BRPI0709709A2

BRPI0709709A2 - composto, composiÇço farmacÊutica, mÉtodo de tratamento de cancÊr ou malignidades de cÉlula b, uso de um composto, e, processo para preparar um composto

Info

Publication number: BRPI0709709A2
Application number: BRPI0709709-3A
Authority: BR
Inventors: Barrie Wilkinson; Steven Moss; Ming Zhang
Original assignee: Biotica Tech Ltd
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2011-07-26
Also published as: AU2007253422A1; GB0609981D0; KR20090010064A; MX2008014600A; US20090312316A1; CN101442999A; WO2007135078A2; CA2652399A1; JP2009537487A; WO2007135078A3; EP2023915A2

Abstract

<B>COMPOSTO, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO DE CÂNCER OU MALIGNIDADES DE CÉLULA B, USO DE UM COMPOSTO, E, PROCESSO PARA PREPARAR UM COMPOSTO <D>A presente invenção se refere a derivados de borrelidina que são úteis em medicina, e.g. no tratamento de câncer ou malignidades de célula B, ou outras doenças nas quais angiogênese contribui para a patologia incluindo distúrbios oftálmicos tal como retinopatia diabética assim como degeneração macular relacionada à idade (AMD), neovascularização corneana e retinopatia ou prematuridade. A presente invenção também fornece métodos para a produção destes compostos e seu uso em medicina, em particular no tratamento e 1 ou profilaxia de câncer ou malignidades de célula B e outras doenças nas quais angiogênese está implicada no processo patogénico.

Description

"COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DETRATAMENTO DE CÂNCER OU MALIGNIDADES DE CÉLULA B,USO DE UM COMPOSTO, E, PROCESSO PARA PREPARAR UMCOMPOSTO"Fundamentos da invençãoBorrelidina 1 (Figura 1) é uma macrolida de 18 membrosproduzida por diversas linhagens bacterianas incluindo, mas não limitado a,Streptomyces rochei ATCC23956, Streptomyces parvulus Tüll3 eStreptomyces parvulus Tü4055. A estrutura bruta de borrelidina foi primeiroelucidada em 1967 (Keller-Scheirlein, 1967), e foi subseqüentemente refinadapor análise RMN detalhada (Kuo et ai., 1989). A configuração absoluta deborrelidina foi confirmada por cristalografia de raios X (Anderson et al.,1989). Sua co-identidade como o antibiótico treponemicina foi verificada(Maehr & Evans, 1987).Diversos grupos registraram a síntese de fragmentos daestrutura de borrelidina, e quatro sínteses totais independentes de borrelidinaforam registradas (Hanessian et al., 2003; Duffey et al., 2003; Nagamitsu etal., 2004; Vong et al., 2004). Em adição o agrupamento gênico responsávelpela biossíntese de borrelidina por Streptomyces parvulus TÜ4055 foiidentificado, clonado e seqüenciado (WO 2004/058976; Olano et al., 2004a).Baseado nesta aplicação de engenharia biossintética técnicas permitiramelucidação da via biossintética levando a borrelidina e à produção de novosanálogos (WO 2004/058976; Olano et al., 2003; Olano et al., 2004b; Moss etal., 2006).Borrelidina foi primeiro descoberta devido a sua atividadeantibacteriana (Berger et al., 1949), embora esta atividade antibacteriana seestenda apenas a um número limitado de micrococos, e não é encontradacontra todas as bactérias de teste comuns. O modo de ação emmicroorganismos sensíveis envolve inibição seletiva de treonil tRNA sintetase(Paetz & Nass, 1973; Ruan et al., 2005). Outras atividades contra espiroquetasdo gênero Treponema (Singh et al., 1985; Patente US 4.759.928), contra vírus(Dickinson et al., 1965), usos para o controle de pestes animais e ervasdaninhas (Patente Alemã 3607287) e uso como um fiingicida agrícola(Patente Alemã 19835669; Patente US 6.193.964) foram registrados.Adicionalmente, recentemente, borrelidina foi relatada tendo atividadeantimalárica contra linhagens de Plasmodium falciparum resistentes a droga(Otoguro et al., 2003). Entre todos estes relatos apenas dois relataramquaisquer derivados sinteticamente modificados. O primeiro destes descreve o éster benzílico e seu derivado bis-0-(4-nitrobenzoila) (Berger et al., 1949). Osegundo destes descreve o éster metílico de borrelidina, o derivado de éstermetílico bis O-acetila, e os derivados de éster metílico A14_15-dihidro-,Δ14-15,12-13-tetrahidro-, e Δ14_i 5j 12.13-tetrahidro-C 12-amino (Anderton &Rickards, 1965). Nenhuma atividade biológica foi registrada para qualquer destes compostos.

Uma recente descrição de particular interesse é a descoberta deque borrelidina apresenta atividade anti-angiogênese (Wakabayashi et al.,1997). Angiogênese é o processo da formação de novos vasos sangüíneos.Angiogênese ocorre apenas localmente e transientemente em adultos, estando envolvida em, por exemplo, reparo seguindo trauma local e o cicloreprodutivo feminino. Foi estabelecida como um componente chave emdiversos processos patogênicos incluindo câncer, artrite reumatóide eretinopatia diabética (Perrin et al., 2005). Sua importância em possibilitar quetumores cresçam além de um diâmetro de 1-2 cm foi estabelecida por Folkman (Folkman, 1986), e é provocada pelo tumor respondendo a hipoxia.Em suas conseqüências posteriores angiogênese é principalmente umprocesso derivado de hospedeiro, assim inibição de angiogênese oferecepotencial significante no tratamento de cânceres, evitando os obstáculos deoutras modalidades terapêuticas anticâncer tal como a diversidade de tipos decâncer e resistência a drogas (Matter, 2001). É de interesse adicional quepublicações recentes tenham descrito o envolvimento funcional de tirosinil etriptofanoil-tRNA sintetases na regulação de angiogênese (Wakasugi et al.,2002; Otani et al., 2002).

No modelo de cultura em matriz de aorta de rato deangiogênese, borrelidina exibe um potente efeito inibidor de angiogênese etambém causa ruptura de tubos capilares formados de uma maneira dosedependente induzindo apoptose das células formados de capilares(Wakabayashi et al., 1997). Borrelidina inibiu formação de tudo capilar com um valor de IC50 de 0,4 ng/mL (0,8 nM). No mesmo estudo, borrelidinamostrou possuir atividade antiproliferativa para células endoteliais de veiaumbilical humana (HUVEC) em um ensaio de crescimento celular; o valor deIC50 foi medido a 6 ng/mL, o qual é 15 vezes mais fraco do que a atividadeanti-angiogênese medida no mesmo meio. Esta atividade antiproliferativa de borrelidina mostrou ser geral para várias linhagens celulares, tal como podeser visto em um ensaio de inibição de crescimento de célula de câncer. Emadição a estes dados, os autores relatam que borrelidina inibe síntese protéicanas células cultivadas de rato, um fator mais provavelmente ligado a suacapacidade de inibir treonil tRNA sintetase; entretanto o valor de IC50 para atividade anti-angiogênese (0,4 ng/mL) foi 50 vezes menor do que aquelerelatado para inibição de síntese protéica (20 ng/mL), indicando diferentesatividades do composto. Assim acredita-se que a atividade antiproliferativapode ser ligada a inibição de treonil tRNA-sintetase e modificação estruturalda molécula para alterar especificamente as duas diferentes atividades fornece um meio de melhorar índice terapêutico. A inibição de treonil tRNA sintetasepode ser medida por diversos métodos publicados, e.g. como publicado porRuan et al (Ruan et al., 2005).

Borrelidina também apresenta inibição potente de angiogênesein vivo usando o modelo de saco aéreo dorsal de camundongo (Funahashi etal., 1999), que examina angiogênese induzida por VEGF e é um excelentemodelo para estudar angiogênese de tumor. Borrelidina foi administrada emuma dose de 1,8 mg/kg por injeção intraperitoneal e mostrou reduzirsignificantemente o incremento de volume vascular induzido por célulasWiDr, e em um maior grau do que TNP-470, que é um inibidor deangiogênese sintético em testes clínicos. Controles detalhados verificaram queestes dados são para inibição de angiogênese e não inibição de crescimentodas células de tumor. Os autores também mostraram que borrelidina é eficazpara a inibição da formação de metástases pulmonares espontâneas de célulasde melanoma B16-BL6 na mesma dosagem inibindo os processosangiogênicos envolvidos na sua formação.

Patente JP 9-227.549 e Patente JP 8-173.167 confirmam queborrelidina é eficaz contra linhagens de célula WiDr de câncer de cólonhumano, e também contra linhagens de célula PC-3 de câncer de próstatahumano. Patente JP 9-227.549 descreve a produção de borrelidina porStreptomyces rochei Mer-N7167 (Ferm P-14670) e seu isolamento da culturade fermentação resultante. Em adição a borrelidina 1, 12-desnitrila-12-carboxil borrelidina 2 (presumivelmente um intermediário biossintético oumetabólito de desvio portossitêmico), 10-desmetil borrelidina 3(presumivelmente um análogo biossintético surgindo a partir da incorporaçãode uma unidade extensora de malonil-CoA alternativa em módulo 4 daborrelidina PKS), 11-epiborrelidina 4 e o análogo de borrelidina C14,C15-cis5 foram descritos (veja Figura 1). Assim, Patente JP 9-227.549 especificaborrelidina e análogos de borrelidina caracterizados pelo fato de que umgrupo nitrila ou carboxila é acoplado ao esqueleto de carbono em C12, e umátomo de hidrogênio ou grupo alquila inferior é acoplado ao esqueleto decarbono em CIO.

Borrelidina foi investigada na década de 1960 por seupotencial farmacêutico (antiviral) mas estes esforços foram descontínuosdevido à toxicidade, em particular seu efeito como um sensibilizador químico(Lumb et al, 1965, Dickinson et al., 1965).

WO 01/09113 descreve a preparação de análogos deborrelidina que passaram por modificação sintética na unidade de ácidocarboxílico do anel de ciclopentano. A atividade destes compostos foiavaliada usando ensaios de proliferação de célula endotelial e formação decapilar endotelial de uma maneira similar àquela descrita acima. Em geral,modificação da unidade de carboxila melhorou a seletividade para inibirformação de capilar: a principal razão desta melhora em seletividade é atravésde uma diminuição na atividade de inibição de proliferação celular ao passoque a atividade inibidora de formação de capilar foi alterada em um graumuito menor. Especificamente, a borrelidina-morfolinoetil éster mostrou umíndice de seletividade de 60 vezes, a borrelidina-amida mostrou um índice deseletividade de 37 vezes, a borrelidina-(2-piridila)-etil éster mostrou umíndice de seletividade de 7,5 vezes e a borrelidina-morfolinoetil amidamostrou um índice de seletividade de 6 vezes, para a atividade inibidora deformação de capilar versus proliferação celular com respeito à borrelidina. Aatividade inibidora de formação de capilar destes e outros derivados deborrelidina foi verificada usando um ensaio de formação de micro-vaso. Emadição, os autores mostraram que borrelidina inibiu fracamente a propagaçãode nódulos metastáticos, depois de remoção do tumor primário, ao usar ummodelo de adenocarcinoma pulmonar de Lewis. Entretanto, o derivado deborrelidina-(3-picolilamida) foi registrado inibindo muito consideravelmenteo aumento de micrometástases em ratos depois de intraperitoneal e tambémcom administração por via oral em doses subtóxicas. Similarmente, usando omodelo de cólon 38 baço fígado, a capacidade de formar metástase de célulasde adenocarcinoma de cólon de camundongo transplantadas em baço decamundongo foi consideravelmente diminuída depois de tratamento com umadose subtóxica deste derivado de borrelidina. Estes dados confirmam acapacidade previamente relatada de borrelidina e seus derivados de inibir aformação de metástases.

Borrelidina também foi identificada como um inibidor dequinase dependente de ciclina Cdc28/Cln2 de Saccharomyces eerivisiae comum valor de IC5o de 12 \iglmL (24 μΜ) (Tsuchiya et al., 2001). Foi mostradoque borrelidina seqüestra tanto células haplóides como diplóides em fase Gitardia (em um momento indistinguível de ferormônio de acasalamento a), eem concentrações que não afetam biossíntese protéica bruta. Estes dadosforam adotados para indicar que borrelidina tem potencial como um compostolíder para desenvolver agentes antitumor.

Dois relatos adicionais foram publicados referentes à atividadebiológica de borrelidina. O primeiro destes indica que os efeitos anti-angiogênicos de borrelidina são mediados através de vias distintas(Kawamura et al., 2003). Altas concentrações de treonina foram encontradas atenuando a capacidade de borrelidina de inibir tanto formação de tubocapilar no modelo de cultura de aorta de rato como proliferação de célulasHUVEC; entretanto, isto não afetou a capacidade de borrelidina de colapsartubos capilares formados ou de induzir apoptose em HUVEC. Borrelidinatambém foi encontrada ativando caspase-3 e caspase-8, e inibidores de ambas destas borrelidinas suprimidas induziram apoptose em HUVEC. O segundodestes artigos usou o método de definição de perfil de mRNA celular globalpara fornecer percepção dos efeitos de borrelidina em Saccharomycescerevisiae (Eastwood and Schaus, 2003). Esta análise mostrou a indução deenzimas biossintéticas de aminoácidos de uma maneira dependente de tempomediante tratamento com borrelidina, e ficou acertado que indução desta viaenvolve o fator de transcrição GCN4.

Certos análogos de borrelidina foram descritos em WO2004/058976 (Biotica Technology Ltd et al).

Em resumo, o efeito inibidor de angiogênese de borrelidina édirecionado para os efeitos biológicos combinados de proliferação e formaçãocapilar. Em adição, borrelidina, e derivados desta, mostraram inibir apropagação de metástases. Borrelidina também tem indicações para uso emmodulação de ciclo celular. Assim, borrelidina e compostos relacionados sãoalvos particularmente atrativos para investigação como agentes terapêuticospara o tratamento de tecidos de tumor, ou como agentes únicos ou para usocomo um adjunto para outras terapias. Em adição, eles podem ser usados paratratar outras doenças nas quais angiogênese está implicada no processopatogênico, incluindo, mas não restrito a, a seguinte lista: artrite reumatóide,psoríase, arteriosclerose, e vários distúrbios oftálmicos tal como retinopatiadiabética assim como degeneração macular relacionada à idade (AMD),neovascularização corneana e retinopatia da prematuridade.A presente invenção fornece derivados de borrelidina que sãoúteis como agentes anticâncer e anti-malignidade de célula B, e como agentespara o tratamento de outras doenças nas quais angiogênese está implicada noprocesso patogênico.Portanto, permanece uma necessidade de identificar novosderivados de borrelidina com índice terapêutico melhorado, o que pode terutilidade no tratamento de câncer e / ou malignidades de célula B, ou comoagentes para o tratamento de outras doenças nas quais angiogênese estáimplicada no processo patogênico. Preferivelmente tais derivados deborrelidina têm uma ou mais das seguintes propriedades: uma proporçãomelhorada de atividade anti-angiogênica para inibição de proliferação celulargeral e/ou atividade de tRNA sintetase, solubilidade em água melhorada,permeabilidade celular melhorada, um perfil farmacológico melhorado eperfil de efeito colateral reduzido para administração. A presente invençãodescreve derivados de análogos de borrelidina ou com unidades iniciadoras decadeia aberta ou unidades iniciadoras de anel de 4 membros que geralmentetêm propriedades biológicas melhoradas comparadas com borrelidina eanálogos relacionados; em particular eles mostram melhoras com respeito auma proporção melhorada de atividade anti-angiogênica para inibição deproliferação celular geral.

Sumário da invenção

A presente invenção fornece derivados de borrelidina, métodospara a preparação destes compostos, intermediários destes e métodos para ouso destes compostos em medicina.

Em um aspecto mais específico a presente invenção fornecederivados de borrelidina de acordo com a fórmula (I) abaixo, ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmos:

<formula>formula see original document page 9</formula>

Fórmula (I)

onde:

R1 e R2 independentemente representam cada H, SR3 ou umgrupo alquila C1-C4 que pode ser opcionalmente substituído por um ou maisgrupos selecionados a partir de OH, F, Cl ou SR3; onde R3 representa H, CH3ou COCH3; alternativamente R1 e R2 junto com os carbonos com os quais elessão acoplados representam um anel de cicloalquila de 4 membrosopcionalmente substituído por um ou mais átomos de halogênios ou um oumais grupos alquila C1 a C3

R4 representa

<formula>formula see original document page 9</formula>

ou -NHNHC(O)R8 onde R8 representa biotina, H ou um grupoalquila C1-C4 opcionalmente substituído por um ou mais grupos selecionadosa partir de OH, F, Cl;

X representa -NH- ou -O-;

Y representa -NH-, -O- Ou-CH2-;

R5 representa H ou -(CH2)nR^ onde:

η representa um número inteiro entre 1 e 3,R6 representa H, -OH, -OCH3, -CO2Ry, ou um grupo alquilaCl a C4 opcionalmente substituído por um ou mais grupos selecionados apartir de OH, F, Cl, -CO2R7, -COR7, onde R7 representa um grupo alquila Cl-C4

ou R<s representa:

i) um anel aromático de 6 membros,

ii) um anel heteroaromático de 5 a 7 membros contendo entreum e três átomos de N, S ou O,

iii) um grupo de cicloalquila de 5 a 7 membros ou

iv) um anel de heteroalquil de 5 a 7 membros contendo entreum e três átomos de N, S ou O,

cada um de i) a iv) acima pode ser opcionalmente substituídopor um ou mais grupos selecionados a partir de CH3, OCH3, F, Cl ou Br

R9 representa CN, CO2H, CH3 ou CONH2;contanto, entretanto, que quando X representa -O- então R5não representa H.

A estrutura acima mostra um tautômero representativo e ainvenção abrange todos os tautômeros dos compostos de fórmula (I), porexemplo, compostos cetônicos onde compostos enólicos são ilustrados e viceversa.

Em um aspecto adicional, a presente invenção fornecederivados de borrelidina tal como compostos de fórmula (I) ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmos, para uso como um produtofarmacêutico.Definições

Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para se referir a umou a mais do que um (i.e. pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo.

Como forma de exemplo "um análogo" significa um análogo ou mais do queum análogo.

Como usado aqui o termo "análogo(s)" se refere a compostosquímicos que são estruturalmente similares a outros mas que diferemlevemente em composição (como na substituição de um átomo por outro napresença ou ausência de um grupo funcional particular).

Em particular, o termo "análogo de borrelidina" se refere a umcomposto de borrelidina produzido pelos métodos de WO 2004/05 B976 ecomo mostrado por fórmula (II). Estes compostos são também referidos como"compostos parentais" e estes termos são usados permutavelmente nopresente pedido. No presente pedido o termo "análogos de borrelidina" incluireferência a própria borrelidina.

Como usado aqui, o termo "derivado de borrelidina" se referea um derivado de borrelidina referido acima como representando a invençãoem seu mais amplo aspecto, i.e. um composto de acordo com fórmula (I)acima, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmos. Estes compostossão também referidos como "compostos da invenção" ou "derivados deborrelidina" e estes termos são usados permutavelmente no presente pedido.

Como usado aqui, o termo "câncer" se refere a um novocrescimento maligno que surge a partir de epitélio, encontrado na pele ou,mais comumente, na mucosa de órgãos corporais, por exemplo, mama,próstata, pulmão, rim, pâncreas, estômago ou intestino. Um câncer tende a seinfiltrar em tecido adjacente e se espalhar (metastasiar) para órgãos distantes,por exemplo, para osso, fígado, pulmão ou o cérebro. Como usado aqui otermo câncer inclui tanto tipos metastáticos de célula tumorosa, tal como masnão limitado a, melanoma, linfoma, leucemia, fibrosarcoma,rabdomiosarcoma, como mastocitoma e tipos de carcinoma de tecido, talcomo mas não limitado a, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer depulmão de célula pequena e câncer de pulmão de célula não pequena, câncerde mama, câncer pancreático, câncer de bexiga, câncer renal, câncer gástrico,gliobastoma, câncer de fígado primário e câncer ovariano.

Como usado aqui o termo "malignidades de célula B" incluium grupo de distúrbios que incluem leucemia linfocítica crônica (CLL),mieloma múltiplo, e linfoma não Hodgkin (NHL). Estas são doençasneoplásicas do sangue e órgãos formadores de sangue. Elas causam disfunçãode medula óssea e sistema imune, o que torna o hospedeiro altamentesusceptível a infecção e hemorragia.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos dainvenção tal como os compostos de fórmula (I) incluem sais convencionaisformados a partir de ácidos ou bases inorgânicos ou orgânicosfarmaceuticamente aceitáveis assim como sais de adição de ácido de amônioquaternário. Exemplos mais específicos de sais ácidos adequados incluemclorídrico, bromídrico, sulfürico, fosfórico, nítrico, perclórico, fumárico,acético, propiônico, succínico, glicólico, fórmico, láctico, maléico, tartárico,cítrico, palmóico, malônico, hidroximaléico, fenilacético, glutâmico,benzóico, salicílico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico,naftaleno-2-sulfônico, benzenossulfônico hidroxinaftóico, hidroiódico,málico, esteróico, tânico e os semelhantes. Outros ácidos tais como oxálico,embora não farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis na preparação desais úteis como intermediários para obter os compostos da invenção e seussais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos mais específicos de sais básicosadequados incluem sais de sódio, lítio, potássio, magnésio, alumínio, cálcio,zinco, Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina,etilenodiamina, N-metilglucamina e procaína. Referências daqui por diante aum composto de acordo com a invenção incluem tanto compostos de fórmula(I) como seus sais farmaceuticamente aceitáveis.Grupos alquila, alcenila e alcinila podem ser de cadeia linearou ramificada.

Exemplos de grupos alquila C1-C4 incluem metila, etila, n-propila, i-propila e n-butila.

Grupos cicloalquila de 5 a 7 membros se referem a um anel decicloalquila incluindo 5-7 átomos de carbono que opcionalmente podem serramificados. Exemplos incluem ciclopentila e ciclohexila.

Anéis de heteroalquila de 5 a 7 membros contendo um ou maisheteroátomos selecionados a partir de N, O e S incluem anéis contendo um oudois heteroátomos, especialmente um heteroátomo. Exemplos incluem furano,pirano, oxetano, oxirano, piperidina, pirrolidina, azetidina, aziridina, tiirano,tietano, tiofeno, tiopirano e morfolina.

Anéis aromáticos de 6 membros incluem fenil.

Anéis heteroaromáticos de 5 a 7 membros contendo 1 a 3heteroátomos selecionados a partir de O, N e S incluem anéis de 6 membrostal como piridil e pirimidinil e anéis de 5 membros tal como furanila, pirrolila,imidazolila, tiofenila, oxazolila, oxadiazolila, tiazolil e tiadiazolil.

Descrição da invenção

A presente invenção fornece derivados de borrelidina, comodescrito acima, métodos para a preparação destes compostos, intermediáriosdestes e métodos para o uso destes compostos em medicina.

Adequadamente R9 representa CN.

Adequadamente R1 e R2 junto com os carbonos com os quaiseles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4 membros.

Adequadamente Ri e R2 junto com os carbonos com os quaiseles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4 membros,substituído apenas por R4.Adequadamente X representa -O-. Alternativamente,adequadamente X representa -NH-.

Adequadamente Y representa -NH- ou -O-. Em uma forma derealização Y representa -NH-. Em outra forma de realização Y representa-O-.

Adequadamente R4 representa

<formula>formula see original document page 14</formula>

Adequadamente η representa 1. Alternativamente,adequadamente η representa 2.

Adequadamente R6 representa um anel heteroaromático de 6membros contendo entre um e três átomos de N, S ou O.

Mais adequadamente R6 representa um anel heteroaromáticode 6 membros contendo um átomo de N.

Mais adequadamente R6 representa

<formula>formula see original document page 14</formula>

ou

<formula>formula see original document page 14</formula>

Alternativamente, adequadamente R6 representa um anel deheteroalquil de 6 membros contendo entre um e três átomos de N, S ou O

Mais adequadamente R6 representa

<formula>formula see original document page 14</formula>

Adequadamente, R1 e R2 junto com os carbonos com os quaiseles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4 membros,substituído apenas por R4 que representa

<formula>formula see original document page 14</formula>onde X representa -O- e R5 representa -(CH2)nR6, onde nrepresenta 2 e R6 representa

<formula>formula see original document page 15</formula>

Alternativamente, adequadamente R1 e R2 junto com oscarbonos com os quais eles são acoplados representam um anel decicloalquila de 4 membros substituído apenas por R4 que representa

<formula>formula see original document page 15</formula>

onde X representa -O- e R5 representa -(CH2)nR6, onde nrepresenta 2 e R6 representa

Alternativamente, adequadamente, R1 e R2 junto com oscarbonos com os quais eles são acoplados representam um anel decicloalquila de 4 membros substituído apenas por R4 que representa

<formula>formula see original document page 15</formula>

onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nR6, onde nrepresenta 2 e R6 representa

<formula>formula see original document page 15</formula>

onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nR6, onde nrepresenta 1 e R6 representa

<formula>formula see original document page 15</formula>Alternativamente, adequadamente Ri e R2 junto com oscarbonos com os quais eles são acoplados representam um anel decicloalquila de 4 membros substituído apenas por R4 que representa

<formula>formula see original document page 16</formula>

onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nR6, onde ηrepresenta 1 e R6 representa

<formula>formula see original document page 16</formula>

Alternativamente, adequadamente Rj e R2 junto com oscarbonos com os quais eles são acoplados representam um anel decicloalquila de 4 membros substituído apenas por R4 que representa

<formula>formula see original document page 16</formula>

onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nR6, onde ηrepresenta 2 e R6 representa

Alternativamente, adequadamente R1 e R2 junto com oscarbonos com os quais eles são acoplados representam um anel decicloalquila de 4 membros substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 17</formula>

onde X representa -NH- e R5 representa H.

Em geral, os compostos da invenção são preparados porderivação semi-sintética de um análogo de borrelidina. Análogos deborrelidina podem ser preparados usando métodos como descritos em WO2004/058976, cujo documento é incorporado aqui por referência em suatotalidade.

Em geral, o processo para preparar um composto de fórmula(I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo compreende:(a) reagir um composto de fórmula (II):

<formula>formula see original document page 17</formula>

ou um derivado protegido deste, usando qualquer um dosmétodos descritos em (i) a (viii) abaixo, ou

(b) converter um composto de fórmula (I) ou um sal deste emcomposto de fórmula (I) ou outro sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

ou

(c) desproteger um composto protegido de fórmula (I).

Compostos de fórmula (II) podem ser adequadamenteproduzidos por quaisquer métodos conhecidos por uma pessoa versada naarte. Em particular, de acordo com os métodos descritos em WO2004/058976.

A presente invenção fornece métodos para preparar oscompostos de fórmula (I), em particular usando métodos de esterificação,amidação e redução conhecidos por uma pessoa versada na arte. Em adiçãoaos métodos específicos e referências fornecidas aqui uma pessoa versada naarte também pode consultar referências de livros-texto padrão para métodossintéticos, incluindo, mas não limitado a Vogel's Textbook of PracticalOrganic Chemistry (Furniss et al., 1989) e March's Advanced OrganicChemistry (Smith and March, 2001).

Os compostos de fórmula geral (I) podem ser preparadosadaptando os métodos gerais descritos aqui, por exemplo, usando, mas nãolimitado a, os seguintes processos:

(i) reação de um cloreto ácido formado a partir de umcomposto de fórmula (II) com um álcool ou amina adequada;

(ii) esterificação ou amidação direta de um composto defórmula (II) na presença de carbodiimida, tal como N-(3-dimetilaminopropila)-N'-etilcarbodiimida (EDCI), e uma base;

(iii) transesterificação de um éster, formado a partir de umcomposto de fórmula (II), com um álcool adequado;

(iv) reação de um éster de metila de um composto de fórmula(II) com uma amina adequada;

(v) formação de um éster ativo a partir de um composto defórmula (II), e.g. com 1-hidroxibenztriazol, então reação com um álcool ouamina adequada;

(vi) formação de um anidrido misturado a partir de umcomposto de fórmula (II), e.g. com éster de ácido clorofórmico, então reaçãocom uma amina adequada;

(vii) redução de um anidrido misturado a partir de umcomposto de fórmula (II) com um hidreto metálico a um álcool;

(viii) alquilação e acilação de um álcool primáriopreparado a partir de um composto de fórmula (II).Em particular derivados de éster de um composto de fórmula(II) podem ser mais preferivelmente preparados reagindo um derivado ativadoformado a partir de um composto de fórmula (II) com 1 -hidroxibenztriazol napresença de carbidiimida (tal como N-(3-dimetilaminopropila)-N'-etilcarbodiimida (EDCI)), com um álcool adequado.

Uma tal reação é tipicamente realizada em solventes inertes,tal como mas não limitados a tetrahidrofurano (THF). Em uma tal reação N-(3-dimetilaminopropila)-N'-etilcarbodiimida (EDCI) é usada como acarbodiimida e dimetilaminopiridina (DMAP) é usada como uma base. Éadequado usar um excesso molar de 10 vezes do componente alcoólico. Areação é realizada em uma temperatura entre 0°C e 100°C, preferivelmenteem ambiente (e.g. 25°C), com agitação por entre 1 e 10 h, mas tipicamentepor 3 h.

Derivados de amida de um composto de fórmula (II) podemser prontamente preparados, por exemplo com o derivado de anidridomisturado formou éster de ácido clorofórmico. A reação pode ser realizadaem solventes orgânicos inertes e livres de água tal como, mas não limitados a,THF ou diclorometano (DCM). Trietilamina, piridina e 4-(dimetilamino)piridina podem ser usados como base. Tipicamente a amina aser acoplada pode estar presente em até excesso molar de 10 vezes. A reaçãoé realizada agitando em uma temperatura entre -20°C e 50°C. A reação étipicamente deixada em agitação por entre 1 e 10 h. Em uma forma derealização preferida do processo o anidrido misturado é formado comcloroformiato de isobutila em THF anidro a -20°C, na presença detrietilamina, e acoplamento é realizado durante 3 h depois de adicionarexcesso entre 5 e 10 vezes da amina.

Derivados de álcool primário de um composto de fórmula (II)podem ser preparados a partir de um anidrido misturado e redução comhidreto metálico complexo em THF a -20°C. A alquilação e acilação de taiscompostos pode ser realizada por qualquer método geral, tal como aquelesdescritos em Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (Furniss et al.,1989) e March's Advanced Organic Chemistry (Smith and March, 2001).

Em adição aos métodos específicos e referências fornecidasaqui uma pessoa de verso na arte também pode consultar referências de livro-texto padrão para métodos sintéticos, incluindo, mas não limitado a Vogel'sTextbook of Practical Organic Chemistry (Furniss et al., 1989) e March'sAdvanced Organic Chemistry (Smith and March, 2001).

Em processos (a) e (c), exemplos de grupos protetores e dosmeios para sua remoção podem ser encontrados em T W Greene "ProtectiveGroups in Organic Synthesis" (J Wiley and Sons, 1991). Grupos protetores dehidroxila adequados incluem alquila (e.g. metila), acetal (e.g. acetonida) e acil(e.g. acetila ou benzoíla) que podem ser removidos por hidrólise, e arilalquil(e.g. benzila) que pode ser removido por hidrogenólise catalítica, ou éter desilila, que pode ser removido por hidrólise ácida ou clivagem auxiliada poríon fluoreto. Grupos protetores de amina adequados incluem sulfonil (e.g.tosila), acil (e.g. benziloxicarbonila ou t-butoxicarbonila) e arilalquil (e.g.benzila) que podem ser removidos por hidrólise ou hidrogenólise comoapropriado.

Outros compostos da invenção podem ser preparados pormétodos conhecidos por si ou por métodos análogos àqueles descritos acima.

Os compostos da invenção são úteis diretamente, e comomodelos para semi-síntese ou bioconversão adicional, para produzircompostos úteis como agentes anticâncer. Métodos para a derivação semi-sintética de borrelidina foram descritos em WO 01/09113.

As estruturas acima de intermediários (e.g. compostos defórmula (II)) podem ser sujeitas a tautomerização e onde um tautômerorepresentativo é ilustrado será entendido que e todos os tautômeros, porexemplo, compostos cetônicos onde compostos enólicos são ilustrados e viceversa são pretendidos para serem referidos como.

A invenção propicia adicionalmente o uso de um composto dainvenção no tratamento de câncer ou malignidades de célula B. Ela tambémfornece um composto da invenção para uso no tratamento de câncer oumalignidades de célula B. Ela também fornece um método de tratamento decâncer ou malignidades de célula B que compreende administrar a umpaciente uma quantidade eficaz de um composto da invenção. Ela tambémfornece o uso de um composto da invenção na preparação de ummedicamento para o tratamento de câncer ou malignidades de célula B.

Borrelidina também é conhecida por ter utilidades notratamento de outras condições, incluindo, mas não limitado a infecçõesbacterianas, infecções virais e malária e em outras doenças nas quaisangiogênese está implicada no processo patogênico, incluindo, mas nãorestrito a, as seguintes: artrite reumatóide, psoríase, arteriosclerose, retinopatiadiabética e vários distúrbios oftálmicos. Os usos e métodos envolvendo oscompostos da invenção também se estendem a estas outras indicações.

Em uma forma de realização preferida, a presente invençãofornece compostos com utilidade no tratamento de câncer ou malignidades decélula B. Alguém versado na arte será capaz por experimentação de rotina dedeterminar a capacidade destes compostos de inibir crescimento de célula detumor (veja, por exemplo, os métodos descritos em Roth et ai., 1999 eDengler et ai., 1995 e os métodos descritos nos Exemplos aqui).

A presente invenção também fornece uma composiçãofarmacêutica compreendendo um derivado de ansamicina, ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmos, junto com um carreadorfarmaceuticamente aceitável.

Os compostos mencionados acima da invenção ou umaformulação destes podem ser administrados por qualquer métodoconvencional, por exemplo, mas sem limitação eles podem ser administradosparenteralmente (incluindo administração intravenosa), oralmente,topicamente (incluindo bucal, sublingual ou transdérmica), através de umdispositivo médico (e.g. uma endoprótese expansível), por inalação, ouatravés de injeção (subcutânea ou intramuscular). O tratamento pode consistirde uma única dose ou uma pluralidade de doses durante um período de tempo.

Embora seja possível para um composto da invenção seradministrado sozinho, é preferível apresentá-lo como uma formulaçãofarmacêutica, junto com um ou mais carreadores aceitáveis. Assim éfornecida uma composição farmacêutica compreendendo um composto dainvenção junto com um ou mais diluentes ou carreadores farmaceuticamenteaceitáveis. O(s) diluente(s) ou carreador(es) devem ser "aceitáveis" no sentidode serem compatíveis com o composto da invenção e não deletérios aosdestinatários deste. Exemplos de carreadores adequados são descritos em maisdetalhe abaixo.

Os compostos da invenção podem ser administrados sozinhosou em combinação com outros agentes terapêuticos. Co-administração de dois(ou mais) agentes pode possibilitar doses significantemente mais baixas decada um a ser usado, com isso reduzindo os efeitos colaterais vistos. Tambémé fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um composto dainvenção e um agente terapêutico adicional junto com um ou mais diluentesou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

Em um aspecto adicional, a presente invenção sustenta o usode um composto da invenção em terapia de combinação com um segundoagente para o tratamento de câncer ou malignidades de célula B.

Em uma forma de realização, um composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento de câncer oumalignidades de célula B agentes preferidos incluem, mas não são limitadosa, metotrexato, leucovorina, adriamicina, prenisona, bleomicina,ciçlofosfamida, 5-fluorouracila, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina,vinorelbina, doxorubicina, tamoxifeno, toremifeno, megestrol acetato,anastrozol, goserelina, anticorpo monoclonal anti- HER2 (e.g. Herceptin™),capecitabina, cloridrato de raloxifeno, inibidores de EGFR (e.g. IressaTarceva™, Erbitux™), inibidores de HSP90 (e.g. 17-(alilamino)-17-demetoxigeldanamicina (17-AAG) ou 17-(dimetilaminoetilamino)-17-demetoxigeldanamicina (17-DMAG)), inibidores de mTOR (e.g. rapamicina,CCI-779, RADOO1) ou inibidores de VEGF (e.g. Avastin™), inibidores deproteassomo (e.g. Velcade™) ou Glivec ® . Adicionalmente, um composto dainvenção pode ser administrado em combinação com outras terapiasincluindo, mas não limitado a, radioterapia ou cirurgia.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas emforma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer dos métodosbem conhecidos na arte de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de colocarem associação o ingrediente ativo (composto da invenção) com o carreadorque constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral as formulaçõessão preparadas colocando uniformemente e intimamente o ingrediente ativoem associação com carreadores líquidos ou carreadores sólidos finamentedivididos ou ambos, e então, se necessário, modelando o produto.

Os compostos da invenção normalmente serão administradosoralmente ou por qualquer via parenteral, na forma de uma formulaçãofarmacêutica compreendendo o ingrediente ativo, opcionalmente na forma deum ácido orgânico, ou inorgânico não tóxico, ou base, sal de adição, em umaforma de dosagem farmaceuticamente aceitável. Dependendo do distúrbio epaciente a ser tratado, assim como da via de administração, as composiçõespodem ser administradas em doses variadas.

Por exemplo, os compostos da invenção podem seradministrados oralmente, bucalmente ou sublingualmente na forma decomprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podemconter agentes aromatizantes ou corantes, para aplicações de liberaçãoimediata, atrasada ou controlada.

Tais comprimidos podem conter excipientes tal como celulosemicrocristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálciodibásico e glicina, desintegrantes tal como amido (preferivelmente amido demilho, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose de sódioe certos silicatos complexos, e ligantes de granulação tal comopolivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxi-propilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia. Adicionalmente, agenteslubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato deglicerila e talco podem ser incluídos.

Composições sólidas de um tipo similar também podem serempregadas como materiais de enchimento em cápsulas de gelatina.Excipientes preferidos neste sentido incluem lactose, amido, uma celulose,açúcar do leite ou polietilenoglicóis de alto peso molecular. Para suspensõesaquosas e/ou elixires, os compostos da invenção podem ser combinados comvários agentes adoçantes ou aromatizantes, matéria corante ou corantes, comagentes emulsificantes e/ou suspensores e com diluentes tais como água,etanol, propilenoglicol e glicerina, e combinações destes.

Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldando,opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos quepassaram por compressão podem ser preparados comprimindo em umamáquina adequada o ingrediente ativo em uma forma de fluxo livre tal comoum pó ou grânulos, opcionalmente misturado com um ligante (e.g. povidona,gelatina, hidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte,conservante, desintegrante (e.g. glicolato de amido de sódio, povidonareticulada, carboximetil celulose de sódio reticulada), agente ativo emsuperfície ou dispersante. Comprimidos modulados podem ser feitosmoldando em uma máquina adequada uma mistura do composto em póumedecida com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem seropcionalmente revestidos ou marcados e podem ser formulados de forma afornecer liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo neste usando, porexemplo, hidroxipropilmetilcelulose em proporções variadas para fornecerperfil de liberação desejado.

Formulações em conformidade com a presente invençãoadequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidadesdistintas tal como cápsulas, hóstias ou comprimidos, cada uma contendo umaquantidade pré-determinada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos;como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquidonão aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou uma emulsãolíquida de água em óleo. O ingrediente ativo também pode ser apresentadocomo um bolo, electuário ou pasta.

Formulações adequadas para administração tópica na bocaincluem pílulas compreendendo o ingrediente ativo em uma base aromatizada,normalmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas compreendendo oingrediente ativo em uma base inerte tal como gelatina e glicerina, ousacarose e acácia; e antissépticos bucais compreendendo o ingrediente ativoem um carreador líquido adequado.

Deve ser entendido que em adição aos ingredientesparticularmente mencionados acima as formulações desta invenção podemincluir outros agentes convencionais na arte levando em consideração o tipode formulação em questão, por exemplo, aqueles adequados paraadministração oral podem incluir agentes aromatizantes.

Composições farmacêuticas adaptadas para administraçãotópica podem ser formuladas como pomadas, cremes, suspensões, loções, pós,soluções, pastas, géis, curativos impregnados, líquidos pulverizáveis,aerossóis ou óleos, dispositivos transdérmicos, pós polvilháveis, e ossemelhantes. Estas composições podem ser preparadas através de métodosconvencionais contendo o agente ativo. Assim, elas também podemcompreender carreadores e aditivos convencionais compatíveis, tal comoconservantes, solventes para auxiliar penetração de droga, emoliente emcremes ou pomadas e etanol ou álcool oleílico para loções. Tais carreadorespodem ser apresentados como a partir de cerca de 1% até cerca de 98% dacomposição. Mais normalmente eles irão formar até cerca de 80% dacomposição. Apenas como uma ilustração, um creme ou pomada é preparadomisturando quantidades suficientes de material hidrofílico e água, contendode cerca de 5-10% em peso do composto, em quantidades suficientes paraproduzir um creme ou pomada tendo a consistência desejada.

Composições farmacêuticas adaptadas para administraçãotransdérmica podem ser apresentadas como esparadrapos discretospretendidos para permanecer em íntimo contato com a epiderme dodestinatário por um período prolongado de tempo. Por exemplo, o agenteativo pode ser liberado do esparadrapo por iontoforese.

Para aplicações a tecidos externos, por exemplo a boca e pele,as composições são preferivelmente aplicadas como uma pomada ou cremetópico. Quando formulado em uma pomada, o agente ativo pode serempregado ou com uma base de pomada parafínica ou miscível em água.

Alternativamente, o agente ativo pode ser formulado em umcreme com uma base de creme de óleo em água ou uma base de água em óleo.

Para administração parenteral, formas fluidas de dosagemunitária são preparadas utilizando o ingrediente ativo e um veículo estéril, porexemplo, mas sem limitação água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais,sendo preferido água. O ingrediente ativo, dependendo do veículo econcentração usada, pode ser ou suspenso ou dissolvido no veículo. Aopreparar soluções o ingrediente ativo pode ser dissolvido em água parainjeção e esterilizado por filtro antes de encher em um frasco adequado ouampola e vedação.

Vantajosamente, agentes tais como anestésicos locais,conservantes e agentes tamponantes podem ser dissolvidos no veículo. Paraacentuar a estabilidade, a composição pode ser congelada depois deenchimento no frasco e a água removida sob vácuo. O pó liofilizado seco éentão vedado no frasco e um frasco acompanhante de água para injeção podeser fornecido para reconstituir o líquido antes de uso.

Suspensões parenterais são preparadas substancialmente damesma maneira que soluções, exceto que o ingrediente ativo é suspenso noveículo ao invés de ser dissolvido e esterilização não pode ser realizada porfiltração. O ingrediente ativo pode ser esterilizado por exposição a óxido deetileno antes de suspender no veículo estéril. Vantajosamente, um tensoativoou agente umectante é incluído na composição para facilitar distribuiçãouniforme do ingrediente ativo.

Os compostos da invenção também podem ser administradosusando dispositivos médicos conhecidos na arte. Por exemplo, em uma formade realização, uma composição farmacêutica da invenção pode seradministrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, talcomo os dispositivos descritos em Patente US 5.399.163; Patente US5.383.851; Patente US 5.312.335; Patente US 5.064.413; Patente US4.941.880; Patente US 4.790.824; ou Patente US 4.596.556. Exemplos deimplantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem:Patente US 4.487.603, que descreve uma bomba de micro-infusão implantávelpara dispensar medicação em uma taxa controlada; Patente US 4.486.194, quedescreve um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos atravésda pele; Patente US 4.447.233, que descreve uma bomba de infusão demedicamento para liberar medicação em uma taxa de infusão precisa; PatenteUS 4.447.224, que descreve um aparato de infusão implantável de fluxovariável para liberação contínua de droga; Patente US 4.439.196, quedescreve um sistema osmótico de liberação de droga tendo compartimentos demúltiplas câmaras; e Patente US 4.475.196, que descreve um sistemaosmótico de liberação de droga. Muitos outros tais implantes, sistemas deliberação, e módulos são conhecidos por aqueles versados na arte.

A dosagem a ser administrada de um composto da invenção irávariar de acordo com o composto particular, a doença envolvida, o sujeito, e a natureza e severidade da doença e a condição física do sujeito, e a via deadministração selecionada. A dosagem apropriada pode ser prontamentedeterminada por uma pessoa versada na arte.

As composições podem conter de 0,1% em peso,preferivelmente de 5-60%, mais preferivelmente de 10-30% em peso, de um composto da invenção, dependendo do método de administração.

Será reconhecido por alguém de verso na arte que a quantidadeótima e espaçamento de dosagens individuais de um composto da invençãoserão determinados pela natureza e grau da condição sendo tratada, pelaforma, via e sítio de administração, e pela idade e condição do sujeitoparticular sendo tratado, e que um médico irá, no final das contas, determinardosagens apropriadas a serem usadas. Esta dosagem pode ser repetida tantasvezes quanto apropriado. Se efeitos colaterais se desenvolvem a quantidadee/ou freqüência da dosagem pode ser alterada ou reduzida, em conformidadecom prática clínica normal.

Breve descrição das figuras

Figura 1: ilustra a estrutura de borrelidina e algunsmetabólitos relacionados isolados de organismos produtores de borrelidina

Figura 2: mostra os espectros 1H RMN para 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (4-(2-hidroxietila))morfolina éster (7)

Figura 3: mostra os espectros 1H RMN para 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácidocarboxílico)borrelidina (2-(2-hidroxietila)piridina éster (8)

Figura 4: mostra os espectros 1H RMN para 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácidocarboxílico)borrelidina (4-(2-aminoetila))morfolina amida (9)

Figura 5: mostra os espectros 1H RMN para 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácidocarboxílico)borrelidina (4-aminometila)piridina amida (10)

Figura 6: mostra os espectros 1H RMN para 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácidocarboxílico)borrelidina (3-aminometila)piridina amida (11)

Figura 7: mostra os espectros 1H RMN para 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácidocarboxílico)borrelidina (2-aminometila)piridina amida (12)

Figura 8: mostra os espectros 1H RMN para 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácidocarboxílico)borrelidina (3-(2-aminoetila))piridina amida (13)

Figura 9: mostra os espectros 1H RMN para 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácidocarboxílico)borrelidina amida (14)

Figura 10:Estruturas dos compostos (6-14) produzidos nosexemplos.

EXEMPLOS

Métodos Gerais

Fermentação de culturas

A produção de análogos de borrelidina foi realizada comodescrito previamente em WO 2004/058976 e um exemplo típico é fornecidoabaixo (Exemplo 1).

Procedimento de análise LCMS para análise de caldo defermentação e estudos de transformação in vivo

Caldo de cultura (1 mL) e acetato de etila (1 mL) forammisturados por 15 min seguido por centrifugação por 10 min. 0,5 mL dacamada orgânica foi coletado, evaporado até secura e então re-dissolvido em0,25 mL de metanol. LCMS foi realizado em um sistema integrado AgilentHPllOO HPLC em combinação com um espectrômetro de massa porelectrospray Bruker Daltonics Esquire 3000+ operando em modo de íonpositivo. Cromatografia foi atingida por uma coluna Phenomenex Hyperclone(C18 BDS, 3u, 150 χ 4,6 mm) eluindo durante 25 min em uma vazão de 1mL/min com um gradiente linear de água + 0,1% de ácido fórmico paraacetonitrila + 0,1% de ácido fórmico.

Síntese

Todas as reações foram conduzidas em condições anidras amenos que de outra maneira determinado, em vidraria seca no forno que foiresfriado sob vácuo, e usando solventes secos. Reações foram monitoradaspor LC-UV-MS em instrumento quádruplo simples Micromass Platform.Cromatografia foi atingida por sílica de fase reversa usando uma colunaAtlantis dC18 (50 χ 2,1 mm, 5 mícron) eluindo em 1 ml/min com o seguintegradiente: T = O, 100% A; T = 2,5, 100% B; fase móvel A, água + 0,1% deácido fórmico; fase móvel B, acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico. Detecçãode UV foi realizada em 215 nm.

Verificação de solubilidade em água

Solubilidade em água pode ser testada como segue: Umasolução estoque de 10 mM do análogo de Borrelidina é preparada em 100%de DMSO em temperatura ambiente. Alíquotas de 0,01 mL triplicadas sãoconstituídas para 0,5 mL ou com solução de 0,1 M de PBS, pH 7,3 ou 100%de DMSO em frascos de âmbar. As soluções resultantes de 0,2 mM sãoagitadas no escuro, em temperatura ambiente em um agitador IKA® vibraxVXR por 6 h, seguido por transferência das soluções ou suspensõesresultantes em tubos Eppendorf de 2 mL e centrifugação por 30 min a 13200rpm. Alíquotas do fluido de sobrenadante são então analisadas pelo método deLCMS como descrito acima.Verificação de permeabilidade celular

Permeabilidade celular pode ser testada como segue: Ocomposto de teste é dissolvido para 10mM em DMSO e então diluídoadicionalmente em tampão para produzir uma concentração de dosagem finalde 10μΜ. O marcador de fluorescência amarelo lúcifer também é incluídopara monitorar integridade de membrana. Composto de teste é então aplicadoà superfície apical de monocamadas de célula Caco-2 e permeação decomposto no compartimento basolateral é medida. Isto é realizado na direçãoreversa (basolateral para apical) para investigar transporte ativo. LC-MS/MS éusado para quantificar níveis tanto do composto de teste como de controlepadrão (tal como Propanolol e Acebutolol).

Determinação de estrutura RMN de compostos sintéticos

Espectros 1H RMN foram registrados em 400 MHz em umamáquina Bruker 400. Compostos foram dissolvidos em CDC13 e referenciadoscomo o próton residual ressonante em d = 7,26 ppm.

Bioensaio in vitro para atividade anticâncer

Avaliação in vitro de compostos para atividade anticâncer emum quadro de 12 linhagens humanas de célula de tumor em um ensaio deproliferação em monocamada foi realizada no Oncotest Testing Facility,Institute for Experimental Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg. Ascaracterísticas das 12 linhagens celulares selecionadas estão resumidas em

Tabela I.

Tabela I - Linhagens celulares de teste

<table>table see original document page 31</column></row><table>10 UXF 1138L Útero

11 LNCAP Próstata - PTEN negativo

12 DU145_Próstata - PTEN positivo_

As linhagens celulares de Oncotest foram estabelecidas a partirde xenoenxertos de tumor humano como descrito por Roth et al., (1999). Aorigem dos xenoenxertos doadores foi descrita por Fiebig et al., (1999).Outras linhagens celulares foram ou obtidas a partir do NCI (H460, SF-268,OVCAR-3, DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-468) ou adquiridas a partir deDSMZ3 Braunschweig, Germany (LNCAP).

Todas as linhagens celulares, a menos que de outra formaespecificado, foram cultivadas a 37 0C em uma atmosfera umidificada (95 %de ar, 5 % de CO2) em um meio 'pré-misturado' contendo meio RPMI 1640,10 % de soro bovino fetal, e 0,1 mg/mL de gentamicina (PAA, Coíbe,Germany).

Ensaio de monocamada - breve descrição de protocolo:

Um ensaio modificado de iodeto de propídio foi usado paraverificar os efeitos do(s) composto(s) de teste no crescimento de linhagenscelulares de tumor humano (Dengler et al., (1995)).

Resumidamente, células foram coletadas de culturas em faseexponencial por tripsinização, contadas e emplacadas em placas demicrotítulo de fundo plano de 96 poços em uma densidade celular dependenteda linhagem celular (5 - 10.000 células viáveis/poço). Depois de recuperaçãopor 24 h para permitir que células retornem ao crescimento exponencial,0,010 mL de meio de cultura (6 poços de controle por placa) ou meio decultura contendo macbecina foram adicionados aos poços. Cada concentraçãofoi emplacada em triplicata. Compostos foram aplicados em duasconcentrações (0,001 mM e 0,01 mM). Seguindo 4 dias de exposiçãocontínua, meio de cultura celular com ou sem composto de teste foisubstituído por 0,2 mL de uma solução aquosa de iodeto de propídio (PI) (7mg/L). Para medir a proporção de células vivas, células forampermeabilizadas congelando as placas. Depois de descongelar as placas,fluorescência foi medida usando o leito de microplaca Cytofluor 4000(excitação 530 nm, emissão 620 nm), gerando uma relação direta para onúmero total de células viáveis.

A inibição de crescimento média através do quadro de 12linhagens celulares foi expressa como tratado/controle χ 100 (% T/C).

A atividade de análogos de borrelidina mostrada neste ensaiode inibição de crescimento de célula de câncer é pensada ocorrer amplamenteatravés de inibição de treonil tRNA sintetase.

Exemplo 1: Fermentação e isolamento de 17-des(ciclopentano-2-ácidocarboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (6)

O exemplo dado é específico para a produção de 6 mas ométodo geralmente é para todos os análogos de borrelidina, uma pessoa deverso na arte irá perceber como adaptar o método específico descrito abaixopara a produção de análogos de borrelidina alternativos. Fermentadores 3x7L Applikon foram corridos como descrito e os caldos de fermentaçãocombinados para extração.

Um frasco de inseminação contendo meio NYG (30 mL emum frasco Erlenmyer de 250 mL) foi inoculado com S. parvulusTü4055/borG::aac3(IV)) (WO 2004/058976) de uma cultura estoquemiceliana (0,5 mL; gerada por diluição 1:1 de uma cultura inseminada de 2dias com crio-conservante (20% w/v de glicerol e 10% w/v de lactose emágua deionizada)). Meio NYG contém, em água deionizada: extrato de carne(0,3% w/v), Bacto peptona (0,5% w/v), glicose (1% w/v) e extrato delevedura (0,5% w/v).

Sementes secundárias também foram preparadas como acima(mas com 250 mL de NYG em frascos Erlenmyer de 2 L). Meio de produçãoPYDG (4 L) com 0,01% v/v de Pluronic L0101 para prevenir espumação foiinoculado com os inóculos de semente secundária (10% v/v). Meio PYDGcontém, em água deionizada: nutriente de leite peptonizado (1,5% w/v),autolisado de levedura (0,15% w/v), dextrina (4,5% w/v) e glicose (0,5% w/v)ajustado para pH 7,0. Isto foi deixado para fermentar em um fermentadorApplikon de 7 L por 6 dias a 30 °C. Depois de 24 h ciclobutanol,2-trans-diácido carboxílico em metanol foi adicionado para gerar uma concentraçãofinal de 4 mM. Fluxo de ar foi ajustado em 0,75 vvm, com septos inclinados ea velocidade de impulsão controlada eletronicamente entre 250 e 600 rpm afim de manter tensão de oxigênio dissolvido em ou acima 30% de saturaçãodo ar. O caldo de fermentação de três tais fermentadores foi combinado (12 L)e ensaiado; um total de 339 mg de 6 foi produzido (em um título médio 28 mg/L).

O caldo de fermentação foi ajustado para pH -5.5 (conc. HCl)e então clarificado por centrifugação. O sobrenadante foi extraído cometilacetato (2x1 volume equivalente), e a pelota celular extraída com metanol(2x1 volume equivalente). Os extratos orgânicos combinados foramevaporados para produzir uma suspensão aquosa marrom. Esta foi diluídacom água (para 1 L) e extraída com etilacetato (3x1 L). Os extratosorgânicos combinados foram evaporados para produzir óleo marrom (-4,5 g).O óleo foi dissolvido em acetona, gel de sílica "flash" 60 foi adicionado (150g) e o solvente removido por evaporação. Este foi aplicado a uma coluna desílica "flash" (5 χ 25 cm) pré-preparada em heptano. A coluna foi eluída comum gradiente escalonado de 100% de heptano a 100% de acetato de etila.Frações contendo 6 foram identificadas por TLC, combinadas, e o solventeremovido por evaporação para gerar um óleo amarelo (-1 g). Este óleo foientão dissolvido no volume mínimo de mistura de solvente(heptanoiCHC^ietanol, 10:10:1) e aplicado a uma coluna de Sephadex LH-20(2,5 χ 60 cm) pré-preparada na mesma mistura de solvente. The column waseluted under gravity with approx. 3 L da mesma mistura de solvente,coletando frações de 12 mL. Frações contendo 6 foram combinadas e osolvente removido por evaporação. O sólido amarelo pálido resultante (550mg) foi cristalizado dissolvendo em uma quantidade mínima de CHCl3 eentão adicionando hexano até que se tornasse nebuloso. A solução resultantefoi armazenada a -20°C durante a noite e o sólido resultante coletado porfiltração e então lavado com hexano frio. O licor mãe foi tratado similarmentede novo. Os dois grupos foram combinados para produzir 6 (190 mg).Espectros RMN para 6 foram registrados em umespectrômetro Bruker Advance 500 a 298 K operando em 500 MHz e 125MHz para He C respectivamente. Programas de pulso Bruker padrão foramusados para adquirir os espectros 1H-1H COSY, APT, HMQC e HMBC;constantes de acoplamento são dadas em hertz. Experimentos RMN foramcorridos em CDCl3 e foram referenciados para o próton residual ressonanteem dH 7,26 e carbono em dc 77,0 para CDCl3.

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TabelaII

<table>formula see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table>

ESI-MS m/z: 498,4 [M+Na]+, 476,3 [M+H]+, 458,4 [M-18]+;474,5 [M-H]\ 456,4 [M-18]"

UV: Imax(DAD) = 258 nm

Exemplo 2: Síntese de 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (4-(2-hidroxietila))morfolinaéster (7)

Uma solução agitada de análogo de borrelidina 6 (125 mg,0,263 mmol) em tetrahidrofurano anidro (THF) (7 mL) foi tratada sobnitrogênio com 1-hidroxitriazol (35 mg, 0,263 mmol), N-(3-dimetilaminopropila)-N'-etilcarbodiimida (EDCI) (64 mg, 0,33 mmol) eDMAP (73 mg, 0,60 mmol). Depois de 30 min 4-(2-hidroxietila)morfolina(344 mg, 0,32 mL, 2,63 mmol) foi adicionada. Depois de 3 h adicionais amistura foi evaporada até secura. O resíduo foi absorvido em diclorometano(DCM), lavado duas vezes com água e seco por sulfato de magnésio. Depoisde filtração e evaporação o resíduo foi purificado por 'Combiflash' eluindocom um gradiente de 0-90% de acetato de etila em DCM. O produto foievaporado até secura e azeotropado duas vezes com clorofórmio para produzirum vidro sem cor. Produção = 61 mg, 39%. Pureza (por LCMS) >95%. 1HRMN foi consistente com o composto correto (Figura 2).

Exemplo 3: Síntese de 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (2-(2-hidroxietila)piridina éster (8)

Este composto foi preparado como descrito em exemplo 2usando as mesmas quantidades de material mas com 2-(2-hidroxietila)piridina(323 mg, 0,30 mL, 2,63 mmol) em lugar da 4-(2-hidroxietila)morfolina.

Produção = 89 mg, 58%. Pureza (por LCMS) >95%. 1H RMN foi consistentecom o composto correto (Figura 3).

Exemplo 4: Síntese de 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (4-(2-aminoetila))morfolinaamida (9)

Uma solução agitada de 6 (100 mg, 0,204 mmol) em THF seco(7,5 mL) foi resfriada para -20°C e tratada, sob nitrogênio, com trietilaminaseca (0,03 mL, 0,225 mmol) seguido por cloroformiato de isobutila (0,03 mL,0,225 mmol). Depois de agitar a -20°C por 30 min a mistura foi filtrada pararemover cloridrato de trietilamina. O filtrado foi novamente resfriado a -20°Ce tratado, sob nitrogênio, com 4-(2-aminoetila)morfolina (0,17 mL, 1,3mmol). A temperatura foi deixada crescendo até ambiente pelas próximas 3 h,depois de cujo tempo a mistura foi evaporada até secura. O resíduo foiabsorvido em DCM, lavado três vezes com água e seco por sulfato demagnésio. Depois de filtragem o solvente foi removido por evaporação emtemperatura ambiente. O produto foi purificado por 'Combiflash' eluindo comum gradiente de 0-90% de acetato de etila em DCM, seguido por 5% detrietilamina em acetato de etila. Depois de evaporação o produto foi obtidocomo um vidro ligeiramente amarelo. Produção = 84 mg, 54%. Pureza (porLCMS) >99%. 1H RMN foi consistente com o composto correto (Figura 4).

Exemplo 5: Síntese de 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (4-aminometila)piridina amida(10)

Este composto foi preparado como descrito em exemplo 4 masusando as seguintes quantidades de material: análogo de borrelidina 6 (125mg, 0,263 mmol), THF seco (10 mL), trietilamina seca (29 mg, 0,04 mL,0,289 mmol), cloroformiato de isobutila (39 mg, 0.04 mL, 0,289 mmol) e 4-(aminometila)piridina (181 mg, 0,17 mL, 1,68 mmol). Purificação foirealizada usando 'Combiflash' usando 0-90% de acetato de etila em DCM,seguido por acetato de etila líquido. O produto foi isolado como um sólidobranco. Produção = 32 mg, 21,5%. Pureza (por LCMS) >97%. 1H RMN foiconsistente com o composto correto mas requereu a adição de algum d6-DMSO para auxiliar solubilidade do produto (Figura 5).Exemplo 6: Síntese de 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (3-aminometila)piridina amida (11)

Este composto foi preparado como descrito em exemplo 4usando as mesmas quantidades de material mas com 3-(aminometila)piridina(181 mg, 0,17 mL, 1,68 mmol) em lugar de 4-(2-aminoetila)morfolina.Purificação foi realizada usando 'Combiflash' usando 0-90% de acetato de etila seguido por 90% de acetato de etila em DCM (o produto eluído depoisde um subproduto). O produto foi azeotropado duas vezes com clorofórmiopara gerar um vidro sem cor. Produção =121 mg, 81%. Pureza (por LCMS)100%. 1H RMN foi consistente com o composto correto (Figura 6).Exemplo 7: Síntese de 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (2-aminometila)piridina amida(12)

Este composto foi preparado como descrito em exemplo 4usando as mesmas quantidades de material mas com 2-(aminometila)piridina(181 mg, 0,17 mL, 1,68 mmol) em lugar de 4-(2-aminoetila)morfolina.Purificação como exemplo 4 para gerar o produto como um vidro sem cor.

Produção = 137 mg, 92%. Pureza (por LCMS) 100%. 1H RMN foi consistentecom o composto correto (Figura 7).

Exemplo 8: Síntese de 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (3-[2-aminoetila))piridina amida

Este composto foi preparado como descrito em exemplo 4usando as mesmas quantidades de material mas com 3-(2-aminoetila)piridina(205 mg, 0,27 mL, 1,68 mmol) em lugar de 4-(2-aminoetila)morfolina.

Purificação como exemplo 4 para gerar o produto como um vidro sem cor.Produção = 98 mg, 64%. Pureza (por LCMS) 100%. 1H RMN foi consistentecom o composto correto (Figura 8).

Exemplo 9: Síntese de 17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina amida (14)

Este composto foi preparado como descrito em exemplo 4usando as mesmas quantidades de material mas com amônia aquosa (0,1 mL)em lugar de 4-(2-aminoetila)morfolina. Três gotas de ácido acético glacialforam adicionadas imediatamente antes de processamento e então purificaçãocomo exemplo 4 para gerar o produto como um vidro sem cor. Produção = 90mg, 72%. Pureza (por LCMS) >99%. 1H RMN foi consistente com ocomposto correto (Figura 9).

Exemplo 10: Estudos de clivagem de derivados de éster 7 & 8 e derivados deamida 9 & 13

Compostos 7, 8, 9 & 13 foram incubados em sangue de rato eavaliados por sua clivagem para gerar o ácido parental 6.

Compostos 7, 8, 9 & 13 foram adicionados a sangue de rato(contendo EDTA) em uma concentração final de 0,01 mg/mL e incubados a37 °C. Amostras foram tomadas em 2, 30, 60, 120 e 180 minutos e extraídasusando cartuchos SPE. Resumidamente, amostra (0,1 mL) foi transferida paraum tubo de propileno de 2 mL e padrão interno foi adicionado. A amostra foidiluída para um volume de 1 mL por adição de 0,1 M de KH2PO4 aquoso. Aamostra foi turbilhonada por um período de 5 min e centrifugada a 3000 rpmpor 5 min. Um cartucho Oasis MAX (1 cc/30 mg) foi condicionado com 1 mL de MeOH e 1 mL de água sucessivamente. O sobrenadante foi transferidopara o cartucho condicionado em uma vazão de 1-2 mL/min. O cartucho foilavado com 2% de NH4OH em água e 30 % de MeOH (contendo 2 % deácido fórmico) a 1-2 mL/min. Finalmente, o analito foi eluído com 80 % deMeOH (contendo 2 % de ácido fórmico) a 1-2 mL/min. Os extratos foram transferidos para frascos de amostrador automático e imediatamenteanalisados por LC/MS. Amostras foram comparadas com uma curva decalibração padrão para 6.

As amostras com tempo de 2 minutos para cada compostoforam serialmente diluídas depois de extração e analisadas por LC-MS para assegurar que sua resposta fosse linear ao longo de um intervalo deconcentração de 3-100%. LCMS foi realizado em um espectrômetro de massaBruker Daltonics Esquire 3000+ equipado com uma fonte de electrosprayacoplada ao HPLC. As condições de HPLC foram: 20 % de B por 1 minseguido por um gradiente linear para 100 % de B por um período de 7 min eum período isocrático de 2 min a 100 % de B. Volume de injeção: 0,05 mL.HPLC foi realizado em uma coluna Waters Symmetry C8 de 3,5 microns, 50mm χ 2,1 mm, correndo uma fase móvel de: fase móvel A: 0,1% de ácidofórmico em água; fase móvel B: 0,1% de Ácido fórmico em acetonitrila;vazão: 1 mL/minuto.

Composto 6 mostra um íon [M-H]" intenso a m/z 474.

Fragmentação desta espécie molecular resulta em um espectro com íonsintensos a m/z 271 e 412. O íon irmão a m/z 412 pode ser idealmenteselecionado para quantificação.

Usando estes métodos os derivados de amida 9 & 13 seclivaram para gerar qualquer composto parental 6. Os dois derivados de éster7 & 8 se clivaram rapidamente para gerar o composto parental 6. A meia-vidapara a clivagem de 7 foi estimada em 12 min, e para 8 a taxa de clivagem foimuito rápida para calcular usando este protocolo.

Baseado nestes dados os derivados de éster 7 e 8 sãoconsiderados como atuando como pró-fármacos potenciais de 6. Os derivadosde amida não funcionam do como pró-fármacos de 6.

Exemplo 11 :Dados biológicos - Avaliação in vitro de atividade anticâncerdos derivados de borrelidina

Avaliação in vitro dos compostos de teste para atividadeanticâncer em um quadro de linhagens celulares de tumor humano em umensaio de proliferação em monocamada foi realizada como descrito nosmétodos gerais usando um ensaio modificado de iodeto de propídio. Estatriagem pode ser usada como um modelo para os efeitos tóxicos de compostosao inibir crescimento celular geral.

Os resultados são apresentados em Tabela III abaixo; cadaresultado representa a média de experimentos em triplicata, exceto paracompostos 1 e 6 para os quais os resultados representam a média deexperimentos em duplicata.

Tabela III -dados de linhagem celular in vitro

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Compostos 9, 10, 11, 12, 13 e 14 resultaram em pouca ounenhuma inibição de crescimento celular a 1 mM e portanto estes compostospodem ser dito terem um perfil de segurança relativamente bom. Compostos7 e 8 foram melhorados em relação a composto 6 o próprio melhorado emrelação a composto 1.

Exemplo 12: Dados biológicos - avaliação de atividade anti-angiogênica dederivados de borrelidina usando um ensaio de membrana corioalantóica(CAM) de frango

Ovos férteis frescos foram incubados por 3 dias em umaincubadora de ovos padrão a 37°C por 3 dias. Em Dia 3, ovos foram rachadosem condições estéreis e embriões foram colocados em placas de plástico de20 χ 100 mm e cultivados a 37°C em uma incubadora de embriões com umreservatório de água na prateleira de baixo. Ar foi continuamente borbulhadono reservatório de água usando uma bomba pequena de forma que a umidadena incubadora foi mantida constante. Em Dia 6, um anel "o" de siliconeestéril foi colocado em cada CAM e uma quantidade estabelecida decomposto de teste dissolvida em 10 μΐ de 0,5% de metilcelulose foi liberadaem cada anel "o" em uma coifa estéril. Embriões foram retornados para aincubadora depois de adição de material de teste. Embriões de controlereceberam 10 μΙ, de veículo apenas. Em Dia 8, embriões foram removidos daincubadora e mantidos em temperatura ambiente enquanto que densidade devasos sangüíneos foi determinada em cada anel "o" usando um sistema decaptura de imagens em uma magnificação de 160x.

A densidade de vasos sangüíneos foi medida semi-quantitativamente usando um sistema de pontuação de angiogênese, no qualnúmeros exponenciais 1 a 32 foram usados para indicar número de vasossangüíneos presente nos sítios de tratamento no CAM. Número 32representou a maior densidade e 0 representou nenhuma angiogênese. Opercentual de inibição em cada sítio de dosagem foi calculado usando oescore registrado para aquele sítio dividido pelo escore médio obtido a partirdas amostras de controle apropriadas para cada experimento individual. Opercentual de inibição para cada dose de um dado composto foi calculadocombinando todos os resultados obtidos para aquela dose.

Os resultados são apresentados em Tabela IV abaixo; cadaescore médio de densidade de vasos sangüíneos representa a média de dezexperimentos. A inibição percentual de linhagens de células de câncer a IuMfoi calculada subtraindo a %T/C média a IuM de tabela III de 100. Um valormaior na proporção de inibição de vasculatura CAM para inibição de célulade câncer in vitro deve sugerir um aumento relativo em atividadeantiangiogênica comparado com inibição de crescimento celular geral, ouatividade de tRNA sintetase.

Tabela IV - Dados de ensaio CAM e proporção de inibição de célula decâncer para inibição de angiogênese

<table>table see original document page 43</column></row><table>

A partir destes dados, parece que o índice terapêutico anti-angiogênico (proporção de anti-angiogênese para inibição celular geral) de 9 éespecialmente bom, e 7 e 9 são melhorados, se comparados com 1 e 6.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável domesmo, o composto caracterizado pelo fato de ser de acordo com fórmula (I)abaixo:<formula>formula see original document page 48</formula>onde:R1 e R2 independentemente representam cada H, SR3 ou umgrupo alquila C1-C4 que pode ser opcionalmente substituído por um ou maisgrupos selecionados a partir de OH, F, Cl ou SR3; onde R3 representa H, CH3ou COCH3; alternativamente R1 e R2 junto com os carbonos com os quais elessão acoplados representam um anel de cicloalquila de 4 membrosopcionalmente substituído por um ou mais átomos de halogênio ou um oumais grupos alquila Cl a C3;R4 representa<formula>formula see original document page 48</formula>-NHNHC(O)R8 onde R8 representa biotina, H ou um grupoalquila C1-C4 opcionalmente substituído por um ou mais grupos selecionadosa partir de OH, F, Cl;X representa -NH- ou -O-;Y representa -NH-, -O- ou -CH2-;R5 representa H ou -(CH2)nR6,n representa um número inteiro entre 1 e 3,R6 representa Η, -OH, -OCH3, -CO2R7, ou um grupo alquilaCl a C4 opcionalmente substituído por um ou mais grupos selecionados apartir de OH, F, Cl, -CO2R7, -COR7, onde R7 representa um grupo alquila Cl-C4ou R6 representa:i) um anel aromático de 6 membros,ii) um anel heteroaromático de 5 a 7 membros contendo entreum e três átomos de N, S ou O,iii) um grupo de cicloalquila de 5 a 7 membros ouiv) um anel de heteroalquila de 5 a 7 membros contendo entreum e três átomos de N, S ou O,cada um de i) a iv) acima pode ser opcionalmente substituídopor um ou mais grupos selecionados a partir de CH3, OCH3, F, Cl ou Br; eR9 representa CN, CO2H, CH3 ou CONH2,contanto, entretanto, que quando X representa -O- então R5não representa H.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que R9 representa CN.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, 20 caracterizado pelo fato de que Ri e R2 junto com os carbonos com os quaiseles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4 membros.

4. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que R1 e R2 junto com os carbonos com os quais eles sãoacoplados representam um anel de cicloalquila de 4 membros, substituídoapenas por R4.

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que R4 representa<formula>formula see original document page 49</formula>

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 5, caracterizado pelo fato de que X representa -O-.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 5, caracterizado pelo fato de que X representa -NH-.

8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 7, caracterizado pelo fato de que η representa 1.

9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 7, caracterizado pelo fato de que η representa 2.

10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 9, caracterizado pelo fato de que quando R6 representa um anelheteroaromático de 6 membros contendo entre um e três átomos de N, S ou O.

11. Composto de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que R6 representa um anel heteroaromático de 6 membroscontendo um átomo de N.

12. Composto de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que R6 representa

13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 9, caracterizado pelo fato de que R^ representa um anel de heteroalquila de6 membros contendo entre um e três átomos de N, S ou O.

14. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que R6 representa<formula>formula see original document page 50</formula>

15. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri e R2 junto com os carbonoscom os quais eles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4membros, substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 51</formula>onde X representa -O- e R5 representa -(CH2)nR6, onde nrepresenta 2 e R6 representa<formula>formula see original document page 51</formula>

16. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 junto com os carbonoscom os quais eles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4membros substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 51</formula>onde X representa -O- e R5 representa -(CH2)nR6, onde nrepresenta 2 e R6 representa

17. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 junto com os carbonoscom os quais eles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4membros substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 51</formula>onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nR6, onde nrepresenta 2 e R6 representa

18. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 junto com os carbonoscom os quais eles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4membros substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 52</formula>onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nR6, onde ηrepresenta 1 e R6 representa<formula>formula see original document page 52</formula>

19. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri e R2 junto com os carbonoscom os quais eles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4membros substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 52</formula>onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nRe, onde ηrepresenta 1 e R6 representa<formula>formula see original document page 52</formula>

20. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri e R2 junto com os carbonoscom os quais eles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4membros substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 52</formula>onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nR6, onde ηrepresenta 1 e R6 representa<formula>formula see original document page 52</formula>

21. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri e R2 junto com os carbonoscom os quais eles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4membros substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 53</formula>onde X representa -NH- e R5 representa -(CH2)nR6, onde nrepresenta 2 e R6 representa<formula>formula see original document page 53</formula>

22. Composto de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri e R2 junto com os carbonoscom os quais eles são acoplados representam um anel de cicloalquila de 4membros substituído apenas por R4 que representa<formula>formula see original document page 53</formula>onde X representa -NH- e R5 representa H.

23. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser:17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (4-(2-hidroxietila))morfolina éster;17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (2-(2-hidroxietila)piridina éster;17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (4-(2-aminoetila))morfolina amida;17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (4-aminometila)piridina amida;17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (3-aminometila)piridina amida;17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (2-aminometila)piridina amida;17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-ácido carboxílico)borrelidina (3-(2-aminoetila))piridina amida;17-des(ciclopentano-2-ácido carboxílico)-17-(ciclobutano-2-acido carboxilico)borrelidina (3-(2-aminoetila))piridina amida;ácido carboxílico)borrelidina amida;ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um destes.

24. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser para uso como um produto farmacêutico.

25. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser para uso como um produto farmacêuticono tratamento de câncer ou malignidades de célula B.

26. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23 junto com um ou mais diluentes ou carreadoresfarmaceuticamente aceitáveis.

27. Método de tratamento de câncer ou malignidades de célulaB, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um paciente umaquantidade eficaz de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23.

28. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de ummedicamento para o tratamento de câncer ou malignidades de célula B.

29. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser para uso como um produto farmacêuticono tratamento de distúrbios oftálmicos em que angiogênese está implicada.

30. Composto de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o distúrbio oftálmico é retinopatia diabética.

31. Composto de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o distúrbio oftálmico é degeneração macular relacionada àidade, neovascularização corneana e retinopatia da prematuridade.

32. Processo para preparar um composto de fórmula (I) ou umsal farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de compreender:(a) reagir um composto de fórmula (II):CH3 ÇH3 OH3<formula>formula see original document page 55</formula>em que Rj, R2 e R.9 são como definidos em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23,ou um derivado protegido destes, usando qualquer um dosmétodos descritos em (i) a (viii) abaixo:(i) reação de um cloreto ácido formado a partir de umcomposto de fórmula (II) com um álcool ou amina adequada;(ii) esterificação ou amidação direta de um composto de fórmula (II) na presença de carbodiimida, e uma base;(iii)transesterificação de um éster, formado a partir de umcomposto de fórmula (II), com um álcool adequado;(iv) reação de um éster de metila de um composto de fórmula(II) com uma amina adequada;(v) formação de um éster ativo a partir de um composto defórmula (II), então reação com um álcool ou amina adequada;(vi) formação de um anidrido misturado a partir de umcomposto de fórmula (II), então reação com uma amina adequada;(vii) redução de um anidrido misturado a partir de umcomposto de fórmula (II) com um hidreto metálico a um álcool;(viii) alquilação e acilação de um álcool primário preparado apartir de um composto de fórmula (II).ou(b) converter um composto de fórmula (I) ou um sal deste emoutro composto de fórmula (I) ou outro sal farmaceuticamente aceitável domesmo; ou(c) desproteger um composto protegido de fórmula (I).