo breve na corrente sangüínea antes de entrarem em uma célula hospedeira onde ficam protegidos do sistema imune.Adicionalmente, as trans-sialidases possuem uma caudaimunodominante muito longa de repetições SAPA que atuadesviando a atenção do sistema imune, atraindo com sucessoanticorpos para longe do sítio catalítico importante da enzima.

Existem atualmente 2 drogas para combater a doença:Benzinizadol e Nifurtimox. Muito pouco se sabe sobre seumecanismo, porém é conhecido que induzem esforço deoxidação nas células. Ambos os produtos não estabelecemdiferenciação entre parasitas e células hospedeiras,causando como resultado graves efeitos colaterais para opaciente. Devido a estes efeitos colaterais e devido aofato de apresentarem uma eficiência muito limitada empacientes crônicos, estas drogas possuem um uso apenaslimitado.

A vacinação poderia solucionar estes problemas. Uma vacina seria provavelmente muito mais eficaz paratratamento de pacientes crônicos que a medicação existentee teria igualmente a vantagem de possuir um efeitopreventivo. O documento n° GB2000968 divulga uma vacinabaseada em tripanossoma morto. Entretanto, ostripomastigotos são difíceis de cultivar em elevadadensidade, e a capacidade imunogênica da vacina é baixa.Vários outros pedidos de patente descreveram uma fraçãomicrossomal (EP 0003529), uma fração de glicoproteína (US4.298.596) ou u peptídeo (WO 93/16199) derivados de T.cruzi como uma possível vacina. Entretanto, nenhuma destasvacinas demonstrou ser suficientemente eficiente.

Devido a seu papel essencial na infecção e devidoao fato de a enzima ser tanto bem exposta sobre asuperfície da célula quanto presente como uma moléculalivre no sangue., constituindo portanto um bom alvo paraanticorpos, a trans-sialidase pode constituir um bomantígeno candidato para produção de uma vacina contra adoença de Chagas. Não é previsto que uma vacina baseada naenzima trans-sialidase tenha efeitos colaterais importantesvisto não existirem homólogos da trans-sialidase em sereshumanps, o que significa que todos os anticorpos geradosseriam específicos para parasita. Vários autores divulgaramvacinas baseadas no fornecimento de DNA codificando trans-sialidase (Costa e outros, 1998; Vasconcelos e outros,2004), possivelmente em combinação com IL-12 (Katae eoutros, 2002). No estudo de vacinação de DNA trans-sialidase de Pereira-Chioccola e outros (1999), foiutilizada como controle trans-sialidase recombinante. Foidemonstrado que esta trans-sialidase recombinante fazsurgir anticorpos inativadores de trans-sialidase e podereduzir a parasitemia induzida por triptomastigotos emcamundongos. Entretanto, a trans-sialidase é ineficientecomo antigeno devido à cauda imunodominante. Portanto, autilização da enzima de parasita ativa de tipo natural emvacinação não é viável, já que as elevadas doses de trans-sialidase recombinante requeridas induziriam efeitoscolaterais, particularmente na medida em que foidemonstrado que a trans-sialidase ativa é capaz de ativarreceptores neuronais (Woronowicz e outros, 2004). Odocumento n° US2005/158.347 divulga uma vacina de múltiploscomponentes contra T. cruzi compreendendo trans-sialidaseou um polinucleotídeo codificando trans-sialidase.Entretanto, as desvantagens relativas ao uso de trans-sialidade, conforme citadas acima, são igualmente válidaspara esta vacina de múltiplos componentes.

Surpreendentemente, os presentes inventoresdescobriram que mutantes com atividade enzimática limitadaou sem atividade enzimática podem ser utilizados com êxitocomo vacina. Ist-o é inesperado, já que não seria de preverque anticorpos contra estes mutantes inativos fossem aindacapazes de inativar a atividade enzimática de trans-sialidase de tipo natural e/ou inibir o ciclo de infecção.

Ainda mais surpreendentemente, os presentes inventoresforam capazes de tornar a vacina mais eficiente medianteengenharia da trans-sialidase (TS) de tal forma que a caudaimunodominante de repetições SAPA deixasse de se encontrarpresente. A enzima trans-sialidase mutante obtida porengenharia pode ser utilizada como uma eficiente vacinacontra a doença de Chagas em camundongos. Muitosurpreendentemente, a forma de trans-sialidase mutante (MutTS) protege os animais imunizados contra danos em tecidosem músculos cardíacos e esqueletais (miocardite e miosite)e contra esplenomegalia, ao passo que animais imunizadoscom trans-sialidase de tipo natural continuam sendoafetados.

Um primeiro aspecto da invenção consiste nautilização de uma proteína mutante de trans-sialidase deTrypanosoma enzimaticamente inativa como medicamento. Aexpressão proteína mutante de trans-sialidaseenzimaticamente inativa conforme é aqui utilizada significaque a atividade de sialidase remanescente e/ou atividade detransferase é menor que 20% da atividade do tipo natural,preferencialmente menor que 10% da atividade do tiponatural, e ainda mais preferencialmente menor que 5% daatividade do tipo natural. As atividades de sialidase etransferase são quantificadas separadamente, conforme seencontra descrito na parte de materiais e métodos para osexemplos. Preferencialmente, o referido Trypanosoma é T.cruzi. Preferencialmente, a referida trans-sialidasemutante é trans-sialidase recombinante. Preferencialmente,a referida trans-sialidase mutante não possui a caudaimunodominante de repetições SAPA. Ainda maispreferencialmente, a referida trans-sialidase mutantecompreende a SEQ ID N0 1, mais preferencialmente a referidatrans-sialidase mutante consiste na SEQ ID N0 1. Umaconfiguração preferencial é um mutante enzimaticamenteinativo de acordo com a invenção, do qual o perfil deglicosilação é diferente do perfil de glicosilação nostripanossomas de tipo natural. Como exemplo não limitativo,esse perfil de glicosilação diferente pode ser obtidomediante produção da enzima mutante como uma enzima mutanterecombinante em uma célula de um hospedeiro não mamífero,preferencialmente uma célula de fermento, ainda maispreferencialmente de fermento Pichiaf ainda maispreferencialmente Pichia pastoris GS115 ou qualquer cepaobtida por engenharia de Pichia pastoris derivada da cepaGS115. Preferencialmente, o mutante enzimaticamente inativoapresenta um perfil de N-glican que existepredominantemente em M8GlcNAc2. 0 termo predominantementeconforme é aqui utilizado significa que o pico maisimportante na análise de N-glican consiste na fraçãoM8GlcNAc2.

Um aspecto adicional da invenção consiste nautilização da proteína mutante de trans-sialidase deTrypanosoma enzimaticamente inativa para preparação de umavacina. Opcionalmente, a referida trans-sialidase deTrypanosoma enzimaticamente inativa pode ser misturada com outros antígenos adequados. Opcionalmente, podem seradicionados à vacina adjuvantes e/ou citocinas, paraaperfeiçoamento da resposta imune. A título de exemplo nãolimitativo, um adjuvante adequado foi descrito no documenton° WO 0160404, sendo as citocinas adequadas, a título de exemplo não limitativo, Interleucina-6 e Interleucina-12.Preferencialmente, o referido Trypanosoma é Trypanosomacruzi e a referida vacina é útil para profilaxia e/outratamento terapêutico da doença de Chagas.Preferencialmente, a referida trans-sialidase mutante é uma trans-sialidase recombinante. Preferencialmente, a referidatrans-sialidase mutante não possui a cauda imunodominantede repetições SAPA. Ainda mais preferencialmente, areferida trans-sialidase mutante compreende a SEQ ID N0 1,mais preferencialmente a referida trans-sialidase mutanteconsiste na SEQ ID N0 1. Uma configuração preferencialconsiste em um mutante enzimaticamente inativo de acordocom a invenção cujo perfil de glicosilação é diferente doperfil de glicosilação dos tripanossomas de tipo natural.

Um outro aspecto da invenção, consiste em umacomposição farmacêutica compreendendo uma proteína mutantede trans-sialidase de Trypanosoma enzimaticamente inativacomo vacina. Preferencialmente, o referido Trypanosoma éTrypanosona cruzi e a referida vacina é utilizada emtratamento profilático e/ou terapêutico da doença deChagas. Preferencialmente, a referida trans-sialidasemutante é desprovida da cauda imunodominante de repetiçõesSAPA. Ainda mais preferencialmente, a referida trans-sialidase mutante compreende a SEQ ID N0 1, e ainda maispreferencialmente a referida trans-sialidase mutanteconsiste na SEQ ID M0 1. Uma configuração preferencialconsiste em um mutante enzimaticamente inativo de acordocom a invenção, cujo perfil de glicosilação é diferente doperfil de glicosilação existente nos tripanossomas de tiponatural.

Um outro aspecto ainda da invenção consiste nautilização de uma proteína mutante de trans-sialidase deTrypanosoma enzimaticamente inativa de acordo com ainvenção para proteger mamíferos (incluindo seres humanos)de miocardite e/ou miosite e/ou esplenomegalia causadas porinfecção de Trypanosoma cruzi. Preferencialmente, areferida trans-sialidase mutante não possui a caudaimunodominante de repetições SAPA. Ainda maispreferencialmente, a referida trans-sialidase mutantecompreende a SEQ ID N0 1, e ainda mais preferencialmente areferida trans-sialidase mutante consiste na SEQ ID N° 1.Uma configuração preferencial consiste em um mutante deacordo com a invenção enzimaticamente inativo cujo perfilde glicosilação é diferente do perfil de glicosilação dostripanossomas de tipo natural.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: o plasmideo pPICZTSjE contendo o gene detrans-sialidase

AOXl P = promotor passível de indução por metanolAOXl, preMF = fator de pareamento de fermento (sinal desecreção), TS = gene, de trans-sialidase, E-tag - marcadorde afinidade, (fd g3) = DNA bacteriano sem função, AOXl T =seqüência terminadora de AOXl, TEFl P = promotor defermento, EM7 P = promotor bacteriano, Sh ble = marcador deresistência a zeocina, CYCl T = Seqüência terminadora decitocromo C, ori = origem de replicação.

Figura 2: combinação de dados de ensaio defluorescência com dados ELISA como método de triagem

A = Placa de fundo transparente de 96 receptáculosvisualizada com o Lumilmager®. A fluorescência é uma medidada quantidade de atividade de trans-sialidase no meio deindução de cada transformante. B = ELISA em placa deligação de proteínas de 96 receptáculos. A trans-sialidasede tamanho pleno no meio de indução de cada transformantefoi detectada com um anticorpo anti-marcador-E orientadocontra o marcador-E do terminal-C.

Figura 3: glico-perfis de trans-sialidase produzidaem Pichia pastoris GS115 (WT) e Pichia pastoris GlycoswitchMS (OCHl)

Foi produzida trans-sialidase recombinante emPichia pastoris GS115 e em Pichia pastoris GS115Glycoswitch M8, uma cepa em que a hiperglicosilação foiinibida mediante eliminação "knock-out" da atividade deOCHl. Foram analisados exames N-glican das trans-sialidasessecretadas utilizando a tecnologia DSA-FACE. Os N-glicansde trans-sialidase produzida em Pichia pastoris G-Sl 15Glycoswitch M8 constituem predominantemente M8GlcNAc2.

Figura 4: atividade de sia lida se do mutante detrans-sialidase

A atividade de sialidase do mutante de trans-sialidase que foi utilizado neste projeto foi determinadamediante medição da quantidade de metilumbeliferona livrena mistura de reação após reação da enzima com o substratode ácido 4-metilumbeliferil-N-acetilneuraminico. A mediçãoda quantidade de fluorescência foi realizada com umdispositivo de leitura de placa de múltiplos receptáculosCYTOFLUOR® Multi-Well Plate Reader Series 4000 (PerSeptiveBiosystems).

Figura 5: atividade de transferase do mutante detrans-sialidase

1 = escada de dextran, 2 = controle, 3 = TSmutante, 4 = TS ativa, 5 = perfil de glican padrão B RNase.A atividade de transferase da trans-sialidase mutante quefoi utilizada neste projeto foi determinada medianteanálise da quantidade de glicans de NA2FB sialilados(asialo-, galactosilados biantenários., com núcleosubstituído por fucose e com GlcNAc de bisecção) com atecnologia DSA-FACE.

Figura 6: mortalidade dos animais de testeRepresentação gráfica do número de animaissobreviventes em diferentes pontos no tempo após a infecçãocom parasitas de T. cruzi.

Teste de classificação (Estatística de Teste de Igualdadede Distribuições de Sobrevivência):

Diferenças entre todos os grupos: p<0,00001

Diferenças entre G1-G2-G6: p=0,8404

Diferenças entre G3-G4-G5-G7: p=0,5201

Figura 7: parasitemia em animais de testeO número de parasitas no sangue dos camundongos foiverificado 14 e 21 dias após a infecção. Foi realizadacontagem de parasitas em 5 μΐ de sangue retirado da caudados camundongos, utilizando uma câmara de Neubauer. Osresultados foram expressos como número de parasitas/50

campos microscópicos (400x).

Teste de Kruskal Wallis14° dia pós-infecção

Diferenças entre todos os grupos: p<0,0001Diferenças entre G1-G2-G6: p=0,553Diferenças entre G3-G4-G5-G7: p=0,22421° dia pós-infecção

Diferenças entre todos os grupos: p<0,0001Diferenças entre G1-G2-G6: p=0,266Diferenças entre G3-G4-G5-G7: p=0,073

Figura 8: peso dos animais de teste

Representação gráfica do peso corporal dos animaisdeterminado em uma base semanal.

Figura 9: Resultados representativos de análisehistopatológica em camundongos imunizados e não imunizados

Camundongos BALB/c foram injetados com 100 formasde corrente sangüínea e foram colhidos órgãos 60 dias pósinfecção. Secções embebidas em parafina foram manchadas comhematoxilina e eosina, e foram examinadas com ummicroscópio de luz nas seguintes ampliações: *200 e χ400(Β, C, Ε, F, Η, I) , χ400 (G) ou *400 e *600 (A, D) . Vide o textoquanto a detalhes de preparação e descrição de morfologia.

Figura 10: Alterações de peso do baço emcamundongos imunizados e expostos a TS's.

0 peso do órgão é apresentado da seguinte forma:[peso do baço (g)/peso total do corpo (g)]. Os resultadosrepresentam a média ± SD aos 60 dias pós-inf ecção. Osvalores apresentados correspondem a um (OVA) de trêscamundongos não imunizados e infectados e um de seis gruposde controle não imunizados e não infectados (resultadossimilares)

Figura 11: Níveis de anticorpos anti-TS ao longo dainfecção por T. cruzi.

Valores individuais e médios (barras horizontais)de cada grupo. Os grupos infectados expostos a WT,OCHl ouMut TS tinham uma tendência para apresentar níveis maiselevados de anticorpos específicos para TS que oscamundongos OVA infectados. (p<0,001). Os anticorposespecíficos para TS apresentavam diferenças significativasentre OVA mais outros grupos de controle em comparação comcamundongos imunizados e não infectados expostos a WT deOCHl e Mut TS, em todos os pontos no tempo.

Figura 12: Níveis em circulação de anticorpos anti-SAPA durante a infecção por T. cruzi.

Valores individuais e médios (barras horizontais)de cada grupo. 28 dias pós-infecção, os grupos infectadosOVA expostos a WT e OCHl apresentavam quantidadessignificativamente mais elevadas de anticorpos específicosanti-SAPA que os camundongos infectados expostos a Mut TS(p<0,001). Nos camundongos de controle, os resultadosrepresentam um (OVA) de três grupos não imunizados einfectados (resultados similares). No dia -1 pós-infecção,os anticorpos específicos anti-SAPA eram indetectáveis emtodos os grupos. No dia +14 pós-infecção, os resultadosforam similares aos do dia 28 pós-infecção.

EXEMPLOS

Materiais e métodos para os exemplos

Mutagênese aleatória do gene de trans-sialidase

O gene de trans-sialidase que foi clonado em nossolaboratório e que não possui a parte que codifica asrepetições imunodominantes (Laroy e outros, 2000) foimutado mediante utilização de uma técnica de mutagênesebaseada em PCR no plasmídeo pPICZTSjE. Neste método sãocriadas mutações aleatórias no gene pela DNA polimerase deTaq com tendência de erro. A freqüência dos erros éaumentada por utilização de concentrações desiguais dedNTP' s (0,2 mM de dATP e dGTP / 1 mM de dCTP e dTTP) eadição de 0,1 mM de Mn2+ à mistura de reação.

Transformação para Pichia pastoris

Os fragmentos de PCR mutantes foram ligados aovetor original pPICZTSjE e os plasmideos foramtransformados no fermento metilotrófico Pichia pastoris.Anteriormente à transformação os plasmideos foramlinearizados por uma digestão de restrição Sacl para tornarmais fácil a inserção no genoma do fermento. Atransformação do DNA do plasmideo para Pichia pastorisGSl15 (his4) foi realizada por eletroporação de acordo comas instruções do fabricante (Invitrogen). A seleção foirealizada em placas YPDS contendo o antibiótico zeocina(100 μg/ml) . Com um robô de colheita de colônia Flexys(Genomic Solutions) , todos os transformantes foramcolocados em receptáculos individuais de placas de 96receptáculos que foram previamente preenchidos com mídiaYPD. As células foram cultivadas durante 24 horas a 30° C eforam então estampadas em placas de YPD sólido paraarmazenagem e futura análise.

Triagem de transformantes para clones expressandotrans-sialidase inativa

Foram cultivados transformantes em 150 μΐ de mídiaBMGY em placas de 96 receptáculos. Após 24 horas, foiinduzida expressão de trans-sialidase mediante mudança damídia BMGY para mídia mínima (100 mM de tampão de fosfatode pH 7 + 1,34% de YNB + 1% de CSM + 1% de metanol) . Aexpressão foi permitida durante 28 horas e foi adicionado1% de metanol a cada 12 horas. Para ensaio enzimático foramutilizados 5 μΐ de mídia de indução de cada transformante.Para análise da atividade enzimática das trans-sialidasesexpressadas foi utilizado em ensaio de fluorescência. Amistura de reação que foi disposta em cada receptáculo deurna placa de 96 receptáculos consistia em 20 μΜ de lactose-AMAC, 0,4 mM de sialillactose, 20 mM de Hepes de pH 7,2 e10% de mídia de indução (o volume total de reação é de 50μl) . Após 1 hora de incubação a 37° C, a reação éinterrompida mediante adição de 150 μΐ de H2O. A colheitadas moléculas sialiladas é realizada com uma resina detroca aniônica (QAE-sephadex, SIGMA), em uma placa defiltração de 96 receptáculos (Millipore). Anteriormente àadição das amostras, a resina é pré-umedecida com 200 μΐ deH2O e o líquido é removido por centrifugação a 1000 rpm.Após 4 lavagens com 200 μΐ de H2O as moléculas sialiladassão eluídas para uma placa de fundo transparente de 96receptáculos com 150 μΐ de 1 M de acetato de amônio. Afluorescência é medida com o dispositivo Lumilmager®(Boehringer) a 520 nm. Para separar clones expressandotrans-sialidase inativa verdadeira de clones que expressamsomente uma parte da trans-sialidase (devido a um cód-on deinterrupção criado pela mutagênese), os dados do ensaio defluorescência foram combinados com dados de um ensaio ELISArealizado de acordo com protocolos convencionais. Para oensaio ELISA foram utilizados 5 μΐ de mídia de indução decada transformante e a trans-sialidase foi detectada comanticorpo anti-marcador-E ("anti-E-tag) seguido por umanticorpo secundário acoplado com peroxidase. Aquimioluminescência foi medida com o dispositivoLumilmager® (Boehringer).

Purificação de trans-sialidase

Para purificação a cepa Pichia pastoris, queexpressa a trans-sialidase, foi cultivada em 600 ml deBMGY. Em Αβοο de 15 foi iniciada a indução em 600 ml deBMMY. Foi permitida expressão por 28 horas e foi adicionado1% de metanol a cada 12 horas. A mídia de expressão foicolhida e filtrada (filtro de 0,45 μπι, Millipore). Paraevitar degradação de proteínas foram adicionados inibidoresde protease (1 pílula de Complete Protease InhibitorCocktail, Roche). A mídia de cultura foi aplicada a umacoluna de 5 ml de anti-E-tag pré-preenchida (PharmaciaBiotech) equilibrada com tampão de ligação (0,2 M defosfato, 0,05% de NaN3, pH 7) a uma taxa de fluxo de2ml/min utilizando um sistema FPLC (Pharmacia Biotech).Subseqüentemente, a coluna foi cuidadosamente lavada comtampão de ligação. A trans-sialidase foi eluída com 1 M deglicina com pH 3. Foram colhidas frações de 2,7 ml em tuboscontendo 0,3 ml de tampão de neutralização (1 M de Tris-HCl, pH 8,8). Foram analisadas frações por SDS-PAGE quantoà presença de trans-sialidase.. A concentração de proteínasfoi determinada com o método de Bradford (Bradford, M.N.,197 6). 0 rendimento médio de trans-sialidase foi de cercade 1 mg / litro de mídia de expressão.

Análise detalhada da atividade enzimática da trans-sialidase mutante

A trans-sialidase mutante que foi selecionada parautilização neste projeto foi analisada mais detalhadamente:foram quantificadas tanto a atividade de sialidase quanto aatividade de transferase.

A atividade de transferase foi medida em 20 mM deHepes, pH 7,2, 20 μΜ de N-acetilneuraminil lactose e 220 nM de estruturas de açúcar NA2FB marcadas com APTS (asialo-,galactosiladas biantenárias, núcleo-substituídas com fucosee com GlcNAc de bisseção) em um volume total de reação de50 μΐ. As estruturas de açúcar NA2FB foram marcadas epurificadas de acordo com o protocolo anteriormente descrito (Callewaert e outros, 2001). Foram adicionados 50ng de enzima purificada e a reação foi incubada a 25° Cdurante 30 minutos. A reação foi interrompida medianteadição de 150 μΐ de água e colocação dos tubos a -20° C. Amistura de reação foi então submetida a secagem por evaporação em vácuo e foi reconstituída em 5 μΐ de água.Para análise das estruturas de glican, os presenteinventores utilizaram a tecnologia DSA-FACE conformedescrita anteriormente (Callewaert e outros, 2001). Aatividade de sialidase da enzima foi medida em 20 mM deTris-HCl, pH 7,6, 30 mM de NaCl e 0,2 mM de ácido 4-metilumbeliferil-N-acetilneuramínico (MUNANA) em um volumefinal de 50 μΐ a uma temperatura de 25° C. Para o ensaiofoi utilizado 1 μς de trans-sialidase purificada. Após 15minutos de incubação a reação foi interrompida medianteadição de 150 μΐ de 0,2 M de carbonato e a fluorescência de4-metilumbeliferona livre foi medida com um dispositivo deleitura de placa de múltiplos receptáculos CYTOFLUOR®Multi-Well Plate Reader Series 4000 (PerSeptiveBiosystems).

Camundongos e parasitas

Foram utilizados camundongos machos BALB/c (13-14semanas de idade) das instalações para animais da EscolaVeterinária de La Plata - Universidade Nacional de LaPlata. Durante o experimento os camundongos foram mantidosnas instalações para animais da Escola de Medicina deRosário. Os animais tinham acesso a alimentos e água adIibitum e foram mantidos era condições de temperaturaconstante (22-24° C), estabelecendo-se um período de luzdiário de 12 horas. Foram obtidos do sangue de camundongosinfectados tripomastigotos da cepa Tulahuén de Trypanosomacruzi (Tc). A amostra heparinizada foi diluída em soluçãofisiológica ("Physiological Solution" - PS) e os parasitasforam contados com utilização de uma câmara de Neubauer.

ImunizaçõesForam feitas 3 imunizações — com 14 dias deintervalo - para cada proteína. Para a primeira imunizaçãofoi utilizado Adjuvante Completo de Freund (Adj), e para asimunizações seguintes foi utilizado Adjuvante Incompleto de

Freund (Adj) (SIGMA)

OCHlr 30 μς por via subcutânea. Vf 0,1 ml/camundongo: 50%TS + veículo (tampão= 75% glicina IM pH=3 + 25% fosfato 0,2M pH=7), + 50% Adj.

WTr 30 μς por via subcutânea: idem para os restantes.Mutr 30 μg por via subcutânea: idem para os restantes.

Alb, ovalbumina (SIGMA) foi utilizada como proteínairrelevante para os grupos de controle (indicada como OVA)

Projeto experimentalGl veículo + Tc (n=10)G2 Adj + veículo + Tc (n=10)G3 Adj + WT + Tc (n=10)G4 Adj + OCHl + Tc (n=10)GS Adj + Mut + Tc (n=10)G6 Adj + Alb + veículo + Tc (n=10)G7 Adj + OCHl (duas doses) + Tc (n=10)G8 veículo + PS (n=5)G9 Adj + veículo + PS (n=5)GlO Adj + WT + PS (n=5)Gll Adj + OCHl + PS (n=5)Gl2 Adj + Mut + PS (n=5)

Gl3 Adj + Alb + veículo + PS (n=5)Gl4 Adj + OCHl (duas doses) + PS (n=5)Exposição a Trypanosoma cruzi

14 dias após a última imunização os camundongosforam expostos a 100 tripomastigotos por camundongo, porvia subcutânea. Os grupos 8-14 receberam PS.

A infecção aguda in vivo foi monitorada poravaliação de sobrevivência, peso dos animais e parasitemia.

Estudo histopatológico

Os órgãos (coração, timo, baço, músculo estriado efígado) foram colhidos e pesados aos 60 dias pós-infecção,foram lavados em PBS, e foram fixados em formalinatamponada a 10% durante 24 horas. Seções contíguas de 5 μπαforam montadas e manchadas com hematoxilina-eosina etricromo de Masson de acordo com procedimentosconvencionais.

A inflamação e parasitismo de tecidos foramavaliados de acordo com o grau de inflamação conformeanteriormente descrito por Roggero e outros (2002) .

Exemplo 1: Mutagênese aleatória do gene de trans-sialidase

Mediante utilização de uma técnica de mutagênesebaseada em PCR no plasmídeo pPICZTSjE (Figura 1), ospresentes inventores puderam criar mutações no gene detrans-sialidase. 0 método é baseado no uso da DNApolimerase de Taq com tendência de erro. Medianteutilização de elevadas quantidades desta enzima na reação eadição de quantidades desiguais de dNTP's e Mn2+ à misturade reação, a freqüência destes erros foi aumentada. Atécnica foi otimizada para assegurar que ocorresse em médiasomente 1 mutação por produto de PCR. 0 gene de trans-sialidase após a mutação foi ligado ao vetor pPICZTSjEoriginal onde substituiu o gene original.

Os plasmídeos portando o gene de trans-sialidaseapós a mutação foram transformados para o fermentometilotrófico Pichia pastoris e foram dispostostransformantes em placas de 96 receptáculos por um robô decolheita de colônias Flexys (Genomic Solutions). A coleçãode transformantes foi então submetida a triagem para clonesexpressando uma trans-sialidase inativa com um ensaio defluorescência que utilizou uma molécula aceptora marcadacom fluorescência (Iactose-AMAC) e uma grande quantidade demoléculas doadoras de ácido siálico (sialillactose) . Após areação com a trans-sialidase na midia de indução dostransformantes, as moléculas sialiladas foram colhidas comuma resina de troca iônica em urna placa de filtração de 9 6receptáculos e foram eluidas para uma placa de fundotransparente de 96 receptáculos. A quantidade desialillactose-AMAC pôde então ser medida com um dispositivoLumilmager® (Boehringer) e constituiu uma medida daatividade da trans-sialidase expressada pelos diferentestransformantes.. Para exclusão de transformantes que somenteexpressavam urna trans-sialidase parcial devido à inserçãode um códon de interrupção prematuro pela mutagênese, osdados do ensaio de fluorescência foram combinados com osdados de um ensaio ELISA em que os presentes inventoresutilizaram um anticorpo contra o marcador-E de terminal-C(Figura 2) . Desta forma puderam ser identificados váriostransformantes que expressavam uma trans-sialidase compouquíssima atividade enzimática ou já sem nenhumaatividade.

Exemplo 2: Purificação de trans-sialidase recombinante

Devido à presença de um marcador E-tag naextremidade de terminal C da trans-sialidase, a enzima pôdeser purificada até uma quase homogeneidade com uma únicaetapa utilizando-se cromatografia de afinidade. Trêsdiferentes formas da trans-sialidase foram purificadas paraeste projeto: a trans-sialidase ativa que foi clonada emnosso laboratório e foi expressada na cepa de Pichiapastoris GS115(his4) (Laroy e outros, 2000) (WT), a mesmaenzima porém expressada na cepa de Pichia pastoris GS115 {his4) Glycoswitch M8, uma cepa de fermento em que ahiperglicosilação foi inibida através de "knock-out" daatividade de OCHl (Vervecken e outros, 2004) (OCHl) (Figura3) e uma trans-sialidase mutante que foi selecionada dacoleção de mutantes criada pelos presentes inventoresmediante mutagênese aleatória e que foi expressada na cepade Pichia pastoris GS115{his4) (Mut). Todas as trans-sialidases utilizadas pelos presentes inventores nesteprojeto eram desprovidas da cauda de repetições SAPAimunodominantes que se encontra presente em quase todas astrans-sialidases derivadas do parasita propriamente dito.

A atividade enzimática do mutante que foiselecionado para uso neste projeto foi analisada · com maisdetalhe. Tanto a atividade de sialidase quanto a atividadede transferase foram medidas por meio de ensaios altamentesensíveis. Os dados demonstraram que o mutante utilizadoneste projeto já apresentava somente cerca de 3,6% de atividade de sialidase (Figura 4) e 4,5% de atividade detransferase (Figura 5) . Este mutante foi selecionado pornão ter demonstrado atividade no ensaio de fluorescência eter apresentado uma expressão muito boa no ensaio ELISA.

Para caracterização adicional das conseqüências sistêmicas das imunizações com TS's e das possíveisalterações nas propriedades cinéticas da proteína OCHl, foirealizado um experimento in vivo. Proteínas de TS's foramadministradas subcutaneamente a camundongos e suaconcentração foi monitorada em amostras de sangue colhidas em diferentes momentos após a injeção. Simultaneamente, foirealizada uma análise histopatológica. Não foram observadasalterações em tecidos (ou seja, atrofia do timo) durantetodo o decurso do experimento. Não foram registradosquaisquer valores detectáveis em medições realizadas 1, 3, e 4 dias após a injeção. Aos 15, 20 e 30 dias pós-inoculação, as três TS's recombinantes apresentaram níveissimilares na circulação. Os dados cinéticos foramadicionalmente confirmados por testes "Western blot" emamostras de soro empregado um anticorpo anti-marcador-E("anti-E-tag") monoclonal.

Coletivamente, pode ser concluído que as proteínasrecombinantes aqui utilizadas não induziram alteraçõeshistopatológicas per se, em nenhum dos órgãos estudados.Deverá ser observado., entretanto, que o tecido relevantepara wt TS é o sistema nervoso onde poderia talvez serencontrada atividade de neuro-diferenciação.

Adicionalmente, a proteína recombinante de TS OCHl, que édesprovida da característica de hiperglicosilação, não tevealteradas sua concentração e sua estabilização no sanguerelativamente a WT e MUT.

Exemplo 3: Experimentos de vacinação

Foram utilizados para estes experimentos 14 gruposde camundongos, e foi administrado um tratamento diferentea cada grupo. Os grupos 1-7 forame expostos a parasitas deTrypanosoma cruzi 14 dias após a última imunização,enquanto que os grupos 8-14 funcionaram como controle sendoadministrado aos mesmos solução fisiológica (PS). Os grupos1—7 consistiam em 10 camundongos por grupo, enquanto osgrupos 8-14 consistiam em 5 camundongos por grupo. Ainfecção aguda nos animais foi monitorada medianteavaliação de sobrevivência, peso dos animais e parasitemia.

A sobrevivência foi verificada mediante controle diário demortalidade e o peso dos animais foi registrado em uma basesemanal. As parasitemias foram estudadas por observaçãomicroscópica direta em condições padrão. Aos 14 e 21 diaspós-infecção, foram analisados 5 μL de sangue obtidos dacauda de camundongos infectados; os resultados foramexpressados como número de parasitas/50 camposmicroscópicos (400x). Os resultados demonstram que ocorreu80-100% de sobrevivência em animais vacinados com trans-sialidase. Em contrapartida, os animais que não seencontravam vacinados com trans-sialidase apresentaramsomente 20% de sobrevivência. A trans-sialidase mutante foiainda mais eficiente que a trans-sialidase ativa nestesexperimentos (Figura 6) . Quando a parasitemia foiverificada nos diferentes grupos, foi demonstrado que emanimais não vacinados o número de parasitas no sangue eraelevado, ao passo que nos animais vacinados com a trans-sialidase o número de parasitas no sangue era muito baixo(Figura 7) . Ao se observar o número de parasitas no sangue,foi demonstrado que a trans-sialidase mutante tinha umefeito melhor que a trans-sialidase ativa. Além disso, atrans-sialidase ativa que foi expressada em uma cepa defermento na qual na hiperglicosilação foi inibidaapresentou um efeito melhor que a trans-sialidase ativa quefoi expressada em uma cepa de fermento que era ainda capazde sintetizar proteínas hiperglicosiladas. Isto pode serexplicado pelo fato de a trans-s'\lidase que foi expressadana cepa de fermento com hiperglit-jsilação ineficiente serámuito provavelmente eliminada com menor rapidez do corpo docamundongo, significando que terá um efeito mais duradourona corrente sangüínea do camundongo. Uma explicaçãoalternativa para isto pode encontrar-se no fato de a parte de proteína das glicoproteínas ser bem mais acessível aosanticorpos na cepa em que a hiperglicosilação foidesativada, devido aos menores glicans nestasglicoproteinas. Quando o peso dos animais foi verificado,foi demonstrado que os animais que tinham sido vacinadoscom trans-sialidase apresentavam peso normal, ao passo quefoi observado um decréscimo de peso significativo nosanimais infectados e não vacinados (Figura 8).

Exemplo 4: A imunização com Mut (mas não com OCHl) induzproteção contra danos em tecidos em infecção experimentalcom T, cruzi

Os presentes resultados, bem como alguns estudospublicados, demonstram que a imunização com diferentesproteínas de T. cruzi (ou seu gene por imunização genética)pode aumentar a sobrevida de camundongos infectados com T.cruzi. Entretanto, em nenhum destes estudos anteriores aimunização impediu em elevada proporção os danos causados atecidos em animais infectados. Para esta análise, seções decoração, timo, baço, músculo estriado e fígado decamundongos imunizados e expostos a T. cruzi foramavaliados aos 60 dias pós-infecção (estágio tardio deinfecção) quanto a carga de parasitas nos tecidos einflamação. A persistência dos parasitas e portanto agravidade da doença neste modelo murino de infecção por T.cruzi são mais elevadas no coração e nos músculosesqueletais, e portanto estes tecidos constituíram o focode atenção principal. Independentemente das condições deimunização, todos os grupos de camundongos apresentaramausência de ninhos de amastigotos em músculos esqueletais eno coração (Figura 9 B, C, E, F, Η, I e Tabela 1). Emcomparação, os animais não imunizados apresentaram niveisentre moderados e altos de parasitismo em tecidos.

Significativamente, em camundongos imunizados comMut, o grau de inflamação e os danos concomitantes emtecidos no coração e músculos esqueletais foramnotavelmente reduzidos ou encontravam-se virtualmenteausentes após a infecção (Figura 9 C, F, I) . Em contraste,os camundongos imunizados com WT ou OCHl apresentaram umamelhoria parcial de suas lesões musculares e no miocárdio(Figura 9 Β, Ε, H) . Muito embora a maioria dos animais decontrole (60-90%) tenha morrido, os poucos sobreviventesapresentavam extensa inflamação de músculos esqueletais enecrose de tecidos, as marcas características da doença deChagas. Finalmente, conforme pode ser observado na TabelaII, não foram registradas lesões inflamatórias emcamundongos não infectados, independentemente deadministração de proteínas.

A esplenomegalia e a Iinfadenopatia relacionadascom ativação policlonal de células B e células T sãocaracterísticas típicas da infecção por T. cruzi (Olivierie outros, 2002) . Além disso, o baço é um órgão normalmentecomprometido era diversos modelos animais de doença deChagas (Lima e outros, 2001) . Por este motivo, o peso dobaço de camundongos imunizados e camundongos de controle no60° dia após a exposição a T. cruzi foi analisado (Figura10) . Camundongos BALB/c não imunizados e infectadosapresentaram uma esplenomegalia significativa. Grupostratados com WT e com OCHl desenvolveram uma esplenomegaliamoderada simultaneamente com a presença de miocardite oumiosite. Nestes animais, o estudo histológico revelouhiperplasia dos foliculos linfóides, com necrose focai emcentros germinais e polpa vermelha ("red pulp") na ausênciade parasitas. Em contraste, não foram encontradasalterações histológicas ou de peso do baço em camundongosimunizados com Mut, apresentando dados muito similares aosdos controles não infectados.

Os grupos infectados mas não tratados apresentaraminfiltrados focais hepáticos de macrófagos contendoamastigotos, alternativamente bem preservados ou emdesintegração, com alguma necrose hepatocitica nas áreasfocais.

Exemplo 5: A imunização com todas as proteínasrecombinantes estimula a resposta sistêmica de anticorposanti-TS porém animais infectados vacinados com Mut nãoinduzem uma resposta humoral anti-SAPA específica

Foi realizado um estudo cinético de resposta de IgGanti-TS especifica de camundongos imunizados e de controlenos dias -1, +14, +28 e +60 antes e após a exposição a T.cruzi. Foram observados títulos séricos elevados de IgG'santi-TS em todos os grupos imunizados e/ou infectados nasavaliações feitas em todos os pontos no tempo (Figura 11).

Somente no dia +60 pós-infecção se encontravam presentestítulos baixos a moderados de IgG anti-TS em animais decontrole infectados (grupos OVA+Tc, Adj+Tc e veículo+Tc).Conforme previsto, não ocorreram respostas específicas paratodas as TS' s no soro de camundongos de controle nãoimunizados/não infectados . Portanto, a imunização com TS' spode estimular uma forte resposta específica de anticorposIgG, independentemente da proteína recombinanteadministrada.

Devido ao fato de todas as TS7 s recombinantesutilizadas neste estudo não apresentarem a caudaimunodominante de repetições SAPA, as respostas imunesdirigidas a este domínio repetitivo resultaram da exposiçãoa parasitas, independentemente da proteína de TS inoculada.Alguns camundongos foram vacinados conforme se encontradescrito em Materiais e Métodos e foram subseqüentementetestados 14, 28 e 60 dias após a infecção com T. cruziquanto à presença de resposta de anticorpos IgG anti-SAPAespecíficos (Figura 11). Foram detectados níveis moderados(dias 14 e 28) e elevados (dia 60) de anticorposespecíficos anti-SAPA no soro de camundongos imunizados comproteínas WT ou OCHl e em camundongos não imunizados poréminfectados (grupo OVA+Tc). Notavelmente, os recipientes daproteína Mut não apresentaram anticorpos anti-SAPA(p<0,001), o que constitui uma indicação de controleeficiente da infecção. Finalmente, não puderam serdetectados anticorpos específicos anti-SAPA em soroscolhidos anteriormente à infecção por T. cruzi. A presençade anticorpos anti-SAPA na circulação foi correlacionadacom um agravamento do curso da infecção. Na medida em queos anticorpos anti-SAPA não têm ação protetora, a ausênciade anticorpos anti-SAPA constitui uma clara vantagem já queeste fato evita um desvio de atenção do sistema imune ecria uma resposta imune eficaz direcionada ao sitiocatalitico importante da enzima. De fato, os camundongosimunizados com proteína TS Mut não somente sobreviveram àinfecção de T. cruzi mas controlaram igualmente a carga deparasitas no sangue e nos tecidos, simultaneamenteapresentando uma redução dramática de necrose e inflamaçãode músculos esqueletais e cardíaco durante a fase maistardia de infecção. Estes resultados indicam que umcontrole imunológico eficaz de carga de parasitas duranteas fases aguda e crônica de infecção, conforme obtido com avacina de TS Mut, produz como resultado uma redução decarga de parasitas nos tecidos e decréscimos associados deintensidade da doença. Fica claro com base nestesresultados que a gravidade das lesões em tecidos nainfecção por T. cruzi se encontra intimamente ligada aorelativo êxito na limitação dos níveis de parasitas e queuma limitação bem sucedida, conforme comprovada pelo nívelde anticorpos anti-SAPA, somente é obtida com a vacina deTS Mut.Tabela 1

<table>table see original document page 33</column></row><table>Bradford Μ.Μ. (1976) A rapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utIlizingthe principie of protein-dye binding [Um método rápido esensível para quantificação de quantidades de microgramasde proteínas utilizando o princípio de ligação proteína-corante] , Anal. Biochem. 72, .248-254

Callewaert N., Geysens S., Molemans F., Contreras R. (2001)Ultrasensitive profiling and sequencing of N-Iinkedoligosaccharides using standard DNA-sequencing equipment[Método ultra-sensível de análise de perfil eseqüenciamento de olissacarídeos N-Iigados utilizandoequipamentos convencionais de seqüenciamento de DNA] ,Glycobiology 11(4), 275-281

Ciavaglia M., de Carvalho T.U., de Souza W. (1993)Interaction of Trypanosoma cruzi with cells with alteredglycosylation patterns [Interação de Trypanosoma cruzi comcélulas com padrões de glicosilação alterados], Biochem.Biophys. Res. Commun^ 193, 718-721

Costa F., Francjin, G., Pereira-Chioecola, V.L., Ribeirão,M., Schenkman, S. e Rodrigues, M.M. (1998) Immunizationwith a plasmid containing the gene of trans-sialidasereduces Trypanosoma cruzi infection in mice [Imunização comum plasmídeo contendo o gene de trans-sialidase reduzinfecção por Trypanosoma cruzi em camundongos]. Vaccine 16,768-774

El-Sayed N.M., Myler P.J., Bartholomeu D.C., Nilsson D.,Aggarwal G., Tran AN, Ghedin E., Worthey E.A., DelcherA.L., Blandin G., Westenberger S.J., Caler E., CerqueiraG.C., Branche C.', Haas B., Anupama A., Arner E., Ãslund L.,Attipoe P., Bontempi E., Bringaud F., Burton P., Cadag E.,Campbell D.A., Carrington M.:, Crabtree J., Darban H., daSilveira J.F., de Jong P., Edwards K., Englund P.T.,Fazelina G., Feldblyum T., Ferella M., Frasch A.-C., GullK., Horn D., Hou L., Huang Y., Kindlund E., Klingbeil M.,Kluge S., Koo H., Lacerda D., Levin M.J., Lorenzi H., LouieT., Machado C.R., McCulloch R., McKenna A., Mizuno Y.,Mottram J.C., Nelson S., Oehaya S., Osoegawa K., Pai G.,Parsons M., Pentony M., Pettersson U., Pop M., RamirezJ.L., Rinta J., Robertson L., Salzberg S.L., Sanchez D.O.,Seyler A., Sharma R., Shetty J., Simpson A.J., Sisk E.,Tammi M.T., Tarleton R., Teixeira S., Van Aken S., Vogt C.,Ward P.N., Wickstead B., Wortman J., White O., Fraser C.M.,Stuart K.D., Andersson B. (2005) The genome sequence ofTrypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease[Seqüenciamento do genoma de Trypanosoma cruzi, agenteetiológico da doença de Chagas], Science 309 (5733), 409-415

Katae M., Miyahara, Y., Takeda, K., Matsuda, H., Yagita,H.., Okumuraf K. , Takeuchif T., Kamiyamaf T., Ohwadaf Α. ,Fukuehi7 Υ. e Aokif Τ. (2002) Coadministration of aninterleukin-12 gene and a trypanosome cruzi gene improvesvaccine efficacy [A co-administração de um gene de interleucina-12 e de um gene de Trypanosoma cruziaperfeiçoa a eficiência de vacinação] . Infect. Immun. 70,4833-4840

Laroy W., Contreras R. (2000) Cloning of Trypanosoma cruzi trans-sialidase and expression in Piehia pastoris [Clonagemde trans-sialidade de Trypanosoma cruzi e expressão emPichia pastoris], Protein expression and purification 20,389-393

Lima, E. S., Andrade7 Z.A., Andrade, S.G. (2001) TNF-alphais expressed at sites of parasite and tissue destruction inthe spleen of mice acutely infected with Trypanosoma cruzi.[Expressão de TNF-alfa em sítios de parasitas e destruiçãode tecidos no baço de camundongos com infecção aguda de Trypanosoma cruzi] Int. J. Exp. Pathol. 82, 327-336.

Ming M.f Chuenkova M., Ortega-Barria E., Pereira M.E.A.(1993) Mediation of Trypanosoma cruzi invasion by sialieacid on the host cell and trans-sialidase on the trypanosome [Mediação de invasão de Trypanosoma cruzi porácido siálico na célula hospedeira e trans-sialidase notripanossoma]7 Mol. Biochem. Parasitol. 59, 243-252Olivieri, Β.P., Cotta-De-Almeida, V., Araújo-Jorge, Τ.(2002) Benznidazole treatraent following acute Trypanosomacruzi infection triggers CD8+ T-cell expansion andpromotes resistance to reinfection. [Tratamento combenznizadol após infecção aguda por Trypanosoma cruzi ativaexpansão de células-T CD 8+ e promove resistência à re-infecção] Antimicrob. Agents Chemother. 4 6, 37 90-37 96.

Pereira-chioccola, V.P., Costa, F., Ribeirão, M., Soares,I.S., Arena, F., Schenkman, S. e Rodrigues, M.M. (1999)Comparison of antibody and protective immune responsesagainst Trypanosoma cruzi infection elicited byimmunization with a parasite antigen delivered as naked DNAor recombinant protein. [Comparação de anticorpos erespostas imunes protetoras contra infecção por Trypanosomacruzi elicitada por imunização com um antigeno de parasitaadministrado como DNA descoberto ou proteína recombinantelParasite Immunology 21, 103-110

Roggero, E., Perez, A., Tamae-kakazu, M., Piazzon, I.,Nepomnaschy, I., Wietzerbin, J. (2002) Differentialsusceptibility to acute Trypanosoma cruzi infection inBALB/c and C57BL/6 mice is not associated with distinctparasite Ioad but cytokine abnormalities. [Asuscetibilidade diferencial a infecção aguda porTrypanosoma cruzi em camundongos BALB/c e C57BL/6 não seencontra associada a cargas distintas de parasitas e sim aanormalidades de citocinas] Clin. Exp. Immunol. 128, 421-428.

Ruiz R., Rigoni V.L., Gonzalez J., Yoshida N. (1993) The35/50 kDa surface antigen of Trypanosoma cruzi metacyclictrypomastigotes, an adhesion molecule involved in host cellinvasion [0 antígeno de superfície de 35/50 kDa detripomastigotos metacíclico de Trypanosoma cruzi, umamolécula de adesão envolvida na invasão de célulashospedeiras], Parasitol. Immunol. 15, 121-125

Schenkman R.P.S., Vandekerckhove F., Schenkman S. (1993)Mammalian cell sialic acid enhances Trypanosoma cruziinvasion [0 ácido siálico de células de mamíferos aumenta ainvasão de Trypanosoma cruzi], Infect. Immun. 61, 898-902

Sehenkman S., Jiang M., Hart G.W., Nussenzweig V. (1991) Anovel cell surface trans-sialidase of Trypanosoma cruzigenerates a stage-specific epitope required for invasion ofmammalian cells [Urna nova trans-sialidase de superfíciecelular de Trypanosoma cruzi gera um epitopo específico deestágio necessário para a invasão de células de mamíferos],Cell 65, 1117-1125

Vasconcelos, J.R., Hiyane, M.I., Marhino, C.R., Claser, C.,Machado, A.M., Gazzinelli, R.T., Bruna-Romero, 0., Alvarez,J.M., Boscardin, S.B. e Rodrigues, Μ.Μ. (2004) Protectiveimmunity against trypanosome cruzi infection in a highlysusceptible mouse strain after vaccination with genesencoding the amastigote surface protein-2 and trans-sialidase. [Imunidade protetora contra infecção porTrypanosoma cruzi em uma cepa murina altamente suscetívelapós vacinação com genes que codificam trans-sialidase eproteína-2 de superfície de amastigoto] Hum. Gene Ther. 15,878-886.

Vervecken W., Kaigorodov V., Callewaert N., Geysens S., DeVusser K., Contreras R. (2004) In vivo synthesis ofmammalian-like, hybrid-type N-glycans in Pichia pastoris,{Síntese in vivo de N—glicans de tipo híbrido, do tipo demamíferos em Pichia pastoris] Appl. Environ. Microbiol. 70(5), 2639-2646

Woronowicz A., De Vusser K., Laroy W., Contreras R., MeakinS.O., Ross G.M., Szewczuk M.R. (2004) Trypanosome trans-sialidase targets TrkA tyrosine kinase receptor and indueesreceptor internalization and activation, [A trans-sialidasede tripanossoma dirige-se ao alvo receptor de TrkA tirosinaquinase e induz internalização e ativacão do receptor] Glycobiology. 14 (11), 987-998

Yoshida N., Mortara R.N., Araguth M.F., Gonzalez J.C.,Russo M. (1989) Metacyclic neutralizing effect ofmonoclonal antibody 10D8 directed to the 35- and 50-kílodalton surface glycoconjugates of Trypanosoma cruzi, [Oefeito neutralizador metacíclico do anticorpo monoclonal10D8 dirigido aos glicoconjugados de superfície de 35 e 50quiloDaltons de Trypanosoma cruzi] Mol. Biochem. Parasitol.39, 39-46LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

Requerentes: VIB vzw e Universiteit Gent

Titulo: USO DE UMA PROTEÍNA MUTANTE DE TRANS-SIALIDASE DETRYPANOSOMA ENZIMATICAMENTE INATIVA, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICARCO/CHG/V232PCT-EP2007-052399Prioridade: EP 06111294.2Data de Depósito : 2006-03-17 <160> 1

Programa ; PatentIn versão 3.3<210> 1<211> 643<212> PRT<213> Artificial<220>

Nome: Trans-sialidase mutanteNúmero : 1

Met Val Leu Ala Pro Gly Ser Ser Arg Val Glu Leu Phe Lys Arg Lys1 5 10 15

Asn Ser Thr Val Pro Phe Glu Asp Lys Ala Gly Lys Val Thr Glu Arg

20 25 30

Val Val His Ser Phe Arg Leu Pro Ala Leu Val Asn Val Asp Gly Val35 40 45

Met Val Ala Ile Ala Asp Ala Arg Tyr Asp Thr Ser Asn Asp Asn Ser50 55 60

Leu Ile Asp Thr Val Ala Lys Tyr Ser Val Asp Asp Gly Glu Thr Trp65 70 75 80

Glu Thr Gln Ile Ala Ile Lys Asn Ser Arg Val Ser Ser Val Ser Arg85 90 95

Val Val Glu Pro Thr Val Ile Val Lys Gly Asn Lys Leu Tyr Val Leu

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Tyr Ser Ser Arg Ser Tyr Trp Ser Ser His Gly Asp115 120 125

Ala Arg Asp Trp Asp Ile Leu Leu Ala Val Gly Glu Val Thr Lys Ser

130 135 140

Ile Ala Gly Gly Lys Ile Thr Ala Ser Ile Lys Trp Gly Ser Pro Val145 150 155 160

Ser Leu Lys Lys Phe Phe Pro Ala Glu Met Glu Gly Met His Thr Asn

165 170 175

Gln Phe Leu Gly Gly Ala Gly Val Ala Ile Val Ala Ser Asn Gly Asn

180 185 190

Leu Val Tyr Pro Val Gln Val Thr Asn Lys Arg Lys Gln Val Phe Ser195 200 205

Lys Ile Phe Tyr Ser Glu Asp Asp Gly Lys Thr Trp Lys Phe Gly Lys

210 215 220

Gly Arg Ser Asp Phe Gly Cys Ser Glu Pro Val Ala Leu Glu Trp Glu225 230 235 240

Gly Lys Leu Ile Ile Asn Thr Arg Val Asp Trp Lys Arg Arg Leu Val

245 250 255

Tyr Glu Ser Ser Asp Met Gly Asn Thr Trp Val Glu Ala Val Gly Thr

260 265 270

Leu Ser Arg Val Trp Gly Pro Ser Pro Lys Ser Asp Gln Pro Gly Ser275 280 285

Gln Ser Ser Phe Thr Ala Val Thr Ile Glu Gly Met Arg Val Met Leu

290 295 300

Phe Thr His Pro Leu Asn Phe Lys Gly Arg Trp Leu Arg Asp Arg Leu305 310 315 320Asn Leu Trp Leu Thr Asp Asn Gln Arg Ile Tyr Asn Val Gly Gln Val

325 330 335

Ser Ile Gly Asp Glu Asn Ser Ala Tyr Ser Ser Val Leu Tyr Lys Asp340 345 350

Asp Lys Leu Tyr Cys Leu His Glu Ile Asn Thr Asp Glu Val Tyr Ser355 360 365

Leu Val Phe Ala Arg Leu Val Gly Glu Leu Arg Ile Ile Lys Ser Val

370 375 380

Leu Arg Ser Trp Lys Asn Trp Asp Ser His Leu Ser Ser Ile Cys Thr385 390 395 400

Pro Ala Asp Pro Ala Ala Ser Ser Ser Glu Ser Gly Cys Gly Pro Ala

405 410 415

Val Thr Thr Val Gly Leu Val Gly Phe Leu Ser Gly Asn Ala Ser Gln420 425 430

Asn Val Trp Glu Asp Ala Tyr Arg Cys Val Asn Ala Ser Thr Ala Asn435 440 445

Ala Glu Arg Val Arg Asn Gly Leu Lys Phe Ala Gly Val Gly Gly Gly

450 455 460

Ala Leu Trp Pro Val Ser Gln Gln Gly Gln Asn Gln Arg Tyr Arg Phe465 470 475 480

Ala Asn His Ala Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Thr Ile His Glu Ala

485 490 495

Pro Arg Ala Ala Ser Pro Leu Leu Gly Ala Ser Leu Asp Ser Ser Gly500 505 510

Gly Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Glu Lys His Gln Trp Gln515 520 525

Pro Ile Tyr Gly Ser Thr Pro Val Thr Pro Thr Gly Ser Trp Glu Thr

530 535 540

Gly Lys Arg Tyr His Val Val Leu Thr Val Ala Asn Lys Ile Gly Ser545 550 555 560

Val Tyr Ile Asp Gly Glu Leu Leu Glu Gly Ser Gly Gln Thr Val Val

565 570 575

Pro Asp Gly Arg Thr Pro Asp Ile Ser His Phe Tyr Val Gly Gly Tyr 580 585 590

Gly Arg Ser Asp Met Pro Thr Ile Ser His Val Thr Val Asn Asn Val

595 600 605

Leu Leu Tyr Asn Arg Gln Leu Asn Thr Glu Glu Ile Arg Thr Leu Phe610 615 620

Leu Ser Gln Asp Leu Ile Gly Thr Glu Ala His Met Asp Ser Ser Ser625 630 635 64 0

Asp Thr Lys

Claims (13)

1. USO DE UMA PROTEÍNA MUTANTE TRANS-SIALIDASE DETRYPANOSOMA ENZIMATICAMENTE INATIVA, caracterizado por sercomo um medicamento.

2. USO DE UMA PROTEÍNA MUTANTE TRANS-SIALIDASE DETRYPANOSOMA ENZIMATICAMENTE INATIVA, caracterizado por serpara a preparação de uma vacina.

3. USO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 e 2, caracterizado por a trans-sialidasemutante ser uma trans-sialidase mutante recombinante.

4. USO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado por a trans-sialidasemutante não possuir o rabicho de repetição SAPA imuno-dominante.

5. USO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações Ia 4, caracterizado por a trans-sialidasecompreender SEQ ID N°l.

6. USO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado por a trans-sialidasemutante possuir um padrão de glicolisação modificadocomparado ao tipo selvagem de trans-sialidase.

7. USO, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 6, caracterizado por a referida vacinaser usada no tratamento profilático e/ou terapêutico dadoença de Chagas.

8. USO DE UMA PROTEÍNA MUTANTE TRANS-SIALIDASE DETRYPANOSOMA ENZIMATICAMENTE INATIVA, caracterizado por serpara a proteção de mamíferos de miocardites e/ou miositese/ou esplenomegalia causada pela infecção por Trypanosomacruzi.

9.COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada porcompreender uma proteína mutante trans-sialidase deTrypanosoma enzimaticamente inativa.

10. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 9, caracterizada por a trans-sialidasemutante ser uma trans-sialidase mutante recombinante.

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 9 e 10, caracterizada por a trans-sialidase mutante não possuir o rabicho de repetição SAPAimuno-dominante.

12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 11, caracterizada por a trans-sialidasecompreender SEQ ID N°l.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualqueruma das reivindicações 9 a 12., caracterizada por a trans-sialidase mutante possuir um padrão de glicolisaçãomodificado comparado ao tipo selvagem de trans-sialidase.