BRPI0710011A2

BRPI0710011A2 - proteìnas de ligação compreendendo articulação de imunoglobulina e regiões fc dotadas de funções efetoras fc alteradas

Info

Publication number: BRPI0710011A2
Application number: BRPI0710011-6A
Authority: BR
Inventors: Peter Robert Baum; Erik Stephen Espling; Phillip Tan; Peter Armstrong Thompson
Original assignee: Trubion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-04-14
Filing date: 2007-04-13
Publication date: 2011-08-02
Also published as: US20080227958A1; JP2009538273A; AU2007238034A1; WO2007121354A2; EP2007808A4; CN101466733A; CA2648849A1; EP2007808A2; MX2008013057A; WO2007121354A3

Abstract

PROTEìNAS DE LIGAçãO COMPREENDENDO ARTICULAçãO DE IMUNOGLOBULINA E REGIõES FC DOTADAS DE FUNçõES EFETORAS FC ALTERADAS A presente invenção proporciona proteínas de ligação compreendendo um ou mais domínio CH2 e/ou CH3 de região de articulação Fc de imunoglobulina onde um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de região constante e/ou articulação é modificado para alterar a afinidade e/ou especificidade de ligação da proteína de ligação para um receptor cognato (por exemplo, um Receptor Fc) e/ou para proporcionar uma ou mais novas especificidades de ligação a região de articulação e/ou constante que a imunoglobulina não modificada correspondente não possui (por exemplo, afinidade para classe distinta de receptor cognato distinto da classe de receptor cognato ao qual a proteína de ligação não modificada se liga especificamente). As proteínas de ligação de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpos, proteínas de ligação recombinantes, e proteínas de fusão de domínio imunoglobulina de ligação trabalhadas molecularmente por engenharia, incluindo os produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos (produtos SMIPTM).

Description

Referência cruzada aos pedidos relacionados

O presente pedido reivindica os benefícios do pedido provisório de patente U.S. No.60/744,899, depositado em 14 de Abril de 2006, os benefícios da data de deposito anteriordo qual está aqui reivindicada sob 35 U.S.C. § 119 (e) e adicionalmente aqui incorporadopor referência.

Antecedentes da Invenção

Campo Técnico da InvençãoA presente invenção se refere em geral aos campos de imunologia, química deproteína, e biologia molecular. Mais especificamente, aqui proporcionadas estão proteínasde ligação que compreendem uma ou mais articulação de imunoglobulina, domínio CH2e/ou CH3, onde uma ou mais articulações do domínio CH2 e/ou CH3 é modificada paraalterar a afinidade de ligação de proteína de ligação e/ou a especificidade para um receptorcognato (por exemplo, um receptor Fc), e/ou proporcionar uma ou mais novasespecificidades de ligação à articulação e/ou região constante que a proteína de ligação nãomodificada correspondente não possui (por exemplo, afinidade para o receptor Fc distinto apartir do(s) receptor(es) cognato(s) ao qual a proteína de ligação não modificadaespecificamente se liga). As proteínas de ligação de acordo com a presente invençãoincluem, por exemplo, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpos, proteínas deligação recombinantes, e proteínas de fusão de ligação de domínio imunoglobulinatrabalhadas molecularmente por engenharia, incluindo pequenos produtosimunofarmacêuticos modulares (produtos SMIP™).

Descrição da técnica relacionadaUma imunoglobulina é uma proteína multimérica composta de dois polipeptídeos decadeia leve idênticos e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos (H2L2) que sãounidos em um complexo macromolecular por ligações de dissulfeto de intercadeia. Asligações de dissulfeto de intercadeia unem diferentes áreas da mesma cadeia depolipeptídeo resultando na formação de alças as quais, junto com os amino ácidosadjacentes, constituem os domínios de imunoglobulina.

Na porção amino terminal, cada cadeia leve e cada cadeia pesada apresenta umaúnica região variável que mostra uma variação considerável na composição do amino ácidoa partir de um anticorpo para outro. A região variável de cadeia leve, VL, se associa com aregião variável da cadeia pesada, VH, para formar um campo de ligação de antígeno daimunoglobulina, Fv. As cadeias leves apresentam um domínio de região constante simples(CH1) e as cadeias pesadas apresentam diversos domínios de região constante. As classesIgG1 IgA1 e IgD são dotadas de três domínios de região constante de cadeia pesada, osquais são designados CH1, CH2, e CH3; e as classes IgM e IgE são dotadas de quatrodomínios de região constante de cadeia pesada, CH1, CH2, CH3, e CH4. A estrutura e afunção da imunoglobulina são revistas em in Hariow et al., Eds., "Antibodies: A LaboratoryManual," Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor1 1988) e em Lo,Ed., "Antibody Engineering: Methods and Protocols," Part 1 (Humana Press, Totowa, NewJersey, 2004).

As cadeias pesadas das imunoglobulinas podem ser divididas em tres regiõesfuncionais: a região Fd1 a região de articulação, e a região Fc (fragmento cristalizável). Aregião Fd compreende os domínios VH e CH1 e, em combinação com a cadeia leve, formaFab - o fragmento de ligação a antígeno. O fragmento Fc é responsável pelas funçõesefetoras da imunoglobulina, as quais incluem, por exemplo, a fixação de complemento e aligação aos receptores Fc cognatos das células efetoras. A região de articulação,encontrada nas classes de imunoglobulinas IgG, IgA e IgD, atua como um espaçadorflexível que permite que a porção Fab se mova livremente no espaço com relação à regiãoFc. Diferente das regiões constantes, os domínios de articulação são estruturalmentediversos, variando tanto em seqüência quanto em comprimento entre as classes esubclasses de imunoglobulinas.

De acordo com estudos cristalográficos, a região de articulação de imunoglobulinapode ser adicionalmente subdividida estruturalmente e funcionalmente em três regiões: aarticulação superior, o núcleo, e a articulação inferior. Shin et al., Immunological Reviews130:87 (1992). A articulacao superior inclui aacs da extremidade carboxila de CH1 para oprimeiro resíduo na articulação que restringe o movimento, em geral o primeiro resíduo decisteína que forma uma ligação dissulfeto intercadeia entre as duas cadeias pesadas. Ocomprimento da região de articulação superior se correlaciona com a flexibilidade segmentaido anticorpo. A região de articulação do núcleo contém pontes de dissulfeto de intercadeiapesada. A região de articulação inferior une a extremidade amino terminal de, e inclui umresíduo no domínio CH2. Id.

A região de articulação do núcleo IgGI contém a seqüência Cys-Pro-Pro-Cys quequando dimerizado pela formação de ligação dissulfeto, resulta em um octapeptídeo cíclicoo qual se acredita agir como um pivô, conferindo assim flexibilidade. As mudançasconformacionais permitidas pela estrutura e a flexibilidade da seqüência de polipeptídeo daregião de articulação de imunoglobulina pode afetar as funções efetoras da porção Fc doanticorpo.

Três categorias gerais de funções efetoras associadas com a região Fc incluem (1)a ativação da cascata clássica de complemento, (2) a interação com as células efetoras, e(3) a compartimentalização das imunoglobulinas. As subclasses de IgG humano diferentesvariam com relação às eficácias com as quais as mesmas fixam o complemento, ou ativame amplificam as etapas da cascata de complemento (ver, por exemplo, Kirschfink, Immunol.Rev. 180:177 (2001); Chakraborti et ai, Cell Signal 12:607 (2000); Kohl et ai, Moi Immunol.36:893 (1999); Marsh èt al., Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 8:557 (1999); e Speth et ai,Wien Klin. Wochenschr. 111:378 (1999)). Acredita-se que a citotoxicidade complemento-dependente (CDC) seja um mecanismo significativo para a depuração de células alvoespecificas tais como células de tumor. Em geral IgGI e lgG3 mais eficientemente fixam ocomplemento, lgG2 é menos eficaz, e lgG4 não ativa o complemento. A ativação docomplemento é iniciada pela ligação de C1q, uma subunidade do primeiro componente C1na cascata, ao complexo de antígeno-anticorpo.

Embora o campo de ligação para C1q seja localizado no domínio CH2 do anticorpo,a região de articulação influencia a capacidade o anticorpo para ativar a cascata. Porexemplo, as imunoglobulinas que estão faltando de uma região de articulação sãoincapazes de ativar o complemento. Shin et ai, (1992), supra. Sem a flexibilidade conferidapela região de articulação, a porção Fab do anticorpo ligado ao antígeno pode não sercapaz de adotar a conformação necessária para permitir que C1q se ligue a CH2. (ver Id.) ocomprimento da articulação e a flexibilidade segmentai correlata, a uma extensão limitada,com a ativação de complemento. Assim, as moléculas lgG3 humanas com regiões dearticulação alterada são rígidas como as regiões de articulação lgG4, permanecem eficazesna ativação da cascata de complemento.

A região de articulação pode ainda conter um ou mais campo(s) de glicosilação,que inclui uma série de tipos estruturalmente distintos de campos para a fixação decarboidratos. Por exemplo, o IgAI contém cinco campos de glicosilação dentro de umsegmento de 17 amino ácidos da região de articulação, conferindo resistência excepcionalao polipeptídeo de região de articulação para proteases intestinais, considerada umapropriedade vantajosa para a imunoglobulina secretória.

A ausência de uma região de articulação, ou a falta de uma região de articulaçãofuncional, pode ainda afetar a habilidade de determinadas imunoglobulinas humanas a seligar a receptores Fc em células efetoras imunes. A ligação de uma imunoglobulina aoreceptor Fc facilita a citotoxicidade mediada a célula anticorpo dependente (ADCC), o quese presume ser um mecanismo importante para a eliminação de células tumorais. A famíliado receptor Fc IgG humano (FcR) é dividida em três grupos, FcyRI (CD64), que é capaz dese ligar a IgG com alta afinidade, e FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), ambos os quais sãoreceptores de baixa afinidade. O receptor Fc IgA humano é FcaR (CD89). A evidênciaexperimental indica que os resíduos na região proximal de articulação do domínio CH2 sãoimportantes para a especificidade da interação entre uma imunoglobulina e cada um dosreceptores Fc respectivos. Isto é suportado pela observação de que proteínas de mielomaIgGI e os anticorpos quiméricos lgG3 recombinantes que faltam de uma região dearticulação são incapazes de se ligar a FcyRI, provavelmente em função da reduzidaacessibilidade ao domínio CH2. Shin et al., lntern. Rev. Immunol. 10:177, 178 - 79 (1993).Os FcY-receptores são em geral revistos em Ingmar et al., "Humano IgG Fc Receptors,"Intern. Rev. Immunol. 16:29 - 55 (1997) e Ravetch and Bolland, "IgG Fc Receptors," Annu.Rev. Immunol. 19:275 - 90 (2001). Ver também, Getahun et al., J. Immunol. 172:5269 - 5276(2004).

FcyRI (CD64) é expresso em macrófagos e células dendríticas e desempenha umpapel na fagocitose, surto respiratório, estimulação de citocina, e transporte endocítico decélula dendrítica. A expressão de FcyRI é regulada a maior tanto por GM-CSF e γ-interferon(γ-IFN) e regulada a menor por interleucina-4 (IL-4). Quando todos os receptores deativação são nocauteados, os ratos são protegidos contra inflamação mediada a complexoimune. Similarmente, quando FcyRI é nocauteado, os ratos são proporcionados com algumaproteção.

Três formas de FcyRII (CD32) foram identificados, FcYRIIa, FcYRIIb, e FcyRllc.FcYRIIa é expresso em leucócitos polimorfonucleares (PMN), macrófagos, célulasdendríticas, e células mastócitos. FcyRIIa desempenha um papel na fagocitose, surtorespiratório, e estimulação de citocina. A expressão de FcyRIIa é regulada a maior por GM-CSF e γ-IFN, e reduzida por IL-4. Quando todos os receptores de ativação sãonocauteados, os ratos são protegidos contra inflamação mediada a complexo imune.FcYRIIa se liga ao polimorfo H131 (CRP) protina c-reativa com alta afinidade e ao polimorfoCRP R131 com baixa afinidade. A distribuição de polimorfismos na população geral é deaproximadamente 50:50 de R131 associada com um aumento na susceptibilidade parainfecção e lúpus nefrite. A FcyRIIb é expressa em células B, PMN, macrófagos, e célulasmastócitos. O Fcyllb inibe as respostas mediadas por motivo de ativação com base emtirosina imunoreceptor (ITAM); assim, este é um receptor inibitório. A expressão de FcyRllcé regulada a maior pela imunoglobulina intravenosa (IVIG) e IL-4 e reduzida por y-IFN.Ratos com FcYRIIb nocauteados exibem respostas de anticorpo aumentadas esusceptibilidade a doença auto-imune e resposta de recall de célula B diminuída quando ascélulas dendríticas foliculares (FDC) são nocauteadas por CD32. FcyRllc é expressa emcélulas NK mas a sua função e regulação da expressão são pobremente entendidos.

Duas formas de FcyRIII (CD16) foram identificadas, FcYRIIIa e FcyRIIIb. FcYRIIIa éexpressa em células exterminadoras naturais (NK), macrófagos, células mastócitos, eplaquetas. O referido receptor participa na fagocitose, surto respiratório, estimulação decitocina, agregação plaquetária e desgranulação, e ADCC NK-mediada. A expressão deFcyRIII é regulada a maior por C5a, TGF/?, e γ-IFN e regulada a menor por IL-4. Quandotodos os receptores de ativação são nocauteados, os ratos estão protegidos contrainflamação mediada a complexo imune. FcYRIIIa é polimórfico com F176 sendo o maiscomum e V-176 sendo o menos comum. F-176 se liga com menos avidez ao IgG e estáassociado com lúpus eritematoso. FcYRIIIb é um receptor ligado a GPI expresso em PMN.Uma deficiência herdada de FcYRIIIb existe e não apresenta fenótipo conhecido. Umpolimorfismo FcYRIIIb NA1/NA2 é importante em neutropenia isoimune.

A tecnologia de anticorpos monoclonais e os métodos de engenharia genéticaconduziram a um rápido desenvolvimento de moléculas de imunoglobulina para a diagnosee o tratamento das doenças humanas. A engenharia de proteínas foi aplicada paraaprimorar a afinidade de um anticorpo para o seu antígeno cognato, para reduzir osproblemas relacionados a imunogenicidade de polipeptídeos recombinantes administrados,e para alterar as funções efetoras de anticorpo. A estrutura de domínio das imunoglobulinasé receptiva a engenharia recombinante, no sentido de que os domínios de ligação deantígeno e os domínios que conferem as funções efetoras podem ser trocados entre asclasses de imunoglobulinas (por exemplo, IgG, IgA1 e IgE) e subclasses (por exemplo, IgG1,IgG2, IgG3l e IgG4, etc.).

Ademais, moléculas de imunoglobulinas menores foram construídas para superaros problemas associados com a terapia de imunoglobulina total. Por exemplo, polipeptídeosde fragmento de região variável de imunoglobulina de cadeia simples (ScFv) compreendeum domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina unido por meio de um peptídeo decurta ligação a um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina. Huston et al. Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 85:5879-83 (1988). Em virtude do pequeno tamanho de moléculasscFv, as mesmas exibem uma depuração muito rápida a partir de plasma e tecidos e sãocapazes de penetração mais eficaz nos tecidos do que as imunoglobulinas totais. Ver, porexemplo, Jain, Câncer Res. 50:814s-819s (1990). Um scFv anti-tumor mostrou umapenetração de tumor mais rápida e uma distribuição mais rápida através da massa tumoraldo que o anticorpo quimérico correspondente. Yokota et al., Câncer Res. 52:3402-08 (1992).A fusão de um scFv a outra molécula, tal como uma toxina, leva vantagem da atividade deligação específica a antígeno e do pequeno tamanho de scFv para enviar a toxina ao tecidoalvo. Chaudary et ai, Nature 339:394 (1989) and Batra et ai, Mol. Ce». Bioi U:2200 (1991).

Apesar das vantagens que as moléculas scFv trazem a soroterapia, existemdiversos inconvenientes com relação a esta abordagem terapêutica. Embora uma rápidadepuração de scFv possa reduzir os efeitos tóxicos em células normais, a referida rápidadepuração pode evitar o envio de uma dose eficaz mínima ao tecido alvo. As quantidadesde fabricação adequadas de scFv para a administração em pacientes tem sido um desafioem virtude das dificuldades na expressão e no isolamento de scFv que afeta adversamenteo rendimento. Durante a expressão, as moléculas scFv faltam de estabilidade e comfreqüência se agregam em virtude do pareamento de regiões variáveis a partir de diferentesmoléculas. Ademais, os níveis de produção de moléculas scFv em sistemas de expressãode mamíferos são baixos, limitando o potencial para a fabricação eficiente de moléculasscFv para terapia. Davis et ai, J. Biol. Chem. 265:10410-18 (1990) and Traunecker et ai,EMBO J. 10:3655-59 (1991). Estratégias para o aprimoramento da produção têm sido exploradas, incluindo a adição de campos de glicosilação às regiões variáveis. Ver, porexemplo, U.S. Pat. No. 5,888,773 e Jost et al., J. Biol. Chem. 269:26267-73 (1994).

Uma desvantagem adicional de usar scFv para a terapia é a falta de funçõesefetoras. Um scFv que falta de funções citolíticas, ADCC e de citotoxicidade dependente decomplemento (CDC)1 que são tipicamente associadas às regiões constantes deimunoglobulina, podem ser ineficazes para o tratamento da doença. Embora odesenvolvimento da tecnologia scFv tenha se iniciado aproximadamente a duas décadas,atualmente nenhum produto scFv é aprovado para terapia. A conjugação ou a fusão detoxinas em scFv tem sido assim uma estratégia alternativa para proporcionar uma moléculaespecífica a antígeno, potente, mas a dosagem com os referidos conjugados ou quimeras com freqüência é limitada pela toxicidade excessiva e/ou não específica tendo como suaorigem a fração de toxina das referidas preparações. Os efeitos tóxicos podem incluir aelevação suprafisiológica das enzimas do fígado e a síndrome de vazamento vascular, eoutros efeitos indesejados. Ademais, as imunotoxinas são em si altamente imunogênicasapós serem administradas a um hospedeiro, e os anticorpos do hospedeiro gerados contra aimunotoxina limitam sua utilidade potencial em tratamentos terapêuticos repetidos de umindivíduo.

Os benefícios das funções efetoras associadas a região constante deimunoglobulina no tratamento de doença acarretou no desenvolvimento de proteínas defusão nas quais as seqüências de polipeptídeo de região constante de imunoglobulina sãopresentes e de seqüências de não imunoglobulina são substituídas pela região variável deanticorpo. Por exemplo, CD4, a proteína de superfície de célula T reconhecida pelo HIV foirecombinantemente fundida a um domínio efetor Fc de imunoglobulina. Ver, Sensel et ai,Chem. Immunol. 65:129-158 (1997). A atividade biológica da referida molécula depende, emparte, na classe ou na subclasse da região constante escolhida. Uma proteína de fusão lL-2-IgG1, por exemplo, efetua a Iise mediada a complemento de células que portam o receptorIL-2. Ver ld. O uso de regiões constantes de imunoglobulina para construir as referidas eoutras proteínas de fusão pode também conferir propriedades farmacocinéticasaprimoradas.

Permanece ainda uma necessidade não alcançada na técnica para proteínas deligação derivadas de imunoglobulina aprimoradas onde a articulação e/ou o domínio Fcsejam modificados para alterar uma ou mais funções efetoras tais como afinidade e/ouespecificidade de ligação a receptor Fc alterada (e ADCC associada), meia vida de proteínade ligação in vivo, e/ou fixação de complemento.

Sumário da Invenção

A presente invenção vai de encontro aos referidas e outras necessidades relatadasao proporcionar, entre outras coisas, proteínas de ligação que compreendem um ou maisdomínio(s) CH2, e/ou CH3 de articulação de região constante de imunoglobulina, onde o umou mais domínio CH2, e/ou CH3 de região constante e/ou articulação é modificado paraalterar uma ou mais funções efetoras Fc de proteína de ligação. Exemplificados aqui estãoas proteínas onde a articulação de imunoglobulina e/ou região Fc é modificada paraalcançar uma afinidade de ligação alterada e/ou especificidade para um receptor cognato(por exemplo, um receptor Fe) e/ou proporcionar uma ou mais novas especificidades deligação à região Fc que a proteína de ligação não modificada correspondente não possui(por exemplo, afinidade para um ou mais receptor Fc que é distinto do receptor cognato aoqual a proteína de ligação não modificada especificamente se liga).

As proteínas de ligação de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo,anticorpos modificados, fragmentos de anticorpos, proteínas de ligação recombinantes, eproteínas de fusão de domínio-imunoglobulina de ligação trabalhadas molecularmente porengenharia, incluindo os produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos (produtosSMIP™) onde uma ou mais seqüências de amino ácidos em domínio CH2 e/ou CH3 emuma articulação de imunoglobulina é alterada. Dentro de determinadas modalidades, asproteína de ligação modificadas descritas aqui compreendem mudanças em uma ou maisseqüências de amino ácidos no domínio CH2 e/ou CH3 da articulação que são responsáveispela afinidade e/ou especificidade de ligação do receptor.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona proteínas de ligação, emparticular proteínas de ligação que compreendem um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 dearticulação de cadeia pesada de imunoglobulina, onde a proteína de ligação é modificada demodo que a mesma se liga com afinidade e/ou especificidade de ligação alterada a um oumais Fc receptores específicos a imunoglobulina.

Exemplificadas aqui estão as proteínas de ligação que compreendem um ou maisdomínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada de imunoglobulina IgG, onde aproteína de ligação é modificada de tal forma que a mesma se liga com afinidade e/ouespecificidade de ligação alterada (isto é, aumentada ou reduzida) a um ou mais receptoresFc específicos a imunoglobulina IgG FcyRI (CD64); FcyRII (CD32), incluindo FcyRIIa,FcyRIIb1 e FcyRllc; e/ou FcyRIII (CD16), incluindo FcyRIIIa e FcyRIIIb. As proteína deligação deste tipo incluem, por exemplo, proteínas de ligação onde um ou mais aminoácidos são inseridos em e/ou deletados a partir da seqüência de amino ácido primária nasregiões, domínios, voltas, e/ou estruturas de alça responsáveis pela ligação Fcy-receptor. Asreferidas mudanças incluem, mas não são limitados a, inserção e/ou deleção de um ou maisamino ácidos entre e/ou adjacente aos amino ácidos que, com a ligação ao receptor Fccognato, estão em contato direto com os amino ácidos dentro de um ou mais receptor(es)Fc imunoglobulina-específico(s) incluindo FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e/ou FcyRIII(CD16).

As modalidades específicas para os referidos aspectos da presente invençãoincluem as proteínas de ligação que compreedem um ou mais domínios CH2 IgG onde odomínio CH2 é um domínio CH2 IgGI e/ou lgG3. Algumas das referidas modalidadesproporcionam proteínas de ligação que compreendem um ou mais amino ácido de deleção apartir de uma amino ácido de inserção dentro de uma estrutura de alça proximal dearticulação, L-L-G-G-P, do domínio IgG1 e/ou IgG3 CH2. Especificamente exemplificado aquiestão as proteínas de ligação que compreendem inserções simples de um único aminoácido na posição indicada pelo "*" dentro da estrutura de alça proximal de articulação aseguir. Assim, proporcionado aqui estão proteínas · de ligação que compreendem asestruturas de alça proximal de articulação modificada L-L-*-G-G-P, L-L-G-*-G-P, e L-L-G-G-*-P. Ainda proporcionado aqui estão as proteínas de ligação que compreendem inserçõessimples de dois ou mais amino ácidos nas posições indicadas por "*" dentro das estruturasde alça proximais de articulação L-L-*-G-G-P, L-L-G-*-G-P, e L-L-G-G-*-P. Assim, dentrodas referidas modalidades, "*" indica a inserção de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 amino ácidos. Tipicamente, os amino ácidos adequadospara a geração de proteínas de ligação dotadas das referidas estruturas de alça proximaisde articulação são selecionadas a partir do grupo que consiste em Ala, Gly, lie, Leu, e Vai.

Outras das referidas modalidades proporcionam proteínas de ligação quecompreende um ou mais domínios CH2 IgG onde o domínio CH2 é um domínio CH2 IgGi,IgG2, e/ou IgG3. Algumas das referidas modalidades proporcionam proteínas de ligação quecompreendem uma ou mais deleção de amino ácido a partir e/ou inserção de amino ácidode dentro da estrutura de alça BC, D-V-S-H-E1 do domínio CH2 IgG1, IgG2, e/ou IgG3.Especificamente exemplificadas aqui estão as proteínas de ligação que compreendeminserções simples de um amino ácido simples nas posições indicadas pelo "*" dentro dasestruturas de alça a seguir. Assim, estão proporcionadas aqui as proteínas de ligação quecompreendem estruturas de alça BC D-V-*-S-H-E e D-V-S-*-H-E. Também proporcionadasaqui estão as proteínas de ligação que compreendem inserções simples de dois ou maisamino ácidos nas posições indicadas por "*"dentro das estruturas de alça BC D-V-*-S-H-E eD-V-S-*-H-E. Assim, dentro das referidas modalidades, "*" indica a inserção de pelo menos2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 amino ácidos. Tipicamente,os amino ácidos adequados para a geração de proteínas de ligação dotadas das referidasestruturas de alça BC modificadas são selecionados a partir do grupo que consiste em Ala,Gly, lie, Leu, e Vai.Ainda outras modalidades proporcionam proteínas de ligação que compreendemum ou mais domínios CH2 IgG onde o domínio CH2 é um domínio CH2 IgGi e/ou IgG3.Algumas das referidas modalidades proporcionam proteínas de ligação que compreendemuma ou mais deleção de amino ácido a partir de e/ou inserção de amino ácido dentro daestrutura de alça FG1 A-L-P-A-P-I1 do domínio CH2. Especificamente exemplificadas aquiestão as proteínas de ligação que compreende inserções simples de um amino ácidosimples nas posições indicadas pelo "*" dentro da estrutura de alça FC a seguir. Assim,proporcionadas aqui estão as proteínas de ligação que compreende as estruturas de alçaFG modificadas A-L-*-P-A-P-l, A-L-P-*-A-P-l, e A-L-P-A-*-P-l. Ainda proporcionadas aquiestão as proteínas de ligação que compreende inserções simples de dois ou mais aminoácidos nas posições indicadas pelo "*" dentro da estrutura de alça FG A-L-*-P-A-P-l, A-L-P-*-A-P-l, e A-L-P-A-*-P-l. Assim, dentro das referidas modalidades, "*" indica a inserção depelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 amino ácidos.Tipicamente, os amino ácidos adequados para a geração de proteínas de ligação dotadasdas referidas estruturas de alça FG modificadas são selecionadas a partir do grupo queconsiste em Ala, Gly, lie, Leu, e Vai.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona proteínas de ligação, emparticular proteínas de ligação que compreendem um ou mais domínio CH2 e/ou CH3 dearticulação de cadeia pesada, onde a proteína de ligação compreende uma ou maismodificações dentro de um ou mais domínio CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeiapesada, onde a modificação compreende a inserção de uma ou mais seqüência(s) deglicosilação N-Iigadas e/ou mais seqüência(s) de glicosilação O-ligadas, cuja(s)seqüência(s) de glicosilação é suficiente para alcançar a glicosilação N- e/ou O-Iigada naposição de inserção deste modo alterando (isto é, seja aumentando ou diminuindo) aafinidade e/ou especificidade de ligação da proteína de ligação a um ou mais receptor Fcespecífico para imunoglobulina. As proteínas de ligação deste tipo incluem, por exemplo,aquelas que compreendem mudanças na seqüência de amino ácido nas posições que sãoproximais e/ou distais às regiões, domínios, e/ou estruturas de alça responsáveis pelaglicosilação na proteína de ligação não modificada.

Exemplificadas aqui estão as proteínas de ligação que compreendem um ou maisdomínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada IgG, onde as proteínas de ligaçãocompreendem uma ou mais modificações dentro de um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 dearticulação de cadeia pesada IgG onde a modificação compreende a inserção de uma oumais seqüência(s) de glicosilação N-Iigada e/ou uma ou mais seqüência(s) de glicosilaçãoO-ligada, cuja(s) seqüência(s) de glicosilação é suficiente para alcançar a glicosilação N-e/ou O-Iigada na posição de inserção deste modo alterando (isto é, seja aumentando oudiminuindo) a afinidade e/ou especificidade de ligação da proteína de ligação a um ou maisreceptor(es) específico(s) para imunoglobulina IgG FcyRI (CD64); FcyRII (CD32), incluindoFcyRIIa, FcyRIIb, e FcyRIIc; e/ou FcyRIII (CD16), incluindo FcYRIIIa e FcYRIIIb, emcomparação à proteína de ligação correspondente que compreende um ou mais domíniosCH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada IgG não modificados.

Modalidades específicas dos referidos aspectos da presente invenção incluem asproteínas de ligação compreendendo um ou mais domínios de articulação de IgG, um oumais domínios de CH2 IgG, e/ou um ou mais domínios de CH3 IgG onde o domínio CH2e/ou CH3 de articulação, é um Domínio CH2 e/ou CH3 de articulação IgGI, um domínioCH2 e/ou CH3 de articulação lgG2, um domínio CH2 e/ou CH3 de articulação lgG3, e/ou umdomínio CH2 e/ou CH3 de articulação lgG4. Algumas das referidas modalidadesproporcionam proteínas de ligação que compreendem a inserção de uma ou mais seqüênciade glicosilação N-ligada N-X-(S/T) (onde X é qualquer amino ácido) e/ou uma ou maisseqüência de glicosilação O-ligada X-P-X-X (onde pelo menos um X é T), T-X-X-X (ondepelo menos um X é T), X-X-T-X (onde pelo menos um X é R ou K), e/ou S-X-X-X (onde pelomenos um X é S)) proximal a e/ou distai ao campo de glicosilação N-ligada e/ou O-ligada nodomínio CH2 e/ou CH3 de articulação de imunoglobulina IgG nativa correspondente. Dentrode determinados aspectos das referidas modalidades, a proteína de ligação exibe umaafinidade e/ou especificidade de ligação FcyR alterada (isto é, aumentada ou reduzida).

Exemplificadas aqui estão as referidas modalidades onde as proteínas de ligaçãocompreendem um ou mais domínios de articulação de IgG, um ou mais domínios de CH2IgG, e/ou um ou mais domínios de CH3 IgG e onde as proteínas de ligação adicionalmentecompreendem uma inserção de uma ou mais seqüência de glicosilação N-ligada N-X-(S/T)(onde X é qualquer amino ácido). Por exemplo, a presente invenção proporciona asreferidas proteínas de ligação compreendendo uma inserção de uma ou mais seqüência N-X-(S/T) adjacente à seqüência N-S-T nativa dentro da alça DE de um ou mais domínios CH2IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4. Dentro de determinados aspectos das referidas modalidades, aproteína de ligação exibe uma afinidade e/ou especificidade de ligação a FcyR alterada (istoé, aumentada ou reduzida).

Dentro de determinadas modalidades especificas, a seqüência de glicosilação N-ligada dentro da alça DE de um domínio CH2 IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4 compreende aseqüência de amino ácido N-S-T e é inserida adjacente a e/ou dentro de 0 a 10 aminoácidos amino-terminais e/ou carbóxi-terminal à seqüência N-S-T nativa de modo que aseqüência de amino ácido X-N-S-T-Z é modificada a (AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAc) ondecada um de AAa AAb, e AA0 independentemente designa de 1 a 100 amino ácidos. Dentro demodalidades específicas, a seqüência de glicosilação N-ligada dentro da alça DE dedomínio CH2 de IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4 compreende a seqüência de amino ácido N-S-Te é inserida adjacente à seqüência N-S-T nativa de modo que a seqüência de amino ácidonativa X-N-S-T-Z é modificada em X-N-S-T-Z-N-S-T-Z1 onde XeZ são independentementeselecionados a partir de Tyr (Y) e Phe (F).

Dentro de modalidades alternativas, a seqüência de glicosilação N-Iigada inseridadentro da alça BC de um ou mais domínios CH3 IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4 compreende aseqüência de amino ácido N-S-T e é inserida distai à seqüência N-S-T nativa de modo que aseqüência de amino ácido nativa Y-P-S-D-I-A é modificada em Y-P-N-S-T-D-I-A e Y-N-S-T-P-S-D-I-A.

Dentro de ainda de aspectos adicionais, a presente invenção proporciona proteínasde ligação, em particular proteínas de ligação compreendendo um ou mais domínios CH2e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada de uma primeira classe de imunoglobulina (isto é,IgA, IgD, IgE, IgG, ou IgM), onde a proteína de ligação é modificada (isto é, por substituiçãode amino ácido e/ou inserção de amino ácido) na seqüência amino primária de um ou maisdomínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada da primeira classe deimunoglobulina para gerar uma proteína de ligação capaz de ligar a um ou mais receptoresFc cognatos de uma segunda classe de imunoglobulina distinta da primeira classe deimunoglobulina. As referidas mudanças incluem, por exemplo, a substituição e/ou aremodelagem de uma ou mais alças, ou amino ácido e/ou porções de peptídeos do mesmo,de um primeiro domínio de imunoglobulina com uma ou mais alças, ou o amino ácido e/ouas porções peptídeos do mesmo, de um segundo domínio de imunoglobulina, onde osegundo domínio de imunoglobulina compreende um ou mais amino ácidos que formampelo menos uma porção de uma seqüência de ligação para o segundo receptor Fcimunoglobulina-específico. As proteínas de ligação de acordo com os referidos aspectos dapresente invenção são capazes de especificamente se ligar a FcαR além de serem capazesde especificamente se ligar a FcyRI, FcyRII, e/ou FcyRIII.

Exemplificadas aqui estão as proteínas de ligação compreendendo um ou maisdomínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada IgG, onde a proteína de ligação émodificada para se ligar a um ou mais receptores Fc imunoglobulina-específico não IgGincluindo, mas não são limitados ao receptor imunoglobulina-específico IgA FcaR (CD89).As proteínas de ligação deste tipo incluem, por exemplo, as proteínas de ligaçãocompreendendo mudanças (isto é, substituição de amino ácido e/ou inserção de aminoácido) na seqüência de amino ácido primária de um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 dearticulação de cadeia pesada IgG para gerar seqüências de amino ácido capazes de ligaçãoa receptor Fc imunoglobulina-específico não-lgG tal como, por exemplo, a ligação a Fca-receptor.

Em determinadas modalidades, são proporcionadas proteínas de ligaçãocompreendendo um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada IgG,onde a proteína de ligação é modificada para se ligar ao receptor imunoglobulina-específicoIgA FcctR (CD89). A referida proteína de ligação compreende uma ou mais substituições deamino ácido dentro da alça FG CH3 IgG e/ou uma ou mais substituições de amino ácidodentro da alça CD CH3 IgG. Por exemplo, uma das referidas proteínas de ligaçãoexemplificativas compreende a substituição da alça FG CH3 IgG compreendendo aseqüência de amino ácido C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q1 ou uma porção da mesma, coma alça FG CH3 IgA compreendendo a seqüência de amino ácido C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q1 ou uma porção correspondente do mesmo.

Outra proteína de ligação exemplificativa compreende a substituição da alça CD deCH3 IgG compreendendo a seqüência de amino ácido Q-P-E-N1 ou uma porção da mesma,com a alça CD de CH3 IgA compreendendo a seqüência de amino ácido Q-E-L-P-R-E, ouuma porção da mesma. Ainda uma outra proteína de ligação exemplificativa compreende asubstituição de ambas as alças FG CH3 IgG compreendendo a seqüência de amino ácidoC-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q, ou uma porção da mesma, com a alça FG CH3 de IgAcompreendendo a seqüência de amino ácido C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q, ou umaporção correspondente da mesma, e a alça CD CH3 IgG compreendendo a seqüência deamino ácido Q-P-E-N1 ou uma porção da mesma, com a alça CD CH3 IgA compreendendo aseqüência de amino ácido Q-E-L-P-R-E1 ou uma porção da mesma.

Qualquer uma das modalidades de proteínas de ligação acima mencionadas podeadicionalmente compreender a substituição do amino ácido CH3 de cadeia pesada IgG Met(na posição de amino ácido CH3 No. 28 dentro da seqüência K-D-T-L-M-l-S-R-T) com oamino ácido Leu de modo que uma proteína de ligação adicionalmente compreende aseqüência de amino ácido K-D-T-L-L-l-S-R-T. Alternativa ou adicionalmente, qualquer umadas modalidades de proteína de ligação pode adicionalmente compreender a substituição doamino ácido CH3 de cadeia pesada IgG Glu (na posição de amino ácido CH3 No. 157dentro da seqüência D-l-A-V-E-W-E-S-N) com o amino ácido Arg de modo que a proteína deligação adicionalmente compreende a seqüência de amino ácido D-l-A-V-R-W-E-S-N.

Esses e outros aspectos da presente invenção se tornarão aparentes comreferência à descrição detalhada a seguir e aos desenhos anexos. Todas as publicações,patentes e pedidos de patentes aqui mencionados, seja acima ou abaixo, se encontram aquiincorporados por referência em suas totalidades.

Breve descrição das figuras e identificadores de seqüência

A figura 1 apresenta o alinhamento de domínios CH2 IgG e IgA.

A figura 2 apresenta o alinhamento de uma região CH2-CH3 IgG do tipo selvageme três modificações exemplificativas para a referida região adequada para a geração deproteínas de ligação de acordo com a presente invenção.

A figura 3 apresenta o alinhamento de regiões CH2 e CH2 a partir de IgAI, lgA2,IgM, lgG2, lgG2, lgG2, lgG2, e IgE e de alças de imunoglobulinas correspondentes.(De Herr et ai, Nature 423:614 - 620 (2003))

SEQ ID NO: 1 é a seqüência de amino ácido da região de articulação de IgA1humano (VPSTPPTPSPSTPPTPSPS).

SEQ ID NO: 2 é a seqüência de amino ácido da região CH2 de IgA1 humano(CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGC YS VSS VLPG CAE PW N H G KT FTCT AAYP ES KTP LTATLS KS)

SEQ ID NO: 3 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgAI humano(GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSWMAEVDGTCY).

SEQ ID NO: 4 é a seqüência de amino ácido da região de articulação de IgA2humano (VPPPPP).

SEQ ID NO: 5 é a seqüência de amino ácido da região de lgA2CH2 humano(CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKS).

SEQ ID NO: 6 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgA2 humano(GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSWMAEVDGTCY).

SEQ ID NO: 7 é a seqüência de amino ácido da região de articulação de IgDhumano

(ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP).

SEQ ID NO: 8 é a seqüência de amino ácido da região CH2 de IgD humano(ECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFWGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREP).

SEQ ID NO: 9 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgD humano(AAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPRSTT FW AWSVLRVPAPPSPQPATYTCWSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK).

SEQ ID NO: 10 é a seqüência de amino ácido da região CH2 de IgE humano(VCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA).

SEQ ID NO: 11 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgE humano(DSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLWDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS).

SEQ ID NO: 12 é a seqüência de amino ácido da região CH4 de IgE humano(GPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK).SEQ ID NO: 13 é a seqüência de amino ácido da região de articulação de IgGihumano (EPKSCDKTHTCPPCP).

SEQ ID NO: 14 é a seqüência de amino ácido da região CH2 de IgG1 humano(APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWWDGVEVH NAKTKPRE EQ YN STYR WS VLTVL H Q DW LNG KEYKC KVS NKALPAPIEKTISKAK).

SEQ ID NO: 15 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgG1 humano(GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK).

SEQ ID NO: 16 é a seqüência de amino ácido da região de articulação IgG2humano (ERKCCVECPPCP).

SEQ ID NO: 17 é a seqüência de amino ácido da região CH2 de IgG2 humano(APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK).

SEQ ID NO: 18 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgG2 humano(GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK).

SEQ ID NO: 19 é a seqüência de amino ácido da região de articulação de lgG3

humano

(ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP).

SEQ ID NO: 20 é a seqüência de amino ácido da região CH2 de IgG3 humano(APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTFRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK).

SEQ ID NO: 21 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgG3 humano(GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK).

SEQ ID NO: 22 é a seqüência de amino ácido da região de articulação de IgG4humano(ESKYGPPCPSCP).

SEQ ID NO: 23 é a seqüência de amino ácido da região CH2 de IgG4 humano(APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK).

SEQ ID NO: 24 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgG4 humano(GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK).SEQ ID NO: 25 é a seqüência de amino ácido da região CH2 de IgM humano

(VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP).SEQ ID NO: 26 é a seqüência de amino ácido da região CH3 de IgM humano(DQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPK).

SEQ ID NO: 27 é a seqüência de amino ácido da região CH4 de IgM humano(GVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCWAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY).

SEQ ID NO: 28 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Bci-I Forward (ttc ttc tga tca gga gcc caa at).

SEQ ID NO: 29 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Sac-Il Reverso (GCT CCT CCC GCG GCT TTG TCTTGG).

SEQ ID NO: 30 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib1A_F1 (ttc ttc tga tca gga gcc caa ate ttc tga caaaac tca cac ate tcc acc gtg ccc ag).

SEQ ID NO: 31 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib1A_F2 (ggg acc gtc agt ctt cct ctt ccc ccc aaa acccaa gga cac cct cat gat ctc ccg ga).

SEQ ID NO: 32 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib1A_F3 (tgt ggt gga cgt gag cca cga aga ccc tgaggt caa gtt caa ctg gta cgt gga cgg cg).

SEQ ID NO: 33 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib1A_R1 (AGA GGA AGA CTG ACG GTC CACCNW NCA AGA GTT CAG GTG CTG GGC ACG GTG GAG ATG TGT).

SEQ ID NO: 34 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib1A_R2 (CGT GGC TCA CGT CCA CCA CCACGC ATG TGA CCT CAG GGG TCC GGG AGA TCA TGA GGG TGT).

SEQ ID NO: 35 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Libl A_R3 (GCT CCT CCC GCG GCT TTG TCT TGGCAT TAT GCA CCT CCA CGC CGT CCA CGT ACC AGT TGA).

SEQ ID NO: 36 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Libl B_F2 (wgg acc gtc agt ctt cct ctt ccc ccc aaa acccaa gga cac cct cat gat ctc ccg ga).

SEQ ID NO: 37 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib1B_R1 (AGA GGA AGA CTG ACG GTC CNWNAC CCA AGA GTT CAG GTG CTG GGC ACG GTG GAG ATG TGT).

SEQ ID NO: 38 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib1C_F2 (gnw ncc gtc agt ctt cct ctt ccc ccc aaa acccaa gga cac cct cat gat ctc ccg ga).

SEQ ID NO: 39 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib1C_R1 (AGA GGA AGA CTG ACG GNW NTCCAC CCA AGA GTT CAG GTG CTG GGC ACG GTG GAG ATG TGT).

SEQ ID NO: 40 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib2A_F2 (gcc gtc agt ctt cct ctt ccc ccc aaa acc caagga cac cct cat gat ctc ccg gac cc).

SEQ ID NO: 41 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib2A_F3 (tgt gga cgt gnw nag cca cga aga ccc tgaggt caa gtt caa ctg gta cgt gga cgg cg).

SEQ ID NO: 42 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib2A_R1 (GGA AGA GGA AGA CTG ACG GTCCAC CCA AGA GTT CAG GTG CTG GGC ACG GTG GAG ATG TGT).

SEQ ID NO: 43 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib2A_R2 (CGT GGC TNW NCA CGT CCA CCACCA CGC ATG TGA CCT CAG GGG TCC GGG AGA TCA TGA GG).

SEQ ID NO: 44 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib2B_F3 (tgt gga cgt gag cnw nca cga aga ccc tgaggt caa gtt caa ctg gta cgt gga cgg cg).

SEQ ID NO: 45 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib2B_R2 (CGT GNW NGC TCA CGT CCA CCACCA CGC ATG TGA CCT CAG GGG TCC GGG AGA TCA TGA GGG).

SEQ ID NO: 46 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como lib3A-F (gtc tcc aac aaa gcc nwn ctc cca gcc ccc ate).

SEQ ID NO: 47 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como lib3A-R (GAT GGG GGC TGG GAG NWN GGC TTTGTT GGA GAC).

SEQ ID NO: 48 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib3B-F (ccc aac aaa gcc ctc nwn cca gcc ccc ategag).

SEQ ID NO: 49 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib3B-R (CTC GAT GGG GGC TGG NWN GAGGGC TTT GTT GGA G).

SEQ ID NO: 50 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib3C-F (cac aaa gcc ctc cca nwn gcc ccc ate gagaaa ac).SEQ ID NO: 51 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como Lib3C-R (GTT TTC TCG ATG GGG GCN WNT GGGAGG GCT TTG TTG).

SEQ ID NO: 52 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como F1_ver1 (cag aac cac agg tgt aca ccc tgc ccc cat cccggg atg age tga cca aga acc agg).

SEQ ID NO: 53 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como F2_ver1 (age ttc tat cca age gac ate gcc gtg cgt tgggag age aat ggg cag gag ctg ccg).

SEQ ID NO: 54 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como F3_ver1 (ccc cgt gct gga ctc cga cgg ctc ctt ctt cct ctacag caa gct cac cgt gga caa).

SEQ ID NO: 55 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como F4-_ver1 (gct tet cct gea tgg tga tgc atg agg ctc tgc cac tcg cct tca cgc aga aga gcc).

SEQ ID NO: 56 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como R1_ver1 (tgc ttg gat aga age ctt tga cca ggc agg tcaggc tga cct ggt tet tgg tca gct).

SEQ ID NO: 57 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como R2_ver1 (cga gtc cag cac ggg agg cgt ggt ctt gta gttgtt ctc cgg cag ctc ctg ccc att).

SEQ ID NO: 58 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como R3_ver1 (ccc atg cag gag aag acg ttc ccc tgc tgc cacctg ctc ttg tcc acg gtg age ttg).

SEQ ID NO: 59 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como R4_ver1 (cgc tat aat cta gat cat tta ccc gga gac agggag agg ctc ttc tgc gtg aag g).

SEQ ID NO: 60 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como short-F (cag aac cac agg tgt aca ccc tgc cc).

SEQ ID NO: 61 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como short-R (cct ata ate tag ate att tac c).

SEQ ID NO: 62 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como F4_ver2 (gtc ttc tcc tgc atg gtg ggc cac gag gcc ctgccg ctg gcc ttc aca cag aag acc a).

SEQ ID NO: 63 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como R4_ver2 (cgc tat aat cta gat cat tta ccc gcc aag cggtcg atg gtc ttc tgt gtg aag g).SEQ ID NO: 64 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como F2_ver3 (agg ctt cta tcc aag cga cat cgc cgt tcg ctggct gca ggg gtc aca gga gct gcc c).

SEQ ID NO: 65 é a seqüência de nucleotídeos da região de primer deoligonucleotídeo designada aqui como R2_ver3 (cga gtc cag cac ggg agg cgt ggt ctt gta cttctc gcg ggg cag ctc ctg tga ccc).

Descrição Detalhada da Invenção

Como indicado acima, a presente invenção proporciona proteínas de ligaçãocompreendendo um ou mais domínio(s) CH2 e/ou CH3, de articulação de região constantede imunoglobulina onde um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de região constante e/ouarticulação é modificado para alterar uma ou mais função(ões) efetoras Fc da proteína deligação. Exemplificadas aqui estão as proteínas de ligação onde a região Fc de articulaçãode imunoglobulina é modificada para alcançar uma afinidade e/ou especificidade de ligaçãoalterada para um receptor cognato (por exemplo, um receptor Fc) e/ou para proporcionaruma ou mais nova(s) especificidade(s) de ligação à região Fc que a proteína de ligação nãomodificada correspondente não possui (por exemplo, afinidade para um ou mais receptoresFc que é distinta do receptor cognato ao qual a proteína de ligação não modificadaespecificamente se liga).

Especificamente, as proteínas de ligação modificadas aqui descritas incluem o aseguir:

(1) proteínas de ligação compreendendo uma inserção de um ou mais amino ácidosdentro de uma região CH2 e/ou CH3 de articulação de imunoglobulina onde aimunoglobulina exibe uma afinidade e/ou especificidade de ligação alterada (isto é,aumentada ou reduzida) para um ou mais de FcyRI (CD64); FcyRII (CD32), incluindoFcyRIIa, FcYRIIb, e FcyRIIc; e/ou FcyRIII (CD16), incluindo FcYRIIIa e FcYRIIIb;

(2) proteínas de ligação compreendendo uma inserção de uma ou maisseqüência(s) de glicosilação N-Iigada e/ou O-Iigada (tais como, por exemplo, uma ou maisseqüência(s) de glicosilação N-X-(S/T) N-Iigadas e/ou uma ou mais X-P-X-X (onde pelomenos um X é T), T-X-X-X (onde pelo menos um X is T), X-X-T-X (onde pelo menos um X isR ou K), e S-X-X-X (onde pelo menos um X is S)) proximal a e/ou distai ao campo de ligaçãoglicosilação N-Iigada e/ou O-Iigada na região Fc de imunoglobulina nativa correspondente,onde a proteína de ligação exibe uma afinidade e/ou especificidade de ligação a FcyRalterada (isto é, aumentada ou reduzida); e

(3) proteínas de ligação compreendendo a inserção e/ou a substituição de um oumais amino ácidos dentro de uma região CH2 e/ou CH3 de imunoglobulina IgG onde ainserção e/ou a substituição de amino ácido compreende um ou mais amino ácidoscorrespondendo a uma região CH2 e/ou CH3 de imunoglobulina IgA1 onde o(s) um ou maisamino ácido(s) de uma região CH2 e/ou CH3 de imunoglobulina IgA participa na ligaçãoespecífica de uma imunoglobulina IgA com o seu receptor Fc cognato e onde a proteína deligação modificada é capaz de se ligar especificamente ao FcaR.

Cada uma das referidas modalidades da presente invenção é descrita em maioresdetalhes abaixo.

A prática da presente invenção irá empregar, a não ser que indicadoespecificamente o contrário, métodos convencionais de imunologia, biologia molecular, equímica de proteína dentro da técnica, muitas das quais são descritas abaixo com o objetivoapenas de ilustração. As referidas técnicas são explicadas amplamente na literatura. Ver,por exemplo, Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (segunda edição,1989); "DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II" (D. Glover, ed.)\ "OligonucleotideSynthesis" (N. Gait, ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. Hames & S. Higgins, eds.,1985); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); Ausubel et a/., "CurrentProtocols in Molecular Biology" (New York, John Wiley e Sons, 1987); Bonifacino et al.,"Current Protocols in Cell Biology" (New York1 John Wiley & Sons, 1999); Coligan et al.,"Current Protocols in Immunology" (New York, John Wiley & Sons, 1999); Harlow e LaneAntibódies: a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988); e Lo, Ed., "AntibodyEngineering: Methods and Protocols," Part 1 (Humana Press, Totowa, New Jersey, 2004).As técnicas para a produção de ambos os tipos de mutação são bem conhecidas na técnica.Por exemplo, as mutações específicas podem ser introduzidas usando mutagênsesespecífica de campo como descrito em Sambrook et al., "Protocols in Molecular Biology,"supra. Mutações aleatórias em regiões específicas podem ser introduzidas usando, porexemplo, evolução forçada como descrito em Gulick e Fahl, Proc. NatL Acad. Sei. USA,92:8140-8144(1995).

DEFINIÇÕES

Como usado aqui, o termo "proteína de ligação" se refere a proteínascompreendendo um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada deimunoglobulina. "proteína de ligação" inclui e é mais preferivelmente uma imunoglobulina talcomo um anticorpo ou equivalente biológico ou funcional do mesmo e inclui partes,fragmentos, formas precursoras, derivados, variantes, e formas trabalhadas por engenhariagenética das mesmas e incluem a marcação com produtos químicos e/ou radioisótopos esemelhante, "proteínas de ligação" incluem, mas não são limitados a, "imunoglobulinas","anticorpos", "anticorpos monoclonais", "anticorpos quiméricos", "anticorpos humanizados", e"produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos" (isto é, produtos CMIP™) onde uma ouseqüências de amino ácido em um domínio CH2 e/ou CH3 de articulação de imunoglobulinaé alterado. Em determinadas modalidades, as proteínas de ligação modificadas aquidescritas compreendem mudanças em uma ou mais seqüência de amino ácido no domínioCH2 e/ou CH3 da articulação que são responsáveis pela afinidade e/ou especificidade deligação do receptor.

Os termos "imunoglobulina" e "anticorpo" amplamente incluem todas as classes esubclasses de anticorpos incluindo IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA1 e IgA2. O termo"anticorpo" inclui "anticorpo monoclonal" o qual como usado aqui, se refere a um anticorpoobtido a partir da população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, osanticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto pelas mutações deocorrência natural que não afetam substancialmente a especificidade, afinidade e/ouatividade de ligação do anticorpo. "Anticorpos monoclonais" incluem, mas não são limitadosa, anticorpos monoclonais não humanos, monoclonais quiméricos, monoclonaishumanizados, e monoclonais completamente humanos assim como os fragmentos e/ouporções de ligação a antígeno dos mesmos.

Como usado aqui, o termo "anticorpos quiméricos" se refere a moléculas deanticorpos monoclonais que compreendem cadeias pesadas e leves nos quais os domíniosvariáveis de anticorpo não humano são operacionalmente fundidos aos domínios constanteshumanos. Os anticorpos quiméricos em geral exibem imunogenicidade reduzida emcomparação ao anticorpo monoclonal completamente humano parental.

Como usado aqui, o termo "anticorpos humanizados" se refere a anticorposmonoclonais compreendendo um ou mais regiões de determinação de complementaridadenão humana (CDR), uma região de estrutura de domínio variável (FR), e um domínioconstante de cadeia pesada humana, tal como o domínio constante de cadeia pesada IgGi,IgG2, IgG3, e IgG4 e o domínio constante de cadeia leve humana tal como o domínioconstante de cadeia leve IgLambda e IgKappa. Como usado aqui, o termo "anticorpohumanizado" significa incluir anticorpos monoclonais humanos (anticorpo receptor) no qualos resíduos a partir de uma região de determinação de complementaridade (CDR) doreceptor são substituídos por resíduos de uma CDR de espécies não humanas (anticorpodoador) tal como rato, camundongo, ou coelho dotado da especificidade, afinidade ecapacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de estrutura de domínio variável doanticorpo humano são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Osanticorpos humanizados podem ainda compreender resíduos que são encontrados nem noanticorpo receptor nem na CDR importada ou seqüências de estrutura. Métodos para ahumanização de anticorpos não humanos apresentam um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos no mesmo a partir de uma fonte que não é humana. A humanizaçãopode ser alcançada ao se enxertar CDRs em um FR de suporte humano antes da fusão comum domínio constante de anticorpo humano apropriado. Ver, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); e Verhoeyen et al., Science239:1534-1536(1988).Como usado aqui, o termo "anticorpo completamente humano" se refere àimunoglobulinas compreendendo regiões variáveis humanas além da estrutura humana edas regiões constantes. Os referidos anticorpos podem ser produzidos usando diversastécnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a metodologia de exibição de fago foi descritaonde bibliotecas recombinantes de fragmentos de anticorpos humanos são exibidas em umbacteriófago. Ver, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Hoogenboom e Winter, J.Moi Bioi 227:381 (1991); e Marks et al, J. Moi Bioi 222:581 (1991).

Alternativamente, "anticorpos completamente humanos" podem ser produzidos emanimais transgênicos compreendendo o repertorio de imunoglobulina humana e maquináriopara efetuar a reorganização de gene e o conjunto de imunoglobulina. O uso de tecnologiade hibridoma, anticorpos completamente humanos específicos a antígeno com aespecificidade desejada podem ser produzidos e selecionados. Um sistema de animaltransgênico exemplificativo é a cepa XenoMouse® descrita por Green et ai, NatureGenetics 7:13-21 (1994). As cepas XenoMouse® são trabalhads por engenharia genéticacom cromossomos artificiais de levedura (YACs) contendo fragmentos de configuração delinha germinal 245 kb e 190 kb, respectivamente, do lócus de cadeia pesada humana e dolócus de cadeia leve kappa que contém seqüências de região constante e núcleo variável. Ighumano contendo YACs são compatíveis com o sistema de rato tanto para a reorganizaçãocomo para a expressão de anticorpos e são capazes de substituir os genes Ig de ratoinativados. Mais recentemente, Mendez et al., descreveu a introdução de aproximadamente80% do repertorio de anticorpo humano como fragmentos YAC de linha germinalconfigurada megabase dos Ioci de cadeia pesada humana e dos Ioci de cadeia leve kappa.Nature Genetics 15:146-156 (1997). Os sistemas de animais transgênicos adequados paragerar anticorpos completamente humanos de acordo com a presente invenção foramtambém descritos nas patentes U.S. Nos. 6,150,584; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825;5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 assim como em Jakobavits, Adv Drug Deiiv Rev. 31:33-42(1998); Marks et ai., Bio/Technoiogy 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859(1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev.Immunol. 13:65-93(1995).

Em uma modalidade alternativa para gerar anticorpos completamente humanos,outros empregaram "miniloci" onde um lócus Ig exógeno é mimetizado através da inclusãode fragmentos de genes individuais a partir do lócus Ig. Assim, ou um mais genes VH, um oumais genes Dh, um ou mais genes JH, uma região constante um, e uma segunda regiãoconstante (tipicamente uma região gama constante) são formadas em um construtor parainserção em um animal. A referida abordagem foi descrita na patente U.S. No. 5,545,807 toSurani et al. (Medicai Research Council) e U.S. Patent Nos. 5,545,806 e 5,625,825 toLonberg e Kay (GenPharm International, Inc.) assim como em Taylor et al., InternationalImmunology 6:579-591 (1994); Chen et al., International Immunology 5:647-656 (1993),Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:3720-3724 (1993); Tuaillon et al., J. Immunol.154:6453-6465 (1995); Choi et al. Nature Genetics 4:117-123 (1993); Lonberg et al., Nature368:856- 859 (1994); e Taylor et al., Nucleic Acids Res. 20:6287-6295 (1992).

Os anticorpos humanos evitam determinados problemas associados com osanticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes de rato ou camundongo. Apresença das referidas seqüências derivadas de camundongo ou rato podem conduzir auma rápida depuração dos anticorpos ou pode conduzir à geração de uma resposta imunecontra o anticorpo pelo paciente. Assim, o uso de anticorpos completamente humanos podeproporcionar uma vantagem substancial no tratamento de doenças humanas crônicas ourecorrentes, tais como inflamação, auto-imunidade, e câncer, que necessitam deadministração de anticorpos repetidas.

Como usado aqui, o termo "produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos"(produtos SMIP™) se refere a uma classe de compostos altamente modulares dotados depropriedades de droga aprimoradas em relação aos anticorpos monoclonais erecombinantes. Os produtos SMIP compreendem uma cadeia de polipeptídeo simplesincluindo um domínio de ligação alvo-específico, com base, por exemplo, no domíniovariável de anticorpo, em combinação com uma região FC variável que permite orecrutamento específico de uma classe desejada de células efetoras (tais como, porexemplo, macrófagos, células exterminadoras naturais (NK) e/ou recrutamento de mortemediado a complemento. Dependendo da escolha do alvo e das regiões de articulação, osprodutos SMIP podem sinalizar ou bloquear a sinalização por meio de receptores desuperfície celular. Como usado aqui, as proteínas de fusão trabalhadas por engenharia,denominadas de "produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos" ou produtos SMIP™,são como descritas nas publicações de patentes U.S. co-cessionadas de Nos. 2003/133939,2003/0118592, e 2005/0136049, e publicações de patente internacional co-cessionadasW002/056910, W02005/037989, e W02005/017148 ,

As proteínas de ligação de acordo com a presente invenção são modificadas paraalterar a(s) sua(s) função(ões) efetora(s) de modo que as mesmas se ligam com maior oumenor afinidade e/ou especificidade (a) a um ou mais receptores Fc cognatos e/ou (b) a umou mais receptores Fc não cognatos. Uma proteína de ligação é capaz de "ligaçãoespecífica" a um receptor cognato ou não cognato se a mesma reage a um nível detectável(dentro, por exemplo, de um teste ELISA) com o receptor cognato alvo mas não reage demodo detectável com o polipeptídeo não relacionado sob condições similares. "Ligaçãoespecífica", como usado aqui, em geral se refere a interações não covalentes do tipo queocorrem entre uma região FC de anticorpo e um receptor para o qual a região Fc deanticorpo é específica.

A resistência ou a afinidade das interações de "ligações específicas" pode serexpressa em termos de constante de dissociação (Kd) da interação, onde uma Kd menorrepresenta uma maior afinidade. As propriedades de ligação podem ser quantificadasusando os métodos bem conhecidos na técnica. Um dos referidos métodos se refere àmedição dos coeficientes de formação de complexo de proteína de ligação específica a alvo/receptor Fc (isto é, associação) e dissociação, onde os referidos coeficientes dependem dasconcentrações dos parceiros de complexo, da afinidade da interação, e nos parâmetrosgeométricos que igualmente influenciam o coeficiente em ambas as direções. Assim, tanto a"constante em coeficiente (Kon)" como a "constante fora do coeficiente (Koff) podem serdeterminadas ao se calcular as concentrações e os coeficientes atuais de associação edissociação. A proporção de KoffZKon permite o cancelamento de todos os parâmetros nãorelacionados à afinidade, e é assim igual à constante de dissociação Kd. Ver, em geral,Davies et ai, Annual Rev. Biochem. 59:439-473 (1990). Por "ligação específica" aqui sequer dizer que as proteínas de ligação se ligam aos receptores Fc alvo, proteínas e/ou aoutras moléculas com uma constante de dissociação que está na faixa de pelo menos 10"6-10"9 M, mais comumente pelo menos 10"7-10"9 M.

Como usado na presente especificação e nas reivindicações anexas, as formassingulares "o", "a" incluem as referencias plurais a não ser que o contexto dite claramente ocontrário.

Estrutura de Região Constante de Imunoglobulina

As proteínas de ligação da presente invenção compreendem, em combinaçãooperável, um ou mais domínio(s) CH2 e/ou CH3 de articulação a partir de uma ou maisimunoglobulinas selecionada a partir do grupo que consiste em IgM, IgD1 IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgE, IgA1 e IgA2. Proteínas de ligação exemplificativas compreendem um ou maisdomínio(s) CH2 e/ou CH3 de articulação de uma imunoglobulina IgG selecionada a partir deIgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Como descrito em detalhes aqui, as proteínas de ligação dapresente invenção são alteradas em uma seqüência de amino ácido pela inserção, deleçãoe/ou substituição de um ou mais amino ácidos de um domínio(s) CH2 e/ou CH3 dearticulação de uma imunoglobulina de ocorrência natural.

A seqüência de amino ácido dos domínio(s) CH2 e/ou CH3 de articulação deimunoglobulina são apresentadas na tabela 1 a seguir que é adaptada a partir dasseqüências proporcionadas pelo International ImMunoGeneTics Information System (IMGT)cujas seqüências se encontram publicamente disponíveis, por exemplo, emhttp://imgt.cines.fr/ e descritas aqui como SEQ ID NOs 1 - 27.Tabela 1

Seqüência de amino ácido primário de uma articulação de região Fc deimunoglobulina e domínios CH

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Os polipeptídeos de região de articulação de imunoglobulina ocorrem naturalmenteem imunoglobulinas das classes de IgG1 IgA1 e IgD. Uma grande diferença estrutural entreIgGi, IgG2, IgG3l e IgG4 é o comprimento da região de articulação. Na cadeia pesada deimunoglobulina, os polipeptídeos de região de articulação de imunoglobulina do tiposelvagem são situados entre as regiões CH1 e CH2 e contêm resíduos de cisteína que sãoresponsáveis pela formação de ligações dissulfeto intercadeia.

Como é conhecido na técnica, apesar da tremenda diversidade geral nasseqüências de amino ácido de imunoglobulina, a estrutura primária de imunoglobulina exibeum alto grau de conservação de seqüência em porções particulares das cadeias depolipeptídeo de imunoglobulina, notavelmente com relação à ocorrência dos resíduos decisteína os quais, em virtude de seus grupos sulfidrila, oferecem potencial para a formaçãode ligação dissulfeto com outros grupos sulfidrila disponíveis. Assim, no contexto dapresente invenção, os polipeptídeos de região de articulação de imunoglobulina do tiposelvagem incluem aqueles que caracterizam um ou mais resíduos de cisteína altamenteconservados. A seqüência de polipeptídeo de região de articulação de IgGa humana de tipo selvagem compreende três resíduos de cisteína não adjacentes, referidos como a primeiracisteína da região de articulação de tipo selvagem, uma segunda cisteína da região dearticulação de tipo selvagem e a terceira cisteína da região de articulação de tipo selvagem,respectivamente, prosseguindo ao longo da seqüência de região de articulação a partir dopolipeptídeo N-terminal em direção do C-terminal.

As regiões Fc IgA, IgD, e IgG de imunoglobulina compreendem um único domínioCH2 e um único domínio CH3 enquanto que as regiões Fc de IgE e IgM compreendem umúnico domínio CH2 e um único domínio CH3, e uma única cadeia CH4. Embora o percentualde identidade entre as quatro subclasses de regiões Fc IgG (isto é, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4)esteja em um excesso de 95%, as referidas regiões são dotadas de especificidades deligação a FcyR dramaticamente diferentes (ver tabela 2, abaixo).

Tabela 2

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Em algumas modalidades, as proteínas de ligação da presente invenção sãocapazes de citotoxicidade celular anticorpo dependente (ADCC), citotoxicidade celulardependente de complemento (CDC) e/ou fixação de complemento. A presente invençãooferece vantagens inesperadas associadas à retenção pelas proteínas de ligação descritasaqui da habilidade de mediar ADCC e/ou CDC e/ou fixação de complemento independentede qualquer alteração na afinidade e/ou especificidade de ligação da proteína de ligaçãopara um ou mais receptor cognato e/ou não cognato. A manipulação das seqüências quecodificam os domínios de região constante é referenciada em Morrison e Oi1 patente U.S.No. 6,218,149.

Mutações de Inserção de amino ácido que alteram a Afinidade e/ou especificidadede ligação de Fcv-Receptor de imunoqlobulina com base em IqG

Em um aspecto, a presente invenção proporciona proteínas de ligação, emparticular proteínas de ligação que compreendem um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 dearticulação de cadeia pesada de imunoglobulina, onde a proteína de ligação é modificada demodo que se liga com afinidade e/ou especificidade de ligação alterada (isto é, aumentadaou reduzida) a um ou mais receptor Fc específico para imunoglobulina. As proteínas deligação proporcionadas aqui ainda incluem aqueles onde um ou mais resíduos de aminoácidos é inserido em uma ou mais seqüências de amino ácido na região constante. Em umaspecto, um ou mais resíduos de amino ácidos é inserido em uma ou mais seqüências deamino ácido que fazem contato direto com um receptor, uma ou mais seqüências de aminoácido que são adjacentes à seqüência de amino ácido que faz contato direto com umreceptor, uma ou mais seqüências de amino ácido distais a partir da seqüência de aminoácido que faz contato direto com um receptor, ou varias combinações das referidasseqüências. Os resíduos de amino ácidos inseridos podem introduzir uma mudançaadaptável localizada ou geral na estrutura tridimensional da imunoglobulina que altera aafinidade e/ou especificidade de ligação a um receptor cognato.

Em determinadas modalidades, os resíduos de amino ácido inseridoscompreendem uma seqüência de amino ácido que é idêntica a uma seqüência de aminoácido existente em um domínio CH2 e/ou CH3 de articulação de proteína de ligação que fazcontato direto com um receptor cognato com a ligação. Em uma modalidade, uma ou maisseqüências de amino ácido que fazem contato direto com o receptor são posicionadas embalanço com relação à posição da seqüência de amino ácido de ligação de receptor do tiposelvagem, "tipo selvagem" como usado no presente contexto se refere à seqüência deamino ácido de uma proteína de ligação na qual mudanças devem ser introduzidas ou naseqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo que codifica a proteína de ligação.

Em um outro aspecto, a proteína de ligação inclui uma ou mais seqüências deligação de receptor inseridas idênticas à seqüência de ligação de receptor de tipo selvagemde uma proteína de ligação em um campo que é distai a partir de e na mesma cadeia que aseqüência de ligação de receptor de tipo selvagem e/ou ao campo em uma cadeia naproteína de ligação na qual a seqüência de ligação de receptor de tipo selvagem não estálocalizada, ou ambos. Independente da natureza precisa e da inserção da seqüência deamino ácido, modificações deste tipo são bem conhecidas e rotineiramente praticadas natécnica como descrito em Sambrook et ai, "Protocols in Molecular Biology," supra.

Exemplificadas aqui estão as proteínas de ligação, em particular as proteínas deligação que compreendem um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeiapesada IgG1 onde a proteína de ligação é modificada de tal forma que a mesma se liga comafinidade e/ou especificidade de ligação alterada (isto é, aumentada ou reduzida) a um oumais receptor Fc imunoglobulina específico incluindo, mas não limitado a, um ou mais dosreceptores imunoglobulina-específicos de IgG FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e/ou FcyRIII(CD16). As proteínas de ligação deste tipo incluem, por exemplo, as proteínas de ligaçãoonde um ou mais amino ácidos é inserido na seqüência de amino ácido primaria da proteínade ligação, dentro da articulação do domínio CH2 e/ou CH3, nas seqüências que sãoresponsáveis para a ligação a FcY-receptor. As referidas mudanças incluem, mas não sãolimitados a, inserção de um ou mais amino ácidos entre e/ou adjacente aos amino ácidosque contribuem para o contato direto com a associação de uma proteína de ligação com umou mais receptor Fc imunoglobulina específico(s) incluindo FcyRI (CD64), FcyRII (CD32),e/ou FcyRIII (CD16).

As modalidades específicas dos referidos aspectos da presente invenção incluemas proteínas de ligação que compreendem um ou mais domínios de CH2 IgG onde odomínio CH2 é um domínio CH2 de IgGI e/ou lgG3. Algumas das referidas modalidadesproporcionam proteínas de ligação que compreendem uma ou mais deleções de aminoácidos e/ou inserção de amino ácido dentro da estrutura de alça proximal da articulação, L-L-G-G-P, do domínio CH2 de IgGI e/ou lgG3. Especificamente exemplificado aqui estão asproteínas de ligação que compreendem inserções simples de um único amino ácido nasposições indicadas pelo "*" dentro da estrutura de alça proximal de articulação a seguir.Assim, proporcionadas aqui estão as proteínas de ligação que compreendem as estruturasde alça proximal de articulação modificada L-L-*-G-G-P, L-L-G-*-G-P, e L-L-G-G-*-P.Também proporcionadas aqui estão as proteínas de ligação que compreendem inserçõessimples de dois ou mais amino ácidos nas posições indicadas pelo "*" dentro da estrutura dealça proximal de articulação L-L-*-G-G-P, L-L-G-*-G-P, e L-L-G-G-*-P. assim, nas referidasmodalidades, "*" indica a inserção de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, ou 20 amino ácidos. Tipicamente, os amino ácidos adequados para ageração de proteínas de ligação dotadas das referidas estruturas de alça proximais dearticulação modificadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em Ala, Gly, lie,Leu, e Vai.

Outras modalidades proporcionam proteínas de ligação que compreendemdomínios de CH2 IgG onde o domínio CH2 é um domínio CH2 de IgGI, lgG2 e/ou lgG3.Algumas das referidas modalidades proporcionam proteínas de ligação que compreendemuma ou mais deleções de amino ácidos e/ou inserção de amino ácido dentro da estrutura dealça BC1 D-V-S-H-E, do domínio CH2 de lgG1, lgG2 e/ou lgG3. Especificamenteexemplificado aqui estão as proteínas de ligação que compreendem inserções simples deum único amino ácido nas posições indicadas pelo "*" dentro da estrutura de alça BC aseguir. Assim, proporcionadas aqui estão as proteínas de ligação que compreendem asestruturas de alça BC D-V-*-S-H-E e D-V-S-*-H-E. Também, nas referidas modalidades, "*"indica a inserção de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,ou 20 amino ácidos. Tipicamente, os amino ácidos adequados para a geração de proteínasde ligação dotadas das referidas estruturas de alça BC modificadas são selecionadas apartir do grupo que consiste em Ala, Gly, lle, Leu, e Vai.

Ainda outras modalidades proporcionam proteínas de ligação que compreendemum ou mais domínios de CH2 IgG onde o domínio de CH2 é um domínio de CH2 de IgG1e/ou IgG3. Algumas das referidas modalidades proporcionam proteínas de ligação quecompreendem uma ou mais deleções de amino ácidos e/ou inserção de amino ácido dentroda estrutura de alça FG, A-L-P-A-P-l, do domínio CH2. Especificamente exemplificado aquiestão as proteínas de ligação que compreendem inserções simples de um único aminoácido nas posições indicadas pelo "*" dentro da estrutura de alça FG a seguir. Assim,proporcionadas aqui estão as proteínas de ligação que compreendem as estruturas de alçaFG A-L-*-P-A-P-l, A-L-P-*-A-P-l, e A-L-P-A-*-P-l. Também proporcionadas aqui estão asproteínas de ligação que compreende inserções simples de dois ou mais amino ácidos nasposições indicadas "*" dentro das estruturas de alça FG A-L-*-P-A-P-l, A-L-P-*-A-P-l, e A-L-P-A-*-P-l. Assim, nas referidas modalidades, "*" indica a inserção de pelo menos 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 amino ácidos. Tipicamente, os aminoácidos adequados para a geração de proteínas de ligação dotadas das referidas estruturasde alça FG modificadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em Ala, Gly, lie,Leu, e Vai.

O espaçamento, em termos de número de resíduos de amino ácido intervenientes,entre uma primeira seqüência de ligação de receptor inserido e uma segunda seqüência deligação de receptor inserido e a terceira seqüência de ligação de receptor inserido e assimpor diante, pode variar entre zero (0) resíduos de amino ácido intervenientes e cerca de 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou maisresíduos de amino ácido.

O número exato de resíduos de amino ácido intervenientes, se presentes, entre aprimeira seqüência de ligação de receptor inserido e a segunda seqüência de ligação dereceptor inserido e a terceira seqüência de ligação de receptor inserido irá variar de modo aaumentar a afinidade de ligação do receptor. Nas proteínas de ligação modificadascompreendendo mais de dois campos de ligação de receptor, o número de resíduos deamino ácido intervenientes entre as seqüências de ligação de receptor pode ser o mesmoou pode ser diferente. Os resíduos de amino ácido intervenientes nas regiões espaçadoraspodem ser especificamente selecionados ou podem ser aleatoriamente selecionados ao setestar a afinidade de ligação.

Em uma modalidade exemplificativa, a funcionalidade da proteína de ligação, porexemplo, a funcionalidade do produto G-SMIP™ para aumentar ou diminuir a ligação deFcyRI (CD64), ligação de FcyRII (CD32), e/ou ligação de FcYRIIIa (CD16). Emdeterminados aspectos das referidas modalidades exemplificativas, as referidas mudançasna funcionalidade da imunoglobulina são eficazes no aumento ou na redução,respectivamente, da citotoxicidade celular dependente de anticorpo correspondente (ADCC).Em determinadas modalidades, a proteína de ligação é um produto G-SMIP onde afuncionalidade é alterada, como descrito acima, ao se inserir e/ou deletar uma seqüência deamino ácido dentro das alças Fcy. Nas modalidades relacionadas, a proteína de ligação éum produto G-SMIP onde a funcionalidade é alterada ao se mudar os contatos da alça comFcyR e/ou C1q. Por exemplo, os amino ácidos podem ser inseridos e/ou deletados paraalterar a face de ligação para FcyRs ou para diminuir a CDC ao se reduzir a ligação C1q.

A inserção de resíduos de amino ácido em uma seqüência de amino ácido deproteína de ligação pode ser direcionada, por exemplo, através de uma ou mais mutaçõesde inserção dentro de um polinucleotídeo que codifica a seqüência de amino ácido deimunoglobulina, ou através de mutações aleatórias nas regiões específicas como descritoaqui.

A ligação FcyRI, ligação FcyRII, ligação FcyRIII, e ligação FcctRIII podem seravaliadas ao se medir, respectivamente, a ligação a CD64, CD32, CD16, e CD89 pelametodologia bem conhecida na técnica e como descrito em maiores detalhes aqui abaixo.

Mutações que compreendem as seqüências de qlicosilação que alteram a afinidadee/ou especificidade de ligação de Fcy-Receptor de Imunoglobulina com base em IqG

As proteínas de ligação da presente invenção, como descritas aqui, podem, deacordo com determinadas modalidades, desejavelmente compreender campos adicionais deglicosilação, por exemplo, fixação covalente de frações carboidrato, tais como, por exemplo,monossacarídeos ou oligossacarídeos. A incorporação de seqüências de amino ácido queproporcionam substratos para a glicosilação de polipeptídeo está incluída no âmbito datécnica relevante, incluindo, por exemplo, o uso de metodologias de engenharia genética oude engenharia de proteínas para se obter a seqüência de polipeptídeo contendo, porexemplo, o campo Asn-X-Ser/Thr clássico para a glicosilação N-(asparagina) ligada, ou umaseqüência contendo resíduos Ser ou Thr que são substratos adequados para a glicosilaçãoO-ligada ou as seqüências capazes de C-manosilação, modificaçãoglipiação/glicosilfosfatidilinositol, ou fosfoglicação, todos os quais são identificados deacordo com os critérios estabelecidos na técnica (por exemplo, Spiro, Glybiology 12:43R(2002)).

Acredita-se que a glicosilação N-Iigada da alça DE CH2 de imunoglobulina altere aconformação de CH2 e proporcione contato direto do açúcar com a FcyR. As modificaçõesdentro das glicoformas de imunoglobulina podem ser alcançadas ao se inserir uma ou maisseqüências de amino ácido compreendendo um campo de glicosilação N-Iigado tal como,por exemplo, a seqüência de amino ácido YNSTY. As referidas novas glicoformas podemapresentar propriedades de ligação FCyR alteradas. Em um aspecto alternativo dasreferidas modalidades, um segundo campo de glicosilação N-Iigado pode ser inserido naalça DE CH2. Por exemplo, a seqüência do tipo selvagem YNSTY pode ser convertida emYNSTYNSTY. As referidas modificações de imunoglobulina irão substancialmente afetar aligação FcyR e, conseqüentemente, a citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC).

Foi mostrado que a glicosilação N-ligada, em particular a glicosilação N-Iigada naposição de amino ácido Asn297, é essencial para a ligação às imunoglobulinas da classeIgG aos seus receptores de Fcy cognatos. Assim, por exemplo, a mutação de Asn297 emAla297 foi mostrada para abolir o reconhecimento de FcyRI. Foi similarmente mostrado que,na ausência do oligossacarídeo N-Iigado na posição Asn297, o reconhecimento e/ouativação de FcyRI, FcyRII, FcyRIII (assim como do complemento C1q) é abolido enquantoque a proteína Aea ligação do fator reumatóide não são afetados. As seqüências deglicosilação O-Iigada são bem conhecidas na técnica como descrito, por exemplo, emGooley et ai, Biochem. Biophys. Res. Commun. 178:1194-1201 (1991) e Pisano et ai,Glycobiology 3:429-435 (1993).

Em determinados aspectos, a presente invenção proporciona modificações queincluem a inserção de um ou mais amino ácidos em e/ou a deleção de um ou mais aminoácidos a partir de uma ou mais região de articulação e/ou região constante de alça(s) deimunoglobulina compreendendo um ou mais campo(s) de glicosilação O- e/ou N-ligadas.

Assim, a presente invenção proporciona proteínas de ligação, em particularproteínas de ligação compreendendo um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação decadeia pesada, onde a proteína de ligação compreende uma ou mais modificação(ões)dentro de um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada onde amodificação compreende a inserção de uma ou mais seqüência de glicosilação N-ligada(s)e/ou um ou mais seqüência de glicosilação O-ligada(s), cuja seqüência de glicosilação ésuficiente para alcançar a glicosilação N- e/ou O-Iigada na posição de inserção deste modoalterando (isto é, seja aumentando ou diminuindo) a afinidade e/ou especificidade de ligaçãoda proteína de ligação a um ou mais receptores Fc imunoglobulina-específico ou outraproteína alvo. As proteínas de ligação deste tipo incluem, por exemplo, aquelascompreendendo as mudanças na seqüência amina primária nas posições que são proximaise/ou distais às regiões, domínios, e/ou estruturas de alça responsáveis pela glicosilação naproteína de ligação não modificada.

Exemplificadas aqui estão as proteínas de ligação que compreendem um ou maisdomínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada IgG, onde as proteínas de ligaçãocompreendem uma ou mais modificação(ões) dentro de um ou mais domínios CH2 e/ouCH3 de articulação de cadeia pesada IgG onde a modificação compreende a inserção deuma ou mais seqüência(s) de glicosilação N-ligada(s) e/ou uma ou mais seqüência deglisosilação O-ligada, cuja seqüência de glicosilação é suficiente para alcançar aglicosilação N- e/ou O-Iigada na posição de inserção deste modo alterando (isto é, sejaaumentando ou reduzindo) a a afinidade e/ou especificidade de ligação da proteína deligação a um ou mais Receptor(es) específico(s) para imunoglobulina IgG FcyRI (CD64),FcyRII (CD32), e/ou FcyRIII (CD16) em comparação a uma proteína de ligaçãocorrespondente compreendendo um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação decadeia pesada IgG não modificados.

As modalidades específicas dos referidos aspectos da presente invenção incluemproteínas de ligação compreendendo um ou mais domínios de articulação de IgG, um oumais domínios de CH2 IgG, e/ou um ou mais domínios de CH3 IgG onde o domínio CH2e/ou CH3 da articulação, é um domínio CH2 e/ou CH3 de articulação IgGI, um domínio CH2e/ou CH3 de articulação lgG2, um domínio CH2 e/ou CH3 de articulação lgG3, e/ou umdomínio CH2 e/ou CH3 de articulação lgG4. Algumas das referidas modalidadesproporciona proteínas de ligação compreendendo a inserção de uma ou mais seqüência de glicosilação N-Iigada N-X-(S/T) (onde X é qualquer amino ácido) e/ou uma ou maisseqüência de glicosilação O-Iigada X-P-X-X (onde pelo menos um X é T), T-X-X-X (ondepelo menos um X é T), X-X-T-X (onde pelo menos um X é R ou K), e/ou S-X-X-X (onde pelomenos um X é S)) proximal a e/ou distai ao campo de glicosilação N-Iigada ou deglicosilação O-Iigada no domínio CH2 e/ou CH3 de imunoglobulina IgG nativocorrespondente de articulação IgGI. Em determinados aspectos das referidas modalidades,a proteína de ligação exibe uma afinidade e/ou especificidade de ligação a FcyR alterada(isto é, aumentada ou reduzida).

Exemplificadas aqui estão as referidas modalidades onde as proteínas de ligaçãocompreendem um ou mais domínios de articulação de IgG1 um ou mais domínios de CH2IgG, e/ou um ou mais domínios de CH3 IgG e onde as proteínas de ligação adicionalmentecompreendem a inserção de uma ou mais seqüência de glicosilação N-Iigada N-X-(S/T)(onde X é qualquer amino ácido). Por exemplo, a presente invenção proporciona asreferidas proteínas de ligação que compreendem uma inserção de uma ou mais seqüênciasN-X-(S/T) adjacentes à seqüência N-S-T nativa dentro da alça DE de um ou mais domíniosCH2 IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4. Em determinados aspectos das referidas modalidades, aproteína de ligação exibe uma afinidade e/ou especificidade de ligação a FcyR alterada (istoé, aumentada ou reduzida).

Em modalidades especificas, a seqüência de glicosilação N-Iigada dentro da alçaDE de um ou mais domínio CH2 IgGi, IgG2, IgG3, e/ou IgG4 compreende a seqüência deamino ácidos N-S-T e é inserida adjacente a e/ou dentro de 0 a 100 amino ácidos amino-terminal e/ou carbóxi-terminal para a seqüência N-S-T nativa de modo que a seqüência deamino ácido nativa X-N-S-T-Z é modificada em AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAc) onde cada umde AAa, AAb, e AAc independentemente designa de 1 a 100 amino ácidos.

Nas modalidades especificas, a seqüência de glicosilação N-Iigada dentro da alçaDE de um ou mais domínios CH2 IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4 compreende a seqüência deamino ácido N-S-T e é inserida adjacente à seqüência N-S-T nativa de modo que aseqüência nativa de amino ácido X-N-S-T-Z é modificada para X-N-S-T-Z-N-S-T-Z1 onde X eZ são independentemente selecionados a partir de Tyr (Y) e Phe (F).

Nas referidas modalidades alternativas, a seqüência de glicosilação N-Iigada éinserida na alça BC de um ou mais domínio CH3 de IgG1l IgG2l IgG3, e/ou IgG4 compreendea seqüência de amino ácido N-S-T é inserida distai à seqüência nativa N-S-T de modo que aseqüência nativa de amino ácido Y-P-S-D-I-A é modificada para Y-P-N-S-T-D-I-A e Y-N-S-T-P-S-D-l-A.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona proteínas de ligação, emparticular proteínas de ligação que compreendem um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 dearticulação de cadeia pesada IgG, onde a proteína de ligação compreende uma ou maismodificação(õess) dentro de um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeiapesada IgG onde a modificação compreende a inserção de uma ou mais seqüências deglicosilação N-ligada(s) e/ou um ou mais seqüências de glisosilação O-ligadas, cujaseqüência de glicosilação é suficiente para alcançar a glicosilação N- e/ou O-Iigada naposição de inserção deste modo alterando (isto é seja aumentando ou reduzindo) aafinidade e/ou especificidade de ligação da proteína de ligação a um ou mais receptores Fcimunoglobulina-específico incluindo os receptores IgG imunoglobulina-específicos FcyRI(CD64), FcyRII (CD32), e/ou FcyRIII (CD16) em comparação à proteína de ligaçãocorrespondente compreendendo um ou mais domínio CH2 e/ou CH3 de articulação decadeia pesada IgG não modificados. As proteínas de ligação deste tipo incluem, porexemplo, aquelas compreendendo as mudanças na seqüência amino primária em posiçõesque são proximais e/ou distais às regiões, domínios e/ou estruturas de alça responsáveispara a glicosilação na proteína de ligação não modificada.As referidas mudanças incluem, por exemplo, a inserção de três ou mais aminoácidos compreendendo a seqüência YNS para a glicosilação N-Iigada entre e/ou adjacenteaos amino ácidos que com a ligação estão em contato com um ou mais receptores Fcimunoglobulina-específicos incluindo FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e/ou FcyRIII (CD16).

Um aspecto da modalidade atualmente descrita proporciona modificações dentro daalça DE do domínio CH2 da classe IgG de imunoglobulinas referidas como produtos G-SMIP™, que contêm uma ou mais seqüência de amino ácido YNSTY que é um campo paraa glicosilação N-Iigada e para os contatos de FcyR.

Proteínas de ligação tanto dotada de Especificidades de ligação de Receptorcognato como de Receptor não coonato

Dentro ainda de aspectos adicionais, a presente invenção fornece proteínas deligação, onde uma funcionalidade nova é conseguida substituindo uma ou várias alças deimunoglobulina de uma primeira classe da imunoglobulina com uma ou várias segundas alçade imunoglobulina de uma segunda classe de imunoglobulina onde o segundo alça deimunoglobulina proporciona uma especificidade de ligação nova à proteína de ligaçãomodificada que não está presente na proteína de ligação não modificada correspondente.

Proteínas de ligação de acordo com os referidos aspectos da presente invençãocompreendem uma ou mais articulações de cadeia pesada, domínio de CH2, e/ou CH3 deuma primeira classe da imunoglobulina (isto é, IgA1 IgD, IgE, IgG, ou IgM), na qual aproteína de ligação é modificada (isto é, por substituição de amino ácido e/ou inserção deamino ácido) na seqüência primária de amina de uma ou mais articulações de cadeiapesada, Domínio de CH2, e/ou CH3, da primeira classe da imunoglobulina para gerar aproteína de ligação capaz de se ligar a um ou mais receptor Fc cognato de uma segundaclasse de imunoglobulina distinta da primeira classe de imunoglobulina. As referidasmodificações incluem, por exemplo, a substituição e/ou remodelagem de um ou mais alças,ou de suas porções de amino ácido e/ou peptídeo, de um primeiro domínio deimunoglobulina com uma ou mais alças, ou de suas porções de amino ácido e/ou peptídeo,de um segundo domínio de imunoglobulina, na qual o segundo domínio de imunoglobulinacompreende um ou mais amino ácidos que formam pelo menos uma porção de umaseqüência de ligação para um segundo receptor Fc específico de imunoglobulina. Proteínasde ligação de acordo com os referidos aspectos da presente invenção têm a capacidade deespecificamente se ligar a FcaR além de ser capaz de especificamente se ligar a FcyRI,FcyRII, e/ou FcyRIII.

Estão exemplificadas aqui proteínas de ligação compreendendo um ou mais domínio de CH2, e/ou CH3 de articulações de cadeia pesada IgG, no qual a proteína deligação é modificada para se ligar a um ou mais receptor Fc específico de imunoglobulinanão-lgG incluindo, mas não limitado ao receptor Fc específico de imunoglobulina IgA(CD89). Proteínas de ligação do referido tipo incluem, por exemplo, proteínas de ligaçãocompreendendo modificações (isto é, substituição de amino ácido e/ou inserção de aminoácido) na seqüência primária de amina de um ou mais domínio CH2 e/ou CH3 de articulaçãode cadeia pesada IgG, para gerar seqüências de amino ácido capazes de ligar o receptor Fcespecífico de imunoglobulina não-lgG tais como, por exemplo, ligação de receptor de Fca.

Nas referidas modalidades são proporcionadas proteínas de ligaçãocompreendendo um ou mais domínio CH2 e/ou CH3 de articulacao de cadeia pesada IgG,no qual a proteína de ligação é modificada para se ligar ao receptor Fc específico deimunoglobulina IgA (CD89). As referidas proteínas de ligação exemplificativas compreendemuma ou mais substituição de amino ácido dentro da alça de FG CH3 IgG e/ou um ou maissubstituição de amino ácido dentro da alça de CD CH3 IgG.

Por exemplo, a referida proteína de ligação exemplificativa compreende asubstituição da alça de FG CH3 IgG compreendendo a seqüência de amino ácido C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q1 ou uma porção do referido, com o alça de FG CH3 IgAcompreendendo a seqüência de amino ácido C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q, ou umacorrespondente porção do referido.

Outra proteína de ligação exemplar compreende a substituição da alça de CD CH3IgG compreendendo a seqüência de amino ácido Q-P-E-N, ou uma porção do referido, coma alça de CD CH3 IgA compreendendo a seqüência de amino ácido Q-E-L-P-R-E1 ou umaporção do referido.

Ainda outra referida proteína de ligação exemplar compreende uma substituiçãotanto da alça de FG CH3 IgG compreendendo a seqüência de amino ácido C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q, ou uma porção do referido, com o alça de FG CH3 IgA compreendendo aseqüência de amino ácido C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q, ou uma correspondente porçãodo referido, e a alça de CD CH3 IgG compreendendo a seqüência de amino ácido Q-P-E-N,ou uma porção do referido, com o alça de CD CH3 IgA compreendendo a seqüência deamino ácido Q-E-L-P-R-E, ou uma porção do referido.

Qualquer uma das modalidades de proteína de ligação acima mencionadas pode,além disso, compreender a substituição de CH3 amino ácido Met de cadeia pesada IgG (naposição de amino ácido CH3 no. 28 dentro da seqüência K-D-T-L-M2S-I-S-R-T) com aminoácido Leu de modo que a proteína de ligação, além disso, compreende a seqüência deamino ácido K-D-T-L-L28-I-S-R-T. Alternativa ou adicionalmente, qualquer uma dasmodalidades de proteína de ligação acima mencionadas pode, além disso, compreender asubstituição do amino ácido CH3 de cadeia pesada IgG Glu (na posição de amino ácidoCH3 no. 157 dentro da seqüência D-I-A-V-E157-W-E-S-N) com amino ácido Arg de modo quea proteína de ligação, além disso, compreende a seqüência de amino ácido D-I-A-V-R157- W-E-S-N.Exemplificada aqui, com certas modalidades, um alça compreendendo um contatode ligação para um não- FcyR é inserido na proteína de ligação com base em IgGcompreendendo um ou mais domínio CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada IgG1na qual as proteínas de ligação são modificadas para se ligar a um ou mais receptores Fcespecífico de imunoglobulina não-lgG incluindo, mas não limitado ao IgA receptor Fcespecífico de imunoglobulina FcaR (CD89). Proteínas de ligação do referido tipo incluem,por exemplo, proteínas de ligação compreendendo uma ou mais mudanças (isto é,substituição de amino ácido e/ou inserção de amino ácido) na seqüência primária de aminade um ou mais domínio CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada IgG, para gerarseqüências de amino ácido capazes de ligar o receptor Fc específico de imunoglobulinanão-lgG tais como, por exemplo, ligação de receptor de Fca. As referidas modificaçõesincluem, por exemplo, a substituição e/ou remodelagem de um ou mais alça deimunoglobulina IgG com um ou mais alça de imunoglobulina não-lgG e/ou porções depeptídeo, na qual a alça de imunoglobulina não-lgG compreende a seqüência de ligaçãopara um receptor Fc específico de imunoglobulina não-lgG.

Em certas modalidades, a proteína de ligação é um produto G-SMIP no qual afuncionalidade do produto G-SMIP é alterada de modo que o produto G-SMIP se liga a umou mais FcaR tais como CD89. Várias alças no domínio de CH3 de IgG são projetadas,como descrito acima, para fornecer interações moleculares modificadas e/ou novas. Porexemplo, amino ácidos CH2 e/ou CH/3 de articulação IgG, podem ser substituídos comarticulação IgA, CH2, e/ou resíduos de CH3 que participam da ligação entre IgA e FcaR. Porexemplo, e como descrito acima para proteínas de ligação, geralmente, a alça de FG CH3IgG pode ser substituída com um alça de FG CH3 IgG mais outro amino ácidos que entraem contato com FcaR. Alternativa ou adicionalmente, a alça de CD CH3 IgG pode sersubstituída com a alça de CD CH3 IgA mais outros amino ácidos que entram em contatocom o FcaR. produtos G-SMIPs Exemplares compreendem uma extremidade aminoterminal do anticorpo humano chamado 2H7-018014. Produtos G-SMIP™ compreendendo,por exemplo, amino ácidos que conferem atividade de ligação FcaR retêm os benefícios doproduto não-modificado SMIP™ de base G tal como, por exemplo, longa meia-vida in vivo,de fácil purificação por proteína A, e/ou funções efetoras IgG.

Ainda, além disso, as modalidades proporcionam modificações na especificidade daproteína de ligação para ligação de receptor não-anticorpo tais como, por exemplo, se ligaruma proteína de superfície de célula Τ; B proteínas de superfície de célula; proteínas desuperfície de célula mielóide; e proteínas de célula não imune.

Metodologia para a geração, expressão, e funcionalidades caracterizantes deProteínas de ligação dotadas de função efetora alterada

Uma vez que a proteína de ligação, como proporcionada aqui, tenha sido projetada,polinucleotídeos incluindo codificação de DNA1 a proteína de ligação pode ser sintetizadatotal ou parcialmente via síntese de oligonucleotídeo como descrito, por exemplo, em Sinhaet al., Nucleic Acids Res., 12:4539-4557 (1984); montada via PCR como descrito, porexemplo, em lnnis, Ed. "PCR Protocols" (Academic Press, 1990) e também em Better et al.,J Biol. Chem. 267:16712-16118 (1992). A metodologia para o seqüenciamento, clonagem, eexpressão das referidas proteínas de ligação modificadas e não-modificadas sãoconhecidos no método por referência, por exemplo, a procedimentos como descrito emAusubel et al., Eds. "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons, New York,1989) e também em Robinson et al., Hum. Antibod. Hybridomas 2:84-93 (1991). Asproteínas de ligação da presente invenção podem ser expressas em uma linhagem de célulaeucariota (tais como, por exemplo, uma linhagem de célula CHO), purificadas viacromatografia de Proteína A, e caracterizadas por ensaios funcionais.

A expressão pode ser alcançada em qualquer sistema de expressão mamíferoconvencional conhecido no método pelo isolamento de fragmento DNA codificando aproteína de ligação de interesse e clonando em um vetor mamífero de expressão tais como,por exemplo, pD18. DNA a partir de clones positivos pode ser amplificado usando kits depreparação plasmídeo QIAGEN (QIAGEN, Valencia, CA). O DNA de recombinação doplasmídeo pode ser tornado linear em uma região do não essencial pela digestão com umaendonuclease apropriada de limitação, purificado pela extração do fenol, e resuspenso emmeios de cultura do tecido (por exemplo, Excell 302; Catalog # 14312-79P, JRHBiosciences, Lenexa, KS). Células adequadas para transfecção são, por exemplo, célulasCHO DG44, tipicamente em estágio de crescimento logarítmico. As células são colhidaspara cada reação de transfecção e DNA Iinearizado é adicionado às células para atransfecção ou electroporação. Por exemplo, a produção estável das proteínas de ligação dapresente invenção pode ser alcançada por electroporação de células CHO com umplasmídeo selecionável e amplificável, tais como pD18, contendo o cDNA codificando aproteína de ligação sob o controle do promotor de CMV. (todas as linhas de células estãodisponíveis a partir da American Type Culture Collection; Manassas, VA). Um cassete deexpressão compreendendo a proteína de ligação cDNA pode ser subclonada a jusante deum promotor adequado (tal como o promotor de CMV).

Células transfeccionadas podem se recuperar durante a noite em um meio não-seletivo antes da distribuição seletiva em uma placa inferior lisa de 96 cavidades (Costar)em variar as diluições de série que variam, por exemplo, de 125 células/cavidade a 2000células/cavidade com meio de cultura adequado para célula clonando tais como meiocompleto Excell 302, contendo agentes seletivos (tais como, por exemplo, 100 nMmetotrexato no caso de resistência a DHFR). Diluições seriais de sobrenadantes da culturaa partir de cavidades master são selecionadas para se ligar a células expressando arelevante liga da proteína de ligação.

Os sobrenadantes são tipicamente coletados a partir de células CHO expressandoa proteína de ligação, filtradas através de filtros de 0.2 //m (Nalgene, Rochester, NY), epassadas por agarose de Proteína A (IPA 300 agarose reticulada) coluna (Repligen,Needham1 MA). A coluna é lavada com PBS e a proteína de ligação é eluída usando 0.1 Mde tampão citrato, pH 3. As frações são coletadas e a proteína eluída é neutralizada usando1M Tris1 pH 8.0, antes da diálise no PBS. A concentração de proteína de ligação purificadapode ser determinada por absorção a 280 nm.

As Proteínas de ligação podem ser testadas para atividades desejadas, porexemplo, se ligar a um alvo receptor tal como FcyRI, FcyRII, FcyRIII e/ou FcaR1 ou atividadede ligação de antígeno específico, como descrito, por exemplo, em Harlow et ai, Eds."Antibodies: A Laboratory Manual" Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory1 Cold SpringHarbor, 1988) e Munson et ai, Anal. Biochem.- 107:220-239 (1980) bem como emcitotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidadedependente de complemento (CDC) por métodos conhecidos no método. Os ensaios deADCC e CDC, respostas secundárias de anticorpo in vitro, fluxo de análiseimunocitofluorimétrica de vários subpopulações de células de sangue periférico ou linfóidemononuclear usando sistemas de marcação por antígenos de cavidade, imunohistoquímica,e outros ensaios relevantes são, por exemplo, todos proporcionados aqui por referência aRose et ai Eds. "Manual of Clinicai Laboratory Immunology" (American Society deMicrobiology1 Washington, DC, 1997).

A habilidade de proteínas de ligação para mediar ADCC pode ser medida usandoqualquer alvo de linhagem de célula adequado e PBMCs que as células de efeito. Porexemplo, no específico caso de proteínas de ligação CD20 específicas, as linhagensadequadas de células incluem a linhagem de células B Ramos e Bjab. Efetoras para taxasde alvo são tipicamente variadas, por exemplo, como se segue: 100:1, 50:1, 25:1, e 10:1,com o número de células de alvo por cavidade permanecendo constante enquanto variandoo número de PBMCs. As células de alvo são marcadas com 51Cr (por exemplo, Na251CrO4) eseparadas em alíquotas em uma densidade de célula de 5 χ 104 células/cavidade para cadacavidade de uma placa de 96 cavidades. As proteínas de ligação purificadas sãoadicionadas na concentração de 10 //g/mL para as várias diluições de PBMCs. A liberaçãoespontânea é medida sem a adição de PBMC ou proteína de ligação, e a liberação máximaé medida pela adição de detergente (1% NP-40) nas cavidades apropriadas. As reações sãoincubadas e o sobrenadante da cultura é colhido por um contador de cintilação gama (porexemplo, Lumaplate; Packard Instruments). A Iise total e espontânea é determinadaincubando células alvo em 0.2% de SDS ou no meio completo, respectivamente. Aporcentagem da Iise é calculada pela fórmula:% de Lise = liberação na amostra - liberação espontânea χ 100liberação de Iise total - liberação espontânea

A porcentagem de Iise é expressa por LU que foi determinada usando a equaçãode ajuste exponencial descrita por Pross et ai, J. Clin. Immunoi 1:51-63 (1981). Umaunidade lítica é definida como o número de células efetoras necessárias para obter 20% deIise de células de alvo.

Os ensaios de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) podem tambémser realizados com células de alça marcadas com 51Cr na presença de PBMCs (comodescrito acima para ADCC). As células marcadas são tipicamente distribuídas a 2000células/cavidade em uma placa de 96 cavidades contendo concentrações crescentes deproteína de ligação e então incubadas a 37°C por 1 h com complemento de coelho (Pei-Freez, Rogers1 AK) na diluição final de 1:100. Soro humano obtido a partir de doadores éadicionado às cavidades contendo as células alvo e incubadas a 37°C. O soro ativado porcalor pode ser usado como um controle para assegurar a medição de Iise de complementoespecífico. A Iise específica de célula alvo é determinada como descrito acima para ADCC.A proteína de ligação mediada CDC é determinada por subtração da porcentagem de Iisecélula alvo atribuível apenas ao complemento.

A ligação de Fcr pode ser analisada e determinada avaliando a ligação a Fclgsolúvel (por exemplo, CD64lg, CD32lg, CD16lg, e CD89lg) e/ou nas células que expressamo receptor respectivo de Fc (isto é células CD64+, CD32+, CD16+, e CD89+). Oacoplamento e a ativação de FcR podem, por exemplo, ser medidos através da geração desuperóxido por leucócito (por exemplo, células U937).

Uso contemplado de proteína de ligação dotadas de função efetora alteradaAs proteínas de ligação da presente invenção encontrarão utilidade em uma grandevariedade de aplicações terapêuticas.

Como acima descrito, e como exemplificado abaixo, dentro de determinadasmodalidades, a presente invenção proporciona proteínas de ligação que compreendem umainserção de um ou mais amino ácidos dentro da articulação de imunoglobulina, região CH2e/ou CH3, onde a imunoglobulina exibe uma afinidade e/ou especificidade de ligaçãoalterada (isto é, aumentada ou reduzida) para um ou mais de de FcyRI (CD64), FcyRII(CD32), e/ou FcyRIII (CD16).

Usos contemplados para a referida classe de proteína de ligação incluem, porexemplo, a depleção direcionada de populações de células (a) em pacientes compopulações de células NK exterminadoras naturais baixa/hipofuncional e/ou (b) empacientes que se beneficiam de potência aprimorada da proteína de ligação modificada.Usos alternativos contemplados para as referidas proteína de ligação incluem o tratamentobacteriano, parasítico, e/ou de infecções virais onde um aumento ou uma redução naligação de um FcyRI, FcyRII1 e/ou FcyRIII aumenta a neutralização ou a depuração depatógenos. Alterações na referida atividade de ligação de FcyR será também útil para otratamento de doenças infecciosas onde a infecção pode ser promovida por interações deanticorpo FcyR incluindo, mas não são limitados a, doenças tais como HIV-1.

Em modalidades alternativas são proporcionadas proteínas de ligação quecompreendem uma inserção de uma ou mais seqüência de glicosilação N-Iigada e/ou O-Iigada (tal como, por exemplo, uma ou mais seqüência de glicosilação(s) N-X-(SZT) N-Iigadae/ou um ou mais O-Iigada X-P-X-X (onde pelo menos um X é T), T-X-X-X (onde pelo menosum X é T), X-X-T-X (onde pelo menos um X é R ou K), e S-X-X-X (onde pelo menos um X éS)) proximal a e/ou distai ao campo de glicosilação N-Iigada e/ou O-Iigada na região Fc deimunoglobulina nativa correspondente, onde a proteína de ligação exibe uma afinidade e/ouespecificidade de ligação a FcyR alterada (isto é, aumentada ou reduzida), tal comoafinidade e/ou especificidade de ligação alterada para C1q, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32),e/ou FcyRIII (CD16).

Os usos contemplados para a referida classe de proteína de ligação são, dentro dedeterminados aspectos, com base em uma preservação de meia vida da proteína de ligaçãoe a redução correspondente no potencial de reticulação. Por exemplo, a presente invençãocontempla que as referidas proteínas de ligação modificadas encontram uso para odirecionamento preferencial de um ou mais de C1q, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e/ouFcyRIII (CD16) com reticulação reduzida mediada a sinalização intracelular tal comosinalização de CD3 e/ou CD28. Usos alternativos contemplados para esta classe deproteína de ligação incluem a preservação da meia vida com potenciais mais baixos para adepleção celular e preservação da reticulação para uso quando a reticulação direciona ossinais desejados mas a depleção de células alvo não é desejada. Ex. Agonista SMIP paraEPO-R.

Ainda outras modalidades da presente invenção proporcionam proteínas de ligaçãocompreendendo a inserção e/ou a substituição de um ou mais amino ácidos dentro de umaregião CH2 e/ou CH3 de imunoglobulina IgG onde a inserção e/ou a substituição de aminoácido compreende um ou mais amino ácido correspondendo a uma região CH2 e/ou CH3 deimunoglobulina IgA, onde o um ou mais amino ácido(s) de uma região CH2 e/ou CH3 deimunoglobulina IgA participam na ligação específica de uma imunoglobulina IgA com o seureceptor Fca cognato e onde a proteína de ligação modificada é capaz de se ligarespecificamente a FcaR.

Usos contemplados para esta classe de proteína de ligação incluem a depleção decélula alvo onde, por exemplo, uma proteína de ligação compreendendo uma combinaçãode uma ou mais região(s) CH2 e/ou CH3 IgG e uma ou mais região(s) CH2 e/ou CH3 IgA écapaz de se ligar a um ou mais de CD16, CD32, e/ou CD64 assim como a CD89. Asreferidas proteínas de ligação permitirão o uso de efetoras polimorfonucleares (PMN) alémde efetoras de célula exterminador natural (NK)/monócito para alcançar a eliminação dascélulas alvo. As referidas alterações na especificidade de ligação para as proteínas deligação aqui descritas, irão assim, resultar na potência aprimorada e maior eficácia em umafaixa ampla de populações de pacientes.

Como observado acima com relação às proteínas de ligação que compreendem umou mais amino ácido inserido em uma região CH2 e/ou CH3 de articulação deimunoglobulina de proteínas de ligação dotadas de especificidade de ligação para umacombinação de uma ou mais regiões CH2 e/ou CH3 de IgG e/ou uma ou mais regiões CH2e/ou CH3 de IgA1 encontrarão uso no tratamento de infecções bacterianas, parasíticas, ouvirais onde os aprimoramentos na ligação de FcyR e/ou de FcaR podem resultar em umaumento na neutralização de patógenos e/ou atividade de depuração. Alterações na ligaçãode FcyR e/ou de FcaR serão também úteis no tratamento de doenças infecciosas onde ainfecção pode ser promovida por interações FcR de anticorpos, tais como doençasassociadas com infecção de HIV-1.

Os exemplos a seguir são oferecidos apenas como ilustração e não como limitação.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Modificação de alças dentro de uma articulação de imunoglobulina e/ou domínioCH2 confere afinidade de ligação CdC aprimorada

Um membro da classe de IgG de anticorpos especificamente se ligam a CD16(FcRyIII). As mudanças mutacionais dentro dos domínios de alça de um anticorpo IgGexemplificativo foram construídos para alterar a afinidade de ligação de IgG foramconstruídos para alterar a afinidade de ligação de IgG para seu receptor cognato Fc CD16.

Especificamente direcionados foram as quatro alças dos domínios IgG CH2 que entram emcontato com a molécula em duas interfaces. Com base na estrutura de cristal descrita porSondermann P. et ai, Nature 406(6793):267-73 (2000), uma primeira interface envolve ainteração de CD16 com uma alça da região de articulação e a alça FG da cadeia Alfa deCH2. Uma segunda interface envolve uma interação da molécula CD16 com uma alça deregião de articulação, a alça BC, alça DE (isto é, uma alça de carboidrato), e a alça FG dacadeia beta de CH2. Ver figura 1 para um diagrama dos referidos campos de contato.

Mutagênese de inserção foi empregada para gerar mudanças nas duas interfacesdentro das três alças de carboidratos a seguir: (1) a alça de região de articulação, (2) a alçaBC, e (3) a alça FG. As bibliotecas das referidas mutações de inserção são adequados paraa seleção de mutantes individuais dotados de uma afinidade de ligação desejada para umou mais receptor FcR. As setas apontando para baixo na figura 2 indicam locaisrepresentativos para a incorporação de inserções de aço de modo a alcançar mutantes deinserção de acordo com este aspecto da presente invenção.

As bibliotecas de mutantes de inserção foram construídas ao se inserir umaseqüência de polinucleotídeo dentro da região de codificação para seqüências NWN dentrode cada região de articulação. As bibliotecas 1A, 1B e 1C foram produzidas com uma alçade região de articulação, as bibliotecas 2A e 2B foram produzidas na alça BC, e asbibliotecas 3A, 3B e 3C foram produzidas na alça FG. As bibliotecas contendo 96 membrostotais foram construídas por inserção de 12 seqüências únicas em cada uma das diferentes8 posições. Os amino ácidos dotados seja de cadeia longa ou de lado volumoso: fenilalanina(F)1 Leucina (L)1 Isoleucina (I), Metionina (M)1 Valina (V), Tirosina (Y)1 Histidina (H)1Glutamina (Q)1 Asparagina (N)1 Lisina (K)1 ácido aspártico (D)1 e ácido glutâmico (E).

As seqüências de cDNA para cada uma das bibliotecas 1A, 1B, 1C, 2A, e 2B foramconstruídas usando um método de extensão de sobreposição de PCR utilizando 6 primersde oligonucleotídeo (as seqüências são proporcionadas na tabela 3). Os oligonucleotídeospara a geração da biblioteca 1A são Lib1A_F1, Lib1A_F2, Lib1A_F3, Lib1A_R1, Lib1A_R2 eLib1A_R3. Os oligonucleotídeos para a geração da biblioteca 1B são os mesmos exceto emque os oligonucleotídeos Lib1B_F2 substitui Lib1A_F2 e Lib1B_R1 substitui Lib1A_R1. Osoligonucleotídeos para a geração de LibIC1 os oligos são os mesmos de novo exceto o oligoLib1C_F2 que substitui Lib1A_F2 e oligo Lib1C_R1 que substitui Lib1A_R1. Os20 oligonucleotídeos para a geração da biblioteca 2A são Lib1A_F1, Lib2A_F2, Lib2A_F3,Lib2A_R1, Lib2A_R2 e Lib1A_R3. Os oligonucleotídeos para a geração da biblioteca 2B, osoligonucleotídeos usados são os mesmos que para a biblioteca 2a exceto que o oligoLib2B_F3 substitui Lib2A_F3 e o oligonucleotídeo Lib2B_R2 substitui o oligo Lib2A_R2.

Para cada biblioteca, 6 longos oligonucleotídeos primers, a uma concentração de20 nM, foram misturados com dois primers de oligonucleotídeo de extremidade curta(compreendendo campos de restrição para Bci-I (primer dianteiro) e Sac-Il (primer reverso))a uma concentração de 1 //M. As reações de PCR foram ajustadas usando polimeraselnvitrogen's supermix (Carlsbad, CA) empregando as condições a seguir: (a) uma fusãoinicial a 94°Cpor 1 minuto e (b) 30 ciclos a 94°C por 1 minuto, 50°C por 2 minutos, e 72°Cpor 3 minutos.

Tabela 3

Primers oligonucleotídeos para a geração de bibliotecas de anticorpo 1A. 1B. 1C.2A. e 2B

<table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table>Os fragmentos amplificados foram ligados em vetor TOPO Invitrogen etransformados em células bacterianas TOPIO. Um excesso de 200 colônias foi agrupado e acomplexidade de cada biblioteca foi determinada por análise de seqüência de 15 clones. Osfragmentos foram então digeridos com Bci-I e Sac-Il e ligados em um vetor de expressãopD18 digerido com Bci-l/Sac-ll codificando um produto imunofarmacêutico modular pequenoanti-CD20 (produto SMIP™) e trabalhado por engenharia para remover um campo derestrição extra Sac-Il assim como trabalhado por engenharia para interromper o códon e umúnico campo de restrição (Not-I) para permitir a linearização do vetor de retorno contendo odomínio CH2 do tipo selvagem.

Os genes para as bibliotecas 3A, 3B e 3C foram construídos usando um métodoQuickchange da Stratagene (La Jolla1 CA). 33 primers de oligonucleotídeos de sentido eanti-sentido de par de base foram projetados para facilitar a incorporação das seqüências denucleotídeos codificando a seqüência de amino ácido NWN (isto é, asparagina-triptofano-asparagina). As seqüências dos referidos primers de oligonucleotídeo são apresentadas natabela 4. Os oligonucleotídeos para a biblioteca 3A são Lib3A-F e Lib3A-R.Oligonucleotídeos para a biblioteca 3B são Lib3B-F e Lib3B-R. Oligonucleotídeos para abiblioteca 3C são Lib3C-F e Lib3C-R.

Tabela 4

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Para cada biblioteca, uma reação de PCR de 100 μΙ_ continha 20 ng de modelo deDNA (isto é, um vetor de expressão que codifica um produto imunofarmacêutico modularespecífico para CD37 (produto SMIP™), 125 ng de cada dos primers de oligonucleotídeodianteiro e reverso, 500 nM de dNTP, e 2,5 unidades de DNA Ultra Pfu da Stratagene. Ascondições a seguir foram empregadas para a reação de PCR: (a) fusão inicial a 95°C por 1minuto e (b) 18 ciclos de 95°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto, e 68°C por 6.5 minutos. Emseguida de cada reação de PCR, o vetor do tipo selvagem foi digerido com incubação com aenzima de restrição Dpn-I por 2 horas. A mistura de DNA foi então transformada em célulasbacterianas TOPIO. Um excesso de 200 colônias de cada biblioteca foi agrupado e acomplexidade de cada biblioteca foi determinada por análise de seqüência de 15 clones. Asbibliotecas foram digeridas com Sac-Il e endonucleases de restrição Bsr-Gl e ligados empD18 com uma extremidade dianteira anti-CD37, um campo extra Sac-Il1 um códon deparada, e um campo de restrição Notl para Iinearizar o vetor de fundo contendo aseqüência CH2 de tipo selvagem. Figura 3

Clones membro de cada biblioteca foram expressos em células COS em placas de96 cavidades ou 24 cavidades. A ligação dos clones a CD16 pode ser testada ao seempregar CD16 biotinilado com um prolongamento de imunoglobulina (HuIg) humano ou(MuIg) de murino e varrendo proteínas candidatas individuais por metodologia de ELISApadrão onde as placas são revestidas com proteína A e os sobrenadantes contendo oscandidatos individuais são adicionados seguidos por CD16 Hulg-Biotin e streptavidin-HRP.As moléculas dotadas de uma maior afinidade de ligação específica para CD16 emcomparação ao produto SMIP™ do tipo selvagem correspondente podem então serselecionadas para a caracterização adicional em um teste ADCC e para a interação com aproteína A.

Exemplo 2

Modificação de alças dentro de um domínio CH3 de imunoglobulina IgG confereespecificidades de ligação únicas

O referido exemplo descreve as modificações exemplificativas dentro da regiãoCH3 IgG que proporciona novas superfícies de reconhecimento não nativas, econseqüentemente, especificidades de ligação.

As diversas alças dentro do domínio CH3 do IgG foram trabalhadas por engenhariapara proporcionar interações de ligação IgA-específicas (referidas aqui como larvas IgG/A ).A expressão dos três construtores de larva IgG/A a seguir foram realizadas e expressas emcélulas Cos; (a) amino ácidos IgG dentro dos domínios CH3 IgG foram substituídos comamino ácidos do domínio CH3 IgA1 cujos amino ácidos na imunoglobulina IgA do tiposelvagem entra em contato direto com o Fca-receptor (isto é, CD89), assim como doisamino ácidos adicionais dentro da alça CD; (b) amino ácidos IgG dentro da alça do domínioFG CH3 IgG foram substituídas com amino ácidos do domínio de alça FG CH3 IgA assimcomo outros amino ácidos que entram em contato com o Fcc-receptor; e (c) os aminoácidos IgG dentro do domínio de alça CD CH3 IgG foram substituídos com os amino ácidosdo domínio de alça CD CH3 assim como outros amino ácidos que entram em contato com oFcα-receptor. Em todos os casos, a extremidade dianteira de cada um dos produtos CMIP™IgG mutante resultante foi humanizado 2H7-018014.

A especificidade e/ou afinidade de ligação de um campor de ligação de Fcr-receptorfoi modificado ao se mudar os resíduos de amino ácido nas alças CD e FG de CH3. A figura1 mostra o alinhamento de seqüência dos domínios CH2 e/ou CH3 IgG e IgA. As estruturasterciárias de IgG e IgA são relativamente similares como indicado pelo desvio RMS de 1,7 Áquando as estruturas são superpostas.

Os três genes foram construídos usando uma metodologia de extensão de PCR desobreposição. Para cada versão, um conjunto de 4 oligonucleotídeos longos a umaconcentração de 20 nM foram misturados com os dois oligonucleotídeos de extremidadecurta (curta F e curta R) a uma concentração de 1 μΜ. As reações de PCR foram ajustadasusando polimerase lnvitrogen's supermix empregando as condições a seguir: (1) uma fusãoinicial a 94°C por 1 minuto e (2) 30 ciclos do a seguir: a 94°C por 1 minuto, 50°C por 2minutos, e 72°C por 3 minutos. Os fragmentos amplificados foram digeridos com Bsr-Gl eXba-I e inseridos no vetor pD18 que porta o produto SMIP™ anti-CD20 humanizado(018014) digerido com Bsr-Gl e Xba-I para remover o domínio CH3 do tipo selvagem. Asseqüências para os oligonucleotídeos são apresentadas na tabela 5.

Tabela 5

Primers de oligonucleotídeo para modificação de alças dentro de um domínio CH3de imunoglobulina IgG

<table>table see original document page 48</column></row><table>A substituição dos amino ácidos Ml por LL próximos do início da região CH2 foirealizada por mutagênses de PCR/ os referidos dois amino ácidos são pontos de contatoadicionais entre as imunoglobulinas do isótipo IgA e seus receptores cognatos Fc CD89(FcaR). Ver figura 2. As seqüências de cada um dos três produtos SMIP™ com base emIgG modificado foram confirmados e os vetores pD18 correspondentes foram transfectadosem células COS para a expressão de gene. Os sobrenadantes foram examinados quanto àatividade de ligação para CD20 por coloração de células Wil2S e análise de citometria defluxo. A coloração de CD20 com SMIP CH3 2H7 mutado para a ligação ao receptor IgA.

Os sobrenadantes foram primeiro incubados com células Wil2S por 30 minutos emgelo. As células forma lavadas duas vezes e uma diluição de 1:100 do IgG anti-humano PEconjugado foi adicionado. As células foram lavadas mais uma vez e MF para cada amostrafoi determinada na citometria de fluxo. Cada uma das três imunoglobulinas modificadas foiexpressa a um nível de aproximadamente 2 pg/mL a 4 pg/mL quando comparado à curvapadrão.

Para testar a ligação das referidas moléculas ao receptor IgA1 células Wil2S foramincubadas com os sobrenadantes por 30 minutos, lavadas duas vezes com 1% BSA / PBS,e 5 pg/mL de CD89 (receptor IgA) humano Ig em PBS foi adicionado e incubado por outros30 minutos. As células foram lavadas mais uma vez e 50 pL de proteína A PE conjugadadiluída 1:100 em 1% de BSA/PBS foram adicionadas e incubadas por 30 minutos. Asamostras foram lavadas com 1% de BSA/PBS e resuspensas em 100 mL do tampão delavagem. As amostras foram então lidas por citometria de fluxo.

Cada uma das três imunoglobulinas modificadas foi expressa a um nível deaproximadamente 2 pg/mL - 4 pg/mL, purificada usando cromatografia de afinidade deproteína A, e caracterizada por ligação específica a células Wil2S e a CD89 pormetodologias de citometria de fluxo convencionais empregando CD89 Hulg e proteína A PE-marcada.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> TRUBION PHARMACEUTICALS INC.

<120> "PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO COMPREENDENDO ARTICULAÇÃO DEIMUNOGLOBULINA E REGIÕES FC DOTADAS DE FUNÇÕES EFETORAS FCALTERADAS"

<130> 20632/2203607-W00

<140><141 >

<150> 60/744,899<151 >2006-04-14

<160> 106

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro1 5 10 15

Ser Pro Ser

<210> 2

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400>2

Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu15 10 15

Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg20 25 30

Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser35 40 45

Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val50 55 60

Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr65 70 75 80

Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala85 90 95

Thr Leu Ser Lys Ser100

<210> 3

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>3

Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu15 10 15

Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly20 25 30

Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu35 40 45Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser50 55 60

Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala65 70 75 80

Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu85 90 95

Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly100 105 110

Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly115 120 125

Thr Cys Tyr130

<210>4

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>4

Val Pro Pro Pro Pro Pro1 5

<210>5<211> 101<212> PRT<213> Homo sapiens

<400>5

Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu1 5 10 15

Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg20 25 30

Asp Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser35 40 45

Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val50 55 60

Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr65 70 75 80

Phe Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala85 90 95

Asn Ile Thr Lys Ser100

<210> 6

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>6

Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu15 10 15

Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly20 25 30

Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu35 40 45

Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser50 55 60

Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala65 70 75 80Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu85 90 95

Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly100 105 110

Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly115 120 125

Thr Cys Tyr130

<210> 7

<211> 58

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>7

Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln15 10 15

Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro50 55

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>8Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro15 10 15

Ala Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe20 25 30

Val Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala35 40 45

Gly Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His50 55 60

Ser Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser65 70 75 80

Leu Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser85 90 95

Leu Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro100 105

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>9

Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser15 10 15

Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe20 25 30

Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val35 40 45Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser50 55 60

Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser65 70 75 80

Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg85 90 95

Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp100 105 110

His Gly Pro Met Lys115

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser15 10 15

Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys20 25 30

Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu35 40 45

Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln50 55 60

Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys65 70 75 80

His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly85 90 95

His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala100 105

<210> 11<211>108<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 11

Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro1 5 10 15

Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val20 25 30

Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala35 40 45

Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg50 55 60

Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp65 70 75 80

Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu85 90 95

Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser100 105

<210> 12

<211>110

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 12

Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp15 10 15

Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe20 25 30

Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu35 40 45

Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser50 55 60

Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu65 70 75 80

Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro85 90 95

Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys100 105 110

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro15 10 15

<210> 14<211> 110<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 14Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys15 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys100 105 110

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp15 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys100 105

<210> 16<211>12<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 16

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10

<210> 17

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro15 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln50 55 60Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys100 105

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu15 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys100 105<210> 19

<211> 62

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys1 5 10 15

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu35 40 45

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro50 55 60

<210> 20<211> 110<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 20

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu50 55 60Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys100 105 110

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu35 40 45

Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly65 70 75 80

Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys100 105

<210> 22<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro1 5 10

<210> 23<211> 110<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 23

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys100 105 110<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu15 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys100 105

<210> 25

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg15 10 15

Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala20 25 30

Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly35 40 45

Lys GIn Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala50 55 60

Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp85 90 95

His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro100 105 110

<210> 26<211> 106<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 26

Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala15 10 15

Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp20 25 30

Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly35 40 45

Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala50 55 60

Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn65 70 75 80Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser85 90 95

Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys100 105

<210> 27

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg1 5 10 15

Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr20 25 30

Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln35 40 45

Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro50 55 60

Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu85 90 95

Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly100 105 110

Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly115 120 125

Thr Cys Tyr130

<210> 28<211 >23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 28

ttcttctgat caggagccca aat 23

<210> 29<211 >24<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 29

gctcctcccg cggctttgtc ttgg 24

<210> 30<211> 59<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 30

ttcttctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac acatctccac cgtgcccag<210> 31<211> 59<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 31

gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccgga

<210> 32<211> 59<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 32

tgtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcg

<210> 33<211> 60<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (23)..(23)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (25)..(25)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 33

agaggaagac tgacggtcca ccnwncaaga gttcaggtgc tgggcacggt ggagatgtgt

<210> 34<211 >60<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 34

cgtggctcac gtccaccacc acgcatgtga cctcaggggt ccgggagatc atgagggtgt

<210> 35<211> 60<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 35

gctcctcccg cggctttgtc ttggcattat gcacctccac gccgtccacg taccagttga 60

<210> 36<211> 59<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 36

wggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccgga 59

<210> 37<211> 60<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (20)..(20)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (22)..(22)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 37

agaggaagac tgacggtccn wnacccaaga gttcaggtgc tgggcacggt ggagatgtgt 60

<210> 38<211 >59<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer<220>

<221 > modified_base<222> (2)..(2)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (4)..(4)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 38

gnwnccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccgga 59

<210> 39<211 >60<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (17)..(17)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (19)..(19)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 39

agaggaagac tgacggnwnt ccacccaaga gttcaggtgc tgggcacggt ggagatgtgt

<210> 40<211> 59<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 40gccgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggaccc 59

<210> 41

<211 >59

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221> modified_base

<222> (11)..(11)

<223> a, c, g, t, unknown or other

<220>

<221 > modified_base

<222> (13)..(13)

<223> a, c, g, t, unknown or other

<400> 41tgtggacgtg nwnagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcg

<210> 42

<211 >60

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 42

ggaagaggaa gactgacggt ccacccaaga gttcaggtgc tgggcacggt ggagatgtgt

<210> 43<211> 59<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (8)..(8)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221> modified_base<222> (10)..(10)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 43

cgtggctnwn cacgtccacc accacgcatg tgacctcagg ggtccgggag atcatgagg

<210> 44<211> 59<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer<220>

<221 > modified_base<222> (14)..(14)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (16)..(16)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 44

tgtggacgtg agcnwncacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcg

<210> 45<211 >60<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221> modified_base<222> (5)..(5)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (7)..(7)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 45

cgtgnwngct cacgtccacc accacgcatg tgacctcagg ggtccgggag atcatgaggg

<210> 46<211 >33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (16)..(16)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221> modified_base<222> (18)..(18)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 46

gtctccaaca aagccnwnct cccagccccc ate

<210> 47<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (16)..(16)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221> modified_base<222> (18)..(18)<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 47

gatgggggct gggagnwngg ctttgttgga gac

<210> 48<211 >33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (16)..(16)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (18)..(18)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 48

cccaacaaag ccctcnwncc agcccccatc gag

<210> 49<211 >34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer<220>

<221 > modified_base<222> (16)..(16)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (18)..(18)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 49

ctcgatgggg gctggnwnga gggctttgtt ggag

<210> 50<211> 35<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (16)..(16)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (18)..(18)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 50

cacaaagccc tcccanwngc ccccatcgag aaaac

<210> 51<211 >36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<220>

<221 > modified_base<222> (18)..(18)

<223> a, c, g, t, unknown or other<220>

<221 > modified_base<222> (20)..(20)

<223> a, c, g, t, unknown or other<400> 51

gttttctcga tgggggcnwn tgggagggct ttgttg 36

<210> 52<211> 57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 52

cagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccagg

<210> 53<211 >57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 53

agcttctatc caagcgacat cgccgtgcgt tgggagagca atgggcagga gctgccg 57

<210> 54<211 >57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 54

ccccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaa 57

<210> 55<211> 57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 55

gcttctcctg catggtgatg catgaggctc tgccactcgc cttcacgcag aagagcc 57

<210> 56<211 >57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>primer<400> 59

cgctataatc tagatcattt acccggagac agggagaggc tcttctgcgt gaagg

<210> 60<211 >26<212> DNA

<213> Seqüênica Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 60

cagaaccaca ggtgtacacc ctgccc 26

<210> 61<211 >22<212> DNA

<213> Seqüênica Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 61

cctataatct agatcattta cc 22

<210> 62<211> 58<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 56

tgcttggata gaagcctttg accaggcagg tcaggctgac ctggttcttg gtcagct 57

<210> 57<211> 57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 57

cgagtccagc acgggaggcg tggtcttgta gttgttctcc ggcagctcct gcccatt 57

<210> 58<211 >57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 58

cccatgcagg agaagacgtt cccctgctgc cacctgctct tgtccacggt gagcttg 57

<210> 59<211> 55<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Synthetic<400> 62

gtcttctcct gcatggtggg ccacgaggcc ctgccgctgg ccttcacaca gaagacca 58

<210> 63<211> 55<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 63

cgctataatc tagatcattt acccgccaag cggtcgatgg tcttctgtgt gaagg 55

<210> 64<211> 58<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer

<400> 64

aggcttctat ccaagcgaca tcgccgttcg ctggctgcag gggtcacagg agctgccc 58

<210> 65<211> 57<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Syntheticprimer<400> 65

cgagtccagc acgggaggcg tggtcttgta cttctcgcgg ggcagctcct gtgaccc

<210> 66

<211 >223

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val15 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Gln35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Gln Val His Asn Ala Lys50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asn Trp Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Lys85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro115 120 125

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215 220

<210> 67

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Ala Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu1 5 10 15

Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg20 25 30

Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser35 40 45

Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val50 55 60

Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr65 70 75 80

Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala85 90 95Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu100 105 110

Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr115 120 125

Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu130 135 140

Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser145 150 155 160

Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile165 170 175

Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys180 185 190

Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile195 200 205

Asp Arg Leu Ala Gly Lys210

<210> 68<211> 216<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 68

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro15 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val20 25 30Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln50 55 60

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser130 135 140

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr145 150 155 160

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr165 170 175

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe180 185 190

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys195 200 205

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215

<210> 69<211 > 218

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Leu Leu Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln50 55 60

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser130 135 140

Asp Ile Ala Val Arg Trp Glu Ser Asn Gly Gln Glu Leu Pro Glu Asn145 150 155 160

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe165 170 175Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn180 185 190

Val Phe Ser Cys Met Val Met His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215

<210> 70

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Leu Leu Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln50 55 60

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro100 105 110Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro SerArg Asp Glu Leu Thr115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser130 135 140

Asp Ile Ala Val Arg Trp Glu Ser Asn Gly Gln Glu Leu Pro Glu Asn145 150 155 160

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe165 170 175

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn180 185 190

Val Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr195 200 205

Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys210 215

<210> 71

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Leu Leu Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln50 55 60

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser130 135 140

Asp Ile Ala Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu145 150 155 160

Lys Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe165 170 175

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn180 185 190

Val Phe Ser Cys Met Val Met His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215

<210> 72<211> 218<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 72

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Leu Leu Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln50 55 60

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser130 135 140

Asp Ile Ala Val Arg Trp Glu Ser Asn Gly Gln Glu Leu Pro Glu Asn145 150 155 160

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe165 170 175

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn180 185 190Val Phe Ser Cys Met Val Met His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215

<210> 73

<211> 209

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu15 10 15

Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp20 25 30

Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala35 40 45

Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser50 55 60

Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe65 70 75 80

Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr85 90 95

Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro100 105 110

Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys115 120 125Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln130 135 140

Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg145 150 155 160

Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu165 170 175

Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met180 185 190

Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp195 200 205

Arg

<210> 74

<211 >209

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu15 10 15

Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp20 25 30

Ala Ser Gly Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala35 40 45

Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser50 55 60Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe65 70 75 80

Thr Cys Thr Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn85 90 95

Ile Thr Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro100 105 110

Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys115 120 125

Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln130 135 140

Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg145 150 155 160

Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu165 170 175

Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met180 185 190

Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp195 200 205

Arg

<210> 75<211> 212<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 75

Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe15 10 15

Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr20 25 30

Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val35 40 45

Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser50 55 60

Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu65 70 75 80

Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys85 90 95

Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val100 105 110

Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala115 120 125

Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val130 135 140

Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr145 150 155 160

Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His165 170 175

Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr180 185 190

Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg195 200 205Thr Val Asp Lys210

<210> 76

<211 >208

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu15 10 15

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser20 25 30

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu35 40 45

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr50 55 60

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn65 70 75 80

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro85 90 95

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln100 105 110

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val115 120 125

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val130 135 140

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro145 150 155 160

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr165 170 175

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val180 185 190

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu195 200 205

<210> 77

<211> 208

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu1 5 10 15

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser20 25 30

His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu35 40 45

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr50 55 60

Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn65 70 75 80

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro85 90 95

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln100 105 110Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val115 120 125

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerAsp Ile Ala Val130 135 140

Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro145 150 155 160

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr165 170 175

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val180 185 190

Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu195 200 205

<210> 78

<211 >208

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu15 10 15

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser20 25 30

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu35 40 45

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr50 55 60Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn65 70 75 80

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro85 90 95

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln100 105 110

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val115 120 125

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val130 135 140

Glu Trp GIu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro145 150 155 160

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr165 170 175

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val180 185 190

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu195 200 205

<210> 79<211 >208<212> PRT<213> Homo sapiens

<220>

<221 > MOD_RES

<222> (80)..(80)

<223> Variable amino acid<220>

<221 > MOD_RES<222> (90)..(90)<223> Variable amino acid

<220>

<221 > MOD_RES<222> (103)..(103)<223> Variable amino acid

<220>

<221> MOD_RES<222> (105)..(105)<223> Variable amino acid

<220>

<221 > MOD_RES<222> (181 )..(181)<223> Variable amino acid

<400> 79

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu15 10 15

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser20 25 30

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu35 40 45

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr50 55 60

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Xaa65 70 75 80Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Xaa Lys Gly Leu Pro Ser Ser85 90 95

Ile Glu Lys Thr Ile SerXaa Ala Xaa Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln100 105 110

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val115 120 125

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val130 135 140

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro145 150 155 160

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr165 170 175

Val Asp Lys Ser Xaa Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val180 185 190

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu195 200 205

<210> 80

<211> 210

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe15 10 15

Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro20 25 30Ser Lys Gly Thr Val Gln Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro35 40 45

Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu50 55 60

Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly65 70 75 80

Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu85 90 95

Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val100 105 110

Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr115 120 125

Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln130 135 140

Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr145 150 155 160

Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu165 170 175

Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg180 185 190

Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val195 200 205

Ser Val210<210> 81<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 81

Leu Leu Gly Gly Pro1 5

<210> 82<211 >25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<220>

<221 > MOD_RES<222> (3)..(22)

<223> a região pode englobar entre 2 e 20 amino ácidos variáveis<400> 82

Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Gly Pro20 25

<210> 83<211> 25<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético

<220>

<221 > MOD_RES

<222> (4)..(23)

<223> a região pode englobar entre 2 e 20 amino ácidos variáveis

<400> 83

Leu Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro20 25

<210> 84

<211 >25

<212> PRT

<213> Seqüênica Artificial

<220><223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético

<220><221 > MOD_RES<222> (5)..(24)<223> a região pode englobar entre 2 e 20 amino ácidos variáveis

<400> 84

Leu Leu Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro20 25

<210> 85<211>5<212> PRT

<213> Seqüência Artificial Sequenc<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 85

Asp Val Ser His Glu1 5

<210> 86<211 >25<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220><223> Descrição Artificial de Seqüência: Peptídeo sintético

<220><221 > MOD_RES<222> (3)..(22)<223> a região pode englobar entre 2 e 20 amino ácidos variáveis

<400> 86Asp Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser His Glu20 25

<210> 87<211 >25<212> PRT<213> Seqüênica Artificial

<220><223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<220>

<221 > MOD_RES<222> (4)..(23)

<223> a região pode englobar entre 2 e 20 amino ácidos variáveis<400> 87

Asp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Glu 25

<210> 88<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 88

Ala Leu Pro Ala Pro Ile1 5

<210> 89<211 >26<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<220>

<221 > MOD_RES<222> (3)..(22)

<223> a região pode englobar entre 2 e 20 amino ácidos variáveis<400> 89

Ala Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ala Pro Ile20 25

<210> 90<211 >26<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<220>

<221 > MOD_RES<222> (4)..(23)

<223> a região pode englobar entre 2 e 20 amino ácidos variáveis<400> 90

Ala Leu Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Pro Ile20 25

<210> 91<211 >26<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<220>

<221 > MOD RES<222> (5)..(24)

<223> a região pode englobar entre 2 e 20 amino ácidos variáveis<400> 91

Ala Leu Pro Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ile20 25

<210> 92<211 >306<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<220>

<221 > MOD_RES<222> (1 )..(100)

<223> region may encompass between 1 and 100 variable aminoacids

<220>

<221 > MOD_RES<222> (104)..(203)

<223> region may encompass between 1 and 100 variable aminoacids

<220>

<221 > MOD_RES<222> (207)..(306)

<223> region may encompass between 1 and 100 variable aminoacids

<400> 92Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa50 55 60

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa65 70 75 80

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa85 90 95

Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Ser Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa100 105 110

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa115 120 125

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa130 135 140

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa145 150 155 160

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa165 170 175

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa180 185 190

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Ser Thr Xaa Xaa195 200 205

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa210 215 220

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa225 230 235 240

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa245 250 255

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa260 265 270

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa275 280 285

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa290 295 300

Xaa Xaa305

<210> 93<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<220>

<221 > MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Tyr or Phe

<220><221 > MOD_RES<222> (5)..(5)<223> Tyr or Phe

<220>

<221 > MOD_RES<222> (9)..(9)<223> Tyr or Phe

<400> 93

Xaa Asn Ser Thr Xaa Asn Ser Thr Xaa1 5

<210> 94<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 94

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala1 5

<210> 95<211> 8<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 95

Tyr Pro Asn Ser Thr Asp Ile Ala1 5<210> 96<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 96

Tyr Asn Ser Thr Pro Ser Asp Ile Ala1 5

<210> 97<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<40O> 97

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln1 5 10

<210> 98<211> 14<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 98

Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln1 5 10<210> 99<211> 4<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético

<400> 99Gln Pro Glu Asn1

<210> 100<211> 6<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 100

Gln Glu Leu Pro Arg Glu1 5

<210> 101<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 101

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr1 5

<210> 102<211>9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 102

Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ser Arg Thr1 5

<210> 103<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 103

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn1 5

<210> 104<211>9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 104

Asp Ile Ala Val Arg Trp Glu Ser Asn1 5

<210> 105<211> 5<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético

<400> 105

Tyr Asn Ser Thr Tyr

1 5

<210> 106<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição artificial de seqüência: Peptídeo sintético<400> 106

Tyr Asn Ser Thr Tyr Asn Ser Thr Tyr1 5

Claims

1. Proteína de ligação, CARACTERIiZADA pelo fato de que compreende um oumais domínio(s) CH2 e/ou CH3, de articulação de região constante de imunoglobulina ondeos referidos um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de região constante e/ou articulaçãocompreende uma inserção e/ou uma deleção de um ou amino ácidos onde a referidaproteína de ligação exibe uma afinidade de ligação alterada para um ou mais receptores Fccognatos.

2. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação é selecionada a partir do grupo que consiste emum anticorpo, um fragmento de anticorpo, e um produto imunofarmacêutico modularpequeno (produtos SMIP™).

3. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, a referida proteína deligação sendo CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais domínios CH2e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada de imunoglobulina IgG modificados, onde oreferido um ou mais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada deimunoglobulina IgG é modificada pela inserção de um ou mais amino ácidos(s) e/ou deleçãode um ou mais amino ácidos(s), onde a referida proteína de ligação se liga a um receptor Fcselecionado a partir do grupo que consiste em FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII(CD 16) com uma maior afinidade em comparação à proteína de ligação correspondentecompreendendo domínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesadas deimunoglobulina IgG não modificada.

4. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelofato de que o referido domínio IgG modificado é um domínio CH2 IgGi modificado, umdomínio CH2 IgG2 modificado, um domínio CH2 IgG3 modificado, e/ou um domínio CH2 IgG4modificado.

5. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelofato de que o referido domínio IgG modificado é um domínio CH2 IgGI modificado e/ou umdomínio CH2 lgG3 modificado e onde o referido domínio CH2 IgGI modificado e/ou domínioCH2 lgG3 modificado compreende uma ou mais deleção de amino ácido a partir de e/ouinserção de amino ácido dentro da estrutura de alça proximal de articulação L-L-G-G-P dodomínio CH2 IgG1 e/ou IgG3 CH2.

6. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende um ou mais inserção(ões) de um oumais amino ácido(s) dentro da estrutura de alça proximal de articulação L-L-G-G-P.

7. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelofato de que a referida estrutura de alça proximal de articulação compreende uma inserçãode um ou mais amino ácido(s) na posição "*" de modo que a estrutura de alça proximal dearticulação compreende uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste em L-L-*-G-G-P, L-L-G-*-G-P, e L-L-G-G-*-P, onde "*" indica a inserção de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5,-6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 amino ácidos.

8. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelofato de que o referido "*" compreende um ou mais amino ácidos selecionados a partir dogrupo que consiste em Ala, Gly, lie, Leu, e Vai.

9. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelofato de que o referido domínio IgG modificado é um domínio CH2 IgGI modificado, umdomínio CH2 IgG2 modificado, e/ou um domínio CH2 lgG3 modificado e onde o referidodomínio CH2 IgGI modificado, domínio CH2 IgG2 modificado, e/ou domínio CH2 lgG3modificado compreende uma ou mais deleção de amino ácido a partir de e/ou inserção deamino ácido dentro da estrutura de alça BC D-V-S-H-E do domínio CH2 IgGi, IgG2, e/ouIgG3.

10. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende um ou mais inserção(ões) de um oumais amino ácido(s) dentro da estrutura de alça BC D-V-S-H-E.

11. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelofato de que a referida estrutura de alça BC compreende uma inserção de um ou mais aminoácido(s) na posição "*" de modo que a estrutura de alça BC compreende uma seqüênciaselecionada a partir do grupo que consiste em D-V-*-S-H-E e D-V-S-*-H-E, onde "*" indica ainserção de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20amino ácidos.

12. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelofato de que o referido "*" compreende um ou mais amino ácidos selecionados a partir dogrupo que consiste em Ala, Gly, lie, Leu, e Vai.

13. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelofato de que o referido domínio IgG modificado é um domínio CH2 IgGI modificado e/ou umdomínio CH2 lgG3 modificado, onde o referido domínio CH2 IgGI modificado e/ou umdomínio CH2 lgG3 modificado compreende uma ou mais deleção de amino ácido a partir dee/ou inserção de amino ácido dentro da estrutura de alça FG, A-L-P-A-P-I do domínio CH2IgG1 e/ou IgG3.

14. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende uma ou mais inserção(ões) de um oumais amino ácido(s) dentro da estrutura de alça FG A-L-P-A-P-l.

15. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelofato de que a referida estrutura de alça FG compreende uma inserção de um ou mais aminoácido(s) na posição "*" de modo que a estrutura de alça BC compreende uma seqüênciaselecionada a partir do grupo que consiste em A-L-*-P-A-P-l, A-L-P-*-A-P-l, e A-L-P-A-*-P-l,onde "*" indica a inserção de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,-17, 18, 19, ou 20 amino ácidos.

16. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelofato de que referido "*" compreende um ou mais amino ácidos selecionados a partir do grupoque consiste em Ala, Gly, lie, Leu, e Vai.

17. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, a referida proteína deligação sendo CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais domínios CH2e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada IgG modificados, onde os referidos um ou maisdomínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada é modificado pela inserção deuma ou mais seqüências de glicosilação N-ligada(s) em uma ou mais posição que éproximal e/ou distai a uma seqüência de glicosilação nativa, cuja seqüência de glicosilação ésuficiente para alcançar a glicosilação N-Iigada na posição de inserção, onde a referidaproteína de ligação modificada se liga a um receptor Fc selecionado a partir do grupo queconsiste em FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII (CD16) com uma afinidade superior emcomparação à proteína de ligação correspondente compreendendo os domínios CH2 e/ouCH3 de articulação de cadeia pesadas de imunoglobulina IgG não modificado.

18. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelofato de que o referido domínio CH2 e/ou CH3 de articulação, é um domínio CH2 e/ou CH3de articulação IgGI, um domínio CH2 e/ou CH3 de articulação lgG2, um domínio CH2 e/ouCH3 de articulação lgG3, e/ou um domínio CH2 e/ou CH3 de articulação lgG4compreendendo a inserção de uma ou mais seqüência de glicosilação N-Iigada N-X-(S/T),onde X é qualquer amino ácido proximal a e/ou distai ao campo de glicosilação N-Iigada nodomínio CH2 e/ou CH3 de articulação de imunoglobulina IgG nativa correspondente.

19. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende um domínio de CH2 IgG onde oreferido domínio CH2 compreende uma inserção de uma ou mais seqüência H-X-(SfT)adjacente a e/ou dentro de 0 a 100 amino ácidos amino-terminais e/ou carbóxi-terminaispara a seqüência N-S-T nativa dentro da alça DE do referido Domínio de CH2 IgG.

20. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelofato de que o referido domínio de CH2 IgG compreende a seqüência de amino ácido N-S-Tinserida adjacente a e/ou dentro de 0 a 100 amino ácidos amino-terminais e/ou carbóxi-terminais para a seqüência N-S-T nativa de modo que a seqüência de amino ácido X-N-S-T-Z nativa é modificada para (AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAc) onde cada um de AAa AAb1 e AAcindependentemente designa de 1 a 100 amino ácidos.

21. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelofato de que o referido domínio de CH2 IgG é modificado de modo que a seqüência de aminoácido N-S-T é inserida dentro de um amino ácido a partir da seqüência N-S-T nativa demodo que a seqüência de amino ácido X-N-S-T-Z nativa é modificada para X-N-S-T-Z-N-S-T-Z1 onde XeZ são independentemente selecionados a partir de Tyr (Y) e Phe (F).

22. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelofato de que a referida seqüência de glicosilação N-Iigada é inserida dentro da alça BC de umou mais domínio CH3 IgGi, IgG2, IgG3, e/ou IgG4 distai ao referido campo nativo daglicosilação N-Iigada dentro do domínio CH2 de modo que a seqüência de amino ácidonativa Y-P-S-D-I-A é modificada para Y-P-N-S-T-D-I-A ou para Y-N-S-T-P-S-D-l-A.

23. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende um ou mais domínios CH2 e/ou CH3de articulação de cadeia pesada da primeira classe de imunoglobulina selecionada a partirde IgA1 IgD1 IgE1 IgG1 e IgM1 onde a proteína de ligação é modificada por substituição deamino ácido e/ou inserção de amino ácido na seqüência amino primária do referido um oumais domínios CH2 e/ou CH3 de articulação de cadeia pesada da primeira classe deimunoglobulina para gerar proteína de ligação capaz de ligação a um ou mais receptor Fc dasegunda classe de imunoglobulina, onde a referida segunda classe de imunoglobulina édistinta da referida primeira classe de imunoglobulina.

24. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelofato de que a referida primeira classe de imunoglobulina é IgG e onde a referida segundaclasse de imunoglobulina é IgA.

25. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação é capaz de se ligar especificamente (a) umreceptor Fc selecionado a partir do grupo que consiste em FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), eFcyRIII (CD16) e (b) para FcaR (CD89).

26. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende uma ou mais substituição(ões) deamino ácido dentro da alça FG CH3 IgG e/ou um ou mais amino ácido substituição(ões) deamino ácido dentro da alça CD CH3 IgG.

27. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende a substituição da alça FG CH3 IgGcompreendendo a seqüência de amino ácido C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q, ou umaporção da mesma, com a alça FG CH3 IgA compreendendo a seqüência de amino ácido C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q1 ou uma porção correspondente da mesma.

28. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende a substituição da alça CD CH3 IgGcompreendendo a seqüência de amino ácido Q-P-E-N1 ou uma porção da mesma, com aalça CD CH3 IgA compreendendo a seqüência de amino ácido Q-E-L-P-R-E1 ou uma porçãoda mesma.

29. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelofato de que a referida proteína de ligação compreende a substituição de ambas as alças FGCH3 IgG compreendendo a seqüência de amino ácido C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q, ouuma porção da mesma, com a alça FG CH3 IgA compreendendo a seqüência de aminoácido C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q, ou uma porção correspondente da mesma, e a alçaCD CH3 IgG compreendendo a seqüência de amino ácido Q-P-E-N, ou uma porção damesma, com a alça CD CH3 IgA compreendendo a seqüência de amino ácido Q-E-L-P-R-E,ou uma porção da mesma.

30. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 - 29,CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente compreende a substituição do aminoácido CH3 de cadeia pesada IgG Met na posição de amino ácido CH3 no. 28 dentro daseqüência K-D-T-L-M-I-S-R-T com o amino ácido Leu de modo que a proteína de ligaçãoadicionalmente compreende a seqüência de amino ácido K-D-T-L-L-l-S-R-T.

31. A proteína de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 - 29,CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente compreende a substituição do aminoácido CH3 de cadeia IgG Glu na posição de amino ácido CH3 no. 157 dentro da seqüênciaD-I-A-V-E-W-E-S-N com o amino ácido Arg de modo que a proteína de ligaçãoadicionalmente compreende a seqüência de amino ácido D-l-A-V-R-W-E-S-N.