BRPI0710155A2 - compostos e métodos para diagnóstico e tratamento de leishmaniose - Google Patents

compostos e métodos para diagnóstico e tratamento de leishmaniose Download PDF

Info

Publication number
BRPI0710155A2
BRPI0710155A2 BRPI0710155-4A BRPI0710155A BRPI0710155A2 BR PI0710155 A2 BRPI0710155 A2 BR PI0710155A2 BR PI0710155 A BRPI0710155 A BR PI0710155A BR PI0710155 A2 BRPI0710155 A2 BR PI0710155A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
wing
glu
leishmania
amino acid
tandem
Prior art date
Application number
BRPI0710155-4A
Other languages
English (en)
Inventor
Steven G Reed
Yasuyuki Goto
Original Assignee
Infectious Disease Res Inst Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Infectious Disease Res Inst Inc filed Critical Infectious Disease Res Inst Inc
Publication of BRPI0710155A2 publication Critical patent/BRPI0710155A2/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

COMPOSTOS E MéTODOS PARA DIAGNóSTICO E TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE. A presente invenção refere-se a compostos e métodos para di- agnóstico, prevenção, tratamento e detecção de infecção por Leishmania, sendo descritas respostas a estimulação imunológica em pacientes. Os compostos descritos incluem polipeptídeos e proteínas de fusão que contém, pelo menos, uma porção imunogênica de um ou mais antígenos de Leishamania, ou uma variante destes. Adicionalmente, são descritos métodos para rastrear proteínas com sequências repetidas em tandem que possuem propriedades imunogênicas em biblioteca de rastreamento. São descritas vacinas e composições farmacêuticas compreendendo polinucleotídeos, polipeptídeos, proteínas de fusão e variantes destes que podem ser utilizados para a prevenção de terapia de leishmaniose, bem como para a detecção de infecção por Leishmania.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS-TOS E MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE LEISHMA-NIOSE".
Este pedido de patente reivindica prioridade sobre o Pedido U.S.
Não-provisória 11/733 440, depositado em 10 de abril de 2007. O pedido depatente precedente é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência,conforme se integralmente descrito neste pedido de patente.
Este pedido de patente reivindica prioridade sobre o Pedido dePatente Provisória U.S. 60/744.798, depositado em 13 de abril de 2006. Opedido de patente precedente é aqui incorporado, em sua totalidade, porreferência, conforme se integralmente descrito neste pedido de patente.
Este pedido de patente reivindica prioridade sobre o Pedido dePatente Provisória U.S. 60/791 226, depositado em 10 de abril de 2006. Opedido de patente precedente é aqui incorporado, em sua totalidade, porreferência, conforme se integralmente descrito neste pedido de patente.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se, de modo geral, ao sorodiagnósti-co de infecção por Leishmania. A invenção é mais especialmente dirigida aouso de um ou mais polipeptídeos de Leishmania, em métodos e kits diagnós-ticos, para rastrear, em organismos e suprimentos de sangue, a presença deLeishmania, e para identificar aqueles indivíduos que, possivelmente, evolui-rão para Ieishamiose visceral aguda. A invenção é dirigida também a vacinase composições farmacêuticas para tratamento e imunização de um organis-mo contra leishmaniose.
Antecedentes da Invenção
Os organismos pertencentes ao gênero Leishmania são parasi-tas protozoários intracelulares de macrófagos que causa uma ampla varie-dade de doenças clínicas em seres humanos e animais domésticos, primari-amente em cachorros. Em algumas infecções, o parasita permanece latentepor muitos anos. Em outros casos, o hospedeiro pode desenvolver uma dasvárias formas de leishmaniose. Por exemplo, a doença pode ser assintomá-tica ou pode se manifestar como leishmaniose visceral subclínica que é ca-racterizada por sintomas leves de mal estar, diarréia e hepatomegalia inter-mitente. Pacientes com doença subclínica ou assintomática possuem geral-mente títulos de anticorpos baixos, tornando difícil detectar a doença comtécnicas convencionais. Alternativamente, a Ieishamiose pode se manifestar como doença cutânea que é uma condição médica grave, porém geralmenteautolimitante, ou sob a forma de doença altamente destrutiva de mucosasque não é autolimitante. Finalmente, e mais gravemente, a doença pode semanifestar sob a forma de infecção visceral aguda, envolvendo o baço, fíga-do e linfonodos, a qual, se não tratada, é geralmente uma doença fatal. Sin-tomas de Ieishmaniose visceral aguda incluem hepatoesplenomegalia, febre,leucopenia, anemia e hipergamaglobulinemia.
A Ieishmaniose é um problema sério em muitas regiões do mun-do, incluindo o Brasil, China, África Oriental, índia e regiões dó Meio-Oriente.A doença é endêmica também na região mediterrânea, incluindo sul daFrança, Itália, Grécia, Espanha, Portugal e Norte da África. O número decasos de Ieishmaniose tem aumentado drasticamente nos últimos 20 anos, eexistem atualmente milhões de casos desta doença em todo o mundo. Cercade 2 milhões de novos casos são diagnosticados a cada ano, 25% destes deleishamiose visceral. No entanto, não há vacinas ou tratamentos efetivosatualmente disponíveis.
O diagnóstico de Ieishmaniose visceral não pode ser feito sem-pre somente com base em sintomas clínicos, uma vez que o quadro clínicode Ieishamiose visceral assemelha-se aos de outras doenças, como malária,febre tifóide e tuberculose, que ocorrem comumente nas mesmas áreas en-dêmicas. Dessa forma, o diagnóstico de Ieishmaniose visceral baseia—seem grade parte em métodos parasitológicos ou sorológicos. O primeiro é adetecção microscópica de amastigotos em aspirados de baço e de medulaóssea ou a detecção de promastigotos pela cultura dos aspirados. Infeliz-mente, este método requer a biópsia de medula óssea, fígado, baço, ou po-dem ser precisos linfonodos, o que pode levar à infecção secundária ou des-figuramento posterior do paciente. Adicionalmente, além de ser um diagnós-tico invasivo, requer um longo período de tempo para o diagnóstico e os re-sultados são comumente inconclusivos. Por conseguinte, este método é in-vasivo, lento e não suficientemente sensível, fazendo com que não seja efi-ciente.
Na verdade, existem procedimentos laboratoriais menos invasi-vos e lentes, no entanto, estes carecem de sensibilidade ou são de imple-mentação difícil. Por exemplo, o Teste de Aglutinação Direta Líquida (LQDAT: Universidade Ahfad, Khartoum e IPB, Addis Abbeba) e de DAT SecoCongelado (FD DAT: Meredith et al. 1995) possuem boa sensibilidade, po-rém requerem múltiplas etapas de coletas com pipetas e incubação, que tor-na a implementação deste teste difícil em países em desenvolvimento. Simi-larmente, o Teste de Aglutinação de Antígeno em Látex em Urina (KATEX®:Kalon Biological Ltd - Reino Unido) possui boa sensibilidade e especificida-de, porém requer em uma etapa complicada que a urina seja fervida, alémde sofrer de baixa reprodutibilidade. Finalmente, os testes de fita reagenterK39 e rK26 (Inbios®, Seattle, WA) podem fornecer resultados em questãode minutos, porém estes testes carecem de sensibilidade em certas regiõesgeográficas, como Sudão, Etiópia e Quênia. Como os testes com fitas rea-gentes podem ser fáceis e rapidamente implementados e de custo acessível,embora careçam de sensibilidade a antígeno, a descoberta de novos antíge-nos é necessária para diagnóstico mais preciso de leishmaniose.
Entre os antígenos de Leishmania definidos, relatados anterior-mente, rK39 parece ser o melhor antígeno para sorodiagnóstico de leishma-niose visceral, em termos de sensibilidade e especificidade. rK39 é sensívele confiável mesmo em formato de fita, o qual pode ser aplicado em uso emcampo, e o teste de fita do rK39 possui alta sensibilidade na índia, Nepal eBrasil. No Sudão, Etiópia e Quênia, contudo, a sensibilidade do teste de fitacai para 67%, e as respostas negativas no teste de fita parecem estar corre-lacionadas com reatividade mais baixa em teste por ELISA. Por conseguinte,novos antígenos diagnósticos são necessários para complementar rK39,contribuindo para o desenvolvimento de diagnostico mais preciso de leish-maniose. A presente invenção atende a essas necessidades e a muitas ou-tras relacionadas.Sumário da Invenção
Resumidamente, esta invenção refere-se a compostos e méto-dos para detecção e tratamento de Ieishmaniose em indivíduos e em supri-mentos de sangue.
Mais especificamente, são providos compostos e métodos paradiagnóstico, prevenção, tratamento e detecção de infecção por Leishmania,sendo descritas respostas a estimulação imunológica em pacientes. Oscompostos descritos incluem polipeptídeos e proteínas de fusão que contêm,pelo menos, uma porção imunogênica de um ou mais antígenos de Leisha-mania, ou uma variante destes. Adicionalmente, são descritos métodos pararastrear proteínas com seqüências repetidas em tandem que possuem pro-priedades imunogênicas em biblioteca de rastreamento. São descritas vaci-nas e composições farmacêuticas, compreendendo polinucleotídeos, poli-peptídeos, proteínas de fusão e variantes destes, que podem ser utilizadaspara a prevenção e terapia de leishmaniose, bem como para a detecção deinfecção por Leishmania.
Em uma concretização, é descrito um método de detecção deinfecção por Leishmania que compreende as etapas de, inicialmente, por emcontato uma amostra biológica com polipeptídeos, compreendendo, pelomenos, uma unidade de repetição em tandem, em que a unidade de repeti-ção em tandem contém uma seqüência de aminoácidos com homologia auma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo constituído pelasSEQ ID NO: 1-59; e, em segundo lugar, a detecção da presença de anticor-pos na amostra biológica para detectar infecção por Leishmania. Concretiza-ções relacionadas incluem métodos similares de uso de proteínas com se-qüências repetidas em tandem e proteínas de fusão que compreendem umaou mais das seqüências de aminoácidos, representadas pelas SEQ ID NO:1-59. Em ainda outras concretizações, são descritos kits diagnósticos paradetecção de infecção por Leishmania, os quais compreendem os polipeptí-deos descritos acima.
Em ainda outras concretizações da presente invenção, são des-critas seqüências de DNA que codificam os polipeptídeos descritos acima,além de vetores de expressão e células hospedeiras compreendendo osmesmos.
Concretizações adicionais são descritas, em que os polipeptí-deos descritos são utilizados em composições farmacêuticas e métodos re-acionados de uso destas composições para tratar, detectar e imunizar con-tra infecção causada por Leishmania.
Em outras concretizações, são descritos métodos de rastrea-mento de polipeptídeos imunogênicos, rastrear a biblioteca com uma amos-tra biológica e analisar as seqüências identificadas para selecionar genescom seqüências repetidas em tandem. São descritos ainda outros métodospara concretizações da presente invenção, nos quais uma ou mais seqüên-cias de polipeptídeos ou polinucleotídeos são selecionadas e, em seguida,rastreadas quanto a domínios de repetição em tandem, de forma a selecio-nar polinucleotídeos imunogênicos ou polipeptídeos imunogênicos.Descrição Resumida dos Desenhos
Concretizações preferidas e alternativas da presente invençãosão descritas mais detalhadamente abaixo, com referência aos seguintesdesenhos:
A Figura 1 apresenta uma análise representativa por PCR degenes com seqüências repetidas em tandem. Reações de PCR realizadascom conjuntos iniciadores específicos para regiões de repetição em tandemde LinJ 16.1750, LinJ22.1590 e LinJ33.2870, ou para um gene de T. cruzi,empregando DNA total de L. infantum (Li), L. donovani (Ld), L. major (Lm), Lamazonensis (La) e T. cruzi (Tc), como modelos. Os tamanhos são apresen-tados em pares de bases.
A Figura 2 ilustra um exemplo da expressão e purificação deproteínas recombinantes de L. infantum. São apresentados géis de gradientede poliacrilamente de SDS/4-20% corados por azul de coomassie de Iisadosde E. coli (faixa 1), Iisados induzidos (faixa 2) e proteínas purificadas (faixa3). Os tamanhos são apresentados em kDa.
A Figura 3 apresenta uma avaliação demonstrativa, por ensaioimunoenzimático direto de absorvência, de soro-reatividade de pacientes aproteínas recombinantes de L. infantum. Foram utilizados soros de pacientescom Ieishmaniose visceral (VL, η = 10), Ieishmaniose cutânea (CL, η = 10),tuberculose (TB, η = 10), malária (n = 6), ou soros de controles saudáveisnos Estados Unidos (n = 10). São apresentados valores de OD de média eSEM em cada grupo.
A Figura 4 mostra reatividade representativa de soros de pacien-tes humanos com Ieishmaniose visceral contra proteínas com seqüênciasrepetidas em tandem. (A) Soros de pacientes com Ieishmaniose visceral (n =35) e de controles saudáveis (n = 20) foram testados quanto à reatividade arLinJ16.1750r2 ou rK39 por ELISA. A média em cada grupo é apresentadaem linha contínua. Linhas tracejadas representam valores de corte, calcula-dos como média + 3 DP de valores de OD, obtidos de controle saudáveis.
A figura 5 ilustra um exemplo de reconhecimento de proteínasrecombinantes por soros de oitos pacientes com Ieishmaniose visceral, quedemonstraram baixa reatividade a rK39 (OD < 1,0, A em círculo).
A Figura 6 exibe respostas demonstrativas de anticorpo de sorosde pacientes com Ieishmaniose visceral a proteínas com seqüências repeti-das em tandem. A reatividade de soros de pacientes com Ieishmaniose vis-ceral (círculos fechados: η = 16) e de controles saudáveis (círculos abertos:η = 8) foi testada a proteínas com seqüências repetidas em tandem por ELI-SA, e os valores de OD são apresentados individualmente. As barras repre-sentam as médias de cada grupo.Descrição detalhada
Conforme declarado acima, a presente invenção refere-se acomposições e métodos para detecção e proteção contra infecção por Lei-shmania em amostra biológica ou organismo, além de métodos para rastre-amento e identificação de compostos que são eficazes na detecção e prote-ção contra infecção por Leishmania em amostra biológica ou organismo.
Em uma concretização, a invenção provê compostos de um mé-todo para detecção de infecção por Leishmania em amostra biológica ouorganismo, compreendendo: (a) contato de uma amostra biológica com umou mais polipeptídeos, dos quais pelo menos um compreende unidades derepetição em tandem, ou um variante destes que difere somente em substi-tuições ou modificações conservadoras, sendo que esta unidade de repeti-ção em tandem comprende, em certas concretizações, uma seqüência deaminoácidos com, pelo menos, 8 aminoácidos consecutivos e com, pelo me-nos, 70% de homologia de seqüência de uma seqüência de aminoácidosselecionada entre SEQ ID NOS: 1-59, sob condições e por tempo suficientepara ocorrer a ligação do(s) polipeptídeo(s) por um anticorpo na amostra; e(b) detecção, na amostra biológica, da presença de um ou de uma pluralida-de de anticorpos que se ligam especificamente ao polipeptídeo, sendo de-tectada, pelo mesmo, infecção por Leishmania na amostra biológica.
Em outra concretização, a invenção provê métodos e composi-ções para detecção de infecção por Leishmania em amostra biológica ouorganismo, compreendendo: (a) contacto de uma amostra biológica comuma composição compreendendo um polipeptídeo que inclui uma unidadede repetição em tandem, ou uma variante deste que difere somente emsubstituições ou modificações conservadoras, sob condições e por temposuficiente para ocorrer a ligação do(s) polipeptídeo(s) por um anticorpo naamostra; e (b) detecção, na amostra biológica, da presença de anticorposque se ligam ao polipeptídeo, sendo detectada, pelo mesmo, infecção porLeishmania na amostra biológica. Nestas e em outras concretizações rela-cionadas, a composição pode incliur uma única repetição em tandem, con-forme provido nesta exposição, ou pode incluir duas ou mais unidades derepetição em tandem, as quais podem ser iguais ou diferentes. Esta compo-sição pode compreender, dessa forma, um ou mais tipos de unidades derepetição em tandem, e/ou pode incluir também proteínas de fusão, compre-endendo um ou mais tipos de unidades de repetição em tandem.
Em ainda uma outra concretização, a invenção provê métodospara rastreamento e seleção de proteínas com seqüências repetidas emtandem com eficácia para detectar infecção por Leishmania em amostra bio-lógica ou organismo, compreendendo: (a) construção de biblioteca de ras-treamento de Leishmania; (b) varredura na biblioteca de rastreamento deLeishmania; e (c) análise dos genes que foram identificados em varredura nabiblioteca de rastreamento de Leishmania para selecionar genes que possu-em seqüências repetidas em tandem.
Em ainda uma outra concretização, a invenção provê sistemas emétodos para tratamento e detecção de Ieishmaniose em pacientes cominfecção clínica ou subclínica por Leishmania.
Polipeptídeos contemplados de acordo com certas concretiza-ções da invenção incluem, entre outros, polipeptídeos compreendendo por-ções imunogênicas de antígenos de Leishmania, incluindo as seqüênciasreferidas nas SEQ ID NO:1-59. Conforme utilizado nesta exposição, o termo"polipeptídeo" abrange cadeias de aminoácidos de qualquer extensão, inclu-indo proteínas em extensão completa (ou seja, antígenos), em que os resí-duos de aminoácidos estão ligados covalentemente sob a forma de políme-ros lineares por pontes entre peptídeos. Dessa forma, um polipeptídeo com-preendendo uma porção imunogênica de um os antígenos acima pode serinteiramente constituído pela porção imunogênica, ou pode conter seqüên-cias adicionais. As seqüências adicionais podem ser seqüências que ocor-rem naturalmente, como aquelas derivadas do antígeno nativo de Leishma-nia, ou podem ser heterólogas (por exemplo, derivadas de outras fontes,incluindo seqüências exógenas que ocorrem naturalmente e/ou seqüênciasartificiais), e estas seqüências podem (porém não precisam) ser imunogêni-cas. Um antígeno "com" uma seqüência especialmente referida é aquele quecompreende uma seqüência referida, por exemplo, que contenha, em toda aextensão de sua seqüência, a seqüência referida. O antígeno nativo podeconter, ou não, uma ou mais seqüências adicionais de aminoácidos. Um ma-terial, molécula, preparado ou similares que são "isolados", refere-se a tersido removido do ambiente ou fonte no qual ocorre naturalmente. Por exem-plo, uma seqüência de polinucleotídeos que é parte de um gene, presenteem cromosso em um indivíduo ou fonte biológica, como, por exemplo, ani-mal vivo intacto, não é isolada, enquanto que o DNA extraído de uma amos-tra biológica que foi obtida deste indivíduo ou desta fonte biológica seriaconsiderado isolado. De modo similar, "isolamento" pode referirs-se a etapasrealizadas nos processos ou métodos para retirada deste material do ambi-ente natural no qual ocorre.
Conforme utilizado no presente, o termo "repetição em tandem"refere-se a uma região de uma seqüência de polinucleotídeos (por exemplo,uma seqüência de DNA,RNA, oligonucleotídeos construídos por recombina-ção ou sintéticos, incluindo polímeros lineares de nucleotídeos ou análogosde nucleotídeos, ou similares, que não ocorrem naturalmente, incluindo mi-méticos de nucleotídeos), ou a uma região de polipeptídeo ou proteína quecompreenda uma seqüência, respectivamente, de aproximadamente 6 a1200 nucleotídeos ou de 2 a 400 aminoácidos, que é repetida em tandem deforma que a seqüência ocorra, pelo menos, duas vezes. Conforme utilizadonesta exposição, o termo "unidade de repetição em tandem" refere-se a umaúnica unidade da seqüência que é repetida em tandem. Adicionalmente, otermo "repetição em tandem" abrange também uma região de DNA, em queuma única unidade de repetição em tandem de 2 a 400 aminoácidos ou de 6a 1200 nucleotídeos é repetida em tandem ou com bases ou aminoácidosintervenientes, desde que, pelo menos, uma das seqüências seja repetida,pelo menos, duas vezes em tandem. Ademais, o termo "repetição em tan-dem" abrange também regiões de DNA ou de uma proteína, em que as uni-dades de repetição em tandem não são idênticas. Quando duas ou mais se-qüências forem, pelo menos, 70% homólogas entre si, ou se forem variantesrazoáveis das mesmas, estas seqüências serão consideradas unidades derepetição em tandem, no que se refere a compreender e constituir uma repe-tição em tandem.
Além disso, quando uma seqüência for consistindo em, pelo me-nos, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou mais ami-noácidos de uma unidade de repetição em tandem, esta seqüência seráconsiderada uma unidade de repetição em tandem, no que se refere a com-preender e constituir uma repetição em tandem.
E também, quando uma seqüência for consistindo em, pelo me-nos, aproximadamente 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51 ou qual-quer número inteiro de nucleotídeos interferentes, a seqüência será conside-rada uma unidade de repetição em tandem, no que se refere a compreendere constituir uma repetição em tandem.
Adicionalmente, o termo "repetição em tandem" abrange tam-bém repetição em tandem, em que um ou mais unidades de repetição emtandem de uma repetição em tandem é a seqüência reversa das outras uni-dades de repetição em tandem. Unidades de repetição em tandem reversase unidades de repetição em tandem não-reversa podem ser configuradas emqualquer maneira, e com ou sem de bases nucleotídeos ou aminoácidos in-tervenientes. Configurações de seqüências reversas e não-reversas incluem,entre outras, aquelas em que uma seqüência não-reversa é seguida por se-qüência reversa, em que uma seqüência reversa é seguida por seqüêncianão-reversa e aquelas em que uma seqüência reversa é seguida por se-qüência reversa. No caso de polinucleotídeos de fita dupla com repetição emtandem, duas ou mais destas repetições podem estar presentes na mesmafita ou podem ocorrer em fitas opostas.
Em certas concretizações preferidas, uma repetição em tandempode compreender uma porção imunogênica de um antígeno de Leishmania.Uma porção imunogênica de um antígeno de Leishmania é aquela capaz deprovocar uma resposta imune (ou seja, celular e/ou humoral), em um pacien-te que está correntemente ou foi anteriormente infectado por Leishmania(como ser humano ou cachorro) e/ou em culturas de células de Iinfonodo oude células mononucleares de sangue periférico (PBMC), isoladas de indiví-duos com infecção atual ou anterior por Leishmania. Versados na técnicaestarão familiarizados com qualquer uma de uma ampla variedade de meto-dologias, utilizadas para determinar se uma resposta imune foi provocada.(Consultar, por exemplo, Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons Publishers, NY). As células nas quais uma resposta é provocada po-dem compreender uma mistura de tipos de células ou podem conter compo-nentes celulares isolados (incluindo, por exemplo, células T, células NK, ma-crófagos, monócitos e/ou células B). Em particular, porções imunogênicassão capazes de induzir proliferação de célula T e/ou uma resposta de citoci-na predominantemente do tipo Th1-(por exemplo, produção de IL-2, IFN-gama e/ou TNF-alfa por células T e/ou células NK; e/ou produção de IL-12por monócitos, macrófagos e/ou células B). Porções imunogênicas dos antí-genos aqui descritos podem ser geralmente identificadas, empregando téc-nicas conhecidas por qualquer versado na técnica, incluindo os métodos re-presentativos, providos nesta exposição.
As composições e métodos da presente invenção abrangemtambém variantes dos polipeptídeos acima. "Variante" de polipeptídeo, ouum polipeptídeo que é "homólogo" a uma outra proteína, conforme utilizadonesta exposição, é um polipeptídeo que difere de uma proteína nativa (porexemplo, que ocorre naturalmente) em uma ou mais substituições, exclu-sões, adições e/ou inserções, de forma que a imunogenicidade do polipeptí-deo não é diminuída substancialmente. Por exemplo, a capacidade de umvariante reagir com anticorpo específico de um antígeno, antisoro ou célula Tpode ser intensificada ou inalterada, em relação à proteína nativa, ou podeser diminuída em menos de 50% e, de preferência, em menos de 20%, emrelação à proteína nativa. Estes variantes podem ser identificados geralmen-te por modificação de uma das seqüências do polipeptídeo, descritas nestaexposição, e avaliação da reatividade do polipeptídeo modificado com anti-corpos específicos de antígenos ou antisoro, conforme aqui descrito. Varian-tes preferidos incluem aqueles em que uma ou mais porções, como umaseqüência líder N-terminal ou domínio transmembrana, foram removidas.Outros variantes preferidos incluem aqueles em que uma porção pequena(por exemplo, 1-30 aminoácidos, de preferência 5-15 aminoácidos) foramremovidos do N-terminal e/ou C-terminal da proteína madura.
Variantes de polipeptídeos abrangidos pela presente invençãoincluem aqueles exibindo, pelo menos, aproximadamente 70%, 75%, 80%,85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais deidentidade (determinada conforme descrito abaixo) com os polipeptídeosdescritos no presente.
De preferência, um variante contém substituições conservado-ras. "Substituição conservadora" é aquela em que um aminoácido é substitu-ído por outro aminoácido com propriedades similares, de tal forma que umversado na técnica de química de peptídeos esperaria que a estrutura se-cundária e natureza hidropática do polipeptídeo permaneceriam substanci-almente inalteradas. Substituições de aminoácidos são efetuadas geralmen-te com base em semelhança, em termos de polaridade, carga, solubilidade,hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza antipática dos resíduos. Porexemplo, aminoácidos de carga negativa incluem ácido aspártico e ácidoglutâmico; aminoácidos de carga positiva incluem Iisina e arginina; e amino-ácidos com grupos dianteiros sem carga polar com valores similares de hi-drofilicidade incluem leucina, isoleucina e valina; glicina e alanina; asparagi-na e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tirosina. Outros grupos deaminoácidos que podem representar alterações conservadoras incluem: (1)ala, pro, gli, glu, asp, gln, asn, ser, tr; (2) eis, ser, tir, tr; (3) vai, ile, leu, met,ala, fe; (4) lis, arg, his; e (5) fe, tir, trp, his. Uma variante pode conter tam-bém, ou alternativamente, alterações não-conservadoras. Em uma concreti-zação preferida, polipeptídeos variantes diferem de uma seqüência nativapor substituição, exclusão ou adição de cinco aminoácidos ou menos. Vari-antes podem ser modificados também (ou alternativamente), por exemplo,pela exclusão ou adição de aminácidos que possuem influência mínima so-bre a imunogenicidade, estrutura secundária e natureza hidropática do poli-peptídeo.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser preparadosde acordo com qualquer maneira conhecida na técnica. Estes polipeptídeosincluem aqueles que ocorrem naturalmente, polipeptídeos produzidos porrecombinação, polipeptídeos produzidos sinteticamente ou polipeptídeosproduzidos por combinação desses métodos. Da mesma forma, certas con-cretizações descritas no presente contemplam polipeptídeos compreendidosentre os que ocorrem naturalmente com cadeia principal formada por fosfatode açúcares (por exemplo, ribose ou desoxirribose) em ligação de 5' para 3',porém a invenção não é limitada a estes e contempla também polinucleotí-deos compreendidos entre qualquer um entre alguns polipeptídeos naturaise/ou artificiais e/ou análogos de polipeptídeos naturais e/ou artificiais e/oumiméticos, por exemplo, aqueles criados para resistir degradação ou comoutras propriedades fisico-químicas desejáveis, como polinucleotídeos sinté-ticos com cadeia principal formada por fósforotioato, ou similar.
Os polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa(ou seja, seqüência endógena que codifica uma proteína ou uma parte des-ta) ou podem compreender um variante ou equivalente biológico ou funcionalantigênico desta seqüência. Variantes de polinucleotídeos podem conteruma ou mais substituições, adições, exclusões e/ou inserções, conformemais descrito abaixo, de preferência de tal forma que a imunogenicidade dopolipeptídeo codificado não seja diminuída em relação à proteína tumoralnativa. O efeito sobre a imunogenicidade do polipeptídeo codificado pode seravaliado, em geral, conforme descrito nesta exposição. O termo "variantes"abrange também genes homólogos de origem xenogênica.
Quando se comparam seqüências de polinucleotídeos ou de po-lipeptídeos, as duas seqüências são ditas "idênticas" se a seqüência de nu-cleotídeos ou de aminoácidos nas duas seqüências é a mesma quando ali-nhadas em correspondência máxima, conforme descrito abaixo. As compa-rações entre duas seqüências são efetuadas tipicamente por comparaçãodas seqüências em um intervalo de comparação para identificar e compararregiões em que há semelhança de seqüência. "Intervalo de comparação",conforme utilizado nesta exposição, refere-se a um segmento de, pelo me-nos, aproximadamente 20 posições contíguas, geralmente de aproximada-mente 30 a aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, em que umaseqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmonúmero de posições contíguas, depois que as duas seqüências são otima-mente alinhadas.
Alinhamento ótimo de seqüências por comparação pode serconduzido com o programa Megalign na suíte de Lasergene de software debioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), utilizando parâmetros-padrão. Este programa personifica vários esquemas de alinhamento, descri-tos nas seguintes referências: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionarychange in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff,M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National BiomedicalResearch Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; HeinJ. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Me-thods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Hig-gins, D. G. e Sharp, Ρ. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. e MullerW. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105;Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol Evol. 4:406-425; Sneath, Ρ. H. A. e So-kal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy--the Principies and Practice of Nume-rical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W. J. e Lip-man, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sei. USA 80:726-730.
Alternativamente, o alinhamento ótimo de seqüências para com-paração pode ser conduzido pelo algaritmo de identidade local de Smith eWaterman (1981) Add. APL. Math 2:482, pelo algoritmo de alinhamento deidentidade de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. BioL 48:443, pela pesqui-sa de métodos de semelhança de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 85: 2444, por programas desenvolvidos para computador des-tes algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST1 FASTA e TFASTA no Pacote deSoftwares da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspeção.
Um exemplo preferido de algoritmos adequados para determina-ção de percentual de identidade de seqüência e semelhança entre seqüên-cias são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 que são descritos por Altschul etai (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410, respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 podem ser utilizados,por exemplo, com os parâmetros descritos nesta exposição, para determinaro percentual de identidade de seqüência dos polinucleotídeos e polipeptí-deos da invenção. O software para realizar análises com BLAST é publica-mente disponível, através do National Center for Biotechnology Information.Em um exemplo ilustrativo, é possível calcular resultados acumulados, deseqüências de nucleotídeos, utilizando os parâmetros M (resultado positivopara par de resíduos que se combinam; sempre >0) e N (resultado negativopara resíduos que não se combinam; sempre <0). Em relação a seqüênciasde aminoácidos, uma matriz de pontuação pode ser utilizada para calcular oresultado acumulado. A extensão dos acertos de palavra, em cada direção,é interrompida quando: o resultado acumulado do alinhamento é diminuídopela quantidade X de seu valor máximo obtido; o resultado acumulado vaipara zero ou abaixo, pelo acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduosde resultados negativos; ou o final de cada seqüência é atingido. Os parâ-metros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocida-de do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeos)usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, e expectativa (E)de 10, e os alinhamentos da matriz de pontuação BLOSUM62 (consultarHenikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915), (B) de 50,expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambos os fila-mentos.
De preferência, o "percentual de identidade de seqüência" é de-terminado por comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobreum intervalo de comparação de, pelo menos, 20 posições, em que a porçãoda seqüência do polinucleotídeo ou polipeptídeo, no intervalo de compara-ção, pode compreender adições ou exclusões (ou seja, lacunas) de 20 porcento ou menos, geralmente de 5 a 15 por cento, ou de 10 a 12 porcento,comparado às seqüências de referência (que não compreendem adições ouexclusões), quanto ao alinhamento ótimo das duas seqüências. O percentualé calculado por determinação do número de posições em que ocorrem ba-ses idênticas de ácidos nucléicos ou de resíduos de aminoácidos em ambasas seqüências para produzir o número de posições combinadas, dividindo onúmero de posições combinadas pelo número total de posições na seqüên-cia de referência (ou seja, o intervalo de tamanho) e multiplicando os resul-tados por 100 para produzir o percentual de identidade de seqüência.
Por conseguinte, a presente invenção abrange seqüências depolinucleotídeos e de polipeptídeos que possuem grande identidade com asseqüências descritas no presente, por exemplo, aquelas compreendendo,pelo menos, 50% de identidade de seqüência, de preferência, pelo menos,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%ou mais de identidade de seqüência, comparado a uma seqüência de poli-nucleotídeo ou de polipeptídeo desta invenção, empregados os métodosaqui descritos, (por exemplo, análise por BLAST com parâmetros conven-cionais, conforme descrito abaixo). Um versado nesta técnica reconheceráque estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinaridentidade correspondente de proteínas codificadas pelas duas seqüênciasde nucleotídeos, levando em conta degeneração de códon, semelhança deaminoácidos, posicionamento de quadro de leitura e similares.
Em concretizações adicionais, a presente invenção provê poli-nucleotídeos e polipeptídeos isolados, compreendendo várias extensões desegmentos contínguos de seqüência idêntica ou complementar de uma oumais entre as seqüencias descritas no presente. Por exemplo, são providospolinucleotídeos por esta invenção que compreendem, pelo menos, aproxi-madamente 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000 oumais nucleotídeos contíguos de uma ou mais entre as seqüências descritasno presente, bem como todas extensões intermediárias entre elas. Fica ime-diatamente entendido que "extensões intermediárias", nesse contexto, signi-fica qualquer extensão entre os números citados, como 16, 17, 18, 19, etc.;21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.;150, 151, 152, 153, etc.; incluindo todos os números inteiros de 200-500;500-1.000, e similares.
Os polinucleotídeos da presente invenção, ou fragmentos des-tes, não independente da extensão da própria seqüência codificadora, po-dem ser combinados com outras seqüências de DNA, como promotoras, desinalização de poliadenilação, sítios adicionais de restrição de enzima, sítiosmúltiplos de clonagem, outros segmentos codificadores, e similares, de talforma que a sua extensão final pode variar consideravelmente. Por conse-guinte, é contemplado o emprego de fragmentos de ácido nucléico com pra-ticamente qualquer extensão, sendo a extensão total, de preferência, limita-da pela facilidade de preparo e uso no protocolo pretendido de DNA recom-binante. Por exemplo, segmentos ilustrativos de DNA com extensões totaisde aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente3000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50pares de base, em extensão, e similares (incluindo todas as extensões in-termediárias) são contemplados como úteis em muitas implementações des-ta invenção.
Em outras concretizações, a presente invenção é dirigida a poli-nucleotídeos que são capazes de se hibridizar, sob condições moderamenterigorosas, com uma seqüência de polinucleotídeo aqui provida, fragmentodesta ou com uma seqüência complementar desta. As técnicas de hibridiza-ção são bem-conhecidas na técnica de biologia molecular. A título de ilustra-ção, condições moderadamente rigorosas adequadas para testes da hibridi-zação de um polinucleotídeo desta invenção com outros polinucleotídeosincluem pré-lavagem em solução de 5 vezes SSC, 0,5% de SDS, EDTA a1,0 mM (pH 8,0); hibridização a 50 graus. C.-65 graus C., 5 X SSC, durantea noite; seguido por duas lavagens a 65 graus C. por 20 minutos com cadauma de 2 vezes, 0,5 vez e 0,2 vez SSC contendo 0,1% de SDS.
Além disso, será apreciado por qualquer versado na técnica que,em resultado da degeneração do código genético, há muitas seqüências denucleotídeos que codificam um polipeptídeo conforme descrito nesta descri-ção. Alguns destes polinucleotídeos exibem homologia mínima com a se-qüência de nucleotídeo de qualquer gene nativo. Todavia, polinucleotídeosque variam em decorrência de diferenças em uso de códon são especifica-mente contemplados pela presente invenção. Além disso, alelos dos genescompreendendo as seqüências de polinucleotídeos aqui providas são a-brangidos pela presente invenção. Alelos são genes endógenos que sãoalterados em resultado de uma ou mais mutações, como exclusões, adiçõese/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultantes po-dem, porém não precisam, apresentar estrutura ou função alterada. Alelospodem ser identificados com técnicas convencionais (como hibridização,amplificação e/ou comparação de seqüências em banco de dados).
"Polipeptídeos", conforme descritos nesta exposição, incluemtambém polipeptídeos combinados, também referidos como proteínas defusão. "Polipeptídeo de combinação" ou "proteína de fusão" é aquele quecompreende, pelo menos, uma das porções imunogênicas acima e uma oumais seqüências adicionais imunogênicas de Leishmania, que são unidospor meio de ligação peptídica em uma única cadeia de aminoácidos. As se-qüências podem ser unidas diretamente (ou seja, sem aminoácidos interve-nientes) ou podem ser unidas por meio de uma seqüência de ligação (porexemplo, Gli-Cis-Gli) que não diminua significativamente as propriedadesimunogênicas dos polipeptídeos constituintes.
Proteínas de fusão podem ser preparadas geralmente com téc-nicas convencionais, incluindo conjugação química. De preferência, umaproteína de fusão é expressa sob a forma de proteína recombinante, permi-tindo a produção de níveis maiores, em relação à de uma proteína não-fundida, em um sistema de expressão. Resumidamente, seqüências de DNAque codificam os componentes polipeptídicos podem ser montadas separa-damente e ligadas em um vetor de expressão apropriado. A extremidade 3'da seqüência de DNA que codifica um componente polipeptídico é ligada,com ou sem um Iigante peptídico, à extremidade 5' de uma seqüência deDNA codificadora do segundo componente polipeptídico, de forma que osquadros de leitura das seqüências estão em quadro. Isso permite traduçãoem uma única proteína de fusão que retém a atividade biológica de ambosos polipeptídeos constituintes.
Uma seqüência de Iigante peptídico pode ser empregada paraseparar o primeiro e o segundo constituinte polipeptídico em distância sufici-ente para garantir que cada polipeptídeo dobra-se em suas estruturas se-cundária e terciária. Esta seqüência de Iigante peptídico é incorporada naproteína de fusão com técnicas convencionais bem-conhecidas na técnica.Seqüências adequadas de ligantes peptídicos podem ser escolhidas combase nos seguintes fatores: (1) a sua capacidade para adotar uma confor-mação estendida flexível; (2) a sua capacidade para adotar uma estruturasecundária que possa interagir com epítopos funcionais no primeiro e nosegundo polipeptídeo; e (3) a ausência de resíduos hidrofóbicos ou com car-ga que poderiam reagir com os epítopos funcionais do polipeptídeo. Se-qüências preferidas de Iigantes peptídicos contêm resíduos de Gli, Asn eSer. Outros aminoácidos quase neutros, como Tr e Ala podem ser utilizadostambém nas seqüências de ligantes. Seqüências de aminoácidos, que po-dem ser empregadas utilmente como ligantes, incluem aquelas descritas porMaratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83:8258-8262, 1986; Patente U.S. N° 4 935 233 e Patente U.S. N° 4751 180. A seqüência do Iigante pode conter geralmente de 1 a aproxima-damente 50 aminoácidos em extensão. Seqüências de ligantes não são ne-cessárias quando o primeiro e o segundo polipeptídeo possuem regiões N-terminais de aminoácidos não essenciais que podem ser utilizadas para se-parar os domínios funcionais e impedir interferência estérica.
As seqüências unidas de DNA são operacionalemnte ligadas aelementos adequados de regulação transcricional ou traducional. Os ele-mentos reguladores responsáveis por expressão de DNA estão localizadossomente em 5', em relação à seqüência de DNA que codifica os primeirospolipeptídeos. Da mesma forma, códons de finalização, necessários parainterromper sinais de terminação de tradução e transcrição, estão presentessomente em 3' em relação à seqüência de DNA que codifica o segundo poli-peptídeo.
Em uma concretização da presente invenção, proteínas de fusãocompreendem uma ou mais unidades de repetição em tandem. Em outrasconcretizações, a única ou mais unidades de repetição em tandem são sele-cionadas de um grupo consistindo em SEQ ID NO. 1-59. Em ainda outrasconcretizações, as proteínas de fusão compreendem ainda as porções anti-gênicas de proteínas, tais como, entre outras, rK26, rK39 e rLiA2, que sãodescritas especificamente nas SEQ ID NO. 119-121.
Métodos de varredura para polipeptídeos imunogênicos
Em uma concretização, a invenção provê métodos para rastreare selecionar proteínas com repetição em tandem que podem ser úteis emdiagnóstico, tratamento e/ou imunização de um indivíduo ou fonte biológica,como paciente humano, por exemplo, em detectar infecção por Leishmaniaem amostra biológica ou organismo, compreendendo: (a) construção de bi-blioteca de rastreamento de Leishmania; (b) varredura na biblioteca de ras-treamento de Leishmania; e (c) análise dos genes identificados na varredurada biblioteca de rastreamento de Leishmania para selecionar genes comrepetição em tandem. Em outras concretizações, uma biblioteca de rastrea-mento pode ser construída a partir do DNA genômico de qualquer organis-mo, por exemplo, a título de ilustração e não de limitação, um organismoinfeccioso ou não infeccioso, que pode ser patogênico ou não patogênico,como bactéria, vírus, protozoário, fungo, levedura, diplomoadida e cineto-plastídeo. Em certas concretizações, a biblioteca de rastreamento pode serconstruída a partir de material genético (ou seja, ácido nucléico) ou um or-ganismo que causa ou é capaz de causar leishmaniose, como Leishmaniainfantum, Leishmania donovani, Leishmania major, Leishmania amazonen-sis, Trypanosoma cruzi, ou uma cepa bacteriana natural ou não que causeleishmaniose. Em ainda uma outra concretização, bibliotecas podem serconstruídas com espécies de nucleotídeos, incluindo, entre outros, DNA ecDNA.
Por exemplo, uma destas concretizações contempla um métodode identificação de polipeptídeo imunogênico para diagnóstico, tratamentoou imunização em um paciente, compreendendo (a) expressar, em uma ouem pluralidade de células hospedeiras, produtos de expressão de uma bibli-oteca de expressão de polinucleotídeos, a qual compreende um ou uma plu-ralidade de canditados a polinucleotídeos codificadores de polipeptídeos i-munogênicos, sendo que pelo menos um destes é capaz de expressar umcandidato a polipeptídeo imunogênico que compreenda uma repetição emtandem, para obter uma população de células hospedeiras compreendendoprodutos de expressão (b) por em contato, sob condições e por tempo sufi-ciente para ligação específica de, pelo menos, um anticorpo na amostra bio-lógica, com pelo menos um produto de expressão, (i) a população de célulashospedeiras compreendendo produtos de expressão de (a) com (ii) um ma-terial biológico que é obtido de um indivíduo ou de fonte biológica que tenhasido infectado por um organismo infeccioso ou não-infeccioso, ou por orga-nismo patogênico ou não-patogênico, como uma bactéria, vírus, protozoário,fungo, levedura, diplomonoadida ou cinetoplastídeo, ou organismo do gêne-ro Leishmania ou outro organismo que seja capaz de causar leishmaniose,em que o material biológico compreende, pelo menos, um anticorpo e é se-lecionado entre sangue, soro e urina (c) detectar, pelo menos, uma célulahospedeira que compreenda o, pelo menos, único produto de expressão aoqual o, pelo menos, único anticorpo liga-se especificamente; (d) isolar dacélula hospedeira detectada em (c) um polinucleotídeo que codifica o produ-to de expressão ao qual o, pelo menos, único anticorpo liga-se especifica-mente para obter um polinucleotídeo isolado; e (e) analisar uma seqüênciade nucleotídeos do polipeptídeo isolado de (d) quanto à presença ou ausên-cia de uma repetição em tandem, em que a presença de repetição em tan-dem indica que o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo imunogê-nico e, a partir do mesmo, identificar o polipeptídeo imunogênico.
A construção de uma biblioteca de rastreamento de polinucleotí-deos, como uma biblioteca de expressão de polinucleotídeos conforme aquidescrita, pode ser realizada por clivagem ou rompimento de DNA com méto-dos como sonicação ou restrição de enzima, os quais são bem-conhecidosna técnica. Os fragmentos de nucleotídeos resultantes podem ser de qual-quer tamanho, no entanto, eles têm em média, de preferência, 1, 2, ou 3 kb.Os fragmentos de nucleotídeos resultantes podem ser amplificados em se-guida por métodos que são bem-conhecidos na técnica, como ligação emvetores de polinucleotídeos recombinantes, incluindo vetores de amplifica-ção e/ou de expressão, como o vetor fago □ ou o vetor ZAP Express© (Stra-tagene, La Jolla, CA), para gerar uma biblioteca de rastreamento de polinu-cleotídeos, por exemplo, uma biblioteca de expressão de polinucleotídeos. Abiblioteca de rastreamento é selecionada, em seguida, por exposição de ma-terial biológico a células hospedeiras, compreendendo produtos expressosda biblioteca de expressão, onde o material biológico pode ser soro, sangue,urina, saliva ou qualquer material biológico que tenha sido obtido de um indi-víduo ou de fonte biológica que tenha sido ou que esteja infectado por Lei-shmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania major, Leishmania a-mazonensis, Trypanosoma cruzi, ou outras cepas naturais ou não de bacté-rias que causam leishmaniose. A célula hospedeira pode ser uma célula eu-cariótica mais evoluída, como célula de mamífero (incluindo célula de tumor),ou célula eucariótica pouco evoluída, como célula de levedura, ou pode seruma célula procariótica, como célula de bactérias. Exemplos representativosde células hospedeiras apropriadas, de acordo com a presente invenção,incluem, porém não precisam estar limitadas a estas, células de bactérias,como as de E. coli, Streptomyces, Salmonella tvphimurium] células de fun-gos, como as de levedura; células de inseto, como as de Drosophila S2 eSpodoptera Sf9; células de animais, como as células CHO, COS ou 293;adenovírus; células de plantas, ou qualquer célula adequada já adaptadapara proliferação in vitro ou assim estabelecida de novo. A seleção de umhospedeiro apropriada é considerada ao alcance de versados na técnica, apartir dos ensinamentos nesta exposição. Vários sistemas de cultura de cé-lulas de mamíferos podem ser empregados também para expressar proteínarecombinante. Exemplos de sistema de expressão de mamíferos incluem aslinhagens COS-7 de fibroblastos de rim de macaco, descritas por Gluzman,Cell 23:175 (1981), e outras linhagens celulares capazes de expressar umvetor compatível, por exemplo, as linhagens celulares C127, 3T3, CHO, He-La e BHK. Vetores de expressão de mamíferos compreenderão uma origemde replicação, um promotor e intensificador adequados, além de quaisquersítios necessários de ligação a ribossomo, sítio de poliadenilação, sítios dedoador e aceptor de splice, seqüências de terminação transcricional e se-qüências flanqueadoras 5' não transcritas. Seqüências de DNA, derivadasdo splice SV40, e sítios de poliadenilação podem ser utilizados para forneceros elementos genéticos não transcritos necessários. A introdução de cons-trução na célula hospedeira pode ser efetuada por uma variedade de méto-dos, os quais aqueles versados na técnica estarão familiarizados, incluindo,entre outros, por exemplo, transfecção por fosfato de cálcio, transfecçãomediada por DEAE-Dextrano, eletroporação (por exemplo, Davis etal., 1986Basic Methods in Molecular Biology) ou por outras técnicas conhecidas natécnica.
Células hospedeiras que expressam produtos de expressão quecompreendem um polipeptídeo imunogênico (por exemplo, um polipeptídeoque reaja com um anticorpo presente em material biológico em teste pormeio de interação por ligação específica) podem ser identificadas de acordocom qualquer uma entre algumas metodologias conhecidas. Expressão decélula hospedeira de observação imediata de um produto de biblioteca deexpressão, por exemplo, que resultam em placas na biblioteca de expres-são, podem ser detectadas então, e os fragmentos de polinucleotídeos codi-ficados de epítopo antigênico podem ser extraídos e recuperados do vetorde expressão. Em concretizações alternativas, a biblioteca de rastreamentoé derivada de um indivíduo ou de fonte biológica que foi descrito a um mate-rial biológico infectado por um organismo (por exemplo, um organismo infec- cioso), como bactéria patogênica ou não-patogênica, protozoário, fungo, le-vedura, vírus, diplomonoadida, cinetoplastídeo ou outro organismo infeccio-so. Os fragmentos de nucleotídeos extraídos podem ser seqüenciados emseguida, utilizando métodos que são bem-conhecidos na técnica. Em umaconcretização adicional, estas seqüências são comparadas a genes conhe-cidos que podem ser encontrados em bancos de dados, como o banco dedados gênicos de Leishmanis infantum (GeneDB: The Wellcome Trust San-ger Istitute, www.genedb.org), ou o banco de dados gênicos GenBank (Nati-onal Center for Biotechnoiogy Information (NCBI) www.ncbi.nih.gov).
As seqüências de nucleotídeos, obtidas do seqüenciamento dosfragmentos de nucleotídeos são analisadas, a seguir, para deerminar secompreendem repetições em tandem. Repetições em tandem podem seridentificadas, por exemplo, empregando o programa Tandem Repeats Finder(http://tandem.bu.edu/trf/trf.htm) ou outros programas ou métodos similaresque identificam repetições em tandem. Tipicamente, estes programas oumétodos identificam o tamanho do intervalo de repetições em tandem e onúmero de cópias alinhadas com o padrão de consenso. Em uma concreti-zação da presente invenção, a varredura pode excluir motivos pequenos derepetição em tandem que possuem tamanho do período (por exemplo, peri-odicidade) de aproximadamente 24, 21, 18, 15, 12 ou 10 pares de base ou menos.
Em ainda uma outra concretização, bibliotecas de seqüências oude genomas de qualquer organismo podem ser rastreadas quanto a repeti-ções em tandem para descobrir epítopos que possam ser utilizados para osorodiagnóstico ou tratamento de doenças incluindo, entre outras, leishma-niose, tuberculose, infecção por HIV e câncer. Quando uma ou mais se-qüências de DNA, cDNA, RNA ou de aminoácidos de qualquer organismosão conhecidas, estas seqüências podem ser rastreadas quanto a repeti-ções em tandem. Conforme foi descrito acima, programas como TandemRepeats Finder podem ser utilizados para analisar e identificar seqüênciasincluindo repetições em tandem, as quais possivelmente compreendem epí-topos que são úteis no sorodiagnóstico ou tratamento de uma doença. Emuma concretização, o genoma de L. infantum é rastreado quanto à presençade repetições em tandem.
Em uma outra concretização, seqüências com repetições emtandem, identificadas de uma biblioteca de seqüências, são rastreadas sub-seqüentemente por exposição a uma amostra biológica de um indivíduo in-fectado ou suprimento de sangue para identificar seqüências de repetiçãoem tandem que possuem eficácia maior no sorodiagnóstico ou tratamento deuma doença.
Em ainda outra concretização, a unidade ou unidades de repeti-ção em tandem das seqüências identificadas são isoladas e utilizadas paraconstruir novas proteínas com uma ou mais unidades de repetição em tan-dem de uma ou mais seqüências de unidade de repetição em tandem. Porexemplo, entre outras possibilidades, proteínas construídas podem compre-ender uma única unidade de repetição em tandem, múltiplas unidades derepetição em tandem, ou ser uma proteína de fusão com uma ou mais uni-dades de repetição em tandem, sendo estas unidades de seqüências dife-rentes ou homólogas.
Exemplos de unidades de repetição em tandem, descobertasatravés destes e de outros métodos, são descritas em SEQ ID NO 1-59.
Em ainda uma outra concretização da presente invenção, as u-nidades de repetição em tandem ou seqüências repetidas em tandem, identi-ficadas pelos métodos supramencionados, são rastreadas subseqüentemen-te quanto à homologia com outras proteínas conhecidas ou desconhecidas.Confrme utilizado nesta exposição, o termo "menos homologia" refere-se aum subconjunto de uma ou mais seqüências que possuem menos homologiacom uma ou mais seqüências de referência, comparado a, pelo menos, umaseqüência no conjunto. Seqüências de referência podem ser, por exemplo,as seqüências de polipeptídeos de organismos que potencialmente infectamorganismos que são potencialmente infectados por Leischmania, ou orga-nismos que são potencialmente infecados por Leishmania. O rastreamentode homologia pode ser realizado pelos métodos de rastreamento de homo-logia descritos acima, ou pelos muitos métodos que são bem-conhecidos natécnica. Por exemplo, seqüências repetidas em tandem ou unidades de re-petição em tandem podem ser rastreadas, quanto à homologia, com parasi-tas conhecidos como Trypanosoma cruzi, os quais estão potencialmentepresentes em pacientes que estão sendo testados quanto a Leischamia. Pe-lo rastreamento de proteínas que não são homologas a proteínas nestesparasitas, é possível selecionar proteínas para fins farmacêuticos ou diag-nósticos, que terão mais especificidade para a doença sendo tratada ou emteste, a qual, neste exemplo, é leishmaniose. Pelo rastreamento de proteí-nas com alta especificidade para leishmaniose, falsos positivos e diagnósti-cos equivocados podem ser evitados.
Em ainda uma outra concretização, as unidades de repetição emtandem ou seqüências repetidas em tandem, identificadas pelos métodossupramencionados, são rastreadas subseqüentemente quanto à homologia,com outras proteínas conhecidas ou desconhecidas, em mamíferos, comocamundongo, cachorro ou ser humano, os quais são possíveis hospedeirosou hospedeiros de teste para Leishmania. O rastreamento quanto à baixahomologia com proteínas neste mamífero possibilita também que aplicaçõesfarmacêuticas e diagnosticas tenham mais especificidade para leishmaniose,e reduz ou elimina falsos positivos ou diagnósticos equivocados.
Em ainda outras concretizações, os métodos de rastreamentodescritos acima podem ser aplicados a qualquer doença.
Compostos e métodos para detecção de infeccão por Leishmania
Conforme foi descrito acima, a presente invenção expõe méto-dos de rastreamento e seleção de proteínas com repetição em tandem quesão eficazes na detecção de infecção por Leishmania, em amostra biológicaou organismo, compreendendo as etapas: (a) construção de biblioteca derastreamento de Leishmania; (b) varredura na biblioteca de rastreamento de Leishmania; e (c) análise dos genes identificados na varredura da bibliotecade rastreamento de Leishmania para selecionar genes com repetição emtandem. Polipeptídeos rastreados e selecionados por este e por outros mé-todos da presente invenção podem ser utilizados para várias aplicações,incluindo, entre outras, sistemas e métodos para detecção, tratamento, pre-venção, monitoramento e imunização contra infecção por Leishmania, emorganismo ou suprimentos de sangue.
De acordo com o mesmo, em outra concretização desta inven-ção, métodos são descritos para detecção e monitoramento de infecção porLeishmania, em indivíduos e suprimentos de sangue. Em geral, infecção porLeishmania pode ser detectada em qualquer amostra biológica que contenhaanticorpos. De preferência, a amostra é de sangue, soro, plasma, saliva, lí-quido cerebroespinhal ou urina. Mais preferivelmente, a amostra é de san-gue ou soro, obtida de um paciente ou de suprimento de sangue. Resumi-damente, a infecção por Leishmania pode ser detectada, utilizando um oumais polipeptídeos, proteínas de fusão ou outros polipeptídeos, conformediscutidos acima, com repetição em tandem, ou variantes destes. O único oumais polipeptídeos, proteínas de fusão ou outros polipeptídeos com repeti-ção em tandem são, então, utilizados para determinar a presença ou ausên-cia de anticorpos que são capazes de se ligarem especificamente ao poli- peptídeo ou polipeptídeos na amostra.
Polipeptídeos abrangidos pela presente invenção incluem, entreoutros, polipeptídeos compreendendo porções imunogênicas de antígenosde Leishmania, compreendendo as seqüências descritas em SEQ ID NO:1-59. Conforme utilizado nesta exposição, o termo "repetição em tandem" refe-re-se a uma região de DNA ou de uma proteína compreendendo uma se-qüência de 4 a quarenta 400 nucleotídeos ou aminoácidos repetidos em tan-dem, pelo menos, duas vezes. Conforme utilizado nesta exposição, o termo"unidade de repetição em tandem" refere-se a uma única unidade da se-qüência que é repetida em tandem.
Conforme utilizadas nesta exposição, referências a interações"de ligação" entre duas moléculas, como as que ocorrem entre um anticorpoe seu antígeno cognato, podem incluir ligação que pode ser, de acordo comteoria não Iimitante1 o resultado de uma ou mais interações eletrostáticas,interações hidrofóbicas, interações estéricas, forças de van der Waals, pon-tes de hidrogênio ou similares, ou outros tipos de interações que influenciamestes eventos de ligação, como ligação de um anticorpo a um polipeptídeo,ligação de um reagente de detecção a um complexo anticorpo/peptídeo, ouqualquer outra interação de ligação de moléculas, incluindo, em concretiza-ções preferidas, , interações de ligação específica, em que, em ligação "es-pecífica", a constante de afinidade, Ka, pode ser tipicamente inferior a apro-ximadamente 10-9 M, inferior a aproximadamente 10-8 M, inferior a aproxi-madamente 10-7 M, inferior a aproximadamente 10-6 M, inferior a aproxima-damente 10-5 M ou inferior a 10-4 M.
Há uma variedade de formatos de ensaio, conhecidos de qual-quer versado na técnica, que usam um polipeptídeo para detectar anticorposem uma amostra. Consultar, por exemplo, Current Protocols in Immunology(Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, publishers), e Harlow e Lane, Anti-bodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, os quaissão aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Em uma con-cretização preferida, o ensaio envolve o uso de um polipeptídeo (por exem-plo, um antígeno polipeptídico compreendendo uma ou mais unidades derepetição em tandem, conforme descritas no presente), imobilizado em su-porte sólido para ligar-se e remover o anticorpo da amostra. O anticorpo li-gado pode ser, então, detectado com um reagente de detecção que se ligaespecificamente ao complexo anticorpo/polipeptídeo, e que compreende umgrupamento de detecção imediata, como um grupo repórter que pode serdetectado. Reagentes adequados de detecção incluem anticorpos que seligam ao complexo anticorpo/polipeptídeo, e deixam o polipeptídeo marcadolivre com um grupo repórter (por exemplo, em ensaio semicompetitivo). Al-ternativamente, pode ser utilizado um ensaio competitivo, no qual um anti-corpo que se liga ao polipeptídeo é marcado com um grupo repórter e épermitido que se ligue ao polipeptídeo imobilizado, após incubação do poli-peptídeo com a amostra. A extensão na qual componentes da amostra ini-bem a ligação do anticorpo marcado com o polipeptídeo, é indicativa da rea-tividade da amostra com o polipeptídeo marcado.
O suporte sólido ao qual o polipeptídeo pode ser fixado pode serqualquer material conhecido por alguém versado na técnica. Por exemplo, osuporte pode ser uma cavidade de teste em uma placa de microtitulação oumembrana de nitrocelulose ou outra membrana adequada. Alternativamente,o suporte pode ser uma partícula ou disco, como de vidro, fibra de vidro, lá-tex ou de material plástico, como poliestireno ou cloreto de polivinila. O su-porte pode ser também uma partícula magnética ou sensor de fibra óptica,como aqueles descritos, por exemplo, na Patente U.S. N9 5 359 681.
O polipeptídeo pode ser unido ao suporte sólido, utilizando umavariedade de técnicas conhecidas de versados na técnica, as quais são am-plamente descritas na literatura de patentes e na científica. No contexto dapresente invenção, o termo "unida" refere-se a associação não-covalente,como adsorção, e fixação covalente (a qual pode ser ligação direta entre oantígeno e grupos funcionais no suporte ou pode ser uma ligação por meiode agente de ligação cruzada). A união por adsorção a uma cavidade, emplaca de microtitulação ou a uma membrana, é preferida. Nesses casos, aadsorção pode ser obtida por contato do polipeptídeo em tampão adequadocom o suporte sólido, por tempo adequado. O tempo de contato varia comtemperatura, porém é tipicamente entre aproximadamente 1 hora e 1 dia.Em geral, o contato em uma cavidade de placa de microtitulação plástica(como de poliestireno ou cloreto de polivinila) de uma quantidade de polipep-tídeo que varia de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 .mu.g, e,de preferência, aproximadamente 100 ng, é suficiente para unir uma quanti-dade adequada de antígeno. Nitrocelulose unirá aproximadamente 100.mu.g de proteína por cm.sup.3.
A fixação covalente de polipeptídeo a um suporte sólido podeser conseguida, geralmente, por reação inicial do suporte com um reagentebifuncional que reagirá com o suporte e um grupo funcional, como grupo hi-droxila ou grupo amino, no polipeptídeo. Por exemplo, o polipeptídeo podeser unido a um suporte com revestimento apropriado de polímero, empre-gando benzoquinona ou por condensação de grupo aldeído, no suporte, comuma amina e um hidrogênio ativo no polipeptídeo (consultar, por exemplo,Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (1991) em Α12-A13).
Em certas concretizações, o ensão é o ensaio imunoenzimáticode adsorvência (ELISA). Este ensaio pode ser realizado por contato inicialde um antígeno polipeptídico que foi imobilizado em suporte sólido, comu-mente a cavidade de placa de microtitulação, com a amostra, de forma queseja permitido a anticorpos contra o polipeptídeo, na amostra, liguem-se aopolipeptídeo imobilizado. Amostra não-ligada é removida, em seguida, dopolipeptídeo imobilizado, é um reagente capaz de se ligar ao complexo anti-corpo/polipeptídeo imobilizado é adicionado. A quantidade de reagente dedetecção que permanece ligada ao suporte sólido é determinada, em segui-da, empregando um método apropriado para o reagente de detecção especí-fico.
Uma vez imobilizado o polipeptídeo no suporte, os demais sítiosde ligação de proteína, no suporte, são tipicamente bloqueados. Qualqueragente bloqueador adequado conhecido de alguém versado na técnica, co-mo albumina sérica bovina (BSA) ou Tween 20.TM. (Sigma Chemical Co.,St. Louis, Mo.) pode ser empregado. O polipeptídeo imobilizado é incubado,em seguida, com a amostra, e é permitido que o anticorpo (se presente naamostra) se ligue ao antígeno. A amostra pode ser diluída com um diluenteadequado, como solução salina com tampão fosfato (PBS), antes de serconduzida a incubação. Em geral, tempo de contato apropriado (ou seja,tempo de incubação) é aquele período de tempo que é suficiente para permi-tir que seja detectada a presença de anticorpo na amostra infectada por Lei-shmania. De preferência, o tempo de contato é suficiente para atingir umnível de ligação de, pelo menos, 95% daquele atingido quando há equilíbrioentre anticorpo ligado e não-ligado. Qualquer versado na técnica reconhece-rá que o tempo necessário para atingir o equilíbrio pode ser rapidamentedeterminado por ensaio do nível de ligação que ocorre em um período detempo. Em temperatura ambiente, tempo de incubação de aproximadamente30 minutos é geralmente suficiente.
Amostra não-ligada pode ser, então, removida por lavagem dosuporte sólido com tampão apropriado, como PBS contendo 0,1% de Tween20TM. O reagente de detecção pode ser, então, adicionado ao suporte sóli-do. Reagente de detecção apropriado é qualquer composto que se liga aocomplexo anticorpo-polipeptídeo imobilizado e que pode ser detectado poruma variedade de meios conhecidos de versados na técnica. De preferência,o reagente de detecção contém um agente de ligação (como, por exemplo,Proteína A, Proteína G, imunoglobulina, Iectina ou antígeno livre), conjugadoa um grupo repórter. Grupos repórteres preferidos incluem enzimas (comoperoxidase de rábano), substratos, co-fatores, inibidores, corante, radionu-clídeos, grupos luminescentes, grupos fluorescentes e biotina. A conjugaçãode agente de ligação com um grupo repórter pode ser realizada empregandométodos convencionais conhecidos de qualquer versado na técnica. Agentescomuns de ligação pode ser também adquiridos conjugados a uma varieda-de de grupos repórteres de muitas origens (por exemplo, Zymed Laboratori-es, San Francisco, Calif. e Pierce, Rockford, III.).
O reagente de detecção é incubado, em seguida, com o comple-xo anticorpo-polipeptídeo imobilizado por tempo suficiente para detectar oanticorpo ligado. Quantidade apropriada de tempo pode ser determinadageralmente a partir das instruções do fabricante, ou analisando o nível deligação que ocorre durante um período de tempo. O reagente de detecçãonão-ligado é removido, em seguida, e o regente de detecção ligado é detec-tado, utilizando o grupo repórter. O método empregado para detecção dogrupo repórter depende da natureza do grupo repórter. Para grupos radioati-vos, métodos de contagem de cintilação ou autoradiográficos são geralmen-te apropriados. Métodos de espectroscopia podem ser utilizados para detec-tar corante, grupos luminescentes e grupos fluorescentes. Biotina pode serdetectada com avidina, acoplada a um grupo repórter diferente (comumenteum grupo radioativo ou fluorescente ou uma enzima). Grupos repórteres deenzimas podem ser detectados geralmente pela adição de substrato (geral-mente por período de tempo especificado), seguido por análise por espec-troscopia ou outra análise dos produtos da reação.
Para determinar a presença ou ausência de anticorpos anti-Leishmania na amostra, o sinal detectado, emitido pelo grupo repórter quepermanece especificamente ligado ao suporte sólido, é geralmente compa-rado a um sinal que corresponde a um controle apropriado, de acordo commetodologias aceitas pela técnica, por exemplo, um valor predeterminado delimite de corte. Em uma concretização preferida, o valor de limite de cortepode ser o sinal médio na média, obtido quando o polipeptídeo imobilizado éincubado com amostras de um paciente não infectado. Em geral, uma amos-tra que gera um sinal correspondente a três desvios-padrão, acima do valorpredeterminado de limite de corte, é considerado positivo (ou seja, reativocom o polipeptídeo). Em uma concretização alternativa preferida, o valor delimite de corte é determinado com Curva de Operador Receptor (ROC - Re-ceiver Operator Curve), de acordo com o método de Sackett et ai., ClinicaiEpidemiology: A Basic Science for Clinicai Medicine, p. 106-7 (Little Brownand Co., 1985). Resumidamente, nesta concretização, o valor de limite decorte pode ser determinado a partir de um gráfico de pares de taxas de posi-tivos verdadeiros (ou seja, sensibilidade) e taxas de positivos falsos (100%de especificidade) que correspondem a cada valor possível de limite de cortepara o resultado do teste diagnóstico. O valor do limite de corte, no gráfico,mais próximo do canto esquerdo superior (ou seja, o valor que engloba amaior área) é o valor de limite de corte mais preciso, e uma amostra que ge-ra um sinal acima do valor de limite de corte, determinado por este método,pode ser considerado positivo. Alternativamente, o valor de limite de cortepode ser deslocado para a esquerda, junto com o gráfico, para minimizar ataxa de falsos positivos, ou para a direita, para minimizar a taxa de falsosnegativos.
Em uma concretização relacionada, o ensaio é conduzido emformato de fluxo em membrana ou teste em fita, em que o antígeno (por e-xemplo, um ou mais polipeptídeos, compreendendo pelo menos uma unida-de de repetição em tandem) é imobilizado em suporte sólido, por exemplo,uma membrana como de nitrocelulose. No teste de fluxo em membrana, aamostra líquida é posta em contato com o suporte sólido, sob condições epor tempo suficiente, que permite que anticorpos, se presentes na amostra,se liguem especificamente ao polipeptídeo imobilizado, à medida que a a-mostra atravessa a membrana. Um reagente de detecção (por exemplo, pro-teína Α-ouro coloidal), pode estar presente no suporte sólido ou pode ser,alternativamente, aplicado, liga-se, então, ao complexo anticorpo-polipeptídeo, à medida que a solução contendo o reagente de detecção a-travessa a membrana. A determinação de reagente de detecção ligado podeser conduzida, em seguida, conforme descrito acima. Em certas concretiza-ções relacionadas do formado de teste em fita, uma extremidade de umamembrana de suporte sólido, à qual o antígeno polipeptídico está ligado, éimersa em uma solução contendo a amostra. A amostra migra junto com amembrana através de uma região contendo reagente de detecção e para aárea em que se encontra o antígeno polipeptídico imobilizado. A concentra-ção do reagente de detecção, na área do antígeno polipeptídico imobilizado,indica a presença de anticorpos contra Leishmania na amostra. Tipicamente,a concentração de reagente de detecção naquele local geral um padrão,como uma linha ou uma série de duas ou mais linhas, que pode ser interpre-tado visualmente. A ausência deste padrão indica resultado negativo. Emgeral, a quantidade de polipeptídeo imobilizado na membrana é selecionadade forma a gerar um padrão visualmente discernível quando a amostra bio-lógica contiver um nível de anticorpos que seria suficiente para gerar um si-nal positivo em um ensaio por ELISA, conforme discutido acima. De prefe-rência, a quantidade de polipeptídeo imobilizado na membrana varia de a-proximadamente 25 ng a aproximadamente 1 .mu.g e, mais preferivelmente,de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Estes testes podemser tipicamente realizados com quantidade muito pequena (por exemplo,uma gota) de soro ou sangue de pacientes.
Evidentemente, inúmeros outros protocolos de ensaio existemque são adequados para o uso com os polipeptídeos da invenção, e estessão bem-conhecidos daqueles que estão familiarizados com a técnica paradetectar a presença de um anticorpo que é capaz de se ligar especificamen-te a um antígeno polipeptídico em particular. As descrições acima se desti-nam a ser somente exemplos.
Sistemas e métodos de tratamento, prevenção e imunização contra Ieishmaniose
Conforme foi descrito acima, a presente invenção expõe méto-dos de rastreamento e seleção de proteínas com repetição em tandem quesão eficazes na detecção de infecção por Leishmania, em amostra biológicaou organismo, compreendendo as etapas: (a) construção de biblioteca derastreamento de Leishmania-, (b) varredura na biblioteca de rastreamento deLeishmania; e (c) análise dos genes identificados na varredura da bibliotecade rastreamento de Leishmania para selecionar genes com repetição emtandem. Conforme descritos nesta exposição, polipeptídeos rastreados eselecionados por este e por outros métodos da presente invenção podemser utilizados para várias aplicações, incluindo, entre outras, sistemas e mé-todos para detecção, tratamento, prevenção, monitoramento e imunizaçãocontra infecção por Leishmania, em organismo ou suprimentos de sangue.
De acordo com o mesmo, em certas características da presenteinvenção, descritas em detalhes abaixo, os polipeptídeos, epítopos antigêni-cos, unidades de repetição em tandem, seqüências imunogênicas, proteínasde fusão e/ou antígenos solúveis de Leishmania da presente invenção po-dem ser incorporados em composições farmacêuticas ou vacinas. A título declareza, o termo "polipeptídeo" será utilizado ao serem descritas concretiza-ções específicas das composições terapêuticas e métodos diagnósticos dainvenção; no entanto, será claro para qualquer versado na técnica que osepítopos antigênicos, polipeptídeos, unidades de repetição em tandem e pro-teínas de fusão da presente invenção podem ser empregados também nes-tas composições e métodos.
As composições farmacêuticas compreendem um ou mais poli-peptídeos, cada um dos quais podendo conter uma ou mais das seqüênciasacima (ou variantes destas), e um veículo fisiologicamente aceitável. As va-cinas, também referidas como composições imunogênicas, compreendemum ou mais dos polipeptídeos acima, e um imunoestimulador, como adju-vante (por exemplo, LbelF4A, interleucina-12 ou outras citocinas), ou umlipossomo (no qual o polipeptídeo é incorporado). Muitos adjuvantes contêmuma substância destinada a proteger o antígeno de catabolismo rápido, co-mo hidróxido de alumínio ou óleo mineral, e um estimulador de respostasimunes, como lipídeo A e proteínas derivadas de Bortadella pertussis ou My-cobacterium tuberculosis. Certos adjuvantes estão à disposição no mercadocomo, por exemplo, Adjuvante Incompleto e Adjuvante Completo de Freund(Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Adjuvante 65 da Merck (Merck and Com-pany, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKIine Beecham, Philadelphia, Pa.);sais de alumínio como hidróxido de alumínio (alum) ou fosfato de alumínioem gel; sais de cálcio, ferro ou zinco; suspensão insolúvel de tirosina adia-da; açúcares acilados; derivados de políssacarídeos catiônicos ou aniônicos;polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; monofosforil lipídeo A e quil A.Citocinas, como GM-CSF, interleucina-2, 7 e 12 e outros fatores de cresci-mento, podem ser utilizados também como adjuvantes.
Em certas concretizações da invenção, a composição adjuvanteé, de preferência, uma que induza resposta imune, predominantemente dotipo Th1. Em virtude de sua capacidade de induzir resposta imune exclusi-vamente do tipo Th1, o uso de LbelF4A, e variantes deste, como adjuvantenas vacinas da presente invenção, é particularmente preferido. Certos outrosadjuvantes preferidos para provocar resposta predominantemente do tipoTh1 incluem, por exemplo, Imiquimod, Res-lmiquimod, uma combinação demonofosforil lipídeo A, de preferência, 3-de-O-monofosforil lipídeo A acilado,junto com um sal de alumínio. Adjuvantes MPL.RTM. são fornecidos por Co-rixa Corporation (Seattle, Wash.; consultar, por exemplo, as Patentes Nos 4436 727, 4 877 611, 4 866 034 e 4 912 094). Oligonucleotídeos contendoCpG (nos quais o dinucleotídeo CpG não é metilado) induzem também res-posta predominantemente do tipo Th1. Estes oligonucleotídeos são bem-conhecidos e estão descritos, por exemplo, em WO 96/02555, WO 99/33488e Patente U.S. Nos 6 008 200 e 5 856 462. Seqüências de DNA imunoesti-muladoras são descritas também, por exemplo, por Sato Gt a/., SciGnce273:352, 1996. Outro adjuvante preferido compreende uma saponina, comoQuil A, ou derivados deste, incluindo QS21 e QS7 (Aquila Biopharmaceuti-cais Inc., Framingham, Mass.); Escina; Digitonina; ou saponinas de Gypso-phila ou Chenopodium quinoa. Outras formulações preferidas incluem maisde uma saponina nas combinações adjuvantes da presente invenção, porexemplo, combinações de, pelo menos, dois do grupo seguinte, compreen-dendo QS21, QS7, Quil A, .beta.-escina, ou digitonina.
Alternativamente, as formulações de saponina podem ser com-binadas com veículos de vacinas, compostos de quitosano ou outros políme-ros catiônicos, partículas polilactídeas e polilactídea-co-glicolídea, matriz depolímero à base de poli-N-acetil glicosamina, partículas compostas de polis-sacarídeos ou polissacarídeos modificados quimicamente, Iipossomas e par-tículas à base de lipídeos, partículas compostas por glicerol monoésteres,etc. As saponinas podem ser formuladas na presença de colesterol paraformar estruturas particuladas, como Iipossomas ou ISCOMs. Além disso, assaponinas podem ser formuladas junto com um polioxietileno éter ou éster,em solução não-particulada ou suspensão, ou em estrutura particulada, co-mo lipossomo paucilamelar ou ISCOM. As saponinas podem ser formuladastambém com excipientes como Carbopol.sup.R para aumentar viscosidade,ou podem ser formuladas em pó seco, com excipiente em pó como lactose.
Em uma concretização preferida, o sistema adjuvante inclui acombinação de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina, comoa combinação de QS21 e adjuvante 3D-MPL.RTM., conforme descrita emWO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica, em que o QS21 éinterrompido bruscamente com colesterol, conforme descrito em WO96/33739. Outras formulações preferidas compreendem emulsão óleo-em-água e tocoferol. Outra formulação adjuvante especialmente preferida, em-pregando QS21, adjuvante 3D-MPL.RTM. e tocoferol em emulsão de óleo-em-água, é descrita em WO 95/17210.
Outro sistema adjuvante melhorado envolve a combinação deoligonucleotídeo contendo CpG e um derivado de saponina, especialmente acombinação de CpG e QS21, descrita em WO 00/09159. De preferência, aformulação compreende adicionalmente uma emulsão óleo-em-água e toco-ferol.
Adjuvantes adicionais ilustrativos a serem utilizados nas compo-sições da invenção incluem Montanide ISA 720 (Seppic, França), SAF (Chi-ron, Calif., Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), a série SBASde adjuvantes (por exemplo, SBAS-2 ou SBAS-4, fornecidos por SmithKIineBeecham, Rixensart, Bélgica), EnhanZyn.TM. (Corixa, Hamilton, MT), RC- 529 (Corixa, Hamilton, Mont.) e outros aminoalquil glicosamina 4-fosfatos(AGPs), como aqueles descritos na Patente U.S. Nq 6 113 918 e pedido depatente pendente U.S. Nº de série09/074 720, cujos conteúdos, em sua tota-lidade, são aqui incorporados por referência neste pedido de patente, e ad-juvantes polioxietileno éter, como aqueles descritos em WO 99/52549A1.
Outros adjuvantes preferidos incluem aqueles com moléculas dafórmula geral (l):HO(CH.sub.20.CH.sub.20).n--A--R, em que, η é 1-50, A éuma ligação ou -C(O)--, R é C.sub.1-50 alquila ou Fenil C.sub.1-50 alquila.Uma concretização da presente invenção consiste em uma formulação devacina, compreendendo um polioxietileno éter da fórmula geral (I), em que η é entre 1 e 50, de preferência, 4-24, mais preferivelmente 9; o componente Ré C 1-50, de preferência, C.sub.4-C.sub.20 alquila e, o mais preferível,C.sub.12 alquila, e A é uma ligação. A concentração dos polioxietileno éteresdeve variar entre 0,1-20%, de preferência, de 0,1-10% e, o mais preferível,entre 0,1-1%. Polioxietileno éteres preferidos são selecionados do seguinte grupo: polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-9-esteoril éter, polioxietileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35-lauril éter, e polio-xietileno-23-lauril éter. Polioxietileno éteres, como polioxietileno Iauril éter,são descritos no índex da Merck (12ê edição: registro 7717). Estas molécu-las adjuvantes são descritas em WO 99/52549. O polioxietileno éter, de a-cordo com a fórmula geral (I) acima, pode, se desejado, ser combinado aoutro adjuvante. Por exemplo, uma combinação adjvante preferida contém,de preferência, CpG, conforme descrita no pedido de patente pendente UKGB 9820956.2.
As vacinas podem conter adicionalmente um veículo de libera-ção, como uma microesfera biodegradável (descrita, por exemplo, na Paten-te U.S. N9 4,897,268 e 5,075,109). Composições farmacêuticas e vacinasabrangidas pela presente invenção podem conter outros antígenos de Lei-shmania, quer incorporados em uma combinação de polipeptídeo ou presen-tes em um ou mais polipeptídeos separados.
Alternativamente, uma composição farmacêutica ou imunogêni-ca pode conter um imunoestimlar, como adjuvante (por exemplo, LbelF4A,interleucina-12 ou outras citocinas, ou DNA codificador destes promotores),e um polinucleotídeo (por exemplo, DNA) que codifica um ou mais polipeptí-deos ou proteínas de fusão, descritos acima, de forma que o polipeptídeo égerado in situ. Nestas composições, o DNA pode estar presente em qual-quer uma entre uma variedade de sistemas de liberação, conhecidos dequalquer versado na técnica, incluindo sistemas de expressão de ácido nu-cléico, sistemas de expressão bacterianos e virais. Sistemas de expressãode ácido nucléico adequados contêm as seqüências necessárias de DNApara expressão no paciente (como um promotor adequado e sinal de termi-nação). Sistemas de liberação bacterianos envolvem a administração deuma bactéria (como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expressa uma porçãoimunogênica do polipeptídeo em sua superfície celular.
Em uma concretização preferida, o DNA pode ser introduzidocom um sistema de expressão viral (por exemplo, vaccinia ou outro víruspox, retrovírus ou adenovírus) que pode envolver o uso de vírus não-patogênico (defeituoso) de replicação competente. Técnicas para incorpora-ção de DNA nestes sistemas de expressão são bem-conhecidos de qualquerversado na técnica. O DNA pode estar também "desprotegido", conformedescrito, por exemplo, por Ulmer et al., Science259:1745-1749 (1993) e re-visto por Cohen, Science 259:1691-1692 (1993). A absorção de DNA des-protegido pode ser aumentada, revestindo partículas biodegradáveis com oDNA, as quais são eficientemente transportadas para o interior das células.
Embora qualquer veículo adequado, conhecido de qualquer ver-sado na técnica, possa ser empregado nas composições farmacêuticas des-ta invenção, o tipo de veículo variará dependendo do modo de administra-ção. Para administração parenteral, como sob a forma de injeção subcutâ-nea, o veículo compreende preferivelmente água, solução salina, álcool, umlipídeo, cera ou tampão. Para administração oral, qualquer um dos veículosacima ou veículo sólido, como manitol, lactose, amido, estearato de magné-sio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose e carbonato de mag-nésio, podem ser empregados. Microesferas biodegradáveis (por exemplo,galactídeo poliláctico) podem ser empregadas também como veículos paraas composições farmacêutiacas desta invenção. Microesferas biodegradá-veis são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 4 897 268 e 5 075109.
Em uma concretização preferida, composições da presente in-venção incluem polipeptídeos múltiplos, selecionados de forma a conferiremproteção intensificada contra uma variedade de espécies de Leishmania.Estes polipeptídeos podem ser selecionados com base nas espécies de ori-gem do antígeno nativo ou com base em grau de conservação alto de se-qüência de aminoácidos entre espécies diferentes de Leishmania. Umacombinação de polipeptídeos individualizados pode ser especialmente eficazcomo vacina profilática e/ou terapêutica porque (1) a estimulação de prolife-ração e/ou produção de citocinas por combinação de polipeptídeos indivi-dualizados pode ser acumulativa, (2) a estimulação de proliferação e/ou pro-dução de citocinas por combinação de polipeptídeos individualizados podeser sinergística, (3) uma combinação de polipeptídeos individualizados podeestimular perfis de citocinas de maneira a se complementarem e/ou (4) poli-peptídeos individualizados podem se complementar quando alguns delessão expressos mais abundantemente nas espécies ou cepas individualiza-das da Leishmania responsável pela infecção. Uma combinação preferidacontém polipeptídeos com porções imunogênicas de M15, Ldp23, Lbhsp83,Lt-1 e LbelF4A. Alternativamente, ou em acréscimo, a combinação pode in-cluir um ou mais polipeptídeos com porções imunogênicas de outros antíge-nos de Leishmania descritos no presente, e/ou antígenos solúveis de Leish-mania.
Em uma outra concretização, composições da presente inven-ção incluem polipeptídeos únicos, selecionados de forma a fornecer prote-ção intensificada contra uma variedade da espécie de Leishmania. Um poli-peptídeo único pode ser especialmente eficaz como vacina profilática e/outerapêutica por aqueles motivos declarados acima para combinações de po-lipeptídeos individualizados.
Em uma outra concretização, composições da presente inven-ção incluem polipeptídeos individualizados e combinações dos polipeptídeosdescritos acima, empregados com uma variedade de adjuvantes, como IL-12(proteína ou DNA) para conferir resposta protetora contra uma variedade deespécies de Leishmania.
Em ainda uma outra concretização, composições da presenteinvenção incluem construções de DNA das várias espécies de Leishmania,empregados isoladamente ou em combinação com uma variedade de adju-vantes, como IL-12 (proteína ou DNÁ) para conferir resposta protetora contrauma variedade de espécies de Leishmania.
As composições farmacêuticas e vacinas acima podem ser utili-zadas, por exemplo, para induzir imunidade protetora contra Leishmania emum paciente, como ser humano ou um cachorro, para prevenir contra Ieish-maniose. Doses e métodos de administração apropriados, para essas finali-dades, são descritos em detalhes abaixo.
As composições farmacêuticas e imunogênicas descritas nopresente podem ser utilizadas também para estimular resposta imune, a qualpode ser celular ou humoral, em um paciente. Para pacientes infectados porLeishmania, as respostas imunes que podem ser geradas incluem respostaimune preferencial do tipo Th1 (ou seja, caracterizada pela produção dascitocinas interleucina-1, interleucina-2, interleucina-12 e/ou interferon-gama.,bem como fator de necrose tumoral alfa). Para pacientes não-infectados, aresposta imune pode ser a produção interleucina-12 e/ou interleucina-2, ou aestimulação de células T delta gama. Em qualquer uma destas categorias depacientes, a resposta estimulada pode incluir produção de IL-12. Estas res-postas podem ser provocadas também em amostras biológicas de PBMC oucomponentes destas, derivadas de indivíduos infectados ou não por Leish-mania. Conforme observado acima, ensaios para qualquer uma das citoci-nas podem ser geralmente conduzidos com métodos conhecidos de qual-quer versado na técnica, como ensaio imunoenzimático de adsorvência (E-LISA).
Composições farmacêuticas e vacinas a serem utilizadas nestacaracterística da presente invenção são aquelas que contêm, pelo menos,um polipeptídeo compreendendo uma porção imunogênica de um antígenode Leishmania descrito no presente (ou um variante deste). De preferência,os polipeptídeos empregados nas composições farmacêuticas e vacinas sãocomplementares, conforme descritos acima. Antígenos solúveis de Leish-mania, com ou sem polipeptídeos adicionais, podem ser empregados tam-bém.
As composições farmacêuticas e vacinas descritas no presentepodem ser utilizadas também para tratar um paciente acometido por umadoença que responda à estimulação de IL-12. O paciente pode ser qualqueranimal de sangue quente, como ser humano ou animal. Estas doenças in-cluem infecções (que podem ser, por exemplo, bacterianas, virais ou porprotozoário) ou doenças como câncer. Em uma concretização, a doença éleishmaniose, e o paciente pode exibir sintomas clínicos ou ser assintomáti-co. Em geral, o nível de resposta de uma doença em particular à estimula-ção de IL-12 pode ser determinado por avaliação do efeito do tratamentocom uma composição farmacêutica ou vacina da presente invenção por pa-râmetros clínicos que se correlacionam com imunidade. Por exemplo, se otratamento resultar em resposta elevada do tipo Th1 ou a conversão de perfilde Th2 para o de Th1, acompanhado por melhora clínica no paciente trata-do, a doença responde à estimulação de IL-12. A administração de polipep-tídeos pode ser conforme descrita abaixo, ou pode estender-se por períodode tempo mais longo, dependendo da indicação. De preferência, os polipep-tídeos empregados nas composições farmacêuticas e vacinas são comple-mentares, conforme descrito acima. Uma combinação especialmente prefe-rida contém polipeptídeos que compreendem porções imunogênicas deLmSTM, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 e LbelF4A, Lmspl a, Lmsp9a e TSA. Antíge-nos solúveis de Leishmania, com ou sem polipeptídeos adicionais, podemser empregados também.
Vias e freqüências de administração, bem como doses, para ascaracterísticas acima da presente invenção, variarão individualmente e po-derão ser iguais àquelas correntemente utilizadas em imunização contra ou-tras infecções, incluindo protozoários, vírus e bactérias. Em geral, as com-posições farmacêuticas e vacinas podem ser administradas por injeção (porexemplo, intracutânea, intramuscular, intravenosa ou subcutânea), por viaintranasal (por exemplo, por aspiração) ou via oral. Entre 1 e 12 doses po-dem ser administradas ao longo de um período de um ano. Para vacinaçãoterapêutica (ou seja, tratamento de indivíduo infectado), são administradasde preferência 12 doses, em intervalos de um mês. Para uso profilático, sãoadministradas de preferência 3 doses em intervalos de 3 meses. Em ambosos casos, vacinas de reforço podem ser administradas periodicamente de-pois do mesmo. Protocolos alternativos individuais podem ser apropriadospara pacientes. Uma dose adequada é uma quantidade de polipeptídeo oude DNA que, quando administrada conforme descrito acima, é capaz de in-duzir resposta imune em paciente imunizado, suficiente para protegê-lo con-tra Ieishmaniose por, pelo menos, 1-2 anos. Em geral, a quantidade de poli-peptídeo presente em uma dose (ou produzida in situ pelo DNA em uma do-se) varia de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 mg por kg dehospedeiro, tipicamente de aproximadamente 10 .mu.g a aproximadamente100 .mu.g. Tamanhos adequados de dose variarão com o tamanho do paci-ente, porém variarão tipicamente de aproximadamente 0,1 ml a aproxima-damente 5 ml.
Em uma outra característica, esta invenção provê métodos parauso de um ou mais polipeptídeos descritos acima para diagnóstico de infec-ção por Leishmania em um paciente, utilizando um teste cutâneo. Conformeutilizado nesta exposição, o termo "teste cutâneo" é qualquer ensaio realiza-do diretamente em um paciente, no qual uma reação de hipersensibilidadedo tipo tardia (DTH) (como enduração acompanhada de vermelhidão) é me-dida após injeção intradérmica de um ou mais polipeptídeos descritos acima.Esta injeção pode ser realizada com qualquer dispositivo adequado, suficien-te para o contato do polipeptídeo ou polipeptídeos com células da derme dopaciente, como uma seringa de tuberculina ou seringa de 1 ml. De preferên-cia, a reação é medida pelo menos 48 horas após a injeção, mais preferi-velmente, 72 horas após a injeção.
A reação de DTH é uma resposta imune mediada por célula, queé maior em pacientes que foram descritos previamente a teste com antígeno(ou seja, uma porção imunogênica de um polipeptídeo empregado, ou umvariante deste). A resposta pode ser medida visualmente com uma régua.Em geral, diâmetro de enduração maior do que aproximadamente 0,5 cm, depreferência maior do que aproximadamente 1,0 cm é resposta positiva, indi-cativa de infecção por Leishmania, a qual pode estar ou não manifestadacomo doença ativa.
Os polipeptídeos desta invenção são formulados, de preferência,para uso em teste cutâneo, sob a forma de composições farmacêuticas con-tendo, pelo menos, um polipeptídeo e um veículo fisiologicamente aceitável,conforme descritos acima. Estas composições contêm um ou mais dos poli-peptídeos acima em quantidade que varia de aproximadamente 1 .mu.g a100 .mu.g, de preferência, de aproximadamente 10 .mu.g a 50 .mu.g, emvolume de 0,1 ml. De preferência, o veículo empregado nestas composiçõesfarmacêuticas é solução salina com conservantes apropriados, como fenole/ou Tween .sub.80T.
Os polipeptídeos da invenção podem ser empregados tambémem combinação com um ou mais antígenos conhecidos de Leishmania nodiagnóstico de leishmaniose, utilizando, por exemplo, o teste cutâneo descri-to acima. De preferência, polipeptídeos individuais são escolhidos de manei-ra a se complementarem. Exemplos de antígenos conhecidos de Leishmaniaque podem ser empregados utilmente em associação aos polipeptídeos dainvenção incluem K39 (Bums et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993 90:775-779).Os exemplos seguintes são oferecidos a título de ilustração enão de limitação.
Exemplos
Exemplo 1: Parasita e infeccão de hamsters
Foram utilizados Leishmania infantum, Leishmania donovani,Leishmania major, Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi para in-fectar Hamsters e, produzir, pelo mesmo, soros infectados. Os hamsters fo-ram infectados por via intracardíaca com 1 x 107 promastigotos de Leishma-nia infantum, Leishmania donovani, Leishmania major, Leishmania amazo-nensis ou de Trypanosoma cruzi, em fase estacionária. Após oito a dozesemanas, os hamsters infectados foram sacrificados e os soros, coletados.
Exemplo 2: Soros de pacientes
O soro de pacientes sudaneses com Ieishmaniose visceral foicoletado de pacientes com doença ativa, diagnosticados clinicamente e comcomprovação parasitológica. Os soros de pacientes com leishmaniose cutâ-nea (Brasil), tuberculose (EUA) e malária (Brasil) foram coletados de pacien-tes bem-caracterizados, incluindo diagnóstico parasitológico (leishmaniosecutânea, malária) ou diagnóstico com cultura positiva (tuberculose). Sorosnormais foram obtidos de indivíduos saudáveis nos Estados Unidos.
Exemplo 3: Rastreamento sorolóqico de biblioteca de expressão de L. infan-tum
Foram realizadas a construção e varredura de biblioteca. Emresumo, DNA total de L infantum foi rompido por sonicação até um tamanhomédio de ~2 kb e extremidades fechadas com T4 DNA polimerase, seguidopela adição de adaptores EcoRI. O inserto foi ligado subseqüentemente novetor ZAP Express©, pré-digerido com EcoRI (Stratagene, La Jolla, CA) eembalado, empregando o Extrato de Embalagem Gigapack III© Gold (Stra-tagene). A biblioteca em fago foi amplificada e submetida à varredura, emseguida, de acordo com a instrução do fabricante, com soros agrupados dehamster infectado por L. infantum ou com soros agrupados de pacientes su-daneses com leishmaniose visceral, descritos acima. Foi efetuada a varredu-ra em aproximadamente 5 x 105 placas, empregando os soros em diluiçãode 1:100, e as placas imunorreativas foram detectadas com IgG de cabraanti-hamster conjugada à fosfatase alcalina ou IgG de cabra anti-humana(KPL, Gaithersburg, MD) e o substrato, BCIP/NBT (KPL). Vetores fagemí-deos PBK-CMV foram extraídos dos clones de fagos imunorreativos, de a-cordo com o protocolo do fabricante. Os insertos foram seqüenciados e ana-lisados, utilizando o banco de dados gênico de Leishmania infantum (Ge-neDB: The Wellcome Trust Sanger Institute, www.genedb.org).Exemplo 4: Análise qênica de repetição em tandem
Os genes identificados pela varredura foram analisados paradeterminar se eram genes com repetição em tandem. Tandem Repeats Fin-der, um programa para localizar e exibir repetições de seqüências em tan-dem em seqüências de DNA, foi utilizado para esta análise(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) (5). Como controle para os genes rastrea-dos, 108 genes, escolhidos aleatoriamente do banco de dados gênico de L.infantum, foram analisados também quanto à presença de motivos de repeti-ção em tandem. O programa calcula o resultado de acordo com a naturezados genes com repetição em tandem, tais como o tamanho do período darepetição, o número de cópias alinhadas com o padrão de consenso e o per-centual de combinações entre cópias adjacentes, no total. Neste estudo, osgenes foram considerados como genes com repetição em tandem se os re-sultados da análise pelo programa Tandem Repeats Finder fossem acima de500, sendo excluídos, dessa forma, genes contendo número pequeno demotivos de repetição em tandem, como os LinJ01.0470 e LinJ13.0810 (Ta-bela I).
Tabela I. Proteínas de L. infantum, identificadas por varredura sorolóqica
<table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table>
Os números de identificação em GeneDB são temporários e po-dem variar. Os tamanhos são apresentados em kDa. Os dados de PS, CN eresultado, na análise de TR, são obtidos de programa de análise utilizando oprograma Tandem Repeat Finder. Genes com repetição em tandem são a-presentados em negrito. Espaços em branco nas colunas de PS, CN e resul-tados representam que não foram encontradas repetições nos genes. PS:tamanho do período (pb) da repetição, CN: número de cópias alinhadas compadrão de consenso.
Exemplo 5: Análise por PCR e clonagem de genes com repetição em tan-dem
As seqüências repetidas em tandem de LinJI 6.1750,LinJ22.1590 ou LinJ33.2870 foram amplificadas por PCR, utilizando iniciado-res que correspondiam a ambas as extremidades de uma única cópia darepetição em tandem (as seqüências dos iniciadores são apresentadas naTabela II). Toda seqüência gênica de LinJ28.2310 foi amplificada por PCR eos iniciadores utilizados para esta reação são apresentados também na Ta-bela II. A fim de analisar se estes genes estão preservados ou não entre asespécies de Leishmania, o DNA total de L. infantum, L. donovani, L. major,L. amazonensis e de Trypanosoma cruzi foram utilizados como modelos.Como controle, um gene de T. cruzi (GenBank: XM_810936) foi amplificadopor PCR, utilizando o DNA de L. infantum e Trypanosoma cruzi como mode-los (a seqüência dos iniciadores é apresentada na Tabela II). Para a clona-gem dos genes para produção de proteínas recombinantes, o DNA total deL. infantum foi utilizado como modelo para as reações de PCR.Tabela II. Iniciadores utilizados neste estudo
<table>table see original document page 48</column></row><table>
Exemplo 6: Expressão de proteínas recombinantes
O produto de PCR1 correspondente a duas cópias de repetiçãoLinJ 16.1750 (LinJ16.1750r2), três cópias de repetição LinJ22.1590(LinJ22.1590r3), uma cópia de repetição LinJ33.2870 (LinJ33.2870r1) ou aogene completo de LinJ28.2310, foi inserido no sítio Ndel/BamHI ouNdel/EcoRI do vetor pET28. A seqüência dos insertos foi analisada em se-guida. Estes vetores pET28 foram transformados em E. coli Rosetta paraexpressão das proteínas recombinantes. A expressão das proteínas recom-binantes foi induzida por cultivo com isopropil-p-D-tiogalactosida a 1M. Asproteínas recombinantes foram purificadas em seguida, como proteínas 6xHis-tagged (com cauda de seis resíduos de histidina), empregando Ni-NTAagarose (Qiagen Inc., Valencia, CA). A pureza das proteínas foi avaliada porcoloração com azul de Coomassie, seguido por SDS-PAGE. As concentra-ções destas proteínas foram medidas por ensaio de proteínas com BCA (Pi-erce Biotechnology Inc., Rockford, IL).
Exemplo 7: Ensaio imunoenzimático de absorvência (ELISA)
rLinJ16.1750r2, rLinJ22.1590r3, rLinJ28.2310, rLinJ33.2870,rK39 ou antígeno de Iisado solúvel de promastigoto de L infantum (LiSLA)foram diluídos em tampão de revestimento para ELISA, e placas de 96 cavi-dades foram revestidas com rLinJ16.1750r2, rLinJ22.1590r3, rLinJ28.2310,rl_inJ33.2870 (200 ng), rK39 (50 ng) ou LiSLA (1 pg), seguido por bloqueiocom solução salina de tampão fosfato, contendo 0,05% de Tween-20 e 1%de albumina sérica bovina. A seguir, as placas foram incubadas com sorosde pacientes (diluídos em 1:100), bem como de controles saudáveis, e, emseguida com proteína G conjugada a peroxidase de rábano (Zymed Iaborato-ries, South San Francisco, CA). As placas foram desenvolvidas com substra-to de peroxidase TMB (KPL), e lidas por leitor de microplacas em compri-mento de onda de 450 nm.
Exemplo 8: Detecção de genes com repetição em tandem em genes rastre-ados sorolooicamente
Soros agrupados de hamster infectados por L. infantum ou depacientes sudaneses com Ieishmaniose visceral foram utilizados para varre-dura em uma biblioteca de expressão de L. infantum. Meio milhão de placasforam rastreados, abrangendo equivalentes genômicos ~x8 de L infantum.Fagemídeos PBK-CMV fo_ram extraídos de clones positivos; os insertos fo-ram seqüenciados e analisados utilizando GeneDB. No total, 43 genes foramindentificados como genes codificadores de antígenos de células B (TabelaI). Alguns dos genes codificaram antígenos previamente identificados, comoHSP70 e K39 (9, 20), porém a maioria codificou antígenos que não haviamsido previamente identificados.
Os genes identificados pela varredura foram analisados, em se-guida, pelo programa Tandem Repeats Finder. Neste estudo, um gene foiconsiderado como com repetição em tandem se fosse obtido o resultado daanálise de 500 ou mais alto, excluindo, desse modo, genes que continhamdomínios pequenos de repetição em tandem. Dos 43 genes identificados porvarredura sorológica, 19 foram identificados como genes com repetição emtandem (Tabela I). Por exemplo, LinJI6.1750 continha 8,7 cópias de umaseqüência com 219 pb e LinJ28.3170, 23,4 cópias de uma seqüência com60 pb. Com exceção de LinJ14.1160 (conhecido como rK39), estes genesforam genes recém-identificados que codificam antígenos para células B.Cento e oito genes, escolhidos aleatoriamente do banco de dados (3 genesde cada cromossomo), foram analisados também com o programa TandemRepeats Finder para comparar a prevalência de genes com repetição emtandem com a existente nos genes identificados por varredura. Ao contráriodos genes rastreados, não foram encontrados genes com repetições emtandem nos 108 genes escolhidos aleatoriamente.
Exemplo 9: Análise por PCR de genes com repetições em tandem
As amplificações por PCR foram realizadas com DNA total deespécies de Leishmania e T. cruzi para analisar se genes com repetições emtandem estavam preservados ou não entre esses parasitas. Utilizando con-juntos de iniciadores específicos para domínios de repetições em tandem deLinJ 16.1750 e LinJ22.1590, os produtos da PCR exibiram faixas em escada,correspondentes a uma ou múltiplas cópias da repetição (Figura 1). Estesgenes estavam preservados entre espécies de Leishmania porque padrõessimilares de faixas foram observados entre todas as quatro espécies testa-dos de Leishmania. Quando iniciadores de domínios de repetição em tan-dem de LinJ33.2870 foram utilizados, o produto resultante da PCR exibiutambém faixas com tamanhos que correspondiam a uma ou duas cópias darepetição em espécies de Leishmania, porém não em L. amazonensis (Figu-ra 1). Quando iniciadores do gene completo de LinJ33.2870 foram utilizados,foram constatadas uma faixa de 1,5 kb em L. infantum e L. donovani, e fai-xas de 2,1 kb e de 1,8 kb, em L. major e L amazonensis, respectivamente.Em todos os casos, não foram constatadas faixas em reações de PCR comDNA de T. cruzi. Por outro lado, foi encontrada uma única faixa de tamanhoesperado em T. cruzi, porém não em L. infantum, quando iniciadores paraum gene de T. cruzi foram utilizados para PCR. Dessa forma, enquanto quegenes com repetições em tandem não estão preservados entre Leishmaniae T. cruzi, eles estão bem-preservados entre Leishmania spp.
Exemplo 10: Reconhecimento de proteínas recombinantes com repetição emtandem por soro de pacientes com Ieishmaniose visceral
Para testar formalmente as proteínas identificadas com repetiçãoem tandem, como possíveis canditadas para diagnóstico, LinJI6.1750r2,LinJ22.1590r3, LinJ28.2310 e LinJ33.2870r1 foram avaliadas como proteí-nas recombinantes (Figura 2).A prevalência de anticorpos contra as proteínas recombinantes,em uma varredura preliminar com soro de dez pacientes sudaneses comIeishmaniose visceral, foi avaliada por ELISA. O soro de pacientes com Iei-shmaniose visceral exibiu reatividade significativamente mais forte, contratodas as proteínas recombinantes, do que soros dos grupos sem Ieishmani-ose visceral, isto é, de pacientes com tuberculose, malária e Ieishamiosecutânea ou de indivíduos saudáveis, apesar de o achado de que pacientescom Ieishmaniose cutânea exibiam respostas de anticorpo contra LiSLA (Fi-gura 3). Entre as proteínas testadas, rLinJ16.1750r2 foi o melhor antígeno,tendo sido fortemente reconhecido pelo soro de pacientes com Ieishmaniosevisceral com alto grau de especificidade. A seguir, rLinJ16.1750r2 foi testadacom soro adicional de pacientes sudaneses com Ieishmaniose visceral. En-tre 35 soros testados, 34 exibiram respostas de anticorpos contra r-LinJ16.1750r2 (usando como valor de corte a média + 3 DP de controlessaudáveis: Figura 4A). A sensibilidade com rLinJ16.1750r2 foi de 97%, com-parável àquela do rK39 (35/35, 100%: Figura 4A). Os valores médios deO.D. para rLinJ16.1750r2 e rK39 foram 1,159 e 1,771, respectivamente.
Embora estes 35 soros fossem 100% positivos com rK39, oitosoros exibiram baixa reatividade a rK39 (os valores de OD foram < 1,0: Figu-ra 4A). Essas oito amostras foram testadas, quanto à reatividade a r-LinJ16.1750r2, rLinJ22.1590r3, rLinJ28.2310 ou rLinJ33.2870r1, para exa-minar se aqueles antígenos poderiam ou não complementar rK39 para de-tecção mais sensível de anticorpos. Cinco dos oito soros exibiram respostasmelhores aos novos antígenos, do que a rK39 (N° 3-7 na Figura 4B). Cincopacientes (N° 3-7) exibiram respostas melhores a rLinJ22.1590r3, quatro (N°4-7) a rLinJ28.2310, e três (N° 3, 5 e 6) a rLinJ33.2870r1. rLinJ22.1590r3 foifracamente reconhecido por todos os oito soros, comparado a rK39.
Exemplo 11: Análise de Bioinformática por Computador para descoberta degenes com repetições em tandem
Seqüências de DNA de 8.191 genes de L. infantum foram obti-das do GeneDB de L. infantum(http://www.genedb.org/genedb/linfantum/index.jsp). Tandem Repeats Fin-der, um programa para localizar e exibir repetições de seqüências em tan-dem em seqüências de DNA, foi utilizado para esta análise(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html). O programa calcula o resultado de acordocom a natureza dos genes com repetição em tandem, tais como o tamanhodo período da repetição, o número de cópias alinhadas com o padrão deconsenso e o percentual de combinações entre cópias adjacentes, no total.Dessa forma, uma divulgação de um resultado alto, em análise gênica, signi-fica que o gene possui uma seqüência grande de repetição em tandem eque a repetição está altamente preservada entre as cópias. Um resultadobaixo significa o oposto; por exemplo, um resultado de um gene com 3,6 có-pias de repetição com 36 pb foi 111. Neste estudo, os genes foram conside-rados como com repetição em tandem se os resultados da análise pelo Tan-dem Repeats Finder fossem acima de 500, excluindo, dessa forma, genesque continham motivos pequenos de repetição em tandem. Empregandoesses parâmetros de varredura, os genes seguintes foram identificados apartir do GeneDb de L. infantum. (Tabela III).
Tabela III. Genes com TR de L. infantum , identificados pelo programa Tan-dem Repeats Finder
<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>
Os números seguintes correspondem aos números sobrescritos
na Tabela III: (1) Os números de identificação no GeneDB são temporários epodem variar; (2) C ou I significa se o gene é completo ou incompleto, res-pectivamente; (3) Os dados de PS, CN e resultado, na análise de TR, sãoobtidos de uma análise pelo programa Tandem Repeats Finder. Genes comTR são apresentados em negrito. Espaços em branco nas colunas de PS,CN e resultados representam que não foram encontradas repetições nosgenes. PS: tamanho do período (pb) da repetição, CN: número de cópiasalinhadas com o padrão de consenso; e (4) antigenicidade da proteína rela-tada no artigo referenciado.
Exemplo 12: Análise de composições de aminoácidos de proteínas com re-petição em tandem
Proteínas com repetição em tandem, codificadas pelos genescom repetição em tandem que foram identificados por análise de bioinformá-tica, foram analisadas quanto ao seu ponto isométrico e composições deaminoácidos, com o software, EditSeq (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Lisinae Arginina foram classificadas como aminoácidos fortemente básicos, ÁcidoAspártico e Ácido Glutâmico foram como aminoácidos fortemente ácidos,Asparagina, Cisteína, Glutamina, Serina, Treonina e Tirosina, como outros aminoácidos polares, e Alanina, Isoleucina1 Leucina, Fenilalanina, Triptofanoe Valina como aminoácidos hidrofóbicos. Domínios de repetição em tandemdas proteínas com repetições em tandem foram analisados da mesma ma-neira. Como controle, 108 genes, selecionados aleatoriamente do banco dedados gênico de L. infantum, foram analisados também quanto a pontos i- sométricos e composições de aminoácidos de suas seqüências deduzidasde aminoácidos.
Exemplo 13: Expressão de proteínas recombinantes
Seqüências codificadoras de domínios completos ou parciais derepetição em tandem de LinJ20.1220, LinJ25.1100 e LinJ32.3710 foram am- plificadas por PCR. Os produtos amplificados por PCR foram inseridos emsítios múltiplos de clonagem de pET28a, e a combinação das seqüênciasdos insertos com aquelas em banco de dados foi confirmada. Os vetorescom os insertos foram transformados e introduzidos em E. coli hospedeirode expressão, e as proteínas foram purificadas como proteínas 6x His- tagged (cauda com 6 resíduos de histidina), empregando Ni-NTA agarose(Qiagen Inc., Valencia, CA). As concentrações destas proteínas foram medi-das por ensaio de proteínas com BCA (Pierce Biotechnology Inc., Rockford,IL).
Exemplo 14: Reconhecimento de proteínas recombinantes com repetição emtandem por soro de pacientes com Ieishmaniose
Para avaliar a antigenicidade das proteínas com repetição emtandem, foi conduzida uma análise pela técnica ELISA com 200 ng de antí-geno por cavidade, em placas de 96 cavidades. O soro de pacientes comleishmaniose visceral (Sudão), Ieishmaniose cutânea (Brasil) e de indivíduos saudáveis (Estados Unidos) foi empregado em diluições de 1:100 para aanálise por ELISA.
O soro de pacientes com Ieishmaniose visceral exibiu reativida-de significativamente mais forte contra todas as proteínas recombinantes doque soros dos grupos sem Ieishmaniose visceral, isto é, de pacientes comtuberculose, malária e Ieishamiose cutânea ou de indivíduos saudáveis, a-pesar de o achado de que pacientes com Ieishmaniose cutânea exibiam res-postas de anticorpo contra LiSLA (Figura 6). Entre as proteínas testadas,rLinJ16.1750r2 foi o melhor antígeno, tendo sido fortemente reconhecidopelo soro de pacientes com Ieishmaniose visceral com alto grau de especifi-cidade. A seguir, rLinJ16.1750r2 foi testada com soro adicional de pacientessudaneses com Ieishmaniose visceral. Entre 35 soros testados, 34 exibiramrespostas de anticorpos contra rLinJ16.1750r2 (usando como valor de cortea média + 3 DP de controles saudáveis: Figura 6). A sensibilidade com r-LinJI 6.1750r2 foi de 97%, comparável àquela de rK39 (35/35, 100%: Figura6). Os valores médios de O.D. para rLinJ16.1750r2 e rK39 foram 1,159 e1,771, respectivamente.
Embora estes 35 soros fossem 100% positivos com rK39, oitosoros exibiram baixa reatividade a rK39 (os valores de OD foram < 1,0: Figu-ra 6). Essas oito amostras foram testadas, quanto à reatividade a r-LinJ16.1750r2, rLinJ22.1590r3, rLinJ28.2310 ou rLinJ33.2870r1, para exa-minar se aqueles antígenos poderiam ou não complementar rK39 para de-tecção mais sensível de anticorpos. Cinco dos oito soros exibiram respostasmelhores aos novos antígenos, do que a rK39 (N9 3-7 na Figura 6). Cincopacientes (Ne 3-7) exibiram respostas melhores a rLinJ22.1590r3, quatro (Ne4-7) a rLinJ28.2310, e três (Ns 3, 5 e 6) a rLinJ33.2870r1. Finalmente, r-LinJ22.1590r3 foi fracamente reconhecido por todos os oito soros, compara-do a rK39.
Exemplo 15: Análise por ELISA de proteínas com repetição em tandem, i-dentificadas por varredura sorolóqica e análise bioinformática
Proteínas recombinantes com repetição em tandem ou antígenode lisado solúvel de promastigoto de L. infantum (LiSLA) foram diluídos emtampão de revestimento para ELISA, e placas de 96 cavidades foram reves-tidas com rK39 (50 ng), outras proteínas recombinantes (200 ng) ou LiSLA (1pg), seguido por bloqueio com solução salina com tampão fosfato, contendo0,05% de Tween-20 e 1% de albumina sérica bovina. A seguir, as placasforam incubadas com soros de pacientes (n = 16), bem como de controlessaudáveis (n = 8) em diluição de 1:100 e, em seguida, com IgG anti-humanaconjugada com peroxidase de rábano (Rockland Immunochemicals, Inc.,Gilbertsville, PA). As placas foram desenvolvidas com substrato de peroxi-dase TMB (KPL), e lidas por leitor de microplacas em comprimento de ondade 450 nm (empregando 570 nm como referência).
Comparado a controles saudáveis, foram detectados níveis maisaltos de anticorpo ligado a proteínas com repetição em tandem, não só pro-venientes de varredura sorológica, mas também exclusivamente da análisebioinformática em pacientes com Ieishmaniose visceral (Tabela IV) (Figura6). Esse resultado demonstra que proteínas com repetição em tandem, nãosó provenientes de varredura sorológica, mas também identificadas exclusi-vamente por análise bioinformática, são antigênicas.
Tabela IV. Reatividade de proteínas com repetição em tandem de L. infan-tum em análise por ELISA
<table>table see original document page 57</column></row><table>Notas: aPS: extensão de uma cópia da repetição em unidadesde aminoácidos, CN: número de cópias. bValores médios de OD de pacien-tes LV (LV: η = 16) e controles saudáveis (CS: n=8). Valores ρ obtidos deanálise estatística com o teste de Mann-Whitney test. *P<0,05, **P<0,01.***P<0,001.
A partir do precedente, será apreciado que, apesar de concreti-zações específicas desta invenção terem sido descritas neste relatório des-critivo para fins ilustrativos, várias modificações podem ser efetuadas sem seafastar do espírito e abrangência da invenção. De acordo com o mesmo, ainvenção não é limitada, exceto pelas reivindicações anexadas.LISTAGEM DE SEQÜENCIA
<110> Infectious Disease Research Institute
Reed, Steven G.Goto, Yasuyuki
<120> COMPOSTOS E MÉTODOS PARA DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE LEISHMANIO-
SE
<130> IDRI-1-1001.2
<160> 121
<170> PatentIn verão 3.3
<210> 1<211> 39
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 1
SequenceName : LinJ03.0120
Gln Gln Arg Leu Val Thr Ala Ala Gln Gln Arg Ala Glu Leu Glu Ala1 5 10 15
Gln Val Ala Arg Leu Ala Ala Asp Arg Asp Glu Ala Arg Glu Gln Leu
20 25 30
Ala Ala Asn Ala Glu Glu Leu35
<210> 2<211> 38
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 2
SeguenceName : LinJ05.0380
Asp Pro Ala Met Tyr Asn Thr Thr Thr Lys Asp Ala Tyr Lys Lys Tyr1 5 10 15
Asp Pro Asp Ala Tyr Arg Arg Glu Leu Pro Ala Asp Asp Gly Glu Gly
20 25 30
Tyr Glu Lys Ala Pro Val<210> 3
<211> 76
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 3
SequenceName : LinJ09.0950
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Ala Leu Glu15 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Glu Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly65 70 75
<210> 4
<211> 46
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 4
SequenceName : LinJll.0070
Leu Arg His Gln Leu Ala Ala Gly Ala Asp Glu Gln Ala Gln Ala His15 10 15
Glu Ala Leu Arg Ala Glu Leu Ala Ala Ala Gln Ser Glu Arg Asp Asn
20 25 30
Ala Ala Gln Gln Ala Gln Arg His Ala Glu Glu Leu Glu Gln
35 40 45
<210> 5
<211> 21<212> PRT<213> Leishmania infantum
<400> 5
SequenceName : LinJ13.0780
Ala Ala Pro Ala Gly Glu Ala Gln Ala Ala Glu Glu Gln Glu Pro Ala1 5 10 15
Gly Ala Asp Thr Tyr20
<210> 6<211> 28<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 6
LinJl4.0370
Thr Pro Leu Arg Leu Glu Thr Ala Ser Gly Ala Asp Val Pro Thr Pro1 5 10 15
Ser Arg Leu Glu Ala Ala Ser Gly Ala Asp Val Ala
20 25
<210> 7
<211> 56
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 7
SequenceName : LinJ14.1180
Gln Leu Glu Lys Ala His Ala Lys Leu Glu Lys Ser Ser Ala Ala Leu1 5 10 15
Glu Gln Gln Val Ala Glu Trp Lys Thr Arg Ala Thr Ser Leu Asp Ala
20 25 30
Glu Arg Gly Asp Val Ser Glu Arg Leu Val Arg Leu Glu Gly Glu His
35 40 45
Ala Glu Leu Ala Arg Thr His Glu
50 55
<210> 8<211> 105
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 8
SeguenceName : LinJ14.1190Ala Leu Arg Gly Gln Leu Glu1 5
Gln Ser Glu Leu Glu Glu Lys20
Asp Ser Glu Ala Leu Arg Gly35
Glu Arg Leu Gln Ser Glu Leu
50 55
Ala Lys Glu Asp Asn Glu Ala65 70
Ala Glu Lys Glu Arg Leu Gln85
Ala Glu Ala Ala Lys Glu Asp100
<210> 9
<211> 161<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 9
SeguenceName : LinJ14.1210
Ala Asn Ala Glu Lys Glu Arg Leu Gln Ser Glu Leu Glu Glu Lys Gly1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ala Ala Lys Glu Asp Ser Glu Ala Leu Arg Gly Gln
20 25 30
Leu Glu Glu Thr Thr Gln Gln Leu Glu Glu Ala Asn Ala Glu Lys Glu
35 40 45
Arg Leu Gln Ser Glu Leu Glu Glu Lys Gly Ser Glu Ala Glu Ala Ala
Glu Ala Asn Ala Glu Lys Glu Arg Leu
10 15
Gly Ser Glu Ala Glu Ala Ala Lys Glu
25 30
Gln Leu Glu Glu Ala Asn Ala Glu Lys40 45
Glu Glu Lys Gly Ser Glu Ala Glu Ala60
Leu Arg Gly Gln Leu Glu Glu Ala Asn
75 80
Ser Glu Leu Glu Glu Lys Gly Ser Glu90 95
Ser Glu10550 55 60
Lys Glu Asp Ser Glu Ala Leu Arg Gly Gln Leu Glu Glu Thr Thr Gln65 70 75 80
Gln Leu Glu Glu Ala Asn Ala Glu Arg Glu Arg Leu Gln Ser Glu Leu
85 90 95
Glu Glu Lys Gly Ser Glu Ala Glu Ala Ala Lys Glu Asp Asn Glu Ala
100 105 110
Leu Arg Gly Gln Leu Glu Glu Thr Thr Gln Gln Leu Glu Glu Ala Asn
115 120 125
Ala Glu Arg Glu Arg Leu Gln Ser Glu Leu Glu Glu Lys Gly Ser Glu
130 135 140
Ala Glu Ala Ala Lys Glu Asp Asn Glu Ala Leu Arg Gly Gln Leu Glu145 150 155 160
Glu
<210> 10<211> 24
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 10
SeguenceName : LinJ14.1540
Ala Ser Glu Ala Ala Ser Glu Ser Glu Ala Gly Glu Glu Gly Leu Arg1 5 10 15
Arg Pro Ala Ala Ala Ser Glu Glu20
<210> 11<211> 35
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 11
SeguenceName : LinJ15.0490
Met Gly Thr Pro Val Asp Glu Ala Glu Arg Ala Leu Glu Ser Ala Leu1 5 10 15
Gln Gln Ala Gly Asp Ala Lys Glu Pro Ala Asp Arg Asp Ala Val Leu20 25 30
Glu Arg Ser35
<210> 12<211> 35
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 12
SequenceName : LinJ15.1570
Gln Arg Ala Leu Glu Ser Ala Leu Gln Gln Ala Gly Asp Ala Lys Glu15 10 15
Pro Ala Ser Arg Asp Ala Val Leu Glu Arg Ser Met Gly Thr Pro Val20 25 30
Asp Glu Thr35
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 13
SeguenceName : LinJ16.1540
Thr Glu Glu Thr Leu Gln Glu Thr Ser Ala Lys Leu Ala Asp
1 5 10
<210> 14
<211> 73
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 14
SeguenceName : LinJ16.1750
Tyr Pro Phe Leu Arg Leu His Glu Glu Glu Gly Trp Ala Glu Ala Leu1 5 10 15
Gly Ala Asp Glu Ala Phe Gln Gly Leu Ala Ala Glu Tyr Ala Asp Leu
20 25 30
Val Cys Asp Ala Arg Lys Asn Ala Ala Ala Leu Arg Ala Val Glu Asp
35 40 45
Ala Met Asn Glu Arg Gly Asp Ala Val Ala Ala Ala Leu Arg Arg Ala
50 55 60
Ala Ala Met Asp Glu Leu Ala Ser Arg65 70
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 15
SequenceName : LinJ18.1030His His His His His Arg His1 5
<210> 16<211> 27
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 16
SequenceName : LinJ19.1560
Ala Pro Gln Pro Ser Glu Ala Ala Pro Ala Ser Ala Val Glu Ala Leu1 5 10 15
Pro Pro Thr Pro Ala Glu Cys Ala Ser Glu Ala
20 25
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 17SequenceName : LinJ20.1220
Gln Ala Glu Asp Cys Asn Glu Ala Ala Pro Ala Glu Glu1 5 10
<210> 18<211> 64
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 18
SequenceName : LinJ21.2010
Glu Ala Glu Leu Asp Ala Ala Asn Ala Glu Leu Gln Ala Thr Arg Glu15 10 15
Ser Ala Ala Ala Ala Arg Pro Thr Arg Gly Asp Gly Asn Pro Phe Ala
20 25 30
Asp Ala Glu Asp Pro Phe Gly Gly Ser Ser Arg Val Ala Ala Pro Cys
35 40 45
Ala Asp Asp Gly Ala Leu Asp Ala Ala Arg Gln Arg Ile Ala Glu Leu
50 55 60
<210> 19
<211> 61<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 19
SequenceName : LinJ22.0410
Gly Val Ala Ala Glu Ala Ala Gly Ala Leu Ala Gln Leu Ala Glu Asp1 5 10 15
Arg Ala Ala Asp Met Ala Gln Ala Val Ser Ser Ala Glu Gly Gly Ser
20 25 30
Arg Ala Ala Leu Glu Ala Thr Glu Ala Ala Glu Arg Ala Glu Gln Glu
35 40 45
Arg Ala Cys Val Ala Ser Glu Glu Cys Ala Ala Arg Ala
50 55 60
<210> 20<211> 27
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 20
SequenceName : LinJ22.1510
Ala Pro Gln Pro Ser Glu Ala Ala Pro Val Ser Ala Val Glu Ala Leu1 5 10 15
Pro Pro Thr Pro Ala Glu Cys Ala Ser Glu Ala
20 25
<210> 21<211> 13
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 21
SeguenceName : LinJ22.1520
Asp Val Asn Val His Asn Thr Gln Thr Lys Met Tyr Ile1 5 10
<210> 22<211> 27
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 22
SequenceName : LinJ22.1550
Gln Pro Ser Glu Ala Ala Pro Ala Ser Ala Val Glu Ala Leu Pro Pro15 10 15
Thr Pro Ala Glu Cys Ala Ser Asp Ala Val Pro
20 25
<210> 23
<211> 89
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 23SequenceName : LinJ22.1560
Val Cys Leu His Ala Phe Arg Gly Cys Cys Arg Tyr Cys Val Gly Trp1 5 10 15
Leu Gln Thr Pro Leu Phe Val Asp Tyr Ile Phe Leu Ser Phe Ala Leu
20 25 30
Val Phe Tyr Ile Tyr Ser His Ser Phe Ser His Leu Pro Ile Tyr Leu
35 40 45
Phe Phe Pro Pro Ala Ala Leu Pro Leu Pro His Ser Leu Gly Ala Cys
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Pro -Leu Leu Ser Ile Pro Val Val Val Ala Ser Phe65 70 75 80
Gln Ile Val Phe Ser Lys Ile Lys Arg85
<210> 24
<211> 27
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 24
SequenceName : LinJ22.1570
Ala Pro Gln Pro Ser Glu Ala Ala Pro Val Ser Ala Val Glu Ala Leu1 5 10 15
Pro Pro Thr Pro Ala Glu Cys Ala Ser Glu Ala
20 25
<210> 25
<211> 89
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 25
SequenceName : LinJ22.1580
Cys Arg Leu Val Ser Asn Cys Phe Phe Glu Ser Gln Ala Cys Val Phe1 5 10 15
Ala Arg Leu Pro Trp Leu Leu Ser Leu Leu Arg Arg Leu Val Ala Asp20 25 30
Thr Ser Phe Arg Arg Leu Tyr Leu Ser Phe Leu Arg Pro Arg Leu Leu
35 40 45
His Leu Leu Pro Phe Val Leu Ser Ser Pro Tyr Ile Phe Val Phe Pro
50 55 60
Thr Arg Gly Ser Ser Ser Thr Ser Leu Pro Arg Cys Val Trp Trp Trp
65 70 75 80
Phe Ala Ser Leu Val Asp Ser Cys Ser
85
<210> 2 6<211> 28<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 26
SequenceName : LinJ22.1590
Ala Asp Leu Arg Glu Gln Leu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Ala Arg Asp
1 5 10 15
Val Glu Ala Gln Gln Cys Asp Arg Asp Ala Glu Val
20 25
<210> 27
<211> 22
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 27
SeguenceName : LinJ25.1100
Ala Glu Ser Val Ala Thr Ile Ser Ile Arg Glu Glu Pro Ser Glu Gly
1 5 10 15
His Arg Asp Asp Lys Val
20
<210> 28<211> 123<212> PRT<213> Leishmania infantum
<400> 28
SequenceName : LinJ25.1910
Ala Asp Val Pro Leu Ala Glu1 5
Pro Glu Asp Ala Gln Trp Ala20
Ala Lys Pro Ala Glu Asp Glu35
Lys Asp Ser Ala Ala Asp Ser
50 55
Asn Arg Leu Asp Ala Ala Ala65 70
Ser Asp Val Ala Asp Asp Ala85
Leu Pro Ser Lys Lys Ser Ser100
Ala Ala Gly Ser Arg Lys Ser115
<210> 29
<211> 16<212> PRT
<213> Leishinania infantum
<400> 29
SequenceName : LinJ26.2140
Ala Pro Gln Glu Ala Tyr Glu Gly Val Glu Glu Ala Asp Arg Ala Ala1 5 10 15
<210> 30
<211> 10<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 30
Glu His Glu Asp Gln Pro Glu Ala Tyr
10 15
Gly Glu Ala Leu Met Thr Thr Glu Asp
25 30
Asp Lys Tyr Ser Glu Asp Gly Phe Phe40 45
Ala Val Ala Ala Glu Pro Gln Leu Tyr60
His Asp Asp Asp Ala Val Lys Ala Lys
75 80
Tyr Asp Glu Asp Asn Phe Glu Asp Glu
90 95
Val Ala Ser Ser Ala Pro Arg Ser Pro
105 110
Asp Ala Ser Gly120SequenceName : LinJ27.0140Gln Gln Ala Glu Ala Glu Glu Ala Ala Arg1 5 10
<210> 31
<211> 10<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 31
SequenceName : LinJ27.0170
Ala Ala Arg Gln Gln Ala Glu Ala Glu Glu
1 5 10
<210> 32
<211> 68
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 32
SequenceName : LinJ27.0400
Arg Ala His Asp Leu Ala Cys Asp Lys Lys Trp Ala Asp Arg Asp Arg1 5 10 15
Val Leu Asp Pro Lys Pro Glu Gly Val Pro Leu Arg Cys Val Pro Leu
20 25 30
Asp Glu Asp Ala Glu Phe Val Ala Leu Glu Asp Glu Trp Arg Gly Leu
35 40 45
Leu Gln Asp Pro Gln Arg Asn Ser Met Pro Leu Lys Asp Leu Glu Arg
50 55 60
Arg Met Asn Asp65
<210> 33
<211> 105
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 33SequenceName : LinJ28.2310
Glu Glu Leu Gln Arg Gln Arg Glu Glu Glu Glu Lys Gln Arg Ile Glu1 5 10 15
Met Val Arg Lys Gln Arg Glu Glu Ala Gln Lys Lys Arg Glu Glu Ile
20 25 30
Gln Lys Gln Arg Glu Asp Glu Ile Lys Arg Arg Lys Ala Glu Ile Glu
35 40 45
Ala Glu Arg Gln Lys Leu Lys Glu Leu Gln Glu Glu His Glu Arg Glu
50 55 60
Gln Glu Glu Val Arg Gln Arg Arg Val Ala Glu Glu Lys Glu Ala Gln
65 70 75 80
Lys Arg Ala Glu Lys Lys Ala Glu Glu Val Glu Gly Glu Phe Ala Ala
85 90 95
Thr Arg Arg Gln Arg Lys Gly Glu Leu
100 105
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 34
SequenceName : LinJ28.3170
Ala Ala Pro Phe Lys Ser Ala Phe Gly Ala Val Ser Ala Pro Asp Ala1 5 10 15
Ala Lys Pro Ala20
<210>35
<211> 8
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 35
SequenceName : LinJ29.0110
Ala Glu Glu Gln Ala Arg Arg Val1 5
<210> 36
<211> 39
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 36
SequenceName : LinJ30.0400
Leu Glu Ala Ala Lys Ala Val Ala Asp Ala Arg Val Gln Glu Leu Glu1 5 10 15
Ala Ala Ala ,Ala Ser Ser Ala Glu Val Ala Ser Arg Leu Ala Ala Glu
20 25 30
His Ala Glu His Val Ala Gly35
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 37
SequenceName : LinJ31.1820
Ser Ser Ser Gly Ser Ala Gly Glu Val Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser1 5 10 15
Thr Ala Thr Thr Ala Glu Pro Thr Pro
20 25
<210> 38
<211> 8<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 38
SequenceName : LinJ31.1840Pro Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ala1 5
<210> 39<211> 152
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 39
SeguenceName : LinJ31.2660
Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Met Met Glu Ala Asp Ser Ala Val Ala Pro1 5 10 15
Asp Ala Ser Ala Ala Ser Arg Ser Asn Gly Gly Tyr Ser Val Gly Gly
20 25 30
Arg Ser Glu Thr Ser Val Gln Ser Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Met Met
35 40 45
Glu Ala Asp Ser Ala Val Ala Pro Asp Ala Gly Ala Ala Ser Arg Ser
50 55 60
Asn Gly Gly Tyr Ser Leu Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Met Met65 70 75 80
Glu Ala Asp Ser Ala Val Ala Pro Asp Ala Gly Ala Ala Ser Arg Ser
85 90 95
Asn Gly Gly Tyr Ser Val Gly Gly Arg Ser Glu Thr Ser Val Arg Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Tyr Gly Ser Met Met Glu Ala Asp Ser Ala Val Ala Pro
115 120 125
Asp Ala Gly Ala Ala Ser Arg Ser Asn Gly Gly Tyr Ser Leu Gly Gly
130 135 140
Arg Ser Glu Thr Ser Val Gln Ser145 150
<210> 40
<211> 10<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 40
SequenceName : LinJ31.3360
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ala Pro Thr1 5 10
<210> 41
<211> 50
<212> PRT
<213> Leishinania infantum
<400> 41
SequenceName : LinJ32.2730
Thr Ala Glu Arg Glu Gln His Glu Ser Arg Val Ala Glu Leu Gln Gln1 5 10 15
Gln Leu Glu Thr Glu Arg Asp Arg Ala Ala Ala Ser Gln Ser Thr Val
20 25 30
Glu Glu Arg Glu Ser Val Leu Gln Gln Arg Leu Ala Glu Leu Arg Thr35 40 45
Ser Met50
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 42
SequenceName : LinJ32.2780
Glu Glu Gln Ala Arg Leu Ala Arg Glu Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 33
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 43
SequenceName : LinJ32.3710
Ala Ala Pro Lys Arg Pro Leu Thr Ala Glu Gln Ile Ala Ala Glu Arg1 5 10 15
Ala Glu Leu Asp Arg Leu Glu Arg Glu Glu Leu Leu Ala Ser Glu Ala20 25 30
Thr
<210> 44
<211> 148
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 44
SeguenceName : LinJ33.2870
Glu Glu His Ala Pro Ala Leu Gln Arg Val..Gly Thr Pro Val Glu Pro1 5 10 15
Gln Pro Arg Leu Ala Val Thr Thr His Arg Val Arg Leu Asp Gly Asp20 25 30
Leu Trp Ala Arg Val Val Asp Glu Trp Pro Asp Leu Leu Lys Gln Glu35 40 45
Phe Thr Ser Asp Val Cys Asp Ala Thr Ala Leu Pro Arg Thr Ser Met50 55 60
Gln Arg Leu Val Leu Thr Ala Gly Ser Leu Val Ala Asp Phe Gln Leu65 70 75 80
Ser His Gly Gly Leu Ala Lys Arg Glu Leu Asn Lys Gln Leu Ala Ser85 90 95
Ser Pro Phe Thr Arg Thr Trp Ala Leu Tyr Glu Arg Val Ala Glu Thr100 105 110
Lys Glu Thr Pro Pro Thr Arg Ala Thr Pro Pro Ala Ala Leu Arg Ala115 120 125
Ser Glu Ser Phe Ala Ser Leu Asp Pro Val Glu Glu Ala Ala Val Leu130 135 140
Arg Ala Gln Gln145
<210> 45
<211> 111
<212> PRT<213> Leishmania infantum
<400> 45
SequenceName : LinJ34.0710
Gly Ala Gly Gly Gly Arg Asp Thr Gly Arg Arg Ala Ala Glu Gly Ala1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Glu Ala Glu Gly Arg Gln Pro Pro Ala Gly Gln Arg
20 25 30
Gln Arg Ala Ala Gly His Arg Ala Gly Glu Gly Ala Gly Gly Gly Arg
35 40 45
Glu Ala Gly Arg Arg Ser Arg Lys Gly Ala Gly Gly Gly Arg Asp Thr
50 55 60
Gly Gly Glu Leu Gln Lys Ala Gln Glu Asp Gly Glu Arg Gln Lys Ala65 70 75 80
Asp Asn Arg Gln Leu Ala Ser Asp Asn Glu Arg Leu Ala Thr Glu Leu
85 90 95
Glu Arg Ala Gln Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ala Gly Asp Leu Glu
100 105 110
<210> 46
<211> 83
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 46
SequenceName : LinJ34.2140
Arg Ala Glu Ala Glu Arg Leu Ala Lys Glu Val Ala Ala Phe Arg Ala1 5 10 15
Arg Arg Asn Ala Ala Leu Glu Ala Arg Asp Ala Asp Gly Thr Leu Pro
20 25 30
Val Pro Ala Arg Pro Val Pro Ala Gly Glu Ala Ala Glu Arg Ala Leu
35 40 45
Glu Pro Gln Gln Ile Ala Asp Glu Pro Leu Tyr Ala Val Thr Leu Glu
50 55 60
Glu Tyr Leu Gly Lys Asp Ala Ala Val Glu Gln Leu Ala Ala Glu Leu65 70 75 80
Glu Glu Gln
<210> 47
<211> 56
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 47
SequenceName : LinJ34.4250
Gln Glu Glu Ala Glu Arg Leu Ala Gly Asp Leu Glu Lys Ala Glu Glu15 10 15
Glu Ala Glu Thr Leu Ala Gly Glu Leu Gln Lys Ala Gln Glu Asp Gly
20 25 30
Glu Arg Gln Lys Ala Asp Asn Arg Gln Leu Ala Ser Asp Asn Glu Arg
35 40 45
Leu Ala Thr Glu Leu Glu Arg Ala
50 55
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 48
SeguenceName : LinJ35.0590
Pro Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ala15 10 15
<210> 49
<211> 45
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 49
SequenceName : LinJ35.0600
Pro Ala Ala Ala Pro Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg Leu Arg Arg Pro1 5 10 15
Ala Ala Ala Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Arg Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Ala Pro Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg Leu Arg Arg
35 40 45
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 50
SequenceName : LinJ35.0610
Gln Gln Gln Leu Arg Ala Val Gly Val Leu Val Val Cys Ala Val1 5 10 15
<210> 51
<211> 30
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 51
SequenceName : LinJ35.0620
Gln Gln Leu Arg Ala Val Gly Val Leu Val Val Cys Ala Val Gln Gln1 5 10 15
Gln Leu Arg Ala Val Gly Val Leu Val Val Cys Thr Val Gln
20 25 30
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 52
SequenceName : LinJ35.0630
Val Leu Val Val Cys Ala Val Gln Gln Gln Leu Arg Ala Val Gly1 5 10 15
<210> 53<211> 15
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 53
SequenceName : LinJ35.0640
Gln Leu Arg Ala Val Gly Val Leu Val Val Cys Ala Val Gln Gln15 10 15
<210> 54
<211> 47
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 54
SequenceName : LinJ35.1530
Leu Arg Ala Ile Ala Gln Ala Leu Gly Val Pro Pro Asp Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Gly Glu Arg Asp Gly Glu Cys Val Pro Thr Thr Gly Gln Leu Ala Glu
20 25 30
Arg Ala Gly Ala Val Val Ser Ala Arg Ala Glu Glu Thr Ala Gly35 40 45
<210> 55
<211> 42
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 55
SequenceName : LinJ35.1620
Ala Glu Gln Glu Ala Glu Met Val Ala Leu Arg Gln Leu Leu Ala Glu15 10 15
Ala Gln Arg Glu Ala Gln Ala Ala Gly Ala Arg Gln Arg Asp Ser Gly20 25 30
Ala Ala Val Gln Ala Leu Arg Asp Gln Met35 40
<210> 56<211> 55
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 56
SeguenceName : LinJ35.4500
Lys Pro Ser Pro Lys Gln Ala Pro Lys Lys Ala Pro Ile Ala Asp Ser1 5 10 15
Asp Ser Asp Asp Asp Glu Pro Val Arg Lys Pro Val Leu Ala Lys Lys
20 25 30
Pro Val Ala Asp Ser Ser Ser Asp Glu Glu Glu Ala Pro Lys Lys Pro
35 40 45
Ala Ala Lys Arg Pro Ser Pro
50 55
<210> 57
<211> 24
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 57
SequenceName : LinJ36.0320
Ser Ser Ser Asp Val Thr Thr Ala Ser Ser Ser Glu Gly Thr Thr Ala1 5 10 15
Ser Ser Ser Glu Gly Thr Thr Ala20
<210> 58
<211> 92
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 58
SeguenceName : LinJ36.5810
Glu Glu Arg Leu Glu Ala Ala Ser Ala Glu Gln Gln Gln Leu Gln Ala1 5 10 15
Asp Arg Asp Ala Lys Leu Arg Ala Ala Asp Glu Arg Leu Ala Gln Thr20 25 30
Ala Arg Gln Glu Leu Cys Asp Ser Val Ala Asp Ala Leu Ala35 40 45
Gly Ala Asp Ala Pro Ala Ser Pro Ser Val Ala Glu Ala Ile
50 55 60
Ala Ala Ala Asp Ala Ala Glu Arg Glu Arg Ala Leu Arg Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Glu Glu Arg Leu Gln Ala Met85 90
59
PRT
Leishmania infantum59
SequenceName : LinJl9.0940Val Cys Val Cys Val Cys Val Cys Val Cys 10
<210> 60<211> 117
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 60
SeguenceName : LinJ03.0120 DNA
cagcagcgcc tggtcacggc cgcgcagcag cgcgccgagc tggaggcaca ggtggcacggctggccgcgg accgcgacga ggcgcgcgag cagctggccg cgaacgccga ggagctg<210> 61<211> 114
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 61
SeguenceName : LinJ05.0380 DNA
gaccccgcca tgtacaacac gaccaccaag gacgcctaca agaagtacga ccccgacgcg
Ala Ala
Ala Leu
50Ala Arg65
Glu Val
<210><211><212><213><400>tacaggcgcg agctgccggc ggacgacggc gagggctacg agaaggcgcc cgtg 114
<210> 62
<211> 228
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 62
SequenceNaitie : LinJ09.0950 DNA
atgcagatct tcgtgaagac gctgaccggc aagacgatcg cgctggaggt ggagccgagc 60
gacacgatcg agaacgtgaa ggcgaagatc caggacaagg agggcatccc gccggaccag 120
cagcgcctga tcttcgccgg caagcagctg gaggagggcc gcacgctctc ggactacaac 180
atccagaagg agtccacgct gcacctggtg ctgcgcctgc gcggcggc 228
<210> 63
<211> 138
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 63
SequenceName : LinJll.0070 DNA
ctccgccacc agctggccgc cggcgcggac gagcaggcac aggcccacga ggccctccgc 60
gctgagctgg cggcggcgca gagcgagcgc gacaacgccg cgcagcaggc gcagcggcac 120
gcagaggagc tggagcag 138
<210> 64
<211> 63
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 64
SequenceName : LinJ13.0780 DNA
gccgcgccag ctggggaggc gcaggccgcg gaagagcagg agcctgctgg cgccgatacc 60tac 63
<210> 65
<211> 84
<212> DNA
<213> Leishmania infantum<400> 65
SequenceName : LinJ14.0370 DNA
acaccgctgc gtctcgagac agcctccggc gccgacgtgc cgactccctc gcgtctcgag 60
gcagcctccg gcgcagatgt cgcg 84
<210> 66
<211> 168
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 66
SequenceName : LinJ14.1180 DNA
cagctggaga aggcgcatgc gaagctggag aagtcgagtg ccgctctgga gcagcaggtg 60
gcggagtgga agacccgcgc cacgagcctg gacgctgagc gcggcgacgt gtcggagcgc 120
cttgtgcggc tggagggcga gcacgcggag ctggccagga cgcacgag 168
<210> 67
<211> 315
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 67
SequenceName : LinJ14.1190 DNAgcgctgcgcg gccagctgga ggaggcgaac gcggagaagg agcgcctgca gagcgagctg 60
gaggagaagg gctcggaggc cgaggccgcc aaggaggaca gcgaggcgct gcgcggccag 120
ctggaggagg cgaacgcgga gaaggagcgt ctgcagagcg agctggagga gaagggctcg 180
gaggcggagg ccgccaagga ggacaacgag gcgctgcgcg gccagctgga ggaggcgaac 240
gcggagaagg agcgtctgca gagcgagctg gaggagaagg gctcggaggc cgaggccgcc 300
aaggaggaca gcgag 315
<210> 68
<211> 483
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 68
SequenceName : LinJ14.1210 DNA
gcgaacgcgg agaaggagcg tctgcagagc gagctggagg agaagggctc ggaggccgag 60gccgccaagg aggacagcga ggcgctgcgc ggccagctgg aggagacgac ccagcagctg 120
gaggaggcga acgcggagaa ggagcgcctg cagagcgagc tggaggagaa gggctcggag 180
gcggaggccg ccaaggagga cagcgaggcg ctgcgcggcc agctggagga gacgacccag 240
cagctggagg aggcgaacgc ggagagggag cgtctgcaga gcgagctgga ggagaagggc 300
tcggaggccg aggccgccaa ggaggacaac gaggcgctgc gcggccagct ggaggagacg 360
acccagcagc tggaggaggc gaacgcggag agggagcgtc tgcagagcga gctggaggag 420
aagggctcgg aggccgaggc cgccaaggag gacaacgagg cgctgcgcgg ccagctggag 480
gag 483<210> 69
<211> 72
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 69
SequenceName : LinJ14.1540 DNAgcgtcggaag ccgcttcgga atccgaggcg ggggaagagg gtctgcgccg gcctgcggcg 60gcgtcggaag ag 72
<210> 70
<211> 105
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 70
SequenceName : LinJ15.0490 DNA
atgggcacgc ccgtcgacga ggcggagcgg gcgctggaga gcgctctgca gcaagccggc 60
gatgcgaagg agcccgccga ccgcgacgcc gtgctggagc ggtcg 105
<210> 71
<211> 105
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 71
SequenceName : LinJ15.1570 DNA
cagcgggcgc tggagagcgc tctgcagcaa gccggcgatg cgaaggagcc cgccagccgc 60
gacgccgtgc tggagcggtc gatgggcacg cccgtcgacg agacg 105<210> 72
<211> 42
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 72
SequenceName : LinJl6.1540 DNA
accgaggaga cgctgcagga gacgtccgcc aagctcgccg ac 42
<210> 73
<211> 219
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 73
SequenceName : LinJ16.1750 DNA
tacccgttcc tacggctgca cgaggaggag gggtgggcgg aagcgcttgg ggcggacgag 60
gcgttccagg gtcttgctgc ggagtacgcg gacctggtgt gcgatgcgag gaagaacgcc 120
gccgcgctgc gcgctgtgga ggacgcgatg aacgagcgcg gcgacgccgt tgcggccgcg 180ctgcggcgcg ctgctgcgat ggacgagctg gcgtcgcgc 219
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 74
SequenceName : LinJ18.1030 DNA
caccaccacc accaccgaca c 21
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 75SequenceName : LinJ19.0940 DNA
gtgtgcgtgt gcgtgtgcgt gtgcgtgtgc 30
<210> 76<211> 81
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 76
SeguenceName : LinJ19.1560 DNA
gcgccccagc cgagcgaggc ggcgccggcg tctgcagtgg aggctctgcc tccgacgcct 60gccgagtgcg catctgaggc g 81
<210> 77
<211> 39
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 77
SeguenceName : LinJ20.1220 DNA
caggctgagg attgcaacga ggccgcaccg gcagaggag 39
<210> 78
<211> 192
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 78
SeguenceName : LinJ21.2010 DNA
gaggcggagc tggatgcggc caatgctgag ctgcaggcta cccgcgagag tgccgctgct 60gcgcggccca cacgcggtga cgggaacccg ttcgccgacg ccgaggaccc gttcggcggc 120tcgtcgcgcg tcgctgcacc gtgtgcggac gacggggcgc tggatgctgc ccgccagagg 180atcgcggagc tg 192
<210> 79
<211> 183
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 79
SegueneeName : LinJ22.0410 DNA
ggcgttgctg cegaggeggc gggcgcgctg gcgcagctgg cggaggaccg cgcegeggae 60atggcgcagg ccgtgtcgag cgccgaggga ggcagccgcg ccgcccttga ggcaaccgag 120gccgccgagc gcgccgagca ggagcgcgct tgcgttgcgt cggaggagtg cgctgcgcgc 180gcc 183
<210> 80
<211> 81
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 80
SequenceNaine : LinJ22.1510 DNA
gcgccccagc cgagcgaggc ggcgccggtg tctgcagtgg aggctctgcc tccgacgcct 60
gccgagtgcg catctgaggc g 81
<210> 81
<211> 39
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 81
SequenceName : LinJ22.1520 DNA
gacgttaatg tacacaacac acaaacaaag atgtatata 39
<210> 82
<211> 81
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 82
SequenceName : LinJ22.1550 DNA
cagccgagcg aggcggcgcc ggcgtctgca gtggaggctc tgcctccgac gcctgccgag 60
tgcgcatccg acgccgtgcc a 81
<210> 83
<211> 267
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 83
SequeneeName : LinJ22.1560 DNA
gtgtgtttgc acgccttceg tggttgctgt cgttactgcg tcggttggtt gcagacacct 60cttttcgtcg actatatctt tctttctttc gccctcgtct tttacatcta ctcccattcg 120
ttctctcatc tccctatata tttgtttttc ccacccgcgg ctcttcctct acctcactcc 180
ctcggtgcgt gtggtggtgg ttcgcctctc ttgtcgattc ctgtagttgt cgcctcgttt 240
caaattgttt tttcgaaaat caagcgt 267
<210> 84
<211> 81
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 84
SequenceName : LinJ22.1570 DNA
gcgccccagc cgagcgaggc ggcgccggtg tctgcagtgg aggctctgcc tccgacgcct 60
gccgagtgcg catctgaggc g 81
<210> 85
<211> 267
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 85
SeguenceName : LinJ22.1580 DNA
tgtcgcctcg tttcaaattg ttttttcgaa agtcaagcgt gtgtgtttgc acgccttccg 60
tggttgctgt cgttactgcg tcggttggtt gcagacacct cttttcgtcg actatatctt 120
tctttccttc gccctcgtct tttacatcta ctcccattcg ttctctcatc tccctatata 180
tttgtttttc ccacccgcgg ctcttcctct acctcactcc ctcggtgcgt gtggtggtgg 240
ttcgcctctc ttgtcgattc ctgtagt 267
<210> 86
<211> 84
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 86
SeguenceName : LinJ22.1590 DNA
gctgacctga gggagcagct gcgtgaggcg gaggagcgcg cgagggacgt ggaggcgcag 60cagtgcgaca gggacgccga ggtg 84
<210> 87<211> 66
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 87
SequenceName : LinJ25.1100 DNA
gccgagagtg tcgccaccat ctccatacgg gaggagccca gcgaaggcca ccgggacgac 60
aaggta 66
<210> 88
<211> 369
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 88
SequenceName : LinJ25.1910 DNA
gccgatgtcc cgctggctga agagcacgag gaccagccgg aagcctatcc agaggatgcg 60
cagtgggctg gagaggcttt gatgaccacc gaggatgcga agccagcgga ggacgaggac 120
aagtacagcg aggacggctt cttcaaggat agcgccgcgg acagtgccgt cgcggcggaa 180
ccgcagctat acaatcggct ggatgccgcc gcccacgacg acgacgctgt gaaggccaag 240
agcgacgtag ccgacgacgc gtacgacgag gacaacttcg aggatgaact gccctccaag 300
aagtcgtcgg tggcctcgtc cgcgccgcga tcgccggccg cggggtcgag gaagagcgac 360
gcctcgggc 369
<210> 89
<211> 48
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 89
SequenceName : LinJ26.2140 DNA
gctccgcagg aggcgtacga gggcgtggag gaggctgacc gcgctgcc 48
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 90SequenceName : LinJ27.0140 DNA
cagcaggccg aggcggagga ggctgcccgc 30
<210> 91
<211> 30
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 91
SeguenceName : LinJ27.0170 DNA
gctgcccgcc agcaggccga ggcggaggag 30
<210> 92
<211> 204
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 92
SequenceName : LinJ27.0400 DNA
cgcgcgcacg accttgcgtg cgacaagaag tgggcggacc gcgacagggt gctggacccg 60
aagccggagg gcgtgccgct gcgctgcgtc ccgctggacg aggacgcgga gttcgtggcg 120ctggaggacg agtggcgcgg cctgctgcag gacccacagc gcaacagcat gccgctgaag 180gacctggaga ggaggatgaa cgac 204
<210> 93
<211> 315
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 93
SequenceName : LinJ28.2310 DNA
gaggagctgc agcgccagcg cgaggaggag gagaagcagc gcatcgagat ggtgcgcaag 60cagcgtgagg aggcccaaaa gaagcgggag gagatccaga agcagcgcga ggatgagatc 120aagcgccgca aggctgagat cgaagcagag aggcagaagc tgaaggagct gcaggaggag 180cacgagaggg agcaggagga ggtccgccag cgtcgcgtcg cggaggagaa ggaggcacag 240aagagggccg agaagaaggc cgaggaggtc gagggcgagt tcgctgcgac gcgccggcag 300aggaaggggg agttg 315
<210> 94<211> 60
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 94
SequenceName : LinJ28.3170 DNA
gctgcgccgt tcaagagcgc ctttggtgcc gtgtctgcac cggatgcggc caagcctgct 60
<210> 95
<211> 24
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 95
SequenceName : LinJ29.0110 DNA
gctgaggagc aggcgcgtcg cgtg 24
<210> 96
<211> 117
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 96
SequenceName : LinJ30.0400 DNActggaggccg cgaaggctgt ggctgacgcg agggtgcagg agctggaggc ggctgccgcg 60tcgagcgccg aggtggcgag caggctggcc gccgagcacg ctgagcacgt cgccggg 117
<210> 97
<211> 75
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 97
SequenceName : LinJ31.1820 DNA
agcagetceg gctcggccgg cgaggtgtcc gggtcgtcga gctcgagcac cgccacgacc 60geagagecga ctccg 75
<210> 98
<211> 24
<212> DNA<213> Leishmania infantum
<400> 98
SequenceName : LinJ31.1840 DNA
ccgacgacca cgacgaccga ggca 24
<210> 99
<211> 456
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 99
SequenceName : LinJ31.2660 DNA
cgcggcgggt acggcagcat gatggaggcc gacagcgctg tggccccaga cgcgagcgct 60
gcgtcgcgtt cgaatggcgg gtacagcgtt ggcgggcgca gcgagacgag cgtgcaatcg 120cgcggcgggt acggcagcat gatggaggcc gacagcgctg tggccccaga cgcgggcgct 180gcgtcgcgtt cgaatggcgg gtacagcctt ggcgggcgcg gcgggtacgg cagcatgatg 240gaggccgaca gcgctgtggc cccagacgcg ggcgctgcgt cgcgttcgaa tggcgggtac 300agcgttggcg ggcgcagcga gacgagcgtg cggtcgcgcg gcgggtacgg cagcatgatg 360gaggccgaca gcgctgtggc cccagacgcg ggcgctgcgt cgcgttcgaa tggcgggtac 420agccttggcg ggcgcagcga gacgagcgtg caatcg 456
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 100
SequenceNcime : LinJ31.3360 DNA
acaacgacca cgacgacaga ggcaccaacg 30
<210> 101<211> 150
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 101
SequenceName : LinJ32.2730 DNA
acagcggagc gcgagcagca cgagagccgg gtggcggagc tgcagcagca gctagagacg 60gagcgcgacc gcgcggctgc cagccagtct actgtggagg agcgcgagtc tgtgttgcag 120cagcgcctcg ccgagctgcg caccagtatg 150
<210> 102<211> 30
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 102
SequenceName : LinJ32.2780 DNA
gaggagcagg cacggctcgc ccgtgaggcg 30
<210> 103
<211> 99
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 103
SequenceName : LinJ32.3710 DNA
gcggccccga agcgcccgct cacggcggag cagattgcgg ctgagcgcgc tgagctggac 60
cggctggagc gcgaggagct gctggcctct gaggccacg 99
<210> 104
<211> 444
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 104
SequenceName : LinJ33.2870 DNA
gaggagcatg cgccagcgct gcagcgcgtc ggcacgccgg tggagccgca gccgcgcctc 60
gcggtcacga cacaccgggt tcgcctggac ggcgatttgt gggcgcgtgt cgtcgacgag 120
tggccggacc tgctcaagca ggagttcaca agcgacgtgt gcgatgccac ggcgctgccg 180
cggacgtcga tgcagcggct ggtgctcaca gccggcagcc tcgtcgccga cttccagctc 240
tcgcacggag gcctcgcgaa gagggagctg aacaagcagc ttgccagctc gcccttcacc 300
cgcacctggg cactgtacga gcgcgtcgcc gagacgaaag agacgccgcc cacccgcgcc 360
acgccgccgg ctgcccttcg cgcctcggag agcttcgcgt cgctggaccc ggtggaggag 420
gccgcagtgc tgcgtgcgca gcag 444
<210> 105<211> 335
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 105
SequenceName : LinJ34.0710 DNA
ggcgcaggag gaggccgaga cactggccgg cgagctgcag aaggcgcagg aggacgggga 60gaggcagagg gccgacaacc gccagctggc cagcgacaac gagcggctgg ccaccgagct 120ggagagggcg caggaggagg ccgagaggct ggccggcgat ctcgaaaagg cgcaggagga 180ggccgagaca ctggcggcga gctgcagaag gcgcaggagg acggggagag gcagaaggcc 240gacaaccgcc agctggccag cgacaacgag cggctggcca ccgagctgga gagggcgcag 300gaggaggccg agaggctggc cggcgatctc gaaaa 335
<210> 106
<211> 249
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 106
SequenceName : LinJ34.2140 DNA
agggcggagg cggagaggct tgcgaaggag gtggccgcct tccgcgcgag gcgcaacgcg 60gcgctggagg cccgcgacgc ggacggcacg ctgcccgtgc cggcaaggcc tgtgcccgcg 120ggcgaggcgg cggagcgcgc gctggagccg cagcagatcg ccgacgagcc gctgtacgct 180gtgacgctgg aggagtacct gggcaaggac gcggccgtgg agcagctggc ggcggagctg 240gaggagcag 249
<210> 107
<211> 168
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 107
SequenceName : LinJ34.4250 DNA
caggaggagg ccgagaggct ggccggcgat ctcgaaaagg cagaggagga ggccgagaca 60ctggcgggcg agctgcagaa ggcgcaggag gacggggaga ggcagaaggc cgacaaccgc 120cagctggcca gcgacaacga gcggctggcc accgagctgg agagggcg 168
<210> 108<211> 45
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 108
SeguenceName : LinJ35.0590 DNA
ccgtcggcgt cgtcgtcgtc tgcgccgtcc agcagcagct ccgcg 45
<210> 109
<211> 135
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 109
SequenceName : LinJ35.0600 DNA
ccagcagcag ctccgcgccg tcggcgtcct cgtcgtctgc gccgtccagc agcagctccg 60cgccgtcggc gtcgtcgtcg tctgcgccgt ccagcagcag ctccgcgccg tcggcgtcct 120cgtcgtctgc gccgt 135
<210> 110<211> 45
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 110
SeguenceName : LinJ35.0610 DNA
cagcagcagc tccgcgccgt cggcgtcctc gtcgtctgcg ccgtc 45
<210> 111<211> 90
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 111
SeguenceName : LinJ35.0620 DNA
cagcagctcc gcgccgtcgg cgtcctcgtc gtctgcgccg tccagcagca gctccgcgcc 60
gtcggcgtcc tcgtcgtctg caccgtccag 90
<210> 112<211> 45<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 112
SequenceName : LinJ35.0630 DNAgtcctcgtcg tctgcgccgt ccagcagcag ctccgcgccg tcggc 45
<210> 113
<211> 45
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 113
SequenceName : LinJ3 5.0640 DNA
cagctccgcg ccgtcggcgt cctcgtcgtc tgcgccgtcc agcag 45
<210> 114
<211> 141
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 114
SequenceName : LinJ35.1530 DNA
ctgcgcgcca tcgcccaggc cctcggcgtg ccgccggacg cgtacgctgg cgagcgggac 60
ggcgagtgcg tgccaacaac cggacagcta gcggagcgcg ctggcgctgt ggtgagcgcc 120cgcgctgagg agacggcggg g 141
<210> 115
<211> 126<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 115
SequenceName : LinJ35.1620 DNA
gcggagcagg aggcggagat ggttgcgctc cgccagctgc tggctgaggc acagcgcgag 60gcacaggccg ccggcgcaag acagcgcgac agtggcgccg ctgtgcaggc gctgcgcgac 120
cagatg 126
<210> 116<211> 165<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 116
SeguenceName : LinJ35.4500 DNAaagccttcgc caaagcaggc ccccaagaag gcccccatcg ccgacagcga cagcgacgac 60
gacgagcctg ttcgcaagcc ggtgctagcc aaaaagcctg tggcggactc gagctctgac 120gaggaggagg ctccgaaaaa gccggcggcg aagcgccctt ctccg 165
<210> 117
<211> 72
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 117
SequenceName : LinJ36.0320 DNA
agcagcagcg acgttaccac cgccagcagc agcgagggca ccaccgccag cagcagcgag 60ggcaccaccg cc 72
<210> 118<211> 276
<212> DNA
<213> Leishmania infantum
<400> 118
SequenceName : LinJ36.5810 DNA
gaggagcgcc tggaggcggc gagcgccgag cagcagcagc tgcaggcgga ccgcgacgcg 60aagctgcgtg ccgcggacga gcggctggcg cagacggcgg ctgcgcgcca ggagctgtgc 120gacagcgttg ccgacgcgct tgctgcgttg ggtgcggacg cgccggcgtc gccgtctgtc 180gcggaggcga ttgcgcgcgc ggccgccgat gccgcggagc gcgagcgtgc actgcgcgcc 240gaggtcgccg cggcggagga gcgcctgcag gcgatg 276
<210> 119
<211> 39
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 119
SequenceName : rK3 6Leu Glu Gln Gln Leu Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala1 5 10 15
Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp
20 25 30
Arg Glu Asn Thr Arg Ala Ala35
<210> 120<211> 14
<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 120
SequenceName : rK2 6
Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly Pro1 5 10
<210> 121<211> 10<212> PRT
<213> Leishmania infantum
<400> 121
SeguenceName : rLiA2
Val Gly Pro Gln Ser Val Gly Pro Leu Ser1 5 10

Claims (44)

1. Método de detecção de infecção por Leishmania em um indi-víduo, compreendendo:a) o contato de uma amostra biológica de um indivíduo com sus-peita de infecção por Leishmania com um ou mais polipeptídeos, em quecada um dos polipeptídeos compreende, pelo menos, uma unidade de repe-tição em tandem, em que a unidade de repetição em tandem compreendeuma seqüência de aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoácidos consecuti-vos, e com pelo menos, 70% de homologia, de uma seqüência de aminoáci-dos selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1-59, sob condiçõese por tempo suficiente para que ocorra ligação de um anticorpo na amostra;eb) detecção, na amostra biológica, da presença de um ou deuma pluralidade de anticorpos que se ligam especificamente ao polipeptídeoe, pelo mesmo, detecção de infecção por Leishmania na amostra biológica.
2. Método de detecção de infecção por Leishmania em uma a-mostra biológica de acordo com a reivindicação 1, em que o único ou maispolipeptídeos compreendem, cada um, pelo menos duas unidades de repeti-ção em tandem, em que cada unidade de repetição em tandem inclui umaseqüência de aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoácidos consecutivos, ecom pelo menos 70% de homologia, de uma seqüência de aminoácidos, se-lecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1-59.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosum ou mais polipeptídeos é uma proteína de fusão, compreendendo pelomenos uma primeira e uma segunda unidade de repetição em tandem, emque a primeira unidade de repetição em tandem compreende uma seqüenciade aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoácidos consecutivos, e com pelomenos 70% de homologia, de uma seqüência de aminoácidos, selecionadado grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-59; e a segunda unidade de repeti-ção em tandem compreende uma seqüência de aminoácidos com, pelo me-nos, 8 aminoácidos consecutivos, e com pelo menos 70% de homologia, deuma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo consistindo em SEQID NO: 1-59.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a primeiraunidade de repetição em tandem e a segunda unidade de repetição em tan-dem são idênticas.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a primeiraunidade de repetição em tandem possui, pelo menos, 8 aminoácidos conse-cutivos, e com pelo menos 70% de homologia, da segunda unidade de repe-tição em tandem.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, reivindicação 2 oureivindicação 3, em que uma unidade de repetição em tandem compreendeuma seqüência de aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoácidos consecuti-vos, e com pelo menos 70% de homologia, de uma seqüência de aminoáci-dos, selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 14, 17, 26, 27, 33,-43, 44.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, reivindicação 2 oureivindicação 3, em que infecção Ieishmaniose visceral clínica ou subclínicaé detectada, e em que, pelo menos, uma unidade de repetição em tandemcompreende uma seqüência de aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoáci-dos consecutivos, e com pelo menos 70% de homologia, de uma seqüênciade aminoácidos, selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 14, 26,-33, 44.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, reivindicação 2 oureivindicação 3, em que infecção Ieishmaniose visceral clínica ou subclínicaé detectada, e em que, pelo menos, uma unidade de repetição em tandemcompreende uma seqüência de aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoáci-dos consecutivos, e com pelo menos 70% de homologia, de uma seqüênciade aminoácidos, selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 17, 27,-43.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, reividicação 2 oureivindicação 3, em que o um ou mais polipeptídeos estão ligados a um su-porte sólido.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o um oumais polipeptídeos são ligados não-covalentemente a um suporte sólido.
11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o suportesólido compreende nitrocelulose, látex ou material plástico.
12. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a etapa dedetecção de um anticorpo ou pluralidade de anticorpos compreende:(a) remoção de amostra não-ligada do suporte sólido;(b) exposição do suporte sólido a um reagente de detecção; e(c) determinação de nível de ligação dos anticorpos ao suportesólido, em relação a um valor predeterminado de corte e detecção, pelomesmo, de infecção por Leishmania na amostra biológica.
13. Kit diagnóstico para detecção de infecção por Leishmaniaem amostra biológica, compreendendo:(a) um ou mais polipeptídeos, em que cada um dos polipeptí-deos compreende, pelo menos, uma unidade de repetição em tandem, emque a unidade de repetição em tandem compreende uma seqüência de ami-noácidos com, pelo menos, 8 aminoácidos consecutivos, e com pelo menos70% de homologia, de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconsistindo em: SEQ ID NO: 1-59; e(b) um reagente de detecção.
14. Kit diagnóstico de acordo com a reivindicação 13, compre-endendo ainda um polipeptídeo contendo, pelo menos, 8 aminoácidos con-secutivos, e com pelo menos 70% de homologia, de uma seqüência de ami-noácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 119.
15. Kit diagnóstico de acordo com a reivindicação 13, compre-endendo ainda um polipeptídeo contendo, pelo menos, 8 aminoácidos con-secutivos, e com pelo menos 70% de homologia, de uma seqüência de ami-noácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 119-121.
16. Proteína de fusão compreendendo, pelo menos, uma primei-ra e uma segunda unidade de repetição em tandem, em que a primeira uni-dade de repetição em tandem compreende uma seqüência de aminoácidoscom, pelo menos, 8 aminoácidos consecutivos, e com pelo menos 70% dehomologia, de uma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo consis-tindo em SEQ ID NO: 1-59; e a segunda unidade de repetição em tandemcompreende uma seqüência de aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoáci-dos consecutivos, e com pelo menos 70% de homologia, de uma seqüênciade aminoácidos, selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-59.
17. Polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo que éselecionado do grupo consistindo em (i) um polipeptídeo que compreende,pelo menos, uma unidade de repetição em tandem, em que a unidade derepetição em tandem compreende uma seqüência de aminoácidos com, pelomenos, 8 aminoácidos consecutivos, e com pelo menos 70% de homologia,de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em:SEQ ID NO: 1-59, (ii) um polipeptídeo que compreende, pelo menos, duasunidades de repetição em tandem, em que cada unidade de repetição emtandem compreende uma seqüência de aminoácidos com, pelo menos, 8aminoácidos consecutivos, e com pelo menos 70% de homologia, de umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: SEQ IDNO: 1-59, e (iii) um polipeptídeo que compreende uma proteína de fusãocompreendendo, pelo menos, uma primeira e uma segunda unidade de re-petição em tandem, em que a primeira unidade de repetição em tandemcompreende uma seqüência de aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoáci-dos consecutivos, e com pelo menos 70% de homologia, de uma seqüênciade aminoácidos, selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-59, eem que a segunda unidade de repetição em tandem compreende uma se-qüência de aminoácidos com, pelo menos, 8 aminoácidos consecutivos, ecom pelo menos 70% de homologia, de uma seqüência de aminoácidos, se-lecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-59.
18. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 17, compre-endendo uma seqüência de nucleotídeos com, pelo menos, 24 nucleotídeos,e com pelo menos 70% de homologia, de uma seqüência selecionada dogrupo consistindo em: SEQ ID NO: 60-118.
19. Vetor de expressão recombinante, compreendendo um poli-nucleotídeo como definido na reivindicação 18.
20. Célula hospedeira transformada com um vetor de expressãocomo definido na reivindicação 19.
21. Composição farmacêutica compreendendo um veículo fisio-logicamente aceitável e um ou mais polipeptídeos, em que cada um dos po-lipeptídeos compreende, pelo menos, uma unidade de repetição em tandem,em que a unidade de repetição em tandem compreende uma seqüência deaminoácidos com, pelo menos, 8 aminoácidos consecutivos, e com pelo me-nos 70% de homologia, de uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo consistindo em: SEQ ID NO: 1-59.
22. Composição farmacêutica compreendendo, pelo menos,uma proteína de fusão como definido na reivindicação 16 e um veículo fisio-logicamente aceitável.
23. Composição imunogênica compreendendo um imunoestimu-lador e um ou mais polipeptídeos, em que cada um dos polipeptídeos com-preende, pelo menos, uma unidade de repetição em tandem, em que a uni-dade de repetição em tandem compreende uma seqüência de aminoácidoscom, pelo menos, 8 aminoácidos consecutivos, e com pelo menos 70% dehomologia, de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consis-tindo em: SEQ ID NO: 1-59.
24. Composição imunogênica, compreendendo um imunoestimu-lador e uma ou mais proteínas de fusão como definido na reivindicação 16.
25. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 20ou 21, compreendendo ainda um veículo de liberação.
26. Método de indução de imunidade protetora contra Ieishmani-ose em um paciente, compreendendo a administração de uma composiçãofarmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 21 e 22.
27. Método de indução de imunidade protetora contra Ieishmani-ose em um paciente, compreendendo a administração de uma composiçãoimunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 23 e 24.
28. Método de rastreamento de polipeptídeos imunogênicos parao diagnóstico, tratamento ou imunização de um paciente ou suprimento desangue, compreendendo:(a) construir uma biblioteca de rastreamento de polinucleotídeos;(b) expressar produtos de expressão que estão presentes em (a);(c) rastrear o produto de expressão, presente na biblioteca derastreamento, pelo contato deste produto com uma amostra biológica; e(d) analisar seqüências identificadas, provenientes do rastrea-mento do produto de expressão, presente na biblioteca de rastreamento,para selecionar genes com repetições de seqüências em tandem e a sele-ção, pelo mesmo, de polipeptídeos imunogênicos que compreendem repeti-ções de seqüências em tandem.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, compreendendoainda a etapa de exclusão de polinucleotídeos com motivos de repetição emtandem que possuem 8 aminoácidos consecutivos ou menos, ao serem ana-lisados genes que foram identificados em varredura na biblioteca de rastre-amento, para selecionar genes com repetição em tandem.
30. Método de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que abiblioteca de rastreamento é construída a partir de L. Infantum.
31. Método de rastreamento de polipeptídeos imunogênicos parao diagnóstico, tratamento ou imunização de um paciente ou suprimento desangue, compreendendo:(a) selecionar uma ou mais seqüências de polipeptídeos ou se-qüência de polinucleotídeos;(b) analisar a única ou mais seqüências selecionadas ou a se-qüência de polinucleotídeos e selecionar seqüências que compreendam re-petição em tandem;(c) expressar as seqüências selecionadas de (b); e(d) rastrear um produto de expressão de (c), por exposição doproduto de expressão a uma ou mais amostras biológicas, obtidas de um oumais pacientes infectados por Leishmania, e selecionar, pelo mesmo, poli-peptídeos imunogênicos.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que os poli-peptídeos imunogênicos são utilizados para o diagnóstico ou tratamento, ouimunização contra leishamiose.
33. Método de acordo com a reivindicação 28, reivindicação 29,reivindicação 30, reivindicação 31 ou reivindicação 32, compreendendo ain-da a etapa de rastreamento dos polipeptídeos imunogênicos selecionadospor comparação da homologia das seqüências dos polipeptídeos imunogêni-cos selecionados com as seqüências de polipeptídeos de organismos quesão potencialmente infectados por Leishmania, e seleção, pelo mesmo, deum ou mais polipeptídeos que são, pelo menos, homólogos a polipeptídeosde organismos que são potencialmente infectados por Leishmania.
34. Método de acordo com a reivindicação 28, reivindicação 29,reivindicação 30, reivindicação 31 ou reivindicação 32, compreendendo ain-da a etapa de rastreamento dos polipeptídeos imunogênicos selecionadospor comparação da homologia das seqüências dos polipeptídeos imunogêni-cos selecionados com as seqüências de polipeptídeos de organismos quesão potencialmente infectam organismos que são potencialmente infectadospor Leishmania, e seleção, pelo mesmo, de um ou mais polipeptídeos quesão, pelo menos, homólogos a polipeptídeos de organismos que potencial-mente infectam organismos que são potencialmente infectados por Leish-mania.
35. Método de identificação de um polipeptídeo imunogênicopara diagnóstico, tratamento ou imunização em um paciente, compreenden-do:(a) expressar, em uma ou em uma pluralidade de células hospe-deiras, produtos de expressão de uma biblioteca de expressão de polipeptí-deos, a qual compreende um ou uma pluralidade de candidatos a polinucleo-tídeos codificadores de polipeptídeos imunogênicos, sendo que, pelo menosum destes é capaz de expressar um candidato a polipeptídeo imunogênicoque compreende uma repetição de seqüência em tandem, para obter umapopulação de células hospedeiras compreendendo produtos de expressão;(b) por em contato, sob condições e por tempo suficiente paraligação específica de, pelo menos, um anticorpo no material biológico com,pelo menos, um produto de expressão, (i) a população de células hospedei-ras compreendendo produtos de expressão de (a) com (ii) um material bioló-gico obtido de um indivíduo ou de fonte biológica que tenha sido infectadapor um organismo do gênero Leishmania, em que o material biológico com-preende, pelo menos, um anticorpo e é selecionado entre sangue, soro eurina.(c) detectar, pelo menos, uma célula hospedeira que compreen-da o, pelo menos, único produto de expressão ao qual o, pelo menos, únicoanticorpo liga-se especificamente;(d) isolar da célula hospedeira detectada em (c) um polinucleotí-deo que codifique o produto de expressão ao qual o, pelo menos, único anti-corpo liga-se especificamente para obter um polinucleotídeo isolado; e(e) analisar uma seqüência de nucleotídeos do polinucleotídeoisolado de (d), quanto à presença ou ausência de uma repetição em tandem,em que a presença de uma repetição em tandem indica que o polinucleotí-deo isolado codifica um polipeptídeo imunogênico e, a partir do mesmo, i-dentificar o polipeptídeo imunogênico.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a bibliote-ca de expressão de polinucleotídeo é construída a partir de seqüências deácido nucléico que são obtidas de um organismo selecionado entre um or-ganismo infeccioso e um organismo não-infeccioso.
37. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a bibliote-ca de expressão de polinucleotídeos é construída a partir de um organismoque causa leishmaniose.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o orga-nismo que causa leishmaniose é selecionado do grupo consistindo em Lei-shmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania major, Leishmania a-mazonensis, Trypanosoma cruzi, e uma cepa bacteriana natural ou não quecausa leishmaniose.
39. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a bibliote-ca de expressão de polinucleotídeo é construída a partir de um organismomicrobiano patogênico ou não-patogênico que é selecionado do grupo con-sistindo em bactéria, vírus, protozoário, fungo, levedura, diplomonoadida ecinetoplastídeo.
40. Método de identificação de um polipeptídeo imunogênicopara diagnóstico, tratamento ou imunização em um paciente, compreenden-do:(a) expressar, em uma ou em uma pluralidade de células hospe-deiras, produtos de expressão de uma biblioteca de expressão de polinucle-otídeos, a qual compreende um ou uma pluralidade de candidatos a polinu-cleotídeos codificadores de polipeptídeos imunogênicos, sendo que, pelomenos um destes é capaz de expressar um candidato a polipeptídeo imuno-gênico que compreende uma repetição de seqüência em tandem, para obteruma população de células hospedeiras compreendendo produtos de expres-são;(b) por em contato, sob condições e por tempo suficiente paraligação específica de, pelo menos, um anticorpo no material biológico com,pelo menos, um produto de expressão, (i) a população de células hospedei-ras compreendendo produtos de expressão de (a) com (ii) um material bioló-gico obtido de um indivíduo ou de fonte biológica que foi infectado por umorganismo infeccioso, em que o material biológico compreende, pelo menos,um anticorpo e é selecionado entre sangue, soro e urina.(c) detectar, pelo menos, uma célula hospedeira que compreen-da o, pelo menos, um produto de expressão ao qual o, pelo menos, um anti-corpo liga-se especificamente;(d) isolar da célula hospedeira detectada em (c) um polinucleotí-deo que codifique o produto de expressão ao qual o, pelo menos, um anti-corpo liga-se especificamente para obter um polinucleotídeo isolado; e(e) analisar uma seqüência de nucleotídeos do polinucleotídeoisolado de (d), quanto à presença ou ausência de uma repetição em tandem,em que a presença de uma repetição em tandem indica que o polinucleotí-deo isolado codifica um polipeptídeo imunogênico e, a partir do mesmo, i-dentificar o polipeptídeo imunogênico.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a bibliote-ca de expressão de polinucleotídeos é construída a partir de seqüências deácido nucléico que são obtidas de um organismo selecionado entre um or-ganismo infeccioso e um organismo não-infeccioso.
42. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a bibliote-ca de expressão de polinucleotídeos é construída a partir de um organismoque causa leishmaniose.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o orga-nismo que causa leishmaniose é selecionado do grupo consistindo em Lei-shmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania major, Leishmania a-mazonensis, Trypanosoma cruzi, e uma cepa bacteriana natural ou não quecausa leishmaniose.
44. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a bibliote-ca de expressão de polinucleotídeo é construída a partir de um organismomicrobiano patogênico ou não-patogênico que é selecionado do grupo con-sistindo em bactéria, vírus, protozoário, fungo, levedura, diplomonoadida ecinetoplastídeo.
BRPI0710155-4A 2006-04-10 2007-04-10 compostos e métodos para diagnóstico e tratamento de leishmaniose BRPI0710155A2 (pt)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79122606P 2006-04-10 2006-04-10
US60/791,226 2006-04-10
US74479806P 2006-04-13 2006-04-13
US60/744,798 2006-04-13
PCT/US2007/066338 WO2007121184A2 (en) 2006-04-10 2007-04-10 Compounds and methods for diagnosis and treatment of leishmaniasis
US11/733,440 US7833534B2 (en) 2006-04-10 2007-04-10 Compounds and methods for diagnosis and treatment of leishmaniasis
US11/733,440 2007-04-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0710155A2 true BRPI0710155A2 (pt) 2011-08-23

Family

ID=38575575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0710155-4A BRPI0710155A2 (pt) 2006-04-10 2007-04-10 compostos e métodos para diagnóstico e tratamento de leishmaniose

Country Status (4)

Country Link
US (3) US7833534B2 (pt)
BR (1) BRPI0710155A2 (pt)
WO (1) WO2007121184A2 (pt)
ZA (1) ZA200808363B (pt)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7833534B2 (en) 2006-04-10 2010-11-16 Infectious Disease Research Institute Compounds and methods for diagnosis and treatment of leishmaniasis
WO2009158729A2 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 The Infectious Disease Research Institute Inc. Compounds and methods for diagnosis and treatment of chagas disease
BRPI0913972B1 (pt) 2008-07-03 2018-06-26 Infectious Disease Research Institute Polipeptídeo de fusão compreendendo antígenos de leishmania, polinucleotídeo, composição farmacêutica, bem como métodos para detecção de infecção e para identificação de leishmaniose e kit diagnóstico para detecção e identificação de leishmaniose
BRPI0900961B8 (pt) * 2009-03-23 2021-07-13 Fundacao Oswaldo Cruz métodos e kit para diagnóstico de leishmaniose
US9804159B2 (en) 2010-10-15 2017-10-31 Purdue Research Foundation Immunoreactive antigens of Mycoplasma haemofelis and diagnostic immunoassay
EP2756850A1 (en) * 2013-01-18 2014-07-23 Philipps-Universität Marburg Diagnosis of Leishmania infection
US9909114B2 (en) 2013-03-28 2018-03-06 Infectious Disease Research Institute Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis
EP4215916A1 (de) * 2022-01-20 2023-07-26 Philipps-Universität Marburg Test zum nachweis von antikörpern gegen leishmanien

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5411865A (en) 1993-01-15 1995-05-02 Iasys Corporation Method of detecting anti-leishmania parasite antibodies
WO1995006729A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Mcgill University Differentially expressed leishmania genes and proteins
US6013268A (en) 1994-04-22 2000-01-11 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
PT804581E (pt) 1994-04-22 2002-02-28 Corixa Corp Compostos e metodos para a estimulacao e reforco das respostas imunitarias protectoras e da producao de il-12
US5879687A (en) 1994-04-22 1999-03-09 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
US5876735A (en) 1994-04-22 1999-03-02 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
US5756662A (en) * 1995-03-14 1998-05-26 Corixa Corporation Compounds and methods for the detection of T. cruzi infection
CA2215536A1 (en) 1995-03-17 1996-09-26 Du Pont Pharmaceuticals Company Cyclic urea hiv protease inhibitors
US5912166A (en) 1995-04-21 1999-06-15 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of leishmaniasis
US5965142A (en) 1995-08-04 1999-10-12 Corixa Corporation Polypeptides and methods for the detection of L. tropica infection
US6500437B1 (en) 1995-09-22 2002-12-31 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
US6613337B1 (en) 1997-02-12 2003-09-02 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
US6638517B2 (en) * 1995-09-22 2003-10-28 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
US6375955B1 (en) 1995-09-22 2002-04-23 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
US6607731B1 (en) 1995-09-22 2003-08-19 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
US6365165B1 (en) 1995-09-22 2002-04-02 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of Leishmaniasis
US5834592A (en) 1995-09-22 1998-11-10 Corixa Corporation Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of Leishmaniasis
US7833534B2 (en) 2006-04-10 2010-11-16 Infectious Disease Research Institute Compounds and methods for diagnosis and treatment of leishmaniasis
EP2170372A1 (en) 2007-07-13 2010-04-07 Infectious Disease Research Institute Leishmania sterol 24-c-methyltransferase compositions for the prevention, treatment and diagnosis of leishmaniasis
US8410258B2 (en) 2008-05-21 2013-04-02 Infections Disease Research Institute Recombinant polyprotein vaccines for the treatment and diagnosis of leishmaniasis
BRPI0912768A2 (pt) 2008-05-21 2016-05-17 Infectious Disease Res Inst vacinas de poliproteínas recombinante para o tratamento e diagnóstico de leishmaniose
BRPI0913972B1 (pt) 2008-07-03 2018-06-26 Infectious Disease Research Institute Polipeptídeo de fusão compreendendo antígenos de leishmania, polinucleotídeo, composição farmacêutica, bem como métodos para detecção de infecção e para identificação de leishmaniose e kit diagnóstico para detecção e identificação de leishmaniose
EA201390676A1 (ru) 2010-11-08 2013-11-29 Инфекшес Дизиз Рисерч Инститьют Вакцины, содержащие полипептиды неспецифической нуклеозидгидролазы и стерол 24-c-метилтрансферазы (smt), для лечения и диагностики лейшманиоза

Also Published As

Publication number Publication date
US20110280902A1 (en) 2011-11-17
US20150072354A1 (en) 2015-03-12
US20070237794A1 (en) 2007-10-11
US8865180B2 (en) 2014-10-21
WO2007121184A9 (en) 2008-03-06
US7833534B2 (en) 2010-11-16
ZA200808363B (en) 2009-12-30
WO2007121184A2 (en) 2007-10-25
WO2007121184A3 (en) 2008-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20150072354A1 (en) Compounds and methods for diagnosis and treatment of leishmaniasis
EP2291394B1 (en) Fusion proteins and their use in the diagnosis and treatment of leishmaniasis
US8916168B2 (en) Leishmania sterol 24-c-methyltransferase compositions for the prevention, treatment and diagnosis of leishmaniasis
EP2462160A1 (en) Porphyromonas gingivalis polypeptides
US20120316209A1 (en) Diagnostic assay for trypanosoma cruzi infection
CN101466831A (zh) 用于诊断和治疗利什曼病的化合物和方法
KR101881947B1 (ko) 기생충 질병에 대한 백신 또는 진단용으로 사용되는 ｌ3 및/또는 ｌ5 공급원의 용도
US20090325204A1 (en) Compounds and methods for diagnosis and treatment of chagas disease
US10086057B2 (en) Stage specific diagnostic antigens, assay and vaccine for lyme disease
MX2010009516A (es) Secuencias novedosas de brachyspira, composiciones inmunogenicas, metodos para la preparacion y usos de las mismas.
EP3761029A1 (en) A novel assay for the diagnosis of nematode infections
BR102013022374A2 (pt) gene modificado de leishmania ssp., processo para obtenção de proteína e uso como antígeno em composição vacinal ou em imunodiagnóstico
BR102019004148A2 (pt) Polipeptídeo ligbnid de leptospira spp. para uso como imunobiológico
WO2017103909A1 (pt) Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana, e uso
BRPI1006638A2 (pt) peptÍdeos marcadores das fases clÍnicas da neurocisticercose

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according art. 34 industrial property law
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law
B08F Application fees: dismissal - article 86 of industrial property law
B07E Notice of approval relating to section 229 industrial property law

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B08K Lapse as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi (acc. art. 87)