BRPI0709758A2

BRPI0709758A2 - organismos termofÍlicos para conversço de biomassa lignocelulàsica em etanol

Info

Publication number: BRPI0709758A2
Application number: BRPI0709758-1A
Authority: BR
Inventors: Arthur Josephus Shaw; Sunil G Desai; Lee R Lynd; Mikhail V Tyurin; Kara Podkaminer; John Bardsley; David Anthony Hogsett
Original assignee: Dartmouth College
Priority date: 2006-05-01
Filing date: 2007-05-01
Publication date: 2011-07-26
Also published as: AU2007248091A1; CA2651011A1; EP2397556A1; EP2021487A2; CN101868548A; ZA200809352B; JP2010504734A

Abstract

<B>ORGANISMOS TERMOFILICOS PARA CONVERSçO DE BIOMASSA LIGNOCELULOSICA EM ETANOL<D>A presente invenção refere-se a organismos termofílicos mutan- tes que consomem uma variedade de substratos derivados de biomassa que são descritos aqui. Cepas de Thermoanaerobacterium saccharolyticum com expressão de acetato quinase e fosfotransacetilase eliminada são descritos aqui. Além disso, a cepa ALK1 foi manipulada por recombinação homóloga dirigida ao sítio para o "knockout" da produção de ácido acético e de ácido lático. Cultura contínua envolvendo um estímulo com concentração de subs- trato levou à evolução de ALK1, e à formação de uma cepa mais robusta designada ALK2. Os organismos podem ser utilizados, por exemplo, em reações de SSF e SSCF termofílicas realizadas em temperaturas que são ótimas para a atividade de celulase para produzir rendimentos de etanol próximos aos teóricos sem expressar piruvato descarboxilase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ORGANIS-MOS TERMOFÍLICOS PARA CONVERSÃO DE BIOMASSA LIGNOCELU-LÓSICA EM ETANOL".

Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade para o PCT/US06/042442, de-positado em 31 de outubro de 2006, o qual reivindicou prioridade para o Pe-dido U.S. No. 60/796.380, depositado em 1 de maio de 2006. Cada um des-tes pedidos está incorporado aqui por referência.

Interesses Governamentais

O governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos na pre-sente invenção já que a pesquisa relevante ao seu desenvolvimento foi cus-teada pelo National Institute of Standards and Technology (NIST), contratonúmero 60NANB1D0064.

Antecedentes

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de processamento debiomassa para produzir etanol. Em particular, novos organismos termofílicosque consomem uma variedade de substratos derivados de biomassa e pro-duzem etanol em alto rendimento são descritos, assim como processos paraa produção e uso dos organismos.

2. Descrição da técnica relacionada

A biomassa representa um substrato celulolítico barato e pron-tamente disponível a partir do qual açúcares podem ser produzidos. Estesaçúcares podem ser usados sozinhos ou fermentados para produzir alcoóise outros produtos. Entre os produtos de bioconversão, o interesse no etanolé alto porque ele pode ser usado como um combustível doméstico renová-vel.

Pesquisas significativas têm sido realizadas nas áreas de dese-nhos de reatores, protocolos de pré-tratamento e tecnologias de separação,tal que os processos de bioconversão estão se tornando economicamentecompetitivos com as tecnologias de combustíveis do petróleo. Entretanto,estima-se que as maiores economias podem ser obtidas quando duas oumais etapas de processo são combinadas. Por exemplo, os processos desacarificação e fermentação simultâneas (SSF) e sacarificação e co-fermentação (SSCF) combinam uma etapa de sacarificação enzimática coma fermentação em um único reator ou aparelho de processo contínuo. Emum processo de SSF, a inibição do produto final é removida já que os açúca-res solúveis são continuamente fermentados em etanol. Quando múltiplosorganismos são usados para fornecer uma variedade de produtos de hidróli-se, o processo de SSF é geralmente referido como um processo simultâneode sacarificação e co-fermentação (SSCF). Além das economias associadasa tempos de reação mais curtos, e custos de capital reduzidos, processos deco-fermentação também podem fornecer rendimentos de produto melhora-dos porque certos compostos que, de outra maneira, seriam acumulados emníveis que inibem a metabólise ou hidrólise, são consumidos pelos organis-mos co-fermentadores. Em um exemplo, a β-glicosidase pára de hidrolisarcelobiose na presença de glicose e, por sua vez, a formação de celobioseimpede a degradação da glicose. Um processo de SSCF que envolve a co-fermentação de produtos de hidrólise de celulose e hemicelulose pode aliviareste problema por converter a glicose em um ou mais produtos que não ini-bem a atividade hidrolítica de β-glicosidase.

O bioprocessamento consolidado (CBP) envolve quatro eventosmediados biologicamente: (1) produção de enzima, (2) hidrólise do substra-to, (3) fermentação de hexose e (4) fermentação de pentose. Estes eventospodem ser realizados em uma única etapa. Esta estratégia requer um micro-organismo que utiliza celulose e hemicelulose. O desenvolvimento de orga-nismos de CBP poderia resultar potencialmente em reduções de custo muitograndes, quando comparado a uma abordagem mais convencional de pro-dução de enzimas sacarolíticas em uma etapa de processo dedicada. Pro-cessos de CBP que utilizam mais do que um organismo para realizar os qua-tro eventos mediados biologicamente são referidos como fermentações debioprocessamento consolidado em co-cultura.

Algumas bactérias têm a habilidade de converter açúcares depentose em açúcares de hexose, e fermentar açúcares de hexose em umamistura de ácidos orgânicos e outros produtos por glicólise. A via glicolíticacomeça com a conversão de uma molécula de glicose de seis carbonos emmoléculas de piruvato de três carbonos. O piruvato pode ser então convertidopara Iactato pela ação da Iactato desidrogenase ("Idh"), ou para acetil coenzi-ma A ("acetil-CoA") pela ação da piruvato desidrogenase ou piruvato ferredo-xina oxidorredutase. A acetil-CoA é ainda convertida para acetato pela fosfo-transacetilase e acetato quinase, ou reduzida para etanol pela acetaldeídodesidrogenase ("AcDH") e álcool desidrogenase ("adh"). De forma geral, odesempenho de organismos produtores de etanol é comprometido pela pro-dução de produtos orgânicos com exceção do etanol, e particularmente pelaconversão de piruvato para Iactato mediada por ldh, e pela conversão de ace-til-CoA para acetato pela fosfotransacetilase e acetato quinase.

A manipulação metabólica de bactérias recentemente resultouna criação de um "knockout" de Iactato desidrogenase nas bactérias termofí-licas, anaeróbicas, Gram-positivas T. saccharolyticum. Veja, Desai, S. G.;Guerinot, M.L..; Lynd, L.R. "Cloning of L-Iactate dehydrogenase and elimina-tion of Iactic acid production via gene knockout in Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum JW/SL-YS485" Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 600-605, 2004.

Embora o "knockout" de Idh constitua um avanço à técnica, ele éproblemático para alguns usos deste organismo em que esta cepa de T.saccharolyticum continua a fazer ácido orgânico - em particular, ácido acético.

Sumário

Os presentes instrumentos fazem um avanço na técnica e supe-ram os problemas descritos acima por fornecer bactérias anaeróbicas queconsomem uma variedade de substratos derivados de biomassa e produzemetanol em rendimentos próximos aos teóricos. Métodos para produzir etanolusando os organismos também são descritos.

Os instrumentos relatados aqui resultam no "knockout" de váriosgenes tanto isoladamente quanto em combinação, onde tais genes no orga-nismo nativo poderiam resultar de outra forma na formação de ácidos orgâ-nicos. Por exemplo, pode haver "knockouts" de: (a) acetato quinase e/oufosfotransacetilase e (b) Iactato desidrogenase (Idh), acetato quinase (ack) efosfotransacetilase (pta) em T. saccharolyticum JW/SL-YS485. Embora osresultados aqui contidos sejam para T. saccharolyticum, os métodos e assoluções também se aplicam a outros membros do gênero Thermoanaero-bacter incluindo Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, Thermoanae-robacterium aotearoense, Thermoanaerobacterium polysaccharolylicum,Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyti-cum, e Thermoanaerobacterium xyianolyticum. Os métodos e materiais sãoúteis geralmente no campo de bactérias Gram-positivas, termofílicas, meta-bolicamente manipuladas.

Em uma modalidade, um organismo isolado, o qual não expres-sa piruvato descarboxilase, fermenta um substrato celulolítico para produziretanol em uma concentração que é pelo menos 90% de um rendimento teórico.

Em uma modalidade, uma bactéria Gram-positiva que em umestado nativo contém pelo menos um gene que confere à bactéria Gram-positiva uma habilidade de produzir ácido acético como um produto de fer-mentação, é transformada para eliminar a expressão de pelo menos um ge-ne. A bactéria pode ser uma Thermoanaerobacter tal como Thermoanaero-bacterium saccharolyticum. O gene que confere à bactéria Gram-positivauma habilidade de produzir ácido acético como um produto de fermentaçãopode codificar a expressão de acetato quinase e/ou fosfotransacetilase.

Em outra modalidade, a bactéria Gram-positiva pode ser trans-formada adicionalmente para eliminar a expressão de um ou mais genes queconferem à bactéria Gram-positiva a habilidade de produzir ácido lático co-mo um produto de fermentação. Por exemplo, o gene que confere a habili-dade de produzir ácido lático pode ser Iactato desidrogenase.

Em uma modalidade, um método para produzir etanol incluitransformar um organismo nativo para produzir a bactéria Gram-positiva quefoi transformada para eliminar a expressão de todos os genes que conferemà bactéria Gram-positiva a habilidade de produzir ácidos orgânicos comoprodutos de fermentação, para produzir um hospedeiro bacteriano transfor-mado, e cultivar o hospedeiro bacteriano transformado em um meio que con-tém um substrato que inclui um material selecionado do grupo que consisteem glicose, xilose, celobiose, sacarose, xilano, amido, e combinações destessob condições adequadas por um período de tempo suficiente permitir a sa-carificação e a fermentação do substrato.

Em uma modalidade, uma cultura biologicamente pura de ummicroorganismo designado ALK1 e depositado sob a Designação de Depósi-to de Patente no. PTA-7206 é descrita.

Em uma modalidade, um polinucleotídeo isolado compreende (a)uma seqüência de SEQ ID NO: 10; ou (b) uma seqüência de SEQ ID NO: 9e SEQ ID NO: 10; ou (c) uma seqüência que tem pelo menos cerca de 90%de identidade de seqüência com a seqüência de (a) ou (b). Um vetor quecompreende o polinucleotídeo isolado de (a), (b) ou (c) é descrito, assimcomo uma célula hospedeira geneticamente manipulada para expressar umcomplemento do polinucleotídeo de (a), (b) ou (c). Em outra modalidade, umpolinucleotídeo isolado compreende uma seqüência que tem pelo menos95% de identidade de seqüência com a seqüência de (a) ou (b). Em outramodalidade ainda, um polinucleotídeo isolado compreende uma seqüênciaque tem cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de se-qüência com a seqüência de (a) ou (b).

Em uma modalidade, um método de produzir etanol inclui culti-var uma bactéria mutante que expressa um complemento do polinucleotídeoisolado de (a), (b) ou (c) em meio que contém um substrato selecionado dogrupo que consiste em glicose, xilose, celobiose, sacarose, xilano, amido, ecombinações destes sob condições adequadas por um período de temposuficiente para permitir a fermentação do substrato para etanol.

Em uma modalidade, um método para produzir etanol inclui for-necer dentro de um frasco de reação, uma mistura de reação que compre-ende o substrato lignocelulósico, celulase e um agente de fermentação. Oagente de fermentação compreende uma bactéria Gram-positiva que foitransformada para eliminar a expressão de pelo menos um gene que confereà bactéria Gram-positiva, em um estado nativo, uma habilidade de produzirácido acético como um produto de fermentação. A mistura de reação é rea-gida sob condições adequadas por um período de tempo suficiente parapermitir a sacarificação e fermentação do substrato lignocelulósico.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra reações da via glicolíticaFigura 2 mostra a produção de hidrogênio em T. saccharolyticumselvagem em comparação a várias cepas "knockout" de T. saccharolyticum.

Figura 3 mostra uma comparação de seqüências de polinucleo-tídeo experimentais e esperadas para a região de Idh do vetor suicidapSGD9 (SEQ ID NO: 9) integrado no genoma de T. saccharolyticum.

Figura 4 mostra uma comparação de seqüências de polinucleo-tídeo experimentais e esperadas para a região de pta/ack do vetor suicidapSGD8-Erm (SEQ ID NO: 10) integrado no genoma de T. saccharolyticum.

Figuras 5 a 7 mostram traços de cromatografia líquida de altaeficiência (HPLC) de um caldo de fermentação em vários intervalos de tem-po durante o cultivo de ALK1.

Figura 8 mostra as concentrações de xilose, ácido orgânico eetanol durante a fermentação pela cepa ALK1.

Figura 9 mostra as concentrações de xilose, ácido orgânico eetanol durante a fermentação por T. saccharolyticum selvagem.

Figura 10 mostra as concentrações de xilose, ácido orgânico eetanol durante um estímulo de cultura contínua de ALK1.

Figura 11 mostra as concentrações de xilose, ácido orgânico eetanol durante a fermentação pela cepa ALK2.

Figura 12 mostra a produção de etanol em várias concentraçõesde Avicel durante reações de SSF termofílicas envolvendo ALK2 e celulasea 50°C.

Figura 13 mostra o rendimento de etanol para reações de SSFtermofílicas mostradas na figura 12.

Descrição Detalhada

Agora serão mostrados e descritos métodos para manipular eutilizar bactérias Gram-positivas termofílicas, anaeróbicas na conversão debiomassa para etanol.

Como usado aqui, um organismo está no seu "estado nativo" seele não tiver sido manipulado geneticamente nem manipulado de outra for-ma pela mão do homem de uma forma que altere intencionalmente a genéti-ca ou constituição fenotípica do organismo. Por exemplo, organismos selva-gens podem ser considerados como estando em um estado nativo.

A eliminação completa da produção de ácido orgânico a partir deT. saccharolyticum em um estado nativo foi obtida usando dois eventos derecombinação homóloga de DNA sítio-dirigida. A cepa mutante, Thermoana-erobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 ALK1 ("ALK1") produz quanti-dades quase teóricas de etanol com baixa alimentação de substrato em cul-tura em batelada em uma temperatura na faixa de cerca de 30 a 669C e umpH na faixa de cerca de 3,85 a 6,5. Em uma modalidade, o rendimento deetanol é de pelo menos 90% do máximo teórico. ALK1 e seus descendentestêm o potencial de contribuir com economias significativas na biomassa Iig-nocelulósica para a conversão de etanol devido às suas condições de cultu-ra, as quais são substancialmente ótimas para a atividade de celulase emprocessos de SSF e SSCF. Por exemplo, parâmetros de atividade de celula-se ótimos incluem um pH entre 4 e 5 e uma temperatura entre 40 e 509C.Adicionalmente, não é necessário ajustar o pH do caldo de fermentaçãoquando organismos "knockout", que não têm a habilidade de produzir ácidosorgânicos, são usados.

ALK1 e organismos similares também podem ser adequadospara uma fermentação de bioprocessamento consolidado em co-cultura on-de o organismo "knockout" poderia converter pentoses para etanol, e celula-se seria degradada por um organismo celulolítico tal como C. thermocellum.

Operar um processo de SSF, SSCF ou CBO em temperaturastermofílicas oferece vários benefícios importantes sobre as temperaturas defermentação mesofílicas convencionais de 30 a 379C. Em particular, concen-trações de enzimas necessárias para se obter uma dada quantidade de con-versão podem ser reduzidas devido à alta atividade enzimática em tempera-turas termofílicas. Como um resultado, os custos para uma etapa de proces-so dedicada para a produção de celulase são substancialmente reduzidos(por exemplo, 2 vezes ou mais) para SSF e SSCF termofílicos, e são elimi-nados para CBP. Os custos associados ao resfriamento do fermentador etambém à troca de calor antes e após a fermentação também são esperadosserem reduzidos para SSF, SSCF ou CBP termofílicos. Finalmente, os pro-cessos que apresentam biocatalisadores termofílicos podem ser menos sus-cetíveis à contaminação microbiana quando comparados com processos queapresentam biocatalisadores mesofílicos convencionais.

Ao contrário dos microorganismos "fermentadores de homoeta-nol" conhecidos, tais como Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilisde ocorrência natural, e as cepas recombinantes de Escheriehia eoli e Kleb-siella oxytoea, os organismos atualmente descritos não dependem da con-versão de piruvato para acetaldeído através da ação da piruvato descarboxi-Iase (veja figura 1, 9). De fato, bactérias que pertencem ao gênero Thermo-anaerobaeter não expressam piruvato descarboxilase no seu estado nativo.A partir das reações da via glicolítica mostradas na figura 1, pode ser obser-vado que o piruvato pode ser metabolizado para acetil-CoA, dióxido de car-bono, e ferredoxina reduzida pela enzima piruvato-ferredoxina oxidorreduta-se 2. Entretanto, a fim de produzir etanol como o único produto de fermenta-ção, os elétrons carregados pela ferredoxina reduzida devem ser todostransferidos para NAD através de NAD: ferredoxina oxidorredutase 3 paraformar NADH. NADH é subseqüentemente oxidado de volta para NAD nodecorrer da reação em duas etapas de redução de acetil-CoA para etanolpor acetaldeído desidrogenase 7 e álcool desidrogenase 8. Evidência dautilização eficaz de NADH pode ser observada na figura 2 como uma diminu-ição na produção de H2 pelo organismo "knockout" para acetato, que é inca-paz de expressar aeke pta e pelo organismo "knockout" duplo (ALK1), que éincapaz de expressar aek, pta e Idh. Estes organismos fornecem a primeirademonstração de transferência de elétron estequiométrica a partir de ferre-doxina reduzida para NAD e subseqüentemente para etanol.

A via descrita acima, a qual produz rendimentos estequiométri-cos de etanol em organismos que não possuem a habilidade de expressarPDC é diferente da via empregada em todas as cepas fermentadores dehomoetanol descritas anteriormente. Cepas descritas anteriormente utilizampiruvato descarboxilase endógena (PDC) ou são manipuladas para expres-sar PDC exógena. Já que a expressão de PDC é rara no mundo microbiano,a habilidade de redirecionar o fluxo de elétrons em virtude de modificaçõesno fluxo de carbono tem amplas implicações. Por exemplo, esta abordagempoderia ser usada para produzir altos rendimentos de etanol em cepas dife-rentes de T. saccharolyticum e/ou produzir solventes diferentes de etanol.

Em particular, bactérias Gram-positivas tais como membros do gêneroThermoanaerober; Clostridium thermocellum e outras espécies de Clostrí-dios termofílicos e mesofílicos; espécies de Bacilos termofílicos e mesofíli-cos, bactérias Gram-negativas tais como Escherichia coiie KIebsieiIa oxyto-ca, Fibrobacter succinogenes e outras espécies de Fibrobacter; Thermotoganeopolitana e outras espécies de Thermotoga; e fungos anaeróbicos incluin-do espécies de Neocallimatix e Piromyces que não têm a habilidade de ex-pressar PDC, e podem se beneficiar das instrumentações descritas.

Será observado que material lignocelulósico que é sacarificadopara produzir um ou mais dentre glicose, xilose, manose, arabinose, galac-tose, frutose, celobiose, sacarose, maltose, xilano, manana, e amido podemser utilizados pelos organismos descritos. Em várias modalidades, a bio-massa lignocelulósica compreende madeira, resíduos de milho, serragem,cortiça, folhas, resíduos agrícolas e florestais, gramas tal como "switch-grass", produtos de digestão de ruminantes, resíduos municipais, efluente demoinho de papel, jornais, papelão ou combinações destes.

Exemplo 1

Produção da Cepa ALK1

Materiais e Métodos

A cepa de JW/SL-YS485 Thermoanaerobaeterium saeeharolyti-eum (DSM 8691) é uma bactéria termofílica, anaeróbica isolada do WestThumb Basin no Parque Nacional de Yellowstone, Wyoming (Lui, S.Y; Ghe-rardini, F. C; Matuschek, M.; Bahl, H.; Wiegel, J. "Cloning, sequencing, andexpression of the gene encoding a Iarge S-layer-associated endoxylanasefrom Thermoanaerobacterium sp strain JW/SL-YS485 in Escherichia coli' J.Bacteriol 178: 1539-1547, Maio de 1996; V.; Wiegel, J. "Advances in deve-Iopment of a genetic system for Thermoanaerobacterium spp: Expression ofgenes encoding hydrolytic enzymes, development of a second shuttle vector,and integration of genes into the chromosome" Appl. Environ. Microbiol. 66:4817-4821, 2000). Ela cresce em uma faixa de temperatura de 30 a 66-C eem uma faixa de pH de 3,85 a 6,5. Ela consome uma variedade de substra-tos derivados de biomassa incluindo os monossacarídeos glicose e xilose,os dissacarídeos celobiose e sacarose, e os polissacarídeos xilano e amido,mas não celulose. O organismo produz etanol assim como os ácidos orgâni-cos, ácido lático e ácido acético, como produtos de fermentação primários.Clonagem e Seqüenciamento

Os genes de Iactato desidrogenase (L-Idh), fosfotransacetilase(pia), e acetato quinase (ack) foram identificados e seqüenciados usandotécnicas usuais, conforme relatado anteriormente para L-Idh (Desai, 2004).Iniciadores degenerados foram feitos usando o algoritmo CODE-HOP (Rose,T.; Schultz, E.; Henikoff, J.; Pietrokovski, S.; McCaIIum, C; Henikoff, S. "Con-sensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distan-tly-related sequences" Nucleic Acids Research, 26(7): 1628-1635, 1 de Abrilde 1998) e as reações de PCR foram executadas para se obter a seqüênciade DNA entre as regiões conservadas. Os fragmentos do gene fora das re-giões conservadas foram seqüenciados diretamente a partir do DNA genô-mico usando a enzima ThermoFideIase (Fidelity Systems, Gaithersburg, MD)com o kit BigDye Terminator v3.1 (ABI, Foster City CA).Construção de Vetores Suicidas

Vetor "knockout" para acetato quinase e fosfotransacetilase, pSGD9

Técnicas de clonagem usuais foram seguidas (Sambrook). Ovetor suicida de 6,2 kb pSGD9 foi baseado em pBLUESCRIPT Il SK (+) (S-tratagene) usando uma abordagem de desenho semelhante à relatada ante-riormente (Desai, 2004; Maio, 2000). Fragmentos de gene da seqüência depta/ack, pta-up (-1,2 kb) e ack-down (~ 0,6 kb), foram amplificados a partirdo DNA genômico usando os pares de iniciadores SEQ ID NOS: 1 e 2, eSEQ ID NOS: 3 e 4. A amplificação por PCR foi realizada com pfu DNA po-limerase e os fragmentos foram extraídos de um gene de eletroforese a 1%.Aos fragmentos de pta-up e ac/c-down foi então adicionada a cauda de ala-nina com Taq polimerase os fragmentos foram clonados em TOPO pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA). Um fragmento de 1,5 kb contendo o marcador decanamicina foi obtido de um digesto de Pstl/Xbal de plKM1 e subclonado empBLUESCRIPT Il SK (+). TOPO contendo pta-up foi digerido comXhol/BsiHKAI e subclonado em pBLUESCRIPT Il SK (+) digerido comXhol/Pstl a montante do marcador de canamicina previamente clonado. TO-PO contendo ac/c-down foi digerido com Xbal/Sphl e subclonado em pUC19(Invitrogen). O fragmento de Xbal/Afllll contendo ac/c-down foi digerido esubclonado a jusante do marcador de canamicina para se obter o construtofinal pSGD9.

Vetor "knockouf para Iactato desidrogenase com resistência à eritromicina,pSGD8-Erm

O vetor suicida de 5,5 kb pSGD8-Erm foi baseado no plasmídeopSGD8 conforme produzido por Desai et al. 2004. No lugar do marcador deantibiótico canamicina de aph, um gene de fusão baseado no promotor deaph do plasmídeo plKM1 e o gene de adenina metilase que confere resis-tência à eritromicina do plasmídeo pCTC1 (Klapatch, T.R.; Guerinot, M.L.;Lynd, L.R. "Electrotransformation of Clostridium thermosaccharolyticum" J.Ind. Microbiol. 16(6): 342-7, Junho de 1996) foram usados para seleção. Osfragmentos de PCR do gene foram criados usando pfu polimerase (Strata-gene) e os iniciadores SEQ ID NOS: 5 a 6 para o promotor de aph e SEQ IDNOS: 7 a 8 para a fase aberta de leitura de adenina metilase. Os fragmentosforam digeridos com Xbal/BamH1 (fragmento de aph) e BamHI/EcoRI (ade-nina metilase) e ligados ao sítio de clonagem múltipla de plKM1. Este genede fusão foi então excisado com BseRI/EcoRI e ligado em pSGD8 digeridode forma semelhante.

Transformação de T. saccharolyticum

Transformação de T. saccharolyticum foi realizada de forma in-tercambiável com dois métodos, o primeiro conforme descrito anteriormente(Mai, V.; Lorenz, W.; Weigel, J. 'Transformation of Thermoanaerobacteriumsp. strain JW/SL-YS485 with plasmid PIKM1 conferring kanamycin resistan-ce" FEMS Microbiol. Lett. 148: 163-167, 1997) e o segundo com várias modi-ficações após a coleta celular e baseado no método desenvolvido para Clos-tridium thermocellum (Tyurin, M.V.; Desai, S.G.; Lynd, L. R. "Electrotrans-formation of Clostridium thermocellum" Appl. Environ. Microbiol. 70(2): 883-890, 2004). As células foram cultivadas durante a noite usando meio pré-reduzido DSMZ 122 em tubos de cultura descartáveis estéreis dentro deuma câmara anaeróbica em uma incubadora mantida a 55°C. Após isso, ascélulas foram subcultivadas com 4 pg/ml de hidrazida de ácido isonicotônico(isoniacina), um agente enfraquecedor da parede celular (Hermans, J.; Bos-chloo, J. G.; de Bont, J.A.M. "Transformation of M. aurum by electroporation:the use of glycine, Iysozyme and isonicotinic acid hydrazide in enhancingtransformation efficiency" FEMS Microbiol. Lett. 72, 221-224, 1990), adicio-nado ao meio após a fase Iag inicial. As células em fase exponencial foramcoletadas e lavadas com solução de celobiose a 200 mM estéril gelada pré-reduzida, e ressuspensas na mesma solução e mantidas em gelo. Cuidadoextremo foi tido após a coleta das células para mantê-las geladas (aproxi-madamente 4QC) em todos os momentos incluindo o tempo durante a centri-fugação.

Amostras compostas de 90 μΙ da suspensão celular e 2 a 6 μΙ depSGD9 ou pSGD8-Erm (1 a 3 μg) adicionados logo antes da aplicação dopulso, foram colocadas em tubos de microcentrífuga de polipropileno descar-táveis de 2 ml_ estéreis que serviram como cubetas de eletrotransformação.Uma onda-quadrada com comprimento de pulso ajustado em 10 ms foi apli-cada usando um sistema de eletrodo de titânio gerador de pulso produzidosob medida. Um limite de voltagem correspondendo à formação de eletropo-ros em uma amostra celular foi avaliado como uma troca de corrente não-linear quando a voltagem do pulso foi aumentada linearmente em aumentosde 200 V. Uma voltagem particular que forneceu a melhor razão de rendi-mento de transformação versus taxa de viabilidade celular em uma dadaconcentração de DNA foi usada, a qual neste caso particular foi de 25kV/cm.As células pulsadas foram inicialmente diluídas com 500 μΙ de meio DSM122, mantidas em gelo por 10 minutos e então recuperadas a 55°C por 4 a 6h. Após a recuperação, as células transformadas com pSGD9 foram mistu-radas com meio de ágar a 2% contendo canamicina a 75 Mg/ml e colocadassobre placas de petri e incubadas em jarras de anaerobiose por 4 dias. Ascélulas transformadas com pSGD8-Erm foram deixadas se recuperar a 48°Cpor 4 a 6 h e foram plaqueadas em meio de ágar a 2% em pH 6,0 contendoeritromicina a 5 pg/ml ou meio líquido similar e incubadas em jarras de anae-robiose a 48°C por 6 dias. Qualquer uma das linhagens celulares transfor-madas pode ser usada sem manipulação adicional. Entretanto, um organis-mo onde a eliminação da expressão de todos os genes que conferem a habi-lidade de produzir ácidos orgânicos foi obtido por realizar uma segundatransformação (seqüencial). A segunda transformação foi realizada comodescrito acima com o transformante primário substituído pela suspensão ce-lular transformada. O transformante secundário, ALK1, foi cultivado em meiocontendo canamicina e eritromicina.

Seqüenciamento de regiões de "knockout"

O seqüenciamento das regiões de "knockout" dirigido ao sítio foifeito por PCR a partir do DNA genômico usando Taq polimerase (New En-gland Biolabs) e iniciadores fora das regiões de sobreposição homóloga en-tre o genoma e os vetores suicidas. Iniciadores dentro dos produtos de PCRforam usados para o seqüenciamento com o kit BigDye Terminator v3.1 (A-Bl, Foster City, CA). As regiões foram dispostas usando o programa CAP3(Huang, X. "An improved sequence assembly program" Genomics 33: 21-31,1996) e comparadas à seqüência de DNA esperada usando o algoritmoCLUSTALW (Higgins, D. G.; Bleasby, A. J.; Fuchs, R. "CLUSTAL V: impro-ved software for multiple sequence alignment" Computer Applications in theBiosciences (CABIOS), 8(2): 189-191, 1992). Um alto grau de homologia(percentual de identidade) existiu entre a seqüência compilada experimen-talmente e a seqüência esperada com base nas seqüências do vetor suicidae selvagem conhecidas (figuras 3 e 4)."Identidade" refere-se a uma comparação entre os pares de áci-dos núcleicos ou moléculas de aminoácido. Métodos para determinar a iden-tidade de seqüência são conhecidas. Veja, por exemplo, programas de com-putador comumente empregados para esta finalidade, tal como o programaGap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, GeneticsComputer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), que usa oalgoritmo de Smith & Waterman1 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482-489.Verificação da cepa mutante

DNA genômico da cepa mutante Thermoanaerobacterium sac-charolyticum JW/SL-YS485 ALK1 ("ALK1") mostrou a recombinação homó-loga sítio-dirigida esperada nos Ioci de L-Idh e pta/ack através de seqüenci-amento de DNA. Ambos os eventos de integração foram integrações duplas,que é um genótipo mais estável geneticamente.

Exemplo 2

Dados comparativos mostrando a produção de etanol por alkl e t. Saccha-rolyticum selvagem

T. saccharolyticum foi cultivado em meio MTC parcialmente defi-nido contendo 2,5 g/L de Extrato de Levedura (Zhang, Y.; Lynd, L. R. "Quan-tification of cell and cellulase mass concentrations during anaerobic cellulosefermentation: development of an enzyme-linked immunosorbent assay-basedmethod with application to Clostridium thermocellum batch cultures" Anal.Chem. 75: 219-222, 2003). Glicose, xilose, acetato, Iactato e etanol foramanalisados por HPLC em uma coluna Aminex 87H (BioRad Laboratories,Hercules, CA) a 55°C. A fase móvel consistiu em ácido sulfúrico a 5mM emuma taxa de fluxo de 0,7 ml/min. A detecção foi através de índice refrativousando um refratômetro Waters 410 (Milford, MA). O nível de detecção mí-nimo para acetato foi de 1,0 mM. Um traço padrão contendo 5 g/L de xilose,5 g/L de ácido lático, 5 g/L de ácido acético e 5 g/L de etanol é mostrado nafigura 5.

A cepa ALK1 produzida apenas com etanol com até 17 g/L dexilose, ou com 5 g/L de xilose e 5 g/L de glicose, sem ácidos orgânicos ououtros produtos detectados por HPLC. A figura 6 mostra a fermentação dacepa ALK1 no tempo 0 hora e a figura 7 mostra a mesma fermentação em72 horas. Os gráficos do decorrer do tempo da fermentação da cepa ALK1 eselvagem sobre meio com xilose tamponado com 8 g/L de MES em um pHinicial de 6,0, 55°C e 100 rpm mostram que a cepa ALK1 é capaz de conver-ter mais do que 99% de xilose para etanol (figura 8), enquanto a que cepaselvagem sob condições similares se torna limitada pelo pH devido à produ-ção de ácido orgânico e é incapaz de consumir toda a xilose presente (figura9). O organismo selvagem gerou 0,15 mM de etanol, enquanto que ALK1gerou 0,46 mM de etanol.

Exemplo 3

Evolução de ALK1

Conforme mostrado na figura 10, uma cultura contínua na qual aconcentração de substrato alimentada foi aumentada com o tempo foi utili-zada para estimular ALK1. A figura 10 mostra as concentrações de xilose,xilulose e etanol durante a cultura contínua. Após mais do que 1000 horasde exposição a este ciclo de evolução de estresse, uma cepa aperfeiçoada,ALK2, foi isolada do caldo de fermentação. ALK2 foi capaz de iniciar o cres-cimento a 50 g/L de xilose em cultura em batelada. A figura 11 mostra asconcentrações de xilose, ácido orgânico e a densidade óptica (OD) e asconcentrações de etanol durante a fermentação pela cepa ALK2.

Exemplo 4

Sacarificação e Fermentação Termofílicas Simultâneas

Algumas cepas de leveduras termotolerantes foram testadasquanto à produção que foram testadas para a produção de etanol através deSSF em temperaturas de 40 a 45°C, com rendimento reduzido acima destastemperaturas (Banat, I. M.; Nigam, P.; Singh, D.; Marchant, R.; McHaIe, A.P."Review: Ethanol production at elevated temperatures and alcohol concentra-tions: Part I - Yeasts in general." World Journal of Microbiology and Biotech-nology 14: 809-821, 1998). Além disso, Patel et al. demonstraram SSF a50°C para a produção de ácido lático usando uma cepa de Bacillus (Patel,Μ. A.; Ou1 M. S.; Ingram, L. O.; Shanmugam, Κ. T. "Simultaneous saccharifi-cation and co-fermentation of crystalline cellulose and sugar cane bagassehemicellulose hydrolysate to Iactate by a thermotolerant acidophilic Bacillussp." Biotechnol. Prog. 21: 1453-1460, 2005). SSF termofílica, entretanto, nãofoi demonstrada anteriormente a 50-C para a produção de etanol com ne-cessidades de enzima reduzidas.

Como discutido acima, organismos termofílicos transformadosde acordo com a presente descrição têm o potencial para contribuir com e-conomias significativas na biomassa lignocelulósica para a conversão deetanol devido às suas condições de cultivo, as quais são substancialmenteótimas para a atividade de celulase em processos de SSF. Por exemplo,ALK1 e ALK2 são termófilos anaeróbicos que podem crescer a 50°C e pH5,0, enquanto que os parâmetros ótimos da celulase incluem um pH entre 4e 5 e temperatura entre 40 e 50-C.

Em uma reação termofílica de fermentação e sacarificação si-multâneas (tSSF) realizada em uma escala de 1,5 L em um reator de batela-da a 50-C, ALK2 foi usada em conjunto com 4 FPU/g de celulase de T. ree-sei (Genencor, Palo Alto, CA) para produzir etanol a partir do substrato sóli-do Avicel (20 g/L, 50 g/L e 80 g/L). Não havia nenhum açúcar solúvel medidoapós dezesseis horas de fermentação e menos do que 0,5 g/L de ácido láti-co foram produzidos em qualquer um dos testes. A figura 12 mostra que 30g/L de etanol foram produzidos em 140 horas quando a reação de tSSF foirealizada em 80 g/L de Avicel, com 25 dos 30g/L de etanol produzidos nasprimeiras 50 horas. A figura 13 mostra os rendimentos de etanol para as re-ações ilustradas na figura 12. Os rendimentos são calculados com base nomáximo teórico de 0,51 g de etanol por equivalente em grama de glicose. AAvicel a 20 g/L, cerca de 90% de conversão foram obtidos em 140 horas.

Será observado que T. saccharolyticum pode fermentar ambos osaçúcares pentose e hexose. Os organismos descritos podem, portanto serusados em reações de Sacarificação e Co-Fermentação Simultâneas (SSCF),nas quais uma enzima que converte hemicelulose em açúcares de pentose(por exemplo, xilase) pode ser utilizada em combinação com celulase.

Depósito de ALK1

ALK1 foi depositada com a American Type Culture Collection,Manassas, VA 20110-2209. O depósito foi feito em 1 de novembro de 2005e recebeu o número de Designação de Depósito de Patente PTA-7206. Estedepósito foi feito em conformidade com as exigências do tratado de Buda-peste de que a duração do depósito deve ser por trinta (30) anos a partir dadata de depósito ou por cinco (5) anos após a última requisição de depósitono depositário pela vida executável de uma Patente U.S. que surge a partirdeste pedido, o período que for mais longo. ALK1 será suprida caso ela setorne não-viável no depositário.

A descrição das modalidades específicas revela conceitos geraisque outros podem modificar e/ou adaptar para várias aplicações ou usos quenão desconsideram os conceitos gerais. Portanto, tais adaptações e modifi-cações devem e são pretendidas como estando abrangidas dentro do signi-ficado e amplitude dos equivalentes das modalidades descritas. Deve sercompreendido que a fraseologia ou terminologia empregada aqui tem a fina-lidade de descrição e não de limitação.

Os exemplos anteriores podem ser adequadamente modificadospara uso de qualquer bactéria Gram-positiva, e especialmente os membrosdo gênero Thermoanaerobacter incluindo Thermoanaerobacterium thermo-sulfurigenes, Thermoanaerobacterium aotearoense, Thermoanaerobacteriumpolysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermoanaerobacteri-um thermosaeeharolyticum, e Thermoanaerobacterium xyianoiyticum.

Todas as referências mencionadas neste pedido estão incorpo-radas por referência a mesma proporção que se estivessem completamentereproduzidas aqui.Seqüência de Listagem<110> The Trustees of Dartmouth CollegeLynd, Lee R.Shaw, Arthur JosephusDesai, Sunil G.Tyurin, Mikhail V.Podkaminer, KaraBardsIey, JohnHogsett, David

<120> Organismos Termofilicos para Conversão de Biomassa Lignocelulósica

Etanol<130> 466905<140> Not Yet Assigned<141> 2007-05-01<150> US 60/731,674<151> 2005-10-31<150> US 60/796,380<151> 2006-05-01<150> PCT/US06/042442<151> 2006-10-31<160> 10

<170> PatentXn versão 3.2<210> 1<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador pta<400> 1

acatgcatgc ccatttgtct ataatagaag gaag 34

<210> 2<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador pta

<400> 2

cgtcaacaat atctctatag ctgc

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador ack

<400> 3

gctctagagc atagaattag ctccactgc

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador ack

<400> 4

acatgcatgc cgacgcctcc catagctgct gcat

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador aph

<400> 5

tggatccgcc atttattatt tccttcctct tttc

<210> 6

<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador aph<400> 6

ttctagatgg ctgcaggtcg ataaacc<210> 7<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador adenina metilase<400> 7

gcggatccca tgaacaaaaa tataaaatat tctc<210> 8<211> 31<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador adenina metilase<400> 8

gcgaattccc tttagtaacg tgtaactttc c<210> 9<211> 2778<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Lócus L-Idh de knockout Thermoanaerobacterium saccharolyticum<400> 9

ggaaacgaat agtaaaggaa tggaggcgaa ttaatgagta atgtcgcaat gcaattaatagaaatttgtc ggaaatatgt aaataataat ttaaacataa atgaatttat cgaagactttcaagtgcttt atgaacaaaa gcaagattta ttgacagatg aagaaatgag cttgtttgatgatatttata tggcttgtga atactatgaattgtatattg gagaaaatga attaagacaagcataataaa ccgctaaggc atgatagctaaaatgatatc tgataaactg cgaaaaagtacaaatcaata aggacaaaat aagattaaaaatattattaa aggaaaatac atattatttaataggatctg gttttgtagg tgcaacatcgacagatatcg tgctggtgga tttaaacaagagccatggca taccgctaat acagcctgtaaaaggcgcag atgtaatagt tgtgacagcacttgaccttg taaagaaaaa tacagccatatacaatgaca aggccatata tttgattgtgacatacaaga tttctggact tccatggggcagctcaaggt ttagatacct tttaagcaagcatttgaggt gataggtaag attataccgaaattactcta tgaagcgcca tatttaaaaaaggaggcaga ttgccttgaa tatattgacagaagatatcg ccgtatgtaa ggatttcaggatatctatag aatgggcaaa gcataaaaacaataacctta tagcttgtaa attctatcatactatgttat acgccaactt tgaaaacaacttttagaatg caaggaacag tgaattggagatctttaaat actgtagaaa agaggaaggaatataaaata ttctcaaaac tttttaacgaaattgaattt aaaagaaacc gataccgtttcgacgaaact ggctaaaata agtaaacaggtcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactgattctacagtt tcaattccct aacaaacagaatttaagcac acaaattatt aaaaaagtggtgattgttga agaaggattc tacaagcgtatcttgcacac tcaagtctcg attcagcaatctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa

caggatgaaa atataagaaa tgaatatcac 240

aaagtgcaaa aacttgtaaa aaagttagca 300

aagcggtatt tttatgcaat taaaaggatg 360

ttttagaaaa taactataaa gataatattt 420

tttagacaat ttcatcaaaa ctatgttata 480

ggaggcgatg taatgagcaa ggtagcaata 540

gcatttacgc tggcattaag tgggactgtg 600

gacaaggcta taggcgatgc actggacata 660

aatgtgtatg caggtgacta caaagatgtg 720

ggtgctgctc aaaagccggg agagacacgg 780

tttaagtcca tgatacctga gcttttaaag 840

acaaatcccg tagatatact gacgtacgtt 900

agagtttttg gttctggcac cgttcttgac 960

gactgctgca ggtcgataaa cccagcgaac 1020

ggtatgaaaa cgagaattgg acctttacag 1080

gctaccaaga cgaagaggat gaagaggatg 1140

atactgataa gataatatat cttttatata 1200

gggcaaggca taggcagcgc gcttatcaat 1260

ttgcatggac taatgcttga aacccaggac 1320

aattgtggtt tcaaaatcgg ctccgtcgat 1380

tttgaaaaag ctgttttctg gtatttaagg 1440

ttcgtcttgt tataattagc ttcttggggt 1500

aataataaat ggcggatccc atgaacaaaa 1560

gtgaaaaagt actcaaccaa ataataaaac 1620

acgaaattgg aacaggtaaa gggcatttaa 1680

taacgtctat tgaattagac agtcatctat 1740

atactcgtgt cactttaatt caccaagata 1800

ggtataaaat tgttgggagt attccttacc 1860

tttttgaaag ccatgcgtct gacatctatc 1920

ccttggatat tcaccgaaca ctagggttgc 1980

tgcttaagct gccagcggaa tgctttcatc 2040

aacttacccg ccataccaca gatgttccag 2100ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga gaatatcgtc 2160aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta aacaatttaa 2220gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta tttaacggga 2280ggaaataatt ctatgagtcg cttttgtaaa tttggaaagt tacacgttac taaagggaat 2340tctctagaca gagtttgcag catggagcat aacaaacata tcgggtatat catttaatga 2400gtactgcagc atatgcggac gcgtctgcaa cacaaatttc agaaaggaag tagaagaaga 2460agtcgtaaat gctgcttaca agataataga caaaaaaggt gctacatact atgctgtggc 2520agttgcagta agaaggattg tggagtgcat cttaagagat gaaaattcca tcctcacagt 2 580atcatctcca ttaaatggac agtacggcgt gaaagatgtt tcattaagct tgccatctat 2 640cgtaggcagg aatggcgttg ccaggatttt ggacttgcct ttatctgacg aagaagtgga 2700gaagtttagg cattcagcaa gtgtcatggc agatgtcata aaacaattag atatataatc 2760aaattatgtt gggaggct 2778

<210> 10<211> 3355<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> lócus pta/ack de knockout Thermoanaerobacterium saccharolyticum<220>

<221> misc_feature<222> (2632)..(2634)<223> η é a, c, g ou t<220>

<221> misc_feature<222> (3262) . . (3265)<223> néa, c, g, out<400> 10

agcgctgtac gaaattgcca ctcattacag ctacgacaaa gtctgctttt gtcatttcca 60

tagacttttt tatgtgatat acgtgcccat tgtgaagtgg attgtattct acaattaaac 120ctaatacgct cataatatgc gcctttctaa aaaattatta attgtactta ttattttata 180aaaaatatgt taaaatgtaa aatgtgtata caatatattt cttcttagta agaggaatgt 240ataaaaataa atattttaaa ggaagggacg atcttatgag cattattcaa aacatcattg 300aaaaagctaa aagcgataaa aagaaaattgtaaaagctgc tgaaatagtt ttaaaagaagaagatgagat aagaaatgct gcaaaagactctgtaaagtc tgaaatgttt gataggtatgaaggaatcac gttggaaaaa gccagagaaatgatggttaa agaaggttat gctgatggatatttattaag acctgcattt cagataattagcttttttat aatggaagtg cctaattgtgctgattgtgc ggtcaaccca tcgcctaatgctgctaatac tgcaaagaat ttgttgggctctacaaaagg tagtgcatca catgaattagcaaaagaatt gatgccagat gttgctatcgttaaagaagt tgcagagcta aaagcgccggttatattccc tgatttacaa gctggtaataaggcaaatgc aattggacct ataacacaagccatttgagg tgataggtaa gattataccggaattactct atgaagcgcc atatttaaaagaggaggcag attgccttga atatattgacagaagatatc gccgtatgta aggatttcagtatatctata gaatgggcaa agcataaaaacaataacctt atagcttgta aattctatcatactatgtta tacgccaact ttgaaaacaagttttagaat gcaaggaaca gtgaattggatatctttaaa tactgtagaa aagaggaaggccggaattga aaaaactgat cgaaaaataccctgctaagg tatataagct ggtgggagaaagccggtata aagggaccac ctatgatgtggaaggaaagc tgcctgttcc aaaggtcctgctgctcatga gtgaggccga tggcgtccttcctgaaaaga ttatcgagct gtatgcggagtcggattgtc cctatacgaa tagcttagacaataacgatc tggacgatgt ggattgcgaa

ttctgccaga aggtgcagaa cccaggacat 360ggattgcaga tttagtgctt cttggaaatg 420tggacatatc caaagctgaa atcattgacc 480ctaatgattt ctatgagtta aggaagaaca 540caatcaagga taatatctat tttggatgta 600tggtatctgg cgctattcat gctactgcag 660

aaacggctcc aggagcaaag atagtatcaa 720

aatatggtga aaatggtgta ttcttgtttg 780cagaagaact tgcttctatt gccgtacaat 840ttgaaccaaa agttgccatg ctatcatttt 900tagataaagt aagaaaagcg acagagatag 960

acggtgaatt gcaattggat gctgctcttg 1020

gaagcaaagt tgcgggatgt gcaaatgtgc 1080

taggatataa gcttgtacag aggttagcta 1140

gaatgggtgc aggtcgataa acccagcgaa 1200

aggtatgaaa acgagaattg gacctttaca 1260

agctaccaag acgaagagga tgaagaggat 1320

aatactgata agataatata tcttttatat 1380

ggggcaaggc ataggcagcg cgcttatcaa 1440

cttgcatgga ctaatgcttg aaacccagga 1500

taattgtggt ttcaaaatcg gctccgtcga 1560

ctttgaaaaa gctgttttct ggtatttaag 1620

gttcgtcttg ttataattag cttcttgggg 1680

aaataataaa tggctaaaat gagaatatca 1740

cgctgcgtaa aagatacgga aggaatgtct 1800

aatgaaaacc tatatttaaa aatgacggac 1860

gaacgggaaa aggacatgat gctatggctg 1920

cactttgaac ggcatgatgg ctggagcaat 1980

tgctcggaag agtatgaaga tgaacaaagc 2040

tgcatcaggc tctttcactc catcgacata 2100

agccgcttag ccgaattgga ttacttactg 2160

aactgggaag aagacactcc atttaaagat 2220ccgcgcgagc tgtatgattt tttaaagacgcacggcgacc tgggagacag caacatctttgatcttggga gaagcggcag ggcggacaagatcagggagg atatcgggga agaacagtataagcctgatt gggagaaaat aaaaaaatatgatttagatg tctaaaaagc tttaactacatacatccgca actgtccata ctctgatgttggggtcccga gcgcctacga ggaatttgtatgcacaatcc tgctaatata gaaggaattacaatggtggc ggtatttgat acagcctttcatccaatacc ttatgaatac tacacaaagtcatcgcataa atatgtttca aatagggctgtgaaaatcat aacttgtcat cttggaaatgaatcaattga cacaagcatg ggatttacacctggaagcat agacccatcc atcatttcgtaagaagtagt aaatatatta aataaaaaatgcgattttag agacttagaa gatgccgcctctttaaatgt gtttgcatat cgangtaaaggggaggcgtc gatgtcattg tatttacagcgaaaagcccg aagaggaact tgtcttttcc 2280gtgaaagatg gcaaagtaag tggctttatt 2340tggtatgaca ttgccttctg cgtccggtcg 2400

gtcgagctat tttttgactt actggggatc 2460

attttactgg atgaattgtt ttagtaccta 2520

agctttttag acatctaatc ttttctgaag 2580

ttatatcttt tctaaaagtt cgnctagata 2640

tcgactctag agcatagaat atagctccac 2700

aagcttgcca gcaaatcatg ccaaacgttc 2760

atcagacaat gcctgattat gcatatcttt 2820

acaggattag aagatatgga tttcatggca 2880

cagagatttt gaataaacct attgaagatt 2940

gctccagcat tgctgctgtc aaatatggta 3000

cattagaagg tttggctatg ggtacacgat 3060

atcttatgga aaaagaaaat ataagcgctg 3120

ctggtgttta cggtatttca ggaataagca 3180

ttaaaaatgg agatgaaaga gctcagttgg 3240

aagacgattg gcgcttatgc agcagactat 3300

aggtgtgggt tggaaaatgg gtcca 3355

Claims

1. Organismo isolado que fermenta um produto de sacarificaçãode um substrato celulolítico para produzir etanol em uma concentração que épelo menos 90% de um rendimento teórico, em que o organismo não ex-pressa piruvato descarboxilase.

2. Método para produzir etanol, o dito método compreendendo:transformar um organismo nativo para produzir o organismo iso-lado como definido na reivindicação 1, para fornecer um hospedeiro trans-formado; ecultivar o hospedeiro transformado em um meio que contém umsubstrato que inclui um material selecionado do grupo que consiste em gli-cose, xilose, manose, arabinose, galactose, frutose, celobiose, sacarose,maltose, xilano, manana, amido, e combinações destes sob condições ade-quadas por um período de tempo suficiente para permitir a sacarificação e afermentação do substrato.

3. Organismo transformado que compreende:uma bactéria Gram-positiva que em um estado nativo contémpelo menos um gene que confere à bactéria Gram-positiva uma habilidadede produzir ácido acético como um produto de fermentação,a bactéria Gram-positiva sendo transformada para eliminar aexpressão de pelo menos um gene.

4. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque a bactéria Gram-positiva é um membro do gênero de Thermoanaerobac-ter.

5. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque a bactéria Gram-positiva é um Thermoanaerobacterium saccharolyti-cum.

6. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque o pelo menos um gene codifica a expressão de acetato quinase.

7. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3, emque o pelo menos um gene codifica para expressão de fosfotransacetilase.

8. Bactéria Gram-positiva de acordo com a reivindicação 3, emque o pelo menos um gene inclui uma pluralidade de genes.

9. Bactéria Gram-positiva de acordo com a reivindicação 8, emque a pluralidade de genes codifica a expressão de acetato quinase e fosfo-transacetilase.

10. Bactéria Gram-positiva de acordo com a reivindicação 9,transformada adicionalmente para eliminar a expressão de um ou mais ge-nes que conferem à bactéria Gram-positiva a habilidade de produzir ácidolático como um produto de fermentação.

11. Bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 3,transformada adicionalmente para eliminar a expressão de um ou mais ge-nes que conferem à bactéria Gram-positiva a habilidade de produzir ácidolático como um produto de fermentação.

12. Bactéria Gram-positiva de acordo com a reivindicação 11,em que o pelo menos um gene codifica a expressão de Iactato desidrogena-se.

13. Método para produzir etanol, o dito método compreendendo:transformar um organismo nativo para produzir a bactéria Gram-positiva como definida na reivindicação 11, para produzir um hospedeirobacteriano transformado; ecultivar o hospedeiro bacteriano transformado no meio que con-tém um substrato que inclui um material selecionado do grupo que consisteem glicose, xilose, manose, arabinose, galactose, frutose, celobiose, sacaro-se, maltose, xilano, manana, amido, e combinações destes sob condiçõesadequadas por um período de tempo suficiente permitir a sacarificação e afermentação do substrato.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o ditohospedeiro bacteriano é um Thermoanaerobacterium saccharolyticum.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, o em que os ge-nes codificam a expressão de Iactato desidrogenase, acetato quinase, e fos-fotransacetilase.

16. Cultura biologicamente pura de um microorganismo desig-nado ALK1 e depositado sob a Designação de Depósito de Patente no. PTA--7206.

17. Polinucleotídeo isolado que compreende:(a) uma seqüência de SEQ ID NO: 10;(b) uma seqüência de SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10; ou(c) uma seqüência que tem pelo menos cerca de 90% de identi-dade de seqüência com a seqüência de (a) ou (b).

18. Polinucleotídeo como definida na reivindicação 17, que tempelo menos 95% de identidade de seqüência com a seqüência de (a) ou (b).

19. Vetor que compreende o polinucleotídeo isolado como defi-nido na reivindicação 18.

20. Célula hospedeira geneticamente manipulada para expres-sar um complemento como definido na polinucleotídeo da reivindicação 18.

21. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 20, emque a célula hospedeira é uma célula bacteriana.

22. Método de produzir etanol que compreende a etapa de:cultivar uma bactéria mutante como definida na reivindicação 21, em meioque contém um substrato selecionado do grupo que consiste em glicose,xilose, manose, arabinose, galactose, frutose, celobiose, sacarose, maltose,xilano, manana, amido, e combinações destes sob condições adequadas porum período de tempo suficiente para permitir a fermentação do substratopara etanol.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que a bactériamutante é Thermoanaerobacterium saccharolyticum.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a bactériamutante é Thermoanaerobacterium saccharolyticum ALK1 (JW/SL-YS485ALK1).

25. Construto genético que compreende SEQ ID NO: 10 operati-vamente conectada a um promotor que pode ser expresso em uma bactéria.

26. Bactéria recombinante que compreende o construto genéticocomo definido na reivindicação 25.

27. Bactéria recombinante de acordo com a reivindicação 26,em que a dita bactéria é Thermoanaerobacterium saccharolyticum.

28. Método para produzir etanol, o dito método compreendendo:fornecer dentro de um frasco de reação, uma mistura de reaçãoque compreende o substrato lignocelulósico, celulase e um agente de fer-mentação, o agente de fermentação compreendendo uma bactéria Gram-positiva que foi transformada para eliminar a expressão de pelo menos umgene que confere à bactéria Gram-positiva, em um estado nativo, uma habi-lidade de produzir ácido acético como um produto de fermentação,em que a mistura de reação é reagida sob condições adequadaspor um período de tempo suficiente para permitir a sacarificação e fermenta-ção do substrato lignocelulósico.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que as condi-ções adequadas compreendem uma temperatura de pelo menos de 50SC.

30. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a bactériaGram-positiva é um membro do gênero Thermoanaetrobacter.

31. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a bactériaGram-positiva é uma Thermoanaerobacterium saccharolyticum.

32. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o pelomenos um gene codifica a expressão de acetato quinase.

33. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o pelomenos um gene codifica a expressão de fosfotransacetilase.

34. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o pelomenos um gene inclui uma pluralidade de genes.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a plurali-dade de genes codificam a expressão de acetato quinase e fosfotransacetilase.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, ainda compreen-dendo transformar a bactéria Gram-positiva para eliminar a expressão de umou mais genes que conferem à bactéria Gram-positiva a habilidade de pro-duzir ácido lático como um produto de fermentação.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o pelomenos um gene codifica a expressão de Iactato desidrogenase.

38. Método de acordo com a reivindicação 28, ainda compreen-dendo transformar a bactéria Gram-positiva para eliminar uma expressão deum ou mais genes que conferem à bactéria Gram-positiva a habilidade deproduzir ácido lático como um produto de fermentação.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o pelomenos um gene codifica a expressão de Iactato desidrogenase.