BRPI0709713A2 - polinucleotÍdeo, proteÍna, vetor, organismo transformado, mÉtodos para produzir um lipÍdeo ou Ácido graxo, para produzir um alimento, uma droga ou um material industrial, para avaliar a capacidade de formaÇço de Ácido graxo de um fungo de teste produtor de lipÍdeo, e para selecionar um fungo produtor de lipÍdeo, e, alimento, droga ou industrial material - Google Patents

polinucleotÍdeo, proteÍna, vetor, organismo transformado, mÉtodos para produzir um lipÍdeo ou Ácido graxo, para produzir um alimento, uma droga ou um material industrial, para avaliar a capacidade de formaÇço de Ácido graxo de um fungo de teste produtor de lipÍdeo, e para selecionar um fungo produtor de lipÍdeo, e, alimento, droga ou industrial material Download PDF

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Abstract

POLINUCLEOTIDEO, PROTEINA, VETOR, ORGAMSMO TRANSFORMADO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM LIPÍDEO OU ÁCIDO GRAXO, PARA PRODUZIR UM ALIMENTO, UMA DROGA OU UM MATERIAL INDUSTRIAL, PARA AVALIAR A CAPACIDADE DE FORMAÇçO DE ÁCIDO GRAXO DE UM FUNGO DE TESTE PRODUTOR DE LIPÍDEO, E PARA SELECIONAR UM FUNGO PRODUTOR DE LIPÍDEO, E, ALIMENTO, DROGA OU INDUSTRIAL MATERIAL A presente invenção proporciona ácido-graxo-sintetases quesão responsáveis pela síntese de ácido graxo novo, polinucleotídeos quecodificam tais ácido-graxo-sintetases (e.g., um polinucleotídeo compreendendo (a) um polinucleotídeo consistindo da seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, ou (b) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo compreendendo uma seqúência de nucleotídeos complementar à seqúéncia de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, e que codifica uma proteína possuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase, vetores de expressão e transformantes compreendendo tais polinucleotídeos, métodos para produzir alimento e outros produtos usando tais transformantes, produtos alimentícios produzidos por tais métodos, e métodos para avaliar e selecionar fungos de teste produtores de lipídeo.

Description

"POLINUCLEOTÍDEO, PROTEÍNA, VETOR, ORGANISMOTRANSFORMADO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM LIPÍDEO OUÁCIDO GRAXO, PARA PRODUZIR UM ALIMENTO, UMA DROGA OUUM MATERIAL INDUSTRIAL, PARA AVALIAR A CAPACIDADE DEFORMAÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DE UM FUNGO DE TESTEPRODUTOR DE LIPÍDEO, E PARA SELECIONAR UM FUNGOPRODUTOR DE LIPÍDEO, E, ALIMENTO, DROGA OU INDUSTRIALMATERIAL"
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção refere-se a um gene que codifica ácido-graxo-sintetase, e aos seus usos.
ARTE ANTERIOR
Genes de ácido-graxo-sintetase que são responsáveis pelasíntese de ácido graxo novo têm sido clonados em uma variedade deorganismos e totalmente estudados (e.g., Documento de Não-Patente 1: E.Schweizer et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 68, 501-517 (2004)).
Em algumas bactérias e em fungos e animais, as denominadasenzimas multifuncionais de "tipo I" tais como aquelas mostradas abaixo sãoconhecidas em catalisarem uma série de reações em síntese de ácido graxo.
Tipo Ia: (Fungos) AC-ER-DH-MPT/ACP-KR-KR-KS-PPT,α6β6 (β + α: aprox. 3.950 aminoácidos). (Bactérias) AC-ER-DH-MPT-ACP-KR-KS-PPT, a6, estrutura na qual as subunidades β e α de ácido-graxo-sintetase fungica (FAS) são conectadas cabeça-em-cauda (a: aprox. 3.000aminoácidos).
Tipo Ib: (Animais) KS-AT-DH-ER-KR-ACP-TE, α2 (a: aprox.2.500 aminoácidos). As abreviações acima representam o seguinte:
AC: ac(et)il-transferase
AT: malonil/acetil-transferase
MPT: malonil/palmitoil-transferaseCS: cetoacil-sintase
CR: cetoacil-redutase
DH: desidratase
ER: enoil-redutase
ACP: proteína carreadora de acila
TE: tioesterase
PPT: palmitoil/palmitoil-transferase.
Na levedura Saccharomyces eerevisiae (também abreviadacomo "S. eerevisiae"), síntese de ácido graxo novo é realizada por uma ácido-graxo-sintetase (um complexo de ο^βό composto de subunidades β codificadaspelo gene FAS 1 e subunidades α codificadas pelo gene FAS2) de até 18carbonos (ácido esteárico). Em adição, ELOl, EL02 e EL03 são conhecidoscomo genes de ácido-graxo-elongase. E considerado que ELOl é responsávelpela extensão do comprimento de cadeias Cl2 a C16 para de C16 a C18,ELO2 é responsável pela extensão de comprimento de cadeias Cl6 a Cl8para C22, e EL03 é responsável pela extensão de comprimento de cadeiasCl8 a C24 paraC26.
Ao mesmo tempo, o fato de que, em fungo produtor de lipídeoMortierella alpina (também abreviado abaixo como "M. alpina"), uma cepamutante possuindo uma atividade de alongamento de ácido graxo diminuídade ácido palmítico para ácido esteárico pode ser obtida por tratamentomutagênico (Documento de Patente 1: Pedido de Patente Japonesa Publicadode No. 2001-245687) sugere que, pelo menos, enzimas diferentes sãoresponsáveis pela síntese de até ácido palmítico e pela síntese de ácidopalmítico a ácido esteárico.
Contudo, os genes de ácido-graxo-sintetase que sãoresponsáveis pela síntese de ácido graxo novo em fungos produtores delipídeo tal como M. alpina ainda não têm sido previamente clonados.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃOÀ luz do discutido acima, tem existido um desejo paraidentificar as enzimas de síntese de ácido graxo que são responsáveis pelasíntese de ácido graxo novo em fungos produtores de ácido graxo tal como Malpina e os genes que codificam tais enzimas.
Os inventores têm conduzido investigações extensivas, comoum resultado das quais têm tido sucesso na clonagem de um gene de ácido-graxo-sintetase responsável pela síntese de ácido graxo novo no fungoprodutor de lipídeo M. alpina e têm finalmente chegado à presente invenção.Conseqüentemente, a invenção proporciona os seguintes polinucleotídeos,proteínas, vetores de expressão, transformantes, métodos para produção dealimentos e outros produtos usando tais transformantes, alimentos e produtosalimentícios produzidos por tais métodos, e métodos para avaliar e selecionarfungos de teste produtores de lipídeo.
(1) Um polinucleotídeo selecionado de qualquer um dosseguintes (a) a (h):
(a) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoconsistindo da seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ IDNO: 1;
(b) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoconsistindo da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte;
(c) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 3;
(d) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína que consiste de uma seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 3 na qual um ou mais aminoácidos estão deletados,substituídos, inseridos e/ou adicionados, e que possui uma atividade de ácido-graxo-sintetase;
(e) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo 60% ou mais de identidade com aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que possui uma atividade deácido-graxo-sintetase;
(f) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, e que codifica uma proteínapossuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase;
(g) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte, e que codifica uma proteína possuindouma atividade de ácido-graxo-sintetase; e
(h) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde um polinucleotídeo codificador de uma proteína consistindo da seqüênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que codifica uma proteína possuindouma atividade de ácido-graxo-sintetase.
(2) O polinucleotídeo de (1) acima que é selecionado dequalquer um dos seguintes (i) a (m):
(i) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína que consiste de uma seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 3 na qual um a dez aminoácidos estão deletados, substituídos,inseridos e/ou adicionados, e que possui uma atividade de ácido-graxo-sintetase;
(j) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo 90% ou mais de identidade com aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que possui uma atividade deácido-graxo-sintetase;
(k) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições elevadamente estringentes em um polinucleotídeoconsistindo de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência denucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, e que codifica umaproteína possuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase;
(l) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições elevadamente estringentes em um polinucleotídeoconsistindo de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência denucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte, e que codifica uma proteínapossuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase; e
(m) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições elevadamente estringentes em um polinucleotídeoconsistindo de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência denucleotídeos de um polinucleotídeo codificador de uma proteína consistindoda seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que codifica uma proteínapossuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase.
(3) O polinucleotídeo de (1) acima, compreendendo umpolinucleotídeo que consiste da seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a12486 de SEQ ID NO: 1.
(4) O polinucleotídeo de (1) acima, compreendendo umpolinucleotídeo que consiste da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.
(5) O polinucleotídeo de (1) acima, compreendendo umpolinucleotídeo que consiste da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.
(6) O polinucleotídeo de (1) acima, compreendendo umpolinucleotídeo que codifica uma proteína consistindo da seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 3.
(7) O polinucleotídeo de qualquer um de (1) a (6) acima que é DNA.(8) Uma proteína codificada pelo polinucleotídeo de qualquerum de (1) a (7) acima.
(8a) Uma proteína que compreende a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 3.
(8b) Uma proteína que compreende uma seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 3 na qual um ou mais aminoácidos estãodeletados, substituídos, inseridos e/ou adicionados, e que possui umaatividade de ácido-graxo-sintetase.
(8c) Uma proteína possuindo 60% ou mais de identidade coma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que possui uma atividade deácido-graxo-sintetase.
(9) Um vetor compreendendo o polinucleotídeo de qualquerum de (1) a (7) acima.
(9a) O vetor de (9) acima que compreende um cassete deexpressão compreendendo os seguintes componentes (a) a (c):
(a) um promotor que transcreve em uma célula hospedeira;
(b) o polinucleotídeo de qualquer um de (1) a (7) acima queestá unido ao promotor; e
(c) um sinal que funciona dentro de uma célula hospedeira emconexão com a terminação de transcrição e poliadenilação de uma moléculade RNA.
(9b) O vetor de (9a) acima no qual a célula hospedeira é umfungo produtor de lipídeo (e.g., M. alpina) ou uma levedura (e.g., S.cerevisiaé).
(10) Um organismo transformado possuindo introduzido nomesmo o polinucleotídeo de qualquer um de (1) a (7) acima.
(11) Um organismo transformado possuindo introduzido nomesmo o vetor de (9) acima.
(12) O organismo transformado de (11) acima possuindo umacapacidade de formação de ácido graxo aumentada devido à introdução dovetor de (9) acima.
(13) O organismo transformado de qualquer um de (10) a (12)acima, no qual o organismo é um fungo produtor de ácido graxo.
(14) O organismo transformado de (13) acima, no qual o fungoprodutor de ácido graxo é Mortierella alpina.
(15) Um método para produzir um lipídeo ou ácido graxousando o organismo transformado de qualquer um de (10) a (14) acima.
(16) Um método para produzir um alimento, uma droga ou ummaterial industrial usando o organismo transformado de qualquer um de (10)a (14) acima.
(16a) O método de produção de (16) acima, no qual o alimentoé um alimento contendo óleo e gordura.
(17) Um alimento, uma droga ou um material industrialproduzido pelo método de (16) acima.
(17a) O alimento ou material industrial de (17) acima, no qualo alimento é um alimento contendo óleo e gordura.
(18) Um método para avaliar a capacidade de formação deácido graxo de um fungo de teste produtor de lipídeo, que compreende o usode um iniciador ou uma sonda planejado(a) baseado(a) na seqüência denucleotídeos de um gene de ácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência denucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1.
(18a) Um método para selecionar, pelo método de (18) acima,um fungo produtor de lipídeo possuindo uma capacidade de formação deácido graxo alta.
(18b) Um método para produzir um óleo e uma gordurausando o fungo produtor de lipídeo selecionado pelo método de (18a) acima.
(19) Um método para avaliar a capacidade de formação deácido graxo de um fungo de teste produtor de lipídeo, compreendendo cultivarum fungo de teste produtor de lipídeo e medir um nível de expressão de umgene de ácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência de nucleotídeos dePosições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1.
(19a) Um método para selecionar um fungo produtor delipídeo possuindo uma capacidade alta para formar ácidos graxos de 16carbonos, compreendendo avaliar fungos de teste produtores de lipídeo pelométodo de (19) acima, e selecionar um fungo produtor de lipídeo possuindoum nível de expressão alto do gene de ácido-graxo-sintetase.
(19b) Um método para produzir um óleo e uma gordura,compreendendo o uso do fungo produtor de lipídeo selecionado pelo métodode (19a) acima.
(20) Um método para selecionar um fungo produtor de lipídeo,compreendendo: cultivar um fungo de referência produtor de lipídeo e umfungo de teste produtor de lipídeo, medir um nível de expressão de um genede ácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência de nucleotídeos de Posições 1a 12486 de SEQ ID NO: 1 em cada fungo produtor de lipídeo, e selecionar umfungo de teste produtor de lipídeo que expressa o gene mais elevadamente doque o fungo de referência produtor de lipídeo.
(21) Um método para selecionar um fungo produtor de lipídeo,compreendendo: cultivar um fungo de referência produtor de lipídeo e umfungo de teste produtor de lipídeo, determinar quantitativamente a proteína de(8) acima em cada fungo produtor de lipídeo, e selecionar um fungo de testeprodutor de lipídeo contendo uma quantidade maior de proteína do que ofungo de referência produtor de lipídeo. Isto é, um método para selecionar umfungo produtor de lipídeo, compreendendo as etapas de cultivar umapluralidade de fungos produtores de lipídeo, determinar quantitativamente aproteína de (8) acima em cada fungo produtor de lipídeo, e selecionar dentreestes um fungo de teste produtor de lipídeo contendo uma quantidade grandede proteína.Os polinucleotídeos da invenção, quando utilizado paratransformar organismos tais como fungos produtores de lipídeo (e.g., Malpina) e leveduras, são úteis para aplicação na manufatura de alimentos,cosméticos, drogas (e.g., preparações externas para pele), sabões esemelhante.
Ácidos graxos podem ser eficientemente produzidos pelométodo para produzir lipídeos ou ácidos graxos da invenção. Além disso, peloemprego dos nucleotídeos da invenção em transformação de leveduras eoutros organismos, lipídeos ou ácidos graxos possuindo um conteúdo alto deácidos graxos de 16 carbonos (e.g., ácido palmítico, ácido palmitoleico)podem ser produzidos. A presente invenção portanto é benéfica para aumentara capacidade para produzir tais ácidos graxos.
Pelo uso de fungos produtores de lipídeo que têm sidoavaliados e selecionados usando os métodos para avaliar e selecionar fungosprodutores de lipídeo da invenção, óleos e lipídeos das composições desejadas(e.g., óleos e lipídeos possuindo uma proporção alta de ácidos graxos de 16carbonos) podem ser eficientemente manufaturados.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
FIG. 1 (1-1 a 1-5) mostra o alinhamento de seqüências deaminoácidos para proteínas FASl conhecidas (de Saccharomyces eerevisiae,Candida albieans, e Aspergillus nidulans).
MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO
Como mostrado em detalhe nos exemplos da invençãosubseqüentemente descritos, os inventores têm sido bem sucedidos pelaprimeira vez na clonagem de cDNA de comprimento total para uma ácido-graxo-sintetase da cepa 1S4 de M alpina, que é um fungo produtor de lipídeo.Além disso, têm obtido a seqüência de bases do DNA genômico para a ácido-graxo-sintetase de cepa 1S-4 de M. alpina (SEQ ID NO: 2), e a seqüência deaminoácidos putativa para aquela ácido-graxo-sintetase (SEQ ID NO: 3). EsteDNA e esta enzima podem ser obtidos usando, por exemplo, as técnicasmencionadas nos exemplos da invenção subseqüentemente descritos, técnicasde engenharia genética conhecidas, e técnicas de síntese conhecidas. Ospolinucleotídeos de ácido-graxo-sintetase proporcionados pela presenteinvenção, quando empregados para transformar organismos tais como fungosprodutores de lipídeo ou leveduras, são úteis para a produção de óleos elipídeos com tais levedura ou fungos produtores de lipídeo transformados(e.g., M. alpina) e para a manufatura de alimentos, drogas (e.g., preparaçõesexternas para pele), materiais industriais (tais como para cosméticos e sabões)e semelhante que utilizam tais óleos e lipídeos.
1. Polinucleotídeos da invenção
Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção proporciona osseguintes polinucleotídeos:
(a) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoconsistindo da seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1;
(b) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoconsistindo da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte;
(c) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 3;
(d) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína que consiste de uma seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:3 na qual um ou mais aminoácidos estão deletados,substituídos, inseridos e/ou adicionados, e que possui uma atividade de ácido-graxo-sintetase;
(e) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo 60% ou mais de identidade com aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que possui uma atividade deácido-graxo-sintetase;
(f) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, e que codifica uma proteínaconsistindo de uma atividade de ácido-graxo-sintetase;
(g) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte, e que codifica uma proteína possuindouma atividade de ácido-graxo-sintetase; e
(h) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde um polinucleotídeo codificador de uma proteína consistindo da seqüênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que codifica uma proteína possuindouma atividade de ácido-graxo-sintetase.
Como aqui usado, o termo "polinucleotídeo" refere-se a DNAou RNA.
Como aqui usado, "parte do DNA consistindo da seqüência denucleotídeos de SEQ ID NO: 2" inclui, por exemplo, a porção da seqüência denucleotídeos de SEQ ID NO: 2 correspondendo ao exon.
"Um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes"refere-se aqui a um polinucleotídeo que é obtido, por exemplo, porhibridização de colônia, hibridização de placa ou hibridização de Southernusando como a sonda todo ou parte de um polinucleotídeo consistindo daseqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeos dePosições 1 a 12486 de SEQ ID NO: Iea seqüência de nucleotídeos de SEQID NO: 2, ou um polinucleotídeo consistindo de uma seqüência denucleotídeos codificadora da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Ométodo de hibridização usado pode ser um método descrito, por exemplo, emSambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 3 (ColdSpring Harbor, Laboratory Press 2001) ou Ausubel: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987-1997).
Como aqui usado, "condições estringentes" podem ser referiràs condições de estringência baixa, condições de estringência moderada econdições de estringência alta. "Condições de estringência baixa" são, porexemplo, 5x SSC, 5x solução de Denhart, SDS 0,5% e formamida 50% a 32°C. "Condições de estringência moderada" são, por exemplo, 5x SSC, 5xsolução de Denhart, SDS 0,5% e formamida 50% a 42°C. "Condições deestringência alta" são, por exemplo, 5x SSC, 5x solução de Denhart, SDS0,5% e formamida 50% a 50°C. Sob estas condições, é esperado que DNA dehomologia mais alta seja obtido eficientemente em temperatura mais alta. Múltiplos fatores estão envolvidos em estringência de hibridização, incluindotemperatura, concentração de sonda, comprimento de sonda, força iônica,tempo e concentrações de sal, e uma pessoa experiente na arte podeapropriadamente selecionar estes fatores para realizar uma estringênciasimilar.
Um exemplo de um kit comercial que pode ser usado parahibridização é AlkPhos Direct Labeling Reagents (Amersham PharmaciaBiotech). De acordo com o protocolo que acompanha o kit, após incubaçãocom uma sonda marcada durante a noite, a membrana é lavada com umtampão de lavagem primário contendo SDS 0,1% (p/v) a 5 5°C, após a qual o DNA hibridizado pode ser detectado.
Outros polinucleotídeos que podem ser hibridizados incluemDNAs possuindo cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, 71% ou mais,72% ou mais, 73% ou mais, 74% ou mais, 75% ou mais, 76% ou mais, 77%ou mais, 78% ou mais, 79% ou mais, 80% ou mais, 81% ou mais, 82% oumais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais,88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93%ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% oumais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% ou mais, 99,3% ou mais, 99,4% oumais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7% ou mais, 99,8% ou mais ou99,9% ou mais de identidade ao DNA de SEQ ID NO: 1 (ou a seqüência denucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1), o DNA de SEQ IDNO: 2, ou o DNA codificadora da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3, conforme determinado com programa de computador de pesquisa dehomologia, tais como FASTA ou BLAST, usando os parâmetros pré-estabelecidos.
Identidade entre seqüências de aminoácidos ou seqüências denucleotídeos podem ser determinadas usando o algoritmo BLAST de Karlin eAltschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8722642268 (1990); Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 90: 5873 (1993)). Programas chamados BLASTN e BLASTXbaseados no algoritmo BLAST têm sido desenvolvidos (Altschul SF, et al., J.Mol. Biol. 215: 403 (1990)). Quando uma seqüência de nucleotídeos éanalisada usando BLASTN, os parâmetros são ajustados para, por exemplo,escore = 100 e comprimento de palavra = 12. Quando uma seqüência deaminoácidos é analisada usando BLASTX, os parâmetros são ajustados para,por exemplo, escore = 50 e comprimento de palavra = 3. Quando osprogramas BLAST e Gapped BLAST são usados, os parâmetros pré-estabelecidos para os respectivos programas são empregados.
Os seguintes polinucleotídeos da invenção podem ser obtidospor uma técnica de engenharia genética conhecida ou uma técnica de sínteseconhecida.
2. Proteínas da invenção e polinucleotídeos que codificam as proteínas
Em outro aspecto, a invenção proporciona proteínascodificadas por um ou mais dos polinucleotídeos (a) a (h) acima.
Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona:
(a) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 3;
(b) uma proteína que compreende uma seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 3 na qual um ou mais aminoácidos estãodeletados, substituídos, inseridos e/ou adicionados, e que possui umaatividade de ácido-graxo-sintetase; ou
(c) uma proteína possuindo 60% ou mais de identidade com aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que possui uma atividade deácido-graxo-sintetase.
Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona umpolinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos codificadorada proteína acima.
A proteína (b) ou (c) acima é tipicamente uma variante daproteína naturalmente ocorrente de SEQ ID NO: 3, e pode ser obtidaartificialmente pelo uso de uma técnica de mutagênese sítio-específica em,por exemplo, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Vol. 3 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987-1997);Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 6409(1982); Gene, 34, 315 (1985); Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985); ou Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 82, 488 (1985).
No relatório descritivo, a "proteína que consiste de umaseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3 na qual um ou mais aminoácidosestão deletados, substituídos, inseridos e/ou adicionados, e que possui umaatividade de ácido-graxo-sintetase" é exemplificada por proteínas queconsistem de uma seqüência de aminoácidos na qual de 1 a 500, de 1 a 100,de 1 a 90, de 1 a 80, 1 a 70, de 1 a 60, de 1 a 50, de 1 a 40, de 1 a 39, de 1 a38, de 1 a 37, de 1 a 36, de 1 a 35, de 1 a 34, de 1 a 33, de 1 a 32, de 1 a 31,de 1 a 30, de 1 a 29, de 1 a 28, de 1 a 27, de 1 a 26, de 1 a 25, de 1 a 24, de 1 a23, de 1 a 22, de 1 a 21, de 1 a 20, de 1 a 19, de 1 a 18, de 1 a 17, de 1 a 16,de 1 a 15, de 1 a 14, de 1 a 13, de 1 a 12, de 1 a 11, de 1 a 10, de 1 a 9, de 1 a8, de 1 a 7, de 1 a 6 (de 1 a vários), de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, 1 ou 2, ou 1resíduo de aminoácido na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3 temsido deletado, substituído, inserido e/ou adicionado, e que possuem umaatividade de ácido-graxo-sintetase. Um número menor de resíduos deaminoácido deletados, substituídos, inseridos e/ou adicionados acima é geralmente mais preferido. Tais proteínas são exemplificadas por proteínaspossuindo uma seqüência de aminoácidos com cerca de 60% ou mais, cercade 70% ou mais, 71% ou mais, 72% ou mais, 73% ou mais, 74% ou mais,75% ou mais, 76% ou mais, 77% ou mais, 78% ou mais, 79% ou mais, 80%ou mais, 81% ou mais, 82% ou mais, 83% ou mais, 84% ou mais, 85% ou mais, 86% ou mais, 87% ou mais, 88% ou mais, 89% ou mais, 90% ou mais,91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96%ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% oumais, 99,3% ou mais, 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7%ou mais, 99,8% ou mais ou 99,9% ou mais de identidade à seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 3, e possuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase. Uma identidade percentual mais alta é geralmente mais preferível.A atividade de ácido-graxo-sintetase pode ser medida, por exemplo, pelométodo descrito em James K Stoops et al., J.B.C. 253, 4464-4475 (1978).
A deleção, substituição, inserção e/ou adição de um ou maisresíduos de aminoácido na seqüência de aminoácidos da proteína da invençãosignifica que um ou mais resíduos de aminoácido é deletado, substituído,inserido e/ou adicionado em qualquer uma ou mais posições na mesmaseqüência. Quaisquer dois ou mais tipos de mudanças dentre deleções,substituições inserções e adições podem ocorrer concorrentemente.Exemplos de resíduos de aminoácido mutuamentesubstituíveis são dados abaixo. Resíduos de aminoácido pertencendo aomesmo grupo são mutuamente substituíveis.
Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina,alanina, ácido 2-amino-butanóico, metionina, o-metil-serina, t-butil-glicina, t-butil-alanina, ciclo-hexil-alanina;
Grupo B: ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido isoaspártico,ácido isoglutâmico, ácido 2-amino-adípico, ácido 2-amino-subérico;
Grupo C: asparagina, glutamina;
Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diamino-butanóico, ácido 2,3-diamino-propiônico;
Grupo E: prolina, 3-hidróxi-prolina, 4-hidróxi-prolina;
Grupo F: serina, treonina, homo-serina; e
Grupo G: fenil-alanina, tirosina.
A proteína da invenção também pode ser produzida por umprocesso de síntese química tal como o processo Fmoc process (processo defluorenil-metil-óxi-carbonila) ou o processo tBoc (processo de t-butil-óxi-carbonila). Em adição, sintetizadores de peptídeo disponíveis de, porexemplo, Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein TechnologyInstrument, Synthecell-Vega, PerSeptive e Shimadzu Corporation podem serusados para síntese química.
3. Vector da invenção e transformantes nos quais o vetor temsido introduzido
Em um outro aspecto, a invenção proporciona um vetor deexpressão que compreende o polinucleotídeo da invenção. O vetor deexpressão da invenção compreende um dos seguintes polinucleotídeos:
(a) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoconsistindo da seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ IDNO: 1;(b) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoconsistindo da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte;
(c) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 3;
(d) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína que consiste de uma seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 3 na qual um ou mais aminoácidos estão deletados,substituídos, inseridos e/ou adicionados, e que possui uma atividade de ácido-graxo-sintetase;
(e) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo 60% ou mais de identidade com aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que possui uma atividade deácido-graxo-sintetase;
(f) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, e que codifica uma proteínaconsistindo de uma atividade de ácido-graxo-sintetase;
(g) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte, e que codifica uma proteína possuindouma atividade de ácido-graxo-sintetase; ou
(h) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde um polinucleotídeo codificador de uma proteína consistindo da seqüênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que codifica uma proteína possuindouma atividade de ácido-graxo-sintetase.
O vetor da invenção geralmente compreende um cassete deexpressão compreendendo os seguintes componentes: (i) um promotor quetranscreve em uma célula hospedeira; (ii) o polinucleotídeo de qualquer umde (a) a (h) acima que está unido ao promotor; e (iii) um sinal que funcionadentro de uma célula hospedeira em conexão com a terminação de transcriçãoe poliadenilação de uma molécula de RNA. O vetor construído nesta maneiraé introduzido em uma célula hospedeira. Células hospedeiras adequadas parauso na invenção são exemplificadas por leveduras e fungos produtores delipídeo.
Cepas fungicas mencionadas, por exemplo, em Mycotaxon,Vol. XLIV, No. 2, pp. 257265 (1992) podem ser usadas como o fungoprodutor de lipídeo. Exemplos ilustrativos incluem microorganismospertencentes ao gênero Mortierella, tais como os seguintes microorganismos pertencentes ao subgênero Mortierella: Mortierella elongata 1F08570,Mortierella exigua IF08571, Mortierella hygrophila IF05941, e Mortierellaalpina IF08568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219,35,CBS224,37, CBS250,53, CBS343,66, CBS527/72, CBS528,72, CBS529,72,CBS608,70 e CBS754,68; e os seguintes microorganismos pertencentes ao subgênero Micromucor: Mortierella isabellina CBS 194,28, IF06336,IF07824, IF07873, IF07874, IF08286, IF08308 e 1F07884, Mortierellanana 1F08190, Mortierella ramanniana IF05426, IF08186, CBSl 12,08,CBS212,72, 1F07825, IF08184, IF08185 e IF08287, e Mortierella vinaceaCBS236,82. Mortierella alpina é especialmente preferido.
Exemplos ilustrativos de leveduras incluem Saccharomycescerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 e NBRC1954. Estas célulashospedeiras que têm sido transformadas com o vetor da invenção são capazesde muito eficientemente produzirem em particular ácidos graxos possuindo 16átomos de carbono.O vetor usado para introdução em fungos produtores de lipídeoé exemplificado por, mas não limitado a, pDura5 (Appl. Microbiol.Biotechnol., 65, 419-425, (2004)).
O vetor utilizado para introdução em uma levedura pode serum vetor de multicópias (vetor YEp), um vetor de cópia única (vetor YCp),ou um vetor de integração cromossômica (vetor YIp). Um exemplo de umvetor YEp conhecido é YEp24 (J. R. Broach et al., ExperimentalManipulation of Gene Expression (Academic Press, New York; 1983), 83),um exemplo de um vetor YCp é YCp50 (M. D. Rose et al., Gene 60: 237(1987)), e um exemplo de um vetor YIp é YIp5 (K. Struhl et aL, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 76: 1035 (1979)). Todos estes estão prontamentedisponíveis.
Qualquer combinação de promotores e terminadores pode serusada para regulação de expressão de gene na célula hospedeira, desde quefuncionem na célula hospedeira. Por exemplo, quando um fungo produtor delipídeo é empregado, pode ser feito uso do promotor de gene de histona H4,lou do promotor de gene de gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase.
Exemplos de marcadores seletivos que podem ser usadosdurante transformação incluem marcadores auxotróficos (ura5, niaD),marcadores de resistência à droga (higromicina, zeocina), genes de resistênciaà geneticina (G418r), genes de resistência a cobre (CUPl) (Marin et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 81, 337 (1984)), e genes de resistência à cerulenina(fas2m, PDR4) (respectivamente Junji Inokoshi et al., Biochemistry, 64, 660(1992); e Hussain et al., Gene, 101: 149 (1991)).
Um método comumente conhecido pode ser utilizado paratransformar a célula hospedeira. No caso de fungos produtores de lipídeo,exemplos de métodos adequados incluem eletroporação (Mackenzie D.A., etaL, Appl. Environ. Microbiol. 66, 4655-4661 (2000)) e o método de liberaçãode partículas (o método descrito em Pedido de Patente Japonesa Publicado deNo. 2005-287403, intitulado "Method for Breeding Lipideo-Producing Fungi"[método para geração de fungos produtores de lipídeo]). No caso deleveduras, exemplos não-limitantes, ilustrativos de métodos apropriadosincluem eletroporação, o método de esferoplasto (Proc. Natl. Acad. Sei. USA,75: 1929 (1978)), o método de acetato de lítio (J. Bacteriology, 153: 163(1983)), e os métodos descritos em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75: 1929(1978) e em Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition: A Cold Spring HarborLaboratory Course Manual.
Mais especificamente, no caso de fungos produtores delipídeo, o hospedeiro é inoculado em um meio Czapek-Dox e cultivado por 2semanas a 28°C para formar esporos. Os esporos são então colhidos, e umgene é introduzido nos mesmos pelo método de liberação de partículas(descrito em Pedido de Patente Japonesa Publicado de No. 2005-287403,intitulado "Method for Breeding Lipideo-Producing Fungi" [método parageração de fungos produtores de lipídeo]) ou semelhante. A seguir, os esporoscompreendendo o gene introduzido são posicionados sobre um meio de ágarpadrão contendo um antibiótico ou semelhante a ser usado como ummarcador seletivo ou, quando um marcador auxotrófico é para ser empregado,sobre um meio de ágar faltante do nutriente a ser usado como o marcador demodo a obter um transformante. Alternativamente, no caso de leveduras, ohospedeiro é cultivado em um meio nutriente padrão (e.g., o meio YEPDdescrito em Genetic Engineering, Vo 1. 1 (Plenum Press, New York; 1979), p.117) de modo que a densidade óptica do meio em 600 nm (OD600) estejaentre 1 e 6. As células cultivadas são então colhidas por centrifugação,lavadas, e pré-tratadas com íons de metal alcalino, em uma concentração decerca de 1 a 2 M. As células são deixadas em repouso a 30°C por cerca de 60minutes, então são deixadas em repouso juntas com o DNA a ser introduzido(cerca de 1 a 20 μg) a cerca de 30°C por cerca de 60 minutos. Poli(etileno-glicol), preferivelmente um poli(etileno-glicol) possuindo um peso molecularde cerca de 4.000 daltons, é adicionado em uma concentração final de 20% a50%. As células são deixadas em repouso a cerca de 30°C por cerca de 30minutos, então são tratadas com calor a cerca de 42°C por cerca de 5 minutos.Preferivelmente, a suspensão celular resultante é lavada com um meionutriente padrão, adicionado em uma quantidade predeterminada de meionutriente padrão fresco, e deixada em repouso a cerca de 30°C por cerca de 60minutos. A cultura resultante é inoculada sobre um meio de ágar padrãocontendo um antibiótico ou semelhante a ser usado como um marcadorseletivo ou, quando um marcador auxotrófico é para ser empregado, sobre ummeio de ágar faltante do nutriente a ser usado como o marcador de modo aobter um transformante. Outras técnicas de clonagem comuns podem serencontradas, por exemplo, em Sambrook & Russell, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Vol. 3 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) eMethods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual (Cold Spring HarborLaboratory Press; Cold Spring Harbor, NY).
4. Método para produzir um lipídeo ou ácido graxo dainvenção
Em ainda um outro aspecto, a invenção proporciona ummétodo para produzir um lipídeo ou um ácido graxo usando a levedura ou ofungo produtor de lipídeo transformado.
Como aqui usado, "lipídeo" refere-se aos lipídeos simplescontendo, por exemplo, um composto feito de um ácido graxo e um álcoolcom uma ligação éster entre ambos (e.g. um glicerídeo) ou um seu análogo(e.g., um éster de colesterol), lipídeos complexos adicionalmente possuindo,por exemplo, um ácido fosfórico, um aminoácido ou açúcar ligado em umlipídeo simples, e lipídeos derivados que são hidrolisados de lipídeo e não sedissolvem em água.
"Óleos e gorduras" referem-se aqui aos ésteres de gliceróis eácidos graxos (glicerídeos)."Ácidos graxos" referem-se aqui aos ácidos monocarboxílicosalifáticos (ácidos carboxílicos possuindo um único grupo carboxila, no qualos átomos de carbono são ligados juntos na forma de uma cadeia) de fórmula
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geral RCOOH (R sendo um grupo alquila). Ácidos graxos incluem ácidosgraxos saturados não possuindo ligações duplas na cadeia de hidrocarboneto,e ácidos graxos insaturados que contêm uma ligação dupla.
O lipídeo ou ácido graxo da invenção pode ser extraído naseguinte maneira das células transformadas de acordo com a presenteinvenção. No caso de organismos transformados (e.g., leveduras ou fungosprodutores de lipídeo), após completitude do cultivo, as células cultivadas sãocolhidas por uma técnica convencional tal como centrifugação ou filtração.
As células são totalmente enxaguadas e preferivelmente secas. Secagem podeser realizada por liofilização, secagem com ar ou semelhante. As células secassão rompidas, tal como com um Dynomill ou ultra-sonicamente, entãopreferivelmente são submetidas ao tratamento de extração com um solventeorgânico sob uma corrente de nitrogênio. Solventes orgânicos que podem serusados incluem éter, hexano, metanol, etanol, clorofórmio, diclorometano eéter de petróleo. Alternativamente, resultados bons também podem serobtidos por extração alternada com metanol e éter de petróleo, ou porextração usando um sistema de camada única de clorofórmio-metanol-águacomo o solvente. Pela separação do solvente orgânico do extrato sob umapressão reduzida, pode ser obtido um lipídeo contendo ácido graxo.
Separação de ácido graxo do lipídeo contendo ácido graxoacima no estado de um ácido graxo misto ou éster de ácido graxo misto podeser realizada por concentração e separação de acordo com uma técnicaconvencional (e.g., o método de adição de uréia, o método de separação poresfriamento, cromatografia em coluna).
Usando o método para produzir um lipídeo ou ácido graxo dainvenção, um ácido graxo pode ser eficientemente produzido pelo aumento doconteúdo de ácido graxo das células. Alternativamente, quando uma leveduraé usada como o hospedeiro, um lipídeo ou ácido graxo possuindo umconteúdo alto de ácido graxo saturado ou insaturado de 16 carbonos (e.g.,ácido palmítico ou ácido palmitoleico) pode ser obtido, que é particularmente útil quando há uma necessidade para produzir um tal ácido graxo em umaquantidade grande e/ou em uma eficiência alta.
O lipídeo ou ácido graxo assim obtido pode ser usado deacordo com um método convencional em tais aplicações como a manufaturade alimentos contendo lipídeo, drogas contendo lipídeo (e.g., preparações externas para pele), e materiais industriais contendo lipídeo (materiais iniciaispara cosméticos, sabões e semelhante).
Para ilustrar, devido ao fato de que ácido palmitoleico é umácido graxo que está presente em uma concentração de pelo menos cerca de10% em sebo de humano e reputadamente desempenha um papel maior naregeneração de sebo, ele pode ser utilizado ao se incluído em cosméticos parapele para prevenção de envelhecimento da pele ou em preparações externaspara pele. Por exemplo, em um paciente possuindo um distúrbio de pele talcomo eczema, independente da idade do paciente, regeneração do tecido dapele pode ser promovida pela suplementação de ácido palmitoleico. Portanto,o lipídeo ou ácido graxo obtido pelo método para produzir um lipídeo ouácido graxo da invenção pode ser vantajosamente usado na produção decosméticos e drogas (e.g., preparações externas para pele) produzidos paratais propósitos como a prevenção de envelhecimento da pele ou pararegeneração de tecido. Conseqüentemente, em ainda outro aspecto, a invençãoproporciona um método para produzir um alimento, cosmético, droga, sabãoou semelhante usando a levedura transformada ou o fungo produtor de lipídeotransformado da invenção. Este método inclui a etapa de formar um lipídeoou ácido graxo usando a levedura transformada ou o fungo produtor delipídeo transformado da invenção. O alimento, cosmético, droga, sabão ousemelhante contendo o lipídeo ou ácido graxo que tem sido formado épreparado por um método convencional. Nesta maneira, o alimento,cosmético, droga, sabão ou semelhante manufaturado pelo método dainvenção contém um lipídeo ou ácido graxo formado usando a leveduratransformada ou o fungo produtor de lipídeo transformado da invenção. Emadição, a invenção também proporciona o alimento, cosmético, droga, sabãoou semelhante manufaturado por um tal método.
A forma do cosmético (composição) ou droga (composição) dainvenção não está sujeita à qualquer limitação particular. Qualquer formaadequada, tal como aquela de uma solução, pasta, gel, sólido ou pó, pode serempregada. Composições de cosmético ou composições de droga de acordocom a invenção podem ser usadas, por exemplo, em cosméticos oupreparações externas para pele tais como óleos, loções, cremes, emulsões,geles, xampus, enxágües para cabelo, condicionadores para cabelo, vernizesde unha, bases, batons, pós faciais, máscaras faciais, pomadas, perfumes, pós,colônias, pastas de dente, sabões, aerossóis e espumas limpadoras; e emagentes melhoradores e inibidores de envelhecimento da pele, agentesmelhoradores e inibidores de dermatite, agentes de banho, medicações paracrescimento de cabelo, soros para pele, filtros solares, e agentes inibidores emelhoradores para cortes, pele rachada, e pele seca, rugosa.
Composições de cosmético de acordo com a invenção tambémpodem opcionalmente incluir outros óleos e gorduras e/ou corantes,fragrâncias, conservantes, tensoativos, pigmentos e antioxidantes, etc. Aproporção na qual tais ingredientes são incluídos pode ser apropriadamentedecidida por uma pessoa experiente na arte de acordo com o propósitointencionado (por exemplo, óleos e gorduras podem ser incluídos nacomposição em uma proporção de 1 a 99,99% em peso, preferivelmente de 5a 99,99% em peso, e mais preferivelmente de 10 a 99,95% em peso).Composições de droga de acordo com a invenção (e.g., preparações externaspara pele) podem opcionalmente incluir outros ingredientesfarmaceuticamente aceitáveis (e.g., ingredientes antiinflamatórios) ouingredientes adjuvantes (e.g., ingredientes lubrificantes, ingredientes veículo).
Por exemplo, exemplos ilustrativos de outros ingredientes em cosméticos oupreparações externas para pele incluem medicações para acne, agentes anti-caspa e anti-prurido, antiperspirantes, medicações para queimadura, agentesanti-carrapato e piolhos, amaciantes de queratina, medicações de xeroderma,agentes antivirais e intensificadores de absorção percutânea.
Exemplos de alimentos de acordo com a invenção incluemsuplementos dietéticos, alimentos para saúde, alimentos funcionais, alimentospara criança, leite modificado para bebê, leite modificado para bebêprematuro, e alimentos geriátricos. Neste relatório descritivo, "alimentos"referem-se genericamente aos produtos ingeríveis que são sólidos, fluidos,líquidos, ou suas misturas.
"Suplementos dietéticos" referem-se aos alimentos fortificadoscom ingredientes nutricionais específicos. "Alimentos para saúde" referem-seaos alimentos considerados saudáveis ou bons para a saúde, e incluemsuplementos dietéticos, alimentos naturais e alimentos de dieta. "Alimentosfuncionais" referem-se aos alimentos para reposição de ingredientesnutricionais que possuem funções de regulação corporal, e são sinônimos dealimentos com usos para saúde especificados. "Alimentos para criança"referem-se aos alimentos dados a crianças de até cerca de 6 anos de idade.
"Alimentos geriátricos" referem-se aos alimentos que têm sido tratados demodo a serem mais fáceis para digestão e absorção do que os alimentos nãotratados. "Leite modificado para bebê" refere-se às fórmulas de leite dadas acrianças de até 1 ano de idade. "Leite modificado para bebê prematuro"refere-se às fórmulas de leite dadas a bebês prematuros de até cerca de 6meses de idade.Exemplos de formas destes alimentos incluem alimentosnaturalmente ocorrentes tais como carne, peixe e nozes (alimentos tratadoscom óleos e gorduras); alimentos nos quais óleos e gorduras são adicionadosno momento da preparação, tais como alimento chinês, talharim japonês esopas; alimentos preparados usando óleos e gorduras como um meio detransferência de calor, tais como tempurá, alimentos intensamente fritos, tofufrito, arroz frito, rosquinha, e petisco doce japonês frito conhecido comokarinto; alimentos baseados em óleo e gordura ou alimentos processadosobtidos pela adição de óleos e gorduras durante o processamento, tais comomanteiga, margarina, maionese, molho de salada, chocolate, talharim pré-cozido seco, caramelo, biscoitos, bolachas, bolos, sorvete; e alimentos quetêm sido acabados por borrifo ou cobertura com óleo e uma gordura, taiscomo biscoitos crocantes de arroz okaki, biscoitos duros e pães doce de passasconhecidos como anpan. Contudo, os alimentos da invenção não sãolimitados aos alimentos contendo óleos e gorduras, e também incluem, porexemplo, pães, talharins, arroz, doces (balas duras, goma de mascar, balas degoma, balas secas prensadas, doces japoneses), alimentos agrícolas tais comotofu e alimentos processados feitos de tofu; alimentos fermentados tais comosaquê, licor medicinal, vinho de cozimento de arroz (mirin), vinagre, molhode soja e mis o; alimentos obtidos de animais de fazenda, tais como iogurte,presunto, toicinho defumado e lingüiça; produtos de frutos do mar tais comopasta de peixe moldada (kamaboko), alimentos fritos baseados em peixeconhecidos como bolos de peixe hanpen e ageten\ e também bebidas defrutas, bebidas não-alcoólicas, bebidas esportivas, bebidas alcoólicas e chá.
Os alimentos da invenção podem estar alternativamente naforma de preparações de droga tais como cápsulas; ou em formas processadastais como alimentos de fluidez livre, dietas semi-digeridas, dietas elementares,bebidas energéticas e alimentos enterais obtidos por formulação de óleo egordura da invenção juntos com ingredientes tais como proteínas, açúcares,gorduras, elementos traço, vitaminas, emulsificadores e agentesaromatizantes.
5. Métodos para avaliar a capacidade de formação de ácidograxo dos fungos de teste produtores de lipídeo e para selecionar os fungosprodutores de lipídeo da invenção
Em aspectos adicionais, a invenção proporciona (i) um métodopara avaliar a capacidade de formação de ácido graxo de um fungo de testeprodutor de lipídeo, compreendendo o uso de um iniciador ou uma sondaplanejado(a) baseado(a) na seqüência de nucleotídeos de um gene de ácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486de SEQ ID NO: 1; (ii) um método para avaliar a capacidade de formação deácido graxo de um fungo de teste produtor de lipídeo, compreendendo asetapas de cultivar um fungo de teste produtor de lipídeo e medir o nível deexpressão de um gene de ácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência denucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1; e (iii) um método paraselecionar um fungo produtor de lipídeo, compreendendo as etapas de cultivarum fungo de referência produtor de lipídeo e um fungo de teste produtor delipídeo, medir o nível de expressão de um gene de ácido-graxo-sintetasepossuindo a seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO:1 em cada fungo produtor de lipídeo, e selecionar um fungo de teste produtorde lipídeo que expressa o gene mais elevadamente do que o fungo dereferência produtor de lipídeo. A seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2pode ser usada em vez da seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 deSEQ ID NO: 1.
Técnicas gerais para realizar um tal método de avaliação sãoconhecidas na arte e incluem aquelas descritas, por exemplo, em WO01/040514 e Pedido de Patente Japonesa Publicado de No. H8-205900. Ométodo de avaliação é brevemente descrito abaixo.
Primeiro, o genoma do fungo de teste produtor de lipídeo épreparado. A preparação pode ser realizada por qualquer método conhecido,tal como um envolvendo o uso de um kit comercial; e.g., um DNeasy PlantKit (QIAGEN). Um iniciador ou uma sonda planejado(a) baseado(a) naseqüência de nucleotídeos de gene de ácido-graxo-sintetase de Posições 1 a12486 de SEQ ID NO: 1 ou de SEQ ID NO: 2 (preferivelmente a seqüênciade nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1) é então usado paradeterminar se este gene mesmo ou uma seqüência de nucleotídeos específicano gene está presente no genoma do fungo de teste produtor de lipídeo quetem sido preparado. Uma técnica conhecida pode ser usado para planejar oiniciador ou a sonda.
Uma técnica conhecida pode ser usada para detectar o gene ouuma seqüência de nucleotídeos específica no mesmo. Por exemplo, uso, comoiniciador, de um polinucleotídeo compreendendo parte da ou toda a seqüênciade nucleotídeos específica ou de um polinucleotídeo compreendendo umaseqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosespecífica, e uso, como outro iniciador, de um polinucleotídeocompreendendo parte de ou toda uma seqüência de nucleotídeos a montanteou a jusante da seqüência de nucleotídeos específica ou um polinucleotídeocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência denucleotídeos a montante ou a jusante, o ácido nucleico do fungo produtor delipídeo é amplificado pelo método de reação em cadeia da polimerase (PCR),a presença ou ausência de produto de amplificação é determinada, e os pesosmoleculares de quaisquer tais produtos são medidos. O número denucleotídeos nos polinucleotídeos usados como os iniciadores é geralmente depelo menos 10 pb, e preferivelmente de 15 a 25 pb. E geralmente apropriadose o número de nucleotídeos na porção do polinucleotídeo entre os iniciadoresseja de 300 a 2.000 pb.
As condições de reação para o método de PCR não estãosujeitas a qualquer limitação particular. Por exemplo, condições dentro dasseguintes faixas podem ser utilizadas: temperatura de desnaturação, 90 a98°C; temperatura de anelamento, 40 a 60°C; temperatura de extensão, 60 a75°C; número de ciclos, 10 ou mais. O produto de reação obtido como umresultado pode ser separado por uma técnica tal como eletroforese em gel deagarose, e os pesos moleculares dos produtos de amplificação podem sermedidos. Usando este método, a capacidade do fungo produtor de lipídeo paraformar ácidos graxos é predita e avaliada baseado no fato de se os pesosmoleculares dos produtos amplificados são suficientemente grandes paraconterem a molécula de DNA para porções específicas. A capacidade acimapode ser ainda mais acuradamente predita e avaliada pela análise da seqüênciade nucleotídeos dos produtos de amplificação.
Além disso, na prática da invenção, pelo cultivo do fungo deteste produtor de lipídeo e pela medição do nível de expressão do gene deácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a12486 de SEQ ID NO: 1, também é possível avaliar a capacidade de formaçãode ácido graxo do fungo de teste produtor de lipídeo. Isto pode ser feito pelocultivo do fungo de teste produtor de lipídeo, e pela determinação quantitativado mRNA ou do produto proteína do gene de ácido-graxo-sintetase possuindoa seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1. Adeterminação quantitativa do mRNA ou da proteína pode ser conduzidausando uma técnica conhecida. Por exemplo, o mRNA pode ser determinadoquantitativamente pela hibridização de northern ou RT-PCR quantitativa, e aproteína pode ser determinada quantitativamente por western blotting(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1994-2003).
Em adição, um fungo produtor de lipídeo adequado pode serselecionado pelo cultivo de fungos de teste produtores de lipídeo, medição donível de expressão de um gene de ácido-graxo-sintetase possuindo aseqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, e seleçãode um fungo de teste produtor de lipídeo possuindo um nível de expressão dogene de ácido-graxo-sintetase que está de acordo com a capacidade deformação de ácido graxo desejada. Alternativamente, é possível cultivar umfungo de referência produtor de ácido graxo e fungos de teste produtores deácido graxo, medir o nível de expressão do gene em cada um dos fungosprodutores de lipídeo, comparar os níveis de expressão do gene no fungo dereferência produtor de lipídeo e nos fungos de teste produtores de lipídeo, eselecionar o fungo de teste produtor de lipídeo desejado. Especificamente,fungos produtores de lipídeo adequados podem ser selecionados pelo cultivode um fungo de referência produtor de lipídeo e de fungos de teste produtoresde lipídeo, medição das quantidades de expressão do gene de ácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 deSEQ ID NO: 1 em cada fungo produtor de lipídeo, e seleção de um fungo deteste produtor de lipídeo dentro da expressão deste gene que é mais alta doque no fungo de referência produtor de lipídeo.
Alternativamente, um fungo de teste produtor de lipídeodesejado pode ser selecionado pelo cultivo de fungos de teste produtores delipídeo, e seleção de um fungo produtor de lipídeo que possui uma capacidadede formação de ácido graxo alta ou baixa ou no qual o gene de ácido-graxo-sintetase contendo a seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQID NO: 1 mostra uma atividade alta ou baixa de ácido-graxo-sintetase. Emtais casos, fungos produtores de lipídeo nos quais o vetor da invenção descritoacima tem sido introduzido, fungos produtores de lipídeo nos quais expressãodo polinucleotídeo (DNA) da invenção descrito acima está suprimida, fungosprodutores de lipídeo que têm sido submetidos ao tratamento mutagênico, efungos produtores de lipídeo que tem sido espontaneamente mutados podemser usados como os fungos de teste produtores de lipídeo ou o fungo dereferência produtor de lipídeo. A capacidade de formação de ácido graxo podeser medida usando um método para determinação quantitativa do nível deácido graxos dentro das células de fungo, e a atividade de ácido-graxo-sintetase pode ser medida utilizando o método descrito em James K. Stoops etal., J.B.C. 253, 4464-4475 (1978).
Devido ao fato de ser portanto possível pela invenção aavaliação da capacidade de formação de ácido graxo de fungos produtores de lipídeo (e.g., M. alpina), e a seleção de um fungo produtor de lipídeo desejado(e.g., um fungo produtor de lipídeo possuindo uma capacidade de formaçãode ácido graxo alta ou um fungo produtor de lipídeo possuindo um conteúdoalto de ácido graxo por célula), podem ser eficientemente manufaturadosgorduras e óleos de uma composição desejada.
Além disso, o nível de expressão do gene de ácido-graxo-sintetase pode ser usado como um indicador para tais propósitos comoinvestigação das condições de cultivo para realização eficiente de produção deácido graxo, e para controle do processo de cultivo.
EXEMPLOS
Exemplos são dados abaixo para ilustrar mais completamentea presente invenção, mas não são intencionados para limitarem o escopo dainvenção.
Análise EST
Cepa 1S-4 de M. alpina foi inoculada em 100 mL de meio(1,8% de glicose, 1% de extrato de levedo, pH 6,0) e pré-cultivada por 3 diasa 28°C. A seguir, 5 litros de meio (1,8% de glicose, 1% de pó de soja, 0,1%de azeite de oliva, 0,01% de Adekanol, 0,3% de KH2PO4, 0,1% de Na2SO4,0,05% de CaCl2.2H20, 0,05% de MgCl2.6H20, pH 6,0) foram adicionados emum biorreator de 10 litros (Able Co., Tóquio), após o qual a quantidade inteira da pré-cultura acima foi inoculada nos mesmos e cultivado sob aeração sobagitação por 8 dias a 300 rpm, 1 vvm e 26°C. Glicose em quantidadescorrespondendo a 2%, 2% e 1,5% foi adicionada nas culturas nos dias 1, 2 e 3de cultivo, respectivamente. As células foram colhidas em estágios diferentesnos dias 1, 2, 3, 6 e 8 de cultivo, e o RNA total foi preparado pelo método decloridrato de guanidina / CsCl. Um 01igotex-dT30 Super mRNA PurificationKit (Takara Bio) foi usado para realizar a purificação por poli(A)+RNA doRNA total. Uma biblioteca de cDNA para cada estágio foi construída usandoo ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene), e foi realizadaanálise de seqüência de uma passagem (8.000 clones x 5 estágios) a partir daextremidade 5' do cDNA.
Pesquisa de homólogo de FAS
A seqüência de nucleotídeos assim obtida foi pesquisada paraos homólogos conhecidos de gene de ácido-graxo-sintetase por BLAST.Como um resultado, foram encontradas duas seqüências de nucleotídeospossuindo homologia extremamente alta com porções da subunidade α deuma ácido-graxo-sintetase de Schizosaccharomyces pombe (Número deAcesso GB de BAB62032; o gene foi FAS2). Estas seqüências tiveram seçõesem comum, e foram consideradas como originárias de um único gene. Aseqüência obtida como um resultado da montagem correspondeu aosnucleotídeos 12262 a 12920 em SEQ ID NO: 1 (cDNA). Contudo, homólogosdo gene FASl não puderam ser encontrados.
Obtenção de uma seqüência parcial de um homólogo de FAS1
Devido ao fato de que um homólogo de FAS1 não foiencontrado pela análise acima, foi realizado o alinhamento de seqüências deaminoácidos de proteína FAS1 conhecidas (Número GB de P07149 deSaccharomyees eerevisiae; Número GB de P34731 de Candida albieans;Número GB de AAB41494 de Aspergillus nidulans) (FIG. 1). Baseado nasseqüências (1) e (2) do domínio conservado:
Seqüência (1): QGSQEQGMGM (SEQ ID NO: 4)
Seqüência (2): ATQFRQPALT (SEQ ID NO: 5),
os seguintes iniciadores degenerados foram planejados:
Flh-f: CARGGNWSNCARGARCARGGNATGGGNATG(SEQ ID NO: 6)Flh-r: GTNARNGCNGGYTGNGTRAAYTGNGTNGC (SEQ
ID NO: 7).
O cDNA de M. alpina 1S-4 foi sintetizado a partir de RNAtotal obtido pela análise EST descrita acima usando iniciadores hexaméricosaleatórios com o SuperScript Fast Strand System for RT-PCR (Invitrogen).Usando o cDNA de M. alpina 1S-4 com o modelo, 30 ciclos de reação PCR -cada ciclo consistindo de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C e 1 minuto a12°C - foram realizados com ExTaq (Takara Bio), dando deste modofragmentos de DNA de aproximadamente 300 pb. Os fragmentos de DNAobtidos foram TA clonados com um TA Cloning Kit (Invitrogen), e oplasmídeo assim obtido foi chamado de pCR-MaFASl-1. A seqüência denucleotídeos foi então determinada. Análise BLAST mostrou que há um graualto de homologia com parte da subunidade β da ácido-graxo-sintetase.
Triagem da biblioteca de cDNA
Homólogos de FASl e homólogos de FAS2 foram triadoscomo segue a partir da biblioteca de cDNA. Um DIG Labeling System(Roche) foi usado para triagem. Com o plasmídeo pCRMaFASl-1 como omodelo, uma sonda DIG-marcada para homólogos de FASl foi preparadausando o iniciador Fl-lf: 5'-GCTCTGTATGACTCTTCCCCC-3' (SEQ IDNO: 8) e o iniciador Fl-lr: 5'-GCCAAAAGACCGTTGGGTGAC-3, (SEQID NO: 9).
Uma sonda para homólogos de FAS2 foi preparada com ocDNA da cepa 1S4 de M. alpina como o modelo e usando os iniciadores F2-lf: 5'-GGTGCAGGAGCGGGACTGAGTG-31 (SEQ ID NO: 10) e F2-lr: 5,-CGCATTTGCAACCGCAACCGCG-3, (SEQ ID NO: 11) pela realização de30 ciclos de reação - cada ciclo consistindo de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a55°C e 1 minuto a 72°C - com ExTaq (Takata Bio). O fragmento de DNA deaproximadamente 170 pb obtido foi TA clonado com um TOPO-TA CloningKit (Invitrogen), e o plasmídeo resultante foi chamado de pCR-MaFAS2-l.Uma sonda DIG-marcada foi preparada por PCR com o plasmídeo pCR-MaFAS2-l como o modelo e usando os iniciadores F2-lf e F2-lr.
Triagem da biblioteca de cDNA foi realizada usando estassondas. Clones positivos não puderam ser obtidos com a sonda para oshomólogos de FAS1.
Contudo, quando a sonda para homólogos de FAS2 foi usada,foi possível obter vários clones positivos. O clone mais longo incluiu umaseqüência que correspondeu aos nucleotídeos 7861 a 12,920 (5,060 pb) deSEQ ID NO: 1 (cDNA). Este clone foi chamado de plasmídeo pBSMAFAS2-1. Contido, quando comparado com o gene FAS2 conhecido, não pareceuincluir o comprimento total.
Construção de biblioteca genômica
A cepa 1S-4 de M. alpina foi inoculada em 100 ml de um meiolíquido (1% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, pH 6,0), e cultivada sobagitação a 28°C por 4 dias. As células foram colhidas por filtração com umfiltro, e o DNA genômico foi extraído pelo método CTAB.
O DNA genômico assim obtido (aproximadamente 200 μg) foirapidamente digerido com a enzima de restrição Sau3AI de modo que adistribuição do DNA clivado fosse centrada próxima de 20 kb. Os fragmentosde DNA resultantes foram submetidos à centrifugação em gradiente dedensidade de sacarose de 10% a 40% sacarose (rotor, SW28 (Beckman),25,000 rpm, 10°C, 24 horas), e fracionados usando um Automatic LiquidCharger (Advantec) e uma Micro Tube Pump (Eyela) em frações de 1 ml. Asfrações possuindo distribuições centradas próximas de 20 kpb forampurificadas. Com os fragmentos de DNA assim obtidos, foi preparada umabiblioteca genômica usando o XBlueSTAR/BamHI Vector Kit (Novagen).
Triagem de biblioteca genômica
Os homólogos de FASl e homólogos de FAS2 foram triadosda biblioteca genômica na mesma maneira como no exemplo acima (triagemda biblioteca de cDNA). Como um resultado, foram obtidos clones que forampositivos ambos com a sonda para homólogos de FAS 1 e a sonda parahomólogos de FAS2. Parte da seqüência de nucleotídeos do inserto desteclone (15.539 pb de SEQ ID NO:2(genoma)) foi seqüenciada.
De uma comparação com a seqüência de aminoácidos deproteínas FAS1 e proteínas FAS2 conhecidas, foi inferido que os nucleotídeos1062 a 1064 (ATG) em SEQ ID NO: 2 (genoma) funcionam como um códonde iniciação. Também foi inferido que os homólogos de FASl e oshomólogos de FAS2 são codificados por um polipeptídeo único.
Clonagem de cDNA de comprimento total
Primeiro, com o cDNA de M. alpina 1S-4 como o modelo eusando o iniciador F1-2f: ATGACTACCGCACAGTCCAACTTGACC (SEQID NO: 12) e o iniciador F1-1r, 30 ciclos de reação PCR - cada cicloconsistindo de 10 segundos a 98°C e 15 minutos a 68°C - foram realizadoscom LATaq (Takara Bio). O fragmento de DNA de aproximadamente 5,4 kbobtido como um resultado foi clonado com um TOPO-TA Cloning Kit(Invitrogen), dando um plasmídeo que foi chamado de pCR-MAFAS-1. Aseqüência de nucleotídeos do inserto foi checada, e verificado quecorresponde aos nucleotídeos 1 a 5435 de SEQ ID NO: 1 (cDNA). O DNA foidigerido com a enzima de restrição EcoRI, e o fragmento de DNA de 5,4 kbDNA obtido foi ligado no sítio de EcoRI do vetor pBluescriptlI SK+. Foiselecionado o produto no qual o nucleotídeo de número 1 em SEQ ID NO: 1(cDNA) está localizado no lado de SacI de um sítio de multiclonagem novetor pBluescriptlI SK+. O plasmídeo resultante foi chamado de pBS-MAFAS-1.
A seguir, um fragmento de DNA de aproximadamente 2 kbobtido por digestão do plasmídeo pBSMAFAS2-1 com as enzimas derestrição Apal e EcoRV foi ligado nos sítios ApaI e EcoRV do vetorpBluescript II SK+. O plasmídeo resultante foi chamado de pBS-FAS2. Aseguir, com o cDNA de M. alpina 1S-4 como o modelo e usando o iniciadorFl-3f: TGTCTTGAAGAGCAAGGAGTGG (SEQ ID NO: 13) e o iniciadorF2-2r: GCGTAGTAGTCGCCGTGCTCAGCCATC (SEQ ID NO: 14), dezciclos de reação - cada ciclo consistindo de 2 minutos a 92°C seguido por 10segundos a 92°C, 30 segundos a 55°C e 8 minutos at 68°C, então vinte ciclosde reação - cada ciclo consistindo de 10 segundos a 92°C, 30 segundos a 55°Ce 8 minutos mais 10 segundos a 68°C - foram realizados com Pfu Turbo DNAPolymerase (Stratagene). O fragmento de DNA de aproximadamente 3,6 kbDNA obtido como um resultado foi clonado no vetor pCR4 Blunt-TOPOusando o Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen), e o plasmídeoresultante foi chamado de pCR-MAFAS-5. O fragmento de DNA deaproximadamente 3,1 kb DNA obtido por digestão do plasmídeo pCR-MAFAS-5 com as enzimas de restrição EcoRV e SpeI foi ligado com ofragmento de DNA de 4,9 kb obtido por digestão do plasmídeo pBS-MAFAS-2 com as enzimas de restrição EcoRV e SpeI. O plasmídeo resultante foichamado de pBS-MAFAS-3.
Em adição, um fragmento de DNA de 2,6 kb obtido pordigestão de pBS-MAFAS2-l com a enzima de restrição EcoRV foi ligadocom um fragmento de DNA obtido por digestão do plasmídeo pB S-MAFAS-3 com a enzima de restrição EcoRV. O fragmento de DNA inserido foiconfirmado em estar orientado na direção apropriada, dando assim oplasmídeo pBS-MaFAS.
O plasmídeo pBS-MaFAS compreende DNA possuindo aseqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, e foi considerado em incluir ocomprimento total do cDNA de homólogo de FAS de M. alpina 1S-4. CDSfoi a seqüência de nucleotídeos 1 a 12489, e ORF foi a seqüência denucleotídeos 1 a 12486, de SEQ ID NO: 1. A seqüência de aminoácidosputativa é mostrada em SEQ ID NO: 3 (proteína).
Esta seqüência de aminoácidos, quando comparada com osgenes de ácido-graxo-sintetase conhecidos, teve a estrutura de ácido-graxo-sintetases de fungos conhecidos na qual as subunidades β e α estão conectadasde cabeça-em-cauda. Contudo, foi baixa a homologia de ácido-graxo-sintetases de tipo I de origem bacteriana conhecida em ter uma estruturasimilar. Quando a seqüência de aminoácidos desta proteína foi comparadacom as seqüências de aminoácidos de ácido-graxo-sintetases de origemfungica nas quais a subunidade Pea subunidade α estão conectadas, aidentidade foi de cerca de 50%. Houve duas repetições de um motivocomposto de 165 aminoácidos correspondendo à parte da seqüênciaconservada (COG4982) de 3-oxo-acil-[proteína carreadora de acila].
Além disso, quando comparado com a seqüência genômicaobtida no início, este gene teve 7 íntrons. Em SEQ ID NO: 2, houve 8 exons:bases 1062 a 1304, bases 2140 a 2679, bases 2778 a 4724, bases 4823 a 7027,bases 7115 a 7243, bases 7339 a 7497, bases 7582 a 10668 e bases 10772 a14947; e 7 íntrons: bases 1305 a 2139, bases 2680 a 2777, bases 4725 a 4822,bases 7028 a 7114, bases 7244 a 7338, bases 7498 a 7581, e bases 10669 a10771.
Construção de vetor de expressão para a levedura Saccharomyces cerevisiae
O plasmídeo pBS-MaFAS foi digerido com a enzima derestrição ApaI, e então as extremidades foram cegadas com um DNABlunting Kit (Takara Bio). Isto foi seguido pela digestão com a enzima derestrição EcoRI, dando um fragmento de DNA de aproximadamente 13 kb.Este fragmento de DNA foi digerido com a enzima de restrição BamHI, entãocegado e subseqüentemente ligado com o vetor pYE22m (Biosci. Biotech.
Biochem., 59, 12211228, 1995) digerido com a enzima de restrição EcoRI,construindo deste modo o plasmídeo ρYE-MaFAS.Análise de ácido graxo de levedura de expressão alta de MaFAS
Duas cepas aleatoriamente selecionadas dentre ostransformantes obtidos pela transformação de cepa EH1315 de levedura S.cerevisiae (Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989) com oplasmídeo pYE-MaFAS foram chamadas de cepa MaFAS-I e cepa MaFAS-2.Em adição, uma cepa aleatoriamente selecionada dentre os transformantesobtidos pela transformação da cepa EH1315de levedura S. cerevisiae com ovetor pYE22m foi usada como o controle (cepa C-1). Uma alça de platina decada uma destas cepas foi inoculada em 10 ml de um meio líquido SC-Trp ou10 ml de um meio líquido YPD, e cultivada a 30°C por 2 dias. As célulasforam então colhidas por separação centrífuga e liofilizadas. Os ácidos graxosnas células foram convertidos em seus metil-ésteres pelo método de ácidoclorídrico / metanol, e extraídos com hexano. O hexano foi então destilado, eanálise cromatográfica a gás foi realizada. Os resultados são mostrados em
Tabela 1.
Tabela 1
Composição de ácido graxo de células de levedura crescidas em meiosdiferentes
<table>table see original document page 39</column></row><table>
Na cepa C-1, a proporção de ácidos graxos de 18 carbonosácido esteárico e ácido oleico foi mais alta do que aquela de ácidos graxos de16 carbonos, enquanto que a cepa MaFAS-I e a cepa MaFAS-2 que teveexpressão alta de MaFAS, a proporção de ácidos graxos de 16 carbonos ácidopalmítico e ácido palmitoleico foi mais alta.
Construção de vetor de expressão no fungo produtor de lipídeo Mortierellaalpina
O plasmídeo pBIueHpt (Publicação JP Publicada de No. 2005-287403) foi digerido com NcoI e BamHI, e então MCS I-F e MCS I-R nosquais a terminação 5' foi fosforilada foram anelados e inseridos, para dar oplasmídeo pBlueHptMCS.
MCS l-F:5'-catggatcctctagactgcaggcatgcaagcttctcga (SEQ ID NO: 15)
MCS l-R:5'-ctaggagatctgacgtccgtacgttcgaagagctctag (SEQ ID NO: 16)
O plasmídeo pDura5 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425,(2004)) foi digerido com a enzima de restrição BamHI, e então asextremidades foram cegadas, seguido por auto-ligação. Então, o plasmídeoobtido foi digerido com a enzima de restrição XbaI, e então as extremidadesforam cegadas, seguido por auto-ligação. Ademais, o plasmídeo obtido foidigerido com a enzima de restrição HindIII, e então as extremidades foramcegadas, seguido por auto-ligação. Após o plasmídeo obtido ser digerido comEcoRI, foi inserido um fragmento possuindo cerca de 1,7 kpb obtido pordigestão do plasmídeo pBlueHptMCS com EcoRI. Um plasmídeo possuindoo promotor de gene histonH4,linserido na mesma direção foi selecionado, edesignado como vetor plasmídeo pDura5MCS.
O plasmídeo pBS-MaFAS foi digerido com a enzima derestrição ApaI, e então as extremidades foram cegadas usando o DNABlunting Kit (Takara Bio). O produto foi então digerido com a enzima derestrição XbaI, dando um fragmento de DNA de aproximadamente 13 kb.Este fragmento de DNA foi digerido com a enzima de restrição HindIII, entãocegado, após o qual ele foi ligado no vetor pDura5MCS digerido com aenzima de restrição XbaI, construindo deste modo o plasmídeo pDura5-MaF AS.
Transformação do fungo produtor de lipídeo M. alpina
Usando o plasmídeo pDura5-MaFAS, transformação pelométodo de liberação de partícula foi realizada, com o uso de cepa Aura-3requerendo uracila, como hospedeiro, derivada de M. alpina de acordo com ométodo do Documento de Patente (método para geração de fungos produtoresde lipídeo). Um meio de ágar SC (0,5% de Base Nitrogenada de Levedurasem Aminoácidos e Sulfato de Amônio (Difco), 0,17% de sulfato de amônio,2% de glicose, 0,002% de adenina, 0,003% de tirosina, 0,0001% demetionina, 0,0002% de arginina, 0,0002% de histidina, 0,0004% lisina, 0,0004% triptofano, 0,0005% de treonina, 0,0006% de isoleucina, 0,0006%de leucina, 0,0006% de fenil-alanina, 2% de ágar) foi usado para seleção dostransformantes.
Dois dos transformantes obtidos foram chamados de cepaFAS-3 e cepa FAS-4. Uma cepa aleatoriamente selecionada na qual pDura5 tem sido introduzido foi chamada de cepa C-2. Estas cepas foram inoculadasem um meio líquido contendo 2% de glicose e 1% de extrato de levedo, ecultivadas com agitação a 28°C. No dia 3 do cultivo, uma solução de glicose20% foi adicionada em uma quantidade correspondendo a 1/20 da culturalíquida. No dia 4, um pouco das células foi colhido e liofilizado. Os ácidos graxos das células foram convertidos nos metil-ésteres correspondentes, entãoextraídos com hexano. O hexano foi destilado e análise cromatográfica gasosafoi realizada, determinando deste modo quantitativamente a quantidade deácidos graxos por célula. As quantidades são mostradas em Tabela 2.
Tabela 2
<table>table see original document page 41</column></row><table>
Comparado com a cepa C-2, a quantidade de ácido graxo porcélula aumentou nas cepas FAS-3 e FAS-4.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
A presente invenção é útil para melhorar a produtividade deácido graxo, para a produção de ácidos graxos desejados, e/ou para aprodução de qualquer um dos seguintes que contêm ácidos graxos desejados:alimentos, cosméticos, preparações externas para pele e/ou sabões.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Suntory Limited
<120> Ácido-graxo-sintase, polinucleotideo codificador da mesma, e seususos
<130> PCT07-0017
<150> JP2006-12877 9<151> 2006-05-08
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1<211> 12926<212> DNA
<213> Mortierella alpina<400> 1
atgactaccg cacagtccaa cttgacccgt cctttggccc tcaagcaagg aacttctgag 60
gtctcgatcc tcgttccttc ggatgtctgg gtagcggctg aacaacttcg tgaggagttt 120
ctgatctcgg tcgaggctgc tcctgcagag gaggccgcag cgaccggaag tgctgacgat 180
caggccccgg agatggcttt ggtggcccgt tttctcaaat ttgctacgga caagagcgag 240
cagagcgatc cttcactgca gttcattcct gtgctgagaa ccgtcttcct gttctttgtc 300
accaaatacc ttaaaggaaa cgacatccac gcggtcactc gacttttagc aaaggatacc 360
cgggtggtga tcatcaatgc gttcttctcg gccttggtct tcctccgtgc tacggaggct 420
cttgcacccg aggactacac cccgccaacc tcggcactat ttgccgctgc tcaggaggga 480
aaggctaagc tgtttgccat ctttggcggt cagggcaata tcgaggagta ctttgacgag 540
ctggcagaca tctacacgac ctataccacg ttggtgcagg actacgtcga ggacatggct 600
gcagtgttgc gcgagcacgc cagatcggat gatgcctcgg tcttccactc caagggactg 660
gatgtcatgg ggtggttgag gagcccagac tcgaagccag atgttgcgta tctggtttca 720
gcacccgtct ctctgccctt gattggactt gtccagctta tgcattacta tgtgatgctc 780
aaggttcttg accagactcc cgcccagctt cgcgatgtta ttcttggttc gacgggacac 84 0
tcccagggca tcatctcgtc tgtggtcatc tcatcctcgg ccacattcga ggagttcttt 900
gctaactctc gtaaggcact gggacttctt ttctggatcg gaacccgctc ccaggaggtc 960
taccctcaaa ccaccctcaa tcccgccatt cttcaagact cgctctctaa caatgaaggc 1020
aaccctactc ctatgctggt tgtcaactct ttgcgcgcat ctgaggtcca gaagtacgtc 1080
gaggccacca accgccattt gccagaggac cgcaagatca agatcgcgct tattaacgga 1140
ccccgctcat ctatctgcac gggacctcct caatcgttgt acggcctgaa ccttgctctt 1200
cgcaagctca aggctcccac gggcctggag cagggtcgtg tacccttttc gcagagaaag 1260
gtcaagttct cgtcccgttt cttgcccatc actgcaccct tccactcttc gtatctggat 1320
ggcgtctctg ccctggtcga gagcgatatt gctcggtacg acctgaggtt tgaccatacc 1380
cagatgacca tccccgtctt ctcaaccgac tctggaaagg acattgcagg atcgcctact 1440
attactacgg accttgtcaa tcaaatttgt tcccttcccg tgcactggga gaaggcgact 1500
gctatggcag gattgaccca tgtgatcgat ttcggccccg gcggctcctc gggcgtcggc 1560
tctttgacgg cccgcaacaa ggacggcacg ggtgtccagg tgatgctggc cggcgcttct 1620
gagggcgtca accgcgagct gtcgtacaaa cccgacatct tcgatgccaa cccagctgct 1680
ctgcgctatg cccccaactg ggccaatgag ttccagccaa agctggttcg ctccgtcaac 1740
ggcgagatcc acatcgacac tcgcatgtcc cgcctccttt ccaagccccc attgatggtc 1800
gccggaatga ccccctcgac tgttaacgag ggctttgtca gtgctgttat gaatgccggt 1860
taccacgttg agctggccgg tggtggacac tataacgagg ccgcggtccg cagcaaggtc 1920
aagaagatca tgcagctcac cactcctgga gccggtatca ctctcaacac cctcttcatc 1980
aatgtgcgcc agtggggctt ccaagctccc ttggtgccca agctccgtcg cgagggcctc 2040
cccatggagg gcttttgttg cgctgccggt gttccctcgc tcgaggtcgc agacgagttc 2100
atcactgaca tgctcagtgc cggaatccgt cacatctcct tcaagcctgg ctcggccgag 2160
gccatccgcc aggtcttggc gatcgccaat gcccaccctg agatgcccat cgttcttcag 2220
tggactggtg gccgtgctgg tggccatcac agtttcgagg atttccatca gcccatcctg 2280
gagacatact ctgccatccg tcgtcaccct aacgttgtcc tggtggccgg ctctggtttc 2340
ggtggcgctg aggacaccta cccctacctc acaggtgact ggtctgtcca gctcgactac 2400cctcccatgc cttttgatgg tatgcttttt ggttcacgcg tcatggtggc caaggaggga 2460
atggcttcgc ttggtgtgaa gcaggctatt gtcgatgcac ccggagtcga ggactctgag 2520
tgggaaaaga cttacaaggg acccaccgga ggcgtcatga ctgtccgttc cgaattggga 2580
gagcccattc ataaaattgc aacccgcgga gtcaagctgt ggaaggagat ggacgacacc 2640
atctttgctc tgcccaagga caagcgtccc gctgccctct tggccaagaa ggactacatc 2700
atcaagcgtc tgaacgctga cttccaaaag gtctggttcg gtaagaaggc caacggcagc 2760
gttgctgatc ttcaggacat gacttatgag gaggtcatca accgcttgat tgagctcatg 2820
tttatcaagc atgaggagcg ctggattgat cactctcacc gcaacttgct cggcgacatc 2880
cttcgccgga ttgaggagcg cttcgttggc gttgagaaga agtccattgt ccaaaccttc 2940
tctcagcttg acatcccttt tgcgtttgcc caggagtttg tcgacaccta tcccctgacc 3000
aagacccagc tcttgactac cgaggatgtt ggatacttct tgttcttgat gaaccgtcgt 3060
ggacaaaagc ccgtgccatt cattcccgtg ctcgacaagg actttgaggt gtggtttaag 3120
aaggactctc tctggcaggc cgaggacttg gccgctgttg ttgatcagga tgtgcagcgc 3180
acctgcattc ttcagggacc tgccgccgtc cgctatgcaa ccaaggtgga tgagcccgtc 3240
aaggatattt tggacggcat cttccacagc cacattgcct ggttgaagga gcgttattac 3300
aacaacaacg atgccaacat tccccaggtc gagtactttg gcggcaagcc cggacgcttc 3360
gagtccgcct tggatgctgt cttgcccttg gtcaaggtcg agacttacga caacggcaag 3420
gtcaagatgg tggagacctc catgctagag tcaagcttgc ccaagaatga ggattggctc 3480
gagtaccttg ctggccagga cccctcttgg ttccgcgccc tcttgactgc ccccgccgtc 3540
attcaaggca agaagttctt ggataatcct cttgcacgca tcttccgtcc tcgtgtctct 3600
caagccgttc acttcgagta cgccgaggac aagttgcaaa ccattaccgt ttacgatcgt 3660
cgctcctggt ctgcttccag caagtcgagc gagctctctc cctcgcttcg cgcccgtctg 3720
cagcccaacg agctcattga ggtcgtgctg gtggagaaga acggcgagcg tttgattcct 3780
ttccctctcc tcttccacta cacccccgag aagggatatg cccctatcca tgaggtcatg 3840
gagggtcgca acgagagaat caaggagttc tactacaagc tttggttccc ttcagaggag 3900
gatcaattca acgcctgcct ggccactgat gccttcaccg aaaagtttat ttgcaatggt 3960
gagcaggtca gcacgccaga gatcaaggag ttttgccagg ctgtcggaaa ccaggccgag 4020
ctctacgttg agcgccgcca gaaagttgtc tatgcgccca tggattttgc tattgtcgtt 4080
ggctggaagt ctatcatcaa ggccatcttc cccaagtcga ttgacggtga tctgttgaag 4140
cttgtccatc tctcgaacgg cttccgtatg ttagatggcg ccgagtcctt gaagcaaggc 4200
gacattgttg acactgttgc cgagatcaat gccgttgtca acaacgattc cgggaagttg 4260
gttcaggtca agggcgtggt tctgcgtgag ggcaagcgcg tcatggaggt gacctcggag 4320
ttcttgtacc gcggcacctt tgtggattac cagaacacat tccaaaagac ggttgagacc 4380
cccatggagg ttaagctgac gtccgccaag gatgtggctg tcttgaagag caaggagtgg 4440
atccagtggg ccgagggtga gcacaccgtc gggcctaatg cgtccttggt cttccgcctg 4500
aacacgattg ttcgcttcaa gaacaagacc accttctcgc atgttgagac cactggtacc 4560
gtgtcgatgc agatttccac taaggagcat gtcgagattg ccactgttca ctatagcaac 4 620
gacgaggaga ctcagggaaa tcccgtcctc gcctacttga agcgctcggg ttctcctatc 4680
gagcaggcca tccacttcga gaacggtgga tattctgtca tgcccgaggg ttccttcagc 4740
tcggaggtca tttctccctt cagcaatgag ccctatgcta aggtttcggg tgactttaac 4800
cctatccacg ttaaccctta ctttgctgat ctcgctgagc tccctggcac tattacccat 4860
ggcatgtgga ctagtgcctc gacccgcaag tttgtggaga tctttgctgc agagaatcat 4920
cctcagcgtg tcactagcta cgaggtcaag ttcctttcta tggtgcttcc tcaggaccgt 4980
ctttcgacca agttatcgca cattggaatg atcaacggaa agaagatcat caaagtggaa 5040
actttcaacc agaacggcag caaggttgtt gagggcactg ctgagattga tcagcccacg 5100
atcgcctatg tgttcactgg acagggatct caggagcagg gaatgggaat ggctctgtat 5160
gactcttccc ccgtcgccaa ggacatctgg cagagagccg accgtcattt cttggaaaac 5220
tatggcttct ccattctgga tattgtccgc aacaatcctc tgaagaagac gattcacttt 5280
ggtggtccca agggtaacgc cattcgtcag aattacatgt cgatgcgcta cgatcaagtt 5340
gaccaggatg gctccatcaa atctttgcct ctgttccccg gcatcaacga gaccacgcac 5400
ttttacacct tccagtcacc caacggtctt ttggctgcca ctcagttcac acagcctgcc 5460
ttgaccctta tggagaaggc cgccttcgag gacatgcgct ccaagggttt gatccagggc 5520
aactgtgcct ttgccggtca ctcgctcgga gagtactctg ctcttgctgc cattggtgag 5580
gtccttccca tcgaatcctt ggttgatgtc gtcttctacc gtggtatgac catgcaggtc 5640
gctgttcccc gcgactctgt cggccgctcc aactatggaa tggtcgccat caacccatcg 5700
cgtgtctcgc ccacattcaa cgactctgct ctccgctatg tcgtggacgc aatcgccaga 5760
cagtcgaacg gtcttttgga aattgtcaat gagaacgttg agaactggca gtatgttgct 5820
gctggtgagc tttctaactt ggacgctctc tcgactgtcc tgaactacct caaggtgcag 5880
aagatcgatc ttcagaagct gatggagacc atgcccttgg aagaggtcaa gaagcacctg 5940
tctcagatca ttgccggcgc ccttgagaag gttgccgaga aggttgccaa ggatggtcac 6000
atcaagcctg agcgcggtgt tgctaccatc cccttggctg gaatcgatgt ccccttccac 6060
tctagcttct tgttgtccgg tgtcgctccc ttccgcacct atctcgccaa gaagatcaac 6120
cctacgttca ttaacgtgcc cctgttgact tccaagtaca ttcccaattt gactgctcag 6180cccttcagca ttgagaagtc ctacattgag ggcgtctaca acctcacgtc gtctccccgt 6240
ctggccaagg tcctcaagaa ctggatcgac accaagctga ctgccaagca gcagcagcgt 6300
ctgggatata ctctcttggt cgagttgctc gcttaccagt tcgcttcgcc cgtccgttgg 6360
attgagaccc aggatagact cttcaaggag tacaacgtcg tccgcttgat tgaggttgga 6420
ccctcgccca cgctctgtgg tatggcccaa cgcacgctca agttcaagta cgaggcttat 6480
gatgatgcct tgaccttcca gcgttcgact ctttgcacgt ccaaggactc caaggagatt 6540
tattatgcca tggacaatgt cgagtcctcg gctcctgctc cggctgccag tgctgctgct 6600
cccgccccca aagccacccc agttgccgct gcagcccccg ctcccgtggc tgtcgccgct 6660
gcaggacctg ctgccgccgt ttcagatgtc cccatcaagg cccttgagat cttgcatgtg 6720
atcgttgccc aaaaggtcaa gaagactctc gaagaggtcc ctctctcgaa ggccatcaag 6780
gatcttgtag gaggcaagtc gactcttcag aacgaaatct tgggtgatct tcagaaggag 6840
tttggtagca gcggattccc tgagaagggc gaggaggctc ctctggagga gcttgccaac 6900
gctcttcagg gcaacttcaa cggagctctt ggaaagcaga ccacttcgct catcgccaag 6960
atgattggat ccaagatgcc cggtggttat tcgctctcga ctgccaaggg atacctggcc 7020
aaggcccacg gcctgggtcc tgtccgtgcc gatgctgcgc tcttggtcgg tttgacgatg 7080
gagcccgcag cccgtctggg cgccgttcct gaggccaatg cttggttgga ttcggtcgct 7140
caggcttacg cccgccgtgc tggtatctcg ctgtcggctg gtgcccccgc tggtggtgcc 7200
gctcccgtca tgatggcggc tgctggccct gctgctgctg gtcctgcagc tgctgttgct 7260
gatgctccta tcaaggctat tgacattctt cacgtcattg ttgcccaaaa gatcaagaag 7320
actgtcgagg aggtcccact ctcgaaggcc atcaaggatc ttgttggtgg caagtcgact 7380
ctgcagaacg agatcttggg tgatcttcag aaggagtttg gcagcagtgg cttccctgag 7440
aagggcgagg aggctccttt ggaagatctc ggaaatgctc tccagggtaa ctttggtgga 7500
tccttgggca tgcagacgac ctcgttgatt gccaagatga tgggatccaa gatgccaggt 7560
ggatttaccc agtcctcagc caaggcttac ctcgcctcgt cttatggctt gggtccactc 7 620
cgcgctgacg gtgcgttgct cttgggtgtc actatggagc ccagcgcccg cctcggatcc 7680
gagggtgatg ccaaggcttg gttggacact gtcgcccaag cttacgctcg tcgtgccggt 7740
atttccttgg gaggcggcgg cggcggtgct gtcgctggtg gtgccgttgg tggtgccatg 7800
atgaacagtg aggagttcaa ccaattccag gccaagcaga acgcgatgat gtaccagcac 7860
ctcgagatct atgctcgtta ccttgagaag gatctccgtg ctggcgaaaa gcagtacgag 7920
gaggagaagc tggcgaccct gcgcttgcag gcagatatcg accagtggat ggctgagcac 7980
ggcgactact acgccgaggg catcaagcct gccttcagcg ccaagaaggc ccgcaagtac 8040
gactcacact ggaactgggt ccgtcaggat gccatgtcgc tcttgtacga catgatcttt 8100
ggccgactca ccgtcgttga ccgcgaggtc gtggcccagt gcatccatgt catgaaccgc 8160
gctaaccccc agttgcttga gtttatgatc taccacattg acaacactgc tgctgatcgc 8220
ggcaagacct atgctttggc caaggagttt ggtaacatgt tgatcgagaa ctgtcgcgag 8280
gttctggaag ccgcgcctgt ctacaaggat gtcggtgttc ctaccggtcc ccagacgacg 8340
atcgataaca agggcaatat cttgtacgag gaggttcagc gcgtgggtgt ccgcaagctg 8400
gatcactatg tcaaggatat ggtcgctggt ggcaagatgt ccgagtacag caaccgccag 8460
aaggtgcaga agaaccttgc tcagatctac aagatcatta aggctcagaa cacgatgaag 8520
tcttcctcca agttggcgat caagtcactc tacggcgagg tcatccatgc catgaacatg 8580
tccaacacca tcatccgtga ggagaagaac cgccgtgcca gccgcgtccg ccgcgcctcg 8640
gccgttccca gcgccgaccg ccctaagaag gaggccaaga aggagaccat tcccttcttg 8700
cacctcaaga agaagaaccc ccagtctgag agcggatggg agttcagtca gcgtttgaca 87 60
agcgtttact tggatgtctt gaccaacatt gcgcgcgacg gtgttacatt tgagaaccgc 8820
atggtcctga tgaccggtgc tggaaaggac tcgatcggag cctcgatcct caagggtctc 8880
ttgtccggag gagccaaggt tgttgtcacg acctcgcgct tcagccgtga tgtgaccgag 8940
tactaccaat cgatctacca gcgccacgga tccaagaact catgcttggt tgttgttccc 9000
ttcaacggag gctccaagca ggatgtcgac gcacttgtca actacattta cgataaggat 9060
ctcaagaagg gtcttggctg ggatctcgac tacatcatcc ccttcgctgc catctcggtc 9120
cagggcaagg agattgacaa catcgactcg cagtccgagc tggctcaccg tatcatgttg 9180
accaacgttt tgcgtctgct cggaaacgtt aaggccaaga agatggagca cggctacgac 9240
actcgccctg ctcaggtcat cctgcccttg tcgcccaacc acggaacctt cggagctgac 9300
ggtctctatg gtgagtctaa ggttgctctc gagaccttgt tcaaccgctg gagttccgag 9360
tcttggggcg cctatctgac catcaccgga gccgttattg gctggactcg cggtactgga 9420
ttgatgagcg gtaacaacat tgtggccgag ggcctggaga agtacggtgt ccgcaccttc 9480
tctggccagg agatggcatt caacattctc ggtctcatgc atccctcgat caccaacctc 9540
tgccaggtcg agcctgtctg ggccgacttg aacggtggtc ttcagtactt gcccaacctg 9600
aacgaaatct cggccaactt gcgtgccgaa taccgccaga cggccgagat ccgcaaggcg 9660
atcgtcaccg agaacactct ggatttcaag gagacccacg gtgctgaggc cgagcgtaag 9720
caccaacccc acaaggtcac gcctcgtgcc aacatgaaat tccctttccc tgagctgaag 9780
gactacaagg acctgtcgca cgctcacaag ctccgcggca tgctcgatct tgagaaggtt 9840
gtcgtcgtca ctggtttctc tgaggtcgga ccttggggta actcgcgcac tcgctgggaa 9900
atggaggcta atggccagtt ctcactcgag ggatgcattg agatggcctg gatcatgggc 9960ttcatcaaac atcacaatgg taacctcaag tctggctccc cttactctgg ctgggtcgat
gccaagactg aagagcccgt caaggatcgc gatgtgaaag ccaagtacga gaagcagatc
ttggagcaca ctggtatccg tctgattgag cccgagctct ttggaggtta tgatcccaag
cgtaagggac tgcttcagga ggtcttgatc gaccatgatc ttgaggcctt tgaggtctcg
aaggaggagg cccagatgtt caagcttgag cacggcgaca aggtcgacat ttacgaggag
gagtctggtc agtgggccgt caagttcaag aagggcgcta acatgtatat tcccaaggcc
ctgaagttcg atcgtcttgt tgctggccag atccccactg gatgggatgc tgcccgcttt
ggagtaccca aggacatcat tgaccaggtc gatactatta ccctttatgt cttggtctcg
accgtggagg ccttggttgc ctcgggtatc actgatcctt atgagttcta ccagtacgtt
cacgtgtctg aggttggaaa tacagctgga tccggtgtcg gaggcatgct ctcgcttcgc
ggcatgtacc gcggtcgcgt gatggatgat cctgtgcaga aggatatctt gcaggagtcc
ttcatcaaca cgatgcctgc ctgggtcaac atgctgctcc tgtcatcctc tggacctatc
aagacacccg tcggagcttg tgccaccgct gtcgagtctg tcgagattgg tgtggatacg
atccagagcg gtaaggcaaa gattgtgatt gtcggaggct acgatgactt ccaggaggaa
ggttcgtacg agtttgccaa catgaaggcg accagcaaca ccgaggaaga gtttgcgcat
ggacgtacgc ccaaggagat gtcccgccct gcaacctcga cccgctctgg attcatggag
tctcacggag ctggtattga gattttgatg caggccaagc ttgccgtgga gatgggtgtg
cccatttacg gtatcgtcgg tctcaccaac actgccaccg acaaggaggg tcgctctgtt
ccagctcctg gacagggtgt cctcaccact gctcgtgagg ctaagggcaa gatgccttcg
cgccttctgg acatcaagta ccgcaagcgc cagatcgatt cccgccgagc tcagattaag
caatgggtcg agaacgagta tgctgagctc cgctacgagc tcgatgagct caaggccagc
aacagcctca ccgtctcgga agaagagtat cttgctgctg agactgagcg cattcagaag
gaagccaagc gtcagcaccg cgaggccctt aacctgtggg gcaatgagtt ctacagacag
gaccctcaga tcgctcctct gcgtggtgcc cttgcctcct ttggcttgac gatcgatgac
attggtgttg gatccttcca cggtacctcc accaaggcca acgacaagaa cgaatccgaa
gtcgtcaaca agcagctcga gcatttgggt cgcagcaagg gtaacgcttt gccctctatc
tggcaaaagt acctcacggg acatcccaag ggtgctgctg ctgcctggat gatgaacggt
gtcctgcaag tcctccagac gggtctcatt cccggaaacc gtaacgccga caacattgac
gacacaatga gacagtatga gcacgtcttg tacacctcgc ggtcgattca gactgatggt
gtcaaggccg gtctgctcaa atcgttcggt ttcggccagg tcggaggtga agttctcctg
atccactcgg attacattct tggtgcattg gaggagcacg agtacgaggc ttacaaggtc
aagcagcagg cgcgccaggc caagtcgtac cggtacttgc atgactctat gaccggcggc
cctgccctgg tccaggtcaa gaacgctccc ccatactcgc ccgagctcga gtcccccgtg
tacttgaacc ccaaggcccg tgcgcagtac aacaacgcga ccaagtcctg ggcgttcaac
gctaagcacc tggtacccga gtctgacaag attgatgtgg acatgacgcg tgcgattctg
gagacgtccg ctcaagagtc attaggtgtg acgtcctcgt cttcgcgcgg tgtgggtgtg
gatgtggaaa tggtctctgc gatcaacatt gagaacgaca cgttcttgga gcgtaacttt
acccagcagg agattgacta ctgtctgagc cgaccggatc ctcaggctag ctttgctggt
cggtggtctg ccaaggaggc cgtggttaag gccgtttcgt cgttctcgct cgactctgag
aaggtgtgga cacagggtgc aggagcggga ctgagtgaga ttgagattgt gatggcagag
agcggcgcac cctcggtggt gttctcgggt gcggcccagg aggcggcggc caaggccggc
gtcaaggaga tcaaggtctc gatcagccat tctggcgcgt acgcggttgc ggttgcaaat
gcgttgtaaa aacctcccct ctccttcaag tgttcttgtt ctttcatttt ttctttcgtt
cttttaattg cgcttgcttg tgctttcttc agtagagttc tcttttttct ttcttcattc
tatttcttta cttcttatac cttttcatgg gcccttgtat acaaacaact tataaataaa
aagggtgttc tgcgggtggg gtgggaggcg ggccacgatg ggtttcaagc aggtatgatg
gaagaaggct ctacattctc aagagaacag ctggggagtg acaggttgag ttgaacgcaa
cgcttctctt cttgcctcct ttattttcta gttctcccga gtcccttctt gactacttgg
cttacgcaac aagtacccag cgcgcctcct tcaccttcac ttacgagagc aatatctcta
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctcgac
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aagatggagccacggaacctttcaaccgctggctggactcaagtacggtgcatccctcgacttcagtactacggccgagaggtgctgaggttccctttccatgctcgatcaactcgcgcagagatggcctccttactctggccaagtacgtttggaggttcttgaggcctaaggtcgacaaacatgtataggatgggatgaccctttatgtatgagttctggaggcatgcaaggatatctctgtcatcctgtcgagattgtacgatgactaccgaggaagacccgctctgcttgccgtgggacaaggagggctaagggcatcccgccgagctcgatgagcgagactgagcggcaatgagttttggcttgaaacgacaagaggtaacgcttgctgcctggacgtaacgccgcggtcgattcgtcggaggtggagtacgaggcatgactctacccgagctcgaccaagtcctgacatgacgctcttcgcgcgacgttcttggcctcaggctatcgttctcgcattgagattggaggcggcggtacgcggttgtctttcatttctcttttttctacaaacaacgggtttcaaggacaggttgaagtcccttctcttacgagagcgatgattat
acggctacgatcggagctgaggagttccgagcggtactggtccgcacctttcaccaaccttgcccaaccttccgcaaggcccgagcgtaactgagctgaattgagaaggtctcgctgggaggatcatggggctgggtcgaagaagcagatatgatcccaattgaggtctctttacgaggattcccaaggcctgcccgctttcttggtctcaccagtacgttctcgcttcgtgcaggagtcctggacctatgtgtggatactccaggaggaagtttgcgcagattcatggaagatgggtgtgtcgctctgtagatgccttcctcagattaatcaaggccaggcattcagaatctacagacacgatcgatgaacgaatccgatgccctctattgatgaacggacaacattgaagactgatggaagttctcctcttacaaggttgaccggcggagtcccccgtgggcgttcaagtgcgattctgtgtgggtgtagcgtaacttgctttgctggtcgactctgatgatggcagaccaaggccggcggttgcaaatttctttcgttttcttcattttataaataacaggtatgatgttgaacgcatgactacttgcaatatctctgatgcttttg
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3170 3175 3180
Glu Pro Val Trp Ala Asp Leu Asn Gly Gly Leu Gln Tyr Leu Pro
3185 3190 3195
Asn Leu Asn Glu Ile Ser Ala Asn Leu Arg Ala Glu Tyr Arg Gln
3200 3205 3210
Thr Ala Glu Ile Arg Lys Ala Ile Val Thr Glu Asn Thr Leu Asp
3215 3220 3225
Phe Lys Glu Thr His Gly Ala Glu Ala Glu Arg Lys His Gln Pro
3230 3235 3240
His Lys Val Thr Pro Arg Ala Asn Met Lys Phe Pro Phe Pro Glu
3245 3250 3255
Leu Lys Asp Tyr Lys Asp Leu Ser His Ala His Lys Leu Arg Gly
3260 3265 3270
Met Leu Asp Leu Glu Lys Val Val Val Val Thr Gly Phe Ser Glu
3275 3280 3285
Val Gly Pro Trp Gly Asn Ser Arg Thr Arg Trp Glu Met Glu Ala3290 3295 3300 Asn Gly 3305 Gln Phe Ser Leu Glu 3310 Gly Cys Ile Glu Met 3315 Ala Trp IleMet Gly 3320 Phe Ile Lys His His 3325 Asn Gly Asn Leu Lys 3330 Ser Gly SerPro Tyr 3335 Ser Gly Trp Val Asp 3340 Ala Lys Thr Glu Glu 3345 Pro Val LysAsp Arg 3350 Asp Val Lys Ala Lys 3355 Tyr Glu Lys Gln Ile 3360 Leu Glu HisThr Gly 3365 Ile Arg Leu Ile Glu 3370 Pro Glu Leu Phe Gly 3375 Gly Tyr AspPro Lys 3380 Arg Lys Gly Leu Leu 3385 Gln Glu Val Leu Ile 3390 Asp His AspLeu Glu 3395 Ala Phe Glu Val Ser 3400 Lys Glu Glu Ala Gln 3405 Met Phe LysLeu Glu 3410 His Gly Asp Lys Val 3415 Asp Ile Tyr Glu Glu 3420 Glu Ser GlyGln Trp 3425 Ala Val Lys Phe Lys 3430 Lys Gly Ala Asn Met 3435 Tyr Ile ProLys Ala 3440 Leu Lys Phe Asp Arg 3445 Leu Val Ala Gly Gln 3450 Ile Pro ThrGly Trp 3455 Asp Ala Ala Arg Phe 3460 Gly Val Pro Lys Asp 3465 Ile Ile AspGln Val 3470 Asp Thr Ile Thr Leu 3475 Tyr Val Leu Val Ser 3480 Thr Val GluAla Leu 3485 Val Ala Ser Gly Ile 3490 Thr Asp Pro Tyr Glu 3495 Phe Tyr GlnTyr Val 3500 His Val Ser Glu Val 3505 Gly Asn Thr Ala Gly 3510 Ser Gly ValGly Gly 3515 Met Leu Ser Leu Arg 3520 Gly Met Tyr Arg Gly 3525 Arg Val MetAsp Asp 3530 Pro Val Gln Lys Asp 3535 Ile Leu Gln Glu Ser 3540 Phe Ile AsnThr Met 3545 Pro Ala Trp Val Asn 3550 Met Leu Leu Leu Ser 3555 Ser Ser GlyPro Ile 3560 Lys Thr Pro Val Gly 3565 Ala Cys Ala Thr Ala 3570 Val Glu SerVal Glu 3575 Ile Gly Val Asp Thr 3580 Ile Gln Ser Gly Lys 3585 Ala Lys IleVal Ile 3590 Val Gly Gly Tyr Asp 3595 Asp Phe Gln Glu Glu 3600 Gly Ser TyrGlu Phe 3605 Ala Asn Met Lys Ala 3610 Thr Ser Asn Thr Glu 3615 Glu Glu PheAla His 3620 Gly Arg Thr Pro Lys 3625 Glu Met Ser Arg Pro 3630 Ala Thr SerThr Arg 3635 Ser Gly Phe Met Glu 3640 Ser His Gly Ala Gly 3645 Ile Glu IleLeu Met 3650 Gln Ala Lys Leu Ala 3655 Val Glu Met Gly Val 3660 Pro Ile TyrGly Ile Val Gly Leu Thr Asn Thr Ala Thr Asp Lys Glu Gly Arg 3665 3670 3675 Ser Val 3680 Pro Ala Pro Gly Gln 3685 Gly Val Leu Thr Thr 3690 Ala Arg GluAla Lys 3695 Gly Lys Met Pro Ser 3700 Arg Leu Leu Asp Ile 3705 Lys Tyr ArgLys Arg 3710 Gln Ile Asp Ser Arg 3715 Arg Ala Gln Ile Lys 3720 Gln Trp ValGlu Asn 3725 Glu Tyr Ala Glu Leu 3730 Arg Tyr Glu Leu Asp 3735 Glu Leu LysAla Ser 3740 Asn Ser Leu Thr Val 3745 Ser Glu Glu Glu Tyr 3750 Leu Ala AlaGlu Thr 3755 Glu Arg Ile Gln Lys 3760 Glu Ala Lys Arg Gln 3765 His Arg GluAla Leu 3770 Asn Leu Trp Gly Asn 3775 Glu Phe Tyr Arg Gln 3780 Asp Pro GlnIle Ala 3785 Pro Leu Arg Gly Ala 3790 Leu Ala Ser Phe Gly 3795 Leu Thr IleAsp Asp 3800 Ile Gly Val Gly Ser 3805 Phe His Gly Thr Ser 3810 Thr Lys AlaAsn Asp 3815 Lys Asn Glu Ser Glu 3820 Val Val Asn Lys Gln 3825 Leu Glu HisLeu Gly 3830 Arg Ser Lys Gly Asn 3835 Ala Leu Pro Ser Ile 3840 Trp Gln LysTyr Leu 3845 Thr Gly His Pro Lys 3850 Gly Ala Ala Ala Ala 3855 Trp Met MetAsn Gly 3860 Val Leu Gln Val Leu 3865 Gln Thr Gly Leu Ile 3870 Pro Gly AsnArg Asn 3875 Ala Asp Asn Ile Asp 3880 Asp Thr Met Arg Gln 3885 Tyr Glu HisVal Leu 3890 Tyr Thr Ser Arg Ser 3895 Ile Gln Thr Asp Gly 3900 Val Lys AlaGly Leu 3905 Leu Lys Ser Phe Gly 3910 Phe Gly Gln Val Gly 3915 Gly Glu ValLeu Leu 3920 Ile His Ser Asp Tyr 3925 Ile Leu Gly Ala Leu 3930 Glu Glu HisGlu Tyr 3935 Glu Ala Tyr Lys Val 3940 Lys Gln Gln Ala Arg 3945 Gln Ala LysSer Tyr 3950 Arg Tyr Leu His Asp 3955 Ser Met Thr Gly Gly 3960 Pro Ala LeuVal Gln 3965 Val Lys Asn Ala Pro 3970 Pro Tyr Ser Pro Glu 3975 Leu Glu SerPro Val 3980 Tyr Leu Asn Pro Lys 3985 Ala Arg Ala Gln Tyr 3990 Asn Asn AlaThr Lys 3995 Ser Trp Ala Phe Asn 4000 Ala Lys His Leu Val 4005 Pro Glu SerAsp Lys 4010 Ile Asp Val Asp Met 4015 Thr Arg Ala Ile Leu 4020 Glu Thr SerAla Gln 4025 Glu Ser Leu Gly Val 4030 Thr Ser Ser Ser Ser 4035 Arg Gly ValGly Val 4040 Asp Val Glu Met Val 4045 Ser Ala Ile Asn Ile 4050 Glu Asn AspThr Phe 4055 Leu Glu Arg Asn Phe 4060 Thr Gln Gln Glu Ile 4065 Asp Tyr CysLeu Ser 4070 Arg Pro Asp Pro Gln 4075 Ala Ser Phe Ala Gly 4080 Arg Trp SerAla Lys 4085 Glu Ala Val Val Lys 4090 Ala Val Ser Ser Phe 4095 Ser Leu AspSer Glu 4100 Lys Val Trp Thr Gln 4105 Gly Ala Gly Ala Gly 4110 Leu Ser GluIle Glu Ile Val Met Ala Glu Ser Gly Ala Pro Ser Val Val Phe 4115 4120 4125 Ser Gly 4130 Ala Ala Gln Glu Ala 4135 Ala Ala Lys Ala Gly 4140 Val Lys GluIle Lys Val Ser Ile Ser His Ser Gly Ala Tyr Ala Val Ala Val 4145 4150 4155
Ala Asn Ala Leu4160
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de aminoácidos conservada 1<400> 4
Gln Gly Ser Gln Glu Gln Gly Met Gly Met1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Seqüência de aminoácidos conservada<4 00> 5
Ala Thr Gln Phe Arg1 5
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
Gln Pro Ala Leu Thr10
<220>
<223> iniciador Flh-f<220>
<221> caracteristica_misc.
<222> (6)..(6)
<223> η is a, c, g, or t
<220>
<221> caracteristica_misc.
<222> (9)..(9)
<223> η is a, c, g, or t
<220>
<221> caracteristica_misc.
<222> (21)..(21)
<223> η is a, c, g, or t
<220>
<221> caracteristica_misc.
<222> (27) .. (27)
<223> η is a, c, g, or t
<4 00> 6
carggnwsnc argarcargg natgggnatg
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Flh-r<220>
<221> caracteristica_misc.
<222> (3)..(3)
<223> η is a, c, g, or t
<220><221> caracter!stica_misc.
<222> (6)..(6)
<223> η is a, c, g, or t
<220>
<221> característica_misc.
<222> (9)..(9)
<223> η is a, c, g, or t
<220>
<221> característica_misc.
<222> (15)..(15)
<223> η is a, c, g, or t
<220>
<221> caracteristica_misc.
<222> (24) . . (24)
<223> η is a, c, g, or t
<220>
<221> caracteristica_misc.
<222> (27) .. (27)
<223> η is a, c, g, or t
<400> 7
gtnarngcng gytgngtraa ytgngtngc
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Fl-If
<4 00> 8
gctctgtatg actcttcccc c
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Fl-Ir
<4 00> 9
gccaaaagac cgttgggtga c
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador F2-lf
<400> 10
ggtgcaggag cgggactgag tg
<210> 11<211> 22<212> DNA<213> Artificial<220>
<223> iniciador F2-lr
<400> 11
cgcatttgca accgcaaccg cg
22
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Fl-2f
<400> 12
atgactaccg cacagtccaa cttgacc 27
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador Fl-3f
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador F2-2r
<400> 14
gcgtagtagt cgccgtgctc agccatc 27
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador MCSl-F
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> iniciador MCSl-R
<400> 13
tgtcttgaag agcaaggagt gg
22
<400> 15
catggatcct ctagactgca ggcatgcaag cttctcga
38
<400> 16
ctaggagatc tgacgtccgt acgttcgaag agctctag
38

Claims (20)

1. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de ser selecionadode qualquer um dos seguintes (a) a (h):(a) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoconsistindo da seqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ IDNO: 1;(b) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoconsistindo da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte;(c) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 3;(d) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína que consiste de uma seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:3 na qual um ou mais aminoácidos estão deletados,substituídos, inseridos e/ou adicionados, e que possui uma atividade de ácido-graxo-sintetase;(e) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo 60% ou mais de identidade com aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que possui uma atividade deácido-graxo-sintetase;(f) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, e que codifica uma proteínapossuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase;(g) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte, e que codifica uma proteína possuindouma atividade de ácido-graxo-sintetase; e(h) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo consistindode uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeosde um polinucleotídeo codificador de uma proteína consistindo da seqüênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que codifica uma proteína possuindouma atividade de ácido-graxo-sintetase.
2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ser selecionado de qualquer um dos seguintes (i) a (m):(i) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína que consiste de uma seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 3 na qual um a dez aminoácidos estão deletados, substituídos,inseridos e/ou adicionados, e que possui uma atividade de ácido-graxo- sintetase;(j) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeocodificador de uma proteína possuindo 90% ou mais de identidade com aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que possui uma atividade deácido-graxo-sintetase;(k) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições elevadamente estringentes em um polinucleotídeoconsistindo de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência denucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1, e que codifica umaproteína possuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase;(1) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições elevadamente estringentes em um polinucleotídeoconsistindo de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência denucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua parte, e que codifica uma proteínapossuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase; e(m) um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeoque hibridiza sob condições elevadamente estringentes em um polinucleotídeoconsistindo de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência denucleotídeos de um polinucleotídeo codificador de uma proteína consistindoda seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e que codifica uma proteínapossuindo uma atividade de ácido-graxo-sintetase.
3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo que consiste daseqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1.
4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo que consiste daseqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.
5. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo que consiste daseqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.
6. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo que codifica umaproteína consistindo da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
7. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser DNA.
8. Proteína, caracterizada pelo fato de ser codificada pelopolinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender opolinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
10. Organismo transformado, caracterizado pelo fato depossuir introduzido no mesmo polinucleotídeo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 7.
11. Organismo transformado, caracterizado pelo fato depossuir introduzido no mesmo o vetor como definido na reivindicação 9.
12. Organismo transformado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de possuir uma capacidade de formação de ácidograxo aumentada devido à introdução do vetor como definido nareivindicação 9.
13. Organismo transformado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o organismo é umfungo produtor de ácido graxo.
14. Organismo transformado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o fungo produtor de ácido graxo éMortierella alpina.
15. Método para produzir um lipídeo ou ácido graxo,caracterizado pelo fato de usar o organismo transformado como definido emqualquer uma das reivindicações 10 a 14.
16. Método para produzir um alimento, uma droga ou ummaterial industrial, caracterizado pelo fato de usar o organismo transformadocomo definido em qualquer uma das reivindicações IOa 14.
17. Alimento, droga ou industrial material, caracterizado pelofato de ser produzido(a) pelo método como definido na reivindicação 16.
18. Método para avaliar a capacidade de formação de ácidograxo de um fungo de teste produtor de lipídeo, caracterizado pelo fato decompreender o uso de um iniciador ou uma sonda planejado(a) baseado(a) naseqüência de nucleotídeos de um gene de ácido-graxo-sintetase possuindo aseqüência de nucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1.
19. Método para avaliar a capacidade de formação de ácidograxo de um fungo de teste produtor de lipídeo, caracterizado pelo fato decompreender cultivar um fungo de teste produtor de lipídeo; e medir um nívelde expressão de um gene de ácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência denucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1.
20. Método para selecionar um fungo produtor de lipídeo,caracterizado pelo fato de compreender: cultivar um fungo de referênciaprodutor de lipídeo e um fungo de teste produtor de lipídeo; medir um nívelde expressão de um gene de ácido-graxo-sintetase possuindo a seqüência denucleotídeos de Posições 1 a 12486 de SEQ ID NO: 1 em cada fungo produtorde lipídeo; e selecionar um fungo de teste produtor de lipídeo que expressa ogene mais elevadamente do que o fungo de referência produtor de lipídeo.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2507264C2 (ru) * 2007-07-11 2014-02-20 Сантори Холдингз Лимитед Гомологи фосфатазы фосфатидной кислоты и их применение
BRPI0909059A2 (pt) * 2008-04-29 2019-09-24 Univ California produção de biocombustíveis usando sintases de policetídeo.
AU2011211291B2 (en) 2010-02-01 2014-05-15 Suntory Holdings Limited Polynucleotide encoding acyl-CoA synthetase homolog and use thereof
US8852902B2 (en) 2010-11-22 2014-10-07 The Regents Of The University Of California Producing a trimethylpentanoic acid using hybrid polyketide synthases
JP5963538B2 (ja) * 2012-02-24 2016-08-03 三井造船株式会社 モーレラ属細菌の遺伝子組換え法
CN104031894B (zh) * 2013-03-04 2016-09-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用
US11634718B2 (en) 2017-11-01 2023-04-25 Takasago International Corporation Production of macrocyclic ketones in recombinant hosts

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6218775A (ja) 1985-07-18 1987-01-27 Stanley Electric Co Ltd Ｌｅｄランプ
JP4149007B2 (ja) 1995-02-01 2008-09-10 麒麟麦酒株式会社 酵母の凝集性判定用ｄｎａ分子および凝集性判定方法
JP2000063356A (ja) 1998-08-21 2000-02-29 Sumitomo Chem Co Ltd 含フッ素ヘテロ環化合物の製造法および含フッ素ヘテロ環化合物
AU780412B2 (en) 1999-11-30 2005-03-17 Asahi Breweries, Ltd. Method of judging flocculating properties of bottom brewer's yeast
JP3871179B2 (ja) * 2000-01-28 2007-01-24 株式会社マンダム 整髪用化粧料組成物
JP4036595B2 (ja) 2000-03-03 2008-01-23 サントリー株式会社 ｎ−４系及び／又はｎ−７系高度不飽和脂肪酸を含有する脂質及びその製造方法
JP4421804B2 (ja) * 2002-03-25 2010-02-24 日本メナード化粧品株式会社 高血圧抑制剤
JP2004107512A (ja) 2002-09-19 2004-04-08 Jfe Engineering Kk ガス輸送方法及び装置
CA2509227C (en) * 2002-12-19 2013-05-21 Monsanto Technology, Llc Elevation of oil levels in brassica plants
AU2005214874B2 (en) * 2004-02-13 2010-02-18 Martek Biosciences Corporation Schizochytrium fatty acid synthase (FAS) and products and methods related thereto
JP4481702B2 (ja) * 2004-03-31 2010-06-16 サントリーホールディングス株式会社 脂質生産菌の育種方法およびその利用

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Publication number Publication date
KR20090010095A (ko) 2009-01-28
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JP2009536019A (ja) 2009-10-08
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RU2444572C2 (ru) 2012-03-10
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