BRPI0710179A2 - uso de um inibidor de quinase para o tratamento de tumores resistentes particulares - Google Patents
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Abstract
<B>USO DE UM INIBIDOR DE QUINASE PARA O TRATAMENTO DE TUMORES RESISTENTES PARTICULARES<D> A presente invenção provê compostos de baixo peso molecular, nomeadamente, tetrahidropirrol [3, 4-c] pirazoles, mostrando alta afinidade para uma sitio ATP da tirosinoquinase ABL. Estes compostos são, por conseguinte, inibidores de tirosinoquinase competitivos ATP que também exibem uma potência inibidora significativa, e em particular, para o inibidor resistente aos mutantes de BCR- ABL da ABL T3151. Os compostos da invenção encontram aplicação no tratamento das doenças mediadas ABL inibidor resistente BCR-ABL, tal como leucemia mielogenosa crónica resistente a Imatinibe. Além disso, a invenção provê um método de rastreamento para a identificação de compostos capazes de ligar o sítio ATP de uma proteína de quinase, particularmente da quinase ABL do mutante T3151.
Description
USO DE UM INIBIDOR DE QUINASE PARA O TRATAMENTO DETUMORES RESISTENTES PARTICULARES
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se relaciona ao tratamento dedoenças mediadas pela ABL transformadas através do uso depequenas moléculas inibidoras de quinase competitivas ATP.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A leucemia mielogenosa crônica (CML) é uma desordemhematológica que constitui cerca de 15% das leucemias emadultos, é definida pela expansão maligna da linhagemmielóide. O triunfo genético do CML é uma translocaçãoreciproca entre os cromossomos 9 e 22 resultando no entãochamado cromossomo Filadélfia (Ph). A conseqüência destatroca molecular inter-cromosomica é a criação do genequimérico BCR-ABL, que codifica um polipeptidio datirosinoquinase onde o domínio da tirosinoquinase éconsecutivamente ativado. A expressão desta proteína defusão mostrou ser necessária e suficiente para o fenótipotransformado das células CML (FADERL, S, et. Al. TheBiology of chronic myeloid leukemia. New England ofMedicine. 1999, vol.341, no.3, p.164-172. SAWYERS, C.Chronic myeloid Leukemia. New England of Medicine. 1999,vol.340, no.17, ρ.1330-1340.) Além do CML, Atividadequinase ABL desregulada que é o resultado da translocaçãodo cromosoma Ph é também detectada em até 20% dos pacienteadultos com leucemia linfoblástica (ALL) os pacientes(OTTMANN, O.G., et al. A phase 2 study of imatinib inpatients with relapsed or refractory Philadelphiachromosome-positive acute lymphoid leukemias. Blood. 2002,vol.100, no.6, p.1965-1971.)
Transduções do sinal ABL dos receptores de superfíciecélular do fator de crescimento e receptores de adesãoregulam a estrutura citoesquelética. Várias proteínas desinalização para interagir com ABL que ativa uma gama decaminhos sinalizadores foram mostradas. Então, a inibiçãoda ABL constitui uma nova aproximação para melhorar aterapia para os pacientes com CML.
A descoberta de que BCR-ABL é requerida para apatogênese da CML, e que a atividade da tirosinoquinase daABL é essencial para a transformação mediada por BCR-ABL,feita para a quinase ABL tem um alvo atraente para aintervenção terapêutica. Imatinibe (Gleevec®, tambémconhecido como STI571, EP 564409 A) é um inibidor ATP-competitivo de BCR-ABL que potencialmente inibe a atividadeda tirosinoquinase. A alta seletividade e eficácia daImatinibe são devidas a sua habilidade em ligar e bloquearBCR-ABL em uma conformação cataliticamente ativa da enzima.Estudos clínicos e pré-clinicos demonstraram uma notáveleficácia e alta tolerância de Imatinibe que é neste momentoo tratamento de primeira linha para todos os pacientes deCML diagnosticados (DEININGER, Μ, et al. The development ofimatinib as a therapeutic agent for chronic myeloidleukemia. Blood. 2005, vol. 105, no.7, p.2640-2653.)Entretanto, a imatinibe é altamente efetiva na fase inicialda doença, considerando que os pacientes na fase aceleradae blástica da CML, bem como aqueles com Ph+ ALL, quefreqüentemente desenvolvem resistência a imatinibe (DRUKER,B.J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tirosina kinase in the blast crisis of chronic myeloidleukemia and acute lymphoblastic leukemia with thePhiladelphia chromosome. New England Journal of Medicine.2001, vol.344, no.14, p.1038-1042. SAWYERS, C.L., et al.Imatinibe induces hematologic and cytogenetic responses inpatients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blastcrisis: results of a phase Il study. Blood. 2002, vol.99,no.10, p.3530-3539.)
Um mecanismo principal para a resistência a imatinibeé a. evolução dos clones que adquirirem pontos de mutaçõesdentro do domínio catalístico da tirosinoquinase BCR-ABL ediminuem ou evitam diretamente a interação com o inibidor.
Enquanto a maioria deles induz mudanças estruturaisque previnem o domínio da quinase ABL para adotar aconformação inativa fechada requerida para a ligação daImatinibe (SHAH, N.P., et al. Mechanisms of resistance toSTI571 in Philadelphia chromosome-associated leukemias.Oncogene. 2003, vol.22, no.47, ρ.7389-7395.), algumasmutações, como a Treonina 315 para substituição deIsoleucina (a seguir chamado T315I), interfere diretamentecom a interação da Imatinibe ao Sitio de Ligação de ATP.
A compreensão da base molecular da resistência deImatinibe estimulou a procura de novos inibidores de BCR-ABL que sejam eficazes contra doenças mediadas ABLresistentes a imitinib clinicamente observadas. Umavariedade de segunda geração do inibidor competitivo do ATPde BCR-ABL, como AMN 107 (WEISBERG, E, et al.Characterization of AMN 107, a selective inhibitor ofnative and mutant Bcr-Abl. Câncer Cell. 2005, vol.7, p.129-141.) e BMS-354825 (também conhecido como Desatinibe)(SHAH, N.P., et al. Overriding imatinibe resistance with anovel ABL kinase inhibitor. Science. 2004, vol.305,no.5682, p.399-401.), foi desenvolvido e estudado sobprévias avaliações clinicas. Estes compostos são ativoscontra a maioria dos mutantes ABL resistentes a Imatinibe,mas nenhum deles é ativo contra o mutante T315I que é asegunda mutação que ocorre com mais freqüência em pacientesresistentes a Imatinibe (01HARE, T, et al. In vitroactivity of Bcr-Abl inhibitors AMN 107 and BMS-354825against clinically relevant imatinibe-resistant AbI kinasedomain mutants. Câncer Research. 2005, vol.65, no.11,p.4500-4505).Pode ser concluído que é particularmente difícilinibir a mutação do ABL T315I com um composto competitivoATP. De fato, até muito recentemente o único inibidor quefoi relatado para também ser ativo contra o mutante T315I,foi o ON12380 que realmente é um inibidor substratocompetitivo (i.e. um ATP não competitivo) (GUMIREDDY, K.,et al. A non-ATP- competitive inhibitor of BCR-ABLoverrides imatinibe resistance. Proc. Natl. Acad. Sei.U.S.A. 2005, vol.102, no.β, ρ.1992-1997.).
Recentemente, duas moléculas ATP-competitivas, VX-680(HARRINGTON, E.A., et al. VX-680, a potent and selectivesmall-molecule inhibitor of the Aurora kinases, suppressestumor growth in vivo. Nature Medicine. 2004, vol. 10, no.3,p.262-267.) e BIRB-796 (PARGELLIS, C , et al. Inhibition ofp38 MAP kinase by utilizing a novel allosteric bindingsite. Nat. Struct. Biol.. 2002, vol.9, no.4, p.268-272.)foi relatado ser capaz de ligar in vitro ao T315I mutado dodomínio da tirosinoquinase da ABL com baixa nanomolaridadeKd, mas mostrou uma baixa potência para inibição do T315Iem células BCR-ABL (CARTER, T.A., et al. Inhibition ofdrug-resistant mutants of ABL, KIT, and EGF receptorkinases.. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 2005, vol.102,no.31 , ρ.1 101 1- 11016).
No momento, não há nenhum tratamento efetivo visandoa quinase para pacientes afetados por doenças mediadas pelaABL resistente ao inibidor BCR-ABL T315I, que sejacalculado para constituir 20% de todos os pacientes querecaem após o tratamento de Imatinibe e é esperado que sejaselecionado para o tratamento com as próximas gerações deinibidores mencionados acima. Isto representa umanecessidade médica para novos inibidores competitivos ATPpotentes do mutante BCR-ABL T315I não disponíveis. Apresente invenção focaliza este problema.
RESUMO DA INVENÇÃO
A invenção provê compostos de baixo peso molecularexibindo uma alta afinidade para o sítio ATP datirosinoquinase ABL. Estes compostos são assim inibidorescompetitivos da tirosinoquinase ATP que exibem uma potênciainibidora significativa para BCR-ABL T315I resistente aoinibidor mutantes da ABL, em particular para os mutantesABL T315I resistentes a Imatinibe. A inibição da atividadeda tirosinoquinase resulta no bloqueio da sinalização dacascata mediada por ABL e o mutante T315I.
Os compostos da presente invenção que mostram aatividade desejada são tetrahidropirrol[3,4-c]-pirazolesprojetados para ser um alvo do sítio ATP das proteínasquinases. Os compostos desta classe química revelaram serpotentes inibidores competitivos da ATP da aurora quinase(FANCELLI, D., et al. Potent and selective Aurorainhibitors identified by the expansion of a novel scaffoldfor protein kinase inhibition. Journal of MedicinalChemistry. 2005, vol.48, no.8, p.3080-3084. PCT/WO2005005427) . Inesperadamente, os compostos com o mesmosuporte químico foram encontrados para exibir uma potênciainibitória significativa para ABL e em particular elespodem também inibir in vitro a forma mutante T315Iresistente ao inibidor BCR-ABL da ABL.
Devido à atividade biológica, os compostos dainvenção oferecem um novo caminho para o desenvolvimento deum tratamento para a população de paciente que sofrem dedoenças mediadas de ABL resistente a Imatinibe.
A invenção também provê um ensaio para aidentificação de compostos adicionais que ligam o sítio ATPde uma proteína quinase alvo, em particular atirosinoquinase ABL. Este ensaio mostra a habilidade paradetectar o resultado da ligação ao sítio ATP alvo e éconduzido em condições quantitativas de modo que aafinidade de ligação de um composto para o sítio ATP podeser determinada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Em um primeiro aspecto, a presente invenção serelaciona a um método para inibir uma atividadetirosinoquinase resistente ao inibidor BCR-ABLcompreendendo contatar um polipeptídio de tirosinoquinaseresistente ao inibidor BCR-ABL com uma quantidade efetivado composto de fórmula (I).
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em que R é hidrogênio ou metil,
Ri é hidróxi ou um grupo alcóxi ou alquil C1-C3 linearou ramificado,
R2 é um hidrogênio ou átomo de halogênio,
X é um grupo divalente selecionado de metileno(-CH2-) ou fluormetileno (-CHF-), ou um heteroátomo ougrupo heteroatômico selecionados de oxigênio (-0-) ounitrogênio (-NR'-) onde R' é um átomo de hidrogênio, umgrupo alquil C1-C4 linear ou ramificado ou um grupocicloalquil C3-C6, ou um sal farmaceuticamente aceitáveldeste.
Os compostos de fórmula (I) da invenção têm átomos decarbono assimétricos e podem, portanto, existir comoisômeros ópticos individuais, como misturas racêmicas oucomo qualquer outra mistura que inclui uma maioria de umdos dois isômeros óptico que são pretendidos como dentro doescopo da presente invenção.Em casos quando os compostos possam existir em formastautoméricas, cada forma é contemplada como sendo incluídodentro desta invenção se existir em equilíbrio oupredominantemente em uma forma.
Como tal, a menos que seja informadoo, quando somente
uma das formas tautoméricas seguintes da fórmula (Ia) ou(Ib) é indicada, o restante ainda é pretendido comoincluído dentro do escopo da invenção:
Na presente descrição, a menos que especificado
contrário, com o termo alquil C1-C3 ou C1-C4 linear ouramificado, pretendemos qualquer dos grupos tais como, porexemplo, metil, etil, n-propil, isopropil, n-butil,isobutil, tert-butil e sec-butil.
Com o termo alquoxi' C1-C3 linear ou ramificado,pretendemos quaisquer dos grupos tais como, por exemplo,metóxi, etóxi, n-propoxi e isopropoxi.
Com o átomo de halogênio nós pretendemos um flúor,cloro, bromo ou átomo de iodo.
Com o termo cicloalquil C1-C6, pretendemos qualquergrupo como ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil eciclohexil.Claramente, dependendo da natureza do grupo X, estemesmo heterociclico que é ligado à porção do fenileno doscompostos de fórmula (I) pode representar um piperidino, 4-fluoropiperidino, piperazino, 4-alquil-piperazino, A-cicloalquil-piperazino ou anel morfolino.
Os compostos da fórmula (I) são descritos ereivindicado no pedido de patente internacionalW02005/005427 e pode ser preparado de acordo com o processoaqui revelado.
0 método da presente invenção pode ser executado invitro ou in vivo. Um polipeptidio de tirosinoquinasecompleto pode ser usado; alternativamente, uma porção dofragmento, ou analógo deste pode ser utilizado.
Mais particularmente, a atividade. inibidora doscompostos selecionados da invenção é determinada peloensaio gel-quinase. 0 ensaio consiste na transferência daradioatividade da porção do fosfato etiquetada pela quinaseda ABL para um substrato, na presença do composto teste.Uma vez terminada a reação, a mistura de reação é carregadaem um gel de poliacrilamida e sinal de radioatividade édetectado. Este ensaio de inibição é melhor ilustrado nosexemplos.
Adicionalmente, a atividade inibidora do compostosselecionados da invenção é determinada em sistemascelulares. As células satisfatórias são aquelas nas quais atranslocação cromosomica BCR-ABL ocorreu naturalmente, comocélulas de leucemia humanas K-562 e células transfectadascom um recombinante construído levando o gene mutante ABLT315I. As células são tratadas com os compostos da invençãoe atividade inibidora é detectada através de immunoblottingcomo ilustrado nos exemplos.
Em uma modalidade preferida da invenção, opolipeptídio inibidor resistente a tirosinoquinase BCR-ABLé um mutante T315I da tirosinoquinase ABL.
Em uma modalidade mais preferida da invenção, oinibidor de BCR-ABL é Imatinibe.
Em um segundo aspecto, a presente invenção serelaciona a um método para tratar uma doença mediada ABLT315I resistente ao inibidor BCR-ABL que compreendeadministrar a um mamífero na necessidade de uma quantidadeefetiva do composto de acordo com fórmula (I) como definidoacima.
Dentro da extensão do método do tratamentoreivindicado na presente invenção está o uso de todos ospossíveis isômeros e suas misturas e de ambos osmetabólitos e o bioprecursores farmaceuticamente aceitáveis(de outro modo chamado de pró-droga) dos compostos defórmula (I) . Pró-drogas são quaisquer compostoscovalentemente ligados, que liberam a droga ativa parentede acordo com fórmula (I), in vivo.Os dois métodos acima são preferivelmente realizadoscom um composto da fórmula (I)
em que R é hidrogênio, Ri é metóxi, R2 é hidrogênio eX é metileno (-CH2-) ou é um heteroátomo ou grupo heteroatômico selecionados de oxigênio (-0-) ou nitrogênio(-NR-) em que R' é um átomo de hidrogênio, ou um grupoalquil selecionado de metil, etil, isopropil, ciclopropilou tert-butil.
Mais preferivelmente, os compostos são selecionados do grupo que consiste de:
N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1, 4, 5, 6-tetrahidro pirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-metilpiperazin-1-il) benzamida;
N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6- tetrahidro pirrol [3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-etilpiperazin-l-il) benzamida;
N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidro pirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-
isopropilpiperazin-l-il) benzamida; N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1, 4, 5, 6-tetrahidro pirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-ciclopropilpiperazin-l-il) benzamida;
N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5, 6-tetrahidro pirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-piperidin-l-ilbenzamida;4-(4-fluoropiperidin-l-il)-N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-fenil etanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida
N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5, 6-tetrahidro pirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-morfolin-4-ilbenzamida;
N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-metilpiperazin-l-il)benzamida;
N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-etilpiperazin-l-il)benzamida;
N-{5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-piperidin-l- ilbenzamida;
4-(4-fluoropiperidin-l-il)-N-{5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1, 4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida;
4-morfolin-4-il-N-{5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1,4,5, 6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida.
0 composto mais preferido a ser usado nos doismétodos acima da invenção é N-5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-metilpiperazin-l-il)benzamida, abaixo chamado de"Composto 1"
Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos defórmula (I) inclui sais de adição de ácidos com ácidosorgânicos ou inorgânicos como, por exemplo, nitrico,clorídrico, bromídrico, sulfúrico, perclórico, fosfórico,acético, trifluoracético, propiônico, glicólico, lático,oxálico, malônico, málico, malêico, tartárico, cítrico,benzóico, cinâmico, mandélico, metanosulfônico, isetiônicoe salicílico.
O termo "doenças mediadas ABL T315I" é pretendido porenglobar doenças as quais inibem direta ou indiretamente aatividade da tirosinoquinase ABL T315I, é desejável.
O termo "inibidor de BCR-ABL" é pretendido porenglobar moléculas competitiva ATP que têm a habilidade deinibir a atividade enzimática da proteína BCR-ABL. Exemplosnão limitativos de tais moléculas são Imatinibe, Desatinibee AMN107.
Em uma modalidade preferida do método descrito acima,a doença é uma leucemia resistente ao inibidor causada pelomutante T315I da tirosinoquinase ABL.
Em uma modalidade mais preferida a leucemia éleucemia mielogenosa crônica.
Em outra modalidade preferida do método descritoacima, o inibidor da BCR-ABL é Imatinibe.
Um composto de acordo com fórmula (I) pode seradministrado a um sujeito sobre determinação do sujeitocomo tendo uma doença ou condição não desejada que sebeneficiariam através do tratamento com o dito composto. Osmédicos ou técnicos podem fazer a determinação como partede uma diagnóstico de uma doença ou condição de um sujeito.O composto também pode ser usado na prevenção de talcondição que pode ser vista como redutora da probabilidadede um sujeito ter uma ou mais destas condições.
O método da invenção pode ser realizado contactandouma célula com um composto da fórmula (I) que inibe uma oumais das atividades do mutante ABL T315I. Este método podeser executado in vitro (por exemplo, cultivando a célulacom o composto) ou, alternativamente, in vivo (por exemplo,administrando o composto a um sujeito). Também pode serexecutado ex vivo, como no caso de células obtidas de umsujeito e tratada in vitro seguida pelo seu retorno aosuj eito.
In vivo, o efeito de uma proteína alvo inibindo acomposição terapêutica pode ser avaliado em um modeloanimal satisfatório.
Como usado aqui, uma quantidade efetiva de umcomposto se refere a uma quantidade suficiente paraalcançar a proposta desejada. Determinação das quantiadadesefetivas está bem dentro da capacidade daqueles versados naarte baseados na obtenção de um efeito desejado. Umaquantidade efetiva dependerá dos fatores que incluem, masque não se limitam, ao tamanho de um sujeito e/ou grau parao qual a doença ou condição não desejada progride nosujeito. A quantidade efetiva também dependerá se ocomposto é administrado ao sujeito em uma única dosagem ouperiodicamente com o passar do tempo.
O composto de fórmula (I) da presente invenção é planejado para o tratamento dos sujeitos. Como usado aqui,o termo "sujeito" é pretendido englobar mamíferos e nãomamíferos. Exemplos de mamíferos incluem, mas não estálimitado, a qualquer elemento da classe mamífera: humanos,primatas não humanos, tais como chimpanzés, e outros macacos e espécies de macaco; animais de fazenda, tais comogados, cavalos, ovelhas, cabras, suínos; animais domésticostais como coelhos, cachorros e gatos; animais delaboratório incluindo roedores, tais como ratos,camundongos, porquinhos da índia, e semelhantes. Exemplos de não mamíferos incluem, mas não está limitado, pássaros,peixe e semelhantes.
O termo que "tratamento" como usado aqui incluialcançar um benefício terapêutico.
Através do benefício terapêutico que dizer erradicação ou melhora da doença a ser tratada. Porexemplo, em um benefício terapêutico em um paciente comcâncer, inclui erradicação ou melhoria do câncer. Também,um benefício terapêutico é alcançado com a erradicação oumelhoria de um ou mais dos sintomas fisiológicos associados com a desordem de modo que uma melhoria é observada nopaciente, apesar do fato de que o paciente ainda possaestar afetado com a desordem.
0 método da invenção inclui a administração de umcomposto da fórmula (I) como um único agente ou,alternativamente, em combinação com uma ou mais de outrasmoléculas ou outros agentes satisfatórios para o tratamentode uma doença ou condições não desejadas como reveladoaqui. Exemplos de moléculas ou agentes satisfatórios para otratamento combinado são agentes citotóxicos oucitoestáticos, agentes do tipo antibiótico, agentesalquilantes, agentes antimetabolitos, agentes hormonais,agentes imunológicos, agentes do tipo interferon,inibidores de ciclooxigenase (por exemplo, inibidores deCOX-2), inibidores de matrixmetalloprotease, inibidores detelomerase, inibidores de tirosinoquinase, agentesreceptores do fator anticrescimento, agentes anti-HER,agentes anti-EGFR, agentes anti-angiogenesis (por exemplo,inibidores de angiogenesis), inibidores de transferase defarnesil, inibidores do caminho de transdução do sinal ras-raf, inibidores do ciclo celular, outros inibidores cdks,agentes de ligação tubulina, inibidores de topoisomerase I,inibidores de topoisomerase II e semelhantes.
A presente invenção também inclui composiçõesfarmacêuticas que incluem um composto da fórmula (I) ou umsal farmaceuticamente aceitável deste em associação com umexcipiente farmaceuticamente aceitável que pode serportador ou um diluente.
As composições farmacêuticas que contêm os compostosda invenção são preparadas pelos seguintes métodosconvencionais e são administradas em uma forma farmacêuticasatisfatória.
Por exemplo, as formas orais sólidas podem conter,junto com o composto ativo, diluente, por exemplo, lactose,dextrose, sacarose, sucrose, celulose, goma de milho ougoma de batata; lubrificantes, por exemplo, silica, talco,ácido de esteárico, esterato cálcio ou magnésio e/ouglicois de polietileno ; agentes ligantes, por exemplo,gomas, goma arábica, gelatina, metilcelulose,
carboximetilcelulose ou pirrolidona de polivinil; agentesdesintegradores, por exemplo, goma, ácido alginico,alginadores ou glicolato de goma de sódio; misturasefervescentes; corantes; adoçantes; agentes umidificantestais como lecitina, polisorbatos, laurilsulfatos; e, emgeral, substâncias inativas farmacologicamentes e nãotóxicas usadas nas formulações farmacêuticas. Estaspreparações farmacêuticas podem ser fabricadas de maneiraconhecida, por exemplo, por meio de mistura, granulação,tabletagem, revestimentos de açúcar, ou processos derevestimento por filme. As dispersões líquidas para administração oral podemser, por exemplo, xaropes, emulsões ou suspensões.
Como um exemplo, podem conter os xaropes, comoportador, sacarose ou saccrose com glicerina e/ou mannitole sorbitol.
As suspensões e as emulsões podem conter, comoexemplos de portadores, goma natural, ágar, alginate desódio, pectina, metilcelulose, carboximetilcelulose ouálcool de polivinil.
A suspensão ou soluções para injeção intramuscularpode conter, junto com o composto ativo, um portadorfarmaceuticamente aceitável, por exemplo, água estéril,azeite de oliva, oleate de etil, glicóis, por exemplo,propileno glicol e, se desejado, uma quantia satisfatóriade cloridrato de lidocaina.
As soluções para injeções intravenosas ou infusõespodem conter, como um portador, água estéril oupreferivelmente elas podem está na forma de soluçõesestéreis, aquosas, isotônicas, salinas ou elas podem conterpropileno glicol como um portador. Infusões intravenosaspodem ser conduzidas em um intervalo de tempo de cerca de 1hora a aproximadamente 10 horas, seguindo de um regimesemanal de tratamento por 1 a 6 ciclos semanais.
Os supositórios podem conter, junto com o compostoativo, um portador aceitável farmaceuticamente, porexemplo, manteiga de cacau, glicol de polietileno, umsorbitan de polioxietileno surfactantes de ester ácidograxo ou lecitina.
Composições farmacêuticas satisfatórias para uso napresente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão presentes em uma quantidadeefetiva, i.e., em uma quantidade efetiva para alcançar osbenificios profilácticos e/ou terapêuticos em um ser emtratamento. A quantidade efetiva atual para uma aplicaçãoparticular dependerá da condição ou condições do sertratado, a condição do sujeito, a formulação, e a rota deadministração, bem como outros fatores conhecidos aquelesversados na arte. A determinação de uma quantidade efetivados compostos da presente invenção está dentro dascapacidades daqueles versados na arte, face ao revelado aqui, e será determinado usando técnicas de otimizaçãorotineiras.
Em uso terapêutico, os compostos da invenção sãoadministrados a um sujeito em níveis de dosagem deaproximadamente para cerca de 30 mg/m2 3000 mg/m2 de superfície do corpo por dia. Um nível de dosagem de cercade 100 mg/m2 para 1000 mg/m2 constitui uma gamaparticularmente satisfatória. Para um adulto sujeitohumano, uma dosagem de cerca de 50 mg a aproximadamente5000 mg por dose, mais preferivelmente cerca de 150 mg a aproximadamente 1000 mg por dose, de 1 a 5 vezesdiariamente, pode ser usada como exempl, mas não selimitando a isto. Doses menores ou maiores do que aquelasreveladas aqui podem ser usadas, quando requerido. Porém,elas podem ser alteradas dependendo do número de variáveis, sem se limitar à atividade do composto usado, na condição aser tratada, do modo de administração, do regime detratamento, das exigências individuais do sujeito, daseveridade da condição a ser tratada e das determinaçõesmédicas. As faixas anteriores são meramente sugestivas, enquanto que como o número de variáveis não é incomum emrelação a um regime de tratamento individual que é grande econsiderável nas excursões destes valores recomendados.
A quantidade efetiva para uso em humanos pode serdeterminada em modelos animal. Por exemplo, uma dose parahumanos pode ser formulada para circular no fígado ou emconcentrações gastrointestinais e/ou tópicas, foi vistacomo efetiva em animais.
Em um terceiro aspecto a presente invenção serelaciona a um método de rastreamento para a identificação de compostos capazes de ligar o sítio ATP de uma proteínade quinase, compreendendo as etapas de:
prover uma mistura de reação que compreende aproteína de quinase, um derivado de indolinona que temafinidade para o dito sítio ATP da proteína de quinase e é capaz de gerar um sinal fluorescente ao ligar o dito sítioATP, e diluições consecutivas do composto teste, comparandoo sinal fluorescente gerado na ausência do composto testecom o sinal fluorescente gerado na presença de diferentesconcentrações do composto teste, por meio de um níveldecresecente de fluorescência que indica a habilidade docomposto teste para deslocar o derivado de indolinona.
Em uma modalidade preferida do método derastreamento, a proteína de quinase e o derivado deindolinona são pré-misturados.
Em outra modalidade preferida do método derastreamento, a proteína de quinase e o composto teste sãopré-misturados.
Em uma modalidade preferida adicional do método derastreamento, proteína de quinase é um quinase da ABL.
Em uma modalidade mais preferida, a quinase da ABL émutante T315I quinase da ABL.
O termo "proteína de quinase" engloba as proteínasnativas completas como também fragmentos desta, enquanto osfragmentos compreendem o sítio ATP da proteína de quinase.
O termo "sítio ATP" indica o local ATP é ligadadentro da proteína de quinase.
O derivado de indolinona é preferivelmente umcomposto da fórmula (II) abaixo:em que Rl é hidrogênio ou metilamino-sulfonil oubenzil-sulfonil, R2 é hidrogênio ou metil, R3 é metil ou 4-clorofenil ou 2,4-difluorofenil.
Mais preferivelmente, o derivado de indolinona é umcomposto selecionado do grupo que consiste de:
Ácido 2,4-dimetil-5- [2-oxo-5-fenilmetanosulfonil-l, 2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-lH-pirrol-3-carboxilico(2-dietilamino-etil)-amida (que foi revelado no pedido depatente Internacional W002/096361)
4-(4-clorofenil)-N- [2-(dietilamino)etil]-2-metil-5-((Z)-5{(metilamino)sulfonil]-2-oxo-l,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno}metil)-1 H-pirrol-3-carboxamida;
N-[2-(dietilamino)etil]-4-(2,4-difluorofenil)-2-metil-5-((Z)-{5-[(metilamino)sulfonil]-2-oxo-l,2-dihidro-3H-indol-3-ilidenometil}-lH-pirrol-3-carboxamida;
4-(4-clorofenil)-N-[2-(dietilamino)etil]-2-metil-5-[(Z) -(4-metil-2-oxo-l,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno)metil]-1H-pirrol-3-carboxamida.
Os derivados de indolinona foram selecionados para a
sua capacidade de ligar o sitio ATP tanto ao tipo selvagemquanto às formas transformadas da ABL, para a afinidade doteste para a proteína quinase, para a robustez do ensaio, ede acordo com dados publicados sobre os inibidores da ABLconhecidos (eg: Imatinibe).
O sinal de fluorescência pode ser medido, porexemplo, por um leitor de placa, tal como o leitor de placaFusion α-FP HT (Packard). A habilidade de deslocamento docomposto teste está em correlação direta com a afinidade docomposto para o sítio ATP da proteína de quinase. AAfinidade de ligação constante (KD) do composto teste podeser determinada como explicado nos exemplos.
O ensaio da invenção é baseado no novo achado em que éobservado um aumento significante da intensidade defluorescência ao ligar os derivado de indolinona aproteínas de quinase. Portanto, os grupos quimicamenteligados a um teste de afinidade são capazes de ligar aporção alvo provida para o sinal fluorescente. Porém, taismétodos sofrem desvantagens relacionadas à baixa afinidadepelo sítio da quinase que impede a possibilidade de ajustaros ensaios sensíveis. Uma aproximação alternativa que foiusada confia no teste de ligação imobilizado ou proteína dequinase com as limitações típicas de um ensaio da fasesólida (por exemplo, impedimento estérico e necessidade delavagem).
A presente invenção supera estas desvantagens, tendoem vista que as indolinonas mostram uma afinidaderelativamente alta para quinase alvo e o sinal gerado naligação é diretamente dependente na ligação permitindoconstruir um ensaio homogêneo.
Considerando que o presente ensaio de blindagem é por este meio exemplificado com a quinase da ABL, uma pessoaversada na técnica poderá realizar isto, sem experimentaçãoindevida, também com outras proteínas de quinase, aproteína quinase fornecida contém um sítio ATP. De fato, ospresentes inventores detectaram uma mudança no sinal de fluorescência quando o ensaio é realizado com o fator decrescimento como Insulina (desfosforilada e
tridesfosforilada) o Receptor de insulina (desfosforilada etridesfosforilada), c-Met, AIk, Chkl e PDKl. É entãoesperado que possam ser empregadas proteínas quinases adicionais de modo adequado no ensaio da presente invenção.
Finalmente a presente invenção se relaciona ao uso docomposto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamenteaceitável deste, como definido acima, na fabricação'de ummedicamento para tratar uma doença mediada ABL T315I resistente ao inibidor BCR-ABL.
Com o objetivo de melhor ilustrar a presenteinvenção, sem impor qualquer limitação a esta, agora sãodados os exemplos a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 ilustra a atividade inibidora do composto1 e Imatinibe na atividade da quinase do tipo selvagem ABLe domínio quinase mutante ABL T315I.
A atividade inibidora foi medida através da análiseda quinase em gel na presença da concentração crescente docomposto. A proteína básica de mielina foi usada comosubstrato.
A figura 2 é um immunoblotting que mostra a inibiçãode BCR-ABL em células leucêmicas K-562 tratadas com ocomposto 1 (linha 2) ou Imatinibe (linha 3).
A inibição da sinalização BCR-ABL foi analizadamonitorada o estado de fosforilação dos alvos STAT5 ouCRKL. A linha 1 mostra as células K-562 não tratadas.
A figura 3 é um immunoblotting que mostra a inibiçãode tipo selvagem e mutante ABL T315I pelo composto 1 emcélulas transfectadas HCT-116. As células de tumorcoloretal HCT-116 foram transfectada com um tipo selvagemABL (linha 1) ou um mutante ABL T315I expressão construída(linha 2) . As células lisadas foram analisadas porimmunoblotting que usa anticorpos contra proteína ABL total(a-ABL) ou um anticorpo fosfo-específico que reconhece ABLquando é fosforilada na posição Y412 a-pY412-ABL). Umacomparação entre células não tratadas (-) e tratadas ( + )mostra de células que o composto 1 é capaz de inibir tantoo tipo selvagem quanto o mutante ABL T315I.Exemplos
Nos exemplos a seguir, os números dos resíduos deaminoácido se referm ao número Genbank de acesso para aisoforma Ia da proteína ABL AAB60394Exemplo 1:
Clonagem, expressão e purificação do domínio quinasemutante ABL recombinante.
0 domínio quinase ABL (correspondendo aos resíduos229-512) foi amplificados por PCR uma biblioteca de cDNA detestículos humano. Amplificação foi realizada usando ooligonucleotídeo no sentido direto:
5 ' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTACTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCTCCCCCAACTACGACAAGTG-31;[SEQ ID N0: 1] e ooligonucleotídeo no sentido reverso:5 ' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTATTTCCCCAGCTCCTTTTCCAC-3' [SEQ ID N°: 2]
Para propostas de clonagem, os oligonucleotídeosincluíram locais attB para obter um produto PCR attB-flanqueado satisfatório para clonagem usando a tecnologiaGateway® (Invitrogen). Além disso, para propostas depurificação, o primer no sentido direto incluiu uma divisãolocal PreScission® (Amersham Biosciences). 0 produto PCRresultante foi clonado no vetor de expressão baculovíruspVL1393 (Invitrogen) Gateway®-modifiçada. Para propostas depurificação e expressão, uma etiqueta GST foi adicionada aoN-terminal para o domínio da quinase ABL.
A clonagem foi executada de acordo com os protocolosdescritos no manual de Gateway®.
O mutante ABL T315I resistente ao Imatinibe foigerado por mutagênese local-direcionado usando o kitmutagênese QuikChange® (Stratagene).
O oligonucleotídeo usado na reação de mutagênese foi:5' -CCCCGTTCTATATCATCATTGAGTTCATGACCTACG-31 [SEQ ID N°: 3].
Os baculovírus foram gerados através da cotransfecçãocélulas de inseto Sf9 com o vetor de expressão e o DNAusando o kit de transfecção BaculoGold® (Pharmingen).Cobrenadantes virais foram recuperados após 5 dias eexpostos a 3 rodadas de amplificação para aumentar titervirótico. As proteínas recombinantes foram produzidas parainfectar a células de inseto High5 com densidade de IxlO6células por ml com 3 ml sobrenadante virótico por bilhõesde células. Depois de 48 horas de infecção, as célulasforam recuperadas, empelotadas e congeladas a -80°C. Parapurificação das proteínas recombinantes, as pelotas foramdescongeladas, resuspensas no tampão lisado (Tris - HCI 50mM, NaCl 150 mM, CHAPS 0,2%, DTT 20 mM, glicerol 10%) elisada através de ultra-som. Os lisados foram clareados porcentrifugação a 20000 g por 30 minutos e carregado em umacoluna de glutationa sefarose 4B® (Amersham Biosciences).Após extensa lavagem, as proteínas recombinantes foramclivadas e eluidas através da incubação com proteasePreScission®.
Exemplo 2:
A atividade dos compostos foi avaliada dentro de umensaio quinase em gel que mede a fosforilação da proteínabásica mielina pelo tipo selvagem recombinante e mutanteABL T315I do domínio quinase.
Os ensaios foram realizados em 20 μl de uma misturade reação que contém 15 NM de enzima de recombinante, 10 μΜde proteína básica mielina (Sigma-Aldrich) como substrato,10 mM Hepes pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 15 nM Na3VO4, 4%DMSO, 3 nM ATP, 0,1 pCurie de γΡ32-ΑΤΡ. 0 composto 1 foitestado e Imatinibe também foi testada em paralelo comoreferência. A concentração do inibidor varia de 10 NM a 10μΜ. Depois da pré-incubação da enzima e do substrato com oinibidor por 15 minutos a temperatura ambiente, o ATP foiadicionado e a reação foi conduzida por 30 minutos a 30°C eterminada com adição de gel carregando o tampão e fervendopor 5 minutos. As misturas de reação foram então carregadasem um 10% gel de poliacrilamida-SDS. Depois da separação,os géis foram secados e sinal de radioatividade foirevelado usado o sistema Phosphorimager (DinâmicaMolecular).
Como esperado, a imatinibe pode inibir a atividade daquinase do tipo selvagem do domínio da quinase ABL,enquanto era completamente inativo no mutante T315I. Demodo contrário, o composto testado foi ativado em ambos ostipos selvagem e mutante T315I com a mesma potência.
Exemplo 3:
O ajuste do ensaio de deslocamento dependente dolocal ATP e validação.
Um ensaio de deslocamento dependente do local ATP foiajustado para a avaliação da afinidade quantitativa doscompostos testados.
O ensaio leva vantagem do aumento significantivo naintensidade de fluorescência observada na ligação de certosderivados de indolinonas a proteínas de quinase.
Aqui abaixo, nós mostramos os resultados obtidos comdois derivados de indolinonas diferente, selecionados comotestes de potencial na base da magnitude de aumento defluorescência ao ligar a ABL.
3.1 Teste de Indolinona ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-5-fenilmetanosulfonil-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-lH-pirrol-3-carboxílico (2-dietilamino-etil)-amidaIndolinona ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-5-fenilmetano-
sulfonil-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-lH-pirrol-3-carboxílico (2-dietilamino-etil)-amida foi avaliado parasua habilidade para ligar domínio da quinase ABL do tiposelvagem e o mutante ABL T315I em um experimento detitulação. 0 desempenho do ensaio (fator Z) bem como odeslocamento do teste por ATPyS e Imatinibe foramavaliados. Em todos os experimentos, o sinal defluorescência foi medido usando o leitor de placa Fusion a-FP HT (Packard). A análise dos dados foi realizada usandosoftware Dynafit.
Particularmente, os dados de titulação foramajustados para o seguintes equilíbrio: Enzima + teste <==>teste de enzima complexa, enquanto os dados de deslocamentoforam ajustados para o seguinte equilíbrio: Enzima + teste<==> teste de enzima complexa, Enzima + Compsto <==>Composto de Enzima Complexo, por meio da ligação do teste eo composto na enzima são mutuamente exclusivos (mecanismocompetitivo puro).
A experiência de titulação foi realizada como aseguir: 10 NM domínio quinase ABL (tipo selvagem ou mutanteT3151) , concentração de indolinona de 3 μΜ para 0, cometapas de diluição 1:1.5 em 50 mM TrisHCI, pH 7,5, 150 mMNaCl2, 5 mM MgCl2, 1 mM Mn Cl2, 1 mM DTT, 1% DMS0, 3 μΜNaaVO4 (tampão 1). Os resultados obtidos (mostrado naTabela 1 abaixo) indicam que o teste é capaz de ligar todasas formas testadas do domínio da quinase ABL. 0 fator Z'(Z'=I- (3* (SDteste+proteína+SDteste) / (Meanteste+proteina+Meanteste) foideterminado como a seguir: concentração do teste desaturação (0,15, 0,12 e 0,42 μΜ para ABL selvagemdesfosforilada (OP), tipo selvagem e T315I,respectivamente) foi avaliado na presença (probe+protein)ou na ausência (teste) de 10 e 5 NM de proteína. Em todosos casos, os valores de Z foram maior que 0,8 que indicamque os ensaios foram robustos.
O ensaio foram validados usando ATPyS e Imatinibe emum ensaio de deslocamento como a seguir:
As diluições dos compostos de teste (etapa dediluição 1:2) foram primeiro preparadas em 7% DMSO ediluições adicionais no teste de tampão 1 para ter 1% de concentração DMSO final. ATPyS foi testado a 250 μΜ comoconcentração mais alta, enquanto 10 μΜ foi Imatinibe deconcentração mais alta. As enzimas estavam presentes em umaconcentração final de 10 NM. As concentrações dos testesfinais foram 0,15, 0,12 e 0,42 μΜ, respectivamente, para ABL tipo selvagem desfosforilada (OP), tipo selvagemT315I, respectivamente. A mistura da enzima e a sonda foramadicionados aos compostos previamente diluídos. Resultados(Tabela 1) indica que a sonda pode ser completamentedeslocada pelo ATPyS de todas as sondas ABL construídas indicando que a indolinona se liga no sítio ATP. Emconformidade, a afinidade de ligação constante (KD) foideterminada pelo ajuste com o mecanismo competitivo puro.Os valores KD são a média de três experiênciasindependentes.
Imatinibe, como esperado, mostrou uma afinidade maisalta para a forma desfosforilada do que para a formafosforilada da ABL, considerando que nenhum deslocamentofoi observado no mutante ABL T315I.
TABELA 1
<table>table see original document page 34</column></row><table>
Tomados juntos estes resultados mostram que o ensaiode deslocamento é dependente do local ATP e as afinidadesmedidas estão em linha com os dados publicados em Imatinibe(CARTER, T.A., et al. Inhibition of drug-resistant mutantsof ABL, KIT, and EGF receptor kinases. Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A.. 2005, vol. 102, no.31 , p.l 101 1-1 1016.FABIAN, Miles A., et al. A small molecule-kinaseinteraction map for clinicai kinase inhibitors . Nat.biotechnoL 2005, vol.23, no.3, p.329-336. ) ATP site-dependent displacement assay with recombinant ABL kinasedomains.
O ensaio de deslocamento dependente do local ATP comdomínios quinase ABL recombinante
A afinidade que liga o composto com o tipo selvagemrecombinante e mutante T315I domínio quinase ABL foramavaliados no ensaio de deslocamento. Os compostos da classequímica pirrolopirazol foram testados, com Imatinibeincluído para comparação.
A Tabela 2 mostra a determinação afinidade de ligaçãoconstante (KD) para diferentes construções ABL. VX-680 é uminibidor de tirosinoquinase ATP competitivo de vértice quefoi recentemente relatado por possuir in vitro habilidadede ligação para o mutante ABL T315I; 0 composto 1 é umcomposto exemplificativo da invenção.
TABELA 2
<table>table see original document page 35</column></row><table>Afinidade de ligação constante (KD) para o mutante
ABL T315I foi também determinado por compostosexemplificativos adicionais da invenção.
Os resultados são informados na Tabela 3, onde ocomposto 2 é N-[5-[((2R)-2-metóxi-2-fenilacetil)-1, 4, 5, 6-tetrahidro-pirrol[3,4-c]pirazol-3-il]-4-piperidin-l-il-benzamida; o composto 3 4-(4-etil-piperazin-l-il)-N-[5-((R) -2-metóxi-2-fenil-acetil)-1,4,5,6-tetrahidro-pirrol[3,4-c]pirazol-3-il]benzamida; o composto 4 é 4-(4-ciclopropil-piperazin-l-il)-N-[5-((R)-2-metóxi-2- fenil-acetil)1,4,5,6-tetrahidro-pirrol[3,4-c]pirazol-3-il] -benzamida; composto 5 é 4-(4-isopropil-piperazin-1-il)-N-[5-((R)-2-metóxi-2-fenil-acetil)-1,4,5,6-tetrahidro-pirrol [3,4-c]pirazol-3-il]-benzamida.
TABELA 3
<table>table see original document page 36</column></row><table>
0 ensaio de deslocamento foi executado como descritoanteriormente, com 3 μΜ como a concentração mais altatestada do inibidor com as etapas de diluição 1:1.5. OsResultados mostrados nas tabelas 2 e 3 indicam que todos oscompostos testadas eram ativos no mutante ABL T315I.
3.2 Teste indolinone N-[2-(dietilamino)etil]-4-(2,4-difluorofenil)-2-metil-5-((Z)-{5-[(metilamino) sulfonil]-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno}metil)-1H-pirrol-3-carboxamidaIndolinona N- [2- (dietilamino)etil]-4-(2,4-difIuor-fenil)-2-metil-5-((Z)-{5- [ (metilamino) sulfonil]-2-oxo-l,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno}metil)-lH-pirrol-3-carboxamidafoi avaliada pela sua habilidade para ligar o tipo selvagemdo domínio de quinase ABL e o mutante ABL T315I em umexperimento de titulação, como descrito acima. As condiçõesaplicadas foram as mesmas com exceção da concentração deteste de saturação (2, 3,3 e 0,2 μΜ para ABL tipo selvagemdesfosforilada (OP), tipo selvagem e T315I,respectivamente) e o teste de concentração final (2, 3,3 e0,2 μΜ para ABL tipo selvagem desfosforilada (OP) , tiposelvagem e T315I, respectivamente).
Também neste caso, os resultados (Tabela 4) indicamque o teste pode ser completamente deslocado pelo ATPyS detodos os testes ABL construídos indicando que a indolinonase liga no sítio ATP. Imatinibe, como esperado, mostrou umaafinidade mais alta para a forma desfosforilada do que paraa forma fosforilada da ABL, considerando que nenhumdeslocamento foi observado no mutante ABL T315I.
TABELA 4
<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>
Tomados juntos estes resultados mostram que o ensaiode deslocamento é dependente do local ATP e as afinidadesmedidas estão em linha com os dados publicados em Imatinibe(CARTER, T.A., et al. Ibib.; FABIAN, Miles A., et al.Ibid.)
0 ensaio de deslocamento dependente do local ATP comdomínios quinase ABL recombinante
A afinidade que liga o composto com o tipo selvagemrecombinante e mutante T315I domínio quinase ABL foramavaliados no ensaio de deslocamento como realtado em 3.1 etestando os mesmos compostos de pirrolopiraxole. A Tabela 5mostra a afinidade de ligação constante (KD) paradiferentes construções ABL.
TABELA 5
<table>table see original document page 38</column></row><table>Afinidade de ligação constante (KD) para mutante ABLT315I foi também determinado para compostosexemplificativos adicionais da invenção (os compostos 2 a 5como definidos acima). Os resultados são informados abaixo em Tabela 6.
TABELA 6
<table>table see original document page 39</column></row><table>
O ensaio de deslocamento foi executado como descritoanteriormente, com 3 μΜ como a concentração de inibidormais alta testada. Os resultados mostraram nas tabelas 5 e6 são as médias das três experiências independentes. Elasindicam que todos os compostos testados foram ativos nomutante ABL T315I.
Exemplo 4. Inibição da atividade ABL em célulasMateriais e MétodosClonagem de polipeptidios da ABLcDNA da ABL (correspondente aos resíduos 27-1130)forma PCR amplificados de uma biblioteca de cDNA dotestículo humano. A amplificação foi realizada usando ooligonucleotídeo no sentido direto:
GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTACTGGAAGTTCTGTTCCAG5 GGGCCCGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAG-3' (SEQ ID NO:4) e ooligonucleotídeo no sentido reverso:
5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTACCTCTGCACTATGTCACTG-3' (SEQ ID NO:5)
Para propostas de clonagem, os oligonucleotídeosincluíram locais attB para obter um produto PCR attB-flanqueado satisfatório para clonagem usando a tecnologiaGateway® (Invitrogen). 0 produto do PCR resultante foiclonado no vetor de expressão mamífero pcDNA3.1/nV5 DEST(Invitrogen). A clonagem foi realizada adequadamente deacordo com os protocolos descritos no manual de Gateway®.
0 mutante T315I resistente ao imatinibe foi geradopor mutagênese local dirigida usando QuikChange® o kitmutagênese (Stratagene).
0 oligonucleotídeo usado na reação da mutagênese foi:5'-CCCCGTTCTATATCATCATTGAGTTCATGACCTACG-3' (SEQ IDNO:6).
Immunoblotting
lmmunoblotting foi realizado de acordo com métodospadrões. As células foram preparadas em 125 mM pH de Tris-HCl 6,8 e 2% SDS. As amostras foram submetidas ao ultra-some aquecido para 5 min a 95°C. 10 pg do extrato de proteína,como determinado por BCA™ Protein Assay (Pierce, Rockford,IL) foi carregado em SDS-PAGE.
o Kit de super sinal de quimioluminescência (Pierce,Rockford, o IL) foi usado para detecção. A análise deImmunoblot foi realizada usando os seguintes anticorpos:anti-ABL (SIGMA, catalogue n°. A5844); anti-pY412-ABL (CELLSIGNALING, catalogue n°. 2865); anti-Stat-5 (CELLSIGNALING, catalogue n°. 9352); anti-pStat-5, anti-Crkl,anti p-Crkl, anti-ElF4e (BCR/ABL Activity Assay, CELLSIGNALING, catalogue no.7130)
Resultados:
Para confirmar a atividade inibidora de um compostoexemplificativo da invenção que expressa células de BCR-ABLde modo endógeno, o composto 1 foi testado em célulasleucêmicas K-562 que suportam o cromossomo Filadélfiarelacionadas a translocação de BCR-ABL. As células formatratadas durante uma hora com o composto 1 ou Imatinibe. Ascélulas foram coletadas e analizadas através deimmunoblotting para inibição da auto-fosforilação ABL doresíduo da tirosina na posição 412 (Y412) que é localizadana alça de ativação de quinase da ABL. As proteínas desinalização conhecidas como Stat-5 ou Crkl foram analisadaspara os seus estados de f osf orilação. 0 composto 1 eImatinibe (em concetração clinicamente relevante), inibe afosforilação de Y412 e fosforilação dos mediadores de BCR-ABL Stat-5 e Crkl (Figura 2) confirmando o mecanismoesperado de ação, considerando que nenhum efeito foi vistoem Src excluindo um efeito geral na fosforilação deproteína (dados não mostrados) .
Para testar a atividade celular do Imatinibe e docomposto 1 em células no mutante ABL T315I, as células deHCT-116 foram transfectada com tipo selvagem ou com aexpressão mutante construída (veja Materiais e Métodosacima) e a atividade inibidora foi testada para Imatinibe eo composto 1 a 5 μΜ. Como esperado Imatinibe mostrouatividade inibidora construída só no tipo selvagem ABL,considerando que o mutante ABL T315I construído eraresistente. Em contraste, o composto 1 mostrou uma forteatividade inibidora para o tipo selvagem e o mutante ABLT315I (Figura 3).
Claims (19)
1. Método para inibir uma atividade do inibidorresistente a tirosinoquinase BCR-ABL, CARACTERIZADO pelofato de que compreende contactar um polipeptidio inibidorresistente a tirosinoquinase BCR-ABL com uma quantidadeefetiva do composto de fórmula (I)<formula>formula see original document page 43</formula>em que R é hidrogênio ou metil,R1 é hidróxi ou um grupo alcóxi ou alquil C1-C3 linearou ramificado,R2 é um hidrogênio ou átomo de halogênio,X é um grupo divalente selecionado de metileno (-CH2-)ou fluormetileno (-CHF-), ou um heteroátomo ou grupoheteroatômico selecionados de oxigênio (-0-) ou nitrogênio(-NR'-) onde R' é um átomo de hidrogênio, um grupo alquilC1-C4 linear ou ramificado ou um grupo cicloalquil C3-C6, ouum sal farmaceuticamente aceitável deste.
2. Método, de acordo com, a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que polipeptidio inibidorresistente a tirosinoquinase BCR-ABL é uma tirosinoquinaseABL do mutante T315I.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor de BCR-ABL éImatinibe.
4. Método para tratar uma doença mediada ABL T315Iresistente ao inibidor BCR-ABL, CARACTERIZADO pelo fato decompreender administrar a um mamífero na necessidade domesmo uma quantidade efetiva do composto de fórmula (I) comodefinido na reivindicação 1 ou um sal farmaceuticamenteaceitável deste.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que a doença mediada ABL T315Iresistente ao inibidor BCR-ABL é a leucemia resistente aoinibidor BCR-ABL.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5,CARACTERIZADO pelo fato de que a doença é leucemiamielogenosa crônica resistente ao inibidor BCR-ABL.
7. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que oinibidor de BCR-ABL é Imatinibe.
8. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de queeste é realizado com um composto da fórmula (I) em que R éhidrogênio, R1 é metóxi, R2 é hidrogênio e X é metileno (-CH2-) ou é um heteroátomo ou grupo heteroatômicoselecionados de oxigênio (-0-) ou nitrogênio (-NR-) em queR' é um átomo de hidrogênio, ou um grupo alquil selecionadode metil, etil, isopropil, ciclopropil ou tert-butil, ou umsal farmaceuticamente aceitável deste.
9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que ocomposto da fórmula (I) é selecionado do grupo que consistede:N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-metilpiperazin-l-il)benzamida;N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5, 6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-etilpiperazin-l-il)benzamida;N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5, 6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-isopropilpiperazin-l-il)benzamida;N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-ciclopropilpiperazin-l-il)benzamida;N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-piperidin-l-ilbenzamida;-4-(4-fluoropiperidin-l-il)-N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamidaN-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5, 6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-morfolin-4-ilbenzamida;N-{ 5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-metilpiperazin-l-il)benzamida;N-{ 5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-etilpiperazin-l-il)benzamida; N-{5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-piperidin-l- ilbenzamida;-4-(4-fluoropiperidin-l-il)-N-{5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1, 4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida;-4-morfolin-4-il-N-{5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1, 4 , 5, 6- tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que o composto da fórmula (I) éselecionado do grupo que consiste de:N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidro pirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-A-(4-metilpiperazin-l-il)benzamida;N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1, 4, 5, 6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-etilpiperazin-l-il)benzamida; N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-isopropilpiperazin-l-il)benzamida;N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-ciclopropilpiperazin-l-il) benzamida;
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o composto da fórmula (I) éN-{5—[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-metilpiperazin-l-il)benzamida.
12. Método de rastreamento para a identificar oscompostos capazes de ligar o sitio ATP de uma proteína dequinase, CARACTERIZADO por compreender as etapas de:prover uma mistura de reação que compreende a proteínade quinase, um derivado de indolinona que tem afinidade parao sítio ATP da dita proteína quinase e que é capaz de gerarum sinal fluorescente ao ligar o dito sítio ATP, e diluirconsecutivamente o composto teste, comparar o sinalfluorescente gerado na ausência do composto teste com osinal fluorescente gerado na presença de diferentesconcentrações do composto teste, através do qual um níveldecresecente de fluorescência que indica a habilidade docomposto teste desloca o derivado de indolinona.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de quinase e oderivado de indolinona são pré-misturados.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de quinase e ocomposto teste são pré-misturados.
15. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 12 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que aproteína de quinase é um quinase da ABL.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de que a quinase da ABL é mutanteΤ315Ι da quinase da ABL.
17. Método de acordo com qualquer um dasreivindicações de 12 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que aindolinona é um composto da fórmula (II)<formula>formula see original document page 48</formula>em que Rl é hidrogênio ou metilamino-sulfonil oubenzil-sulfonil, R2 é hidrogênio ou metil, R3 é metil ou 4-clorofenil ou 2,4-difluorofenil.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a indolinona é selecionada dogrupo que consiste de:ácido 2,4-dimetil-5- [2-oxo-5-fenilmetanosulfonil-l, 2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-lH-pirrol-3-carboxílico (2-dietilamino-etil)-amida;-4-(4-clorofenil)-N-[2-(dietilamino)etil]-2-metil-5-((Z)-5{(metilamino)sulfonil]-2-oxo-l,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno}metil)-1 H-pirrol-3-carboxamida;N-[2-(dietilamino)etil]-4-(2,4-difluorofenil)-2-metil--5-((Z)-{5-[(metilamino)sulfonil]-2-oxo-l,2-dihidro-3H-indol--3-ilidenometil}-lH-pirrol-3-carboxamida;-4-(4-clorofenil)-N-[2-(dietilamino)etil]-2-metil-5-[(Z) -(4-metil-2-oxo-l,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno)metil]-1H-pirrol-3-carboxamida.
19. Uso do composto de fórmula (I) ou um salfarmaceuticamente aceitável deste, como definido nasreivindicações 1 ou 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser usadona fabricação de um medicamento para tratar uma doençamediada ABL T315I resistente ao inibidor de BCR-ABL.
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