BRPI0710242A2 - uso de uma composição - Google Patents

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Abstract

<B>USO DE UMA COMPOSIçãO<D> A presente invenção diz respeito ao uso de uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos precoces de papilomavírus humano (HPV)- 18 ou um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos precoces de HPV- 18 para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção ou uma condição patológica causada por pelo menos um outro papilomavírus que não HPV- 18. A invenção é de interesse muito especial na imunoterapia, em particular na prevenção ou tratamento de infecções persistentes de HPV que levam possivelmente a neoplasia intraepitelial cervical (CIN) e ultimamente ao câncer cervical.

Description

"USO DE UMA COMPOSIÇÃO"
A presente invenção diz respeito ao uso de uma composiçãoque compreende um ou mais polipeptídeos precoces de papilomavírushumano (HPV)-18 ou um ácido nucleico que codifica um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-18 para a fabricação de um medicamento paraa prevenção ou tratamento de uma infecção ou uma condição patológicacausada por pelo menos um outro papilomavírus que não HPV-18. Ainvenção é de interesse muito especial na imunoterapia, em particular naprevenção ou tratamento de infecções persistentes de HPV que levampossivelmente a neoplasia intraepitelial cervical (CIN) e ultimamente aocâncer cervical.
Os papilomavírus são vírus de DNA pequeno que foramidentificados em diversos organismos superiores incluindo seres humanos(ver, por exemplo, Pfister, 1987, em The papovaviridae: The Papillomavirus,Salzman and Howley edition, Plenum Press, New York, ρ 1-38). Estes estãoassociados com condições patológicas que variam de tumores benignos amalignos. Em tumores benignos, o genoma viral é epissomal enquanto emtumores malignos, DNA DE HPV está integrado nos cromossomos dohospedeiro (Stoler, 2000, Int. J. Gynecol. Path. 19, 16-28).
Os papilomavírus possuem um DNA circular de filamentoduplo de cerca de 7900 pares de base que é circundado por um capsídeo deproteína. O genoma compreende uma região (E) precoce contendo asestruturas de leitura E1-E7 e uma região (L) posterior. A região posteriorcodifica as proteínas Ll e L2 estruturais que formam o capsídeo viral vistoque os genes precoces codificam proteínas reguladoras que são observadaspredominantemente no núcleo. El codifica duas proteínas importantes namanutenção e replicação do genoma viral. E2 codifica as proteínas ativadorase repressoras que regulam o promotor viral que direciona a transcrição de E6e E7 (Bechtold et al., 2003, J. Virol. 77, 2021-2028). A proteína codificadapor E4 que liga e rompe a rede de queratina citoplásmica e pode desempenharum papel na maturação viral. O papel para a proteína E5 ainda é controverso esua expressão é freqüentemente perdida durante a integração viral noscromossomos do hospedeiro. Os produtos genéticos codificados por E6 e E7de genótipos de HPV associados com câncer estão envolvidos natransformação oncogênica de células infectadas (Kanda et al., 1988, J. Virol.62, 610-613; Vousden et al., 1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell et al., 1987,J. Virol. 61, 3635-3640), que ocorre de maneira presumível devido àcapacidade destas proteínas virais para ligar os produtos genéticos supressoresde tumor celular p53 e retinoblastoma (Rb), respectivamente. Os resíduos deaminoácidos envolvidos na ligação do polipeptídeo HPV-16 E6 natural aop53 foram claramente definidos a partir dos resíduos 118 a 122 (+1 sendo oprimeiro resíduo Met ou de resíduos 111 a 115 começando preferivelmente dosegundo resíduo Met usado) (Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556) e aquelesenvolvidos na ligação do polipeptídeo E7 do HPV-16 to Rb estão localizadosa partir dos resíduos 21 a 26 (Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105;Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 4442-4446). Trais regiõesde ligação também são conservadas em E6 e E7 de HPV-18 (Pim et al., 1994,Oncogene 9, 1869-1876; Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89,4442-4446).
Atualmente, mais de 100 genótipos de papilomavírus humano(HPV) foram clonados e seqüenciados (Stoler, 2000, Int. J. Gynecol. Path 19,16-28). Apenas 40 genótipos de HPV infectam a mucosa genital com cerca de15 dos quais colocam a mulher em risco de tumores malignos do trato genital.Mais especificamente, os dois genótipos mais prevalescentes, HPV-16 eHPV-18, são detectados em mais do que 70% do carcinoma cervical invasivovisto que HPV-31, HPV-33 e HPV-45 juntos, respondem por 10% dos casos(Cohen et al., 2005, Science 308, 618-621).
Embora programas de avaliação cervical existam, quase meiomilhão de mulheres no mundo todo são diagnosticas com cânceres cervicaiscada ano e mais do que 270.000 morrem de acordo com os dados daInternational Agency for Research on câncer. Os métodos convencionaispermanecem cirurgia e radioterapia, mas novas estratégias de vacina foramprojetadas nos últimos 15 anos, por exemplo, vacinas com base em peptídeo(Feltkamp et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 2242-2249), vacinas de partículassemelhantes a vírus (VLP), vacinas de DNA (Osen et al, 2001, Vaccine 19,4276-4286; Smahel et al., 2001, Virology 281, 231-238) e vacinas de vetorviral (EP 462,187, Daemen et al., 2000, Gene Ther. 7: 1859-1866; He et al.,2000, Virology 270, 146-161; Borysiewicz et al., 1996, Lancet 347, 1523-1527).
Conceitualmente, existem dois métodos para vacinas contraHPV, profilático e terapêutico. O método profilático busca evitar a infecçãoviral, isto é, bloquear o vírus antes deste penetrar nas células hospedeirasprincipalmente através da indução de anticorpos neutralizadores. Usualmente,as vacinas profiláticas alvejam as proteínas capsídicas expressadas nasuperfície viral. Maioria destes contam com VLPs produzidosrecombinantemente de proteínas de LPl ou mistura de VLPs dos maioria dostipos de HPV prevalescentes. Ensaios clínicos de fase III bem sucedidosforam recentemente relatados por Merck and GlaxoSmithKline (GSK) comeficácia de 100% na prevenção de infecções cervicais do tipo específico). Aproteção cruzada contra genótipos de HPV-31 e HPV-45 oncogênicos foidescrita seguindo a administração de uma mistura de VLPs de HPV-16 eHPV-18 (WO 2004/056389). Entretanto, as vacinas preventivas com base emVLP não são esperadas induzir a regressão de condições patológicas quedesenvolvem a seguinte infecção por HPV.
O método terapêutico procura tratar infecções por HPVestabelecidas e induzem a regressão de condições patológicas pré-cancerosase cancerosas associadas com o HPV principalmente através da indução deuma resposta imune celular. Usualmente, a estratégia terapêutica conta com aimunização direcionada a oncoproteínas E6 e/ou E7 que são expressadas pelascélulas tumorais induzidas por HPV. Até agora, a imunidade fornecida pelosantígenos de HPV E6 e E7 é considerada específica do genótipo e as vacinasterapêuticas correntes no desenvolvimento clínico ou pré-clínico focamprincipalmente no HPV-16 oncogênico mais prevalescente e a uma extensãomenor HPV-18.
Entretanto, uma vacina terapêutica ideal deve permitir fornecerproteção não apenas contra os genótipos de HPV mais prevalescentes mastambém contra os outros genótipos menores de HPV envolvido nos 30%remanescentes de cânceres cervicais. Isto pode ser atingido através dodesenvolvimento de candidatos a vacina alternativos direcionados a cada umdos genótipos oncogênicos de HPV. Entretanto, esta estratégia,provavelmente, não deve ser muito atrativa em consideração do custo dedesenvolvimentos clínicos e pré-clínicos requeridos por autoridadesreguladoras versus o número limitado de pacientes expostos aos genótiposmenores de HPV.
Pode-se esperar que o HPV continuará a ser uma séria ameaçaà saúde global por muito anos devido à natureza persistente e crônica dainfecção, seu predomínio alto e a morbidez significante de Cânceresinduzidos por HPV. Portanto, existe uma necessidade de desenvolver umavacina que ofereça uma cobertura mais ampla que seja capaz de proteger e/outratar contra genótipos múltiplos de HPV incluindo, além disso, HPV-18outros genótipos menores e potencialmente oncogênicos de HPV.
Desta maneira, a presente invenção representa um avançosignificante para melhorar a prevenção e o tratamento de infecções porpapilomavírus ou lesões malignas ou pré-malignas associadas com opapilomavírus em países industrializados, bem como em países emdesenvolvimento.Este problema técnico é resolvido pelo fornecimento dasformas de realização como definido nas reivindicações.
Outros aspectos e aspectos adicionais, características evantagens da presente invenção estarão evidentes a partir do seguinte relatóriodescritivo das formas de realização presentemente preferidas da invenção.Estas formas de realização são dadas para o propósito de divulgação.
Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a presenteinvenção fornece o uso de uma composição que compreende um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-18 ou um ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos precoces de HPV-18 para a fabricação de ummedicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção ou umacondição patológica causada por pelo menos um outro papilomavírus que nãoHPV-18.
Mais particularmente, a presente invenção diz respeito ao usode uma composição que compreende um ou mais polipeptídeos precoces deHPV-18 ou um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeosprecoces de HPV-18 para a fabricação de um medicamento para tratar umainfecção ou uma condição patológica causada por pelo menos um outropapilomavírus humano que não HPV-18. A presente invenção também dizrespeito a um método de tratar uma infecção ou uma condição patológicacausada por pelo menos um outro papilomavírus humano que não HPV-18, ométodo compreendendo administrar a um organismo hospedeiro, umacomposição que compreende um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-18ou um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-18.
Como usado aqui por todo o pedido, os termos "um" e "uma"são usados no sentido de que este significa "pelo menos um", "pelo menos umprimeiro", "um ou mais" ou "uma pluralidade" dos compostos ou etapasreferidos, a não ser que o contexto dite de outra maneira. Por exemplo, otermo "uma célula" inclui uma pluralidade de células incluindo uma misturadestes, mais especificamente, "pelo menos um" and "um ou mais" significaum número que é um ou maior do que um, com uma preferência especial porum, dois ou três.
O termo "e/ou" usado em qualquer parte deste inclui osignificado de "e", "ou" e "todas ou quaisquer outras combinações doselementos conectados pelo dito termo".
O termo "cerca de" ou "aproximadamente" como usado nestesignifica dentro de 20%, preferivelmente dentro de 10% e maispreferivelmente dentro de 5% de um dado valor ou faixa.
O termo "aminoácidos" e "resíduos" são sinônimos. Estestermos referem-se a aminoácidos naturais, não naturais e/ou sintéticos,incluindo isômeros óticos D ou L, aminoácidos modificados e análogos deaminoácido.
Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usadosneste de maneira intercambiável para referir-se a polímeros de resíduos deaminoácido que compreendem nove ou mais aminoácidos ligados porintermédio de ligações de peptídeo. O polímero pode ser linear, ramificado oucíclico e pode compreender análogos de ocorrência natural e/ou deaminoácidos e estes podem ser interrompidos por não-aminoácidos. Comouma indicação geral, se o polímero de aminoácido for longo (por exemplo,mais do que 50 resíduos de aminoácido), este é preferivelmente referido comoum polipeptídeo ou uma proteína.
Dentro do contexto da presente invenção, os termos "ácidonucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleotídeo" e "seqüência denucleotídeo" são usados de maneira intercambiável e definem um polímero dequalquer comprimento de polidesoxiribonucleotídeos (DNA) (por exemplo,cDNA, DNA genômico, plasmídeos, vetores, genomas virais, DNA isolado,sondas, iniciadores e quaisquer misturas destes) ou moléculas depolirribonucleotídeos (RNA) (por exemplo, mRNA, RNA anti-sentido) oupolirribo-polidesoxiribinucleotídeos mistos. Estes abrangem polinucleotídeosde filamento simples ou duplo, linear ou circular, natural ou sintético. Alémdisso, um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos que não ocorremnaturalmente, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo(ver US 5.525.711, US 4.711.955 ou EPA 302 175 como exemplos demodificações) e podem ser interrompidos por componentes não-nucleotídeos.Se presente, modificações ao nucleotídeo podem ser comunicadas antes ouapós a polimerização.
Como usado neste, o termo "que compreende" quando usadopara definir produtos, composições e métodos, é pretendido significar que osprodutos, composições e métodos incluem os compostos ou etapas referidos,mas não excluindo outros. "Consistindo essencialmente de" deve significarexcluindo outros compostos ou etapas se houver qualquer significânciaessencial. Desta maneira, a composição que consiste essencialmente doscompostos citados não deve excluir contaminantes traço e carregadoresfarmaceuticamente aceitáveis. "Consistindo de" deve significar excluindomais do que elementos traço de outros compostos ou etapas. Por exemplo, umpolipeptídeo "consiste de" uma seqüência de aminoácido quando opolipeptídeo não contém quaisquer aminoácidos mas a seqüência deaminoácido citada. Um polipeptídeo "consiste essencialmente de" umaseqüência de aminoácido quando uma tal seqüência de aminoácido estápresente junto com apenas alguns resíduos de aminoácido adicionais,tipicamente de cerca de 1 a cerca de 50 ou ainda resíduos adicionais. Umpolipeptídeo "compreende" uma seqüência de aminoácido quando a seqüênciade aminoácido é pelo menos parte da seqüência de aminoácido final dopolipeptídeo. Um tal polipeptídeo pode ter de alguns a diversas centenas deresíduos de aminoácidos adicionais. Tais resíduos de aminoácido adicionaispodem desempenhar um papel em tráfego de polipeptídeo, facilitar aprodução ou purificação de polipeptídeo; prolongar a vida média, entre outrascoisas. O mesmo pode ser aplicado às seqüências de nucleotídeo.
Como usado neste, o termo "isolado" refere-se a uma proteína,polipeptídeo, peptídeo ou um ácido nucleico que é purificado ou removido deseu ambiente natural. O termo "purificado" refere-se a uma proteína,polipeptídeo, peptídeo ou um ácido nucleico que é separado de pelo menosum outro componente com o qual este está naturalmente associado.
O termo "célula hospedeira" deve ser entendido amplamentesem qualquer limitação com respeito à organização particular em tecido,órgão ou células isoladas. Tais células podem ser de um tipo único de célulasou um grupo de tipos diferentes de células e abrange linhas celularescultivadas, células primárias e células proliferativas. O termo "organismohospedeiro" refere-se a um vertebrado, particularmente um membro dasespécies de mamíferos e, especialmente, animais domésticos, animaisesportivos e primatas incluindo seres humanos.
"HPV" significa "papilomavírus humano". Sua classificação éfundamentada no grau de relação de seus genomas. Mais do que 100genótipos de HPV foram identificados no presente período e estes foramnumerados seguindo a ordem cronológica de seu isolamento. Por convenção,dois isolados constituem tipos distintos se estes dividirem menos do que 90%identidade em torno de cerca de porção longa de 2000 nucleotídeos de seugenoma contendo as estruturas de leitura aberta E6, E7 and LI. Uma árvorefilogenética foi construída a partir do alinhamento da seqüência denucleotídeo disponível (Van Ranst et al., 1992, J. Gen. Virol. 73, 2653; DeVilliers et al., 2004, Virology 324, 17-27).
Como usado neste o termo "polipeptídeo precoce" refere-se auma proteína não estrutural reconhecida na técnica, preferivelmenteselecionado dentre o grupo consistindo de polipeptídeos El, E2, E4, E5, E6 eE7. No contexto da invenção, o um ou mais polipeptídeos precoces incluídosna composição ou codificados pelo ácido nucleico incluído na composiçãousada de acordo com a invenção origina-se de HPV-18. O termo "origina-se"significa ser isolado, clonado, derivado ou relacionado. Desta maneira, deacordo com a presente invenção, o um ou mais polipeptídeos de HPV-18precoces podem originar-se de um polipeptídeo de HPV-18 precoce naturalou de um derivado destes. A "polipeptídeo de HPV-18 precoce natural"refere-se a uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo que pode ser encontrada ouisolada de uma fonte na natureza, como diferente de ser artificialmentemodificada ou alterada pelo homem no laboratório. Tais fontes na naturezaincluem amostras biológicas (por exemplo, sangue, plasma, soros, fluidosvaginais e cervicais, seções de tecido, biópsias, amostras ginecológicas depacientes infectados com HPV-18), células cultivadas, bem como materiaisrecombinantes (por exemplo, HPV-18 vírus ou genoma, bibliotecasgenômicas ou de cDNA, plasmídeos contendo fragmentos de genoma deHPV-18, polipeptídeo HPV-18 precoce recombinante e outros). Destamaneira o termo "polipeptídeo HPV-18 precoce natural" deve incluirpolipeptídeos de HPV-18 precoces de ocorrência natural e fragmentos destes.
Um fragmento é preferivelmente de pelo menos 9 resíduos de aminoácido ecompreende pelo menos um epítopo imunogênico e particularmente umepítopo T. tais fragmentos podem ser usados de maneira independente ou emcombinação (por exemplo, em fusão). O nucleotídeo e as seqüências de genesprecoces de aminoácido de HPV-18 / polipeptídeos foram descritos naliteratura e estão disponíveis em bancos de dados especializados, por exemploem Genbank sob número de acesso NC_001357 e X05015, respectivamente.
Entretanto, polipeptídeos HPV-18 precoces naturais não são limitados a estasseqüência exemplares. De fato as seqüências de aminoácido podem variarentre isolados de HPV-18 diferentes e seu escopo natural de variação genéticaestá incluído dentro do escopo da invenção.
Um derivado de um polipeptídeo de HPV-18 precoce incluiuma ou mais modificações com respeito ao polipeptídeo de HPV-18 precocenatural, tal como aqueles definidos abaixo. As modificações podem sergeradas por meio de mutação e/ou adição de porções químicas (por exemplo,alquilação, acetilação, amidação, fosforilação e outros) ou porções derotulação. Mutação inclui anulação, substituição ou adição de um ou maisresíduos de aminoácido ou quaisquer combinações destas possibilidades.Quando diversas modificações são consideradas, estes podem dizer respeito aresíduos consecutivos e/ou resíduos não consecutivos. As modificaçõespodem ser feitas em diversas maneiras conhecidas por aqueles habilitados natécnica, tais como mutagênese direcionada ao local (por exemplo, usando-se osistema de mutagênese in vitro Sculptor of Amersham, Les Ullis, France),Mutagênese de PCR e Mistura de DNA.
Vantajosamente, um polipeptídeo de HPV-18 precocemodificado retém um alto grau de identidade de seqüência de aminoácidocom o polipeptídeo HPV-18 precoce natural correspondente na seqüência deaminoácido de comprimento total ou um fragmento mais curto deste (porexemplo, de pelo menos 9, 20, 30, 40, 50, 100 aminoácidos de comprimento),que é maior do que 75%, vantajosamente maior do que 80%, desejavelmentemaior do que 85%, preferivelmente maior do que 90%, mais preferivelmentemaior do que 95%, ainda mais preferivelmente maior do que 97% (porexemplo, 100% de identidade de seqüência). A identidade percentual entredois polipeptídeos é uma função do número de posições idênticas divididaspelas seqüências, levando em conta o número de fendas que necessitam serintroduzidas para o alinhamento ótimo e o comprimento de cada fenda. Váriosprogramas de computador e algoritmos matemáticos estão disponíveis natécnica para determinar as identidades de percentagem entre as seqüências deaminoácido tais como, por exemplo o software W2H HUSAR e o programaBlast (por exemplo, Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402;Altschul et al., 2005, FEBS J. 272, 5101-5109) disponível em NCBI.Desej avelmente, o polipeptídeo de HPV-18 precocemodificado no uso de acordo com a invenção retêm atividade imunogênica dopolipeptídeo HPV-18 precoce natural tal como a capacidade de estimular umaresposta imune mediada por célula.
Em uma forma de realização, a composição é usada para tratarinfecção por HPV e/ou condições patológicas, especialmente no tratoanogenital, a pele ou a cavidade oral, causado por pelo menos um outrogenótipo de HPV que não HPV-18. Em um aspecto, o genoma do pelo menosum papilomavírus humano divide menos do que 90%, vantajosamente menosdo que 87% e, desejavelmente menos do que 86% de identidade de seqüênciade nucleotídeo com a porção do genoma de HPV-18 que codifica ospolipeptídeos E6 ou E7 mas mais do que 50%, vantajosamente mais do que55% e, desejavelmente mais do que 60% de identidade de seqüência denucleotídeo com a porção do genoma de HPV-18 que codifica ospolipeptídeos E6 ou E7. Preferivelmente este divide de aproximadamente61% a aproximadamente 86% de identidade de nucleotídeo com os ORFs deE6 ou E7 de HPV. A identidade percentual entre as porções dos Genomas deHPV é uma função do número de posições idênticas divido pelas duasseqüências, levando em conta o número de fendas que necessitam serintroduzidas para o alinhamento ótimo e o comprimento de cada fenda. Váriosprogramas de computador e algoritmos matemáticos estão disponíveis natécnica para determinar as identidades de percentagem entre seqüências denucleotídeo. Exemplos representativos de tais genótipos de HPV incluem,sem limitação HPV-13, HPV-18, HPV-30, HPV-32, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-61, HPV-64, HPV-68, HPV-70 e HPV-85.
Preferivelmente, o pelo menos um outro papilomavírushumano que não HPV-18 é selecionado dentre o grupo que consiste de HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 e HPV-85 ouqualquer combinação possível destes, com uma preferência especial por HPV-45. O nucleotídeo e as seqüências de aminoácido destes genótipos de HPVforam descritos na literatura e estão disponíveis em bancos de dadosespecializados, como ilustrado na Tabela I.
Tabela I: Números de acesso Genbank
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Em uma outra forma de realização, a composição usada deacordo com a invenção compreende ou codifica um polipeptídeo E6 de HPV-18, um polipeptídeo E7 de HPV-18 ou tanto um polipeptídeo E6 de HPV-18quanto um polipeptídeo E7 de HPV-18. Dadas as observações redenominadasacima na energia de transformação dos polipeptídeos E6 e polipeptídeo E7,polipeptídeos E6 e/ou polipeptídeos E7 de HPV-18 modificados sãopreferivelmente usados sendo variantes não oncogênicas mutadas na regiãoenvolvida na interação com os produtos genéticos supressores de tumorcelular p53 e Rb respectivamente. A presente invenção abrange o uso dequalquer polipeptídeo E6 de HPV-18 que liga-se ao p53 é alterado ou pelomenos significantemente reduzido e/ou o uso de qualquer polipeptídeo deHPV-18 E7 que liga-se ao Rb é alterado ou pelo menos significantementereduzido (Pim et al., 1994, Oncogene 9, 1869-1876; Heck et al., 1992, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89, 4442-4446). Uma variante E6 de HPV-18 nãooncogênica que é adequada para o propósito da presente invenção é anuladade um ou mais resíduos de aminoácido localizados aproximadamente daposição 113 aproximadamente da posição 117 (começando do primeiroresíduo de metionina do polipeptídeo E6 de HPV-18), com uma preferênciaespecial pela anulação completa dos resíduos 113 a 117 (NPAEK). A varianteoncogênica mais preferida do polipeptídeo E6 de HPV-18 compreende ou,alternativamente, consiste essencialmente de, ou, alternativamente, consistede uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência deaminoácido mostrada na SEQ ID N°: 1. Uma variante E7 de HPV-18 nãooncogênica que é adequada para o propósito da presente invenção é anuladade um ou mais resíduos de aminoácido localizados aproximadamente daposição 24 aproximadamente da posição 28 (+1 que representa o primeiroaminoácido do polipeptídeo E7 de HPV-18 natural), com uma preferênciaespecial pela anulação completa dos resíduos 24 a 28 (DLLCH). A varianteoncogênica mais preferida do polipeptídeo E7 de HPV-18 compreende ou,alternativamente, consiste essencialmente de, ou, alternativamente, consistede uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência deaminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2.
Em um aspeto preferido, o um ou mais polipeptídeos de HPV-18 precoces em uso na invenção ainda são modificados a fim de melhorarapresentação da classe MHC I e/ou classe MHC II, e/ou para estimular aimunidade anti-HPV. HPV-18 E6 and polipeptídeo E7s são proteínasnucleares e estas mostraram que apresentação de membrana permite melhorara eficácia terapêutica dos polipeptídeos de HPV-16 correspondentes (ver, porexemplo, W099/03885). Desta maneira, pode ser desejável modificar pelomenos um dos polipeptídeos de HPV-18 precoce a fim de ser ancorado àmembrana celular. A ancoragem de membrana pode ser facilmente atingidapela incorporação no polipeptídeo de HPV-18 precoce uma seqüência deancoragem de membrana e se o polipeptídeo natural precisa de uma seqüênciasecretora (isto é, um peptídeo sinalizador). Os polipeptídeos E6 e/oupolipeptídeos E7 de HPV-18 e são preferivelmente modificados pelaincorporação de uma seqüência de ancoragem de membrana e uma seqüênciasecretora. A ancoragem de membrana e as seqüências secretoras sãoconhecidas na técnica. Resumidamente, as seqüências secretoras estãopresentes no terminal N da membrana apresentada ou polipeptídeossecretados e iniciam sua passagem no retículo endoplásmico (ER). Estesusualmente compreendem de 15 a 35 aminoácidos essencialmentehidrofóbicos que são então removidas por uma endopeptidase localizada emER específica para dar o polipeptídeo maduro. As seqüências de ancoragemde membrana são, usualmente, altamente hidrofóbicas em estado natural eservem para ancorar os polipeptídeos na membrana celular (ver, por exemplo,Branden and Tooze, 1991, em Introduction to Protein Structure p. 202-214,NY Garland).
A escolha da ancoragem de membrana e seqüências secretorasque podem ser usadas no contexto da presente invenção é vasta. Estes podemser obtidos a partir de qualquer polipeptídeo ancorado na membrana e/ousecretado que o compreende (por exemplo, polipeptídeos celulares e/ouvirais) tal como a glicoproteína da hidrofobia, da glicoproteína do envelopedo vírus HIV ou da proteína F do vírus do sarampo ou pode ser sintético. Aancoragem de membrana e/ou seqüências secretoras inseridas em cada um dospolipeptídeos de HPV-18 precoces usados de acordo com a invenção pode teruma origem comum ou diferente. O local preferido de inserção da seqüênciasecretora é o terminal N a jusante do códon para o início da tradução e aqueleda seqüência de ancoragem de membrana é o terminal C, por exemploimediatamente a montante do códon de interrupção. Além disso, um peptídeoligador pode ser usado para conectar a seqüência secretora ao polipeptídeo deHPV-18 precoce em uso na invenção ou para conectar o polipeptídeo deHPV-18 precoce à seqüência de ancoragem de membrana. Os peptídeosligadores são conhecidos na técnica. Tipicamente, estes contém de 2 a 20aminoácidos e incluem alanina, glicina, prolina e/ou serina.
O polipeptídeo E6 de HPV-18 em uso na presente invenção épreferivelmente modificado pela inserção dos sinais secretores e deancoragem de membrana da proteína F do sarampo, com uma preferênciaespecial por um polipeptídeo que compreende ou, alternativamente,consistindo essencialmente de, ou, alternativamente, consistindo de umaseqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência deaminoácido mostrada na SEQ ID N°: 3. Opcionalmente ou em combinação, opolipeptídeo E7 de HPV-18 em uso na presente invenção é preferivelmentemodificado pela inserção dos sinais secretores e de ancoragem de membranada glicoproteína da raiva, com uma preferência especial para um polipeptídeoque compreende ou, alternativamente, consistindo essencialmente de, ou,alternativamente, consistindo de uma seqüência de aminoácido que éhomóloga ou idêntica à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 4.
Em um outro e mais preferido aspecto, a eficácia terapêuticada composição em uso na invenção pode ser melhorada pelo uso de um oumais polipeptídeos imunopotenciadores ou um ou mais ácidos nucleicos quecodificam tais polipeptídeos imunopotenciadores. Por exemplo, pode servantajoso ligar os polipeptídeos de HPV-18 precoces a um polipeptídeo, talcomo calreticulina (Cheng et ai., 2001, J. Clin. Invest. 108, 669-678), Proteínade choque por calor de Mycobacterium tuberculosis 70 (HSP70) (Chen et ai.,2000, Câncer Res. 60, 1035-1042), ubiquitina (Rodriguez et al., 1997, J.Virol. 71, 8497-8503) ou uma toxina bacteriana tal como o domínio detranslocação de Exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA(dlII)) (Hunget al., 2001 Câncer Res. 61, 3698-3703). Alternativamente, a composição emuso na presente invenção ainda pode compreender uma citocina ou um ácidonucleico que codifica uma citocina. Citocinas adequadas incluem, semlimitação interleucina (IL)-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21 e IFNg, com umapreferência especial por IL-2.
De acordo com uma outra forma de realização ou preferida, acomposição no uso de acordo com a invenção compreende um ácido nucleicoque codifica um ou mais polipeptídeos de HPV-18 precoces como definidoacima. É preferido um ácido nucleico que codifica pelo menos:o um polipeptídeo E6 de HPV-18 que compreende ou,alternativamente, consistindo essencialmente de, ou, alternativamente,consistindo de uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica àseqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N°: 3; and
o um polipeptídeo de HPV-18 E7 que compreende ou,alternativamente, consistindo essencialmente de, ou, alternativamente,consistindo de uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica àseqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 4.
Se necessário, a molécula de ácido nucleico em uso nainvenção pode ser otimizada para fornecer expressão de alto nível dospolipeptídeos de HPV-18 precoces em uma célula hospedeira ou organismoparticular, por exemplo, uma célula hospedeira ou organismo humano.Tipicamente, a otimização de códon é realizada pela substituição um ou maiscódon "em estado natural" (por exemplo, HPV) correspondente a um códonusado de maneira não freqüente na célula hospedeira de mamífero por um oumais códons que codificam o mesmo aminoácido que é mais freqüentementeusado. Isto pode ser atingido pela mutagênese convencional ou pelas técnicassintéticas químicas (por exemplo, resultando em um ácido nucleico sintético).Não é necessário substituir todos os códons naturais correspondentes aoscódons usados de maneira não freqüente visto que a expressão aumentadapode ser atingida mesmo cm a substituição parcial. Além disso, algunsdesvios de aderência estritos ao uso de códon otimizado podem ser feitos paraacomodar a introdução de locais de restrição.
Preferivelmente, o ácido nucleico codificador de polipeptídeode HPV-18 precoce em uso na invenção está em uma forma adequada para asua expressão em uma célula hospedeira ou organismo, significando que aseqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo E6 e/ou a seqüênciade ácido nucleico que codifica o polipeptídeo E7 são colocados sob o controlede um ou mais elementos reguladores necessários para a expressão na célulahospedeira ou organismo. Como usado neste, o termo "elemento regulador"refere-se a qualquer seqüência que permite, contribui ou modula a expressãodo ácido nucleico em uma dada célula hospedeira, incluindo replicação,duplicação, transcrição, união, tradução, estabilidade e/ou transporte do ácidonucleico ou um de seus derivados (isto é, mRNA) na célula hospedeira. Seráestimado por aquele habilitado na técnica que a escolha dos elementosreguladores pode depender de fatores, tais como a célula hospedeira, o vetor eo nível de expressão desejado.
O promotor é de importância especial e a presente invençãoabrange o uso de promotores constitutivos que direcionam a expressão doácido nucleico em muitos tipos de células hospedeiras e aqueles quedirecionam a expressão apenas em certas célula hospedeiras ou em respostaaos eventos específicos os fatores exógenos (por exemplo, por temperatura,aditivo de nutriente, hormônio ou outro ligando). Os promotores adequadossão amplamente descritos na literatura e pode-se citar mais especificamentepromotores virais, tais como RSV (Vírus do Sarcoma de Rous), SV40 (VírusSímio-40), CMV (Citomegalo Vírus) e promotores de MLP (promotor TardioPrincipal). Promotores preferidos para o uso em um vetor poxviral incluem,sem limitação promotores de vaccinia 7.5K, H5R, TK, p28, pll e KlL,promotores quiméricos entre promotores poxvirais precoces e tardios bemcomo promotores sintéticos tais como aqueles descritos em Chakrabarti et al.(1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al. (1997, J. VirologicalMethods 66, 135-138) and Kumar and Boyle (1990, Virology 179, 151-158).
Aqueles habilitados na técnica estimarão que os elementosreguladores controlam a expressão do ácido nucleico ainda compreendeelementos adicionais para a iniciação apropriada, regulação e/ou terminaçãoda transcrição (por exemplo, seqüências de terminação de transcrição polyA),transporte de mRNA (por exemplo, seqüências sinalizadoras de localizaçãonuclear), processamento (por exemplo, sinais de união), estabilidade (porexemplo, íntrons e seqüências 5' e 3' não codificadoras) e tradução (porexemplo, seqüências líderes tripartidas, locais de ligação de ribossoma,seqüências de Shine-Dalgamo, etc.) na célula hospedeira ou organismo.
De acordo com uma outra forma de realização preferida, oácido nucleico usado de acordo com a presente invenção é compreendido deum vetor. O termo "vetor" como usado neste refere-se a vetores virais bemcomo não virais (por exemplo, DNA de plasmídeo), incluindo vetoresextracromossômico (por exemplo, epissoma), multicópia e integradores (istoé, para ser incorporado nos cromossomos do hospedeiro). Particularmenteimportante no contexto da invenção são os vetores de terapia genética (isto é,que são capazes de liberar o ácido nucleico a um organismo hospedeiro) bemcomo vetores de expressão para o uso em vários sistemas de expressão.
Vetores não virais adequados incluem plasmídeos, tais como pREP4, pCEP4(Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAXand pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76,12735-12746). Os vetores virais adequados podem ser derivados de umavariedade de vírus diferentes (por exemplo, retrovírus, adenovírus, AAV,poxvírus, vírus do herpes, vírus do sarampo, vírus espumoso e outros). Comousado neste, o termo "vetor viral" abrange o DNA do vetor bem comopartículas virais geradas destes. Os vetores virais podem ser competentes dereplicação ou podem ser geneticamente desabilitados a fim de seremdefeituosos na replicação ou enfraquecidos na replicação. O termo"competentes de replicação" como usado neste abrange vetores viraisseletivos de replicação e condicionalmente replicadores que são projetadospara replicar melhor ou seletivamente em células hospedeiras específicas (porexemplo, células tumorais).
Em um aspecto, o vetor em uso na invenção é um vetoradenoviral (para uma revisão, ver "Adenoviral vectors for gene therapy",2002, Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Press). Isto pode ser derivado apartir de uma variedade de fontes humanas ou animais e qualquer sorotipopode ser utilizado a partir do serotipos de adenovírus 1 até 51.Particularmente preferidos são adenovírus humanos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6(Ad6), 11 (Adll), 24 (Ad24) e 35 (Ad35). Tais adenovírus estão disponíveisa partir do American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.) eforam o objetivo de publicações numerosas que descrevem sua seqüência,organizações e métodos de produzir, deixando o técnico aplicá-lo (ver, porexemplo, US 6.133.028; US 6.110.735; WO 02/40665; WO 00/50573; EP1016711; Vogels et al., 2003, J. Virol. 77, 8263-8271).
O vetor adenoviral em uso na presente invenção pode sercompetente de replicação. Exemplos numerosos de competentes de vetores dereplicação adenoviral estão facilmente disponíveis para aqueles habilitados natécnica (Hernandez-Alcoceba et al., 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024;Nemunaitis et al., 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al., 2000, NatureBiotechnology 18, 723-727). Por exemplo, estes podem ser projetados a partirde um genoma de adenovírus do tipo selvagem pela anulação no DomínioElA CR2 (por exemplo, W000/24408) e/ou pela substituição promotores Ele/ou E4 naturais com tecido, tumor ou promotores específicos do estadocelular (por exemplo, US5,998,205, W099/25860, US5,698,443,WOOO/46355, W000/15820 e W001/36650).
Alternativamente, o vetor adenoviral em uso na invenção édefeituoso na replicação (ver, por exemplo, W094/28152; Lusky et al., 1998,J. Virol 72, 2022-2032). Defeituosos preferidos no vetores de replicaçãoadenoviral são defeituosos de El (por exemplo, US 6,136,594 e US6,013,638), com uma anulação de El que se estende aproximadamente dasposições 459 a 3328 ou aproximadamente das posições 459 a 3510 (porreferência à seqüência do adenovírus humano tipo 5 divulgado no GeneBanksob o número de acesso M 73260 e em Chroboczek et al., 1992, Virol. 186,280-285). A capacidade de clonagem ainda pode ser melhorada pela anulaçãodas porções adicionais do genoma adenoviral (toda ou parte da região E3 nãoessencial ou de outras regiões E2, E4 essenciais). A inserção do ácidonucleico pode ser realizada através da recombinação homóloga em qualquerlocalização do genoma adenoviral como descrito em Chartier et al. (1996, J.Virol. 70, 4805-4810). Por exemplo, o ácido nucleico que codifica opolipeptídeo E6 de HPV-18 pode ser inserida na substituição da região Eleoácido nucleico que codifica o polipeptídeo de HPV-18 E7 na substituição daregião E3 ou vice versa.
Em um outro e preferido aspecto, o vetor em uso na invenção éum vetor poxviral (ver, por exemplo, Cox et al. in "Viruses in Human GeneTherapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press). Isto pode ser obtido apartir de qualquer membro do poxviridae, em particular vírus canarypox,fowlpox e vaccinia, o último sendo preferido. Os vírus vaccinia adequadosincluem, sem limitação a cepa Copenhagen (Goebel et al., 1990, Virol. 179,247-266 e 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401), a cepa Wyethe a cepa Ankara modificada altamente atenuada (MVA) (Mayr et al., 1975,Infection 3, 6-16). A determinação da seqüência completa do genoma MVA ea comparação com o genoma Copenhagen permitiu a identificação precisa desete anulações (I a VII) que ocorreu no genoma MVA (Antoine et al., 1998,Virology 244, 365-396), qualquer um dos quais pode ser usado para inserir oácido nucleico codificador de polipeptídeo de HPV-18 precoce.
A técnica básica para a inserção do ácido nucleico ereguladores de elemento associado requeridos para a expressão em umgenoma poxviral é descrito em numerosos descritos acessíveis à pessoahabilitada na técnica (Paul et al., 2002, Câncer gene Ther. 9, 470-477; Picciniet al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4.769.330; US4.772.848; US 4.603.112; US 5.100.587 e US 5.179.993). Usualmente,procede-se através da recombinação homóloga entre seqüências desobreposição (isto é, flanqueando o local de inserção desejado) presente tantono genoma viral e um plasmídeo que carrega o ácido nucleico para inserção.
O ácido nucleico é preferivelmente inserido em um local nãoessencial do genoma poxviral, a fim de que o poxvírus recombinantepermanece viável e infeccioso. As regiões não essenciais são regiõesintergênicas não codificadoras ou qualquer gene para os quais a inativação ouanulação não prejudica significantemente desenvolvimento, replicação ouinfecção. Uma pessoa também pode considerar inserção em um local viralessencial contanto que a função defeituosa seja fornecida in trans durante aprodução de partículas virais, por exemplo usando-se uma linha celularauxiliar que carrega as seqüências complementares correspondente àquelesanulados no genoma poxviral.
Quando se usa o vírus vaccinia de Copenhagen, o ácidonucleico codificador de polipeptídeo de HPV-18 precoce é preferivelmenteinserido no gene de timidina cinase (tk) (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad.Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537). Entretanto,outros locais de inserção também são apropriados, por exemplo, no gene dehemaglutinina (Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), no local KlL, nogene u (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190) ou na extremidadeesquerda do genoma do vírus vaccinia onde uma variedade de anulaçõesespontâneas ou projetadas foram relatados na literatura (Altenburger et al.,1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al. 1981, J. Virol. 40, 387-395;Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et al, 1989, J. Virol. 63,3829-3836; Perkus et al, 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al, 1991, Virol.180, 406-410).
Quando se usa MVA, o ácido nucleico codificador depolipeptídeo de HPV-18 precoce pode ser inserida em qualquer uma dasanulações identificadas I a VII bem como no local D4R, mas a inserção naanulação II ou III é preferida (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040).Quando se usa vírus fowlpox, embora a inserção dentro dogene de timidina cinase possa ser considerada, o ácido nucleico codificador depolipeptídeo de HPV-18 precoce é preferivelmente introduzido na regiãointergênica situada entre ORPs 7 e 9 (ver, por exemplo, EP 314 569 e US5,180,675).
Como descrito acima, a composição em uso na invenção aindapode compreender um ácido nucleico que expressa citocina. Isto pode serrealizado pelo vetor que codifica o um ou mais polipeptídeos de HPV-18precoces ou por um vetor independente que pode ser da mesma origem ou diferente.
Uma forma de realização preferida da invenção é direcionadaao uso de uma composição que compreende um vetor de MVA que codifica opolipeptídeo E6 de HPV-18 colocado sob o promotor 7,5K, o polipeptídeo deHPV-18 E7 colocado sob o promotor 7,5K e o gene IL-2 humano colocadosob o controle do promotor H5R. Preferivelmente, ácidos nucleicos quecodificam o polipeptídeo E6 de HPV-18, o polipeptídeo de HPV-18 E7 e oIL-2 humanos são inseridos na anulação III do genoma de MVA.
Além disso, a composição em uso na invenção pode incluiruma ou mais substâncias estabilizantes, tais como lipídeos (por exemplo,lipídeos catiônicos, lipossomas, lipídeos como descrito em W098/44143),inibidores de nuclease, hidrogel, hialuronidase (W098/53853), colagenase,polímeros catiônicos, polissacarídeos, agentes de quelação (EP890362), a fimde preservar sua degradação dentro do corpo animal e/ou humano e/oumelhorar a transfecção/infecção do vetor na célula hospedeira ou organismo.Tais substâncias podem ser usadas sozinhas ou em combinação (por exemplo,lipídeos catiônicos ou neutros).
As partículas virais infecciosas que compreendem o ácidonucleico descrito acima ou vetores podem ser produzidas por processo derotina, um processo exemplar compreende as etapas de:(a) introduzir o vetor viral em uma linha celular adequada,
(b) cultivar a dita linha celular sob condições adequadas a fimde permitir a produção da dita partícula viral infecciosa,
(c) recuperar a partícula viral infecciosa produzida a partir dacultura da dita linha celular e
(d) opcionalmente, purificar dita partícula viral infecciosarecuperada.
Quando o vetor viral é defeituoso, as partículas infecciosas sãousualmente produzidas em uma linha celular de complementação ou porintermédio de um vírus auxiliar, que fornece in trans os genes virais nãofuncionais. Por exemplo, linhas celulares adequadas para complementarvetores adenovirais anulados em El incluem as 293 células (Graham et al.,1997, J. Gen. Virol. 36, 59-72) bem como as células PER-C6 (Fallaux et al.,1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917) as células apropriadas para apropagação de poxvírus vetores são célula aviárias e mais preferivelmentefibroblastos de embrião de galinha primários (CEF) preparados a partir deembriões de galinha obtidos a partir de ovos fertilizados.
As partículas virais infecciosas podem ser recuperadas dosobrenadante de cultura ou a partir das células após a Iise (por exemplo, pormeios químicos, congelamento/descongelamento, choque osmótico, choquemecânico, sonificação e outros). As partículas virais podem ser isoladas porséries consecutivas de purificação de placa e então purificadas usando-se astécnicas da técnica (métodos cromatográficos, ultracentrifugação em cloretode césio ou gradiente de sacarose).
A presente invenção também abrange o uso de vetores oupartículas virais que foram modificadas para permitir o alvejamentopreferencial a uma célula hospedeira alvo particular (ver, por exemplo,Wickam et al., 1997, J. Virol. 71, 8221-8229; Arnberg et al., 1997, Virol. 227,239-244; Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668; W094/10323;W002/96939 e EP 1 146 125). Um aspecto particular de vetores e partículasvirais alvejadas é a presença em sua superfície de um ligando capaz dereconhecer e ligar-se a um componente de superfície celular ou exposta talcomo um marcador específico celular (por exemplo, uma célula infectada porHPV), um marcador específico de tecido (por exemplo, um marcadorespecífico cervical), bem como um antígeno viral (por exemplo, HPV). Osexemplos de ligandos adequados incluem anticorpos ou fragmentos destesdirecionados a um domínio antigênico de HPV. O ligando é, usualmente,inserido geneticamente em um polipeptídeo presente na superfície do vírus(por exemplo, fibra adenoviral, penton, pIX ou produto genético pl4 devaccinia).
A composição em uso na presente invenção pode serproduzida por qualquer método adequado, por exemplo, pelas técnicassensibilizadoras de peptídeo diretas padrão (por exemplo, Bodanszky, 1984 inPrincipies of peptide synthesis, Springer-Verlag) e pelo tecnologia de DNArecombinante em células hospedeiras apropriadas. Por exemplo, o ácidonucleico codificando quanto aos polipeptídeos E6 e E7 de HPV-18 precocespodem ser isolados diretamente a partir de células contendo HPV, cDNA ebibliotecas genômicas, genomas virais ou qualquer vetor da técnica anteriorconhecido por incluí-los, por biologia molecular convencional ou técnicas dePCR. Se necessário, este ainda pode ser modificado pelas técnicas demutagênese de rotina. Alternativamente, o ácido nucleico em uso na invençãotambém pode ser gerado pela síntese química em processo automatizado (porexemplo, montado a partir de oligonucleotídeos sintéticos de sobreposiçãocomo descrito por exemplo em Edge, 1981, Nature 292, 756; Nambair et ai.,1984, Science 223, 1299; Jay et al., 1984, J. Biol. Chem. 259, 6311). aqueleshabilitados na técnica estão informados sobre os sistemas de expressãonumerosos disponíveis para a produção do polipeptídeo de HPV-18 precocesem células hospedeiras apropriadas e dos métodos para a produção de umvetor ou de uma partícula viral infecciosa em uma célula hospedeira.
O uso preferido de uma composição de acordo com a invençãoé para o tratamento uma variedade de doenças e condições patológicas,especialmente aquelas associados com uma infecção por HPV causado porpelo menos um dos genótipos de HPV listados abaixo. Embora a invençãotambém abrange uma profilaxia, é especialmente útil para a terapia, porexemplo, para tratamento da infecção persistente de HPV, pré-cancerosasbem como condições cancerosas que podem desenvolver em pacientesinfectados por HPV. Exemplos de condições cancerosas associadas com HPVincluem carcinoma cervical, carcinoma anal e câncer oral. As condições pré-cancerosas associados ao HPV estende-se a partir das lesões de alto grau àbaixo grau incluindo neoplasia epitelial intra-cervical (CIN) de grau 1, 2 ou 3.
Preferivelmente, na administração em um organismohospedeiro de acordo com as modalidades descritas neste, a composição dainvenção fornece um benefício terapêutico ao organismo hospedeiro tratado.
O benefício terapêutico pode ser evidenciado por diversas maneiras comocomparadas ao tratamento anterior, por exemplo em um nível de populaçãopor uma diminuição da freqüência da infecção por HPVs, por um atraso nodesenvolvimento de uma condição patológica tipicamente associada cominfecção por HPV (por exemplo, atraso no desenvolvimento de lesões ClN oucânceres cervicais) ou no nível individual por uma diminuição de HPVviremia, e/ou uma inibição de expressão de gene viral (por exemplo, umadiminuição RNAs que expressam HPV E6 ou E7) e/ou por uma melhoria doresultado clínico (por exemplo, estabilização, regressão parcial ou total deuma lesão associada ao HPV) e/ou por uma estimulação do sistema imuneresultante no desenvolvimento de uma resposta anti-HPV intensificadahumoral ou celular ou ambos (por exemplo, produção de anticorpos de anti-HPV e/ou imunidade mediada por células T) e/ou por uma respostamelhorada do organismo hospedeiro por terapias convencionais. Por exemplo,a composição usada de acordo com a invenção fornece um benefício quandoesta administração à mulheres com HPV positivo é seguido por (i) umadetecção de HPV negativo seguinte um ou mais detecções positivas, (ii) umaregressão de lesões CIN2/3 de alto grau por CIN 1 de baixo grau ou (iii) aestabilização ou regressão de um carcinoma cervical invasivo. Umacompanhamento regular dos pacientes após o tratamento é recomendadodurante um mínimo de 6 meses.
A presença de HPV pode ser determinado em fluido biológico(por exemplo, um fluido cervical ou vaginal, sangüíneo, soro, plasma),amostras ginecológicas coletadas usando dispositivo de amostragem cervicalconvencional, seções de tecido, e biópsias. Uma variedade de métodos sãodisponíveis por aqueles habilitados na técnica para avaliar a presença de DNAde HPV e RNA em uma amostra, tal como sistema LiPA (W099/14377; LaboBiomedical products, Países Baixos), Pre Tect HPV Proofer (NorChip AS,Norway), Sistema Hybrid Capture II (Digene Corp, USA), Sistema Thin Prep(Cytyc Corporate; Marlborough, MA) e Sistemas PCRIRT-PCR. Osiniciadores adequados são conhecidos àquela pessoa habilitada ou podem serfacilmente sintetizados na base da seqüência de nucleotídeo do genótipo deHPV de interesse. Um também pode proceder pelos ensaios deimunogenicidade (por exemplo, ELISA) usando anticorpos adequados. Aregressão ou estabilização de uma lesão induzida por HPV pode serdeterminada pela medição do tamanho atual da lesão em um período detempo. A observação direta (por exemplo, colposcopia), métodos devisualização radiológicos, métodos de visualização imunológicos ou ultra-som pode ser usado para avaliar o tamanho da lesão durante o período. Alémdisso, uma variedade de métodos in vitro pode ser usado a fim de predizerestabilização ou regressão de uma lesão associada ao HPV em um organismohospedeiro, tal como análise histológica ou citológica para avaliar a presençade células atípicas. A estimulação de um resposta imune anti-HPV pode seravaliada por diversas técnicas de rotina tal como aquelas descritas abaixo emconexão com o uso de uma composição para induzir ou estimular umaresposta imune.
Adequadamente, a composição da invenção ainda compreendeum veículo aceitável farmaceuticamente para fornecer uma composiçãofarmacêutica. Como usado neste, a "veículo aceitável farmaceuticamente" épretendido para incluir qualquer ou todos os carregadores, solventes,diluentes, excipientes, adjuvantes, dispersão média, revestimentos, agentesanti-bacterianos ou anti-fungicos, e agentes retardantes de absorção, e outros,compatível com a administração farmacêutica. O veículo aceitávelfarmaceuticamente incluído em uma composição também deve permitirpreservar esta estabilidade sob as condições de fabricação e armazenamentoduradouro (isto é pelo menos um mês) em congelamento (por exemplo, -70°C, -20°C), refrigerado (por exemplo, 4°C) ou temperatura ambiente (porexemplo, 20°C) ou em um estado liofilizado.
A composição em uso da invenção é adequadamentetamponada a fim de ser apropriada por uso humano em um pH básicolevemente ou fisiológico (por exemplo, entre cerca de pH 7 a cerca de pH 9).Tampões adequados incluem, sem limitação tampão de fosfato (por exemplo,PBS), tampão de bicarbonato e/ou tampão de Tris.
Além disso pode compreender um diluente apropriado para ouso animal ou humano. Um tal diluente é preferivelmente isotônico,hipotônico ou hipertônico fracamente e tem um força iônica relativamentebaixa. Os exemplos representativos incluem água estéril, solução salinafisiológica (por exemplo, cloreto de sódio), solução de Ringers, glicose,trealose ou soluções de sacarose, solução de Hank, e outros soluções salinasbalanceadas fisiologicamente aquosas (ver, por exemplo, a edição maiscorrente de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro,Lippincott, Williams&Wilkins).A composição também pode conter outros excipientesaceitáveis farmaceuticamente para fornecer propriedades farmacodinâmicasou farmacêuticas desejadas, incluindo por exemplo modificar ou manter aosmolaridade, viscosidade, claridade, cor, esterilidade, estabilidade, taxa dedissolução da formulação, modificar ou manter a liberação ou absorção noorganismo animal ou humano, promover o transporte cruzando a barreirasangüínea ou penetração em um órgão particular (por exemplo, fígado). Osexcipientes adequados incluem aminoácidos.
Além disso, a composição pode ser usada em combinação comadjuvantes convencionais adequados para aplicação sistêmica ou mucosal emhumanos.
A composição pode ser administrada ao organismo hospedeiropor uma variedade de modos de administração, incluindo administraçãolocalizada e tópica, sistêmica. As vias de administração adequadas incluem,sem limitação subcutânea, intradermal, intramuscular, intravenosa,intraperitoneal, intratumoral, intravascular, e injeção intra-arterial. Asinjeções pode ser feitas com seringas e agulhas convencionais, ou qualqueroutro dispositivo apropriado disponível na técnica. Alternativamente acomposição pode ser administrada por intermédio da via mucosal, tal como avia oral/alimentar, nasal, intra-traqueal, intra-pulmonar, intra-vaginal ou intra-retal. A administração tópica também pode ser realizada usando meiostransdérmicos (por exemplo, emplastros e outros). No contexto da invenção,as administrações subcutânea e intramuscular constituem as vias preferidas. Aadministração pode acontecer em uma dose simples ou uma dose repetidauma ou diversas vezes após um intervalo de tempo certo variando a partir dodia ao ano. Desejavelmente, os intervalos são uma substância de uma semanaa um mês.
A dosagem apropriada pode ser adaptada como uma função devários parâmetros, em particular o modo de administração; a composiçãoutilizada; a idade, saúde, e peso do organismo hospedeiro; a natureza eextensão dos sintomas; tipo de tratamento simultâneo; a freqüência dotratamento; e/ou a necessidade para prevenção ou terapia. O refino adicionaldos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada érotineiramente feito por um médico, na luz das circunstâncias relevantes. Paraorientação geral, a dosagem adequada para uma composição contendo vacinavaria de cerca de IO4 a IO9 pfu (unidades formadoras de placas),desejavelmente de cerca de IO5 e IO8 pfu visto que adenovirus quecompreende composição varia de cerca de IO3 a 1013 iu (unidadesinfecciosas), desejavelmente de cerca de 107 e IO11 iu. Uma composição combase em plasmídeos de vetor pode ser administrada em doses entre 10 μg e 20mg, vantajosamente entre 100 μg e 2 mg. Uma composição de proteína podeser administrada em doses entre 10 ng e 20 mg, com uma preferência especialpor uma dosagem de cerca de 0,1 μg a cerca de 2 mg por Kg de peso corporal.
Em uma forma de realização preferida, a composição em usoda invenção compreende o vetor MVA descrito acima e é administrada emtrês doses de 5x10 pfu a 5x10 pfu por via subcutânea em intervalossemanais.
Se desejado, o uso da invenção pode ser realizada emconjunção com um ou mais modalidades terapêuticas convencionais (porexemplo, radiação, quimioterapia e/ou cirurgia). Os métodos terapêuticosmúltiplos fornece ao paciente com uma intervenção com base mais ampla. Emuma forma de realização, o método da invenção pode ser precedido oupreferivelmente seguido por uma excisão cirúrgica da lesão associada ao HPV(por exemplo, conisação). Em uma outra forma de realização, este pode serprecedido ou seguido pela radioterapia (por exemplo, radiação de gama).
Aqueles habilitados na técnica podem rapidamente formular protocolos deterapia de radiação apropriados e parâmetros que podem ser usados (ver, porexemplo, Perez and Brady, 1992, Principies and Practice of RadiationOncology, 2o Ed. JB Lippincott Co; usando adaptações apropriadas emodificações como serão rapidamente evidentes àqueles habilitados nocampo). Ainda em outra forma de realização, o método ou uso da invenção éassociada à quimioterapia com um ou mais medicamentos que são usadosconvencionalmente para tratamento ou prevenção de infecção por HPVs,condições patológicas associadas com HPV.
A composição também pode ser usada em combinação comoutros polipeptídeos HPV, tal como um ou mais do polipeptídeo de HPV-16precoces, desejavelmente os polipeptídeos E6 e/ou E7 HPV-16preferivelmente modificados como descritos na técnica a não ser oncogênicose membrana apresentada (ver W099/03885). Uma tal composição quecompreende os polipeptídeos E6 e/ou E7 de HPV-16 e HPV-18 ou um ácidonucleico que codifica os polipeptídeos E6 e/ou E7 de HPV-16 e HPV-18podem ser particularmente úteis para tratar uma infecção ou uma condiçãopatológica causada por pelo menos um outro papilomavírus que não HPV-16e HPV-18, tal como qualquer um de HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52 eHPV-58 além de qualquer um de HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 e HPV-85 ou qualquer combinação destes (porexemplo, HPV-3 1 e HPV-45).
Em uma outra forma de realização, o uso da invenção érealizada de acordo com o auxílio principal modalidade terapêutica quecompreende administração seqüencial de um ou mais composições deimprimação e um ou mais composições auxiliares. Tipicamente, ascomposições de imprimação e as auxiliares são veículos diferentes quecompreende ou codifica pelo menos um domínio imunogênico em comum. Acomposição de imprimação é inicialmente administrada ao organismohospedeiro e a composição auxiliares é subseqüentemente administrada apósum período de tempo que varia de um dia a doze meses. Além disso, ascomposições de imprimação e auxiliares podem ser administradas no mesmolocal ou em locais alternativos pela mesma via ou por vias diferentes deadministração. Por exemplo, uma composição de imprimação com base empolipeptídeo HPV-18 precoce pode ser administrado por uma via mucosalvisto que a composição auxiliar com base no vetor de ácido nucleico épreferivelmente injetado, por exemplo, injeção subcutânea para um vetorMVA, injeção intramuscular para um plasmídeo de DNA e por um vetoradenoviral.
A presente invenção também refere-se ao uso de umacomposição que compreende um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-18ou um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos precoces deHPV-18 para induzir ou estimular uma resposta imune contra pelo menos umoutro papilomavírus humano que não HPV-18. A invenção também dizrespeito a um método de indução ou estimulação em uma resposta imune deum mamífero contra pelo menos um outro papilomavírus humano que nãoHPV-18, o método compreendendo administrar ao mamífero uma composiçãoque compreende um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-18 ou um ácidonucleico que codifica um ou mais polipeptídeos precoces de HPV-18. Aresposta imune é preferivelmente uma resposta imune celular direcionada aum polipeptídeo precoce HPV, com uma preferência por um CD4+, a CD8+ou tanto CD4+ quanto CD8+ de resposta imune mediada.
A capacidade para induzir ou estimular uma resposta imuneanti-HPV na administração em um organismo humano ou animal pode seravaliado in vitro ou in vivo usando uma variedade de ensaios que são padrõesna técnica. Para uma descrição geral de técnicas disponíveis para avaliar ocomeço e uma estimulação de uma resposta imune, ver, por exemplo, Coliganet al. (1992 e 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc,National Institute of Health). A medição da imunidade celular pode serrealizada por uma medição da perfis de citocina secretadas pelas células deefeitos ativados incluindo aquelas derivadas de CD4+ e CD8+ células T (porexemplo, quantificação de IL-IO ou células que produzem IFNg por ELlspot),pela determinação do estado de ativação de células de efeito imunes (porexemplo, ensaios de proliferação de células T por uma absorção de timidina[3H] clássica), submetendo-se ao ensaio quanto a linfócitos T específicos deantígeno em um paciente sensibilizado (por exemplo, Iise específica depeptídeo em um ensaio de citoxicidade), pela atividade citolítica anti-tumormediada por linfócito determinado por exemplo, por um ensaio de liberação51Cr. A capacidade para estimular uma resposta humoral pode ser determinadapela ligação de anticorpo e/ou competição em ligação (ver, por exemplo,Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press) ou pela geração in vitroda inibição mediada pelo anticorpo específico de tumor de desenvolvimentocelular (Gazit et al., 1992, Câncer Immunol. Immunother 35, 135-144). Ométodo da invenção também ainda pode ser validado em modelos animaisprovocados com um agente de indução de tumor apropriado (por exemplo,HPV-18 E6 e células TCl que expressam E7) para determinar atividade anti-tumor, refletindo uma indução ou uma estimulação de um resposta imuneanti-HPV.
A invenção foi descrita em uma maneira ilustrativa, é esta seráentendida que a terminologia que foi usada é pretendida ser na natureza daspalavras da descrição em vez da limitação. Obviamente, muitas modificaçõese variações da presente invenção são possíveis na luz das técnicas acima. Éportanto a ser entendido que dentro do escopo das reivindicações anexadas, ainvenção pode ser praticada em uma maneira diferente a partir do que éespecialmente descrita neste.
Todas as descobertas citadas acima das Patentes, Publicações eEntrada de banco de dados são especialmente incorporadas neste porreferência em sua totalidade à mesma extensão como se cada uma tal Patenteindividual, Publicação ou Entrada foram especificamente e indicadasindividualmente a serem incorporadas por referência.Os seguintes exemplos servem para ilustrar a presente invenção.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: Construção de polipeptídeos HPV-18 E6 e E7 que expressam o vírus
As construções descritas abaixo são realizadas de acordo coma engenharia genética geral e técnicas de clonagem moleculares detalhadasem Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor NY) ou de acordo com as recomendações dofabricante quando um equipamento comercial é usado. As técnicas deamplificação PCR são conhecidas às pessoas habilitadas na técnica (ver, porexemplo, PCR protocols - A guide to methods and applications, 1990,published by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press). Asconstruções de vírus de vacina recombinantes são realizados de acordo com atecnologia convencional no campo dos documentos acima citados e emMackett et al. (1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 7415-7419) e Mackett etal. ( 1984, J. Virol. 49, 857-864). O gene gpt de seleção (xantina guaninafosforibosiltransferase) de E. coli (Falkner and Moss, 1988, J. Virol. 62,1849-1854) é usado para facilitar a seleção do vírus de vacina recombinante.
Um vírus MVA recombinante que expressa uma membranaancorada e variantes não oncogênicas de polipeptídeos HPV-18 E6 e E7(E6*TMF and E7*TMR) podem ser construídas como descrito emW099/03885 e U.S. 6.884.786 (descrito por MVATG8042 que expressa amembrana ancorada e variantes não oncogênicas de polipeptídeos E6 e E7 deHPV-16). Preferivelmente, as seqüências do gene HPV-18 são amboscolocadas sob o controle do promotor p7,5K e inseridos na região de excisãoIII do genoma MVA. Se o constructo inclui um gene imunopotenciador, apreferência é dada ao gene IL-2 conduzido pelo promotor H5R. O constructoresultante é projetado por MVA-HPV-18.As partículas do vírus MVA-HPV-18 podem ser produzidasem células CEF de acordo com as técnicas convencionais. Os estoques devírus serão mantidos a -80°C até o dia da injeção. A suspensão viral serárapidamente descongelada, e diluída antes da administração em tampãoadequado contendo por exemplo Tris-HCl de 10 mM de pH8, 5% de sacarose(p/v), e 50 mM de NaCl, a fim de obter uma dosagem viral de 5x10 pfu emum volume de 100 ul.
EXEMPLO 2: A reatividade cruzada fornecida pelos polipeptídeos HPV-18E6 e E7
A reatividade cruzada pode ser avaliada pelo ensaio IFNgELISPOT em esplenócitos obtidos de camundongos imunizados comMVATG HPV-I 8 como descrito abaixo.
As seqüências de aminoácido E6 e E7 a partir de genótiposdiferentes de HPV são alinhados usando o programa de alinhamento múltiploHUSAR (CLUSTAL) (https://genius.embnet.dkfzhei delberg. de/menu/c gi-bin/w2h/w2h. start).
Os peptídeos reconhecidos por células T previstas (H2brestrito) pode ser identificado pelo uso do software BIMAS de ligação depeptídeo disponível na Internet (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind).Os peptídeos tendo uma contagem de ligação igual ou acima aquela obtidacom o peptídeo de referência descrito na técnica como sendo reconhecido porCTL específico por E7, será analisado. Aquele mostra uma ou duas diferençasno aminoácidos com respeito à seqüência de aminoácido de polipeptídeosHPV-18 E6 e E7 serão selecionados por esta análise de reatividade cruzada.Os peptídeos selecionados podem ser sintetizado por técnicas de sínteseconvencionais e sua capacidade de atuar cruzada com esplenócitos obtidos decamundongos imunizados com polipeptídeos HPV-18 E6 e E7 e pode serdeterminado como seguintes.
Os camundongos fêmeas saudáveis C57B1/6 SPF serãoobtidos de um fornecedor comercial e serão alojados sob condiçõescontroladas (simples, ambiente exclusivo, ar condicionado para fornecer ummínimo de 11 mudanças de ar por hora com faixas de temperatura e umidaderelativa dentro de 18°C e 22°C e 40 a 70% respectivamente. A iluminação écontrolada automaticamente para dar um ciclo de 12 horas de luz e 12 horasde escuro. O alimento e água são fornecidos ad libitum por todo o estudo).
Os camundongos fêmeas C57B1/6 com sete semanas de idadeSpecific Pathogene Free (livre de patógeno específico) (SPF), obtidos de umfornecedor comercial e alojados sob as condições definidas acima podem serimunizados subcutaneamente 3 vezes ao dia 0,7 e 14 com 5x107 pfu deMVATGN33 ou MVATG HPV-18. As injeções subcutâneas sãopreferivelmente realizada cada um período em um local diferente do flancodireito dos animais. Os baços podem ser retirados no dia 24 após a últimaimunização. As células do baço frescas podem ser preparadas usando técnicasconvencionais na técnica.
Um placa nitrocelulose de 96 reservatórios pode ser revestidacom 3 μg/ml de anticorpo IFNg anti-camundongo de rato monoclonal (CloneR4-6A2; Pharmingen, Cat. Número 551216, 100 gl/reservatório) em tampãode carbonato de sódio. As placas podem ser incubadas durante a noite a 4°Cou 1 hora a 37°C. As placas podem ser lavadas três vezes com DMEM 10%de FCS e saturadas 2 horas a 37°C com ΙΟΟμΙ de DMEM 10% deFCS/reservatório. Os esplenócitos podem ser colocados em uma concentraçãode IO6 células/100 gl. O IL-2 pode ser adicionado aos reservatórios em umaconcentração de 6U/500 reservatório (R&D Systems; 10 ng/ml). OConcanavalin A é geralmente usado como controle positivo (5 μg/ml).
Peptídeos que portam epítopo T previstos podem sersintetizados e fornecidos em DMSO a 10 mg/ml pela armazenagem a 4°C. opeptídeo de referência HPV-18 é usado como controle positivo e um peptídeoirrelevante como controle negativo. Os peptídeos podem ser adicionados aosreservatórios em uma concentração de 5 μg/ml em incubados 48 horas a37°C, em 5% de CO2.
Após a lavagem uma vez com PBS IX e 5 vezes com PBS de0,05% de Tween, o anti-camundongo biotinilado IFNg (clone XMG 1,2,Pharmingen) pode ser adicionado a concentração de 0,3 μg/100μl/reservatório e incubado 2 horas a temperatura ambiente sob lenta agitação.A placa pode ser lavada 5 vezes com PBS de 0,05% de Tween. O ExtravidinAKP (Sigma, St. Louis, MO) diluído a 1/5000 em PBS de 0,05% de TweenFCS1% também pode ser adicionado aos reservatórios (100 gl/reservatório).A placa pode ser incubada 45 minutos em temperatura ambiente e entãolavada 5 vezes com PBS de 0,05% de Tween. A secreção IFNg pode serrevelada com Biorad Kit. O substrato de 100 μΐ (NBT+BLIP) pode seradicionado por reservatório e a placa levada em temperatura ambiente por 0,5hora. a placa pode ser lavada com água e colocada secar durante a noite emtemperatura ambiente. Os pontos pode ser contados usando uma leitoraElispot Bioreader 4000 Pro-X (BIOSYS-Gmbh; Serlabo France).
É esperado que a cultura dos esplenócitos imunizados napresença de peptídeo de referência HPV-18 estimula a produção de IFNgvisto que a adição de peptídeos de reação não cruzada (tal como o peptídeoirrelevante) na cultura do esplenócito terão efeitos não significantes (produçãode IFNg sob um nível de base). A reatividade cruzada é demonstrada quandoos não peptídeos HPV-18 são reconhecidos pelo CTL os camundongosimunizados, sugerindo que a vacinação com polipeptídeos HPV-18 E6 e/ouE7 ou vetores de expressão (por exemplo, MVATG HPV-18) também devemser eficazes para tratamento de infecções com outros genótipos de HPV.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<ÜQ> 1ERaKSGBBE S,A,
<120> Vacina de papilomavírus com base em HFV-18
<130> TO175<2S0> 4
<170> PafcentIn versão 3.1
<210> 1<211> 153<213> PRT
<213> Variante não oncogênica da seqüência artificial <220> <223-do polipeptídeo B6 de HPV-18
<400> 1
M©t Ala Artf Phe Glu Asp Pro Tar Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Am1 5-10 15
Leu Cys THr Glu Lau Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Gla lie Thr Cys20 25 30
Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thx Glu Val ?he CSlu Phe Ala35 40 45
Phe Lys Asp leu ?be Val Val Tyr Arg Asp Ser Ϊ1© Pro His Ma Aia50 55 60
Cys Jiis Lys Cys Ile Asp Fhe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Ris65 70 75 80
Tyr Ser Asp Ssii Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Lett Thr Asn ThrSS 50 95
Gly Leu Tyr Asn Leu Leu He Arg Cys Leu. Arg Cya Gln Lys Pro Leu100 105 110
Ley Arg His teu Asn. Clu Lys Arg Arg pfce His Asn Ile Ala Gly His115 120 125
Tyf Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cye Asn Arg AXa Arg Gln Glu Arg130 135 140
Leu Gla Arg Arg Arg Glu Thr Gln Vãl145 150<210> 2<211> 100<212> PST
<213> Variante não oncogênica da seqüência artificial <220>
<223> do polipeptídeo E7 de HFV l
<400> 2
Mst His Gly sTo Lys Ala Thi &eu Gla Aap Ile Val Leu Hi s Leu Glw1 5 10 15
Pro Gln Asn Olu Ile Pro Val Glu Sln Leu Ser Asp Ser Slu Glu Giu20 25 30
Asn Asp Glu Jle Asp cly vai Aaa His Gln His Leii Pro Ala Arg Arg35 40 45
Ala Glu Pro Gls Arg His Thr Met Leu Cys iíet Cys Cys Lys Cys Glu50 55 60
MLa Arg lie Gly Lsu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ala65 70 75 80
Phe Glu G In. Leu Pbe teu Asn Thr Leu Ses Pte Val Cys Pro fPrp Cys85 90 95
Ala Ser Gln Gln100
243PRT
<210> 3<211> 243<212 > PRT<213 > Variante nao oncogenica apresentada na membrana da sequencia artificial<220> (223> do polipeptido B6 de<400> 3
Met Gly Leu Lys Vsl Asn Val Ser Ala Ilfe Phe Met Ala Val Ley Leu1 5 10 15
Thr Leu Gln Thr Pro Tiir Gly Slsl Ile His Trp Gly Met Ala Arg Phe20 25 30
Clu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pre Asp Leu Cys Thr Glu35 40 45
Leu Asu Thr Ser Leu Gln Asp lie Glu Xie ISuc Cys Val Tyr cys Lys50 55 60
Thr Val Leu Glu Leu Trir Glu Val Glu Phe Ala ?he Lys Asp Leu65 70 75 SO
àe Val Vs 1 IVr Ãrg Asp Ser Ile Stq h±s Ala hle. Gys Bis Lys Cys85 90 95
Ile Asp Phe Tyr Sex Arg Xle Arg Giu Leu Arg His Tyr Ser Asp Ser100 105 110
Val Tyr Gly Asp jFbr Leu Glu Lys Lau Thr Asn Thr Gly Leu Tyr Asn
115 120 125
Lea LetL Ile Arg Cys Leu Arg Gys Gln Lys Pro Leu Leu Arg Hie Leu130 135 140
Asn GXu Lys Arg Arg Che Hifi Asu Jle Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln145 150 155 160
Cys Hig Ser Cya Cye Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Axçr Arg165 170 175
Arg Glu Thr Gln Vatl Gly Leu Ser Ser Thr Ser Xle Val Tyr Ite Leu180 IBS 190
Xle Ala Vsl Cys Letí Gly Gly Len Ile Gly He Pxo Ala Leu He Cys195 200 205
Cys Cys Arg Oly Arg Cys Asn Lys Lys Gly Olu Gln Val Gly Met Ser210 215 220
Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Tbx Gly Thr Ser Lys Ser Tjt Val225 230 235 240
Ârg Ser Leu
<210> 4<211> 193
<212> PRT
<213> Variante não oncogênica apresentada na membrana daseqüência artificial <220> <223> da proteína B7 deHPV-18<4Q0> 4
Het vai Pro GItt Ala Leu teu Kib Val Pro Leu ieu. Val Phe Pro Leu1 5 10 15
Cys Phe Gly Lys Fbe Pro Ile Gly- Ser Met His Gly Pro Lys Ala Tiar20 25 30
Leu, Gln Asp Ile Val Leu. Kis Lau Glu Ero Gln Asa Glu Iie Pro Val35 40 45
Glu Gln ϊίβα Ser Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Agp GXy Val50 55 SO
Asn His Gltv ais Leu Pxo Ala Arg Arg Ala Glu Pro Cla Arg His Thr65 70 75 80
Met Leu Cye Met Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ilè Glu Leu vai Val85 SO 95
Gla Sea- Ser Ãlè Asp Asp Leu Arg Ala Pbe Gln Gln Leu Phe beu Asn100 105 110
Thr Leu. Sêr ?he Vai Cys Pro Trp Cys Ala Sex Gln Gln Arg Ser115 120 125
VaI Leu Leu Ser Alá Gly Ala Leu Tbr. Ala Leu Met teu Ile Ile Piie130 135 140
Lea Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Gi u Btq 1Shr Gln HiaUS 150 155 160
Asn Leu Arg GIy Tfar Oly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly165 170 ItS
Lvs Ile lie Ser Ser Trp Glu Ser Hls Lys Ser CiIy Gly Glu Thr ArgIBO ISS 190
Leu

Claims (25)

1. Uso de uma composição que compreende um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-18 ou um ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos precoces de HPV-18, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de umainfecção ou uma condição patológica causada por pelo menos um outropapilomavírus que não HPV-18.
2. Uso de uma composição que compreende um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-18 ou um ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos precoces de HPV-18, caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para tratar uma infecção ou uma condiçãopatológica causada por pelo menos um outro papilomavírus humano que nãoHPV-18.
3. Uso de uma composição que compreende um ou maispolipeptídeos precoces de HPV-18 ou um ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos precoces de HPV-18, caracterizado pelo fato de ser parainduzir uma resposta imune contra pelo menos um outro papilomavírushumano que não HPV-18.
4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-3, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um outro papilomavírushumano que não HPV-18 é selecionado dentre o grupo que consiste de HPV--39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 e HPV-85.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-4, caracterizado pelo fato de que o dito um ou mais polipeptídeos de HPV-18precoces é um polipeptídeo E6, um polipeptídeo E7 ou tanto um polipeptídeoE6 quanto um polipeptídeo E7.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que os ditos polipeptídeos E6 e/ou E7 de HPV-18 são variantes nãooncogênicas.
7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a dita variante não oncogênica do polipeptídeo E6 de HPV-18compreende uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica àseqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 1.
8. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a dita variante não oncogênica do polipeptídeo E7 de HPV-18compreende uma seqüência de aminoácido que é homóloga ou idêntica àseqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID N°: 2.
9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a-8, caracterizado pelo fato de que os ditos polipeptídeos E6 e/ou E7 de HPV--18 são modificados a fim de serem ancorados à membrana celular pelaincorporação de uma seqüência de ancoragem de membrana e uma seqüênciasecretora.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a dita seqüência de ancoragem de membrana e/ou seqüênciasecretora são obtidas a partir da glicoproteína da raiva, a glicoproteína doenvelope do vírus HIV ou a proteína F do vírus do sarampo.
11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que o dito polipeptídeo E6 de HPV-18 compreende uma seqüência deaminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência de aminoácido mostradana SEQ ID N°: 3.
12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que o dito polipeptídeo E7 de HPV-18 compreende uma seqüência deaminoácido que é homóloga ou idêntica à seqüência de aminoácido mostradana SEQ ID N°: 4.
13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-12, caracterizado pelo fato de que a dita composição adicional compreende acitocina ou um ácido nucleico que codifica uma citocina.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de que a dita citocina é IL-2.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-14, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico que codifica um oumais polipeptídeos de HPV-18 precoces é compreendido em um vetor.
16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelofato de que o dito vetor é um vetor de vaccinia.
17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato de que o dito vetor de vaccinia é um vetor de MVA.
18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelofato de que o dito vetor de MVA compreende um ácido nucleico que codificao polipeptídeo E6 de HPV-18 colocado sob o promotor 7,5K, um ácidonucleico que codifica o polipeptídeo E7 de HPV-18 colocado sob o promotor-7,5K e o gene IL-2 humano colocado sob o controle do promotor H5R.
19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que os ditos ácidos nucleicos que codificam o dito polipeptídeo E6 deHPV-18, o dito polipeptídeo E7 de HPV-18 e o dito gene IL-2 humano sãoinseridos na anulação III do genoma de MVA.
20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-19, caracterizado pelo fato de que a dita condição patológica é infecçãopersistente de HPV, uma condição pré-cancerosa ou cancerosa.
21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelofato de que a dita condição cancerosa associada com HPV é um carcinomacervical, um carcinoma anal ou um câncer oral.
22. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelofato de que a dita condição pré-cancerosa associada com HPV é umaneoplasia infra-epitelial cervical neoplasia (CIN) de grau 1, 2 ou 3.
23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-22, caracterizado pelo fato de que a dita composição é administrada pela viasubcutânea ou intramuscular.
24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20a 23, caracterizado pelo fato de que a dita composição é administrada emdoses que compreendem de 5x10"5 pfu a 5x10"7 pfu de vetor de vaccinia.
25. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de que a dita composição compreende um vetor de MVA como definidona reivindicação 17, 18oul9eé administrado em três doses de 5x105 pfu a5x10"7 pfu por via subcutânea em intervalos semanais.
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