BRPI0710360A2

BRPI0710360A2 - peptìdeos lineares antimicrobianos, seu uso, composição fitossanitária e método para prevenir e tratar infecções e doenças de plantas causadas por bactérias

Info

Publication number: BRPI0710360A2
Application number: BRPI0710360-3A
Authority: BR
Inventors: Rodríguez Bardají; Eduard; Segui Montesinos; Emili; Romacho Badosa; Esther; Soley Feliu; Lidia; Grabuleda Planas; Marta; Malagón Ferre; Rafael
Original assignee: Universitat De Girona
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-24
Publication date: 2011-08-16
Also published as: CA2650903A1; US8026219B2; CN101466731A; ES2262448A1; EP2017285A1; WO2007125142A1; ES2262448B1; AU2007245654A1; WO2007125142A8; BRPI0710360B1; EP2017285A4; US20100016167A1; MX2008013601A

Abstract

<B>PEPTIDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, SEU USO, COMPOSIçãO FITOSSANITáRIA E MéTODO PARA PREVENIR E TRATAR INFECçõES E DOENçAS DE PLANTAS CAUSADAS POR BACTéRIAS<D>, que apresentam atividade antimicrobiana. Os ditos peptideos são compostos por 11 aminoácidos e têm o grupo amina do aminoácido, que constitui a extremidade N-terminal, sem derivar ou é funcionalizado com o grupo acetila, p-toluenossulfonila, benzila ou benzoila. O aminoácido que constitui a extremidade C-terminal dos ditos peptídeos tem a forma de carboxamida. A presente invenção descreve a síntese e a utilização dos ditos peptídeos lineares como agentes antimicrobianos contra bactérias patogênicas para plantas. Também se refere a composições que compreendem os ditos peptídeos lineares e um agente auxiliar, bem como a um método para prevenir e tratar infecções e doenças de plantas causadas por bactérias patogênicas.

Description

"PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, SEU USO1 COMPOSIÇÃOFITOSSANITÁRIA E MÉTODO PARA PREVENIR E TRATAR INFECÇÕES EDOENÇAS DE PLANTAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS"

Campo Técnico

Trata-se a presente invenção de peptídeos lineares, queapresentam propriedades antimicrobianas, são particularmente eficazes contrabactérias patogênicas das plantas e podem ser utilizados em composiçõesfitossanitárias.

Fundamentos da Invenção

As bactérias fitopatogênicas são responsáveis por perdasde grande importância econômica na produção vegetal. Entre elas, destacam-se,por exemplo, as bacterioses causadas pelas bactérias Erwinia amylovora,Pseudomonas syringae e Xanthomonas vesicatoria.

Atualmente, na Europa, apenas alguns produtos sãoautorizados para a proteção de plantas contra doenças bacterianas, que sãobaseados principalmente em derivados cúpricos, com uma eficácia de controleinsuficiente.

Os antibióticos, como, por exemplo, casugamicina ouestreptomicina, que até poucos anos atrás eram autorizados em alguns países,não são atualmente autorizados na Europa. Os antibióticos estreptomicina etetraciclina estão autorizados em alguns países, como, nos Estados Unidos, masem muitos casos, tem sido destaque o surgimento de linhagens do agentepatogênico resistentes, tornando, portanto, sua utilização ineficaz, ou podemrepresentar um risco de transferência da dita resistência a outras bactériaspatogênicas. No caso de infecções fúngicas provocadas por fungosfitopatogênicos, embora existam substâncias ativas disponíveis, é necessário quehaja novos fungicidas de forma contínua, em parte, devido ao surgimento deresistências, com certa freqüência.

Além disso, muitos dos compostos antibacterianosconhecidos mais eficazes apresentam uma persistência no meio ambiente, o quenão é desejável.Nos últimos anos, intensificou-se o desenvolvimento denovos tipos de antibióticos, que podem evitar a resistência das bactérias. Entreestes antibióticos, destacam-se os compostos isolados da própria natureza, como,por exemplo, os peptídeos, que estão presentes em plantas e animais, e algunsdeles apresentam propriedades antimicrobianas.

As cecropinas são peptídeos antimicrobianos presentesna hemolinfa do bicho-da-seda Hyalophora Cecropia, em resposta a uma infecçãobacteriana. Em particular, a cecropina A é um peptídeo linear composto de 37aminoácidos, que apresenta uma potente atividade Iitica contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. No entanto, existe certa relutância quanto ao seuemprego em aplicações fitossanitárias, devido ao seu elevado custo de produção,tendo uma extensão considerável e baixa estabilidade contra degradação porprotease.

Em Ali e outros, Mol. Plant-Microbe Interact., 2000, 13,847-859, descreve-se um peptídeo ativo contra algumas bactérias patogênicasdas plantas, como Erwinia carotovora subsp. carotovora e Erwinia carotovorasubsp. atroseptica. Trata-se de um undecapeptídeo preparado pela primeira vezpor Cavallarin e outros, Mol. Plant-Mierobe Interact., 1998, 11, 218-227, que éformado pela seqüência de aminoácidos Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu, e que o aminoácido da extremidade C-terminal apresenta um grupocarboxamida. O dito peptídeo é um peptídeo híbrido formado por fragmentos dospeptídeos de origem natural cecropina A e melitina. Especificamente, o ditopeptídeo é constituído pelos aminoácidos 2-8 de cecropina A e 6-9 de melitina.

Não há descrição da aplicação do dito undecapeptídeocontra outras bactérias fitopatogênicas, como, por exemplo, Erwinia amylovora,Xanthomonas vesicatoria e Pseudomonas syringae, que são particularmenteimportantes porque afetam plantas que são de grande importância econômica, econtra as quais até agora os métodos utilizados para combatê-las não são muitoeficazes.

Conseqüentemente, ainda há a necessidade de novoscompostos antimicrobianos, que apresentem uma boa eficácia contra bactériaspatogênicas das plantas, em particular, contra as bactérias Erwinia amylovora,Xanthomonas vesicatoria, ou Pseudomonas syringae.

Objetos da Invenção

Os autores da presente invenção desenvolveram novospeptídeos que são fáceis de preparar e apresentam alto índice de eficácia parainibir o crescimento de bactérias patogênicas das plantas, além de apresentarembaixa citotoxicidade nas células eucariotas e uma boa estabilidade à degradaçãopor protease.

O objeto da presente invenção consiste em apresentarpeptídeos lineares que apresentem propriedades antimicrobianas.

Faz parte do objeto da presente invenção, o uso dos ditospeptídeos como agentes antimicrobianos.

Outro objeto da presente invenção consiste emapresentar uma composição fitossanitária que compreende os peptídeos dapresente invenção e um agente auxiliar.

Outro objeto da presente invenção consiste emapresentar um método para prevenir e tratar infecções e doenças das plantascausadas por bactérias.

Sumário da InvençãoPeptídeos

O objeto da presente invenção consiste em apresentarpeptídeos lineares que correspondem à fórmula geral (I):

X1-X2-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-X3-Leu-NH2 (I)sendo que:

X1 é hidrogênio, acetila, p-toluenossulfonila, benzila oubenzoíla;

X2 é Lys, Tyr, Leu, Phe ou Trp, e;

X3 é Lys, Tyr, Vai, Phe ou Trp,com a condição de que o peptídeo em que Xi é hidrogênio, X2 é Trp e X3 é Valseja expressamente excluído da presente invenção.

Na fórmula geral, quando X1 é hidrogênio, ele érepresentado como Η, o grupo acetila é representado como Ac1 o grupo p-toluenossulfonila é representado como Ts1 o grupo benzila é representado comoBn e o grupo benzoíla é representado como Bz.

As abreviaturas utilizadas para os aminoácidos no presente relatório descritivoestão de acordo com a Normativa da Comissão para a Nomenclatura Bioquímicada IUPAC-IUB, conforme descrito no livro Biochemical Nomenclature and RelatedDocuments, 2 a edição, Portland Press, 1992, Londres [ISBN 1-85578-005-4],Desta forma, Leu é L-leucina, Lys significa L-lisina, Ile é L-isoleucina, Phe é L-fenilalanina, L-tirosina é Tyr1 Trp é L-triptofano e Val é L-valina.

De acordo com a dita normativa, os peptídeos sãorepresentados pelas abreviaturas dos aminoácidos que os compõem unidos porhífens, que representam as ligações peptídicas. Assim, por exemplo, o peptídeodenominado glicilglicilglicina é simbolizado como Gly-Gly-Gly. Isto exige aalteração do símbolo Gly para glicina, H2N-CH2-COOH, de três diferentesmaneiras:

(i) "Gly-" significa H2N-CH2-CO-

(ii) "Gly-" significa HN-CH2-CO-, e

(iii) "-Gly" significa HN-CH2-COOH

Portanto, quando o hífen for colocado à direita dosímbolo, como no caso (i), indica que foi eliminado o grupo OH do grupocarboxílico do aminoácido; quando o hífen for colocado à esquerda do símbolo,como no caso (iii), indica que foi eliminado um átomo de hidrogênio do grupoamina do aminoácido; no caso (ii), ambas as alterações foram aplicadas aomesmo símbolo.

O aminoácido Gly- constitui a extremidade N-terminal dopeptídeo e o aminoácido -GIy constitui a extremidade C-terminal do peptídeo.

Como se pode observar na fórmula geral (I), todos ospeptídeos da presente invenção têm o aminoácido Leu da extremidade C-terminalsob a forma de carboxamida, representado como -Leu-NH2.O aminoácido que constitui a extremidade N-terminal dos peptídeos da presenteinvenção pode manter seu grupo amina sem derivar, ou então ele mesmo podeser funcionalizado com um grupo acetila, p-toluenossulfonila, benzoíla ou benzila,conforme expresso na fórmula geral (I).Quando o grupo amina não é derivado, isto é, quando Xié hidrogênio, no presente relatório, considera-se que o símbolo H-X- éequivalente ao símbolo X-, que é a forma adotada pela União Internacional deQuímica Pura e Aplicada (IUPAC), no caso (i) já mencionado.

As estruturas do peptídeo da presente invenção sãodefinidas de acordo com a fórmula geral (I).

Outra maneira de definir a estrutura dos peptídeos dapresente invenção consiste em utilizar as seqüências de aminoácidosSEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, e também especificando a funcionalidade querepresentam na extremidade N-termínal e na extremidade C-terminal dospeptídeos. Como indicado acima, todos os peptídeos da presente invenção têm oaminoácido que forma a extremidade C-terminal sob a forma de carboxamida.

As seqüências mencionadas apresentam os aminoácidosque são apresentados na Tabela I:

TABELA I

<table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table><table>table see original document page 8</column></row><table>

A seqüência c enominada SEQ_ID_NO:15 corresponde àseqüência do peptídeo descrito por Cavallarin e outros, Mol. Plant-MicrobeInteract., 1998, 11, 218-227, cujo derivado carboxamida na extremidade C-terminal da seqüência encontra-se expressamente excluído da presente invenção.

Entre os peptídeos da presente invenção consideradospreferidos, encontram-se os peptídeos definidos pelas seqüências SEQ-ID_NO: 1a SEQJDNO: 14, e SEQ_ID_NO: 16 a SEQ_ID_NO: 25, e têm o aminoácido daextremidade C-terminal sob a forma do grupo carboxamida.

Dentro deste grupo, são especialmente preferidos os peptídeos definidos pelas seqüências SEQ_ID_NO: 6 a SEQ_ID_NO: 11,SEQ ID NO: 13, SEQ_ID_NO: 16, SEQ_ID_NO: 18 a SEQ_ID_NO: 22, eSEQ_ID_NO: 25, e têm o aminoácido da extremidade C -terminal na forma degrupo carboxamida.

Particularmente preferidos são os peptídeos definidos pelas seqüências SEQ_ID_NO: 6 e SEQ_ID_NO: 16, e têm o aminoácido daextremidade C-terminal na forma de grupo carboxamida. O último destes doispeptídeos preferidos tem a seguinte estrutura: H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Phe-Leu-NH2, correspondente à fórmula geral (I)1 sendo que X1 é H, X2 éLys e X3 é Phe.

Também são preferidos os peptídeos definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO: 1 a SEQJD_NO: 25, e que têm o aminoácido daextremidade N-terminal funcionalizado com o grupo acetila e o aminoácido daextremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

Dentro deste grupo, o peptídeo especialmente preferido éo peptídeo definido pela seqüência SEQ_ID_NO: 16, que tem o aminoácido daextremidade N-terminal funcionalizado com o grupo acetila e o aminoácido daextremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida. O dito peptídeo tem aestrutura Ac-Lys-Lys-Leu-Lys-Phe-lle-Lys-Leu-Lys-Phe-Leu-NH2, correspondenteà fórmula geral (I), sendo que^ é acetila (Ac), X2 é Lys e X3 é Phe.

Também são preferidos os peptídeos definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, e que têm o aminoácido daextremidade N-terminal funcionalizado com o grupo p-toluenossulfonila, e oaminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

Dentro deste grupo, os peptídeos especialmentepreferidos são os peptídeos definidos pelas seqüências SEQ_ID_NO: 1, 6, 11 e16, e têm o aminoácido da extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo p-toluenossulfonila e o aminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupocarboxamida.

O peptídeo mais preferido é definido pela seqüênciaSEQ_ID_NO:1 e que tem o aminoácido da extremidade N-terminal funcionalizadocom o grupo p-toluenossulfonila e o aminoácido da extremidade C-terminal naforma do grupo carboxamida. Este peptídeo tem a estrutura Ts-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Lys-Leu-NH2, correspondente à fórmula geral (I), sendo queXi é p-toluenossulfonila (Ts)1 X2 é Lys e X3 é Lys.

Também são preferidos os peptídeos definidos pelasseqüências de aminoácido SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, e que têm oaminoácido da extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo benzila e oaminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.Dentro deste grupo, o peptídeo especialmente preferido éo peptídeo definido pela seqüência SEQ_ID_NO: 15, e que tem o aminoácido daextremidade N-terminal funcionalizado com o grupo benzila e o aminoácido daextremidade C-terminal na forma de grupo carboxamida. Este peptídeo tem aestrutura Bn-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-IIe-Leu-Lys-VaI-Leu-NH2, correspondente àfórmula geral (I), sendo que Xi é benzila (Bn)1 X2 é Trp e X3 é Vai.

Também são preferidos os peptídeos definidos pelasseqüências de aminoácidos SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, e que têm oaminoácido da extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo benzoíla e oaminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

Dentro deste grupo, os peptídeos especialmentepreferidos são os peptídeos definidos pelas seqüências SEQ_ID_NO: 1 e aSEQ_ID_NO:11, e que têm o aminoácido da extremidade N-terminalfuncionalizado com o grupo benzoíla e o aminoácido da extremidade C-terminalna forma do grupo carboxamida. O mais preferido dentre estes peptídeos é oprimeiro peptídeo, que tem a estrutura Bz-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-Leu-NH2, correspondente à fórmula geral (I), sendo que Xi é benzoíla (Bz), X2é Lys e X3 é Lys.

Os peptídeos descritos na presente invenção sãoformados por 11 aminoácidos, o que os tornam apropriados para serempreparados por meio do uso dos procedimentos habituais de síntese de peptídeosem fase sólida, descritos por R.B. Merrifield1 J.Am.Chem.Soc., 1963, 85, 2149-2154.

Entre eles, pode-se mencionar o peptídeo que emprega,como suporte sólido, a resina 4-metilbencidrilamino (MBHA) funcionalizada comgrupos amina. Sobre o dito suporte sólido, foram realizadas sucessivas reaçõesde acoplamento entre os diferentes aminoácidos que compõem o peptídeo.

Este procedimento é bastante conhecido pelosespecialistas na técnica e é descrito, por exemplo, por Sakata, F. Albericio Eds.,Solid-Phase Synthesis. Um guia prático, Mareei Dekker, New York, 2000 [ISBN: 0-8247-0359-6], ou K. Burgess Eds., Solid-Phase Organic Synthesis, Wiley, John &Sons, Nova Iorque, 1999 [ISBN: 0471318256],Quando se emprega a resina MBHA como suporte líquido,normalmente se incorpora à dita resina um espaçador bifuncional sensível aomeio ácido, que permite o desencaixe sob condições suaves do peptídeo, umavez sintetizado. Por exemplo, um espaçador bifuncional apropriado é o Fmoc-Rink-Linker (CAS: 145469-56-3) comercializado pela empresa Senn Chemicals(Suíça).

O dito espaçador, uma vez unido através de seu grupocarboxílico ao grupo amina da resina MBHA e removido o grupo Fmoc protetor,apresenta um grupo amina livre, que permite o encaixe de um aminoácido, quetem um grupo carboxílico livre.

No mercado, pode-se adquirir a resina Fmoc-Rink-MBHAjunto à empresa Senn Chemicals, que já tem o espaçador acima incluído na mesma.

Um procedimento para a preparação dos peptídeos dapresente invenção pode ser, por exemplo, conforme descrição abaixo.

O dito procedimento utiliza a química do grupo Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) como o protetor do grupo α-amina dos aminoácidos quesão utilizados para preparar os peptídeos da presente invenção.

Para a proteção da cadeia lateral da Iisina (Lys) e dotriptofano (Trp), foi utilizado o grupo terc-butiloxicarbonila (Boc). Para a proteçãoda cadeia lateral da tirosina (Tyr), foi utilizado o grupo terc-butila (t-Bu).

Na primeira etapa, realiza-se a eliminação do grupoprotetor Fmoc, presente no grupo amina do espaçador bifuncional. Depois disso,ocorre o encaixe do aminoácido leucina, que também tem o grupo a-aminaprotegido pelo grupo Fmoc.

Antes de fazer o novo acoplamento, elimina-se o grupoprotetor Fmoc da leucina encaixada na resina.

O ciclo de acoplamento-desproteção é repetido atécompletar a estrutura do peptídeo.

A incorporação dos últimos dois aminoácidos do peptídeoé feita normalmente por meio de 2 ou 3 acoplamentos sucessivos, para completara reação de acoplamento do aminoácido com o peptídeo encaixado sobre aresina.

A separação do peptídeo do suporte sólido é feita sobcondições ácidas, ao mesmo tempo em que se eliminam os grupos protetores dascadeias laterais dos aminoácidos que compõem o peptídeo.

Após um processo convencional de isolamento, ospeptídeos da presente invenção são obtidos com boa pureza, geralmente acimade 90%, determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), sob aforma de sólidos cobertos por pó, e são caracterizados por espectrometria demassa (ESI-MS).

Surpreendentemente, verificou-se que os peptídeos dapresente invenção apresentam uma atividade antimicrobiana, que éparticularmente eficaz contra microorganismos patogênicos das plantas, como,por exemplo, as bactérias patogênicas Erwinia amylovora, Xanthomonasvesicatoria e Pseudomonas syringae.

Faz parte do objeto da presente invenção o uso dospeptídeos da presente invenção, para a preparação de uma composiçãoantimicrobiana.

De preferência, os peptídeos da presente invenção sãoutilizados como agentes antimicrobianos contra bactérias patogênicas dasplantas.

De preferência, as bactérias fitopatogênicas sãoselecionadas do grupo que consiste em Erwinia amylovora, Xanthomonasvesicatoria, e Pseudomonas syringae.

Os peptídeos da presente invenção, que sãoconsiderados preferidos para uso como agentes antimicrobianos contra bactériaspatogênicas das plantas, são os peptídeos preferidos mencionadosanteriormente.

As bactérias mencionadas são indicadores apropriadospara determinar a atividade antimicrobiana de compostos que podem serempregados para combater infecções e doenças causadas por bactérias emplantas.Erwinia amylovora é uma bactéria gram-negativa quecausa a doença conhecida como fogo bacteriano, que afeta as plantas da famíliadas rosáceas, incluindo árvores frutíferas de grande importância econômica,como, por exemplo, maçã e pêra, e plantas ornamentais, como, por exemplo,sorveira, espinheiro e montajeiro branco. Na Europa, Erwinia amylovora estácatalogada como uma bactéria de quarentena na agricultura. O fogo bacterianopode afetar praticamente todos os órgãos da planta e, muitas vezes, implica namorte das árvores ou dos arbustos doentes. Não existem atualmente métodoseficazes para controlar o fogo bacteriano e é necessário combinar várias medidaspara eliminar ou reduzir o inóculo.

Xanthomonas vesicatoria é uma bactéria gram-negativaque causa a doença conhecida como mancha bacteriana em plantas pertencentesà família Solanaceae, que têm grande importância econômica, como tomate epimentão. Esta doença afeta folhas, caules e frutos, fazendo com que a plantamurche ou morra.

Pseudomonas syringae é uma bactéria gram-negativa quecausa doenças conhecidas como necrose bacteriana em plantas de cultivohortícolas e lenhosos, como frutas. A patogenicidade da Pseudomonas syringaereside, em muitos casos, em sua atividade nucleadora de gelo (INA +) quepotencializa os danos por geada, e a produção de diversas fitotoxinas, comosiringomicinas.

De preferência, as plantas que podem ser tratadas comos peptídeos da presente invenção são selecionadas do grupo que consiste emárvores frutíferas, plantas hortícolas e plantas ornamentais.

Entre as árvores frutíferas, encontram-se as árvores defrutas com semente (maçã, pêra), frutas com caroço (pêssego, damasco, ameixa,cereja) e bananeira.

Entre as plantas hortícolas, encontram-se as solanáceas(tomate, pimentão, batata) e cucurbitáceas (melão, melancia).Exemplos de plantas ornamentais são sorveira, cravo, espinheiro e montajeirobranco.

Composições FitossanitáriasUm objeto da presente invenção consiste em apresentaruma composição fitossanitária que compreende:

- um peptídeo linear que corresponde à fórmula geral (I):X1-X2-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-X3-Leu-NH2 (I)

sendo que:

X1 é hidrogênio, acetila, p-toluenossulfonila, benzila oubenzoíla;

X2 é Lys, Tyr, Leu, Phe ou Trp, e;

X3 é Lys, Tyr, Vai, Phe ou Trp,com a condição de que o peptídeo em que Xi é hidrogênio, X2 é Trp e X3 é Valseja expressamente excluído, e

- um agente auxiliar.

Entre os peptídeos da presente invenção consideradospreferidos para fazer parte das ditas composições fitossanitárias, destacam-se ospeptídeos mencionados como preferidos, na seção anterior denominadaPeptídeos.

As composições fitossanitárias da presente invençãoapresentam boas propriedades antimicrobianas contra bactérias patogênicas dasplantas.

Normalmente, nas composições antimicrobianas,combinam-se vários princípios ativos para a obtenção de maior eficácia ou umespectro mais amplo de ação. Neste caso, as composições fitossanitárias dapresente invenção também podem incluir outros agentes antibacterianos paraobter maior eficácia antimicrobiana, como, por exemplo, a combinação dediversos peptídeos da presente invenção, ou sua combinação com outrassubstâncias ativas diferentes.

Os peptídeos da presente invenção também podem sercombinados com agentes antifúngicos e, conseqüentemente, podem apresentaruma ação antimicrobiana mais ampla.

A quantidade de peptídeos que faz parte da composiçãofitossanitária pode variar de acordo com diversos fatores, como, por exemplo, otipo de planta, a concentração das bactérias patogênicas na planta, a extensão dadoença e assim por diante. A concentração efetiva do peptideo pode serdeterminada e facilmente adaptada por meio de métodos conhecidos pelosespecialistas na técnica. Normalmente, a concentração efetiva do peptideo variaentre 0,01 e 0,5 g/l.

O agente auxiliar que acompanha os peptídeos dapresente invenção nas ditas composições fitossanitárias podem ter váriasfunções, como, por exemplo, facilitar a dosagem dos peptídeos, fornecer umproduto facilmente manipulável, melhorar a molhagem das plantas com acomposição fitossanitária, entre outras.

O dito agente auxiliar pode ser selecionado do grupo queconsiste em: dissolventes, diluentes, cargas inertes, agentes tensoativos, agenteshidratantes, agentes tampão, agentes dispersantes, agentes antiaglomerantes,agentes lubrificantes, filtros de radiação ultravioleta e/ou suas misturas.

De preferência, o agente auxiliar é selecionado do grupoque consiste em dissolventes, agentes tensoativos, agentes tampão, filtros deradiação ultravioleta e/ou suas misturas.

De preferência, o solvente é água.

As composições podem ser na forma líquida ou na formasólida. Por exemplo, no caso de formulações líquidas, a composição da presenteinvenção pode ser na forma de uma composição diluída pronta para ser utilizadaou sob a forma de uma composição concentrada, que exige diluição antes de serutilizada, normalmente com água.

No caso das composições líquidas aquosas, a presençade agentes tensoativos hidratantes facilita a molhagem das plantas quando sãopulverizadas com a dita composição.

Uma vantagem dos peptídeos da presente invenção é queeles podem ser facilmente dissolvidos em água e, em geral, podem serformulados como soluções aquosas, sem a necessidade de utilizar dissolventesorgânicos adicionais.

As composições na forma sólida podem ser na forma degrânulos ou em pó, sendo que os peptídeos da presente invenção são misturadoscom cargas inertes finamente divididas, como, por exemplo, caulim, terrasdiatomáceas, dolomita, carbonato de cálcio ou talco. Os peptídeos da presenteinvenção também podem apresentar-se na forma de pó ou de grânulosdispersiveis, que compreendem um agente umectante para facilitar a dispersãodos mesmos no líquido.

Um objeto da presente invenção consiste em apresentarum método de prevenção e tratamento de infecções e doenças de plantascausadas por bactérias, que compreende a colocação das plantas em contatocom uma composição fitossanitária, que inclui os peptídeos da presente invenção.

No método da presente invenção, a composiçãofitossanitária pode ser aplicada preventivamente às plantas, para evitar oaparecimento de infecções e doenças causadas por bactérias. O tratamentopreventivo é baseado nos peptídeos da presente invenção, que inibem ocrescimento de bactérias patogênicas nas plantas.

No método da presente invenção, a composiçãofitossanitária também pode ser utilizada para tratar as ditas infecções e doenças,uma vez que sua presença tenha sido detectada nas plantas, uma vez que ospeptídeos da presente invenção inibem o crescimento das bactérias causadorasdas ditas infecções e doenças.

No presente relatório descritivo, o termo "infecção" refere-se à invasão e destruição de um órgão, por exemplo, folhas, flores ou frutas, porparte dos microrganismos patogênicos. Conseqüentemente, trata-se de umprocesso localizado. Em contraste, o termo "doença" refere-se a um processo queafeta a planta, levando a sintomas.

De preferência, o método da presente invenção é utilizadopara prevenir e tratar infecções e doenças causadas por bactérias patogênicas deplantas selecionadas do grupo que consiste em Erwinia amylovora, Xanthomonasvesicatoria, e Pseudomonas syringae.

No método da presente invenção, a composição pode sercolocada em contato com as partes das plantas selecionadas do grupo queconsiste em sementes, raízes, caules, folhas ou frutos, ou com o solo ou comqualquer meio de crescimento em torno das raízes das plantas.

No método da presente invenção, a composiçãofitossanitária pode ser colocada em contato com a planta por meio de qualquertécnica convencional, entre as quais se destacam pulverização, imersão ouirrigação.

Por exemplo, pode-se preparar uma dissolução aquosados peptídeos da presente invenção e executar a pulverização das partes daplanta afetadas ou que possam ser afetadas. Se for um fruto de uma árvorefrutífera, por exemplo, o tratamento também pode ser realizado por meio deaspersão ou imersão, antes de sua colheita ou pós-colheita.

O tratamento das raízes pode ser feito, por exemplo, pormeio do emprego de uma composição sólida, na qual os peptídeos se encontramdispersos em uma carga inerte, ou por meio da pulverização da solução aquosaacima mencionada, ou através de sua aplicação, por meio de irrigação.

Ensaios biológicos

A atividade antimicrobiana dos peptídeos da presenteinvenção contra bactérias patogênicas para plantas foi avaliada peladeterminação da concentração de peptídeos mínima necessária para inibir ocrescimento dos microorganismos. Normalmente, a dita concentração é chamadade concentração inibitória mínima (CIM).

Este tipo de teste é comum em microbiologia e é bastanteconhecido pelos especialistas na técnica. Uma descrição da metodologia utilizadaé encontrada, por exemplo, em MJPeIczar Jr, ECSChan, NRKrieg, Microbiology:Concepts and Applications. New York: McGraw-HiI1, 1997.

Para avaliar o efeito antimicrobiano dos peptídeos dapresente invenção foram utilizadas as seguintes linhagens de bactériaspatogênicas: Erwinia amylovora PMV6076 (INRA, Angers, França), Xanthomonasvesicatoria 2133-2 (IVIA, Valência, Espanha) e Pseudomonas syringae pv.syringae EPS94 (INTEA, Universidade de Girona, Espanha).

Verificou-se que as composições que incluem ospeptídeos da presente invenção dissolvidos em água a concentrações que variamentre 2,5 e 7,5 μΜ são eficazes para inibir o crescimento de bactérias comoErwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria e/ou Pseudomonas syringae.

Estes resultados demonstram a eficácia da atividadeantimicrobiana dos peptídeos da presente invenção, uma vez que, em Avrahami eoutros, Biochemistry, 2001, 40, 12591-12603, descreve-se que uma concentraçãoinibitória mínima inferior a 50 μΜ é considerada significativa.

Os peptídeos da presente invenção são mais efetivoscontra as ditas bactérias do que o peptídeo descrito por Cavallarin e outros,definido pelas seqüencias SEQ_ID_NO: 15 e que tem a extremidade C-terminalsob a forma do grupo carboxamida, pois este peptídeo apresenta concentraçõesinibitórias mínimas superiores a 7,5 μΜ, quando testado contra as bactériasErwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, e Pseudomonas syringae.

A atividade hemolítica dos peptídeos é um indicador datoxicidade em células eucariotas e uma característica que normalmente édeterminada para aqueles compostos que podem entrar em contato com o corpohumano. Este seria o caso se frutas ou vegetais tratados com os peptídeos dapresente invenção contivessem vestígios dos mesmos e fossem consumidos porseres humanos, ou ao serem manipulados por operadores durante sua aplicaçãoou preparação.

A dita atividade hemolítica foi avaliada pela determinaçãoda liberação de hemoglobina, que ocorre quando uma solução dos ditospeptídeos é colocada em contato com uma solução tampão Tris com suspensõesde eritrócitos a 5% em volume/volume provenientes de sangue humano fresco. Oresultado desta determinação é expresso como a percentagem de hemólise queocorre com uma concentração conhecida de peptídeos. Uma descrição dametodologia empregada para a determinação da atividade hemolítica está emOren e outros, Biochemistry, 2000, 39, 6103-6114, e em Ragusa e outros, J. Am.Chem. Soc., 2002, 124, 12774-12785.

Verificou-se que a grande maioria dos peptídeos dapresente invenção apresenta uma atividade hemolítica significativa a umaconcentração que varia entre dez e cem vezes superior à concentração à qualsão ativos para inibir o crescimento de bactérias patogênicas em plantas.A estabilidade dos peptídeos à degradação por protease éuma característica que permite avaliar se os peptídeos se encontram inalteradosao redor da planta durante um tempo de vida meio razoável. Os peptídeos podemser degradados tanto por protease presente no tecido das plantas, como nosmicroorganismos epífitos.

A estabilidade dos peptídeos à degradação por proteasefoi avaliada mediante o tratamento das soluções dos peptídeos em soluçãotampão Tris com Proteinase K (Sigma-AIdrich) e o monitoramento da suadegradação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em diferentesintervalos de tempo. A degradação é expressa como a porcentagem de peptídeosdegradados após um determinado intervalo de tempo calculado a partir dadiminuição da área do pico do peptídeo nativo por cromatografia líquida de altaeficiência (HPLC). Uma descrição da metodologia empregada para adeterminação da estabilidade a protease está em Rozek e outros, Biochemistry,2003,42,14130-14138.

Verificou-se que alguns peptídeos da presente invençãosão mais estáveis à degradação por protease do que o peptídeo descrito porCavallarin e outros.

Por fim, com a finalidade de completar suficientemente adescrição acima, são apresentados os exemplos abaixo.

Exemplos

Nos exemplos abaixo, são empregadas as seguintesabreviações: Ac: acetila; AC2O: anidrido acético; Bn: benzila; Boc: terc-butiloxicarbonila; t-Bu: terc-butila; Bz: benzoíla; CIM: concentração inibitóriamínima; DIEA: N, N-diisopropiletilamina; DMF: N, N-dimetilformamida; EDTA:ácido etilenodiaminotetracético; ESI-MS: espectrometria de massas comionização por eletronebulização; Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonila; HBTU:Hexafluorofosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il) (dimetilamina) metileno]-N-metilmetanamínio; HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência; LB: LuriaBertani; MBHA: 4-metilbenzidrilamina; NMP: N-metilpirrolidona; TFA: ácidotrifluoroacético; TIS: Triisopropilsilano; TRIS: tris(hidroximetil)aminometano; Ts: p-toluenossulfonila; TSB: caldo tripticase de soja; UV: ultravioleta.Os produtos Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH1 Fmoc-lle-OH, Fmoe-Tyr(tbu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoe-Val-OH1 aresina Fmoe-Rink-MBHA funeionalizada com grupos amina, e HBTU, foramobtidos junto à empresa Senn Chemicals. Os produtos cloreto de benzila, cloretode benzoíla, ácido trifluoroacético, N-metilpirrolidona e TIS foram obtidos junto àempresa Aldrich. Os produtos cloreto de benzila, piperidina e DIEA foram obtidosjunto à empresa Fluka.

As seguintes informações sobre o procedimento para apreparação dos peptídeos são de caráter geral:

- Foram utilizados aminoácidos que têm o grupo a-aminaprotegido com o grupo Fmoc.

- Para a proteção da cadeia lateral da Iisina e dotriptofano, foi utilizado o grupo terc-butiloxicarbonila (Boc).

- Para a proteção da cadeia lateral de tirosina, foi utilizadoo grupo ferc-butila (t-Bu).

- As reações foram realizadas em seringas de 2 ou 5 ml,que tinham incorporado um filtro microporoso de polipropileno.

- Todas as transformações e lavagens foram realizadas a25°C, salvo indicação contrária.

-A análise por cromatografia líquida de alta eficiência(HPLC) foi realizada com um fluxo de 1,0 ml/min, por meio do uso de uma colunade etapa reversa Kromasil (4,6 χ 40 mm, tamanho das partículas de 3,5 pm).Foram empregados gradientes lineares com TFA aquoso a 0,1% e TFA emacetonitrila a 0,1%, com uma proporção entre 0,98:0,02 e 0,98:0,1 e durante umtempo de 7 minutos, com detecção ultravioleta a um comprimento de onda de 220nm.

- Os espectros ESI-MS foram adquiridos por meio do usode um instrumento quadripolar Navigator; operando no modo positivo de íons(ES+) com uma voltagem na amostra de 30 kV.

- Todas as relações entre os dissolventes sãovolume/volume, exceto quando há outro tipo de proporção.Exemplo 1 - Preparação de H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val- Leu-NH2(Fórmula geral (I), sendo que X1 é hidrogênio (H), X2 é Lys e X3 éVal)

Em uma seringa de 2 ml de capacidade, equipada com um filtro microporoso na parte inferior, foram colocados 30 mg de resina Fmoc-Rink-MBHA com uma funcionalidade de 0,66 mmol/g, o equivalente a 19,8 pmolesde grupos amina, e a seringa foi cheia com dissolvente para inchar-lavar a resinade acordo com a seguinte seqüência: CH2CI2 (1 x 20 min) e DMF (1 χ 20 min). Aexpressão CH2CI2 (1 χ 20 min) refere-se a uma lavagem de 20 minutos realizada com cloreto de metileno. Após cada etapa de lavagem, o solvente foi removidocom um filtro de vácuo múltiplo (Vac Man Laboratory Vacuum Manifold daPromega Distribuidora).

Depois de inchar-lavar a resina, a resina foi tratada comuma mistura de piperidina e DMF (3:7, 1x2x1 min e 10 min) para remover o grupo Fmoc presente no grupo amina do espaçador bifuncional e depois foilavada com DMF (6 χ 1 min).

Em seguida, a resina foi tratada com 21 mg de Fmoc-Leu-OH (59 pmoles), 22 mg de HBTU (59 pmoles) e 11 μΙ de DIEA (63 pmoles) em 0,1ml de DMF. Depois de 4 horas, a resina foi lavada com DMF (6 χ 1 min) e verificou-se que o teste de ninidrina foi negativo (Kaiser e outros, Anal. Biochem.,1970, 34, 595-598).

A eliminação do grupo Fmoc e as lavagens subseqüentesforam realizadas conforme descrição acima.

O ciclo de acoplamento-desproteção foi repetido para os seguintes quatro aminoácidos protegidos com o grupo N0-Fmoc: Fmoc-Val-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH e Fmoc-lle-OH. Em cada etapa foi feita alavagem com DMF (6x1 min).

A partir do quinto aminoácido incorporado, tanto aeliminação do grupo Fmoc, os ciclos de acoplamento-desproteção, como as lavagens correspondentes foram realizadas da mesma forma, nesses casos,substituindo a DMF por NMP. Os últimos seis aminoácidos foram incorporadosprotegidos com o grupo Na-Fmoc: Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH e Fmoc-Leu-OH. Para a incorporação dos últimos dois aminoácidos foram feitos de 2 a 3acoplamentos sucessivos para obter um teste de ninidrina negativo.

Depois de eliminar o grupo Fmoc do último aminoácidoacoplado, conforme descrição acima, a resina foi lavada com NMP (6x1 min) eCH2C^ (6x1 min), e obteve-se o peptídeo linear unido à resina, H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-IIe-Leu-Lys-VaI-Leu-Rink-MBHA. Em seguida, separou-se o peptídeoda resina por meio de um tratamento com 1 ml de uma mistura de TFA, água eTIS (95:2,5:2,5) durante duas horas. Os filtrados foram coletados em um frascoatravés de uma pressão positiva de nitrogênio. A resina foi lavada com umamistura de TFA, água e TIS (95:2,5:2,5, 2 χ 0,5 ml). Os filtrados misturaram-se eevaporaram quase à secura sob uma corrente de nitrogênio até a obtenção de umóleo. Este óleo foi precipitado com éter dietílico, centrifugado e o éter foidecantado. Este processo foi repetido 3 ou 4 vezes. Finalmente, o produto sólidoobtido foi dissolvido em água e foi liofilizado.

Obteve-se um sólido coberto por pó, que tinha umapureza superior a 90% analisada por cromatografia líquida de alta eficiência(HPLC) (tempo de retenção: 4,39 minutos), e sua estrutura foi confirmada porESI-MS.

A síntese deste peptídeo também foi efetuada à maiorescala por meio do uso de 200 mg da resina Fmoc-Rink-MBHA com umafuncionalidade de 0,66 mmol/g, equivalente a 132 pmoles do grupo amina, pormeio do uso do procedimento descrito neste Exemplo 1.

Exemplo 2 - Preparação de Ac-Lys-Lys-Leu-Lys Phe-lle-Lys-Leu-Lys-Val-Leu-NH2 (Fórmula geral (I), sendo que Xi é acetila (Ac), X2 é Lys e X3 éVai)

A peptidil-resina H-Lys-Lys-Leu-Lys-Phe-lle-Lys-Leu-Lys-VaI-Leu-Rink-MBHA obtida no Exemplo 1 foi tratada com 0,2 ml de uma misturade anidrido acético (Ac2O ), piridina e CH2CI2 (1:1:1), à temperatura ambiente,durante uma hora. Posteriormente, a resina foi lavada com CH2CI2 (6 χ 1 min).Em seguida, o peptídeo foi separado da resina e isolado,de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A pureza do peptídeoobtido foi superior a 90%, determinada por cromatografia líquida de alta eficiência(HPLC) (tempo de retenção 4,59 minutos), e sua estrutura foi confirmada por ESI-MS.

Exemplo 3 - Preparação de Ts-Lys-Lys-Leu-Lys-Phe-Ile-Lys-Leu-Lys-Val-Leu-Nhb(fórmula geral (I), sendo que X1 é p-toluenossulfonila (Ts)1 X2 é Lys eX3 é Vai)

A peptidil-resina H-Lys-Lys-Leu-Lys-Phe-Ile-Lys-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA obtida no Exemplo 1 foi tratada com cloreto de p-íoluenossulfonila (TsCl) (792 pmoles) e DIEA (1,58 moles) em 0,2 ml de umamistura de CH2Cl2 e NMP (9:1) à temperatura ambiente, durante uma hora.Posteriormente, a resina foi lavada com NMP (6 χ 1 min).

Em seguida, o peptídeo foi separado da resina e isolado,de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A pureza do peptídeoobtido foi superior a 90%, determinada por cromatografia líquida de alta eficiência(HPLC) (tempo de retenção 4,89 minutos), e sua estrutura foi confirmada por ESI-MS.

Exemplo 4 - Preparação de Bz-Lys-Lys-Leu-Lys-Phe-Ile-Lys-Leu-Lys-Val-Leu-NH2(Fórmula geral (I), sendo que X1 é benzoíla (Bz), X2 é Lys e X3 é Vai)A peptidil-resina H-Lys-Lys-Leu-Lys-Phe-Ile-Lys-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA obtida no Exemplo 1 foi tratada com cloreto de benzoíla(BzCl) (792 pmoles) e DIEA (1,58 mmoles) em 0,2 ml de uma mistura de CH2Cl2 eNMP (9:1) à temperatura ambiente, durante uma hora. Posteriormente, a resinafoi lavada com NMP (6 χ 1 min).

Em seguida, o peptídeo foi separado da resina e isolado,de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A pureza do peptídeoobtido foi superior a 90%, determinada por cromatografia líquida de alta eficiência(HPLC) (tempo de retenção 5,00 minutos), e sua estrutura foi confirmada por ESI-MS.

Exemplo 5 - Preparação de Bn-Lys-Lys-Leu-Lys-Phe-Ile-Lys-Leu-Lys-Val-Leu-NH2((Fórmula geral (I), sendo que X1 é benzila (Bn)1 X2 é Lys e X3 é Vai)A peptidil-resina H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA obtida no Exemplo 1 foi tratada com brometo de benzila(BnBr) (792 pmoles) e DIEA (1,58 mmoles) em 0,2 ml de uma mistura de CH2Cl2 eNMP (9:1) à temperatura ambiente, durante 48 horas. Posteriormente, a resina foilavada com NMP (6 x 1 min).

Em seguida, o peptídeo foi separado da resina e isolado,de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A pureza do peptídeoobtido foi superior a 90%, determinada por cromatografia liquida de alta eficiência(HPLC) (tempo de retenção 4,73 minutos), e sua estrutura foi confirmada por ESI-MS.

Exemplo 6 - Preparação de uma quimioteca de peptídeos lineares em fase sólida

Foi projetada uma quimioteca para a obtenção de 125peptídeos, que correspondem à fórmula geral (I):

X1-X2-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-IIe-Leu-Lys-X3-Leu-NH2 (I)sendo que:

X1 é hidrogênio, acetila, p-toluenossulfonila, benzila oubenzoíla;

X2 é Lys, Tyr, Leu, Phe ou Trp, e;

X3 é Lys, Tyr, Val, Phe ou Trp,com a condição de que o peptídeo em que X1 é hidrogênio, X2 é Trp e X3 é Valseja expressamente excluído dos peptídeos da presente invenção.

Em cinco seringas de 5 ml de capacidade, devidamenteetiquetadas e equipadas com um filtro microporoso na parte inferior, foramcolocados 350 mg de resina Fmoc-Rink-MBHA com uma funcionalidade de 0,66mmol/g, o equivalente a 231 pmoles de grupos amina. As seringas foram cheiascom dissolvente para inchar-lavar a resina, de acordo com a seguinte seqüência:CH2CI2 (1 x 20 min) e DMF (1 x 20 min). Após cada etapa de lavagem, o solventefoi removido com um filtro de vácuo múltiplo (Vac Man Laboratory VacuumManifold de Promega Distribuidora).

Depois de inchar-lavar as resinas, as resinas foramtratadas com uma mistura de piperidina e DMF (3:7, 1 x 2 min e 1 x 10 min) pararemover o grupo Fmoc presente no grupo amina do espaçador bifuncional e,depois, foram lavadas com DMF (6 x 1 min).

Em seguida, as cinco resinas foram tratadas com 245 mgde Fmoc-Leu-OH (693 pmoles), 263 mg de HBTU (693 pmoles) e 121 μl de DIEA(693 pmoles) em 0,8 ml de DMF. Após 4 horas, as resinas foram lavadas comDMF (6x1 min), e verificou-se que o teste de ninidrina foi negativo (Kaiser eoutros, Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598).

Em seguida, eliminou-se o grupo Fmoc e foram realizadasas lavagens, conforme descrição acima. Depois, acoplou-se a cada resina oaminoácido X3 correspondente: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Trp (Boc)-OH, Fmoc-Tyr(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH ou Fmoc-Lys(Boc)-OH, seguindo o procedimentoutilizado para acoplar o aminoácido protegido Fmoc-Leu-OH.

O ciclo de acoplamento-desproteção foi repetido para osseguintes três aminoácidos. Desta forma, acoplaram-se seqüencialmente: Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH e Fmoc-IIe-OH. Esses acoplamentos foram feitospara cada uma das cinco resinas. Em cada etapa foi realizada a lavagem comDMF (6 χ 1 min).

A partir do quinto aminoácido incorporado, tanto aeliminação do grupo Fmoc, os ciclos de acoplamento-desproteção, como aslavagens correspondentes foram realizadas da mesma forma, nesses casos,substituindo a DMF por NMP. Seguindo este procedimento, acoplaram-se, deforma seqüencial, a cada uma das cinco resinas, dois resíduos Fmoc-Lys (Boc)-OH, um resíduo Fmoc-Phe-OH e um resíduo Fmoc-Leu-OH. Em cada etapa foifeita a lavagem com NMP (6x1 min). Para a incorporação do décimo resíduo, foinecessário um acoplamento duplo para obter um teste de ninidrina negativo.

Uma vez acoplado o décimo resíduo, cada uma daspeptidil-resinas confinadas nas cinco seringas foi dividida em cinco frações. As 25frações obtidas, correspondentes a aproximadamente 46 pmoles de peptidil-resina cada uma, foram colocadas em 25 seringas de 2 ml de capacidade,devidamente etiquetadas e equipadas com um filtro microporoso, na parte inferior.Depois, o grupo Fmoc foi removido e foram feitas as lavagens, conformedescrição acima. A cada uma das cinco frações de resina que tem integrado omesmo aminoácido X3,, acoplou-se o resíduo X2 correspondente: Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Tyr(íBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc) ou Fmoc-Leu-OH. Osacoplamentos foram feitos por meio do uso de 138 pmoles do aminoácido Na-Fmoc protegido correspondente, 138 pmoles de HBTU e 138 pmoles de DIEA em0,3 ml de NMP. Para a incorporação desses aminoácidos foi necessário fazer umacoplamento duplo para a obtenção de um teste de ninidrina negativo.

Depois, cada uma das cinco frações anteriores foi divididaem cinco frações iguais. As 125 frações de resina obtidas, correspondentes aaproximadamente 9,2 pmoles de peptidil-resina, foram colocadas em 125seringas de 2 ml de capacidade, devidamente etiquetadas e equipadas com umfiltro microporoso, na parte inferior. Depois, o grupo Fmoc foi removido e foramrealizadas as lavagens, conforme descrição acima.

Quatro das cinco frações de resina obtidas a partir decada uma das 25 frações anteriores derivaram-se na extremidade N-terminal poracetilação, tosilação, benzoilação ou benzilação, respectivamente.

A acetilação foi realizada por meio do tratamento com 0,2ml de uma mistura de AC2O, piridina e CH2Cb (1:1:1), à temperatura ambiente,durante uma hora.

A tosilação foi realizada por meio do tratamento com TsCI(368 pmoles) e DIEA (736 pmoles) em 0,2 ml de uma mistura de CH2CI2 e NMP(9:1) à temperatura ambiente, durante uma hora.

A benzoilação foi realizada por meio do tratamento comBzCI (368 Mmoles) e DIEA (736 pmoles) em 0,2 ml de uma mistura de CH2CI2 eNMP (9:1) à temperatura ambiente, durante uma hora.

A benzilação foi realizada por meio do tratamento comBnBr (368 pmoles) e DIEA (736 pmoles) em 0,2 ml de uma mistura de CH2CI2 eNMP (9:1) durante 48 horas, à temperatura ambiente.

Depois destes tratamentos, as resinas foram lavadas comNMP (6 χ 1 min).

Finalmente, foi realizada a separação dos 125 peptídeosda resina na seringa correspondente e o isolamento de cada um deles, seguindoo procedimento descrito no Exemplo 1.Os peptídeos obtidos foram analisados por cromatografialíquida de alta eficiência (HPLC) e sua estrutura foi confirmada por meio de ESI-MS. Em todos os casos, obteve-se uma pureza superior a 90%.Exemplo 7 - Testes de atividade antimicrobiana

O efeito antimicrobiano dos peptídeos da presenteinvenção foi determinado contra as seguintes linhagens de bactérias patogênicas:Erwinia amylovora PMV6076 (INRA, Angers, França), Xanthomonas vesicatoria2133-2 (!VIA, Valência, Espanha) e Pseudomonas syringae pv. syringae EPS94(INTEA, Universidade de Girona, Espanha).

Todas as bactérias foram mantidas a uma temperatura de-80°C no meio Luria-Bertani (LB) complementado com glicerina a 20% devolume/volume.

As suspensões de E.amylovora PMV6076 e P.syringaepv. syringae EPS94 foram obtidas após um crescimento de 24 horas a 25° Ceaamostra de X.vesicatoria 2133-2 foi obtida após a incubação durante 48 horas a25°C, em ágar LB. Em todos os casos, foi realizada a re-suspensão em águaesterilizada para obter uma suspensão ajustada a uma absorbância de 0,2 a 600nm, que corresponde aproximadamente a 108 unidades formadoras decolônias/ml.

Para determinar a concentração inibitória mínima (CIM),os peptídeos se solubilizaram em água esterilizada Milli-Q até uma concentraçãofinal de 1000 μΜ e filtrados através de um filtro de 0,22 pm de poro.

Foram feitas diluições dos peptídeos da presenteinvenção para a obtenção de soluções a concentrações de 750, 500, 250, 200,150, 125, 100, 75, 50 e 25 μΜ.

Foram misturados 20 μΙ de cada diluição com 20 μΙ dasuspensão do indicador bacteriano em questão e 160 μΙ do meio líquido TSB(caldo tripticase de soja), até um volume total de 200 μΙ em cada cavidade de umamicroplaca. Portanto, as concentrações eficazes às quais as suspensões debactérias foram submetidas foram 75, 50, 25, 20, 15, 12.5, 10, 7,5, 5 e 2,5 μΜ.

Foram feitas duas réplicas de cada linhagem,concentração e peptídeo em teste.Os controles positivos continham água em vez depeptídeos e os controles negativos continham peptídeos sem a suspensãobacteriana.

O crescimento microbiano foi determinadoautomaticamente mediante a medição da densidade óptica a 600 nm, por meio douso do analisador Microbiology Analyser Bioscreen C (Labsystems).

As microplacas foram incubadas a 25°C durante 48 horascom uma agitação de 20 segundos antes da medida da absorbância a cada hora.Cada experimento foi realizado duas vezes.

A concentração inibitória mínima (CIM) tornou-se aconcentração mais baixa do peptídeo, à qual não se produziu nenhumcrescimento bacteriano no final do experimento.

A Tabela II apresenta a variação de concentrações entreas quais se encontra a concentração inibitória mínima (CIM)1 expressa em μΜ,após 48 horas de incubação a 25°C, para diferentes peptídeos da presenteinvenção contra as bactérias Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria ePseudomonas syringae. Os peptídeos da Tabela Il são identificados com osparâmetros X1, X2 e X3 contidos na fórmula geral (I). Além disso, a Tabela II incluio número de referência relacionado à quimioteca apresentada no Exemplo 6. NaTabela II, estão incluídos, como exemplo comparativo, os resultadoscorrespondentes ao peptídeo descrito por Cavallarin e outros, que não faz parteda presente invenção:

TABELA II

<table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>

Pode-se verificar que os peptideos da presente invençãoapresentam uma boa eficácia para inibir o crescimento das bactériasPseudomonas syringae, Xanthomonas vesicatoria e/ou Erwinia amylovora.

Além disso, a eficácia dos peptideos da presenteinvenção é superior á eficácia dos peptideos já conhecidos, cujos resultados sãoapresentados na primeira linha da tabela acima, sob o título ExemploComparativo.

Exemplo 8 - Testes de atividade hemolítica

A atividade hemolítica dos peptideos da presenteinvenção foi avaliada por meio da determinação da liberação de hemoglobina, queé produzida quando uma solução de peptideos entra em contato com umasuspensão de glóbulos vermelhos a 5% em volume, provenientes de sanguehumano fresco.

O sangue foi colhido assepticamente por meio do uso deum sistema Vacutainer® K2E (Belliver, Grã-Bretanha) com EDTA e armazenado a4°C durante um período inferior a duas horas.O sangue foi centrifugado a 6.000g durante 5 minutospara separar os glóbulos vermelhos. Estes foram lavados três vezes com soluçãotampão TRIS (10 mM Tris1 150 mM NaCI1 pH 7,2), e foram suspensos na soluçãotampão TRIS para a obtenção de uma suspensão contendo 10% em volume deglóbulos vermelhos.

Os peptídeos foram solubilizados na solução tampãoTRIS até uma concentração final de 100, 300 e 500 μΜ.

Foram utilizadas três réplicas para cada peptídeo econcentração.

Foram misturados 65 μl da suspensão de glóbulosvermelhos a 10% em volume com 65 μΙ da solução de peptídeos, em cadacavidade de uma placa de 96 cavidades Micro-Amp® (Applied Biosystems, EUA)(5% em volume de glóbulos vermelhos), e a mistura foi incubada durante umahora a 37°C, sob agitação. Deste modo, as suspensões de glóbulos vermelhosforam submetidas a concentrações de peptídeos de 50, 150 e 250 μΜ.

Em seguida, as placas foram centrifugadas a 3.500gdurante 10 minutos, e alíquotas de 80 μl do sobrenadante foram transferidas paramicroplacas de 100 cavidades (Bioscreen), que foram diluídas com 80 μΙ de águaesterilizada Milli-Q.

O grau de hemólise foi determinado com base naabsorbância a 540 nm, por meio do uso de um leitor de placa Bioscreen.

O controle positivo de hemólise completa foi determinadoem uma solução tampão TRIS contendo melitina 200 μΜ (Sigma-AIdrich,Espanha).

O percentual de hemólise (H) foi determinado através daequação:

H = 100x[(Op-Ob)/(Om-Ob)]

sendo que Op era a densidade óptica medida a uma concentração do peptídeodeterminada, Ob era a densidade óptica da solução tampão e Om era adensidade óptica para o controle positivo com melitina.

A Tabela III apresenta os resultados da atividadehemolítica expressada como a porcentagem de hemólise calculada por meio douso da equação acima, para concentrações de peptídeos da presente invençãocorrespondentes a 50, 150 e 250 μΜ. Os peptídeos da Tabela III se identificamcom os parâmetros X1, X2 e X3 contidos na fórmula geral (I). Além disso, a TabelaIII inclui o número de referência relativo à quimioteca apresentada no Exemplo 6: TABELA III

<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>

Em todos os casos, observa-se que a concentração emque chega a produzir uma significativa hemólise é entre 10 e 100 vezes superior àconcentração em que os peptídeos da presente invenção apresentam atividadeantimicrobiana.

Exemplo 9 - Testes de estabilidade à degradação por protease

A estabilidade dos peptídeos da presente invenção àdegradação por protease foi determinada pelo teste de digestão do peptídeo porproteinase K (Sigma-Aldrich Corporation, Madri, Espanha).Foi empregada uma dissolução de 50 pg/ml de peptídeose 1 pg/ml de proteinase K em uma solução tampão TRIS 100 mM com um pH de7,6, à temperatura ambiente.

O progresso da separação dos peptideos foi determinadopor meio de cromatografia de tempo em tempo, entre 5 e 45 minutos. Para tanto,utilizou-se uma coluna de fase reversa C18 (Kromasil, 4,6 χ 40 mm, 3,5 pm detamanho de partícula) e gradientes lineares de TFA aquoso a 0,1% e TFA emacetonitrila a 0,1% de 0,98:0,02 a 0:1 durante 7 minutos, realizando a detecçãopor meio de absorbância no ultravioleta a 220 nm.

A Tabela IV apresenta os resultados de estabilidade àdegradação por protease, expressa como a percentagem de degradação de cadapeptídeo após 45 minutos. Os peptídeos da Tabela IV são identificados com osparâmetros Χι, X2, e X3 contidos na fórmula geral (I). Além disso, a Tabela IVinclui o número de referência relativo à quimioteca apresentada no Exemplo 6. NaTabela IV, estão incluídos, como exemplo comparativo, os resultadoscorrespondentes ao peptídeo descrito por Cavallarin e outros, que não faz parteda presente invenção:

TABELA IV

<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table>

Pode-se observar que alguns peptídeos da presenteinvenção são mais estáveis à degradação por protease do que o peptídeodescrito por Cavallarin e outros (exemplo comparativo). Em particular, ospeptídeos correspondentes à fórmula geral (I), na qual Χ1 é hidrogênio, X2 é Lys,X3 é Phe, ou X1 é benzoíla, X2 é Lys e X3 é Lys, demonstram ser duas vezes maisestáveis do que o peptídeo do exemplo comparativo.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> UniversitatdeGirona

Placa Sant Domenec, 3, Edifici Lês Aligues

E-17071 Girona ESPANHA

Prioridade No. P200601098 de 28/04/2006ESPANHA

<120> PEPTÍDEOS LINEARES ΑΝΤΙMICROBIANOS1 SEU USO,COMPOSIÇÃO FITOSSANITÁRIA E MÉTODO PARA PREVENIR ETRATAR INFECÇÕES E DOENÇAS DE PLANTAS CAUSADASPOR BACTÉRIAS

<130> —--

<160> 25

<170> Patentln version 3.3

<210> 1<211> 11<212> PRT<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 1

Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu1 5 10

<210> 2<211> 11<212> PRT<213> Synthetic<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 2

Tyr Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 3

Leu Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 4

Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu1 5 10<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 5

Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 6

Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)<400> 7

Tyr Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220><221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 8

Leu Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu1 5 10

<210> 9

<211 > 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 9

Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu1 5 10

<210> 10<211> 11<212> PRT<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 10

Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Tyr Leu1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 11

Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Val Leu1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 12Tyr Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Val Leu1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 13

Leu Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Val Leu1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 14

Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Val Leu1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 15

Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Val Leu1 5 10

<210> 16<211> 11<212> PRT<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 16

Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Phe Leu

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220><221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 17

Tyr Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Phe Leu1 5 10<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 18

15 Leu Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Phe Leu1 5 10

<210> 19<211> 11<212> PRT<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 19

Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Phe Leu1 5 10

35 <210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)<400> 20

Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Phe Leu1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 21

Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Trp Leu1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> Synthetic

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(11)

<400> 22

Tyr Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Trp Leu1 5 10

<210> 23

<211> 11<212> PRT<213> Synthetic

<220><221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 23

Leu Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Trp Leu1 5 10

<210> 24<211> 11<212> PRT<213> Synthetic

<220><221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 24

Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Trp Leu1 5 10

<210> 25<211> 11<212> PRT<213> Synthetic

<220><221 > PEPTIDE<222> (1)..(11)

<400> 25Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Trp Leu1 5 10

Claims

1. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOScaracterizados pelo fato de que correspondem à fórmula geral (I):<formula>formula see original document page 47</formula>sendo que:X1 é hidrogênio, acetila, p-toluenossulfonila,benzila ou benzoíla;X2 é Lys1 Tyr, Leu, Phe ou Trp, e;X3 é Lys1 Tyr, Val, Phe ou Trp,com a condição de que o peptídeo em que X1 é hidrogênio, X2 é Trp e X3 é Valseja expressamente excluído da presente invenção.

2. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQ-ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 14 e a SEQ_ID_NO: 16 aSEQ_ID_NO: 25, e pelo fato de terem o aminoácido da extremidade C-terminal naforma do grupo carboxamida.

3. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQJD_NO: 6 a SEQ_ID_NO: 11, SEQ_ID_NO: 13, SEQ_ID_NO:-16, SEQJDNO: 18 a SEQ_ID_NO: 22 e a SEQ_ID_NO: 25, e pelo fato de teremo aminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

4. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 3, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO: 6 e a SEQ_ID_NO: 16, e pelo fato de terem oaminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

5. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, pelo fato de terem o aminoácidoda extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo acetila e pelo fato deterem o aminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

6. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem definidos pelaseqüência SEQ_ID_NO: 16, pelo fato de terem o aminoácido da extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo acetila e pelo fato de terem o aminoácido daextremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

7. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, pelo fato de terem o aminoácidoda extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo p-toluenossulfonila e pelofato de terem o aminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupocarboxamida.

8. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 7, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO: 1, 6, 11 e 16, pelo fato de terem o aminoácido daextremidade N-terminal funcionalizado com o grupo p-toluenossulfonila e pelofato de terem o aminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupocarboxamida.

9. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 8, caracterizados pelo fato de serem definidos pelaseqüência SEQ_ID_NO: 1, pelo fato de terem o aminoácido da extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo p-toluenossulfonila e pelo fato de terem oaminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

10. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO:1 a SEQ_ID_NO: 25, pelo fato de terem o aminoácidoda extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo benzila e pelo fato deterem o aminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

11. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 10, caracterizados pelo fato de serem definidos pelaseqüência SEQ_ID_NO:15, pelo fato de terem o aminoácido da extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo benzila e pelo fato de terem o aminoácido daextremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

12. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO:1 a SEQ_ID_NO: 25, pelo fato de terem o aminoácidoda extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo benzoíla e pelo fato deterem o aminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

13. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem definidos pelasseqüências SEQ_ID_NO: 1 e SEQ_ID_NO: 11, pelo fato de terem o aminoácidoda extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo benzoíla e pelo fato deterem o aminoácido da extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

14. PEPTÍDEOS LINEARES ANTIMICROBIANOS, deacordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de serem definidos pelaseqüência SEQ_ID_NO: 1, pelo fato de terem o aminoácido da extremidade N-terminal funcionalizado com o grupo benzoíla e pelo fato de terem o aminoácidoda extremidade C-terminal na forma do grupo carboxamida.

15. UTILIZAÇÃO DOS PEPTÍDEOS LINEARESANTIMICROBIANOS, de acordo com as reivindicações de 1 a 14, caracterizadapelo fato de ser realizada para a preparação de uma composição antimicrobiana.

16. UTILIZAÇÃO DOS PEPTÍDEOS LINEARESANTIMICROBIANOS, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fatode os peptídeos lineares antimicrobianos serem utilizados como agentesantimicrobianos contra bactérias patogênicas das plantas.

17. UTILIZAÇÃO DOS PEPTÍDEOS LINEARESANTIMICROBIANOS, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fatode a bactéria patogênica das plantas ser selecionada do grupo que consiste emErwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria e Pseudomonas syringae.

18. UTILIZAÇÃO DOS PEPTÍDEOS LINEARESANTIMICROBIANOS, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelofato de as plantas serem selecionadas do grupo que consiste em árvoresfrutíferas, plantas hortícolas e plantas ornamentais.

19. COMPOSIÇÃO FITOSSANITÁRIA caracterizada pelofato de compreender um peptídeo linear antimicrobiano, de acordo com qualqueruma das reivindicações de 1 a 14, e um agente auxiliar.

20. COMPOSIÇÃO FITOSSANITÁRIA, de acordo com areivindicação 19, caracterizada pelo fato de a concentração do peptídeo variarentre 0,01 e 0,5 g/l

21. COMPOSIÇÃO FITOSSANITÁRIA, de acordo com areivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de o agente auxiliar serselecionado do grupo que consiste em dissolventes, agentes tensoativos, agentestampão, filtra de radiação ultravioleta e/ou suas misturas.

22. COMPOSIÇÃO FITOSSANITÁRIA, de acordo com areivindicação 21, caracterizada pelo fato de o solvente ser água.

23. MÉTODO PARA PREVENIR E TRATARINFECÇÕES E DOENÇAS DE PLANTAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS,caracterizado pelo fato de compreender a colocação da planta em contato comuma composição fitossanitária, de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 19 a 22.

24. MÉTODO PARA PREVENIR E TRATARINFECÇÕES E DOENÇAS DE PLANTAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS, deacordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de as bactérias seremselecionadas do grupo que consiste em Erwinia amylovora, Xanthomonasvesicatoria e Pseudomonas syringae.

25. MÉTODO PARA PREVENIR E TRATARINFECÇÕES E DOENÇAS DE PLANTAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS, deacordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de as plantas seremselecionadas do grupo que consiste em árvores frutíferas, plantas hortícolas eplantas ornamentais.

26. MÉTODO PARA PREVENIR E TRATARINFECÇÕES E DOENÇAS DE PLANTAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS, deacordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 25, caracterizado pelo fatode a composição fitossanitária entrar em contato com as partes das plantasselecionadas do grupo que consiste em sementes, raízes, caules, folhas oufrutos, ou com o solo ou com qualquer meio de crescimento em torno das raízesdas plantas.

27. MÉTODO PARA PREVENIR E TRATARINFECÇÕES E DOENÇAS DE PLANTAS CAUSADAS POR BACTÉRIAS, deacordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 26, caractenzado pelo fatode a composição fitossanitária entrar em contato com as plantas por meio depulverização, imersão ou irrigação.