BRPI0710185A2 - anticorpos contra receptor de fator de crescimento i semelhante à insulina e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

<B>ANTICORPOS CONTRA RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO I SEMELHANTE à INSULINA E USOS DOS MESMOS.<D> A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a IGF-IR, 5 sendo do tipo lgGl ou IgG3 humana e sendo glicosilado com uma cadeia de açúcar em Asn297, sendo o dito anticorpo caracterizado pelo fato de que a quantidade de fucose dentro da dita cadeia de açúcar é pelo menos 99%, e, além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1 ,3-gaíactose N-.terminal é 1% ou menos, tem propriedades aperfeiçoadas na terapia antitumoral.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOSCONTRA RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO I SEMELHANTE ÀINSULINA E USOS DOS MESMOS".

A presente invenção refere-se ao receptor de fator de cresci-mento I semelhante à insulina (IGF-IR), métodos para sua produção, com-posições farmacêuticas contendo os ditos anticorpos, e usos dos mesmos.

Receptor de fator de crescimento I semelhante à insulina (IGF-IR,EC 2.7.112, antígeno CD 221) pertence à família de proteína transmembrâ-nica tirosina cinase (LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 6 (1995) 143-163; eAdams, T. E., Cell. Mol. Life. Sei. 57 (2000) 1050-1093). IGF-IR se liga aoIGF-I com alta afinidade e inicia a resposta fisiológica a este Iigante in vivo.IGF-IR também se liga ao IGF-II, contudo, com afinidade ligeiramente me-nor. A superexpressão de IGF-IR promove a transformação neoplásica dascélulas e há evidência de IGF-IR estar envolvido na transformação malignadas células e é, portanto, um alvo útil para o desenvolvimento de agentesterapêuticos para o tratamento de câncer (Adams, T.E. et al., Cell. Mol. LifeSei. 57 (2000) 1050-1093).

Anticorpos contra IGF-IR são bem-conhecidos do estado da téc-nica e investigados quanto aos seus efeitos antitumorais in vitro e in vivo(Benini, S., et al., Clin. Câncer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., et al.,Câncer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K., et al., Int. J. Câncer 101(2002) 11-16; Brunetti, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165(1989) 212-218; Prigent, S. A., et al., J. Bioi Chem. 265 (1990) 9970-9977;L1, S. L., et al., Câncer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252; Pessino,A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya,K. H., et al., J. BioL Chem. 277 (2002) 16718-16725; Soos, Μ. A., et al., J.Bioi Chem., 267 (1992) 12955-12963; Soos, Μ. A., et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 86 (1989) 5217-5221; O1Brien, R. M., et al., EMBO J. 6 (1987)4003-4010; Taylor, R., et al., Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, Μ. A.,et al., Biochem. J. 235 (1986) 199-208; L1, S. L., et al., Biochem. Biophys.Res. Commun. 196 (1993) 92-98; Delafontaine, P., et al., J. Mol. Cell. Cardi-ol. 26 (1994) 1659-1673; Kull, F. C. Jr., et al., J. Bioi Chem. 258 (1983)6561-6566; Morgan, D. O., e Roth1 R. A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371;Forsayeth1 J. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 3448-3451; S-chaefer, E. M., et al., J. Bioi Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T.A., e Rutter, W. J., J. Bioi Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, Ρ. A., etal., FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, Ρ. A., et al., J. Struct. Bioi 125

(1999) 11-18; Rohlik, Q. T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 149(1987) 276-281; e Kalebic, T., et al., Câncer Res. 54 (1994) 5531-5534; A-dams, T. E., et al., Ceii Moi Life. Sei. 57 (2000) 1050-1093; Dricu, A., et al.,Glycobiology 9 (1999) 571-579; Kanter-Lewensohn, L., et al., Melanoma

Res. 8 (1998) 389-397; Li, S. L., et al., Câncer Immunoi immunother. 49(2000) 243-252). Anticorpos contra IGF-IR estão também descritos em mui-tas outras publicações, por exemplo, Arteaga, C. L., et al., Breast CâncerRes. Treatment 22 (1992) 101-106; e Hailey, J., et al., Mol. Câncer. Ther. 1(2002) 1349-1353.

Em particular, o anticorpo monoclonal contra IGF-IR chamado deoclR3 é largamente usado na investigação que estuda os processos media-dos por IGF-IR e doenças mediadas por IGF-I, tal como câncer. Alfa-IR-3 foidescrito por Kull, F.C., J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566. Nesse ínterim,cerca de cem publicações foram publicadas relacionadas à investigação eao uso terapêutico de alR3 com respeito ao seu efeito antitumoral, sozinhoou junto com agentes citostáticos tais como doxorrubicina e vincristina. alR3é um anticorpo monoclonal murino que é conhecido por inibir a ligação deIGF-I ao receptor de IGF, mas não a ligação de IGF-II ao IGF-IR. alR3 esti-mula, em altas concentrações, a proliferação de células tumorais e a fosfori-lação de IGF-IR (Bergmann, U., et al., Câncer Res. 55 (1995) 2007-2011;Kato, H., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661). Existem outros anticor-pos (por exemplo, 1H7, Li, S.L., et al., Câncer Immunoi Immunother. 49(2000) 243-252), que inibem a ligação de IGF-II ao IGF-IR de forma maispotente que a ligação de IGF-I. Um sumário do estado da técnica de anticor-pos e suas propriedades e características é descrito por Adams, T.E., et al.,Cell. Mol. Life. Sei. 57 (2000) 1050-1093.

A maioria dos anticorpos descritos no estado da técnica é deorigem de camundongo. Tais anticorpos, como é bem-conhecido do estadoda técnica, não são úteis na terapia de pacientes humanos, sem posterioresalterações, tal como quimerização ou humanização. Com base nessas des-vantagens, os anticorpos humanos são claramente preferidos como agentesterapêuticos no tratamento de pacientes humanos. Os anticorpos humanossão bem-conhecidos do estado da técnica (van Dijk, M.A., e van de Winkel,J.G., Curr. Opin. Chem. Bioi 5 (2001) 368-374). Com base em tal tecnologia,podem ser produzidos anticorpos humanos contra uma grande variedade dealvos. Exemplos de anticorpos humanos contra IGF-IR estão descritos emWO 02/053596, WO 2004071529, WO 2005016967 WO 2006008639, US20050249730, US 20050084906, WO 2005058967, W02006013472, US20030165502, WO 2005082415, WO 2005016970, WO 03106621, WO04083248, WO 2003100008, WO 2004087756, WO 2005005635 e WO2005094376.

Contudo, há ainda uma necessidade por anticorpos contra IGF-IR com benefícios convincentes para pacientes que necessitam de terapiaantitumoral. O benefício relevante para o paciente é em termos simples aredução do crescimento do tumor e um significante prolongamento de tempopara progressão causado pelo tratamento com o agente antitumorigênico.

Routier, F. H. et al., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207 repor-tam o padrão de glicolização de um anticorpo IgGI humanizado expressoem células CHO-DUKK. Esse anticorpo mostra uma razão molar de Fuc:Man de 0,8:3,0, que se refere a uma razão de fucosilação de 80%. Niwa, R.et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 reportam anticorpos IgGI elgG3 anti-CD20 produzidos recombinantemente em fucosilação de CHODG44 de 90% resp. 91%. Mimura, Y. et al., J. Immunol. Methods 247 (2001)205-206, reportam que butirato aumenta a produção de IgG quimérica hu-mana em células CHO-K1, enquanto a função e perfil de glicoforma sãomantidos. Os perfis de oligossacarídeos mostram um teor considerável deestruturas de glicana afucosilada. Raju, T. S., BioProcess Internacional 1(2003) 44-53 reporta o impacto da variação de glicosilação por sistemas deexpressão sobre a atividade biológica das imunoglobulinas terapêuticas e anomenclatura. Ma, S. et al., Anal. Chem. 71 (1999) 5185-5192 reportam aanálise de carboidrato de rituximab. Rituximab mostra 9 a 10% de flucosila-ção (Niwa, R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160). Fujii, S., J.Biol. Chem 265 (1990) 6009-6018 reporta que IgG bovina inclui cerca de11% de IgG afucosilada. Mizuochi, T., J. Immunol. 129 (1982) 2016-2020reporta que IgG humana é cerca de 14% afucosilada. Bergwerff, A.A., Gly-conjugate J. 12 (1995) 318-330 reporta que anticorpos produzidos em ca-mundongo SP2/0 contêm oligossacarídeos de ácido N-glicolilneuramínico(NGNA) em grandes quantidades. Nahrgang, S. et al., Animal Cell Techno-logy: Products from Cells, Cells as Products, Bernard, A. et al. (eds.), KluwerAcademic Publishers, Dordrecht, NL, (1999) pp. 259-261, reportam que paraexpressão em CHO de IgGI, depois da transfecção transitória, foi encontra-da uma pobre glicosilação total. Lund, J. et al., Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748 reportam a produção recombinante de um anticorpo quimérico de ca-mundongo/humano em célula de transfectoma de camundongo. O anticorpoIgGI é afucosilado em uma quantidade de 13%. Patel, T.P., et al., Biochem.J. 285 (1992) 839-845 reportam a glicosilação de anticorpos a partir de célu-las hibridoma e ascite de camundongo. Niwa R. et al., J. Immunol. Methods306 (2005) 151-160, reportam para anticorpo IgGI CD20 uma fucosilação de91% depois da produção recombinante em CHO DG44 e Moril, K. et al., Bio-tech. Bioeng. 88 (2004) 901-908 uma fucosilação de 94%. Davies, J. et al.,Biotechol. Bioeng. 74 (2001) 288-294 reportam que a expressão de anticor-pos com glicoformas alteradas leva a um aumento de ADCC. Sheeley, D.M.,et al., Anal. Biochem. 247 (1997) 102-110 comparam a glicosilação de anti-corpos em diferentes sistemas de expressão. Shields, R.L., et al., J. Biol.Chem 277 (2002) 26733-26740 reportam que falta de fucose em Fc de IgGIhumana aperfeiçoa a ligação de FcyRII e ADCC. Um anticorpo Her3 sendocerca de 90% fucosilado mostra também ADCC em uma quantidade consi-derável. Zhu, L., et al., Nature Biotechnol. 23 (2005) 1159-1169, reportam aprodução de anticorpos humanos em ovos de galinha.

Sumário da Invenção

A invenção compreende um anticorpo que se liga ao IGF-IR,sendo do tipo IgGI ou lgG3 humana e sendo glicosilado com uma cadeia deaçúcar em Asn297, em que o dito anticorpo é caracterizado pelo fato de quea quantidade de fucose dentro da cadeia de açúcar é pelo menos 98%("completamente fucosilado", versões preferidas vide abaixo), e, além disso,a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1,3-galactose N-terminal é 1% ou menos.

De acordo com a invenção, "quantidade" significa a quantidadedo dito açúcar dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à somade GO, G1, G2 (sem manose (4 e 5)) como 100% e conforme calculada noexemplo 3.

De acordo com a invenção, é possível proporcionar anticorposque se ligam ao IGF-IR com uma fucosilação de ainda 99,4% ou mais,99,5% ou mais ou 99,9% ou mais.

Preferivelmente, a quantidade de NGNA é de 0,5% ou menos,mais preferivelmente de 0,1% ou menos e ainda não detectável por LCMS(Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa).

Preferivelmente, a quantidade de alfa-1,3-galactose N-terminal é0,5% ou menos, mais preferivelmente 0,1% ou menos e ainda não detectá-vel por LCMS.

A cadeia de açúcar mostra, preferivelmente, as característicasnas glicanas N-Iigadas e ligadas a Asn297 de um anticorpo que se liga aoIGF-IR recombinantemente expresso em uma célula CHO (ovário de hams-ter chinês).

Preferivelmente, a célula CHO é uma célula CHO que compre-ende a deleção (por exemplo, DG44) ou inativação funcional de ambos osalelos DHFR ou uma deleção de um alelo DHFR e uma inativação funcionaldo segundo alelo DHFR (por exemplo, DXB11).

Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Preferi-velmente, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

A invenção compreende preferivelmente um anticorpo comple-tamente fucosilado que se liga ao IGF-IR e que inibe a ligação de IGF-I eIGF-II ao IGF-IR, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo mostra umaou mais propriedades selecionadas do grupo que consiste em:

a) mostra uma razão de valores IC5o de inibição da ligação deIGF-I ao IGF-IR para a inibição de ligação de IGF-II ao IGF-IR de 1:3 a 3:1,

b) inibe para pelo menos 80%, preferivelmente 90%, em umaconcentração de IGF-IR a 5nM a fosforilação em um ensaio de fosforilaçãocelular usando células HT29, em um meio contendo 0,5% de soro de bezer-ro fetal (FCS) termoinativado em comparação com tal ensaio sem o dito an-ticorpo,

c) não mostra atividade estimulante de IGF-IR (nenhuma sinali-zação, nenhuma atividade mimética de IGF-1) medida por fosforilação dePKB em uma concentração de 10μΜ em um ensaio de fosforilação celularusando células 3T3, proporcionando 400.000 a 600.000 moléculas de IGF-IRpor células em um meio contendo 0,5% de soro de bezerro fetal (FCS) ter-moinativado em comparação com tal ensaio sem o dito anticorpo,

d) infra-regula 50% ou mais de IGF-IR expresso em uma célulatumoral (por exemplo, HT29), 24 horas depois da adição do anticorpo à célula.

Os anticorpos de acordo com a invenção mostram benefíciospara pacientes que necessitam de terapia antitumoral e proporcionam a re-dução de crescimento de tumor e um significante prolongamento de tempopara progressão. Os anticorpos de acordo com a invenção têm propriedadesnovas e inventivas que proporcionam um benefício para um paciente quesofre de doença associada a uma desregulação de IGF, especialmente umadoença tumoral. Os anticorpos de acordo com a invenção são caracteriza-dos pelas propriedades mencionadas acima.

Surpreendentemente, um anticorpo de acordo com a invenção("anticorpo completamente fucosilado") não causa ADCC (citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo) (dentro de 3xDP (desvio-padrão) do anticorpo-padrão de referência (anticorpo contra hemocianina delapa californiana, anticorpo contra KLH)) conforme mostrado no ensaio deADCC descrito no exemplo.

Preferivelmente, o anticorpo é de ligação específica para IGF-IR,inibindo a ligação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR na razão mencionada acima, éde isótipo de IgGI, e não é de ativar a sinalização de IGF-IR mesmo nascélulas que superexpressam IGF-IR em uma concentração de 200 vezes doseu valor de IC5O-

Os anticorpos que se ligam ao IGF-IR, não tendo "atividade mi-mética de IGF-I" em combinação com "fucosilação completa", proporcionamuma grande vantagem quando usados como um agente terapêutico.

Preferivelmente, em uma concentração de anticorpos a 5nM deacordo com a invenção inibem completamente a transdução de sinal media-da por IGF-I de IGF-IR em células tumorais.

Ácidos nucléicos preferidos de polipeptídeos, que são capazesde serem montados juntamente com a outra cadeia de anticorpo respectivaa um anticorpo de acordo com a invenção são definidos abaixo:

a) uma cadeia pesada do anticorpo compreendendo como CDRsa CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) e CDR3 (aa 99-107) da SEQ ID NO:1ou 3;

b) uma cadeia leve do anticorpo compreendendo como CDRs aCDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) e a CDR3 (aa 89-98) da SEQ ID NO:2ou 4.

O anticorpo é preferivelmente um anticorpo monoclonal e, alédisso, um anticorpo quimérico (cadeia constante humana), um anticorpo hu-manizado e de modo especialmente preferível um anticorpo humano.

O anticorpo se liga preferivelmente ao IGF-IR humano (EC2.7.1.112, SwissProt P08069) em competição com o anticorpo 18.

O anticorpo é preferivelmente ainda caracterizado por uma afini-dade de IO 8M (K0) ou menos, preferivelmente de cerca de 10"9 e IO13M.

O anticorpo não mostra, preferivelmente, inibição dependente deconcentração detectável de ligação da insulina ao receptor de insulina.

O anticorpo é preferivelmente do tipo IgGI.

O anticorpo, de acordo com a invenção, prolonga de modo con-siderável o tempo para progressão em modelos de tumores de xenoenxertorelevantes em comparação com animais tratados com veículo e reduz ocrescimento do tumor. O anticorpo inibe a ligação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR in vitro e in vivo, preferivelmente em cerca de uma maneira igual paraIGF-I e IGF-H.

Preferivelmente, os anticorpos de acordo com a invenção com-preendem como regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) asseguintes seqüências:

a) uma cadeia pesada do anticorpo compreendendo como CDRsa CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) e CDR3 (aa 99-107) da SEQ ID NO:1ou 3;

b) uma cadeia leve de anticorpo compreendendo como CDRs aCDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) e CDR3 (aa 89-98) da SEQ ID NO:2 ou 4.

Regiões variáveis e CDRs preferidas, especialmente a CDR3 dacadeia pesada dos anticorpos de acordo com a invenção, são proporciona-das por <IGF-1 R> HUMAB Clone 18 (anticorpo 18) e <IGF-IR> HUMAB Clo-ne 22 (anticorpo 22), depositados com Deutsche Sammlung von Mikroorga-nismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemanha.

<table>table see original document page 9</column></row><table>

Esses anticorpos estão descritos em detalhes no WO2005/005635.

Outras regiões variáveis e CDRs preferidas, especialmente C-DR3 da cadeia pesada dos anticorpos de acordo com a invenção são pro-porcionadas por <IGF-1R> HuMab Clone 1a (anticorpo 1A, Ab 1A, ou Ak1 A), <IGF-1R> HuMab Clone 23 (anticorpo 23) e <IGF-1R> HuMab-CIone 8(anticorpo 8), depositado com Deutshce Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemanha:

<table>table see original document page 9</column></row><table>Esses anticorpos essão descritos em detalhes no WO 2004/087756.

A invenção proporciona ainda métodos para a produção recom-binante de tais anticorpos.

A invenção proporciona ainda métodos para o tratamento decâncer, que compreende administrar a um paciente diagnosticado com cân-cer (e, portanto, necessitando de uma terapia antitumoral) uma quantidadeeficaz de um anticorpo antagonista contra o IGF-IR de acordo com a inven-ção. O anticorpo pode ser administrado sozinho, em uma composição far-macêutica, ou alternativamente em combinação com um tratamento citotóxi-co tal como radioterapia ou um agente citotóxico ou um produto deste.

A invenção compreende ainda o uso de um anticorpo de acordocom a invenção para tratamento de câncer e para a fabricação de uma com-binação farmacêutica de acordo com a invenção. Além disso, a invençãocompreende um método para a fabricação de uma composição farmacêuticade acordo com a invenção.

A invenção compreende ainda uma composição farmacêuticacontendo um anticorpo de acordo com a invenção em uma quantidade far-maceuticamente eficaz, opcionalmente juntamente com um tampão e/ou umadjuvante útil para a formulação de anticorpos para fins farmacêuticos.

A invenção proporciona ainda composições farmacêuticas quecompreendem tais anticorpos em um veículo farmaceuticamente aceitável.Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser incluída em umartigo ou kit.

A invenção compreende ainda um método para a produção deum anticorpo humano recombinante de acordo com a invenção, caracteriza-do por expressar um ácido nucléico que codifica um anticorpo que se liga aoIGF-1R em uma célula hospedeira CHO, que fucosila completamente o ditoanticorpo e recupera o dito anticorpo da dita célula. A invenção compreendeainda o anticorpo obtenível por tal método recombinante.

Breve Descrição do Desenho

A figura é um quadro de barras mostrando a atividade da ADCCou falta dela nos anticorpos da invenção e nos anticorpos de controle ecomparativos.

Descrição Detalhada da Invenção

O termo "anticorpo" engloba as várias formas de anticorpos in-cluindo, mas sem limitação, anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpos,anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos geneticamenteengenheirados desde que as propriedades características de acordo com ainvenção sejam mantidas.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção do anti-corpo de tamanho natural, geralmente pelo menos da porção de ligação deantígeno ou a região variável deste. Exemplos de fragmentos de anticorposincluem diacorpos, moléculas de anticorpos de cadeia simples, imunotoxi-nas, e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos.

Os termos "anticorpo monoclonal" e "composição de anticorpomonoclonal", como usados aqui, se referem a uma preparação de moléculasde anticorpos de uma composição de aminoácidos simples. Por conseguinte,o termo "anticorpo monoclonal humano" se refere a anticorpos que exibemuma especificidade de ligação simples, que têm regiões variáveis e constantesderivadas de seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana.

O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo mono-clonal que compreende uma região variável, isto é, região de ligação, deuma fonte ou espécie e pelo menos uma porção de uma região constantederivada de uma fonte ou espécie diferente, usualmente preparada por téc-nica de DNA recombinante. Anticorpos quiméricos compreendendo uma re-gião variável murina e uma região constante humana são especialmente pre-feridos. Tais anticorpos quiméricos murinos/humanos são o produto de ge-nes de imunoglobulina expressos compreendendo segmentos de DNA quecodificam regiões variáveis de imunoglobulina murina e segmentos de DNAque codificam regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formasde "anticorpos quiméricos" englobados pela presente invenção são aquelasem que a classe ou subclasse foi modificada ou alterada daquela do anticor-po original. Tais anticorpos "quiméricos" são também referidos como "anti-corpos mudados de classe". Os métodos para produzir anticorpos quiméri-cos envolvem técnicas convencionais de DNA recombinante e de transfec-ção de gene agora bem-conhecidas da técnica. Vide, por exemplo, Morrison,S.L., et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes US5.202.238 e US 5.204.244.

O termo "anticorpo humanizado" se refere aos anticorpos onde aestrutura ou "regiões determinadoras de complementaridade" (CDR) forammodificadas para compreender a CDR de uma imunoglobulina de especifici-dade diferente em comparação com aquela da imunoglobulina parente. Emuma modalidade preferida, uma CDR murina é enxertada na região de estru-tura de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Vide,por exemplo, Riechmann, L. et al., Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger,M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. CDRs particularmente preferidascorrespondem àquelas que representam seqüências que reconhecem osantígenos mencionados acima para anticorpos quiméricos e bifuncionais.

O termo "anticorpo humano", como usado aqui, tem o objetivode incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas das se-qüências de imunoglobulina de linha germinativa humana. A cadeia pesadavariável é preferivelmente derivada da seqüência de linha germinativa DP-50(GenBank L06618) e a cadeia leve variável é preferivelmente derivada daseqüência de linha germinativa L6 (GenBank X01668) ou a cadeia pesadavariável é preferivelmente derivada de DP-61 (GenBank M99682) e a cadeialeve variável é derivada da seqüência de linha germinativa L15 (GenBankK01323). As regiões constantes do anticorpo são regiões constantes do tipoIgGI humana. Tais regiões podem ser alotípicas e são descritas, por exem-plo, por Johnson, G., e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 e asbases de dados referenciadas aí.

O termo "anticorpo humano recombinante" se refere a anticorpostendo regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglo-bulina da linha germinativa humana em uma forma rearranjada. Os anticor-pos humanos recombinantes, de acordo com a invenção, têm sido submeti-dos a uma hipermutação somática in vivo. Assim, as seqüências de aminoá-cidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüênciasque, embora derivadas de e relacionadas às seqüências de VH e VL da linhagerminativa humana, não podem existir naturalmente dentro do repertório dalinha germinativa do anticorpo humano in vivo.

Como usado aqui, "ligação" refere-se à ligação do anticorpo aoIGF-IR com uma afinidade de cerca de 10"13 e IO 8M (KD), preferivelmente decerca de 10"13 a 10"9M.

O termo "molécula de ácido nucléico", como usado aqui, tem oobjetivo de incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula deácido nucléico pode ser de filamento simples ou de filamento duplo, mas épreferivelmente DNA de filamento duplo.

Domínios constantes humanos tendo do tipo IgGI ou lgG3 sãodescritos em detalhes por Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Im-munological Interest, 5- Edição, Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991), e por Brüggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527.Exemplos são mostrados nas SEQ ID NOS:5 a 8. Outros domínios constantesúteis e preferidos são os domínios constantes dos anticorpos obteníveis daslinhagens de células hibridoma depositadas com DSMZ para esta invenção.

Os domínios constantes do tipo IgGI ou lgG3 são glicosiladosem Asn297. "Asn297", de acordo com a invenção, significa o aminoácidoasparagina localizado em cerca da posição 297 na região de Fc; com basenas variações de seqüência menores dos anticorpos, Asn297 pode ser tambémlocalizada em alguns aminoácidos menores (usualmente não mais que ±3aminoácidos) a montante ou a jusante. Por exemplo, em um anticorpo de acor-do com a invenção, "Asn297" está localizada na posição de aminoácido 298.

A glicosilação da IgGI ou lgG3 humana ocorre em Asn297 comoglicosilação de oligossacarídeo complexo diantenário fucosilado de núcleoterminada com até 2 resíduos Gal (galactose). Essas estruturas são desig-nadas como GO, G1 (a1,6 ou a1,3) ou resíduos de glicana G2, dependendoda quantidade de resíduos Gal terminal (Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003)44-53). Glicosilação tipo CHO da partes de Fc de anticorpo é descrita, porexemplo, por Routier, F.H., Glyconjugate J. 14 (1997) 201-207.A "região variável" (região variável de uma cadeia leve (VL), re-gião variável de uma cadeia pesada (VH)), como usada aqui, denota cadaum do par de cadeias leve e pesada envolvido diretamente na ligação doanticorpo ao antígeno. Os domínios das cadeias, leve e pesada, variáveis,humanas têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatroregiões de estrutura (FR)1 cujas seqüências são largamente conservadas,conectadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões determinadoras decomplementaridade, CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conforma-ção da folha β e as CDRs podem formar circuitos que se conectam com aestrutura da folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas em sua estrutu-ra tridimensional pelas regiões de estrutura e formam juntamente com asCDRs da outra cadeia o sítio de ligação de antígeno. As regiões de CDR3 dacadeia pesada e leve do anticorpo desempenham um papel particularmenteimportante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordocom a invenção e, portanto, proporcionam um outro objeto da invenção.

Os termos "região hipervariável" e "porção de ligação de antíge-no de um anticorpo", quando usados aqui, referem-se aos resíduos de ami-noácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. Aregião hipervariável compreende resíduos de aminoácidos das "regiões de-terminadoras de complementaridade" ou "CDRs". As regiões de "estrutura"ou de "FR" são aquelas regiões de domínios variáveis diferentes dos resí-duos de região hipervariável como aqui definidas. Portanto, as cadeias levee pesada de um anticorpo compreendem a partir da terminação N a C osdomínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Especialmente, C-DR3 da cadeia pesada é a região que contribui mais para a ligação de antí-geno. As regiões de CDR e FR são determinadas de acordo com a defini-ção-padrão de Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5â Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Be-thesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "circuito hipervariável".

O termo "ligação ao IGF-IR", como usado aqui, significa a liga-ção do anticorpo ao IGF-IR em um ensaio in vitro, preferivelmente em umensaio de ligação, onde o anticorpo é ligado a uma superfície e a ligação deIGF-IR é medida por Ressonância de Plasmônio de Superfície (SPR). Liga-ção significa uma afinidade de ligação (K0) de 10"8M ou menos, preferivel-mente 10"13a 10"9M.

A ligação ao IGF-IR pode ser investigada por um ensaio Biacore(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia). A afinidade da ligação é defini-da pelos termos da constante ka (constante de taxa para a associação doanticorpo do complexo de anticorpo/antígeno), kd (constante de dissocia-ção), e K0 (kd/ka). Os anticorpos de acordo com a invenção mostram umaKd de IO10M ou menos.

A ligação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR é também inibida pelosanticorpos de acordo com a invenção. A inibição é medida como IC5o em umensaio para a ligação de IGF-I/IGF-II ao IGF-IR em células tumorais. Tal en-saio é descrito no Exemplo 7. Em tal ensaio, a quantidade de IGF-I ou IGF-IIradiorrotulado ou de fragmentos de ligação de IGF-IR destes ligados ao IGF-IRproporcionados na superfície das ditas células tumorais (por exemplo, HT29)é medida sem e com concentrações crescentes do anticorpo. Os valores deIC5O dos anticorpos de acordo com a invenção para a ligação de IGF-I e IGF-IIao IGF-IR são não mais que 2nM e a razão dos valores IC5o para ligação deIGF-I/IGF-II ao IGF-IR é de cerca de 1:3 a 3:1. Os valores IC50 são medidoscomo a média ou valores médios de pelo menos três medições independen-tes. Valores IC5o simples podem estar fora do escopo.

O termo "inibir a ligação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR", como usa-do aqui, refere-se a inibir a ligação de IGF-I ou IGF-II rotulado com I125 aoIGF-IR apresentado na superfície das células tumorais HT29 (ATCC HTB-38)em um ensaio in vitro. Inibir significa um valor IC5o de 2nM ou inferior.

O termo "células que expressam IGF-IR" refere-se a tais célulasque superexpressam o receptor de IGF-I para cerca de pelo menos 20.000receptores/célula. Tais células são, por exemplo, linhagens de células tumo-rais tal como NCI H322M ou HT29, ou uma linhagem de célula (por exemplo,3T3 ATCC CRL1658) que superexpressa IGF-IR após transfecção com umvetor de expressão para IGF-IR. A quantidade de receptores por célula émedida de acordo com Lammers, R. et al., EMBO J. 8 (1989) 1369-1375.O termo "inibir a fosforilação de IGF-IR" refere-se a um ensaio defosforilação celular usando células 3T3 proporcionando 400.000 a 600.000 mo-léculas de IGF-IR por célula, em um meio contendo 0,5% de soro de bezerrofetal (FCS) termoinativado em comparação com tal ensaio sem o dito anti-corpo. A fosforilação é detectada por Western blotting usando um anticorpoespecífico para proteínas fosforiladas em tirosina. Tal ensaio está descritono Exemplo 11. A termoinativação do FCS é realizada por aquecimento emcurto tempo para 56°C para inativação do sistema de complemento.

O termo "inibição da fosforilação por PKB" refere-se a um ensaiode fosforilação celular células 3T3 proporcionando 400.000 a 600.000 molé-culas de IGF-IR por célula em um meio contendo 0,5% de soro de bezerrofetal (FCS) termoinativado quando em comparação com tal ensaio sem odito anticorpo. A fosforilação é detectada por Western blotting usando umanticorpo específico para PKB fosforilada na serina 473 da PKB (Akt 1, Prot.Acesso Suíço N0 P31749). Tal ensaio está descrito no Exemplo 11.

O termo "citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)"refere-se à Iise de células-alvo tumorais humanas por um anticorpo de acor-do com a presente invenção em presença de células efetoras. ADCC é me-dida preferivelmente pelo tratamento de uma preparação de células que ex-pressam IGF-IR com um anticorpo de acordo com a invenção em presençade células efetoras tais como PBMC recentemente isoladas (células mono-nucleares de sangue periférico) ou células efetoras purificadas de revesti-mentos de creme leucocitário, como monócitos ou células NK (células ex-terminadoras naturais).

O termo "inibição completa da transdução de sinal mediada porIGF-I" refere-se à inibição da fosforilação mediada por IGF-I do IGF-IR. Paratal ensaio, células que expressam IGF-IR, preferivelmente células H322M,são estimuladas com IGF-I e tratadas com um anticorpo de acordo com ainvenção (uma concentração de anticorpo de 5nM ou maior é útil). Subse-qüentemente, uma SDS PAGE é realizada e fosforilação do IGF-IR é medidapor análise de Western blotting com um anticorpo específico para tirosinafosforilada. Inibição completa da transdução de sinal é encontrada se noWestern blot nenhuma banda pode ser visivelmente encontrada, que se refe-re ao IGF-IR fosforilado.

Os anticorpos da invenção mostram preferivelmente uma ligaçãoao mesmo epítopo do IGF-IR como anticorpo 18 ou são inibidos na ligaçãoao IGF-IR devido ao impedimento estérico de ligação pelo anticorpo 18. Ainibição de ligação pode ser detectada por um ensaio SPR usando o anticor-po 18 imobilizado e IGF-IR em uma concentração de 20-50nM e o anticorpoa ser detectado em uma concentração de 100nM. Uma redução de sinal de50% ou mais mostra que o anticorpo compete com o anticorpo 18. Tal en-saio pode ser realizado de mesmo modo usando o anticorpo 22 como umanticorpo imobilizado.

O termo "epítopo" significa um determinante de proteína capazde ligação específica a um anticorpo. Epítopos consistem usualmente emgrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa tais como ami-noácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm usualmente característicasestruturais tridimensionais específicas, bem como características de cargaespecíficas.

Epítopos conformacionais e não-conformacionais são distingui-dos em que a ligação aos anteriores e não aos últimos é perdida em presen-ça de solventes desnaturantes.

Os anticorpos de acordo com a invenção inibem a fosforilaçãode IGF-IR da tirosina e preferivelmente também a fosforilação com PKB datirosina em uma extensão similar.

Os anticorpos de acordo com a invenção infra-regulam preferi-velmente o nível de proteína IGF-IR em células tumorais e em tumores, porexemplo, tumores em xenoenxerto.

Os anticorpos de acordo com a invenção inibem preferivelmenteo crescimento tridimensional das células tumorais em ensaio de formação decolônias bem como a proliferação de células que expressam IGF-IR (por e-xemplo, células NIH 3T3).

Os anticorpos de acordo com a invenção não inibem, preferivel-mente, a ligação de insulina ao receptor de insulina em um ensaio de com-petição de ligação em células 3T3 que superexpressam receptor de insulina,usando o anticorpo em uma concentração de 200 nmols/L.

Os anticorpos de acordo com a invenção são produzidos pormeios recombinantes em uma célula CHO que fucosila completamente oanticorpo. Para a expressão de proteína, os ácidos nucléicos codificam ascadeias leves e pesadas, ou fragmentos destes são inseridos nos vetores deexpressão por métodos-padrão. A expressão é realizada em tais células CHO,e o anticorpo é recuperado das células (sobrenadante ou células após a lise).

Uma célula hospedeira CHO útil pode ser produzida por um mé-todo que compreende cultivar uma célula CHO, transfectada com ácido nu-cléico que codifica um anticorpo de acordo com a invenção, sob pressão deseleção DHFR, colher clones simples expandindo os clones e selecionar umclone que produza um anticorpo com padrão de glicosilação de acordo coma invenção. PreferiveImente, a cultivação é realizada por pelo menos dois,preferivelmente pelo menos três semanas. A célula CHO é preferivelmenteuma célula DG44.

O termo "célula CHO" engloba as várias formas de células deOvário de Hamster Chinês (CHO) com base em dois alelos dhfr (deficientesem diidrofolato redutase (dhfr")), funcionalmente inativos, preferivelmentedeletados. Tais células dhfr" e métodos para sua geração são descritos, porexemplo, por Urlaub, G. et al., Cell 33 (1983) 405-412; Chasin, L. et al., Som.Cell Molec. Genet. 12 (1986) 555-556; Kolkekar, A.S. et al., Biochemistry 36(1997) 10901-10909. Preferivelmente, a célula é uma linhagem de célulaDG44. Tais células CHO dhfr" podem ser produzidas usando raios gama pa-ra eliminar o local dhfr inteiro. Em células do tipo selvagem não-mutadas,dhfr é uma enzima essencial para a síntese de novo de glicina, purinas, etimidilato. Isso permite que o gene de dhfr codificado em plasmídeos sejausado como um marcador selecionável dominante e um ampliador de genepara a expressão de proteínas em linhagens de células deficientes de dhfr".A mutação de dhfr" em célula DG44 é estável e irreversível. As células CHOco-transfectadas com sucesso com vetor(es) de expressão para um anticor-po do tipo de IgGI ou lgG3 humana e o gene de DHFR possuirão o fenótipodhfr+ e podem ser prontamente selecionados por cultura das colônias emmeios isentos de timidina e hipoxantina e contendo, opcionalmente, metotre-xato (MTX) para ampliação.

Células DG44 são bem-conhecidas do estado da técnica e, porexemplo, comercialmente disponíveis como linhagens de células, por exemplo,da Invitrogen Corp. (E.U.A). As células DG44 podem crescer aderentes, emsuspensão e/ou em meio isento de soro. Como usadas aqui as expressões"célula", "linhagem de células" e "cultura de células" são empregadas inter-cambiavelmente e todas tais designações de linhagens de células CHO dhfr"(dois alelos dhfr deletados) incluem progênie. Assim, as palavras "transfor-mantes" e "células transformadas" incluem a célula primária do paciente e asculturas derivadas dela sem consideração ao número de transferências. Étambém entendido que toda a progênie não pode ser precisamente idênticaao teor de DNA, devido às mutações deliberadas ou negligentes. É incluídaa progênie variante que tem as propriedades de glicosilação de acordo coma invenção conforme selecionadas na célula originalmente transformada.

PreferiveImente, a linhagem de células CHO dhfr" é co-ampliadacom pelo menos DHFR como um gene marcador selecionável. Por exemplo,um vetor de expressão de mamífero contendo o(s) marcador(es) selecioná-vel(veis) e o gene de anticorpo são co-transfectados em células CHO recipi-entes. As colônias resultantes podem ser selecionadas e colônias exibindo ofenótipo esperados são capazes de expressarem o anticorpo. Marcadoresselecionáveis adicionais podem ser ou não de natureza dominante. Exem-plos de marcadores selecionáveis adicionais para uso na co-transfecção in-cluem adenosina desaminase (Kaufman, R. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 83 (1986) 3136-3140), asparagina sintetase (Cartier, M., et al., Mol. CellBioL 7 (1987) 1623-1628), gene de E. coli trpB e gene de Salmonella hisD(Hartman, S. C., e Mulligan, R. C., Proc. NatL Acad. Sei. USA 85 (1988)8047-8051), ribonucleotídeo redutase de camundongo M2 (Thelander, M., eThelander, L., EMBO J. 8 (1989) 2475-2479), gene de resistência a multi-fármacos, humano (Kane, S. E., et al., Gene 84 (1989) 439-446), glutaminasintetase (Bebbington, C. R. et al., DNA Cloning, Vol. 111, D. M. Glover (ed.),IRL Press, pp. 163-188, 1987), xantina guanina fosforibosil transferase (gpt)(Mulligan, R. C., e Berg, P., Science 209 (1980) 1422-1427), higromicina B(Santerre, R. F., et al., Gene 30 (1984) 147-156), gene de neomicina (Sou-thern, P. J., e Berg, P., J. Mol. AppL Genet. 1 (1982) 327-341).

Os marcadores selecionáveis podem proporcionar também abase na qual os genes que codificam o anticorpo podem ser ampliados. Naco-transfecção de uma linhagem de células CHO, os DNAs do vetor são fre-qüentemente integrado ao cromossomo da célula no mesmo local. Assim, ouso de somente um dos marcadores selecionáveis, como a base para, am-pliação resulta normalmente em um aumento paralelo do número de cópiasde ambos os genes. Um marcador selecionável particular para uso dessemodo é dhfr que permite a ampliação desejada a ser obtida através do usode concentrações crescentes de MTX (metotrexato). Um segundo marcadorselecionável preferido é GS que permite a ampliação pela adição de metio-nina sulfoximina (MSX).

Naturalmente, os marcadores selecionáveis estão sob controlede elementos reguladores de DNA de modo a proporcionarem sua expres-são. No caso do uso de dhfr como um marcador selecionável, os elementosreguladores são, preferivelmente, de fonte viral tal como de vírus de tumorDNA. Particularmente preferido é o uso de um SV40 ou promotor tardio prin-cipal de adenovírus. É particularmente vantajoso, a esse respeito, remover oelemento intensificador do promotor, assim "danificando" o mesmo eficaz-mente. Essa modificação possibilita níveis aumentados de ampliação de ge-ne em cada concentração de seleção de metotrexato que do contrário ocor-reria se um promotor forte fosse usado. No caso do uso de neomicina comoum marcador selecionável, um exemplo de um promotor adequado é o pro-motor de metalotioneína de camundongo.

Os métodos gerais para produção recombinante de anticorpossão bem-conhecidos do estado da técnica e estão descritos, por exemplo, nosartigos de revisão de Makrides, S. C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202;Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif: 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol.Biotechnoi 16 (2000) 151-161; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.Os anticorpos podem estar presentes nas células inteiras, nosobrenadante, em um Iisado de células, ou em uma forma parcialmente puri-ficada ou substancialmente pura. A purificação é realizada de modo a elimi-nar outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo,outros ácidos nucléicos ou proteínas celulares, por técnicas-padrão, incluin-do tratamento alcalino/SDS, padrão de bandas em CsCI, cromatografia emcoluna, eletroforese em gel de agarose, e outras bem-conhecidos da técnica.Vide Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing e Wiley Interscience, Nova Iorque (1987).

As seqüências de controle que são adequadas para procariotas,por exemplo, incluem um promotor, uma seqüência operadora, e um sítio deligação de ribossomo.

Células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores,intensificadores e sinais de poliadenilação.

O ácido nucléico está "operavelmente ligado" quando é colocadoem uma relação funcional com uma outra seqüência de ácidos nucléicos.Por exemplo, DNA para uma pré-seqüência ou líder secretor é operavelmen-te ligado ao DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensi-ficador é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele afetaa transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo é opera-velmente ligado a uma seqüência de codificação se ele está posicionado demodo a facilitar a tradução. Geralmente, "operavelmente ligado" significa queas seqüências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas, e, no casode um líder secretor, contíguas e em quadro de leitura. Contudo, intensifica-dores não têm que ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios derestrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores ou Iigan-tes de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com a prática con-vencional.

Os anticorpos monoclonais podem ser adequadamente separa-dos de um meio de cultura de hibridoma por procedimentos de purificaçãode imunoglobulina convencionais, tais como, por exemplo, cromatografia emproteína A-Sepharose, hidroxiapatida, eletroforese em gel, diálise, ou croma-tografia de afinidade. DNA e RNA que codificam os anticorpos monoclonaissão prontamente isolados e seqüenciados usando procedimentos conven-cionais. As células hibridoma podem servir como uma fonte de tais DNA eRNA. Uma vez identificado e isolado, o DNA pode ser inserido nos vetoresde expressão, que são então transfectados nas células CHO que de outromodo não produzem a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anti-corpos monoclonais nas células hospedeiras.

A invenção também pertence a imunoconjugados que compre-endem o anticorpo de acordo com a invenção conjugado a um agente citotó-xico tal como um gente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, toxina enzi-maticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, oufragmentos desta), isótopo radiativo (isto é, um radioconjugado) ou um pró-fármaco de um agente citotóxico. Agentes úteis na geração de tais imuno-conjungados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e frag-mentos destas, que podem ser usadas, incluem cadeia de difteria A, frag-mentos ativos de não-ligação da toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (daPseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia demodeccina A, alfa-sarcina, proteínas Aleuritesfordii, proteína diantina, proteí-nas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordicacharantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mito-gelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são feitos usandouma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais tais co-mo N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), deri-vados bifuncionais de imidoésteres; (tal como adimidato de dimetila HCI),ésteres ativos (tal como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tal comoglutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como (p-azidobenzoil) hexanodi-amina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etileno-diamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisociananto de tolueno), e compostosde flúor bis-ativos (tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo,uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito por Vitetta,E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104. Ácido isotiocianatobenzil-3-metil-dietileno triaminapentaacético rotulado com carbono 14 (MX-DTPA) é umexemplo de agente quelante para a conjugação de radionucleotídeo ao anti-corpo. Vide WO 94/11026.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma composição,por exemplo, uma composição farmacêutica contendo um anticorpo da presen-te invenção, formulada junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser tambémadministradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outrosagentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composi-ção da presente invenção com pelo menos um agente antitumoral, como umagente quimioterapêutico, um agente citotóxico ou um pró-fármaco ou outraterapia convencional.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem Adri-amicina, Doxorrubicina, 5-Fluoruracil, Citosina arabinosídeo ("Ara-C"), Ciclo-fosfamida, Tiotepa, Taxotero (docetaxel), Bussulfano, Gencitabina, Citoxina,Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalano, Vimblastina, Bleomicina, Etoposí-deo, lfosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincreistina, Vinorrelbina, Car-boplatina, Teniposídeo, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dacti-nomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (vide a Patente US 4.675.187), Melfa-lano e outras mostardas nitrogenadas relacionadas.

O termo "agente citotóxico", como usado aqui, refere-se a umasubstância que inibe ou impede a função das células e/ou causa a destrui-ção das células. O termo tem o objetivo de incluir isótopos radiativos, agen-tes quimioterapêuticos, e toxinas tais como toxinas enzimaticamente ativasde origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destas.

O termo "pró-fármaco", como usado neste relatório descritivo,refere-se a uma forma de precursor ou de derivado de uma substância far-maceuticamente ativa que é menos citotóxica para as células tumorais emcomparação com o fármaco parente e é capaz de ser enzimaticamente ati-vada ou convertida na forma parente mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman,D. E., Biochemical Society Transactions 14 (1986) 375-382, e Stella, V. J. et al.,"Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed DrugDelivery, Borchardt, R. T. et al., (eds.), PP- 247-267, Humana Press, Clifton,N.J. (1985). Os pró-fármacos desta invenção incluem, mas sem limitação,pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo peptídeo, pró-fármacosmodificados com D-aminoácido, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos deanel de β-lactama, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmentesubstituída ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionlamente substi-tuída, 5-fluorcitosina e outros pró-fármacos de 5-fluouridina que podem serconvertidos no fármaco livre citotóxico mais ativo. Exemplos de fármacoscitotóxicos que podem ser derivatizados em uma forma de pró-fármaco parauso nesta invenção incluem, mas sem limitação, aqueles agentes quimiote-rapêuticos descritos acima.

Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente ativo" inclui qual-quer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentesbactericidas e fungicidas, agentes isotônicos e retardadores de absorção, esimilares que são fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o veículo éadequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, pa-renteral, espinal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão).

Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal queretém a atividade biológica desejada do anticorpo e não confere quaisquerefeitos toxicológicos indesejados (vide, por exemplo, Berge, S. M., et al., J.Pharm. Sei. 66 (1977) 1-19). Tais sais estão incluídos na invenção. Exem-pios de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base.Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicosatóxicos, tais como sais de cloridrato.

Uma composição da presente invenção pode ser administradapor uma variedade de métodos conhecida da técnica. Como será apreciadopor aquele técnico especializado, a via e/ou o modo de administração varia-rão dependendo dos resultados desejados.

Para administrar um composto da invenção por certas vias deadministração, pode ser necessário revestir o compostos com ou co-admi-nistrar o composto com um material para impedir a sua inativação. Por e-xemplo, o composto pode ser administrado a um paciente em um veículoapropriado, por exemplo, lipossomos, ou um diluente. Diluentes farmaceuti-camente aceitáveis incluem soluções salinas e aquosas para tampão.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dis-persões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporâneade solução ou dispersão injetável estéril. O uso de tais meios e de agentespara substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido da técnica.

As frases "administração parenteral" e "administrado parente-ralmente", como usadas aqui, significam modos de administração diferentesde administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limi-tação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal,intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, interdérmica, intraperitoneal, trans-traqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, intra-espinal,epidural, e intra-esternal.

Essas composições podem conter também adjuvantes tais comoconservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dis-persantes. Prevenção da presença de microrganismos pode ser asseguradatanto por procedimentos de esterilização, supra, como pela inclusão de vá-rios agentes bactericidas e fungicidas, por exemplo, parabeno, clorobutanol,fenol, ácido sórbico, e similares. Pode ser também desejável incluir agentesisotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composi-ções. Além disso, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável podeser obtida pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como mo-noestearato e gelatina.

Independente da via de administração selecionada, os compos-tos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hidratadaadequada, e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção sãoformuladas nas formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por méto-dos convencionais conhecidos daqueles versados na técnica.

Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composi-ções farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo aobter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para a obtenção daresposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição emodo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagemselecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos inclu-indo a atividade das composições particulares da presente invenção empre-gadas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excre-ção do composto particular que está sendo empregado, a duração do trata-mento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinaçãocom as particulares composições empregadas, a idade, sexo, peso, condi-ção, saúde geral e histórico médico anterior do paciente que está sendo tra-tado, e fatores similares bem-conhecidos da técnica médica.

A composição deve ser estéril e fluida na medida em que acomposição for administrável por seringa. Além de água, o veículo é preferi-velmente uma solução salina tamponada isotônica.

Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso derevestimento tal como lecitina, por manutenção do tamanho de partícula re-querido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, épreferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois talcomo manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição.

Preferivelmente, um anticorpo completamente fucosilado de a-cordo com a invenção é útil para o tratamento de NSCLC (carcinoma depulmão de não-pequenas células), preferivelmente em combinação com Er-Iotinib (Tarceva®), para o tratamento de câncer da mama, preferivelmenteem combinação com Herceptin® (Trastuzumab), a tumores pancreáticos,preferivelmente em combinação com gencitabina (Gemzar®).

Os seguintes exemplos, figura e listagem de seqüências são for-necidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, cujo verdadeiroescopo está estabelecido nas reivindicações apensas. É entendido que po-dem ser feitas modificações nos procedimentos descritos sem se desviar doespírito da invenção.

ExemplosLinhagens de células

A linhagem de célula parental usada para a geração de uma li-nhagem de célula para expressão de IgG recombinante é uma linhagem decélulas do ovário de hamster chinês (CHO), CHO-DG44 (Flintoff, W. F. et al.,Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261; Flintoff et al., Mol. CeH Biol. 2 (1982)275-285; Urlaub, G. et al., Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G. et al., Somat.Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566). Células CHO-DG44 perderam ambosos locais endógenos para a enzima Diidrofolato Redutase (DHFR).

Células CHO-DG44 foram crescidas em Meio MEM alpha Minus(Gibco N0 22561), 10% de FCS dialisado (Gibco N0 26400-044) e 2 mmols/Lde L-Glutamina, 100μΜ de Hipoxantina, 16μΜ de Timidina (suplemento HT).Plasm ídeos

O sistema de expressão compreendeu o promotor de CMV eestá descrito na tabela 1. Como anticorpo foi usado um anticorpo contra IGF-1R(WO 2005005635; AK18 ou AK22).

Tabela 1

<table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table>

Exemplo 1

Transfeccão e Seleção

A transfecção do plasmídeo de expressão foi efetuada com Fu-gene (Roche Diagnostics GmbH). Um dia depois da transfecção, célulasDG44 foram colocadas sob pressão de seleção consistindo em Meio MEMalpha Minus, 10% de FCS dialisado e 2 mmols/L de L-glutamina e Metotre-xato a 20nM (MTX). Depois de 3 semanas sob pressão de seleção, clonessimples foram colhidos da placa e expandidos.

Sobrenadantes foram coletados e a presença do anticorpo foianalisada com ELISA específico para IgG humana. Subclones foram aindaexpandidos e analisados para a produção de anticorpo específico.

Os clones foram adaptados para crescimento em cultura em sus-pensão e meio isento de soro, HyQ SFM4 CHO-UtiIity (HyCIone n2 SH30516)contendo MTX a 20nM. Em paralelo, o perfil glicopadrão foi determinado. Ossubclones foram selecionados proporcionando a desfucosilação de 2,0% oumenos (com referência à quantidade de oligossacarídeo molar total).

Exemplo 2

Cultivo e Purificação

3x105 células foram crescidas em frascos para agitação de 125mL (Corning) preenchidos com 30 mL de meio a 37°C, 5% de CO2, 100 rpm,por 10 dias. A densidade celular foi medida por Contador CASY e o sobre-nadante foi colhido para determinação da concentração de anticorpo porcromatografia por afinidade com a proteína A. Cerca de 20 mL de cada so-brenadante foram purificados para posterior caracterização bioquímica porcromatografia com Proteína A (equilíbrio com PBS, lavagem com tampão decitrato de sódio a 25mM pH 5,2, eluição com tampão de citrato de sódio a100mM pH 2,8, CIP com NaOH a 10mM).

Exemplo 3

Análise da glicoestrutura do anticorpo

O material de anticorpo purificado foi analisado por análise demapa de peptídeo por Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa. Asamostras foram reduzidas (TRIS/HCI a 0,4M, Guanidina/HCI a 8M, pH 8,5,DTT (3 mg/mL)), carboximetiladas (ácido iodoacético) e clivadas com tripsi-na. A mistura de peptídeo-glicopeptídeo foi separada com RP-HPLC e anali-sada online com espectrometria de massa eletrospray-. Os espectros m/z daglicoestrutura contendo o peptídeo foram integrados e os resultados são da-dos na Tabela 2.Tabela 2

Quantidade relativa de variantes de glicosilação

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Man: Estruturas com alto teor de manose compreendendo entre quatro ecinco resíduos de manose, respectivamente.

GO, G1, G2: cadeias pesadas reduzidas com carboidrato do tipo decomplexo diantenário fucosilado com 1, 2 ou 3 resíduos de galactose terminais.

nonFuc: cadeias pesadas reduzidas com carboidrato do tipocomplexo diantenário sem fucose.

O clone 5 da linhagem de células CHO (hu MAv<IGF-1R>B1-4E10_9-16) foi depositado sob o Tratado de Budapeste sobre reconheci-mento internacional do depósito de microrganismos para fins de procedimen-to patentário, com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultu-ren GmBH (DSMZ)1 Alemanha, em 21 de junho de 2006 sob N0 de AcessoDSM ACC 2795.

Os meios usados para cultivar os clones diferentes foram obtidosda Hyclone (HyQ SFM4 CHO-Utility, usado para os clones 4-6) ou Sigma(C-8862 usados para os clones 1-3 e 7).

A análise de mapa de peptídeo por LCMS foi realizada por inte-gração dos cromatogramas de íon específico de todos os estados de cargapara todos os glicopeptídeos.

GIcNac de bissecção, NGNA e alta manose foram determinadosde mesmo modo.GIcNac de bissecção e NGNA não foram detectáveis. Assim, aquantidade de NGNA é 0,5% ou inferior, e é também 0,1% ou inferior. A quanti-dade de GIacNac de bissecção é também 0,5% ou inferior, e 0,1% ou inferior.

Um exemplo de cálculo de glicosilação é mostrado na Tabela 3(Tabela 3a: clone 3, Tabela 3b: clone 5; peptídeo compreendendo asn298,designado como H27).

<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>

Área: área de pico

H27_ G0_ H27_G4: Glicopeptídeo H27 (contendo Asn298) com

carboidrato do tipo complexo diantenário fucosilado com galactose x-terminal(por exemplo, G4 com 4 unidades de galactose)

Quantidade relativa sem Fuc: percentagem de Fuc em relação atodos os GO, G1, G2 sem glicoestrutura de manose (4 e 5) (alta manose).

H27_G1-1 NGNA - H27_G3_2NGNA: Glicopeptídeo H27 (con-tendo Asn298) com carboidrato do tipo complexo diantenário fucosilado comunidades de galactose x-terminal (por exemplo, G2 com 2 unidades) com-preendendo um a dois ácidos N-glicolil-neuramínicos.

Quantidade relativa sem Fuc: percentagem de Fuc em relação dostodos os GO, G1, G2 sem glicoestrutura de manose (4 e 5) (manose alta).

Tabela 3b

Exemplo de cálculo de qlicosilacão (clone 5)

<table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table>1)glicoestrutura do tipo complexo diantenário fucosilado com ga-Iacose x-terminal (O, 1, 2, 3, e 4, respectivamente)

2)glicoestrutura do tipo complexo diantenário fucosilado com ga-Iacose x-terminal (O, 1, 2, 3, e 4, respectivamente) com resíduos de ácidos n-glicolil neuramínico

3)glicoestruturas do tipo complexo diantenário fucosilado (princi-palmente produtos do método)

4)estruturas de manose alta compreendendo quatro ou cinco re-síduos, respectivamente

5)glicoestruturas não fucosiladas

Exemplo 4

Determinação das funções efetoras mediadas pelo anticorpo por anti-IGF-IRHuMAbs

De modo a determinar a capacidade dos anticorpos HuMAb ge-rados de elicitarem os mecanismos imunoefetores, foram realizados estudosde citotoxicidade de célula dependente de anticorpo (ADCC).

Para estudar os efeitos dos anticorpos em ADCC, células decâncer da próstata DU145 (HTB-81 ATCC; 1 χ 106 em 2 a 4 mL de RPMI-FM) expressando IGF-IR foram marcadas com 1 μl de solução de 2,2':6',6"-terpiridina-6,6"-dicarboxilato de bis(acetoximetila) (BTDA) por 25 minutos, a37°C, em uma incubadora de células. As células foram lavadas, quatro ve-zes, com 10 mL de RPMI-FM e giradas por 10 minutos a 200 xg com freio.Depois disso, as células foram ajustadas para uma concentração de 1 χ 105células por mL. Cinco mil células foram plaqueadas por cavidade em umaplaca de fundo redondo correspondente a um volume de 50 μl. AnticorposHuMAb foram adicionados em uma concentração final variando de 25-0,1ng/mL em um volume de 50 μΙ de meio de cultura de células. Subseqüente-mente, 50 μl- de células efetoras, PBMC recentemente isoladas de sangueintegral ou de células efetoras purificadas de cremes leucocitários foram adi-cionados em uma razão de E:T na faixa de 25:1. As placas foram imediata-mente centrifugadas por 1 minuto a 200 xg com freio, e incubadas por 2 ho-ras a 37°C. Depois da incubação, as células foram giradas por 10 minutos a200 xg e 20 μL de sobrenadante foram transferidos para uma placa de mi-crotitulação Optiplate 96-F. Duzentos microlitros de solução de Europium (natemperatura ambiente) foram adicionados e a mistura foi incubada por 15minutos em um agitador. A fluorescência resultante foi medida em um fluo-rímetro resolvido por tempo usando o protocolo EU-TDA da Perkin Elmer.

A magnitude de Iise celular por ADCC é expressa como % daliberação máxima de TDA das células-alvo Iisadas por detergente, corrigidapara liberação espontânea do 2,2':6',2"-terpiridina-6,6"-dicarboxilato (TDA)das células-alvo, respectivas. Como referência padrão de um anticorpo mos-trando "não ADCC" é usado um anticorpo (monoclonal) contra KLH (hemoci-anina de lapa califomiana) do mesmo tipo de IgG ou uma mistura de IgGisolada de cerca de 35.000 doadores ("Redimune"). Um anticorpo 75% livrede fucose mostrou uma liberação de TDA que está dentro de 3xDP da libe-ração de TDA do anticorpo-padrão (Figura 1).Exemplo 5

Determinação da afinidade de anticorpos anti-IGF-IR por IGF-IRInstrumento: BIACORE® 3000Chip: CM5

Acoplamento: acoplamento de aminaTampão: HBS (HEPES, NaCI), pH 7,4, 25°C

Para medições de afinidade, anticorpos FCy anti-humanos (decoelho) foram acoplados à superfície do chip para apresentação do anticor-po contra IGF-IR. O domínio extracelular de IGF-IR foi adicionado em váriasconcentrações em solução. A associação foi medida por injeção de IGF-IRde 3 minutos; a dissociação foi medida por lavagem da superfície do chipcom tampão por 5 minutos. Os dados de afinidade para os anticorpos 18 e22 estão mostrados na Tabela 4.Tabela 4

Dados de afinidade medida por SPR (BIACORE® 3000)

<table>table see original document page 36</column></row><table>Exemplo 6

Inibicão da ligação de IGF-I e IGF-II às células tumorais que expressam IGF-IRDe modo a determinar a capacidade do anticorpo da invençãode bloquear a ligação dos Iigantes IGF-I e IGF-II ao receptor de IGF-I (IGF-IR),foram realizados experimentos de competição do peptídeos Iigantes rotula-dos radiativamente.

Células tumorais humanas (HT29, NCI H322M, 0,5 a 1 χ 105 cé-lulas/mL) foram plaqueadas em meio RPMI 1640 (PAA, Cat. N0 E15-039)suplementado com L-Glutamina a 2mM, 1 χ de aminoácidos não-essenciais(Gibco, Cat. N0 11140-035), piruvato de sódio a 1mM (Gibco, Cat. N0 11360-039)e 10% de FCS termoinativado (PAA, Cat. N0 A15-771). Seis garrafas no formatoT175 foram inoculadas com 20 ml_ de células no meio respectivo para cadaexperimento e cultivadas por dois dias a 37°C e 5% de CO2 para obter mo-nocamadas de células confluentes.

Para coletar células individuais, 2 mL de 1x Tripsina/EDTA (Gib-co, Cat N0 25300-054) por frasco T175 foram adicionados e o desprendi-mento das células foi monitorado com microscópio Axiovert25. As célulasforam coletadas e o meio com 10% de FCS como descrito anteriormente foiadicionado para um volume total de 50 mL. As células foram reisoladas porcentrifugação, durante 10 minutos, a 1.000 rpm (Heraeus, Omnifuge 2.0 RS)e ressuspensas em 50 mL de tampão de ligação (NaCI a 120mM, KCI a5mM, MgSO4 a 1,2mM, EDTA a 1mM, D(+)glicose a 10mM, NaAc a 15mM, He-pes a 100mM pH 7,6, 1% de BSA). As células foram contadas, reisoladas porcentrifugação e ajustadas com tampão de ligação para 1 χ 106 células/mL.

Peptídeos de IGF-I e IGF-II rotulados com I125 (Amersham, -2.000de Ci/mmol, Cat N0 IM172 e IM238), solubilizados em 0,1% de CH3COOH,foram diluídos em tampão de ligação para uma atividade final de 4 χ 105contagens/(minuto χ mL). Setenta e cinco microlitros de anticorpo nas con-centrações especificadas juntamente com 25 μί de peptídeo de IGF-I ou deIGF-II rotulado com I125 pré-diluído foram adicionados a 200 μl de suspen-são de células e incubados por 3,5 h, a 4°C. As células foram reisoladas porcentrifugação por 5 minutos a 2.000 rpm (Eppendorf, 5415C) e o sobrena-dante removido. Depois de lavagem, duas vezes, em 1 mL de tampão deligação, as células foram ressuspensas em 1 mL de tampão de ligação etransferidas para tubos de cintilação. A quantidade de peptídeo radiativo li-gado aos receptores de superfície de células foi medida em um contador decintilação.

O valor IC5o médio para o anticorpo 18 é de 0,3nM. Não podeser observada nenhuma inibição detectável para ligação de IGF-II.

Exemplo 7

Ensaio de competição anticorpo para ligação de IGF-IR

Para mapeamento de epítopo de anticorpos monoclonais anti-IGF-IR, um formato similar para a medição de afinidade (Exemplo 5) foi se-lecionado, mas IGF-IR foi pré-incubado por pelo menos 0,5h à temperaturaambiente com o anticorpo em solução. Essa mistura foi injetada e ligação(ou inibição) ao IGF-IR foi detectada. Esse ensaio permite medir a atividadeinibidora recíproca de anticorpos monoclonais para ligação ao IGF-IR. Foiverificado que os anticorpos da invenção competem para ligação ao IGF-IRcom alR3, um anticorpo que é conhecido por ligar-se a aa 217-274 (Gustaf-son, T.A., e Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667).

Exemplo 8

Inibição de fosforilacão mediada por IGF-I de IGF-IR e Akt/PKB

De modo a determinar a capacidade do anticorpo da invençãode inibir a ativação e fosforilação do receptor de IGF-I (IGF-IR), experimentosde competição foram realizados com peptídeo de IGF-I e subseqüente análi-se de Western blotting com anticorpos específicos para tirosina fosforilada.

Células tumorais humanas (HT29, NCI H322M, 5 χ 10"4 célu-las/mL) foram plaqueadas em meio RPMI 1640 (PAA, Cat. N0 E15-039) su-plementado com L-Glutamina a 2mM, 1 χ de aminoácidos não essenciais(Gibco, Cat. N0 11140-035), piruvato de sódio a 1mM (Gibco, Cat. N0 11360-039) e 0,5% de FCS termoinativado (PAA, Cat. N0 A15-771). Para determi-nação dos valores IC50, placas de 12 cavidades foram incubadas com 1 mLde células no meio respectivo para cada experimento e cultivadas por doisdias, a 37°C e 5% de CO2.

Depois de 48 horas de cultivo com meio de soro baixo, o meiofoi cuidadosamente removido e substituído por concentrações diferentes deanticorpo diluídos no meio respectivo. Depois de 5 minutos a 37°C e 5% deCO2, peptídeo de IGF-I foi adicionado em uma concentração final de 2nM eas células foram novamente incubadas por 10 minutos sob as condiçõesmencionadas acima. O meio foi cuidadosamente removido por aspiração e100 μΙ_ de tampão de Iise gelado foram adicionados por cavidade (Hepes a50mM pH 7,2, NaCI a 150mM, EGTA a 1mM, 10% de glicerol, 1% de Tri-ton®-X100, NaF a 100mM, Na4P2O7 a 10mM, inibidor de protease Comple-te®). As células foram desprendidas usando um raspador de células (Cor-ning, Cat. N0 3010) e os conteúdos das cavidades foram transferidos paratubos de reação Eppendorf. Fragmentos de células foram removidos porcentrifugação por 10 minutos, a 13.000 rpm e a 4°C e metade do sobrena-dante foi adicionada a 2x tampão de amostra Laemmli em uma razão 1:1(v/v). Para imunoprecipitação do IGF-IR, o sobrenadante remanescente doIisado de células foi submetido a uma rotação de clarificação (10 minutos, a13.000 rpm e a 4°C) imediatamente antes de 1 μΙ_ de um anticorpo policlonalcontra IGF-IRp (C-20, Santa Cruz Biotechnologies) ou de um anticorpo mo-noclonal murino (IgGI) que reconhece um epítopo dentro dos aminoácidos440-586 do domínio extracelular (α-cadeia) do Receptor do Tipo 1 de IGFhumano ser adicionado (mAb 24-55, GroPep). Depois de 2 horas de incuba-ção a 4°C, em um tubo de reação Eppendorf, em rotação, 25 μL de contasde Proteína G Sepharose® (Amersham Biosciences, Cat. N0 17-0618-01)foram adicionados seguidos por uma outra etapa de incubação de 1 hora a4°C. As contas com complexos de anticorpo-proteína ligados foram isoladaspor centrifugação (1 minuto a 2.000 rpm e 4°C) e lavadas três vezes comtampão de lavagem (tampão de Iise com somente 0,1% de Triton®-X100).Depois de ferver as contas em tampão de amostra Laemmli, proteínas celu-lares foram separadas por SDS-PAGE e transferidas a uma membrana denitrocelulose (PROTRAN® BA 85, Schleicher&SchuelI) por Western blottingsemi-seco.Um anticorpo específico de fosfotirosina (Upstate, clone 4G10,Cat. N0 05-321) foi usado para determinar o estado da fosforilação do IGF-IRimunopurificado. Para a detecção de Akt/PKB fosforilado, foi aplicado umanticorpo com especificidade para Ser473 fosforilada (Cell Signalling, Cat.N0 9271).

Foi verificado que o anticorpo 18 pode inibir a fosforilação medi-ada por IGF-1 de IGF-1R e PKB com uma IC50 de 0,6nM.

Exemplo 9

Indução de infra-regulação mediada por anticorpo de IGF-IR in vitro

De modo a detectar os efeitos do anticorpo da invenção sobre aquantidade de receptor de IGF-I (IGF-IR) em células tumorais, foram realiza-dos experimentos de tempo-curso e subseqüente análise de Western blot-ting com anticorpos específicos para IGF-IR.

Células tumorais humanas (HT29, 5 χ 104 células/mL) em meioRPMI 1640 (PAA, Cat. N0 E15-039) suplementado com L-Glutamina a 2mM,1 χ de aminoácidos não essenciais (Gibco, Cat. N0 11140-035), piruvato desódio a 1mM (Gibco, Cat. N0 11360-039) e 10% de FCS termoinativado(PAA, Cat. N0 A15-771). Para cada período de incubação, uma placa de 12cavidades foi inoculada com 1 ml_ de células no meio respectivo para cadaexperimento e cultivada por 24 horas, a 37°C, e 5% de CO2.

O meio foi cuidadosamente removido e substituído por concen-trações diferentes de anticorpo diluído no meio respectivo. Em duas cavida-des de controle, o meio foi substituído ou por meio sem anticorpo ou pormeio com um anticorpo de controle (AB-1, Oncogene, Cat. N0 GR11). Ascélulas foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 e placas individuais foram tiradaspara posterior processamento depois de 15 minutos, 24 horas e 48 horas.

O meio foi cuidadosamente removido por aspiração e 100 μΙ_ detampão de Iise gelado foram adicionados por cavidade (Hepes a 50mM pH7,2, NaCI a 150mM, EGTA a 1mM, 10% de glicerol, 1% de Triton® -X100,NaF a 100mM, Na4P2O7 a 10mM, inibidor de protease Complete®). As célulasforam desprendidas usando um raspador de células (Corning Cat. N0 3010) eos conteúdos das cavidades transferidos para tubos de ensaio Eppendorf.Os fragmentos de células foram removidos por centrifugação por 10 minutos,a 13.000 rpm, e a 4°C e o sobrenadante foi adicionado a 2x tampão de a-mostra Laemmli em uma razão 1:1 (v/v). As proteínas celulares foram sepa-radas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose(PROTRAN® BA 85, Schleicher&SchuelI, Cat. N0 10 401196) por Westernblotting semi-seco.

Um anticorpo específico para IGF-IR (C-20, Santa Cruz Biotech-nologies, Cat. N0 sc-713) foi usado para determinar os níveis de proteína deIGF-IR.

Foi observada infra-regulação do IGF-IR induzida pelo anticorpoda invenção depois de menos de 24 horas após a adição do anticorpo.Exemplo 10

Inibição da ligação de insulina a células 3T3 que expressam receptor de insu-lina humana

De modo a determinar se o anticorpo da invenção também blo-queia a ligação de insulina ao receptor de insulina (IR), foram realizados ex-perimentos de competição com um peptídeo de Iigante rotulado radiativa-mente.

Células 3T3 (1 χ 105/mL) expressando recombinantemente altosnúmeros (>105) de IR humana foram plaqueadas em um meio DulbeccoMEM (DMEM) com glicose alta (PAA, Cat. N0 E15-009) suplementado comL-glutamina a 2mM (Gibco, Cat. N0 25030-024) e 10% de FCS termoinativa-do (PAA, Cat. N0 A15-771). Seis garrafas no formato T175 foram inoculadascom 20 mL de células no meio respectivo para cada experimento e cultiva-das por dois dias a 37°C e 5% de CO2 para obter monocamadas de célulasconfluentes.

Para coletar células individuais, 2 mL de 1x Tripsina/EDTA (Gibco,Cat N0 25300-054) por frasco T175 foram adicionados e o desprendimento dascélulas foi monitorado com microscópio. As células foram coletadas e o meiocom 10% de FCS como descrito anteriormente foi adicionado para um volu-me total de 50 mL. As células foram reisoladas por centrifugação, durante 10minutos, a 1.000 rpm e ressuspensas em 50 mL de tampão de ligação (NaCIa 120mM, KCI a 5mM, MgSO4 a 1,2mM, EDTA a 1 mM, D(+) glicose a 10mM,NaAc a 15mM, Hepes a IOOmM pH 7,6, 1% de BSA). As células foram con-tadas, reisoladas por centrifugação e ajustadas com tampão de ligação para1 χ 106 células/mL.

Peptídeos de insulina rotulados com I125 (Amersham, Cat. N0IM166, -2.000 de Ci/mmol), solubilizados em 0,1% de CH3COOH, foram di-luídos em tampão de ligação para uma atividade final de 4* 105 contagens/(minuto*mL). Setenta e cinco microlitros de anticorpo juntamente com 25 μΙ_de peptídeo de insulina foram adicionados a 200 μΙ_ de suspensão de célu-Ias (concentração de anticorpo final de 200nM) e incubados por 3,5 h, a 4°C.As células foram reisoladas por centrifugação por 5 minutos a 2.000 rpm e osobrenadante removido. Depois de lavagem, duas vezes, em 1 mL de tam-pão de ligação, as células foram ressuspensas em 1 mL de tampão de liga-ção e transferidas para tubos de cintilação. A quantidade de peptídeo radia-tivo ligado aos receptores de superfície de células foi medida em um conta-dor de cintilação.

Os resultados demonstram que o anticorpo da invenção não in-terfere com a ligação de insulina ao receptor de insulina.

Exemplo 11

Nenhum estímulo de IGF-IR e fosforilacão de Akt/PKB

De modo a excluir as atividades estimuladoras de IGF-IR do an-ticorpo da invenção, fosforilação do IGF-IR foi determinada em ausência doIigante de IGF-I, mas em presença do anticorpo da invenção e um anticorpode referência (oclR3, Oncogene, Alemanha). Isso foi realizado por análise deWestern blotting com anticorpos específicos para o estado de fosforilação.Células 3T3 (ATCC CRL 1658) transfectadas com IGF-IR (5*104 cells/mL,Pietrzkowski, Z., et al., Cell Growth Differ. 4 (1992) 199-205) foram plaqueadasem meio Dulbecco MEM (DMEM) com glicose alta (PAA, Cat N0 E15-009) su-plementado com L-Glutamina a 2mM (Gibco, CatNo. 25030-024) e 0,5% deFCS termoinativado (PAA, Cat N0 A15-771) ou células tumorais humanas(HT29, NCI H322M, 5*104/mL) em meio RPMI 1640 (PAA, Cat N0 E15-039)suplementado com L-Glutamina a 2mM, 1x de aminoácidos não-essenciais(Gibco, Cat N0 11140-035), piruvato de sódio a 1mM (Gibco, Cat N0 11360-039)e 0,5% de FCS termoinativado (PAA, Cat N0 A15-771). Para determinação dosvalores IC50, placas de 12 cavidades foram inoculadas com 1 ml de célulasno meio respectivo para cada experimento e cultivadas por dois dias a 37°Ce 5% de CO2.

Depois de 48 horas de cultivo com meio de soro baixo, o meiofoi cuidadosamente removido e substituído por concentrações diferentes deanticorpo diluído no meio respectivo. As células foram incubadas por 15 mi-nutos sob as condições mencionadas acima. O meio foi cuidadosamenteremovido por aspiração e 100 μl de tampão de Iise gelado foram adiciona-dos por cavidade (Hepes a 50mM pH 7,2, NaCI a 150mM, EGTA a 1mM,10% de glicerol, 1% de Triton®-X100, NaF a 100mM, Na4P2O7 a 10 mM, ini-bidor de protease Complete®). As células foram desprendidas usando umraspador de células (Corning, Cat. N0 3010) e os conteúdos das cavidadesforam transferidos para tubos de ensaio Eppendorf. Fragmentos de célulasforam removidos por centrifugação por 10 minutos, a 13.000 rpm e a 4°C(centrífuga Eppendorf 5415R) e metade do sobrenadante foi adicionada a 2xde tampão de amostra Laemmli em uma razão 1:1 (v/v). Para imunoprecipi-tação do IGF-IR, o sobrenadante remanescente dos Iisados de células foisubmetido a uma rotação de clarificação (10 minutos, a 13.000 rpm e a 4°C)imediatamente antes de 1 μL de um anticorpo policlonal contra IGF-IRp seradicionado (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Cat. N0 sc-173 ou mAb 24-55, GroPep. Cat. N0 MAD1). Depois de 2 horas de incubação a 4°C, em umtubo de reação Eppendorf, em rotação, 25 μL de contas de Proteína G Se-pharose® (Amersham Biosciences, Cat. N0 17-0618-01) foram adicionadosseguidos por uma outra etapa de incubação de 1 hora a 4°C. As contas comcomplexos de anticorpo-proteína ligados foram isoladas por centrifugação (1minuto a 2.000 rpm e 4°C) e lavadas três vezes com tampão de lavagem(tampão de Iise com somente 0,1% de Triton®-X100). Depois de ferver ascontas em tampão de amostra Laemmli, proteínas celulares foram separa-das por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose(PROTRAN® BA 85, Schleicher&SchuelI, Cat. N0 10 401196) por Westernblotting semi-seco.

Um anticorpo específico de fosfotirosina (Upstate, clone 4G10,Cat. N0 05-321, reconhecendo proteína fosforiladas em tirosina) foi usadopara determinar o estado da fosforilação do IGF-IR imunopurificado. Para adetecção de Akt/PKB fosforilado, foi aplicado um anticorpo contra Aktl comespecificidade para Ser473 fosforilada (Cell Signalling, Cat. N0 9271).

Foi observado que a Akt/PKB cinase a jusante na via de sinali-zação do IGF-IR foi ativada significantemente pelo anticorpo de referênciaem concentrações mais altas que 5nM, mas não pelo anticorpo da invenção,em concentrações até 10.000nM.

Exemplo 12

Indução de infra-regulacão do receptor em modelos de xenoenxerto H322M

Tumores foram induzidos em camundongos nús ("nude") e tra-tados uma vez com concentrações diferentes do anticorpo da invenção. Vin-te e quatro horas depois do tratamento, os tumores foram extraídos e homo-geneizados sob nitrogênio líquido. Tampão de Iise gelado foi adicionado(Hepes a 50mM pH 7,2, NaCI a 150mM, EGTA a 1mM, 10% de glicerol, 1%de Triton®-X100, NaF a 100mM, Na4P2O7 a 10 mM, inibidor de proteaseComplete®, PMSF a 1mM) em uma razão de volume de tampão para pesode tumor de 3:1 e inteiramente misturados com o homogeneizado de tumorem descongelamento. Depois de solubilizar, o tecido por 15 minutos sobregelo, fragmentos insolúveis foram removidos por centrifugação por 10 minu-tos, a 13.000 rpm e a 4°C (centrífuga Eppendorf 5415R). A concentração deproteína das amostras foi determinada com os Reagentes Micro BCA® (Pier-ce), e tampão de Iise foi adicionado para ajuste de concentrações iguais.Parte do sobrenadante foi adicionada a 2x de tampão de amostra Laemmliem uma razão de 1:1 (v/v). As proteínas celulares foram separadas porSDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (PROTRANBA 85, Schleicher&SchuelI, Cat. N0 10 401196) por Western blotting semi-seco. Um anticorpo específico de IGF-IR (C-20, Santa Cruz Biotechnologies,Cat. N° sc-713) foi usado para detectar IGF-IR.

Mediante tratamento com o anticorpo da invenção, foi observadoum decréscimo dependente de concentração dos níveis de IGF-IR com umaEC50 estimada em 0,6 mg/kg.

Exemplo 13

Inibicão de crescimento de tumores H322M

Os efeitos do anticorpo 18 in vivo foram investigados por indu-ção de tumores em camundongos nús atímicos de acordo com métodos es-tabelecidos. Células H322M NSCLC humanas foram co-injetadas juntas comMatrigel, subcutaneamente, em camundongos nu atímicos de 6 a 7 semanasde idade (nu/nu). Para esse propósito, 5 χ 106 células H322M foram concen-tradas em 100 μΙ_ de Matrigel. Duzentos microlitros dessa mistura foram inje-tados nos flancos direitos dos camundongos. O volume de tumor foi calcula-do por medição dos diâmetros tumorais com calibradores Vernier1 duas ve-zes na semana, de acordo com a fórmula publicada por Geran et al. ("Proto-cols for screening chemical agents and natural products against animal tu-mors and other biological systems", Câncer Chemother. Rep. 11.301, 1972),onde o volume do tumor [mg] = (comprimento χ largura)2).

O anticorpo foi administrado intraperitonealmente (i.p.) a 10mUkg. O tratamento foi iniciado com doses duplas do anticorpo administradoem volumes duplos. Os tumores foram induzidos em camundongos nús con-forme descrição acima. Depois dos tumores terem crescidos para um volu-me médio de 160 mg, os camundongos foram tratados intraperitonealmenteseis vezes, uma vez por semana com 6, 0,6 e 0,06 mg/kg de anticorpo comodoses consecutivas começando com 12, 1,2 e 0,12 mg/kg como dose inicialdada uma vez no primeiro dia do tratamento. O experimento demonstra queo bloqueio do eixo do IGF-IR por mAb 18 anti-IGF-IR rhu resulta em eficáciaantitumoral quando administrado como um agente único em 6 e 0,6 mg/kg.Em contraste, 0,06 mg/kg não teve efeito sobre o crescimento de tumor.

Além disso, o anticorpo 18 foi testado em combinação com gen-citabina no mesmo modelo. Os tumores foram induzidos conforme descriçãoacima e o tratamento foi iniciado, quando os tumores haviam sido estabele-cidos, uma vez por semana i.p., em 6 e 0,6 mg/kg e em combinação com 62mg/kg de gencitabina em 0,6 mg. Gencitabina foi administrada, um ciclo, istoé, a cada três dias por quatros vezes no total. O tratamento foi iniciado poradministração de doses duplas. O experimento demonstrou que o tratamen-to com o anticorpo 18 administrado uma vez a cada sete dias inibe o cresci-mento do tumor por ele mesmo e intensifica a eficácia da gencitabina, umcomposto antimetabólico conhecido.

Exemplo 14

Inibição do crescimento de tumores 3T3

Os tumores foram induzidos em camundongos nús essencial-mente conforme descrito no Exemplo 15, exceto que fibroblastos 3T3 muri-nos superexpressando o IGF-IR humano foram usados. Os camundongoscom tumores estabelecidos de aproximadamente 180 mg foram tratados in-traperitonealmente uma vez na semana, sete vezes, com 18, 6 ou 0,6 mg/kgdo anticorpo 18. O tratamento foi iniciado com doses duplas do anticorpodadas como dose inicial (36, 12 e 1,2 mg/kg). O experimento demonstra quepor tratamento com o anticorpo, o crescimento do tumor pode ser retardadoquando administrado com 18 e 6 mg/kg, uma vez na semana.

Exemplo 15

Indução de infra-requlacão mediada por anticorpo do IGF-1R in vitro

De modo a detectar os efeitos do anticorpo da invenção sobre aquantidade do receptor de IGF-I (IGF-IR) em células tumorais, foram realiza-dos experimentos em tempo-curso e subseqüente análise de Western blot-ting com anticorpos específicos de IGF-IR.

Células tumorais humanas (HT29 5 χ 104 células/mL) em meioRPMI 1640 (PAA, Cat. N0 E15-039) suplementado com L-Glutamina a 2mM,1 χ de aminoácidos não essenciais (Gibco, Cat. N0 11140-035), piruvato desódio a 1mM (Gibco, Cat. N0 11360-039) e 10% de FCS termoinativado(PAA, Cat. N0 A15-771). Para cada período de incubação, uma placa com 12cavidades foi inoculada com 1 mLde células no respectivo meio para cadaexperimento e cultivada por dois dias a 37°C e 5% de CO2.

O meio foi cuidadosamente removido e substituído por concen-trações diferentes de anticorpo diluído no meio respectivo. Em duas cavida-des de controle, o meio foi substituído ou por meio sem anticorpo ou pormeio com um anticorpo de controle (AB-1, Oncogene, Cat. N0 GR11). Ascélulas foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 e placas individuais foram tira-das para posterior processamento depois de 15 minutos, 24 horas e 48 horas.

O meio foi cuidadosamente removido por aspiração e 100 μί detampão de Iise gelado foram adicionados por cavidade (Hepes a 50mM pH7,2, NaCI a 150mM, EGTA a 1mM, 10% de glicerol, 1% de Triton® -X100,NaF a 100mM, Na4P207 a 10mM, inibidor de protease Complete®). As célulasforam desprendidas usando um raspador de células (Corning Cat. N0 3010)e os conteúdos das cavidades transferidos para tubos de reação Eppendorf.

Os fragmentos de células foram removidos por centrifugação por 10 minutos,a 13.000 rpm, e a 4°C e o sobrenadante foi adicionado a 2x tampão de a-mostra Laemmli em uma razão 1:1 (v/v). As proteínas celulares foram sepa-radas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose(PROTRAN® BA 85, Schleicher&SchuelI, Cat. N0 10 401196) por Westernblotting semi-seco.

Um anticorpo específico para IGF-IR (C-20, Santa Cruz Biotech-nologies, Cat. N0 sc-713) foi usado para determinar os níveis de proteína deIGF-IR.

Foi observada infra-regulação de 50% ou mais do IGF-IR induzidapelo anticorpo da invenção depois de 24 horas após a adição do anticorpo.TRATADO DE BUDAPESTESOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MI-CROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE

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1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na AutoridadeInternacional de depósito foi obtido.

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1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a datarelevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente.

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1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na AutoridadeInternacional de depósito foi obtido.

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2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente.

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Claims (13)

1. Anticorpo que se liga ao IGF-IR1 sendo do tipo IgGI ou lgG3humana e sendo glicosilado com uma cadeia de açúcar em Asn297, o ditoanticorpo sendo caracterizado pelo fato de que a quantidade de fucose den-tro da cadeia de açúcar é pelo menos 99% ("completamente fucosilado") e,além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade dealfa-1,3-galactose N-terminal é 1% ou menos.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a quantidade de NGNA é de 0,5% ou menos.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a quantidade de alfa 1,3-galactose N-terminal é 0,5% oumenos.

4. Anticorpo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracteriza-do pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ouhumano.

5. Anticorpo de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracteriza-do pelo fato de que o dito anticorpo mostra uma ou mais propriedades sele-cionadas do grupo que consiste em:a) mostra uma razão de valores IC5o de inibição da ligação deIGF-I ao IGF-IR para a inibição de ligação de IGF-II ao IGF-IR de 1:3 a 3:1,b) inibe por pelo menos 80%, preferivelmente 90%, em umaconcentração de fosforilação de IGF-IR a 5nM em um ensaio de fosforilaçãocelular usando células HT29, em um meio contendo 0,5% de soro de bezer-ro fetal (FCS) termoinativado em comparação com tal ensaio sem o dito an-ticorpo, ec) não mostra atividade estimulante de IGF-IR (nenhuma sinali-zação, nenhuma atividade mimética de IGF-1) medida por fosforilação dePKB em uma concentração a 10μΜ em um ensaio de fosforilação celularusando células 3T3, proporcionando 400.000 a 600.000 moléculas de IGF-IRpor célula em um meio contendo 0,5% de soro de bezerro fetal (FCS) ter-moinativado em comparação com tal ensaio sem o dito anticorpo.

6. Anticorpo de acordo com a reivindicações 1 a 5, caracterizadopor uma afinidade de cerca de 10-13 a IO-9M (KD).

7. Anticorpo de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracteriza-do por compreender regiões determinadoras de complementaridade (CDRs)tendo as seguintes seqüências:a) uma cadeia pesada do anticorpo compreendendo como CDRsa CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) e CDR3 (aa 99-107) da SEQ ID NO:1ou 3;b) uma cadeia leve do anticorpo compreendendo como CDRs aCDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) e a CDR3 (aa 89-98) da SEQ ID NO:2 ou 4.

8. Uso de um anticorpo como definido nas reivindicações 1 a 7,para a fabricação de uma composição farmacêutica.

9. Composição farmacêutica contendo um anticorpo como defi-nido nas reivindicações 1 a 7, em uma quantidade farmaceuticamente eficaz.

10. Método para a fabricação de uma composição farmacêuticaque compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpocomo definido nas reivindicações 1 a 7.

11. Método para o tratamento de um paciente em necessidadede uma terapia antitumoral, caracterizado por administrar ao paciente umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo como definido nasreivindicações 1 a 7.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que o anticorpo é administrado em combinação com um agentecitotóxico, um pró-fármaco deste ou uma radioterapia citotóxica.

13. Célula CHO capaz de expressar recombinantemente um an-ticorpo como definido nas reivindicações 1 a 7.