BRPI0710368A2

BRPI0710368A2 - polinucleotìdeos isolados, polipepeptìdeo, molecula de ácido nucleico isolado, construção de dna recombinante, célula yarrowia sp, métodos de transformação de celulas de produção de plantas transformadas, sementes, métodos de elaboração de graxos poliinsaturados de cadeia longa em células, de ácidos graxos, poliinsaturados de cadeia longa em células vegetais, óleo, plantas oleaginosas, óleo ou subprodutos, alimento ou ração, método de fabricação de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa em células e prole da planta

Info

Publication number: BRPI0710368A2
Application number: BRPI0710368-9A
Authority: BR
Inventors: Howard Glenn Damude; Quinn Qun Zhu
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-26
Publication date: 2011-08-09
Also published as: EP2013351B1; CA2646129A1; US20110184200A1; WO2007127381A2; US8470571B2; AU2007243286A1; US20080118623A1; CA2646129C; EP2013351A2; AU2007243286B2; EP2405012A1; WO2007127381A3; US7943823B2; US8058517B2; US20120015420A1; US20090313720A1

Abstract

<B>POLINUCLEOTIDEOS ISOLADOS, POLIPEPTIDEO, MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADO, CONSTRUçãO DE DNA RECOMBINANTE, CéLULA, YARROWIA SP, METODOS DE TRANSFORMAçãO DE CELULAS, DE PRODUçãO DE PLANTAS TRANSFORMADAS, SEMENTES, MéTODOS DE ELABORAçãO DE áCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM CéLULAS, DE áCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM CéLULAS VEGETAIS , óLEO, PLANTAS OLEAGINOSAS, óLEO OU SUBPRODUTOS, ALIMENTO OU RAçãO, MéTODO DE FABRICAçãO DE áCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM CéLULAS E PROLE DA PLANTA<D>Fragmentos de ácido nucleico isolados e construções recombinantes que compreendem esses fragmentos que codificam uma delta-8 dessaturase são descritos junto com um método de elaboração de ácidos graxos pollinsaturados (PUFAs) de cadeia longa utilizando essa deíta-8 dessaturase em plantas e levedura oleaginosa.

Description

"POLINUCLEOTÍDEOS ISOLADOS, POLIPEPTÍDEO, MOLÉCULA DEÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE,CÉLULA, YARROWIA SP, MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO DECÉLULAS, DE PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSFORMADAS, SEMENTES,MÉTODOS DE ELABORAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOSDE CADEIA LONGA EM CÉLULAS, DE ÁCIDOS GRAXOSPOLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM CÉLULAS VEGETAIS , ÓLEO,PLANTAS OLEAGINOSAS, ÓLEO OU SUBPRODUTOS, ALIMENTO OURAÇÃO, MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOSPOLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM CÉLULAS E PROLE DA

PLANTA"

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido ProvisórioNorte-Americano n° 60/795.810, depositado em 28 de abril de 2006, e doPedido Provisório Norte-Americano n° 60/837.789, depositado em quinze deagosto de 2006, cujo teor integral é incorporado ao presente como referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma seqüência depolinucleotídeos que codifica uma delta-8 dessaturase e ao uso dessadessaturase na elaboração de ácidos graxos poliinsaturados com cadeia longa(PUFAs).

Antecedentes da Invenção

Ácidos graxos (lipídios) são biomoléculas orgânicas insolúveis emágua que podem ser extraídas de células e tecidos por solventes não polarestais como clorofórmio, éter ou benzeno. Lipídios possuem várias funçõesbiológicas importantes, servindo como (1) componentes estruturais demembranas; (2) formas de armazenagem e transporte de combustíveismetabólicos; (3) um revestimento protetor sobre a superfície de muitosorganismos; e (4) componentes da superfície celular indicados noreconhecimento celular, especificidade de espécies e imunidade de tecidos.Mais especificamente, ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) sãocomponentes importantes da membrana de plasma da célula, onde podem serencontrados em formas tais como fosfolipídios e podem também serencontrados em triglicérides. PUFAs também servem de precursores de outrasmoléculas importantes em seres humanos e animais, que incluem asprostaciclinas, Ieucotrienos e prostaglandinas. Existem duas famílias principaisde PUFAs (ou seja, os ácidos graxos ômega 3 e os ácidos graxos ômega 6).

O corpo humano é capaz de produzir a maior parte dos PUFAs deque necessita para funcionar. Ácido eicosapentaenóico (EPA; 20:5, delta-5, 8,11, 14, 17) e ácido docosahexaenóico (DHA; 22:6, delta-4, 7, 10, 13, 16, 19)não podem ser sintetizados eficientemente pelo corpo humano e, desta forma,devem ser fornecidos por meio da alimentação. Como o corpo humano nãopode produzir quantidades adequadas desses PUFAs, eles são denominadosácidos graxos essenciais. Devido aos seus papéis importantes em saúdehumana e nutrição, EPA e DHA são objeto de muito interesse, conformediscutido no presente.

DHA é um ácido graxo da série ômega 3 de acordo com alocalização da última união dupla na extremidade metila. Ele é sintetizado poreio de etapas alternativas de dessaturação e alongamento (vide Fig. 12). Aprodução de DHA é importante devido ao seu efeito benéfico sobre a saúdehumana. Demonstrou-se, por exemplo, que o aumento da absorção de DHA ébenéfico ou possui um efeito positivo em disfunções inflamatórias (tais comoartrite reumatóide), diabete do tipo II, hipertensão, arteriosclerose, depressão,enfarte do miocárdio, trombose, alguns cânceres e para a prevenção do iníciode disfunções degenerativas, tais como mal de Alzheimer. Atualmente, asprincipais fontes de DHA são óleos de peixe e de algas.

EPA e ácido araquidônico (AA ou ARA; 20:4, delta-5, 8, 11, 14)são ambos ácidos graxos essenciais delta-5. EPA pertence à série ômega 3com cinco uniões duplas na cadeia acila, é encontrado em alimentos marinhose é abundante em peixe oleoso do Atlântico Norte. Efeitos benéficos oupositivos do aumento da absorção de EPA foram demonstrados em pacientescom doenças cardíacas coronarianas, alta pressão sangüínea, doençasinflamatórias, doenças do pulmão e dos rins, diabete do Tipo II, obesidade,colite ulcerativa, mal de Crohn, anorexia nervosa, queimaduras, osteoartrite,osteoporose, distúrbio de hiperatividade e déficit de atenção e estágios iniciaisde câncer colo-retal (vide, por exemplo, a análise de McCoII, J., NutraCos. 2(4): 35-40 (2003)).

AA pertence à série ômega 6 com quatro uniões duplas. A falta deuma união dupla na posição ômega 3 confere a AA propriedades diferentes dasencontradas em EPA. Os eicosanóides produzidos a partir de AA possuemfortes propriedades inflamatórias e de agregação de plaquetas, enquanto osderivados de EPA possuem propriedades anti-inflamatórias e anti-agregaçãode plaquetas. AA é reconhecido como o principal ácido graxo ômega 6encontrado no cérebro humano e um componente importante de leite maternoe muitas fórmulas infantis, com base no seu papel no desenvolvimento visual eneurológico precoce. AA pode ser obtido a partir de alguns alimentos (taiscomo carne, peixe e ovos), mas a concentração é baixa.

Ácido gama-linolênico (GLA; 18:3, delta-6, 9, 12) é outro ácidograxo essencial encontrado em mamíferos. GLA é o intermediário metabólicode ácidos graxos ômega 6 com cadeia muito longa e de várias moléculasativas. Em mamíferos, a formação de PUFAs com cadeia longa possuivelocidade limitada pela dessaturação delta-6. Demonstrou-se que muitascondições fisiológicas e patológicas tais como envelhecimento, tensão, diabete,eczema e algumas infecções reduzem a etapa de dessaturação delta-6. Alémdisso, GLA é facilmente catabolizado por meio da oxidação e rápida divisãocelular associada a certas disfunções (tais como câncer ou inflamação).

Conforme descrito acima, pesquisas demonstraram que váriosácidos graxos ômega reduzem o risco de doenças cardíacas, possuem umefeito positivo sobre o desenvolvimento das crianças e sobre certas doençasmentais, doenças autoimunes e queixas das juntas. Embora haja muitosbenefícios à saúde associados a uma alimentação suplementada com essesácidos graxos, entretanto, reconhece-se que diferentes PUFAs exercemdiferentes efeitos fisiológicos no corpo (tais como, mais notadamente, osefeitos fisiológicos opostos de GLA e AA). Desta forma, espera-se que aprodução de óleos utilizando meios recombinantes possua diversas vantagenssobre a produção a partir de fontes naturais. Podem ser utilizados, porexemplo, organismos recombinantes que possuem características preferidaspara a produção de óleo, pois o perfil de ácidos graxos de ocorrência natural dohospedeiro pode ser alterado por meio da introdução de novos processosbiossintéticos no hospedeiro e/ou da supressão de processos indesejados, deforma a resultar em níveis mais altos de produção de PUFAs desejados (ousuas formas conjugadas) e redução da produção de PUFAs indesejados.

Opcionalmente, organismos recombinantes podem fornecer PUFAs em formasespecíficas que podem possuir usos específicos; ou a produção de óleo podeser manipulada de tal forma que a razão entre ácidos graxos ômega 3 e ômega6 produzida desta forma seja modificada e/ou um PUFA específico sejaproduzido sem acúmulo significativo de outros produtos acima ou abaixo nofluxo de PUFA (tais como a produção de óleos que compreendem AA e nãocontêm GLA).

O mecanismo de síntese de PUFA freqüentemente ocorre pormeio do processo de dessaturação delta-6. A síntese de PUFA de cadeia longaem mamíferos processa-se predominantemente, por exemplo, por meio de umprocesso de dessaturação delta-6, em que a primeira etapa é a dessaturaçãodelta-6 de ácido Iinoleico (LA; 18:2, delta-9, 12) e ácido alfa-linolênico (ALA;18:3, delta-9, 12, 15) para gerar ácido gama-linolênico (GLA; 18:3, delta-6, 9,12)) e ácido estearidônico (STA; 18:4, delta-6, 9, 12, 15), respectivamente.Etapas adicionais de alongamento e dessaturação de ácidos graxos geramácido araquidônico (AA ou ARA) e ácido eicosapentaenóico (EPA).

Conseqüentemente, genes que codificam delta-6 dessaturases, componentesdelta-6 elongase (também identificados como elongases C18/2o) e delta-5dessaturases foram clonados a partir de uma série de organismos que incluemplantas superiores, algas, musgos, fungos, nematóides e seres humanos.Seres humanos podem sintetizar PUFAs de cadeia longa a partir dos ácidosgraxos essenciais, LA e ALA; a biossíntese de PUFAs de cadeia longa,entretanto, é um tanto limitada (eles são regulados por alterações alimentares ehormonais) e LA e ALA necessitam ser obtidos a partir da alimentação.

A Publicação PCT n0 WO 02/26946 (publicada em quatro de abrilde 2002) descreve moléculas de ácidos nucleicos isoladas que codificammembros da família de dessaturase de ácidos graxos FAD4, FAD5, FAD5-2 eFAD6 que são expressos em organismos produtores de PUFA de cadeia longa,tais como Thraustochytrium, Pythium irregulare, Schizichytrium eCrypthecodinium. Indica-se que construções que contêm os genes dessaturasepodem ser utilizadas em qualquer sistema de expressão, incluindo plantas,animais e microorganismos, para a produção de células capazes de produzirPUFAs de cadeia longa.

A Patente PCT n0 WO 98/55625 (publicada em 19 de dezembrode 1998) descreve a produção de PUFAs por meio da expressão de genes desíntese similares a poliquetídeos em plantas.

A Patente PCT n0 WO 98/46764 (publicada em 22 de outubro de1998) descreve composições e métodos de preparação de ácidos graxos decadeia longa em plantas, partes de plantas e células de plantas que utilizamseqüências de ácidos nucleicos e construções que codificam dessaturases deácidos graxos, incluindo delta-5 dessaturases, delta-6 dessaturases e delta-12dessaturases.

A Patente Norte-Americana n° 6.075.183 (emitida para Knutzon etal em 13 de junho de 2000) descreve métodos e composições de síntese dePUFAs de cadeia longa em plantas.

A Patente Norte-Americana n° 6.459.018 (emitida para Knutzon etal em 1° de outubro de 2002) descreve um método de produção de STA emsementes de plantas utilizando uma construção que compreende umaseqüência de DNA que codifica uma delta-6 dessaturase.

Spychalla et al (Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 94: 1142-1147(1997)) descrevem o isolamento e a caracterização de um cDNA deCaenorhabditis elegans que, quando expresso em Arabidopsis, codifica umadessaturase de ácido graxo que pode catalisar a introdução de uma uniãodupla ômega 3 em uma faixa de ácidos graxos com 18 e 20 carbonos.

Um processo alternativo de biossíntese de AA e EPA opera emalguns organismos (ou seja, o processo de delta-9 elongase e delta-8dessaturase). No presente, LA e ALA são alongados em primeiro lugar paraácido eicosadienóico (EDA; 20:2, delta-11, 14) e ácido eicosatrienóico (EtrA);20:3, delta-11, 14, 17), respectivamente, por uma delta-9 elongase. Adessaturação delta-8 e delta-5 subseqüente desses produtos gera AA e EPA.O processo delta-8 está presente, entre outros, em espécies euglenóides, ondeé o processo dominante de formação de PUFAs com vinte carbonos.

A Publicação PCT n0 WO 2000/34439 (publicada em quinze dejunho de 2000) descreve seqüências de ácidos nucleicos e aminoácidos paraenzimas delta-5 e delta-8 dessaturase. Com base nas informaçõesapresentadas no pedido copendente do Cessionário do Depositante que possuinúmero de Pedido Provisório 60/583.041 depositado em 25 de junho de 2004(Pedido Norte-Americano n° 11/166.003 depositado em 24 de junho de 2005(Patentes PCT n0 WO 2006/012325 e WO 2006/012326, publicadas em dois defevereiro de 2006)), é evidente que as seqüências de aminoácidos enucleotídeos delta-8 dessaturase da Patente PCT n0 WO 2000/34439 não sãocorretas. A seqüência correta é descrita, entretanto, na Patente Norte-Americana correspondente n° 6.825.017 (emitida para Browse et al em trinta denovembro de 2004) que descreve dessaturases, particularmente delta-5 edelta-8 dessaturases e sua utilização na síntese de PUFAs. Browse descreve amesma delta-8 dessaturase na Publicação Norte-Americana n° 2006090221(emitida em 27 de abril de 2006).

O pedido copendente do Cessionário do Depositante que possuinúmero de Pedido Norte-Americano 11/166.003 depositado em 24 de junho de2005 (Patentes PCT n0 WO 2006/012325 e WO 2006/012326, publicadas em doisde fevereiro de 2006) refere-se a uma delta-8 dessaturase de Eulgena gracilis.

Wallis et al (Arch. Biochem. and Biophys. 365 (2): 307-316 (maiode 1999)) descrevem a clonagem de um gene que aparentemente codifica umadelta-8 dessaturase em Euglena gracilis. Esta seqüência aparentemente é amesma seqüência descrita na Patente PCT n0 WO 2000/34439.

Qi et al (Nat. Biotech. 22 (6): 739-45 (2004)) desrevem a produçãode PUFAs de cadeia longa utilizando, entre outras, uma delta-8 dessaturase deEuglena gracilis; a seqüência completa da delta-8 dessaturase, entretanto, nãoé fornecida.

A Patente PCT n0 WO 2004/057001 (publicada em oito de julhode 2004) descreve seqüências de aminoácidos e ácidos nucleicos para umaenzima delta-8 dessaturase de Euglena gracilis.

A Patente PCT n0 WO 2005/103253 (publicada em 22 de abril de2005) descreve seqüências de aminoácidos e ácidos nucleicos para umaenzima delta-8 dessaturase de Pavlova salina (vide também a PublicaçãoNorte-Americana n°2005/0273885).

Sayanova et al (FEBS Lett. 580: 1946-1952 (2006)) descrevem oisolamento e a caracterização de um cDNA da ameba que vive livremente nosolo Acanthamoeba castellanii que, quando expressa em Arabidopsis, codificauma delta-8 dessaturase C20·

Um extenso estudo de PUFAs de fontes naturais e de síntesequímica não é suficiente para necessidades comerciais. É interessante,portanto, encontrar meios alternativos de permitir a produção de quantidadescomerciais de PUFAs. A biotecnologia oferece um processo atraente deprodução de PUFAs de cadeia longa de forma segura e eficiente para o seucusto em microorganismos e plantas.

Com relação a microorganismos, muitas algas, bactérias, fungose leveduras podem sintetizar óleos no processo comum de metabolismocelular. Desta forma, a produção de óleo envolve o cultivo do microorganismoem um meio de cultivo apropriado para permitir a síntese de óleo, seguida porseparação do microorganismo do meio de fermentação e tratamento pararecuperação do óleo intracelular. Foram realizadas tentativas de otimização daprodução de ácidos graxos por meios fermentativos que envolvem a variaçãodesses parâmetros conforme os microorganismos utilizados, meios econdições que permitam a produção de óleo. Estes esforços provaram ser,entretanto, em grande parte mal sucedidos na melhoria do rendimento de óleoou da capacidade de controle das características da composição de óleoproduzida. Uma classe de microorganismos que não foi examinadaanteriormente como plataforma de produção para PUFAs (antes do trabalho doCessionário do Depositante), entretanto, são as leveduras oleaginosas. Essesorganismos podem acumular óleo até 80% do seu peso de células secas. Atecnologia de cultivo de levedura oleaginosa com alto teor de óleo é bemdesenvolvida (vide, por exemplo, EP 0.005.277 B1; Ratledge, C., Prog. Ind.Microbiol. 16: 119-206 (1982)) e pode oferecer vantagem de custo emcomparação com a fermentação de microalgas comerciais para a produção dePUFAs ômega 3 ou ômega 6. Células de leveduras integrais podem tambémrepresentar uma forma conveniente de encapsulação de óleos enriquecidoscom PUFA ômega 3 ou ômega 6 para uso em alimentos funcionais esuplementos alimentícios animais.

O pedido copendente do Cessionário do Depositante que possuinúmero de Pedido Provisório Norte-Americano 60/739.989 depositado em 23de novembro de 2005 (pasta do advogado n° BB-1562) descreve uma delta-9elongase de Eulgena gracilis.

WO 02/077213 (publicada em três de outubro de 2002) descrevemoléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma elongase de ácidograxo com especificidade para ácido Iinoleico ou ácido alfa-linolênico deIsochrysis galbana (ou seja, delta-9 elongase).

A Patente Norte-Americana n° 6.403.349 (emitida em 11 de junhode 2002) refere-se à identificação de seqüências de nucleotídeos eaminoácidos de um gene elongase derivado de Mortierella alpina.

A Patente PCT n0 WO 2004/101757 e a Patente PCT n0 WO2004/101753 (publicada em 25 de novembro de 2004) referem-se à produçãode PUFAs em leveduras oleaginosas e são pedidos copendentes doCessionário do Depositante.

A Patente PCT n0 WO 2004/071467 (publicada em 26 de agostode 2004) refere-se à produção de PUFAs em plantas, enquanto a Patente PCTn0 WO 2004/071178 (publicada em 26 de agosto de 2004) refere-se a promotores de anexina e seu uso na expressão de transgenes em plantas;ambos são pedidos copendentes do Cessionário do Depositante.

Os pedidos copendentes do Cessionário do Depositante quepossuem número de Pedido Norte-Americano 10/985.109 e o Pedido Norte-Americano n° 10/985.254 depositado em dez de novembro de 2004 (PatentePCT n° 2005/047479 e Patente PCT n° 2005/047480; publicadas em 26 demaio de 2005) referem-se a genes delta-15 dessaturase apropriados para oaumento dos níveis de ácidos graxos de ômega 3.

Os pedidos copendentes do Cessionário do Depositante tambémincluem o Pedido Norte-Americano n° 11/265.761 depositado em dois denovembro de 2005, Pedido Norte-Americano n° 11/264.784 depositado emprimeiro de novembro de 2005 e o Pedido Norte-Americano n° 11/264.737depositado em primeiro de novembro de 2005 (métodos de fabricação de EPA1ARA e DHA1 respectivamente, em Yarrowia lipolytica), cada qual reivindicando obenefício de data de depósito provisório anterior de quatro de novembro de 2004.

Descrição Resumida da InvençãoA presente invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado quecompreende:

(a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo que possui atividade delta-8 dessaturase, em que o polipeptíeopossui pelo menos 80% de identidade de aminoácidos, com base no métodode alinhamento Clustal V, em comparação com uma seqüência de aminoácidosconforme descrito em SEQ ID N° 16;

(b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo que possui atividade delta-8 dessaturase, em que a seqüência denucleotídeos possui pelo menos 80% de identidade de seqüências, com baseno método BLASTN de alinhamento, em comparação com uma seqüência denucleotídeos conforme descrito em SEQ ID N0 15; ou

(c) um complemento da seqüência de nucleotídeos de (a) ou

(b), em que o complemento e a seqüência de nucleotídeos consistem damesma quantidade de nucleotídeos e são 100% complementares.

Em uma segunda realização, a presente invenção refere-se aotimização de códons, especificamente uma molécula de ácido nucleico isoladaque codifica uma enzima delta-8 dessaturase conforme descrito em SEQ ID N057 em que pelo menos 162 códons são otimizados por códon para expressãoem Yarrowia sp.

Em uma terceira realização, a presente invenção refere-se a umaconstrução de DNA recombinante que compreende qualquer dospolinucleotídeos de acordo com a presente invenção ligado operativamente apelo menos uma seqüência reguladora.

Em uma quarta realização, a presente invenção refere-se a umacélula que compreende a construção de DNA recombinante de acordo com apresente invenção. São de interesse células selecionadas a partir do grupo queconsiste de plantas e levedura.

Em uma quinta realização, a presente invenção refere-se a umYarrowia sp transformado que compreende a construção recombinante deacordo com a presente invenção.

Em uma sexta realização, a presente invenção refere-se a ummétodo de transformação de células, que compreende a transformação decélulas com a construção recombinante de acordo com a presente invenção ea seleção das células transformadas com a construção recombinante deacordo com a presente invenção.

Em uma sétima realização, a presente invenção refere-se a ummétodo de produção de plantas transformadas que compreende atransformação de uma célula vegetal com um polinucleotídeo de acordo com apresente invenção e regeneração de plantas a partir da célula de plantatransformada. Uma planta preferida é soja.

Em uma oitava realização, a presente invenção refere-se a ummétodo de produção de leveduras que compreende a transformação de célulasde levedura com um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção ecultivo de levedura a partir da célula de levedura transformada e,particularmente, levedura oleaginosa.

Em uma nona realização, a presente invenção refere-se asementes que compreendem a construção recombinante de acordo com apresente invenção.

Em uma décima realização, a presente invenção refere-se a ummétodo de elaboração de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa emcélulas que compreende:

(a) transformação de células com a construção recombinantede acordo com a presente invenção; e

(b) seleção das células transformadas que fabricam ácidospoliinsaturados de cadeia longa.

Em uma décima-primeira realização, a presente invenção refere-se a óleo obtido a partir de sementes que compreendem a construçãorecombinante de acordo com a presente invenção ou levedura quecompreende a construção recombinante de acordo com a presente invenção.

Em uma décima-segunda realização, a presente invenção refere-se a um método de fabricação de ácidos graxos poliinsaturados de cadeialonga em células vegetais que compreende:

(b) seleção das células transformadas que fabricam ácidosgraxos poliinsaturados de cadeia longa.

Em uma décima-terceira realização, a presente invenção refere-se a um método de produção de pelo menos um ácido graxo poliinsaturado emcélulas de soja, que compreende:

(a) transformação de células de soja com uma primeiraconstrução de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isoladoque codifica pelo menos um polipeptídeo delta-8 dessaturase, ligadooperativamente a pelo menos uma seqüência reguladora e pelo menos umaconstrução de DNA recombinante adicional que compreende umpolinucleotídeo isolado, ligado operativamente a pelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo queconsiste de delta-4 dessaturase, delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase,delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17 dessaturase, delta-9dessaturase, delta-9 elongase, elongase C14/16, elongase C^/ia, elongase C18/20e elongase C20/22;

(b) regeneração de plantas de soja a partir da célulatransformada da etapa (a); e

(c) seleção das sementes obtidas a partir das plantas da etapa(b) que contêm um nível alterado de ácidos graxos poliinsaturados emcomparação com o nível em sementes obtidas a partir de uma planta de sojanão transformada.

Em uma décima-quarta realização, a presente invenção refere-sea uma planta de soja que compreende:

(a) uma primeira construção de DNA recombinante quecompreende um polipeptídeo isolado que codifica pelo menos um polipeptídeo

delta-8 dessaturase, ligado operativamente a pelo menos uma seqüênciareguladora; e

(b) pelo menos uma construção de DNA recombinanteadicional que compreende um polinucleotídeo isolado, ligado operativamente apelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeo

selecionado a partir do grupo que consiste de delta-4 dessaturase, delta-5dessaturase, delta-6 dessaturase, delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase,delta-17 dessaturase, delta-9 dessaturase, delta-9 elongase, elongase C14/16,elongase C16/18, elongase C18/20 e elongase C20/22·Também são de interesse sementes obtidas a partir dessasplantas oleaginosas e o óleo obtido dessas sementes.

Em uma décima-quinta realização, a presente invenção refere-sea alimentos ou ração que incorporam óleo de acordo com a presente invenção.

Em uma décima-sexta realização, a presente invenção refere-se aalimentos ou ração que compreendem um ingrediente derivado doprocessamento das sementes de acordo com a presente invenção.

Em uma décima-sétima realização, a presente invenção refere-sea um polinucleotídeo isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeosque codifica um polipeptídeo que possui atividade delta-8 dessaturase, em quea seqüência de nucleotídeos possui pelo menos 90% de identidade deseqüências, com base no método BLASTN de alinhamento, em comparaçãocom uma seqüência de nucleotídeos de acordo com SEQ ID N0 15.

Em uma décima-oitava realização, a presente invenção refere-sea um método de fabricação de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longaem células que contêm um nível reduzido de subprodutos ácidos graxos, emque o mencionado método compreende:

(a) transformação de células hospedeiras com pelo menosuma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeoisolado que codifica pelo menos duas delta-8 dessaturases ligadasoperativamente a pelo menos uma seqüência reguladora; e

(b) seleção das células hospedeiras transformadas obtidasque contêm um nível reduzido de subprodutos ácidos graxos, emcomparação com o nível desses subprodutos ácidos graxos em uma célulahospedeira transformada que contém pelo menos uma construção de DNArecombinante que compreende um polinucleotídeo isolado que codificauma delta-8 dessaturase ligada operativamente a uma seqüênciareguladora.Depósitos BiológicosOs plasmídeos a seguir foram depositados junto à Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos (ATCC)1 10801 University Boulevard1Manassas VA 20110-2209 e possuem as designações, números de acesso edatas de depósito a seguir (Tabela 1).

Tabela 1Depósitos ATCC

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A presente invenção pode ser mais completamente compreendidaa partir do relatório descritivo detalhado a seguir e dos desenhos e Listagem deSeqüências anexos, que fazem parte do presente relatório descritivo.

As descrições de seqüências resumem a Listagem de Seqüênciasanexa ao presente. A Listagem de Seqüências contém códigos de uma letrapara caracteres de seqüência de nucleotídeos e os códigos de uma e trêsletras para aminoácidos, conforme definido nos padrões IUPAC-IUB descritosem Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) e em Biochemical Journal219(2): 345-373 (1984).

A Fig. 1 é um mapa do plasmídeo pY121 (vetor de expressão delevedura).

A Fig. 2 é um mapa de plasmídeo pKR902 (vetor de expressão desoja).

A Fig. 3 é um mapa de plasmídeo pKR903 (vetor de expressão desoja).

A Fig. 4 é um mapa de plasmídeo pY118 (vetor de expressão deYarrowia).

A Fig. 5 é um mapa de plasmídeo pKR973 (vetor de expressão desoja).

A Fig. 6 é um mapa de plasmídeo pKR912 (vetor de expressão desoja).

A Fig. 7 é um mapa de plasmídeo pKR983 (vetor de expressão desoja).

As Figs. 8A e 8B exibem uma tabela dos perfis de ácidos graxosde embriões de soja somáticos que expressam a delta-8 dessaturase dePavlova Iutheri e delta-9 elongase de Isochrysis galbana (vide Exemplo 12).

As Figs. 9-A, 9-B, 9-C e 9-D são mapas dos plasmídeospEgD9ES, pDMW263, pZUF17 e pZUFmEgD9ES.

A Fig. 10 exibe um cromatograma do perfil de lipídios de umextrato celular de Euglena gracilis conforme descrito nos Exemplos.

As Figs. 11-A, 11-B1 11-C e 11-D são um mapa dos plasmídeospPiD8S, pEXPGUS1-C, pZGD5T-CP e pZUFmE9SP8S.

A Fig. 12 é um processo de ácido graxo ômega 3 e ômega 6representativo que fornece a conversão de ácido mirístico por meio de váriosintermediários de ácido docosahexaenóico (DHA).

As Figs. 13A e 13B exibem um alinhamento Clustal V (comparâmetros padrão) de SEQ ID N0 16 (a seqüência de aminoácidos da delta-8dessaturase de acordo com a presente invenção), SEQ ID N0 76 (a seqüênciade aminoácidos de seqüência delta-8 dessaturase de Pavlova salina descritacomo SEQ ID N0 1 na Patente PCT n0 WO 2005/103253; publicada em 22 deabril de 2005), SEQ ID N0 77 (a seqüência de aminoácidos de seqüência delta-8 dessaturase de Euglena gracilis descrita como SEQ ID N0 2 na Patente PCTn0 WO 2006/012325, publicada em dois de fevereiro de 2006), SEQ ID N0 17 (aseqüência de aminoácidos de dessaturase de ácido graxo delta-6 de Rhizopusstolonifer (Acesso NCBI n° ABB96724 (Gl 83027409), local ABB96724, CDSDQ291156; Zhang et al, não publicado)) e SEQ ID N0 2 (a seqüência deaminoácidos da dessaturase de ácido graxo delta-6 de Rhizopus stolonifer(Acesso NCBI n° AAX22052 (Gl 60499699), local AAX22052, CDS AY795076;

Lu et al, não publicado)).

A Fig. 14 exibe o perfil médio de ácidos graxos para os dezmelhores eventos EPA de cultivo de suspensão embriogênica de soja (cv.Jack) transformado com os fragmentos Ascl de pKR973 (SEQ ID N0 45, Fig. 5)e pKR983 (SEQ ID N0 56, Fig. 7) (vide Exemplo 22).

SEQ ID N0 1 é a seqüência do primer T7.

SEQ ID N0 2 é a seqüência de aminoácidos da dessaturase deácido graxo delta-6 de Rhizopus stolonifer (Acesso NCBI n° AAX22052 (Gl60499699), local AAX22052, CDS AY795076; Lu et al, não publicado).

SEQ ID N0 3 é a seqüência de uma parte do inserto de cDNA doclone eps1c.pk002.f22 (extremidade 5' de um inserto de cDNA).

SEQ ID N0 4 é a seqüência de nucleotídeos do ESTeps1c.pk002.f22:fis totalmente seqüenciado (seqüência de inserto total - FIS).

SEQ ID N0 5 é a seqüência de aminoácidos deduzida de SEQ IDN0 4 (clone eps1c.pk002.f22:fis).SEQ ID N0 6 é a seqüência do primer SeqE.

SEQ ID N0 7 é a seqüência do primer SeqW.

SEQ ID N0 8 é a seqüência de aminoácidos da delta-6dessaturase de Mortierella alpina (Acesso NCBI n° BAC82361 (Gl 34221934),local BAC82361, CDS AB070557; Sakuradani e Shímizu, Biosci. BiotechnoiBiochem. 67: 704-711 (2003)).

SEQ ID N0 9 é a seqüência do primer universal AP1.

SEQ ID N0 10 é a seqüência do primer GSP PvDES.

SEQ ID N0 11 é a seqüência do primer M13-28Rev.SEQ ID N° 12 é a seqüência do primer PvDES seq.

SEQ ID N° 13 é a seqüência terminal 5' completa do processo degenoma de delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri.

SEQ ID N° 14 é a seqüência de nucleotídeos da delta-8dessaturase de Pavlova lutheri de acordo com a presente invenção.

SEQ ID N° 15 é a seqüência de nucleotídeos da CDS de SEQ IDN° 14 (delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri de acordo com a presenteinvenção).

SEQ ID N° 16 é a seqüência de aminoácidos deduzida de SEQ IDN° 15 (delta-8 dessaturase de acordo com a presente invenção).

SEQ ID N° 17 é a seqüência de aminoácidos da dessaturase deácido graxo delta-6 de Rhizopus stolonifer (Acesso NCBI n° ABB96724 (Gl83027409), local ABB96724, CDS DQ291156; Zhang et al, não publicado).

SEQ ID N° 18 é a seqüência do primer PvDES5'Not-1. SEQ ID N° 19 é a seqüência do primer PvDES3'Not-1. SEQ ID N° 20 é a seqüência do primer GSP PvDES-2. SEQ ID N° 21 é a seqüência de pY121. SEQ ID N° 22 é a seqüência de pKR123r. SEQ ID N° 23 é a seqüência de pKR900. SEQ ID N° 24 é a seqüência de pKR925. SEQ ID N° 25 é a seqüência de pKR902. SEQ ID N° 26 é a seqüência de pKR607. SEQ ID N° 27 é a seqüência de pKR903. SEQ ID N° 28 é a seqüência do primer GPD com sentido. SEQ ID N° 29 é a seqüência do primer GPD sem sentido. SEQ ID N° 30 é a seqüência de pY5-22GPD. SEQ ID N° 31 é a seqüência de pY118. SEQ ID N° 32 é a seqüência de nucleotídeos do CDS deelongase de Euglena gracilis.

SEQ ID N° 33 é a seqüência de primer oEugEL1-1.SEQ ID N° 34 é a seqüência de primer oEugEL1-2.SEQ ID N° 35 é a seqüência de pKR906.SEQ ID N° 36 é a seqüência de pKR132.

SEQ ID N° 37 é a seqüência de pKR953.SEQ ID N° 38 é a seqüência de pKR287.

SEQ ID N° 39 é a seqüência de nucleotídeos do CDS de delta-5dessaturase de Mortierella alpina, que é descrita na Patente Norte-Americanan° 6.075.183 e nas Patentes PCT n0 WO 2004/071467 e WO 2005/0479479.

SEQ ID N° 40 ê a seqüência de pKR277.SEQ ID N° 41 é a seqüência de pKR952.SEQ ID N° 42 é a seqüência de pKR457.SEQ ID N° 43 é a seqüência do conjunto Kti/Notl/Kti3'Salb3'modificado.

SEQ ID N° 44 é a seqüência de pKR970.SEQ ID N° 45 é a seqüência de pKR973.SEQ ID N° 46 é a seqüência de pKR72.SEQ ID N° 47 é a seqüência de pKR912.SEQ ID N° 48 é a seqüência de pKR886r.SEQ ID N° 49 é a seqüência de pKR271.SEQ ID N° 50 é a seqüência de pKR226.SEQ ID N° 51 é a seqüência do primer oCon-1SEQ ID N° 52 é a seqüência do primer oCon-2SEQ ID N° 53 é a seqüência de pKR179.SEQ ID N° 54 é a seqüência de pKR226.SEQ ID N° 55 é a seqüência de pKR582.SEQ ID N° 56 é a seqüência de pKR983.SEQ ID N0 57 é a seqüência de nucleotídeos para a delta-8dessaturase sintética (otimizada por códons) derivada de Pavlova Iutheriotimizado por códons para expressão em Yarrowia lipolytica.

SEQ ID N0 58 é a seqüência de pPiD8S.

SEQ ID N0 59 é a seqüência de nucleotídeos da enzima dealongamento de PUFA de cadeia longa de Isochrysis galbana (Acesso NCBI n°AAL37626 (Gl 17226123), local AAL37626, CDS AF390174).

SEQ ID N0 60 é a seqüência 5' do inserto de cDNA do cloneeeg1c.pk001.n5.f, enquanto SEQ ID N0 61 é a seqüência 3' do inserto de cDNAdo clone eeg1c.pk001.n5.f.

SEQ ID N0 61 é a seqüência 3' do inserto de cDNA do cloneeeg1c.pk001.n5.f.

SEQ ID N0 62 é a seqüência alinhada de SEQ ID N0 60 e SEQ IDN0 61 (seqüência de cDNA total excluindo a extremidade poliA).

SEQ ID N0 63 é a seqüência de nucleotídeos do primer universalM13F.

SEQ ID N0 64 é a seqüência de aminoácidos deduzida de SEQ IDN0 63 (delta-9 elongase - clone eeg1c.pk001.n5.f).

SEQ ID N0 65 é a seqüência de aminoácidos da enzima dealongamento de PUFA de cadeia longa de Isochrysis galbana (Acesso NCBI n°AAL37626 (Gl 17226123), local AAL37626, CDS AF390174).

SEQ ID N0 66 é a seqüência de nucleotídeos da delta-9 elongasesintética (otimizada por códons) derivada de Isochrysis galbana otimizada porcódons para expressão em Yarrowia lipolytica.

SEQ ID N0 67 é a seqüência de pEgD9ES.

SEQ ID N0 68 é a seqüência de pDMW263.

SEQ ID N0 69 é a seqüência de pZUF17.

SEQ ID N0 70 é a seqüência de pZUFmEgD9ES.SEQ ID N° 71 é a seqüência de pZUFmE9SP8S.

SEQ ID N° 72 é a seqüência de pEXPGUS1-C.

SEQ ID N° 73 é a seqüência de pZGD5T-CP.

SEQ ID N° 74 é a seqüência de pYZDE2-S.

SEQ ID N° 75 é a seqüência de pY5-22.

SEQ ID N° 76 é a seqüência de aminoácidos de seqüência dedelta-8 dessaturase de Pavlova salina descrita como SEQ ID N° 1 na PatentePCT n° WO 2005/103253 (publicada em 22 de abril de 2005).

SEQ ID N° 77 é a seqüência de aminoácidos de seqüência delta-8dessaturase de Eulgena gracilis descrita como SEQ ID N° 2 no pedidocopendente do Cessionário do Depositante que possui número de pedido11/166.003 depositado em 24 de junho de 2005 (Patente PCT n° WO2006/012325, publicado em dois de fevereiro de 2006).

SEQ ID N0 78 é a seqüência de pY5-30.

Descrição Detalhada da Invenção

Todas as patentes, pedidos de patentes e publicaçõesmencionadas no presente são integralmente incorporados como referência.

No contexto do presente relatório descritivo, será utilizada umasérie de termos.

A expressão "ácidos graxos" designa ácidos alifáticos de cadeialonga (ácidos alcanóicos) com comprimentos de cadeia variáveis de cerca deC12 a C22 (embora sejam conhecidos ácidos com comprimentos de cadeia maislongos e mais curtos). Os comprimentos de cadeias predominantes são de Ci8a C22- Detalhes adicionais referentes à diferenciação entre "ácidos graxossaturados" e "ácidos graxos insaturados", "ácidos graxos monoinsaturados"contra "ácidos graxos poliinsaturados" (ou "PUFAs") e "ácidos graxos ômega-6"(ω-6 ou n-6) contra "ácidos graxos ômega-3" (ω-3 ou n-3) são fornecidos naPatente PCT n° WO 2004/101757.Ácidos graxos são descritos no presente por um sistema denotação simples "X:Y", em que o número antes dos dois pontos indica onúmero de átomos de carbono no ácido graxo e o número após os dois pontosé o número de uniões duplas que estão presentes. O número após adesignação de ácido graxo indica a posição da união dupla a partir daextremidade carboxila do ácido graxo com o sufixo "c" para a configuração c/sda união dupla (tal como ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácidooleico (18:1, 9c), ácido petroselínico (18:1, 6c), LA (18:2, 9c, 12c), GLA (18:3,6c, 9c, 12c) e ALA (18:3, 9c, 12c, 15c)). A menos que especificado emcontrário, 18:1, 18:2 e 18:3 designam ácidos graxos oleico, LA e linolênico.Caso não seja especificamente escrito em contrário, considera-se que uniõesduplas possuam a configuração eis. As uniões duplas em 18:2 (9, 12), porexemplo, seriam consideradas na configuração eis.

Um processo representativo é ilustrado na Fig. 12, que fornece aconversão de ácido mirístico por meio de vários intermediários de DHA, o quedemonstra como ácidos graxos ômega 3 e ômega 6 podem ser produzidos apartir de uma fonte comum.

A expressão "ácido graxo intermediário" designa qualquer ácidograxo produzido em um processo metabólico de ácido graxo que pode seradicionalmente convertido em um produto ácido graxo desejado nesteprocesso por meio da ação de outras enzimas de processo metabólico. Aoproduzir-se EPA utilizando o processo metabólico de delta-9 elongase, porexemplo (delta-15 dessaturase, delta-9 elongase, delta-8 dessaturase, delta-5dessaturase e delta-17 dessaturase), EDA, ERA, DGLA, ETA e ARA podem serproduzidos e são considerados "ácidos graxos intermediários", pois essesácidos graxos podem ser adicionalmente convetidos em EPA por meio da açãode outras enzimas de processos metabólicos.

A expressão "subproduto ácido graxo" designa qualquer ácidograxo produzido em um processo metabólico de ácido graxo que não seja oproduto ácido graxo pretendido do processo, nem um "ácido graxointermediário" do processo. Ao produzir-se EPA utilizando o processometabólico de delta-9 elongase, por exemplo (delta-15 dessaturase, delta-9 elongase, delta-8 dessaturase, delta-5 dessaturase e delta-17dessaturase), ácido ciadiônico (SC) e ácido juniperônico (JUP) podemtambém ser produzidos por meio da ação de uma delta-5 dessaturasesobre EDA ou ERA, respectivamente. Eles são considerados"subprodutos ácidos graxos", pois nenhum deles pode ser adicionalmenteconvertido em EPA por meio da ação de outras enzimas de processosmetabólicos.

Um processo metabólico, em sentido bioquímico, pode serconsiderado como uma série de reações químicas que ocorrem no interiorde uma célula, catalisadas por enzimas, para atingir a formação de umproduto metabólico a ser utilizado ou armazenado pela célula, ou o iníciode um outro processo metabólico (denominado em seguida uma etapa degeração de fluxo). Muitos destes processos são elaborados e envolvemuma modificação etapa por etapa da substância inicial para moldá-la emum produto que possui a estrutura química exata desejada.

A nomenclatura utilizada para descrever PFUAs no presenterelatório descritivo é exibida abaixo na Tabela 2. Na coluna intitulada"Notação Abreviada", é utilizado o sistema de referência ômega paraindicar a quantidade de carbonos, o número de uniões duplas e a posiçãoda união dupla mais próxima do carbono ômega, contando a partir docarbono ômega (que recebe o número 1 para este propósito). O restanteda Tabela resume os nomes comuns de ácidos graxos ômega 3 e ômega 6,as abreviações que serão utilizadas ao longo de todo o restante dorelatório descritivo e o nome químico de cada composto.Tabela 2

Nomenclatura de Ácidos Graxos Poliinsaturados

<table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table>

A expressão "ácido graxo essencial" designa um PUFA específicoque um organismo deve ingerir para que sobreviva, sendo incapaz de sintetizaro ácido graxo essencial específico novo. Mamíferos, por exemplo, não podemsintetizar o ácido graxo essencial LA. Outros ácidos graxos essenciais incluem,mas sem limitar-se a GLA, DGLA, AA1 EPA e DHA.

O termo "gordura" designa uma substância de lipídio que é sólidaa 25 0C e normalmente saturada.

O termo "óleo" designa uma substância de lipídio que é líquida a25 0C e normalmente poliinsaturada. PUFAs são encontrados nos óleos dealgumas algas, leveduras oleaginosas e fungos filamentosos. "Óleosmicrobianos" ou "óleos de células isoladas" são os óleos produzidosnaturalmente por microorganismos durante o seu período de vida. Esses óleospodem conter PUFAs de cadeia longa.

A expressão "processo biossintético de PUFA" designa umprocesso metabólico que converte ácido oleico em LA, EDA, GLA, DGLA, AA1ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA e DHA. Este processo é bem descrito naliteratura (vide, por exemplo, a Patente PCT n0 WO 2005/003322). De formasimplista, este processo envolve o alongamento da cadeia de carbono por meioda adição de átomos de carbono e dessaturação da molécula por meio daadição de uniões duplas, por uma série de enzimas de desnaturação ealongamento especiais (ou seja, "enzimas do processo biossintético de PUFA")presentes na membrana de retículo endoplasmático. Mais especificamente,"enzimas do processo biossintético de PUFA" designam qualquer das enzimasa seguir (e genes que codificam as mencionadas enzimas) associadas àbiossíntese de um PUFA, que incluem: delta-4 dessaturase, delta-5dessaturase, delta-6 dessaturase, delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase,delta-17 dessaturase, delta-9 dessaturase, delta-8 dessaturase, delta-9elongase, elongase C14/16, elongase C16/18. elongase C18/20 e/ou elongase C20/22·"Dessaturase" é um polipeptídeo que pode dessaturar um ou maisácidos graxos para produzir um ácido graxo mono ou poliinsaturado que sejade interesse. São de interesse específico no presente delta-8 dessaturases quedessaturarão um ácido graxo entre o oitavo e o nono átomo de carbononumerados a partir da extremidade carboxil-terminal da molécula e que podemcatalisar, por exemplo, a conversão de EDA em DGLA e/ou ETrA em ETA.Outras dessaturases de ácidos graxos úteis incluem, por exemplo, (1) delta-5dessaturases que catalisam a conversão de DGLA em AA e/ou ETA em EPA;(2) delta-6 dessaturases que catalisam a conversão de LA em GLA e/ou ALAem STA; (3) delta-4 dessaturases que catalisam a conversão de DPA em DHA;(4) delta-12 dessaturases que catalisam a conversão de ácido oleico em LA; (5)delta-15 dessaturases que catalisam a conversão de LA em ALA e/ou GLA emSTA; (6) delta-17 dessaturases que catalisam a conversão de AA em EPA e/ouDGLA em ETA; e (7) delta-9 dessaturases que catalisam a conversão depalmitato em ácido palmitoleico (16:1) e/ou estearato em ácido oleico (18:1).

A expressão "sistema de elongase" designa uma suíte de quatroenzimas que são responsáveis pelo alongamento de uma cadeia de carbonode ácidos graxos para produzir um ácido graxo que contém dois carbonos amais que o substrato de ácido graxo sobre o qual age o sistema de elongase.Mais especificamente, o processo de alongamento ocorre em associação comsintase de ácidos graxos, por meio do quê CoA é a portadora acila (Lassner etal, Plant Cell 8: 281-292 (1996)). Na primeira etapa, que se concluiu serespecífica de substrato e também limitadora da velocidade, malonil-CoA écondensado com um acil-CoA de cadeia longa para gerar dióxido de carbono(CO2) e β-cetoacil-CoA (em que a porção acila tenha sido alongada em doisátomos de carbono). Reações subseqüentes incluem redução para β-hidroxiacil-CoA, desidratação em um enoil-CoA e uma segunda redução paragerar o acil-CoA alongado. Exemplos de reações catalisadas por sistemas deelongase são a conversão de GLA em DGLA1 STA em ETA1 LA em EDA, ALAem ERA e EPA em DPA.

Para os propósitos do presente, uma enzima que catalisa aprimeira reação de condensação (ou seja, conversão de malonil-CoA em β-cetoacil-CoA) será designada geralmente uma "elongase". Geralmente, aseletividade de substrato de elongases é um tanto ampla mas segregada pelocomprimento de cadeia e pelo grau de insaturação. Conseqüentemente,elongases podem possuir especificidades diferentes. Uma elongase C14/16utilizará, por exemplo, um substrato Cu (tal como mirístico), uma elongaseC16/18 utilizará um substrato Ci6 (tal como palmitato), uma elongase C18/20utilizará um substrato C-is (tal como GLA1 STA) e uma elongase C20/22 utilizaráum substrato C20 (tal como EPA). De forma similar e de interesse específico nopresente, uma "delta-9 elongase" é capaz de catalisar a conversão de LA eALA em EDA e ETrA. É importante observar que algumas elongases possuemampla especificidade e, portanto, uma única enzima pode ser capaz decatalisar várias reações de elongase (agindo desta forma, por exemplo, comoelongase C16/ie e elongase C18/2o)·

Em realizações preferidas, é desejável determinar empiricamentea especificidade de uma elongase de ácido graxo por meio da transformaçãode um hospoedeiro apropriado com o gene para a elongase de ácido graxo edeterminação do seu efeito sobre o perfil de ácido graxo do hospedeiro.Elongases de ácidos graxos de diferentes substâncias podem exibir grandevariabilidade da especificidade de substratos. Delta-6 elongase de Mortierellaalpina, por exemplo, age como uma elongase C18/20 (alongamento de GLA paraDGLA) em levedura, mas pode agir adicionalmente como um alongamento deC20/22 de LA ou ALA em EDA ou ETrA1 respectivamente, em soja.

A expressão "processo de delta-9 elongase/delta-8 dessaturase"designa uma elongase para o alongamento de EPA em DPA ou como delta-9elongase para o processo biossintético de produção de PUFAs de cadeialonga. Este processo compreende pelo menos uma delta-9 elongase e umadelta-8 dessaturase, de forma a permitir a biossíntese de DGLA e/ou ETA apartir de LA e ALA, respectivamente.

A expressão "delta-9 elongase" designa uma enzima que é capazde catalisar pelo menos uma reação de elongase tal como o alongamento deácido Iinoleico (LA) ou alfa-linolênico (ALA) em EDA ou ETrA1 respectivamente.Ela pode agir como uma elongase C16/18, elongase C18/20 e elongase C20/22 epode possuir especificidades alternativas, mas não preferidas, para ácidosgraxos delta-5 e delta-6, tais como EPA e/ou GLA, respectivamente.

A expressão "delta-8 dessaturase" designa uma enzima que écapaz de catalisar pelo menos uma reação de dessaturação tal como adessaturação de ácido eicosadienóico (EDA) ou ácido eicosatrienóico (ETrA)em DGLA ou ETA, respectivamente. Ela age como dessaturase C20·

As expressões "polinucleotídeo", "seqüência de polinucleotídeos","seqüência de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico" e "fragmento deácido nucleico isolado" são utilizadas de forma intercambiável no presente.Estas expressões englobam seqüências de nucleotídeos e similares. Umpolinucleotídeo pode ser um polímero de RNA ou DNA que possui fita simplesou dupla, que contenha opcionalmente bases de nucleotídeos sintéticas, nãonaturais ou alteradas. Um polinucleotídeo na forma de polímero de DNA podeser composto de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNAsintético ou suas misturas. Nucleotídeos (normalmente encontrados na suaforma de 5'-monofosfato) são designados por uma denominação de uma letraconforme segue: "A" por adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA,respectivamente), "C" para citidilato ou desoxicitidilato, "G" para guanilato oudesoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (Aou G), "Y" para pirimidinas (C ou Τ), "K" para G ou Τ, "H" para A, C ou Τ, Tpara inosina e "N" para qualquer nucleotídeo.

As expressões "subfragmento que é funcionalmente equivalente"e "subfragmento funcionalmente equivalente" são utilizadas de formaintercambiável no presente. Estas expressões designam uma parte ousubseqüência de um fragmento de ácido nucleico isolado no qual a capacidadede alteração da expressão genética ou produção de um certo fenótipo é retida,seja o fragmento ou subfragmento codificador ou não de uma enzima ativa. Ofragmento ou subfragmento pode ser utilizado, por exemplo, no projeto degenes quiméricos para produzir o fenótipo desejado em uma plantatransformada. Genes quiméricos podem ser projetados para uso em supressãoligando-se um fragmento de ácido nucleico ou seu subfragmento, codifique ounão uma enzima ativa, na orientação com ou sem sentido com relação a umaseqüência promotora de plantas.

A expressão "domínio conservado" ou "motivo" indica um conjuntode aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de umaseqüência alinhada de proteínas relacionadas evolucionariamente. Emboraaminoácidos em outras posições possam variar entre proteínas homólogas,aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicamaminoácidos que são essenciais na estrutura, estabilidade ou atividade de umaproteína. Como são identificados pelo seu alto grau de conservação emseqüências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, eles podemser utilizados como identificadores ou "assinaturas" para determinar se umaproteína com uma seqüência recém determinada pertence a uma família deproteínas identificada anteriormente.

As expressões "homologia", "homólogo", "substancialmentesimilar" e "substancialmente correspondente" são utilizadas no presente deforma intercambiável. Elas designam fragmentos de ácidos nucleicos em quemodificações em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a capacidadedo fragmento de ácido nucleico de mediar a expressão genética ou produzir umcerto fenótipo. Estas expressões também designam modificações dosfragmentos de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, tais comoexclusão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteremsubstancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleicoresultante com relação ao fragmento não modificado inicial. Compreende-se,portanto, como apreciarão os técnicos no assunto, que a presente invençãoengloba mais que as seqüências de exemplos específicas.

Além disso, os técnicos no assunto reconhecem que seqüênciasde ácido nucleico substancialmente similares englobadas pela presenteinvenção também são definidas pela sua capacidade de hibridização sobcondições moderadamente estringentes (tais como 0,5 X SSC, 0,1% SDS, 60°C) com as seqüências exemplificadas no presente, ou qualquer parte dasseqüências de nucleotídeos descritas no presente e que são funcionalmenteequivalentes a qualquer das seqüências de ácido nucléico descritas nopresente. As condições de estringência podem ser ajustadas para selecionarfragmentos moderadamente similares, tais como seqüências homólogas deorganismos com relacionamento distante, até fragmentos altamente similares,tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos intimamenterelacionados. Lavagens após a hibridização determinam as condições deestringência. Um conjunto de condições preferidas envolve uma série delavagens a partir de 6X SSC, 0,5% SDS à temperatura ambiente por quinzeminutos, repetidas em seguida com 2X SSC1 0,5% SDS a 45 0C por trintaminutos, repetidas em seguida por duas vezes com 0,2X SSC, 0,5% SDS a 500C por trinta minutos. Um conjunto de condições estringentes de maiorpreferência envolve o uso de temperaturas mais altas em que as lavagens sãoidênticas às acima, exceto pela temperatura das duas lavagens finais de trintaminutos em 0,2X SSC, 0,5% SDS, que foi aumentada para 60 °C. Outroconjunto preferido de condições altamente estringentes envolve o uso de duaslavagens finais em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65 °C.

"Identidade de seqüências" ou "identidade", no contexto deseqüências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, designa as bases de ácidosnucleicos ou resíduos de aminoácidos nas duas seqüências que são idênticasquando alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela decomparação especificada.

Desta forma, "percentual de identidade de seqüências" designa ovalor determinado por meio de comparação de duas seqüências alinhadasidealmente ao longo de uma janela de comparação, em que a parte daseqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreenderadições ou exclusões (ou seja, lacunas) em comparação com a seqüência dereferência (que não compreende adições nem exclusões) para alinhamentoideal das duas seqüências. O percentual é calculado determinando-se aquantidade de posições em que ocorre o resíduo de aminoácidos ou base deácido nucleico idêntico nas duas seqüências para gerar o número de posiçõescoincidentes, dividindo-se o número de posições coincidentes pelo número totalde posições na janela de comparação e multiplicando-se os resultados por 100para gerar o percentual de identidade de seqüências. Exemplos úteis depercentuais de identidades de seqüências incluem, mas sem limitar-se a 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou qualquer percentualinteiro de 50 a 100%. Estas identidades podem ser determinadas utilizandoqualquer dos programas descritos no presente.

Alinhamentos de seqüências e cálculos de similaridade ouidentidade percentual podem ser determinados utilizando uma série demétodos de comparação projetados para detectar seqüências homólogas queincluem, mas sem limitar-se ao programa Megalign® da suíte de computaçãobioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison Wl1 Estados Unidos). Oalinhamento múltiplo das seqüências é realizado utilizando o método Clustal Vde alinhamento (Higgins, D. G. e Sharp, Ρ. M. (1989), Comput. Appl. Biosci. 5:151-153; Higgins, D. G. et al (1992), Comput. Appli. Biosci. 8: 189-191) com osparâmetros padrão (PENALIDADE DO INTERVALO = 10, PENALIDADE DOCOMPRIMENTO DO INTERVALO = 10). Os parâmetros padrão paraalinhamentos em pares e cálculo do percentual de identidade de seqüências deproteínas utilizando o método Clustal são COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1,PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHORRESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5. Para ácidosnucleicos, esses parâmetros são COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1,PENALIDADE DO INTERVALO = 5, VISUALIZAÇÃO DO MELHORRESULTADO = 4 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 4.

Os técnicos no assunto compreendem bem que muitos níveis deidentidade de seqüências são úteis na identificação de polipeptídeos, de outrasespécies, em que esses polipeptídeos possuem função ou atividade similar ouidêntica. Exemplos úteis de percentuais de identidades incluem, mas semlimitar-se a 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ouqualquer percentual inteiro de 55% a 100%. De fato, qualquer identidade deaminoácido inteira de 50% a 100% pode ser útil na descrição da presenteinvenção. Além disso, é de interesse qualquer complemento parcial ou decomprimento total desse fragmento de nucleotídeo isolado.

"Gene" designa um fragmento de ácido nucleico que expressauma proteína específica, que inclui seqüências reguladoras anteriores(seqüências não codificadoras 5') e posteriores (seqüências não codificadoras3') à seqüência codificadora. "Gene nativo" indica um gene encontrado nanatureza com suas próprias seqüências reguladoras. "Gene quimérico" designaqualquer gene que não é um gene nativo, que compreende seqüênciasreguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza.Conseqüentemente, um gene quimérico pode compreender seqüênciasreguladoras e seqüências de codificação que são derivadas de fontesdiferentes, ou seqüências reguladoras e seqüências de codificação derivadasda mesma fonte, mas dispostas de maneira diferente da encontrada nanatureza. Gene "exógeno" indica um gene normalmente não encontrado noorganismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro pormeio de transferência genética. Os genes exógenos podem compreendergenes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um"transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por meio de umprocedimento de transformação.

"Gene otimizado por códons" é um gene que possui a suafreqüência de uso de códons projetado para imitar a freqüência de uso decódons preferido da célula hospedeira.

"Alelo" é uma das diversas formas alternativas de um gene queocupa um dado local sobre um cromossomo. Quando todos os alelos presentesem um dado local sobre um cromossomo forem idênticos, aquela planta éhomozigótica naquele local. Caso os alelos presentes em um dado local sobreum cromossomo difiram, aquela planta é heterozigótica naquele local.

"Seqüência codificadora" indica uma seqüência de DNA quecodifica uma seqüência de aminoácidos específica. "Seqüências reguladoras"indicam seqüências de nucleotídeos localizadas acima (seqüências nãocodificadoras 5'), na própria ou abaixo (seqüências não codificadoras 3') deuma seqüência codificadora e que influenciam a transcrição, estabilidade ouprocessamento de RNA ou tradução da seqüência codificadora associada. Asseqüências reguladoras podem incluir, mas sem limitar-se a promotores,seqüências líderes de tradução, introns, seqüências de reconhecimento depoliadenilação, locais de processamento de RNA, locais de união de efetores eestruturas de circuito de haste.

"Promotor" designa uma seqüência de DNA capaz de controlar aexpressão de uma seqüência codificadora ou RNA funcional. A seqüênciapromotora consiste de elementos próximos e mais distantes no fluxo, comestes últimos muitas vezes denominados amplificadores. Conseqüentemente,um "amplificador" é uma seqüência de DNA que pode estimular a atividadepromotora e pode ser um elemento inato do promotor ou um elementoheterólogo inserido para amplificar o nível ou a especificidade de tecido de umpromotor. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um genenativo ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentespromotores encontrados na natureza, ou podem mesmo compreendersegmentos de DNA sintéticos. Os técnicos no assunto compreendem quediferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene isolado emdiferentes tecidos ou tipos de células, em diferentes estágios dedesenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais.Reconhece-se ainda que, como na maior parte dos casos as fronteiras exatasde seqüências reguladoras não foram totalmente definidas, fragmentos de DNAcom alguma variação podem possuir atividade promotora idêntica. Ospromotores que fazem com que um gene seja expresso na maior parte dostipos de células na maior parte das vezes são comumente denominados"promotores constitutivos". Novos promotores de diversos tipos úteis emcélulas vegetais estão constantemente sendo descobertos; numerososexemplos podem ser encontrados na compilação de Okamuro, J. K. eGoldberg1 R. B., BiochemistryofPIants 15: 1-82 (1989).

"Seqüência líder de tradução" designa uma seqüência depolinucleotídeos localizada entre a seqüência promotora de um gene e aseqüência codificadora. A seqüência líder de tradução está presente no mRNAtotalmente processado após a seqüência inicial de tradução. A seqüência líderde tradução pode afetar o processamento do transcrito primário em mRNA, aestabilidade do mRNA ou a eficiência da tradução. Foram descritos exemplosde seqüências líderes de tradução (Turner, R. e Foster, G. D. (1995), Mol.Biotechnol. 3: 225-236 (1995)).

"Seqüências não-codificadoras 3"', "término de transcrição" ou"seqüências de término" designam seqüências de DNA em local posterior auma seqüência codificadora e incluem seqüências de reconhecimento depoliadenilação e outras seqüências codificadoras de sinais reguladorescapazes de afetar o processamento de mRNA ou a expressão genética. O sinalde poliadenilação é normalmente caracterizado por afetar a adição de traços deácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor de mRNA. A utilização dediferentes seqüências não-codificadoras 3' é exemplificada por Ingelbrecht, I. L.et al, Plant Cell 1: 671-680 (1989).

"Transcrito de RNA" designa o produto resultante da transcriçãocatalisada por polimerase de RNA de uma seqüência de DNA. Quando otranscrito de RNA for uma cópia complementar perfeita da seqüência de DNA1ele é denominado transcrito primário. Um transcrito de RNA é denominadoRNA maduro quando for uma seqüência de RNA derivada do processamentopós-transcricional do transcrito primário. "RNA mensageiro" ou "mRNA" designao RNA que não contém introns e que pode ser traduzido em proteína pelacélula. "cDNA" designa DNA que é complementar a um modelo de mRNA esintetizado a partir dele utilizando a enzima transcriptase reversa. O cDNApode ser de fita única ou convertido em forma de fita dupla utilizando ofragmento Klenow de polimerase I de DNA. RNA "com sentido" designatranscrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido em proteína em umacélula ou in vitro. "RNA sem sentido" designa um transcrito de RNA que écomplementar a um mRNA ou transcrito primário alvo, no todo ou em parte, eque bloqueia a expressão de um gen alvo (Patente Norte-Americana n°5.107.065). A complementaridade de um RNA sem sentido pode dar-se comqualquer parte do transcrito genético específico, ou seja, na seqüência não-codificadora 5', seqüência não-codificadora 3', introns ou na seqüênciacodificadora. "RNA funcional" designa RNA sem sentido, RNA de ribozima ououtro RNA que pode não ser traduzido, mas que ainda tenha efeito sobreprocessos celulares. As expressões "complemento" e "complemento reverso"são utilizadas de forma intercambiável no presente com relação a transcritos demRNA e destinam-se a definir o RNA sem sentido da mensagem.

A expressão "ligado operativamente" designa a associação deseqüências de ácido nucleico sobre um fragmento de ácido nucleico isolado, detal forma que a função de um seja regulada pelo outro. Um promotor é ligadooperativamente a uma seqüência codificadora, por exemplo, quando for capazde regular a expressão daquela seqüência codificadora (ou seja, a seqüênciacodificadora encontra-se sob o controle transcricional do promotor). Asseqüências codificadoras podem ser ligadas operativamente a seqüênciasreguladoras em orientação com sentido ou sem sentido. Em outro exemplo, asregiões de RNA complementar de acordo com a presente invenção podem serligadas operativamente, seja direta ou indiretamente, 5' ao mRNA alvo, ou 3' aomRNA alvo, ou no mRNA alvo, ou uma primeira região complementar é 5' eseu complemento é 3' para o mRNA alvo.

As técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecularutilizadas no presente são bem conhecidas na técnica e são descritas de formamais completa em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., MolecularCloning: A Laboratory Manual·, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold SpringHarbor NY (1989). Os métodos de transformação são bem conhecidos dostécnicos no assunto e são descritos abaixo.

"PCR" ou "reação em cadeia de polimerase" é um método desíntese de grandes quantidades de segmentos de DNA específicos e consistede uma série de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, NorwalkCT). Tipicamente, o DNA de fita dupla é desnaturado por calor, os dois primerscomplementares às fronteiras 3' do segmento alvo são combinados sob baixatemperatura e estendidos em seguida em uma temperatura intermediária. Umconjunto destas três etapas consecutivas é denominado "ciclo".

O termo "recombinante" designa uma combinação artificial de doissegmentos de seqüência de outra forma separados, por meio, por exemplo, desíntese química ou da manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicospor meio de técnicas de engenharia genética.

Os termos "plasmídeo", "vetor" e "conjunto" designam umelemento cromossômico adicional que freqüentemente conduz genes que nãofazem parte do metabolismo central da célula e, normalmente, encontram-sena forma de fragmentos de DNA com fita dupla. Esses elementos podem serseqüências de reprodução autônoma, seqüências integrantes de genomas,seqüências de fagos ou nucleotídeos, lineares ou circulares, de um DNA ouRNA de fita simples ou dupla, derivado de qualquer fonte, no qual uma série deseqüências de nucleotídeos foi unida ou recombinada em uma únicaconstrução que é capaz de introduzir um fragmento promotor e seqüência deDNA para um produto genético selecionado junto com uma seqüência nãotraduzida 3' apropriada em uma célula. "Conjunto de transformação" designaum vetor específico que contém um gene exógeno e contém elementosadicionais ao gene exógeno que facilitam a transformação de uma célulahospedeira específica. "Conjunto de expressão" designa um vetor específicoque contém um gene exógeno e que contém elementos adicionais ao geneexógeno que permitem expressão aprimorada daquele gene em um hospedeiroexógeno.

As expressões "construção recombinante", "construção deexpressão", "construção quimérica", "construção" e "construção de DNArecombinante" são utilizadas de forma intercambiável no presente. Umaconstrução recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentosde ácido nucleico, tais como seqüências reguladoras e codificação que não sãoencontradas juntas na natureza. Uma construção recombinante podecompreender, por exemplo, seqüências reguladoras e seqüências decodificação que são derivadas de diferentes fontes ou seqüências reguladorase seqüências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas dispostas de formadiferente da encontrada na natureza. Esta construção pode ser utilizada por siprópria ou pode ser utilizada em conjunto com um vetor. Caso seja empregadoum vetor, a seleção do vetor depende do método a ser utilizado paratransformar as plantas hospedeiras, como é bem conhecido dos técnicos noassunto. Pode ser utilizado, por exemplo, um vetor de plasmídeo. Os técnicosno assunto conhecem bem os elementos genéticos que necessitam estarpresentes sobre o vetor a fim de transformar, selecionar e propagar comsucesso células hospedeiras que compreendem qualquer dos fragmentos deácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção. Os técnicos noassunto também reconhecerão que eventos diferentes e independentes detransformação resultarão em níveis e padrões diferentes de expressão (Joneset al, EMBO J. 4: 2411-2418 (1985); De Almeida et al, Moi Geri. Genetics 218:78-86 (1989)) e, portanto, que diversos eventos devem ser selecionados a fimde obter linhagens que exibam o nível e padrão desejado de expressão. Estaseleção pode ser atingida por meio de análise Southern de DNA, análiseNorthern de expressão de mRNA, análise de imunomanchas de expressão deproteínas ou análise fenotípica, entre outras.

O termo "expressão", da forma utilizada no presente, designa aelaboração de um produto final funcional (tal como um mRNA ou uma proteína(seja precursora ou madura)).

A expressão "conjunto de expressão", da forma utilizada nopresente, indica um fragmento de ácido nucleico discreto para o qual pode sermovido um fragmento ou seqüência de ácido nucleico.

Proteína "madura" indica um polipeptídeo processado após atradução (ou seja, do qual qual(is)quer pré ou pró-peptídeo(s) presente(s) noproduto de tradução primária tenha(m) sido removido(s)). Proteína "precursora"indica o produto primário de tradução de mRNA (ou seja, com pré e pró-peptídeos ainda presentes). Pré e pró-peptídeos podem ser mas não sãoimitados a sinais de localização intracelular.

"Transformação estável" indica a transferência de um fragmentode ácido nucleico para o genoma de um organismo hospedeiro, incluindogenomas nucleares e de organelas, o que resulta em herança geneticamenteestável. Por outro lado, "transformação transitória" indica a transferência de umfragmento de ácido nucleico para o núcleo ou uma organela que contém DNAde um organismo hospedeiro, resultando em expressão genética semintegração nem herança estável. Os organismos hospedeiros que contêm osfragmentos de ácidos nucleicos transformados são denominados organismos"transgênicos".

"Inibição sem sentido" designa a produção de transcritos de RNAsem sentido capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. "Co-supressão"designa a produção de transcritos de RNA com sentido capazes de suprimir aexpressão de genes exógenos ou endógenos idênticos ou substancialmentesimilares (Patente Norte-Americana n° 5.231.020). Construções de co-supressão em plantas foram anteriormente projetadas concentrando-se nasobreexpressão de uma seqüência de ácido nucleico que possui homologiapara um mRNA endógeno, na orientação com sentido, o que resulta naredução de todo o RNA que possui homologia para a seqüência sobreexpressa(Vaucheret et al, Plant J. 16: 651-659 (1998); e Gura1 Nature 404: 804-808(2000)). A eficiência geral deste fenômeno é baixa e a extensão da redução deRNA é amplamente variável. Trabalhos recentes descreveram o uso deestruturas de "grampo de cabelo" que incorporam, no todo ou em parte, umaseqüência de codificação de mRNA em orientação complementar que resultaem potencial estrutura de "circuito de haste" para o RNA expresso (PatenteInternacional PCT n0 WO 99/53050, publicada em 21 de outubro de 1999;Patente PCT n0 WO 02/00904, publicada em três de janeiro de 2002). Issoaumenta a freqüência de co-supressão nas plantas transgênicas recuperadas.Outra variação descreve o uso de seqüências virais de plantas para dirigir asupressão ou "silenciamento" de seqüências de codificação de mRNA próximas(Patente PCT n0 WO 98/36083, publicada em 20 de agosto de 1998). Nenhumdestes dois fenômenos de co-supressão foi elucidado mecanicamente, emboraevidências genéticas tenham começado a desemaranhar esta complexasituação (Elmayan et al (1998), Plant Cell 10: 1747-1757).

O termo "oleaginoso" designa os organismos que tendem aarmazenar a sua fonte de energia na forma de Iipidios (Weete, Fungai LipidBiochemistry, segunda edição, Plenum, 1980). Geralmente, o teor de óleocelular desses microorganismos segue uma curva sigmóide, em que aconcentração de lipídio aumenta até atingir um máximo na fase de crescimentologarítmico posterior ou estacionário inicial e, em seguida, é gradualmentereduzida durante as fases estacionária posterior e de morte (Yongmanitchai eWard, Appl. Environ. Microbioi 57: 419-25 (1991)).

A expressão "levedura oleaginosa" designa os microorganismosclassificados como leveduras que fabricam óleo. Não é incomum quemicroorganismos oleaginosos acumulem mais de cerca de 25% do seu peso decélulas secas na forma de óleo. Exemplos de leveduras oleaginosas incluem,mas não se limitam de nenhuma forma aos gêneros a seguir: Yarrowia,Candida1 Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon eLipomyces.

O "método Clustal V de alinhamento" corresponde ao método dealinhamento marcado Clustal V (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989)) e encontrado no programa MegAlign® da suíte de computaçãobioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison Wl). Os "parâmetrospadrão" são os parâmetros previamente definidos pelos fabricantes doprograma. Para alinhamentos múltiplos, eles correspondem a PENALIDADEDO INTERVALO = 10 e PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO =10; e, para alinhamentos em pares, são COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1,PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5. Após o alinhamentodas seqüências utilizando o programa Clustal V, é possível obter um"percentual de identidade" observando-se a tabela "distâncias de seqüências"no mesmo programa.

"Método de alinhamento BLASTN" é um algoritmo fornecido peloCentro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI) para compararseqüências de nucleotídeos utilizando parâmetros padrão.

"Prole" compreende qualquer geração subseqüente de umaplanta.

A presente invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado quecompreende:

(a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo que possui atividade delta-8 dessaturase, em que o polipeptíeopossui pelo menos 80% de identidade de aminoácidos, com base no métodode alinhamento Clustal V, em comparação com uma seqüência de aminoácidosconforme descrito em SEQ ID N0 16;

(b) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo que possui atividade delta-8 dessaturase, em que a seqüência denucleotídeos possui pelo menos 90% de identidade de seqüências, com baseno método BLASTN de alinhamento, em comparação com uma seqüência denucleotídeos conforme descrito em SEQ ID N0 15; ou

(c) um complemento da seqüência de nucleotídeos de (a) ou(b), em que o complemento e a seqüência de nucleotídeos consistem damesma quantidade de nucleotídeos e são 100% complementares.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a umpolinucleotídeo isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos quecodifica um polipeptídeo que possui atividade delta-8 dessaturase, em que aseqüência de nucleotídeos possui pelo menos 80% de identidade deseqüências, com base no método de alinhamento BLASTN, em comparaçãocom uma seqüência de nucleotídeos conforme descrito em SEQ ID N0 15.

Concluiu-se que uma comparação de SEQ ID N0 15 e SEQ ID N057, utilizando o método de alinhamento BLASTN com parâmetros padrão,demonstrou que essas seqüências apresentaram pelo menos 86% deidentidade de seqüências.

Esta delta-8 dessaturase pode ser utilizada isoladamente ou emcombinação com outros componentes de dessaturase e elongase para produzirdiversos PUFAs ômega 6 e ômega 3, incluindo, por exemplo, DGLA, ETA, AA1EPA, DPA e/ou DHA (Fig. 12). Os técnicos no assunto reconhecerão ascombinações apropriadas da delta-8 dessaturase de acordo com a presenteinvenção em conjunto com uma delta-4 dessaturase, delta-5 dessaturase,delta-6 dessaturase, delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17dessaturase, delta-9 dessaturase, delta-8 dessaturase, delta-9 elongase,elongase C14/16, elongase C16/18, elongase C18/20 e/ou elongase C20/22, com basena célula hospedeira específica (e seu perfil de PUFA e/ou perfil dedessaturase e/ou elongase), na disponibilidade de substrato e no(s) produto(s)final(is) desejado(s).

Às vezes, pode ser desejável minimizar os subprodutos ácidosgraxos. A abundância relativa de subprodutos ácidos graxos poderá serreduzida por meio do aumento da atividade total de delta-8 dessaturase. Umaabordagem para minimizar os subprodutos ácidos graxos seria expressar maisde uma delta-8 dessaturase (ou seja, delta-8 dessaturase idêntica oudiferente). A presença de ácido ciadônico (SCI) e/ou ácido juniperônico (JUP),comumente encontrados nos lipídios de sementes de gimnospermas (Wolff etal, Lipids 35 (1): 1-22 (2000)), tais como os da família Pinaceae (pinheiro), porexemplo, poderá ser considerada como sbuprodutos ácidos graxos de umprocesso de delta-6 dessaturase ou delta-9 elongase. Embora se considereque esses ácidos graxos possuam diversas propriedades de melhoria da saúde(Nakane et al, Biol. Pharm. Buli. 23: 758-761 (2000)), a sua presença comosubprodutos ácidos graxos em um processo de PUFA elaborado, tal como emuma safra de oleaginosa, pode não ser desejável, dependendo da aplicação.

Em uma outra realização, a presente invenção refere-se a umaconstrução recombinante que compreende o polinucleotídeo de acordo com apresente invenção ligado operativamente a pelo menos uma seqüência reguladora.

Como se observou acima, um promotor é uma seqüência de DNAque dirige maquinaria celular de uma planta para produzir RNA a partir daseqüência de codificação contígua abaixo no fluxo (3') do promotor. A regiãopromotora influencia a velocidade, o estágio de desenvolvimento e o tipocelular no qual é elaborado o transcrito de RNA do gene. O transcrito de RNA éprocessado para produzir mRNA que serve de modelo para tradução daseqüência de RNA na seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Aseqüência líder não traduzida 5' é uma região do mRNA acima no fluxo daregião de codificação de proteína que pode desempenhar um papel no início ena tradução do mRNA. O sinal de poliadenilação/término de transcrição 3' éuma região não traduzida abaixo no fluxo da região de codificação de proteínaque funciona na célula vegetal para causar o término do transcrito de RNA e aadição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do RNA.

A origem do promotor selecionado para dirigir a expressão daseqüência de codificação não é importante, desde que ele possua atividade detranscrição suficiente para realizar a presente invenção por meio da expressãode mRNA traduzível para os fragmentos de ácidos nucleicos desejados notecido hospedeiro desejado no momento certo. Promotores heterólogos ou nãoheterólogos (ou seja, endógenos) podem ser utilizados para a prática dapresente invenção. Promotores apropriados incluem, por exemplo, mas semlimitar-se a: subunidade primária alfa de promotor beta conglicinina, promotorde inibidor 3 de tripsina Kunitz, promotor de anexina, promotor Gly1,subunidade beta de promotor de beta-conglicinina, promotor de P34/Gly Bd m30K, promotor de albumina, promotor de Leg A1 e promotor de Leg A2.

O promotor de anexina, ou P34, é descrito na Patente PCT n0 WO2004/071178 (publicada em 26 de agosto de 2004). O nível de atividade dopromotor de anexina é comparável com o de muitos promotores fortesconhecidos, tais como: (1) o promotor de CaMV 35S (Atanassova et al, PlaritMol. Biol. 37: 275-285 (1998); Battraw e Hall, Plant Mol. Bioi 15: 527-538(1990); Holtorf et al, Plant Moi Biol. 29: 637-646 (1995); Jefferson et al, EMBOJ. 6: 3901-3907 (1987); Wilmink et al, Plant Moi Biol. 28: 949-955 (1995)); (2)os promotores de oleosina de Arabidopsis (Plant et al, Plant Mol. Biol. 25: 193-205 (1994); Li, tese de Ph.D na Universidade A&M do Texas, págs. 107-128(1997)); (3) os promotores de proteínas de extensão de ubiquitina deArabidopsis (Callis et al, J. Biol. Chem. 265 (21): 12486-93 (1990)); (4) umpromotor de gene de ubiquitina de tomate (Rollfinke et al, Gene 211 (2): 267-76(1998)); (5) um promotor de proteína de choque de calor de soja (Schoffl et al,Moi Geri. Genet 217 (2-3): 246-53 (1989)); e (6) um promotor de gene dehistona H3 de milho (Atanassova et al, Plant Moi Biol. 37 (2): 275-85 (1989)).

Uma outra característica útil do promotor de anexina é o seu perfilde expressão em sementes em desenvolvimento. O promotor de anexina émais ativo em sementes em desenvolvimento em estágios precoces (antes dedez dias após a polinizáção) e é em grande parte inativo nos estágiosposteriores. O perfil de expressão do promotor de anexina é diferente demuitos promotores específicos de sementes, tais como promotores deproteínas de armazenagem de sementes, que freqüentemente proporcionamatividade mais alta em estágios posteriores de desenvolvimento (Chen et al,Dev. Genet. 10: 112-122 (1989); Ellestrom et al, PIantMoi Bioi 32: 1019-1027(1996); Keddie et al, Plant Mol. Bioi 24: 327-340 (1994); Plant et al (acima); Li(acima)). O promotor de anexina possui um perfil de expressão maisconvencional, mas permanece distinto de outros promotores específicos desementes conhecidos. Desta forma, o promotor de anexina será um candidatomuito atraente quando se desejar a sobreexpressão ou a supressão de umgene em embriões em um estágio de desenvolvimento inicial. Pode serdesejável, por exemplo, sobreexpressar um gene regulando-se odesenvolvimento de embriões inicial ou um gene envolvido no metabolismoantes do amadurecimento das sementes.

Após a identificação de um promotor apropriado para a expressãode uma seqüência de codificação específica, o promotor é ligadooperativamente em seguida em orientação com sentido utilizando meiosconvencionais bem conhecidos dos técnicos no assunto.

Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrãoutilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos maiscompletamente em Sambrook, J. et ai, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, segunda edição; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold SpringHarbor1 Nova Iorque, 1989 (a seguir, "Sambrook et al, 1989") ou Ausubel1 F.M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. eStruhl, K., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,Nova Iorque, 1990 (a seguir, "Ausubel et al, 1990").

Após a elaboração da construção recombinante, ela pode serintroduzida em seguida em uma célula de planta selecionada por meio demétodos bem conhecidos dos técnicos comuns no assunto (tais comotransfecção, transformação e eletroporação). Células vegetais de oleaginosassão as células vegetais preferidas. A célula vegetal transformada é cultivadaem seguida e regenerada sob condições apropriadas, permitindo a expressãodo PUFA de cadeia longa que é recuperado opcionalmente em seguida epurificado.

As construções recombinantes de acordo com a presenteinvenção podem ser introduzidas em uma célula vegetal; ou, alternativamente,cada construção pode ser introduzida em células vegetais separadas.

A expressão em uma célula vegetal pode ser realizada de formatransitória ou estável, conforme descrito acima.

Os PUFAs de cadeia longa desejados podem ser expressos emsementes. Também se encontram dentro do escopo da presente invençãosementes ou partes de plantas obtidas a partir dessas plantas transformadas.

As partes de plantas incluem tecidos diferenciados e nãodiferenciados, que incluem, mas sem limitar-se aos seguintes: raízes, hastes,brotos, folhas, pólen, sementes, tecidos de tumores e várias formas de célulase cultivo (tais como células isoladas, protoplastas, embriões e tecido de calo).O tecido vegetal pode estar em uma planta ou órgão, tecido ou cultivo celularde planta.A expressão "órgão de planta" designa um tecido de planta ougrupo de tecidos que constituem uma parte morfológica e funcionalmentedistinta de uma planta. O termo "genoma" designa o seguinte: (1) ocomplemento completo de material genético (genes e seqüências nãocodificadoras) está presente em cada célula de um organismo, vírus ouorganela; (2) um conjunto completo de cromossomos herdados na forma deunidade (haplóide) de um progenitor.

Desta forma, a presente invenção também se refere a um métodode transformação de células, que compreende a transformação de uma célulacom a construção recombinante de acordo com a presente invenção e seleçãodas células transformadas com a construção recombinante de acordo com areivindicação 5.

Também é de interesse um método de produção de uma plantatransformada que compreende a transformação de uma célula vegetal com opolinucleotídeo de acordo com a presente invenção e regeneração de plantas apartir da célula vegetal transformada.

Métodos de transformação de dicotiledôneas (utilizandoprincipalmente Agrobacterium tumefaciens) e obtenção de plantas transgênicasforam publicados, dentre outros, para: algodão (Patente Norte-Americana n°5.004.863); Patente Norte-Americana n° 5.159,135); soja (Patente Norte-Americana n° 5.569.834; Patente Norte-Americana n° 5.416.011); Brassica(Patente Norte-Americana n° 5.463.174); amendoim (Cheng et al, Plant CellRep. 15: 653-657 (1996); McKentIy et al, Plant Cell Rep. 14: 699-703 (1995));mamão (Ling, K. et al, Bio/Technology 9: 752-758 (1991)); e ervilha (Grant et al,Plant Cell Rep. 15: 254-258 (1995)). Para análise de outros métodoscomumente utilizados de transformação vegetal, vide Newell, C. A. (Mol.Biotechnol. 16: 53-65 (2000)). Um destes métodos de transformação utilizaAgrobacterium rhizogenes (Tepfler, M. e Casse-Delbart, F., Microbiol. Sei. 4:24-28 (1987)). Transformação de soja utilizando fornecimento direto de DNA foipublicada utilizando fusão de PEG (Patente PCT n0 WO 92/17598),eletroporação (Chowrira, G. M. et al, Moi Biotechnol. 3: 17-23 (1995); Christou,P. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 84: 3962-3966 (1987)), microinjeção oubombardeamento de partículas (McCabe, D. E. et al, Bio/Technology 6: 923(1988); Christou et al, PlantPhysiol. 87: 671-674 (1988)).

Existe uma série de métodos de regeneração de plantas a partirde tecido vegetal. O método de regeneração específico dependerá do tecidovegetal inicial e da espécie de planta específica a ser regenerada. Aregeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas a partir de transformadoresde protoplasta vegetal isolados ou de vários explantes transformados é bemconhecida na técnica (Weissbach e Weissbach, Methods for Plant MolecularBiology (Eds.), Academic: San Diego CA (1988)). Este processo deregeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de célulastransformadas e cultivo das células individualizadas ao longo dos estágioshabituais de desenvolvimento embriônico ao longo do estágio de plantículaenraizada. Embriões e sementes transgênicas são regenerados de formasimilar. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são plantados emseguida em um meio de crescimento vegetal apropriado, tal como solo.Preferencialmente, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecerplantas transgênicas homozigóticas. Caso contrário, o pólen obtido das plantasregeneradas é cruzado com plantas cultivadas com sementes de linhagensagronomicamente importantes. Por outro lado, o pólen de plantas destaslinhagens importantes é utilizado para polinizar plantas regeneradas. Umaplanta transgênica de acordo com a presente invenção que contém umpolipeptídeo desejado é cultivada utilizando métodos bem conhecidos dostécnicos no assunto.

Além dos procedimentos discutidos acima, os técnicos no assuntosão familiares com os materiais de recurso padrão que descrevem condições eprocedimentos específicos de construção, manipulação e isolamento demacromoléculas (tais como moléculas de DNA1 plasmídeos etc.), geração defragmentos de DNA recombinantes, construções de expressão recombinantese seleção e isolamento de clones. Vide, por exemplo, Sambrook et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: Nova Iorque(1989); Maliga et al, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor:Nova Iorque (1995); Birren et al, Genome Analysis: Detecting Genes, Vol. 1,Cold Spring Harbor: Nova Iorque (1998); Birren et al, Genome Analysis:Analyzing DNA, vol. 2, Cold Spring Harbor: Nova Iorque (1988); Plant MolecularBiology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: Nova Iorque (1997).

Exemplos de plantas oleaginosas incluem, mas sem limitar-se asoja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão, Iinho e açafrão.

Exemplos de ácidos graxos poliinsaturados que contêm pelomenos vinte átomos de carbono e cinco ou mais uniões duplas carbono-carbono incluem, mas sem limitar-se a ácidos graxos ômega 3 tais como EPA1DPA e DHA. Sementes obtidas dessas plantas também se encontram dentrodo escopo da presente invenção, bem como o óleo obtido dessas sementes.

Em uma realização, a presente invenção refere-se a uma plantaoleaginosa que compreende: a) uma primeira construção de DNArecombinante que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica umpolipeptídeo delta-8 dessaturase, ligado operativamente a pelo menos umaseqüência reguladora; e b) pelo menos uma construção de DNA recombinanteadicional que compreende um polinucleotídeo isolado, ligado operativamente apelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeoselecionado a partir do grupo que consiste de delta-4 dessaturase, delta-5dessaturase, delta-6 dessaturase, delta-8 dessaturase, delta-9 dessaturase,delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17 dessaturase, delta-9elongase, elongase C14/16, elongase C16/18, elongase C18/20 e elongase C20/22·

Essas dessaturases são discutidas, por exemplo, nas PatentesNorte-Americanas n° 6.075.183, 5.968.809, 6.136.574, 5.972.664, 6.051.754,6.410.288 e nas Patentes PCT n0 WO 98/46763, WO 98/46764, WO 00/12720e WO 00/40705.

A seleção de combinação de conjuntos utilizados depende, emparte, do perfil de PUFA e/ou perfil de dessaturase/elongase das células deplantas oleaginosas a serem transformadas e do PUFA de cadeia longa quedeve ser expressado. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de

fabricação de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa em uma célulavegetal que compreende:

(a) transformação de uma célula com a construçãorecombinante de acordo com a presente invenção; e (b) seleção das células transformadas que fabricam ácidos

graxos poliinsaturados de cadeia longa.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo de produção de pelo menos um ácido graxo poliinsaturado em umacélula de soja que compreende: (a) transformação de uma célula de soja com uma primeira

construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isoladoque codifica um polipeptídeo delta-8 dessaturase, ligado operativamente a pelomenos uma seqüência reguladora e pelo menos uma construção de DNArecombinante adicional que compreende um polinucleotídeo isolado, ligadooperativamente a pelo menos uma seqüência reguladora, que codifica umpolipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de uma delta-4dessaturase, delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase, delta-8 dessaturase,delta-9 dessaturase, delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17dessaturase, delta-9 elongase, elongase Cune, elongase Cie/ie. elongase C18/20e elongase C20/22;

(b) regeneração de uma planta de soja a partir da célulatransformada da etapa (a); e

(c) seleção das sementes obtidas das plantas da etapa (b) quepossuem um nível alterado de ácidos graxos poliinsaturados em comparaçãocom o nível em sementes obtidas a partir de uma planta de soja nãotransformada.

Métodos de isolamento de óleos de semente são bem conhecidosna técnica (Young et al, Processing of Fats and Oils, The Lipid Handbook,Gunstone et al, Eds., Capítulo 5, págs. 253-257; Chapman & Hall, Londres(1994)). Óleo de soja é produzido, por exemplo, utilizando uma série de etapasque envolvem a extração e purificação de um produto óleo comestível dasemente que contém óleo. Óleos de soja e subprodutos de soja são produzidosutilizando as etapas generalizadas exibidas na Tabela 3.

Tabela 3

Etapas Generalizadas da Produção de Óleo de Soja ε Subprodutos

<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table> Mais especificamente, as sementes de soja são limpas,temperadas, descascadas e transformadas em flocos, de forma a aumentar aeficiência da extração de óleo. A extração de óleo normalmente é realizada pormeio de extração com solvente (tal como hexano), mas pode também seratingida por uma combinação de pressão física e/ou extração com solvente. Oóleo resultante é denominado óleo bruto. O óleo bruto pode ser desengomadopor meio de hidratação de fosfolipídios e outros complexos de Iipidios polares eneutros que facilitam a sua separação da fração de triglicérides não hidratante(óleo de soja). As gomas de Iecitina resultantes podem ser adicionalmenteprocessadas para elaborar produtos de Iecitina comercialmente importantesutilizados em uma série de produtos alimentícios e industriais como agentes deemulsificação e liberação (ou seja, antiadesivos). Óleo desengomado pode seradicionalmente refinado para a remoção de impurezas (principalmente ácidosgraxos livres, pigmentos e gomas residuais). O refino é realizado por meio daadição de um agente cáustico que reage com ácido graxo livre para formarsabão e hidratos fosfatídeos e proteínas no óleo bruto. Utiliza-se água paralavar traços de sabão formados durante o refino. O subproduto de estoque desabão pode ser utilizado diretamente em alimentos animais ou acidulado pararecuperar os ácidos graxos livres. A cor é removida por meio de adsorção comuma terra Iixiviadora que remove a maior parte da clorofila e dos compostos decarotenóide. O óleo refinado pode ser hidrogenado, de forma a resultar emgorduras com várias propriedades de fusão e texturas. Pode-se utilizarwinterização (fracionamento) para remover estearina do óleo hidrogenado pormeio de cristalização sob condições de resfriamento cuidadosamentecontroladas. A desodorização (principalmente por meio de destilação a vapor avácuo) é a última etapa e é projetada para remover compostos queproporcionem odor ou sabor ao óleo. Outros subprodutos valiosos tais comotocoferóis e esteróis podem ser removidos durante o processo dedesodorização. Destilado desodorizado que contém esses subprodutos podeser vendido para a produção de vitamina E natural e outros produtosfarmacêuticos com alto valor. Gorduras e óleos refinados, Iixiviados(hidrogenados, fracionados) e desodorizados podem ser embalados e vendidosdiretamente ou adicionalmente processados em produtos mais especializados.

Uma referência mais detalhada ao processamento de sementes de soja,produção de óleo de soja e utilização de subprodutos pode ser encontrada emErickson, Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization, TheAmerican Oil Chemists' Society e United Soybean Board (1995).

Óleo de soja é líquido à temperatura ambiente porque possui teorrelativamente baixo de ácidos graxos saturados em comparação com óleos taiscomo coco, palma, semente de palma e manteiga de cacau. Muitas gordurasprocessadas (incluindo espalhantes, gorduras de confeitaria, manteigas duras,margarinas, coberturas de cozimento etc.) necessitam de vários graus desolidez à temperatura ambiente e somente podem ser produzidas a partir deóleo de soja por meio de alteração das suas propriedades físicas. Isso é maiscomumente atingido por meio de hidrogenação catalítica.

A hidrogenação é uma reação química na qual adiciona-sehidrogênio às uniões duplas de ácido graxo insaturado com o auxílio de umcatalisador tal como níquel. Óleo de soja com alto teor oleico contém ácidosgraxos linolênico, LA e oleico insaturado e cada um deles pode serhidrogenado. A hidrogenação possui dois efeitos primários. Em primeiro lugar,a estabilidade oxidativa do óleo aumenta como resultado da redução do teor deácido graxo insaturado. Em segundo lugar, as propriedades físicas do óleo sãoalteradas porque as modificações de ácidos graxos aumentam o ponto de fusão, oque resulta em uma gordura sólida ou semi-líquida à temperatura ambiente.

Existem muitas variáveis que afetam a reação de hidrogenação, oque, por sua vez, altera a composição do produto final. As condições deoperação, que incluem pressão, temperatura, tipo e concentração decatalisador, agitação e projeto de reator encontram-se entre os parâmetrosmais importantes que podem ser controlados. Condições de hidrogenaçãoseletiva podem ser utilizadas para hidrogenar os ácidos graxos maisinsaturados em preferência aos menos insaturados. Freqüentemente seemprega hidrogenação muito leve ou de escova para aumentar a estabilidadede óleos líquidos. Hidrogenação adicional converte um óleo líquido em umagordura fisicamente sólida. O grau de hidrogenação depende dasfinal específico. Coberturas líquidas (utilizadas na fabricação de produtos decozimento, gorduras sólidas e coberturas utilizadas para operações de fritura etorração comerciais) e estoques base para a fabricação de margarinaencontram-se entre a série de possíveis produtos de óleo e gordura atingidospor meio de hidrogenação. Uma descrição mais detalhada de hidrogenação eprodutos hidrogenados pode ser encontrada em Patterson, Η. B. W.,Hydrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice, The American OilChemists' Society (1994).

Óleos hidrogenados também se tornaram controversos devido àpresença de isômeros de ácidos graxos trans que resultam do processo dehidrogenação. A ingestão de grandes quantidades de isômeros trans foirelacionada com efeitos prejudiciais à saúde que incluem razões mais altasentre lipoproteínas de baixa densidade e alta densidade no plasma do sanguee aumento do risco de doenças cardíacas coronarianas.Em comparação com outros óleos vegetais, acredita-se que osóleos de acordo com a presente invenção funcionem de forma similar a outrosóleos em aplicações alimentícias do ponto de vista físico. Óleosparcialmente hidrogenados, tais como óleo de soja, são amplamenteutilizados como ingredientes para espalhantes moles, margarina ecoberturas para cozimento e fritura.

Geralmente, o acúmulo de lipídios em microorganismosoleaginosos é acionado em resposta à razão geral entre carbono e nitrogêniopresente no meio de crescimento. Este processo, que gera a síntese de novopalmitato livre (16:0) em microorganismos oleaginosos, é descrito em detalhesna Patente PCT n° WO 2004/101757. Palmitato é o precursor de derivados deácidos graxos saturados e insaturados de cadeia mais longa, que são formadospor meio da ação de elongases e dessaturases. Palmitato, por exemplo, éconvertido no seu derivado insaturado (ácido palmitoleico (16:1)) por meio daação de uma delta-9 dessaturase. De forma similar, palmitato é alongado poruma elongase de ácido graxo Ci6/18 para formar ácido esteárico (18:0), quepode ser convertido no seu derivado instaurado por uma delta-9 dessaturasepara, desta forma, gerar ácido oleico (18:1).

Triacilgliceróis (a unidade de armazenagem primária para ácidosgraxos) são formados por meio da esterificação de duas moléculas de acil-CoAem 3-fosfato de glicerol para gerar fosfato de 1,2-diacilglicerol (comumenteidentificado como ácido fosfatídico). O fosfato é removido em seguida, por meiode fosfatase de ácido fosfatídico, para gerar 1,2-diacilglicerol. Triacilglicerol éformado mediante a adição de um terceiro ácido graxo por meio da ação deuma diacilglicerol-acil transferase.

Muitos microorganismos, incluindo algas, bactérias, fungos eleveduras, podem sintetizar PUFAs e ácidos graxos ômega no transcursonormal de metabolismo celular. São particularmente bem estudados os fungosque incluem Schizochytrium aggregatum, espécies do gênero Thraustochytriume Morteriella alpina. Além disso, muitos dinoflagelados (Dinophyceaae)produzem naturalmente altas concentrações de PUFAs. Desta forma,identificou-se uma série de genes envolvidos na produção de óleo por meiosgenéticos e as seqüências de DNA de alguns desses genes são disponíveis aopúblico. Vide, por exemplo, AY131238, Y055118, AY055117, AF296076,AF007561, L11421, NM_031344, AF465283, AF465281, AF110510,AF465282, AF419296, AB052086, AJ250735, AF126799, AF126798 (delta-6dessaturases); AF199596, AF226273, AF320509, AB072976, AF489588,AJ510244, AF419297, AF07879, AF067654, AB022097 (delta-5 dessaturases),AAG36933, AF110509, AB020033, AAL13300, AF417244, AF161219,AY332747, AAG36933, AF110509, X86736, AF240777, AB007640, AB075526,AP002063 (delta-12 dessaturases); NP_441622, BAA18302, BAA02924,AAL36934 (delta-15 dessaturases); AF338466, AF438199, E11368, E11367,D83185, U90417, AF085500, AY504633, NM_069854, AF230693 (delta-9dessaturases), AF390174 (delta-9 elongase), AF139720 e CQ831420 (delta-8dessaturase); e AX464731, NM_119617, NM_134255, NM_134383,NM_134382, NM_068396, NM_068392, NM_070713, NM_068746,NM 064685 (elongases).

Além disso, a literatura de patentes fornece muitas seqüências deDNA de genes adicionais (e/ou detalhes referentes a vários dos genes acima eseus métodos de isolamento) envolvidos na produção de PUFA (tais comoPatente PCT n0 WO 02/077213 (delta-9 elongases); Patente PCT n0 WO00/34439, WO 04/057001 e Patente Norte-Americana n° 6.825.017 (delta-8dessaturases); Patente Norte-Americana n° 5.968.809 (delta-6 dessaturases);Patente Norte-Americana n° 5.972.664 e Patente Norte-Americana n°6.075.183 (delta-5 dessaturases); Patente PCT n0 WO 94/11516, PatenteNorte-Americana n° 5.443.974, Patente PCT n0 WO 03/099216 e Patente PCTn0 WO 05/047485 (delta-12 dessaturases); Patente PCT n0 WO 93/11245(delta-15 dessaturases); Patente PCT n0 WO 91/13972 e Patente Norte-Americana n° 5.057.419 (delta-9 dessasturases); Publicação Norte-Americanan° 2003/0196217 A1 (delta-17 dessaturase); e Patente PCT n0 WO 00/12720 ePatente PCT n0 WO 2002/077213, Patente Norte-Americana n° 6.403.349,Patente Norte-Amerieana n° 6.677.145 e Publicação Norte-Americana n°2004/0111763 (elongases C14/16. Cie/ie e C18/2o))· Cada uma dessas patentes epedidos é integralmente incorporada ao presente como referência.

Como será óbvio para os técnicos no assunto, as funcionalidadesespecíficas que necessitam ser introduzidas em um organismo hospedeiromicrobiano para a elaboração de um produto final PUFA específico dependerãoda célula hospedeira (e seu perfil de PUFA nativo e/ou perfil dedessaturases/elongase), da disponibilidade do substrato e do(s) produto(s)final(is) desejado(s). LA, GLA, EDA, DGLA1 AA, ALA, STA, ETrA, ETA, EPA,DPA e DHA podem todos ser produzidos em leveduras oleaginosas, por meiode introdução de várias combinações das funcionalidades de enzimas PUFA aseguir: delta-4 dessaturase, delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase, delta-8dessaturase, delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17 dessaturase,delta-9 dessaturase, delta-9 elongase, elongase C14/16> elongase Ci6/18,elongase C18/20 e/ou elongase C20/22· Os técnicos no assunto poderão identificarvários possíveis genes que codificam cada uma das enzimas acima, segundoliteratura disponível ao público (tal como GenBank), literatura de patentes eanálise experimental de microorganismos que possuem a capacidade deprodução de PUFAs. As seqüências podem ser derivadas de qualquer fonte, talcomo isoladas de uma fonte natural (de bactérias, algas, fungos, plantas,animais etc.), produzidas por meio de um processo semi-sintético ousintetizadas novas. Em algumas realizações, a manipulação de genesendógenos para o hospedeiro é preferida; para outros propósitos, é necessáriointroduzir genes heterólogos.

Embora a fonte específica dos genes dessaturase e elongaseintroduzidos no hospedeiro não seja crítica para a presente invenção,considerações para selecionar um polipeptídeo específico que possui atividadede dessaturase ou elongase incluem (1) a especificidade de substrato dopolipeptídeo; (2) se o polipeptídeo ou um de seus componentes é uma enzimalimitadora da velocidade; (3) se a dessaturase ou elongase é essencial para asíntese de um PUFA desejado; e/ou (4) cofatores exigidos pelo polipeptídeo. Opolipeptídeo expresso possui preferencialmente parâmetros compatíveis com oambiente bioquímico da sua localização na célula hospedeira. O polipeptídeopode necessitar, por exemplo, competir por substrato com outras enzimas nacélula hospedeira. Análises da atividade específica e Km do polipeptídeo sãoconsideradas, portanto, na determinação da adequação de um dado polipeptídeopara modificar a produção de PUFA em uma dada célula hospedeira. Opolipeptídeo utilizado em uma célula hospedeira específica é aquele que podefuncionar sob as condições bioquímicas presentes na célula hospedeira pretendidamas, caso contrário, pode ser qualquer polipeptídeo que possui atividade dedessaturase ou elongase capaz de modificar o PUFA desejado.

Em alguns casos, o organismo hospedeiro no qual é desejávelproduzir PUFAs possuirá genes endógenos que codificam algumas enzimas doprocesso biossintético de PUFA. Levedura oleaginosa, por exemplo, podeproduzir tipicamente ácidos graxos 18:2 (e algumas possuem a capacidadeadicional de sintetizar ácidos graxos 18:3); desta forma, levedura oleaginosapossui tipicamente atividade de delta-12 dessaturase nativa e pode tambémpossuir delta-15 dessaturases. Em algumas realizações, portanto, a expressãoda enzima dessaturase nativa é preferida sobre uma enzima heteróloga (ou"exógena") pois (1) a enzima nativa é otimizada para interação com outrasenzimas e proteínas no interior da célula; e (2) é improvável que genesheterólogos compartilhem a mesma preferência de códons no organismohospedeiro. Além disso, incorre-se em vantagens quando a seqüência do genenativo for conhecida, pois isso permite fácil rompimento do gene endógeno pormeio de rompimento dirigido.

Em muitos casos, entretanto, as dessaturases e elongasesapropriadas não estão presentes no organismo hospedeiro selecionado parapermitir a elaboração dos produtos de PUFA desejados. Desta forma, énecessário introduzir genes heterólogos. Em uma realização da presenteinvenção, conduziu-se trabalho com o objetivo de desenvolver uma leveduraoleaginosa que acumula óleos enriquecidos em ácidos graxos ômega 6 e/ouômega 3 de cadeia longa por meio da expressão de um projeto de delta-9elongase/delta-8 dessaturase, para permitir a produção de EDA, DGLA, ARA,ALA, ETrA1 ETA1 EPA, DPA e/ou DHA.

A fim de expressar genes que codificam o processo de delta-9elongase/delta-8 dessaturase para a biossíntese de PUFAs de cadeia longa(tais como AA e EPA) nesses organismos, foi necessário, portanto, (1) identifiaruma delta-9 elongase e delta-8 dessaturase apropriada que funcionasse deforma relativamente eficiente em levedura oleaginosa com base em testes dealimentação de substratos e (2) submeter o gene delta-9 elongase e delta-8dessaturase a métodos de otimização de códons (abaixo) para aumentaradicionalmente a expressão das enzimas heterólogas no hospedeiro delevedura oleaginosa, de forma a permitir a produção máxima de ácidos graxosômega 3 e ômega 6.

Será óbvio para os técnicos no assunto que os genes heterólogosserão expressos com eficiências variáveis em um hospedeiro alternativo. Destaforma, a produção de PUFA ômega 3 e/ou ômega 6 pode ser otimizada pormeio de seleção de uma dessaturase ou elongase específica cujo nível deexpressão em um hospedeiro heterólogo é preferido com relação à expressãode uma dessaturase ou elongase alternativa no organismo hospedeiro deinteresse. Além disso, pode ser desejável modificar a expressão de enzimas doprocesso biossintético de PUFA específicas para atingir a eficiência deconversão ideal de cada uma, de acordo com a composição de produto PUFAespecífico de interesse. Uma série de métodos de engenharia genética édisponível para otimizar a expressão de uma enzima específica. Dois dessesmétodos incluem a otimização de códons e mutação genética, conformedescrito abaixo. Os genes produzidos, por exemplo, por qualquer desses doismétodos, que possuem atividade(s) de dessaturase e/ou elongase, seriamúteis na presente invenção para a síntese de PUFAs ômega 3 e/ou ômega 6.

Como apreciarão os técnicos no assunto, é freqüentemente útilmodificar uma parte dos códons que codificam um polipeptídeo específico quedeva ser expresso em um hospedeiro exógeno, de tal forma que o polipeptídeomodificado utilize códons que sejam preferidos pelo hospedeiro alternativo. Ouso de códons preferidos de hospedeiros pode aumentar substancialmente aexpressão do gene exógeno que codifica o polipeptídeo.

Geralmente, códons preferidos de hospedeiros podem serdeterminados em uma espécie hospedeira de interesse específicoexaminando-se o uso de códons em proteínas (preferencialmente os expressosem quantidade maior) e determinando-se quais códons são utilizados comfreqüência mais alta. Em seguida, a seqüência de codificação para umpolipeptídeo de interesse que possui atividade de dessaturase ou elongasepode ser sintetizada, no todo ou em parte, utilizando os códons preferidos nasespécies hospedeiras. Todo o DNA (ou partes dele) pode também sersintetizado para remover quaisquer seqüências de desestabilização ou regiõesde estrutura secundária que estariam presentes no mRNA transcrito. Todo oDNA (ou partes dele) pode também ser sintetizado para alterar a composiçãobase para uma de maior preferência na célula hospedeira desejada.Na presente invenção, é desejável modificar uma parte doscódons que codificam o polipeptídeo que possui atividade delta-8 dessaturase,para aumentar a expressão do gene em um organismo hospedeiro que inclui,mas sem limitar-se a uma planta, partes de plantas e/ou levedura oleaginosaYarrowia lipolytica. A seqüência de ácido nucleico do gene nativo (ou seja, adelta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri definida no presente como SEQ ID N014, 15 e 16) é modificada para empregar códons preferidos de hospedeiros.Esta dessaturase do tipo selvagem contém 423 aminoácidos (SEQ ID N0 16);no gene otimizado por códons (SEQ ID N0 57), 166 bp da região de codificaçãode 1272 bp (13,1%), 161 códons são otimizados por códons (38,1%) e o localde início de tradução é modificado.

Os técnicos no assunto apreciarão que a modulação da delta-8dessaturase de Pavlova lutheri, bem como diversas outras delta-8dessaturases heterólogas de fontes variáveis podem ter códons otimizadospara aprimorar a sua expressão em um hospedeiro de levedura oleaginosa(vide, por exemplo, o Exemplo 18 do presente, em que uma delta-8dessaturase otimizada por códons sintética derivada de Pavlova lutheri ^oicriada para expressão em Yarrowia lipolytica). A presente invençãocompreende a seqüência completa do gene otimizado por códons sintéticoconforme relatado na Listagem de Seqüências anexa (SEQ ID N0 57), ocomplemento dessas seqüências completas e partes substanciais dessasseqüências. Além disso, o método de otimização de códons descrito naPatente PCT n0 WO 2004/101753 e descrito no presente para otimização dadelta-8 dessaturase de Pavlova lutheri é igualmente aplicável a outros genesno processo biossintético de ácido graxo ômega 3/ômega 6.

Métodos de síntese de seqüências e reunião de seqüências sãobem estabelecidos na literatura. Mutagênese e seleção in vitro, mutagênesedirigida a locais, PCR à prova de erros (Melnikov et al, Nucleic Acids Research,27 (4): 1056-1062 (fevereiro de 1999)), "comutação de genes" ou outros meiospodem ser empregados, por exemplo, para obter mutações de genesdessaturase ou elongase de ocorrência natural (em que essas mutaçõespodem incluir exclusões, inserções e mutações pontuais, ou suascombinações). Isso permitiria a produção de um polipeptídeo que possuiatividade de dessaturase ou elongase, respectivamente, in vivo comparâmetros físicos e cinéticos mais desejáveis para função na célulahospedeira, tais como meia vida mais longa ou velocidade de produção maisalta de um PUFA desejado. Ou, se desejado, as regiões de um polipeptídeo deinteresse (ou seja, uma dessaturase ou elongase) importante para atividadeenzimática podem ser determinadas por meio de expressão de mutagênese derotina dos polipeptídeos mutantes resultantes e determinação das suasatividades. Uma visão geral desses métodos é descrita na Patente PCT n0 WO2004/101757. Todas essas proteínas mutantes e seqüências de nucleotídeosque os codificam que são derivadas do gene otimizado por códons descrito nopresente encontram-se dentro do escopo da presente invenção.

A produção microbiana de ácidos graxos ômega 3 e/ou ômega 6possui várias vantagens. Por exemplo, (1) muitos micróbios são conhecidoscom composições de óleo muito simplificadas em comparação com os deorganismos superiores, facilitando a purificação de componentes desejados; (2)a produção microbiana não está sujeita a flutuações causadas por variáveisexternas, tais como tempo e fornecimento de alimentos; (3) óleo produzido pormicróbios é substancialmente livre de contaminação por poluentes ambientais;(4) micróbios podem fornecer PUFAs em formas específicas que podempossuir usos específicos; e (5) a produção de óleo por micróbios pode sermanipulada por meio do controle das condições de cultivo, notadamentefornecendo-se substratos específicos para enzimas expressas por micróbios oupela adição de compostos/engenharia genética para suprimir processosbioquímicos indesejados.

Além destas vantagens, a produção de ácidos graxos ômega 3e/ou ômega 6 de micróbios recombinantes fornece a capacidade de alterar operfil de ácidos graxos microbianos de ocorrência natural por meio dofornecimento de novos processos biossintéticos no hospedeiro ou desupressão de processos indesejados, de forma a aumentar os níveis de PUFAsdesejados, ou suas formas conjugadas, e reduzir os níveis de PUFAsindesejados. É possível, por exemplo, modificar a razão entre ácidos graxosômega 3 e ômega 6 produzidos desta forma, produzir exclusivamente ácidosgraxos ômega 3 ou ômega 6, eliminando a produção do ácido graxo ômegaalternativo, ou elaborar a produção de um PUFA específico sem acúmulosignificativo de outros produtos de PUFA acima ou abaixo no fluxo (permitir, porexemplo, a biossíntese de AA, EPA e/ou DHA por meio do processo de delta-9elongase/delta-8 dessaturase, de forma a evitar a síntese de GLA e/ou STA).

Os genes e produtos genéticos descritos no presente podem serelaborados em células hospedeiras microbianas heterólogas, particularmentenas células de leveduras oleaginosas (tais como Yarrowia Iipolytica). Aexpressão em hospedeiros microbianos recombinantes pode ser útil para aprodução de vários intermediários de processos de PUFA ou para a modulaçãode processos de PUFA já existentes no hospedeiro para a síntese de novosprodutos até aqui impossíveis utilizando o hospedeiro.

Sistemas de expressão microbiana e vetores de expressão quecontêm seqüências reguladoras que dirigem expressão de alto nível deproteínas exógenas são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Qualquerdestes poderá ser utilizado para construir genes quiméricos para a produção dequalquer dos produtos genéticos das seqüências de dessaturase e/ou elongasepreferidas. Estes genes quiméricos poderão ser introduzidos em seguida emmicroorganismos apropriados por meio de transformação para fornecerexpressão em alto nível das enzimas codificadas.

Conseqüentemente, espera-se que a introdução de genesquiméricos que codificam um processo biossintético de PUFA1 sob o controledos promotores apropriados, resulte no aumento da produção de ácidos graxosômega 3 e/ou ômega 6. Contempla-se que será útil expressar váriascombinações desses genes dessaturase e elongase de PUFA juntos em ummicroorganismo hospedeiro. Será óbvio para os técnicos no assunto que osgenes específicos incluídos em um ou mais conjuntos de expressãoespecíficos dependerão da célula hospedeira, sua capacidade de sintetizarPUFAs utilizando dessaturases e elongases nativas, disponibilidade desubstrato e produto(s) final(is) desejado(s). Pode ser desejável, por exemplo, aconstrução de um conjunto de expressão que compreende genes quecodificam uma ou mais das atividades enzimáticas a seguir: delta-4dessaturase, delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase, delta-8 dessaturase,delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17 dessaturase, delta-9dessaturase, delta-9 elongase, elongase Cu/16, elongase Ci6/18, elongase C18/20e/ou elongase C20/22· Desta forma, a presente invenção engloba um método deprodução de PUFAs que compreende a exposição de um substrato ácido graxoà(s) enzima(s) de PUFA descrita(s) no presente, de tal forma que o substratoseja convertido no produto ácido graxo desejado. Desta forma, cada gene dePUFA e o produto de enzima correspondente descrito no presente (tal comouma enzima do tipo selvagem, otimizada para códons, sintética e/ou mutanteque possui atividade de dessaturase ou elongase apropriada) pode serutilizado direta ou indiretamente para a produção de PUFAs. Ocorre aprodução direta de PUFAs em que o substrato ácido graxo é convertidodiretamente no produto ácido graxo desejado sem nenhuma etapaintermediária ou intermediários de processo. A produção de AA ocorreria, porexemplo, em uma célula hospedeira que produz ou recebe DGLA, por meio daadição ou introdução na mencionada célula de um conjunto de expressão quefornece atividade delta-5 dessaturase. De forma similar, a expressão da delta-8dessaturase de acordo com a presente invenção permite a síntese direta deEDA e ETrA (quando LA e ALA, respectivamente, são fornecidos comosubstrato). Desta forma, por exemplo, a presente invenção pode englobar ummétodo de produção de EDA ou ETrA, respectivamente, que compreende:

a. fornecimento de um organismo hospedeiro que inclui, massem limitar-se a uma levedura oleaginosa que compreende: (i) um gene quecodifica um polipeptídoe delta-8 dessaturase conforme descrito em SEQ ID N°16 ou SEQ ID N° 57; e (ii) uma fonte de substrato dessaturase que consiste deEDA ou ETrA, respectivamente; e

b. cultivo da levedura da etapa (a) na presença de uma fontede carbono fermentável apropriada, em que o gene que codifica umpolipeptídeo delta-8 dessaturase é expresso e EDA é convertido em DGLA ouETrA é convertido em ETA, respectivamente; e

c. recuperação opcional do DGLA ou ETA, respectivamente,da etapa (b).

Em algumas realizações preferidas, a seqüência de nucleotídeosde um gene que codifica um polipeptídeo delta-8 dessaturase é estabelecidaem SEQ ID N° 57, em que pelo menos 162 códons foram otimizados paraexpressão em Yarrowia.

Por outro lado, diversos genes que codificam o processobiossintético de PUFA podem ser utilizados em combinação, de tal forma queocorra uma série de reações para produzir um PUFA desejado. Conjunto(s) deexpressão que codifica(m) a atividade de delta 9-elongase, delta-8dessaturase, delta-5 dessaturase e delta-17 dessaturase, por exemplo,permitiria(m) que uma célula hospedeira que produz naturalmente LA,produzisse ARA no seu lugar (de tal forma que LA seja convertido em EDA pordelta-9 elongase; EDA pode ser convertido em seguida em DGLA por umadelta-8 dessaturase; DGLA é convertido em seguida em ARA por uma delta-5dessaturase). De forma relativa, a expressão da delta-8 dessaturase de acordocom a presente invenção permite a produção direta/indireta de ETA1 EPA1 DPAe/ou DHA como PUFAs abaixo no fluxo, caso sejam catalisadas reaçõessubseqüentes de dessaturase e alongamento. Em uma realização preferida,em que a célula hospedeira é uma levedura oleaginosa, conjuntos deexpressão que codificam cada uma das enzimas necessárias para abiossíntese de PUFA necessitarão ser introduzidos no organismo, pois PUFAsproduzidos naturalmente nesses organismos são limitados a ácidos graxos18:2 (ou seja, LA) e, menos comumente, ácidos graxos 18:3 (ou seja, ALA).Alternativamente, pode ser necessário alimentação de substratos.

Vetores ou conjuntos de DNA úteis para a transformação decélulas hospedeiras microbianas apropriadas são bem conhecidos na técnica.A seleção específica de seqüências presentes na construção depende dosprodutos de expressão desejados (acima), da natureza da célula hospedeira edos meios propostos de separação de células transformadas contra células nãotransformadas. Tipicamente, entretanto, o vetor ou conjunto contém seqüênciasque dirigem a transcrição e a tradução do(s) gene(s) relevante(s), um marcadorselecionável e seqüências que permitem a reprodução autônoma ou integraçãocromossômica. Vetores apropriados compreendem uma região 5' do gene quecontrola início de transcrição (tal como um promotor) e uma região 3' dofragmento de DNA que controla o término da transcrição (ou seja, um terminal).É de preferência superior quando as duas regiões de controle são derivadas degenes da célula hospedeira transformada, embora deva-se compreender queessas regiões de controle não necessitam ser derivadas dos genes nativospara as espécies específicas selecionadas como hospedeiro de produção.

Promotores ou regiões de controle de início que são úteis paradirigir a expressão de ORFs dessaturase e/ou elongase na célula hospedeiramicrobiana desejada são numerosos e familiares para os técnicos no assunto.Virtualmente qualquer promotor capaz de dirigir a expressão desses genes nacélula hospedeira selecionada é apropriado para a presente invenção. Aexpressão em uma célula hospedeira microbiana pode ser realizada de formatransitória ou estável. A expressão transitória pode ser realizada por meio daindução da atividade de um promotor regulável ligado operativamente ao genede interesse; alternativamente, expressão estável pode ser atingida utilizandoum promotor constitutivo ligado operativamente ao gene de interesse. Quandoa célula hospedeira for uma levedura, por exemplo, são fornecidas regiões detranscrição e tradução funcionais em células de levedura, particularmente daespécie hospedeira. As regiões reguladoras de início de tradução podem serobtidas, por exemplo, a partir de (1) genes no processo glicolítico, tais comoálcool desidrogenase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (Patente PCT n°WO 2005/003310), fosfoglicerato mutase (Patente PCT n0 WO 2005/003310),frutose-bisfosfato aldolase (Patente PCT n0 WO 2005/049805), fosfoglicose-isomerase, fosfoglicerato quinase, glicerol-3-fosfato O-aciltransferase (PatentePCT n0 WO 2006/031937) etc.; ou (2) genes reguláveis tais como fosfataseácida, lactase, metalotioneína, glucoamilase, a proteína fator de alongamentode tradução EF1-a (TEF) (Patente Norte-Americana n° 6.265.185), proteínaribossomal S7 (Patente Norte-Americana n° 6.265.185), proteínas de transportede amônio (Pedido Norte-Americano n° 11/185.301), proteínas de exportaçãoetc. Qualquer uma dentre uma série de seqüências reguladoras pode serutilizada, dependendo se se deseja transcrição constitutiva ou induzida, daeficiência do promotor na expressão do ORF de interesse, da facilidade deconstrução e similares.

Concluiu-se que seqüências de nucleotídeos em volta do códonde início de tradução "ATG" afetam a expressão em células de leveduras. Casoo polipeptídeo desejado seja mal expresso em levedura, as seqüências denucleotídeos de genes exógenos podem ser modificadas para incluir umaseqüência de início de tradução de levedura eficiente para obter expressãogenética ideal. Para expressão em levedura, isso pode ser feito por meio demutagênese dirigida a local de um gene expresso de forma ineficiente por meiode sua fusão em quadro a um gene de levedura endógeno, preferencialmenteum gene altamente expresso. Alternativamente, conforme demonstrado napresente invenção em Yarrowia lipolytica, pode-se determinar a seqüência deinício de tradução de consenso no hospedeiro e elaborar esta seqüência emgenes heterólogos para sua expressão ideal no hospedeiro de interesse.

A região de término pode ser derivada da região 3' do gene doqual foi obtida a região de início ou de um gene diferente. Uma grandequantidade de regiões de término é conhecida e funciona satisfatoriamente emuma série de hospedeiros (quando utilizados em gêneros e espécies idênticose diferentes dos quais foram derivados). A região de término normalmente émais selecionada por questão de conveniência que devido a algumapropriedade específica. Preferencialmente, a região de término é derivada deum gene de levedura, particularmente Saccharomyces, Candida, Yarrowia ouKluyveromyces. As regiões 3' de genes de mamíferos que codificam γ-interferona ea-2 interferona também são conhecidas por funcionarem em levedura. Regiões decontrole de término podem também ser derivadas de vários genes nativos para oshospedeiros preferidos. Opcionalmente, um local de término pode serdesnecessário; é de maior preferência, entretanto, se incluído.

Como sabem os técnicos comuns no assunto, a mera inserção deum gene em um vetor de clonagem não garante que ele seja expresso comsucesso no nível necessário. Em resposta à necessidade de uma altavelocidade de expressão, muitos vetores de expressão especializados foramcriados por meio da manipulação de uma série de elementos genéticosdiferentes que controlam aspectos de transcrição, tradução, estabilidade deproteínas, limitação de oxigênio e secreção da célula hospedeira. Maisespecificamente, algumas das características moleculares que forammanipuladas para controlar a expressão genética incluem: (1) a natureza dasseqüências de término e promotora de transcrição relevantes; (2) a quantidadede cópias do gene clonado e se o gene é contido em plasmídeo ou integradoao genoma da célula hospedeira; (3) a localização celular final da proteínaexógena sintetizada; (4) a eficiência de tradução no organismo hospedeiro e adobra correta da proteína no organismo hospedeiro; (5) a estabilidadeintrínseca do mRNA e da proteína do gene clonado no interior da célulahospedeira; e (6) o uso de códons no gene clonado, de forma que a suafreqüência aproxime-se da freqüência de uso de códons preferida da célulahospedeira. Cada um destes tipos de modificações é englobado na presenteinvenção como um meio de otimização adicional da expressão das enzimas deprocesso biossintético de PUFA.

Após a obtenção do DNA que codifica um polipeptídeodessaturase ou elongase apropriado para expressão em uma leveduraoleaginosa, ele é colocado em um vetor de plasmídeo capaz de reproduçãoautônoma em uma célula hospedeira; ou ele é integrado diretamente aogenoma da célula hospedeira. A integração de conjuntos de expressão podeocorrer aleatoriamente no interior do genoma hospedeiro ou pode ser dirigidautilizando construções que contenham regiões de homologia com o genomahospedeiro suficientes para dirigir recombinação no interior do localhospedeiro. Quando construções forem dirigidas para um local endógeno,todas ou uma parte das regiões reguladoras de tradução e transcrição podemser fornecidas pelo local endógeno.

Um método de expressão de genes em Yarrowia Iipolytica é pormeio de integração de DNA linear no genoma do hospedeiro e integração emdiversos locais no interior do genoma pode ser particularmente útil quando sedesejar expressão de genes em alto nível. Com este propósito, é desejávelidentificar uma seqüência no genoma que esteja presente em diversas cópias.

Schmid-Berger et al (J. Bact. 176 (9): 2477-2482 (1994))descobriram o primeiro elemento similar a retrotransposson Yltl em Yarrowialipolytica. Este retrotransposson é caracterizado pela presença de repetiçõesterminais longas (LTRs; cada qual com cerca de 700 bp de comprimento)denominadas regiões zeta. Yltl e elementos zeta isolados estavam presentesde forma dispersa no interior do genoma em pelo menos 35 cópias por genomae 50 a 60 cópias por genoma, respectivamente; determinou-se que os doiselementos funcionam como locais de recombinação homóloga. Além disso, otrabalho de Juretzek et al (Yeast 18: 97-113 (2001)) demonstrou que aexpressão genética poderia ser dramaticamente aumentada direcionando-seplasmídeos para as regiões repetitivas do genoma de levedura (utilizando DNAlinear com regiões zeta LTR nas duas extremidades), em comparação com aexpressão obtida utilizando transformadores de plasmídeos com baixas cópias.Desta forma, a integração dirigida a zeta pode ser ideal como meio de garantira integração múltipla de DNA de plasmídeo para Yarrowia lipolytica, de forma apermitir a expressão genética em alto nível. Infelizmente, entretanto, nem todasas linhagens de Yarrowia lipolytica possuem regiões zeta (tais como alinhagem identificada como número de acesso ATCC n° 20362). Quando alinhagem for desprovida dessas regiões, também é possível integrar DNA deplasmídeo que compreende conjuntos de expressão em locais alternativos paraatingir o número de cópias desejado para o conjunto de expressão. Locaisalternativos preferidos incluem, por exmeplo, o local Ura3 (Acesso GenBank n°AJ306421), o local de gene Leu2 (Acesso GenBank n° AF260230), o gene Lys5(Acesso GenBank n° M34929), o local de gene Aco2 (Acesso GenBank n°AJ001300), o local de gene Pox3 (Pox3: Acesso GenBank n° XP_503244); ouAco3: Acesso GenBank n° AJ001301), o local de gene delta-12 dessaturase, olocal de gene Lipl (Acesso GenBank n° Z50020) e/ou o local de gene Lip2(Acesso GenBank n° AJ012632).

Convenientemente, o gene Ura3 pode ser utilizado repetidamenteem combinação com seleção de ácido 5-fluoroorótico (monoidrato de ácido 5-fluorouracil-6-carboxílico; "5-FOA") (abaixo), para permitir facilmente aintegração de modificações genéticas no genoma de Yarrowia de forma fácil.

Quando dois ou mais genes forem expressos a partir de vetoresde reprodução separados, é desejável que cada vetor possua um meio deseleção diferente e não deverá ter homologia para as outras construções, paramanter a expressão estável e evitar a nova disposição de elementos entre asconstruções. Seleção criteriosa de regiões reguladoras, meios de seleção emétodo de propagação da construção introduzida pode ser determinadaexperimentalmente, de forma que todos os genes introduzidos sejamexpressos nos níveis necessários para fornecer a síntese dos produtosdesejados.

Construções que compreendem o gene de interesse podem serintroduzidas em uma célula hospedeira por meio de qualquer método padrão.Estes métodos incluem a transformação (tal como transformação de acetato delítio (Methods in Enzymology, 194: 186-187 (1991))), fusão de protoplastas, impactobolístico, eletroporação, microinjeção ou qualquer outro método que introduza ogene de interesse na célula hospedeira. Ensinamentos mais específicos aplicadospara leveduras oleaginosas (ou seja, Yarrowia Iipoiytica) incluem a Patente Norte-Americana n° 4.880.741, Patente Norte-Americana n° 5.071.764 e Chen, D. C. et al(Appl. Microbioi Biotechnoi 48 (2): 232-235 (1997)).

Por conveniência, uma célula hospedeira que tenha sidomanipulada por meio de qualquer método para absorver uma seqüência deDNA (tal como um conjunto de expressão) será denominada "transformada" ou"recombinante" no presente. O hospedeiro transformado conterá pelo menosuma cópia da construção de expressão e pode conter duas ou mais, dependendode se o gene é integrado ao genoma, amplificado ou está presente sobre umelemento extracromossômico que contém diversos números de cópias.

A célula hospedeira transformada pode ser identificada por meiode diversos métodos de seleção, conforme descrito na Patente PCT n0 WO04/101757. Métodos de seleção preferidos para uso no presente são aresistência à canamicina, higromicina e ao amino glicosídeo G418, bem como acapacidade de cultivo sobre meios que não contenham uracil, leucina, lisina,triptofano ou histidina. Em realizações alternativas, 5-FOA é utilizado para aseleção de mutantes Ura de leveduras. O composto é tóxico para células delevedura que possuam um gene URA3 em funcionamento que codifiqueorotidina 5'-monofosfato descarboxilase (OMP descarboxilase); desta forma,com base na sua toxicidade, 5-FOA é especialmente útil para a seleção eidentificação de linhagens de leveduras mutantes Ura" (Bartel, P. L. e Fields, S.,Yeast 2-Hybrid System, Universidade de Oxford: Nova Iorque, vol. 7, págs.109-147, 1997). Mais especificamente, pode-se em primeiro lugar abater ogene Ura3 nativo para produzir uma linhagem que contém um fenótipo de Ura,em que a seleção ocorre com base em resistência de 5-FOA. Em seguida, umconjunto de diversos genes quiméricos e um novo gene Ura3 poderá serintegrado a um local diferente do genoma de Yarrowia, de forma a produziruma nova linhagem que contém um fenótipo de Ura+. Integração subseqüenteproduziria uma nova linhagem de Ura3 (novamente identificada utilizandoseleção de 5-FOA), quando o gene Ura3 for abatido. Desta forma, o gene Ura3(em combinação com seleção de 5-FOA) pode ser utilizado como um marcadorde seleção em diversas rodadas de transformação.

Após a transformação, substratos apropriados para asdessaturases e/ou elongases expressas de forma recombinante (e,opcionalmente, outras enzimas de PUFA que sejam expressas na célulahospedeira) podem ser produzidos pelo hospedeiro naturalmente ou de formatransgênica, ou podem ser fornecidos de forma exógena.

Métodos de manipulação de processos bioquímicos são bemconhecidos dos técnicos no assunto; e espera-se que diversas manipulaçõessejam possíveis para maximizar a biossíntese de ácidos graxos ômega 3 e/ouômega 6 em leveduras oleaginosas e, particularmente, em Yarrowia lipolytica.Isso pode necessitar de elaboração metabólica diretamente no processobiossintético de PUFA ou manipulação adicional de processos que contribuemcom carbono para o processo biossintético de PUFA.

No caso de manipulações no processo biossintético de PUFA1pode ser desejável aumentar a produção de LA para permitir a maior produçãode ácidos graxos ômega 3 e/ou ômega 6. A introdução e/ou amplificação degenes que codificam delta-9 e/ou delta-12 dessaturases pode realizar isso.

Para maximizar a produção de ácidos graxos insaturados deômega 6, os técnicos no assunto sabem bem que a produção é favorecida emum microorganismo hospedeiro que seja substancialmente livre de ALA. Destaforma, preferencialmente, o hospedeiro é selecionado ou obtido por meio daremoção ou inibição da atividade de dessaturase tipo delta 15 ou ômega 3 quepermite a conversão de LA em ALA. A atividade de dessaturase endógenapode ser reduzida ou elminada, por exemplo, por meio de (1) fornecimento deum conjunto de transcrição de seqüências sem sentido para o produto detranscrição de delta-15 dessaturase; (2) rompimento do gene delta-15dessaturase por meio de inserção, substituição e/ou exclusão do gene alvo, notodo ou em parte; ou (3) uso de uma célula hospedeira que possuinaturalmente (ou sofreu mutação para que possua) pouca ou nenhumaatividade de delta-15 dessaturase. A inibição de processos de dessaturaseindesejados pode também ser realizada utilizando inibidores de dessaturaseespecíficos, tais como os descritos na Patente Norte-Americana n° 4.778.630.

Alternativamente, pode ser desejável maximizar a produção deácidos graxos ômega 3 (e minimizar a síntese de ácidos graxos ômega 6).Desta forma, poder-se-ia utilizar um microorganismo hospedeiro em que aatividade de delta-12 dessaturase que permite a conversão de ácido oleico emLA seja removida ou inibida, utilizando qualquer dos meios descritos acima(vide também, por exemplo, a Patente PCT n0 WO 2004/104167, integralmenteincorporada ao presente como referência). Em seguida, conjuntos deexpressão apropriados seriam introduzidos no hospedeiro, junto comsubstratos apropriados (tais como ALA) para conversão em derivados deácidos graxos ômega 3 de ALA (tais como STA, ETrA, ETA, EPA, DPA, DHA).

Além do processo biossintético de PUFA imediato, espera-se quea manipulação de vários outros processos enzimáticos que geram abiossíntese de ácidos graxos precursores possa contribuir com a biossínteselíquida geral de PUFAs específicos. A identificação e a manipulação dessesprocessos relacionados serão úteis no futuro.

Cópias adicionais de genes dessaturase e elongase podem serintroduzidas no hospedeiro para aumentar a emissão de processosbiossintéticos de ácidos graxos ômega 3 e/ou ômega 6. A expressão dos genesdessaturase ou elongase também pode ser aumentada no nível de transcriçãoutilizando um promotor mais forte (seja regulado ou constitutivo) para causarmaior expressão, por meio da remoção/exclusão de seqüênciasdesestabilizantes do mRNA ou da proteína codificada, ou da adição deseqüências estabilizantes ao mRNA (Patente Norte-Americana n° 4.910.141).Ainda outra abordagem para o aumento da expressão dos genes dessaturaseou elongase, conforme demonstrado na presente invenção, é o aumento daeficiência de tradução dos mRNAs codificados por meio de substituição decódons no gene nativo pelos de expressão genética ideal no microorganismohospedeiro selecionado.

Por outro lado, processos bioquímicos que concorrem com osprocessos biossintéticos de ácidos graxos ômega 3 e/ou ômega 6 por energiaou carvão, ou enzimas do processo biossintético de PUFA nativas queinterferem com a elaboração de um produto final de PUFA específico, podemser eliminados por meio de rompimento genético ou regulados para baixo poroutros meios (tais como mRNA sem sentido). Para rompimento genético, umfragmento de DNA exógeno (tipicamente um gene marcador selecionável) éinserido no gene estrutural a ser rompido, a fim de interromper a sua seqüênciade codificação e, desta forma, desativar funcionalmente o gene. Atransformação do conjunto de rompimento na célula hospedeira resulta nasubstituição do gene nativo funcional por meio de recombinação homóloga como gene rompido não funcional (vide, por exemplo, Hamilton et al, J. Bacterioi171: 4617-4622 (1989); Balbas et al, Gene 136: 211-213 (1993); Gueldener etal, Nucleic Acids Res. 24: 2519-2524 (1996); e Smith et al, Methods MoL CeILBioL 5: 270-277 (1996)).

Tecnologia sem sentido é um outro método de regulagem parabaixo de genes quando a seqüência do gene alvo for conhecida. Paraconseguir isso, um segmento de ácido nucleico do gene desejado é clonado eligado operativamente a um promotor, de tal forma que a fita sem sentido deRNA seja transcrita. Esta construção é introduzida em seguida na célulahospedeira e a fita sem sentido de RNA é produzida. RNA sem sentido inibe aexpressão genética evitando o acúmulo de mRNA que codifica a proteína deinteresse. Os técnicos no assunto saberão que considerações especiais sãoassociadas ao uso de tecnologias sem sentido, a fim de reduzir a expressão degenes específicos. O nível adequado de expressão de genes sem sentido podenecessitar do uso de diferentes genes quiméricos, utilizando diferenteselementos reguladores conhecidos dos técnicos no assunto.Embora tecnologia sem sentido e de rompimento genéticodesejada ofereça meios eficazes de regulagem para baixo de genes em que aseqüência é conhecida, foram desenvolvidas outras metodologias menosespecíficas que não são baseadas em seqüências (tais como mutagênese pormeio de agentes químicos/radiação de UV ou uso de elementostransportáveis/transposons; vide a Patente PCT n0 WO 2004/101757).

Dentro do contexto da presente invenção, pode ser útil modular aexpressão do processo biossintético de ácidos graxos por meio de qualquerdos métodos descritos acima. A presente invenção fornece, por exemplo,métodos por meio dos quais genes que codificam enzimas chave nosprocessos biossintéticos são introduzidos em leveduras oleaginosas para aprodução de ácidos graxos ômega 3 e/ou ômega 6. Será particularmente útilexpressar esses genes em leveduras oleaginosas que não contenhamnaturalmente processos biossintéticos de ácidos graxos ômega 3 e/ou ômega 6e coordenem a expressão desses genes, para maximizar a geração deprodutos de PUFA processados utilzando vários meios de elaboraçãometabólica do organismo hospedeiro.

Células hospedeiras microbianas para a produção de ácidosgraxos ômega podem incluir hospedeiros microbianos que crescem sobre umasérie de estoques de alimentação, que incluem carboidratos simples oucomplexos, ácidos graxos, ácidos orgânicos, óleos e alcoóis e/ouhidrocarbonetos ao longo de uma ampla variedade de valores de pH etemperatura.

Hospedeiros microbianos preferidos, entretanto, são levedurasoleaginosas. Estes organismos são naturalmente capazes de síntese eacúmulo de óleos, em que o óleo pode compreender mais de cerca de 25% dopeso seco celular, de maior preferência mais de cerca de 30% do peso secocelular e, de preferência superior, mais de cerca de 40% do peso seco celular.Os gêneros tipicamente identificados como levedura oleaginosa incluem, massem limitar-se a: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium,Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces. Mais especificamente, leveduras quesintetizam óleo ilustrativas incluem: Rhodosporidium toruloides, Lipomycesstarkeyii, L. Iipoferus, Candida revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis,Trichosporon pullans, T. cutaneum, Rhodotorula glutinus, R. graminis eYarrowia Iipolytica (anteriormente classificada como Candida lipolytica).

É de preferência superior a levedura oleaginosa Yarrowialipolytica; e, em uma realização adicional, são de maior preferência aslinhagens de Yarrowia lipolytica designadas como Acesso ATCC n° 20362,8862, 18944, 76982 e/ou LGAM S(7) 1 (Papanikolaou, S. e Aggelis, G.,Bioresour. Technol. 82 (1): 43-9 (2002)).

A célula hospedeira microbiana transformada é cultivada sobcondições que otimizam as atividades de dessaturase e elongase e produzemo maior e mais econômico rendimento das PUFAs preferidas. De forma geral,as condições de meios que podem ser otimizadas incluem o tipo e aquantidade de fonte de carbono, o tipo e a quantidade de fonte de nitrogênio, arazão entre carbono e nitrogênio, a quantidade de íons minerais diferentes, onível de oxigênio, a temperatura de crescimento, pH, duração da fase deprodução de biomassa, duração da fase de acúmulo de óleo e o tempo emétodo de colheita celular. Microorganismos de interesse, tais como leveduraoleaginosa, são cultivados em meios complexos (tais como caldo de dextrose-peptona-extrato de levedura (YPD)) ou um meio mínimo definido que nãocontém um componente necessário para o crescimento e, desta forma, força aseleção dos conjuntos de expressão desejados (tais como base de nitrogêniode levedura (Difco Laboratories, Detroit Ml)).

Os meios de fermentação de acordo com a presente invençãodevem conter uma fonte de carbono apropriada. Fontes de carbonoapropriadas são ensinadas em WO 2004/101757. Embora se contemple que afonte de carbono utilizada na presente invenção pode englobar uma amplavariedade de fontes que contêm carbono, fontes de carbono preferidas sãoaçúcares, glicerol e/ou ácidos graxos. É de preferência superior glicose e/ouácidos graxos que contêm de 10 a 22 carbonos.

Nitrogênio pode ser fornecido a partir de uma fonte inorgânica (talcomo (NH4)2SO4) ou fonte orgânica (tal como uréia ou glutamato). Além defontes de carbono e nitrogênio apropriadas, o meio de fermentação tambémdeve conter minerais apropriados, sais, cofatores, tampões, vitaminas e outroscomponentes conhecidos dos técnicos no assunto apropriados para ocrescimento do microorganismo e promoção dos processos enzimáticosnecessários para a produção de PUFA. Atenção específica é fornecida paravários íons metálicos (tais como Fe+2, Cu+2, Mn+2, Co+2, Zn+2, Mg+2) quepromovem a síntese de lipídios e PUFAs (Nakahara, T. et al, lnd. Appi SingleCell Oils, D. J. Kyle e R. Colin, eds., págs. 61-97 (1992)).

Meios de crescimento preferidos na presente invenção são meiospreparados comercialmente comuns, tais como base de nitrogênio de levedura(Difco Laboratories, Detroit Ml). Outros meios de crescimento sintéticos oudefinidos podem também ser utilizados e o meio apropriado de crescimento domicroorganismo específico será conhecido dos técnicos no assunto demicrobiologia ou ciência da fermentação. Uma faixa de pH apropriada para afermentação é tipicamente de cerca de pH 4,0 a pH 8,0, em que pH 5,5 a pH7,5 é preferida como a faixa para as condições de crescimento iniciais. Afermentação pode ser conduzida sob condições aeróbicas ou anaeróbicas esão preferidas condições microaeróbicas.

Tipicamente, o acúmulo de altos níveis de PUFAs em células deleveduras oleaginosas necessita de um processo de duas etapas, pois oestado metabólico deve ser "equilibrado" entre o crescimento e asíntese/armazenagem de gorduras. Desta forma, de maior preferência, énecessário um processo de fermentação em duas etapas para a produção dePUFAs em levedura oleaginosa. Esta abordagem é descrita na Patente PCT n°WO 2004/101757, bem como vários projetos de processo de fermentaçãoapropriados (ou seja, em bateladas, bateladas alimentadas e contínuos) econsiderações durante o crescimento.

Os PUFAs podem ser encontrados no microorganismo hospedeirona forma de ácidos graxos livres ou em formas esterificadas, tais comoacilgliceróis, fosfolipídios, sulfolipídios ou glicolipídios, e podem ser extraídosda célula hospedeira por uma série de meios bem conhecidos na técnica. Umaanálise de métodos de extração, análise de qualidade e padrões deaceitabilidade para lipídios de levedura é a de Z. Jacobs (Criticai Reviews inBiotechnology 12 (5/6): 463-491 (1992)). Uma rápida análise de processamentoabaixo no fluxo também é disponível por meio de A. Singh e O. Ward (Adv.Appi Microbiol. 45: 271-312 (1997)).

Geralmente, meios de purificação de PUFAs podem incluirextração com solventes orgânicos, sonicação, extração de fluidos supercríticos(utilizando, por exemplo, dióxido de carbono), saponificação e meios físicos taiscomo prensas ou suas combinações. Um refere-se aos ensinamentos daPatente PCT n0 WO 2004/101757 para detalhes adicionais.

O mercado sustenta atualmente uma grande variedade dealimentos e produtos alimentícios, que incorporam ácidos graxos ômega 3 e/ouômega 6 (particularmente ARA, EPA e DHA). Contempla-se que os óleosvegetais de acordo com a presente invenção e os óleos de levedura de acordocom a presente invenção que compreendem PUFAs de cadeia longafuncionarão em alimentos e produtos alimentícios para proporcionar osbenefícios à saúde de formulações atuais. Mais especificamente, os óleos deacordo com a presente invenção que contêm ácidos graxos ômega 3 e/ouômega 6 serão apropriados para uso em uma série de alimentos e produtosalimentícios que incluem, mas sem limitar-se a análogos de alimentos,produtos de carne, produtos de cereais, alimentos cozidos, lanches e produtosalimentícios.

Além disso, os óleos do presente podem ser utilizados emformulações para proporcionar benefícios à saúde em alimentos médicos queincluem produtos nutricionais médicos, suplementos alimentares, fórmulasinfantis bem como produtos farmacêuticos. Os técnicos no assunto deprocessamento de alimentos e formulação de alimentos compreenderão comoa quantidade e a composição dos óleos do presente podem ser adicionadas aosalimentos ou produtos alimentícios. Essa quantidade será indicada no presentecomo quantidade "efetiva" e dependerá do alimento ou produto alimentício, da dietaque o produto pretende suplementar ou da condição média que o alimento médicoou produto nutricional médico destina-se a corrigir ou tratar.

Um "análogo de alimento" é um produto similar a alimentofabricado para relembrar o seu alimento correspondente, seja ele carne, queijo,leite ou similar, e pretende-se que ele possua a aparência, sabor e textura doseu correspondente. Desta forma, o termo "alimento", da forma utilizada nopresente, também engloba análogos de alimentos. Análogos de alimentospodem ser elaborados utilizando processos bem conhecidos dos técnicos noassunto. As Patentes Norte-Americanas n° 6.355.296 B1 e 6.187.367 B1descrevem análogos de carne emulsificados e extensores de carneemulsificados. A Patente Norte-Americana n° 5.206.050 B1 descreve umcoágulo de proteína de soja útil para análogos de alimentos cozidos (ele podetambém ser utilizado como um processo para formar um coágulo útil para afabricação de análogos de alimentos). A Patente Norte-Americana n° 4.284.656de Hwa descreve um caldo de proteína de soja útil para análogos de alimentos.A Patente Norte-Americana n° 3.988.485 de Hibbert et al descreve um alimentode proteína similar a carne formado a partir de fibras de proteína vegetal fiadas.A Patente Norte-Americana n° 3.950.564 de Puski et al descreve um processode fabricação de um substituto de carne com base em soja e a Patente Norte-Americana n° 3.925.566 de Reinhart et al descreve um produto de carnesimulada. Proteína de soja que tenha sido processada para proporcionar umaestrutura, pedaço ou fibra para uso como ingrediente alimentício, por exemplo,é denominada "proteína de soja texturizada" (TSP). TSPs são freqüentementeelaboradas de forma a relembrar a aparência e estrutura de carne, frutos domar ou aves quando hidratadas.

Análogos de alimentos podem ser classificados como imitaçõesou substitutos, dependendo das suas características funcionais e decomposição. Uma imitação de queijo, por exemplo, necessita apenas relembraro queijo que é projetado para substituir. Um produto pode geralmente serdenominado substituto de queijo, por exemplo, somente se for nutricionalmenteequivalente ao queijo que está substituindo e atender às necessidadesmínimas de composição daquele queijo. Desta forma, o queijo substitutofreqüentemente conterá níveis mais altos de proteína que as imitações dequeijo e será fortalecido com vitaminas e sais minerais.

Análogos de leite ou produtos alimentícios não lácteos incluem,mas sem limitar-se a imitações de leite e sobremesas congeladas não lácteas(tais como as fabricadas com grãos de soja e/ou produtos de proteína de soja).

Produtos de carne englobam uma ampla variedade de produtos.Nos Estados Unidos, "carne" inclui "carnes vermelhas" produzidas com bois,porcos e carneiros. Além das carnes vermelhas, existem produtos de aves queincluem frangos, perus, gansos, galinhas d'angola, patos e peixes e frutos domar. Existe uma ampla variedade de produtos de carne processada etemperada: frescos, curados e fritos, curados e cozidos. Lingüiças e salsichassão exemplos de produtos de carne processada. Desta forma, a expressão"produtos de carne", da forma utilizada no presente, inclui, mas sem limitar-se aprodutos de carne processada.

Um produto alimentício de cereal é um produto alimentícioderivado do processamento de grãos de cereal. Um grão de cereal incluiqualquer planta da família das gramíneas que gere grãos comestíveis (cereais).Os grãos mais populares são cevada, milho, milho branco, aveia, quinoa, arroz,centeio, sorgo, triticale, trigo e arroz selvagem. Exemplos de produtosalimentícios de cereais incluem, mas sem limitar-se a grãos inteiros, grãospicados, fragmentos, farinha, farelo, gérmen, cereais matinais, alimentosextrudados, massas e similares.

Um produto alimentício cozido compreende qualquer dos produtosalimentícios de cereais mencionados acima que tenha sido cozido ouprocessado de forma comparável ao cozimento (ou seja, secagem ouendurecimento por meio de submissão ao calor). Exemplos de produtosalimentícios cozidos incluem, mas sem limitar-se a pães, bolos, roscas, barras,massas, migalhas de pão, lanches cozidos, minibiscoitos, minibolachas,minicookies e minipretzels. Conforme mencionado anteriormente, os óleos deacordo com a presente invenção podem ser utilizados como ingredientes.

Um produto de lanche alimentício compreende qualquer dosprodutos alimentícios descritos acima ou abaixo.

Um produto alimentício frito compreende qualquer dos produtosalimentícios descritos acima ou abaixo que tenha sido frito.

A bebida pode apresentar-se em forma líquida ou seca em pó.

Pode-se mencionar, por exemplo, bebidas não carbonatadas taiscomo sucos de frutas, frescos, congelados, enlatados ou concentrados;bebidas de leite integral ou aromatizado etc. Fórmulas nutricionais para adultose bebês são bem conhecidas na técnica e disponíveis comercialmente (taiscomo Similac®, Ensure®, Jevity® e Alimentum® da Divisão de Produtos Ross,Abbott Laboratories).

Fórmulas para bebês são líquidos ou pós reconstituídosadministrados a bebês e crianças jovens. "Fórmula para bebê" é definida nopresente como um produto nutricional enteral que pode ser substituído por leitematerno humano na alimentação de bebês e é tipicamente composto de umpercentual desejado de gordura misturado com percentuais desejados decarboidratos e proteínas em uma solução aquosa (vide, por exemplo, a PatenteNorte-Americana n° 4.670.285). Com base nos estudos mundiais decomposição, bem como em níveis especificados por grupos de especialistas,leite materno humano médio contém cerca de 0,20% a 0,40% de ácidos graxostotais (considerando cerca de 50% de calorias de gordura); e, geralmente, arazão entre DHA e ARA variaria de cerca de 1:1 a 1:2 (vide, por exemplo,formulações de Enfamil LIPIL® (Mead Johnson & Company) e SimilacAdvance® (Divisão de Produtos Ross, Abbott Laboratories)). Fórmulas parabebês possuem um papel especial a desempenhar na alimentação de bebêsporque freqüentemente são a única fonte de nutrientes para bebês; e, emboraa amamentação ainda seja a melhor nutrição para bebês, as fórmulas parabebês são uma alternativa suficientemente próxima para que os bebês nãoapenas sobrevivam, mas também sejam bem nutridos.

Produto lácteo é um produto derivado do leite. Um produtoanálogo do leite ou não lácteo é derivado de uma fonte diferente de leite, talcomo leite de soja, conforme discutido acima. Estes produtos incluem, massem limitar-se a leite integral, leite desnatado, produtos de leite fermentado taiscomo iogurte ou leite azedo, creme de leite, manteiga, leite condensado, leiteem pó, clareador de café, creme de café, sorvete, queijo etc.

Produtos alimentícios adicionais nos quais poderão ser incluídosos óleos que contêm PUFA de cadeia longa de acordo com a presenteinvenção são, por exemplo, chicles, confeitos e congelados, gelatinas e pudins,doces duros e moles, geléias e compotas, açúcar granulado branco, substitutos deaçúcar, molhos doces, coberturas, xaropes e misturas em pó misturadas a seco.

Um produto alimentício saudável é qualquer produto alimentícioque proporcione um benefício à saúde e inclui alimentos funcionais, alimentosmédicos, produtos nutricionais médicos e suplementos alimentares. Alémdisso, os óleos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados emcomposições farmacêuticas padrão (os óleos que contêm PUFA de cadeialonga poderão ser facilmente incorporados, por exemplo, em qualquer um dosprodutos alimentícios mencionados acima, de forma a produzir um alimentomédico ou funcional). Formulações mais concentradas que compreendemARA, EPA ou DHA incluem, por exemplo, cápsulas, pós, pastilhas, géis moles,cápsulas gelatinosas, concentrados líquidos e emulsões que podem serutilizados como suplemento alimentar em seres humanos ou animais diferentesde seres humanos.

Rações animais são genericamente definidas no presente comoprodutos destinados a uso como alimentos ou para mistura em alimentos paraanimais diferentes de seres humanos. Os óleos que contêm PUFA de cadeialonga de acordo com a presente invenção podem ser utilizados comoingredientes em vários alimentos animais. Mais especificamente, embora sem limitações no presente,espera-se que os óleos de acordo com a presente invenção possam serutilizados em produtos de ração para animais domésticos, produtos de raçãopara aves e ruminantes e produtos de ração para aquacultura. Produtos deração para animais domésticos são os produtos destinados a seremadministrados a animais domésticos (tais como cães, gatos, pássaros, répteis eroedores). Estes produtos podem incluir os produtos de cereais e alimentossaudáveis acima, bem como carne e subprodutos de carne, produtos deproteína de soja, grama e produtos de feno (tais como alfafa, capim derebanho, aveia ou capim cevadinha, legumes). Produtos alimentícios para avese ruminantes são aqueles em que o produto se destina a ser fornecido aanimais (tais como perus, frangos, bois e porcos). Como ocorre com as raçõespara animais domésticos acima, estes produtos podem incluir produtos decereais e alimentos saudáveis, produtos de proteína de soja, carne esubprodutos de carne, grama e produtos de feno conforme relacionado acima.Os produtos de ração para aquacultura (ou "alimentos aquáticos") são osprodutos destinados a uso em aquacultura que cuidam da propagação, cultivoou criação de organismos aquáticos e/ou animais em água doce ou salgada.

Exemplos

A presente invenção é adicionalmente definida nos Exemplos aseguir, nos quais as partes e percentuais são em peso e os graus são Celsius,a menos que indicado em contrário. Dever-se-á compreender que estesExemplos, embora indiquem realizações preferidas da presente invenção, sãofornecidos unicamente como forma de ilustração. A partir da discussão acima edestes Exemplos, os técnicos no assunto podem determinar as característicasessenciais da presente invenção e, sem abandonar seu espírito e escopo,podem elaborar várias mudanças e modificações da presente invenção paraadaptá-la a vários usos e condições. Desta forma, diversas modificações dapresente invenção além das exibidas e descritas no presente serão evidentespara os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima. Essasmodificações também se destinam a enquadrar-se dentro do escopo dasreivindicações anexas.

O significado das abreviações é o seguinte: "seg" indicasegundo(s), "min" indica minuto(s), "h" indica hora(s), "d" indica dia(s), "μΙ"indica microlitro(s), "ml" indica mililitro(s), "I" indica litro(s), "μΜ" indicamicromolar, "mM" indica milimolar, "M" indica molar, "mmol" indica milimol(es),'Vmol" indica micromol(es), "g" indica grama(s), '^g" indica micrograma(s), "ng"indica nanograma(s), "U" indica unidade(s), "bp" indica par(es) de bases e "kB"indica quilobase(s).

Transformação ε cultivo de Yarrowia lipolyticaLinhagens de Yarrowia lipolytica com números de acesso ATCC20362, 76982 e 90812 fgoram adquiridas da Coleção Norte-Americana deCultivos de Tipos (Rockville MD). Linhagens de Yarrowia lipolytica foramtipicamente cultivadas a 28 0C sobre agar YPD (1% extrato de levedura, 2%bactopeptona, 2% glicose, 2% agar).

Transformação de Yarrowia lipolytica foi realizada de acordo como método de Chen, D. C. et al (Appl. Microbioi Biotechnol. 48 (2): 232-235(1997)), a menos que indicado em contrário. Resumidamente, Yarrowia foiriscado sobre uma placa YPD e cultivado a 30 °C por cerca de dezoito horas.Vários circuitos grandes de células foram raspados da placa e novamentesuspensos em 1 ml de tampão de transformação que contém: 2,25 ml de 50%PEG, MW médio 3350; 0,125 ml de 2 M acetato de Li, pH 6,0; 0,125 ml de 2 M DTT;e 50 μg de DNA de esperma de salmão cortado. Em seguida, cerca de 500 ng deDNA de plasmídeo Iinearizado foram incubados em 100 μl de células novamentesuspensas e mantidos a 39 °C por uma hora com mistura por turbilhão emintervalos de quinze minutos. As células foram colocadas em placas sobre placasde meios de seleção e mantidas a 30 °C por dois a três dias.

Para seleção de transformadores, foi geralmente utilizado meiomínimo ("MM"); a composição de MM é a seguinte: 0,17% de base de nitrogênio delevedura (Difco Laboratories, Detroit Ml) sem sulfato de amônio ou aminoácidos, 2%glicose, 0,1% prolina, pH 6,1). Foram adicionados suplementos de uracil conformeapropriado até uma concentração final de 0,01% (de forma a produzir meios deseleção de "MMU", preparados com 20 g/l de agar).

Alternativamente, transformadores foram selecionados sobremeios de seleção de ácido 5-fluoroorótico ("FOA", também monoidrato de ácido5-fluorouracil-6-carboxílico), que compreendem: 0,17% de base de nitrogêniode levedura (Difco Laboratories, Detroit Ml) sem sulfato de amônio ouaminoácidos, 2% glicose, 0,1% prolina, 75 mg/l de uracil, 75 mg/l de uridina,900 mg/l de FOA (Zymo Research Corp., Orange CA) e 20 g/l de agar.

Análise de ácidos graxos de Yarrowia lipolytica

Para análise de ácidos graxos, células foram recolhidas por meiode centrifugação e lipídios foram extraídos conforme descrito em Bligh, E. G. eDyer, W. J. (Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917 (1959)). Metil ésteres deácidos graxos foram preparados por meio de transesterificação do extrato delipídios com metóxido de sódio (Roughan, G. e Nishida1 I., Arch. Biochem.Biophys. 276 (1): 38-46 (1990)) e analisados em seguida com um Hewlett-Packard 6890 GC equipado com uma coluna de 30 m χ 0,25 mm (diâmetrointerno) de HP-INNOWAX (Hewlett-Packard). A temperatura do forno foi de 1700C (manutenção por 25 minutos) a 185 0C a 3,5 °C/min.

Para transesterificação de bases diretas, cultivo de Yarrowia (3ml) foi colhido, lavado uma vez em água destilada e seco a vácuo em Speed-Vac por cinco a dez minutos. Adicionou-se metóxido de sódio (100 μΙ de 1%) àamostra e, em seguida, a amostra foi turbilhonada e balançada por vinteminutos. Após a adição de três gotas de 1 M NaCI e 400 μΙ de hexano, aamostra foi turbilhonada e centrifugada. A camada superior foi removida eanalisada por meio de GC conforme descrito acima.

Exemplo 1

Síntese de cDNA de Pavlova lutheri (CCMP459). construção de bibliotecae seqüenciamento

Uma biblioteca de cDNA de Pavlova lutheri (CCMP459) foisintetizada conforme descrito na Patente PCT n0 WO 2004/071467 (publicadaem 26 de agosto de 2004). Resumidamente, pelotas congeladas de Pav459foram obtidas por meio do Centro Nacional Provasoli-Guillard para Cultivo deFitoplâncton Marinho (CCMP, West Boothbay Harbor, ME). Estas pelotas forampicadas em nitrogênio líquido e RNA total foi extraído de Pav459 utilizando oKit Maxi Qiagen RNeasy® (Qiagen, Valencia CA) segundo as informações dofabricante. Deste RNA total, mRNA foi isolado utilizando resina de oligo dTcelulose, que foi empregada em seguida para a construção de uma bibliotecade cDNA utilizando o vetor pSportl (Invitrogen, Carlsbad CA). O cDNAproduzido desta forma foi clonado direcionalmmente (5' Sall/3' Notl) em umvetor pSportl. A biblioteca de Pav459 continha cerca de 6,1 χ 105 clones porml, cada qual com um tamanho de inserto médio de cerca de 1200 bp. Abiblioteca de Pavlova Iutheri foi denominada epslc.

Para seqüenciamento, os clones foram recuperados em primeirolugar de cultivos de glicerol arquivados cultivados/congelados em placas demeios de congelamento com 384 cavidades e inoculados com um tomador decolônias QPix® automático (Genetix) em placas de cavidades profundas com96 cavidades contendo LB + 100 mg/ml de ampicilina. Após cultivo por vintehoras a 37 0C, as células foram peletizadas por meio de centrifugação earmazenadas a -20 0C. Plasmídeos foram isolados em seguida sobre um robôEppendorf 5Prime, utiizando um método de minipreparação por Iise alcalinacom formato de 96 cavidades modificado (Eppendorf PerfectPrep®).Resumidamente, um condutor a vácuo e filtro foi utilizado para facilitar aremoção de fragmentos celulares após a precipitação de acetato. DNA deplasmídeo foi unido em seguida sobre uma segunda placa de filtro diretamentea partir do filtrado, lavado, seco e eluído.

Plasmídeos foram seqüenciados no final em placas com 384cavidades, utilizando primer T7 com primer de vetor (SEQ ID N0 1) e o kit deseqüenciamento 3 Prism versão ABI BigDye. Para a reação deseqüenciamento, foram utilizados 100 a 200 ng de modelo e 6,4 pmol de primere as condições de reação a seguir foram repetidas por 25 vezes: 96 0C por dezsegundos, 50°C por cinco segundos e 60°C por quatro minutos. Após alimpeza com base em etanol, produtos de reação de seqüenciamento de ciclosforam resolvidos e detectados em seqüenciadores automáticos Perkin-ElmerABI 3700.

Exemplo 2

Identificação de homólogos de enzima delta-8 dessaturase de biblioteca decDNA de Pavlova lutheri eps1c

Clones de cDNA que codificam homólogos de delta-8 dessaturasede Pavlova lutheri (denominados a seguir delta-8 dessaturases) foramidentificados conduzindo-se pesquisas de similaridade BLAST (Ferramenta deBusca de Alinhamento Local Básico; Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410(1993)) por seqüências contidas no banco de dados "nr" do BLAST (quecompreende todas as traduções de CDS de GenBank1 seqüências derivadasdo Banco de Dados de Proteínas Brookhaven com estrutura tridimensional, aúltima publicação principal do banco de dados de seqüências de proteínasSWISS-PROT, bancos de dados EMBL e DDBJ). As seqüências de cDNAobtidas no Exemplo 1 foram analisadas para determinar a similaridade a todasas seqüências de DNA disponíveis ao público contidas no banco de dados "nr"utilizando o algoritmo de BLASTN fornecido pelo Centro Nacional deInformações Biotecnológicas (NCBI). As seqüências de DNA foram traduzidasem todos os quadros de leitura e comparadas para determinar a similaridade atodas as seqüências de proteínas disponíveis ao público contidas no banco dedados "nr" utilizando o algoritmo BLASTX (Gish e States, Nat. Genet. 3: 266-272 (1993)) fornecido pelo NCBI. Para conveniência, os valores P(probabilidade) de observação de uma coincidência de seqüência de cDNAcom uma seqüência contida nos bancos de dados pesquisados meramente aoacaso conforme calculado por meio de BLAST são relatados no presente comovalores "pLog" que representam o negativo do Iogaritmo do valor P relatado.Conseqüentemente, quanto maior o valor pLog, maior a probabilidade de que aseqüência de cDNA e o "resultado" do BLAST representem proteínashomólogas.

A pesquisa BLASTX utilizando a seqüência de nucleotídeos doclone eps1c.pk002.f22 revelou similaridade entre a proteína codificada pelocDNA e a delta-6 dessaturase de Rhizopus stolonifer (SEQ ID N0 2) (AcessoNCBI n° AAX22052 (Gl 60499699), local AAX22052, CDS AY795076; Lu et al,não publicado). A seqüência de uma parte do inserto de cDNA do cloneeps1c.pk002.f22 é exibida em SEQ ID N0 3 (extremidade 5' do inserto decDNA). Em seguida, a seqüência de inserto total (eps1c.pk002.f22:fis) foiobtida e é exibida em SEQ ID N0 4. A seqüência para a seqüência deaminoácidos deduzida (do nucleotídeo 1 de SEQ ID N0 4 até o primeiro códonde parada no nucleotídeo 864 de SEQ ID N0 4) é exibida em SEQ ID N0 5.Seqüenciamento de insertos completos foi conduzido utilizando um protocolode transposição modificado. Clones identificados para FIS foram recuperadosde estoques de glicerol arquivados na forma de colônias isoladas e DNA deplasmídeo foi isolado por meio de Iise alcalina. Modelos de plasmídeos foramtranspostos por meio do kit de transposição do Sistema de Geração deModelos (TGS II) (Finnzymes Oy1 Espoo, Finlândia), seguindo o protocolo dofabricante. O DNA transposto foi transformado em células eletrocompetentesEH10B (Edge BioSystems, Gaithersburg MD) por meio de eletroporação.Diversos transformadores foram selecionados aleatoriamente a partir de cadareação de transposição, DNA de plasmídeo foi preparado e modelos foramseqüenciados conforme acima (ABI BigDye v3.1) para fora do local de eventode transposição, utilizando os primers exclusivos SeqE (SEQ ID N0 6) e SeqW(SEQ ID N0 7).

Dados de seqüências foram recolhidos (software ABI PrismCollections) e reunidos utilizando o programa de montagem de seqüênciasPhrap (Ρ. Green1 Universidade de Washington, Seattle). Conjuntos sãoobservados por meio do editor de seqüências Consed (D. Gordon,Universidade de Washington, Seattle) para edição final.

A seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID N° 5 foi avaliadapor meio de BLASTP, gerando um valor pLog de 19,52 (valor E de 3e-20)contra a delta-6 dessaturase de Mortierella alpina (SEQ ID N° 8) (Acesso NCBIn° BAC82361 (Gl 34221934), local BAC82361, CDS AB070557; Sakuradani eShimizu, Biosci. Biotechnol. Biochem. 67: 704-711 (2003)). Com base nosresultados da comparação de BLASTP com Mortierella alpina e outrasdessaturases de ácidos graxos, a delta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri nãopossuía comprimento total e não continha seqüência na extremidade 5'.

Exemplo 3

Clonagem de delta-8 dessaturase de comprimento total de DNA genómicode Pavlova lutheri

DNA genômico foi isolado de Pavlova lutheri (CCMP459)utilizando o Kit Maxi Prep Qiagen DNeasy® Plant de acordo com o protocolo dofabricante. Utilizando uma coluna maxi por 1 g de pelotas celulares congeladas,um total de 122 μg de DNA genômico foi isolado a partir de 4 g de cultivo dePavlova lutheri. A concentração final de DNA genômico foi de 22,8 ng/μΙ.Bibliotecas GenomeWaIker foram sintetizadas utilizando o kit UniversalGenomeWalker® (BD Biosciences Clonetech, Palo Alto CA) seguindo oprotocolo do fabricante (Prot. N° PT3042-1, versão PR03300).Resumidamente, quatro digestões de restrição foram configuradas de acordocom o protocolo utilizando 300 ng de DNA genômico por reação. Após limpezacom fenol, as pelotas foram dissolvidas em 4 μΙ de água e adaptadores foramligados de acordo com o protocolo.

Para o PCR primário, o kit PCR genômico Advantage® CR (BDBiosciences Clonetech) foi utilizado seguindo o protocolo do fabricante (Prot. N°ΡΤ3090-1, versão η° PR1X433). Para cada digestão de restrição, 1 μl debiblioteca foi combinado com 22,8 μΙ de água com grau de PCR1 10 μl de 5XTampão de Reação PCR Genômico GC1 2,2 μΙ de 25 mM de Mg(CH3C02)2, 10μl de GC-Fundido (5 M), 1 μΙ de mistura de 50 X dNTP (10 mM cada), 1 μΙ deMistura Pol. Genômica GC Advantage (50 X), 1 μΙ de primer UniversalGenomeWalker® AP1 (10 μΜ, SEQ ID N0 9) e 1 μΙ de GSP PvDES (10 μΜ,SEQ ID N0 10). Após desnaturação a 95 0C1 as condições de reação a seguirforam repetidas 35 vezes: 94 0C por trinta segundos, 68 °C por seis minutos.Após estas condições de reação, conduziu-se uma extensão adicional a 68 0Cpor seis minutos, seguida por resfriamento a 15 0C até a sua remoção.

A reação PCR primária para cada biblioteca foi analisada pormeio de eletroforese de gel de agarose e foram observadas faixas de DNA compesos moleculares de cerca de 6 kb, 3,5 kb, 2,5 kb e 1,2 kb. Faixas de DNApara cada biblioteca foram purificadas utilizando o Kit de Recuperação de DNAem Gel Zymoclean® (Zymo Research, Orange CA) seguindo o protocolo dofabricante. O DNA resultante foi clonado no Vetor pGEM®-T Easy (Promega)seguindo o protocolo do fabricante e insertos foram seqüenciados utilizando osprimers T7 (SEQ ID N0 1) e M13-28Rev (SEQ ID N0 11) conforme descritoacima. Seqüências adicionais foram obtidas em seguida utilizando um primerde seqüenciamento específico de genes PvDES seq (SEQ ID N0 12) que foiderivado dos dados de seqüências recém adquiridos. A seqüência posterior 5'completa obtida por meio de genome walking é exibida em SEQ ID N0 13. Aseqüência das regiões sobrepostas da seqüência genômica (SEQ ID N0 13) e oEST totalmente seqüenciado eps1c.pk002.f22:fis (SEQ ID N0 4) foramalinhados utilizando Sequencher® (Versão 4.2, Gene Codes Corporation, AnnArbor Ml), utilizando o algoritmo de montagem Large Gap. É interessanteobservar que a comparação demonstrou que o EST que era seqüenciadooriginalmente (SEQ ID N0 4) não continha 459 bp em comparação com aseqüência genômica (SEQ ID N0 13). Esta seqüência faltante no ESTaparentemente é uma exclusão e não um intron, pois nenhum local de divisãode introns claro foi identificado no DNA genômico na extremidade 5' do gene. Aseqüência genômica para a extremidade 5' (SEQ ID N0 13) foi combinada coma extremidade 3' da seqüência EST (SEQ ID N0 4) para gerar SEQ ID N0 14.Utilizando software de análise de seqüências EditSeq® 6.1 (DNASTAR Inc.,Madison Wl), foi identificado um ORF (SEQ ID N0 15). A seqüência deaminoácidos codificada por SEQ ID N0 15 é exibida em SEQ ID N0 16.

A seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID N0 16 foiavaliada por meio de BLASTP, gerando um valor pLog de 35,10 (valor E de 8e-36) contra a delta-6 dessaturase de Rhizopus stolonifer (SEQ ID N0 17)(Acesso NCBI n° ABB96724 (Gl 83027409), local ABB96724, CDS DQ291156;Zhang et al, não publicado). Além disso, a delta-8 dessaturase de Pavlovalutheri é 78,0% idêntica à seqüência de delta-8 dessaturase de Pavlova salina(SEQ ID N0 76) descrita na Patente PCT n0 WO 2005/103253 (publicada em 22de abril de 2005), utilizando o método de Jotun Hein. Cálculos de percentuaisde identidade de seqüências realizados por meio do método de Jotun Hein(Hein, J. J., Meth. Enz. 183: 626-645 (1990) foram realizados utilizando oprograma MegAlign® v6.1 da suíte de computação bioinformáticaLASARGENE (DNASTAR Inc., Madison Wl) com os parâmetros padrão paraalinhamentos em pares (COMPRIMENTO DE PALAVRA = 2). A delta-8dessaturase de Pavlova Iutheri é 76,4% idêntica à seqüência de delta-8dessaturase de Pavlova salina utilizando o método Clustal V. Cálculos depercentuais de identidade de seqüências realizados por meio do métodoClustal V (Higgins, D. G. e Sharp, P. M., Comput. Appi Biosci. 5: 151-153(1989); Higgins et al, Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191 (1992)) foram realizadosutilizando o programa MegAlign® v6.1 da suíte de computação bioinformáticaLASARGENE (DNASTAR Inc., Madison Wl) com os parâmetros padrão paraalinhamentos em pares (COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADEDO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5,ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5 e PENALIDADE DO COMPRIMENTODO INTERVALO = 10). Avaliações e probabilidades de BLAST indicam que opresente fragmento de ácido nucleico (SEQ ID N0 15) codifica uma delta-8dessaturase de Pavlova Iutheri completa.

As Figs. 13A e 13B exibem um alinhamento Clustal V (comparâmetros padrão) de SEQ ID N0 16 (a seqüência de aminoácidos da delta-8dessaturase de acordo com a presente invenção), SEQ ID N0 76 (a seqüênciade aminoácidos de delta-8 dessaturase de Pavlova salina descrita como SEQID N0 1 na Patente PCT n° WO 2005/103253; publicada em 22 de abril de2005), SEQ ID N0 77 (a seqüência de aminoácidos de delta-8 dessaturase deEuglena gracilis descrita como SEQ ID N0 2 na Patente PCT n0 WO2006/012325; pulibcada em dois de fevereiro de 2006), SEQ ID N0 17 (aseqüência de aminoácidos de dessaturase de ácido graxo delta-6 de Rhizopusstolonifer (Acesso NCBI n° ABB96724 (Gl 83027409), local ABB96724, CDSDQ291156; Zhang et ai, não publicado)) e SEQ ID N0 2 (a seqüência deaminoácidos para a dessaturase de ácido graxo delta-6 de Rhizopus stolonifer(Acesso NCBI n° AAX22052 (Gl 60499699), local AAX22052, CDS AY795076;Lu et al, não publicado)). Os resultados do alinhamento Clustal V demonstramque SEQ ID N0 16 é 76,4%, 22,6%, 22,2% e 22,2% idêntica a SEQ ID N0 76,SEQ ID N0 77, SEQ ID N0 17 e SEQ ID N0 2, respectivamente.

Exemplo 4

Clonagem da delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri a partir de cDNA dePavlova lutheri

Pavlova lutheri (CCMP459) foi obtida a partir de CCMP e cultivadaem frascos de 250 ml contendo 50 ml de meio F/2-Si (elaborado utilizando Kitde Meio Família F/2 - KIT20F2 e Seqwater Filtrado - SEA2 da CCMP) a 26 °Ccom agitação a 150 rpm. Os cultivos foram transferidos para um meio novosemanalmente utilizando diluição 1:4 (cultivo velho: meio novo).

Cultivos de 28 frascos (1400 ml) foram combinados, células forampeletizadas por meio de centrifugação a 1800 χ g por dez minutos, lavadasuma vez com água e novamente centrifugadas. RNA total foi extraído da pelotaresultante utilizando o reagente RNA STAT-60® (TEL-TEST Inc., FriendswoodTX) e seguindo o protocolo do fabricante fornecido. Desta forma, 2,6 mg deRNA total (2,6 mg/ml) foram obtidos da pelota. O mRNA foi isolado de 1,25 mgde RNA total utilizando o Kit de Purificação de mRNA (Amersham Biosciences,Piscataway NJ) seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. Desta forma,foram obtidos 112 μg de mRNA.

cDNA foi sintetizado a partir de 224 ng de mRNA utilizando oSistema de Síntese de Primeiro Cordão SuperScript® para Kit de RT-PCR(Invitrogen® Life Technologies, Carlsbad CA) com o primer oligo(dT) fornecidode acordo com o protocolo do fabricante. Após tratamento com RNase H deacordo com o protocolo, a delta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri foiamplificada a partir do cDNA resultante com os primers de oligonucleotídeosPvDES 5'Not-1 (SEQ ID NO 18) e PvDES3'Not-1 (SEQ ID NO 19) utilizando ascondições descritas abaixo.

cDNA (2 μl) da reação descrita acima foi combinado com 50pmol de PvDES5'Not-1 (SEQ ID NO 18), 50 pmol de PvDES3'Not-1 (SEQ IDNO 19), 1 μl de mistura de nucleotídeos PCR (10 mM, Promega, MadisonWl), 5 μl de 10X tampão PCR (Invitrogen Corporation), 1,5 μl de MgCl2 (50mM, Invitrogen Corporation), 0,5 μl de Taq polimerase (InvitrogenCorporation) e água até 50 μl. As condições de reação foram de 94 °C portrês minutos, seguidas por 35 ciclos de 94 °C por 45 segundos, 55 °C por45 segundos e 72 °C por um minuto. PCR foi finalizada a 72 0C por seteminutos e, em seguida, mantida a 4 0C. A reação de PCR foi analisada pormeio de eletroforese de gel de agarose sobre 5 μl e observou-se uma faixade DNA com peso molecular de cerca de 1,3 kb. Os 45 μΙ de produtorestantes foram separados por meio de eletroforese de gel de agarose e oDNA foi purificado utilizando o Kit de Recuperação de DNA Zymoclean®Gel (Zymo Research, Orange CA) seguindo o protocolo do fabricante. ODNA resultante foi clonado no Vetor pGEM®-T Easy (Promega) seguindo oprotocolo do fabricante. Diversos clones foram seqüenciados utilizando osoligonucleotídeos T7 (SEQ ID N0 1), M13-28Rev (SEQ ID N0 11) e PvDes-2(SEQ ID N0 20). A seqüência dos clones testados foi idêntica à de SEQ IDN° 15 e um dos clones corretos (pLF113) foi selecionado para estudos deexpressão adicionais.

Exemplo 5

Clonagem da delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri em um vetor deexpressão de levedura

O vetor do tipo plasmídeo epissomal de levedura (YEp)pRS425 (Christianson et al, Gene 110: 119-122 (1992)) contém seqüênciasdo plasmídeo endógeno de Saccharomyces cerevisiae 2μ, um marcadorselecionável LEU2 e seqüências com base na cadeia principal de umfagomídeo multifuncional, pBluescript Il SK(+). O promotor forte econstitutivo de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD) deSaccharomyces cerevisiae foi clonado entre os locais Sae/1 e SpeI depRS425 da mesma forma descrita por Jia et al (Physiol. Genom. 3: 83-92(2000)) para produzir pGPD-425. Um local Nott foi introduzido no localSarnHI de pGPD-425, de forma a gerar um local Nott ladeado por locaisBamHI e esse plasmídeo foi denominado pY-75. A delta-8 dessaturase dePavlova Iutherifoi liberada de pLF113 (do Exemplo 4) por meio de digestãocom Nott e clonada no local Nott de pY75 para produzir pY121 (SEQ ID N021; Fig. 1).Exemplo 6

Clonagem da delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri em um vetor de

expressão de yarrowia

O promotor de GPD de Yarrowia foi amplificado a partir doplasmídeo pYZDE2-S (SEQ ID N0 74) utilizando os oligonucleotídeos GDP comsentido (SEQ ID N0 28) e GDP sem sentido (SEQ ID N0 29). O promotoruYarrowia GPD" neste gene quimérico designa a região não traduzida acima nofluxo 5' em frente ao códon de início de tradução "ATG" de uma proteínacodificada pelo gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD) de Yarrowialipolytica e que é necessário para expressão (WO 2005/003310). O fragmentode DNA resultante foi digerido com Sall/Notl e clonado no fragmento deSall/Notl de pY5-22 (SEQ ID N0 75), de forma a substituir o promotor de TEF1gerando pY5-22GPD (SEQ ID N0 30).

A delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri foi liberada de pLF113(do Exemplo 4) por meio de digestão com Notl e clonada no local Not\ de pY5-22GPD para produzir pY118 (SEQ ID N0 31, Fig. 4).

Exemplo 7

Clonagem da delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri em um vetor de

expressão de soja

Vetor pKR123r (SEQ ID N0 22), que foi descrito anteriormentena Patente PCT n0 WO 2004/071467 (publicada em 26 de agosto de 2004;cujo teor é incorporado ao presente como referência) contém um local Nottladeado pelo promotor Inibidor de Tripsina de soja Kunitz (KTi) (Jofuku etal, Plant Cell 1: 1079-1093 (1989)) e a reigão de término de KTi 3' cujoisolamento é descrito na Patente Norte-Americana n° 6.372.965 (conjuntoKTi/A/oíl/KTi3'). A delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri (SEQ ID N0 15) foiliberada de pLF113 (do Exemplo 4) por meio de digestão com Nott eclonado no local Nott de pKR123r para produzir pKR900 (SEQ ID N0 23).O plasmídeo pKR72 (Acesso ATCC n° PTA-6019; SEQ ID N0 46,seqüência de 7085 bp), um derivado de pKS123 que foi descrito anteriormente naPatente PCT n0 WO 2002/008269 (cujo teor é incorporado ao presente comoreferência) contém o gene higromicina B fosfotransferase (HPT) (Gritz, L. e Davies1J., Gene 25: 179-188 (1983)), ladeado pelo promotor T7 e término de transcrição(conjunto de T7prom/hpt/T7term) e uma origem de reprodução bacteriana (ori) paraseleção e reprodução em bactérias (tais como E. coli). Além disso, pKR72 tambémcontém o gene higromicina B fosfotransferase, ladeado pelo promotor 35S (Odell etal, Nature 313: 810-812 (1985)) e término de transcrição NOS 3' (Depicker et al, J.Mol. Appl. Genet. 1: 561-570 (1982)) (conjunto 35S/hpt/NOS3') para seleção emplantas tais como soja. pKR72 também contém um local de restrição de Noti,ladeado pelo promotor para a subunidade α de β-conglicinina (Beachy et al, EMBOJ. 4: 3047-3053 (1985)) e a região de término de transcrição 3' do gene faseolina(Doyle et al, J. Biol. Chem. 261: 9228-9238 (1986)), de forma a permitir forteexpressão de tecido nas sementes de soja de genes clonados no local Nott. Oconjunto pcon/Notl/Phas3' no plasmídeo pKR72 foi removido por meio de digestãocom Hindlll e o fragmento que contém o gene HPT foi novamente ligado para gerarpKR325 (SEQ ID N0 24), previamente descrito na Patente PCT n0 WO 2006/012325(cujo teor é incorporado ao presente como referência).

O plasmídeo pKR900 (SEQ ID N0 23) foi digerido em seguida comSbfl e o fragmento que contém a delta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri foiclonado no local Sbf1 de pKR325 para produzir pKR902 (SEQ ID N0 25). Éexibida uma ilustração esquemática de pK902 na Fig. 2.

Exemplo 8

Clonagem da delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri em um vetor deexpressão de soja e coexpressão com a delta-9 elongase de isochrysisgalbana

O plasmídeo pKR900 (do Exemplo 7; SEQ ID N0 23) foi digeridocom Sbfl e o fragmento que contém a delta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri foiclonado no local Sbf1 de pKR607 (SEQ ID N0 26), anteriormente descrito naPatente PCT n0 WO 2006/012325 (cujo teor é incorporado ao presente comoreferência) para gerar pKR903 (SEQ ID N0 27). Desta forma, a delta-8 dessaturasede Pavlova Iutheri é coexpressa com a delta-9 elongase de Isochrysis galbana atrásde promotores específicos de sementes fortes. É exibida uma ilustraçãoesquemática de pK903 (Acesso ATCC n° PTA-7494) na Fig. 3.

Exemplo 9

Análise funcional da delta-8 dessaturase de Pavlova lutherí emSaccharomyces cerevisiae

Plasmídeos de expressão de Saccharomyces cerevisiae pY121 epY75 (do Exemplo 5) foram transformados em Saccharomyees cerevisiaeINVSC1 (Invitrogen Corporation) utilizando procedimentos de transformação deacetato de lítio padrão. Transformadores foram selecionados sobre meiosDOBA suplementados com CSM-Ieu (Qbiogene, Carlsbad CA). Ostransformadores foram avaliados para determinar as atividades de delta-6,delta-8 e delta-5 dessaturase conforme segue. Transformadores de cada placaforam inoculados em 2 ml de meio DOB suplementado com CSM-Ieu(Qbiogene) e 0,2% de tergitol. As células foram cultivadas por um dia a 30 0C1após o quê 0,1 ml foram transferidos para 3 ml do mesmo meio suplementadocom ácido Iinoleico (LA 18:2 (9,12)), ácido α-linolênico (ALA-18:3 (9, 12, 15)),ácido diomo-gama-linolênico (DGLA-20:3 (8,11,14)), ácido eicosadienóico(EDA-20:2 (11,14)) ou ácido eicosatrienóico (ERA-20:3 (11,14,17)) até 0,175mM. Estes foram incubados por dezesseis horas a 30 0C, 250 rpm e, emseguida, foram obtidas pelotas por meio de centrifugação. Células foramlavadas uma vez com água, peletizadas por meio de centrifugação e secas emar. As pelotas foram transesterificadas (Roughan, G. e Nishida, I., Arch.Biochem. Biophys. 276 (1): 38-46 (1990)) com 500 μΙ de 1% metóxido de sódiopor trinta minutos a 50 °C após o quê foram adicionados 500 μl de 1 M cloretode sódio e 100 μl de heptano. Após mistura completa e centrifugação, metilésteres de ácido graxo (FAMEs) foram analisados por meio de GC conformedescrito acima. Ao fazê-lo, nenhuma atividade de dessaturação para nenhumdos substratos testados pôde ser detectada.

Exemplo 10

Análise funcional da delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri em Yarrowialipolytica

Uma linhagem auxotrófica de uracil ura3 de Yarrowia Iipolytica(linhagem Y2224) foi utilizada para testes funcionais. Para produzir Y2224,células de Yarrowia Iipolytica (Acesso ATCC n° 20362) de uma placa YPDforam riscadas sobre uma placa de meio mínimo (75 mg/l de uracil e uridinacada, 6,7 g/l de YNB com sulfato de amônia, sem aminoácido, e 20 g/l deglicose) contendo 250 mg/l de 5-FOA (Zymo Resarch). Placas foram incubadasa 28 °C e quatro das colônias resultantes foram colocadas na forma deemplastro separadamente sobre placas de meio mínimo contendo 200 mg/mlde 5-FOA e placas de meio mínimo sem uracil e uridina para confirmarauxotrofia de uracil ura3. Um auxotrofo confirmado foi denominado Y2224.

Linhagem Y2224 de Yarrowia Iipolytica foi cultivada a 28 0C sobreYPD agar (1% extrato de levedura, 2% bactopeptona, 2% glicose, 2% agar).Para seleção de transformadores, utilizou-se meio mínimo (0,17% base denitrogênio de levedura (DIFCO Laboratories, Detroit Ml) sem sulfato de amônioou aminoácidos, 2% glicose, 0,1% prolina, pH 6,1). Suplementos de adenina,leucina, Iisina e/ou uracil foram adicionados até concentração final de 0,01%.

Transformação de Yarrowia lipqlytica

Plasmídeo pY118, que contém a delta-8 dessaturase de Pavlovalutheri, ou pY5-22GPD, o vetor de controle, foram transformados em linhagemY2224 de Yarrowia Iipolytica cojnforme descrito nos Métodos Gerais.Resumidamente, linhagem n° 2224 de Yarrowia Iipolytica foi riscadasobre um placa YPD e cultivada a 30 0C por cerca de dezoito horas. Vários circuitosgrandes de células foram raspados da placa e novamente suspensos em 1 ml detampão de transformação que contém: 0,25 ml de 50% PEG, MW médio 3350;

0,125 ml de 2 M acetato de Li, pH 6,0; 0,125 ml de 2 M DTT; e 50 μg de DNA deesperma de salmão cortado. Cerca de 500 ng de DNA de plasmídeo pY5-22GPDou pY118 foram incubados em 100 μΙ de células novamente suspensas e mantidasa 39 0C por uma hora com mistura em turbilhonamento em intervalos de quinzeminutos. As células foram colocadas em placas sobre placas com meios mínimosque não contêm uracil e mantidas a 30 0C por dois a três dias.

Colônias isoladas de transformador Yarrowia Iipolytica contendopY118 ou pY5-22GPD foram cultivadas em 3 ml de meios mínimos que nãocontêm uracil suplementados com 0,2% tergitol a 30 0C por um dia. Emseguida, 0,1 ml foram transferidos para 3 ml do mesmo meio suplementadosem ácido graxo, com ácido α-linolênico (ALA-18:3 (9,12,15)), ácido diomo-gama-linolênico (DGLA-20:3 (8,11,14)), ácido eicosadienóico (EDA-20:2(11,14)) ou ácido eicosatrienóico (ERA-20:3 (11,14,17)) até 0,175 mM. Estesforam incubados por dezesseis horas a 30 0C1 250 rpm e, em seguida, foramobtidas pelotas por meio de centrifugação. Células foram lavadas uma vez comágua, peletizadas por meio de centrifugação e secas em ar. Pelotas foramtransesterificadas conforme descrito acima. FAMEs de células que contêmpY118 foram analisadas por meio de GC como para células que contêm pY121no Exemplo 9. Ao fazê-lo, nenhuma atividade de dessaturação para nenhumdos substratos testados pôde ser detectada.

Exemplo 11

Transformação de cultivos de embriões de soja somáticosCondições de cultivoCultivos de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack) forammantidos em 35 ml de meio líquido SB196 (abaixo) sobre um agitador giratório,150 rpm, 26 0C com luzes fluorescentes brancas frias em um fotoperíodo de16:8 horas de dia/noite em intensidade de luz de 60 a 85 μΕ/ιτι2/5. Os cultivosforam subcultivados a cada sete dias a duas semanas por meio de inoculaçãode cerca de 35 mg de tecido em 35 ml de SB196 líquido novo (o intervalo desubcultivo preferido é a cada sete dias).

Cultivos de suspensão embriogênica de soja foram transformadoscom os plasmídeos de expressão de soja por meio do método debombardeamento de disparador de partículas (Klein et al, Nature 327: 70(1987)), utilizando um instrumento DuPont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste dehélio) para todas as transformações.

Início de cultivo de suspensão embriogênica de sojaCultivos de soja foram iniciados duas vezes por mês comcinco a sete dias entre cada início. Vagens com sementes imaturas deplantas de soja disponíveis 45 a 55 dias após o plantio foram tomadas,removidas das suas cascas e colocadas em uma caixa magentaesterilizada. As sementes de soja foram esterilizadas por meio de suaagitação por quinze minutos em uma solução de Clorox a 5% com umagota de sabão marfim (ou seja, 95 ml de água destilada em autoclave mais5 ml de Clorox e uma gota de sabão, bem misturados). Sementes foramenxaguadas utilizando duas garrafas de um litro de água destilada estéril eaquelas com menos de 4 mm foram colocadas sobre lâminas demicroscópio individuais. A extremidade pequena da semente foi cortada eos cotilédones foram prensados para fora do revestimento de semente.Cotilédones foram transferidos para placas contendo meio SB1 (25 a 30cotilédones por placa). As placas foram embaladas com fita de fibra earmazenadas por oito semanas. Após esse período, embriões secundáriosforam cortados e colocados em meios líquidos SB196 por sete dias.Preparação de DNA para bombardeamento

Um plasmídeo intacto ou um fragmento de plasmídeo de DNA quecontém os genes de interesse e o gene marcador selecionável foram utilizadospara bombardeamento. Fragmentos de plasmídeos de expressão de soja pKR902 epKR903 foram obtidos por meio de isolamento de gel de plasmídeos digeridos. Emcada caso, 100 μg de DNA de plasmídeo foram utilizados em 0,5 ml da mistura deenzimas específica descrita abaixo. Plasmídeos foram digeridos com ^scl (100unidades) em NEBuffer 4 (20 mM de Tris-acetato, 10 mM de acetato de magnésio,50 mM de acetato de potássio, 1 mM de ditiotreitol, pH 7,9), 100 μg/ml de BSA e 5mM de beta-mercaptoetanol a 37 0C por uma hora e meia. Os fragmentos de DNAresultantes foram separados por meio de eletroforese de gel sobre 1 % SeaPIaqueGTG agarose (BioWhitaker Molecular Applications) e os fragmentos de DNA quecontêm os conjuntos genéticos foram cortados do gel de agarose. DNA foipurificado a partir da agarose utilizando a enzima de digestão de GELase seguindoo protocolo do fabricante.

Uma parcela de 50 μΙ de água destilada estéril contendo 3 mg departículas de ouro foi adicionada a 5 μΙ de uma solução de 1 μg/μl de soluçãode DNA (seja plasmídeo intacto ou fragmento de DNA preparado conformedescrito acima), 50 μΙ de 2,5 M CaCI2 e 20 μΙ de 0,1 M espermidina. A misturafoi agitada por três minutos no nível 3 de um agitador por turbilhonamento ecentrifugada por dez segundos em um microcentrifugador de bancada. Apósuma lavagem com 400 μΙ de etanol a 100%, a pelota foi suspensa por meio desonicação em 40 μΙ de etanol a 100%. Cinco microlitros de suspensão de DNAforam liberados para cada disco suspenso do instrumento BiolisticPDS1000/HE. Cada parcela de 5 μΙ continha cerca de 0,375 mg de partículasde ouro por bombardeamento (ou seja, por disco).

Preparação de tecidos ε bombardeamento com DNA

Cerca de 150 a 200 mg de cultivos de suspensão embriônica comsete dias de idade foram colocados em uma placa petri de 60 χ 15 mm estérilvazia e a placa foi coberta com tela plástica. O tecido foi bombardeado uma ouduas vezes por placa com pressão de ruptura da membrana definida em 1100psi e a câmara foi evacuada até um vácuo de 68 a 71 cm de mercúrio. O tecidofoi colocado a cerca de 8,9 cm da tela de retenção/parada.

Seleção de embriões transformadosEmbriões transformados foram selecionados utilizandohigromicina como o marcador selecionável. Especificamente, após obombardeamento, o tecido foi colocado em meios SB196 novos e cultivadoconforme descrito acima. Seis dias após o bombardeamento, o SB196 étrocado com SB196 novo contendo 30 mg/l de higromicina. Os meios deseleção foram renovados uma vez por semana. Quatro a seis semanasapós a seleção, tecido verde transformado pode ser observado crescendoa partir de conjuntos embriogênicos necróticos não transformados. Tecidoverde isolado foi removido e inoculado em placas com múltiplas cavidadespara gerar novos cultivos de suspensão embriogênica transformados epropagados de forma clonal.

Amadurecimento dos embriõesOs embriões foram cultivados por quatro a seis semanas a 26°C em SB196 sob lâmpadas fluorescentes brancas frias (Phillips Econowattbranca fria F40/CW/RS/EW) e Agro (Philips F40 Agro) (40 watts) em umfotoperíodo de 16:8 horas com intensidade da luz de 90 a 120 μΕ/m2S.Após esse período, conjuntos de embriões foram removidos para um meioagar sólido, SB166, por uma a duas semanas. Os conjuintos foramsubcultivados em seguida para meio SB103 por três semanas. Duranteeste período, embriões individuais foram removidos dos conjuntos eselecionados conforme as alterações nas suas composições de ácidosgraxos conforme descrito acima.Receitas de meiosSB196 - Meio de proliferação líquido FN Lite (por litro)

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Soluções padrão FN Lite

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Meio sólido SB1 (por litro)

1 pacote de sais MS (Gibco/BRL - Cat. N0 11117-066)

1 ml de vitaminas B5 1000X padrão

31,5 g de sacarose

2 ml de 2,4-D (20 mg/l de concentração final)

pH 5,7

8 g de TC agar

Meio sólido SB166 (por litro)

1 pacote de sais MS (Gibco/BRL - Cat. N0 11117-066)

1 ml de vitaminas B5 1000X padrão

60 g de maltose

750 mg de MgCl2 hexaidrato

5 g de carvão ativado

pH 5,7

2 g de gelritaMeio sólido SB103 (por litro)

1 pacote de sais MS (Gibco/BRL - Cat. N0 11117-066)

1ml de vitaminas B5 1000X padrão60 g de maltose

750 mg de MgCb hexaidratopH 5,7

2g de gelrita

Meio sólido SB 71-4 (por litro)1 garrafa de sais B5 de Gamborg com sacarose (Gibco/BRL - cat.N0 21153-036)

pH 5,7

5 g de TC Agar

Padrão 2.4-D

Obter pré-fabricado da Phytotech Cat. No. D 295 - concentraçãode 1 mg/ml.

Vitaminas B5 padrão (por 100 ml)

Armazenar pacelas a -20 0C:10 mg de mio-inositol100 mg de ácido nicotínico100 mg de piridoxina HCI1 g de tiamina

Caso a solução não se dissolva com rapidez suficiente, aplicarnível baixo de calor por meio da placa sob agitação quente.

Exemplo 12

Análise funcional da delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri em embriõesde soja somáticos

Embriões de soja somáticos maduros são um bom modelo paraembriões zigóticos. Embora no estado de embrião globular em estado líquido,embriões de soja somáticos contêm quantidades muito baixas de triacilglicerolou proteínas de armazenagem típicas de embriões de soja zigóticos emamadurecimento. Neste estágio de desenvolvimento, a razão entretriacilglicéride total e lipídio polar total (fosfolipídios e glicolipídio) é de cerca de1:4, como é típico de embriões de soja zigóticos no estágio de desenvolvimentoa partir dos quais foi iniciado o cultivo de embriões somáticos. Também noestágio globular, os mRNAs para as proteínas de sementes proeminentes,subunidade α de β-conglicinina, inibidor de tripsina Kunitz 3 e Iectina desementes são essencialmente ausentes. Mediante transferência para meioslivres de hormônios para permitir a diferenciação para o estado de embriõessomáticos em amadurecimento, triacilglicerol torna-se a classe de lipídio maisabundante. Da mesma forma, mRNAs para subunidade α de β-conglicinina,inibidor de tripsina Kunitz 3 e Iectina de semente tornam-se mensagens muitoabundantes na população de mRNA total. Com base nisso, o sistema deembriões de soja somáticos comporta-se de forma muito similar a embriões desoja zigóticos em amadurecimento in vivo e, portanto, é um sistema modelobom e rápido para análise dos efeitos fenotípicos de modificação da expressãode genes no processo de biossíntese de ácidos graxos (vide a Patente PCT n°WO 2002/00904, Exemplo 3). De forma mais importante, o sistema de modelotambém prevê a composição de ácido graxo de sementes de plantas derivadasde embriões transgênicos.

Embriões de soja somáticos transgênicos que contêm pKR902(Exemplo 7) ou pKR903 (Exemplo 8) foram analisados conforme segue. Metilésteres de ácidos graxos foram preparados a partir de embriões de sojasomáticos amadurecidos isolados por meio de transesterificação. Embriõesindividuais foram colocados em uma ampla contendo 50 μl de hidróxido detrimetilsulfônio (TMSH) e 0,5 ml de hexano e incubados por trinta minutos àtemperatura ambiente mediante agitação. Metil ésteres de ácidos graxos (5 μlinjetados a partir da camada de hexano) foram separados e quantificadosutilizando um Cromatógrafo de Gases Hewlett-Packard 6890 equipado comuma coluna capilar de sílica fundida Omegawax 320 (Catálogo n° 24152,Supelco Inc.). A temperatura do forno foi programada para manter-se em 220°C por 2,6 minutos, aumentar para 240 °C a 20 °C/min e, em seguida, manter-se por 2,4 min adicionais. Gás veículo foi fornecido por um gerador dehidrogênio Whatman. Os tempos de retenção foram comparados com os demetil ésteres de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Check Prep., Inc.).Rotineiramente, cinco a dez embriões por evento foram analisados por meio deGC, utilizando a metodologia descrita acima.

Perfis de ácidos graxos de embriões para vinte eventos (cincoembriões cada) contendo pKR902 (Exemplo 7 - somente delta-8 dessaturasede Pavlova Iutheri) foram obtidos. Nenhuma atividade de delta-8 dessaturase(ou seja, conversão de LA em GLA ou ALA em STA) pôde ser detectada emnenhum dos eventos analisados.

Perfis de ácidos graxos de embriões para seis linhagens quecontêm pKR903 (Exemplo 8 - delta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri e delta-9elongase de Isochrysis galbana) são exibidos nas Figs. 8A e 8B. O percentualde dessaturação geral, percentual de dessaturação para substratos n-3 e n-6 erazões de dessaturação calculados também são exibidos nas Figs. 8A e 8B.

Resumindo as Figs. 8A e 8B, a delta-8 dessaturase de PavlovaIutheri funciona bem em soja para converter EDA e ERA em DGLA e ETA,respectivamente. A linhagem com o teor médio de DGLA mais alto (1890-3-5)continha embriões com um teor médio de DGLA de 20,7% e teor médio de ETAde 3,9%. O teor mais alto de DGLA e ETA para um embrião individual destalinhagem foi de 26,3% e 5,4%, respectivamente. O percentual geral médio maisalto de dessaturação (cálculo descrito abaixo) foi de 72,7%, em que opercentual geral mais alto de dessaturação para um embrião individual é de83,1%. Quando decomposto em percentual de dessaturação para ossubstratos n-6 e n-3, o percentual médio de dessaturação mais alto foi de80,5% e 47,9% para EDA e ERA, respectivamente. O percentual mais alto dedessaturação para um embrião individual foi de 89,9% e 55,9% para EDA eERA, respectivamente. A delta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri possui umapreferência para EDA sobre ERA em que a razão média de dessaturação variade 1,7 a 3,3. De forma interessante, algum GLA acumula-se em embriões emque a delta-8 dessaturase é bem expressa.

Além disso, resumindo as Figs. 8A e 8B, o percentual geral dedessaturação (C20% desasturação de delta-8) foi calculado por meio dedivisão da soma do percentual em peso para DGLA e ETA pela soma dopercentual em peso para EDA, DGLA, ERA e ETA, multiplicando-se por 100para expressão na forma de percentual. De forma similar, a dessaturação de n-3 delta-8 individual (% ERA de dessaturação delta-8) exibida foi calculadadividindo-se a soma do percentual em peso para ETA pela soma do percentualem peso para ERA e ETA, multiplicando-se por 100 para expressão na formade percentual. A razão entre dessaturação delta-8 para substratos n-6 e n-3(razão de percentual de dessaturação EDA/ERA) foi obtida dividindo-se opercentual de dessaturação delta-8 EDA pelo percentual de dessaturaçãodelta-8 ERA.

Exemplo 13

Clonagem da delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri em um vetor deexpressão de soja que contém a delta-9 elongase de euglena gracilis edelta-5 dessaturase de Mortierella alpina

A delta-9 elongase de Euglena gracilis (SEQ ID N° 32) foiamplificada com primers de oligonucleotídeos oEugEL1-1 (SEQ ID N° 33) eoEugEL1-2 (SEQ ID N° 34) utilizando a DNA Polimerase VentR® (Cat. N°M0254S, New England Biolabs Inc., Beverly MA) seguindo o protocolo dofabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagempCR-Blunt® utilizando o Kit de Clonagem PCR Zero Blunt® (InvitrogenCorporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR906 (SEQID N0 35).

O plasmídeo pKR906 foi digerido com Notl e o fragmento quecontém a delta-9 elongase de Euglena gracilis foi clonado no plasmídeopKR132 (SEQ ID N0 36, que é descrito na Patente PCT n0 WO 2004/071467)para gerar pKR953 (SEQ ID N0 37).

O vetor pKR287 (SEQ ID N0 38, que é descrita na Patente PCT n°WO 2004/071467, publicada em 26 de agosto de 2004, cujo teor é incorporadoao presente como referência) contém a delta-5 dessaturase de Mortierellaalpina (SEQ ID N0 39), que é descrita na Patente Norte-Americana n°6.075.183 e nas Patentes PCT n0 WO 2004/071467 e WO 2005/047479 (cujosteores são incorporados ao presente como referência), ladeadas pelo promotorglicinina Gy1 de soja e pela região de término de Iegumina A2 3' de ervilha(conjunto Gy1/MaD5/legA2). O vetor pKR287 foi digerido com Sbfl/BsIWI e ofragmento que contém o conjunto Gy1/MaD5/legA2 foi clonado no fragmentode Sbfl/BsiWI de pKR277 (SEQ ID N0 40, que é descrito na Patente PCT n°WO 2004/071467, cujo teor é incorporado ao presente como referência) paraproduzir pK952 (SEQ ID N0 41).

O vetor pKR457 (SEQ ID N0 42), que foi descrito anteriormente naPatente PCT n0 WO 2005/047479 (cujo teor é incorporado ao presente comoreferência), contém um local Not\ ladeado pelo promotor inibidor de tripsina desoja Kunitz (KTi) (Jofuku et al, Plant Cell 1: 1079-1093 (1989)) e a região detérmino 3' de KTi, cujo isolamento é descrito na Patente Norte-Americana n°6.372.965, seguido pelo término de transcrição de albumina de soja, que foidescrito anteriormente na Patente PCT n0 WO 2004/071467 (conjuntoKti/Notl/Kti3'Salb3'). Por meio de uma série de etapas de subclonagem,seqüências que contêm locais de restrição Asp718 foram adicionadas àsextremidades 5' e 3' do conjunto Kti/Notl/Kti3'Salb3* para gerar SEQ ID N0 43.Após a clonagem do fragmento Notl de pLF113 (Exemplo 4), que contém a delta-8dessaturase de Pavlova lutheri, no conjunto de Kti/Notl/Kti3'Salb3' modificado (SEQID N0 43), o fragmento de DNA foi digerido com Asp718 e clonado no local Sbfl depKR952 (SEQ ID N0 41) para gerar pKR970 (SEQ ID N0 44).

O plasmídeo pKR953 (SEQ ID N0 37) foi digerido com Pstl e ofragmento que contém a delta-9 elongase de Euglena gracilis foi clonado nolocl Sbfl de pKR970 (SEQ ID N0 44) para gerar pKR973 (SEQ ID N0 45, Fig. 5).Desta forma, a delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri poderá sercoexpressa com a delta-5 dessaturase de Mortierella alpina e a delta-9elongase de Euglena gracilis atrás de promotores fortes e específicos desementes.

Exemplo 14 Clonagem da delta-9 elongase de Euglena gracilis em um vetor deexpressão de soja

O gene para a delta-9 elongase de Euglena gracilis (SEQ ID N062) é liberado de pKR906 (SEQ ID N0 35) por meio de digestão com Nott eclonado no local Nott de pKR72 (SEQ ID N0 46 e Acesso ATCC n° PCA-6019)para produzir pKR912 (SEQ ID N0 47). É exibida uma ilustração esquemáticade pKR912 na Fig. 6.

Exemplo 15

Construção de um vetor que contém a delta-17 dessaturase deSaprolegnia diclina ε delta-15 dessaturase de FusariummoniliformeO vetor pKR886r (SEQ ID N0 48) foi elaborado por meio declonagem do fragmento Pstt que contém o conjunto Ann/Sdd17/BD30 depKR271 (SEQ ID N0 49, que é descrito na Patente PCT n0 WO 2004/071467)no local Sbft de pKR226 (SEQ ID N0 50, que é descrito na Patente PCT n0 WO2004/071467).

O conjunto pcon/Notl/Phas3' em plasmídeo pKR72 (SEQ ID N° 46e possui Acesso ATCC n° PTA-6019) foi amplificado utilizando primers deoligonucleotídeos oCon-1 (SEQ ID N° 51) e oCon-2 (SEQ ID N° 52) utilizando aDNA Polimerase VentR® (Cat. N0 M0254S, New England Biolabs Inc., BeverlyMA) seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foidigerido com Xbal e clonado no local Xbal de pUC19 para produzir pKR179(SEQ ID N° 53).

A delta-15 dessaturase de Fusarium monoliforme foi liberada doplasmídeo pKR578 (SEQ ID N° 54, que é descrita na Patente PCT n° WO2005/047479 e possui Acesso ATCC n° PTA-6280) por meio de digestão comNotl e foi clonada no local Notl do plasmídeo pKR179 para gerar pKR582 (SEQID N0 55).

O vetor pKR582 foi digerido com Pstl e o fragmento que contém adelta-15 dessaturase de Fusarium monoliforme foi clonado no local Sbfl depKR886r (SEQ ID N° 48) para gerar pKR983 (SEQ ID N° 56). Uma ilustraçãoesquemática de pKR983 é exibida na Fig. 7.

Exemplo 16

coexpressão de outras combinações de conjuntos detérmino/gene/promotores

Além dos genes, promotores, terminais e conjuntos genéticosdescritos no presente, os técnicos no asunto podem apreciar que outrascombinações de conjuntos de término/gene/promotores podem ser sintetizdaasde forma similar, mas não limitada à descrita no presente. As Patentes PCT n°WO 2004/071467 e WO 2004/071178, por exemplo, descrevem o isolamentode uma série de seqüências de término de transcrição e promotoras para usoem expressão específica de embriões em soja. Além disso, as Patentes PCT n°WO 2004/071467, WO 2005/047479 e WO 2006/012325 descrevem a síntesede diversas combinações de conjuntos de término/gene/promotores por meioda ligação de términos de transcrição, genes e promotores individuais juntosem combinações exclusivas. Geralmente, um local Notl ladeado pelo promotorapropriado (tal como os relacionados na Tabela 4, mas sem limitar-se a estes)e um término de transcrição (tal como os relacionados na Tabela 5, mas semlimitar-se a estes) é utilizado para clonar o gene desejado. Os locais Notlpodem ser adicionados a um gene de interesse, tais como os relacionados naTabela 6, mas sem limitar-se a estes, utilizando amplificação de PCR comoligonucleotídeos projetados para introduzir locais Notl nas extremidades 5' e3' do gene. O produto PCR resultante é digerido em seguida com Notl eclonado em um conjunto de término/Notl/promotor apropriado.

Além disso, as Patentes PCT n0 WO 2004/071467, WO2005/047479 e WO 2006/012325 descrevem a ligação adicional entre si deconjuntos de genes individuais em combinações exclusivas, junto comconjuntos marcadores selecionáveis apropriados, a fim de obter a expressãofenotípica desejada. Embora isso seja feito principalmente utilizando diferenteslocais de enzimas de restrição, os técnicos no assunto podem apreciar queuma série de métodos pode ser utilizada para atingir a combinação de términode transcrição, gene e promotor desejada. Ao fazê-lo, qualquer combinação deconjuntos de término de transcrição, gene e promotor específico de embriõespode ser atingida. Os técnicos no assunto podem também apreciar que estesconjuntos podem estar localizados sobre fragmentos de DNA individuais ousobre diversos fragmentos, em que a coexpressão de genes é o resultado dacotransformação de diversos fragmentos de DNA.

Tabela 4

Promotores Específicos de Sementes

<table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table>

Tabela 5

términos de transcrição

<table>table see original document page 116</column></row><table>Tabela 6

Genes do Processo Biossintético de EPA

<table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table>Exemplo 17

Síntese de um gene delta-8 dessaturase otimizado por códons derivado dePavlova lutheri em Yarrowia lipolyticaO uso de códons do gene delta-8 dessaturase de Pavlova lutheri(SEQ ID N0 14, Exemplo 4, acima) foi otimizado para expressão em Yarrowialipolytica, de forma similar à descrita na Patente PCT n0 WO 2004/101753.Especificamente, um gene delta-8 dessaturase otimizado por códons(denominado "PÍD8S", SEQ ID N0 57) foi projetado com base na seqüência decodificação do gene delta-8 dessaturase de acordo com a presente invenção(SEQ ID N0 14), segundo o padrão de uso de códons de Yarrowia (PatentePCT n0 WO 2004/101753), a seqüência de consenso em volta do códon deinício de tradução "ATG" e as regras gerais de estabilidade de RNA(Guhaniyogi, G. e Brewer, J., Gene 265 (1-2): 11-23 (2001)). Além damodificação do local de início de tradução, 161 bp da região de codificação de1272 bp foram modificados (13,1%) e 161 códons foram otimizados (38,1%).Nenhuma das modificações no gene otimizado por códons alterou a seqüência deaminoácidos da proteína codificada (SEQ ID N0 16). O gene PÍD8S projetado foisintetizado pela GenScript Corporation (Piscataway NJ) e clonado em pUC57(Acesso GenBank n° Y14837) para gerar pPiD8S (SEQ ID N0 58; Fig. 11-A).

Exemplo 18

Construção do plasmídeo pZUFmEgD9ES. que compreende um gene delta-9elongase otimizado por códons derivado de euglena gracilis

O Exemplo do presente descreve a construção do plasmídeopZUFmEgD9ES (SEQ ID N0 70), que compreende um gene delta-9 elongasesintético (derivado de Euglena gracilis) que foi otimizado por códons paraYarrowia lipolytica (denominado no presente "EgD9S" ou "EgD9ES"). Oplasmídeo pZUFmEgD9ES (SEQ ID N0 70; Fig. 9-D) foi construído por meio deligação de três vias utilizando fragmentos de plasmídeos pEgD9ES, pDMW263e pZUF17 (SEQ ID No 67, SEQ ID No 68 e SEQ ID No 69, respectivamente;Figs. 9-A, 9-B e 9-C, respectivamente). Este plasmídeo foi utilizado paraconstruir o plasmídeo pZUFmE9SP8S (SEQ ID N0 71) que compreende oPÍD8S otimizado por códons sintético do Exemplo 17 e EgD9S conformedescrito no presente no Exemplo 19, abaixo.

CONDICOES DE CRESCIMENTO DE EUGLENA GRACILIS, PERFIL DE LIPIDIOS E

ISOLAMENTO DE MRNA

Euglena gracilis foi obtido por meio do laboratório do Dr. RichardTriemer na Universidade do Estado de Michigan (East Lansing1 Ml). De 10 mlde cultivo em crescimento ativo, uma parcela de 1 ml foi transferida para 250ml de meio Euglena gracilis (Eg) em uma garrafa de vidro de 500 ml. Meio Egfoi fabricado por meio da combinação de 1 g de acetato de sódio, 1 g de extratode carne (U126-01, Difco Laboratories, Detroit Ml), 2 g de triptona Bacto®(0123-17-3, Difco Laboratories) e 2 g de extrato de levedura Bacto® (0127-17-9, Difco Laboratories) em 970 ml de água. Após esterilização por filtragem, 30ml de sobrenadante de solo em água (15-3790, Carolina Biological SupplyCompany, Burlington NC) foram adicionados assepticamente para gerar o meioEg final. Cultivos de Euglena gracilis cresceram a 23°C com um ciclo de 16horas de luz e oito horas de escuro por duas semanas sem agitação.

Após duas semanas, 10 ml de cultivo foram removidos paraanálise de lipídios e centrifugados a 1800 x g por cinco minutos. A pelota foilavada uma vez com água e novamente centrifugada. A pelota resultante foiseca por cinco minutos a vácuo, novamente suspensa em 100 μl de hidróxidode trimetilsulfônio (TMSH) e incubada à temperatura ambiente por quinzeminutos com agitação. Em seguida, adicionou-se 0,5 ml de hexano e asampolas foram incubadas por quinze minutos à temperatura ambiente comagitação. Metil ésteres de ácidos graxos (5 μl injetados da camada de hexano)foram separados e quantificados utilizando um Cromatógrafo de GasesHewlett-Packard 6890 equipado com uma coluna capilar de sílica defumadaOmegawax 320 (Supelco Inc., Cat. N0 24152). A temperatura do forno foiprogramada para manter-se em 220 °C por 2,7 minutos, aumentar para 240 °Ca 20 °C/min e manter-se em seguida por 2,3 min adicionais. Gás portador foifornecido por um gerador de hidrogênio Whatman. Os tempos de retençãoforam comparados com os de metil ésteres de padrões disponíveiscomercialmente (Nu-Check Prep., Inc., Cat. N0 U-99-A) e o cromatogramaresultante é exibido na Fig. 10.

O cultivo de duas semanas restante (240 ml) foi peletizado pormeio de centrifugação a 1800 χ g por dez minutos, lavado uma vez com água enovamente centrifugado. O RNA total foi extraído da pelota resultante utilizandoo reagente RNA STAT-60® (TEL-TEST, Inc., Friendswood TX), seguindo oprotocolo fornecido pelo fabricante (utilize 5 ml de reagente, RNA dissolvido em0,5 ml de água). Desta forma, 1 mg de RNA total (2 mg/ml) foi obtido a partir dapelota. O mRNA foi isolado a partir de 1 mg de RNA total utilizando o Kit dePurificação de mRNA (Amersham Biosciences, Piscataway NJ) seguindo oprotocolo fornecido pelo fabricante. Desta forma, foram obtidos 85 μg demRNA.

Síntese de cDNA de Euglena gracilis, construção de biblioteca ε

seqüenciamentoFoi gerada uma biblioteca de cDNA utilizando o Kit de Construçãode Bibliotecas de cDNA Cloneminer® (Cat. N0 18249-029, InvitrogenCorporation, Carlsbad CA), seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante(Versão B, 25-0608). Utilizando o método de rádio marcação, cDNA foisintetizado a partir de 3,2 μg de mRNA (descrito acima) utilizando o primerBiotina-aftB2-Oligo (dT). Após a síntese da primeira e da segunda fita, oadaptador attB'] foi adicionado, ligado e o cDNA foi fracionado de tamanhoutilizando cromatografia de coluna. DNA de frações 7 e 8 (com tamanho quevaria de cerca de 800 a 1500 bp) foi concentrado, recombinado em pDONR®222 e transformado em células resistentes a fagos E. coli ElectroMAC®DH10B® T1 (Invitrogen Corporation). A biblioteca de Euglena gracilis foidenominada eeg1c.

Para seqüenciamento, os clones foram recuperados em primeirolugar de cultivos de glicerol arquivados cultivados/congelados em placas demeios de congelamento com 384 cavidades e reproduzidos com um reprodutor384 pin estéril (Genetix, Boston MA) em placas de microtítulos com 384cavidades que contêm LB + 75 μg/ml de canamicina (placas reproduzidas).Plasmídeos foram isolados em seguida, utilizando o método de kit deamplificação de modelos de seqüenciamento de DNA Templiphi (AmershamBiosciences) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, o métodoTempliphi utiliza DNA polimerase de bacteriófago φ29 para amplificar DNA defita simples ou fita dupla circular por meio de amplificação de círculo rolanteisotérmico (Dean et al, Genome Res. 11: 1095-1099 (2001); Nelson et al,Biotechniques 32 : S44-S47 (2002)). Após cultivo por vinte horas a 37°C,células das placas reproduzidas foram adicionadas a 5 μΙ de tampão dediluição e desnaturadas a 95 °C por três minutos para Iisar parcialmente ascélulas e liberar o modelo desnaturado. Foram adicionados em seguida 5 μΙ demistura prévia Templiphi a cada amostra e a mistura de reação resultante foiincubada a 30 °C por dezesseis horas, depois a 65 0C por dez minutos paradesativar a atividade de DNA polimerase de φ29. Quantificação de DNA com oReagente de Quantificação de dsDNA PicoGreen® (Molecular Probes) foirealizada após a diluição das amostras amplificadas 1:3 em água destilada.

Os produtos amplificados foram desnaturados em seguida a 95°Cpor dez minutos e seqüenciados no final em placas com 384 cavidades,utilizando o primer universal M13F (SEQ ID N° 63) e o Kit de Seqüenciamentode Prismas ABI BigDye versão 3.1. Para a reação de seqüenciamento, foramutilizados 100 a 200 ng de modelos e 6,4 pmol de primers e as condições dereação a seguir foram repetidas por 25 vezes: 96 0C por dez segundos, 50 0Cpor cinco segundos e 60 0C por quatro minutos. Após limpeza com base emetanol, produtos de reação de seqüenciamento de ciclos foram resolvidos edetectados em seqüenciadores automáticos Perkin-Elmer ABI 3730x1.

Identificação de homólogos de enzimas de alongamento de ácidos graxospoliinsaturados de cadeia longa de biblioteca de CDNA de EUGLENA

GRACILIS EEG1C

Clones de cDNA que codificam homólogos de enzimas dealongamento de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (ou seja,homólogos de LC-PUFA ELO ou delta-9 elongases) foram identificados eanalisados por meio de condução de buscas BLAST em busca de similaridadea seqüências contidas no banco de dados "nr" de BLAST, conforme descritoacima (vide Exemplo 2).

A busca BLASTX utilizando as seqüências de nucleotídeos doclone eeg1c.pk001.n5.f revelou similaridade entre a proteína codificada pelocDNA e a enzima de alongamento de PUFA de cadeia longa de Isochrysisgalbana (SEQ ID N0 59) (Acesso NCBI n° AAL37626 (Gl 17226123), localAAL37626, CDS AF390174; Qi et al, FEBS Lett. 510 (3): 159-165 (2002). Aseqüência de uma parte do inserto de cDNA do clone eeg1c.pk001.n5.f éexibida em SEQ ID N0 60 (extremidade 5' do inserto de cDNA). Seqüênciaadicional foi obtida a partir da extremidade 3' do inserto de cDNA deeeg1c.pk001.n5.1 conforme descrito acima, mas utilizando osoligonucleotídeos WobbIeT com primer de cauda poli(A). Resumidamente, oprimer WobbleT é uma mistura equimolar de poli(T)A, poli(T)C we poli(T)G 21mer, utilizados para seqüenciar a extremidade 3' de clones de cDNA.

A seqüência posterior 3' é exibida em SEQ ID N0 61. As duasseqüências, 5' e 3', foram alinhadas utilizando Sequencher® (Versão 4.2,Gene Codes Corporation, Ann Arbor Ml) e a seqüência resultante para ocDNA é exibida em SEQ ID N0 62. Seqüência para a seqüência decodificação do cDNA em eeg1c.pk001.n5.f e a seqüência de aminoácidosdeduzida correspondente é exibida em SEQ ID N0 32 e SEQ ID N0 64,respectivamente.

A seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID N0 64 foiavaliada por meio de BLASTP, gerando um valor pLog de 38,70 (valor E de 2e-39) contra a seqüência de Isochrysis galbana (SEQ ID N0 65). A delta-9elongase de Euglena gracilis é 39,4% idêntica à seqüência de delta-9 elongasede Isochrysis galbana utilizando o método de Jotun Hein. Cálculos depercentuais de identidade de seqüências realizados por meio do método deJotun Hein (Hein, J. J., Meth. Enz. 183: 626-645 (1990)) foram realizadosutilizando o programa MegAlign® v6.1 da suíte de computação bioinformáticaLASARGENE (DNASTAR Inc., Madison Wl) com os parâmetros padrão paraalinhamentos em pares (COMPRIMENTO DE PALAVRA = 2). A delta-9elongase de Euglena gracilis é 31,8% idêntica à seqüência de delta-9 elongasede Isochrysis galbana utilizando o método Clustal V. Cálculos de percentuaisde identidade de seqüências realizados por meio do método Clustal V(Higgins, D. G. e Sharp, P. M., Comput. AppL Biosci. 5: 151-153 (1989);Higgins et al, Comput. Appi Biosci. 8: 189-191 (1992)) foram realizadosutilizando o programa MegAlign® v6.1 da suíte de computação bioinformáticaLASARGENE (DNASTAR Inc., Madison Wl) com os parâmetros padrão paraalinhamentos em pares (COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADEDO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5,ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5 e PENALIDADE DO COMPRIMENTODO INTERVALO = 10). Avaliações e probabilidades de BLAST indicam que opresente fragmento de ácido nucleico (SEQ ID N0 32) codifica uma delta-9elongase de Euglena gracilis completa.Síntese do gene delta-9 elongase otimizado por códons

O uso de códons do gene delta-9 elongase de Euglena gracilis(SEQ ID N0 32 e 64) foi otimizado para expressão em Yarrowia Iipolytica, deforma similar à descrita acima (vide Exemplo 17) e WO 2004/101753.Especificamente, um gene delta-9 elongase otimizado por códons (denominado"EgD9S"), SEQ ID N0 66, foi projetado, com base na seqüência de codificaçãode delta-9 elongase (clone eeg1c.pk001.n5.f), de acordo com o padrão de usode códons de Yarrowia, a seqüência de consenso em volta do códon de iníciode tradução "ATG" e as regras gerais de estabilidade de RNA (Guhaniyogi, G.e Brewer1 J., acima)). Além da modificação do local de início de tradução, 117bp da região de codificação de 777 bp foram modificados (15,1%) e 106 códonsforam otimizados (40,9%). Nenhuma das modificações no gene otimizado porcódons alterou a seqüência de aminoácidos da proteína codificada (SEQ ID N0 64).O gene denominado EgD9S (também "EgD9ES") foi sintetizado pela GenScriptCorporation (Piscataway NJ) e foi clonado em pUC57 (Acesso GenBank n° Y14837)para gerar pEgD9ES (SEQ ID N0 67, Fig. 9A).

Construção de plasmídeo PDMW263

O plasmídeo pY5-30 (SEQ ID N0 78) (descrito anteriormente naPatente PCT n0 WO 2005/003310 (cujo teor é incorporado ao presente comoreferência) é um plasmídeo impulsionador que pode reproduzir-se em E. coli eYarrowia lipolytica. O plasmídeo pY5-30 contém o seguinte: uma seqüência dereprodução autônoma de Yarrowia (ARS18); uma origem de reprodução deplasmídeo CoIEI; um gene de resistência a ampicilina (AmpR) para seleção emE. coli; um gene LEU2 de Yarrowia para seleção em Yarrowia; e um geneTEF::GUS::XPR quimérico. O plasmídeo pDMW263 (SEQ ID N0 68; Fig. 9B) foicriado a partir de pY5-30, por meio de substituição do promotor de TEF com opromotor FBAINm de Yarrowia lipolytica (Patente PCT n0 WO 2005/049805)utilizando métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto. Resumidamente,este promotor designa um promotor modificado que está localizado na regiãonão traduzida acima no fluxo 5' na frente do códon de início de tradução "ATG"da enzima frutose-bisfosfato aldolase (E. C. 4.1.2.13) codificada pelo gene fbale que é necessária para expressão, mais uma parte da região de codificação 5'que possui um intron, em que FBAINm possui uma exclusão de 52 bp entre ocódon de início de tradução ATG e o intron do promotor de FBAIN (de forma aincluir apenas 22 aminoácidos do terminal N) e um novo motivo de consensode tradução após o intron. A Tabela 7 resume os componentes de pDMW263.

Tabela 7

<table>table see original document page 125</column></row><table>Construção do plasmídeo pZUF17

O plasmídeo pZUF17 (SEQ ID N0 69; Fig. 9C) possui umaestrutura similar à de pDMW236. O plasmídeo compreende, entretanto, umgene Ura3 de Yarrowia para seleção em Yarrowia e um geneFBAIN::D17S::Pex20 quimérico, em vez do gene LEU2 e geneFBAINm::GUS::XPR quimérico de pDMW263. A Tabela 8 resume oscomponentes de pZUF17.Tabela 8

Componentes do Plasmídeo PZUF17

<table>table see original document page 126</column></row><table>

Construção final do plasmídeo pZUFmEgD9ES

O fragmento de Nco\/Not\ do plasmídeo pEgD9ES (SEQ ID N0 67;Fig. 9A; que compreende EgD9ES) e o fragmento de SalUNcol de pDMW263(SEQ ID N0 68; Fig. 9B; que compreende o promotor FBAINm de YarrowiaIipolytica) foram utilizados direcionalmente para substituir o fragmento deSalUNofí de pZUF17 (SEQ ID N0 69; Fig. 9C). Isso resultou na geração depZUFmEgD9ES (SEQ ID N0 70; Fig. 9D) que compreende um geneFBAINm::EgD9ES:Pex20 quimérico.

Exemplo 19

Construção de plasmídeo pZUFmE9SP8S. que compreende o gene delta-8dessaturase otimizado por códons derivado de pavlova lutherie o genedelta-9 elongase otimizado por códons derivado de Euglena gracilis

O presente Exemplo descreve a construção do plasmídeopZUFmE9SP8S (SEQ ID N0 71), que compreende o PÍD8S otimizado porcódons sintético do Exemplo 17 e o EgD9ES otimizado por códons sintético doExemplo 18. O plasmídeo pZUFmE9SP8S (SEQ ID N° 71; Fig. 11 D) foiconstruído por meio de ligação de quatro vias utilizando fragmentos dos plasmídeospPiD8S, pZUFmEgD9ES, pEXPGUS1-C e pZGD5T-CP (SEQ ID N° 58, SEQ ID N°70, SEQ ID N° 72 e SEQ ID N° 73, respectivamente; Figs. 11A, 9D, 11B e 11C,respectivamente). Este plasmídeo foi utilizado para testar a coexpressão funcionalde PÍD8S e EgD9ES, conforme descrito no Exemplo 20, abaixo.

Plasmídeo pEXPGUSI-C

O plasmídeo pEXPGUS1-C (SEQ ID N° 72, Fig. 11B) compreendeum gene EXP1::GUS::XPR quimérico (nucleotídeos 953-3963 de SEQ ID N°72). O promotor ???1" nesse gene quimérico designa a região -1000 a -1 bpnão traduzida acima no fluxo 5' em frente ao códon de início de tradução "ATG"de uma proteína codificada pelo gene "YALI0C12034g" de Yarrowia Iipolytica(Acesso GenBank n° XM 501745) e que é necessário para expressão. Combase em homologia significativa de "YALI0C12034g" para a proteína deexportação não clássica de Saccharomyces cerevisiae sp|Q12207 2 (cujafunção está envolvida em um processo inovador de exportação de proteínasque não contém uma seqüência de sinal divisível), este gene foi denominadogene expl, que codifica uma proteína denominada EXP1 (Pedido Norte-Americano n° 11/265.761). "GUS" e "XPR" são definidos como descrito acimana Tabela 7.

Plasmídeo PZGD5T-CP

O plasmídeo pZGD5T-CP (SEQ ID N° 73, Fig. 11C) compreendeum gene GPD::MAD5::Pex16 quimérico (nucleotídeos 3200-346 de SEQ ID N°73). O promotor "GPD" neste gene quimérico designa a região não traduzidaacima no fluxo 5' em frente ao códon de início de tradução "ATG" de umaproteína codificada pelo gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD) deYarrowia Iipolytica e que é necessária para expressão (Pedido PCT n° WO2005/003310). A região de codificação "MAD5" do gene quimérico correspondeao gene Δ5 dessaturase de Mortierella alpina (Acesso GenBank n° AF067654),enquanto "Pex16" designa o terminal Pex16 do gene Pex16 de Yarrowia(Acesso GenBank n° U75433).

Construção final do plasmídeo pZUFmE9SP8S

O fragmento de NcoUNofí do plasmídeo pPiD8S (SEQ ID N0 58,Fig. 11 A, que compreende o gene delta-8 dessaturase sintético de acordo coma presente invenção (ou seja, PÍD8S), o fragmento CIaUNcol de pEXPGUS1-C(SEQ ID N0 72, Fig. 11B, que compreende o promotor EXP1) e o fragmentoNotUPacl do plasmídeo pZGD5T-CP (SEQ ID N0 73, Fig. 11C, que compreendeo terminal Pex16) foram utilizados direcionalmente para substituir o fragmentoCIaUPacl de pZUFmEgD9ES (SEQ ID N0 70, Fig. 9D) para gerarpZUFmE9SP8S (SEQ ID N0 71, Fig. 11 D).

Exemplo 20

Expressão funcional de plasmídeo pZUFmE9SP8S em Yarrowia lipolytica

O presente Exemplo descreve a expressão do plasmídeopZUFmE9SP8S, que compreende o gene quimérico FBAINm::EgD9ES::Pex20e o gene quimérico EXP::PiD8S::Pex16. A expressão de pZUFmE9SP8S emYarrowia lipolytica gerou a produção de até 2,8% de EDA e 0,5% de DGLA.

Especificamente, pZUFmE9SP8S (SEQ ID N0 71, Fig. 11 D) foitransformado em Y20362U de Yarrowia lipolytica (um mutante Ura autônomocom Acesso ATCC n° 20362, que foi gerado por meio de seleção de resistênciaa FOA), conforme descrito acima. As células transformadoras foram colocadasem placas sobre placas de meios de seleção MM e mantidas a 30 0C por dois atrês dias. Quinze transformadores cultivados sobre as placas MM foramtomados e novamente riscados sobre placas MM novas. Uma vez cultivadas,estas linhagens foram inoculadas individualmente em 3 ml de MM líquido a 30°C e cultivadas a 250 rpm/min por dois dias. As células foram recolhidas pormeio de centrifugação, os lipídios foram extraídos e metil ésteres de ácidosgraxos foram preparados por meio de transesterificação e analisados emseguida com um GC Hewlett-Packard 6890.

Análises GC demonstraram que houve cerca de 2,8% de EDA(C20:2) e 0,3% de DGLA (C20:3) de lipídios totais produzidos em treze destesquinze transformadores, em que a eficiência de conversão de EDA em DGLAnessas treze linhagens ocorreu em velocidade média de cerca de 9,7%. Alinhagem n°7 produziu 2,8% de EDA e 0,5% de DGLA, com uma eficiência deconversão de cerca de 15%. A expressão "eficiência de conversão" designa aeficiência por meio da qual uma enzima específica (tal como a delta-8dessaturase otimizada por códons identificada no presente como PÍD8S) podeconverter substrato (ou seja, EDA) em produto (ou seja, DGLA). A eficiência deconversão foi medida de acordo com a fórmula a seguir:([produto]/[substrato+produto])*100, em que "produto" indica o produto imediato e todos os produtos no processo dele derivado.

Exemplo 21

Seleção de clorsulfurona (ALS) ε seleção de clorsulfürona (ALS) deregeneração de plantas

Após o bombardeamento, o tecido é dividido entre dois frascoscom meios SB196 novos e cultivado conforme descrito no Exemplo 11. Seis asete dias após o bombardeamento, SB196 é substituído com SB196 novo quecontém agente de seleção de 100 ng/ml de clorsulfurona. O meio de seleção érenovado semanalmente. Quatro a seis semanas após a seleção, pode-seobservar o crescimento de tecido transformado verde a partir de conjuntosembriogênicos necróticos não transformados. Tecido verde isolado é removidoe inoculado em placas com múltiplas cavidades que contêm SB196 para gerarnovos cultivos de suspensão embriogênica transformados propagados deforma clonal.Regeneração de embriões somáticos de soja em plantas

A fim de obter plantas inteiras a partir de cultivos de suspensãoembriogênica, o tecido deve ser regenerado. Embriões são amadurecidosconforme descrito no Exemplo 11. Após subcultivo sobre o meio SB103 portrês semanas, embriões individuais podem ser removidos dos conjuntos eselecionados pelas alterações nas suas composições de ácido graxo conformedescrito no Exemplo 12. Dever-se-á observar que qualquer fenótipo detectável,resultante da expressão dos genes de interesse, poderá ser selecionado nestaetapa. Isso incluiria, mas sem limitar-se a alterações do perfil de ácido graxo,perfil e teor de proteínas, teor de carboidratos, velocidade de crescimento,viabilidade ou capacidade de desenvolvimento normal em uma planta de soja.

Embriões individuais amadurecidos são dissecados por meioda sua colocação em uma placa petri pequena vazia (35 χ 10 mm) porcerca de quatro a sete dias. As placas são vedadas com fita de fibra (o quecria uma pequena câmara de umidade). Embriões dissecados sãoplantados em meio SB71-4, onde são mantidos em germinação sob asmesmas condições de cultivo descritas acima. Plantículas germinadas sãoremovidas do meio de germinação, enxaguadas completamente com águae, em seguida, são plantadas em Redi-Earth em uma bandeja de pacotecom 24 células, coberta com uma cúpula de plástico transparente. Apósduas semanas, a cúpula é removida e as plantas são endurecidas por maisuma semana. Caso as plantículas parecessem endurecidas, elas eramtransplantadas para um vaso de 25,4 cm de Redi-Earth com até trêsplantículas por vaso. Após dez a dezesseis semanas, as sementesmaduras são colhidas, picadas e analisadas para determinar o seu teor deácidos graxos conforme descrito no Exemplo 12.

Receitas de meios podem ser encontradas no Exemplo 12 e oestoque de clorsulfurona é de 1 mg/ml em 0,01 N hidróxido de amônio.Exemplo 22

COEXPRESSÃO DA DELTA-9 ELONGASE DE euglena gracilis com A DELTA-8

dessaturase de pavlova lutheri (CCMP459), delta-5 dessaturase deMortierella alpina, delta-17 dessaturase de Saprolegnia diclina ε delta-

15 dessaturase de fusarium moniliforme em embriões de sojatransformados com vetores de expressão de soja PKR973 ε pKR983

Cultivo de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack foitransformado com os fragmentos AscI de pKR973 (SEQ ID N0 45, Fig. 5) epKR983 (SEQ ID N0 56, Fig. 7) (fragmentos que contêm os conjuntos deexpressão), conforme descrito para produção no Exemplo 11. Ostransformadores foram selecionados utilizando clorsulfurona conforme descritono Exemplo 21 e os embriões foram amadurecidos conforme descrito noExemplo 11. Um subconjunto de embriões de soja gerados a partir de cadaevento (dez embriões por evento) foi colhido e analisado para determinar acomposição de ácidos graxos conforme descrito no Exemplo 12. Ácidos graxosforam identificados por meio de comparação de tempos de retenção com os depadrões autênticos.

Desta forma, foram analisados 243 eventos transformados compKR973 e pKR983. Dos 243 eventos analisados, foram identificados 117 queproduziram EPA em pelo menos um embrião de dez analisados em umaabundância relativa de mais de 1,0% do total de ácidos graxos. Destes, foramidentificados quinze que produziram EPA em pelo menos um embrião dentredez analisados em abundância relativa de mais de 10,0% do total de ácidosgraxos. O perfil médio de ácidos graxos para os dez melhores eventos de EPA(média de sete a dez embriões individuais) é exibido na Fig. 14. Ácidos graxossão identificados como 16:0 (palmitato), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácidooleico), LA, GLA, ALA, EDA, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA, EPA e DPA; e ascomposições de ácidos graxos relacionadas na Fig. 14 são expressas na forma

Claims

de percentual em peso (% peso) do total de ácidos graxos. Para a Fig. 14,ácidos graxos relacionados como "outros" incluem: 18:2 (5,9), STA, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7, 11) ou 20:2 (8, 11) e 20:3 (5, 11, 14). Cada um destes ácidosgraxos está presente em uma abundância relativa de menos de 1% do total de ácidos graxos. A atividade da delta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri(CCMP459) é expressa na forma de percentual de dessaturação de delta-8(%Desat) calculado de acordo com a fórmula a seguir:([produto]/[substrato+produto])*100.Mais especificamente, o percentual combinado de dessaturaçãodelta-8 para EDA e ERA é exibido como "%Dessat delta-8 total", determinadocomo: ([DGLA + ARA + ERA + ETA + EPA + DPA]/[EDA + DGLA + ARA + ERA+ JUN + ETA + EPA + DPA])*100.Em resumo da Fig. 14, a delta-8 dessaturase de Pavlova Iutheri(CCMP459) funcionou em soja para converter EDA e ERA em DGLA e ETA,respectivamente, e estas foram adicionalmente convertidas em outros LC-PUFAs. A Iinhgem AFS 4802-3-14, a linhagem de alto EPA com o percentualgeral médio mais alto de dessaturação delta-8, apresentou percentual geral dedessaturação delta-8 de 82,5%.

1. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, que compreende:(a) uma seqüência de nucleotídeos que codifica umpolipeptídeo que possui atividade de delta-8 dessaturase, em que opolipeptídeo possui pelo menos 80% de identidade de aminoácidos, com baseno método Clustal V de alinhamento, em comparação com uma seqüência deaminoácidos conforme descrito em SEQ ID N0 16;(b) complemento da seqüência de nucleotídeos, em que aseqüência de nucleotídeos possui pelo menos 80% de identidade deseqüências, com base no método BLASTN de alinhamento, em comparaçãocom uma seqüência de nucleotídeos conforme descrito em SEQ ID N0 15; ou(c) um complemento da seqüência de nucleotídeos de (a) ou(b), em que o complemento e a seqüência de nucleotídeos consistem domesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.

2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, em quea seqüência de aminoácidos do polipeptídeo possui pelo menos 85% deidentidade de seqüências, com base no método Clustal V de alinhamento, emcomparação com SEQ ID N0 16.

3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, em quea seqüência de aminoácidos do polipeptídeo possui pelo menos 90% deidentidade de seqüências, com base no método Clustal V de alinhamento, emcomparação com SEQ ID N0 16.

4. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, em quea seqüência de aminoácidos do polipeptídeo possui pelo menos 95% deidentidade de seqüências, com base no método Clustal V de alinhamento, emcomparação com um dentre SEQ ID N0 16.

5. POLINUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, emque a seqüência de nucleotídeos compreende SEQ ID N0 15.

6. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, em quea seqüência de aminoácidos do polipeptídeo compreende:(a) SEQ ID N0 16; ou(b) uma seqüência de aminoácidos que difere das seqüênciasde aminoácidos em (a) por pelo menos uma substituição de aminoácidosconservadora.

7. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, quecodifica uma enzima delta-8 dessaturase conforme descrito em SEQ ID N0 57em que pelo menos 161 códons são otimizados por códons para expressão emYarrowia sp.

8. CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, quecompreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5ou 6, ligado operativamente a pelo menos uma seqüência reguladora.

9. CÉLULA, que compreende a construção de DNArecombinante de acordo com a reivindicação 8.

10. CÉLULA, conforme a reivindicação 9, caracterizada pelofato de que a mencionada célula é selecionada a partir do grupo que consistede plantas e levedura.

11. YARROWIA SP1 que compreende a construçãorecombinante de acordo com a reivindicação 8.

12. MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS, quecompreende a transformação de uma célula com a construção recombinantede acordo com a reivindicação 8 e seleção das células transformadas com aconstrução recombinante de acordo com a reivindicação 8.

13. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PLANTASTRANSFORMADAS, que compreende a transformação de uma célula deplanta com o polinucleotídeo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5ou 6 e regeneração de plantas a partir da célula de planta transformada.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, em que aplanta é uma planta de soja.

15. MÉTODO DE PRODUÇÃO, de leveduras que compreendea transformação de uma célula de levedura com o polinucleotídeo de acordocom qualquer das reivindicações 1, 5 ou 6 e cultivo de levedura a partir dacélula de levedura transformada.

16. MÉTODO DE PRODUÇÃO, de leveduras que compreendea transformação de uma célula de levedura com o polinucleotídeo de acordocom qualquer das reivindicações 1, 5 ou 6 e cultivo de levedura a partir dacélula de levedura transformada, em que a levedura é uma levedura oleaginosaselecionada a partir do grupo de: Yarrowia, Candida, Rhodotorula,Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.

17. SEMENTE, que compreende a construção recombinantede acordo com a reivindicação 8.

18. SEMENTE, obtida a partir da planta elaborada por meio dométodo de acordo com qualquer das reivindicações 13 ou 14.

19. MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOSPOLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM CÉLULAS, que compreende:(a) transformação de uma célula com a construçãorecombinante de acordo com a reivindicação 8; e(b) seleção das células transformadas que elaboram ácidosgraxos poliinsaturados com cadeia longa.

20. ÓLEO, obtido a partir da semente de acordo com areivnidicação 17.

21. ÓLEO, obtido a partir da semente de acordo com areivindicação 18.

22. ÓLEO, obtido a partir da levedura elaborada por meio dométodo de acordo com qualquer das reivindicações 15 ou 16.

23. MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOSPOLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM CÉLULAS VEGETAIS, quecompreende:(a) transformação de uma célula com a construçãorecombinante de acordo com a reivindicação 8; e(b) seleção das células transformadas que elaboram ácidosgraxos poliinsaturados de cadeia longa.

24. MÉTODO DE PRODUÇÃO, de pelo menos um ácido graxopoliinsaturado em uma célula de soja, que compreende:(a) transformação de células de soja com uma primeiraconstrução de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo isoladoque codifica pelo menos um polipeptídeo delta-8 dessaturase, ligadooperativamente a pelo menos uma seqüência reguladora e pelo menos umaconstrução de DNA recombinante adicional que compreende umpolinucleotídeo isolado, ligado operativamente a pelo menos uma seqüênciareguladora, que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo queconsiste de delta-4 dessaturase, delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase,delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase, delta-17 dessaturase, delta-9dessaturase, delta-9 elongase, elongase C14/16. elongase C16/18, elongase C18/20e elongase C20/22;(b) regeneração de plantas de soja a partir da célulatransformada da etapa (a); e(c) seleção das sementes obtidas a partir das plantas da etapa(b) que contêm um nível alterado de ácidos graxos poliinsaturados emcomparação com o nível em sementes obtidas a partir de uma planta de sojanão transformada.

25. PLANTA OLEAGINOSA, que compreende a construçãorecombinante de acordo com a reivindicação 8.

26. PLANTA OLEAGINOSA, que compreende:(a) uma primeira construção de DNA recombinante quecompreende um polinucleotídeo isolado que codifica pelo menos umpolipeptídeo delta-8 dessaturase, ligado operativamente a pelo menos umaseqüência reguladora; e(b) pelo menos uma construção de DNA recombinanteadicional que compreende um polinucleotídeo isolado, ligado operativamente apelo menos uma seqüência reguladora, que codifica um polipeptídeoselecionado a partir do grupo que consiste de delta-4 dessaturase, delta-5dessaturase, delta-6 dessaturase, delta-12 dessaturase, delta-15 dessaturase,delta-17 dessaturase, delta-9 dessaturase, delta-9 elongase, elongase C14Zi6,elongase Ci6/ie, elongase C18/20 e elongase C20/22·

27. PLANTA OLEAGINOSA, de acordo com qualquer dasreivindicações 25 ou 26, em que a planta oleaginosa é selecionada a partir dogrupo que consiste de soja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão,linho e açafrão.

28. PLANTA OLEAGINOSA, de acordo com qualquer dasreivindicações 25 ou 26, em que a planta oleaginosa é selecionada a partir dogrupo que consiste de soja, espécies de Brassica, girassol, milho, algodão,linho e açafrão, e também em que o ácido graxo poliinsaturado é selecionado aparitr do grupo que consiste de ácido araquidônico, ácido eicosadienóico, ácidoeicosapentaenóico, ácido eicosatetraenóico, ácido eicosatrienóico, ácidodiomo-gama-linolênico, ácido docosapentaenóico e ácido docosahexaenóico.

29. SEMENTE, obtida a partir da planta oleaginosa de acordocom a reivindicação 25.

30. SEMENTE, obtida a partir da planta oleaginosa de acordocom a reivindicação 26.

31. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, obtidos a partir da sementede acordo com a reivindicação 29.

32. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, obtidos a partir da sementede acordo com a reivindicação 30.

33. ÓLEO, obtido por meio do método de acordo com qualquerdas reivindicações 23 ou 24.

34. ALIMENTO OU RAÇÃO, que incorpora o óleo de acordocom a reivnidicação 31.

35. ALIMENTO OU RAÇÃO, que incorpora o óleo de acordocom a reivnidicação 32.

36. ALIMENTO OU RAÇÃO, que incorpora o óleo de acordocom a reivnidicação 33.

37. ALIMENTO OU RAÇÃO, que compreende a semente deacordo com a reivindicação 29.

38. ALIMENTO OU RAÇÃO, que compreende a semente deacordo com a reivindicação 31.

39. ALIMENTO OU RAÇÃO, que compreende um ingredientederivado do processamento das sementes de acordo com a reivindicação 29.

40. ALIMENTO OU RAÇÃO, que compreende um ingredientederivado do processamento da semente de acordo com a reivindicação 30.

41. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, que compreende umaseqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que possui atividadedelta-8 dessaturase, em que a seqüência de nucleotídeos possui pelo menos86% de identidade de seqüências, com base no método BLASTN dealinhamento, em comparação com uma seqüência de nucleotídeos conformedescrito em SEQ ID N0 15.

42. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, de acordo com areivindicação 31, em que o subproduto é lecitina.

43. ÓLEO OU SUBPRODUTOS, de acordo com areivindicação 32, em que o subproduto é lecitina.

44. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOSPOLIINSATURADOS DE CADEIA LONGA EM CÉLULAS, que contêm nívelreduzido de subprodutos ácidos graxos, em que o mencionado métodocompreende:(a) transformação de células hospedeiras com pelo menosuma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeoisolado que codifica pelo menos duas delta-8 dessaturases ligadasoperativamente a pelo menos uma seqüência reguladora; e(b) seleção das células hospedeiras transformadas obtidas quecontêm um nível reduzido de subprodutos ácidos graxos, em comparação como nível desses subprodutos ácidos graxos metabólicos em uma célulahospedeira transformada que contém pelo menos uma construção de DNArecombinante que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica umadelta-8 dessaturase ligada operativamente a uma seqüência reguladora.

45. PROLE DA PLANTA, de acordo com qualquer dasreivindicações 25 ou 26.