BRPI0709801A2 - polinucleotÍdeo isolado, cassete de expressço, mÉtodo para modular o tamanho de àrgços sem plantas, mÉtodo de modular toda a planta ou o tamaho de àrgço em uma planta, produto - Google Patents

polinucleotÍdeo isolado, cassete de expressço, mÉtodo para modular o tamanho de àrgços sem plantas, mÉtodo de modular toda a planta ou o tamaho de àrgço em uma planta, produto Download PDF

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Abstract

<B>POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSAO, MÉTODO PARA MODULAR O TAMANHO DE ORGAOS EM PLANTAS, MÉTODO DE MODULAR TODA A PLANTA OU O TAMANHO DE ORGAO EM UMA PLANTA, PRODUTO<D> A presente invenção fornece polinucleotídeos e peptídeos relacionados com a família do gene ZmARGOS.A presente provê ainda a seqúência genâmica para genes ZmARGOS. ZmARGOS é responsável por controlar o crescimento da planta, o tamanho de órgàos e o rendimento em culturas agrícolas.

Description

POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARAMODULAR O TAMANHO DE ÓRGÃOS EM PLANTAS, MÉTODO DE MODULARTODA A PLANTA OU O TAMANHO DE ÓRGÃO EM UMA PLANTA, PRODUTO
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção está relacionada, de forma geral, ao campoda biologia molecular.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A domesticação de várias plantas se correlacionou comaumentos dramáticos em produção. A maioria das variaçõesfenotipicas ocorrendo em populações naturais é continua e éefetuada por influência de múltiplos genes. Aidentificação de genes específicos responsáveis pelasdramáticas diferenças em produção, em plantas domesticadas,se tornou um foco importante da pesquisa agrícola.
Em Arabidopsis, uma família de genes associados commudanças vegetais que se relacionam a rendimento melhoradoem cultivares, o gene regulado por auxina envolvido emtamanho de órgão (Auxin-Regulated Gene involved in OrganSize - ARGOS) é induzido por auxina. Esse gene éresponsável pela regulação de proliferação celular ecrescimento de órgãos. O ARGOS de Arabidopsis é expressonaturalmente em um nível baixa em vários tecidos jovensincluindo raízes, caules de inflorescências, flor, folhasjovens de rosetas e siliquas, mas indetectável em folhasmaduras. Em estudos por Hu, et ai. (2003 Plant Cell15:1951-61) e Hu, et al. (2006 The Plant Journal 47(1):1-9), plantas transgênicas que ectopicamente super-expressamcDNA de ARGOS senso ou anti-senso apresentam órgãos aéreoscrescidos ou reduzidos, respectivamente. Alteração emtamanho de órgão demonstrado nessas plantas é associada commudanças no número de células, e não em tamanho celular. 0maior número de células é atribuído à duração docrescimento de órgão em Arabidopsis.
A presente invenção inclui a identificação dos genesARGOS putativos de milho, ZmARGOS 1-9 (SEQ ID NOS: 1, 3, 5,40-45 e 71) que são relacionados aos genes ARGOS deArabidopsis (SEQ ID NOS: 59, 60 e 61). 0 ortólogo tendo amaior similaridade a ARGOS Arabidopsis (SEQ ID NO: 59) , éZmARGOS 1 (SEQ ID NO: 1). A expressão de ZmARGOSl e 2 (SEQID NOS: 1 e 3) em milho foi primariamente nas raízes,endosperma inicial, espiga imatura e meristemasinflorescentes de broto e de espiga. A expressão estáassociada com tecidos crescendo ativamente, e é vista em umgrau menor em tecidos maduros. Essa descoberta éconsistente com o efeito positivo notado do gene em regularo crescimento e proliferação celular. O gene ZmARGOS 3(SEQ ID NO: 5) expresso em um amplo espectro de tecidos eestágios de desenvolvimento.
Plantas transgênicas expressando ZmARGOSl (SEQ ID NO:1) mostram um impacto positivo em acúmulo de biomassa etaxa de crescimento de planta de milho, assim como umaumento em tamanho de órgão. Esses genes de milho serãoúteis para intensificar características agronômicas emmilho (e outros cultivares).
A presente invenção também inclui a identificação degenes ARGOS em outras espécies vegetais. A família degenes de arroz é representada por 8 membros da família.Nove membros da família de genes foram encontrados emSorghum bicolor. Cinco seqüências gênicas também foramencontradas em Soja (Glycine max). Três membros da famíliade genes ARGOS de Arabidopsis são aqui descritos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Composições e métodos para controlar o crescimentovegetal e tamanho de órgão para produção crescente em umaplanta são providos. As composições incluem seqüências deARGOS de milho, soja, Arabidopsis, arroz e sorgo.Composições da invenção compreendem seqüências deaminoácidos e seqüências de nucleotideos selecionadas deSEQ ID NOS: 1-37, 40-71 assim como variantes e fragmentosdessas.
Polinucleotideos codificando as seqüências de ARGOSsão providos em construções de DNA para expressão em umaplanta de interesse. São ainda providos cassetes deexpressão, plantas, células vegetais, partes de planta, esementes compreendendo as seqüências da invenção. Emavanços específicos, o polinucleotídeo é operacionalmenteligado a um promotor constitutivo.
Métodos para modular o nível de uma seqüência AHGOS emuma planta ou parte de planta são providos. Os métodoscompreendem introduzir em uma planta ou parte de planta umpolinucleotídeo heterólogo compreendendo uma seqüênciaARGOS da invenção. 0 nível de polipeptídeo ARGOS pode seraumentado ou diminuído. Tal método pode ser usado paraaumentar o rendimento em plantas; em um avanço, o método éusado para aumentar o rendimento de grãos em cereais.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSFigura 1: Dendrograma ilustrando a relação entre ospolipeptideos ARGOS desta invenção de várias espéciesvegetais: milho, arroz, soja, sorgo e Arabidopsis.
Figura 2: Alinhamento de seqüências polipeptidicas demilho, arroz, soja, sorgo e Arabidopsis com identificaçãode regiões conservadas. As proteínas possuem uma regiãobem conservada rica em prolina próxima ao C-terminal. Asregiões N-terminal são geralmente divergentes. As
proteínas são bem curtas, variando de 58 a 146, e com médiade 110 aminoácidos.
Figura 3: Alinhamento de ZmARGOS 1, 2, e 3, comAtARGOS 1, destacando suas áreas de consenso, esubstituições conservadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A menos que definido de outra forma, todos os termostécnicos e científicos aqui usados possuem o mesmosignificado como comumente entendido por alguém deconhecimento ordinário na técnica a qual esta invençãopertence. A menos que mencionado de outra forma, astécnicas aqui empregadas ou contempladas são metodologiaspadrão bem conhecidas de alguém de conhecimento ordináriona técnica. Os materiais, métodos e exemplos sãoilustrativos apenas e não limitantes. 0 seguinte éapresentado por meio de ilustração e não pretende limitar oescopo da invenção.
A presente invenção será agora descrita maiscompletamente dagui em diante com referência aos desenhosque a acompanham, nos quais alguns, mas não todos osavanços da invenção são apresentados. De fato, essasinvenções podem ser incorporadas de várias formasdiferentes e não deveriam ser construídas como limitadasaos avanços aqui apresentados; ao contrário, esses avançossão providos de forma que esta descrição satisfaçarequerimentos legais aplicáveis. Números similaresreferem-se a elementos similares, por conseguinte.
Várias modificações e outros avanços da invenção aquiapresentada virão à mente de um especialista na técnica aqual essas invenções pertencem, tendo o benefício dosensinamentos apresentados nas descrições precedentes edesenhos associados. Portanto, deve ser entendido que asinvenções não devem estar limitadas aos avanços específicosdescritos e que modificações e outros avanços devem serincluídos no escopo das reivindicações em anexo. Apesar determos específicos serem aqui empregados, eles são usadosem um senso genérico e descritivo apenas, e não parapropósitos de limitação.
A prática da presente invenção empregará, a menos queindicado, ao contrário, técnicas convencionais de botânica,microbiologia, cultura de tecidos, biologia molecular,química, bioquímica e tecnologia de DNA recombinante, queestão dentro da especialidade da técnica. Tais técnicas sãoexplicadas completamente na literatura. Ver, e.g.,Langenheim and Thimann, BOTANY: PLANT BIOLOGY AND ITSRELATI0N TO HUMAN AFFAIRS, John Wiley (1982); CELL CULTUREAND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS, vol. 1, Vasilf ed.(1984); Stanier, et ai., THE MICROBIAL WORLD, 5th ed. ,Prentice-Hall (1986); Dhringra and Sinclair, BASIC PLANTPATHOLOGY METHODS, CRC Press (1985); Maniatis, et al. ,MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING,vols. I and II, Glover, ed. (1985); OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS, Gait, ed. (1984); NUCLEIC ACID' HYBRIDIZATIONfHames and Higgins, eds. (1984); e a série METHODS INENZYMOLOGY, Colowick and Kaplan, eds, Academic Press, Inc.,San Diego, CA.
Unidades, prefixos, e símbolos podem estar denotadosna sua forma SI aceita. A menos que indicado ao contrário,ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita naorientação 5' a 3' ; seqüências de aminoácidos são escritasda esquerda para a direita na orientação amino paracarboxi, respectivamente. Amplitudes numéricas incluem osnúmeros definindo a variação. Aminoácidos podem ser aquireferidos tanto por seu símbolo de três letras comumenteconhecido ou pelos símbolos de uma letra recomendados pelacomissão de nomenclatura da IUPAC-IUB (BiochemicalNomenclature Commission). Nucleotídeos, da mesma forma,podem ser referidos por seus códigos de uma letra comumenteaceitos. Os termos definidos abaixo são definidos maiscompletamente por referência à especificação como um todo.
Ao descrever a presente invenção, os seguintes termosserão empregados, e devem ser definidos como indicadosabaixo.
Por "micróbio" pretende-se qualquer microorganismo(incluindo tanto microorganismos eucariontes ouprocariontes) , tais como fungos, leveduras, bactérias,actinomicetos, algas e protozoários, assim como outrasestruturas unicelulares.
Por "amplificado" pretende-se a construção demúltiplas cópias de uma seqüência de ácidos nucléicos oumúltiplas cópias complementares à seqüência de ácidosnucléicos usando pelo menos uma das seqüências de ácidosnucléicos como modelo. Sistemas de amplificação incluem osistema de reação em cadeia da polimerase (PCR), sistema dereação em cadeia da ligase (LCR), amplificação baseada emseqüência de ácidos nucléicos (NASBA, Cangene, Mississauga,Ontario), sistemas Q-Beta Replicase, sistema deamplificação baseado em transcrição (TAS), e amplificaçãode deslocamento de fita (SDA). Ver, e.g., DIAGNOSTICMOLECULAR MICROBIOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Persing, et ai., eds., American Society for Microbiology,Washington, DC (1993). 0 produto de amplificação é chamadode amplicon.
0 termo "variantes modificados conservadamente" seaplica tanto a seqüências de aminoácido e de ácidosnucléicos. Com respeito a seqüências de ácidos nucléicosem particular, variantes modificados conservadamentereferem-se àqueles ácidos nucléicos que codificam variantesidênticos ou modificados conservadamente das seqüências deaminoácidos. Por causa da degeneração do código genético,um grande número de ácidos nucléicos funcionalmenteidênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, oscódons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácidoalanina. Assim, em cada posição onde uma alanina éespecificada por um códon, o códon pode ser alterado paraqualquer dos códons correspondentes descritos sem alterar opolipeptideo codificado. Tais variações em ácidos
nucléicos são "variações silenciosas" e representam umaespécie de variação modificada conservadamente. Cadaseqüência de ácidos nucléicos aqui que codifica umpolipeptideo também descreve cada variação silenciosapossível do ácido nucléico. Alguém de conhecimentoordinário reconhecerá que cada códon em um ácido nucléico(exceto AUG, que é ordinariamente o único códon parametionina; uma exceção é Micrococcus rubens, para o qualGTG é o códon de metionina (Ishizuka, et ai., (1993) <J.Gen. Microbiol. 139:425-32) pode ser modificado paraproduzir uma molécula funcionalmente idêntica. Dessaforma, cada variação silenciosa de um ácido nucléico, oqual codifica um polipeptideo da presente invenção, estáimplícita em cada seqüência polipeptídica descrita eincorporada aqui por referência.
Como para seqüências de aminoácidos, um especialistareconhecerá que substituições, deleções ou adiçõesindividuais para um ácido nucléico, peptídeo, polipeptideo,ou seqüência de proteínas que alterem, adicionem ou deletemum único aminoácido ou uma pequena porcentagem deaminoácidos na seqüência codificada são "variantesmodificados conservadamente" quando a alteração resulta nasubstituição de um aminoácido por um aminoácidoquimicamente similar. Assim, qualquer número de resíduosde aminoácidos selecionado do grupo de número inteirosconsistindo de 1 a 15 pode ser, assim, alterados. Assim,por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 7 ou 10 alterações podem serfeitas. Variantes modificados conservadamente provêm,tipicamente, similar atividade biológica como a seqüênciapolipeptídica não modificada a partir da qual eles sãoderivados. Por exemplo, especificidade de substrato,atividade enzimática, ou ligação ligante/receptor é degeralmente pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%,preferencialmente 60-90% da proteína nativa para seusubstrato nativo. Tabelas de substituições conservadasprovendo aminoácidos funcionalmente similares são bemconhecidas na técnica.
O seis grupos a seguir contêm, cada, aminoácidos quesão substituições conservadas um para o outro:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutâmico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M),Valina (V); e
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).Ver também, Creighton, PROTEINS, W.H. Freeman and Co.(1984) .
Como aqui usado, "consistindo essencialmente de"significa a inclusão de seqüências adicionais a umpolinucleotideo objeto onde as seqüências adicionais nãohibridizam seletivamente, sob condições de hibridizaçãoestringentes, ao mesmo cDNA que o polinucleotideo e onde ascondições de hibridização incluem uma etapa de lavagem emO,1X SSC e 0,1% de sódio dodecil sulfato a 65°C.
Por "codificando" ou "codificado", com respeito a umácido nucléico especificado, pretende-se compreender ainformação para tradução na proteína especificada. Umácido nucléico codificando uma proteína pode compreenderseqüências não traduzidas (e.g., íntrons) em regiõestraduzidas do ácido nucléico, ou podem não possuir taisseqüências não traduzidas intervenientes (e.g., como emcDNA). A informação pela qual uma proteína é codificada éespecificada pelo uso de códons. Tipicamente, a seqüênciade aminoácidos é codificada pelo ácido nucléico usando ocódigo genético "universal". Contudo, variantes do códigouniversal, tal como é presente em algumas mitocôndrias deplantas, animais, e fungos, a bactéria Mycoplasmacapricolum (Yamao, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 82:2306-9), ou o ciliado Macronucleus, podem ser usadosquando o ácido nucléico é expresso usando esses organismos.
Quando o ácido nucléico é preparado ou alteradosinteticamente, pode-se tomar vantagem de preferências decódon conhecidas do hospedeiro visado onde o ácido nucléicodeve ser expresso. Por exemplo, apesar de seqüências deácidos nucléicos da presente invenção poderem ser expressastanto em espécies de plantas monocotiledôneas edicotiledôneas, seqüências podem ser modificadas paracontabilizar as preferências de códon especificas epreferências de conteúdo GC de plantas monocotiledôneas ouplantas dicotiledôneas, já que essas preferências foramvistas por diferirem (Murray, et al., (1989) Nucleic AcidsRes. 17:477-98 e aqui incorporada por referência). Assim,o códon preferido de milho para um aminoácido em particulardeve ser derivado de seqüências gênicas conhecidas demilho. O uso de códon em milho para 28 genes de plantas demilho é listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra.
Como aqui usado, "heterólogo" em referência a um ácidonucléico é um ácido nucléico que se origina de uma espécieestrangeira, ou, se da mesma espécie, é substancialmentemodificado de sua forma nativa em composição e/ou lócusgenômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo,um promotor operacionalmente ligado a um gene estruturalheterólogo é de uma espécie diferente daquela da qual ogene estrutural foi derivado ou, se da mesma espécie, um ouambos são substancialmente modificados se sua formaoriginal. Uma proteína heteróloga pode ser originar de umaespécie estrangeira ou, se da mesma espécie, sersubstancialmente modificada de sua forma original porintervenção humana deliberada.
Por "célula hospedeira" pretende-se uma célula, a qualcontém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão dovetor de expressão. Células hospedeiras podem ser célulasprocariontes, tais como células de E. coli, ou célulaseucariontes, tais como leveduras, células de insetos,plantas, anfíbios, ou de mamíferos. Preferencialmente,células hospedeiras são células vegetais monocotiledôneasou dicotiledôneas, incluindo, mas não se limitando a,milho, sorgo, girassol, soja, trigo, alfafa, arroz,algodão, canola, cevada, milhete e tomate. Uma célulahospedeira de monocotiledônea particularmente preferida éuma célula hospedeira de milho.
0 termo "complexo de hibridização" inclui referência auma estrutura duplex de ácido nucléico formada por duasseqüências de ácidos nucléicos de fita simplesseletivamente hibridizadas uma à outra.
O termo "introduzido", no contexto de inserir um ácidonucléico em uma célula, significa a "transfecção" ou"transformação" ou "transdução" e inclui referência àincorporação de um ácido nucléico em uma célula eucarionteou procarionte, onde o ácido nucléico pode ser incorporadono genoma da célula (e.g., DNA cromossômico, de plasmideo,de plastideo ou mitocondrial), convertido em um repliconautônomo, ou expresso transientemente (e.g., mRNAtransfectado).
O termo "isolado" refere-se a material, tal como umácido nucléico ou uma proteína, que é substancialmente ouessencialmente livre de componentes que normalmenteacompanham ou interagem com o mesmo, como encontrado em seuambiente naturalmente ocorrente. O material isoladocompreende, opcionalmente, material não encontrado com omaterial em seu ambiente natural. Ácidos nucléicos, quesão "isolados", como aqui definido, são também referidoscomo ácidos nucléicos "heterólogos". A menos que declaradode outra forma, o termo "ácido nucléico de ARGOS" significaum ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo("polinucleotídeo ARGOS") codificando um polipeptídeoARGOS.Como aqui usado, "ácido nucléico" inclui referência apolímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo tantona forma de fita simples ou dupla-fita, e a menos quelimitado ao contrário, engloba análogos conhecidos tendo anatureza essencial de nucleotídeos naturais já quehibridizam a ácidos nucléicos de fita simples de maneirasimilar a nucleotídeos naturalmente ocorrentes (e.g.,ácidos nucléicos peptídicos).
Por "biblioteca de ácidos nucléicos" pretende-se umacoleção de DNA isolado ou moléculas de RNA, que compreendeme representam substancialmente toda a fração transcrita deum genoma de um organismo especificado. A construção debibliotecas de ácidos nucléicos exemplares, tais comobibliotecas de DNA genômico e cDNA, é ensinada emreferências padrão de biologia molecular, tais como Bergerand Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, da sérieMETHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 152, Academic Press, Inc., SanDiego, CA (1987); Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: ALABORATORY MANUAL, 2nd ed., vols. 1-3 (1989); e CURRENTPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, et al., eds,Current Protocols, a joint venture between GreenePublishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.(1994 Supplement).Como aqui usado "operacionalmente ligado" incluireferência a uma ligação funcional entre uma primeiraseqüência, tal como um promotor e uma segunda seqüência,caracterizado pelo fato de que a seqüência promotora iniciae media a transcrição da seqüência de DNA correspondente àsegunda seqüência. Geralmente, operacionalmente ligadosignifica que as seqüências de ácidos nucléicos sendoligadas são contíguas e, onde necessário para juntar duasregiões codificadoras de proteína, contíguas e na mesmafase de leitura.
Como aqui usado, o termo "planta" inclui referência aplantas inteiras, órgãos vegetais (e.g., folhas, caules,raízes, etc.), sementes e células vegetais e progênie damesma. Célula vegetal, como aqui usado inclui, semlimitação, culturas em suspensão de sementes, embriões,regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes,brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micrósporos. Aclasse de plantas, que pode ser usada nos métodos dainvenção, é geralmente tão ampla como a classe de plantassuperiores passíveis e técnicas de transformação, incluindotanto plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindoespécies dos gêneros: Cucurbita, Rosaf Vitis, JuglansrFragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium,Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot,Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa,Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nieotiana,Solanumr Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium,Helianassim, Laetuea, Bromus, Asparagus, Antirrhinum,Heteroeallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum,Ranunculus, Seneeio, Salpiglossis, Cueumis, Browaalia,Glyeine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum,Seeale, Allium, e Tritieum. Uma planta particularmentepreferira é Zea mays.
Como aqui usado, "rendimento" inclui referência aalqueires por acre de um grão de cultivo na colheita, comoajustado para umidade de grãos (15% tipicamente) . Aumidade de grãos é medida no grão na colheita. 0 peso deteste ajustado de grão é determinado para ser o peso emlibras por alqueire, ajustado para nivel de umidade degrãos na colheita.
Como aqui usado, "polinucleotídeo" inclui referência aum desoxirribopolinucleotideo, ribopolinucleotideo, ouanálogos desses que possuem a natureza essencial de umribonucleotideo natural no qual hibridizam, sob condiçõesde hibridização estringentes, para substancialmente a mesmaseqüência de nucleotideos como nucleotideos naturalmenteocorrentes e/ou permitem a tradução no mesmo aminoácido(s)como o(s) nucleotideo(s) naturalmente ocorrente (s). Umpolinucleotídeo pode ser de comprimento total ou umasubseqüência de um gene estrutural heterólogo ou regulador.A menos que indicado ao contrário, o termo incluireferência à seqüência especificada, assim como, àseqüência complementar dessa. Assim, DNAs ou RNAs comespinhas dorsais modificadas para estabilidade ou por outrasrazões são "polinucleotideos" como aquele termo é pretendidoaqui. Além do mais, DNAs ou RNAs compreendendo bases nãousuais, tais como inosina, ou bases modificadas, tais comobases tritiladas, para dar apenas dois exemplos, sãopolinucleotideos como o termo é aqui usado. Será ponderadoque uma grande variedade de modificações foi feita para DNAe RNA que servem a vários propósitos úteis conhecidosdaqueles especialistas na técnica. 0 termo polinucleotídeo,como aqui empregado, abrange tais formas de polinucleotideosmodificadas quimicamente, enzimaticamente oumetabolicamente, assim como as formas químicas de DNA e RNAcaracterísticas de vírus e células, incluindo inter alia,células simples e complexas.
Os termos "polipeptídeo," "peptídeo," e "proteína" sãoaqui usados intercambiavelmente para referir-se a umpolímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicama polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos deaminoácido são análogos químicos artificiais de umaminoácido correspondente naturalmente ocorrente, assimcomo a polímeros de aminoácidos naturalmente ocorrentes.
Como aqui usado "promotor" inclui referência a umaregião de DNA acima do início de transcrição e envolvida noreconhecimento e ligação de RNA polimerase e outrasproteínas para iniciar a transcrição. Um "promotorvegetal" é um promotor capaz de iniciar a transcrição emcélulas vegetais. Promotores vegetais exemplares incluem,mas não são limitados a, aqueles que são obtidos a partirde plantas, vírus vegetais, e . bactérias que compreendemgenes expressos em células vegetais, tais comoAgrobacterium ou Rhizobium. Exemplos são promotores quepreferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos,tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos doxilema, traqueídeos, ou esclerênquima. Tais promotores sãoreferidos como "tecido-preferenciais". Um promotorespecífico de "tipo de célula" primariamente dirige aexpressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos,por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Umpromotor "induzido" ou "regulável" é um promotor, que estásob controle ambiental. Exemplos de condições ambientaisque pode efetuar a transcrição por promotores induzidosincluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Outrotipo de promotor é um promotor regulado pordesenvolvimento, por exemplo, um promotor que dirige aexpressão durante o desenvolvimento do pólen. Promotorespreferidos de tecido, específicos de tipo de célula,regulados por desenvolvimento e induzidos constituem aclasse de promotores "não constitutivos". Um promotor"constitutivo" é um promotor, que está ativo sob a maioriadas condições ambientais.
O termo "polipeptídeo ARGOS" refere-se a uma ou maisseqüências de aminoácidos. 0 termo também inclui
fragmentos, variantes, homólogos, alelos ou precursores(e.g., pré-proproteínas ou pró-proteínas) dessas. Uma"proteína ARGOS" compreende um polipeptídeo ARGOS. A menosque declarado de outra forma, o termo "ácido nucléico deARGOS" significa um ácido nucléico compreendendo umpolinucleotídeo ("polinucleotídeo de ARGOS") codificando umpolipeptídeo ARGOS.
Como aqui usado "recombinante" inclui referência a umacélula ou vetor, que foi modificado pela introdução de umácido nucléico heterólogo ou que a célula é derivada de umacélula modificada dessa maneira. Assim, por exemplo,células recombinantes expressam genes que não sãoencontrados de forma idêntica na forma nativa (nãorecombinante) da célula ou expressam genes nativos que são,de outra forma, expressos anormalmente, super-expressos ounão expressos por completo como resultado de intervençãohumana deliberada. O termo "recombinante" como aqui usadonão engloba a alteração da célula ou vetor por eventosnaturalmente ocorrentes (e.g., mutação espontânea,transformação/transdução/transposição natural) tais comoaqueles ocorrendo sem intervenção humana deliberada.
Como aqui usado, um "cassete de expressãorecombinante" é um construção de ácidos nucléicos geradarecombinantemente ou sinteticamente, com uma serie deelementos de ácidos nucléicos especificados, que permitem atranscrição de um ácido nucléico em particular em umacélula alvo. O cassete de expressão recombinante pode serincorporado em um plasmideo, cromossomo, DNA mitocondrial,DNA de plastideo, vírus, ou fragmento de ácido nucléico.Tipicamente, a porção recombinante de cassete de expressãode um vetor de expressão inclui, dentre outras seqüências,um ácido nucléico a ser transcrito, e um promotor.
Os termos "resíduo" ou "resíduo de aminoácido" ou"aminoácido" são usados intercambiavelmente aqui parareferir-se a um aminoácido que é incorporado em umaproteína, polipeptideo, ou peptideo (coletivamente"proteína"). 0 aminoácido pode ser um aminoácido
naturalmente ocorrente e, a menos que limitado de outraforma, pode englobar análogos conhecidos de aminoácidosnaturais que podem funcionar de maneira similar comoaminoácidos naturalmente ocorrentes.
0 termo "hibridiza seletivamente" inclui referência ahibridização, sob condições de hibridização estringentes,de uma seqüência de ácidos nucléicos a uma seqüência deácidos nucléicos alvo especificada a um graudetectavelmente maior (e.g., pelo menos 2 vezes sobre abase) do que sua hibridização a seqüências de ácidosnucléicos não alvo e para a exclusão substancial de ácidosnucléicos não alvo. Seqüências hibridizando seletivamentetipicamente possuem cerca de pelo menos 40% de identidadede seqüência, preferencialmente 60-90% de identidade deseqüência, e mais preferencialmente 100% de identidade deseqüência (i.e., complementar) uma à outra.
Os termos "condições estringentes" ou "condições dehibridização estringentes" incluem referência a condiçõessob as quais uma sonda irá hibridizar a sua seqüência alvoem um grau detectavelmente maior do que a outras seqüências(e.g., pelo menos 2 vezes sobre a base). Condiçõesestringentes são dependentes de seqüência e serãodiferentes em diferentes circunstâncias. Controlando aestringência das condições de hibridização e/ou lavagem,seqüências alvo que são 100% complementares à sonda podemser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente,condições de estringência podem ser ajustadas para permitiralguma falta de correspondência em seqüências de forma quegraus menores de similaridade sejam detectados (sondagemheteróloga). Otimamente, a sonda é de aproximadamente 500nucleotideos em comprimento, mas pode variar muito emcomprimento a partir de menos de 500 nucleotideos até igualao comprimento total da seqüência alvo.
Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nasquais a concentração de sais é menor do que cerca de 1,5 Mde ions de Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a1,0 M de ions de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e atemperatura é de pelo menos cerca de 30 C para sondascurtas (e.g., 10 a 50 nucleotideos) e de pelo menos cercade 60°C para sondas longas (e.g., maiores que 50nucleotideos). Condições estringentes podem ser
alcançadas, também, com a adição de agentesdesestabilizantes, tais como formamida ou Denhardt's.Condições exemplares de baixa estringência incluemhibridização com uma solução tampão de 30 a 35% deformamida, NaCl 1 Μ, SDS 1% (sódio dodecil sulfato) a 37°C,e uma lavagem em SSC IX a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0M/trissódio citrato 0,3 M) a 50 a 55°C. Condiçõesexemplares de estringência moderada incluem hibridização em40 a 45% formamida, NaCl 1,0 M, SDS 1% a 37 °C, e umalavagem em 0,5X a SSC 1X a 55 a 60°C. Condições exemplaresde estringência elevada incluem hibridização em formamida50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37 C, e uma lavagem em SSC 0,1X a60 a 65°C por pelo menos 30 minutos. A especificidade étipicamente a função de lavagens pós hibridização, osfatores críticos sendo a força iônica e temperatura dasolução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, o pontotérmico de derretimento (Tm) pode ser aproximado a partirda equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem.138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61(% form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátionsmonovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosinae citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida nasolução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido empares de bases. A Tm é a temperatura (sob definidas forçaiônica e pH) na qual 50% de uma seqüência alvo complementarhibridiza a uma sonda perfeitamente correspondente. A Tm éreduzida em cerca de 1°C para cada 1% de falta decorrespondência; assim, condições de Tm, hibridização, e/oulavagem podem ser ajustadas para hibridizar a seqüências daidentidade desejada. Por exemplo, se seqüências comidentidade ≥ 90% são procuradas, a Tm pode ser diminuída em10°C. Por exemplo, se seqüências com ≥90% de identidadesão procuradas, a Tm pode ser diminuída em 10°C.Geralmente, condições estringentes são selecionadas paraserem cerca de 5 °C menores do que o ponto térmico dederretimento (Tm) para a seqüência específica e seucomplemento em uma definida força iônica e pH. Contudo,condições severamente estringentes podem utilizar umahibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4 0C menor do que oponto térmico de derretimento (Tm) ; condições moderadamenteestringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a6, 7, 8, 9 ou 10°C menor do que o ponto térmico dederretimento (Tm) ; condições de baixa estringência podemutilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15ou 20°C menor do que o ponto térmico de derretimento (Tm) .Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, eTm desejada, aqueles de conhecimento ordinário entenderãoque variações na estringência de soluções de hibridizaçãoe/ou lavagem são inerentemente descritas. Se o graudesejado de falta de correspondência resulta em uma Tm demenos do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução deformamida) , é preferível aumentar a concentração de SSC deforma que uma maior temperatura possa ser usada. Um guiaextensivo para a hibridização de ácidos nucléicos éencontrado em Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY—HYBRIDIZATION WITHNUCLEIC ACID PROBES, part I, chapter 2, "Overview ofprincipies of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays," Elsevier, New York (1993); and CURRENTPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY, chapter 2, Ausubel, et al.,eds, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1995). A menos que declarado de outra forma, na presenteaplicação estringência elevada é definida como hibridizaçâoem SSC 4X, Denhardt's 5X (5 g Ficoll, 5 gpolivinipirrolidona, 5 g albumina de soro bovino em 500 mlde água), 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmão fervido, eNa fosfato 25 mM a 65°C, e uma lavagem em SSC 0,1X, SDS0,1% a 65°C.
Como aqui usado, "planta transgênica" incluireferência a uma planta, que compreende em seu genoma umpolinucleotideo heterólogo. Geralmente, o polinucleotideoheterólogo é estavelmente integrado no genoma de forma queo polinucleotideo é passado a sucessivas gerações. Opolinucleotideo heterólogo pode ser integrado no genomasozinho ou como parte de um cassete de expressãorecombinante. "Transgênico" é aqui usado para incluirqualquer célula, linha de célula, calo, tecido, parte deplanta ou planta, o genótipo da qual tenha sido alteradopela presença de ácido nucléico heterólogo incluindoaqueles transgênicos inicialmente alterados dessa forma,assim como aqueles criados por cruzamentos sexuados oupropagação assexuada a partir do transgênico inicial. Otermo "transgênico", como aqui usado, não engloba aalteração do genoma (cromossômico ou extra-cromossômico)por métodos convencionais de melhoramento vegetal ou poreventos naturalmente ocorrentes, tais como fertilizaçãocruzada aleatória, infecção viral não recombinante,transformação bacteriana não recombinante, transposição nãorecombinante, ou mutação espontânea.
Como aqui usado, "vetor" inclui referência a um ácidonucléico usado na transfecção de uma célula hospedeira e noqual pode ser inserido um polinucleotideo. Vetores sãofreqüentemente replicons. Vetores de expressão permitem atranscrição de um ácido nucléico ai inserido.
Os seguintes termos são usados para descrever asrelações de seqüência entre dois ou mais ácidos nucléicosou polinucleotideos ou polipeptideos: (a) "seqüênciareferência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade deseqüência", (d) "porcentagem de identidade de seqüência", e(e) "identidade substancial".Como aqui usado, "seqüência referência" é umaseqüência definida usada como base para comparação deseqüências. Uma seqüência referência pode ser um subgrupoou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo,como um segmento de um cDNA ou seqüência gênica decomprimento total, ou o cDNA ou seqüência gênica completos.
Como aqui usado, "janela de comparação" faz referênciaa um segmento contíguo e específico de uma seqüência depolinucleotídeos, caracterizado pelo fato de que aseqüência de polinucleotídeos na janela de comparação podeser comparada a uma seqüência referência, caracterizadopelo fato de que a porção da seqüência de polinucleotídeosna janela de comparação pode compreender adições oudeleções (i.e., espaços) comparada à seqüência referência(que não compreende adições ou deleções) para ótimoalinhamento dos dois polinucleotídeos. Geralmente, ajanela de comparação é de pelo menos 20 nucleotídeoscontíguos em comprimento, e opcionalmente pode ser de 30,40, 50, 100, ou mais longa. Aqueles especialistas natécnica entendem que evitar uma alta similaridade para umaseqüência referência devido à inclusão de espaços (gaps) naseqüência de polinucleotídeos, uma penalidade por espaço étipicamente introduzida e subtraída do número decorrespondências.Métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na técnica. 0 algoritmo de homologialocal (BESTFIT) de Smith and Waterman, (1981) Adv. Appl.Math 2:482, pode conduzir o alinhamento ótimo de seqüênciaspara comparação; pelo algoritmo de alinhamento de homologia(GAP) de Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-53; pela busca para método de similaridade (Tfasta andFasta) de Pearson and Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 85:2444; por implementações computadorizadas dessesalgoritmos, incluindo, mas não se limitando a: CLUSTAL noprograma PC/Gene da Intelligenetics, Mountain View,Califórnia, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacotede software Wisconsin Genetics Software Package, Version 8(disponibilizado pela Genetics Computer Group (GCG®programs (Accelrys, Inc., San Diego, CA)). O programaCLUSTAL é bem descrito por Higgins and Sharp, (1988) Gene73:237-44; Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3;Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90;Huang, et al., (1992) Computer Applications in theBioscienees 8:155-65, e Pearson, et al., (1994) Meth. Mol.Biol. 24:307-31. O programa preferido para usaralinhamento ótimo global de múltiplas seqüências é PileUp(Feng and Doolittle, (1987) J. Mol. Evol., 25:351-60 que ésimilar ao método descrito por Higgins and Sharp, (1989)CABIOS 5:151-53 e incorporado por referência daqui emdiante). A família BLAST de programas que podem ser usadospara buscas de similaridade em base de dados inclui: BLASTNpara buscas por seqüências de nucleotídeos em relação aseqüências de nucleotídeos da base de dados; BLASTX parabuscas por seqüências de nucleotídeos em relação a base dedados de seqüências de proteínas; BLASTP para buscas porseqüências de proteínas em relação à base de dados deseqüências de proteínas; TBLASTN para busca por seqüênciasde proteína em relação a base de dados de seqüências denucleotídeo; e TBLASTX para buscas por seqüências denucleotídeos em relação à base de dados de seqüências denucleotídeos. Ver CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Chapter 19, Ausubel, et al., eds., Greene Publishing andWiley-Interscience, New York (1995).
GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch, supra, paraencontrar o alinhamento de duas seqüências completas quemaximiza o número de correspondências e minimiza o númerode espaços. GAP considera todas as posições de alinhamentoe de espaços possíveis e cria o alinhamento com o maiornúmero de bases com correspondência e o menor de espaços.Isto permite a provisão de uma penalidade de criação deespaços e uma penalidade de extensão de espaços em unidadesde bases com correspondência. GAP deve fazer um saldo denúmero de penalidade de criação de espaços decorrespondências para cada espaço que insere. Se umapenalidade por extensão de espaço maior que zero éescolhida, GAP deve, adicionalmente, fazer um saldo paracada espaço inserido do comprimento do espaço vezes apenalidade por extensão de espaço. Valores padrão depenalidade de criação de espaços e valores de penalidade deextensão de espaços na Versão 10 do pacote de softwareWisconsin Genetics Software Package são 8 e 2,respectivamente. As penalidades de criação e extensão deespaços podem ser expressas como um número inteiroselecionado do grupo de números inteiros consistindo de 0 a200. Assim, por exemplo, as penalidades de criação eextensão de espaços podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores.
GAP apresenta um membro da família de alinhamentosótimos. Podem existir vários membros dessa família, masnenhum outro membro possui uma melhor qualidade. GAPapresenta quatro figuras de mérito para alinhamentos:Quality, Ratior Identity, e Similarity. A Quality é amétrica maximizada para alinhar as seqüências. Ratio é aQuality dividida pelo número de bases no segmento maiscurto. Percent Identity é o percentual dos símbolos que defato se correspondem. Percent Similarity é o percentualdos símbolos que são similares. Símbolos que estão atravésdos espaços são ignorados. Uma similaridade é pontuadaquando o valor da matriz de pontuação para um par desímbolos é maior ou igual a 0,50, o limite de similaridade.A matriz de pontuação usada na Versão 10 do pacote desoftware GCG Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62(ver, Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 89:10915).
A menos que declarado de outra forma, valores deidentidade/similaridade de seqüência aqui providos referem-se ao valor obtido usando a suíte de programas BLAST 2.0usando parâmetros padrão (Altschul, et ai., (1997) NucleicAcids Res. 25:3389-402).
Como aqueles de conhecimento ordinário na técnicaentenderão, buscas BLAST assumem que proteínas podem sermodeladas como seqüências aleatórias. Contudo, váriasproteínas reais compreendem regiões de seqüências nãoaleatórias, que podem ser traços homopoliméricos,repetições de período curtas, ou regiões enriquecidas em umou mais aminoácidos. Tais regiões de baixa complexidadepodem ser alinhadas entre proteínas não relacionadas,apesar de outras regiões da proteína serem totalmentedissimilares. Um número de programas de filtro de baixacomplexidade pode ser empregado para reduzir taisalinhamentos de baixa complexidade. Por exemplo, filtrosde baixa complexidade SEG (Wooten and Federhen, (1993)Comput. Chem. 17:149-63) e XNU (Claverie and States, (1993)Comput. Chem. 17:191-201) podem ser empregados sozinhos ouem combinação.
Como aqui usado, "identidade de seqüência", ou"identidade" no contexto de duas seqüências de ácidosnucléicos ou polipeptidicas de polinucleotideos oupolipeptideos, faz referência aos resíduos nas duasseqüências que são a mesma quando alinhadas paracorrespondência máxima sobre uma janela de comparaçãoespecífica. Quando a porcentagem de identidade de seqüênciaé usada em referência a proteínas, é reconhecido queposições de resíduos, que não são idênticos, freqüentementediferem por substituições de aminoácidos conservativas,onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outrosresíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares(e.g., carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam aspropriedades funcionais da molécula. Quando seqüênciasdiferem em substituições conservadas, a identidade deseqüência percentual pode ser ajustada para cima paracorrigir a natureza conservativa da substituição.
Seqüências que diferem por tais substituições conservadassão ditas por ter "similaridade de seqüência" ou"similaridade". Meios de fazer esse ajuste são bemconhecidos daqueles especialistas na técnica. Tipicamente,isso envolve pontuar uma substituição conservada como umaparcial, ao invés de uma falta de correspondência completa,aumentando, dessa forma, a porcentagem de identidade deseqüência. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idênticorecebe uma pontuação de 1 e uma substituição nãoconservativa recebe uma pontuação de zero, uma substituiçãoconservada recebe uma pontuação entre zero e 1. Apontuação de substituições conservadas é calculada, e.g.,de acordo com o algoritmo de Meyers and Miller, (1988)Computer Applic. Biol. Sei. 4:11-17, e.g., comoimplementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, MountainView, Califórnia, USA).
Como aqui usado, "porcentagem de identidade deseqüência" significa o valor determinado comparando-se duasseqüências otimamente alinhadas por uma janela decomparação, caracterizado pelo fato de que a porção daseqüência de polinucleotideos na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (i.e., espaços), secomparada à seqüência referência (que não compreendeadições ou deleções) para alinhamento ótimo das duasseqüências. A porcentagem é calculada determinando-se onúmero de posições nas quais a base de ácido nucléicoidêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambasseqüências para permitir o número de posições comcorrespondência, dividindo o número de posições comcorrespondência pelo número total de posições na janela decomparação, e multiplicando o resultado por 100 paraproduzir a porcentagem de identidade de seqüência.
O termo "identidade substancial" de seqüências depolinucleotídeos significa que um polinucleotídeocompreende uma seqüência que tem entre 50-100% deidentidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 50%de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos60% de identidade de seqüência, preferencialmente pelomenos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, maispreferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmentepelo menos 95%, comparada a uma seqüência referência usandoum dos programas de alinhamento descritos usando parâmetrospadrão. Um especialista na técnica reconhecerá que essesvalores podem ser ajustados apropriadamente para determinara identidade correspondente de proteínas codificadas porduas seqüências de nucleotídeos, levando-se em conta adegeneração de códon, similaridade de aminoácidos,posicionamento de fase de leitura, e similares. Identidadesubstancial de seqüências de aminoácidos para essespropósitos significa, normalmente, identidade de seqüênciaentre 55-100%, preferencialmente pelo menos 55%,preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmentepelo menos 70%, 80%, 90% e mais preferencialmente pelomenos 95%.
Outra indicação de que seqüências de nucleotideos sãosubstancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizamuma à outra sob condições estringentes. A degeneração docódigo genético permite várias substituições de aminoácidosque levam a variedades na seqüência de nucleotideos quecodifica para o mesmo aminoácido, é possível, assim, épossível que a seqüência de DNA poderia codificar o mesmopolipeptídeo mas não hibridiza uma à outra sob condiçõesestringentes. Isso pode ocorrer, e.g., quando uma cópia deum ácido nucléico é criada usando a degeneração de códonmáxima permitida pelo código genético. Uma indicação deque as seqüências de ácidos nucléicos são substancialmenteidênticas é que o polipeptídeo, que o primeiro ácidonucléico codifica, é imunologicamente reativo aopolipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico.
0 termo "identidade substancial", no contexto de umpeptídeo, indica que um peptídeo compreende uma seqüênciacom identidade de seqüência entre 55-100% em relação a umaseqüência referência preferencialmente pelo menos 55% deidentidade de seqüência, preferencialmente 60%preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, maispreferencialmente pelo menos 90% ou 95% de identidade deseqüência em relação à seqüência referência sobre umajanela de comparação especificada. Preferencialmente,alinhamento ótimo é conduzido usando o algoritmo dealinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, supra. Umaindicação de que duas seqüências peptidicas sãosubstancialmente idênticas é que um peptideo éimunologicamente reativo com anticorpos criados contra osegundo peptideo. Assim, um peptideo é substancialmenteidêntico a um segundo peptideo, por exemplo, onde doispeptideos diferem apenas por uma substituição conservada.Além disso, um peptideo pode ser substancialmente idênticoa um segundo peptideo quando eles diferem por uma mudançanão conservativa se o epitopo que o anticorpo reconhece ésubstancialmente idêntico. Peptideos que são
"substancialmente similares" compartilham seqüências comonotado acima exceto aquelas posições de resíduos, que nãosão idênticas, podem diferir por mudanças de aminoácidoconservativas.
A invenção descreve polinucleotídeos e polipeptídeosARGOS. Os novos nucleotídeos e proteínas da invençãopossuem um padrão de expressão que indica que eles regulamo número de células e, assim, desempenham um papelimportante no desenvolvimento vegetal. Os polinucleotideossão expressos em vários tecidos vegetais. Ospolinucleotideos e polipeptideos provêm, assim, umaoportunidade de manipular o desenvolvimento vegetal paraalterar o desenvolvimento de sementes e tecido vegetativo,sincronismo ou composição. Isso pode ser usado para criaruma planta estéril, uma planta sem sementes ou uma plantacom composição de endosperma alterada.
Ácidos nucléicos
A presente invenção provê, inter alia, ácidosnucléicos isolados de RNA, DNA, e análogos e/ou quimerasdesses, compreendendo um polinucleotideo de ARGOS.
A presente invenção também inclui polinucleotideosotimizados para expressão em diferentes organismos. Porexemplo, para expressão do polinucleotideo em uma planta demilho, a seqüência pode ser alterada para contabilizar parapreferências especificas de códon e para alterar o conteúdode GC, como de acordo com Murray, et al, supra. 0 uso decódon em milho para 28 genes de plantas de milho é listadona Tabela 4 de Murray, et al., supra.Os ácidos nucléicos de ARGOS da presente invençãocompreendem polinucleotideos de ARGOS isolados que incluem:
(a) um polinucleotideo codificando umpolipeptideo ARGOS e variantes conservadamentemodificados e polimórficos desses;
(b) um polinucleotideo tendo pelo menos 70% deidentidade de seqüência em relação a polinucleotideosde (a) ou (b) ;
(c) seqüências complementares depolinucleotideos de (a) ou (b).
A seguinte tabela, Tabela 1, lista as identidadesespecificas dos polinucleotideos e polipeptideos aquidescritos.
TABELA 1.
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Construção de Ácidos nucléicosOs ácidos nucléicos isolados da presente invençãopodem ser feitos usando (a) métodos recombinantes padrão,(b) técnicas sintéticas, ou combinações desses. Em algunsavanços, os polinucleotideos da presente invenção serãoclonados, amplificados, ou, ao contrário, construídos apartir de um fungo ou bactéria.
Os ácidos nucléicos podem convenientemente compreenderseqüências além de um polinucleotídeo da presente invenção.Por exemplo, um sítio de multiclonagem compreendendo um oumais sítios de restrição de endonuclease pode ser inseridono ácido nucléico para auxiliar no isolamento dopolinucleotídeo. Ainda, seqüências traduzíveis podem serinseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeotraduzível da presente invenção. Por exemplo, umaseqüência marcadora de hexa-histidina provê um meioconveniente para purificar as proteínas da presenteinvenção. 0 ácido nucléico da presente invençãoexcluindo a seqüência de polinucleotideos - é opcionalmenteum vetor, adaptador, ou ligante para clonagem e/ouexpressão de um polinucleotídeo da presente invenção.Seqüências adicionais podem ser adicionadas para taisseqüências de clonagem e/ou expressão para otimizar suafunção na clonagem e/ou expressão, para auxiliar noisolamento do polinucleotídeo, ou para melhorar aintrodução do polinucleotídeo em uma célula. Tipicamente,o comprimento de um ácido nucléico da presente invençãomenos o comprimento de seu polinucleotídeo da presenteinvenção é de menos de 20 pares de quilobases,freqüentemente de menos de 15 kb, e freqüentemente de menosde 10 kb. O uso de vetores de clonagem, vetores deexpressão, adaptadores, e ligantes é bem conhecido natécnica. Ácidos nucléicos exemplares incluem tais vetorescomo: M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gtlO,lambda gtll, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASHII, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1,SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET,pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI and II, pOPRSVICAT, pOPI3 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pOG44,pOG4 5, pFRTpGAL, pNEOpGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406,pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSlox, e lambdaMOSElox. Vetores opcionais para a presente invençãoincluem, mas não estão limitados a, lambda ZAP II, e pGEX.Para uma descrição de vários ácidos nucléicos ver, e.g.,Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (LaJolla, CA); and, Amersham Life Sciences, Inc, Catalog '97(Arlington Heights, IL).
Métodos sintéticos para construir ácidos nucléicosOs ácidos nucléicos isolados da presente invençãopodem ser também preparados por síntese química direta pormétodos, tais como, o método de fosfotriéster de Narang, etal., (1979) Meth. Enzymol. 68:90-9; o método defosfodiéster de Brown, et al., (1979) Meth. Enzymol.68:109-51; o método de dietilfosforamidita de Beaucage etal., (1981) Tetra. Letts. 22(20):1859-62; o método defosforamidita triéster em fase sólida descrito porBeaucage ,et al., supra, e.g., usando um sintetizadorautomatizado, e.g., como descrito em Needham-VanDevanter,et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-68; e , o métodode suporte sólido de Patente US No. 4.458.066. A síntesequímica geralmente produz um oligonucleotídeo de fitasimples. Este pode ser convertido DNA de dupla-fita porhibridização com uma seqüência complementar ou porpolimerização com uma DNA polimerase usando a fita simplescomo modelo. Um especialista reconhecerá que enquanto asíntese química de DNA é limitada a seqüências de cerca de100 bases, seqüências mais longas podem ser obtidas pelaligação de seqüências mais curtas.
UTRs e Preferência de Códons
Em geral, a eficiência de tradução foi vista por serregulada por elementos de seqüência específicos na região5' não codificadora ou não traduzida (UTR 5' ) do RNA.Motivos de seqüência positivos incluem seqüências consensode iniciação de tradução (Kozak, (1987) Nucleic AcidsRes.15:8125) e a estrutura 5<G> 7 metil GpppG RNA cap(Drummond, et al., (1985) Nucleic Aeids Res. 13:7375).Elementos negativos incluem estruturas stem-loop estáveisintramoleculares UTR 5' (Muesing, et al., (1987) Cell48:691) e seqüências AUG ou quadros de iniciação de leituracurtos precedidos por um AUG apropriado no UTR 5' (Kozak,supra, Rao, et al., (1988) Mol. and Cell. Biol. 8:284).Dessa maneira, a presente invenção provê regiões UTR 5'e/ou 3' para modulação da tradução de seqüênciascodificadoras heterólogas.
Ainda, os segmentos codificando polipeptideos dospolinucleotideos da presente invenção podem ser modificadospara alterar o uso de códons. 0 uso de códons alteradopode ser empregado para alterar a eficiência de traduçãoe/ou para otimizar a seqüência codificadora para expressãoem um hospedeiro desejado ou para otimizar o uso de códonem uma seqüência heteróloga para expressão em milho. 0 usode códon nas regiões codificadoras dos polinucleotideos dapresente invenção pode ser analisado estatisticamenteusando pacotes de software disponíveis comercialmente, taiscomo yyCodon Preferenee" disponibilizado pelo University ofWisconsin Genetics Computer Group. Ver, Devereaux, et al.,(1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395; or MaeVeetor 4.1(Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Assim, a presenteinvenção provê uma característica de freqüência de uso decódons da região codificadora de pelo menos um dospolinucleotídeos da presente invenção. O número depolinucleotídeos (3 nucleotídeos por aminoácido) que podemser usados para determinar uma freqüência de uso de códonspode ser qualquer número inteiro de 3 até o número depolinucleotídeos da presente invenção como aqui provido.Opcionalmente, os polinucleotídeos serão as seqüências decomprimento total. Um número exemplar de seqüências paraanálise estatística pode ser pelo menos 1, 5, 10, 20, 50 ou100.
Embaralhamento de Seqüências
A presente invenção provê métodos para embaralhamentode seqüências usando polinucleotídeos da presente invenção,e composições resultantes desses. 0 embaralhemento deseqüências é descrito na publicação PCT No. W096/19256.Ver também, Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 94:4504-9; e Zhao, et al., (1998) Nature Bioteeh16:258-61. Geralmente, o embaralhamento de seqüênciasprovê meios para gerar bibliotecas de polinucleotídeostendo uma característica desejada, que pode ser selecionadaou rastreada. Bibliotecas de polinucleotídeosrecombinantes são geradas a partir de uma população depolinucleotídeos de seqüência relacionados, que compreendemregiões de seqüência, as quais possuem identidade deseqüência substancial e podem ser homologamenterecombinadas in vitro ou in vivo. A população depolinucleotídeos de seqüência recombinada compreende umasubpopulação de polinucleotídeos que possui característicasdesejadas ou vantajosas e que podem ser selecionadas por ummétodo de seleção ou rastreamento adequado. Ascaracterísticas podem ser qualquer propriedade ou atributocapaz de ser selecionado ou detectado em um sistema derastreamento, e pode incluir propriedades de: uma proteínacodificada, um elemento transcricional, uma seqüênciacontrolando transcrição, processamento de RNA, estabilidadede RNA, conformação de cromatina, tradução, ou outrapropriedade de expressão de um gene ou transgene, umelemento de replicação, um elemento se ligando a proteína,ou similares, tais como qualquer aspecto que confira umapropriedade passível de seleção ou detecção. Em algunsavanços, a característica selecionada será uma Km e/ou Kcatalterada sobre a proteína de tipo selvagem como aquiprovido. Em outros avanços, uma proteína ou polinucleotídeogerado a partir de embaralhamento de seqüências terá umaafinidade de ligação de ligante maior do que opolinucleotídeo de tipo selvagem não embaralhado. Ainda emoutros avanços, uma proteína ou polinucleotídeo gerado apartir de embaralhamento de seqüências terá um pH ótimoalterado se comparado ao polinucleotídeo de tipo selvagemnão embaralhado. 0 aumento em tais propriedades pode serde pelo menos 110%, 120%, 130%, 140% ou mais do que 150% dovalor de tipo selvagem.
Cassetes de expressão recombinantes
A presente invenção provê ainda cassetes de expressãorecombinantes compreendendo um ácido nucléico da presenteinvenção. A seqüência de ácidos nucléicos codificando opolinucleotídeo desejado da presente invenção, por exemplo,um cDNA ou uma seqüência genômica, codificando umpolipeptídeo longo o suficiente para codificar uma proteínaativa da presente invenção, pode ser usado para construirum cassete de expressão recombinante que pode serintroduzido na célula hospedeira desejada. Um cassete deexpressão recombinante compreenderá, tipicamente, umpolinucleotídeo da presente invenção operacionalmenteligado a seqüências reguladoras iniciação de transcriçãoque irão direcionar a transcrição do polinucleotídeo nacélula hospedeira visada, tal como tecidos de uma plantatransformada.
Por exemplo, vetores de expressão em plantas podemincluir (1) um gene vegetal clonado sob controletranscricional de seqüências reguladoras 5' e 3' e (2) ummarcador de seleção dominante. Tais vetores de expressãoem plantas podem conter também, se desejado, uma regiãoreguladora promotora (e.g., uma conferindo expressãoinduzida ou constitutiva, regulada ambientalmente ou pordesenvolvimento, ou especifica/seletiva de célula outecido), um sitio de inicio de transcrição, um sitio deligação de ribossomo, um sinal de processamento de RNA, umsitio de terminação de transcrição, e/ou um sinal depoliadenilação.
Um fragmento promotor vegetal que irá direcionar aexpressão de um polinucleotideo da presente invenção emtodos os tecidos de uma planta regenerada pode serempregado. Tais promotores são aqui referidos comopromotores "constitutivos" e são ativos sob a maioria dascondições ambientais e estados de desenvolvimento oudiferenciação celular. Exemplos de promotoresconstitutivos incluem o promotor 1'- ou 2'- derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor Smas, opromotor de cinamil álcool desidrogenase (Patente US No.5.683.439), o promotor Nos, o promotor de rubisco, opromotor de GRPl-8, o promotor de 35S de vírus de mosaicode couve-flor (CaMV), como descrito em Odell, et al.,(1985) Nature 313:810-2; actina de arroz (McElroy, et al.,(1990) Plant Cell 163-171); ubiquitina (Christensen, etal., (1992) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen, etal., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-89); pEMU (Last, etal., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-8); MAS (Velten, etal., (1984) EMBO J. 3:2723-30); e histona H3 de milho(Lepetit, et al., (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-85; eAtanassvoa, et al., (1992) Plant Journal 2(3):291-300);promotor ALS, como descrito em PCT Application No. WO96/30530; GOS2 (Patente US No. 6.504.083) e outras regiõesde iniciação de transcrição de vários genes vegetaisconhecidos daqueles especialistas. Para a presenteinvenção, ubiquitina é o promotor preferido para expressãoem plantas monocotiledôneas.
Alternativamente, o promotor vegetal pode dirigir aexpressão de um polinucleotídeo da presente invenção em umtecido especifico ou pode estar, ao contrário, sob controleambiental ou de desenvolvimento mais preciso. Taispromotores são referidos aqui como promotores "induzidos"(Rab17, RAD29). Condições ambientais que podem efetuar atranscrição por promotores induzidos incluem ataque depatógenos, condições anaeróbicas, ou a presença de luz.Exemplos de promotores induzidos são o promotor de Adhl,que é induzido por hipoxia ou estresse de frio, o promotorde Hsp70, que é induzido por estresse de calor, e o promotor de PPDK, que é induzido por luz.
Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimentoincluem promotores que iniciam a transcrição apenas, oupreferencialmente, em certos tecidos, tais como folhas, raizes, frutos, sementes, ou flores. A operação de umpromotor pode variar, também, dependendo de sua localizaçãono genoma. Assim, um promotor induzido pode se tornarcompletamente ou parcialmente constitutivo em certaslocalidades.
Se a expressão de polipeptideo é desejada, égeralmente desejável incluir uma região de poliadenilaçãona extremidade 3' de uma região codificadora depolinucleotideo. A região de poliadenilação pode serderivada de uma variedade de genes vegetais, ou de T-DNA.A seqüência de extremidade 3' a ser adicionada pode serderivada de, por exemplo, os genes de nopalina sintase ouoctopina sintase, ou alternativamente de outro genevegetal, ou menos preferencialmente de qualquer outro geneeucarionte. Exemplos de tais elementos reguladoresincluem, mas não estão limitados a, regiões 3' determinação e/ou poliadenilação, tais como aquelas do genede nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (nos)(Bevan, et al., (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); o5 gene inibidor de proteinase II de batata (PINII) (Keil, etal., (1986) Nucleie Aeids Res. 14:5641-50; and An, et al.,(1989) Plant Cell 1:115-22); e o gene de CaMV 19S (Mogen,et al., (1990) Plant Cell 2:1261-72).
Uma seqüência de intron pode ser adicionada à região5' não traduzida ou a seqüência codificadora da seqüênciacodificadora parcial para aumentar a quantidade da mensagemmadura que se acumula no citosol. A inclusão de um intronpassível de sofrer splieing na unidade de transcrição emambas as construções de expressão em vegetal e animal foimostrada por aumentar a expressão gênica em ambos os níveisde mRNA e de proteína até 1000 vezes (Buchman and Berg,(1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis, et al., (1987)Genes Dev. 1:1183-200). Tal intensificação por intron deexpressão gênica é tipicamente máxima quando colocadapróxima da extremidade 5' da unidade de transcrição. O usode íntrons Adhl-S de milho intron 1, 2, e 6, o intronBronze-I é conhecido na técnica. Ver geralmente, THE MAIZEHANDBOOK, Chapter 116, Freeling and Walbot, eds., Springer,New York (1994).Seqüências sinal de vegetais, incluindo, mas não selimitando a, peptideo sinal codificando seqüências deDNA/RNA que direcionam proteínas para a matriz extracelularda célula vegetal (Dratewka-Kos, et al., (1989) J. Biol.Chem. 264:4896-900), tal como o gene de extensão deNicotiana plumbaginifolia (DeLoose, et al., (1991) Gene99:95-100); peptídeos sinal que direcionam proteínas para ovacúolo, tais como o gene de esporamina de batata-doce(Matsuka, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:834)e o gene de lectina de cevada (Wilkins, et al., (1990)Plant Cell, 2:301-13); peptídeos sinal que fazem com queproteínas seja secretadas, tais como aquele de PRIb (Lind,et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:47-53) ou alfa-amilasede cevada (BAA) (Rahmatullah, et al., (1989) Plant Mol.Biol. 12:119, e, aqui incorporados por referência), oupeptídeos sinal que direcionam proteínas para osplastídios, tais como aquele de enoil-Acp redutase debrássicas (Verwaert, et al., (1994) Plant Mol. Biol.26:189-202) são úteis na invenção. A seqüência sinal dealfa-amilase de cevada fusionada ao polinucleotídeo ARGOS éa construção preferida para expressão em milho para apresente invenção.O vetor compreendendo as seqüências de umpolinucleotideo da presente invenção compreenderá,tipicamente, um gene marcador, que confere um fenótiposelecionável em células vegetais. Usualmente, o genemarcador de seleção codificará resistência a antibióticos,com genes adequados incluindo genes codificando resistênciaao antibiótico espectinomicina (e.g., o gene aada), o genede estreptomicina fosfotransferase (SPT) codificandoresistência a estreptomicina, o gene de neomicinafosfotransferase (NPTII) codificando resistência acanamicina ou geneticina, o gene de higromicinafosfotransferase (HPT) codificando resistência ahigromicina, genes codificando resistência a herbicidas queatuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS), emparticular os herbicidas do tipo sulfoniluréia (e.g., ogene de acetolactato sintase (ALS) contendo mutaçõeslevando a tal resistência em particular as mutações S4 e/ouHra), genes codificando resistência a herbicidas que atuampara inibir a ação de glutamina sintase, tais comofosfinotricina ou basta (e.g., o gene bar), ou outros genesconhecidos na técnica. 0 gene bar codifica resistência aoherbicida basta, e o gene ALS gene codifica resistência aoherbicida clorsulfuron.Vetores típicos úteis para expressão de genes emplantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluemvetores derivados do plasmídeo indutor de tumor (Ti) deAgrobacterium tumefaciens descrito por Rogers, et al.,(1987) Meth . Enzymol. 153:253-77. Aqueles vetores sãovetores vegetais integradores já que, em transformação, osvetores integram uma porção de DNA vetor no genoma daplanta hospedeira. Vetores exemplares de A. tumefaciensúteis aqui são os plasmídeos pKYLX6 e pKYLX7 de Schardl, etal., (1987) Gene 61:1-11, e Berger, et al., (1989) Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 86:8402-6. Outro vetor útil aqui é oplasmídeo pBI101.2 que está disponível pela CLONTECHLaboratories, Inc. (Paio Alto, CA).
Expressão de Proteínas em Células hospedeiras
Usando os ácidos nucléicos da presente invenção, pode-se expressar uma proteína da presente invenção em umacélula construída de forma recombinante, tal comobactérias, leveduras, células de insetos, de mamíferos, oupreferencialmente células vegetais. As células produzem aproteína em uma condição não natural (e.g., em quantidade,composição, localização, e/ou tempo), pois elas foramgeneticamente alteradas através de intervenção humana parafazerem isto.É esperado que aqueles especialistas na técnica sejamconhecedores de numerosos sistemas de expressão disponíveispara expressão de um ácido nucléico codificando umaproteína da presente invenção. Nenhuma tentativa dedescrever em detalhes os vários métodos conhecidos para aexpressão de proteínas em procariontes ou eucariontes seráfeita.
Resumidamente, a expressão de ácidos nucléicosisolados codificando uma proteína da presente invenção serátipicamente alcançada ligando-se operacionalmente, porexemplo, o DNA ou cDNA a um promotor (que é tantoconstitutivo ou induzido), seguido por incorporação em umvetor de expressão. Os vetores podem ser adequados parareplicação e integração tanto em procariontes oueucariontes. Vetores de expressão típicos contêmseqüências terminadoras, de iniciação de transcrição etradução, e promotores úteis para a regulação da expressãodo DNA codificando uma proteína da presente invenção. Paraobter um nível elevado de expressão de um gene clonado, édesejável construir vetores de expressão que contêm, nomínimo, um promotor forte, tal como ubiquitina, paradirecionar a transcrição, um sítio de ligação de ribossomopara iniciação de tradução, e um terminador de transcrição/tradução. Promotores constitutivos são classificados comoprovendo uma amplitude de expressão constitutiva. Assim,alguns são promotores constitutivos fracos, e outros sãopromotores constitutivos fortes. Geralmente, por "promotorfraco" pretende-se um promotor que dirige a expressão deuma seqüência codificadora em nível baixo. Por "nívelbaixo" pretende-se em níveis de cerca de 1/10.000transcritos até cerca de 1/100.000 transcritos até cerca de1/500.000 transcritos. Conseqüentemente, um "promotorforte" dirige a expressão de uma seqüência codificadora emum "nível elevado", ou cerca de 1/10 transcritos até cercade 1/100 transcritos até cerca de 1/1.000 transcritos.
Um especialista reconheceria que modificações poderiamser feitas a uma proteína da presente invenção sem diminuirsua atividade biológica. Algumas modificações podem serfeitas para facilitar a clonagem, expressão, ouincorporação da molécula alvo em uma proteína de fusão.Tais modificações são bem conhecidas daqueles especialistasna técnica e incluem, por exemplo, uma metionina adicionadano amino-terminal para prover um sítio de iniciação, ouaminoácidos adicionais (e.g., poli His) colocados emqualquer dos terminais para criar sítios de restrição, oucódons de terminação, ou seqüências de purificação,convenientemente localizados.Expressão em procariontes
Células procariontes podem ser usadas como hospedeirospara expressão. Procariontes mais freqüentemente sãorepresentados por várias linhagens de E. coli; contudo,outras linhagens microbianas podem ser também usadas.Seqüências controle procariontes comumente usadas que sãoaqui definidas para incluir promotores para iniciação detranscrição, opcionalmente com um operador, junto comseqüências de sitio de ligação de ribossomos, incluem taispromotores comumente usados, como os sistemas promotores debeta lactamase (penicilinase) e lactose (Iac) (Chang, etal., (1977) Nature 198:1056), o sistema promotor detriptofano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic AcidsRes. 8:4057) e o promotor P L lambda derivado e sitio deligação de ribossomo de gene N (Shimatake, et al., (1981)Nature 292:128). A inclusão de marcadores de seleção emvetores de DNA transfectados em E. coli é também útil.Exemplos de tais marcadores incluem genes especificandoresistência a ampicilina, tetraciclina, ou cloranfenicol.
O vetor é selecionado para permitir a introdução dogene de interesse na célula hospedeira apropriada. Vetoresbacterianos são tipicamente de origem de plasmideo ou fago.Células bacterianas apropriadas são infectadas compartículas de vetor de fago ou transfectadas com DNA devetor de fago sem histonas. Se um vetor de plasmídeo éusado, as células bacterianas são transfectadas com o DNAde vetor de plasmídeo. Sistemas de expressão paraexpressar uma proteína da presente invenção estãodisponíveis usando Bacillus sp. e Salmonella (Paiva, etal., (1983) Gene 22:229-35; Mosbach, et al., (1983) Nature302:543-5). O vetor de plasmídeo pGEX-4T-l da Pharmacia éo vetor de expressão de E. coli preferido para a presenteinvenção.
Expressão em eucariontes
Uma variedade de sistemas de expressão eucariontes,tais como leveduras, linhagens de células de insetos,células vegetais e de mamíferos, são conhecidos daquelesespecialistas na técnica. Como resumidamente explicadoabaixo, a presente invenção pode ser expressa nessessistemas eucariontes. Em alguns avanços, células vegetaistransformadas/transfectadas, como discutido infra, sãoempregadas como sistemas de expressão para a produção dasproteínas da atual invenção.A síntese de proteínas heterólogas em leveduras é bemconhecida. Sherman, et al., (1982) METHODS IN YEASTGENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory é um trabalho bemreconhecido descrevendo os vários métodos disponíveis paraproduzir a proteína em leveduras. Duas leveduras
amplamente utilizadas para a produção de proteínaseucariontes são Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.Vetores, linhagens, e protocolos para expressão emSaceharomyces e Piehia são conhecidos na técnica edisponibilizados por fornecedores comerciais (e.g.,Invitrogen). Vetores adequados usualmente possuemseqüências de controle de expressão, tais como promotores,incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou álcool oxidase, e umaorigem de replicação, seqüências de terminação e similares,como desejado.
Uma proteína da presente invenção, uma vez expressa,pode ser isolada a partir de leveduras lisando-se ascélulas e aplicando-se técnicas padrão de isolamento deproteínas para os lisados ou as pelotas. O monitoramentodo processo de purificação pode ser conseguido usando-setécnica de Western blot ou radioimuno-ensaios de outrastécnicas padrão de imunoensaios.
As seqüências codificando proteínas da presenteinvenção podem ser também ligadas a vários vetores deexpressão para uso em culturas de células de transfecção,por exemplo, de origem de mamíferos, insetos, ou vegetal.Sistemas de células de mamíferos freqüentemente serão naforma de monocamadas de células, apesar de que suspensõesde células de mamíferos poderem ser também usadas.Numerosas linhagens de células hospedeiras adequadascapazes de expressar proteínas intactas foram desenvolvidasna técnica, e incluem as linhagens de células HEK293,BHK21, e CHO. Vetores de expressão para essas célulaspodem incluir seqüências de controle de expressão, taiscomo uma origem de replicação, um promotor (e.g., opromotor CMV, um promotor HSV tk ou pgk (f osf ogliceratoquinase) promotor), um intensificador (Queen, et al.,(1986) Immunol. Rev. 89:49), e sítios processadores deinformação necessários, tais como sítios de ligação deribossomos, sítios de splice de RNA, sítios depoliadenilação (e.g., um sítio de adição SV40 T Ag poli Agrande), e seqüências terminadoras de transcrição. Outrascélulas animais úteis para produção de proteínas dapresente invenção são disponibilizadas, por exemplo, pelocatálogo American Type Culture Collection Catalogue of CellLines and Hybridomas (7th ed., 1992)..
Vetores apropriados para expressar proteínas dapresente invenção em células de insetos são usualmentederivados de bacilovirus SF9. Linhagens de células deinsetos adequadas incluem linhagens de células larvas demosquito, bicho da seda, larva de traça, traça, eDrosophila, tais como uma linha de células de Schneider(ver, e.g., Schneider, (1987) J. Embryol. Exp. Morphol.27:353-65).
Como com leveduras, quando células hospedeiras deanimais ou plantas superiores são empregadas, seqüências depoliadenilação ou terminadoras de transcrição sãotipicamente incorporadas no vetor. Um exemplo de umaseqüência terminadora é a seqüência de poliadenilação degene de hormônio de crescimento bovino. Seqüências prasplicing acurado do transcrito pode ser também incluídas.Um exemplo de uma seqüência de splicing é o íntron VPl deSV40 (Sprague, et al.f (1983) J. Virol. 45:773-81).Adicionalmente, seqüências gênicas para controlar areplicação na célula hospedeira podem ser incorporadas novetor, tal como aquelas encontradas em vetores tipo vírusde papiloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papilloma VirusDNA a Eukaryotic Cloning Vector," in DNA CLONING: APRACTICAL APPROACH, vol. II, Glover, ed., IRL Press,Arlington, VA, pp. 213-38 (1985)).
Além disso, o gene para ARGOS colocado no vetor deexpressão vegetal apropriado pode ser usado paratransformar células vegetais. 0 polipeptideo pode ser,então, isolado a partir de calos vegetais ou as célulastransformadas podem ser usadas para regenerar plantastransgênicas. Tais plantas transgênicas podem ser
colhidas, e os tecidos apropriados (sementes ou folhas, porexemplo) podem ser sujeitos a técnicas de extração epurificação de proteína de larga escala.
Métodos de Transformação Vegetal
Numerosos métodos para introduzir genes estrangeirosem plantas são conhecidos e podem ser usados para inserirum polinucleotídeo ARGOS em um hospedeiro vegetal,incluindo protocolos de transformação vegetal biológicos efísicos. Ver, e.g., Miki, et a_Z., "Procedure forIntroducing Foreign DNA into Plants," in METHODS IN PLANTMOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick and Thompson,eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993). Osmétodos escolhidos variam com a planta hospedeira, eincluem métodos de transfecção química, tal como fosfato decálcio, transferência de genes mediada por microorganismo,tal como Agrobacterium (Horsch, et al., (1985) Science227:1229-31), eletroporação, microinjeção, e bombardeamentobiolístico.Cassetes de expressão e vetores e métodos de culturain vitro para transformação de célula ou tecido vegetal eregeneração de plantas são conhecidos e estão disponíveis.Ver, e.g., Gruber, et al., "Vectors for PlantTransformation, " in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY, supra, pp. 89-119.
Os polinucleotídeos ou polipeptídeos isolados podemser introduzidos na planta por uma ou mais técnicastipicamente usadas para liberação direta em células. Taisprotocolos podem variar dependendo do tipo de organismo,célula, planta ou célula vegetal, i.e., monocotiledônea oudicotiledônea, visada para modificação gênica. Métodosadequados de transformar células vegetais incluemmicroinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334; e U.S. Patent 6.300.543), eletroporação (Riggs, etal., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606,transferência direta de gene (Paszkowski, et al., (1984)EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração balística de partículas(ver, por exemplo, Sanf ord, et al., U.S. Patent No.4.945.050; WO 91/10725; e McCabe, et al., (1988)Biotechnology 6:923-926). Também ver, Tomes, et al.,Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells ViaMicroprojectile Bombardment. pp.197-213 in Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods eds. 0. L.Gamborg & G.C. Phillips, Springer-Verlag Berlin HeidelbergNew York, 1995; U.S. Patent 5.736.369 (meristema);Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477;Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology5:27-37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol.87:671-674 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc..Natl. Acad.Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein, et al., (1988)Biotechnology 6:559-563 (milho); WO 91/10725 (milho);Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho);Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839; e Gordon-Kamm, et al., (1990) Plant Cell 2:603-618 (milho);Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (London)311:763-764; Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet, et al., (1985)In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P.Chapman, et al., pp. 197-209; Longman, NY (pólen);Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; eKaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566(transformação mediada por fios de carbeto de silício);U.S. Patent No. 5.693.512 (sonicação); D'Halluin, et al.,(1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li, et al.,(1993) Plant Cell Reports 12:250-255; e Christou and Ford(1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al.,(1996) Nature Biotech. 14:745-750; transformação de milhomediada por Agrobacterium (U.S. Patent 5.981.840); métodosde fios de carbeto de silício (Frame, et al., (1994) PlantJ. 6:941-948); métodos a laser (Guo, et al., (1995)Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos de sonicação (Bao,et al., (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959;Finer and Finer (2000) Lett Appl Microbiol. 30:406-10;Amoah, et al., (2001) J Exp Bot 52:1135-42); métodos depolietileno glicol (Krens, et al., (1982) Nature 296:72-77); protoplastos de células de monocotiledôneas edicotiledôneas podem ser transformados usando eletroporação(Fromm, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824-5828) e microinjeção (Crossway, et al., (1986) Mol. Gen.Genet. 202:179-185); todos os quais são aqui incorporadospor referência.
Transformação mediada por Agrobacterium
O método, mais amplamente utilizado para introduzir umvetor de expressão em plantas é baseado no sistema detransformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e
A. rhizogenes são bactérias de solo patogênicas de plantas,que transformam geneticamente células vegetais. Osplasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes,respectivamente, carregam genes responsáveis pelatransformação genética de plantas. Ver, e.g., Kado, (1991)Crit. Rev. Plant Sei. 10:1. Descrições dos sistemasvetores de Agrobacterium e métodos para transferência degene mediada por Agrobacterium são providos em Gruber, etal., supra; Miki, et al., supra; and Moloney, et al.,(1989) Plant Cell Reports 8:238.
Similarmente, o gene pode ser inserido na região T-DNAde um plasmideo Ti ou Ri derivado de A. tumefaciens ou A.rhizogenes, respectivamente. Assim, cassetes de expressãopodem ser construídos como acima, usando esses plasmídeos.
Várias seqüências controle são conhecidas, as quais, quandocombinadas com uma seqüência codificadora heteróloga etransformadas em um organismo hospedeiro, apresentamfidelidade em expressão gênica em relação a especificidadede tecido/órgão da seqüência codificadora original. Ver,e.g., Benfey and Chua, (1989) Science 244:174-81.Particularmente seqüências controle adequadas para usonesses plasmídeos são promotores para expressãoconstitutiva específica de folha do gene nas várias plantasalvo. Outras seqüências controle úteis incluem um promotore um terminador do gene de nopalina sintase (NOS). Opromotor e terminador de NOS estão presentes no plasmideopARC2, disponibilizado pela American Type CultureCollection e designado ATCC 67238. Se tal sistema é usado,o gene de virulência (vir) tanto do plasmideo Ti ou Ridevem estar também presentes, tanto junto com a porção T-DNA, ou via um sistema binário aonde o gene vir estápresente em um vetor separado. Tais sistemas, vetores parauso desta forma, e métodos de transformar células vegetaissão descritos na patente US No. 4.658.082; Pedido depatente US No. 913.914, preenchida em Io de outubro de1986, como referenciado na Patente US No. 5.262.306,emitida em 16 de novembro de 1993; e Simpson, et al.,(1986) Plant Mol. Biol. 6:403-15 (também referenciado napatente '306); todas incorporadas por referência em suaintegra.
Uma vez construídos, esses plasmídeos podem sercolocados em A. rhizogenes ou A. tumefaciens e essesvetores usados para transformar células de espéciesvegetais, as quais são ordinariamente suscetíveis ainfecção por Fusarium ou Alternaria. Diversas outrasplantas transgênicas são também contempladas pela presenteinvenção incluindo, mas não se limitando a, soja, milho,sorgo, alfafa, arroz trevo, repolho, banana, café, aipo,tabaco, caupi, algodão, melão e pimenta. A seleção tantode A. tumefaciens ou A. rhizogenes dependerá da plantasendo transformado dessa forma. Em geral, A. tumefaciens éo organismo preferido para transformação. A maioria dasplantas dicotiledôneas, algumas gimnospermas e algumaspoucas plantas monocotiledôneas (e.g., certos membros deLiliales e Arales) são suscetíveis a infecção com A.tumefaciens. A. rhizogenes também possui uma amplavariedade de hospedeiros, abrangendo a maioria dasdicotiledôneas e algumas gimnospermas, o que inclui membrosdas Leguminosaer Compositae, e Chenopodiaceae. Plantasmonocotiledôneas podem ser agora transformadas com algumsucesso. 0 pedido de patente européia No. 604 662 Aldescreve um método para transformar monocotiledôneas usandoAgrobacterium. O pedido de patente européia No. 672 752 Aldescreve um método para transformar monocotiledôneas comAgrobacterium usando o escutelo de embriões imaturos.Ishida, et al., discutem um método para transformar milhoexpondo embriões imaturos a A. tumefaciens {NatureBiotechnology 14:745-50 (1996)).
Uma vez transformadas, essas células podem ser usadaspara regenerar plantas transgênicas. Por exemplo, plantasinteiras podem ser infectadas com esses vetores ferindo aplanta e, então, introduzindo o vetor no local doferimento. Qualquer parte da planta pode ser ferida,incluindo folhas, caules e raízes. Alternativamente,tecido vegetal, na forma de um explante, tal como tecidodos cotilédones ou discos foliares, pode ser inoculado comesses vetores, e cultivado sob condições que promove aregeneração vegetal. Raízes ou brotos transformados porinoculação de tecido vegetal com A. rhizogenes ou A.tumefaciens, contendo o gene codificando a enzima dedegradação de fumonisina, podem ser usados como fonte detecido vegetal para regenerar plantas transgênicasresistentes a fumonisina, tanto via embriogênese somáticaou organogênese. Exemplos de tais métodos para regenerartecido vegetal são descritos em Shahin, Theor. Appl. Genet.69:235-40 (1985); Patente US No. 4.658.082; Simpson, etal., supra; e Pedido de patente US Nos. 913.913 e 913.914,ambas preenchidas em Io de outubro de 1986, comoreferenciado em Patente US No. 5.262.306, emitida em 16 denovembro de 1993, todas as descrições dessas incorporadasaqui por referência.
Transferência Direta de Gene
Apesar do fato de que a variedade de hospedeiros paratransformação mediada por Agrobacterium ser ampla, algumasprincipais espécies de culturas e gimnospermas foramgeralmente recalcitrantes a esse modo de transferência degenes, apesar de que algum sucesso ter sido recentementealcançado em arroz (Hiei, et al., (1994) The Plant Journal6:271-82). Diversos métodos de transformação vegetal,coletivamente referidos como transferência direta de gene,foram desenvolvidos como uma alternativa para transformaçãomediada por Agrobacterium.
Um método geralmente aplicável de transformaçãovegetal é a transformação mediada por microprojétil, ondeDNA é carregado na superfície de microprojéteis medindocerca de 1 a 4 pm. 0 vetor de expressão é introduzido emtecidos vegetais com um dispositivo biolístico que aceleraos microprojéteis a velocidades de 300 a 600 m/s, o que ésuficiente para penetrar as paredes e membranas celularesde células vegetais (Sanford, et al., (1987) Part. Sei.Technol. 5:27; Sanford, (1988) Trends Biotech 6:299;Sanford, (1990) Physiol. Plant 79:206; and Klein, et al.,(1992) Biotechnology 10:268).
Outro método para liberação de DNA para plantas é asonicação de células alvo como descrito em Zang, et al.,(1991) BioTechnology 9:996. Alternativamente, fusões delipossomos ou esferoplastos foram usadas para introduzirvetores de expressão em plantas. Ver, e.g., Deshayes, etal., (1985) EMBO J. 4:2731; e Christou, et al., (1987)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3962. A absorção direta deDNA em protoplastos usando precipitação de CaCl2, álcoolpolivinil, ou poli-L-ornitina, foi também relatada. Ver,e. g., Hain, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161; eDraper, et al., (1982) Plant Cell Physiol. 23:451.
A eletroporação de protoplastos e células e tecidosinteiros foi também descrita. Ver, e.g., Donn, et al.,(1990) in Abstracts of the VIIth IntfI. Congress on PlantCell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53; D'Halluin, etal., (1992) Plant Cell 4:1495-505; e Spencer, et al.,(1994) Plant Mol. Biol. 24:51-61.
Aumentando a atividade e/ou nivel de um polipeptideo ARGOS
Métodos são providos para aumentar a atividade e/ounivel do polipeptideo ARGOS da invenção. Um aumento nonivel e/ou atividade do polipeptideo ARGOS da invenção podeser conseguido fornecendo à planta um polipeptideo ARGOS.0 polipeptideo ARGOS pode ser provido introduzindo aseqüência de aminoácidos codificando o polipeptideo ARGOSna planta, introduzindo na planta uma seqüência de nucleotideos codificando um polipeptideo ARGOS oualternativamente modificando um lócus genômico codificandoo polipeptideo ARGOS da invenção.
Como aqui discutido em outra parte, vários métodos sãoconhecidos na técnica para prover um polipeptideo a umaplanta incluindo, mas não se limitando a, introdução diretado polipeptideo na planta, introduzindo na planta(transientemente ou estavelmente) uma construção depolinucleotideo codificando um polipeptideo tendo atividadereguladora de número de células. É também reconhecido queos métodos da invenção podem empregar um polinucleotideoque não é capaz de dirigir, na planta transformada, aexpressão de uma proteína ou um RNA. Assim, o nível e/ouatividade de um polipeptideo ARGOS pode ser aumentadoalterando-se o gene codificando o polipeptideo ARGOS ou seupromotor. Ver, e.g., Kmiec, U.S. Patent 5.565.350;Zarling, et al., PCT/US93/03868. Portanto, são providasplantas mutagenizadas que carregam mutações em genes ARGOS,onde as mutações aumentam a expressão do gene ARGOS ouaumenta a atividade de crescimento vegetal e/oudesenvolvimento de órgão do polipeptideo ARGOS codificado.
Reduzindo a atividade e/ou nível de um polipeptideo ARGOS
Métodos são providos para reduzir ou eliminar aatividade de um polipeptideo ARGOS da invençãotransformando uma célula vegetal com um cassete deexpressão que expressa um polinucleotideo que inibe aexpressão do polipeptideo ARGOS. 0 polinucleotideo podeinibir a expressão do polipeptideo ARGOS diretamenteprevenindo a tradução do RNA mensageiro de ARGOS, ouindiretamente codificando um polipeptideo que inibe atranscrição ou tradução de um gene ARGOS codificando umpolipeptideo ARGOS. Métodos para inibir ou eliminar aexpressão de um gene em uma planta são bem conhecidos natécnica, e qualquer tal método pode ser usado na presenteinvenção para inibir a expressão de um polipeptideo ARGOS.
De acordo com a presente invenção, a expressão de umpolipeptideo ARGOS é inibida se o nivel de proteína dopolipeptideo ARGOS é menos do que 70% do nível de proteínado mesmo polipeptideo ARGOS em uma planta que não foigeneticamente modificada ou mutagenizada para inibir aexpressão daquele polipeptideo ARGOS. Em avanços dainvenção em particular, o nível de proteína do polipeptideoARGOS em uma planta modificada de acordo com a invenção éde menos de 60%, menos de 50%, menos de 4 0%, menos de 30%,menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% donível de proteína do mesmo polipeptideo ARGOS em uma plantaque não é uma mutante ou que não foi geneticamentemodificada para inibir a expressão daquele polipeptideoARGOS. 0 nível de expressão do polipeptideo ARGOS pode sermedido diretamente, por exemplo, testando o nível depolipeptideo ARGOS expresso na célula vegetal ou planta, ouindiretamente, por exemplo, medindo a atividade decrescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão dopolipeptideo ARGOS na célula vegetal ou planta, ou medindoa biomassa na planta. Métodos para efetuar tais testes sãoaqui descritos em outra parte.
Em outros avanços da invenção, a atividade dospolipeptideos ARGOS é reduzida ou eliminada transformandouma célula vegetal com um cassete de expressãocompreendendo um polinucleotideo codificando umpolipeptideo que inibe a atividade de um polipeptideoARGOS. A atividade de crescimento vegetal e/ou
desenvolvimento de órgão de um polipeptideo ARGOS é inibidade acordo com a presente invenção de a atividade decrescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão dopolipeptideo ARGOS é menos do que 70% da atividade decrescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão do mesmopolipeptideo ARGOS em uma planta que não foi modificadapara inibir a atividade de crescimento vegetal e/oudesenvolvimento de órgão daquele polipeptideo ARGOS. Emavanços particulares da invenção, a atividade decrescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão dopolipeptideo ARGOS em uma planta modificada de acordo com ainvenção é de menos do que 60%, menos do que 50%, menos doque 40%, menos do que 30%, menos do que 20%, menos do que10%, ou menos do que 5% da atividade de crescimento vegetale/ou desenvolvimento de órgão do mesmo polipeptídeo ARGOSem uma planta que não foi modificada para inibir aexpressão daquele polipeptídeo ARGOS. A atividade decrescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão de umpolipeptídeo ARGOS é "eliminada" de acordo com a invençãoquando não é detectável pelos métodos de teste aquidescritos em outra parte. Métodos de determinar aatividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento deórgão de um polipeptídeo ARGOS são aqui descritos em outraparte.
Em outros avanços, a atividade de um polipeptídeoARGOS pode ser reduzida ou eliminada rompendo-se o genecodificando o polipeptídeo ARGOS. A invenção englobaplantas mutagenizadas que carregam mutações em genes ARGOS,onde as mutações reduzem a expressão do gene ARGOS ouinibem a atividade de crescimento vegetal e/oudesenvolvimento de órgão do polipeptídeo ARGOS codificado.
Assim, vários métodos podem ser usados para reduzir oueliminar a atividade de um polipeptídeo ARGOS. Além disso,mais de um método pode ser usado para reduzir a atividadede um único polipeptídeo ARGOS. Exemplos não limitantes demétodos de reduzir ou eliminar a expressão de polipeptídeosARGOS são dados abaixo.1. Métodos Baseados em Polinucleotídeos:
Em alguns avanços da presente invenção, uma planta étransformada com um cassete de expressão que é capaz deexpressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de umpolipeptideo ARGOS da invenção. 0 termo "expressão", comoaqui usado, refere-se à biossintese de um produto gênico,incluindo a transcrição e/ou tradução de dito produtogênico. Por exemplo, para os propósitos da presenteinvenção, um cassete de expressão capaz de expressar umpolinucleotídeo que inibe a expressão de pelo menos umpolipeptideo ARGOS é um cassete de expressão capaz deproduzir uma molécula de RNA que inibe a transcrição e/outradução de pelo menos um polipeptideo ARGOS da invenção.A "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptideoa partir de uma molécula de DNA refere-se à transcrição etradução da seqüência codificadora para produzir a proteínaou polipeptideo, enquanto que "expressão" ou "produção" deuma proteína ou polipeptideo a partir de uma molécula deRNA refere-se à tradução da seqüência de RNA codificadorapara produzir a proteína ou polipeptideo.
Exemplos de polinucleotídeos que inibem a expressão deum polipeptideo ARGOS são dados abaixo.i. Supressão/Co-supressão senso
Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode um polipeptídeo ARGOS pode ser obtida por supressão ouco-supressão senso. Para co-supressão, um cassete deexpressão é projetado para expressar uma molécula de RNAcorrespondendo a todo ou parte de um RNA mensageirocodificando um polipeptídeo ARGOS na orientação "senso". Asuper-expressão da molécula de RNA pode resultar emexpressão reduzida do gene nativo. Dessa maneira,
múltiplas linhas vegetais transformadas com o cassete deexpressão de co-supressão são rastreadas para seidentificar aquelas que apresentam a maior inibição deexpressão de polipeptídeo ARGOS.
O polinucleotídeo usado para co-supressão podecorresponder a toda ou parte da seqüência codificando opolipeptídeo ARGOS, toda ou parte da região não traduzida5' e/ou 3' de um transcrito de polipeptídeo ARGOS, ou todaou parte de ambas seqüência codificadora e regiões nãotraduzidas de um transcrito codificando um polipeptídeoARGOS. Em alguns avanços onde o polinucleotídeo compreendetoda ou parte da região codificadora para o polipeptídeoARGOS, o cassete de expressão é projetado para eliminar ocódon de iniciação do polinucleotideo de forma que nenhumproduto de proteína seja traduzido.
Co-supressão pode ser usada para inibir a expressão degenes vegetais para produzir plantas tendo níveis proteínaindetectáveis para as proteínas codificadas por essesgenes. Ver, por exemplo, Broin, et al., (2002) Plant Cell14:1417-1432. A co-supressão pode ser também usada parainibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta.Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5.942.657. Métodos parausar co-supressão para inibir a expressão de genesendógenos em plantas são descritos em Flavell, et al.,(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:34 90-34 96; Jorgensen,et al., (1996) Plant 'Mol. Biol. 31: 957-973; Johansen andCarrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin, etal., (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk, et al.,(2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu, et al., (2003)Phytochemistry 63:753-763; e U.S. Patent Nos. 5.034.323,5.283.184, e 5.942.657; cada qual é aqui incorporada porreferência. A eficiência de co-supressão pode seraumentada incluindo uma região poli-dT no cassete deexpressão na posição 3' em relação à seqüência senso e 5'do sinal de poliadenilação. Ver, U.S. Patent PublicationNo. 20020048814, aqui incorporada por referência.Tipicamente, tal seqüência de nucleotídeos possuiidentidade de seqüência substancial em relação à seqüênciado transcrito do gene endógeno, otimamente maior do quecerca de 65% de identidade de seqüência, mais otimamentemaior do que cerca de 85% de identidade de seqüência,otimamente maior do que cerca de 95% de identidade deseqüência. Ver U.S. Patent Nos. 5.283.184 e 5.034.323;aqui incorporadas por referência.
ii. Supressão Anti-senso
Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãodo polipeptideo ARGOS pode ser obtida por supressão anti-senso. Para supressão anti-senso, o cassete de expressão éprojetado para expressar uma molécula de RNA complementar atodo ou parte de um RNA mensageiro codificando opolipeptideo ARGOS. Super-expressão da molécula de RNAanti-senso pode resultar em expressão reduzida do genenativo. Dessa maneira, múltiplas linhas vegetais com ocassete de expressão de supressão anti-senso são rastreadaspara se identificar aqueles que apresentam a maior inibiçãode expressão de polipeptideo ARGOS.
O polinucleotideo para uso em . supressão anti-sensopode corresponder a todo ou parte do complemento daseqüência codificando o polipeptideo ARGOS, todo ou partedo complemento da região não traduzida 5' e/ou 3' dotranscrito ARGOS, ou todo ou parte do complemento de ambasseqüência codificadora e regiões não traduzidas de umtranscrito codificando o polipeptideo ARGOS. Além disso, opolinucleotideo anti-senso pode ser totalmente complementar(i.e., 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) ouparcialmente complementar (i.e., menos de 100% idêntico aocomplemento da seqüência alvo) em relação à seqüência alvo.Supressão anti-senso pode ser usada para inibir a expressãode múltiplas proteínas na mesma planta. Ver, por exemplo,U.S. Patent No. 5.942.657. Adicionalmente, porções dosnucleotídeos anti-senso podem ser usadas para romper aexpressão do gene alvo. Geralmente, seqüências de pelomenos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos,300, 400, 450, 500, 550 ou maiores podem ser usadas.Métodos para usar supressão anti-senso para inibir aexpressão de genes endógenos em plantas são descritos, porexemplo, em Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e U.S. Patent Nos. 5.759.829 e 5.942.657, cada qual éaqui incorporada por referência. A eficiência de supressãoanti-senso pode ser aumentada incluindo uma região poli-dTno cassete de expressão em uma posição 3' em relação àseqüência anti-senso e 51 do sinal de poliadenilação. Ver,U.S. Patent Publication No. 20020048814, aqui incorporadapor referência.iii. Interferência de RNA de Dupla-Fita
Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode um polipeptideo ARGOS pode ser obtida por interferênciade RNA de dupla-fita (dsRNA). Para interferência de dsRNA,uma molécula de RNA senso como aquela descrita acima paraco-supressão e uma molécula de RNA anti-senso, que étotalmente ou parcialmente complementar à molécula de RNAsenso, são expressas na mesma célula, resultando eminibição da expressão do RNA mensageiro endógenocorrespondente.
A expressão das moléculas senso e anti-senso pode serconseguida projetando o cassete de expressão paracompreender tanto uma seqüência senso e uma seqüência anti-senso. Alternativamente, cassetes de expressão separadospodem ser usados para as seqüências senso e anti-senso.Múltiplas linhas vegetais transformadas com o cassete deexpressão de interferência de dsRNA, ou cassetes deexpressão, são, então, rastreadas para se identificarlinhas vegetais que apresentam a maior inibição deexpressão de polipeptideo ARGOS. Métodos para usarinterferência de dsRNA para inibir a expressão de genesvegetais endógenos são descritos em Waterhouse, et al.,(1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13959-13964, Liuf etal., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743, e WO 99/49029, WO99/53050, WO 99/61631, e WO 00/49035; cada qual é aquiincorporada por referência.
iv. Interferência de RNA Hairpin e Interferênciade RNA Hairpin Contendo íntron
Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode um polipeptideo ARGOS pode ser obtida por interferênciade RNA hairpin (hpRNA) ou interferência de RNA hairpincontendo intron (ihpRNA). Esses métodos são altamentealtamente eficientes em inibir a expressão de genesendógenos. Ver, Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev.Genet. 4:29-38 e as referências ai citadas.
Para interferência de hpRNA, o cassete de expressão éprojetado para expressar uma molécula de RNA que hibridizaa si mesma para formar uma estrutura hairpin que compreendeuma região Ioop de fita simples e uma ramificação base-pareada. A região de ramificação base-pareada compreendeuma seqüência senso correspondendo a todo ou parte do RNAmensageiro endógeno codificando o gene cuja expressão deveser inibida, e uma seqüência anti-senso que é totalmente ouparcialmente complementar à seqüência senso. Assim, aregião de ramificação base-pareada da molécula geralmentedetermina a especificidade da interferência de RNA.Moléculas de hpRNA são altamente eficientes em inibir aexpressão de genes endógenos, e a interferência de RNA queinduzem é herdada por subseqüentes gerações de plantas.Ver, por exemplo, Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al., (2002)Plant Physiol. 129:1723-1731; e Waterhouse and Helliwell(2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Métodos para usarinterferência de hpRNA para inbir ou silenciar a expressãode genes são descritos, por exemplo, em Chuang andMeyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990;Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 12 9:1723-17 31;Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38;Pandolfini, et al., BMC Biotechnology 3:7, e U.S. PatentPublication No. 20030175965; cada qual é aqui incorporadapor referência. Um teste transiente para a eficiência deconstruções de hpRNA em silenciar a expressão gênica invivo foi descrito por Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol.Rep. 30:135-140, aqui incorporado por referência.
Para ihpRNA, as moléculas interferentes possuem amesma estrutura geral como para hpRNA, mas a molécula deRNA compreende, adicionalmente, um intron que é capaz desofrer splicing na célula na qual o ihpRNA é expresso. 0uso de um intron minimiza o tamanho do loop na molécula deRNA hairpin após splicing, e isso aumenta a eficiência deinterferência. Ver, por exemplo, Smith, et al., (2000)Nature 407:319-320. De fato, Smith, et al., apresentam100% de supressão de expressão de gene endógeno usandointerferência mediada por ihpRNA. Métodos para usarinterferência de ihpRNA para inibir a expressão de genesvegetais endógenos são descritos, por exemplo, em Smith, etal., (2000) Nature 407:319-320; Wesley, et al., (2001)Plant J. 27:581-590; Wang and Waterhouse (2001) Curr. Opin.Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat.Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell and Waterhouse (2003)Methods 30:289-295, e U.S. Patent Publication No.20030180945, cada qual é aqui incorporada por referência.
O cassete de expressão para interferência de hpRNApode ser também projetado de forma que a seqüência senso ea seqüência anti-senso não correspondam a um RNA endógeno.Neste avanço, a seqüência senso e a seqüência anti-sensoflanqueiam uma seqüência Ioop que compreende uma seqüênciade nucleotideos correspondendo a todo ou parte do RNAmensageiro endógeno do gene alvo. Assim, é a região Ioopque determina a especificidade da interferência de RNA.Ver, por exemplo, WO 02/00904, aqui incorporada porreferência.ν. Interferência mediada por Amplicon
Cassetes de expressão amplicon compreendem umaseqüência vegetal derivada de vírus que contém todo ouparte do gene alvo, mas que geralmente não todos os genesdo vírus nativo. As seqüências virais presentes no produtode transcrição do cassete de expressão permitem que oproduto de transcrição direcione sua própria replicação.Os transcritos produzidos pelo amplicon podem ser tantosenso ou anti-senso em relação à seqüência alvo (i.e., oRNA mensageiro para o polipeptídeo ARGOS). Métodos de usaramplicons para inibir a expressão de genes vegetaisendógenos são descritos, por exemplo, em Angell andBaulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angell and Baulcombe(1999) Plant J. 20:357-362, e U.S. Patent No. 6.646.805,cada qual é aqui incorporada por referência.
vi. Ribozimas
Em alguns avanços, o polinucleotídeo expresso pelocassete de expressão da invenção é RNA catalítico ou possuiatividade de ribozima específica para o RNA mensageiro dopolipeptídeo ARGOS. Assim, o polinucleotídeo causa adegradação do RNA mensageiro endógeno, resultando emexpressão reduzida do polipeptideo ARGOS. Esse método édescrito, por exemplo, em U.S. Patent No. 4.987.071, aquiincorporada por referência.
vii. RNA de interferência pequeno ou Micro RNA
Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressãode um polipeptideo ARGOS pode ser obtida por interferênciade RNA pela expressão de um gene codificando um micro RNA(miRNA). miRNAs são agentes reguladores consistindo decerca de 22 ribonucleotideos. miRNAs são altamenteeficientes em inibir a expressão de genes endógenos. Ver,por exemplo, Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263, aquiincorporado por referência.
Para interferência de miRNA, o cassete de expressão éprojetado para expressar uma molécula de RNA que é modeladaem um gene de miRNA endógeno. 0 gene miRNA codifica um RNAque forma uma estrutura hairpin contendo uma seqüência de22 nucleotideos que é complementar a outro gene endógeno(seqüência alvo). Para supressão da expressão de ARGOS, aseqüência de 22 nucleotideos é selecionada de uma seqüênciade transcrito ARGOS e contém 22 nucleotideos de ditaseqüência ARGOS na orientação senso e 21 nucleotideos deuma seqüência anti-senso correspondente que é complementarà seqüência senso. Moléculas de miRNA são altamenteeficientes em inibir a expressão de genes endógenos, e ainterferência de RNA que induzem é herdada por subseqüentesgerações de plantas.
2. Inibição de Expressão Gênica baseada emPolipeptideo
Em um avanço, o polinucleotideo codifica uma proteínadedo de zinco que se liga a um gene codificando umpolipeptídeo ARGOS, resultando em expressão reduzida dogene. Em avanços em particular, a proteína dedo de zincose liga a uma região reguladora de um gene ARGOS. Emoutros avanços, a proteína dedo de zinco se liga a um RNAmensageiro codificando um polipeptídeo ARGOS e previne suatradução. Métodos de selecionar sítios para direcionamentopor proteínas dedo de zinco foram descritos, por exemplo,em U.S. Patent No. 6.453.242, e métodos para usar proteínasdedo de zinco para inibir a expressão de genes em plantassão descritos, por exemplo, em U.S. Patent Publication No.20030037355; cada qual é aqui incorporada por referência.
3. Inibição de Atividade de Proteína baseada emPolipeptídeoEm alguns avanços da invenção, o polinucleotideocodifica um anticorpo que se liga a pelo menos umpolipeptideo ARGOS, e reduz a atividade reguladora denúmero de células do polipeptideo ARGOS. Em outro avanço,a ligação do anticorpo resulta em recuperação aumentada docomplexo anticorpo-ARGOS por mecanismos celulares decontrole de qualidade. A expressão de anticorpos emcélulas vegetais e a inibição de vias moleculares porexpressão e ligação de anticorpos a proteínas em célulasvegetais são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo,Conrad and Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, aquiincorporada por referência.
4. Rompimento de Gene
Em alguns avanços da presente invenção, a atividade deum polipeptideo ARGOS é reduzida ou eliminada rompendo ogene codificando o polipeptideo ARGOS. 0 gene codificandoo polipeptideo ARGOS pode ser rompido por qualquer métodoconhecido na técnica. Por exemplo, em um avanço, o gene érompido por marcação de transposon. Em outro avanço, ogene é rompido mutagenizando plantas usando mutagênesealeatória ou direcionada, e selecionando plantas quepossuem atividade reguladora de número de células reduzida.i. Marcação de Transposon
Em um avanço da invenção, marcação de transposon éusada para reduzir ou eliminar a atividade de ARGOS de umou mais polipeptideos ARGOS. Marcação de transposoncompreende inserir um transposon com um gene ARGOS endógenopara reduzir ou eliminar a expressão do polipeptídeo ARGOS."Gene ARGOS" deve significar o gene que codifica umpolipeptídeo ARGOS de acordo com a invenção.
Neste avanço, a expressão de um ou mais polipeptideosARGOS é reduzida ou eliminada inserindo um transposon emuma região reguladora ou região codificadora do genecodificando o polipeptídeo ARGOS. Um transposon que estáem um éxon, íntron, seqüência não traduzida 5' ou 3', umpromotor, ou qualquer outra seqüência reguladora de um geneARGOS pode ser usado para reduzir ou eliminar a expressãoe/ou atividade do polipeptídeo ARGOS codificado.
Métodos para a marcação por transposon de genesespecíficos em plantas são bem conhecidos na técnica. Ver,por exemplo, Maes, et al., (1999) Trends Plant Sei. 4:90-96; Dharmapuri and Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett.179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-274;Phogat, et al., (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000)Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, et al., (2000)Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al., (1999)Genetics 153:1919-1928). Além disso, o processo TUSC paraselecionar inserções Mu em genes selecionados foi descritoem Bensen, et al., (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, et al.,(1996) Science 274:1537-1540; e U.S. Patent No. 5.962.764;cada qual é aqui incorporada por referência.
ii. Plantas Mutantes com Atividade Reduzida
Métodos adicionais para diminuir ou eliminar aexpressão de genes endógenos em plantas são tambémconhecidos na técnica e podem ser similarmente aplicados àatual invenção. Esses métodos incluem outras formas demutagênese, tais como mutagênese induzida por etilmetanossulfonato, mutagênese por deleção, e mutagênese pordeleção rápida de nêutron usada em um senso genéticoreverso (com PCR) para identificar linhas vegetais nasquais o gene endógeno foi deletado. Para exemplos dessesmétodos, ver Ohshima, et al., (1998) Virology 243:472-481;Okubara, et al., (1994) Genetics 137:867-874; e Quesada, etal., (2000) Genetics 154:421-436; cada qual é aquiincorporado por referência. Além disso, um método rápido eautomático para rastrear mutações induzidas quimicamente,TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes),usando HPLC desnaturante ou digestão seletiva deendonuclease de produtos de PCR selecionados é tambémaplicável à autal invenção. Ver, McCallum, et al., (2000)Nat. Biotechnol. 18:455-457, aqui incorporada por referência.
Mutações que causam impacto na expressão gênica ou queinterferem com a função (atividade reguladora de número decélulas) da proteína codificada são bem conhecidas na técnica. Mutações de inserção em éxons gênicos usualmenteresultam em mutantes nulos. Mutações em resíduosconservados são particularmente efetivas em inibir aatividade reguladora de número de células da proteínacodificada. Resíduos conservados de polipeptídeos vegetais ARGOS adequados para mutagênese com a meta de eliminar aatividade reguladora de número de células foram descritos.Tais mutantes podem ser isolados de acordo comprocedimentos bem conhecidos, e mutações em diferentes IociARGOS podem ser combinados por cruzamento genético. Ver, por exemplo, Gruis, et al., (2002) Plant Cell 14:2863-2882.
Em outro avanço desta invenção, mutantes dominantespodem ser usados para iniciar o silenciamento de RNA devidoà inversão gênica e recombinação de um lócus gênicoduplicado. Ver, por exemplo, Kusaba, et al.r (2003) PlantCell 15:1455-1467.
A invenção engloba métodos adicionais para reduzir oueliminar a atividade de um ou mais polipeptideos ARGOS.Exemplos de outros métodos para alterar ou mutar umaseqüência de nucleotideos genômica em uma planta sãoconhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a, ouso de vetores RNA:DNA, vetores mutacionais RNArDNA,vetores de reparo RNA:DNA, oligonucleotideos misturadosduplos, oligonucleotideos RNA:DNA autocomplementares, eoligonucleobases recombinogênicas. Tais vetores e métodosde uso são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, U.S.Patent Nos. 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012;5.795.972; e 5.871.984; cada qual é aqui incorporada porreferência. Ver também, WO 98/49350, WO 99/07865, WO99/25821, e Beetham, et al.r (1999) rProc. Natl. Acad. Sei.USA 96:8774-8778; cada qual é aqui incorporada porreferência.
iii. Atividade moduladora de crescimento vegetale/ou desenvolvimento de órgão
Em métodos específicos, o nível e/ou atividade de umregulador de número de células em uma planta é aumentadoelevando-se o nível ou atividade do polipeptídeo ARGOS naplanta. Métodos para elevar o nível e/ou atividade depolipeptídeos ARGOS em uma planta são aqui discutidos emoutra parte. Resumidamente, tais métodos compreendemprover um polipeptídeo ARGOS da invenção a uma planta e,dessa forma, aumentar o nível e/ou atividade dopolipeptídeo ARGOS. Em outros avanços, uma seqüência denucleotídeos ARGOS codificando um polipeptídeo ARGOS podeser provida introduzindo-se na planta um polinucleotídeocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos ARGOS dainvenção, expressando a seqüência ARGOS, aumentado aatividade do polipeptídeo ARGOS, e, dessa forma, elevando onúmero de células de tecido na planta ou parte de planta.Em outros avanços, o construção de nucleotídeos ARGOSintroduzido na planta é estavelmente incorporado no genomada planta.
Em outros métodos, o número de células e biomassa deum tecido vegetal é aumentado elevando-se o nível e/ouatividade do polipeptídeo ARGOS na planta. Tais métodossão aqui descritos em detalhe em outra parte. Em ummétodo, uma seqüência de nucleotídeos de ARGOS éintroduzida na planta e a expressão de dita seqüência denucleotídeos de ARGOS diminui a atividade do polipeptídeoARGOS, e, dessa forma, o crescimento vegetal e/oudesenvolvimento de órgão na planta ou parte de planta. Emoutros avanços, a construção de nucleotideo ARGOSintroduzida na planta é estavelmente incorporado no genomada planta.
Como discutido acima, um especialista reconhecerá opromotor apropriado para uso para modular o nivel/atividadede um polinucleotideo e polipeptideo de crescimento vegetale/ou desenvolvimento de órgão na planta. Promotoresexemplares para este avanço foram aqui descritos em outraparte.
Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantastendo um crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgãomodificado quando comparado ao crescimento vegetal e/oudesenvolvimento de órgão de um tecido vegetal controle. Emum avanço, a planta da invenção possui um nivel/atividadeelevado do polipeptideo ARGOS da invenção e, assim, possuicrescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão aumentadono tecido vegetal. Em outros avanços, a planta da invençãopossui um nivel reduzido ou eliminado do polipeptideo ARGOSda invenção e, assim, possui crescimento vegetal e/oudesenvolvimento de órgão reduzido no tecido vegetal. Emoutros avanços, tais plantas possuem, estavelmenteincorporadas em seu genoma, uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotideos ARGOS dainvenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige aexpressão na célula vegetal.
iv. Modulando o Desenvolvimento de Raiz
Métodos para modular o desenvolvimento de raiz em umaplanta são providos. Por "modular o desenvolvimento deraiz" pretende-se qualquer alteração no desenvolvimento daraiz da planta quando comparado a uma planta controle.Tais alterações no desenvolvimento da raiz incluem, mas nãosão limitadas a, alterações na taxa de crescimento da raizprimária, o peso fresco da raiz, a extensão de formação deraízes laterais e adventícias, o sistema vascular,desenvolvimento de meristema, ou expansão radial.
Métodos para modular o desenvolvimento de raiz em umaplanta são providos. Os métodos compreendem modular onível e/ou atividade do polipeptídeo ARGOS na planta. Emum método, uma seqüência ARGOS da invenção é provida para aplanta. Em outro método, a seqüência de nucleotideos ARGOSé provida introduzindo na planta um polinucleotídeocompreendendo uma seqüência de nucleotideos ARGOS dainvenção, expressando a seqüência ARGOS e, portanto,modificando o desenvolvimento de raiz. Ainda em outrosmétodos, a construção de nucleotídeo ARGOS introduzida naplanta é estavelmente incorporada no genoma da planta.
Em outros métodos, o desenvolvimento de raiz émodulado alterando-se o nivel ou atividade do polipeptideoARGOS na planta. Um aumento em atividade de ARGOS poderesultar em pelo menos um ou mais das seguintes alteraçõespara desenvolvimento de raiz, incluindo, mas não selimitando a, meristemas radiculares maiores, aumentado emcrescimento de raiz, expansão radial intensificada, umsistema vascular intensificado, ramificação de raizaumentada, mais raízes adventícias, e/ou um aumento no pesofresco de raiz quando comparado a uma planta controle.
Como aqui usado, "crescimento de raiz" engloba todosos aspectos de crescimento das diferentes partes queperfazem o sistema radicular em diferentes estágios de seudesenvolvimento, tanto em plantas monocotiledôneas edicotiledôneas. Deve ser entendido que crescimento de raizintensificado pode resultar de crescimento intensificado deuma ou mais de suas partes, incluindo a raiz primária,raízes laterais, raízes adventícias, etc.
Métodos de medir tais alterações de desenvolvimento nosistema radicular são conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, U.S. Application. No. 2003/0074698 e Werner, etal., (2001) PNAS 18:10487-10492, ambas são aquiincorporadas por referência.
Como discutido acima, um especialista reconhecerá opromotor apropriado para uso para modular o desenvolvimentode raiz na planta. Promotores exemplares para este avançoincluem promotores constitutivos e promotores preferidos deraiz. Promotores exemplares preferidos de raiz foram aquidescritos em outra parte.
Estimular o crescimento de raiz e aumentar a massa deraiz elevando-se a atividade e/ou nivel do polipeptideoARGOS também é útil para melhorar a capacidade desustentação de uma planta. O termo "resistência a corte"ou "capacidade de sustentação" refere-se à habilidade deuma planta para se fixar ao solo. Para plantas com umhábito ereto ou semi-ereto, este termo também refere-se àhabilidade de manter uma posição vertical sob condições(ambientais) adversas. Este traço está relacionado aotamanho, profundidade, e morfologia do sistema radicular.Além disso, estimular o crescimento de raiz e aumentar amassa de raiz elevando-se o nivel e/ou atividade dopolipeptideo ARGOS também é útil para promover a propagaçãoin vitro de explantes.Adicionalmente, uma maior produção de biomassa de raizdevido a um nível e/ou atividade de atividade ARGOS elevadopossui um efeito direto no rendimento e um efeito indiretode produção de compostos produzidos por células radicularesou células radiculares transgênicas ou culturas de célulasde ditas células radiculares transgênicas. Um exemplo deum composto interessante produzido em culturas de raízes emchiconina, o rendimento do qual pode vantajosamenteintensificado por ditos métodos.
Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantastendo desenvolvimento de raiz modulado quando comparada aodesenvolvimento de raiz de uma planta controle. Em algunsavanços, a planta da invenção possui um nível/atividadeaumentado do polipeptídeo ARGOS da invenção e possuicrescimento de raiz e/ou biomassa de raiz intensificado.Em outros avanços, tais plantas têm estavelmenteincorporado em seu genoma uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos ARGOS dainvenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige aexpressão na célula vegetal.ν. Modulando ο Desenvolvimento de Broto e deFolha
Métodos são também providos para modular odesenvolvimento de broto e folha em uma planta. Por"modular o desenvolvimento de broto e/ou folha" pretende-sequalquer alteração no desenvolvimento do broto e/ou folhada planta. Tais alterações no desenvolvimento de brotoe/ou folha incluem, mas não são limitadas a, alterações nodesenvolvimento de meristema de broto, no número de folhas,tamanho de folha, vasos de folha e caule, comprimento deinternodo, e senescência foliar. Como aqui usado,"desenvolvimento de folha" e "desenvolvimento de broto"engloba todos os aspectos de crescimento das diferentespartes que perfazem o sistema foliar e o sistema de broto,respectivamente, em diferentes estágios de seudesenvolvimento, tanto em plantas monocotiledôneas edicotiledôneas. Métodos para medir tais alterações nodesenvolvimento no sistema foliar e de broto são conhecidosna técnica. Ver, por exemplo, Werner, et al., (2001) PNAS98:10487-10492 e U.S. Application No. 2003/0074 698, cadaqual é aqui incorporada por referência.
O método para modular o desenvolvimento de broto e/oufolha em uma planta compreende modular a atividade e/ounível de um polipeptideo ARGOS da invenção. Em um avanço,uma seqüência ARGOS da invenção é provida. Em outrosavanços, a seqüência de nucleotídeos ARGOS pode ser providaintroduzindo-se na planta um polinucleotídeo compreendendouma seqüência de nucleotídeos ARGOS da invenção,expressando a seqüência ARGOS e, dessa forma, modificando odesenvolvimento de broto e/ou folha. Em outros avanços, aconstrução de nucleotídeos ARGOS introduzido na planta éestavelmente incorporada no genoma da planta.
Em avanços específicos, o desenvolvimento de broto oufolha é modulado diminuindo-se o nível e/ou atividade dopolipeptideo ARGOS na planta. Uma diminuição na atividadede ARGOS pode resultar em pelo menos uma ou mais dasseguintes alterações no desenvolvimento de broto e/oufolha, incluindo, mas não se limitando a, número de folhareduzido, superfície foliar reduzida, vascular reduzido,internodos mais curtos e crescimento abalado, e senescênciafoliar retardada, quando comparado a uma planta controle.
Como discutido acima, um especialista reconhecerá opromotor apropriado para uso para modular o desenvolvimentode broto e folha da planta. Promotores exemplares paraeste avanço incluem promotores constitutivos, promotorespreferenciais de broto, promotores preferenciais demeristema de broto, e promotores preferenciais de folha.Promotores exemplares foram aqui descritos em outra parte.
Diminuir a atividade e/ou nivel de ARGOS em uma plantaresulta em internodos mais curtos e crescimento abalado.Assim, os métodos da invenção são úteis para produzirplantas anãs. Além disso, como discutido acima, amodulação de atividade de ARGOS na planta modula tanto ocrescimento de raiz como de broto. Assim, a presenteinvenção prove, ainda, métodos para alterar a razãoraiz/broto. 0 desenvolvimento de broto ou folha pode serainda modulado diminuindo-se o nivel e/ou atividade dopolipeptideo ARGOS na planta.
Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantastendo desenvolvimento de broto e/ou folha modulado quandocomparado a uma planta controle. Em alguns avanços, aplanta da invenção possui um nivel/atividade dopolipeptideo ARGOS da invenção aumentado, alterando odesenvolvimento de broto e/ou folha. Tais alteraçõesincluem, mas não são limitadas a, número de folhasaumentado, superfície foliar aumentada, vascularidadeaumentada, internodos mais longos e estatura de plantaaumentada, assim como alterações em senescência foliar, secomparado a uma planta controle. Em outros avanços, aplanta da invenção possui um nível/atividade dopolipeptideo ARGOS da invenção diminuído.
vi Modulando o Desenvolvimento de Tecido
Reprodutivo
Métodos para modular o desenvolvimento de tecidoreprodutivo são providos. Em um avanço, são providosmétodos para modular o desenvolvimento floral em umaplanta. Por "modular o desenvolvimento floral" pretende-sequalquer alteração em uma estrutura de um tecidoreprodutivo de planta se comparado a uma planta controle naqual a atividade ou nível do polipeptideo ARGOS não foimodulada. "Modular o desenvolvimento floral" inclui aindaqualquer alteração no sincronismo do desenvolvimento de umtecido reprodutivo de planta (i.e., um sincronismo atrasadoou acelerado de desenvolvimento floral) quando comparado auma planta controle na qual a atividade ou nível dopolipeptideo ARGOS não foi modulada. Alterações
macroscópicas podem incluir mudanças em tamanho, formato,número, ou localização ou órgãos reprodutivos, o período detempo de desenvolvimento com que essas estruturas seformam, ou a habilidade de manter ou proceder através doprocesso de florada em tempos de estresse ambientas.Alterações microscópicas podem incluir mudanças aos tiposou formatos de células que perfazem os órgãos reprodutivos.
O método para modular o desenvolvimento floral em umaplanta compreende modular a atividade de ARGOS em umaplanta. Em um método, uma seqüência ARGOS da invenção éprovida. Uma seqüência de nucleotídeos ARGOS pode serprovida introduzindo-se na planta um polinucleotideocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos ARGOS dainvenção, expressando a seqüência ARGOS, e, dessa forma,modificando o desenvolvimento floral. Em outros avanços, aconstrução de nucleotídeos ARGOS introduzido na planta éestavelmente incorporada no genoma da planta.
Em métodos específicos, o desenvolvimento floral émodulado diminuindo-se o nível ou atividade do polipeptídeoARGOS na planta. Um decréscimo na atividade de ARGOS poderesultar em pelo menos uma ou mais das seguintes alteraçõesem desenvolvimento floral, incluindo, mas não se limitandoa, florada retardada, número de flores reduzido,esterilidade masculina parcial, e postura de sementesreduzida, quando comparado a uma planta controle. Induzirflorada atrasada ou inibir a florada pode ser usado paraintensificar o rendimento em cultivos de forrageio, taiscomo alfafa. Métodos para medir tais alterações dedesenvolvimento em desenvolvimento floral são conhecidos natécnica. Ver, por exemplo, Mouradov, et al., (2002) ThePlant Cell S111-S130, aqui incorporada por referência.
Como discutido acima, um especialista reconhecerá o promotor apropriado para uso para modular o desenvolvimentofloral da planta. Promotores exemplares para este avançoincluem promotores constitutivos, promotores induzidos,promotores preferenciais de brotos, e promotorespreferenciais de inflorescência.
Em outros métodos, o desenvolvimento floral é moduladoaumentando-se o nivel e/ou atividade da seqüência ARGOS dainvenção. Tais métodos podem compreender introduzir umaseqüência de nucleotideos ARGOS na planta e aumentar aatividade do polipeptideo ARGOS. Em outros métodos, aconstrução de nucleotideos ARGOS introduzida na planta éestavelmente incorporada no genoma da planta. Aumentar aexpressão da seqüência ARGOS da invenção pode modular odesenvolvimento floral durante períodos de estresse. Tais métodos são aqui descritos em outra parte. Dessa maneira,a presente invenção provê ainda plantas tendodesenvolvimento floral modulado quando comparado aodesenvolvimento floral de uma planta controle. Composiçõesincluem plantas tendo um nível/atividade do polipeptideoARGOS da invenção aumentado e tendo um desenvolvimentofloral alterado. Composições também incluem plantas tendoum nível/atividade do polipeptideo ARGOS da invençãoaumentado caracterizado pelo fato de que a planta mantém ouprocede o processo de florada em tempos de estresse.
Métodos são também providos para o uso das seqüênciasARGOS da invenção para aumentar o tamanho e/ou . peso desemente. 0 método compreende aumentar a atividade dasseqüências ARGOS em uma planta ou parte de planta, tal comoa semente. Um aumento em tamanho e/ou peso de sementecompreende um tamanho ou peso aumentado da semente e/ou umaumento no tamanho ou peso de uma ou mais partes da sementeincluindo, por exemplo, o embrião, endosperma, cobertura dasemente, aleurona, ou cotilédone.
Como discutido acima, um especialista reconhecerá opromotor apropriado para uso para aumentar o tamanho desemente e/ou peso de semente. Promotores exemplares desteavanço incluem promotores constitutivos, promotoresinduzidos, promotores preferenciais de semente, promotorespreferenciais de embrião, e promotores preferenciais deendosperma.
0 método para diminuir o tamanho de semente e/ou pesode semente em uma planta compreende diminuir a atividade deARGOS na planta. Em um avanço, a seqüência de nucleotídeosARGOS pode ser provida pela introdução na planta umpolinucleotideo compreendendo uma seqüência de nucleotídeosARGOS da invenção, expressando a seqüência ARGOS, e, dessaforma, diminuindo o peso e/ou tamanho de semente. Emoutros avanços, a construção de nucleotídeos ARGOSintroduzida na planta é estavelmente incorporada no genomada planta.
É ainda reconhecido que aumentar o tamanho e/ou pesode semente pode estar também acompanhado por um aumento navelocidade de crescimento de plântulas ou um aumento emvigor inicial. Como aqui usado, o termo "vigor inicial"refere-se à habilidade de uma planta crescer rapidamentedurante o desenvolvimento inicial, e está relacionado aoestabelecimento bem-sucedido, após a germinação, de umsistema radicular bem desenvolvido e um aparatofotossintético bem desenvolvido. Além disso, um aumento emtamanho e/ou peso de semente pode resultar, também, em umaumento no rendimento vegetal quando comparado a umcontrole.
Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantastendo um peso de semente e/ou tamanho de semente aumentadoquando comparado a uma planta controle. Em outros avanços,plantas tendo vigor e rendimento vegetal aumentados sãotambém providas. Em alguns avanços, a planta da invençãopossui um nivel/atividade do polipeptideo ARGOS da invençãoaumentado e possui um peso de semente e/ou tamanho desemente aumentado. Em outros avanços, tais plantas têmestavelmente incorporado em seu genoma uma molécula deácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotideosARGOS da invenção operacionalmente ligada a um promotor quedirige a expressão na célula vegetal.
vii. Método de Uso para polinucleotídeospromotores de ARGOS
Os polinucleotídeos compreendendo os promotores deARGOS descritos na presente invenção, assim como variantese fragmentos desses, são úteis na manipulação genética dequalquer célula hospedeira, preferencialmente célulavegetal, quando reunidos com uma construção de DNA, deforma que a seqüência promotora seja operacionalmenteligada a uma seqüência de nucleotideos compreendendo umpolinucleotídeo de interesse. Dessa maneira, os
polinucleotídeos promotores de ARGOS da invenção sãoprovidos em cassetes de expressão juntos com uma seqüênciade polinucleotídeos de interesse para expressão na célulahospedeira de interesse. Como discutido no Exemplo 2abaixo, as seqüências promotoras de ARGOS da invenção sãoexpressas em uma variedade de tecidos e, assim, asseqüências promotoras são úteis em regular a expressãotemporal e/ou espacial de polinucleotideos de interesse.
Regiões promotoras híbridas sintéticas são conhecidasna técnica. Tais regiões compreendem elementos promotoresacima de um polinucleotídeo operacionalmente ligado aoelemento promotor de outro polinucleotídeo. Em um avançoda invenção, a expressão de seqüência heteróloga écontrolada por um promotor híbrido sintético compreendendoas seqüências promotoras de ARGOS da invenção, ou umvariante ou fragmento dessa, operacionalmente ligadas aelemento(s) promotor(es) acima, a partir de um promotorheterólogo.
Elementos promotores acima que estãoenvolvidos no sistema de defesa da planta foramidentificados e podem ser usados para gerar um promotorsintético. Ver, por exemplo, Rushton, et al., (1998) Curr.Opin. Plant Biol. 1:311-315.
Alternativamente, umaseqüência promotora de ARGOS sintética pode compreenderduplicações dos elementos promotores acima encontrados nasseqüências promotoras de ARGOS.
É reconhecido que a seqüência promotora da invençãopode ser usada com suas seqüências codificadoras de ARGOSnativa. Uma construção de DNA compreendendo o promotor deARGOS operacionalmente ligado com seu gene de ARGOS nativopode ser usada para transformar qualquer planta deinteresse para perfazer uma mudança fenotipica desejada,tal como modular o número de células, modular odesenvolvimento de raiz, broto, folha, flores, e embrião,tolerância a estresse, e qualquer outro fenótipo aquidescrito em outra parte.
As seqüências promotoras de nucleotideos e métodosaqui descritos são úteis para regular a expressão dequalquer seqüência heteróloga de nucleotideos em uma plantahospedeira para variar o fenótipo de uma planta. Váriasmudanças em fenótipo são de interesse incluindo modificar acomposição de ácidos graxos em uma planta, alterar oconteúdo de aminoácido de uma planta, alterar um mecanismode defesa contra patógenos de uma planta, e similares.Esses resultados podem ser alcançados provendo a expressãode produtos heterólogos ou expressão aumentada de produtosendógenos em plantas. Alternativamente, os resultadospodem ser alcançados provendo uma redução de expressão deum ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ouco-fatores na planta. Essas mudanças resultam em umamudança em fenótipo da planta transformada.Genes de interesse são um reflexo dos mercadoscomerciais e interesses daqueles envolvidos nodesenvolvimento do cultivo. Cultivos e mercados deinteresse mudam, e à medida que as nações emdesenvolvimento abrem mercados mundiais, novos cultivos etecnologias irão também emergir. Além disso, como nossoentendimento de traços agronômicos e características, taiscomo aumento do rendimento e heterose, a escolha de genespara transformação irá se modificar dessa maneira.Categorias gerais de genes de interesse incluem, porexemplo, aqueles genes envolvidos em informação, tais comodedos de zinco, aqueles envolvidos em comunicação, taiscomo quinases, e aqueles envolvidos em manutenção, taiscomo proteínas de choque de calor. Mais categorias específicas de transgenes, por exemplo, incluem genescodificando importantes traços para agronomia, resistênciaa insetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas,esterilidade, características de grão, produtos ecomerciais. Genes de interesse incluem, geralmente, aqueles envolvidos no metabolismo de óleo, amido,carboidrato, ou nutrientes assim como aqueles afetando otamanho de grão, carregamento de sacarose, e similares.
Em certos avanços, as seqüências de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser usadas em combinação("combinadas") com outras seqüências de polinucleotideos deinteresse para criar plantas com um fenótipo desejado. Ascombinações geradas podem incluir múltiplas cópias dequalquer um ou mais dos polinucleotideos de interesse. Ospolinucleotideos da presente invenção podem ser combinadoscom qualquer gene ou combinação de genes para produzirplantas com uma variedade de combinações de traçosdesejados, incluindo, mas não se limitando a, traçosdesejáveis para alimentação, tais como genes de alto nivelde óleos (e.g., U.S. Patent No. 6.232.529); aminoácidosbalanceados (e.g., hordotioninas (U.S. Patent Nos.5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; e 5.703.409); alto teor delisina em cevada (Williamson, et al., (1987) Eur. J.Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122); e proteínas com muitametionina (Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem.261:6279; Kirihara, et ai., (1988) Gene 71:359; e Musumura,et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidadeaumentada (e.g., proteínas de armazenamento modificadas(U.S. Application Serial No. 10/053.410, preenchida em 7 denovembro de 2001); e tioredoxinas (U.S. Application SerialNo. 10/005.429, preenchida em 3 de dezembro 2001)), asdescrições das quais são aqui incorporadas por referência.Os polinucleotideos da presente invenção podem ser tambémcombinados com traços desejáveis para resistência ainsetos, doenças ou herbicidas (e.g., proteínas tóxicas deBacillus thuringiensis (U.S. Patent Nos. 5.366.892;5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser, et al.r(1986) Gene 48:109); Iectinas (Van Damme, et al., (1994)Plant Mol. Biol. 24:825); genes de desintoxicação deumonisina (U.S. Patent No. 5.792.931); genes deavirulência e resistência a doenças (Jones, et al.r (1994)Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432;Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089); mutantes deacetolactato sintase (ALS) que levam a resistência aherbicidas, tais como as mutações S4 e/ou Hra; inibidoresde sintase glutamina, tais como fosfinotricina ou basta(e.g., gene bar); e resistência a glifosato (gene EPSPS));e traços desejáveis para processar ou produtos de processo,tais como alto conteúdo de óleo (e.g., U.S. Patent No.6.232.529 ); óleos modificados (e.g., genes de desaturasede ácidos graxos (U.S. Patent No. 5.952.544; WO 94/11516));amidos modificados (e.g., ADPG pirofosforilases (AGPase),amidos modificados (SS), enzimas de ramificação de amido(SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE)); epolímeros ou bioplásticos (e.g., U.S. patent No. 5.602.321;beta-cetotiolase, polihidroxibutirato sintase, eacetoacetil-CoA redutase (Schubert, et al., (1988) J.Bacteriol. 170:5837-5847) facilitar a expressão depolihidroxialcanoatos (PHAs)), as descrições das quais sãoaqui incorporadas por referência. Pode-se também combinaros polinucleotídeos da presente invenção compolinucleotídeos afetando características agronômicas, taiscomo esterilidade masculina (e.g., ver U.S. Patent No.5.583.210), força de caule, tempo de florada, ou traços detecnologia de transformação, como regulação de ciclocelular ou direcionamento de genes (e.g., WO 99/61619; WO00/17364; WO 99/25821), as descrições das quais são aquiincorporadas por referência.
Em um avanço, seqüências de interesse melhoram ocrescimento vegetal e/ou rendimentos de cultivo. Porexemplo, seqüências de interesse incluem genesagronomicamente importantes que resultam em sistemasradiculares primários ou laterais melhorados. Tais genesincluem, mas não estão limitados a, transportadores denutrientes/água e indutores de crescimento. Exemplos detais genes, incluem, mas não são limitados a, H+-ATPase demembrana plasmática de milho (MHA2) (Frias, et al., (1996)Plant Cell 8:1533-44); AKTl, um componente do aparato deabsorção de potássio em Arabidopsis, (Spalding, et al.,(1999) J Gen Physiol 113:909-18); genes RML que ativam ociclo de divisão celular nas células radiculares apicais(Cheng, et al., (1995) Plant Physiol 108:881); genesglutamina sintetase de milho (Sukanya, et al., (1994) PlantMol Biol 26:1935-46) e hemoglobina (Duff, et al., (1997) J.Biol. Chem 27:16749-16752, Arredondo-Peter, et al., (1997)Plant Physiol. 115:1259-1266; Arredondo-Peter, et al.,(1997) Plant Physiol 114:493-500 e referências ai citadas).A seqüência de interesse pode ser útil, também, paraexpressar seqüências de nucleotideos anti-senso de genesque afetam negativamente o desenvolvimento de raiz.
Traços adicionais importantes agronomicamente, taiscomo conteúdo de óleo, amido e proteína podem sergeneticamente alterados além de se usar métodos demelhoramento tradicionais. Modificações incluem aumentar oconteúdo de ácido oléico, óleos saturadas insaturados,aumentar os níveis de lisina e enxofre, forneceraminoácidos essenciais, e também modificação de amido.Modificações em proteína hordotionina são descritas em U.S.Patent Nos. 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802, e 5.990.389,aqui incorporada por referência. Outro exemplo é proteínade semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pelaalbumina 2S de soja descrita em U.S. Patent No. 5.850.016,e o inibidor de quimotripsina de cevada, descrito emWilliamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, asdescrições das quais são aqui incorporadas por referência.
Derivados das seqüências codificadoras podem serfeitos por mutagênese sítio direcionada para aumentar onível de aminoácidos pré-selecionados no polipeptideocodificado. Por exemplo, o gene codificando o polipeptideode alto conteúdo de lisina em cevada (BHL) é derivado doinibidor de quimotripsina de cevada, U.S. ApplicationSerial No. 08/740.682, preenchida em 1° de novembro de1996, e WO 98/20133, as descrições das quais são aquiincorporadas por referência. Outras proteínas incluemproteínas vegetais ricas em metionina, tais como desementes de girassol (Lilley, et al., (1989) Proceedings ofthe World Congress on Vegetable Protein Utilization inHuman Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (AmericanOil Chemists Society, Champaign, Illinois), pp. 497-502;aqui incorporada por referência); milho (Pedersen, et al.,(1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al., (1988)Gene 71:359; ambas as quais são aqui incorporadas porreferência); e arroz (Musumura, et al., (1989) Plant Mol.Biol. 12:123, aqui incorporada por referência). Outrosgenes agronomicamente importantes codificam látex, Floury2, fatores de crescimento, fatores de armazenamento desementes, e fatores de transcrição.
Genes de resistência a insetos podem codificarresistência a pestes que causam uma grande retirada derendimento, tais como larva-da-raiz, larva de besouronoctuídeo, lagarta européia, e similares. Tais genesincluem, por exemplo, genes de proteína tóxica de Bacillusthuringiensis (U.S. Patent Nos. 5.366.892; 5.747.450;5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser, et al., (1986)Gene 48:109); e similares.
Genes codificando traços de resistência a doençasincluem genes de desintoxicação, tais como contrafumonosina (U.S. Patent No. 5.792.931); genes avirulência(avr) e resistência à doença (R) (Jones, et al., (1994)Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432; eMindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089); e similares.
Traços de resistência a herbicida podem incluir genescodificando resistência a herbicidas que atuam para inibira ação de acetolactato sintase (ALS) , em particular osherbicidas tipo sulfoniluréia (e.g., o gene de acetolactatosintase (ALS) contendo mutações levando a tal resistência,em particular as mutações S4 e/ou Hra), genes codificandoresistência a herbicidas que atuam para inibir a ação deglutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta (e.g.,o gene bar), ou outros tais genes conhecidos na técnica. Ogene bar codifica resistência ao herbicida basta, o genenptll codifica resistência aos antibióticos canamicina egeneticina, e os mutantes do gene ALS codificam resistênciaao herbicida clorsulfuron.Genes de esterilidade podem ser também codificados emum cassete de expressão e provém uma alternativa pararetirada de pendão física. Exemplos de genes usados emtais meios incluem genes preferenciais de tecido masculinoe genes com fenótipos de esterilidade masculina, tais comoQM, descrito em U.S. Patent No. 5.583.210. Outros genesincluem quinases e aqueles codificando compostos tóxicostanto para o desenvolvimento de gametófito masculino comopara feminino.
A qualidade de grão é refletida em traços, tais comoníveis e tipos de óleos, saturado e insaturado, qualidade equantidade de aminoácidos essenciais, e níveis de celulose.
Em milho, proteínas hordotioninas modificadas são descritasem U.S. Patent Nos. 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802, e5.990.389.
Traços comerciais podem ser também codificados em um gene ou genes que poderiam aumentar, por exemplo, amidopara a produção de etanol, ou prover a expressão deproteínas. Outro importante uso comercial de plantastransformadas é a produção de polímeros e bioplásticos,tais como descrito em U.S. Patent No. 5.602.321. Genes tais como β-cetotiolase, PHBase (polihidroxiburiratosintase), e acetoacetil-CoA redutase (ver, Schubert, etal., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam aexpressão de polihiroxialcanoatos (PHAs).
Produtos exógenos incluem enzimas e produtos vegetais,assim como aqueles de outras fontes incluindo procariontese outros eucariontes. Tais produtos incluem enzimas, co-fatores, hormônios e similares. O nivel de proteínas,proteínas particularmente modificadas, tendo distribuiçãode aminoácido melhorada para melhorar o valor nutricionalda planta, pode ser aumentado. Isto é alcançado pelaexpressão de tais proteínas tendo conteúdo de aminoácidointensificado.
Esta invenção pode ser mais bem entendida porreferência aos seguintes exemplos não limitantes. Seráponderado por aqueles especialistas na técnica que outrosavanços da invenção podem ser praticados sem sair doespírito e do escopo da invenção, como aqui descrito ereivindicado.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Isolamento de seqüências ARGOSUma rotina para identificar todos os membros de umafamília de genes foi empregada para buscar genes ARGOS deinteresse. Um grupo diverso de todos os membros conhecidosda família de genes, como seqüências de proteínas, foipreparado. Esses dados incluem seqüências de outrasespécies. Essas espécies são contrapostas contra uma basede dados de seqüências de milho e um grupo não redundantede pontos se sobrepondo é identificado. Separadamente,pega-se as seqüências de nucleotídeos de qualquer gene deinteresse em mãos e contrapõe-se contra a base de dados eum grupo não redundante de todos os pontos se sobrepondo éencontrado. 0 grupo de pontos de proteína é, então,comparado em relação aos pontos de nucleotídeo. Se afamília de genes está completa, todos os pontos de proteínaestão contidos nos pontos de nucleotídeos. A família degenes ARGOS consiste de 3 genes de Arabidopsis, 8 genes dearroz, 9 genes de milho, 9 genes de sorgo, e 5 genes desoja. Uma representação em dendrograma das inter-relaçõesdas proteínas codificadas por esses genes é provida como aFigura 1.
Exemplo 2. Análise de Seqüência ARGOS
Os polipeptídeos ZmARGOS da invenção atual possuemcaracterísticas comuns com genes ARGOS em uma variedade deespécies vegetais. A relação entre os genes das múltiplasespécies vegetais é mostrada em um alinhamento, ver Figuras
2. A figura 3 contém ZmARGOS 1, 2, 3, e AtARGOS 1 (SEQ IDNOS: 2, 4, 6 e 26) . As proteínas codificadas pelos genesARGOS possuem uma região rica em prolina bem conservadapróxima do C-terminal. As regiões N-terminal são maisdivergentes. As proteínas são relativamente curtas, emmédia 110 aminoácidos.
Exemplo 3. Transformação e Regeneração de Plantastransgênicas
Embriões imaturos de milho de plantas de estufadoadoras são bombardeados com um plasmídeo contendo aseqüência ZmARGOS operacionalmente ligada ao promotorinduzido por seca, promotor RAB17 (Vilardell, et al.,(1990) Plant Mol Biol 14:423-432) e o gene marcador deseleção PAT, que confere resistência ao herbicidaBialaphos. Alternativamente, o gene marcador de seleção éprovido em um plasmídeo separado. A transformação éefetuada como a seguir. As receitas de meio seguem abaixo.
Preparação de Tecido Alvo:
As espigas são descascadas e a superfície esterilizadaem 30% de alvejante Clorox mais 0,5% de Micro detergentepor 20 minutos, e enxaguadas duas vezes com água estéril.Os embriões imaturos são excisados e colocados com o eixodo embrião virado para baixo (lado do escutelo para cima),25 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e, então,alinhados na zona alvo de 2,5cm em preparação para obombardeamento.
Preparação de DNA:
Um vetor de plasmideo compreendendo a seqüência ARGOSoperacionalmente ligada a um promotor de ubiquitina éfeito. Esse DNA de plasmideo mais DNA de plasmideocontendo um marcador de seleção PAT são precipitados empelotas de tungstêniò de 1,1 μm (diâmetro médio) usando umprocedimento de precipitação com CaCl2 como se segue:
100 μl preparado de partículas de tungstêniò em água
10 μl (1 pg) de DNA em tampão Tris EDTA (1 pg de DNAtotal)
100 μl CaCl2 2,5 M
10 μl espermidina 0,1 M
Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensãode partículas de tungstêniò, enquanto mantido no misturadortipo vórtex multitubo. A mistura final é sonicadabrevemente e deixada incubando sob agitação constante por10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos sãocentrifugados brevemente, o líquido removido, lavados com500 ml de etanol 100%, e centrifugados por 30 segundos.Novamente, o líquido é removido, e 105 μΐ de etanol 100%são adicionados à pelota de partículas de tungstênio final.Para a pistola de bombardeamento de partículas, aspartículas de tungstênio/DNA são sonicadas brevemente e 10μl colocados no centro de cada macro-carregador e deixadossecando por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.
Tratamento com Pistola de Partículas;
As placas de amostra são bombardeadas no nível #4 napistola de partículas #HE34-1 ou #HE34-2. Todas asamostras recebem um único tiro a 650 PSI, com um total dedez alíquotas retiradas de cada tubo de preparadopartículas/DNA.
Tratamento Subseqüente:
Após o bombardeamento, os embriões são mantidos emmeio 560Y por 2 dias, então transferidos para meio deseleção 560R contendo Bialaphos a 3 mg/litro, e sub-cultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10semanas de seleção, clones de calos resistentes a seleçãosão transferidos para meio 288J para iniciar a regeneraçãovegetal. Após o amadurecimento do embrião somático (2-4semanas) , embriões somáticos bem desenvolvidos sãotransferidos para meio para germinação e transferidos paraa sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7-10 diasdepois, as plântulas em desenvolvimento são transferidaspara meio 272V sem hormônio em tubos por 7-10 dias até queas plântulas estejam bem estabelecidas. As plantas são,então, transferidas para inserções em planos (equivalente apote de 2,5") contendo solo de pote e crescidas por 1semana em uma câmara de crescimento, crescidassubseqüentemente por 1-2 semanas adicionais na estufa,então transferidas para potes clássicos 600 (1,6 galões) ecultivadas até a maturidade. As plantas são monitoradas epontuadas para tolerância a seca aumentada. Testes paramedir a tolerância a seca aumentada são rotina na técnica eincluem, por exemplo, rendimentos aumentados de capacidadede grãos por espiga sob condições de seca quando comparadoa plantas de milho controle sob condições ambientaisidênticas. Alternativamente, as plantas transformadaspodem ser monitoradas para uma modulação em desenvolvimentode meristema (i.e., um decréscimo na formação de cravos naespiga). Ver, por exemplo, Bruce, et ai., (2002) Journalof Experimental Botany 53:1-13.Meios de Bombardeamento e Cultura:
Meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/l desais basais N6 (SIGMA C-1416) , 1,0 ml/l de mistura deVitamina Eriksson's (IOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/l de HCltiamina, 120,0 g/l de sacarose, 1,0 mg/l de 2,4-D, e 2,88g/l de L-prolina (levado ao volume com H2O dl seguindo oajuste para pH 5,8 com KOH) ; 2,0 g/l Gelrite™ (adicionadoapós levar ao volume com H2O dl); e 8,5 mg/l de nitrato deprata (adicionados após esterilizar o meio e resfriar paratemperatura ambiente). Meio de seleção (560R) compreende4,0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l demistura de vitamina Eriksson's (lOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/lde HCl tiamina, 30,0 g/l de sacarose, e 2,0 mg/l de 2,4-D(levados ao volume com H2O dl seguindo o ajuste para pH 5,8com KOH) ; 3,0 g/l de Gelrite™ (adicionado após levar aovolume com H20 dl); e 0,85 mg/l de nitrato de prata e 3,0mg/l de Bialaphos (ambos adicionados após esterilizar omeio e resfriar para temperatura ambiente).
Meio de regeneração vegetal (288J) compreende 4,3 g/lde sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solução deestoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotinico, 0,02g/l de HCl tiamina, 0,10 g/l de HCl piridoxina, e 0,40 g/lde glicina levados ao volume com H2O dl polida) (Murashigeand Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:413), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarose, e 1,0ml/l de 0,1 mM ácido abscisico (levados ao volume com H2Odl polida após ajustar para pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite™(adicionados após levar ao volume com H2O dl); e 1,0 mg/lde ácido indoloacético e 3,0 mg/l de Bialaphos (adicionadosapós esterilizar o meio e resfriar para 60°C) . Meio semhormônios (272V) compreende 4,3 g/l de sais MS (GIBCO11117-074), 5,0 ml/l de solução de estoque de vitaminas MS(0,100 g/l de ácido nicotinico, 0,02 g/l de HCl tiamina,0,10 g/l de HCl piridoxina, e 0,40 g/l de glicina levadosao volume com H2O dl polida), 0,1 g/l de mio-inositol, e40,0 g/l de sacarose (levados ao volume com H20 dl polidaapós ajustar o pH para 5,6); e 6 g/l de Bacto-ágar(adicionado após levar ao volume com H2O dl polida),esterilizados e resfriados a 60° C.
Exemplo 5. Transformação por Agrobactexium
Para transformação de milho mediada por Agrobacteriumcom uma seqüência anti-senso da seqüência ZmARGOS dapresente invenção, preferencialmente o método de Zhao éempregado (U.S. Patent No. 5.981.840, e a publicação PCTW098/32326; os conteúdos das quais são aqui incorporados porreferência) . Resumidamente, embriões imaturos são isoladosde milho e os embriões levados ao contato com uma suspensãode Agrobacterium, onde as bactérias são capazes detransferir a seqüência ARGOS a pelo menos uma célula depelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa deinfecção). Nesta etapa, os embriões imaturos são
preferencialmente imersos em uma suspensão de Agrobacteriumpara a iniciação da inoculação. Os embriões são co-cultivados por um tempo com as Agrobacterium (etapa 2: aetapa de co-cultivo). Preferencialmente, os embriõesimaturos são cultivados em meio sólido após a etapa deinfecção. Após este período de co-cultivo, uma etapa de"descanso" é contemplada. Nesta etapa de descanso, osembriões são incubados na presença de pelo menos umantibiótico conhecido por inibir o crescimento deAgrobacterium sem a adição de um agente seletivo paratransformantes vegetais (etapa 3: etapa de descanso).Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados emmeio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção,para eliminação de Agrobacterium e por uma fase de descansopara as células infectadas. Em seguida, os embriõesinoculados são cultivados em meio contendo um agenteseletivo e os calos em crescimento transformados sãorecuperados (etapa 4: a etapa de seleção).Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados emmeio sólido com um agente seletivo resultando nocrescimento seletivo de células transformadas. 0 calo é,então, regenerado em plantas (etapa 5: a etapa deregeneração), e, preferencialmente os calos crescidos emmeio seletivo são cultivados em meio sólido para regeneraras plantas. As plantas são monitoradas e pontuadas parauma modulação em desenvolvimento de meristema. Porexemplo, alterações de tamanho e aparência do broto emeristemas florais e/ou produção de folhas, flores e/oufrutos aumentada.
Exemplo 6. A super-expressão de ZmARGOS afeta o tamanhode planta e tamanho de órgão
A função do gene ZmARGOS foi testada usando-se plantastransgênicas expressando o transgene Ubi-ZmARGOS. Aexpressão de transgene foi confirmada usando-se primer RT-PCR especifico de transgene (SEQ ID NO: 38 para ARGOS, eSEQ ID NO: 39 para PIN). Plantas Tl de nove eventos decópias simples foram avaliadas no campo. As plantastransgênicas apresentaram intensificações positivas emcrescimento em diversos aspectos.
Crescimento Vegetativo e acúmulo de biomassa:Comparado aos aparentados não transgênicos, as plantastransgênicas (na geração TI) apresentaram uma média deaumento de 4% em altura de planta por todos os 9 eventos eaté 12% no evento mais alto. 0 caule das plantastransgênicas era mais espesso do que aparentados nãotransgênicas, como medido por valores de diâmetro de caule,com uma média de 9% a 22% de aumento dentre os noveeventos. 0 aumento da altura de planta e a espessuraresultaram em uma maior estatura de planta e biomassa paraas plantas transgênicas. 0 acúmulo de biomassa estimadaapresentou um aumento de 30% em média e até 57% em linhastransgênicas positivas, comparado aos aparentadosnegativos.
ZmARGOS foi visto por causar impacto no crescimentovegetal principalmente acelerando a taxa de crescimento,mas não estendendo o período de crescimento. O crescimentointensificado, i.e., tamanho de planta aumentado e acúmulode biomassa, aparenta ser largamente devido à taxa decrescimento acelerada, e não a um período estendido decrescimento, pois as plantas transgênicas não atrasaram aflorada, baseado nas datas de formação de seda e antese.De fato, as plantas transgênicas floresceram mais cedo doque os aparentados não transgênicas. Em média, peloseventos, os dias para florada foram encurtados entre 30unidades de calor (1-1,5 dias), e 69 unidades de calor (2-2,5 dias). Portanto, a super-expressão do gene ZmARGOSacelerou a taxa de crescimento da planta. A taxa decrescimento acelerada parece estar associada com uma taxade proliferação de célula elevada.
0 crescimento vegetativo intensificado, acúmulo debiomassa em transgênicos e taxa de crescimento aceleradaforam ainda testados com experimentos de campo extensivos,tanto em híbridos como em bases intercruzadas em geraçãoavançada (T3). Plantas transgênicas reprodutivamente
apresentaram altura de planta aumentada em até 18%,diâmetro de caule em até 10%, massa seca de pendão em até15%, área foliar aumentada em até 14%, massa vegetal secatotal em até 25%. A florada mais cedo observada na geraçãoT1 foi novamente observada na geração T3.
Crescimento reprodutivo e produção de grãos;
A super-expressão do gene ZmARGOSl também intensificouo crescimento de órgão reprodutivo. Plantas transgênicasTl apresentaram comprimento de espiga aumentado, cerca de10% na média de nove eventos, e até 14% para o maiorevento. 0 peso total de grão por espiga aumentou 13% em média e até 70% para um evento. 0 aumento no peso total degrãos parece ser atribuído ao número de grãos e tamanho degrão aumentados. A média dos nove eventos mostrou que onúmero de grãos por espiga aumentou 8%, e até 50% no maiorevento. O peso de 100 grãos aumentou 5% em média e até 13%para o maior evento. A mudança positiva nascaracterísticas de grão e espiga está associada com aumentoem produção de grãos.
O crescimento reprodutivo intensificado e produção degrãos de transgênicos foram novamente confirmados emexperimentos de campo extensivos na geração avançada (T3).A intensificação foi observada tanto em bases intercruzadascomo híbridas. Como comparado com aparentado transgênicocomo controle, as plantas transgênicas apresentaram umaumento significativo em massa seca primária de espiga ematé 60%, massa seca secundária de espiga em até 4,7 vezes,massa seca de pendão em até 25%, e massa seca de casca ematé 40%. Os transgênicos apresentaram até 13% de aumentoem número de grãos por espiga, e até 13% de aumento emprodução de grãos.
Plantas transgênicas também apresentaram ASI reduzido,até 40 unidades de calor, esterilidade reduzida em até 50%,e número reduzido de grãos abortados em até 64%. A reduçãoé mais quando as plantas foram cultivadas em uma condiçãode estresse de alta densidade de plantas. Uma medidareduzida desses parâmetros é freqüentemente relacionada àtolerância a estresse biótico.
Além disso, o nível de expressão de transgene estásignificativamente correlacionado com a massa seca deespiga.
Exemplo 7. Transformação de Rmhriao de Soja
Embriões de soja são bombardeados com um plasmideocontendo uma seqüência ARGOS operacionalmente ligada a umpromotor de ubiquitina como se segue. Para induzirembriões somáticos, cotilédones de 3-5 mm em comprimentodissecados a partir de sementes imaturas com superfícieesterilizada do cultivar de soja A2872, são cultivados naluz ou no escuro a 26°C em meio de ágar apropriado por seisa dez semanas. Embriões somáticos produzindo embriõessecundários são, então, excisados e colocados em um meiolíquido adequado. Após seleção repetida para agrupamentosde embriões somáticos que se multiplicaram como embriõesiniciais de estágio globular, as suspensões são mantidascomo descrito abaixo.Culturas em suspensão embriogênicas de soja podem sermantidas em 35 ml de meio liquido em um agitador derotação, 150 rpm, a 26°C com luzes frias brancasfluorescentes em fotoperiodo de 16:8 hr dia/noite. Asculturas são subcultivadas a cada duas semanas inoculando-se aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meioliquido.
Culturas em suspensão embriogênicas de soja podem ser,então, transformadas pelo método de bombardeamento porpistola de partículas (Klein, et al., (1987) Nature(London) 327:70-73, U.S. Patent No. 4.945.050). Uminstrumento Du Pont Biolistic PDS1000/HE (deretroalimentação de hélio) pode ser usado para essastransformações.
Um gene marcador de seleção que pode ser usado parafacilitar a transformação de soja é um transgene compostodo promotor 35S de Vírus de Mosaico de Couve-Flor (Odell,et al., (1985) Nature 313:810-812), o gene de higromicinafosfotransferase de plasmídeo pJR225 (de E. coli; Gritz, etai., (1983) Gene 25:179-188), e a região 3' do gene denopalina sintase do T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacteriumtumefaciens. 0 cassete de expressão compreendendo umaseqüência ARGOS senso operacionalmente ligada ao promotorde ubiquitina pode ser isolada como fragmento de restrição.Esse fragmento pode ser, então, inserido em um sitio derestrição em particular do vetor carregando o genemarcador.
Para 50 μl de uma suspensão de partículas de ouro de 1pm a 60 mg/ml é adicionado (em ordem) : 5 μl DNA (1 pg/μl),20 μl espermidina (0,1 Μ), e 50 μl CaCl2 (2,5 Μ). Apreparação de partículas é, então, agitada por trêsminutos, girada em um microfuge por 10 segundos e osobrenadante removido. As partículas cobertas por DNA são,então, lavadas uma vez em 400 μl de etanol 70% eressuspensas em 40 μΐ de etanol anidro. A suspensãoDNA/partículas pode ser sonicada três vezes por um segundocada. Cinco microlitros das partículas de ouro cobertaspor DNA são, então, carregados em um disco macrocarregador.
Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura de suspensãode duas semanas de idade são colocados em uma placa depetri vazia de 60x15 mm e o líquido residual removido dotecido com uma pipeta. Para cada experimento detransformação, aproximadamente 5-10 placas de tecido sãonormalmente bombardeadas. A pressão de ruptura de membranaé ajustada a 1100 psi, e a câmara evacuada a um vácuo de 28polegadas de mercúrio. O tecido é colocado aaproximadamente 3,5 polegadas da tela de retenção ebombardeado três vezes. Após o bombardeamento, o tecidopode ser dividido ao meio e colocado de volta em liquid ecultivado como descrito acima.
De cinco a sete dias após o bombardeamento, o meioliquido pode ser trocado por meio fresco, e de onze a dozedias após o bombardeamento por meio fresco contendohigromicina a 50 mg/ml. Esse meio seletivo pode serrefrescado semanalmente. De sete a oito semanas após obombardeamento tecido verde transformado pode ser observadocrescendo a partir de agrupamentos embriogênicos necróticosnão transformados. Tecido verde isolado é removido einoculado em frascos individuais para gerar novas culturasem suspensão embriogênicas transformadas, propagadas clonalmente. Cada nova linha pode ser tratada como umevento de transformação independente. Essas suspensõespodem ser, então, subcultivadas e mantidas comoagrupamentos de embriões imaturos ou regeneradas em plantasinteiras por maturação e germinação de embriões somáticos individuais.
Exenqplo 8. Transformação de Tecido Meris'temático de
GirassolTecidos meristemáticos de girassol são transformadoscom um cassete de expressão contendo uma seqüência ARGOSoperacionalmente ligada a um promotor de ubiquitina como sesegue (ver também, European Patent Number EP O 486233, aquiincorporada por referência, e Malone-Schoneberg, et al.,(1994) Plant Science 103:199-207). Sementes de girassolmaduras (Helianthus annuus L.) são descascadas usando umadebulhadora de cabeça de trigo simples. Sementes têm suassuperfícies esterilizadas por 30 minutos em uma soluçãoalvejante de Clorox 20% com a adição de duas gotas de Tween20 por 50 ml de solução. As sementes são enxaguadas duasvezes com água destilada estéril.
Explantes de eixo embriogênico dividido são preparadospor uma modificação de procedimentos descrita porSchrammeijer, et al., (Schrammeijer, et al., (1990) PlantCell Rep. 9:55-60). Sementes são embebidas em águadestilada por 60 minutos após o procedimento deesterilização da superfície. Os cotilédones de cadasemente são, então, quebrados, produzindo uma fratura limpano plano do eixo embriogênico. Após a excisão da ponta daraiz, os explantes são bisseccionados longitudinalmenteentre as folhas primordiais. As duas metades são
colocadas, cortadas com a superfície para cima, em meio GBAconsistindo de Murashige and Skoog elementos minerais(Murashige, et ai., (1962) Physiol. Plant., 15:473-497),adições de vitamina de Shepard (Shepard (1980) EmergentTechniques for the Genetic Improvement of Crops Universityof Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), adenina sulfato40 mg/l, sacarose 30 g/l, 6-benzil-aminopurina (BAP) 0,5mg/l, ácido índolo-3-acético (IAA) 0,25 mg/l, ácidogiberélico (GA3), pH 5,6, e Phytagar 8 g/l.
Os explantes são sujeitos a bombardeamento pormicroprojéteis antes do tratamento com Agrobacterium(Bidney, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Detrinta a quarenta explantes são colocados em um circulo nocentro de uma placa de 60 X 20 mm para este tratamento.Aproximadamente 4,7 mg de microprojéteis de tungstênio de1,8 mm são ressuspensos em 25 ml de tampão TE estéril (10mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) e alíquotas de 1,5 ml sãousadas por bombardeamento. Cada placa é bombardeada duasvezes através de uma tela nytex de 150 mm posicionada 2 cmacima das amostras em um dispositivo de aceleração departículas PDS 1000®.
Agrobacterium tumefaciens linhagem EHA105 desarmada éusada em todos os experimentos de transformação. Um vetorde plasmídeo binário compreendendo o cassete de expressãoque contém o gene ARGOS operacionalmente ligado ao promotorde ubiquitina é introduzido em Agrobacterium linhagemEHA105 via congelamento e descongelamento como descrito porHolsters, et al., (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187.Esse plasmidio compreende ainda um gene marcador de seleçãopara canamicina (i.e., nptll). As bactérias para
experimentos de transformação vegetal são cultivadas de umdia para o outro (28°C e 100 RPM de agitação continua) emmeio liquido YEP (estrato de levedura a 10 gm/1,Bactopeptona a 10 gm/1, e NaCl a 5 gm/1, pH 7,0) com osantibióticos apropriados necessários para manutenção delinhagem bacteriana e plasmidio binário. A suspensão éusada quando alcança uma Οϋβοο de cerca de 0,4 a 0,8. Ascélulas de Agrobacterium são empelotadas e ressuspendidas auma ODeoo final de 0,5 em um meio de inoculação compreendidode MES 12,5 mM pH 5,7, NH4Cl 1 gm/1, e MgSO4 0,3 gm/1.
Explantes frescos bombardeados são colocados em umasuspensão de Agrobacterium, misturados, e deixados semperturbação por 30 minutos. Os explantes são, então,transferidos para meio GBA e co-cultivados, cortados com asuperfície para baixo, a 26°C e dias de 18 horas. Apóstrês dias de co-cultivo, os explantes são transferidos para374B (meio GBA sem reguladores de crescimento e um nívelreduzido de sacarose de 1%) suplementado com cefotaxima 250mg/l e sulfato de canamicina 50 mg/l. Os explantes sãocultivados por duas a cinco semanas em seleção e, então,transferidos para meio fresco 374B sem canamicina por uma aduas semanas de desenvolvimento continuado. Explantes comáreas de crescimento diferenciadas resistentes aantibióticos que não produziram brotos adequados paraexcisão são transferidos para meio GBA contendo 250 mg/lcefotaxime por um segundo tratamento de 3 dias com fitohormônio. Amostras de folhas de brotos verdes resistentesa canamicina são testadas para a presença de NPTII porELISA e para a presença de expressão transgene testando-separa modulação em desenvolvimento meristemático (i.e., umaalteração de tamanho e aparência de broto e meristemasflorais).
Brotos positivos para NPTII são transplantados paraestoque de raiz de plântulas de girassol Pioneer® hybrid6440 cultivadas in vitro. Sementes com a superfícieesterilizada são germinadas em meio 48-0 (sais Murashigeand Skoog meia-força, sacarose 0,5%, gelrite 0,3%, pH 5,6)e cultivadas sob condições descritas para cultivo deexplantes. A porção superior da plântula é removida, umafatia vertical de 1 cm é feita no hipocótilo, e o brototransformado inserido no corte. A área toda é embalada comparafilme para segurar o broto. Plantas enxertadas podemser transferidas para solo após uma semana de cultivo invitro. Enxertos em solo são mantidos sob condições de altaumidade, seguido por uma aclimatação lenta ao ambiente deestufa. Setores transformados de plantas T0 (geraçãoparental) amadurecendo na estufa são identificados porNPTII ELISA e/ou por análise de atividade de ARGOS deextratos de folha, enquanto sementes transgênicas colhidasde plantas T0 positivas para NPTII são identificadas poranálise de atividade de ARGOS de pequenas porções decotilédone de semente seca.
Um protocolo de transformação de girassol alternativopermite a recuperação de progênie transgênica sem o uso depressão de seleção química. Sementes são debulhadas e têma superfície esterilizada por 20 minutos em uma soluçãoalvejante de Clorox 20% com a adição de duas a três gotasde Tween 20 por 100 ml de solução, então enxaguadas trêsvezes com água destilada. Sementes esterilizadas sãoembebidas no escuro a 26°C por 20 horas èm filtro de papelmolhado com água. Os cotilédones e radicais de raiz sãoremovidos, e os explantes de meristema são cultivados em374E (meio GBA consistindo de sais MS, vitaminas Shepard,sulfato de adenina 40 mg/l, sacarose 3%, 6-BAP 0,5 mg/l,IAA 0,25 mg/l, GA 0,1 mg/l, e Phytagar 0,8% em pH 5,6) por24 horas no escuro. As folhas primárias são removidas paraexpor o meristema apical, em torno de 40 explantes sãocolocados com a cúpula apical voltadas para cima em umcírculo de 2 cm no centro de 374M (meio GBA com Phytagar a1,2%), e, então, cultivados em meio por 24 horas no escuro.
Aproximadamente 18,8 mg de partículas de tungstênio de1,8 μπι são ressuspensos em 150 μΐ de etanol absoluto. Apósa sonicação, 8 μΐ são colocados no centro da superfície domacrocarregador. Cada placa é bombardeada duas vezes comdiscos de ruptura a 650 psi na primeira estante a 26 mm deHg de vácuo de hélio.
O plasmídeo de interesse é introduzido emAgrobacterium tumefaciens linhagem EHA105 via congelamentoe descongelamento como descrito previamente. A pelota debactérias cultivada de um dia para o outro a 280C em ummeio líquido YEP (extrato de leveduras 10 g/l, Bactopeptona10 g/l, e NaCl 5 g/l, pH 7,0) na presença de canamicina 50pg/l é ressuspendida em um meio de inoculação (ácidoetanossulfônico 12,5 mM 2-mM 2-(N-morpholino), MES, NH4Cl 1g/l e MgSO4 0,3 g/l em pH 5,7) para alcançar umaconcentração final de 4,0 em OD 600. Explantes bombardeadoscom partículas são transferidos para meio GBA (374E), e umagotícula de suspensão de bactérias é colocada diretamenteem cima do meristema. Os explantes são co-cultivados emmeio por 4 dias, após os quais os explantes sãotransferidos para meio 374C (GBA com sacarose 1% e sem BAP,IAA,GA3 e suplementado com cefotaxime 250 yg/ml) . Asplântulas são cultivadas no meio por cerca de duas semanassob dias condições de incubação de 16 horas e 26°C.
Explantes (em torno de 2 cm de comprimento) de culturade duas semanas em meio 374C são rastreados para umadesenvolvimento de meristema (i.e., uma alteração detamanho e aparência de broto e meristemas florais) . Apósexplantes positivos serem identificados (i.e., uma mudançana expressão de ARGOS), aqueles brotos que falharam emexibir atividade de ARGOS são descartados, e cada explantepositivo é subdividido em explantes nodais. Um explantenodal contém pelo menos um nodo potencial. Os segmentosnodais são cultivados em meio GBA por três a quatro diaspara promover a formação de botões auxiliares a partir decada nodo. Então, eles são transferidos para meio 374C edeixados se desenvolver por quatro semanas adicionais.Botões em desenvolvimento são separados e cultivados porquatro semanas adicionais em meio 374C. Amostras de folhastiradas de cada broto recém recuperado são rastreadasnovamente pelo teste de atividade de proteína apropriado.Neste momento, os brotos positivos recuperados a partir deum único nodo terão sido geralmente enriquecidos no setortransgênico detectado no teste inicial antes da culturanodal.
Brotos recuperados positivos para expressão de ARGOSalterada são enxertados para estoque de raiz de plântulasde girassol Pioneer hybrid 6440 cultivadas in vitro. Osestoques de raiz são preparados da seguinte maneira.Sementes são debulhadas e têm a superfície esterilizada por20 minutos em uma solução alvejante de Clorox 20% com aadição de duas a três gotas de Tiveen 20 por 100 ml desolução, e são enxaguadas três vezes com água destilada.As sementes esterilizadas são germinadas no filtro molhadocom água por três dias, então, elas são transferidas emmeio 48 (sal MS meia-força, sacarose 0,5%, gelrite 0,3% pH5,0) e cultivadas a 26°C no escuro por três dias, entãoincubadas em condições de cultivo de dias de 16 horas. Aporção superior de plântulas selecionadas é removida, umafatia vertical é feita em cada hipocótilo, e um brototransformado é inserido em um corte em V. A área de corte éembalada com parafilme. Após uma semana de cultivo nomeio, as plantas enxertadas são transferidas para solo.Nas primeiras duas semanas, elas são mantidas sob condiçõesde alta umidade para se aclimatar a um ambiente de estufa.Exemplo 9. Variantes de seqüências ARGOS
A. Seqüências de nucleotldeos variantes de ARGOS quenão alteram a seqüência de aminoácidos codificada
As seqüências de nucleotldeos de ARGOS são usadas paragerar seqüências de nucleotldeos variantes tendo aseqüência de nucleotldeos do quadro de iniciação de leituracom cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e 95% de identidade deseqüência de nucleotideo quando comparada à seqüência denucleotldeos de ORF não alterado da SEQ ID NOcorrespondente. Esses variantes funcionais são geradosusando uma tabela de códon padrão. Enquanto a seqüência denucleotldeos dos variantes sãõ alterados, a seqüência deaminoácidos codificada pelos quadros de iniciação deleitura não mudam.
B. Seqüências de aminoácidos variantes depolipeptideos ARGOS
Seqüências de aminoácidos variantes dos polipeptideosARGOS são geradas. Neste exemplo, um aminoácido éalterado. Especificamente, os quadros de iniciação deleitura são revisados para determinar a alteração deaminoácido apropriada. A seleção do aminoácido a sermudado é feita consultando o alinhamento de proteína (comos outros ortóologos e outros membros da família de genesde várias espécies). Um aminoácido é selecionado o qual sesupões não estar sob alta pressão de seleção (não altamente conservado) e que é, ao contrário, facilmente substituídopor um aminoácido com características químicas similares(i.e., cadeia lateral funcional similar). Usando oalinhamento de proteína apresentado na Figura 2, umaminoácido apropriado pode ser mudado. Uma vez oaminoácido visado é identificado, o procedimento destacadona seção C, a seguir, é seguido. Variantes tendo cerca de70%, 75%, 80%, 85%, 90% e 95% de identidade de seqüência deácidos nucléicos são gerados usando este método.
C. Seqüências de aminoácidos variantes adicionais depolipeptideos ARGOS
Neste exemplo, seqüências de proteínas artificiais sãocriadas tendo 80%, 85%, 90% e 95% de identidade em relaçãoà seqüência de proteínas referência. Este último esforçorequer identificar regiões conservadas e variáveis a partirdo alinhamento apresentado na Figura 2 e, então, aaplicação judiciosa de uma tabela de substituições deaminoácidos. Estas partes serão discutidas em maisdetalhes abaixo.Amplamente, a determinação de quais seqüências deaminoácidos são alteradas é feita baseada nas regiõesconservadas entre proteína ARGOS ou entre os outrospolipeptídeos ARGOS. Baseado no alinhamento de seqüência,as várias regiões do polipeptídeo ARGOS que podem serprovavelmente alteradas estão representadas em letrasminúsculas, enquanto as regiões conservadas estãorepresentadas por letras maiúsculas. É reconhecido quesubstituições conservadas podem ser feitas nas regiõesconservadas abaixo sem alterar a função. Além disso, umespecialista entenderá que variantes funcionais daseqüência ARGOS da invenção podem ter alterações deaminoácidos não conservadas menores no domínio conservado.
Seqüências de proteínas artificiais são, então,criadas, as quais são diferentes da original nos intervalosde 80-85%, 85-90%, 90-95% e 95-100% de identidade. Pontosmédios desses intervalos são visados, com amplitude liberalde mais ou menos 1%, por exemplo. As substituições deaminoácidos serão efetuadas por um Perl script padrão. Atabela de substituições é provida abaixo na Tabela 3.Tabela 3. Tabela de substituições
<table>table see original document page 148</column></row><table>
Primeiro, quaisquer aminoácidos conservados naproteína que não deveriam ser mudados são identificados e"cortados" para insulação da substituição. A metionina deinicio será, obviamente, adicionada a esta listaautomaticamente. Em seguida, as mudanças são feitas.
H, C e P não são mudados em qualquer circunstância.As mudanças ocorrerão, primeiro, com isoleucina, varrendodo N-terminal para C-terminal. Então, leucina, e dai parao final da lista até o que alvo desejado seja alcançado.Numerosas substituições interinas podem ser feitas de formaa não causar a reversão de mudanças. A lista é ordenada de1-17, então começa com tantas mudanças de isoleucina comonecessário antes de leucina, e dai até metionina.Claramente, vários aminoácidos não precisarão, destamaneira, ser mudados. L, I e V envolverão uma substituição50:50 das duas substituições ótimas alternativas.
As seqüências de aminoácidos variantes são escritascomo resultado. Perl script é usado para calcular asidentidades percentuais. Usando esse procedimento,variantes dos polipeptideos ARGOS são gerados tendo cercade 80%, 85%, 90% e 95% de identidade de aminoácidos emrelação à seqüência de nucleotideos inicial de ORF nãoalterado de SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 40-71.Todas as publicações e aplicações de patentes nestaespecificação são indicativas do nivel daquelesespecialistas na técnica a qual esta invenção pertence.Todas as publicações e aplicações de patentes são aquiincorporadas por referência na mesma extensão como se cadapublicação ou aplicação de patente individual fosseespecificamente e individualmente indicada por referência.
A invenção foi descrita com referência a váriosavanços e técnicas especificas e preferenciais. Contudo,deveria ser entendido que várias mudanças e modificaçõespodem ser feitas permanecendo no espirito e escopo dainvenção.Listagem de Seqüências
<110> Requerente: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
<120> Titulo: POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSÃO, MÉTODOPARA MODULAR O TAMANHO DE ÓRGÃOS EM PLANTAS, MÉTODO DE MODULAR TODA APLANTA OU O TAMANHO DE ÓRGÃO EM UMA PLANTA, PRODUTO
<130> Referência do documento: P1428
<150> Documento de prioridade: 60/788,123
<151> Data de depósito: 31-03-2006
<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 71
<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1
<211> Comprimento: 879
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 1
tttttagcta gctagatctg gcctgattcg ccgatcgagc ggtggtgaga cggagtgctt 60
cagctcaaag actgctagtg gtaggctggt agctagctgt gtgcctgtgt gcagtgtgca 120
ctgccactgc atgcgcggcg ccttggactt aagacggcag cacacgcacg cgaggaggcg 180
tcggctgaag cgagcgctcc ggcggctccg cttcgctcat caggttcttg agccccggaa 240
acgatgagca cgacccggcc ggaggacacc cagcaactga tcaacagtgc cgccgctagc 300
cccaaccgca gcgcaccgtc cgccgcgccc agcgatatgg agaggggcag cggaaccgcc 360
gcgtcctcgt cgcgcgcttc gacgacgtct cactcccacc agagggccac ccacagggtg 420
gtggaggagg aggaggagga ggagcctagt agcagccgtg gcggcggcag cctctgctcc 480
gggtacctgt cgctcccggc tctgctgctc gtcggcgtca ccgcgtcgct ggtgatcctc 540
ccgctcgtcc tgcccccgct gccgccgccg ccgtcgatgc tgatgctggt ccccgtggca 600
atgctgctcc tgctgctcgt gctggcgttc atgcccacgt cgtccaccgg cggccgcggt 660
ggaaccggac cgacctacat gtagataatc acatcggttt tttttttcct ttctttctct 720
tgtcgtcctt tcgtttggat tttgtgacag agggaggtct tgcgatggat cagttagtcc 780
tcagcttctg ctcttctcga tcgtacgatg tctctgttcg gctaattaat ttgcataggg 840
gtatatatat gctgcctaga tcttaaaagt atctcgtgc 879
<210> SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2
<211> Comprimento: 146
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 2
Met Ser Thr Thr Arg Pro Glu Asp1 5
Ala Ala Ser Pro Asn Arg Ser Ala 20 30
Glu Arg Gly Ser Gly Thr Ala Ala35 40
Ser His Ser His Gln Arg Ala Thr50 55 60
Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser Arg Gly Gly Gly Ser Leu Cys Ser Gly65 70 75 80
Tyr Leu Ser Leu Pro Ala Leu Leu Leu Val Gly Val Thr Ala Ser Leu
85 90 95
Val Ile Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Met
100 105 110
Leu Met Leu Val Pro Val Ala Met Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala
115 120 125
Phe Met Pro Thr Ser Ser Thr Gly Gly Arg Gly Gly Thr Gly Pro Thr
130 135 140
Tyr Met145
<210> SEQ ID NO: SEQ ID NO: 3<211> Comprimento: 936<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 3
caacgtccaa cccctcttgt ctctcgtcta cctctcttct gcccctctgc gtccgtgtct 60
ccctcgtcgt cgctgcgtga ggttgacgac gaccagtcac aggatctgtt cgttcctcat 120
gcgacccagc tagctaaaac tggcatgcat ggacatgcta cgctgctgcg tcaatccatc 180
tcaccagcag tgctagctag ctagatctgg cctgattcgc cgatcgagcg gtcgccggtc 240
agagactcag agttcatgag acggagtgct tcagctcaaa gactgctagt ggtagctagg 300
tagctgcgtg cactgcatgc gcggcgcctt ggacttgaag aaaccgagcg ctccgatagt 360
ccgatccgga aacgatgagt gccgggccgg aggacaccca gcagctgatc aacagtgccg 420
ccgctagccc caaccgcagc gcaccgtccg ccgcgcccag cgatatggag aggggcagcg 480
gaaccgccgc gtcctcgtcg cgcgcttcga cgacgtccca ctcccaccag agggccaccc 540
acagggtggt ggaggaggag gaggaggagc ctagtagcag ccgtggcgcc ggcagcctct 600
gctccgggta cctgtcgctt ccggctctgc tgctcgtcgg cgtcaccgcg tcgctggtga 660
tcctcccgct cgtcctgccc ccgctgccgc cgccgccgtc gttgctgatg ctggtccccg 720
tggcaatgct gctcctgctg ctcgtgctgg cgttcatgcc cacgtcgtcc accggcggcc 780
gcggtggaac cggaccgacc tacatgtaga taatcacatc ggtttttttt tttttccttt 840
ctttctcttg tcgtcctttc gtttggattt tgtgacagag ggaggtcttg cgatggatca 900a gttagtcctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 936
<210> SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4<211> Comprimento: 144<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 4Met Ser Ala Gly Pro1 5
Ala Ser Pro Asn Arg20
Arg Gly Ser Gly Thr35
His Ser His Gln Arg50
Glu Pro Ser Ser Ser65
Glu Asp Thr Gln Gln Leu10
Ser Ala Pro Ser Ala Ala25
Ala Ala Ser Ser Ser Arg40
Ala Thr His Arg Val Val55
Arg Gly Ala Gly Ser Leu70 75
Ile Asn Ser Ala Ala15
Pro Ser Asp Met Glu30
Ala Ser Thr Thr Ser45
Glu Glu Glu Glu Glu60
Cys Ser Gly Tyr Leu
80Ser Leu Pro Ala Leu Leu Leu Val Gly Val Thr Ala Ser Leu Val Ile
85 90 95
Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Met
100 105 110
Leu Val Pro Val Ala Met Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala Phe Met
115 120 125
Pro Thr Ser Ser Thr Gly Gly Arg Gly Gly Thr Gly Pro Thr Tyr Met130 135 140
<210> SEQ ID NO: SEQ ID NO:<211> Comprimento: 1067<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 5
ctccatcctt ccccccggga gcaggagctg cagccaggag tcgagtcggc gtcgtcacgg 60
gagatatcag cttcgctatc accggatccc ccctctgctc cctccgcacc tcccatctgc 120
gctctctgtt ttcttccgcg caccccggct gttggtgtcc cgtccggcgg cgttgctggt 180
ggctgaatcc gagcctttga ggggtctccc gccgccgccg ctcttgagat ctctttattg 240
atctggaggg attaaagagg gattcttgcc ttcctactgg agcaagagaa aggggagaac 300
gtgtttcttc aggcgtggtt gaacagtgag gaccggagaa caatgcgagg ttcgggattt 360
aagatgttct ggctttaggg gccgttcttc tgaagcaggg gacgggcgat tcgaccaccg 420
gagctcagat ctgattacaa aacgttcaga aaacacaagg cgttctcaca ccgcctttca 480
cttcttgctt actttggcaa ccactcactg cgactggtct ccacctccac ctacaccaaa 540
gaacacatgg caagccgatc tagcgcgatg gaaggagggg cggcaataca aaggaggaat 600
gccgtgaagc ggcatctgca gcagcgtcag caggaggcgg atttcctcga caagaaggtc 660
atcgcgtcca cctacttcag catcggggcg ttcctcgtgc tcgcctgcct caccgtctcg 720
ctgctgatac tgccgctggt gctgcctccc ctgccgccgc cgccgtcgct gctgctgtgg 780
ctgccggtct gcctgctcgt cttgctggtt gtactggcct tcatgccgac agatgtgcgc 840
agcatggcct cctcttacct gtaaatagat aaataggtct tggccagatt ttctgtgttt 900
tgcagctgca ggattcgtcc taagacgagt catgagtgta atgtgaagca acttctccag 960
ggatagatct caaccaagtt tggtagccat acgaagttat tgactggaat ttagaacata 1020
tagttgtgca caatttcgaa catatcttgt agtggagagc gggccga 1067
<210> SEQ ID NO: SEQ ID NO: 6<211> Comprimento: 105<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 6
Met Ala Ser Arg Ser Ser Ala Met Glu Gly Gly Ala Ala Ile Gln Arg15 10 15
Arg Asn Ala Val Lys Arg His Leu Gln Gln Arg Gln Gln Glu Ala Asp
20 25 30
Phe Leu Asp Lys Lys Val Ile Ala Ser Thr Tyr Phe Ser Ile Gly Ala
35 40 45
Phe Leu Val Leu Ala Cys Leu Thr Val Ser Leu Leu Ile Leu Pro Leu 50 55 60
Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu Trp Leu Pro65 70 75 80
Val Cys Leu Leu Val Leu Leu Val Val Leu Ala Phe Met Pro Thr Asp
85 90 95
Val Arg Ser Met Ala Ser Ser Tyr Leu100 105
<210> SEQ ID NO: SEQ ID NO: 7
<211> Comprimento: 152
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 7
Met Cys Arg Gly Leu Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Leu Gln Phe1 5 10 15
Gln Ser Gln Asp Cys Ser Arg Gln Gln Arg Gly Thr Thr Gln Ala Pro20 25 30
Pro Gly Arg Ala Ser Glu Ser Val Arg Ala Cys Met Ala Ala Glu Arg 35 40 45
Lys Ala Ala Ser Arg Pro Ala Ala Cys Gly Arg Met Arg Gly Ala Glu50 55 60
Gly Ala Lys Pro Arg Gly Arg Gln Ala Lys Ala Ala Arg Ala Pro Pro65 70 75 80
Gly Gln Gly Tyr Phe Thr Ala Gly Leu Ala Ala Leu Phe Leu Cys Leu85 90 95
Thr Thr Leu Leu Val Phe Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro100 105 110
Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Val Pro Val Gly Leu Met Ala Val Leu 115 120 125
Leu Ala Leu Ala Leu Val Pro Ser Asp Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala130 135 140
Val Ala Ser Ser Ser Cys Val Cys145 150
<210> SEQ ID NO: 8
<211> Comprimento: Comprimento: 119
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 8
Met His Leu Leu Asp Asp Leu Arg Gln Asp Arg Gly Gly Ala Ala Ala1 5 10 15
His Thr Gly Ser Arg Ser Arg Lys Pro Pro Pro Pro Leu Ala Ala Ala20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Ser Ser Thr Ala Ala Thr35 40 45
Ala Thr His Leu Gly Pro Glu Ala Ala Ala Leu Leu Ala Cys Val Thr 50 55 60
Ala Thr Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro65 70 75 80
Pro Pro Leu Leu Leu Leu Val Pro Val Ala Ile Phe Ala Val Leu Leu85 90 95
Leu Leu Val Leu Leu Pro Ser Asp Ala Arg Ala Ala Val Ala Thr Pro100 105 110
Thr Ser Ser Ala Ser Tyr Leu1155/25
<210> SEQ ID NO: 9
<211> Comprimento: 64
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 9
Met Ser Lys Arg Val Leu Met Met Leu Leu Ala Ala Thr Val Ile Leu
15 10 15
Leu Cys Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Leu Phe
20 25 30
Leu Leu Phe Val Pro Val Val Met Met Leu Leu Leu Phe Ser Leu Val
35 40 45
Phe Phe Pro Ser Asn His Cys Pro Cys Ser Ser Pro Thr Phe Thr Gln
50 55 60
<210> SEQ ID NO: 10
<211> Comprimento: 106
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 10
Met Pro Ser Ser Ser Gln Thr Pro Pro Pro Pro Val Gly Arg Thr Ala
15 10 15
Ala His Gly Gly Arg His Lys His Asp Asp Asp Asp Pro Ser Thr Pro
20 25 30
Arg Gly Phe Cys Ala Lys Tyr Phe Ser Arg Glu Ser Cys Leu Leu Leu
35 40 45
Ala Leu Val Thr Val Leu Leu Val Val Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro
50 55 60
Leu Pro Ala Pro Pro Leu Ala Leu Leu Leu Val Pro Val Ala Met Leu
65 70 75 80
Ala Val Leu Leu Val Leu Ala Leu Met Pro Ala Ala Ala Gly Gly Arg
85 90 95
Asn Glu Ala Val Asp Pro Ala Ser Tyr Leu100 105
<210> SEQ ID NO: 11
<211> Comprimento: 118
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 11
Met Met Leu His Cys Thr Phe Ala Ile Ser Glu Ala Pro Ala Arg Ala
15 10 15
Leu Ala Leu Gly Gln Val Ser Val Met Arg Ala Met Pro Gln Glu Glu
20 25 30
Glu Ala Ala Val Ala Thr Thr Thr Met Ala Gly Gly Lys Val Ala Ala
35 40 45
Leu Leu Ala Thr Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu
50 55 60
Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Thr Gln Leu Leu Phe Val Pro Val Val65 70 75 80
Leu Leu Leu Leu Val Ala Ser Leu Ala Phe Cys Pro Ala Ala Thr Ser
85 90 95
Ser Pro Ser Pro Met His Ala Ala Asp His Gly Ser Phe Gly Thr Thr
100 105 110
Gly Ser Pro His Leu Cys115
<210> SEQ ID NO: 12
<211> Comprimento: 12 6
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 12
Met Pro Val Ala Ser Ser Leu Met Ala Met Glu Leu Glu Thr Asp Gln
15 10 15
Leu Ala Trp Ala Glu Gln Gln Arg Gln Gln Asn Arg Arg Gln Thr MetA 20 25 30
Val Val Cys Arg Lys Ser Asp Ala Ala Val Ala Lys Gly Gln Gln Arg
35 40 45
Gln Asn Ala Ser Pro Pro Ser Pro Lys Pro Pro Pro Ala Gly Gly Leu
50 55 60
Ser Ala Glu Ala Phe Leu Val Leu Ala Cys Val Ala Val Ser Leu Ile65 70 75 80
Val Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Ser Pro Pro Pro Pro Leu Leu
85 90 95
Leu Leu Val Pro Val Cys Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Thr100 105 110
Phe Val Pro Ser Asp Val Arg Ser Met Pro Ser Ser Asn Leu115 120 125
<210> SEQ ID NO: 13<211> Comprimento: 103<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 13Met Lys Thr Thr Leu Ala Val Val Glu Gly Thr Arg Ala His Ile Val15 10 15
Asn Leu Ala Asn Ser Arg Ala Ser Arg Leu Asn Glu Arg Leu Ile Asp
20 25 30
Pro Ala Ile Glu Ser Arg Ser Ile Ala Gly Ala Thr Pro Ala Pro Phe35 40 45
Glu Met Glu Thr Ala Met Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Ala Phe
50 55 60
Leu Leu Cys Tyr Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Ser Pro Pro65 70 75 80
Ala Leu Phe Ile Trp Ile Pro Val Phe Met Leu Leu Leu Leu Phe Ala
85 90 95
Leu Ala Leu Phe Pro Val Gln100<210> SEQ ID NO: 14
<211> Comprimento: 68
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 14
Met Val Met Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu Leu 20 25 30
Val Pro Val Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ala Phe Leu Pro
35 40 45
Asn Arg Asp Val Val Val Tyr Gly Gln Gln Pro Ala Ala Asp Gln Phe50 55 60
Phe Phe Arg Gln65
<210> SEQ ID NO: 15<211> Comprimento: 147<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 15
Met Ser Phe Ala Ile Arg Ser Ser Glu Pro Glu Phe Trp Phe Leu Ile1 5 10 15
Pro Ser Glu Glu Ala Ala Val Ala Val Ala Ala His Arg Leu Val Val
20 25 30
Met Asp Gln Arg Arg Ser Gly Ser Ala Tyr Arg Pro Lys Arg Thr His 35 40 45
Met Ala Ala Ala Glu Asp Glu His Arg Arg Pro Gly Thr Ser Ser Arg
50 55 60
Arg Arg Val Ala Pro Thr Pro Thr Thr Gln Thr Gln Thr Gln Thr Ala65 70 75 80
Pro Gly Tyr Phe Thr Val Glu Leu Val Met Ala Phe Val Cys Val Thr
85 90 95
Ala Ser Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro
100 105 110
Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Pro Val Cys Leu Leu Ala Val Leu Val 115 120 125
Ala Met Ala Phe Val Pro Leu Asp Ala Gln Ser Asn Val Val Gly Ser
130 135 140
Ser Cys Leu145
<210> SEQ ID NO: 16
<211> Comprimento: 130
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 16
Met Glu Lys Gly Arg Gly Lys Ala Cys Gly Gly Gly Ser Thr Ala Pro1 5 10 15
Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Gly Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly20 25 30
Ser Asn Ile Arg Glu Ala Ala Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Val Trp
35 40 45
Gly Lys Tyr Phe Ser Val Glu Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Val Thr 50 55 60
Ala Ser Leu Val Ile Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro65 70 75 80
Pro Ser Met Leu Met Leu Val Pro Val Ala Met Leu Val Leu Leu Leu85 90 95
Ala Leu Ala Phe Met Pro Thr Thr Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ala Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Asn Gly Ala Thr Thr Gly His Ala Pro115 120 125
Tyr Leu 130
<210> SEQ ID NO: 17<211> Comprimento: 127<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 17
Met Arg Gly Val Ile Leu Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Ala Met Ala Gly1 5 10 15
His Arg Ser Thr Ala Ala Ala Thr Gly Gly Arg Leu Tyr Gly Gln Val
20 25 30
Gly Val Lys Arg Arg Val Val Glu Glu Thr Ala Ala Ala Val Glu Val35 40 45
30 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Leu Gly Val Glu Ala Ala Val Leu Leu50 55 60
Gly Val Val Thr Ala Thr Leu Leu Val Leu Pro Leu Leu Leu Pro Pro65 70 75 80
Leu Pro Pro Pro Pro Pro Met Leu Leu Leu Val Pro Val Ala Ile Phe35 85 90 95
Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Ser Asp Ala Lys Ser Ile
100 105 110
Ala Ala Ala Gly Arg Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Leu115 120 125
<210> SEQ ID NO: 18
<211> Comprimento: 105
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 18
Met Gln Glu Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Pro Val1 5 10 15
50 Met Asp Gly Gly Lys Ala Met Ala Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Ala
20 25 30
Val Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu
35 40 45
Pro Val Val Leu Leu Leu Leu Val Val Ser Leu Ala Phe Phe Pro Ala55 50 55 60Ala Gly Ser Asp Gly Val Val Ala Ala Ala Ala Val Ala Gly Thr Tyr65 70 75 80
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Arg Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ser
85 90 95
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Gln Leu100 105
<210> SEQ ID NO: 19<211> Comprimento: 105<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 19Met Glu Gly Val Gly Ala Arg Gln Arg Arg Asn Pro Leu Ile Pro Arg15 10 15
Pro Asn Gly Ser Lys Arg His Leu Gln His Gln His Gln Pro Asn Ala20 25 30
fe Ala Glu Lys Lys Thr Ala Ala Thr Ser Asn Tyr Phe Ser Ile Glu Ala 35 40 45
Phe Leu Val Leu Val Phe Leu Thr Met Ser Leu Leu Ile Leu Pro Leu
50 55 60
Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Pro65 70 75 80
Val Cys Leu Leu Ile Leu Leu Val Val Leu Ala Phe Met Pro Thr Asp
85 90 95
Val Arg Ser Met Ala Ser Ser Tyr Leu100 105
<210> SEQ ID NO: 20<211> Comprimento: 120<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 20
»Met Glu Glu Gln Met Phe Arg Glu Gln Gln Met Gln Arg Gly Gly Arg
15 10 15
His His Gln His His Thr Thr Arg Glu Gln Glu Gln Gln Gln Lys Gln 20 25 30
Gln Gln Arg Arg Arg Leu Met Asn Asn Ala Thr Asn Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Asp Gly Gly Ser Arg Cys Tyr Phe Ser Thr Glu Ala Ile Leu Val Leu50 55 60
Ala Cys Val Thr Val Ser Leu Leu Val Leu Pro Leu Ile Leu Pro Pro65 70 75 80
Leu Pro Pro Pro Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Cys Leu Leu
85 90 95
Ala Leu Leu Val Val Leu Ala Phe Met Pro Thr Asp Met Arg Thr Met 100 105 110
Ala Ser Ser Tyr Phe Phe Cys Leu115 120<210> SEQ ID NO: 21<211> Comprimento: 96<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 21
Met Met Met Val His Pro Arg Asp Gln Val Gly Gly Glu Thr His Lys1 5 10 15
Asn Leu Val Glu Pro Asn Val Ala Ala Ser Lys Lys Ala Arg Asn Cys20 25 30
Ala Cys Met Val Ser Tyr Ser Val Leu Ile Leu Ala Leu Leu Thr Leu35 40 45
Ser Ile Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro50 55 60
Leu Leu Leu Leu Phe Val Pro Val Phe Ile Leu Val Val Leu Phe Phe65 70 75 80
Leu Ala Phe Ser Pro Ser Thr Leu Pro Asn Met Ala Val Leu Thr Ser 85 90 95
<210> SEQ ID NO: 22<211> Comprimento: 96<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 22
Met Met Met Val His Pro Arg Asp Gln Val Gly Gly Asp Thr His Lys1 5 10 15
Asn Leu Val Ala Pro Asn Val Ala Ala Ser Lys Lys Ala Arg Asn Cys20 25 30
Ala Cys Met Val Ser Tyr Ser Val Leu Ile Leu Ala Leu Leu Thr Leu35 40 45
Phe Ile Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Ala Pro Pro50 55 60
Leu Leu Leu Leu Phe Val Pro Val Phe Leu Leu Val Val Leu Phe Phe65 70 75 80
Leu Ala Phe Ser Pro Ser Thr Leu Pro Asn Met Ala Val Leu Thr Ser85 90 95
<210> SEQ ID NO: 23<211> Comprimento: 66<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 23
Met Ala Arg Cys Phe Gly Leu Gly Ser Val Leu Val Leu Ala Ala Leu1 5 10 15
Ala Ala Ser Met Val Val Leu Pro Leu Met Leu Pro Pro Leu Pro Pro20 25 30
Pro Pro Leu Val Leu Leu Phe Phe Pro Val Gly Ile Met Ala Ala Leu35 40 45
Met Leu Leu Ala Phe Ser Pro Ser Asp Gln Asn Gly Val Val Tyr Ala50 55 60Ser Thr65
<210> SEQ ID NO: 24<211> Comprimento: 66<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 24Met Ala Arg Cys Phe Gly Leu Gly Ser Val Leu Val Leu Ala Ala Leu1 5 10 15
Ala Ala Ser Met Val Val Leu Pro Leu Met Leu Pro Pro Leu Pro Pro20 25 30
Pro Pro Leu Val Phe Phe Phe Phe Pro Val Gly Ile Met Ala Ala Leu35 40 45
Met Leu Leu Val Phe Ser Pro Ser Asp Gln Asn Gly Val Val Tyr Ala50 55 60
Thr Thr65
<210> SEQ ID NO: 25<211> Comprimento: 90<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 25Met Ser Ser Trp Leu Ile His Tyr Asn Lys Arg Phe Ile Ile Ser Ile1 5 10 15
Ser Leu Ala Phe Met Leu Arg Leu Phe Gly Phe Lys Ser Thr Met Phe20 25 30
Met Val Val Leu Thr Ile Ala Ile Leu Val Leu Pro Leu Met Leu Pro35 40 45
Pro Leu Pro Pro Pro Pro Met Ile Leu Met Leu Val Pro Leu Val Ile50 55 60
Met Leu Leu Leu Val Lys Leu Ala Leu Tyr Ser Lys His Gly Pro Ala65 70 75 80
Asp Val Ile Tyr Gln Cys Asn Phe Thr Trp85 90
<210> SEQ ID NO: 26<211> Comprimento: 130<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 26Met Ile Arg Glu Ile Ser Asn Leu Gln Lys Asp Ile Ile Asn Ile Gln1 5 10 15
Asp Ser Tyr Ser Asn Asn Arg Val Met Asp Val Gly Arg Asn Asn Arg20 25 30
Lys Asn Met Ser Phe Arg Ser Ser Pro Glu Lys Ser Lys Gln Glu Leu35 40 45
Arg Arg Ser Phe Ser Ala Gln Lys Arg Met Met Ile Pro Ala Asn Tyr50 55 60
Phe Ser Leu Glu Ser Leu Phe Leu Leu Val Gly Leu Thr Ala Ser Leu65 70 75 80
Leu Ile Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Phe Met 85 90 95
Leu Leu Leu Val Pro Ile Gly Ile Met Val Leu Leu Val Val Leu Ala
100 105 110
Phe Met Pro Ser Ser His Ser Asn Ala Asn Thr Asp Val Thr Cys Asn115 120 125
Phe Met130
<210> SEQ ID NO: 27<211> Comprimento: 135<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 27
Met Ile Arg Glu Phe Ser Ser Leu Gln Asn Asp Ile Ile Asn Ile Gln1 5 10 15
Glu His Tyr Ser Leu Asn Asn Asn Met Asp Val Arg Gly Asp His Asn
20 25 30
Arg Lys Asn Thr Ser Phe Arg Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ile Met Gly 35 40 45
Lys Gln Glu Leu Phe Arg Tnr Leu Ser Ser Gln Asn Ser Pro Arg Arg
50 55 60
Leu Ile Ser Ala Ser Tyr Phe Ser Leu Glu Ser Met Val Val Leu Val65 70 75 80
Gly Leu Thr Ala Ser Leu Leu Ile Leu Pro Leu Ile Leu Pro Pro Leu
85 90 95
Pro Pro Pro Pro Phe Met Leu Leu Leu Ile Pro Ile Gly Ile Met Val
100 105 110
Leu Leu Met Val Leu Ala Phe Met Pro Ser Ser Asn Ser Lys His Val 115 120 125
Ser Ser Ser Ser Thr Phe Metfe 130 135
<210> SEQ ID NO: 28<211> Comprimento: 88<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 28
Met Arg Val His Asp Gln Arg Leu Arg Phe Asp Val Thr Pro Lys Pro
15 10 15
Met Gly Leu Asn Gly Ser Ser Leu Ile Thr Ala Arg Ser Val Ala Leu20 25 30
Leu Leu Phe Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ile Leu Pro Pro Phe Leu Pro35 40 45
Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala Thr Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu
50 55 60
Met Ile Leu Leu Ile Phe Leu Ala Phe Ser Pro Ser Asn Glu Pro Ser65 70 75 80Leu Ala Val Glu Pro Leu Asp Pro85
<210> SEQ ID NO: 29
<211> Comprimento: 146
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 29
Met Ser Thr Gly Arg Pro Glu Asp Ile Gln Gln Leu Ile Asn Ser Ala1 5 10 15
Thr Ser Ser Pro Asn Arg Thr Ser Pro Ser Ala Ser Pro Ser Asp Met20 25 30
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ser Pro Arg Ala Ser Thr Ser Asp35 40 45
Arg Arg Leu Gln Arg Ala Ala His Ser His Arg Glu Glu Trp Glu Pro50 55 60
Íf Ala Ala Ala Ala Ser Gly Asp Gly Gly Thr Gly Ser Leu Trp Ser Arg65 70 75 80
Tyr Phe Ser Leu Pro Val Leu Leu Leu Val Gly Val Thr Ala Ser Leu85 90 95
Val Ile Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Met100 105 110
Leu Met Leu Val Pro Val Ala Met Leu Val Leu Leu Leu Val Leu Ala115 120 125
Phe Met Pro Thr Ser Ser Val Arg Ala Gly Thr Gly Thr Gly Pro Thr130 135 140
Tyr Met145
<210> SEQ ID NO: 30
<211> Comprimento: 88
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 30
Asn Ala Val Lys Arg His Leu Gln Gln Arg Gln Gln Glu Ala Asp Phe1 5 10 15
His Asp Lys Lys Val Ile Ala Ser Thr Tyr Phe Ser Ile Gly Ala Phe20 25 30
Leu Val Leu Ala Cys Leu Thr Phe Ser Leu Leu Ile Leu Pro Leu Val35 40 45
Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu Trp Leu Pro Val50 55 60
Cys Leu Leu Val Leu Leu Val Val Leu Ala Phe Met Pro Thr Asp Val65 70 75 80
Arg Ser Met Ala Ser Ser Tyr Leu 85<210> SEQ ID NO: 31<211> Comprimento: 107<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 31
Met Ala Ser Arg Ser Ser Ala Leu Glu Gly Gly Gly Ala Ala Ile Gln
1 5 10 15
Arg Arg Asn Asn Ala Val Lys Arg His Leu Gln Gln Arg Gln Gln Glu 20 25 30
Ala Asp Phe His Asp Lys Lys Val Ile Ala Ser Thr Tyr Phe Ser Ile
35 40 45
Gly Ala Phe Leu Val Leu Ala Cys Leu Thr Phe Ser Leu Leu Ile Leu50 55 60
15 Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Leu Trp65 70 75 80
Leu Pro Val Cys Leu Leu Val Leu Leu Val Val Leu Ala Phe Met Pro85 90 95
fc Thr Asp Val Arg Ser Val Ala Ala Ser Tyr Leu 100 105
<210> SEQ ID NO: 32<211> Comprimento: 58 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 32
Met Met Leu Leu Val Ala Thr Val Ile Leu Leu Cys Leu Pro Leu Val 1 5 10 15
Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Leu Phe Leu Leu Phe Val Pro Val
20 25 30
Val Met Met Leu Leu Leu Phe Ser Leu Val Leu Phe Pro Ser His His35 40 45
Cys Ala Cys Ser Ser Pro Thr Phe Thr Gln50 55
<210> SEQ ID NO: 33 <211> Comprimento: 148<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 33 Met Ser Phe Val Ala Gly Ser Ser Glu Ala Asp Gln Leu Trp Phe Leu 1 5 10 15
Ile Pro Ser Glu Gln Ala Arg Ala His Ala Val Gln Pro His His Pro
20 25 30
Leu Ala Met Asp Arg Arg Ser Ser Ala Arg Arg Arg Gly Asp Pro His 35 40 45
Pro His Arg Arg Gly Ala Met His Gly Ala Ala Glu Gln Gln Lys Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Arg Gly Arg Pro Gln Gly Thr Arg Ala Ala Pro Pro Val65 70 75 80
Pro Pro Gly Tyr Phe Thr Ala Glu Leu Val Leu Ala Phe Leu Phe Val85 90 95
Ala Val Ser Leu Ala Phe Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Ser Pro
100 105 110
Pro Pro Phe Leu Leu Leu Leu Val Pro Val Gly Leu Leu Ala Val Leu
115 120 125
Leu Ala Leu Ala Phe Val Pro Leu Asp Ala His Ser His Leu Val Val
130 135 140
Gly Ser Ser Arg145
<210> SEQ ID NO: 34
<211> Comprimento: 120
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 34
Met Ala Glu Glu Arg Lys Gln Ala Gly Ser Arg Trp Pro Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Arg Met Arg Asp Ala Glu Gly Gly Ser Gly Lys Met
20 25 30
Arg Gly Arg Gln Ala Thr Lys Ala Arg Pro Val Val Leu Ala Pro Pro
35 40 45
Gly Gln Gly Tyr Phe Thr Ala Gly Leu Ala Ala Leu Phe Leu Cys Leu
50 55 60
Thr Ala Leu Leu Val Phe Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro
65 70 75 80
Pro Pro Tyr Leu Leu Leu Leu Val Pro Val Gly Leu Met Ala Val Leu
85 90 95
Leu Ala Leu Val Ala Leu Val Pro Ser Asp Gly Arg Ala Ala Thr Ala
100 105 110
Ala Val Ala Ser Ser Cys Val Cys115 120
<210> SEQ ID NO: 35
<211> Comprimento: 101
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 35
Met Arg Arg Ala Val Pro Gln Glu Glu Ala Val Ala Ala Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Thr Met Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Leu Leu Ala Thr Ala Ala
20 25 30
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Thr Gln Leu Leu Phe Val Pro Val Val Met Leu Leu Leu Val Ala
50 55 60
50 Ser Leu Ala Phe Cys Pro Thr Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Ser Lys Leu Ala Asp Ala Asp His Gly Ser Ser Phe Arg Thr Thr Gly
85 90 95
Ser Pro His Leu Arg
100<210> SEQ ID NO: 36<211> Comprimento: 106<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 36
Met Pro Ser Pro Ser Gln Thr Ser Pro Pro Val Gly Arg Arg Thr Ala
15 10 15
His Gly Gly Trp His Lys His Asp Asp Pro Ser Thr Pro Arg Gly Phe20 25 30
Cys Thr Lys Tyr Phe Ser Val Glu Ser Cys Leu Leu Leu Ala Leu Val
35 40 45
Ala Val Leu Leu Leu Val Leu Pro Leu Val Leu Pro Pro Leu Pro Pro50 55 60
Pro Pro Leu Ala Val Leu Leu Val Pro Val Ala Met Leu Ala Val Leu65 70 75 80
Leu Val Leu Ala Leu Met Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Arg85 90 95
Asn Glu Val Val Asp Pro Ala Ser Tyr Leu100 105
<210> SEQ ID NO: 37<211> Comprimento: 72<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 37
Met Glu Arg Ser Met Val Thr Met Leu Leu Leu Ala Thr Ala Ala Val1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ser Ser Leu Pro Pro Pro
20 25 30
Pro Ser Leu Leu Leu Val Val Pro Val Val Leu Leu Leu Ser Leu Leu35 40 45
Ser Leu Ala Phe Leu Pro Thr Arg Asp Asp Asp Asp Ala Ile Ala Ile50 55 60
Tyr Gly Ser Leu Arg Ser Val Gln65 70
<210> SEQ ID NO: 38<211> Comprimento: 13<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Artificial Sequence
<220> Características:
<223> Outras informações: primer
<400> Seqüência: Seqüência: 38cgctagcccc aac<210> SEQ ID NO: 39
<211> Comprimento: 27
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Artificial Sequence
<220> Características:
<223> Outras informações: primer
<400> Seqüência: 39cacataacac acaactttga tgcccac
<210> SEQ ID NO: 40
<211> Comprimento: 459
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 40
gctccagcgc ttcaatttca gtcccaggat 60
gcaccgcccg gccgagcgag cgagtccgtg 120
gcctcccgcc cggccgcctg cgggcgaatg 180
cgtcaggcaa aggcagcgcg ggcaccaccg 240
gcgctgttcc tttgcctcac cacgctgctc 300
ccgccgccgc cgttgctgct gctgctcgtg 360
ctggcgctcg tgccgtccga cggccgggcc 420gtgtgctga 459
<210> SEQ ID NO: 41
<211> Comprimento: 360
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 41
cgcggcggcg cggccgccca caccggcagc 60
gccgccgccg ccgccgccgc gggggtcccg 120
cacctgggcc cggaggcggc ggcgctgctg 180
ccgctggtcc tgccgcccct gccgccgccg 240
atcttcgccg tcctgctact cctcgtgctc 300
acgcccacct cctccgcctc ctacttgtag 360
<210> SEQ ID NO: 42
<211> Comprimento: 195
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 42
gcggcgacag tgatcctcct gtgcctgccg 60
ctgtttcttc tcttcgtccc tgtggtgatg 120
ccgtctaacc actgtccatg ctcttctccg 180
accttcactc agtaa 195<210> SEQ ID NO: 43
<211> Comprimento: 321
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 43
atgccgtcat cgtcgcagac accgccgccg ccggtcggga ggactgctgc tcacggcggc 60cggcacaagc acgacgatga cgacccaagc acgccgaggg gcttctgcgc caagtacttc 120tccagggagt cgtgcctcct gctcgccctc gtcaccgtgc tgctggtggt gctcccgctc 180gtcctgccgc cgctcccggc gccgccgttg gcgctgctgc tcgtgccggt cgcaatgttg 240gcggtgctgc tggtgctcgc gctcatgccg gcggcggcag gtggccggaa cgaggctgtg 300gacccggcgt cgtacttgta g 321
<210> SEQ ID NO: 44
<211> Comprimento: 357
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 44
atgatgctgc actgcacatt tgctatatct gaggctcctg cgcgcgcctt ggcccttggc 60caggtgtctg tcatgcgggc gatgccgcag gaagaagaag ccgcggtggc gacgacgacc 120atggccgggg gcaaggtggc ggcgctgctg gccacggcgg ccgcgctgct gctgctgctc 180ccgctggcgc tgccgccgct gccgccgccg cccacgcagc tgttgttcgt ccccgtggtc 240ttgctgctcc tcgtggcgtc cctcgcgttc tgccccgccg cgacctcctc gccgtcgccg 300atgcatgccg ccgaccacgg gtcgttcggg accactggat caccgcacct atgttga 357
<210> SEQ ID NO: 45
<211> Comprimento: 381
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 45
35 atgccggttg cttcgtcgct aatggcgatg gagttggaga cggaccaact cgcctgggcg 60gagcagcagc ggcagcagaa taggaggcag accatggtcg tctgcagaaa gagcgacgca 120gcggtggcca aagggcagca gcgtcagaac gcttcgccgc cgtcgcccaa gcctccgccc 180gcgggcgggc tcagcgcgga ggcgttcttg gttctggcgt gcgtcgccgt gtcgctcatc 240gtgctgccgc tggtcctgcc gccgctgtcg cccccgccgc ctctgctgct gctggtgccg 300gtgtgcctgc tcctgctcct cgccgcgctc gccaccttcg tgccgtcgga tgtcaggagc 360atgccatcct ccaacttgta a 381
<210> SEQ ID NO: 46
45 <211> Comprimento: 312
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 46
atgaagacga ctttggctgt ggtggaaggg accagggcac atattgttaa cctggcgaat 60tcaagggcgt ctcgattgaa cgaacggctg atcgatccag caatcgagtc tcgatcgatt 120gccggagcaa cacctgcgcc gtttgagatg gagacggcaa tggtgctgct gctgcttgca 180ctggtcgcct tccttctctg ctaccctctt gttctaccac cgctgccgcc ttcgcccccg 240gccctgttca tctggatacc ggtgttcatg ctgctcctgc tcttcgccct tgccctcttc 300cctgttcagt aa 312<210> SEQ ID NO: 47
<211> Comprimento: 207
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 47
atggtgatgc ttctcctcgc tgcggcggcg gtgctgctgc tgctgctccc gctgctgctc 60ccgccgctgc cgccgccgcc gtcgctgctg ctgctcgtcc ccgtcgtgct gctgctggcg 120ctcctttccc tcgctttcct ccccaaccgc gacgtcgtcg tctacggaca gcagccagct 180gcggatcaat tcttcttccg acaatga 207
<210> SEQ ID NO: 48
<211> Comprimento: 444
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 48
atgagctttg caatccgcag ctctgagcct gaattctggt tcttgatccc gtcggaagag 60
gcagcagtag cagtcgcagc acatcggctg gtggtgatgg atcagaggag aagcggatca 120
gcttatcgtc ctaagcggac acatatggcg gcggcggagg acgagcaccg gcggccgggg 180
acgtcgagcc gccgccgggt ggcgccgacg ccgacgacgc agacgcagac gcagacggcg 240
cccggctact tcaccgtcga gctggtgatg gcgttcgtct gcgtgaccgc gtcgctcgtg 300
ctgctgccgc tcgtcctgcc gccgttgccg ccgccgccgt cgctgctgct ggtggtgccg 360
gtgtgcctgc tcgccgtcct ggtggccatg gcgttcgtcc cgctcgacgc gcagagcaac 420
gtcgtcggct cgtcttgctt gtag 444
<210> SEQ ID NO: 49
<211> Comprimento: 537
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 49
atgtacttgt tgagcccaag aaatggcgac gaggaggacg aacaggagga aatccaggag 60
ctgatcagcg acgacgagcc gcccaatctc aagttggcat cctgcgccac tgcagccagc 120
agcagcagca gcagcggcag cgacatggag aagggaagag gtaaagcctg cggcggcggg 180
agtacggcgc cgccgccgcc gccgccgtcg tcgtcaggta aatccggcgg cggcggcggc 240
agcaatatca gggaggcggc ggctagcggc ggcggcggcg gcgtgtgggg caagtacttc 300
tcggtggagt cgctgctcct gctggtgtgc gtgacggcgt cgctggtgat cctcccgctc 360
gtgctgccgc cgctgccccc gccgccgtcg atgctgatgc tggtgccggt ggcgatgctg 420
gtgctgctgc tggcgctggc gttcatgccg acgacgacgt cgtcgtcgtc gtccgccggc 480
ggcggcggcg gcggcggccg caatggggcg acgacgggac atgctcccta cttgtag 537
<210> SEQ ID NO: 50
<211> Comprimento: 384
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 50
atgcgaggag tcatcttgct gcgttacgag gaggacgcca tggccgggca caggtccacg 60
gcggcggcga cgggagggag attgtacgga caggtgggag tgaagcggag agtggtggag 120
gagacggcgg cggcggtgga agtaggcgga ggaggaggag ggtacttggg ggtggaggcg 180
gcggtgctgc tcggggtggt gacggcgacg ctgctggtgc tgccgctgct gctgccgccg 240ctgccgccgc cgccgccgat gctgctgctc gtgcccgtcg ccatcttcgc cgtgctcctc 300ctcctcgtcc tgctgccctc cgacgccaag tccatcgccg ccgctggccg accctcttct 360tcctcctcct cctcctacct gtag 384
<210> SEQ ID NO: 51<211> Comprimento: 318<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 51atgcaagaag aagcggcgtc gtcgtcgtcg tcgtcggcgt cgccggtgat ggacgggggc 60aaggcgatgg cggtgctgct ggcggtggcg gccgcggtgc tgctgctgct cccgctcgtg 120ctgccgtcgc tgctgctgct cctccccgtg gtgctgctcc tgctggtggt ttccctcgcc 180ttcttccccg cggccggcag cgacggcgtc gtcgccgccg ccgcggtcgc cggcacctac 240cagccgccgc cgcctccgcc tgctcggtcg tcaccgccgc cgtcgtcgtc gtcgtcatcg 300tcgtcgcggc agctgtga 318
<210> SEQ ID NO: 52<211> Comprimento: 318<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 52atggaaggtg taggtgctag gcagaggagg aaccctctga tacccagacc aaacggttca 60aagaggcatc tgcagcatca gcatcagcca aatgctgccg agaagaagac cgccgcgaca 120tcgaattact tcagtatcga ggcgttcctc gtgctcgtct tcctcaccat gtcattgctc 180atacttccat tggtgcttcc cccattgcct ccgccgccat cgctgctgct gctgctgcca 240gtctgcctgc tcatcctgct ggttgtgctg gccttcatgc caacggatgt gcggagcatg 300gcttcctctt acttgtaa 318
<210> SEQ ID NO: 53<211> Comprimento: 363<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 53atggaggaac agatgttcag agagcagcaacacaccacaa gggaacaaga acaacagcagaatgcgacca acggcggcgg cggcgacggcatcctggtgc tggcatgcgt caccgtgtcgctgccgccgc cgccgacgct gctgctgctggtgctggcct tcatgcccac tgacatgaggtga
atgcagagag gtggaaggca tcatcagcat 60aagcagcagc agcggcggcg gctgatgaac 120ggcagcaggt gctacttcag cacggaggcc 180ctgctggtgc tgccgctcat cctgccgccg 240ctgccggtgt gcttgctggc gctcctggtg 300accatggcct cttcctactt tttttgtttg 360363
<210> SEQ ID NO: 54<211> Comprimento: 291<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 54atgatgatgg tgcatcctcg tgatcaagta ggtggagaga cacacaagaa tttggtggag 60ccaaacgtgg cagcttctaa gaaagctagattgattttgg ctcttctcac tttgtccattccgccaccac ccttgttgct tctctttgttttggcctttt caccctccac actacccaac
aattgtgcat gcatggtaag ttactcggtg 120ttgttgctac ctttggtgtt acctcctctg 180ccagttttca tcttggtggt tctctttttc 240atggctgttc ttacatcatg a 291
<210> SEQ ID NO: 55
<211> Comprimento: 291
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 55
atgatgatgg tgcatcctcg tgatcaagtaccaaacgtgg cagcttctaa gaaagctagattgattttgg ctcttctgac tttgttcatt
ccggcaccac ccttgttgct tctctttgttttggcctttt caccttccac actacccaac
<210> SEQ ID NO: 56<211> Comprimento: 312<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Glycine max
ggtggagaca cacacaagaa tttggtggcg 60aattgtgcat gcatggtaag ttattcggtg 120ttgttgctgc ctttggtgtt gcctcctctg 180cctgttttcc tcttggtggt tctctttttc 240atggctgttc ttacatcatg a 291
<400> Seqüência: 56
atggcgcgtt gttttggttt aggttccgttgtggttctgc cgctgatgct gccgccgctccccgtcggga tcatggcggc gctcatgttggtcgtttacg cgtcgacgta gcgaaggtggtggggtttct tgaaggttcc gatgggattgttacggtgtt aa
ctggttctgg cggcgctcgc ggcgtcgatg 60ccgccgccgc cactagttct tctcttcttc 120ctcgcgttct cgccatcaga tcaaaacggc 180tgggaaaccg gatcagccgg tgccacattt 240cttcgtttca tgtttttttt tttttttaag 300
312
<210> SEQ ID NO: 57<211> Comprimento: 201
<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 57
atggcgcgtt gtttcggctt aggttccgtt
gtggtgctgc cgttgatgct cccgccgctc
cccgtcggga tcatggcggc gctcatgttg
gtcgtttacg ccaccacgta a
ctggttctgg cggcgctcgc ggcgtcgatg 60ccgccgccgc cgctggtttt tttttttttc 120cttgtgttct cgccgtcgga tcaaaacggc 180
201
<210> SEQ ID NO: 58<211> Comprimento: 273<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Glycine max
<400> Seqüência: 58
atgagctctt ggttgattca ctacaacaag agattcataa taagcatctc attagcgttt 60atgctaaggc tttttgggtt taaatcaacc atgttcatgg tggtgctgac catagcaatc 120ttggttctac cactgatgct accacctcta cctccaccac caatgattct tatgttggtg 180cctcttgtga taatgctgct tctggtgaaa ttggctttgt attccaaaca tggccctgca 240gatgtcattt atcagtgtaa ttttacttgg tag 273
<210> SEQ ID NO: 59<211> Comprimento: 393<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 59atgattcgag aaatctcaaa cttacaaaaaaacaaccgag tcatggacgt cggaagaaacccggagaaaa gcaagcaaga gttacggcggccggcgaatt atttcagttt agagtctctgttaatacttc cgttagtttt gccgccgttacccattggga ttatggtttt actcgtcgttgctaatacag atgtaacttg caatttcatg
gatattataa acattcaaga cagttattcg 60
aaccggaaaa acatgagctt tcgaagttcg 120agtttctcgg cgcagaaaag gatgatgatc 180ttcctattgg ttggtctaac ggcatctctg 240
cctccgcctc cgtttatgct gctattggtt 300cttgccttca tgccttcttc tcattctaat 360taa 393
<210> SEQ ID NO: 60<211> Comprimento: 408<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 60atgattcgtg agttctccag tctacaaaacctcaacaaca acatggacgt gagaggagattcagctccag ctccgattat ggggaagcaaagtccaagga ggctaatatc agcgagttacggtctcacag catctctctt gatcttaccgtttatgctgc ttttgattcc tattgggattccttcttcta attccaaaca tgtttcttct
gacatcataa acattcaaga acattattct 60
cataaccgga aaaacacgag ttttcgtggt 120
gaattgtttc ggacattgtc gtcgcagaac 180
ttcagtttag aatcaatggt tgtgcttgtt 240
ttgattcttc caccattgcc tcctcctcct 300
atggttttgc ttatggttct tgctttcatg 360
tcttccactt ttatgtaa 408
<210> SEQ ID NO: 61<211> Comprimento: 267
<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 61
atgagggttc atgatcaacg gctgagattt gatgtcacac ccaagccgat gggtttgaac 60
ggaagttctt tgatcacggc aagatccgtc gcacttcttc tctttctctc tctgcttctt 120
ctgattctgc caccgttcct gccgccgctt ccaccgcctc cggcgacact cctcctcctt 180
cctctactcc tcatgattct cctcattttc ttggcttttt ctccttctaa tgagcccagc 240ctcgccgttg aacctctcga cccctga 267
<210> SEQ ID NO: 62<211> Comprimento: 441<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 62atgagcaccg gccggccgga ggacatccagaaccgcacta gtccatccgc ctcgcccagctcgccgcgcg cttcgacgtc cgaccggcgc
cagctaatca acagtgccac tagtagcccc 60gacatggaga gcggcggcgg aagcgcgtcc 120ctgcagaggg ccgcccacag tcacagggag 180gagtgggagc ctgctgctgc tgctagcggc gatggcggca cgggtagcct ctggtccagg 240
tacttctcgc tcccggtcct cctgctcgtc ggcgtcaccg cgtcgctggt gatcctcccg 300
ctcgtgctcc ccccgctacc gccgccgccg tcgatgctga tgctggtccc ggtggcaatg 360
ctggtcttgc tgctcgtgct ggcgttcatg ccgacgtcga gcgtccgcgc tgggacgggg 420
acggggccga cctacatgta g 4 41
<210> SEQ ID NO: 63<211> Comprimento: 2 67<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 63
aatgccgtga agcggcacct gcagcagcgg cagcaggagg cggatttcca cgacaagaag 60gtcatcgcgt ccacctactt cagcatcggc gcgttcctgg tgctcgcctg cctcaccttc 120tcgctgctca tcctgcctct ggtgctgccg ccgctgccgc cgccgccgtc gctgctgctg 180tggctgccgg tctgcctgct cgtcctgctg gttgtgctgg ccttcatgcc gacagatgtg 240cgcagcatgg cctcctctta cttgtaa
<210> SEQ ID NO: 64<211> Comprimento: 324<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 64atggcaagcc gatctagcgc gctggaagga gggggggcag caatacagcg gaggaataat 60'gccgtgaagc ggcacctgca gcagcggcag caggaggcgg atttccacga caagaaggtc 120atcgcgtcca cctacttcag catcggcgcg ttcctggtgc tcgcctgcct caccttctcg 18030 ctgctcatcc tgccgctggt gctgccgccg ctgccgccgc cgccgtcgct gctgctgtgg 240ctgccggtct gcctgctcgt cctgctggtt gtgctggcct tcatgccgac agatgtgcgc 300agcgtggcgg cctcttactt gtaa 324
<210> SEQ ID NO: 65
<211> Comprimento: 177
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 65
atgatgttgc tggtggcgac agtgatcctc ctgtgcctgc cattggtgct gccaccactt 60ccgccaccac cgctgttcct tctcttcgtc cctgtggtga tgatgctcct gctcttctcc 120ctggttctct tcccgtctca ccactgtgca tgctcttctc caaccttcac tcagtaa 177
<210> SEQ ID NO: 66<211> Comprimento: 447<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 66
atgagctttg tggccggcag ctctgaggct gatcaactct ggttcttgat cccgtcggaa 60caagcacgag ctcacgcggt acagcctcat catccgttgg ccatggaccg gaggtcgtcg 120gcgaggagga gaggcgatcc tcaccctcac cgccggggcg caatgcacgg tgccgccgag 180cagcagaagc agcagcagca gcgcggccgg ccgcagggaa cgcgggcggc gccgcccgtg 240ccgccgggct acttcacggc ggagctggtggcgttcctcc cgctggtcct gccgccgctgcccgtgggac tgctggccgt gctcctcgcgcacctcgtcg tcggctcctc ccgctga
ctggcgttcc tgttcgtggc cgtgtcgctg 300tcgccgccgc cgttcctgct gctgctggtg 360ctcgcgttcg tgccgctcga cgcgcacagc 420
447
<210> SEQ ID NO: 67
<211> Comprimento: 363
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 67atggcggagg agaggaagca ggcgggctcccgaatgcgcg acgccgaggg tggcagtggcaggcccgtag tactggcgcc gccgggccagttcctctgcc tcaccgcgct gctggtgttcccgccgtatc ttctgctgct cgtgccggtggcgctcgtgc cgtccgacgg ccgggccgcc# tga
TO
cgctggcccg ccggaggcag cggcggcggg 60
aagatgcggg gccggcaggc aacaaaggca 120
gggtacttca cggcggggct ggcggcgctg 180
ctgccgctcg tgctgccccc gctgccgccg 240
ggcctcatgg ccgtactgct ggctctggtg 300
accgccgccg tcgcgtcgtc gtgcgtgtgc 360
363
<210> SEQ ID NO: 68<211> Comprimento: 306<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 68atgcggcggg cggtgccgca ggaggaagccgggggcaagg tggtggcgct gctggccacggcgctgcccc cgctgccgcc gccgcccacgctgctcgtgg cgtccctcgc cttctgccccagcaagctcg ccgacgccga ccacgggtcgcgctga
gtggcggcgg cgacgacgac gaccatggac 60gcggccgcgc tgctgctgct cctcccgctg 120cagctgctgt tcgtccccgt cgtcatgctg 180accgccgcga gcagcggcgg cggcggcaag 240tcgtttcgga ctactggatc accgcacctg 300
306
<210> SEQ ID NO: 69<211> Comprimento: 321<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüatgccgtcgccacaagcacgtcgtgcctccccgctcccgcctggtgctgggacccggcgt
éncia: 69cgtcgcagacatgacccaagtgctcgccctcgccgccgttcgctcatgcccgtacttgta
atcgccgccgcacgccgaggcgtcgccgtgggcggtgctgggtggcggcg
g
gtcgggaggcggcttctgcactgctgctggctcgtgccgggcggcggcgg
ggactgctcaccaagtactttgctcccgcttcgcaatgttgtgcccggaa
tggcggctgg 60ctccgtggag 120cgtcctgccg 180ggcggtgctg 240cgaggtcgtg 300321
<210> SEQ ID NO: 70
<211> Comprimento: 219
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Sorghum bicolor
<400> Seqüência: 70atggaacgaa gcatggtgac gatgctgctcctcccgctgc tgctcccttc ttccctgccggtcgtgctgc tgctctcgct gctttccctcgctattgcta tctacggatc actccgatcc
<210> SEQ ID NO: 71
<211> Comprimento: 2436
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 71
ctcgcgacgg cggccgtggt gcttctgctg 60ccaccgccgt cgctgctgct ggtcgtccct 120gctttccttc ccacccgcga cgacgatgac 180gtgcagtga 219
aacaattctt gctacatgac ataaaaataa taaatggtcg actgacttgt tacactgaca 60gaaataacat ccaagtctcc caatccaatt ccccttaatg aagttagctt ttgttagcaa 120 ggcccatttt ctatgagcca cataaagaac ttgatttttg gtggtttttt ttctttacaa 180atgtgtttaa aatgtaaacc ggtttcattt ctagtaaggt attgtataca gatttgacag 240aaaatcttcc atttttccta gatttccaga taatgctttc tggactgtca ttaagatgga 300acgacaccac ttgttcctaa atcttatccc acatatatat acttgaggtc atccactaat 360
f} aattagattt ttggcacact tactttcttc tggttacata attaataagg gcctgtttag 420 ataccaggag ctaaagaaaa agtggttaaa gtttagtcaa tttagggggt taaagatcta 480aaccggaaga atgagtgact aaaataataa aagtgtaccc ttttagtcac ttttagctcc 540taagaagaag ctaaccttta atcagtttgc ttttaacccc tggatccaaa caagtcctaa 600atcaccggta taactaggca caatgcctca tcagacagcc aactgccaat cccaaattct 660actttgttgt ccatttctaa ttttaatgcc tctgcctgca cgtatactat ttttgttttt 720 gattaagtca taccacatag gagaatcact caatttatta gtaattgtat tgtatgaact 780gaatcatttg gcgtatattt ggctttcttt aagcacaggc acactgctac caaaagcatt 840aggcgcttaa gcatcaccct tgtggctggc acgagaacca tttgattcac gacagattta 900gcgcttgttt gaagtgttgg ctaaaactag caatctacag ggaagaacac catacattag 960tactccgtcg ggacacgcca ccacatgccg ctgaaatata tccgcaacga ttctcccagc 1020 tgcttatagc tcagaagcaa gagccaaggc cggcagctaa ccacgactcg tctaatcatc 1080cctggaccat agcgattaat aaattgatta agctagtaca tcgcccctag atttccggca 1140gaattaagaa aaccgcgggc agcagagccg atgccgatgg caacaaagaa gaaggggctg 1200ttggtactgc agccgcagtc tataaagata aaaattgtag aagtagtagg aagcttagcc 1260ggagctggca tggcaggctg ctgctgagtg agcagcggtg ggggcctcct ggctggcgcg 1320 tggaaaaacc cgagcaaatg gcagcgtgaa gcacgtccga gactgaggtc aggcgtcggg 1380cgggggttgc ggccagggga gacgaatgaa cccctgcccc cgcctggatc ccatcgcaaa 1440agccccctcc ccctctccgc cttcgcgcat attatattcg cgcaccatcg cagcaacttg 1500cacgggcgcc gatgactagt tgcgccagat gcactgcatc tgctcggcgt ggtgcctcca 1560acgtccaacc cctcttcctc ttgtctctcg tctacctctc ttctgcccct ctgcgtccgt 1620gtctccatcg tcgtcgctgc gtgaggttga cgacgaccag tcacaggacc tgttcgttcc 1680tcatgcgacc cagctagcta aaactggcat gcatggacat gctacgctgc tgcgtcaatc 1740catctcacca ggtacgctgc tgtacatgct gctacgagcc tacgatcgat agcagtctgt 1800gccttccttt gctcgatgcc gatgtttatc tgcatgtgat cgtattcgta tgcacggccc 1860tccgccctct caagctgagt gctttttggt gggcccatcg tcctatatac gctcatcagt 1920 tcactgacga cgatataacg actgttgggg ttcagaaact acatattgtg gtgctcgccc 1980gatctctttc ttgtatattc ttcttattat tagtctctct ctctctgaaa gaacaaggaa 2040ctagatgtct tgttttgtgc ctcctactat acctttgcgt gtttttcttg cttttgtcca 2100tggcttttca ccggtctgct gggtgaagta atttacacgc atgtcttacg cacgcgctcc 2160ttcagttgtc cgcatatctg atcataacat cgcttcattc atgtgctgac gagatatttt 2220tcgccgccga gactgcagtg ctagctagct agatctggcc tgattcgccg atcgagcggt 2280ggtgagacgg agtgcttcag ctcaaagact gctagtggta ggctggtagc tagctgtgtg 2340cctgtgtgca gtgtgcactg ccactgcatg cgcggcgcct tggacttaag acggcagcac 2400acgcacgcga ggaggcgtcg gctgaagcga gcgctc 2436

Claims (19)

1. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato deque é isolado do grupo consistido de:a. um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 70%de identidade de seqüência, como determinado peloalgoritmo GAP sob condição de parâmetros padrão,em relação a seqüência completa de umpolinucleotídeo selecionado a partir de um grupoconsistindo de SEQ ID NOS:l, 3, 5 e 40-71; aondeo polinucleotídeo codifica um polipeptídeo quefunciona como um modificador de tamanho de órgão;b. um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeoselecionado a partir do grupo consistindo de SEQID NOs: 2, 4 e 6-37; ec. um polinucleotídeo selecionado a partir do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 40-71; ed. Um polinucleotídeo que é complementar aopolinucleotídeo de (a), (b) ou (c) .
2. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de quecompreende o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação-1, em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado,na orientação sense ou antisense, a um promotor.
3. Célula hospedeira, caracterizada por compreender ocassete de expressão de acordo com a reivindicação 2.
4. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de quecompreende o cassete de expressão de acordo com areivindicação 2.
5. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a referida planta é umamonocotiledônea.
6. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a referida planta é umadicotiledônea.
7. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a referida planta éselecionada a partir de um grupo consistindo de: milho,soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão,arroz, cevada, milheto, amendoim e cacau.
8. Semente transgênica, caracterizada pelo fato de que éproduzida pela planta de acordo com a reivindicação 4.
9. Método para modular o tamanho de órgãos em plantas,caracterizado pelo fato de que compreende:a. introduzir em uma célula vegetal, um cassete deexpressão que compreende o polinucleotideo deacordo com a reivindicação 1 operacionalmenteligado a um promotor; eb. cultivar a planta sob condições de crescimento emcultura celular vegetal; aonde o tamanho do órgãoda referida célula vegetal é modulado.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a célula vegetal é proveniente de umaplanta selecionada a partir do grupo consistindo de: milho,soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão,arroz, cevada, milheto, amendoim e cacau.
11. Método de modular toda a planta ou o tamanho de órgãoem uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende:a. introduzir em uma célula vegetal, um cassete deexpressão recombinante que compreende opolinucleotideo de acordo com a reivindicação 1operacionalmente ligado a um promotor; eb. cultivar a célula vegetal sob condições decrescimento em cultura celular vegetal; eregenerar uma planta a partir da referida célulavegetal, aonde o tamanho do órgão na referidaplanta é modulado.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que e planta é selecionada a partir do grupoconsistindo de: milho, soja, sorgo, canola, trigo, alfafa,algodão, arroz, cevada, milheto, amendoim e cacau.
13. Produto, caracterizado pelo fato de que é derivado dométodo de processamento de tecidos vegetais transgênicosexpressando um polinucleotideo isolado que codifica um geneARGOS, o método compreende:a. transformar uma célula vegetal com um cassete deexpressão recombinante que compreende umpolinucleotideo apresentando pelo menos 90% deidentidade de seqüência com a seqüência completade um polinucleotideo selecionado do grupoconsistindo de SEQ ID N0S: 1, 3, 5 e 40-71,operacionalmente ligado a um promotor; eb. cultivar a célula vegetal sob condições decrescimento em cultura celular vegetal; aonde ocrescimento na referida célula vegetaltransformada é modulado;c. crescer a célula vegetal sob condições deformação de planta para expressar opolinucleotideo no tecido vegetal; ed. processar o tecido vegetal para obter um produto.
14. Produto de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de o polinucleotideo codifica aindaum polipeptideo selecionado a partir do grupo consistindode SEQ ID NO: 2. 4 e 6-37.
15. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a planta é umamonocotiledônea.
16. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada apartir do grupo consistindo de: milho, soja, girassol,sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada emilheto.
17. Produto de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que aumenta a resistência docaule de uma planta pela super expressão dopolinucleotideo.
18. Produto de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que aumenta o rendimento atravésdo incremento da biomassa.
19. Produto de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que é um constituinte de etanol.
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