BRPI0710455A2 - polipeptìdeo isolado, polinucleotìdeo isolado e métodos para aumentar o nìvel de um polipeptìdeo em uma planta, para modular o nìvel de um polipeptìdeo em uma planta e para modificar o crescimento de uma planta - Google Patents

Abstract

<B>POLIPEPTìDEO ISOLADO, POLINUCLEOTìDEO ISOLADO E MéTODOS PARA AUMENTAR O NìVEL DE UM POLIPEPTìDEO EM UMA PLANTA, PARA MODULAR O NìVEL DE UM POLIPEPTIDEO EM UMA PLANTA E PARA MODIFICAR O CRESCIMENTO DE UMA PLANTA<D>. A invenção fornece moléculas de polinucleotídeo isoladas que codificam alelos mutantes e de tipo selvagem do gene D9 do milho. A invenção fornece ainda métodos para modificar o crescimento de plantas que envolvem o uso destas moléculas de polinucleotídeo isoladas, polipeptídeos isolados e plantas transformadas, sementes e células.

Description

MOLÉCULAS DE POLINUCLEOTÍDEO ISOLADAS CORRESPONDENDO AOSALELOS MUTANTE E TIPO SELVAGEM DO GENE D9 DE MILHO EMÉTODOS DE USO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada com a manipulaçãogenética de organismos, particularmente plantas, com genesque controlam o crescimento e desenvolvimento. A invençãoestá relacionada ainda com genes que controlam ocrescimento, incluindo formas homólogas e mutantes, asproteínas codificadas a partir dos mesmos e plantastransformadas com esses genes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Plantas anãs têm tido um maior impacto na agricultura.Variedades anãs de trigo são amplamente usadas na Américado Norte devido tanto ao potencial reduzido para acamamentoe alta produção. Existem outros benefícios que podem serpercebidos do uso de culturas anãs incluindo reduções nasquantidades de pesticidas e fertilizantes requeridas, altasdensidades de plantação, e reduzidos custos de trabalho.

Em vista das tendências atuais de aumento populacionalhumano e redução da superfície adequada para agricultura,aumentar a produtividade agrícola é, e continuará a ser, umdesafio de suprema importância. Plantas cultivadas anãstêm sido e continuarão a ser importantes componentes donosso sistema de produção agrícola. O aumento da utilizaçãode plantas cultivadas anãs pode ajudar a responder asdemandas da produção agrícola do futuro. No entanto,variedades anãs comercialmente aceitáveis não estãodisponíveis para todas as cultivares.

Além do uso de plantas anãs para controlar a alturadas plantas, agentes químicos sintéticos são rotineiramenteaplicados para certas espécies de plantas importanteseconomicamente para reduzir o crescimento. Reguladores docrescimento das plantas, conhecidos como retardantes docrescimento, são usados para reduzir o alongamento do cauleem uma variedade de culturas, incluindo algodão, videiras,árvores frutíferas, amendoins, trigo e ornamentais taiscomo azaléias, crisântemos, hortênsias, bico-de-papagaio emuitas plantas acamadas. Todos os retardantes decrescimento comumente usados são inibidores da biosínteseda giberelina e limitam o crescimento do caule ou do brotoatravés da redução do alongamento. Nos Estados Unidos, oretardante de crescimento mais amplamente utilizado é ocloreto de mepiquat, que é registrado para uso em algodão.Benefícios atribuídos para o uso do cloreto de mepiquat emalgodão incluem aumento da produção, melhora da desfolha,melhora da tolerância ao estresse, maturidade mais uniformeda cultivar e habilidade para colheita antecipada.Anteriormente, o retardante de crescimento daminozida foiregistrado para uso nos Estados Unidos em maçãs, uvas eamendoins sob as marcas ALAR e KYLAR, mas foi removido douso em cultivares alimentícias devido às preocupações com asaúde humana. Apesar das demandas dos produtores agrícolaspor um produto para substituir a daminozida, não existemretardantes de crescimento registrados para uso em uvas,árvores frutíferas e amendoins nos Estados Unidos.Daminozida, no entanto, é ainda amplamente utilizada emcertas espécies de plantas não alimentícias.

A descoberta dos mecanismos moleculares que controlamos processos de crescimento vegetal tais como divisãocelular e alongamento celular provavelmente irá ajudar nodesenvolvimento de novas variedades de plantas com estaturareduzida e novos métodos para reduzir o crescimento deplantas. Tais novas variedades de plantas e métodos podemprover tanto aos agricultores quanto aos horticulturistasalternativas ambientalmente benéficas ao uso de agentesquímicos retardantes de crescimento sintéticos.

0 alongamento de células vegetais e órgãos é um dosparâmetros mais críticos do crescimento e desenvolvimentovegetal. A regulação desta característica em plantas, noentanto, é um processo bastante complicado, tendo tantofatores internos quanto externos influenciando o mesmo. 0estímulo externo mais importante é a luz, que temnormalmente um efeito repressível ou negativo noalongamento celular (Quail, P.H. (1995) Science 268:675-680; Kende, et al., (1997) Plant Cell 9:1197-1210). Ocontrole interno do alongamento celular é mediado por umnúmero de agentes químicos, normalmente referidos comoreguladores ou hormônios do crescimento de plantas (Kende,et al., (1997) Plant Cell 9:1197-1210). Entre os hormôniosde planta clássicos, as auxinas e giberelinas (GAs)promovem o alongamento celular enquanto as citocininas e oácido abscísico têm mostrado ter um efeito negativo noalongamento celular (Kende, et al., (1997) Plant Cell9:1197-1210). Recentemente, outra classe dos reguladores decrescimento de plantas, nomeada brassinosteróides, tem sidoidentificada como promotora do crescimento vegetal (Yokota,T. (1997) Trends Plant Sei. 2:137-143; Azpiroz, et al.,(1998) Plant Cell 10:219-230; Choe, et al., (1998) PlantCell 10:231-243). No entanto, os mecanismos através dosquais os hormônios vegetais agem, individualmente ou emconjunto, para controlar o alongamento celular permanecemdesconhecidos.

Uma forma de ajudar no entendimento dos mecanismos quemediam o alongamento celular é estudar os mutantes ondeeste aspecto do crescimento de planta é comprometido (Klee,et al., (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.42:529-551). Numerosos mutantes têm sido identificadosatravés da maioria das espécies de plantas, incluindomilho, onde mais do que 25 mutações de gene simples queafetam a estatura da planta têm sido caracterizadas (Coe,et al., (1988) In: Corn & Corn Improvement, G. F. Sprague(Ed.) Madison, WI ; Sheridan, W.F. (1988) Annu. Rev. Genet.22:353-385). Esses mutantes anões são consideradosrelacionados com GAi principalmente porque GA é o únicofitormônio cujo papel na regulação da altura em milho foiconvincentemente estabelecido (Phinney, et al., (1985)Curr. Top. Plant Biochem. Physiol. 4:67-74; Fujioka, etal., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:9031-9035).Ambos os tipos de mutantes, GA responsivo e GA não-responsivo, têm sido encontrados nesta coleção de mutantesde milho. Enquanto genes para um número de mutantes GA-responsivos foram clonados e encontrados como estandoenvolvidos na biossíntese de GA (Bensen, et al., (1995)Plant Cell 7:75-84; Winkler, et al., (1995) Plant Cell7:1307-1317), menos se conhece sobre a natureza dessesdefeitos em mutantes de milho GA não responsivos.

Proteínas DELLA são peças essenciais da cascata detransdução de sinal de giberelina (GA), agindo comoreguladores negativas da resposta GA que são degradadas napresença de elevadas concentrações de GA (Silverstone, etal., (2001) Plant Cell 10:155-169). Os domínios dasproteínas DELLA são de particular interesse por causa dofenótipo anão insensível à giberelina de seus mutantes comganho-de-função, que foram parcialmente responsáveis pela"Revolução Verde" por meio de seu aumento no índice decolheita de trigo (Peng, et al., (1999) Nature 400:256-261). Mutações no domínio N-terminal de DELLAfreqüentemente causam um fenótipo dominante GA-insensívelao aumentar muito a estabilidade deste regulador negativoda transdução de sinal de GA (Silverstone, et al., (2001)Plant Cell 10:155-169; Gublerf et al., (2002) PlantPhysiol. 129:191-200; Itoh, et al., (2002) Plant Cell14:57-70). Recentemente, Griffiths, et al., ((2006) PlantCell 18:3399-3414) demonstraram que ambas as regiões N-terminal I e II são requeridas para interação da proteínaDELLA com GlDla de Arabidopsis. Mutações C-terminal nosdomínios conservados GRAS tipicamente levam à perda-de-função (Dill, et al. , (2004) Plant Cell 16:1392-1405),fenótipo de resposta ao crescimento GA constitutivo comanotável exceção de um mutante Brrgal-d recentementeidentificado de Brassica rapa (Muangprom, et al., (2005)Plant Physiol. 137:931-938) e o mutante slnlc de cevada(Gubler, et al., (2002) Plant Physiol. 129:191-200).

Para manter-se com a demanda para a produção agrícolaaumentada, novos alvos são necessários para plantasagrícolas engenheiradas geneticamente para a melhora dascaracterísticas agronômicas. O isolamento e acaracterização molecular de genes codificando proteínas queestão envolvidas no controle da divisão celular ealongamento em plantas proverá novos alvos para oscientistas agrícolas manipularem.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para expressar em plantas genescodificando formas selvagens e variantes da proteína DELLAcodificada pelo gene D9 (Zm-D9) de Zea mays são providos.As composições compreendem moléculas de polinucleotídeoisoladas codificando formas variantes e selvagens dasproteínas Zm-D9. As composições compreendem aindamoléculas de polinucleotídeo isoladas do gene D9 de Zeamays. As moléculas de polinucleotídeo da invenção sãoúteis, por exemplo, em plantas transformadas para expressãotecido-específica ou constitutiva das formas variantes eselvagens das proteínas Zm-D9, para supressão antisense dogene Zm-D9, e para isolar moléculas de polinucleotídeoshomólogas que codificam proteínas DELLA. Tais moléculas depolinucleotídeo encontram uso nos métodos para alterar ocrescimento das plantas, particularmente o crescimento docaule e raiz em plantas, mais particularmente para aredução ou aumento da altura da planta. Em umaconcretização da invenção, as moléculas de polinucleotídeoencontram uso na produção de plantas anãs.

Cassetes de expressão compreendendo as moléculas depolinucleotídeo da invenção são fornecidos. Adicionalmentesão providas plantas transformadas, tecidos vegetais,células vegetais e sementes das mesmas. Proteínas isoladascodificadas por moléculas de polinucleotídeos da invençãosão providas.

BREVE DESCRCIÇÃO DOS ANEXOS E FIGURAS

Anexo 1 retrata plantas GA3 não responsivas (esquerda)e plantas responsivas (direita) segregando para o alelo Zm-D9 MUTl.

Anexo 2 retrata a localização cromossomal dos genes demilho Dwarf 8 e Dwarf 9. PCR analítico de linhagens deaveia adicionais demonstraram que o gene putativo Zm-D9está realmente localizado no cromossomo 5 de milho comoesperado do mapeamento genético. Este gene foi encontradoem uma localização diferente do produto de PCR do controlepositivo Zm-D8, que é conhecido estar no cromossomo 1.

Anexo 3A-3F retrata a localização subcelular dasproteínas DELLA de milho fusionadas com AC-GFPl (Aeguoreacoerulescens GFP). Anexo 3A é uma DSRED (proteínafluorescente vermelha de Discosoma sp.) controle EXPRESS.Anexo 3B é Zm-D8:ACGFPl. Anexo 3C é uma mescla de A e B.Anexo 3D é um controle DSRED EXPRESS. Anexo 3E é Zm-D9: ACGFPl. Anexo 3F é uma mescla de D e Ε. A barra verdeindica 10 μπι nas imagens.

Anexo 4 retrata plantas T2 de Arabidopsis thalianaecotipo Columbia, 56 dias após a germinação, compreendendoos cDNAs DELLA de milho dirigidos pelo promotor MS-S2a. Daesquerda para direita: MS-S2A PRO::GUS; MS-S2A PRO::ZM-D8;MS-S2A PRO::ZM-D9; MS-S2A PRO::MUTl ZM-D9; MS-S2A PR0::ZM-D8 MPL; e MS-S2A PR0::ZM-D8 MUT.

Anexo 5 retrata representantes de flores dissecadas deplantas T1 de Arabidopsis thaliana compreendendo os cDNAsDELLA de milho dirigidos pelo promotor MS-S2a. Duaspétalas e duas sépalas foram removidas das flores acima.

Figura 1 é um alinhamento de seqüência de aminoácidodas seqüências de aminoácidos das proteínas Zm-D9 (SEQ IDNO: 2) e MUTl Zm-D9 (SEQ ID NO: 4).

Figura 2 é um alinhamento múltiplo de seqüência deaminoácido das proteínas DELLA de milho (ZM), Arabidopsisthaliana (AT), Brassica rapa (BR), Hordeum vulgare (HV) ,Oryza sativa (OS), e trigo (rht-Dla/b).

Figura 3 é um alinhamento de seqüência de nucleotídeodas seqüências de nucleotídeos de Zm-D9 (SEQ ID NO: 1) eMUTl Zm-D9 (SEQ ID NO: 3).

Figura 4 é um alinhamento múltiplo de seqüência denucleotídeo das seqüências de nucleotídeo codificandoproteínas DELLA de milho (ZM), Arabidopsis thaliana (AT) ,Brassica rapa (BR), Hordeum vulgare (HV), Oryza sativa(OS), e trigo (rht-Dla/b).

Figura 5 representa os níveis de expressão relativos(em ppm) dos genes d8 e d9 em 32 tecidos e estágios dodesenvolvimento diferentes de milho obtidos através dosistema Lynx MPSS (Brenner, et al., (2000) PNAS 97:1665-1670 and Brenner, et al., (2000) Nat Biotechnol 18:630-634). Linhas verticais dividem o quadro pelos órgãos dosquais as amostras foram derivadas.

Figura 6 apresenta mapas de clone de entrada parcialde d9 e D9 representando o domínio trocado de quimeras queforam produzidas. A - mostra mapas parciais dos clones deentrada d9 e D9 com as diferenças de aminoácidoscodificadas em cada região denotada. A seqüência deaminoácido d9 INDEL é SGSGSGQPTDASPPA (SEQ ID NO: 7). Aseqüência de aminoácido MUTl D9 INDEL é QPTDASSPAAG (SEQ IDNO: 8) . B- mostra mapas parciais do alelo d9 baseado emquimeras (regiões brancas) com segmentos de MUTl D9 emcinza. C - mostra mapas parciais do alelo MUTl D9 baseadoem quimeras (regiões cinza) com segmentos do d9 em branco.

Figura 7 detalha dados morfométricos em plantas T2 deArabidopsis no estágio de crescimento 8.00 (Boyes, et al.,(2001) Plant Cell 13:1499-1510) expressando cDNAs dosalelos d8 e d9 do promotor MS-S2A ocorrendo naturalmente.Letras sobrescritas indicam grupos que não sãosignificativamente diferentes um do outro através deanálise de LSD em um nível de confiança de 95%. Dadosforam colecionados de uma média de oito replicatas dequatro eventos de transformação independentes.

Figura 8 apresenta dados em transição para oflorescimento em plantas T2 de Arabidopsis e plantas TO demilho GS3xGaspe Flint. Letras sobrescritas indicam gruposque não são significativamente diferentes um dos outrosatravés da análise LSD no nível de confiança de 95%. Essesdados foram coletados de uma média de oito replicatas dequatro eventos independentes. Dados de milho foramcoletados de uma simples replicata de 25 eventos detransformação independentes para cada constructo.

Figura 9 detalha os dados morfométricos e tempo deflorescimento para o domínio trocado d9/D9 Tl Arabidopsis.Note que as letras sobrescritas indicam grupos que não sãosignificativamente diferentes um dos outros através daanálise LSD no nível de confiança de 95%. ALT = alterado;a relação fenotípica dos alelos é modificada pelopolimorfismo trocado tal que as diferenças não são maissignificativas. REV = reverso; o polimorfismo produz umareversão significativa estatisticamente da relaçãofenotípica dos alelos. O promotor MS-S2A foi usado paradirigir todas as seqüências codificadoras acima (CDS).Dados foram coletados de uma média de 16.3 eventos detransformação independente por constructo. Diâmetro daRoseta, altura, comprimento da síliqua e largura da síliquaforam medidos no estágio de crescimento principal 8.00(Boyes, et ai., (2001) Plant Cell 13:1499-1510). Dias paraflorescimento e folhas da roseta no florescimento forammedidos no estágio de crescimento principal 5.10.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAAs seqüências de nucleotídeo e aminoácido listadas nalistagem de seqüência acompanhante são apresentadas usandoabreviações de letras padrões para bases de nucleotídeos, eo código de três letras para aminoácidos. As seqüências denucleotídeo seguem a convenção padrão do inicio naextremidade 5' da seqüência e prosseguindo adiante (i.e.,da esquerda para direita em cada linha) para a extremidade3'. Apenas uma cadeia de cada seqüência de nucleotídeo éapresentada, mas a cadeia complementar é entendida serincluída por qualquer referência para a cadeia exibida. Asseqüências de aminoácido seguem a convenção padrão deiniciar na região amino terminal da seqüência e prosseguiradiante (i.e., da esquerda para direita em cada linha) pararegião carboxi terminal.

As seqüências de nucleotídeo e aminoácido listadas nalistagem de seqüência acompanhante são apresentadas usandoabreviações de letras padrões para bases de nucleotídeos, ecódigo de três letras para aminoácidos. As seqüências denucleotídeo seguem a convenção padrão de iniciar naextremidade 5' da seqüência e prosseguir adiante (i.e., daesquerda para direita em cada linha) para a extremidade 3'.

Apenas uma cadeia de cada seqüência de nucleotídeo éapresentada, mas a cadeia complementar é entendida serincluída por qualquer referência para a cadeia exibida. Asseqüências de aminoácido seguem a convenção padrão deiniciar na região amino terminal da seqüência e prosseguiradiante (i.e., da esquerda para direita em cada linha) pararegião carboxi terminal.

SEQ ID NO: 1 descreve o comprimento total da seqüênciacodificadora do alelo tipo selvagem do gene Zm-D9.

SEQ ID NO: 2 descreve a seqüência de aminoácido Zm-D9que é codificada pela SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 descreve o comprimento total da seqüênciacodificadora do alelo tipo selvagem do gene Zm-D9 genemenos o códon de parada. Nucleotideos 1-1875 da SEQ ID NO:3 correspondem aos nucleotídeos 1-1875 da SEQ ID NO: 1. Sedesejado, um códon de parada pode ser adicionado àextremidade 3' da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 3ou a qualquer outra seqüência codificadora que carece docódon de parada. Tais códons de parada incluem, porexemplo, TAA, TAG, e TGA.

SEQ ID NO: 4 descreve o comprimento total da seqüênciacodificadora do alelo mutante (MUTl) do gene Zm-D9.

SEQ ID NO: 5 descreve a seqüência de aminoácido Zm-D9que é codificada pela SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 6 descreve o comprimento total da seqüênciacodificadora do alelo mutante (MUTl) do gene Zm-D9 menos ocódon de parada. Nucleotídeos 1-1866 da SEQ ID NO: 6correspondem aos nucleotídeos 1-1866 da SEQ ID NO: 4.A seqüência de aminoácido do d9 INDEL é a SEQ ID NO:7. A seqüência de aminoácido da D9 INDEL é a SEQ ID NO: 8.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é desenhada para composições emétodos para modificar o crescimento de plantas. Ascomposições incluem moléculas de polinucleotídeo isoladascompreendendo ao comprimento total das seqüênciascodificadoras dos alelos tipo selvagem e mutante do gene D9de milho, que é referenciado aqui como gene Zm-D9. Embora ogene Zm-D9 tenha sido descrito geneticamente (Winkler andFreeling (1994) Planta 193:341-348), o gene não foipreviamente caracterizado em nível molecular. A invençãoprovê ainda seqüências de aminoácidos das proteínas DELLAcodificadas pelos alelos do tipo selvagem e mutante de Zm-D9. Os métodos da presente invenção implicam transformarplantas com moléculas de polinucleotídeo codificando asformas tipo selvagem e variantes da proteína DELLA de Zeamays codificada pelo Zm-D9.

As moléculas de polinucleotídeo da presente invençãosão úteis para modificar o crescimento do caule ou troncoem plantas, assim como produzir uma planta transformada comum caule ou tronco modificado. Mais particularmente, asmoléculas de polinucleotídeo são úteis para diminuir ouaumentar a altura do caule ou tronco assim como resultar emplantas com estatura ou altura da planta reduzida ouaumentada. As moléculas de polinucleotídeo também encontramuso na modificação da arquitetura da raiz e outroscaracteres agronômicos de maneira desejável em plantastransformadas. Tais caracteres agronômicos incluem, mas nãoestão limitados a, grupos de sementes, número de sementes,produção cultivável, comprimento da espiga, tolerância àseca, uso eficiente da água, uso eficiente do nitrogênio,resistência a parasitas, área foliar, acúmulo denitrogênio, capacidade fotossintética, e partição decarbono e nitrogênio. Então, a presente invenção provêplantas transformadas, células vegetais, tecidos vegetais esementes. As moléculas de polinucleotídeo encontram uso naconstrução de cassetes de expressão para transformaçãosubseqüente dentro de plantas e células vegetais deinteresse, como sondas para o isolamento de outros genessemelhantes ao gene D9, como marcadores moleculares, esemelhantes.

Composições da invenção incluem as moléculas depolinucleotídeo nativas do tipo selvagem e do MUTl Zm-D9 evariantes e fragmentos dos mesmos. As composições incluemainda as respectivas seqüências de aminoácidos dasmoléculas de polinucleotídeo do tipo selvagem nativo e doMUTl Zm-D9, bem como fragmentos e variantes de taisseqüências de aminoácidos. As seqüências Zm-D9 sãodescritas na SEQ ID NOS: 1-6. As seqüências de nucleotídeoou seqüências antisense correspondentes encontram uso namodulação da expressão das proteínas Zm-D9 em uma planta oucélula vegetal. Isto é, as seqüências codificadoras podemser usadas para aumentar a expressão enquanto as seqüênciasantisense podem ser usadas para diminuir a expressão.

Proteínas DELLA são conhecidas para regular oalongamento da célula vegetal e podem ser usadas paramodificar, por exemplo, alongamento celular, alongamento daaltura e raiz da planta. Ver, Itoh, et ai., (2002) PlantCell 14:57-70; Achard, et al., (2003) Plant Cell 15:2816-2825; e Fu and Harberd (2003) Nature 421:740-743; todas asquais são aqui incorporadas por referência.

Assim, as moléculas de polinucleotídeo da invençãoencontram uso nos métodos de modificação do crescimento deuma planta. Em uma concretização da invenção, as moléculasde polinucleotídeo da invenção encontram uso em métodos demodificar o crescimento de plantas. Com este fim, asmoléculas de polinucleotídeo da invenção podem serutilizadas em cassetes de expressão ou constructos depolinucleotídeos operacionalmente ligados a qualquer um deuma das variedades dos promotores vegetais. Aspectos docrescimento vegetal que podem ser impactados pelos métodosda invenção incluem, mas não estão limitados a um ou maisdos seguintes: altura da planta; altura do tronco ou caule;atividade metabólica do tronco ou caule vegetal, um ou maisaspectos da arquitetura da raiz (ex.: profundidade da raiz,ângulo da raiz, ramificação da raiz, número de ápicesradiculares, diâmetro nodal radicular, volume nodalradicular, atividade metabólica radicular); o tamanho,forma e número de células e órgãos; taxa de divisãocelular; taxa de alongamento celular; taxa de crescimentoda planta, seus órgãos, tecidos e células; temporização elocalização da iniciação do órgão; duração da vida; esemelhantes.

Métodos da invenção envolvem a transformação dasplantas com moléculas de polinucleotídeo da invenção parareduzir o crescimento vegetal. Em uma concretização dainvenção, uma planta é transformada com uma molécula depolinucleotídeo MUTl Zm-D9 operacionalmente ligada a umpromotor que dirige a expressão em uma planta. Tal moléculade polinucleotídeo compreende a seqüência de nucleotídeodescrita em SEQ ID NO: 4 ou 6, uma seqüência de nucleotídeocodificando o polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 5, ou umfragmento ou variante qualquer de tais moléculas depolinucleotídeo que codificam um polipeptídeo retendosubstancialmente as mesmas atividades biológicas como opolipeptídeo nativo MUTl Zm-D9. Através da expressão de talmolécula de polinucleotídeo MUTl Zm-D9 em uma planta, umaplanta de estatura reduzida, uma planta anã, podem serproduzidas.

Logo, os métodos da invenção encontram uso na produçãode variedades anãs de plantas cultivadas. Plantascultivadas anãs tendo características agronômicasmelhoradas, tais como, por exemplo, potencial reduzido paraacamamento, eficiência do uso da água melhorada, reduzidociclo de vida, eficiência da colheita melhorada e melhorada produtividade por unidade de área são obtidos por essesmétodos.

O termo "anã" significa atipicamente pequeno. O termo"planta anã" significa uma planta atipicamente pequena.Geralmente, uma "planta anã" tem uma estatura ou altura queé reduzida daquela de uma planta típica em cerca de 5%,10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% oumais. Geralmente, mas não exclusivamente, tal planta anã écaracterizada por um comprimento de caule ou troncoreduzido, quando comparado com uma planta típica.

A invenção engloba molécula de polinucleotídeo isoladaou substancialmente purificada ou composições proteicas.Uma molécula de polinucleotídeo ou proteína "isolada" ou"purificada", ou porção ativa biologicamente das mesmas, ésubstancialmente ou essencialmente livre de componentes quenormalmente acompanham ou interagem com a molécula depolinucleotídeo ou proteína como encontrado em seu ambienteocorrendo naturalmente. Então, uma molécula depolinucleotídeo ou proteína isolada ou purificada ésubstancialmente livre de outro material celular, ou meiode cultura quando produzida pelas técnicas recombinantes,ou substancialmente livre de precursores químicos ou outrosagentes químicos quando quimicamente sintetizada.

Otimamente, uma molécula de polinucleotídeo "isolada" élivre de seqüências (otimamente seqüências codificandoproteínas) que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo(i.e., seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' dopolinucleotídeo) no DNA genômico do organismo de onde amolécula de polinucleotídeo é derivada. Por exemplo, emvárias concretizações, a molécula de polinucleotídeoisolada pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb,2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüência de nucleotídeoque naturalmente flanqueia o polinucleotídeo no DNAgenômico da célula de onde a molécula de polinucleotídeo éderivada. Uma proteína que é substancialmente livre dematerial celular inclui preparações de proteína tendo menosdo que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (através do pesoseco) da proteína recombinante. Quando a proteína dainvenção ou porção biologicamente ativa da mesma érecombinantemente produzida, meios de cultura ótimosrepresentam menos do que cerca de 3 0%, 20%, 10%, 5% ou 1%(através do peso seco) de precursores químicos ou agentesquímicos não protéicos de interesse.

Fragmentos e variantes das moléculas depolinucleotídeo reveladas e proteínas por estas codificadassão também englobadas pela presente invenção. O termo"fragmento" significa uma porção da molécula depolinucleotídeo ou uma porção da seqüência de aminoácido eainda proteína codificada pelos mesmos. Fragmentos de umamolécula de polinucleotídeo podem codificar fragmentosprotéicos que retenham a atividade biológica das proteínastipo selvagem e proteínas MUTl Zm-D9 como reveladas aqui eainda atividade repressiva de resposta a giberelina.Alternativamente, fragmentos de uma molécula depolinucleotídeo que sejam úteis como sondas de hibridizaçãogeralmente não codificam fragmentos de proteínas retendoatividade biológica. Então, fragmentos de uma seqüência denucleotídeo pode alcançar cerca de pelo menos 20nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100nucleotídeos, e até o comprimento total da molécula depolinucleotídeo codificando as proteínas da invenção.

Salvo disposição em contrário ou evidentes a partir docontexto, o termo "Zm-D9" destina-se a englobar moléculasde polinucleotídeo compreendendo os alelos tipo selvagem eMUTl do gene Zm-D9 e fragmentos e variantes dos mesmos.Preferencialmente, tais fragmentos e variantes dos alelostipo selvagem e MUTl do gene Zm-D9 codificam proteínas Zm-D9 que retenham a atividade biológica de uma proteína decomprimento total do tipo selvagem ou proteína MUTl Zm-D9como revelada aqui. O termo "Zm-D9" pode também ser usadoaqui para referir a proteínas codificadas pelas moléculasde polinucleotídeo Zm-D9 da presente invenção.

Um fragmento de uma molécula de polinucleotídeo Zm-D9que codifica uma porção biologicamente ativa de umaproteína Zm-D9 da invenção codificará pelo menos 15, 25,30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ou600 aminoácidos contíguos, ou até o número total deaminoácidos presentes em um comprimento total do tiposelvagem ou proteína MUTl Zm-D9 da invenção (por exemplo,625 e 622 aminoácidos para SEQ ID NOS: 2 e 5,respectivamente). Fragmentos de uma molécula depolinucleotídeo Zm-D9 que sejam úteis como sondas dehibridização ou iniciadores de PCR geralmente não precisamcodificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína Zm-D9.

Consequentemente, um fragmento de uma molécula depolinucleotídeo Zm-D9 pode codificar uma porçãobiologicamente ativa de uma proteína tipo selvagem ou MUTlZm-D9, ou ela pode ser um fragmento que pode ser usado comosonda de hibridização ou primer de PCR usando métodosrevelados abaixo. Uma porção biologicamente ativa de umaproteína Zm-D9 pode ser preparada através do isolamento deuma porção de uma das moléculas de polinucleotídeo Zm-D9 dainvenção, proteína Zm-D9 (ex.: através da expressãorecombinante in vitro) , e avaliando a atividade da porçãoZm-D9 da proteína Zm-D9. Moléculas de polinucleotídeo quesão fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo Zm-D9compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250,300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900,1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400 1,500, 1,600, 1,700,1,800 ou 1,850 nucleotídeos contíguos, ou até o número denucleotídeos presentes em um polinucleotídeo Zm-D9 decomprimento total revelado aqui (por exemplo, 1878, 1875,1869, e 1866 nucleotídeos para as SEQ ID NOS: 1, 3, 4 e 6,respectivamente).

O termo "variantes" significa seqüênciassubstancialmente similares. Para moléculas depolinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ouadição de um ou mais nucleotideos em um ou mais sítiosinternos dentro da molécula de polinucleotídeo nativa e/ouuma substituição de iam ou mais nucleotideos em um ou maissítios no polinucleotídeo nativo. Como usado aqui, umamolécula de polinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo"compreende uma seqüência de nucleotídeo ou aminoácidoocorrendo naturalmente, respectivamente. Para moléculas depolinucleotídeos, variantes conservativas incluem aquelasseqüências que, por causa da degeneração do códigogenético, codificam a seqüência de aminoácido de um dospolipeptídeos Zm-D9 da invenção. Variantes alélicasocorrendo naturalmente como essas podem ser identificadascom o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas,como, por exemplo, com reação de polimerase em cadeia (PCR)e técnicas de hibridização como descritas abaixo. Moléculasde proteínas variantes também incluem polinucleotídeosderivados sinteticamente, tais como aqueles gerados, porexemplo, através do uso de mutagênese sítio dirigida, masque ainda codificam uma proteína Zm-D9 da invenção.Geralmente, variantes de uma molécula de polinucleotídeoparticular da invenção terão pelo menos cerca de 80%, 85%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maisidentidade de seqüência para aquela molécula depolinucleotídeo particular como determinada pelos programasde alinhamento de seqüência e parâmetros descritos em outrolugar aqui.

Variantes de uma molécula de polinucleotídeoparticular da invenção (i.e., o polinucleotídeo dereferência) podem também ser avaliados por comparação daporcentagem de identidade de seqüência entre o polipeptídeocodificado por uma molécula de polinucleotídeo variante e opolipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência.Então, por exemplo, uma molécula de polinucleotídeo isoladaque codifica um polipeptídeo com uma dada porcentagem deidentidade de seqüência para o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2e/ou 5 são reveladas. Porcentagem de identidade deseqüência entre qualquer dos dois polipeptídeos pode sercalculada usando programas de alinhamento de seqüência eparâmetros descritos em outro lugar aqui. Onde qualquerdado par de moléculas de polinucleotídeo da invenção éavaliado por comparação da porcentagem de identidade deseqüência compartilhada pelos dois polipeptídeos que elescodificam, a porcentagem de identidade de seqüência entreos dois polipeptídeos codificados é de pelo menos cerca de80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%ou mais de identidade de seqüência.

Proteína "variante" significa uma proteína derivada daproteína nativa através da deleção ou adição de um ou maisaminoácidos em um ou mais sítios internos na proteínanativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um oumais sítios na proteína nativa. Proteínas variantesenglobadas pela presente invenção são biologicamenteativas, quando elas continuam a possuir a atividadebiológica desejada da proteína nativa, isto é, atividade daproteína tipo selvagem ou MUTl Zm-D9 como descrito aqui.Tais variantes podem resultar de, por exemplo,polimorfismos genéticos ou da manipulação humana.Variantes ativas biologicamente de uma proteína nativa Zm-D9 da invenção terão pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou maisidentidade de seqüência com a seqüência de aminoácido daproteína nativa como determinado pelos programas dealinhamento de seqüência e parâmetros descritos em outrolugar aqui. Uma variante ativa biologicamente de umaproteína da invenção pode diferir daquela proteína atravésde tão poucos quanto 1-15 resíduos de aminoácidos, tãopoucos quanto 1-10, tais como 6-10, tão poucos quanto 5,tão poucos quanto 4, 3, 2, ou ainda 1 resíduo deaminoácido.

As proteínas da invenção podem ser alteradas de váriasmaneiras incluindo substituições de aminoácidos, deleções,truncações, e inserções. Métodos para tais manipulações sãogeralmente conhecidos no estado da técnica. Por exemplo,variantes de seqüências de aminoácidos e fragmentos dasproteínas Zm-D9 podem ser preparados através de mutações noDNA. Métodos para mutagêneses e alterações nospolinucleotídeos são bem conhecidos no estado da técnica.Ver, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods in Enzymol.154:367-382; U.S. Patent Number 4,873,192; Walker andGaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York) e as referênciascitadas aí. Orientação quanto a adequada substituição deaminoácidos que não afetem a atividade biológica daproteína de interesse podem ser encontradas no modelo deDayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence andStructure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.),aqui incorporada por referência. Substituiçõesconservativas, tais como a troca de um aminoácido com outrotendo propriedades similares, pode ser otimizado.

Então, os genes e moléculas de polinucleotídeos dainvenção incluem ambas as seqüências ocorrendo naturalmentebem como as formas mutantes. Da mesma forma, as proteínasda invenção englobam proteínas ocorrendo naturalmente bemcomo variações e formas modificadas das mesmas. Taisvariantes continuarão a possuir a atividade desejada dotipo selvagem ou do MUTl Zm-D9. Obviamente, as mutações queserão feitas no DNA codificando a variante não deve colocara seqüência for a da fase de leitura e otimamente nãocriará regiões complementares que possam produzirestruturas de RNAm secundário. Ver, publicação de pedido depatente europeu No. 75,444.As deleções, inserções, e substituições das seqüênciasde proteínas englobadas aqui não são esperadas paraproduzir mudanças radicais nas características da proteína.No entanto, quando é difícil predizer o efeito exato dasubstituição, deleção, ou inserção antes de fazê-lo, umespecialista na área apreciará que o efeito será avaliadopelos ensaios de triagem de rotina. Isto é, a atividadepode ser avaliada pelas mudanças morfológicas da planta ouraiz nas plantas transgênicas, tais como, por exemplo, nomonitoramento das mudanças no alongamento do caule e/ouraiz em plantas transformadas com uma molécula depolinucleotídeo Zm-D9 da presente invenção. Ver, porexemplo, Exemplo 1 abaixo e Anexo 4.

Moléculas de polinucleotídeos e proteínas variantestambém englobam seqüências e proteínas derivadas de umprocedimento mutagênico e recombinogênico tal comoembaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou maisseqüências diferentes codificando Zm-D9 podem sermanipuladas para criar uma nova Zm-D9 possuindo aspropriedades desejadas. Desta maneira, bibliotecas depolinucleotídeos recombinantes são geradas de uma populaçãode seqüências relacionadas de polinucleotídeoscompreendendo regiões de seqüências que tenham identidadede seqüência substancial e possam ser homologamenterecombinadas in vitro or in vivo. Por exemplo, usando estatécnicas, motivos de seqüências codificando um domínio deinteresse podem ser embaralhados entre o gene Zm-D9 dainvenção e outros genes Zm-D9 conhecidos para obter um novogene codificando para uma proteína com uma propriedademelhorada de interesse, tal como um Km aumentado no caso de

uma enzima. Estratégias para tal embaralhamento de DNA sãoconhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, Stemmer(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370:389-391; Crameri, et al., (1997) NatureBiotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol.272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; e patentes americanas números 5,605,793 e 5,837,458.

As moléculas de polinucleotídeo da invenção podem serusadas para isolar seqüências correspondentes de outrosorganismos, particularmente outras plantas, maisparticularmente outras monocotiledôneas. Desta maneira,métodos tais como PCR, hibridização, e semelhantes podemser usados para identificar tais seqüências baseando-se nasua homologia de seqüência para as seqüências descritasaqui. Seqüências isoladas baseadas na sua identidade deseqüência para a seqüência inteira de Zm-D9 descrita aquiou para variantes e fragmentos das mesmas são englobadaspela presente invenção. Tais seqüências incluem seqüênciasque são ortólogas das seqüências reveladas. 0 termo"ortóloga" significa genes derivados de um ancestral comume que são encontrados em diferentes espécies com umresultado de uma especiação. Genes encontrados emdiferentes espécies são considerados ortólogos quando suasseqüências de nucleotídeos e/ou seqüências de proteínascodificadas compartilham pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%,85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oumaior identidade de seqüência Funções dos ortólogos sãofreqüentemente altamente conservadas entre as espécies.Então, moléculas de polinucleotídeo isoladas que codificampara uma proteína Zm-D9 e que hibridizam sob condiçõesestringentes para as seqüências Zm-D9 reveladas aqui, oupara variantes ou fragmentos das mesmas, são englobadaspela presente invenção.

Em uma abordagem por PCR, iniciadores deoligonucleotídeos podem ser desenhados para uso em reaçõesde PCR para amplificar seqüências de DNA correspondentes docDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta deinteresse. Métodos para desenhar iniciadores de PCR eclonagem de PCR são geralmente conhecidas no estado datécnica e são divulgadas em Sambrook, et al., (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver tambémInnis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide toMethods and Applications (Academic Press, New York); Innisand Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press,New York); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR MethodsManual (Academic Press, New York). Métodos conhecidos dePCR incluem, mas não estão limitados a, métodos usandoiniciadores pareados, iniciadores aninhados, iniciadoresúnicos específicos, iniciadores degenerados, iniciadoresgene-específicos, iniciadores vetores-específicos,iniciadores parcialmente mal-pareados, e semelhantes.

Em técnicas de hibridização, todo ou parte de umamolécula de polinucleotídeo conhecida é usada como umasonda que hibridiza seletivamente com outropolinucleotídeos correspondentes presentes em uma populaçãode fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos decDNA (i.e., bibliotecas genômicas ou de cDNA) de umorganismo escolhido. As sondas de hibridização podem serfragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentosde RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadascom um grupo detectável tal como 32 ρ, ou qualquer outromarcador detectável. Então, por exemplo, sondas parahibridização podem ser feitas através de marcação deoligonucleotídeos sintéticos baseada nos polinucleotídeosZm-D9 da invenção. Métodos para preparação de sondas parahibridização e para construção de bibliotecas genômicas ede cDNA são geralmente conhecidos no estado da técnica esão revelados em Sambrook, et al., (1989) MolecularCloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Plainview, New York).

Por exemplo, uma molécula inteira do polinucleotídeoZm-D9 revelada aqui, ou uma ou mais porções da mesma, podeser usada como uma sonda capaz de hibridizarespecificamente à molécula de polinucleotídeo Zm-D9correspondente e RNAs mensageiros. Para alcançarhibridização específica sob uma variedade de condições,tais sondas incluem seqüências que são únicas entre asseqüências de polinucleotídeo Zm-D9 e têm preferencialmentepelo menos 10 nucleotídeos em comprimento, e maispreferencialmente pelo menos cerca de 20 nucleotídeos emcomprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificaruma molécula de polinucleotídeo Zm-D9 de uma plantaescolhida através de PCR. Essa técnica pode ser usada paraisolar seqüências codificadoras adicionais de uma plantadesejada ou como um ensaio diagnóstico para determinar apresença de seqüências codificadoras em uma planta.Técnicas de hibridização incluem rastreamento dehibridização de bibliotecas de DNA plaqueadas (quer placasou colônias; ver, por exemplo, Sambrook, et al., (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, New York).

A hibridização de tais seqüências pode ser realizadasob condições estringentes. 0 termo "condiçõesestringentes" ou "condições de hibridização estringentes"significa condições sob as quais uma sonda hibridizará comsua seqüência alvo em um grau altamente mais detectável doque com outras seqüências (ex.: pelo menos 2 vezes sobre o"background"). Condições estringentes são dependentes deseqüências e serão diferentes em diferentes circunstâncias.Através do controle da estringência da hibridização e/oucondições de lavagem, seqüências alvo que sejam 100%complementares à sonda podem ser identificadas (marcaçãohomóloga). Alternativamente, condições de estringênciapodem ser ajustadas para permitir alguns maus pareamentosnas seqüências a fim de que graus mais baixos desimilaridades sejam detectados (marcação heteróloga).Geralmente, uma sonda é menor do que cerca de 1000nucleotídeos em comprimento, preferencialmente menor do que500 nucleotídeos em comprimento.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nasquais a concentração de sais é menor do que cerca de 1,5 Mde íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M deconcentração de íon Na (ou outros sais) no pH 7.0 a 8.3 ea temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas(ex.: 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C parasondas longas (ex.: maior do que 50 nucleotídeos).Condições estringentes podem também ser alcançadas com aadição de agentes desestabilizadores tais como a formamida.Condições de baixa estringência exemplares incluemhibridização com uma solução tampão de formamida 30 a 35%,1 M NaCl, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio) à 37°C, e umalavagem em IX a 2X SSC (2OX SSC = 3.0 M NaCl/0,3 M citratode trisódio) de 50 à 55°C. Condições de estringênciamoderada exemplares incluem hibridização em formamida 40 a45%, 1,0 M NaCl, 1% SDS à 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IXSSC em 55 à 60°C. Condições de alta estringênciaexemplares incluem hibridização em formamida 50%, 1 M NaCl,1% SDS à 37°C, e uma lavagem em 0,1X SSC em 60 à 65°C.Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cercade 0,1% a cerca de 1% SDS. A duração da hibridização égeralmente menor do que cerca de 24 horas, usualmente cercade 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagemserá pelo menos um comprimento de tempo suficiente paraalcançar o equilíbrio.

Especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, sendo os fatores críticos a força iônica etemperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada da equação de Meinkoth e Wahl(1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16.6 (log

M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é amolaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem denucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é aporcentagem de formamida na solução de hibridização, e L éo comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é a

temperatura (sob força iônica e pH definidos) onde 50% de

uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma sondapareada perfeitamente. Tm é reduzida em cerca de I0C para

cada 1% de mau pareamento; então, Tm, hibridização, e/oucondições de lavagem podem ser ajustados para hibridizar

com seqüências de identidade desejada. Por exemplo, seseqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm pode

ser reduzida 10°C. Geralmente, condições estringentes são

selecionadas para serem cerca de 50C mais baixos do que oponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica e

seu complemento com força iônica e pH definidos. Noentanto, condições severamente estringentes podem utilizarlima hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C mais baixosdo que o ponto de fusão térmico (Tm); condições

moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridizaçãoe/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C mais baixos do que oponto de fusão térmico (Tm); condições de baixa

estringência podem utilizar um hibridização e/ou lavagem a

11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C mais baixos do que o ponto defusão térmico (Tm). Usando a equação, composições dehibridização e lavagem, e Tm desejados, os especialistas na

área entenderão que variações na estringência dahibridização e/ou soluções de lavagem estão inerentementedescritas. Se o grau desejado de maus pareamentos resultaem uma Tm menor do que 4 5 0C (solução aquosa) ou 3 2 0C

(solução formamida), é preferível aumentar a concentraçãoSSC para que uma temperatura mais alta possa ser usada. Ummanual extensivo para hibridização de ácidos nucléicos éencontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, NewYork); e Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols inMolecular Biologyl Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver, Sambrook, et al., (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Os seguintes termos são usados para descrever asrelações de seqüência entre dois ou mais polinucleotídeosou polipeptídeos: (a) "seqüência referência", (b) "janelade comparação", (c) "identidade de seqüência", e, (d)"porcentagem de identidade de seqüência".

(a) Como usado aqui, "seqüência referência" é umaseqüência definida usada como uma base para comparação deseqüência. Uma seqüência referência pode ser um subgrupo ouo todo de uma seqüência especificada; por exemplo, como umsegmento de uma seqüência de comprimento total de cDNA ouseqüência gênica, ou seqüência completa de cDNA ou gênica.

(b) Como usado aqui, "janela de comparação" fazreferência a um segmento contíguo e especificado de umaseqüência de polinucleotídeo, onde a seqüência depolinucleotídeo na janela de comparação pode compreenderadições ou deleções (i.e., "gaps") comparados com aseqüência referência (que não compreende adições oudeleções) para um alinhamento ótimo dos doispolinucleotídeos. Geralmente, a janela de comparação tempelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento, eopcionalmente pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais. Osespecialistas na área entendem que para evitar uma altasimilaridade com a seqüência referência devido à inclusãode gaps na seqüência de polinucleotídeo um "gap penalty" étipicamente introduzido e é subtraído do número depareamentos.

Métodos de alinhamento de seqüência para comparaçãosão bem conhecidos no estado da técnica. Então, adeterminação de porcentagem de identidade de seqüênciaentre quaisquer duas seqüências pode ser realizada usandoum algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de taisalgoritmos matemáticos são algoritmos de Myers e Miller(1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento localSmith, et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmode alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol.Biol. 48:443-453; o método de busca de alinhamento local dePearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 872264, modificado como em Karlin e Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.

Implementações computacionais desses algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para comparações deseqüências para determinar identidade de seqüência. Taisimplementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTALno programa PC/Gene (disponível da Intelligenetics,Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0)e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA na GCG WisconsinGenetics Software Package, Versão 10 (disponível daAccelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia,USA). Alinhamentos usando esses programas podem serrealizados usando parâmetros pré-definidos. 0 programaCLUSTAL está bem descrito em Higgins, et al., (1988) Gene73:237-244 (1988); Higgins, et al., (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90;Huang, et al., (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson, et al.,(1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. O programa ALIGN ébaseado no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Umatabela PAM120 de peso residual, um "gap length penalty" de12, e um "gap penalty" de 4 podem ser usados com o programaALIGN quando comparando seqüências de aminoácidos. Osprogramas BLAST de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol.215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul(1990) supra. Buscas no BLAST de nucleotídeos podem serrealizadas com o programa BLASTN, "score" = 100,"wordlength" = 12, para obter seqüências de nucleotídeohomólogas à seqüência de nucleotídeo codificando umaproteína da invenção. Busca no BLAST por proteínas podemser executadas com o programa BLASTX, "score" = 50,"wordlength" = 3, para obter seqüências de aminoácidoshomólogas a uma proteína ou um polipeptídeo da invenção.Para obter alinhamentos "gapped" para propósitos decomparação, Gapped BLAST (no BLAST 2.0) pode ser utilizadocomo descrito em Altschul, et al., (1997) Nucleic AcidsRes. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (no BLAST 2.0)pode ser usado para realizar uma busca iterada que detectarelações distantes entre as moléculas. Ver, Altschul, etal., (1997) supra. Quando utilizando BLAST, Gapped BLAST,PSI-BLAST, os parâmetros pré-definidos dos respectivosprogramas (ex.: BLASTN para seqüências de nucleotídeos,BLASTX para proteínas) podem ser usados. Ver,www.ncbi.nlm.nih.gov. Alinhamento pode também ser realizadomanualmente através de inspeção.A menos que haja indicação contrária, valores deidentidade/similaridade de seqüência providos aqui sereferem a valores obtidos usando GAP Versão 10 usando osseguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridadepara uma seqüência de nucleotídeo usando "GAP Weight" de 50e "Length Weight" de 3, e a matriz de pontuaçãonwsgapdna. cmp; % de identidade e % de similaridade para umaseqüência de aminoácido usando "GAP Weight" de 8 e "LengthWeight" de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquerprograma equivalente dos mesmos. O termo "programaequivalente" significa qualquer programa de comparação deseqüência que, para quaisquer duas seqüências em questão,gera um alinhamento tendo resíduos compartilhados denucleotídeos ou aminoácidos idênticos e uma porcentagemidêntica de identidade de seqüência quando comparada com oalinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.

GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar o alinhamento de duasseqüências completas que maximizam o número decompartilhamentos e minimiza o número de "gaps". GAPconsidera todos os alinhamentos possíveis e posições de"gap" e cria o alinhamento com o maior número de basespareadas e menor número de "gaps". Ele permite a previsãode um "gap creation penalty" e um "gap extension penalty"em unidades de bases pareadas. GAP deve fazer um ganho donúmero de compartilhamentos "gap creation penalty" paracada "gap" que ele insere. Se um "gap extension penalty"maior zero é escolhido, GAP deve, em adição, fazer um ganhopara cada "gap" inserido do comprimento do "gap" vezes o"gap extension penalty". Valores padrões de "gap creationpenalty" e "gap extension penalty" na Versão 10 do GCGWisconsin Genetics Software Package para seqüências deproteína são 8 e 2, respectivamente. Para seqüências denucleotídeo o padrão de "gap creation penalty" é 50enquanto que o padrão do "gap extension penalty" é 3. O"gap creation" e "gap extension penalties" podem serexpressos como um inteiro selecionado do grupo de inteirosconsistindo de 0 a 200. Então, por exemplo, o "gapcreation" e "gap extension penalties" podem ser 0, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65 ou maior.

GAP apresenta um membro da família dos melhoresalinhamentos. Podem existir muitos membros desta família,mas nenhum outro membro desta família tem melhor qualidade.GAP exibe quatro figuras de mérito para alinhamentos:Qualidade, Razão, Identidade, e Similaridade. A Qualidadeé a métrica maximizada a fim de alinhar as seqüências.Razão é a qualidade dividida pelo número de bases nosegmento mais curto. Porcentagem de identidade é aporcentagem dos símbolos que compartilham efetivamente.Porcentagem de Similaridade é a porcentagem dos símbolosque são similares. Símbolos que estão através dos gaps sãoignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor damatriz de pontuação para um par de símbolos é maior ouigual a 0,50, limiar de similaridade. A matriz de pontuaçãousado na Versão 10 da GCG Wisconsin Genetics SoftwarePackage é BLOSUM62 (ver, Henikoff e Henikoff (1989) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).

(c) Como usado aqui, "identidade de seqüência" ou"identidade" no contexto de duas seqüências depolinucleotídeos ou polipeptídeos faz referência a resíduosnas duas seqüências que são os mesmos quando alinhados paraum máximo de correspondência sobre uma janela de comparaçãoespecificação. Quando a porcentagem de identidade deseqüência é usada em referência a proteínas é reconhecidoque posições nos resíduos que não são idênticasfreqüentemente diferem através de substituições deaminoácidos conservativas, onde resíduos de aminoácidos sãosubstituídos são substituídos por outros resíduos deaminoácidos com propriedades químicas similares (ex.: cargaou hidrofobicidade) e, portanto não mudam as propriedadesfuncionais da molécula. Quando seqüências diferem emsubstituições conservativas, a porcentagem de identidade deseqüência pode ser ajustada para cima para corrigir anatureza conservativa da substituição. Seqüências quediferem através de tais substituições conservativas sãoditas ter "similaridade de seqüência" ou "similaridade.

Meios para fazer esse ajuste são bens conhecidos paraespecialistas na área. Tipicamente isso envolve pontuaruma substituição conservativa como parcial ao invés de ummau emparelhamento total, aumentando assim a porcentagem deidentidade de seqüência. Então, por exemplo, onde a umaminoácido idêntico é dada uma pontuação de 1 e a umasubstituição não conservativa é dada uma pontuação de zero,a uma substituição conservativa é dada uma pontuação entrezero e 1. A pontuação de substituições conservativas écalculada, ex.: como implementada no programa PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).

(d) Como usado aqui, o termo "porcentagem deidentidade de seqüência" significa o valor determinadoatravés da comparação de duas seqüências alinhadasotimamente sobre uma janela de comparação, onde a porção daseqüência de polinucleotídeo na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (i.e., gaps) quandocomparada com a seqüência de referência (que não compreendeadições ou deleções) para um alinhamento ótimo das duasseqüências. A porcentagem é calculada pela determinação donúmero de posições onde o resíduo de base de ácido nucléicoou aminoácido idêntico ocorre em ambas as seqüências paraproduzir o número de posições compartilhadas, dividindo onúmero de posições compartilhadas pelo número total dasposições na janela de comparação, e multiplicando oresultando por 100 para produzir a porcentagem deidentidade de seqüência.

0 uso do termo "polinucleotídeo" não significa limitara presente invenção a polinucleotídeos compreendendo DNA.Especialistas reconhecerão que polinucleotídeos podemcompreender ribonucleotídeos e combinações dosribonucleotídeos e desoxiribonucleotídeos. Tais

ribonucleotídeos e desoxiribonucleotídeos incluem ambas asmoléculas ocorrendo naturalmente e análogos sintéticos. Ospolinucleotídeos da invenção também englobam todas asformas de seqüências incluindo, mas não limitado a, formasde cadeia simples, grampos, estruturas de haste e volta, esemelhantes.

A molécula de polinucleotídeo Zm-D9 da invenção podeser provida em cassetes de expressão para expressão naplanta Zm-D9 de interesse. 0 cassete incluirá seqüênciasregulatórias 5' e 3' operacionalmente ligadas a umamolécula de polinucleoídeo Zm-D9 da invenção. O termo"operacionalmente ligado" significa uma ligação funcionalentre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligaçãooperável entre uma molécula de polinucleotídeo de interessee uma seqüência regulatória (i.e., iam promotor) é umaligação funcional que permite a expressão da molécula depolinucleotídeo de interesse. Elementos operacionalmenteligados podem ser contíguos ou não contíguos. Quando usadapara referir à união de duas regiões codificadoras deproteínas, a ligação operacional significa que as regiõescodificadoras estão na mesma fase leitura. O cassete podeadicionalmente conter pelo menos um gene adicional para serco-transformado dentro do organismo. Alternativamente, o(s)gene(s) adicional(is) pode ser provido em múltiploscassetes de expressão. Tais cassetes de expressão sãoprovidos com uma pluraridade de sítios de restrição e/ousítios de recombinação para inserção da molécula depolinucleotídeo Zm-D9 pra estar sob regulaçãotranscricional das regiões regulatórias. O cassete deexpressão pode adicionalmente conter genes marcadores deseleção.

O cassete de expressão incluirá na direção detranscrição 5'-3', uma região de iniciação transcricional etraducional (i.e., um promotor), uma molécula depolinucleotídeo Zm-D9 da invenção, e uma região determinação transcricional e traducional (i.e., região determinação) funcional em plantas. As regiões regulatórias(i.e., promotores, regiões regulatórias transcricionais, eregiões de terminação traducional) e/ou a molécula depolinucleotídeo Zm-D9 da invenção podem sernativas/análogas à célula hospedeira ou umas com as outras.Alternativamente, as regiões regulatórias e/ou a moléculade polinucleotídeo Zm-D9 da invenção podem ser heterólogasà célula hospedeira ou umas com as outras. Como usadoaqui, o termo "heterólogo" referente a uma seqüência é umaseqüência que é originária de uma espécie estrangeira, ou,se da mesma espécie, é substancialmente modificada de suaforma nativa na composição e/ou locus genômico pelaintervenção deliberada do homem. Por exemplo, um promotorligado operacionalmente a uma molécula de polinucleotídeoheteróloga é de uma espécie diferente da espécie de onde amolécula de polinucleotídeo foi derivada, ou, se da mesmaespécie ou espécie análoga, uma ou ambas sãosubstancialmente modificadas de sua forma original e/oulocus genômico, ou o promotor não é nativo para opolinucleotídeo operacionalmente ligado. Como usado aqui,um gene quimérico compreende uma seqüência codificadoraoperacionalmente ligada a uma região de iniciação detranscrição que é heteróloga à seqüência codificadora.

Enquanto pode ser ótimo expressar as seqüências usandopromotores heterólogos, as seqüências de promotores nativaspodem ser usadas. Tais constructos podem mudar os níveis deexpressão de Zm-D9 na planta ou célula vegetal. Então, ofenótipo da planta ou célula vegetal pode ser alterado.

A região de terminação pode ser nativa com a região deiniciação transcricional, pode ser nativa com a molécula depolinucleotídeo Zm-D9 de interesse operacionalmente ligada,pode ser nativa com a planta hospedeira, ou pode serderivada de outra fonte (i.e., estrangeira ou heteróloga)com relação ao promotor, à molécula de polinucleotídeo Zm-D9 de interesse, à planta hospedeira, ou qualquercombinação dos mesmos. Regiões de terminação convenientesestão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, taiscomo as regiões de terminação da octopina sintase e anopalina sintase. Ver também, Guerineau, et al., (1991)Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen,et al., (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe, et al.,(1990) Gene 91:151-158; Bailas, et al., (1989) NucleicAcids Res. 17:7891-7903; and Joshi, et al., (1987) NucleicAeids Res. 15:9627-9639.

Onde apropriado, os polinucleotídeos podem serotimizados para aumentar a expressão na plantatransformada. Isto é, os polinucleotídeos podem sersintetizados usando códons preferenciais de plantas paramelhorar a expressão. Ver, por exemplo, Campbell and Gowri(1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão do uso decódons preferenciais para hospedeiros. Métodos estãodisponíveis no estado da técnica para sintetizar genespreferidos de plantas. Ver, por exemplo, números depatentes americanas 5,380,831, e 5,43 6,391, e Murray, etal., (1989) Nueleie Aeids Res. 17:477-498, aquiincorporados por referência.

Modificações de seqüências adicionais são conhecidaspara melhorar a expressão gênica em uma célula hospedeira.Isso inclui a eliminação de seqüências codificando sinaisde poliadenilação espúrios, sinais de sítios de união exon-intron, repetições tipo transposons, e outras taisseqüências bem caracterizadas que podem ser deletérias àexpressão gênica. O conteúdo G-C da seqüência pode serajustado a níveis médios para iam dado hospedeiro celular,como calculado por referência a genes conhecidos expressosna célula hospedeira. Quando possível, a seqüência émodificada para evitar estruturas secundarias de mRNA emforma de grampo preditas.

Os cassetes de expressão podem adicionalmente conterseqüências líderes 5' . Tais seqüências líderes podém agirpara melhorar a tradução. Líderes de tradução sãoconhecidas no estado da técnica e incluem: líderes depicornavirus, por exemplo, líder EMCV (região 5' nãocodificadora de Encephalomyocarditis) (Elroy-Stein, et al.,(1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6126-6130); líderes depotivirus, por exemplo, líder TEV (Tobacco Etch Virus)(Gallie, et al. , (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV(Maize Dwarf Mosaic Virus) (Virology 154:9-20), e proteínade ligação à cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP)(Macejak, et al., (1991) Nature 353:90-94); líder nãotraduzida do RNAm da proteína da capa do vírus do mosaicoda alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature325:622-625); líder do vírus do mosaico de tabaco (TMV)(Gallie, et al., (1989) in Molecular Biology of RNA1 ed.Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder do vírus domosqueado clorótico de milho (MCMV) (Lommel, et al., (1991)Virology 81:382-385). Ver também, Della-Cioppa, et al.,(1987) Plant Physiol. 84:965-968.

Na preparação do cassete de expressão, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados, para então proveras seqüências de DNA na orientação apropriada e, comoapropriado, na fase de leitura própria. Em direção a estefim, adaptadores ou ligantes podem ser empregados paraligar os fragmentos de DNA ou outras manipulações podemestar envolvidas para prover convenientes sítios derestrição, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios derestrição, ou semelhantes. Para este propósito, mutagênesein vitro, reparos de iniciadores, restrição, anelamento,resubstituições, por exemplo, transições e transversões,podem estar envolvidas.

Um número de promotores pode ser usado na práticadesta invenção, incluindo o promotor nativo da seqüência depolinucleotídeo de interesse. Os promotores podem serselecionados com base no resultado desejado. Os ácidosnucléicos da invenção podem ser combinados com promotoresconstitutivos, tecido-específicos, ou outros promotorespara expressão em plantas.

Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, aparte principal do promotor Rsyn7 e outros promotoresconstitutivos revelados nas patentes WO 99/43838 e patenteamericana número 6,072,050; a parte principal do promotorCaMV 35S (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812); actinade arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171);ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol.12:619-632 and Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol.18:675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet.81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotores ALS (patente americana número 5,659,026),e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem,por exemplo, patentes americanas números 5,608,149;5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680;5,268,463; 5,608,142; e 6,177,611.

Promotores químico-regulados podem ser usados paramodular a expressão de um gene em uma planta através daaplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo doobjetivo, o promotor pode ser um promotor químico-induzível, onde a aplicação do químico induz a expressãogênica, ou um promotor químico-repressível, onde aaplicação do químico reprime a expressão gênica. Promotoresquímico-induzíveis são conhecidos no estado da técnica eincluem, mas não estão limitados a, promotor de milho In2-2, que é ativado pelo protetor herbicidabenzenosulfonamida, o promotor de milho GST, que é ativadopor compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usadoscomo herbicidas pré-emergentes, e o promotor de tabaco PR-Ia, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotoresquímico-regulados de interesse incluem promotoresesteróides-responsivos (ver, por exemplo, o promotorglucocorticóide-induzível em Schena, et al., (1991) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425 and McNellis, et al.,(1998) Plant J. 14 (2):247-257) e os promotorestetraciclina-induzível e tetraciclina-repressível (ver, porexemplo, Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237,e patentes americanas números 5,814,618 e 5,789,156), aquiincorporados por referência.Promotores tecido-específicos podem ser utilizadospara direcionar a expressão Zm-D9 melhorado dentro de umtecido particular de planta. Promotores tecido-específicosincluem Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12 (2):255-265;Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7):792-803;Hansen, et al. , (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343;Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168;Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341;Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535;Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524;Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5):773-778;Lam (1994) Kesults Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco,et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka,et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90 (20) : 9586-9590 ;e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4 (3):495-505.Tais promotores podem ser modificados, se necessário, parauma expressão fraca.

Certas concretizações da invenção fazem uso de plantastransformadas com promotores tecido-específicos,particularmente promotores caule-específicos,

operacionalmente ligados a seqüências de nucleotídeocodificando proteínas Zm-D9. Em uma concretização dainvenção, o promotor MS-S2A (Abrahams, et al., (1995) PlantMol Biol 27:513-28) é operacionalmente ligado a umaseqüência de polinucleotídeo codificando a proteína tiposelvagem ou a proteína MUTl Zm-D9. A escolha do promotor, ea especificidade de tecido inerente, pode da mesma formainfluenciar o grau ou intensidade das mudanças morfológicasem plantas transgênicas que expressam a proteína tiposelvagem ou proteína MUTl Zm-D9 da invenção. Promotorescaule-específicos, como no caso do promotor MS-S2A,implicam expressão associada com os elementos vascularesque tenham sido documentados (dados não mostrados). Opromotor MS-S2A parece ser ótimo para expressão de MUTl Zm-D9 enquanto o promotor de actina, um promotorconstitutivamente expresso com expressão mais alta notecido foliar, tem mudanças muito modestas ou leves namorfologia quando usado para expressar a proteína MUTl ZM-D9.

Promotores específicos de folha são conhecidos noestado da técnica. Ver, por exemplo, Yamamoto, et al.,(1997) Plant J. 12 (2):255-265; Kwon, et al., (1994) PlantPhysiol. 105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant CellPhysiol. 35 (5) :773-778; Gotor, et al. , (1993) Plant J.3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol.23 (6) : 1129-1138; e Matsuoka, et al. , (1993) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590. (Ver acima)

Promotores raiz-específicos são conhecidos e podem serselecionados dos muitos disponíveis da literatura ouisolados das várias espécies compatíveis. Ver, por exemplo,Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (geneglutamina sintetase de soja específico de raiz); Keller andBaumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elementocontrole raiz específico no gene GRP 1.8 do feijão"French"); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol.14(3):433-443 (promotor raiz específico do gene da manopinasintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); e Miao, etal., (1991) Plant Cell 3(l):ll-22 (comprimento total doclone de cDNA codificando a glutamina sintetase citosólica(GS) , que é expressa em raízes e nódulos de raízes desoja).Ver também, Bogusz, et al., (1990) Plant Cell2(7):633-641,onde dois promotores raiz-específicos isoladosdos genes da hemoglobina do não legume fixador denitrogênio Parasponia andersonii e o não legume não fixadorde nitrogênio relacionado Trema tomentosa são descritos. Ospromotores desses genes foram ligados ao gene repórter daβ-glucuronidase e introduzidos dentro de ambos o não legumeNicotiana tabacum e o legume Lotus corniculatus, e em ambasas instâncias a atividade do promotor raiz específico foipreservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem suas análisesdos promotores dos genes raiz-induzíveis altamenteexpressos rolC e rolD de Agrobacterium rhizogenes (ver,Plant Science (Limerick) 79 (1): 69-76) . Eles concluíram quepotenciadores e DNA tecido-específicos determinantes estãodissociados naqueles promotores. Teeri, et al., (1989)usou fusão gênica para IacZ para mostrar que o gene T-DNAde Agrobacterium codificando octopina sintetase éespecialmente ativa na epiderme do ápice da raiz e que ogene TR2' é específico para raiz na planta intacta eestimulado por ferimentos no tecido foliar, uma combinaçãoespecialmente desejável das características para uso com umgene inseticida ou larvicida (ver, EMBO J. 8(2):343-350). Ogene TRl', fusionado ao nptll (neomicina fosfotransferaseII) mostrou características similares. Promotores raiz-específicos adicionais incluem o promotor do gene VfENOD-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); e o promotor rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol.Biol. 25(4):681-691. Ver também, patentes americanasnúmeros 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252;5,401,836; 5,110,732; e 5,023,179.

Onde o baixo nível de expressão é desejável,promotores fracos serão usados. Geralmente, o termo"promotor fraco" significa um promotor que dirige aexpressão de uma seqüência codificadora em um baixo nível.O termo "baixo nível" significa níveis de cerca de 1/1000transcritos para cerca de 1/100,000 transcritos para cercade 1/500,000 transcritos. Alternativamente, é reconhecidoque promotores fracos também englobam promotores que sãoexpressos em apenas umas poucas células e não em outraspara dar um nível baixo total de expressão. Onde umpromotor é expresso em níveis inaceitavelmente altos,porções da seqüência do promotor podem ser deletadas oumodificadas para diminuir os níveis de expressão.

Tais promotores constitutivos fracos incluem, porexemplo, a parte principal do promotor Rsyn7 (patente WO99/43838 e patente americana número 6,072,050), a parteprincipal do promotor 35S CaMV, e semelhantes. Outrospromotores constitutivos incluem, por exemplo, patentesamericanas números 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121;5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.Ver também, patente americana número 6,177,611, aquiincorporada por referência.

O cassete de expressão pode também compreender um genemarcador de seleção para a seleção de célulastransformadas. Genes marcadores de seleção são utilizadospara seleção de células ou tecidos transformados. Genesmarcadores incluem genes codificando resistência aantibiótico, tais como aqueles codificando a neomicinafosfotransferase II (NEO) e a higromicina fosfotransferase(HPT), bem como os genes conferindo resistência a compostosherbicidas, tais como glufosinato de amônio, bromoxinil,imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).Marcadores de seleção adicionais incluem marcadoresfenotípicos tais como a galactosidase e proteínasfluorescentes tais como proteína fluorescente verde (GFP)(Su, et al., (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 e Fetter, etal., (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína fluorescenteciano (CYP) (Bolte, et al., (2004) J. Cell Science117:943-54 and Kato, et al., (2002) Plant Physiol. 129:913-42) , e proteína fluorescente amarela (PhiYFP™ da Evrogen,ver, Bolte, et al., (2004) J. Cell Science 117:943-54).Para marcadores de seleção adicionais, ver geralmente,Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511;Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff(1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, et al., (1980)in The Operon, pp. 177-220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al.,(1988) Cell 52:713-722; Deuschle, et al. , (1989) Proc.Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2549-2553; Deuschle, et al.,(1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis,University of Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990)Mol. Cell. Biolr 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Baim, et al.,(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5072-5076; Wyborski,et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162;Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother.35:1591-1595; Kleinschnidt, et al. (1988) Biochemistry27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University ofHeidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:5547-5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. AgentsChemother. 36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook ofExperimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag,Berlin); Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724. Taisrevelações são aqui incorporadas por referência.

A lista acima dos genes marcadores de seleção não temo objetivo de ser limitante. Qualquer gene marcador deseleção pode ser usado na presente invenção.Em uma concretização, a molécula de polinucleotídeo deinteresse é direcionada para expressão no cloroplasto.Desta maneira, onde o polinucleotídeo de interesse não édiretamente inserido dentro do cloroplasto, o cassete deexpressão adicionalmente conterá um ácido nucléicocodificando um peptídeo trânsito para dirigir o produtogênico de interesse aos cloroplastos. Tais peptídeos detrânsito são conhecidos no estado da técnica. Ver, porexemplo, Von Heijne, et al., (1991) Plant Mol. Biol. Rep.9:104-126; Clark, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; DelIa-Cioppa, et ai., (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer, et al. , (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun.196:1414-1421; e Shah, et al., (1986) Science 233:478-481.

Seqüências direcionadoras para cloroplastos sãoconhecidas no estado da técnica e incluem a subunidadepequena do cloroplasto da ribulose-1,5-bisfosfatocarboxilase (Riibisco) (de Castro Silva Filho, et al.,(1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell, et al., (1991)J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer, et al., (1990) J.Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); triptofano sintase(Zhao, et al., (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087);plastocianina (Lawrence, et al., (1997) J. Biol. Chem.272 (33)-.20357-20363) ; corismato sintase (Schmidt, et al.,(1993) J. Biol. Chem. 268 (36):27447-27457); a proteína deligação à clorofila a/b captadora de luz (LHBP) (Lamppa, etal., (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Ver também,Von Heijne, et al. , (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126;Clark, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550;Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968;Romer, et al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun.196:1414-1421; and Shah, et al., (1986) Science 233:478-481.

Métodos para transformação de cloroplastos sãoconhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Svab, etal., (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:8526-8530; Svaband Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917;Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método sebaseia em uma arma de partícula liberadora de DNA contendoum marcador de seleção e direcionando o DNA para o genomaplastídial através de recombinação homóloga.Adicionalmente, a transformação plastidial pode serrealizada por transativação de um transgene silencioso deplastídeo carregado através de expressão tecido-específicade uma RNA polimerase codificada no núcleo e dirigida paraplastídeo. Tal sistema tem sido reportado em McBride, etal., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305.

Os polinucleotídeos de interesse para seremdirecionados ao cloroplasto podem ser otimizados paraexpressão no cloroplasto através das diferenças no uso docódon entre o núcleo da planta e sua organela. Desta forma,a molécula de polinucleotídeo de interesse pode sersintetizada usando códons preferidos pelo cloroplasto. Ver,por exemplo, a patente americana 5,380,831, aquiincorporada por referência.

Os métodos da invenção envolvem introduzir umpolipeptídeo ou uma molécula de polinucleotídeo dentro daplanta. O termo "introduzir" significa apresentar à plantaa molécula de polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal formaque a seqüência ganha acesso ao interior de uma célula daplanta. Os métodos da invenção não dependem de um métodoparticular para introduzir uma seqüência dentro de umaplanta, apenas que a molécula de polinucleotídeo oupolipeptídeos ganhem acesso ao interior de pelo menos umacélula da planta. Métodos para introduzir molécula depolinucleotídeo ou polipeptídeos dentro das plantas sãoconhecidas no estado da técnica incluindo, mas não estandolimitado a, métodos de transformação estável, métodos detransformação transiente, e métodos mediado por vírus.

0 termo "transformação estável" significa que oconstructo de nucleotídeo introduzido dentro de uma plantaintegra dentro do genoma da planta e é capaz de ser herdadopela progênie dos mesmos. 0 termo "transformaçãotransiente" significa que uma molécula de polinucleotídeo éintroduzida dentro da planta e não integra dentro do genomada planta ou um polipeptídeo é introduzido dentro de umaplanta.

Protocolos de transformação bem como protocolos paraintroduzir seqüências de polipeptídeos ou polinucleotídeosdentro das plantas podem variar dependendo do tipo deplanta ou célula vegetal, i.e., monocotiledôneas oudicotiledôneas, alvos da transformação. Métodos disponíveisde introduzir polipeptídeos e polinucleotídeos dentro decélulas vegetais incluem microinjeção (Crossway, et al.,(1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs, etal., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606,transformação mediada por Agrobacterium (patentesamericanas números 5,563,055 e 5,981,840), transferênciagênica direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J.3:2717-2722), e aceleração de partículas balística (ver,por exemplo, patente americana número 4,945,050; patenteamericana número 5,879,918; patentes americanas números5,886,244; e 5,932,782; Tomes, et al., (1995) in PlantCell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed.Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabef etal., (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação Lecl(WO 00/28058). Ver também, Weissinger, et al. , (1988) Ann.Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) ParticulateScience and Technology 5:27-37 (cebola); Christou, et al.,(1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe, et al.,(1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen(1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh,et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja);Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz);Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA85:4305-4309 (milho); Klein, et al., (1988) Biotechnology6:559-563 (milho); U.S. Patent Nmribers 5,240,855;5,322,783; and 5,324,646; Klein, et al. , (1988) PlantPhysiol. 91:440-444 (milho); Fromm, et al., (1990)Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren, etal., (1984) Nature (London) 311:763-764; U.S. PatentNiamber5,736,369 (cereais); Bytebier, et al., (1987) Proc. WatI.Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet, et al.,(1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed. Chapman, et al., (Longman, New York), pp. 197-209(pólen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet.84:560-566 (transformação mediada por fibra); D1Halluin, etal., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li, etal., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou andFord (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, etal., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho viaAgrobacterium tumefaciens); todas as quais são aquiincorporadas por referência.

Em concretizações específicas, as seqüências Zm-D9 dainvenção podem ser providas para uma planta usando umavariedade de métodos de transformação transiente. Taismétodos de transformação transiente incluem, mas não estãolimitados a, a introdução da proteína Zm-D9 ou variantes efragmentos dos mesmos diretamente dentro da planta ou aintrodução do transcrito Zm-D9 dentro da planta. Taismétodos incluem, por exemplo, microinjeção oubombardeamento de partículas. Ver, por exemplo, Crossway,et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura, et al.,(1986) Plant Sei. 44:53-58; Hepler, et al., (1994) Proc.Natl. Acad. Sei. 91:2176-2180 and Hush, et al., (1994) TheJournal of Cell Science 107:775-784, todas das quais sãoaqui incorporadas por referência. Alternativamente, amolécula de polinucleotídeo Zm-D9 pode ser transientementetransformada dentro da planta usando técnicas conhecidas noestado da técnica. Tais técnicas incluem sistema de vetorviral e a precipitação da molécula de polinucleotídeo demaneira que opõe à liberação subseqüente do DNA. Então, atranscrição do DNA limitado à partícula pode ocorrer, mas afreqüência com a qual ele é liberado para se tornarintegrado dentro do genoma é altamente reduzida. Taismétodos incluem o uso de partículas cobertas compolietilenoimina (PEI; Sigma #P3143).

Em outras concretizações, a molécula depolinucleotídeo da invenção pode ser introduzida dentro dasplantas através do contato das plantas com um vírus ouácidos nucléicos virais. Geralmente, tais métodos envolvema incorporação de um constructo de nucleotídeo da invençãodentro de uma molécula de DNA ou RNA. É reconhecido que aseqüência de aminoácido Zm-D9 da invenção pode serinicialmente sintetizada como parte de uma poliproteínaviral, que mais tarde pode ser processada por proteólise invivo or in vitro para produzir a proteína recombinantedesejada. Adicionalmente, é reconhecido que promotores dainvenção também englobam promotores utilizados paratranscrição por RNA polimerases virais. Métodos paraintroduzir polinucleotídeos dentro das plantas e expressaruma proteína codificada, envolvendo moléculas de DNA ou RNAvirais, são conhecidos no estado da técnica. Ver, porexemplo, patentes americanas números 5,889,191, 5,889,190,5,866,785, 5,589,367, 5,316,931, e Porta, et al. , (1996)Molecular Biotechnology 5:209-221; aqui incorporadas porreferência.

Métodos são conhecidos no estado da técnica paradirecionar a inserção de uma molécula de polinucleotídeo emum local específico no genoma da planta. Em umaconcretização, a inserção da molécula de polinucleotídeo emum local desejado do genoma é alcançada usando um sistemade recombinação sítio-específica. Ver, por exemplo,W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, eW099/25853, todas das quais são aqui incorporadas porreferência. Brevemente, a molécula de polinucleotídeo dainvenção pode estar contida em um cassete de transferênciaflanqueada por dois sítios de recombinação nãorecombinogênicos. O cassete de transferência é introduzidodentro de uma planta tendo estavelmente incorporado dentrodo seu genoma um sítio alvo que é flanqueado por doissítios de recombinação não recombinogênicos quecorrespondem aos sítios do cassete de transferência. Umarecombinase apropriada é provida e o cassete detransferência é integrado no sítio alvo. A molécula depolinucleotídeo de interesse é então integrada na posiçãocromossomal específica no genoma vegetal.

As células que tenham sido transformadas podem serdesenvolvidas em plantas de acordo com os meiostradicionais. Ver, por exemplo, McCormick, et al., (1986)Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem ser entãodesenvolvidas, e ainda polinizadas com a mesma linhagemtransformada ou linhagens diferentes, e a progênieresultante ter uma expressão constitutiva da característicafenotípica desejada identificada. Duas ou mais geraçõespodem ser desenvolvidas para assegurar que a expressão dacaracterística fenotípica desejada é estavelmente mantida eherdada e então as sementes são colhidas para assegurar quea expressão da característica fenotípica desejada tenhasido alcançada. Desta forma, a presente invenção provêsementes transformadas (também referenciadas como "sementestransgênicas") tendo uma molécula de polinucleotídeo dainvenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção,estavelmente incorporada dentro do seu genoma.

Melhoramento de linhagem ("Pedigree") começa com ocruzamento de dois genótipos, tais como uma linhagem elitede interesse e uma outra linhagem elite pura tendo uma oumais características desejáveis (i.e., tendo estavelmenteincorporada uma molécula de polinucleotídeo da invenção,tendo uma atividade modulada e/ou nível do polipeptídeo dainvenção, etc) que complementa a linhagem elite deinteresse. Se dois parentais originais não provêm todas ascaracterísticas desejáveis, outras fontes podem serincluídas na população do melhoramento genético. No métodode melhoramento de linhagem, plantas superiores são auto-fecundadas e selecionadas em gerações filiais sucessivas.Nas gerações filiais sucessivas a condição de heterozigotosdá forma às linhagens homozigotas como um resultado deauto-polinização e seleção. Tipicamente no método demelhoramento de linhagem do melhoramento genético, cinco oumais gerações filiais sucessivas da auto-fecundação eseleção são praticadas: Fl -» F2; F2 - F3. F3 -> F4;F4 -» F5,

etc. Depois de uma quantidade suficiente de endogamia,gerações filiais sucessivas servirão para aumentar asemente das linhagens puras desenvolvidas. Emconcretizações específicas, a linhagem pura compreendealelos homozigotos de cerca de 95% ou mais de seu Ioci.

Além de ser usado para criar uma conversão deretrocruzamento, o retrocruzamento pode também ser usado emcombinação com o melhoramento genético de linhagem paramodificar uma linhagem elite de interesse e um híbrido queé feito usando a linhagem elite modificada. Como discutidoanteriormente, retrocruzamento pode ser usado paratransferir um ou mais tratos desejáveis de uma linhagem, oparental doador, para uma linhagem pura denominada parentalrecorrente, que tem todas as características agronômicasboas que já perdeu aquele(s) caracter(es) desejável(eis).No entanto, o mesmo procedimento pode ser usado para movera progênie em direção ao genótipo do parental recorrente,mas ao mesmo tempo retém muitos componentes do parentalnão-recorrente colocando fim ao retrocruzamento em umestágio mais cedo e procedendo com auto-fecundação eseleção. Por exemplo, um Fl, tal como um híbrido comercial,é criado. Este híbrido comercial pode ser retrocruzado comuma das suas linhagens parentais para criar um BCl ou BC2.Progênies são auto-fecundadas e selecionadas para que anova linhagem pura desenvolvida tenha muitos atributos doparental recorrente e ainda diversos dos atributosdesejáveis do parental não recorrente. Esta abordagemalavanca o valor e força do parental recorrente para uso emnovos híbridos e melhoramento genético.

Portanto, uma concretização desta invenção é um métodode fazer uma conversão de retrocruzamento de uma linhagempura de milho de interesse, compreendendo os passos decruzar uma planta de uma linhagem pura de milho deinteresse com uma planta doadora compreendendo um genemutante ou transgene conferindo um trato desejado (i.e.,altura ou estatura da planta reduzida), selecionando umaprogênie de planta Fl compreendendo o gene mutante outransgene conferindo o trato desejado, e retrocruzar aprogênie vegetal Fl selecionada com a planta de umalinhagem pura de milho de interesse. Este método podeadicionalmente compreender o passo de obter um perfil demarcador molecular de uma linhagem pura de milho deinteresse e usar o perfil de marcador molecular paraselecionar uma progênie de planta com o trato desejado e operfil de marcador molecular da linhagem pura de interesse.Da mesma forma, esse método pode ser usado para produziruma semente híbrida Fl através da adição de um passo finalde cruzar a conversão do trato desejável da linhagem purade milho de interesse com uma planta de milho diferentepara fazer uma semente de milho híbrida Fl compreendendo umgene mutante ou transgene conferindo o trato desejado.

Seleção recorrente é um método usado em um programa demelhoramento de planta para melhorar uma população deplantas. O método envolve plantas individuais depolinização cruzada entre si para formar uma progênie. Asprogênies são desenvolvidas e a progênie superior éselecionada por qualquer número de métodos de seleção, queincluem plantas individuais, progênies de meio-irmãos,progênies de irmãos completos, progênies auto-fecundadas ecruzamento de topo ("topcrossing"). As progêniesselecionadas passam por polinização cruzada uma com a outrapara formar progênie para outra população. Essa população éplantada e novamente plantas superiores são selecionadaspara passarem por polinização cruzada umas com as outras.Seleção recorrente é um processo cíclico e, portanto podeser repetido quantas vezes forem desejadas. O objetivo daseleção recorrente é melhorar os tratos de uma população. Apopulação melhorada pode então ser usada como uma fonte dematerial de melhoramento genético para obter linhagenspuras para serem usadas em híbridos ou usadas comoparentais para uma cultivar sintética. Uma cultivarsintética é a progênie resultante formada pelointercruzamento de diversas linhagens puras selecionadas.

Seleção em massa é uma técnica útil quando usada emconjunto com a seleção potencializada por marcadormolecular. Na seleção em massa sementes dos indivíduos sãoselecionadas com base no fenótipo e/ou genótipo. Essassementes selecionadas são então empilhadas e usadas paradesenvolver a próxima geração. Seleção de volume ("bulk")requer crescer uma população de plantas em uma parcela emgranel, permitindo às plantas se auto-polinizarem, colher asemente em granel e então usar uma amostra da sementecolhida em granel para plantar a próxima geração. Ao invésde auto-polinização, polinização dirigida pode ser usadacomo parte do programa de melhoramento.

Melhoramento genético por mutação é um dos muitosmétodos que pode ser usado para introduzir novos caracteresdentro de uma linhagem elite. Mutações que ocorremespontaneamente ou são artificialmente induzidas podem serfontes úteis de variabilidade para um melhorista de planta.O objetivo da mutagênese artificial é aumentar a taxa demutação para uma característica desejada. Taxas de mutaçãopodem ser aumentadas por muitos diferentes meios incluindotemperatura, longo tempo de estocagem de semente, condiçõesde cultura de tecido, radiação; tais como raios-X, raiosgama (ex.: cobalto 60 ou césio 137), neutrons, (produtos defissão nuclear por urânio 235 em um reator atômico),radiação beta (emitida de radioisótopos tais como fósforo32 ou carbono 14), ou radiação ultravioleta(preferencialmente de 250 a 290nm), ou mutagênicos químicos(tais como bases análogas (5-bromo-uracil) , compostosrelacionados (8-etoxi cafeína), antibióticos(estreptonigrina), agentes alquilantes (mostardas deenxofre, mostardas de nitrogênio, epoxidos, etilenoaminas,sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida,hidroxilamina, ácido nitroso, ou acridinas. Uma vez que umtrato desejado é observado através da mutagênese o tratopode então ser incorporado dentro de iam germoplasmaexistente através de técnicas de melhoramento tradicionais,tais como retrocruzamento. Detalhes do melhoramentogenético por mutação pode ser encontrado em "Principais ofCultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan PublishingCompany a revelação do mesmo é incorporada aqui porreferência. Em adição, mutações criadas em outras linhagenspodem ser usadas para produzir uma conversão deretrocruzamento de linhagens elite que compreendam tais mutações.

Como usado aqui, o termo plantas inclui célulasvegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecido celularvegetal dos quais plantas podem ser regeneradas, calos deplantas, grupos de plantas, e células vegetais que estãointactas em plantas ou partes das plantas tais comoembriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos,frutos, espigas, grão, cascas, caules, raízes, ápicesradiculares, anteras, e semelhantes. Grão significa asementes madura produzida por plantadores comerciais parapropósito outro do que crescimento ou reprodução daespécie. Progênie, variantes, e mutantes das plantasregeneradas são também incluídas dentro do escopo dainvenção, provido que essas partes compreendam ospolinucleotídeos introduzidos.

A presente invenção pode ser usada para transformaçãode qualquer espécie de planta, incluindo, mas não estandolimitado a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos deespécies vegetais de interesse incluem, mas não estãolimitadas a, milho (Zea mays) , Brassica sp. (e.g., B.napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelasespécies de Brassica úteis como fonte de óleo de semente,alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio(Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) ,milheto (ex.: milheto "pearl" (Pennisetum glaucum) , milheto"proso" (Panicum miliaceum), milheto "foxtail" (Setariaitalica), milheto "finger" (Eleusine coracana)), girassol(Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo(Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotianatabacum), batata (Solanum tuberosum) , amendoins (Arachishypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypiumhirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca {Manihotesculenta), café (Coffea spp.), côco (Cocos nucifera) ,abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrus {Citrus spp.),cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana(Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficuscasica), goiaba (Psidium guajava) , manga (Mangiferaindica), azeite (Olea europaea), mamão (Carica papaya) ,caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamiaintegrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus) , beterraba (Betavulgaris), cana-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada,vegetais, ornamentais, e coníferas.

Vegetais incluem tomates (Lyeopersieon eseulentum) ,alface (ex.: Laetuea sativa), feijão verde (Phaseolusvulgaris) , feijão lima (Phaseolus limensis) , ervilhas(Lathyrus spp.), e membros do gênero Cueumis tais comopepino (C. sativus), melão cantalupo (C. eantalupensis), emelão almíscar (C. melo). Ornamentais incluem azaléia(Rhododendron spp.), hortênsia (Maerophylla hydrangea) ,hibisco (Hibiseus rosasanensis), rosa (Rosa spp.), tulipa(Tulipa spp.), narciso (Nareissus spp.), petúnias (Petuniahybrida), cravo (Dianthus earyophyllus), poinsétia(Euphorbia puleherrima), e crisântemo.

Coníferas que podem ser empregadas na prática dapresente invenção incluem, por exemplo, pinheiros tais comopinheiro "loblolly" (Pinus taeda) , pinheiro "slash" (Pinuselliotii), pinheiro "ponderosa" (Pinus ponderosa) , pinheiro"lodgepole" (Pinus eontorta), e pinheiro "Monterey" (Pinusradi ata); Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); cicutaWestern (Tsuga eanadensis); abeto Sitka (Pieea glauca);pau-brasil (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros taiscomo abeto prata (Abies amabilis) e abeto bálsamo (Abiesbalsamea); e cedros tais como cedro vermelho Western(Thuja plicata) e cedro amarelo do Alaska (Chamaecyparisnootkatensis) . Em concretizações especificas, plantas dapresente invenção são plantas cultivadas (por exemplo,milho, alfalfa, girassol, Brassical soja, algodão, cártamo,amendoim, sorgo, trigo, miheto, tabaco, etc.). Em outrasconcretizações, plantas de milho e soja são preferidas, eainda em outras concretizações plantas de milho sãopreferidas.

Outras plantas de interesse incluem plantas de grãosque provém sementes de interesse, plantas oleaginosas, eplantas leguminosas. Sementes de interesse incluem sementesde grãos, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo,centeio, etc. Plantas oleaginosas incluem algodão, soja,cártamo, girassol, Brassica, milho, alfalfa, palmeira,côco, etc. Plantas leguminosas incluem feijão e ervilha.Feijões incluem guar, feijão de alfarroba, fenacho, soja,feijão de jardim, feijão caupi, mungbean, feijão lima,feijão de fava, lentilhas, grão de bico, etc.

Um método para modular a concentração e/ou atividadedo polipeptídeo da presente invenção em uma planta éprovido. Em geral, a concentração e/ou atividade éaumentada ou diminuída em pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% com relação à plantacontrole nativa, parte da planta, ou célula que não tenha aseqüência da invenção introduzida. Modulação na presenteinvenção pode ocorrer durante e/ou subseqüente aocrescimento da planta ao estágio desejado dedesenvolvimento. Em concretizações específicas, os

polipeptídeos da presente invenção são modulados através daavaliação do nível do polipeptídeo Zm-D9 na planta, ouindiretamente, por exemplo, através da medida da atividadeZm-D9 do polipeptídeo Zm-D9 na planta por, por exemplo,determinação da altura total da planta ou da altura docaule ou tronco. Métodos para determinar a atividade Zm-D9são descritos em outro lugar aqui.

Em concretizações específicas, o polipeptídeo oumolécula de polinucleotídeo da invenção é introduzidodentro da célula vegetal. Subseqüentemente, uma célulavegetal tendo a seqüência da invenção introduzida éselecionada usando métodos conhecidos para os especialistasna área tais como, mas não limitado a, análises de Southernblot, seqüenciamento de DNA, análise de PCR, ou análisesfenotípicas. Uma planta ou parte de planta alterada oumodificada pelas concretizações precedentes é desenvolvidasob condições de formação de planta por um tempo suficientepara modular a concentração e/ou atividade dospolipeptídeos da presente invenção na planta. Condições deformação da planta são conhecidas no estado da técnica ediscutidas brevemente em outro lugar aqui.

Também é reconhecido que o nível e/ou atividade dopolipeptídeo pode ser modulado através do emprego de umamolécula de polinucleotídeo que não seja capaz de dirigir,em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ouum RNA. Por exemplo, os polinucleotídeos da invenção podemser usados para desenhar constructos de polinucleotídeo quepossam ser empregados em métodos para alterar ou mutar umaseqüência de nucleotídeo genômica em um organismo. Taisconstructos de polinucleotídeo incluem, mas não estãolimitados a, vetores RNA:DNA, vetores mutacionais RNArDNA,vetores de reparo RNA:DNA, oligonucleotídeos mistos-duplex,oligonucleotídeos auto-complementares RNArDNA, e

oligonucleobases recombinogênicas. Tais constructos denucleotídeos e métodos de uso são conhecidos no estado datécnica. Ver, patentes americana números 5,565,350;5,731,181; 5,756,325; 5,760,012; 5,795,972; e 5,871,984;todas das quais são aqui incorporadas por referência. Vertambém, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, e Beetham,et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 r 8774-8778 ;aqui incorporados por referência.

É, portanto, reconhecido que métodos da presenteinvenção não dependem da incorporação do polinucleotídeointeiro dentro do genoma, apenas que a planta ou célula damesma seja alterada como um resultado da introdução damolécula de polinucleotídeo dentro de uma célula. Em umaconcretização da invenção, o genoma pode ser alteradoseguindo a introdução da molécula de polinucleotídeo dentrode uma célula. Por exemplo, o polinucleotídeo, ou qualquerparte do mesmo, pode incorporar dentro do genoma da planta.Alterações para o genoma da presente invenção incluem, masnão estão limitadas a, adições, deleções, e substituiçõesdos nucleotídeos dentro do genoma. Enquanto os métodos dapresente invenção não dependem de adições, deleções, esubstituições de qualquer número particular denucleotídeos, é reconhecido que tais adições, deleções, ousubstituições compreendem pelo menos um nucleotídeo.

Em uma concretização, a atividade e/ou nível dopolipeptídeo Zm-D9 da invenção é aumentada. Um aumento nonível e/ou atividade do polipeptídeo Zm-D9 da invenção podeser alcançada através do provimento para planta de umpolipeptídeo Zm-D9. Como discutido em outro lugar aqui,muitos métodos são conhecidos no estado da técnica paraprover um polipeptídeo para uma planta incluindo, mas nãoestando limitado a, introdução direta do polipeptídeodentro da planta, introduzir dentro da planta(transientemente ou estavelmente) um constructo depolinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo Zm-D9. Étambém reconhecido que os métodos da invenção podemempregar uma molécula de polinucleotídeo que não seja capazde dirigir, na planta transformada, a expressão de umaproteína ou um RNA. Então, o nível e/ou atividade de umpolipeptídeo Zm-D9 pode ser aumentada através da alteraçãodo gene codificando o polipeptídeo Zm-D9 ou seu promotor.Ver, ex.: Kmiec, patente americana número 5,565,350;Zarling, et al., PCT/US93/03868. Portanto plantasmutageneizadas que carregam mutações nos genes Zm-D9, ondeas mutações aumentam a expressão do gene Zm-D9 ou aumentama atividade Zm-D9 do polipeptídeo Zm-D9 codificado sãoprovidas.

Em outras concretizações, a atividade e/ou nível dopolipeptídeo Zm-D9 da invenção é reduzida ou eliminadaatravés da introdução de um polinucleotídeo dentro de umaplanta que inibe o nível ou atividade do polipeptídeo Zm-D9da invenção. O polinucleotídeo pode inibir a expressão daZm-D9 diretamente, através da prevenção da tradução do RNAmensageiro de Zm-D9, ou indiretamente, através dacodificação de um polipeptídeo que inibe a transcrição outradução de um gene Zm-D9 codificando uma proteína Zm-D9.Métodos para inibir ou eliminar a expressão de um gene emlima planta são bem conhecidos no estado da técnica, equaisquer tais métodos podem ser usados na presenteinvenção para inibir a expressão de Zm-D9 em uma planta. Emoutras concretizações da invenção, a atividade de umpolipeptídeo Zm-D9 é reduzida ou eliminada através datransformação de uma célula vegetal com a seqüênciacodificando um polipeptídeo que inibe a atividade dopolipeptídeo Zm-D9. Em outras concretizações, a atividadede um polipeptídeo Zm-D9 pode ser reduzida ou eliminadaatravés da desregulação do gene codificando o polipeptídeoZm-D9. A invenção engloba plantas mutageneizadas quecarregam mutações nos genes Zm-D9, onde as mutações reduzema expressão do gene Zm-D9 ou inibem a atividade Zm-D9 dopolipeptídeo Zm-D9 codificado.

Redução da atividade de genes específicos (tambémconhecida como silenciamento gênico ou supressão gênica) édesejável para diversos aspectos de engenharia genética emplantas. Muitas técnicas para silenciamento gênico são bemconhecidas para um especialista na área, incluindo, mas nãoestando limitado a, tecnologia antisense (ver, ex.: Sheehy,et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8805-8809; epatentes americanas números 5,107,065; 5,453,566; e5,759,829); co-supressão (ex.: Taylor (1997) Plant Cell9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech. 8(12):340-344;Flavell (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3490-3496;Finnegan, et al., (1994) Bi o/Technology 12:883-888; eNeuhuber, et al., (1994) Mol. Gen. Genet. 244:230-241); RNAinterferente (Napoli, et al., (1990) Plant Cell 2:279-289;patente americana número 5,034,323; Sharp (1999) Genes Dev.13:139-141; Zamore, et al., (2000) Cell 101:25-33; eMontgomery, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA95:15502-15507), silenciamento gênico induzido por vírus(Burton, et al., (2000) Plant Cell 12:691-705; andBaulcombe (1999) Curr. Op. Plant Bio. 2:109-113); ribozimasespecíficas para RNA-alvo (Haseloff, et al., (1988) Nature334:585-591); estruturas em grampo (Smith, et al. , (2000)Nature 407:319-320; WO 99/53050; WO 02/00904; WO 98/53083;Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al. , (2002) Plant Physiol.129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev.Genet. 4:29-3 8; Pandolfini, et ai., BMC Biotechnology 3:7,U.S. Patent Publication Number 20030175965; Panstrugai etal., (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140; Wesley, et al.,(2001) Plant J. 27:581-590; Wang and Waterhouse (2001)Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; publicação da patenteamericana número 20030180945; e, WO 02/00904, todas asquais são aqui incorporadas por referência); ribozimas(Steinecke, et al., (1992) EMBO J. 11:1525; and Perriman,et al., (1993) Antisense Res. Dev. 3:253); modificaçãodirecionada mediada por oligonucleotideo (ex.: WO 03/076574e WO 99/25853); moléculas alvo wZinc-finger" (ex.: WO01/52620; WO 03/048345; e WO 00/42219); etiquetagem detransposon (Maes, et al., (1999) Trends Plant Sei. 4:90-96;Dharmapuri and Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner, et al. , (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat,et al., (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr.Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, et al., (2000) NucleieAeids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al., (1999) Geneties153:1919-1928; Bensen, et al., (1995) Plant Cell 7:75-84;Mena, et al., (1996) Science 274:1537-1540; e patenteamericana número 5,962,764); cada uma das quais é aquiincorporada por referência; e outros métodos ou combinaçõesdos métodos acima conhecidos para os especialistas na área.

E reconhecido que com os polinucleotídeos da invenção,construções antisense, complementares a pelo menos umaporção do RNA mensageiro (mRNA) para as seqüências Zm-D9podem ser construídas. Nucleotideos antisense sãoconstruídos para hibridizar com o mRNA correspondente.Modificações das seqüências antisense podem ser feitasenquanto que as seqüências hibridizam e interferem com aexpressão do mRNA correspondente. Desta forma, construçõesantisense tendo 70%, preferencialmente 80%, maispreferencialmente 85% de identidade de seqüência com asseqüências antisense correspondentes podem ser usadas.Ademais, porções dos nucleotídeos antisense podem serusadas para desorganizar a expressão do gene alvo.Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300, 400, 450, 500, 550 oumaiores podem ser usadas.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem tambémser usados na orientação sense para suprimir a expressãodos genes endógenos em plantas. Métodos para suprimir aexpressão gênica em plantas usando polinucleotídeos naorientação sense são conhecidos no estado da técnica. Osmétodos geralmente envolvem transformar plantas com umconstructo de DNA compreendendo um promotor que dirige aexpressão em uma planta, operacionalmente ligado a pelomenos uma porção de um polinucleotídeo que corresponde aotranscrito do gene endógeno. Tipicamente, tal seqüência denucleotídeo tem substancial identidade de seqüência com aseqüência do transcrito do gene endógeno, preferencialmentemaior do que cerca de 65% de identidade de seqüência, maispreferencialmente maior do que cerca de 85% de identidadede seqüência, mais preferencialmente maior do que cerca de95% de identidade de seqüência. Ver, patentes americanasnúmeros 5,283,184 e 5,034,323; aqui incorporadas porreferência. Então, muitos métodos podem ser usados parareduzir ou eliminar a atividade de um polipeptideo Zm-D9.Mais do que um método pode ser usado para reduzir aatividade de um simples polipeptideo Zm-D9. Em adição,combinações de métodos podem ser empregadas para reduzir oueliminar a atividade dos polipeptídeos Zm-D9.

Em algumas concretizações, a atividade de Zm-D9 éreduzida ou eliminada através da transformação de umacélula vegetal Zm-D9 com um cassete de expressão queexpresse iam polinucleotídeo que inibe a expressão de Zm-D9.O polinucleotídeo pode inibir a expressão de uma ou maisproteínas Zm-D9 diretamente, através da prevenção datradução do RNA mensageiro Zm-D9, ou indiretamente, atravésda codificação de um polipeptideo que inibe a transcriçãoou tradução de um gene de milho codificando uma proteínaZm-D9. Métodos para inibir ou eliminar a expressão de umgene em uma planta são conhecidos no estado da técnica, equalquer tal método pode ser usado na presente invençãopara inibir a expressão de uma ou mais proteínas Zm-D9.

De acordo com a presente invenção, a expressão de Zm-D9 é inibida se o nível protéico de Zm-D9 éestatisticamente mais baixo do que o nível protéico damesma Zm-D9 em uma planta que não tenha sido geneticamentemodificada ou mutageneizada para inibir a expressão daquelaproteína Zm-D9. Em concretizações particulares dainvenção, o nível protéico da proteína Zm-D9 em uma plantamodificada de acordo com a invenção é menor do que 95%,menor do que 90%, menor do que 80%, menor do que 70%, menordo que 60%, menor do que 50%, menor do que 40%, menor doque 30%, menor do que 20%, menor do que 10% ou menor do que5% do nível protéico da mesma proteína Zm-D9em uma plantaque não seja uma mutante ou que não tenha sidogeneticamente modificada para inibir a expressão daquelaproteína Zm-D9. O nível de expressão da proteína Zm-D9 podeser medido diretamente, por exemplo, através da análise donível da proteína Zm-D9 expressa em uma célula ou planta demilho, ou indiretamente, por exemplo, através da medida daatividade Zm-D9 da proteína Zm-D9 da planta ou célula demilho. Métodos para determinação da atividade Zm-D9 dasproteínas Zm-D9 são descritos em outro lugar aqui.

Em outras concretizações da invenção, a atividade deuma ou mais proteínas Zm-D9 é reduzida ou eliminada atravésda transformação de uma célula vegetal de milho com umcassete de expressão compreendendo um polinucleotídeocodificando um polipeptídeo que inibe a atividade de uma oumais proteínas Zm-D9. A atividade Zm-D9 de uma proteína Zm-D9 é inibida de acordo com a presente invenção se aatividade Zm-D9 da proteína Zm-D9 for estatisticamente maisbaixa do que a atividade Zm-D9 da mesma proteína Zm-D9 emlima planta que não tenha sido geneticamente modificada parainibir a atividade Zm-D9 daquela proteína Zm-D9. Emconcretizações particulares da invenção, a atividade Zm-D9da proteína Zm-D9 em uma planta modificada de acordo com ainvenção é menor do que 95%, menor do que 90%, menor do que80%, menor do que 70%, menor do que 60%, menor do que 50%,menor do que 40%, menor do que 30%, menor do que 20%, menordo que 10%, ou menor do que 5% da atividade Zm-D9 da mesmaproteína Zm-D9 em uma planta que não tenha sido modificadageneticamente para inibir a expressão daquela proteína Zm-D9. A atividade Zm-D9 de uma proteína Zm-D9 é "eliminada"de acordo com a invenção quando ela não for detectávelpelos métodos de análise descritos em outro lugar aqui.Métodos para determinar a atividade Zm-D9 de uma proteínaZm-D9 são descritos aqui em outro lugar.

Em outras concretizações, a atividade de uma proteínaZm-D9 pode ser reduzida ou eliminada através dadesorganização do gene codificando a proteína Zm-D9. Ainvenção engloba plantas de milho mutageneizadas quecarregam mutações nos genes Zm-D9, onde as mutações reduzema expressão do gene Zm-D9 ou inibem a atividade Zm-D9 daproteína Zm-D9 codificada.

Assim, muitos métodos podem ser usados para reduzir oueliminar a atividade de uma proteína Zm-D9. Mais do que ummétodo pode ser usado para reduzir a atividade de umasimples proteína Zm-D9. Em adição, combinações dos métodospodem ser empregadas para reduzir ou eliminar a atividadede duas ou mais proteínas Zm-D9 diferentes.Exemplos não limitantes dos métodos de redução oueliminação da expressão de uma proteína Zm-D9 são dadosabaixo.

A. Métodos baseados em polinucleotídeos:

Em algumas concretizações da presente invenção, umacélula vegetal de milho é transformada com um cassete deexpressão que é capaz de expressar um polinucleotídeo queinibe a expressão de uma proteína Zm-D9. O termo"expressão" como usado aqui refere-se à biossíntese de umproduto gênico, incluindo a transcrição e/ou tradução dodito produto gênico. Por exemplo, para o propósito dapresente invenção, um cassete de expressão capaz deexpressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de pelomenos uma proteína Zm-D9 em uma planta de milho é umcassete de expressão capaz de produzir uma molécula de RNAque inibe a transcrição e/ou tradução de pelo menos umaproteína Zm-D9 em uma planta de milho. A "expressão" ou"produção" de uma proteína ou polipeptídeo de uma moléculade DNA refere-se à transcrição e tradução da seqüênciacodificadora para produzir a proteína ou polipeptídeo,enquanto que a "expressão" ou "produção" de uma proteína oupolipeptídeo de uma molécula de RNA refere-se à tradução delima seqüência de RNA codificadora para produzir a proteínaou polipeptídeo.Exemplos de polinucleotídeos que inibem a expressão deuma proteína Zm-D9 em uma planta de milho são dados abaixo.

1. Co-supressão/supressão senseEm algumas concretizações da invenção, a inibição daexpressão da proteína Zm-D9 pode ser obtida através dasupressão sense ou co-supressão. Para co-supressão, umcassete de expressão é desenhado para expressar umamolécula de RNA correspondendo ao todo ou parte de um RNAmensageiro codificando uma proteína Zm-D9 na orientação"sense". A superexpressão da molécula de RNA pode resultarem uma expressão reduzida do gene nativo. Assim sendo,múltiplas linhagens vegetais transformadas com o cassete deexpressão co-suprimido são rastreadas para identificaraquelas que mostram maior inibição da expressão da proteínaZm-D9.

O polinucleotídeo usado para co-suprimir podecorresponder ao todo ou parte da seqüência codificadora daproteína Zm-D9, todo ou parte da região não traduzida 5'e/ou 3' de um transcrito protéico Zm-D9, ou todo ou partede ambas as seqüências codificadoras e regiões nãotraduzidas de um transcrito codificando uma proteína Zm-D9.Em algumas concretizações onde o polinucleotídeo compreendeo todo ou parte da região codificadora para proteína Zm-D9,o cassete de expressão é desenhado para eliminar o códon deiniciação do polinucleotídeo para que nenhum produtoprotéico seja transcrito.

A co-supressão pode ser usada para inibir a expressãode genes de plantas para produzir plantas tendo níveis deproteínas indetectáveis para as proteínas codificadas poresses genes. Ver, por exemplo, Broin, et al., (2002) PlantCell 14:1417-1432. A co-supressão pode também ser usadapara inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesmaplanta. Ver, por exemplo, patente americana 5,942,657.Métodos para usar co-supressão para inibir a expressão degenes endógenos em plantas são descritos em Flavell, etal., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3490-3496;Jorgensen, et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973;Johansen and Carrington (2001) Plant Physiol. 126:93 0-938;Broin, et al. , (2002) Plant Cell 14:1417-1432;Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731;Yu, et al., (2003) Phytochemistry 63:753-763; e patentesamericanas números 5,034,323, 5,283,184 e 5,942,657; cadauma das quais são aqui incorporadas por referência. Aeficiência da co-supressão pode ser aumentada através dainclusão de uma região poli-dT no cassete de expressão naposição 3' para seqüência sense e 51 do sinal depoliadenilação. Ver, publicação da patente americana número20020048814, aqui incorporada por referência. Tipicamente,tal seqüência de nucleotídeo tem substancial identidade deseqüência com o transcrito do gene endógeno,preferencialmente maior do que cerca de 65% de identidadede seqüência, mais preferencialmente maior do que cerca de85% de identidade de seqüência, mais preferencialmentemaior do que cerca de 95% de identidade de seqüência. Ver,patentes americanas números 5,283,184 e 5,034,323; aquiincorporadas por referência.

2. Supressão antisense

Em algumas concretizações da invenção, a inibição daexpressão da proteína Zm-D9 pode ser obtida através dasupressão antisense. Para supressão antisense, o cassete deexpressão é desenhado para expressar uma molécula de RNAcomplementar ao todo ou parte de um RNA mensageirocodificando a proteína Zm-D9. Superexpressão da molécula deRNA antisense pode resultar na expressão reduzida do genenativo. Assim sendo, múltiplas linhagens vegetais

transformadas com o cassete de expressão de supressãoantisense são rastreadas para identificar aquelas quemostram a maior inibição da expressão da proteína Zm-D9.

O polinucleotídeo para uso na supressão antisense podecorresponder ao todo ou parte do complemento da seqüênciacodificando a proteína Zm-D9, o todo ou parte docomplemento da região não traduzida 51 e/ou 31 dotranscrito protéico Zm-D9, ou o todo ou parte docomplemento de ambas as seqüências codificadoras e asregiões não traduzidas de um transcrito codificando aproteína Zm-D9. Em adição, o polinucleotídeo antisense podeser totalmente complementar (i.e., 100% idêntico aocomplemento da seqüência alvo) ou parcialmente complementar(i.e., menos do que 100% idêntico ao complemento daseqüência alvo) à seqüência alvo. A supressão antisensepode ser usada para inibir a expressão de múltiplasproteínas na mesma planta. Ver, por exemplo, patenteamericana número 5,942,657. Além disso, porções dosnucleotídeos antisense podem ser usadas para desregular aexpressão do gene alvo. Geralmente, seqüências de pelomenos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos,300, 400, 450, 500, 550 ou maiores podem ser usadas.Métodos para usar supressão antisense para inibir aexpressão dos genes endógenos em plantas são descritos, porexemplo, em Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e patentes americanas números 5,759,829 e 5,942,657,cada uma das quais é aqui incorporada por referência.Eficiência da supressão antisense pode ser aumentadaatravés da inclusão de uma região poli-dT no cassete deexpressão na posição 3' da seqüência antisense e 5' dosinal de poliadenilação. Ver, publicação de patente número20020048814, aqui incorporada por referência.

3. Dupla cadeia de RNA interferente

Em algumas concretizações da invenção, a inibição daexpressão de uma proteína Zm-D9 pode ser obtida pelo RNA decadeia dupla interferente (dsRNA). Para dsRNAinterferente, uma molécula RNA sense como aquela descritaacima para co-supressão e uma molécula RNA antisense queseja totalmente ou parcialmente complementar à molécula deRNA sense são expressas na mesma célula, resultando nainibição da expressão do RNA mensageiro endógenocorrespondente.

A expressão das moléculas sense e antisense pode seracompanhada pela concepção do cassete de expressão paracompreender ambas as seqüências sense e antisense.Alternativamente, cassetes de expressão separados podem serusados para as seqüências sense e antisense. Múltiplaslinhagens de plantas transformadas com o cassete deexpressão interferente dsRNA ou cassetes de expressão sãoentão rastreadas para identificar linhagens de plantas quemostram a maior inibição da expressão da proteína Zm-D9.Métodos para usar o dsRNA interferente para inibir aexpressão dos genes endógenos de planta são descritos emWaterhouse, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA95:13959-13964, Liu, et al., (2002) Plant Physiol.129:1732-1743, e WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, eWO 00/49035; cada um dos quais são aqui incorporados porreferência.

4. Greuopo de RNA interferente e grampo contendo íntron deRNA interferente

Em algumas concretizações da invenção, a inibição daexpressão da proteína Zm-D9 pode ser obtida através dogrampo de RNA interferente (hpRNA) ou grampo de RNAinterferente contendo íntron (ihpRNA). Esses métodos sãoaltamente eficientes na inibição da expressão de genesendógenos. Ver, Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev.Genet. 4:29-38 e referências citadas aqui.

Para hpRNA interferente, o cassete de expressão éconstruído para expressar uma molécula de RNA que hibridizecom ela mesma para formar uma estrutura em grampo quecompreende uma região de volta de cadeia simples e umahaste de bases pareadas. A região da haste de basespareadas compreende uma seqüência sense correspondendo aotodo ou parte do RNA mensageiro endógeno codificando o genecuja expressão é para ser inibida, e uma seqüênciaantisense que é totalmente ou parcialmente complementar àseqüência sense. Então, a região de haste de bases pareadasda molécula geralmente determina a especificidade do RNAinterferente. Moléculas hpRNA são altamente eficientes nainibição da expressão de genes endógenos, e o RNAinterferente que eles induzem são herdados pelas geraçõessubseqüentes de plantas. Ver, por exemplo, Chuang andMeyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4985-4990;Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731;e Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38.Métodos para usar hpRNA interferente para inibir ousilenciar a expressão de genes são descritos , por exemplo,em Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol.129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev.Genet. 4:29-38; Pandolfini, et al., BMC Biotechnology 3:7,e na publicação de patente americana número 2003 0175965;cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Umensaio transiente para a eficiência dos constructos hpRNApara silenciar a expressão gênica in vivo tem sido descritopor Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140,aqui incorporado por referência.

Para ihpRNA, as moléculas interferentes têm a mesmaestrutura geral que a hpRNA, mas a molécula de RNAadicionalmente compreende um íntron que é capaz de serencaixado na célula onde a ihpRNA é expressa. O uso de umíntron minimiza o tamanho da volta na molécula do grampo deRNA seguindo a união, e isso aumenta a eficiência dainterferência. Ver, por exemplo, Smith, et al., (2000)Nature 407:319-320. Na verdade, Smith, et al., apresenta100% de supressão da expressão do gene endógeno usandointerferência mediada por ihpRNA. Métodos para usar ihpRNAinterferente para inibir a expressão dos genes endógenos deplantas são descritos, por exemplo, em Smith, et al.,(2000) Nature 407:319-320; Wesley, et al., (2001) Plant J.27:581-590; Wang and Waterhouse (2001) Curr. Opin. PlantBiol. 5:146-150; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev.Genet. 4:29-38; Helliwell and Waterhouse (2003) Methods30:289-295, e publicação de patente americana número20030180945, cada uma das quais é aqui incorporada porreferência.O cassete de expressão para hpRNA interferente podetambém ser construído de tal modo que a seqüência sense e aseqüência antisense não correspondem ao RNA endógeno. Nestaconcretização, as seqüências sense e antisense flanqueiamuma seqüência da volta que compreende uma seqüência denucleotídeo correspondendo ao todo ou parte do RNAmensageiro endógeno do gene alvo. Logo, esta é a região davolta que determina a especificidade do RNA interferente.Ver, por exemplo, WO 02/00904, aqui incorporada porreferência.

Silenciamento gênico transcricional (TGS) pode serrealizado através do uso dos constructos de hpRNA onde arepetição invertida do grampo compartilha identidade deseqüência com a região promotora de um gene a sersilenciado. Processamento do hpRNA em pequenos RNAs quepodem interagir com a região promotora homóloga podedesencadear a degradação ou metilação para resultar nosilenciamento (Aufsatz, et al., (2002) PNAS 99(4):16499-16506; Mette, et al., (2000) EMBOJ 19 (19):5194-5201).

5. Interferência mediada por axnplicon

Cassetes de expressão de amplicon compreendem umaseqüência derivada de vírus de planta que contém o todo ouparte do gene alvo mas geralmente não de todos os genes dosvírus nativos. As seqüências virais presentes no produto detranscrição do cassete de expressão permitem ao produto detranscrição dirigir sua própria replicação. Os transcritosproduzidos pelo amplicon podem ser sense ou antisense comrelação à seqüência alvo (i.e., o RNA mensageiro RNA para aproteína Zm-D9). Métodos de usar amplicons para inibir aexpressão dos genes endógenos de plantas são descritos, porexemplo, em Angell and Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angell and Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362, e napatente americana número 6,646,805, cada uma das quais éaqui incorporada por referência.

6. Ribozimas

Em algumas concretizações, o polinucleotídeo expressopelo cassete de expressão da invenção é um RNA catalíticoou tem uma atividade ribozima específica para o RNAmensageiro da proteína Zm-D9. Então, o polinucleotídeocausa a degradação do RNA mensageiro endógeno, resultandona expressão reduzida da proteína Zm-D9. Este método édescrito, por exemplo, na patente americana número4,987,071, aqui incorporada por referência.

7. Pequeno RNA interferente ou micro RMA

Em algumas concretizações da invenção, a inibição daexpressão da proteína Zm-D9 pode ser obtida através do RNAinterferente pela expressão de um gene codificando um microRNA (miRNA). miRNAs são agentes regulatórios consistindode cerca de 22 ribonucleotídeos. miRNA são altamenteeficientes na inibição da expressão dos genes endógenos.Ver, por exemplo, Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263, aqui incorporado por referência.

Para o miRNA interferente, o cassete de expressão éconstruído para expressar uma molécula de RNA que émodelada em um gene de miRNA endógeno. O gene de miRNAcodifica um RNA que forma uma estrutura em grampo contendouma seqüência de 22 nucleotídeos que é complementar a outrogene endógeno (seqüência alvo). Para supressão da expressãoda proteína Zm-D9, a seqüência de 22 nucleotídeos éselecionada da seqüência do transcrito da proteína Zm-D9 econtém 22 nucleotídeos da dita seqüência da proteína Zm-D9na orientação sense e 21 nucleotídeos de uma seqüênciaantisense correspondente que seja complementar à seqüênciasense. Moléculas miRNA são altamente eficientes nainibição da expressão dos genes endógenos, e o RNAinterferente que elas induzem é herdado pelas geraçõessubseqüentes das plantas.

B. Inibição da expressão gênica baseada em polipeptideo

Em uma concretização, o polinucleotídeo codifica umaproteína zinc finger que se liga a um gene codificando umaproteína Zm-D9 em uma planta ou célula de milho, resultandona expressão reduzida do gene. Em concretizaçõesparticulares, a proteína zinc finger se liga a uma regiãoregulatória de um gene da proteína Zm-D9. Em outrasconcretizações, a proteína zinc finger se liga a vim RNAmensageiro codificando uma proteína Zm-D9 e previne suatradução. Métodos de seleção dos sítios para direcionar aproteínas zinc finger têm sido descritos, por exemplo, napatente americana número 6,453,242, e métodos para usar asproteínas zinc finger para inibir a expressão dos genes emplantas são descritos, por exemplo, na publicação depatente número 20030037355; cada um das quais é aquiincorporada por referência.

C. Inibição da atividade da proteína, baseada empolipept xdeo

Em algumas concretizações da invenção, opolinucleotídeo codifica um anticorpo que se liga a pelomenos uma proteína Zm-D9, e reduz a atividade Zm-D9 daproteína Zm-D9. Em outra concretização, a ligação doanticorpo resulta no aumento rotativo do complexo deproteína anticorpo-Zm-D9 através de mecanismos de controleda qualidade celular. A expressão de anticorpos nas célulasvegetais e a inibição de percursos moleculares através daexpressão e ligação de anticorpos à proteínas nas célulasvegetais são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, porexemplo, Conrad and Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporados aqui por referência.

D. Ruptura de gene:Em algumas concretizações da presente invenção, aatividade de uma proteína Zm-D9 é reduzida ou eliminadaatravés da desregulação de um gene codificando a proteínaZm-D9. O gene codificando a proteína Zm-D9 pode ser rompidopor qualquer método conhecido no estado da técnica. Porexemplo, em uma concretização, o gene é rompido pelaetiquetagem de transposon. Em outra concretização, o geneé rompido pelas plantas de milho mutageneizadas usandomutagênese ao acaso ou direcionada, e selecionando aplantas que tenham atividade da proteína Zm-D9 alterada oureduzida.

1. Etiquetagem de transposon

Em uma concretização da invenção, a etiquetagem detransposon (transposon tagging) é usada para reduzir oueliminar a atividade Zm-D9 da proteína Zm-D9. Etiquetagemde transposon compreende inserir um transposon dentro de umgene Zm-D9 endógeno para reduzir ou eliminar a expressão daproteína Zm-D9. O termo "gene Zm-D9" significa o gene quecodifica uma proteína Zm-D9 de acordo com a invenção.

Nesta concretização, a expressão da proteína Zm-D9 éreduzida ou eliminada pela inserção de um transposon dentrode uma região regulatória ou região codificadora do genecodificando a proteína Zm-D9. Um transposon que está dentrode um éxon, íntron, seqüência não traduzida 5' ou 3' , umpromotor, ou qualquer outra seqüência regulatória de umgene Zm-D9 pode ser usado para reduzir ou eliminar aexpressão e/ou atividade da proteína Zm-D9 codificada.

Métodos para a etiquetagem de transposon de genesespecíficos em plantas são bem conhecidos no estado datécnica. Ver, por exemplo, Maes, et al., (1999) TrendsPlant Sei. 4:90-96; Dharmapuri and Sonti (1999) FEMSMicrobiol. Lett. 179:53-59; Meissner, et al., (2000) PlantJ. 22:265-274; Phogat, et al. , (2000) J. Biosci. 25:57-63;Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, etal., (2000) Nucleic Aeids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, etal., (1999) Geneties 153:1919-1928). Em adição, o processoTUSC para selecionar inserções Mu nos genes selecionadostem sido descrito em Bensen, et al., (1995) Plant Cell7:75-84; Mena, et al. , (1996) Science 274:1537-1540; e napatente americana número 5,962,764; cada um dos quais éaqui incorporado por referência.

2. Plantas mutantes com atividade reduzida

Métodos adicionais para diminuir ou eliminar aexpressão dos genes endógenos em plantas são tambémconhecidos no estado da técnica e podem ser similarmenteaplicados para a presente invenção. Esses métodos incluemoutras formas de mutagênese, tais como mutagênese induzidapor etil metanosulfonato, mutagênese de deleção, emutagênese de deleção de neutron rápida usada em umagenética de sentido reverso (com PCR) para identificarlinhagens vegetais onde o gene endógeno tenha sidodeletado. Para exemplos desses métodos ver, Ohshima, etal., (1998) Virology 243:472-481; Okubara, et al., (1994)Genetics 137:867-874; e Quesada, et al., (2000) Genetics154:421-436; cada um dos quais é aqui incorporado porreferência. Em adição, um método automático e rápido pararastrear as mutações induzidas quimicamente, TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes), usando HPLCdenaturante ou digestão de endonuclease seletiva dosprodutos de PCR selecionados é também aplicável na presenteinvenção. Ver, McCallum, et al., (2000) Nat. Biotechnol.18:455-457, aqui incorporada por referência.

Mutações que impactam expressão gênica ou queinterferem com a função (atividade Zm-D9) da proteínacodificada são bem conhecidas no estado da técnica.Mutações insercionais nos éxons dos genes usualmenteresultam em mutantes nulos. Mutações em resíduosconservados são particularmente efetivos na inibição daatividade Zm-D9 da proteína codificada. Resíduosconservados das proteínas de plantas DELLA adequados paramutagênese com o objetivo de eliminar ou reprimir aatividade de sinalização de giberelina têm sido descritos.Ver, por exemplo, Itoh, H., M. Ueguchi-Tanaka, et al.,(2002) Plant Cell 14:57-70. Tais mutantes podem serisolados de acordo com procedimentos bem conhecidos, emutações em diferentes Ioci Zm-D9 podem ser empilhadasatravés de cruzamento genético. Ver, por exemplo, Gruis, etal., (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

Em outra concretização desta invenção, mutantesdominantes podem ser usados para desencadear osilenciamento de RNA devido à inversão gênica erecombinação gênica de um locus gênico duplicado. Ver, porexemplo, Kusaba, et al., (2003) Plant Cell 15:1455-1467.

A invenção engloba métodos adicionais para reduzir oueliminar a atividade de uma proteína Zm-D9. Exemplos deoutros métodos para alterar ou mutar uma seqüência denucleotídeo genômica em uma planta são conhecidos no estadoda técnica, mas não estão limitados ao uso de vetoresRNA:DNA, vetores mutacionais RNA:DNA, vetores de reparoRNA:DNA, oligonucleotídeos misto-duplex, oligonucleotídeosauto-complementares RNA:DNA, e oligonucleobases

recombinogênicas. Tais vetores e métodos de uso sãoconhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, patentesamericanas números 5,565,350; 5,731,181; 5,756,325;5,760,012; 5,795,972; e 5,871,984; cada uma das quais éaqui incorporada aqui por referência. Ver também, WO98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, e Beetham, et al.,(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8774-8778; cada umadas quais é aqui incorporada aqui por referência.

Em certas concretizações, as moléculas depolinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhadascom qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeosde interesse com a finalidade de criar plantas com umacaracterística desejada. Uma característica, como usadoaqui, se refere a um fenótipo derivado de uma seqüência ougrupos de seqüências particulares. Por exemplo, asmoléculas de polinucleotídeos da presente invenção podemser empilhadas com quaisquer outras moléculas depolinucleotídeos codificando polipeptídeos tendo atividadepesticida e/ou inseticida, tais como outras proteínastóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas nas patentesamericanas números 5,3 66,892? 5,747,450; 5,737,514;5,723,756; 5,593,881; e Geiser, et al., (1986) Gene48:109), lectinas (Van Damme, et al., (1994) Plant Mol.Biol. 24:825, pectina (descrita na patente americana número5,981,722), e semelhantes. As combinações geradas podemtambém incluir múltiplas cópias de qualquer uma dasmoléculas de polinucleotídeos de interesse. As moléculas depolinucleotídeos da presente invenção podem também serempilhadas com qualquer outro gene ou combinação dos genespara produzir plantas com uma variedade de combinações decaracterísticas incluindo mas não estando limitado a,características desejáveis para alimentação animal taiscomo genes ligados ao alto teor de óleo (ex. : patenteamericana número 6,232,529); aminoácidos balanceados (ex.:hordotioninas (patentes americanas números 5,990,389;5,885,801; 5,885,802; e 5,703,409); cevada com alto teor delisina (Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122) e proteínas com alto teor de metionina(Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6279;Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359; e Musumura, et al.,(1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada(ex. : proteínas de armazenamento modificadas (pedido depatente americano número 10/053,410, depositado em 7 denovembro de 2001) ; e tioredoxinas (pedido de patenteamericano número 10/005,429, depositado em 3 de dezembro de2001)); as revelações das quais são incorporadas aqui porreferência.

As moléculas de polinucleotídeo da presente invençãotambém podem ser agrupadas com relação a característicasdesejáveis para resistência a herbicida ou doenças (ex. :genes de detoxificação da fumonisina (patente americananúmero 5,792,931); genes de resistência a doença eavirulência (Jones, et al. , (1994) Science 266:789; Martin,et al., (1993) Science 262:1432; Mindrinos, et al., (1994)Cell 78:1089); mutantes acetolactato sintase (ALS) quelevam à resistência a herbicida tal como mutações S4 e/ouHra; inibidores de glutamina sintase tais comofosfinotricina ou basta (ex.: gene bar); e resistência aglifosato (gene EPSPS)); e características desejáveis parao processamento ou produtos processados tas como alto teorde óleo (ex.: patente americana número 6,232,529); óleosmodificados (pex, genes da desaturase de ácidos graxos(patente americana número 5,952,544; WO 94/11516)); amidosmodificados (ex.: ADPG pirofosforilases (AGPase), amidosintases (SS), enzima amido ramificadoras (SBE), e enzimasde desramificação de amido (SDBE)); e polímeros oubioplásticos (ex. : patente americana número 5.602,321;beta-ketothiolase, polihidroxibutirato sintase, eacetoacetil-CoA redutase (Schubert, et al., (1988) J.Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão daspolihidroxialkanoatos (PHAs)); as revelações das quais sãoaqui incorporadas por referência. Alguém pode tambémcombinar moléculas de polinucleotídeo da presente invençãocom moléculas de polinucleotídeo provendo característicasagronômicas tais como macho esterilidade (ex.: ver, patenteAmericana número 5,583,210), força do caule (ver, patenteamericana número 6,803,498) tempo de florescimento (ver,patente americana número 6,573,430), ou características detecnologia de transformação tais como regulação do ciclocelular ou direcionamento gênico (ex.: WO 99/61619, WO00/17364, e WO 99/25821); as revelações das quais são aquiincorporadas por referência.

Essas combinações agrupadas podem ser criadas porqualquer método incluindo, mas não estando limitado a,plantas de melhoramento cruzado por qualquer metodologiaconvencional ou TopCross, ou transformação genética. Se asseqüências são empilhadas por transformação genética dasplantas, as seqüências de polinucleotídeos de interessepodem ser combinadas a qualquer tempo e em qualquer ordem.Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo uma oumais característica desejada pode ser usada como alvo paraintroduzir características adicionais através detransformação subseqüente. As características podem serintroduzidas simultaneamente em um protocolo de co-transformação com as moléculas de polinucleotídeo deinteresse providas por qualquer combinação dos cassetes detransformação. Por exemplo, se duas seqüências serãointroduzidas, as duas seqüências podem estar contidas emcassetes de transformação separados (trans) ou contidas nomesmo cassete de transformação (eis). Expressão dasseqüências pode ser dirigida pelo mesmo promoter ou porpromotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejávelintroduzir um cassete de transformação que suprimirá aexpressão do polinucleotídeo de interesse. Ele pode sercombinado com qualquer combinação de outros cassetes desupressão ou cassetes de superexpressão para gerar acombinação de características desejáveis na planta. É aindareconhecido que seqüências de polinucleotídeos podem serempilhadas em uma localização genômica desejada usando umsistema de recombinação sítio-específico. Ver, por exemplo,W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, eW099/25853, todas as quais são aqui incorporadas porreferência.

Várias mudanças no fenótipo são de interesse incluindomodificação a composição de ácido graxo em uma planta,alteração do conteúdo de aminoácido de uma planta,alteração de um mecanismo de defesa contra patógeno deplanta, e semelhantes. Esses resultados podem seralcançados através do fornecimento da expressão de produtosheterólogos ou expressão aumentada dos produtos endógenosem plantas. Alternativamente, os resultados podem seralcançados através do fornecimento da redução da expressãode um ou mais produtos endógeno, particularmente enzimas ouco-fatores na planta. Essas mudanças resultam em umamudança no fenótipo da planta transformada.

Genes de interesse são reflexos do mercado comercial einteresse daqueles envolvidos no desenvolvimento dacultivar. Cultivares e mercados de interesse mudam, e comonações em desenvolvimento se abrem para mercados mundiais,novas cultivares e tecnologias irão emergir também. Emadição, como nosso entendimento de característicasagronômicas e características tais como aumento daprodutividade e heterose, a escolha de genes paratransformação irá modificar conseqüentemente. Categoriasgerais de genes de interesse incluem, por exemplo, aquelesgenes envolvidos em informação, tais como zinc fingers,aqueles envolvidos em comunicação, tais como quinases, eaqueles envolvidos na administração interna, tais comoproteínas de choque térmico. Categorias mais específicas detransgenes, por exemplo, incluem genes codificandoimportantes características agronômicas, resistência ainsetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas,esterilidade, características do grão, e produtoscomerciais. Genes de interesse incluem, geralmente, aquelesenvolvidos no metabolismo de óleo, amido, carboidrato, ounutrientes bem como aqueles afetando tamanho do milho,carga de sacarose, e semelhantes.Características importantes agronomicamente tais comoconteúdo de óleo, amido e protéico podem ser geneticamentealteradas em adição ao uso de métodos de melhoramentotradicionais. Modificações incluem aumento do conteúdo deácido oléico, óleos saturados e insaturados, aumento dosníveis de lisina e enxofre, fornecendo aminoácidosessenciais, e também modificação de amido. Modificações daproteína hordotionina são descritas nas patentes americanasnúmeros 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802 e 5,990,389, aquiincorporadas por referência. Outro exemplo é proteína dasemente rica em lisina e/ou enxofre codificada pelaalbumina 2S de soja descrita na patente americana número5,850,016, e o inibidor quimotripsina de cevada, descritoem Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106,as revelações das quais são aqui incorporadas porreferência.

Derivados das seqüências codificadoras podem serfeitos através de mutagênese sítio dirigida para aumentar onível de aminoácidos pré-selecionados no polipeptídeocodificado. Por exemplo, o gene codificando o polipeptídeode cevada com alto teor de lisina (BHL) é derivado doinibidor quimotripsina de cevada, pedido de patenteamericano número 08/740,682, depositado em 01 de novembrode 1996, e WO 98/20133, as revelações das quais são aquiincorporadas por referência. Outras proteínas incluemproteínas ricas em metionina tais como da semente degirassol (Lilley, et al., (1989) Proceedings of the WorldCongress on Vegetable Protein Utilization in Human Foodsand Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American OilChemists Society, Champaign, Illinois), pp. 497-502; aquiincorporada por referência); milho (Pedersen, et al.,(1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al. , (1988)Gene 71:359; ambas as quais são aqui incorporadas porreferência) ;e arroz (Musumura, et al., (1989) Plant Mol.Biol. 12:123, aqui incorporada por referência). Outrosgenes importantes agronomicamente codificam látex, Floury2, fatores de crescimento, fatores de armazenamento desemente, e fatores de transcrição.

Genes de resistência a insetos podem codificarresistência a pragas que tenham maior rendimento de arrastetais como verme da raiz, "cutworm", broca européia domilho, e semelhantes. Tais genes incluem, por exemplo,genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis(patentes americanas números 5,3 66,892; 5,747,450;5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; e Geiser, et al. , (1986)Gene 48:109); e semelhantes.

Genes codificando características de resistência adoenças incluem genes de detoxificação, tais como contrafumonosina (patente americana número 5,792,931); genes deavirulência (avr) e de resistência a doenças (R) (Jones, etal., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science262:1432; and Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089); esemelhantes.

Características de resistência a herbicida podemincluir genes codificando para resistência a herbicidas queagem para inibir a ação da acetolactato sintase (ALS) , emparticular os herbicidas do tipo sulfonilurea (ex.: o geneda acetolactato sintase (ALS) contendo mutações levando atal resistência, em particular as mutações S4 e/ou Hra) ,genes codificando para resistência a herbicidas que agempara inibir ação da glutamina sintase, tais comofosfinotricina ou basta (pex, o gene bar); glifosato (ex.:ogene da EPSPS e o gene GAT; ver por exemplo, publicação dpatente americana número 20040082770 e WO 03/092360); ououtros tais genes conhecidos no estado da técnica. O genebar codifica resistência ao herbicida basta, o gene nptllcodifica resistência aos antibióticos canamicina egeneticina, e mutantes do gene ALS codificando resistênciaao herbicida clorsulfuron.

Genes de esterilidade podem também ser codificados emum cassete de expressão e fornecem uma alternativa pararetirar o pendão fisicamente. Exemplos de genes usados detal forma incluem genes específicos de tecidos masculinos egenes com fenótipo de macho esterilidade tais como QM,descritos na patente americana número 5,583,210. Outrosgenes incluem quinases e aqueles codificando compostostóxicos para desenvolvimento gametofítico feminino oumasculino.A qualidade do grão é refletida em característicastais como níveis e tipos de óleos, saturados e insaturados,qualidade dos aminoácidos essenciais, e níveis de celulose.

Em milho, proteínas hordotioninas modificadas são descritasnas patentes americanas números 5,703,049, 5,885,801,5,885,802 e 5,990,389.

Características comerciais podem também sercodificadas em um ou gene ou genes que possam aumentar, porexemplo, amido para produção de etanol, ou prover expressãode proteínas. Outro importante uso comercial de plantastransformadas é a produção de polímeros e bioplásticos taiscomo descritos na patente americana 5,602,321. Genes taiscomo β-Ketothiolase, PHBase (polhidroxiburirato sintase), eacetoacetil-CoA redutase (ver, Schubert, et al., (1988) J.Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão depolihiroxialkanoatos (PHAs).

Produtos exógenos incluem enzimas e produtos vegetais,bem como aqueles de outras origens incluindo procariotos eoutros eucariotos. Tais produtos incluem enzimas,cofatores, hormônios, e semelhantes. O nível de proteínas,particularmente proteínas modificadas tendo a distribuiçãode aminoácidos melhorada para melhorar o valor nutricionalda planta, pode ser aumentado. Isso é alcançado pelaexpressão de tais proteínas tendo conteúdo de aminoácido melhorado.Um "material vegetal ou célula vegetal" é algo onde aalteração genética, tal como transformação, tenha sidoefetuada com um gene de interesse, ou é uma planta oucélula vegetal que é descendente de uma planta ou célulaentão alterada e que compreende a alteração. Um "controle"ou "planta controle" ou "célula vegetal controle" faz umponto de referência para medir mudanças no fenótipo damatéria ou célula vegetal.

Uma planta ou célula vegetal controle podecompreender, por exemplo, (a) uma planta ou célula tiposelvagem, i.e., do mesmo genótipo que o material inicialpara a alteração genética que resultou na material oucélula vegetal; (b) uma planta ou célula vegetal do mesmogenótipo que o material inicial mas que tenha sidotransformado com um constructo nulo (i.e. com um constructoque não tenha efeito conhecido na característica deinteresse, tal como um constructo compreendendo um genemarcador); (c) uma planta ou célula vegetal que é umasegregante não transformada entre a progênie de uma matériaou célula vegetal; (d) uma planta ou célula vegetalgeneticamente idêntica à matéria ou célula vegetal mas quenão é exposta a condições ou estímulos que poderiam induzira expressão do gene de interesse; ou (e) a matéria oucélula vegetal por ela mesma, sob condições nas quais ogene de interesse não é expresso.

Os exemplos seguintes são oferecidos a título deilustração e não como forma de limitação.

EXEMPLO 1

Isolamento do gene D9 de milho

Milho codifica duas proteínas DELLA (dwarf plant8, D8e dwarf plant9, D9) das quais vários domínios mutantes têmsido isolados (Winkler and Freeling (1994) Planta 193:341-348). Embora, Zm-D9 tenha sido descrita geneticamente(Winkler and Freeling (1994) Planta 193:341-348), o genenão tem sido previamente caracterizado em nível molecular.Dois alelos Zm-D9 têm sido isolados e analisados no cursodeste trabalho. O alelo tipo selvagem Zm-D9 foi isoladoatravés de RT PCR do RNA da linhagem de milho B73. O alelomutante Zm-D9 MUTl foi isolado por PCR do DNA genômicoisolado de plântulas de uma linhagem GA não responsivadesignada D9xB73 (Anexo 1) . Zm-D9 MUTl foi predito paraperder íntrons, tal como outros genes DELLA reportados.Para assegurar que a seqüência codificadora correta foiobtida de Zm-D9 MUTl, o cDNA foi verificado através de RT-PCR.

Zm-D8 está localizado em BIN 1.09, enquanto que Zm-D9está localizado em uma região preservada do cromossomo 5,BIN 5.00 (Helentjaris, et al., (1988) Genetics 118:353-363;Winkler and Freeling (1994) Planta 193:341-348; Lawrence,et al., (2005) Plant Physiol. 138:55-58). Para verificarque os alelos isolados são formas de Zm-D9, múltiplosprojetos foram iniciados incluindo rastreamento debiblioteca BAC e recapitulação de fenótipo através detransgênicos. Zm-D9 foi mapeado com B73 BAC bacb.pk425.i4que não poderia estar ligado a mapas genéticos ou físicos,embora ele estivesse ligado a marcadores encontrados emambos os cromossomos. Para mostrar que o putativo Zm-D9 foidiferente de Zm-D8 e para determinar sua localizaçãocromossômica, análises de PCR das linhagens adicionais deaveia forem realizadas (Anexo 2; Ananiev, et al., (1997)Proc. Natl. Sei. USA 94:3524-3529) e confirmadas através doseqüenciamento dos produtos da reação. Essa análiseconfirmou a localização do putativo Zm-D9 no cromossomo 5,diferente do lócus Zm-D8 no cromossomo 1.

A localização subcelular das duas proteínas DELLA demilho foi determinada através de fusões de proteínasfluorescentes (Anexo 3). A putativa localização Zm-D9 foisimilar aquela de Zm-D8 e está consistente com alocalização no núcleo. Localização nuclear tem sidodocumentada por numerosas proteínas DELLA em outrossistemas vegetais (Silverstone, et al., (2001) Plant Cell10:155-169; Ogawa, et al., (2000) Gene 245:21-29; Fleck andHarberd (2002) Plant J. 32:935-947; Gubler, et al., (2002)Plant Physiol. 129:191-200; Wen and Chang (2002) Plant Cell14:87-100). Partículas de tungstênio cobertas com oMultisite Gateway (Invitrogen, USA) adaptado dosconstructos intermediários da Japan Tobacco (Hiei, et al.,1994; Ishida, et al. , 1996): PHP23800, attB4:UBIPRO:attBl:ZM-D8:attB2:AC-GFPl:NOS TERM:attB3 ou PHP253 55,attB4:UBI PRO:attBl:ZM-D9:attB2:AcGFPl:NOS TERM:attB3 foramempregados. Três dias depois da germinação (DAG) no escuroem RT, HGll plântulas etioladas foram bombardeadas compartículas com os constructos acima usando um sistema deliberação de partículas Biolistic PDS-1000/He (BioRad, USA)e discos de ruptura de 650 psi. Em 6 DAG, o bombardeado,plântulas etioladas foram visualizadas com um microscópioconfocal em disco de fiação CARV (Fryer Company, USA).

Plantas de Arabidopsis T2 carregando cDNAs DELLA demilho dirigidos pelo promotor MS-S2a de alfafa específicode esclerênquima vascular têm sido produzidas. Os efeitosde nanismo (do mais severo ao menos severo) aparecem comosegue Zm-D8 MUT > Zm-D8 MPL > Zm-D9 MUTl > Zm-D8 = Zm-D9(ver Anexo 4) . Adicionalmente, os transgênicos parecem termorfologia floral alterada como visualizada no Anexo 5. NoZm-D8 MUT, Zm-D8 MPLi Zm-D9 e Zm-D9 MUTl os filamentosparecem ser preferencialmente encurtados de tal modo que asanteras são mais curtas do que o estigma. Os transgênicosZm-D8 MUT parecem mais grandemente afetados e ostransgênicos Zm-D9 e Zm-D8 MPL menos afetados. Osfilamentos de GUSf e transgênicos Zm-D8 pareceminalterados. A linhagem transgênica particular Zm-D8 MUTmostrada também é macho estéril, pois não é fornecedora depólen.

Os resultados revelados nos Anexos 2-5 demonstramconclusivamente que os putativos alelos Zm-D9 que foramisolados são alelos genuínos de Zm-D9. O isolado, tiposelvagem Zm-D9 é codificado no cromossomo 5 de milho, comotem sido previamente determinado por Zm-D9 (Winkler andFreeling, 1994). Quando a proteína codificada por Zm-D9 étraducionalmente fusionada com uma proteína marcadorafluorescente ela é encontrada em uma localização subcelularconsistente com o núcleo, como estão outras proteínasDELLA. Mais significantemente, transgênicos de Arabidopsiscarregando o alelo Zm-D9 MUTl são nanicos enquanto queaqueles carregando o tipo selvagem Zm-D9 são de estaturanormal. Esses resultados demonstram que o alelo da proteínamutante DELLA isolado de plântulas de milho anãs mutantesD9 é realmente responsável pelo nanismo de milho,verificando a identidade deste gene com Zm-D9.

Os efeitos na arquitetura da raiz da expressão dasproteínas DELLA de milho foi também estudado nas plantas T2de Arabidopsis. Todas as plantas foram crescidas sob umcomprimento de dia de 18 h em um sistema de iluminação decarro ArabiSun em vertical, placas de Petri quadradas. 0comprimento médio da raiz e a media do número de ápicesradiculares por planta foram determinados em dez dias apósa germinação e os resultados estão sumarizados na Tabela 1.Plantas carregando os constructos Zm-D8 MPL, Zm-D8 MUT, eMUTl Zm-D9 tiveram uma media de comprimento de raiz maissignificantemente mais curto e ápices radicularessignificantemente menores por planta do que as plantascontrole (GUS) . Então, o gene Zm-D9, como o gene Zm-D8,está envolvido no controle da arquitetura da raiz,particularmente comprimento da raiz e ramificação da raiz(como evidenciado pelo número médio de ápices radicularespor planta).

Tabela 1. Os efeitos da expressão das proteínas DELLA demilho na arquitetura da raiz das plantas transgênicas (T2)de Arabidopsis no estágio de crescimento principal 1.03(Boyes, et al., (2001) Plant Cell 13:1499-1510).

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Letras sobrescritas indicam grupos que não sãosignificativamente diferentes de um outro através deanálise LSD, em um nível de confiança a 95%. Dados foramcoletados de 4-15 replicatas de 4 eventos de transformaçãoindependentes.

EXEMPLO 2Transformação de plantas de milho com Zm-D9 e regeneraçãodas plantas transgênicas

Embriões de milho imaturos de plantas doadoras da casade vegetação são bombardeados com um plasmídeo contendo oZm-D9 operacionalmente ligado ao promotor MS-S2A (MS-S2aPRO) e o gene marcador de seleção PAT (Wohlleben, et al.,(1988) Gene 70:25-37), que confere resistência ao herbicidaBialaphos. Alternativamente, o gene marcador de seleção éprovido em um plasmídeo separado. Transformação é realizadacomo segue. Receita dos meios segue abaixo.

Preparação do tecido alvo

As espigas são descascadas e a superfície esterilizadaem alvejante Clorox 30% mais 0,5% de Micro detergente por20 minutos, e lavadas duas vezes com água estéril. Osembriões imaturos são excisados e o eixo embrionáriocolocado voltado para baixo (escutelo para cima), 25embriões por placa, em meio 5 6 OY por 4 horas e entãoalinhados dentro de uma zona alvo de 2.5 cm na preparaçãopara bombardeamento.

Um vetor plasmidial compreendendo Zm-D9operacionalmente ligado a um promotor expressível em umaplanta é feito. Este DNA plasmidial mais o DNA plasmidialcontendo um marcador de seleção PAT é precipitado em 1,1 μm(diâmetro médio) péletes de tungstênio usando umprocedimento de precipitação com CaCl2 como segue: 100 μΐ

de partículas de tungstênio preparadas em água; 10 μΐ (1ug) de DNA em tampão Tris EDTA (1 ug de DNA total); 100 μΐde CaC12 2.5 M; e,10 μΐ de espermidina 0,1 M.

Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensãode partícula de tungstênio, enquanto mantidos em umagitador de multitubo. A mistura final é sonicadabrevemente e permitida incubar sob constante agitação por10 minutos. Depois do período de precipitação, os tubos sãocentrifugados brevemente, o líquido removido, lavado com500 ml de etanol 100%, e centrifugado por 30 segundos.Novamente o líquido é removido, e 105 μΐ de etanol 100% sãoadicionados para o pélete de partículas de tunsgtêniofinal. Para o bombardeamento de partícula, as partículas detungstênio/DNA são brevemente sonicadas e 10 μΐ colocadasno centro de cada macrocarregador e permitidas secar porcerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

As placas das amostras são bombardeadas no nível #4 emuma arma de partículas. Todas as amostras recebem umsimples tiro a 650 PSI, com um total de dez alíquotas tidasde cada tubo das partículas/DNA preparadas.

Seguindo o bombardeamento, os embriões são mantidos emmeio 560Y por 2 dias, e então transferidos para o meio deseleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialaphos, esubcultivados a cada 2 semanas. Depois de aproximadamente10 semanas de seleção, clones de calos resistentes àseleção são transferidos para o meio 288J para iniciar aregeneração da planta. Seguindo a maturação somática doembrião (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidossão transferidos para um meio para germinação etransferidos para uma sala de cultura iluminado.

Aproximadamente 7-10 dias mais tarde, plântulas emdesenvolvimento são transferidas para um meio 272V livre dehormônio em tubos para 7-10 dias até as plântulas estarembem estabelecidas. Plantas são então transferidas parainserções em recipientes (equivalente a um pote de 2.5")contendo solo envasado e deixadas crescer por 1 semana emuma câmara de crescimento, subseqüentemente crescidas em 1-2 semanas adicionais na casa de vegetação, entãotransferidas para 600 potes clássicos (1,6 galão) edeixadas crescer até a maturidade. Plantas são monitoradase marcadas por altura da planta. Plantas MUTl Zm-D9 sãoreduzidas em altura nesse estágio por aproximadamente 60%.

Meio de bombardeamento (560Y) compreende 4.0 g/l desais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mistura devitaminas Eriksson's (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l detiamina HCl, 120,0 g/l de sacarose, 1,0 mg/l de 2,4-D, e2.88 g/l L-prolina (trazidas para o volume com D-I H2Oseguindo ajuste para pH 5.8 com KOH) ; 2.0 g/l de Gelrite(adicionado depois de trazer o volume com D-I H2O) ; e 8.5mg/l de nitrato de prata (adicionado após a esterilizaçãodo meio e esfriado para temperatura ambiente). Meio deseleção (560R) compreende 4.0 g/l de sais basais N6 (SIGMAC-1416), 1,0 ml/l de mistura de vitaminas Eriksson's (1000XSIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l de sacarose,e 2.0 mg/l de 2,4-D (trazidos para volume com D-I H2O

seguindo ajuste para pH 5.8 com KOH) ; 3.0 g/l de Gelrite(adicionada após trazer para o volume com D-I H2O) ; e 0,85

mg/l de nitrato de prata e 3.0 mg/l de bialaphos (ambosadicionados após a esterilização do meio e esfriar paratemperatura ambiente).

Meio de regeneração de planta (288J) compreende 4.3g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l de soluçãoestoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02g/l de tiamina HCL, 0,10 g/l de piridoxina HCL, e 0,40 g/lde glicina trazidos para o volume com D-I H2O pura)

(Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l desacarose, e 1,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM (trazidopara o volume com D-I H2O pura após ajustar com pH 5.6);

3.0 g/l de Gelrite (adicionado após trazer para o volumecom D-I H2O) ; e 1,0 mg/l de ácido indolacético e 3.0 mg/l

de bialaphos (adicionado após a esterilização do meio eesfriar para 60°C). Meio livre de hormônio (272V)compreende 4.3 g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/lde solução estoque de vitaminas MS (0,100 g/l de ácidonicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCL, 0,10 g/l de piridoxinaHCL, e 0,40 g/l de glicina trazidos para o volume com D-IH2O pura), 0,1 g/l de mio-inositol, e 40,0 g/l de sacarose(trazida para o volume D-I H2O pura após ajustar pH para

5.6); e 6 g/l de bacto-agar (adicionado após trazer ovolume com D-I H2O pura), esterilizado e esfriado para60°C.

Bombardeamento e meio de cultura

Meio de bombardeamento (560Y) compreende 4.0 g/l desais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mistura devitaminas Eriksson's (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l detiamina HCl, 120,0 g/l de sacarose, 1,0 mg/l de 2,4-D, e2.88 g/l L-prolina (trazidos para o volume com D-I H2Oseguindo ajuste para o pH 5.8 com KOH); 2.0 g/l de Gelrite(adicionado após trazer para o volume com D-I H2O) ; e 8.5mg/l de nitrato de prata (adicionado após a esterilizaçãodo meio e esfriamento para a temperatura ambiente). Meio deseleção (560R) compreende 4.0 g/l de sais basais N6 (SIGMAC-1416), 1,0 ml/l de mistura de vitaminas ErikssonDfs(1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCli 30,0 g/l desacarose, e 2.0 mg/l de 2,4-D (trazidos para o volume comD-I H2O seguindo o ajuste para o pH 5.8 com KOH) ; 3.0 g/lde Gelrite (adicionado após trazer para o volume com D-IH2O) ; e 0,85 mg/l de nitrato de prata e 3.0 mg/l debialaphos (ambos adicionados após esterilização do meio eesfriar para temperatura ambiente).

Meio de regeneração de planta (288J) compreende 4.3g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/l de soluçãoestoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02

g/1 de tiamina HCL, 0,10 g/1 de piridoxina HCL, e 0,40 g/lde glicina trazidos para o volume com D-I H2O pura)

(Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100mg/1 de mio-inositol, 0,5 mg/1 de zeatina, 60 g/l desacarose, e 1,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM (trazidopara o volume com D-I H2O pura após ajuste para pH 5.6);

3.0 g/1 de Gelrite (adicionado após trazer para o volumecom D-I H2O) ; e 1,0 mg/l de ácido indolacético e 3.0 mg/1

de bialaphos (adicionado após esterilização do meio eesfriar para 60aC). Meio livre de hormônio (272V)compreende 4.3 g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1de solução estoque de vitaminas MS (0,100 g/1 de ácidonicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCL, 0,10 g/1 de piridoxinaHCL, e 0,40 g/l de glicina trazidos para o volume com D-IH2O pura), 0,1 g/l de mio-inositol, e 40,0 g/1 de sacarose(trazidos para o volume com D-I H2O pura após ajustar o pHpara 5.6); e 6 g/l de bacto-agar (adicionado após trazer ovolume com D-I H2O pura), esterilizar e esfriar para 60aC.

EXEMPLO 3

Transformação de milho mediada por Agrobacterium com Zm-D9e regeneração das plantas transformadas

Para transformação de milho mediada por Agrobacteriumcom uma ou mais moléculas de polinucleotídeo Zm-D9 dainvenção, o método de Zhao é empregado (patente americananúmero 5,981,840, e publicação de patente PCT W098/32326;os conteúdos das quais são aqui incorporados porreferência). Brevemente, embriões imaturos são isolados demilho e os embriões colocados em contato com uma suspensãode Agrobacterium, onde as bactérias são capazes detransferir o polinucleotideo(s) Zm-D9 de interesse parapelo menos uma célula de pelo menos um dos embriõesimaturos (passo 1: o passo da infecção). Neste passo osembriões imaturos são imersos em uma suspensão deAgrobacterium para o início da inoculação. Os embriões sãoco-cultivados por um tempo com o Agrobacterium (passo 2: opasso de co-cultivo). Os embriões imaturos são cultivadosem meio sólido após o passo de infecção. Seguindo esteperíodo de co-cultivação um passo de "descanso" opcional écontemplado. Nesse passo de descanso, os embriões sãoincubados na presença de pelo menos iam antibióticoconhecido para inibir o crescimento de Agrobacterium sem aadição de um agente seletivo para plantas transformantes(passo 3: passo de descanso). Os embriões imaturos sãocultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem umagente de seleção, para eliminação de Agrobacterium e parauma fase de descanso para as células infectadas. Depois,embriões inoculados são cultivados em meio contendo umagente seletivo e calos transformados crescidos sãorecuperados (passo 4: o passo de seleção).Os embriõesimaturos são cultivados em meio sólido com um agenteseletivo resultando no crescimento seletivo das célulastransformadas. Os calos são então regenerados em plantas(passo 5: o passo de regeneração), e os calos crescidos emmeio de seleção são cultivados em meio sólido pararegenerar plantas.

EXEMPLO 4

Transformação de embriões de soja com Zm-D9 e regeneraçãodas plantas transformadas

Condições de cultivo

Culturas em suspensão de sojas embriogênicas (cv.Jack) são mantidas em 35 ml de meio líquido SB196 (verreceitas abaixo) em um agitador rotativo, 150 rpm, 26°C comluz fluorescente branca fria em um fotoperíodo de 16:8 hrdia/noite em intensidade luminosa de 60-85 pE/m2/s.Culturas são subcultivadas a cada 7 dias por duas semanasatravés de inoculação de aproximadamente 35 mg de tecidodentro de 35 ml de meio líquido SBl 96 (o intervalopreferido de subcultivo é a cada 7 dias).

Culturas em suspensão embriogênicas de soja sãotransformadas com os plasmídeos e fragmentos de DNAdescritos nos seguintes exemplos pelo método debombardeamento de partículas (Klein, et al., (1987) Nature,327 :70).

Iniciação da cultura em suspensão embriogênica de sojaCulturas de soja são iniciadas duas vezes a cada mêscom 5-7 dias entre cada iniciação.

Vagens com sementes imaturas de plantas de sojadisponíveis de 45-55 dias após plantação são escolhidas,removidas de suas cascas e colocadas dentro de uma caixamagenta esterilizada. As sementes de soja são esterilizadasatravés de agitação das mesmas por 15 minutos em umasolução Clorox 5% com uma gota de sabão marfim (95 ml deágua destilada autoclavada mais 5 ml de Clorox e 1 gota desabão). Misturar bem. Sementes são lavadas usando 2garrafas de 1 litro de água destilada estéril e aquelasmenores do que 4 mm são colocadas em slides microscópicosindividuais. A pequena extremidade da semente é cortada eos cotilédones prensados para fora do tegumento.Cotilédones são transferidos para placas contendo meio SBl(25-3 0 cotilédones por placa). Placas são embrulhadas comfita de fibra e estocadas por 8 semanas. Após esse períodoembriões secundários são cortados e colocados em meiolíquido SB196 por 7 dias.

Preparação de DNA para bombardeamento

Cada plasmídeo intacto ou fragmento DNA plasmidialcontendo os genes de interesse e o gene marcador de seleçãosão usados para bombardeamento. DNAs plasmidiais parabombardeamento são rotineiramente preparados e purificadosusando o método descrito nos protocolos da Promega™ eguias de aplicações, segunda edição (página 106) .Fragmentos dos plasmídeos carregando o polinucleotídeo Zm-D9 são obtidos através de isolamento em gel dos plasmídeosduplo digeridos. Em cada caso, 100 ug de DNA plasmidial sãodigeridos em 0,5 ml da mistura de enzima específica que éapropriada para o plasmídeo de interesse. O resultado dosfragmentos de DNA resultantes são separados através deeletroforese em gel em agarose 1% SeaPlaque GTG(BioWhitaker Molecular Applications) e os fragmentos de DNAcontendo o polinucleotídeo Zm-D9 são cortados do gel deagarose. O DNA é purificado da agarose usando a enzima dedigestão GELase seguindo o protocolo do fabricante.

Uma alíquota de 50 μΐ de água destilada estérilcontendo 3 mg de partículas de ouro (3 mg de ouro) éadicionada a 5 μΐ de uma solução de DNA 1 pg/ul (cadaplasmídeo intacto ou fragmento de DNA preparado comodescrito acima), 50 μΐ 2,5M de CaCl2 e 20 μΐ de 0,1 M de

espermidina. A mistura é agitada por 3 min no nível 3 de umagitador vortex e centrifugada por 10 segundos em umamicrocentrífuga de bancada. Após uma lavagem com 400 μΐ deetanol 100% o pélete é suspendido através de sonicação em40 μl 50 μl de etanol 100%. 5 μΐ (verificar a unidade nooriginal) de suspensão de DNA é dispensada para cada discode lançamento do disco instrumento de biolísticaPDS1000/HE. Cada alíquota de 5 μΐ contém aproximadamente0,375 mg de ouro por bombardeamento (i.e. por disco).Preparação do tecido e bombardeamento com DNA

Aproximadamente 150-200 mg de culturas de suspensãoembriogênica f 7 dias de idade foram colocadas em uma placade petri vazia, estéril de 60 χ 15 mm e o disco coberto comfilme plástico. O tecido é bombardeado com 1 ou 2 tiros porplaca com uma pressão de ruptura de membrana fixada em 1100PSI e a câmara evacuada para um vácuo de 27-28 polegadas demercúrio. O tecido é colocado a aproximadamente 3.5polegadas da tela de retenção/parada.

Seleção dos embriões transformados

Os embriões transformados foram selecionados usandohigromicina (quando o gene da higromicina fosfotransferase,HPT, foi usado como marcador de seleção) ou clorsulfuron(quando o gene da acetolactato sintase, ALS, foi usado comomarcador de seleção).

Seleção com higromicina (HPT)

Seguindo o bombardeamento, o tecido é colocado em meiofresco SB196 e cultivado como descrito acima. Seis diasapós o bombardeamento, o SB196 é substituído com SB196fresco contendo um agente de seleção higromicina 30 mg/L. Omeio de seleção é substituído semanalmente. Quatro a seissemanas após a seleção, o tecido verde transformado podeser observado crescendo dos grupos embriogênicos necróticosnão transformados. O tecido verde isolado é removido einoculado em placas multipoços para gerar novas culturas emsuspensão embriogênicas transformadas propagadasclonalmente.

Seleção com clorsulfuron (ALS)

Após o bombardeamento, o tecido é dividido entre 2balões com meio SB196 fresco e cultivado como descritoacima. Seis a sete dias após o bombardeamento, o SB196 ésubstituído com SB196 fresco contendo o agente de seleçãoClorsulfuron 100 ng/ml. O meio de seleção é substituídosemanalmente. Quatro a seis semanas após a seleção, otecido verde transformado pode ser observado crescendo dosgrupos embriogênicos necróticos não transformados. O tecidoverde isolado é removido e inoculado em placas multipoçoscontendo SBl96 para gerar novas culturas em suspensãoembriogênicas transformadas clonalmente propagadas.

Regeneração dos embriões somáticos de soja em plantas

Com a finalidade de obter plantas inteiras de culturasem suspensão embriogênicas, o tecido deve ser regenerado.

Maturação do embrião

Embriões são cultivados por 4-6 semanas a 26°C emSB196 sob luz fluorescente branca fria (luz branca friaPhillips Econowatt F40/CW/RS/EW) e Agro (Phillips F40 Agro)lâmpadas (40 watt) em um fotoperíodo de 16:8 hr comintensidade luminosa de 90-120 uE/m2s. Após esse períodogrupos de embriões são removidos para vim meio Agar sólido,SB166, por 1-2 semanas. Grupos são então subcultivados parao meio SB103 por 3 semanas.

Dessecação e germinação do embrião

Embriões maduros individuais são dessecados através dacolocação dos mesmos dentro de uma pequena placa de petrivazia (35 χ 10 mm) por aproximadamente 4-7 dias. As placassão seladas com fita de fibra (criando uma pequena câmaraúmida). Embriões dessecados são plantados dentro de um meioSB71-4 onde eles são deixados para germinar sob as mesmascondições de cultura descritas acima. Plântulas germinadassão removidas do meio de germinação e lavadasminuciosamente com água e então plantadas em 24 células deuma bandeja Redi-Earth, cobertas com uma cúpula de plásticoclara. Após 2 semanas a cúpula é removida e plantasamadurecidas por mais uma semana. Se as plântulas pareceremendurecidas elas serão transplantadas para um pote de IOOhde Redi-Earth com até 3 plântulas por pote. Após 10 a 16semanas, sementes maduras são colhidas, retiradas lascas eanalisadas para proteínas.

Receita dos meios

SB 196 - meio de proliferação líquido FN Lite (porlitro) -

MS FeEDTA - 100 x Estoque 1 10 ml

MS Sulfato - 100 x Estoque 2 10 ml

FN Lite Halogenetos - 100 x Estoque 3 10 ml

FN Lite P,B,Mo - 100 x Estoque 4 10 ml

Vitaminas B5 (lml/L) 1,0 ml

2,4-D (lOmg/L de concentração final) 1,0 ml

KNO3 2,83 g

(NH4)2 SO 4 0,463 g

Asparagina 1,0 g

Sacarose (1%) 10 g

pH 5.8

Soluções estoques FN Lite

Estoque # 1000 ml 5O0ml

1 MS Fe EDTA IOOx Estoque

Na2 EDTA* 3,724 g 1,862 g

FeSO4 - 7H20 2,784 g 1,392 g

* Adicionar primeiro, dissolver em garrafa escura enquanto agita

MS Sulfato 100x estoque

MgSO4 - 7H20 37,0 g 18,5 g

MnSO4 - H2O 1,69 g 0,845 g

ZnSO4 - 7H20 0,86 g 0,43 g

CuSO4 - 5H20 0,0025 g 0,00125 g

FN Lite Halogenetos 100x Estoque

CaCl2 - 2H20 3 0,0 g 15,0 g<table>table see original document page 126</column></row><table>

Meio sólido SBl (por litro) compreende: 1 pacote desais MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B51000X estoque; 31,5 g de sacarose; 2 ml de 2,4-D (2 0mg/L deconcentração final); pH 5.7; e, 8 g de TC agar.

Meio sólido SB 166 (por litro) compreende: 1 pacote desais MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B51000X estoque; 60 g de maltose; 750 mg de MgC12hexahidratado; 5 g de carvão ativado; pH 5.7; e, 2 g degelrite.

Meio sólido SB 103 (por litro) compreende: 1 pacote desais MS (Gibco/BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B51000X estoque; 60 g de maltose; 750 mg de MgC12hexahidratado; pH 5.7; e, 2 g de gelrite.

Meio sólido SB 71-4 (por litro) compreende: 1 garrafaGamborg's de sais B5 c/ sacarose (Gibco/BRL - Cat# 21153-036); pH 5.7; e, 5 g de TC agar.2,4-D estoque é obtido pré-pronto da Phytotech cat# D295 - e a concentração é 1 mg/ml.

Estoques de vitaminas B5 (por 100 ml) que é estocadoem alíquotas à -20aC compreende: 10 g de mio-inositol; 100mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCl; e, Ig detiamina. Se a solução não dissolver rapidamente o bastante,aplicar um baixo nível de calor via uma placa quente deagitação. Estoque de Clorsulfuron compreende Img / ml em0,01 N de Hidróxido de amônio.

EXEMPLO 5

Transformação de tecido de meristema de girassol com Zm-D9e regeneração das plantas transformadas

Tecidos meristemáticos de girassol são transformadoscom um cassete de expressão contendo uma molécula depolinucleotídeo Zm-D9 da invenção operacionalmente ligadaao promotor MS-S2A como segue (ver também, patente européianúmero EP 0 486233, aqui incorporada por referência, eMalone-Schoneberg, et al., (1994) Plant Science 103:199-207). Sementes de girassol maduras (Helianthus annuus L.)são descascadas usando uma simples malhadeira de cabeça detrigo. Sementes têm a superfície esterilizada por 30minutos em uma solução alvejante Clorox 20% com a adição deduas gotas de Tween 20 por 50 ml de solução. As sementessão lavadas duas vezes com água destilada estéril.Explantes de eixos embrionários divididos sãopreparados através de uma modificação dos procedimentosdescritos por Schrammeijer, et al., (Schrammeijer, et al.,(1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Sementes são embebidas emáguas destiladas por 60 minutos seguindo o procedimento deesterilização de superfície. Os cotilédones de cada sementesão então retirados, produzindo uma fratura limpa no planodo eixo embrionário. Seguindo a excição do ápice radicular,os explantes são biseccionados longitudinalmente entre asfolhas primordiais. As duas metades são colocadas,superfície cortada para cima, em meio GBA consistindo deelementos minerais de Murashige e Skoog (Murashige, et al.,(1962) Physiol. Plant., 15:473-497), adições de vitaminasShepard1S (Shepard (1980) in Emergent Techniques for theGenetic Improvement of Crops (University of MinnesotaPress, St. Paul, Minnesota), 40 mg/l de adenina sulfato, 30g/l de sacarose, 0,5 mg/l de 6-benzil-aminopurina (BAP),0,25 mg/l de ácido indol-3-acético (IAA), 0,1 mg/l de ácidogiberélico (GA3), pH 5.6, e 8 g/l de Fitagar.

Os explantes estão sujeitos ao bombardeamento demicroprojétil antes do tratamento com Agrobacterium(Bidney, et al. , (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). 30dos 40 explantes são colocados em um círculo no centro deuma placa 60 X 20 mm para este tratamento. Aproximadamente4,7 mg dos microprojéteis de tungstênio 1,8 mm sãoressuspendidos em 25 ml de tampão TE estéril (10 mM de TrisHCl, 1 itiM de EDTA, ρΗ 8.0) e 1,5 ml das alíquotas sãousadas por bombardeamento. Cada placa é bombardeada duasvezes através de uma tela nytex de 150 mm, colocada 2 cmacima das amostras em iam aparelho de aceleração departículas PDS 1000®.

A cepa EHA105 desarmada de Agrobacterium tumefaciens éusada em todos os experimentos de transformação. Um vetorplasmidial binário compreendendo o cassete de expressão quecontém a molécula de polinucleotídeo Zm-D9 operacionalmenteligada ao promotor é introduzida dentro da cepa EHA105 deAgrobacterium através do congelamento/descongelamento comodescrito por Holsters, et ai., (1978) Mol. Gen. Genet.163:181-187. Este plasmídeo compreende ainda um genemarcador de seleção da canamicina (i.e., nptll) . Bactériaspara experimentos de transformação de plantas são crescidasdurante a noite (28aC e agitação contínua a 100 RPM) emmeio líquido YEP (10 gm/1 de extrato de levedura, 10 gm/1de Bactopeptona, e 5 gm/1 de NaCl, pH 7.0) com osantibióticos apropriados requeridos para a cepa bacterianae manutenção do plasmídeo binário. A suspensão é usadaquando ela alcança uma OD6OO de cerca de 0,4 a 0,8. Ascélulas de Agrobacterium são peletizadas e ressuspendidas auma OD6OO final de 0,5 em um meio de inoculaçãocompreendido de 12,5 mM de MES pH 5.7, 1 gm/1 de NH4CI, e0,3 gm/1 de MgSC>4.

Explantes recentemente bombardeados são colocados emuma suspensão de Agrobacterium, misturados, e deixados semdistúrbios por 30 minutos. Os explantes são entãotransferidos para o meio GBA e co-cultivados, superfíciecortada para baixo, a 26°C e 18-horas dia. Após três diasde co-cultivação, os explantes são transferidos para 374B(meio GBA sem reguladores de crescimento e um nível desacarose reduzido de 1%) suplementado com cefotaxime 250mg/l e sulfato de canamicina 50 mg/l. Os explantes sãocultivados por duas a cinco semanas em seleção e entãotransferidos para meio líquido 374B sem canamicina por umaou duas semanas de desenvolvimento continuado. Explantescom diferenciação, áreas resistentes a antibióticos decrescimento que não tenham produzido brotos adequados paraexcisão são transferidos para meio GBA contendo 250 mg/l decefotaxime por um segundo tratamento de fitormônio de 3-dias. Amostras de folhas de brotos verdes, resistentes acanamicina são analisados para a presença de NPTII porELISA e para presença da expressão do transgene através daanálise da atividade de Zm-D9.

Brotos NPTII-positivos são enxertados nos portaenxertos de plântulas de girassol híbridas 6440 da Pioneer®crescidas in vitro. Sementes com a superfície esterilizadassão germinadas em meio 48-0 (metade da força dos sais deMurashige e Skoog, sacarose 0,5%, gelrite 0,3%, pH 5.6) ecrescidas sob condições descritas para cultura de explante.A porção superior das plântulas é removida, um cortevertical de 1 cm é feito no hipocótilo, e o brototransformado inserido dentro do corte. A área total éembrulhada com parafilme para assegurar o broto. Plantasenxertadas podem ser transferidas para o solo após umasemana de cultura in vitro. Enxertos no solo são mantidossob condições de alta umidade seguindo por uma lentaaclimatação para o ambiente da casa de vegetação. Setorestransformados de plantas Tq (geração parental) amadurecidosna casa de vegetação são identificados através de NPTIIELISA dos extratos foliares.

EXEMPLO 6

Expressão e caracterização de Zm-D9

Perfis de expressão mostram de um ponto de vista dodesenvolvimento, d9 mostra preferência para célulasmaduras, diferenciadas, particularmente aquelas associadascom caule, enquanto que d8 está mais associado com ascélulas em divisão ou meristemáticas (Figura 5). Porexemplo, d8 tem expressão significantemente maior emmeristemas, a região de divisão do caule (internódulo) ezona de transição, enquanto que d8 e d9 são expressosaproximadamente em paridade na zona madura do internódulo.

Os níveis mais altos de expressão para d8 e d9 foram emespigas e feixes vasculares, respectivamente. Em geral,órgão/tecidos vasculares tiveram maior expressão de ambosos genes órgãos/tecidos não vasculares. Isso estáconsistente com a presença dos mRNAs e proteínas DELLA nosvasos e em volta dos mesmos em dicotiledôneas (Haywood, etai., (2005) Plant Journal 42:49-68; Israelsson, et al.,(2005) Plant Journal 44:494-504) e sugere que a localizaçãotem sido conservada entre dicotiledôneas emonocotiledôneas.

Para dissecar além da natureza do alelo D9, domínio detroca dos constructos foram criados e transformados dentrode Arabidopsis. Cinco regiões genéticas foram trocadasentre os clones de entrada d9 e D9 (Figura 6), e os clonesde entrada quiméricos resultantes foram usados para criarS2A PRO::DELLA intermediário e vetores co-integrados paratransformação como descrito para os alelos nativos demilho. Análises morfométricas do domínio de troca dostransgênicos foram realizadas na geração Tl (Figura 9) . Amutação E600K de D9 é necessária e suficiente para mudançasfenotípicas no nanismo e florescimento precoce. O d9 E600Ke o D9 K597E produziram efeitos morfológicos desiguais paraseus alelos do suporte principal (Figura 9). As diferençasmais notáveis foram na altura da planta, comprimento dasíliqua, dias para florescimento, e número de folhas emroseta no florescimento. Em todos os quatro casos, asplantas d9 (E600K) mostraram características similares aD9. Em média, o quimera d9 (E600K) produziu plantas com oscaules e síliquas mais curtos e tiveram o menor número derosetas no florescimento de qualquer dos dez constructos.Inversamente, D9 K597E foi classificado como segundo outerceiro mais alto para o comprimento de síliqua, dia paraflorescimento, e número de folhas em roseta noflorescimento. Nenhiim outro polimorfismo exibiu um padrãoclaro de mudanças na estatura ou tempo de florescimento.Esta mutação e outras mutações podem então ter umaaplicação específica na mudança da estatura de milho emdireção ao tipo de grão, arquitetura potencial de altaprodutividade.

Os aleios de nanismo DELLA de milho foram encontradosapressar o florescimento de Arabidopsis. D8 MPL e D8 MUTdeslocaram o florescimento em aproximadamente 6 dias maiscedo (Figura 7). Surpreendentemente, D9 acelerou oflorescimento em 11 dias (26.5%). Este efeito parece estarligado à insensibilidade à giberelina já que as vezes deflorescimento de d8 e d9 transgênicos não foramsignificativamente diferentes do controle GUS. O gene D9causa florescimento tardio em TO GS3xGaspe Flint (Figura8), enquanto que d9 leva ao florescimento precoce (usandonódulos de solo acima do solo como uma base paradeslocamento de maturidade; Figura 7). Nenhiama alteração dotempo de florescimento tem sido observada em d8 ou D8 MPLtransgênico de milho.

O promotor MS-S2A foi selecionado para dirigir aexpressão de cinco alelos DELLA de milho em Arabidopsistransgênica. O promotor de arroz Actinl foi usado paradirigir esses alelos em Arabidopsis em um grupo detransgênicos precoce. Plantas Tl dessas transformações nãoexibiram qualquer fenótipo visível, sugerindo que opromotor de arroz Actin 1 não expressou as proteínas DELLAnos tecidos próprios. Dado este resultado, o perfil deexpressão de milho para d8 e d9 (Figura 5), e o trabalho deHaywood, et al., ((2005) Plant Journal 42:49-68) quemostrou uma associação vascular das proteínas DELLA e mRNAsem três espécies, o promotor MS-S2A foi escolhido paraexpressão de DELLA de milho em Arabidopsis e milho. Umaabordagem de transgênico foi escolhida de forma que umacomparação direta dos alelos do milho poderia serrealizada, a qual não seria desviada por efeitosdependentes de promotores. Esses dados estabelecem o uso depromotores tecido específicos como uma estratégia paramudar a arquitetura da planta.

EXEMPLO 7

Variantes de Zm-D9

A. Seqüências de nucleotídeos variantes de Zm-D9(SEQ ID NOs 1, 3, 4 ou 6) que não alteram a seqüência deaminoácido codificada

A seqüência de nucleotídeo Zm-D9 descrita em SEQ IDNO: 1, 3, 4 ou 6 é usada para gerar seqüências denucleotídeos variantes tendo a seqüência de nucleotídeo dafase aberta de leitura com cerca de 70%, 76%, 81%, 86%, 92%e 97% de identidade de seqüência de nucleotídeo quandocomparada com a seqüência de nucleotídeo ORF de iniciaçãoinalterada da SEQ ID NO: 1, 3, 4 ou 6. Essas variantesfuncionais são geradas usando uma tabela de códon padrão.Enquanto a seqüência de nucleotídeo da variante é alterada,a seqüência de aminoácido codificada pela fase aberta deleitura não muda.

B. Seqüências de aminoácidos variantes de Zm-D9

Seqüências de aminoácidos variantes de Zm-D9 sãogeradas. Neste exemplo, um aminoácido é alterado.Especificamente, a seqüência de aminoácido descrita em SEQID NO: 2 ou 5 é revisada para determinar a alteração deaminoácido apropriada. A seleção do aminoácido para mudar éfeita através da consulta ao alinhamento de proteína (comos outros ortólogos e outros membros da família gênica devárias espécies). Ver Figura 2. Um aminoácido é selecionadoconsiderando que ele não esteja sob alta pressão de seleção(não é altamente conservado) e que facilmente substituídopor um aminoácido com características químicas similares(i.e., lado da cadeia funcional similar). Usando oalinhamento de proteína descrito na Figura 2 um aminoácidoapropriado pode ser mudado. Uma vez que o aminoácido alvo éidentificado, o procedimento descrito no Exemplo 6A éseguido. Variantes tendo cerca de 70%, 75%, 81%, 86%, 92% e97% de identidade de seqüência de ácido nucléico com a SEQID NO: 1, 3, 4, ou 6 são geradas usando este método.

C. Seqüências de aminoácido variantes adicionais de Zm-D9Neste exemplo, seqüências de proteínas artificiais sãocriadas tendo 82%, 87%, 92% e 97% de identidade com relaçãoa seqüência de proteína de referência. Este último esforçorequer identificar regiões conservadas e variáveis doalinhamento descrito da Figura 2 e então a aplicaçãojudiciosa da tabela de substituição de aminoácidos. Essaspartes serão discutidas em mais detalhes abaixo.

Largamente, a determinação de quais seqüências deaminoácidos alteradas é feita baseada em regiõesconservadas entre a proteína Zm-D9 ou entre outrasproteínas DELLA. Ver Figura 2. Baseado no alinhamento deseqüência, as várias regiões da proteína Zm-D9 que possamsemelhantemente ser alteradas são representadas em letrasminúsculas, enquanto que as regiões conservadas sãorepresentadas por letras maiúsculas. É reconhecido quesubstituições conservativas podem ser feitas nas regiõesconservadas abaixo sem alterar função. Em adição, umespecialista na área entenderá que variantes funcionais daseqüência de aminoácido Zm-D9 da invenção podem ter menosalterações de aminoácidos não conservados no domínio conservado.

As regiões conservadas são encontradas entreaproximadamente os aminoácidos 37 a 109, 224 a 504, 528 a625, da SEQ ID NO: 2. As regiões não conservadas sãoprovenientes de cerca de aminoácidos 1 a 36, 110 a 223, 505a 527, da SEQ ID NO: 2.Seqüências de proteínas artificiais são então criadaspara serem diferentes da original nos intervalos de 80-85%,85-90%, 90-95%, e 95-100% de identidade. Pontos médiosdesses intervalos são objetivados, com latitude liberal demais ou menos 1%, por exemplo. As substituições deaminoácidos serão efetuadas por um documento Perl prático.

A tabela de substituição é fornecida abaixo na Tabela 2.Tabela 2. Tabela de substituição

<table>table see original document page 138</column></row><table>

Primeiro, qualquer aminoácido conservado na proteínaque não deva ser mudado é identificado e "marcado fora"para isolamento da substituição. A metionina inicialnaturalmente será adicionada para esta listaautomaticamente. Depois, as mudanças são feitas.Η, C, e P não mudam em qualquer circunstância. Asmudanças ocorrerão com a isoleucina primeiro, varrendo o N-terminal ao C-terminal. Então a leucina, e assim por diantena lista até o objetivo desejado ser alcançado.Substituições de números provisórios podem ser feitas demodo a não provocar a reversão das alterações. A lista éordenada de 1-17, de modo que comece com muitas mudanças deisoleucina quantas forem necessárias antes da leucina, eassim or diante até a metionina. Claramente muitosaminoácidos desta forma não precisarão ser mudados. L, I eV envolverão uma substituição 50:50 de duas substituiçõespreferenciais alteranadas.

As seqüências de aminoácidos variantes são escritascomo saída. Documento Perl é usado para calcular asporcentagens de identidades. Usando este procedimento,variantes de uma proteína Zm-D9 são geradas tendo cerca de82%, 87%, 92% e 97% de identidade de aminoácido com aseqüência de nucleotídeo ORF inalterada inicial da SEQ IDNO: I1 3, 4 ou 6.

0 artigo "um" e "uma" são usados aqui para se referira um ou mais do que um (i.e., para pelo menos um) doobjeto gramatical do artigo.A título de exemplo, "umelemento" significa um ou mais elementos.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionadosna especificação são indicativos do nível dos especialistasno estado da técnica a qual essa invenção pertence. Todasas publicações e pedidos de patente são aqui incorporadospor referência para a mesma extensão como se cadapublicação ou pedido de patente individual fossemespecificamente e individualmente indicados para seremincorporados como referência.

Embora a invenção exposta tenha sido descrita emalguns detalhes por meio de ilustração e exemplos parapropósito de esclarecimento, é óbvio que certas mudanças emodificações podem ser praticadas dentro do escopo dasreivindicações anexadas.

Exemplo 8

Expressão de caracterização de Zm-D9 em milho

Constructos de domínio de troca (ver exemplo 6) d9E600k e D9 K597E foram testados em milho (geração TO) paradeterminar seu efeito na altura da planta, número defolhas, dias para emergência do pendão, dias para oprimeiro pólen ser liberado, e dias para polinização. Osdados fenotípicos de d9 E600k e D9 K597E foram comparadoscom os dados usando o alelo MUTl Zm-D9 e o alelo Zm-D8 MPL.Em todos os casos o promotor S2a foi usado para dirigir aexpressão dos respectivos genes estruturais. Construção dovetor foi detalhada no exemplo 6. A altura da planta de D9K597E não foi alterada quando comparada com plantas demilho não transformada do mesmo genótipo crescendo ao mesmotempo na casa de vegetação. Similarmente, o número defolhas, dias para emergência do pendão, dias para oprimeiro pólen ser liberado, e dias para polinização de D9K597E foi similar às plantas não transformadas. Em média,os transgênicos MUTl D9 e d9 E600K tiveram uma folhaadicional comparado ao D9 K597E. Os transgênicos d9 E600 Ke MUTl D9 foram dramaticamente reduzidos em altura (50% e30% reduzidos respectivamente) quando comparados ao D9K597E. Por outro lado, d9 E600k e MUTl D9 sofreramatrasados na emergência do pendão, liberação do pólen e nadata de polinização quando comparados com D9 K597E. Aliberação do pólen foi prejudicada em até 14 dias com MUTlD9 e 10 dias com d9 E600k. 0 atraso da polinização foisimilar com essas plantas transgênicas. Em adição, essestransgênicos mostraram aproximadamente um nódulo extraquando comparados com D9 K597E. Esses dados mostram umpadrão similar a Arabidopsis para altura (caules maiscurtos), mas o fenótipo oposto para maturidade deslocada naqual o MUTl D9 e d9 E600k tiveram a maturidade atrasada.Esses dados confirmam a significância deste polimorfismopara mudanças na estatura e tempo de florescimento emArabidopsis e milho. As mutações MUTl D9 e d9 E600k podemter uma aplicação específica na mudança da estatura, númerode nódulos, ou maturidade em uma arquitetura de plantaalternativa em um tipo de grão, arquitetura potencial comalta produtividade em milho.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Depositante: Pioneer Hi-Bred International, Inc.

<120> Titulo da Invenção: MOLÉCULAS DE POLINUCLEOTÍDEO ISOLADAS

CORRESPONDENTES A ALELOS MUTANTES E DE TIPOSELVAGEM DO GENE D9 DO MILHO E MÉTODOS DE USO

<130> Referência do documento: 2075-PCT

<140> Número do Depósito: PCT/US2007/066826

<141> Data do Depósito: 18-04-2007

<150> Número do Documento de Prioridade: 60/793,048

<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 19-04-2006

<150> Número do Documento de Prioridade: 60/834,024

<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 28-07-2006

<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 8

<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> SEQ ID NO: 1

<211> Comprimento: 1878

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 1

atgaagcgcg agtaccaaaa cgccggcggg aacgacggct acaggggctc ctccaaggac 60aagtcgatgg cggcggcggc gggggcaggg gagcaggagg aggaggtgga cgagctgctg 120gcggcgctcg ggtacaaggt gcgttcgtcg gatatggcgg acgtcgcgca gaagctagag 180cagctcgaga tggccatggg gatgggcggc gcctgcccca ccgctgatga cgggttcgtc 240tcgcacctcg ccacggacac cgtgcactac aatccctccg acctgtcgtc ctgggtcgag 300agcatgctgt ccgagctcaa cgcgcccccg ccgccgctcc cacccgcgac gccggcacca 360aggctggcgt ccacctcgtc caccgtcaca agtggcgccg ccgccggtgc cggctacttc 420gatctcccgc ccgccgtcga ctcgtccagc agtacctacg ctctgaagcc gatcccctcg 480ccggtggcgg cggcgtcggc cgacccgtcc ccggactcgg cgcgggagcc caagcggatg 540cgaactggcg gcggcagcac gtcgtcgtcc tcttcctcgt cgtcatccat ggacggcggc 600cgcactagga gctccgtggt cgaagctgcc ccgccggcga cgcaggcggc caacgggccg 660gcggtgccgg tggtggtggt ggacacgcag gaggccggga tccggctggt gcacgcgctg 720ctggcgtgcg cggaggccgt gcagcaggag aacttctctg cggcggacgc gctggtgaag 780cagatccccg tgctggcctc gtcgcagggc ggcgccatgc gcaaggtcgc cgcctacttc 840ggcgaggcgc tcgcccggcg cgtgtatcgc ctccgcccgg caccggacgg ctccctcctc 900gacgccgcct tcgccgacct cctgcacgcg cacttctacg agtcctgccc ctacctcaag 960ttcgcccact tcaccgcgaa ccaggccatc ctcgaggctt tcgccgggtg ccgccgcgtc 1020cacgtcgtcg acttcggcat caagcagggg atgcagtggc cggctctcct ccaggccctc 1080gccctccgcc ccggcggccc cccgtcgttc cgtctcaccg gcgtaggccc gccgcagccc 1140gacgagaccg acgccctgca gcaggtgggc tggaagctcg cccagttcgc gcacaccatc 1200

cgcgtcgact tccagtaccg tggcctcgtc gccgccacgc tcgctgacct ggagccgttc 1260

atgctgcgac cggagggcgg cggcgacacg gacgacgagc ccgaggtgat cgccgtaaac 1320

tcggtgtgcg agctgcaccg gctgctcgcg cagcccggta cactcgacaa ggtcctgggc 1380

accgtgcgcg cggtgcggcc gaggatcgtg acggtggtgg agcaggaggc caaccacaac 1440

tccggcacat tcctcgaccg cttcacggag tcgctgcact actactccac catgttcgac 1500

tccctcgagg gcgccggctc aggctccggc tccggctccg gctccggcca gcccaccgac 1560

gcctccccgc cggccggcac ggaccaggtg atgtccgagg tgtacctcgg ccggcagatc 1620

tgcaacatcg tggcgtgcga gggcgccgag cgcacggagc gccacgagac gctggtccag 1680

tggcgcggcc gcctcggcgg gtccgggttc gagcccgtgc acctgggatc caacgcctac 1740

aagcaggcaa gcacgctgct ggccctcttc gccggcggcg acgggtacag ggtggaggag 1800

aaggacgggt gcctgactct gggatggcat acgcgcccgc tcatcgccac ctcggcgtgg 1860

cgcgtcgccg ctccgtga 1878

<210> SEQ ID NO: 2<211> Comprimento: 625<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 2

Met Lys Arg Glu Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Asn Asp Gly Tyr Arg Gly

15 10 15

Ser Ser Lys Asp Lys Ser Met Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Glu Gln

20 25 30

Glu Glu Glu Val Asp Glu Leu Leu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Val Arg

35 40 45

Ser Ser Asp Met Ala Asp Val Ala Gln Lys Leu Glu Gln Leu Glu Met

50 55 60

Ala Met Gly Met Gly Gly Ala Cys Pro Thr Ala Asp Asp Gly Phe Val65 70 75 80

Ser His Leu Ala Thr Asp Thr Val His Tyr Asn Pro Ser Asp Leu Ser

85 90 95

Ser Trp Val Glu Ser Met Leu Ser Glu Leu Asn Ala Pro Pro Pro Pro

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Thr Pro Ala Pro Arg Leu Ala Ser Thr Ser Ser Thr

115 120 125

Val Thr Ser Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ala Leu Lys Pro Ile Pro Ser145 150 155 160

Pro Val Ala Ala Ala Ser Ala Asp Pro Ser Pro Asp Ser Ala Arg Glu

165 170 175

Pro Lys Arg Met Arg Thr Gly Gly Gly Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser

180 185 190

Ser Ser Ser Ser Met Asp Gly Gly Arg Thr Arg Ser Ser Val Val Glu

195 200 205

Ala Ala Pro Pro Ala Thr Gln Ala Ala Asn Gly Pro Ala Val Pro Val

210 215 220

Val Val Val Asp Thr Gln Glu Ala Gly Ile Arg Leu Val His Ala Leu225 230 235 240

Leu Ala Cys Ala Glu Ala Val Gln Gln Glu Asn Phe Ser Ala Ala Asp245 250 255

Ala Leu Val Lys Gln Ile Pro Val Leu Ala Ser Ser Gln Gly Gly Ala

260 265 270

Met Arg Lys Val Ala Ala Tyr Phe Gly Glu Ala Leu Ala Arg Arg Val

275 280 285

Tyr Arg Leu Arg Pro Ala Pro Asp Gly Ser Leu Leu Asp Ala Ala Phe

290 295 300

Ala Asp Leu Leu His Ala His Phe Tyr Glu Ser Cys Pro Tyr Leu Lys305 310 315 320

Phe Ala His Phe Thr Ala Asn Gln Ala Ile Leu Glu Ala Phe Ala Gly

325 330 335

Cys Arg Arg Val His Val Val Asp Phe Gly Ile Lys Gln Gly Met Gln

340 345 350

Trp Pro Ala Leu Leu Gln Ala Leu Ala Leu Arg Pro Gly Gly Pro Pro

355 360 365

Ser Phe Arg Leu Thr Gly Val Gly Pro Pro Gln Pro Asp Glu Thr Asp

370 375 380

Ala Leu Gln Gln Val Gly Trp Lys Leu Ala Gln Phe Ala His Thr Ile385 390 395 400

Arg Val Asp Phe Gln Tyr Arg Gly Leu Val Ala Ala Thr Leu Ala Asp

405 410 415

Leu Glu Pro Phe Met Leu Arg Pro Glu Gly Gly Gly Asp Thr Asp Asp

420 425 430

Glu Pro Glu Val Ile Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Leu His Arg Leu

435 440 445

Leu Ala Gln Pro Gly Thr Leu Asp Lys Val Leu Gly Thr Val Arg Ala

450 455 460

Val Arg Pro Arg Ile Val Thr Val Val Glu Gln Glu Ala Asn His Asn465 470 475 480

Ser Gly Thr Phe Leu Asp Arg Phe Thr Glu Ser Leu His Tyr Tyr Ser

485 490 495

Thr Met Phe Asp Ser Leu Glu Gly Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

500 505 510

Ser Gly Ser Gly Gln Pro Thr Asp Ala Ser Pro Pro Ala Gly Thr Asp

515 520 525

Gln Val Met Ser Glu Val Tyr Leu Gly Arg Gln Ile Cys Asn Ile Val

530 535 540

Ala Cys Glu Gly Ala Glu Arg Thr Glu Arg His Glu Thr Leu Val Gln545 550 555 560

Trp Arg Gly Arg Leu Gly Gly Ser Gly Phe Glu Pro Val His Leu Gly

565 570 575

Ser Asn Ala Tyr Lys Gln Ala Ser Thr Leu Leu Ala Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Gly Asp Gly Tyr Arg Val Glu Glu Lys Asp Gly Cys Leu Thr Leu Gly

595 600 605

Trp His Thr Arg Pro Leu Ile Ala Thr Ser Ala Trp Arg Val Ala Ala610 615 620

Pro625<210> SEQ ID NO: 3

<211> Comprimento: 1875

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 3

atgaagcgcg agtaccaaaa cgccggcggg aacgacggct acaggggctc ctccaaggac 60

aagtcgatgg cggcggcggc gggggcaggg gagcaggagg aggaggtgga cgagctgctg 120

gcggcgctcg ggtacaaggt gcgttcgtcg gatatggcgg acgtcgcgca gaagctagag 180

cagctcgaga tggccatggg gatgggcggc gcctgcccca ccgctgatga cgggttcgtc 240

tcgcacctcg ccacggacac cgtgcactac aatccctccg acctgtcgtc ctgggtcgag 300

agcatgctgt ccgagctcaa cgcgcccccg ccgccgctcc cacccgcgac gccggcacca 360

aggctggcgt ccacctcgtc caccgtcaca agtggcgccg ccgccggtgc cggctacttc 420

gatctcccgc ccgccgtcga ctcgtccagc agtacctacg ctctgaagcc gatcccctcg 480

ccggtggcgg cggcgtcggc cgacccgtcc ccggactcgg cgcgggagcc caagcggatg 540

cgaactggcg gcggcagcac gtcgtcgtcc tcttcctcgt cgtcatccat ggacggcggc 600

cgcactagga gctccgtggt cgaagctgcc ccgccggcga cgcaggcggc caacgggccg 660

gcggtgccgg tggtggtggt ggacacgcag gaggccggga tccggctggt gcacgcgctg 720

ctggcgtgcg cggaggccgt gcagcaggag aacttctctg cggcggacgc gctggtgaag 780

cagatccccg tgctggcctc gtcgcagggc ggcgccatgc gcaaggtcgc cgcctacttc 840

ggcgaggcgc tcgcccggcg cgtgtatcgc ctccgcccgg caccggacgg ctccctcctc 900

gacgccgcct tcgccgacct cctgcacgcg cacttctacg agtcctgccc ctacctcaag 960

ttcgcccact tcaccgcgaa ccaggccatc ctcgaggctt tcgccgggtg ccgccgcgtc 1020

cacgtcgtcg acttcggcat caagcagggg atgcagtggc cggctctcct ccaggccctc 1080

gccctccgcc ccggcggccc cccgtcgttc cgtctcaccg gcgtaggccc gccgcagccc 1140

gacgagaccg acgccctgca gcaggtgggc tggaagctcg cccagttcgc gcacaccatc 1200

cgcgtcgact tccagtaccg tggcctcgtc gccgccacgc tcgctgacct ggagccgttc 1260

atgctgcgac cggagggcgg cggcgacacg gacgacgagc ccgaggtgat cgccgtaaac 1320

tcggtgtgcg agctgcaccg gctgctcgcg cagcccggta cactcgacaa ggtcctgggc 1380

accgtgcgcg cggtgcggcc gaggatcgtg acggtggtgg agcaggaggc caaccacaac 1440

tccggcacat tcctcgaccg cttcacggag tcgctgcact actactccac catgttcgac 1500

tccctcgagg gcgccggctc aggctccggc tccggctccg gctccggcca gcccaccgac 1560

gcctccccgc cggccggcac ggaccaggtg atgtccgagg tgtacctcgg ccggcagatc 1620

tgcaacatcg tggcgtgcga gggcgccgag cgcacggagc gccacgagac gctggtccag 1680

tggcgcggcc gcctcggcgg gtccgggttc gagcccgtgc acctgggatc caacgcctac 1740

aagcaggcaa gcacgctgct ggccctcttc gccggcggcg acgggtacag ggtggaggag 1800

aaggacgggt gcctgactct gggatggcat acgcgcccgc tcatcgccac ctcggcgtgg 1860cgcgtcgccg ctccg 1875

<210> SEQ ID NO: 4<211> Comprimento: 1869<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 4

atgaagcgcg agtaccaaaa cgccggcggg agcgacggct acatggggtc ctccaaggac 60aagtcgatgg cggcggcggc gggggcaggg gagcaggagg aggaggtgga cgagctgctg 120gcggcgctcg ggtacaaggt gcgttcgtcg gatatggcgg acgtcgcgca gaagctagag 180cagctcgaga tggccatggg gatgggcggc gcctgcccca ccgctgatga cgggttcgtc 240tcgcacctcg ccacggacac cgtgcactac aatccctccg acctgtcgtc ctgggtcgag 300agcatgctat ccgagctcaa cacgcccccg ccgccgctcc cgcccgcgac gccggcacca 360aggctcgcgt ccacctcgtc caccgtcaca agtggcgccg ccgccggtgc cggctacttc 420

gatctcccgc ccgccgtcga ctcgtccagc agtacctacg ctctgaagcc gatcccctcg 480

ccggtggcgg cggcgtcggc cgacccgtcc ccggactcgg cgcgggagcc caagcggatg 540

cgaactggcg gcggcagcac gtcgtcgtcc tcttcctcgt cgtcatccat ggacggcggc 600

cgcactagga gctccgtggt cgaagctgcc ccgccggcga cgcaggcggc caacgggccc 660

gcggtgccgg tggtggtggt ggacacgcag gaggccggta tccggctggt gcacgcgctg 720

ctggcgtgcg cggaggccgt gcagcaggag aacttctctg cggcggacgc gctggtgaag 780

cagatccccg tgctggcctc gtcgcagggc ggcgccatgc gcaaggtcgc cgcctacttc 840

ggcgaggcgc tcgcccggcg cgtgtatcgc ctccgcccgg caccggacgg ctccctcctc 900

gacgccgcct tcgccgacct cctgcacgcg cacttctacg agtcctgccc ctacctcaag 960

ttcgcccact tcaccgcgaa ccaggccatc ctcgaggctt tcgccgggtg ccgccgcgtc 1020

cacgtcgtcg acttcggcat caagcagggg atgcagtggc cggctctcct ccaggccctc 1080

gccctccgcc ccggtggccc cccgtcgttc cgtctcaccg gcgtaggccc gccgcagccc 1140

gacgagaccg acgccctgca gcaggtgggc tggaagcttg cccagttcgc gcacaccatc 1200

cgcgtcgact tccagtaccg tggcctcgtc gccgccacgc tcgctgacct ggagccgttc 1260

atgctgcgac cggagggcga cggcgacacg gacgacgagc ccgaggtgat cgccgtaaac 1320

tcggtgtgcg agctgcaccg gctgctcgcg cagcccggta cactcgacaa ggtcctgggc 1380

accgtgcgcg cggtgcggcc gaggatcgtg acggtggtgg agcaggaggc caaccacaac 1440

tccggcacat tcctcgaccg cttcacggag tcgctgcact actactctac catgttcgac 1500

tccctcgagg gcgccggctc cggctccggc cagcccaccg acgcctcctc cccggccgcg 1560

gccggcggca cggaccaggt gatgtccgag gtgtacctcg ggcggcagat ctgcaacatc 1620

gtggcgtgcg agggcgccga gcgcacggag cgccacgaga cgctggtcca gtggcgcggc 1680

cgcctcggcg ggtccgggtt cgagcccgtg cacctgggct ccaacgccta caagcaggca 1740

agcacgctgc tggccctctt cgccggcggc gacgggtaca gggtggagaa gaaggacggg 1800

tgcctgactc tgggatggca tacgcgcccg ctcatcgcca cctcggcgtg gcgcgtcgcc 1860gctccgtga 1869

<210> SEQ ID NO: 5<211> Comprimento: 622<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 5

Met Lys Arg Glu Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Ser Asp Gly Tyr Met Gly

1 5 10 15

Ser Ser Lys Asp Lys Ser Met Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Glu Gln

20 25 30

Glu Glu Glu Val Asp Glu Leu Leu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Val Arg

35 40 45

Ser Ser Asp Met Ala Asp Val Ala Gln Lys Leu Glu Gln Leu Glu Met

50 55 60

Ala Met Gly Met Gly Gly Ala Cys Pro Thr Ala Asp Asp Gly Phe Val65 70 75 80

Ser His Leu Ala Thr Asp Thr Val His Tyr Asn Pro Ser Asp Leu Ser

85 90 95

Ser Trp Val Glu Ser Met Leu Ser Glu Leu Asn Thr Pro Pro Pro Pro

100 105 110

Leu Pro Pro Ala Thr Pro Ala Pro Arg Leu Ala Ser Thr Ser Ser Thr

115 120 125

Val Thr Ser Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Leu Pro Pro130 135 140Ala Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ala Leu Lys Pro

145 150 155

Pro Val Ala Ala Ala Ser Ala Asp Pro Ser Pro Asp Ser

165 170

Pro Lys Arg Met Arg Thr Gly Gly Gly Ser Thr Ser Ser

180 185

Ser Ser Ser Ser Met Asp Gly Gly Arg Thr Arg Ser Ser195 200 205

Ala Ala Pro Pro Ala Thr Gln Ala Ala Asn Gly Pro Ala

210 215 220

Val Val Val Asp Thr Gln Glu Ala Gly Ile Arg Leu Val225 230 235

Leu Ala Cys Ala Glu Ala Val Gln Gln Glu Asn Phe Ser

245 250

Ala Leu Val Lys Gln Ile Pro Val Leu Ala Ser Ser Gln

260 265

Met Arg Lys Val Ala Ala Tyr Phe Gly Glu Ala Leu Ala275 280 285

Tyr Arg Leu Arg Pro Ala Pro Asp Gly Ser Leu Leu Asp

290 295 300

Ala Asp Leu Leu His Ala His Phe Tyr Glu Ser Cys Pro305 310 315

Phe Ala His Phe Thr Ala Asn Gln Ala Ile Leu Glu Ala

325 330

Cys Arg Arg Val His Val Val Asp Phe Gly Ile Lys Gln

340 345

Trp Pro Ala Leu Leu Gln Ala Leu Ala Leu Arg Pro Gly355 360 365

Ser Phe Arg Leu Thr Gly Val Gly Pro Pro Gln Pro Asp

370 375 380

Ala Leu Gln Gln Val Gly Trp Lys Leu Ala Gln Phe Ala385 390 395

Arg Val Asp Phe Gln Tyr Arg Gly Leu Val Ala Ala Thr

405 410

Leu Glu Pro Phe Met Leu Arg Pro Glu Gly Asp Gly Asp

420 425

Glu Pro Glu Val Ile Ala Val Asn Ser Val Cys Glu Leu435 440 445

Leu Ala Gln Pro Gly Thr Leu Asp Lys Val Leu Gly Thr

450 455 460

Val Arg Pro Arg Ile Val Thr Val Val Glu Gln Glu Ala465 470 475

Ser Gly Thr Phe Leu Asp Arg Phe Thr Glu Ser Leu His

485 490

Thr Met Phe Asp Ser Leu Glu Gly Ala Gly Ser Gly Ser

500 505

Thr Asp Ala Ser Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gly Thr Asp515 520 525

Ser Glu Val Tyr Leu Gly Arg Gln Ile Cys Asn Ile Val

530 535 540

Gly Ala Glu Arg Thr Glu Arg His Glu Thr Leu Val Gln

Ile Pro Ser160

Ala Arg Glu

175Ser Ser Ser190

Val Val Glu

Val Pro Val

His Ala Leu240

Ala Ala Asp

255Gly Gly Ala270

Arg Arg Val

Ala Ala Phe

Tyr Leu Lys320

Phe Ala Gly

335Gly Met Gln350

Gly Pro Pro

Glu Thr Asp

His Thr Ile400

Leu Ala Asp415

Thr Asp Asp430

His Arg Leu

Val Arg Ala

Asn His Asn480

Tyr Tyr Ser495

Gly Gln Pro510

Gln Val MetAla Cys GluTrp Arg Gly545 550 555 560

Arg Leu Gly Gly Ser Gly Phe Glu Pro Val His Leu Gly Ser Asn Ala

565 570 575

Tyr Lys Gln Ala Ser Thr Leu Leu Ala Leu Phe Ala Gly Gly Asp Gly

580 585 590

Tyr Arg Val Glu Lys Lys Asp Gly Cys Leu Thr Leu Gly Trp His Thr

595 600 605

Arg Pro Leu Ile Ala Thr Ser Ala Trp Arg Val Ala Ala Pro610 615 620

<210> SEQ ID NO: 6<211> Comprimento: 1866<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays

<400> Seqüência: 6

atgaagcgcg agtaccaaaa cgccggcggg agcgacggct acatggggtc ctccaaggac 60

aagtcgatgg cggcggcggc gggggcaggg gagcaggagg aggaggtgga cgagctgctg 120

gcggcgctcg ggtacaaggt gcgttcgtcg gatatggcgg acgtcgcgca gaagctagag 180

cagctcgaga tggccatggg gatgggcggc gcctgcccca ccgctgatga cgggttcgtc 240

tcgcacctcg ccacggacac cgtgcactac aatccctccg acctgtcgtc ctgggtcgag 300

agcatgctat ccgagctcaa cacgcccccg ccgccgctcc cgcccgcgac gccggcacca 360

aggctcgcgt ccacctcgtc caccgtcaca agtggcgccg ccgccggtgc cggctacttc 420

gatctcccgc ccgccgtcga ctcgtccagc agtacctacg ctctgaagcc gatcccctcg 480

ccggtggcgg cggcgtcggc cgacccgtcc ccggactcgg cgcgggagcc caagcggatg 540

cgaactggcg gcggcagcac gtcgtcgtcc tcttcctcgt cgtcatccat ggacggcggc 600

cgcactagga gctccgtggt cgaagctgcc ccgccggcga cgcaggcggc caacgggccc 660

gcggtgccgg tggtggtggt ggacacgcag gaggccggta tccggctggt gcacgcgctg 720

ctggcgtgcg cggaggccgt gcagcaggag aacttctctg cggcggacgc gctggtgaag 780

cagatccccg tgctggcctc gtcgcagggc ggcgccatgc gcaaggtcgc cgcctacttc 840

ggcgaggcgc tcgcccggcg cgtgtatcgc ctccgcccgg caccggacgg ctccctcctc 900

gacgccgcct tcgccgacct cctgcacgcg cacttctacg agtcctgccc ctacctcaag 960

ttcgcccact tcaccgcgaa ccaggccatc ctcgaggctt tcgccgggtg ccgccgcgtc 1020

cacgtcgtcg acttcggcat caagcagggg atgcagtggc cggctctcct ccaggccctc 1080

gccctccgcc ccggtggccc cccgtcgttc cgtctcaccg gcgtaggccc gccgcagccc 1140

gacgagaccg acgccctgca gcaggtgggc tggaagcttg cccagttcgc gcacaccatc 1200

cgcgtcgact tccagtaccg tggcctcgtc gccgccacgc tcgctgacct ggagccgttc 1260

atgctgcgac cggagggcga cggcgacacg gacgacgagc ccgaggtgat cgccgtaaac 1320

tcggtgtgcg agctgcaccg gctgctcgcg cagcccggta cactcgacaa ggtcctgggc 1380

accgtgcgcg cggtgcggcc gaggatcgtg acggtggtgg agcaggaggc caaccacaac 1440

tccggcacat tcctcgaccg cttcacggag tcgctgcact actactctac catgttcgac 1500

tccctcgagg gcgccggctc cggctccggc cagcccaccg acgcctcctc cccggccgcg 1560

gccggcggca cggaccaggt gatgtccgag gtgtacctcg ggcggcagat ctgcaacatc 1620

gtggcgtgcg agggcgccga gcgcacggag cgccacgaga cgctggtcca gtggcgcggc 1680

cgcctcggcg ggtccgggtt cgagcccgtg cacctgggct ccaacgccta caagcaggca 1740

agcacgctgc tggccctctt cgccggcggc gacgggtaca gggtggagaa gaaggacggg 1800

tgcctgactc tgggatggca tacgcgcccg ctcatcgcca cctcggcgtg gcgcgtcgcc 1860gctccg 1866<210> SEQ ID NO: 7<211> Comprimento: 15<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<223> Outras Informações: seqüência indel<400> Seqüência: 7

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Pro Thr Asp Ala Ser Pro Pro Ala1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 8<211> Comprimento: 11<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<223> Outras Informações: seqüência indel

<400> Seqüência: 8

Gln Pro Thr Asp Ala Ser Ser Pro Ala Ala Gly1 5 10

Claims (32)

1. Polipeptideo isolado caracterizado pelo fato de quecompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada dogrupo que consiste em:(a) seqüência de aminoácidos compreendendo a SEQ IDNO: 2 ou 5;(b) seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos-93% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO: 2, emque o polipeptideo citado possui atividade Zm-D9;(c) seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos95% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO: 5, emque o polipeptideo citado possui atividade MUTl Zm-D9;(d) seqüência de aminoácidos codificada por umaseqüência de nucleotideos que hibridiza sob condiçõesestringentes com o complemento da SEQ ID NO: 1 ou 3,em que as referidas condições estringentes compreendemhibridização em 50% de formamida, IM NaCl, 1% SDS a-37 0C e uma lavagem em 0,1X SSC a uma temperaturaentre 60 0C e 65 0C;(e) seqüência de aminoácidos codificada por umaseqüência de nucleotideos que hibridiza sob condiçõesestringentes com o complemento da SEQ ID NO: 4 ou 6,em que as referidas condições estringentes compreendemhibridização em 50% de formamida, IM NaCl, 1% SDS a-37 °C e uma lavagem em O, IX SSC a uma temperaturaentre 60 °C e 65 °C;(f) seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos-124 aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 2, em que opolipeptideo citado retém atividade Zm-D9; e(g) seqüência de aminoácidos compreendendo pelo menos-124 aminoácidos da SEQ ID NO: 5, em que o polipeptideocitado retém atividade MUTl Zm-D9.

2. Polinucleotideo isolado caracterizado pelo fato de quecompreende uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo que consiste em:(a) seqüência de nucleotideos compreendendo a SEQ IDNO: 1, 3, 4 ou 6;(b) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2ou 5 ;(c) seqüência de nucleotideos que hibridiza sobcondições estringentes com o complemento da seqüênciade nucleotideos de (a) , em que as referidas condiçõesestringentes compreendem hibridização em 50% deformamida, IM NaCl, 1% SDS a 37 °C e uma lavagem em-0,1X SSC a uma temperatura entre 60 °C e 65 °C;(d) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 92% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-1 ou 3, em que a referida molécula de polinucleotideocodifica um polipeptideo que possua atividade Zm-D9;(e) seqüência de nucleotídeos compreendendo pelomenos 698 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 1 ou-3 ou um complemento destas;(f) seqüência de nucleotídeos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 93% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 2, em que areferida molécula de polinucleotídeo codifica umpolipeptídeo que possua atividade Zm-D9; e(g) seqüência de nucleotídeos compreendendo pelomenos 96% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-4 ou 6, em que a referida molécula de polinucleotídeocodifica um polipeptídeo que possua atividadeMUTl Zm-D9;(h) seqüência de nucleotídeos compreendendo pelomenos 395 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 4 ou-6 ou um complemento destas; e(i) seqüência de nucleotídeos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 5, em que areferida molécula de polinucleotídeo codifica umpolipeptídeo que possua atividade MUTl Zm-D9.

3. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de quecompreende a molécula de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 2.

4. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o a referida molécula depolinucleotídeo está operacionalmente ligada a um promotorque dirige a expressão em uma planta.

5. Célula hospedeira não-humana caracterizada pelo fatode que compreende o cassete de expressão de acordo com areivindicação 3 ou 4.

6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que tal célula hospedeira é umacélula vegetal, célula bacteriana ou célula fúngica.

7. Planta caracterizada pelo fato de que compreende umamolécula de polinucleotídeo operacionalmente ligada a umpromotor que dirige a expressão na planta, em que areferida molécula de polinucleotídeo compreende umaseqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consisteem:(a) seqüência de nucleotídeos compreendendo a SEQ IDNO: 1, 3, 4 ou 6;(b) seqüência de nucleotídeos codificando umaseqüência de aminoácidos que compreenda a SEQ ID NO: 2ou 5;(c) seqüência de nucleotídeos que hibridiza sobcondições estringentes com o complemento da seqüênciade nucleotídeos de (a) , em que as condiçõesestringentes citadas compreendem hibridização em 50%de formamida, IM NaCl, 1% SDS a 37 °C e uma lavagem em- 0,1X SSC a uma temperatura entre 60 °C e 65 °C;(d) seqüência de nucleotídeos compreendendo pelomenos 92% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-1 ou 3, em que a referida molécula de polinucleotídeocodifica um polipeptideo que possua atividade Zm-D9;(e) seqüência de nucleotídeos compreendendo pelomenos 698 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 1 ouou um complemento destas;(f) seqüência de nucleotídeos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 93% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 2, em que areferida molécula de polinucleotídeo codifica umpolipeptideo que possua atividade Zm-D9; e(g) seqüência de nucleotídeos compreendendo pelomenos 96% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-4 ou 6, em que a referida molécula de polinucleotídeocodifica um polipeptideo que possua atividadeMUTl Zm-D9;(h) seqüência de nucleotídeos compreendendo pelomenos 395 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 4 ou-6 ou um complemento destas; e(i) seqüência de nucleotídeos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 5, em que areferida molécula de polinucleotídeo codifica umpolipeptideo que tenha atividade MUTl Zm-D9.

8. Planta de acordo com a reivindicação 7, caracterizadafato de que a planta citada é uma célula.

9. Planta de acordo com a reivindicação 7, caracterizadapelo fato de que a planta citada é uma monocotiledônea.

10. Planta de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que a monocotiledônea citada é selecionada dogrupo que consiste em milho, trigo, arroz, sorgo, centeio,painço e cevada.

11. Planta de acordo com a reivindicação 7, caracterizadapelo fato de que a planta citada é uma dicotiledônea.

12. Planta de acordo com a reivindicação 11, caracterizadapelo fato de que a dicotiledônea citada é selecionada dogrupo que consiste em Arabidopsis, soja, girassol, cártamo,alfafa, Brassica, algodão e amendoim.

13. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 7 a 12, caracterizada pelo fato de que a referidamolécula de polinucleotideo está incorporada de maneiraestável no genoma da planta.

14. Planta de acordo com a reivindicação 13, caracterizadapelo fato de que a planta citada é uma semente.

15. Método para aumentar o nivel de um polipeptídeo em umaplanta caracterizado pelo fato de que compreende introduzirna planta citada uma molécula de polinucleotideocompreendendo uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo que consiste em:(a) seqüência de nucleotideos compreendendo a SEQ IDNO: 1, 3, 4 ou 6;(b) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou 5;(c) seqüência de nucleotideos que hibridiza sobcondições estringentes com o complemento da seqüênciade nucleotideos de (a), em que as condiçõesestringentes citadas compreendem hibridização em 50%de formamida, IM NaCl, 1% SDS a 37 0C e uma lavagem em-0,IX SSC a uma temperatura entre 60 0C e 65 °C;(d) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 92% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-1 ou 3, em que a referida molécula de polinucleotideocodifica um polipeptideo que possua atividade Zm-D9;(e) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 698 nucleotideos consecutivos da SEQ ID NO: 1 ou-3 ou um complemento destas;(f) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 93% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 2, em que areferida molécula de polinucleotideo codifica umpolipeptideo que possui atividade Zm-D9; e(g) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 96% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-4 ou 6, em que a referida molécula de polinucleotideocodifica um polipeptideo que tenha atividadeMUTl Zm-D9;(h) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 395 nucleotideos consecutivos da SEQ ID NO: 4 ou-6 ou um complemento destas; e(i) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 5, em que areferida molécula de polinucleotideo codifica umpolipeptideo que possua atividade MUTl Zm-D9.

16. Método para modular o nivel de um polipeptideo em umaplanta caracterizado pelo fato de que compreende introduzirna planta citada uma molécula de polinucleotideocompreendendo uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo que consiste em:(a) seqüência de nucleotideos compreendendo a SEQ IDNO: 1, 3, 4 ou 6;(b) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2ou 5 ;(c) seqüência de nucleotideos que hibridiza sobcondições estringentes com o complemento da seqüênciade nucleotideos de (a) , em que as condiçõesestringentes citadas compreendem hibridização em 50%de formamida, IM NaCl, 1% SDS a 37 °C e uma lavagem em-0,1X SSC a uma temperatura entre 60 °C e 65 °C;(d) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 92% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-1 ou 3, em que a referida molécula de polinucleotideocodifica um polipeptideo que possua atividade Zm-D9;(e) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 698 nucleotideos consecutivos da SEQ ID NO: 1 ou-3 ou um complemento destas;(f) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 93% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 2, em que areferida molécula de polinucleotideo codifica umpolipeptideo que possua atividade Zm-D9; e(g) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 96% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-4 ou 6, em que a referida molécula de polinucleotideocodifica um polipeptideo que possua atividadeMUTl Zm-D9;(h) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 395 nucleotideos consecutivos da SEQ ID NO: 4 ou-6 ou um complemento destas; e(i) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 95% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 5, em que areferida molécula de polinucleotideo codifica umpolipeptideo que possua atividade MUTl Zm-D9.

17. Método de acordo com as reivindicações 15 ou 16,caracterizado pelo fato de que a referida molécula depolinucleotideo está integrada de modo estável no genoma daplanta.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 15 a 17, caracterizado pelo fato de que a planta citadaé uma célula vegetal.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 15 a 17, caracterizado pelo fato de que a planta citadaé uma dicotiledônea.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a dicotiledônea citada é selecionada dogrupo que consiste em Arabidopsis, soja, girassol, cártamo,alfafa, Brassica, algodão e amendoim.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 15 a 17, caracterizado pelo fato de que a planta citadaé uma monocotiledônea.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a monocotiledônea citada é selecionada dogrupo que consiste em milho, trigo, arroz, sorgo, centeio,painço e cevada.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, caracterizado pelo fato de que a planta citada é uma semente.

24. Método para modificar o crescimento de uma plantacaracterizado pelo fato de que o método citado compreendetransformar um organismo com uma construção depolinucleotideos compreendendo uma seqüência denucleotideos operacionalmente ligada a um promotor capaz dedirigir a expressão da seqüência de nucleotideos citada noorganismo citado, em que a seqüência de nucleotideos citadaé selecionada do grupo que consiste em:(a) seqüência de nucleotideos compreendendo a SEQ IDNO: 1, 3, 4 ou 6;(b) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2ou 5;(c) seqüência de nucleotideos que hibridiza sobcondições estringentes com o complemento da seqüênciade nucleotideos de (a) , em que as condiçõesestringentes citadas compreendem hibridização em 50%de formamida, IM NaCl, 1% SDS a 37 0C e uma lavagem em-0, IX SSC a uma temperatura entre 60 0C e 65 °C;(d) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 92% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-1 ou 3, em que a referida molécula de polinucleotideocodifica um polipeptideo que possua atividade Zm-D9;(e) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 698 nucleotideos consecutivos da SEQ ID NO: 1 ou-3 ou um complemento destas;(f) seqüência de nucleotideos codificando umaseqüência de aminoácidos tendo pelo menos 93% deidentidade de seqüência com a SEQ ID NO: 2, em que areferida molécula de polinucleotideo codifica umpolipeptideo que possua atividade Zm-D9; e(g) seqüência de nucleotideos compreendendo pelomenos 96% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO:-4 ou 6, em que a referida molécula de polinucleotideocodifica um polipeptideo que possua atividadeMUTl Zm-D9.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de a seqüência de nucleotideos citada estáoperacionalmente ligada ao promotor citado para a produçãode transcritos antisense.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a altura da planta citada diminui quandocomparada com uma planta não transformada.

27. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a altura da planta citada aumenta quandocomparada com uma planta não transformada.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a arquitetura de raiz da planta citada émodificada quando comparada com uma planta nãotransformada.

29. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a planta citada é uma monocotiledônea.

30. Método de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que a monocotiledônea citada éselecionada do grupo que consiste em milho, trigo, arroz,sorgo, centeio, painço e cevada.

31. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a planta citada é uma dicotiledônea.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a dicotiledônea citada é selecionada dogrupo que consiste em Arabidopsist soja, girassol, cártamo,Brassica, algodão e amendoim.