BRPI0709602A2 - vetor de vìrus mononegavirales recombinante, e, vacina contra um patógeno microbiano - Google Patents

Abstract

VETOR DE VìRUS MONONEGAVIRALES RECOMBINANTE, E, VACINA CONTRA UM PATóGENO MICROBIANO. A invenção refere-se a um vetor de vírus Mononegavirales (MV) recombinante compreendendo um gene estranho que é flanqueado por regiões não-codificadoras de um gene de vírus MV.

Description

"VETOR DE VÍRUS MONONEGAVIRALES RECOMBINANTE, E,VACINA CONTRA UM PATÓGENO MICROBIANO"

Esta invenção refere-se a um vetor de vírus Mononegaviralesrecombinante hospedando uma unidade de transcrição adicionalcompreendendo um gene estranho operativamente ligado com uma seqüênciade início de gene (GS) de vírus Mononegavirales a montante e uma seqüênciade final de gene (GE) de vírus Mononegavirales a jusante bem como a umavacina compreendendo um tal vetor de vírus Mononegavirales recombinante.

Vírus vivos que são capazes de se replicarem em umhospedeiro infectado induzem uma resposta imune forte de duração longacontra seus antígenos expressados. São efetivos na geração de respostasimunes tanto mediadas por células quanto humorais, bem como estimulamrotas de citocina e de quimiocina. Portanto, vírus atenuados, vivos oferecemvantagens distintas sobre composições de vacina baseadas em imunógenosquer de subunidade quer inativos que tipicamente grandemente apenasestimulam o ramo humoral do sistema imune.

Durante a última década tecnologia de DNA recombinante temrevolucionado o campo de engenharia genética dos genomas de ambos osvírus de DNA e de RNA. Em particular, agora é possível introduzir genesestranhos dentro do genoma de um vírus de tal modo que sob replicação dovírus vetor novo em um animal hospedeiro é expressada uma proteínaestranha que pode exercer efeitos biológicos no animal hospedeiro. Comotais, vírus vetores recombinantes têm sido explorados não apenas para ocontrole e a prevenção de infecções microbianas, mas também paradesenvolvimento de terapias alvo para doenças não-microbianas tais comomalignidades e em terapia de gene.

A geração de vírus de RNA de fita negativa, não-segmentada(vírus da ordem Mononegavirales) inteiramente de cDNA clonado por umatécnica designada como "genética reversa", primeiro relatada em 1994(Schnell et al., EMBO J 13, 4195-4203, 1994), tem tornado possível o usotambém de vírus da ordem Mononegavirales (MV) como vetores. Desdeentão, têm sido publicados estudos que descrevem o uso de muitos vírus daordem MV como vetores virais para expressar antígenos estranhos de umpatógeno almejando o desenvolvimento de vacinas contra aquele patógeno.

A ordem de Mononegavirales é classificada em quatro famíliasprincipais: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae e Bornaviridae.Vírus pertencendo a estas famílias possuem genomas que são representadospor uma única molécula de RNA de senso negativo (-), i.e. a polaridade do genoma de RNA é oposta à polaridade de RNA mensageiro (mRNA) que édesignado como de senso positivo (+). A classificação dos vírus MVveterinários e de humano principais é apresentada na tabela abaixo:

Tabela 1: Classificação de vírus dentro da ordem de MononegaviraIes

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A organização genômica e os detalhes do ciclo de vida dosvírus da ordem MV estão bem entendidos hoje em dia e são revistos porvários autores (Neumann et ai., J. Gen. Virology 83, 2635-2662, 2002;Whelan et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 63119, 2004;Conzelmann, K., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004). Emboravírus Mononegaviraleses possuam diferentes hospedeiros e distintaspropriedades morfológicas e biológicas, possuem muitas característicascomuns, tais como organização genômica e elementos essenciais para seutípico modo de replicação e de expressão de gene, ilustrando que têmoriginado de um ancestral comum. São vírus envelopados que se replicam noscitoplasmas da célula e produzem mRNAs que não são editados.

Um vírus Mononegavirales consiste de duas unidadesfuncionais maiores, um complexo de ribonucleoproteína (RNP) e umenvelope. As seqüências de genoma completas para vírus representativos dosgêneros de todas as famílias mencionadas acima têm sido determinadas. Osgenomas variam em tamanho de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de19.000 e contêm de 5 a 10 genes. A estrutura e a organização dos genomasdos vírus MV são muito similares e são governadas por seu modo particularde expressão de gene. Todos os genomas de vírus MV compreendem trêsgenes de núcleo codificadores: uma nucleoproteína (N ou NP), umafosfoproteína (P) e uma RNA-polimerase dependente de RNA (L). Oenvelope viral é composto de uma proteína de matriz (M) e uma ou maisglicoproteínas de transmembrana (e.g. proteínas G, HN e F) quedesempenham um papel em montagem/germinação de vírus bem como nafixação do vírus em célula e/ou entrada do vírus na célula. Dependendo dogênero o repertório de proteínas é estendido pelas proteínas acessórias queexibem certas funções regulatórias específicas em transcrição e replicação devírus ou que estão envolvidas em reações de hospedeiro - vírus (e.g. proteínasC, V e NS). A ordem do gene de vírus MV está elevadamente conservadacom os genes de núcleo N e P, na ou próxima da terminação 3' e com o genegrande (L) na posição distai 5'. OM, os genes de glicoproteína de superfície,bem como os outros genes acessórios, estão localizados entre os genes Ν, P eL.

No complexo RNP, o RNA genômico ou antigenômico está firmemente encapsidado com a proteína N e está associado com a RNA-polimerase dependente de RNA que consiste da proteína L e P. Após infecçãode uma célula, o complexo RNP, mas não o genoma de RNA nu, serve comoum modelo para duas funções de síntese de RNA distintas, i.e., transcrição demRNAs subgenômicos e replicação de RNA genômico de comprimento total.

Todos os genes serialmente arranjados estão separados pordenominadas estruturas "de junção de gene". Uma junção de genecompreende uma seqüência de "final de gene" (GE) conservada, uma "regiãointergênica" (IGR) não-transcrita e uma seqüência de "início de gene" (GS)conservada. Estas seqüências são tanto suficientes quanto necessárias para a transcrição de gene. Durante a transcrição cada gene é seqüencialmentetranscrito em mRNA pela viral RNA-polimerase dependente de RNA queinicia o processo de transcrição na extremidade 3' do RNA genômico naprimeira seqüência GS. Em cada junção de gene transcrição é interrompidacomo um resultado do desengatamento da RNA polimerase na seqüência GE. Reinicio da transcrição ocorre na subseqüente seqüência GS, embora comuma eficiência reduzida. Como um resultado deste processo interrompido,também chamado de um processo de "interrupção-iniciação", atenuação datranscrição ocorre em cada junção de gene como um resultado do qual genesproximais 3' em um genoma de vírus MV são transcritos mais abundantemente do que os genes a jusantes sucessivos. A forma modular detranscrição de genes de vírus MV na qual cada gene é parte de um cistronseparado ou de uma unidade de transcrição separada torna estes vírusextremamente adequados para a inserção e a expressão de genes estranhos.Cada unidade de transcrição em um genoma de vírus MV compreende osseguintes elementos: 3'-GS-matriz de leitura aberta (ORF)-GE-5\

Nas terminações genômicas -3'- e -5' todos os genomas devírus MV possuem uma região não-transcrita curta chamada "líder" (cerca de40-50 nt) e "reboque" (cerca de 20-600 nt), respectivamente. As seqüênciaslíder e reboque são seqüências essenciais que controlam a replicação de RNAgenômico A, encapsidação e empacotamento virais.

Tecnologia de genética reversa e resgate de vírus MVinfeccioso têm tornado possível a manipulação de seu genoma de RNAatravés de sua cópia de cDNA. O complexo de iniciação de replicaçãomínima requerido para sintetizar RNA viral é o complexo RNP. Vírus MVinfeccioso pode ser resgatado por co-expressão intracelular de RNAs(anti)genômicos e as proteínas de suporte apropriadas de plasmídeosacionados por (T7) RNA polimerase. Desde o relatório inicial em 1994 deSchnell et al., 1994 (supra), recuperação confiável de muitas espécies de vírusMV tem sido alcançada baseado no protocolo original (ou suas ligeirasvariações).

Doença de Newcastle e gripe aviária são doenças importantesde aves domésticas, que podem causar perdas econômicas severas na indústriade aves domésticas em todo o mundo. O vírus da doença de Newcastle é umvírus de RNA de fita negativa, não-segmentada dentro da ordem de MV. Ogenoma, que é de cerca de 15 kb em comprimento, contém seis genes quecodificam a nucleoproteína (NP), fosfoproteína e proteína V (P/V), proteínade matriz (M), proteína de fusão (F), proteína hemaglutinina-neuraminidase(HN) e RNA-polimerase dependente de RNA ou proteína grande (L). Osgenes NDV estão arranjados seqüencialmente na ordem 3'-NP-P-M-F-HN-L-5', e estão separados por regiões intergênicas de comprimento diferente.Todos os genes são precedidos por uma seqüência de início de gene (GS) queé seguida por uma região não-codificadora, a matriz de leitura abertacodificadora das proteínas de NDV, uma segunda região não-codificadora e aseqüência de final de gene (GE). O comprimento do genoma de NDV é ummúltiplo de seus que tem que ser considerado para a introdução de genesestranhos.

Gripe aviária (AI) é uma doença de ave domésticacaracterizada por sinais respiratórios suaves a doença severa com mortalidadealta. O agente causador é um vírus de gripe aviária A (AIV) pertencendo àfamília Orthomyxoviridae. AIV contém oito segmentos de RNA genômico depolaridade negativa que codificam 10 proteínas. Baseado na antigenicidadedas glicoproteínas de superfície hemaglutinina (HA) e neuraminidase (N),vírus AI são de subtipo. Até agora, são conhecidos 16 subtipos dehemaglutinina (H1 - H16) e nove subtipos de neuraminidase (NI - N9).Anticorpos para HeN são importantes na resposta imune humoral e inibeminfecção ou previnem doença.

Vírus da doença de Newcastle e da gripe aviária podem seragrupados em dois patótipos distintos de acordo com sua virulência. Sintomascausados por AIV patogênico baixo AIV (LPAI) ou NDV lentogênico sãoconsiderados de relevância menor. Em contraste, gripe aviária elevadamentepatogênica (HPAI) e doença de Newcastle causada por vírus virulentoselevados (NDV: cepas mesogênicas e velogênicas) são doenças notificáveis.

Embora vacinação rotineira contra NDV com cepas de NDVlentogênicas seja realizada para proteger galinha contra cepas de NDVelevadamente virulentas, vacinação contra HPAI não é realizada na maioriados países, porque HPAI é controlada por uma estratégia de erradicação.Contudo, vacinação pode ser usada como uma estratégia para minimizarperdas e reduzir a incidência de doença. Imunidade induzida por vacinas éespecífica para subtipo, o que significa que uma vacina de subtipo H5 podeproteger contra AIV H5 mas não contra outros subtipos H. Normalmente,replicação do vírus da gripe é restrita aos pulmões porque hemaglutinina devírus de LPAI pode ser clivada apenas por triptase Clara, a serina proteaserestrita aos pulmões. Até agora, todos os vírus de HPAI têm sido dos subtiposH5 e H7. Estes vírus de HPAI contêm múltiplos aminoácidos básicos no sítiode clivagem H de modo que ela pode ser clivada por enzimas semelhantes àsubtilisina e furina ubíquas nas subunidades HAl e HA2. Tais vírus portantopodem crescer em outros órgãos.

Vacinas de subtipos H5 e H7 podem proporcionar proteção degalinhas e perus contra sinais clínicos e morte após infecção com HPAI. Emadição às vacinas de AIV inteiro baseadas em óleo convencionais, tem sidomostrado experimentalmente que as vacinas de vírus vetor, proteína desubunidade e DNA são efetivas para imunização contra AI. Desde o adventode genética reversa para vírus diferentes a geração de vírus recombinantespara uso como vetores de vacina é uma aplicação importante. Vírus de RNAde fita negativa recombinantes diferentes expressando proteínas estranhas têmsido construídos. Também, a hemaglutinina de AIV foi inserida em vírusvetores diferentes como o vírus da laringotraqueite infecciosa (ILTV)(Luschow et al., Vaccine 19, 4249-59, 2001), vírus da Peste Bovina (Walsh etal., J. Virol. 74, 10165-75, 2000) e vírus da estomatite vesicular (VSV)(Roberts et al, J. Virol. 247, 4704-11, 1998).

Vírus da Peste Bovina também foi usado como um vírus vetorpara a expressão da proteína do capsídeo VPl do vírus da doença da boca-e-pata (Baron et al, 1999, J. of Gen. Virol, vol. 80, p. 2031-2039).

Tao et al. (1998, J. of Viral, vol. 72, p. 2955-2961) descrevema construção de um vírus da parainfluenza de humano (hPIV) quimérico detipo 3, no qual os genes HN e F de hPIV tipo 1 foram usados para umasubstituição de (não uma adição em) genes HN e F de hPIV tipo 3 endógenos.

Também NDV foi usado para a expressão de hemaglutinina deAIV. O gene de hemaglutinina de gripe A/WSN/33 foi inserido entre os genesP e M da cepa NDV Hitchner BL Este recombinante protegeu camundongoscontra infecção letal embora houvesse uma perda de peso detectável emcamundongos que se recuperaram totalmente dentro de 10 dias Nakaya et al.(J. Virol. 75, 11868-73, 2001). Um outro NDV recombinante com o mesmosítio de inserção para o gene estranho expressou a H7 de um LPAI masapenas 40 % das galinhas vacinadas foram protegidas de ambos HPAI e NDVvelogênicos (Swayne et al., Avian Dis. 47, 104750, 2003).

Estas publicações contudo não descrevem quaisquer efeitosvantajosos das denominadas regiões não-codificadoras de genes de MVendógenos sobre a expressão de genes estranhos adicionais no genoma de umvetor de MV.

Um objetivo desta invenção é proporcionar um vetor de vírusMV recombinante que exibe um nível de expressão mais alto de uma proteínacodificada por um gene estranho inserido no genoma do vírus vetor e/ou quemostra uma imunogenicidade mais forte do que a de vetores de vírus MVexistentes.

Os presentes inventores têm verificado que este objetivo podeser alcançado por um vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom a invenção. Portanto, a presente invenção proporciona um vetor de vírusMononegavirales recombinante hospedando uma unidade de transcriçãoadicional compreendendo um gene estranho operativamente ligado com umaseqüência de início de gene (GS) de vírus Mononegavirales a montante e umaseqüência de final de gene (GE) de vírus Mononegavirales a jusante,caracterizado pelo fato de que entre a seqüência GS e um códon de iniciaçãodo gene estranho e entre um códon de terminação do gene estranho e aseqüência GE, uma região não-codificadora 3' e uma região não-codificadora5' (senso de genoma) de um gene de vírus Mononegavirales estão localizadas,respectivamente.

E notado que as indicações aqui da polaridade das fitas deácido nucleico e no restante do texto são dadas no senso de genoma (-),exceto no contexto de seqüências de cDNA e mRNA.Tem sido verificado que a presença das regiões não-codificadoras 3' e 5' de um gene de vírus MV em uma unidade de transcriçãocompreendendo um gene estranho inserido no genoma de um vírus MVpossui um efeito positivo sobre a transcrição e/ou expressão do gene estranho.

É mostrado na Figura 3 que engenharia das regiões não-codificadoras de umgene de vírus MV entre uma seqüência GS e um gene de hemaglutinina (HA)de vírus da gripe aviária (AIV) e entre o gene AIV HA e uma seqüência GEaumenta a quantidade de HA mRNA sintetizado por um vetor de vírus MVhospedando aquele gene AIV HA. Um efeito positivo também é conservadoem nível de expressão de proteína: comparação dos vetores de vírus MVapenas mostrou uma coloração imunológica intensa com anti-soro específicopara AIV HA no caso do vetor de vírus MV hospedando o gene estranho AIVHA foi flanqueado pelas regiões não-codificadoras (Figura 4). Portanto, temsido verificado que, embora os inventores não desejem se ligar a qualquerteoria ou modelo que pode explicar estas observações, a presença de regiõesnão-codificadoras de vírus MV flanqueando um gene estranho, possui umefeito positivo sobre o desempenho do vetor de vírus MV resultante.

Um gene estranho é uma molécula de polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo ou uma proteína e que não está presente em naturezano genoma do vírus MV recipiente.

Como já descrito em detalhe acima, uma característica comumda organização genômica de vírus MV é sua forma modular de transcrição naqual unidades de transcrição serialmente arranjadas são sucessivamentetranscritas. Em um vírus MV de tipo selvagem os genes transcritos sãoflanqueados (i) em sua extremidade 3' com uma seqüência GS e (ii) em suaextremidade 5' com uma seqüência de nucleotídeos também designada na artecomo "região não-codificadora" e uma seqüência GE. Portanto, o termo"região não-codificadora" (3' ou 5') como aqui usado define uma seqüênciade nucleotídeos que está localizada a montante (3') ou a jusante (5') de umgene natural de um vírus MV e que abarca a região entre a seqüência GS e ocódon de iniciação (ATG) do vírus MV e a região entre o códon determinação (TAA, TAG ou TGA) do gene do vírus MV e a seqüência GE,respectivamente. As regiões não-codificadoras aqui usadas são derivadas deum gene do mesmo vírus como o vírus vetor (i.e. as regiões não-codificadorassão homólogas ao vetor de vírus MV).

Informação detalhada da organização genômica de vírus MV éconhecida na arte, incluindo as seqüências de nucleotídeos dos vários genesde vírus MV e suas seqüências de controle de transcrição (GS e GE) e asseqüências não-codificadoras que flanqueiam os genes. Tal formação está, porexemplo, disponível no banco de dados do National Center for BiotechnologyInformation (NCBI), e.g. via sua página da web na internet; veja Tabelas 2 e

3)·

As seqüências não-codificadoras que são preferivelmenteusadas nesta invenção são derivadas de genes de vírus MV naturais, massubstituição de um ou mais nucleotídeos em uma região não-codificadoranatural também é considerada para estar dentro da invenção Em particular,são contempladas substituições de nucleotídeo que estão localizadasimediatamente a montante ou a jusante do códon de iniciação / terminação dogene estranho, respectivamente, e resultam da introdução de sítios declivagem de enzima de restrição artificiais que permitem a manipulaçãogenética destas regiões.

Em um vetor de vírus MV recombinante preferido de acordocom a presente invenção as regiões não-codificadoras de um gene codificadorde uma proteína de envelope de vírus MV, em particular uma proteína M, G,F ou HN, ou uma proteína RNP, em particular, uma proteína Ν, P ou L.

Em um vírus MV recombinante particularmente preferido deacordo com a invenção as regiões não-codificadoras são de um genecodificador de uma proteína F ou HN.Seqüências de nucleotídeos específicas de regiões não-codificadoras a serem usadas em um vetor de vírus MV recombinante deacordo com a invenção são apresentadas na Tabela 3.

Tabela 2: Informação de genoma e de vetor em vírus Mononegavirales

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As seqüências GS e GE a serem usadas nesta invenção comoas seqüências de controle de transcrição são preferivelmente aquelasderivadas dos genes naturais dos vírus MV. Acredita-se que estas seqüênciasmodulam a atividade da RNA polimerase durante o processo de transcrição,em particular no processo de iniciação de transcrição e modificação deextremidade 5' de mRNA e no controle de terminação e poliadenilação deextremidade 3' de transcrição. Para cada um dos vírus MV, o início de cadagene é marcado por uma seqüência de cerca de 10 nucleotídeos. Enquanto queem algumas espécies de vírus MV as seqüências GS são as mesmas para cadagene, as seqüências GS no genoma de outras espécies de vírus MV podem exibir diferenças sutis.Em vista de sua função comum em terminação de transcrição eformação de cauda poli-A de extremidade 3' de mRNA, as seqüências GE emvírus MV compartilham características de seqüência comuns. Uma seqüênciaGE típica compreende uma região-U de entre 4 e 8 nucleotídeos emcomprimento. Ademais, há uma conservação forte de um resíduo-Cdiretamente a montante da região-U e que é precedida por um segmento denucleotídeos que é rico em A/U. Em várias seqüências GE os 4 nucleotídeosdiretamente a montante da região-U são compostos de 3'-AUUC-5'.

As seqüências de controle de transcrição que definem asbordas de gene ou junções de gene dos genes de vírus MV têm sidoidentificadas para muitos genes de vírus MV por comparação das seqüênciasde nucleotídeos no modelo genômico e as seqüências de nucleotídeospresentes nas terminações de mRNA. Em adição muitos estudos têmidentificado as seqüências de consenso GS e GE que são requeridas paraexpressão de gene eficiente. Características gerais e exemplos específicos deseqüências GS e GE podem ser derivadas da informação do banco de dadosde seqüências de NCBI (veja Tabela 2 para números de acesso em NCBI) etambém são revistas por Neumann et al.(J. Virol. 83, 2635-2662, 2002), eWhelan et al. (Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 63-119, 2004).

Seqüências GS e GE especificamente preferidas a seremusadas em um vetor de vírus MV recombinante de acordo com a invenção sãolistadas em Tabela 3, embora seja reconhecido que uma borda mais precisaentre as seqüências GS, NCR e GE nem sempre pode ser determinada. Estainformação de seqüências é descrita no banco de dados NCBI (veja no. deacesso em Tabela 2). Para NDV, referência é feita ao número de acesso emEMBL de Yl8898, para RV ao número de acesso em GenBank de M31046.Tabela 3: Informação de seqüência de junção de gene de vários genes deMV (senso +)

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Em um vetor de vírus MV recombinante preferido da invenção as seqüênciasGS5 GE e as regiões não-codificadoras derivadas do mesmo gene de vírusMV.

Métodos para a preparação de um vetor de vírus MVrecombinante hospedando uma unidade de transcrição adicionalcompreendendo um gene estranho são bem conhecidos na arte. Por exemplo,Tabela 2 refere-se aos documentos que descrevem a preparação de tais vírusvetores recombinantes para várias espécies de vírus MV. Em princípio, ométodo usado na presente invenção é o mesmo que aquele na arte anterior,exceto que o gene estranho a ser inserido no genoma de vírus MV éflanqueado pelas regiões não-codificadoras 3' e 5' apropriadas, como definidoacima.

Em um método geral de acordo com a invenção o vetor devírus MV recombinante é preparado pela inserção de uma molécula de ácidonucleico isolada compreendendo (i) um gene estranho flanqueado pelasregiões não-codificadoras 3' e 5' como definidas acima e (ii) as seqüências decontrole de transcrição apropriadas, no genoma do vírus MV, de tal modo queno vetor de vírus MV resultante o gene estranho seja tanto precedido quantoseguido por uma junção de gene de vírus MV, em particular por umfragmento de seqüência de nucleotídeos genômica compreendendo oselementos GE-GR-GS. A presença de elementos a montante e a jusantegarante a tradução apropriada não apenas dos genes estranhos inseridos, mastambém dos genes de vírus MV homólogos que estão localizados a montantee a jusante do gene estranho inserido.

Mais em particular, neste método a molécula de ácido nucleicoisolada e o genoma do vírus MV são usados em sua forma de cDNA (senso+). Isto permite as fáceis manipulação e inserção das moléculas de ácidonucleico desejadas no genoma viral.

Em geral, várias partes do genoma poderiam ser usadas para ainserção do gene estranho, entre dois genes, i.e. em regiões intergênicas(IGR), regiões não-codificadoras 3' ou 5'de um gene bem como extremidadesproximal-promotor 3' (antes dos genes N/NP) ou distai 5' (após os genes L)de um genoma.

O gene estranho poderia ser vantajosamente inserido antes dogene N/NP, entre NP-P5 P-M, M-G/F, G/F-HN, HN-L e após o gene L.

O modo mais simples é o uso de uma seqüência dereconhecimento de enzima de restrição (RE) existente em um destes sítiospelo corte com a enzima e introdução de um cassete de transcriçãoapropriado. Visto que seqüências de reconhecimento de enzima de restriçãonaturalmente existentes nem sempre estão localizadas na localizaçãodesejada, os sítios de reconhecimento de RE poderiam ser introduzidos nogenoma convencionalmente por mutagênese sítio-direcionada ou por PCR.

Exemplos de IGRs adequadas para inserção do gene estranho podem serencontrados em Tabela 3.

A composição do cassete de transcrição a ser inserido dependedo sítio de inserção. Por exemplo, no caso de um cassete de transcrição serinserido em uma IGR o cassete pode compreender os seguintes elementos: 3'-sítio de reconhecimento de RE-GS-região não-codificadora-ORF (de geneestranho)-região não-codificadora-GE-sítio de reconhecimento de RE - 5'.Alternativamente, no caso de um cassete de transcrição serintroduzido em uma região não-codificadora 5' de um gene de vírus MVnatural o cassete pode ser composto de: 3' - sítio de reconhecimento de RE-GE-IGR-GS-região não-codificadora-ORF (de gene estranho)-região de nãocodificação-sítio de reconhecimento de RE - 5'.

Similarmente, no caso de um cassete de transcrição serintroduzido em uma região não-codificadora 3' de um gene de vírus MVnatural o cassete de expressão pode ser composto de: 3' - sítio dereconhecimento de RE-região não-codificadora-ORF (de gene estranho)-região não-codificadora-GE-IGR-GS-sítio de reconhecimento de RE - 5'.

A preparação de tais cassetes de transcrição e a sua inserçãoem um genoma de vírus MV apenas envolvem técnicas de biologia molecularrotineiras, tais como exemplificadas nas referências de literatura listadas emTabela 2, e nos presentes Exemplos. Em particular, técnicas de taismutagêneses sítio-direcionada e por PCR podem ser usadas para estepropósito (Peeters et al., 1999, supra; Current Protocols in Molecular Biology,eds.: F. M. Ausubel et al., Wiley N.Y., 1995 edition, páginas 8.5.1.-8.5.9; eKunkel et al., Methods in Enzymology Vol. 154, 376-382, 1987).

Mais em particular, um vetor de vírus MV recombinante deacordo com a presente invenção pode ser preparado por meio do método de"genética reversa" bem estabelecido que permite a modificação genética devírus de RNA de fita negativa, não-segmentada da ordem MV (revisto porexemplo por Conzelmann, K.K., Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004; e Walpita et al., FEMS Microbiol. Letters 244, 9-18, 2005).

Neste método, uma célula apropriada é co-transfectada por umvetor compreendendo uma molécula de cDNA compreendendo umaseqüência de nucleotídeos que codifica um genoma de comprimento total, ou,preferivelmente, um antigenoma (senso positivo) de um vírus MV, e um oumais vetores compreendendo as moléculas de cDNA compreendendoseqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas de suporte requeridas,sob condições suficientes para permitir a transcrição e a co-expressão do(anti)genoma de MV e proteínas de suporte e a produção de um vetor MVrecombinante. Neste método, a citada molécula de ácido nucleicocodificadora de (anti)genoma de vírus MV de comprimento total compreendeuma unidade de transcrição adicional como definida acima.

Com vetor quer-se dar um significado de um replicon, talcomo plasmídeo, fago ou cosmídeo, no qual outro segmento de DNA pode serligado de modo a realizar a replicação do segmento de DNA ligado e suastranscrição e/ou expressão em uma célula transfectada com este vetor.

Preferivelmente, o vetor para a transcrição do genoma decomprimento total é um plasmídeo que compreende uma seqüência de cDNAcodificadora do (anti)genoma do vírus MV, flanqueada pelo promotor de T7polimerase em sua extremidade 5' e uma seqüência de ribozima (hepatitedelta) em sua extremidade 3', embora um promotor de T3 ou SP6 RNApolimerase também possa ser usado.

Para a expressão intracelular das proteínas de suporteapropriadas é feito uso, preferivelmente, de plasmídeos compreendendo aseqüência de cDNA codificadora destas proteínas, sob o controle deseqüências de controle de expressão apropriadas, e.g. um promotor de T7polimerase.

Em um método particularmente preferido a preparação de umvetor de vírus MV recombinante de acordo com a presente invenção, sãousados plasmídeos de expressão que codificam as proteínas N (ou NP), PeL do vírus MV.

As quantidades ou razões de plasmídeos de suportetransfectados a serem usados nesta tecnologia genética reversa cobrem umafaixa ampla. Razões para os plasmídeos de suporte N:P:L podem variar decerca de 20:10:1 a 1:1:2 e protocolos de transfecção eficientes para cada vírussão conhecidos na arte.

Uma cópia exata do RNA genômico é preparada em umacélula transfectada pela ação combinada do promotor de T7 RNA polimerasee da seqüência de ribozima, e este RNA é subseqüentemente empacotado ereplicado pelas proteínas de suporte virais fornecidas pelos plasmídeos deexpressão co-transfectados.

E preferido que uma enzima T7 polimerase seja proporcionadapor um vírus de vacínia recombinante que infecta a célula transfectada, emparticular pelo vírus de vacínia vTF73, ainda também outros vetores devaríola recombinantes, tal como o vírus de epitelioma contagioso, e.g.fpEFLT7pol, ou outros vetores virais podem ser usados para a expressão deT7 RNA polimerase.

Separação do vírus resgatado do vírus da vacínia pode serfacilmente realizada por técnicas físicas simples, tal como filtração. Pararesgate do vírus Sendai ou NDV, o resgate pode ser realizado por inoculaçãodo sobrenadante de células transfectadas em ovos embrionados.

Em uma modalidade ainda mais preferida linhagens de célularecombinante são usadas para a transfecção dos vetores de transcrição eexpressão que constitutivamente expressam a (T7) RNA polimerase e/ou umaou mais das proteínas de suporte requeridas.

Por exemplo, resgate do vírus do Sarampo pode ser realizadoem uma linhagem de célula de rim de embrião humano, 293-3-46, queexpressa ambos a T7 RNA polimerase e as proteínas de suporte N e P dovírus do Sarampo (Radecke et al., EMBO J. 14, 5773-5784, 1995). Outralinhagem de célula muito útil que pode ser usada vantajosamente na presenteinvenção é baseada nas células BSR expressando a T7 RNA polimerase, i.e.linhagem celular BSR-T7/5 (Buchholz et al., J. Virol. 73, 251-259, 1999).

Ademais, informação mais detalhada referente à tecnologia degenética reversa a ser usada para a preparação de um vírus MV de acordo coma presente invenção é descrita na revisão por Conzelmann, K.K. (supra) eExemplo 1.

A capacidade de vetores de vírus MV recombinantes deestavelmente expressarem genes estranhos tem resultado no desenvolvimentode vetores para ambas as aplicações profiláticas e terapêuticas.

Em um vetor de vírus MV recombinante de acordo com apresente invenção o gene estranho pode variar dependendo da espécie devetor de vírus MV específica e da aplicação do vírus vetor.

O gene estranho pode codificar um antígeno de um (outro)patógeno microbiano (e.g., um vírus, uma bactéria de parasita), especialmenteo gene estranho codifica um antígeno de um patógeno que é capaz de produziruma resposta imune protetora.

Por exemplo, seqüências de gene heterólogas que podem serinseridas nos vetores de vírus da invenção incluem, mas não são limitadas aosgenes de glicoproteína de vírus da gripe, em particular, genes dehemaglutininas H5 e H7 do vírus da gripa aviária, genes derivados de Vírusda Doença Bursal Infecciosa (IBDV), especificamente VP2 de (IBDV), genesderivados de Vírus da Bronquite Infecciosa (IBV), vírus da leucemia felina,vírus da cinomose canina, vírus da anemia infecciosa eqüina, vírus da raiva,organismo ehrlichia, em particular Ehrlichia canis, vírus sinciciaisrespiratórios, vírus da parainfluenza, vírus do sarampo e metapneumovírus dehumano.

Alternativamente, o gene estranho pode codificar um imune-modulador polipeptídeo que é capaz de intensificar ou modular a respostaimune à infecção de vírus, por exemplo por co-expressão de uma citocina talcomo uma interleucina (e.g. IL-2, IL-12, lFN-γ, TNF-α ou GM-CSF).

A ordem dos vírus MV inclui ambos os vírus que são capazesde se replicarem em humanos e animais, ou em ambos (e.g. vírus da raiva evírus da doença de Newcastle). Portanto, o gene estranho pode serselecionado de uma ampla variedade de patógenos microbianos veterinários ehumanos.

Embora todos os vírus possam ser usados como um vírus vetorna presente invenção, em uma modalidade preferida da invenção o vetor devírus MV recombinante é um vírus da família Rhabdoviridae, preferivelmentedo gênero Lyssavirus ou Novirhabdovirus, mais preferivelmente da espéciedo vírus da raiva ou IHNV, respectivamente.

Em uma modalidade também preferida o vírus MVrecombinante é um vírus da família Paramyxoviridae, preferivelmente dogênero Respovirus, em particular a espécie hPIV3 ou bPIV3; Morbillivirus,em particular a espécie CDV; Pneumovirus, em particular a espécie RV; eAvulavirus, em particular a espécie NDV.

Em uma maneira particularmente preferida da presenteinvenção é proporcionado um vetor de vírus MV recombinante no qual ovírus é Vírus da doença de Newcastle (NDV). Como NDV é capaz de sereplicar em ambos humanos e animais, em particular aves domésticas, maisem particular, galinhas, um vetor NDV recombinante de acordo com ainvenção pode compreender um gene estranho que codifica um antígeno deum patógeno, em particular de um patógeno respiratório, ou um imune-modulador que é capaz de produzir uma resposta imune em humanos ouqualquer um destes animais.

Métodos de genética reversa para a manipulação genética deNDV têm sido descritos para NDV por Peeters et al. (J. Virology 73, 5 OOl-5009, 1999), Rõmer-Oberdõrfer et al. (J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999), ena revisão por Conzelmann, K.K. (supra). Ademais, também é sabido queNDV pode ser usado como um vetor para a expressão de genes estranhos, porexemplo, para a produção de uma resposta imune em animais infectados como vetor NDV (Nakaya et al., 2001, supra) e Swayne et al., Avian Dis. 47,1047-50, 2003).Um gene estranho pode ser vantajosamente introduzido em umgenoma de NDV em várias posições como descrito em geral para os vírusMV acima. Em particular, em um vetor NDV recombinante de acordo com ainvenção, um gene estranho (como parte de uma unidade de transcriçãoapropriada) pode ser inserido entre os seguintes genes NDV: NP-P, P-M, M-F, F-HN, HN-L e no locus proximal 3' e distai 5' (Zhao et al., 2003, supra;Nakaya et al., 2001, supra), preferivelmente nas regiões proximal 3', P-M, M-F e F-HN, a região F-HN sendo mais preferida.

Ademais, em um vetor NDV recombinante de acordo com apresente invenção as regiões não-codificadoras que flanqueiam o geneestranho podem ser derivadas de todos os genes de NDV naturalmenteocorrentes, em particular dos genes Ν, Ρ, M, F ou ΗΝ, o gene HN sendopreferido.

Em uma modalidade particular da invenção um vetor NDVrecombinante é aqui proporcionado no qual a unidade de transcrição adicionalestá localizada entre os genes F-HN e o gene estranho inserido é flanqueadopelas regiões não-codificadoras do gene NDV HN.

Mais especificamente, um vetor NDV é proporcionado no quala 3'- e 5'-NCR (e opcionalmente as seqüências GS e GE) possuem umaseqüência de nucleotídeos como mostrada nas SEQ ID NO: 1 e 2 ou 3 e 4.

Um vetor NDV recombinante de acordo com a presenteinvenção pode ser vantajosamente usado para induzir uma resposta imune emave doméstica, em particular galinhas, contra outros patógenos. Portanto, ovetor NDV recombinante, preferivelmente compreende um gene estranho quecodifica um antígeno protetor de um patógeno aviário, em particular de vírusda gripe, vírus da doença de Marek (MDV), vírus da laringotraqueíteinfecciosa (ILTV), vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus da doençabursal infecciosa (IBDV), vírus da anemia de galinha (CAV), reovírus,retrovírus aviário, adenovírus de ave, vírus da rinotraqueíte de peru (TRTV),Ε. coli, espécie Eimeria, Cryptosporidia, Mycoplasms tais como M.gallinarum, M. synoviae e M. meleagridis, Salmonella, Campylobacter,Ornithobacterium (ORT) ou Pasteurella sp.

Mais preferivelmente, o vetor NDV recombinante compreendeum gene estranho que codifica um antígeno de AIV, MDV, ILTV, IBV,TRTV, E. coli, ORT ou Mycoplasma.

Em particular, o vetor NDV recombinante mutantecompreende um gene de hemaglutinina (HA) de um vírus da gripe,preferivelmente de um vírus da gripe aviária (AIV), mais preferivelmente deum AVI elevadamente patogênico, em particular de AIV H5 ou H7.

Em princípio, o gene HA de todas as cepas de gripe (aviária)pode ser usado nesta invenção. As seqüências de nucleotídeos de muitosgenes HA têm sido descritas na arte e os genes HA relevantes podem serresgatados de bancos de dados de seqüências de ácido nucleico, tais como osbancos de dados GenBank ou EMBL.

O gene de hemaglutinina (HA) do subtipo H5N2 de AIVA/chicken/Italy/8/98 elevadamente patogênico pode ser vantajosamente usadocomo um gene estranho na presente invenção como descrito acima. O gene éreversamente transcrito, clonado no vetor de expressão eucariótico pcDNA3(Invitrogen), e seqüenciado (Lüschow et al., Vaccine, vol. J_9, p. 4249-4259,2001, e No. de Acesso no GenBank de AJ305306). Do plasmídeo deexpressão obtido pCD-HA5 o gene HA pode ser obtido por amplificação pelouso de iniciadores específicos que geram sítio de reconhecimento de REsartificial que permite a inserção do gene HA nas seqüências genômicas deNDV.

Em uma outra modalidade o gene HA do subtipo H7N1 deAIV A/chicken/Italy/445/99 elevadamente patogênico pode ser usado comoum gene estranho na presente invenção como descrito acima. O gene HA éreversamente transcrito, e amplificado por PCR. O produto de 1711 pb éclonado no vetor pUC 18 digerido por SmaI (Amersham) e seqüenciado (Veitset ai., J. Gen. Virol. 84, 3343-3352, 2003; e No. de Acesso no GenBank deAJ580353).

Em um vetor de vírus MV recombinante particularmentevantajoso de acordo com a presente invenção o vírus vetor MV é atenuado,isto é, o vírus vetor não é patogênico para o animal alvo ou exibe umaredução substancial de virulência comparado com o vírus de tipo selvagem.Muitos vírus MV aqui usados como vetores de vírus possuem um registro desegurança longo como vacinas atenuadas vivas tais como o vírus do sarampoe NDV, enquanto que outros vírus, tais como SeV e VSV são consideradosnão-patogênicos para humanos. Em adição, existem técnicas comerciais paraobter e triar vírus atenuados que mostram um potencial limitado deinfectividade ou replicação. Tais técnicas incluem passagem serial (fria) dovírus em um substrato heterólogo e mutagênese química.

Um vetor NDV recombinante de acordo com a invenção podeser derivado de qualquer cepa de vacina ND convencional. Exemplos de taiscepas de NDV adequadas presentes em vacinas ND comercialmentedisponíveis são: Clone-30®, La Sota, Hitchner BI, NDW, C2 e AV4; Clone-30® a cepa preferida.

Também tem sido verificado pelos presentes inventores queum vetor de vírus MV recombinante de acordo com a presente invenção écapaz de induzir uma resposta imune protetora em animais.

Portanto, em outra modalidade desta invenção é proporcionadauma vacina contra um patógeno microbiano que compreende um a vetor devírus MV recombinante como definido acima em uma forma viva ouinativada, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Uma vacina de acordo com a invenção pode ser preparada pormétodos convencionais tais como aqueles comumente usados para vacinas devírus MV inativado ou vivo comercialmente disponíveis.Resumidamente, um substrato suscetível é inoculado com ovetor de vírus MV recombinante e propagado até que o vírus replicado tenhao título desejado após o qual o material contendo o vírus é colhido.Subseqüentemente, o material colhido é formulado em uma preparaçãofarmacêutica com propriedades imunizantes.

Cada substrato que é capaz de suportar a replicação do vetorde vírus MV recombinante pode ser usado na presente invenção. Como umsubstrato células hospedeiras podem ser utilizadas de ambas as origensprocariótica e eucariótica, dependendo do vírus MV. Células hospedeirasapropriadas podem ser células de vertebrado, e.g. de primata. Exemplosapropriados são as linhagens de células humanas HEK, WI-38, MRC-5 ou H-239, a linhagem de célula simiana Vero, a linhagem de célula de roedor CHO,BHK, a linhagem de célula canina MDCK ou as linhagens de células aviáriasCEF ou CEK.

Um substrato particularmente adequado sobre o qual um vetorNDV recombinante de acordo com a presente invenção pode ser propagadorefere-se ao ovos embrionados SPF. Ovos embrionados podem ser inoculadoscom, por exemplo, 0,2 mL de fluido alantóico contendo NDV compreendendopelo menos 10 ' EID50 por ovo. Preferivelmente, ovos embrionados de 9- a11-dias de idade são inoculados com cerca de IO5'0 EID50 e subseqüentementeincubados a 37°C por 2-4 dias. Após 2-4 dias o produto de vírus ND pode sercolhido preferivelmente por coleta do fluido alantóico. O fluido pode serdepois centrifugado a 2,500 g seguido por filtração do sobrenadante atravésde um filtro (100 μm).

A vacina de acordo com a invenção compreende o vetor devírus MV recombinante juntamente com um diluente ou veículofarmaceuticamente aceitável costumeiramente usado para tais composições.

A vacina contendo o vírus vivo pode ser preparada ecomercializada na forma de uma suspensão ou em uma forma liofilizada.Veículos incluem estabilizadores, conservantes, e tampões. Diluentes incluemágua, tampão aquoso e polióis.

Em outro aspecto da presente invenção é proporcionada umavacina compreendendo o vetor de vírus MV recombinante em uma formainativada. As vantagens maiores de uma vacina inativada são sua segurança eos níveis altos de anticorpos protetores de duração longa que podem serinduzidos.

O objetivo da inativação dos vírus colhidos após a etapa depropagação é a eliminação da reprodução dos vírus. Em geral, isto pode seralcançado por meios físicos ou químicos bem conhecidos.

Se desejado, a vacina de acordo com a invenção pode conterum adjuvante. Exemplos de compostos e composições adequados comatividade adjuvante para este propósito são hidróxido de alumínio, fosfato dealumínio ou óxido de alumínio, emulsão de óleo-em-água ou de água-em-óleobaseada em, por exemplo um óleo mineral, tal como Bayol F® ou Marcol52® ou óleo vegetal tal como acetato de vitamina E, e saponinas. Aadministração de uma vacina de acordo com a invenção pode ser por qualqueruma das formas bem conhecidas e pode depender do tipo de vetor de vírus.Modos de administração adequados incluem vacinação parenteral, intranasal,oral e por borrifo.

Uma vacina de vetor NDV de acordo com a invenção épreferivelmente administrada por técnicas de aplicação em massa baratascomumente usadas para vacinação contra NDV. Para vacinação contra NDVestas técnicas incluem vacinação por borrifo e água potável.

A vacina de acordo com a invenção compreende uma dosagemefetiva do vetor de vírus MV recombinante com o componente ativo, i.e. umaquantidade de material de vírus MV imunizante que induzirá imunidade nasaves vacinadas contra desafio por um organismo microbiano virulento.

Imunidade é aqui definida como a indução de um nível mais alto significativode proteção em uma população de humanos ou de animais contra mortalidadee sintomas clínicos após vacinação comparada com um grupo não-vacinado.Em particular, a vacina de acordo com a invenção protege uma proporçãogrande de animais ou humanos vacinados contra a ocorrência de sintomasclínicos da doença e mortalidade.

Tipicamente, a vacina viva pode ser administrada em umadose de 10^2,0 -10^8,0 cultura de tecido/dose infecciosa para embrião (TC/EID50),preferivelmente em uma dose variando de 10^4,0-10^7,0 TC/EID^50. Vacinasinativadas podem conter o equivalente antigênico de 10^4,0-10^9,0 TC/EID50.

A invenção também inclui vacinas de combinaçãocompreendendo, em adição ao vetor de vírus MV recombinante de acordocom a invenção, uma cepa de vacina capaz de induzir proteção contra umoutro patógeno.EXEMPLOS

Exemplo 1: Geração de um vetor de vírus MV recombinante expressandoum gene HA de vírus da gripe aviária (NDV/AIVH5)

□ Vírus e células

NDV recombinante resgatado e o isolado de vírus da gripeA/chicken/Italy/8/98 foram propagados em ovos de galinha embrionados dedias de idade livres de patógeno (SPF). A cepa de NDV velogênica Herts33/56 e a vacina de NDV Clone 30 (Nobilis®) foram usados.

Células BSR-T7/5 estavelmente expressando a fago T7 RNApolimerase foram usadas para recuperar NDV infeccioso de cDNA.

□ Construção de cDNA codificador de RNA antigenômico de NDVcontendo o gene AIV H5

A numeração entre parênteses como aqui usada paraidentificar as posições de nucleotídeos no genoma de NDV e os resíduos deaminoácido nas proteínas de NDV é como descrita por Rõmer Oberdõrfer etal.(J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999, número de acesso em EMBL deYl8898). O plasmídeo pfINDV, expressando o RNA antigenômico decomprimento total de Clone 30 (Rõmer Oberdõrfer et al., supra) foi usadopara introduzir o gene AIV H5 que havia sido amplificado do plasmídeopCD-HA5 (Luschow et al., supra) por iniciadores específicos com sítios de restrição MluI artificiais (PH5F1: 5'- cta aaç_gçg taa aat gga gaa aat agt gc -3'(SEQ ID NO: 5) e PH5R1: 5'- tcg gac gcg ttt aaa tgc aaa ttc tgc act g -3'(SEQ ID NO: 6), sítios MluI estão sublinhados) para rNDV/AIVH5-A e comsítios NcoI ou AflII (PH5F2: 5'-cct tcc atg gag aaa ata gtg ctt c -3' (SEQ IDNO: 7) e PH5R2: 5'- cct cct taa gta taa ttg act caa tta aat gca aat tct gca ctgcaa tga tcc -3' (SEQ ID NO: 8), sítios de restrição estão sublinhados) pararNDV/AIVH5-B. A introdução de H5 no antigenoma de Clone 30 (Fig. 1 A)foi feita usando os sítios MluI como previamente descrito para a inserção deGFP (Engel-Herbert et al., J. Virol. Methods 108, 19-28, 2003).Resumidamente, para construção do plasmídeo de comprimento totalpfINDV/AIVH5-A a H5 ORF foi amplificada com iniciadores contendo sítiosMluI artificiais (veja acima) que foram usados para inserir a H5 ORF nocassete de gene mínimo entre os genes F e HN de NDV (Fig. 1 A).Construção do plasmídeo de comprimento total contendo o gene AIV H5 parageração de rNDV/AIVH5-B é dado em Figura 1B. Reações de mutagêneseforam feitas usando o kit de mutagênese sítio-direcionada Quik Change® IIXL (Stratagene). Para este fim, um plasmídeo pUC 18 (pUCNDVI) contendoo fragmento the NotI/BsiWI (nt 4953 - 8852) de genoma de Clone 30 e osseguintes iniciadores foram usados: MPl (5'- gac aac agt cct caa cca tgg accgcg CCg -3') (SEQ ID NO: 9) e MP2 (5'- ctg gct agt tga gtc aat tct taa gga gttgga aag atg gc -3') (SEQ ID NO: 10) para mutagênese A (Fig. 1B) resultandono plasmídeo pUCNDVla com sítios NcoI e AflII recém-criados (sítios derestrição em iniciadores estão sublinhados). Após digestão com NcoI e AflII aHN ORF de Clone 30 foi substituída pela AIV H5 ORF amplificada. Paramutagênese B para criar sítios SgfI e SnaBI na região intergênica do gene Lde pUCNDVH5 resultando em pUCNDV/AIVH5_lb (Fig. 1 B) iniciadoresMP3 (5'- caa aac age tca tgg tac gta ata cgg gta gga cat gg -3') (SEQ ID NO:11) e MP4 (5'- gta agt ggc aat gcg ate gea ggc aaa aca gct cat gg -3') (SEQ IDNO: 12) foram usados. Mutagênese C foi feita com MP3 e MP5 (5'- gaa aaaact acc ggc gat cgc tga cca aag gac gat ata cgg g -3') (SEQ ID NO: 13)resultando em plasmídeo pUCNDV_lc para obter sítios SgfI e SnaBI queforam usados para a introdução do gene Clone 30 HN na região intergênica nafrente do gene L no plasmídeo pUCNDVH5_lb. Finalmente, o fragmentoNotI/BsiWI de pflNDV-1 foi substituído pelo fragmento NotI/BsiWI depUCNDVH5_lc (Fig. 1 B). Os comprimentos dos genomas de comprimentototal gerados novos representam um múltiplo de seis (16938 nt pararNDV/AIVH5-A e 17196 nt para rNDV/AIVH5-B).

□ Transfecção e propagação de vírus

Experimentos de transfecção, propagação de vírus econfirmação da recuperação de vírus infeccioso foram realizados comodescrito previamente (Rõmer-Oberdõrfer et al., supra; Engel-Herbert et al.,supra). A única diferença foi que uma quantidade total de DNA de 20 μg (10μg de genoma de comprimento total contendo plasmídeo, 6 μg de pCiteNP, 2μg de pCiteP e 2 μg de pCiteL) foi usada para transfecção.

□ Resultados

A matriz de leitura aberta de AIV H5 foi inserida entre osgenes F e HN do plasmídeo previamente descrito pflNDV (Rõmer-Oberdõrferet al., supra). Para este fim, a AIV H5 ORF do islolado de AIVA/chicken/Italy/8/9 8 (H5N2) foi amplificada do plasmídeo pCD-HA5(Luschow et al., supra) por iniciadores específicos com sítios de restriçãoMluI que foram usados para inserção da AIV H5 ORF no sítio de restriçãoMluI singular de pflNDVoligol; (Engel-Herbert et al., supra) resultando emplasmídeo pflNDV/AIVH5-A (Fig. 1 A). Neste construto a AIV H5 ORF foiflanqueada pelas seqüências de final de gene (GE) e de início de gene (GS)artificiais na região intergênica entre os genes F e HN de NDV. Paraconstrução de plasmídeo de comprimento total pfNDV/AIVH5-B a HN ORPde plasmídeo pUCNDVIa foi substituída pela H5 ORF amplificada como umfragmento NcoI/AflII- (Fig. 1B). No plasmídeo resultante pUCNDVH5 sítiosde restrição SgfI e SnaBI foram criados na região intergênica do gene H5resultando em plasmídeo pUCNDVH5_lb (Fig. 1 B). Os sítios de restriçãocriados SgfI e SnaBI foram usados para introduzir o gene HN do plasmídeopUCNDVlc, no qual o gene HN também estava flanqueado pelos sítios derestrição SgfI e SnaBI (Fig. 1 B). Finalmente, o plasmídeo resultantepUCNDVH5_l c foi usado para substituir o fragmento NotI/BsWI de pflNDV(Fig. 1 Β). O pflNDV/AIVH5 -B construído difere do plasmídeopflNDV/AIVH5-A porque as regiões não-codificadoras de NDV HN foramadicionalmente inseridas entre os elementos de controle de transcrição (GS,GE) e a H5 ORF.

NDV recombinantes rNDV/AIVH5-A e rNDV/AIVH5-Bforam recuperados de células BSR-T7/5 transfectadas com o respectivoscDNA de comprimento total e os plasmídeos de suporte como previamentedescrito (Rõmer-Oberdõrfer et al., supra; Engel-Herbert et al., supra). Pararecuperação de vírus os sobrenadantes de transcrição foram injetados nascavidades alantóicas de ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade eincubados por 5 dias. O fluido alantóico foi colhido e analisado para apresença de vírus pelo teste de hemaglutininação ou de imunofluorescênciaindireta (IF). Fluidos alantóicos contendo vírus foram usados para umasegunda passagem em ovo para propagação de vírus adicional. A presença dogene H5 inserido nos genomas virais de rNDV/AIVH5-A e rNDV/AIVH5-Bfoi confirmada por PCR de transcrição reversa e seqüenciamento (dados nãomostrados). Figuras 2A e 2B mostram a seqüência de nucleotídeos de regiõesflanqueando a HN ORF em NDV e da H5 ORF no vetor NDV.

Exemplo 2: Caracterização in vitro do vetor NDV/AIVH5□ Análise de RNA

Células CEF foram infectadas com NDV Clone 30,rNDWAIVH5- A, rNDV/AIVH5-B e AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) emuma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 por célula e incubadas por 8 h a37°C. RNA total de células infectadas e não-infectadas foi preparado,separado em géis de agarose desnaturantes e hibridizado com cRNA'sradiomarcados. Os plasmídeos pCD-HA5 e pCD-NDVHN que contêm amatriz de leitura aberta de AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) H5 e NDVClone 30 HN, respectivamente, foram usados para transcrição in vitro detRNA marcado com P (SP6/T7 Transcription kit, Roche).

Para verificar a transcrição do gene AIV H5 inserido emrNDV/AIVH5-A e -B análises de Northern blot foram realizadas com RNAtotal de fibroblastos de embrião de galinha primários infectados comNDV/AIVH5 recombinante. Preparação de RNA de células infectadas comNDV Clone 30 e AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) foi usada como controle.Transcrição do gene AIV H5 inserido foi detectada para rNDV/AIVH5-Abem como para NDV/AIVH5-B com tRNA de anti-senso específico para gene(Fig. 3). Pode ser observado que o transcrito AIV-H5B é estendido por cercade 81 nt e está mais abundantemente presente do que o transcrito AIV H5A.

□ Análises de Western blot

Células CEK foram infectadas com NDV Clone 30,rND V/AI VH5 - A, rNDV/AIVH5-B e AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) eincubadas por 20 h a 37°C. Lisados de células infectadas e de células decontrole não-infectadas foram separados por SDS-PAGE (ca. 104 células porpista), e transferidos para filtros de nitrocelulose (Trans-Blot® SD cell, Bio-Rad). Blots foram incubados com um anti-soro policlonal de coelho contraNDV, ou um anti-soro policlonal de galinha contra AIV do subtipo H5 emdiluições de 1: 200.00 e 1: 2.500, respectivamente. Ligação de anticorpossecundários específicos para espécie conjugados com peroxidase foi detectadapor quimioluminescência usando SuperSignal® West Pico ChemiluminescentSubstrate (Pierce) sobre filmes de raios-X (Hyperfilm® MP, Amersham).

Nas análises de Western blot a proteína H5 foi detectávelapenas em células infectadas com rNDV/AIVH5-B. O anti-soro específicopara AIY subtipo H5 detectou duas proteínas proeminentes deaproximadamente 70 e 50 kDa e uma proteína dificilmente visível de ca. 25kDa, que não foram encontradas em células infectadas com NDV Clone 30(Fig. 4).

□ Testes de imunofluorescência indireta (IF)

Para testes de IF indireta as células CEF foram infectadas emMOI baixo com NDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A, rNDV/AlVH5-B e AIVA/chicken/Italy/8/98 (H5N2) por 20 h. Após fixação com metanol e acetona(1:1) as células foram subseqüentemente incubadas quer com um anti-soropoliclonal de coelho contra NDV quer com um anti-soro policlonal de galinhacontra AIV de subtipo H5 em diluições de 1: 3.000 e 1: 100 respectivamente.Após incubação com fragmento F(ab)2 de anticorpos IgG anti-coelho e IgGanti-galinha conjugado com fluoresceína amostras foram analisadas pormicroscopia de fluorescência convencional.

Expressão de H5 foi examinada por teste de IF indireta dascélulas CEF infectadas. Após incubação com um anti-soro específico paraNDV fluorescência pronunciada foi detectável em células infectadas comNDV Clone 30, rNDV/AIVH5-A e rNDV/AIVH5-B, mas não em célulasinfectadas com AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) ou em células não-infectadas (Fig. 5, painel direito). Incubação com um anti-soro específico paraAIV subtipo H5 mostrou uma fluorescente marcante em células infectadascom AIV. Comparando com dois recombinantes, rNDV/AIVH5-B mostrouuma fluorescência específica para H5 mais intensa do que rNDV/AIVH5-Aindicando um nível de expressão mais alto da proteína H5 (Fig. 5, painelesquerdo).□ Microscopia imunoeletrônica

As partículas virais foram adsorvidas para formarem grades decobre revestidas por 7 min. As grades foram lavadas quatro vezes com PBScontendo 0,5% de albumina de soro bovino e subseqüentemente incubadascom um anti-soro específico para AIV subtipo H5 ou específico para NDVpor 45 min. Após várias lavagens com PB, as grades foram incubadas pormais 45 min com proteína A - ouro (10 nm, PAG 10, Biocell International) oucoelho anti-galinha - ouro (10 nm, RCHL 10, Biocell International). Apóslavagens finais com PB as partículas de vírus foram contrastadas com ácidofosfotúngstico (PTA, pH 7,2) e examinadas com microscópio eletrônico.

Quando vírions de NDV Clone 30 ou rNDV/AIVH5-A foramexaminados, coloração foi observada apenas com anti-soro específico paraNDV. Em contraste, para rNDV/AIVH5-B coloração foi observada usandoanti-soros contra NDV e também pelo uso de anti-soros contra AIV,demonstrando que vírions de rNDV/AIVH5-B contêm hemaglutinina H5.Partículas de ouro foram verificadas predominantemente ao longo dasuperfície de vírions rNDV/AIVHS-B, indicando que a hemaglutinina foiancorada na membrana viral.

Exemplo 3: Caracterização in vivo do vetor NDV/AIVH5

□ Avaliação da proteção por rNDV/AIVH5-A e rNDV/AIVH5-Brecombinantes:

Galinhas de um dia de idade foram aleatoriamente designadaspara dois grupos e vacinadas oculonasalmente com IO6 EID50 derNDV/AIVH5-A ou com vacina comercial NDV Clone 30 (Nobilis®,Intervet, NL) via borrifo. Aos 28 dias de idade uma segunda imunização foiadministrada na mesma maneira. No dia 12 após a segunda imunização sanuefoi coletado para avaliar a presença de anticorpos para NDV e AIVH5 peloteste HI. Duas semanas após a segunda vacinação os grupos imunizadosforam divididos e uma parte de cada grupo foi desafiada oculonasalmentecom 10 EID50 de isolado de AIV elevadamente patogênicoA/chicken/Italy/8/98 (H5N2). As galinhas restantes foram usadas para avaliara eficácia protetora das vacinas contra NDV velogênico. Portanto as aves e osanimais de controle adicionais receberam 10' EID5O de NDV cepa Herts33/56 intramuscularmente.

Após imunização e infecção de desafio todas as aves foramobservadas diariamente por um período de 10 dias para sinais clínicos eclassificadas como saudáveis (0), doentes (1; um dos seguintes sinais: sinaisrespiratórios, depressão, diarréia, cianose, edema, sinais nervosos),severamente doentes (2; mais do que um dos seguintes sinais: sinaisrespiratórios, depressão, diarréia, cianose, edema, sinais nervosos), ou mortas(3). Foi calculado um escore clínico que representa o valor médio de todas asgalinhas por grupo por este período. Finalmente, três semanas após o desafioamostras de sangue foram tiradas de todos os animais sobreviventes com oobjetivo de avaliar títulos de anticorpo contra AIV e NDV.

O NDV recombinante rNDV/AIVH5-B foi testado em umteste animal separado de planejamento experimental quase idêntico. As únicasdiferenças foram que imunizações com IO6 EID50 quer de vacinarNDV/AIVH5-B quer de vacina NDV Clone 30 foram administradas emambos os grupos oculonasalmente e não foi realizada infecção de desafio deNDV.

Todos os dados destes experimentos estão sumariados naTabela 4 e na Figura 8. Soros das galinhas imunizadas foram analisados porteste HI três semanas após a vacinação, mas anticorpos de soro específicospara HA não puderam ser detectados em ambos os casos. Todos os animais deambos os grupos desenvolveram anticorpos específicos para NDV em níveisaltos já após a primeira imunização (títulos-HI médios de 2 -2 ) os animaisforam totalmente protegidos contra uma infecção com NDV velogênico,enquanto que todos os animais de controle morreram dentro de 4 diasexibindo sinais típicos de ND. Como esperado, a infecção de desafio de AIVcausou doença severa em galinhas imunizadas com NDV Clone 30 com umataxa de mortalidade de 90 %. Animais do grupo imunizado comrNDV/AIVH5-A sobreviveram com uma dose Ieta de AIV elevadamentepatogênico, mas todas as galinhas exibiram sinais variados de gripe aviáriacom um escore clínico de 0,64 indicando proteção significativa ainda parcial.Contudo, galinhas imunizadas com rNDV/AIVH5-B foram completamenteprotegidas contra quaisquer sinais de doença após infecção com um vírus Ade gripe aviária elevadamente patogênico.

Tabela. 4: Sumário de experimentos animais com rNDV/AIVH5-A e

<table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table>

Exemplo 4: Construção de um vetor NDV/AIV-H5 com ncrflanqueadora do gene NDV F-gene.

Usando essencialmente os mesmos métodos e materiais comodescritos acima (Engel-Herbert et al, supra), um construto de vetor NDV foipreparado trazendo o gene H5 AIV gene entre os genes F e HN do plasmídeopflNDV previamente descrito (Rõmer-Oberdõrfer et al., supra), mas agora oinserto H5 foi flanqueado com regiões não-codificadoras do gene NDV F.

Resumidamente as várias etapas e materiais usados foram:

Um plasmídeo pUC com o fragmento NotI-PstI de 1,6 kb deNDVH5 (pUCIRA) foi mutado para criar um sítio de enzima de restriçãoMluI, usando iniciadores de mutagênese: pMPMLUIGRFHNF (5'- ggt tgt agatga cca aag gac gcg tta cgg gta gaa cgg taa gag agg -3'; SEQ ID NO: 14)aned pMPMLUIGRFHNR (5'- cct ctc tta ccg ttc tac ccg taa cgc gtc ctt tgg tcatct aca acc -3'; SEQ ID NO: 15) (sítio MluI sublinhado, com seqüência GSem negrito), resultando em plasmídeo pUCIRAMLU.

Dois oligo's foram anelados: OFVOF: 5'- agg acg cgt tac gggtag aag att ctg gat ccc ggt tgg cgc cct cca ggt gca gca cca tgg ag -3' (SEQ IDNO: 16, sítio MluI sublinhado) e OFVOR: 5'- ctc cat ggt get gca cct gga gggcgc caa ccg gga tcc aga ate ttc tac ccg taa cac gtc ct -3' (SEQ ID NO: 17, sítioMluI sublinhado). A seguir estes foram digeridos com MluI e NcoI.

Digestão do plasmídeo pUCIRAMLU com MluI e NcoI.Ligação de fragmento Mlul-Ncol de aproximadamente 4,3 kbde pUCIRAMLU com o oligo-híbrido OFVOF/OFVOR digerido por MluI-NcoL O plasmídeo resultante foi chamado de pUCIRA2.

Um plasmídeo pUC (pUCAROK) com o fragmento NotI-BsiWI de NDV com a H5 em vez de a HN orf e pUCIRA2 foi digerido comNcoI e SgfI e o fragmento NotI-NcoI de pUCAROK foi substituído poraquele de pUCIRA2, resultando no plasmídeo pUCAROK2.

HF-PCR (Roche) foi realizada para amplificar a ncr do geneNDV F atrás do gene F inserido, usando os iniciadores: PNCRFHIF: 5'- atactt aag ttc cct aat agt aat ttg tgt -3' (SEQ ID NO: 18, sítio AflII sublinhado), ePNCRFHIR: 5,- cac gcg ate gea ttg cca ctg tac att ttt tet taa ctc tet gaa ctg acagac tac c -3' (SEQ ID NO: 19, sítio SgfI sublinhado), e plasmídeo pUCAROA(pUC com fragmento NotI-SpeI de NDV). O fragmento de ~ 100 pbresultante foi ligado em vetor pGEMTeasy para dar o plasmídeopGEMFncrhi.

Plasmídeos pUCAROK2 e pGEMFncrhi foram digeridos comAflII e SgfI para substituir a HN ncr atrás de H5 de plasmídeo pUCAROK2por aquela de pGEMFncrhi. O plasmídeo resultante foi chamado depUCAROK4.

Na última etapa o fragmento NotI-SgfI do plasmídeo NDVH5foi substituído por aquele de pUCAROK4 resultando no plasmídeo novo decomprimento total E18C, compreendendo o gene AIV H5 inserido no vetorNDV entre F e HN, e flanqueado pelas ncr's de gene F.

Com os experimentos de transfecção de construtos novos,propagação de vírus rec e confirmação da recuperação de vírus infecciosoforam realizadas como descrito acima. A seguir o vírus foi caracterizadobioquimicamente e biologicamente.

Exemplo 5: Geração de outros construtos de vetor NDV e vírus rec:

Usando técnicas similares vários outros insertos forampreparados no vetor NDV, utilizando genes inseridos diferentes, e sítios deinserção diferentes.

Com os detalhes já aqui proporcionados todos estão dentro dapesquisa fácil das capacidades da pessoa experiente, portanto é suficienteapresentar estes na forma de tabela:

Tabela 5: Outros construtos de vetor NDV de acordo com a invenção:

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Exemplo 6: Geração de um vetor de vírus da raiva recombinanteexpressando um gene de envelope de EIAV

Para demonstrar que os efeitos vantajosos da invenção (o usode regiões não-codificadoras de gene MV para aumentar a expressão e/ouapresentação de genes estranhos nos vírions rec MV) se expandem para alémda família Paramyxoviridae, vírus da raiva - um membro da famíliaRhabdoviridae - foi usado como um vetor para expressar uma proteína deenvelope derivada de um vírus não relacionado, vírus da anemia infecciosa eqüina (EIAV).

Neste exemplo a construção é descrita de um vírus da raiva reccompreendendo a proteína de envelope de EIAV, inserido entre os genes G eL de raiva, onde o gene env é flanqueado pelas ncr's do gene de proteína-G daraiva.

Subclones de vírus da raiva foram preparados em fagomídeopBluescript® SK+ usando o clone de comprimento total SAD-D29(Mebatsion, 2001, J. Virol., vol. 75, p. 11496-11502), que é aqui referidocomo ORA-D. Para preparar um vetor de clonagem, um vetor pSK foiprimeiro digerido com Saci, cegado com enzima Klenow, seguido pordigestão com HindIII e purificação em gel do fragmento de ~3 kb. O insertofoi preparado por digestão de ORA-D com StuI e HindIII, purificando ofragmento de 1,3 kb resultante, e ligando no vetor pSK preparado para gerar oplasmídeo pNCR-b.

O plasmídeo pNCR-b foi digerido com BstXI e HindIII e ofragmento de -4,0 kb foi purificado e usado para ligação com os oligo'sBSSNH+ e BSSNH- (veja Tabela 6) para criar o plasmídeo pSSNsc contendoum cassete de transcrição mínimo e ligação com oligos RABGNCRI-4(Tabela 6) para gerar o construto GNCR-b, contendo regiões não-codificadoras em adição à unidade de transcrição mínima (Figura 7).

O gene env de EIAV cepa Wyoming foi obtido poramplificação de um gene sintético de 2052 nt que havia sido códon-otimizado, sítios de editoração de RNA removidos (Cook, et al. 2005, Vet.Micro., vol. 108, p. 23-37), e trincado por 134 aminoácidos na regiãocodificadora 3' do gene original.

Tabela 6: Seqüências de oligo usadas durante a construção de vírus daraiva rec

<table>table see original document page 40</column></row><table>

(*) 3 nt mudados de ORAD original: GGAAAG GGACTGG, para: GGATACGTACTGG

O gene env amplificado foi cinasado e inserido em subclonescomo segue: um amplicon de ~2,0 kb, engenhado para representar a proteínade envelope de EIAV truncada inteira, foi gerado usando o conjunto deiniciadores EIAsynCDF + EIAsynCDstopR (veja Tabela 6). O amplicon foiinserido no subclone GNCR-b que havia sido digerido com SnaBI edesfosforilado para gerar o plasmídeo recombinante pGNCR-b:envG. Ofragmento de -2,0 kb também foi inserido no subclone SSNsc que havia sidopré-digerido com NheI, extremidade cegada e desfosforilado para gerar oplasmídeo recombinante pSSNsc:env.

Cada construto recombinante foi digerido com SphI e HindIIIe ligado no subclone SSNsc, que foi pré-digerido por Sphl/HindIII edesfosforilado com CTAP. Após retorno para o subcclone SSNsc, os insertosmodificados foram retornados para o suporte principal ORAD por digestãocom SphI e MluI para gerar os vírus da raiva recombinantes RV-env e RV-envG (Figura 8). As extremidades 5' e 3' dos construtos foram verificadas poranálise de seqüência usando a Big-Dye® Terminator Cycle Sequencingchemistry (Applied Biosystems) e analisados usando um Applied Biosystems3100-Avant Capillary Electrophoresis Sequencer.

A construção de um clone de cDNA de comprimento totalbaseado na cepa ORAD de raiva SAD modificada e geração de um vírus daraiva recombinante têm sido descritas (Schnell et al., 1994, EMBO J., vol. 13,p. 4195-4203; Mebatsion, 2001, supra). Cada vírus da raiva recombinante foitransferido para células BSR como previamente descrito (Schnell, et aL,1994, supra) usando Mirus Trans-IT-LT 1. Três dias após a transfecção,células e sobrenadante foram colhidos e passados. Passagens subseqüentesforam apenas por sobrenadante, usando um moi estimado de 0,5. Cada vírusrecombinante foi passado um mínimo de cinco vezes para verificarestabilidade.

Células BSR infectadas com raiva recombinante foram fixadas-40 horas após a infecção. Estas foram analisadas por imunofluorescênciaindireta usando FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin (FDI DiagnosticsInc.) ou empregando soros policlonais de cavalo anti-EIAV. Em diluiçõesseriais de 10 vezes, a razão de células infectadas produtoras de vírus da raivatambém foi comparada com as células infectadas expressando EIAV env paramonitorar a estabilidade de vírus e a expressão de antígeno recombinante.

Vírus da raiva recombinantes de cinco passagens foraminoculados em frascos T-75 com células BSR frescas em um moi de 0,01. 24Horas após infecção, o meio foi mudado para livre de soro. Sobrenadante foicoletado e clarificado por centrifugação (10.000 χ g) a 72 horas após infecção.Sobrenadantes virais foram purificados por gradientes de sacarose para anlisarvírions purificados.

Vírions purificados e proteína celular infectada total foramcombinadas com tampão de amostra redutor 2x Laemmli e posicionados emágua fervente por 5-10 minutos. Amostras foram carregadas para um gel deacrilamida 10% Tris-HCl (Bio-Rad) em Tampão de Corrida Ix SDS-PAGE.Géis SOS-PAGE foram corridos a 20 mA até que a frente de corante ficasseperto do ou no fundo do gel. As proteínas separadas foram transferidas paracima de membrana Immobilon-P (PVDF) (IPVH10100, Immobilon) porblotting a 225 mA por 45 minutos. Blots foram incubados em tampão debloqueio (PBS-Tween 20 + 1% de leito desnatado em pó) por uma hora natemperatura ambiente e então lavados 3 vezes por 5 minutos em PBS-Tween20. Expressão de raiva foi detectada usando soros policlonais de coelho anti-raiva direcionados contra glicoproteína e nucleoproteína de raiva diluídas1:20.000 e 1:2.000, respectivamente, em tampão de bloqueio.

Simultaneamente, expressão de EIAV env foi detectadausando soros policlonais de cavalo anti-EIAV diluídos 1:500 em tampão debloqueio. Blots foram incubados por uma hora na temperatura ambiente eentão lavados 3 vezes por 5 minutos em PBS-Tween 20. Blots foram postosem IgG (H+L) de cabra anti-coelho conjugada com HRP (ICPL) e IgG (H+L)de cabra anti-cavalo conjugada com HRP (Bethyl Labs), cada uma diluída1:2.000 em tampão de bloqueio e incubados por uma hora na temperaturaambiente. Blots foram então lavados 3x5 minutos em PBS-Tween 20. Blotsforam incubados em substrato de peroxidase de membrana TMB (KPL) atédesenvolvimento se completar, aproximadamente 1-3 minutos. Blots forampostos em água destilada para interromper a reação.

Um resultado típico de um tal experimento de Western blot émostrado em Figura 9, e demonstra a composição de proteína de vírus daraiva recombinante expressando proteína de envelope de EIAV.

Pista 1: Escada de PM de faixa ampla (Bio-Rad);

Pista 2: Vírus suporte principal ORAD;

Pista 3: RV-env, compreendendo o gene EIAV-env, inseridoentre os genes G e L de raiva, sem ncr's flanqueadoras;

Pista 4: RV-envG, compreendendo o gene EIAV-env,flanqueado pelas regiões ncr da proteína G do vírus da raiva.

Ambos os vírus da raiva recombinantes deram título deinfecção comparáveis e estavelmente expressaram inserto de gene EIAV-envapós passagens múltiplas in vitro.

Contudo, apesar da sujeição de quantidades comparáveis devírions a Western blot, RV-env recombinante, construído no modocostumeiro (portanto sem ncr's flanqueadoras) exibiu apenas uma bandamuito fraca correspondendo à proteína EIAV-env; enquanto que o vírusrecombinante RV-envG, que tinha as regiões não-codificadoras de proteína-Gflanqueando a proteína EIAV-env inserida, foi expressado em uma taxa muitomais alta: Figura 9, comparar a banda para proteína env em pistas 3-4.

Como os construtos e insertos de RV-envG e RV-env são soboutros aspectos idênticos, isto é uma prova forte de que as regiões não-codificadoras possuem um efeito positivo na promoção do nível alto deapresentação imune e produção de proteína estranha.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Intervet International BV

<120> Um vetor de vírus Mononegavirales recombinante

<130> 2006-007-FF

<150> Us 60/783194

<151> 2006-03-15

<160> 27

<170> PatentIn versão 3.3<210> 1<211> 133<212> DNA

<213> Vírus da doença de Newcastle<220>

<221> NDV_final_geneF<222> (1)..(11)<220>

<221> NDV_F-HN_região_intergênica

<222> (12) .. (42)

<220>

<221> NDV_início_geneHN

<222> (43)..(52)

<220>

<221> NDV_geneNH_região_não_codificadora_5'<222> (53)..(133)<4 00> 1

ttaagaaaaa actaccggtt gtagatgacc aaaggacgat atacgggtag aacggtaaga 60gaggccgccc ctcaattgcg agccaggctt cacaacctcc gttctaccgc ttcaccgaca 120

acagtcctca ate 133

<210> 2<211> 177<212> DNA

<213> Vírus da doença de Newcastle<220>

<221> NDV_geneHN_região_não_codificadora_3'

<222> (1)..(166)

<220>

<221> NDV_final_geneHN<222> (167)..(177)<400> 2

ttgagtcaat tataaaggag ttggaaagat ggcattgtat cacctatctt ctgcgacatc 60aagaatcaaa ccgaatgceg gcgcgtgctc gaattccatg ttgccagttg accacaatca 120

gccagtgctc atgcgatcag attaagcctt gtcaatagtc tcttgattaa gaaaaaa 177

<210> 3<211> 133<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Construto de inserção rec NDV<220>

<221> rNDV_final_geneF<222> (1) . . (11)<220>

<221> rNDV_F-HN_região_intergênica

<222> (12) .. (42)

<220>

<221> rNDV_início_geneHN

<222> (43)..(52)

<220><221> rNDV_geneHN_região_não_codificadora_5'<222> (53)..(133)<400> 3

ttaagaaaaa actaccggtt gtagatgacc aaaggacgat atacgggtag aacggtaaga 60gaggccgccc ctcaattgcg agccaggctt cacaacctec gttctaccgc ttcaccgaca 120

acagtcctca acc 133

<210> 4<211> 177<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Construto de inserção rec NDV<220>

<221> rNDV_geneHN_região_não_codificadora_3'

<222> (1)..(166)

<220>

<221> rNDV_final_geneHN<222> (167)..(177)<400> 4

ttgagtcaat tctaagggag ttggaaagat ggcattgtat cacctatctt ctgcgacatc 60aagaatcaaa ccgaatgccg gcgcgtgctc gaattccatg ttgccagttg accacaatca 120

gccagtgctc atgcgatcag attaagcctt gtcaatagtc tcttgattaa gaaaaaa 177

<210> 5<211> 29<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem PH5F1<400> 5

ctaaacgcgt aaaatggaga aaatagtgc 29

<210> 6<211> 31<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem PH5R1<400> 6

tcggacgcgt ttaaatgcaa attctgcact g

<210> 7<211> 25<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem PH5F2<400> 7

ccttccatgg agaaaatagt gcttc

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador de clonagem PH5R2<400> 8

ccttccatgg ãôâaastáât gcttc

<210> 9<211> 30<212> DNA<213> Artificial<220>

31

25

25<223> Iniciador de clonagem MPl<400> 9

gacaacagtc ctcaaccatg gaccgcgccg

<210> 10<211> 41<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem MP2<400> 10

ctggctagtt gagtcaattc ttaaggagtt ggaaagatgg c

<210> 11<211> 38<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem MP3<400> 11

caaaacagct eatggtacgt aatacgggta ggacatgg

<210> 12<211> 38<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem MP4<400> 12

gtaagtggca atgcgategc aggcaaaaca gctcatgg

<210> 13<211> 43<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem MP5<400> 13

gaaaaaacta ccggcgatcg ctgaccaaag gacgatatac ggg

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador de mutagênese pMPMLUIGRFHNF<400> 14

ggttgtagat gaccaaagga cgcgttacgg gtagaacggt aagagagg

<210> 15<211> 48<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de mutagênese pMPMLUIGRFHNR<400> 15

cctctcttac cgttctaccc gtaacgcgtc ctttggtcat ctacaacc

<210> 16<211> 65<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo de clonagem OFVOF<400> 16

aggacgcgtt acgggtagaa gattctggat cccggttggc gccctccagg tgcagcaccatggag<210> 17<211> 65<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Oligo de clonagem OFVOR<400> 17

ctccatggtg ctgcacctgg agggcgccaa ccgggatcca gaatcttcta cccgtaacgc 60gtcct 65

<210> 18<211> 31<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem PNCRFHIF<400> 18

atacttaagt tccctaatag taatttgtgt g 31

<210> 19<211> 58<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem PNCRFHIR<4 00> 19

cácgcgatcg cattgccact gtacattttt tettaaetct ctgaactgac agactacc 58

<210> 20<211> 31<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem BSSNH+<400> 20

Ctggtgaaaa aaactaacac ccctgctagc a 31

<210> 21<211> 39<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem BSSNH-<400> 21

cgttgaccac tttttttgat tgtggggacg atcgttcga 39

<210> 22<211> 50<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem RABGNCRoligol<400> 22

ctggtgaaaa aaactattaa catccctcaa aagactcaag gatacgtact SO

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador de clonagem RABGNCRoligo2<400> 23

gtatccttga gtcttttgag ggatgttaat agtttttttc accagttgc 49

<210> 24<211> 50<212> DNA-

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem RABGNCRoligo3<400> 23

ggccgtcctt tcaacgatcc aagtcctgaa gatcacctcc ccttggggga

<210> 25<211> 59<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem RABGNCRoligo4<400> 23

agcttccccc aaggggaggt gatcttcagg acttggatcg ttgaaaggac ggccagtac

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador de clonagem EIAsynCDF<400> 26

atggtgtcca tcgccttcta

<210> 27<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de clonagem EIAsynCDstopR<400> 27

tcagtgtatg ttgtgttggg c

Claims (23)

1. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante hospedandouma unidade de transcrição adicional compreendendo um gene estranhooperativamente ligado com uma seqüência de início de gene (GS) de vírusMononegavirales a montante e uma seqüência de final de gene (GE) de vírusMononegavirales a jusante, caracterizado pelo fato de que entre a seqüênciaGS e um códon de iniciação do gene estranho e entre um códon de terminaçãodo gene estranho e a seqüência GE, uma região não-codificadora 3' e umaregião não-codificadora 5' (senso de genoma) de um gene de vírusMononegavirales estão localizadas, respectivamente.

2. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as regiões não-codificadoras 3' e 5' são de um gene codificador de uma proteína de envelopede um vírus Mononegavirales, em particular de um gene M, G, F ou HN.

3. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as regiões não-codificadoras 3' e 5' são de um gene codificador de uma proteína RNP de umvírus Mononegavirales.

4. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o gene estranhocodifica um antígeno de um patógeno.

5. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o gene estranhocodifica um modulador imune.

6. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o vetor de vírusMononegaviales é um vírus da família Rhabdoviridae.

7. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vetor de vírusMononegaviales é um vírus da raiva.

8. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vetor de vírusMononegaviales é um vírus da necrose hematopoiética infecciosa.

9. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 6-8, caracterizado pelo fato de que as regiões não-codificadoras 3' e 5' são de um gene Ν, Ρ, M ou G.

10. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 6-9, caracterizado pelo fato de que a unidade detranscrição adicional está localizada em uma posição proximal 3' ou entre osgenes P e Μ, M e G ou G e L.

11. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o vetor de vírusMononegaviales é um vírus da família Paramyxoviridae.

12. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o vetor de vírusMononegaviales é um vírus da doença de Newcastle, vírus da cinomosecaninas ou vírus da parainfluenza (bovina).

13. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordo com as reivindicações 11-12, caracterizado pelo fato de que as regiões não-codificadoras 3' e 5' são de um gene NP, Ρ, M, F ou HN.

14. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 11-13, caracterizado pelo fato de que a unidade detranscrição adicional está localizada em uma posição proximal 3' ou entre os genes P e Μ, M e F, F e NH ou NH e L.

15. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 11-14, caracterizado pelo fato de que o vetor de vírusMononegaviales é vírus da doença de Newcastle.

16. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a unidade detranscrição adicional está localizada entre os genes F e HN.

17. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 15-16, caracterizado pelo fato de que as regiões não-codificadoras são de um gene HN.

18. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 15-17, caracterizado pelo fato de que o gene estranhocodifica um antígeno de um patógeno aviário.

19. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 15-18, caracterizado pelo fato de que o gene estranhocodifica uma hemaglutinina (HA) de um vírus da gripe, preferivelmente umahemaglutinina H5 ou H7.

20. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 1-19, caracterizado pelo fato de que o vetor de vírusMononegaviales é um vírus atenuado.

21. Vacina contra um patógeno microbiano, caracterizada pelofato de compreender um vetor de vírus Mononegavirales recombinante comodefinido nas reivindicações 1-20 em uma forma viva ou inativada, e umdiluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

22. Vacina de acordo com a reivindicação 21, caracterizadapelo fato de adicionalmente compreender um adjuvante.

23. Vacina de acordo com as reivindicações 21-22,caracterizada pelo fato de compreender uma cepa de vacina adicional.