BRPI0710482A2

BRPI0710482A2 - métodos para seleção de alto rendimento de linhagens celulares

Info

Publication number: BRPI0710482A2
Application number: BRPI0710482-0A
Authority: BR
Inventors: Judy H Chou; Peter Franchi; Sarah Koob; Nadine Barron
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2011-08-16
Also published as: US20070287160A1; EP2035455A2; WO2007124143A3; CN101472947A; CA2649295A1; AU2007240624A1; WO2007124143A2; MX2008013394A; JP2009534035A; EP2035455A4

Abstract

<B>MéTODOS PARA SELEçãO DE ALTO RENDIMENTO DE LINHAGENS CELULARES<D>. Trata-se de métodos de seleção de alto rendimento de linhagens celulares para uso em expressão protéica em alguns processos farmacêuticos, de desenvolvimento de fármaco, e biotecnológicos de modo que as linhagens celulares de alta produtividade sejam identificadas em termos de sua capacidade de produzir tanto níveis desejados de expressão protéica como qualidade apropriada de uma proteína de interesse.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA SELEÇÃO DE ALTO RENDIMENTO DE LINHAGENS CELULARES"

Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido Provi-sório No. U.S. 60/793.991, depositado em 21 de abril de 2006, cujo relatóriodescritivo está incorporado a título de referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se geralmente à área farmacêutica.Mais especificamente, a invenção pertence a métodos para seleção de Ii-nhagens celulares em termos de capacidade de produzir quantidades sufici-entes e qualidade comparável de proteína para produção em escala indus-trial.

Antecedentes da Invenção

A tecnologia de alto rendimento se tornou uma ferramenta im-portante em pesquisa farmacêutica e biotecnológica. As metodologias analí-ticas de alto rendimento utilizam procedimentos automatizados para analisarrapidamente a atividade de proteínas, o nível de expressão de proteína, ex-pressão genética, e a quantidade indeterminada de interações químicas queocorrem em um sistema biológico. Os dados gerados por essas metodologi-as e tecnologias foram propostos para uso em uma ampla gama de campos,tais como, pesquisa de câncer, descoberta de fármaco, e cristalografia (veja,por exemplo, Abramovitz et al. (2006) Proteome Sei. 4(1): 5 [Epub ahead ofprint]).

As análises de alto rendimento dependem da capacidade deperceber uma interação química ou composto particular a partir de uma am-pla variedade de reações químicas que ocorrem em um sistema. As tecno-logias de alto rendimento foram usadas para sondar as interações químicasespecíficas e níveis de expressão de milhares de genes em um curto perío-do de tempo. Para realizar essa difícil tarefa, certas técnicas foram desen-volvidas para utilizar sinais moleculares (por exemplo, fluoróforos) e análisesautomatizadas para processar informações em uma taxa bastante rápida(veja, por exemplo., Pinhasov et al. (2004) Comb. Chem. High ThroughputScreen. 7(2): 133-40). Por exemplo, a tecnologia microarranjo vem sendoamplamente utilizada para sondar as interações de milhares de genes aomesmo tempo, enquanto proporciona informações valiosas de genes especí-ficos (veja, por exemplo, Mocellin and Rossi (2007) Adv. Exp. Med. Bioi593:19-30).

Nos últimos anos, a purificação e expressão protéica de altorendimento tanto automática como manual se tornou um meio acessível pa-ra selecionar e produzir rapidamente proteínas solúveis para estudos estru-turais e funcionais (veja Cabrita et al. (2006) BMC Biotechnol. 6: 12). Os de-senvolvimentos, tais como, ensaios baseados em placa de filtro para clona-gem, expressão e purificação, clonagem independente de ligação (LIC), eauto-indução para expressão protéica foram combinados com sistemas au-tomáticos para criar técnicas de produção paralela de proteínas que sãosimples e econômicas (veja, Cabrita et al. (2006) BMC Biotechnol. 6: 12; As-lanidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(20): 6069-6074). Essas aborda-gens forneceram aos pesquisadores ferramentas poderosas para produzirproteínas em níveis de escala industrial para uso em farmacêutica e desen-volvimento de fármacos.

Entretanto, a purificação e expressão de proteínas de célulasparticulares apresentam dificuldades particulares. Uma vez que uma proteí-na de interesse foi identificada, é mais difícil se obter quantidades significati-vas daquela proteína em uma forma purificada. Como resultado, as linha-gens celulares que produzem proteínas recombinantes são usadas paraproduzir proteínas em quantidades suficientes para desenvolvimento industrial.

Embora as linhagens celulares possam fornecer aos pesquisa-dores a oportunidade de produzir grandes quantidades de uma proteína par-ticular, essas nem sempre são eficazes produtoras de proteínas. Certos clo-nes de linhagem celular podem produzir níveis subótimos de proteína. Ou-tros clones de linhagem celular podem produzir níveis ótimos de expressãoprotéica, porém deixaram de produzir um grupo (pool) completamente fun-cional de proteínas devido à modificação pós-traducional tanto com má for-mação estrutural como inapropriada. Tais questões podem resultar em per-da de tempo e recursos durante o desenvolvimento de um composto biologi-camente relevante. Portanto, são necessárias metodologias de seleção dealto rendimento que fornecem informações de maneira rápida e confiável sobre a qualidade e quantidade de uma proteína expressa em uma linhagemcelular particular. A presente invenção se refere a essas e outras finalidadesimportantes.

Sumário da Invenção

Ao analisar os níveis de expressão de uma proteína de interesseem uma linhagem celular antes de iniciar a produção em escala completa da proteína de interesse, não serão desperdiçados tempo e recursos significati-vos sobre linhagens celulares que possuem qualidade insuficiente para ex-pressão de proteína de alto rendimento. A presente invenção se baseia, emparte, na descoberta que procedimentos de seleção de alto rendimento e procedimentos de purificação de alto rendimento podem ser realizados paradeterminar as linhagens celulares que produzem quantidades suficientes deuma proteína de interesse. Ademais, esses procedimentos podem ser utili-zados para selecionar as linhagens celulares candidatas para determinar seessas produzem a proteína de interesse com uma qualidade desejada, por exemplo, atividade biológica. Essas técnicas de seleção de alto rendimentoe purificação de alto rendimento (mais adiante neste documento referida jun-tamente como "seleção de alto rendimento") são, portanto, métodos valiosospara determinar as linhagens celulares adequadas de se utilizar em expres-são protéica em escala industrial. Essa descoberta foi utilizada para propor- cionar uma invenção que permita o uso de métodos de seleção de alto ren-dimento para identificar linhagens celulares que são úteis para produção emescala industrial de uma proteína de interesse.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método de seleçãode alto rendimento de linhagens celulares para expressão protéica. O méto-do inclui a seleção de título de alto rendimento de linhagens celulares paradeterminar o nível de expressão protéica em cada linhagem celular. As li-nhagens celulares que produzem um nível desejado de expressão protéicasão selecionadas para purificação de alto rendimento subseqüente da prote-ína. A linhagem celular é selecionada para expressão protéica se a linhagemcelular produzir um nível desejado de expressão protéica e possuir uma qua-lidade apropriada.

Em algumas modalidades, a proteína é um anticorpo, ligante,receptor, subunidade de proteína, fragmento de proteína, proteína de fusão,proteína recombinante, e fragmento dessas. Em certas modalidades, a pro-teína é um anticorpo, um anticorpo recombinante, ou um fragmento F(ab')2.

Em outras modalidades, o primeiro agente de ligação é selecio-nado do grupo que consiste em anticorpos, ligantes, receptores, proteínasde fusão, subunidades de proteínas, proteínas recombinantes, e fragmentosdesses. Em modalidades particulares, o primeiro agente de ligação é a Pro-teína A ou estreptavidina. Ainda em outras modalidades, os agentes de liga-ção podem ser ligados a um suporte sólido, tais como, microesferas, placas,e chips de microarranjo. Em muitas modalidades, o suporte sólido compre-ende celulose, sefarose, poliacrilamida, vidro ou poliestireno.

Em outras modalidades, o segundo agente de ligação é selecio-nado do grupo que consiste em anticorpos, ligantes, receptores, proteínasde fusão, subunidades de proteínas, proteínas recombinantes, e fragmentosdessas. Em modalidades particulares, o segundo agente de ligação é umanticorpo e fragmentos desse. Em modalidades mais particulares, o anticor-po é um fragmento F(ab')2, e ainda mais particularmente é um fragmentoF(ab')2 que se liga especificamente à parte Fc de um anticorpo.

Ainda em outras modalidades, o marcador detectável é um fluo-róforo, corante químico, agente de ligação radioativo, agente de ligaçãoquimiluminescente, agente eletroqumiluminescente, agente de ligação mag-nética, agente de ligação paramagnética, agente de ligação promagnética,enzima que produz um produto colorido, enzima que produz um produtoquimiluminescente, e enzima que produz um produto magnético. Em moda-lidades muito particulares, o marcador detectável é rutênio ou múltiplos mar-cadores à base de rutênio.

Em algumas modalidades, o reagente compreende uma resina,que, em modalidades particulares, possui um terceiro agente de ligação li-gado a esse. Em certas modalidades, o terceiro agente de ligação é selecio-nado do grupo que consiste em anticorpos, ligantes, receptores, proteínasde fusão, subunidades de proteínas, proteínas recombinantes, e fragmentosdesses. Enquanto que em modalidades particulares, o terceiro agente deligação é Proteína A ou estreptavidina. Em algumas modalidades, a proteínaé eluída do reagente utilizando vácuo. Em outras modalidades, a proteína éeluída por centrifugação. Ainda em outras modalidades, a proteína é eluídapor fluxo de gravidade através da resina. Em muitas modalidades, a seleçãodas linhagens celulares incubadas utiliza uma estação de trabalho automáti-I ca.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de sele-ção de alto rendimento de linhagens celulares para expressão protéica. Ométodo inclui uma etapa para incubar linhagens celulares em meio, e colo-car um suporte sólido em contato com uma amostra de cada linhagem celu-lar incubada. Nesse aspecto, o suporte sólido liga à sua superfície um pri-meiro agente de ligação que se liga a uma proteína em cada amostra. A pro-teína que é ligada pelo primeiro agente de ligação entra em contato com umsegundo agente de ligação, que é ligado de maneira operável a um marca-dor detectável, que se liga à proteína. O nível de expressão protéica em ca-da amostra é determinado ao detectar o marcador ligado de maneira operá-vel ao segundo agente de ligação ligado à proteína. O método também incluia seleção das linhagens celulares que possuem um nível desejado de ex-pressão protéica. Em alguns casos, isso será determinado ao comparar onível de expressão protéica em cada linhagem celular com o nível médio deexpressão protéica em todas as linhagens celulares. Por exemplo, um nívelaumentado de expressão protéica comparado com o nível médio de expres-são protéica em todas as linhagens celulares poderia ser o nível desejadode expressão protéica. Alternativamente, um nível reduzido de expressãoprotéica poderia ser o nível desejado de expressão protéica, que tambémpoderia ser determinado ao comparar o nível de expressão protéica em cadalinhagem celular selecionada com o nível médio de expressão protéica emtodas as linhagens celulares.

O método desse aspecto da invenção exige adicionalmente iso-lar os sobrenadantes das linhagens celulares selecionadas, e distribuir cadasobrenadante a um poço de uma placa com múltiplos poços. Os sobrena-dantes entram então em contato com um reagente que se liga à proteína. Aproteína é eluída do reagente e analisada para qualidade apropriada. Deacordo com esse aspecto da invenção, uma linhagem celular é selecionadapara expressão protéica se a linhagem celular for selecionada na etapa e) ea proteína expressa pela linhagem celular possuir qualidade apropriada. Emalgumas modalidades, a proteína é um anticorpo, ligante, receptor, subuni-dade de proteína, fragmento de proteína, proteína de fusão, proteína recom-binante, e fragmento desses. Em certas modalidades, a proteína é um anti-corpo, um anticorpo recombinante, ou um fragmento F(ab')2.

Em outras modalidades, o primeiro agente de ligação é selecio-nado do grupo que consiste em anticorpos, ligantes, receptores, proteínasde fusão, subunidades de proteínas, proteínas recombinantes, e fragmentosdesses. Em modalidades particulares, o primeiro agente de ligação é Proteí-na A ou estreptavidina. Ainda em outras modalidades, os agentes de ligaçãopodem ser ligados a um suporte sólido, tais como, microesferas, placas, echips de microarranjo. Em muitas modalidades, o suporte sólido compreen-de celulose, sefarose, poliacrilamida, vidro ou poliestireno.

Em outras modalidades, o segundo agente de ligação é selecio-nado do grupo que consiste em anticorpos, ligantes, receptores, proteínasde fusão, subunidades de proteínas, proteínas recombinantes, e fragmentosdesses. Em modalidades particulares, o segundo agente de ligação é umanticorpo e fragmentos desse. Em modalidades mais particulares, o anticor-po é um fragmento F(ab')2, e ainda mais particularmente é um fragmentoF(ab')2 que se liga especificamente à parte Fc de um anticorpo.

Ainda em outras modalidades, o marcador detectável é um fluo-róforo, corante químico, agente de ligação radioativo, agente de ligação qui-emiluminescente, agente eletroqumiluminescente, agente de ligação magné-tica, agente de ligação paramagnética, agente de ligação promagnética, en-zima que produz um produto colorido, enzima que produz um produto quimi-luminescente, e enzima que produz um produto magnético. Em modalidadesmuito particulares, o marcador detectável é rutênio ou múltiplos marcadoresà base de rutênio.

Em algumas modalidades, o reagente compreende uma resina,que, em modalidades particulares, possui um terceiro agente de ligação li-gado a esse. Em certas modalidades, o terceiro agente de ligação é selecio-nado do grupo que consiste em anticorpos, ligantes, receptores, proteínasde fusão, subunidades de proteínas, proteínas recombinantes, e fragmentosdesses. Enquanto que em modalidades particulares, o terceiro agente deI ligação é Proteína A ou estreptavidina. Em algumas modalidades, a proteínaé eluída do reagente utilizando vácuo. Em outras modalidades, a seleçãodas linhagens celulares incubadas utiliza uma estação de trabalho automáti-ca.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de de-senvolvimento de processo de cultura celular. O método inclui uma etapapara incubar cada linhagem celular em uma condição diferente que será tes-tada. As amostras de linhagem celular são então colocadas em contato comum suporte sólido de cada linhagem celular de cada condição diferente.Nesse aspecto, o suporte sólido liga à sua superfície um primeiro agente deligação que se liga a uma proteína em cada amostra. A proteína que é ligadapelo primeiro agente de ligação entra em contato com um segundo agentede ligação, que é ligado de maneira operável a um marcador detectável, quese liga à proteína. O nível de expressão protéica em cada amostra é deter-minado ao detectar o marcador ligado de maneira operável ao segundo a-gente de ligação ligado à proteína. O método também inclui a seleção daslinhagens celulares que possuem um nível desejado de expressão protéica.Em alguns casos, isso será determinado ao comparar o nível de expressãoprotéica em cada linhagem celular com o nível médio de expressão protéicaem todas as linhagens celulares. Por exemplo, um nível aumentado de ex-pressão protéica comparado com o nível aumentado de expressão protéicacomparado com o nível médio de expressão em todas as linhagens célula-res poderia ser o nível desejado de expressão protéica. Alternativamente,um nível reduzido de expressão protéica poderia ser o nível desejado deexpressão protéica, que também poderia ser determinado ao comparar onível de expressão protéica em cada linhagem celular selecionada com onível médio de expressão protéica em todas as linhagens celulares.

O método desse aspecto da invenção exige adicionalmente iso-lar os sobrenadantes das linhagens celulares selecionadas, e distribuir cadasobrenadante a um poço de uma placa com múltiplos poços. Os sobrena-dantes entram então em contato com um reagente que se liga à proteína. Aproteína é eluída do reagente e analisada para qualidade apropriada. Deacordo com esse aspecto da invenção, uma condição de cultura celular a-dequada é identificada se a quantidade e qualidade de proteína foram aper-feiçoadas comparadas com outras condições testadas.

Em outras modalidades, o segundo agente de ligação é selecio-nado do grupo que consiste em anticorpos, ligantes, receptores, proteínasde fusão, subunidades de proteínas, proteínas recombinantes, e fragmentosdesses. Em modalidades particulares, o segundo agente de ligação é umanticorpo e fragmentos desse. Em modalidades ainda mais particulares, oanticorpo é um fragmento F(ab')2, e ainda mais particularmente é um frag-mento F(ab')2 que se liga especificamente à parte Fc de um anticorpo.

Em algumas modalidades, o reagente compreende uma resina,que, em modalidades particulares, possui um terceiro agente de ligação li-gado a esse. Em certas modalidades, o terceiro agente de ligação é selecio-nado do grupo que consiste em anticorpos, ligantes, receptores, proteínasde fusão, subunidades de proteínas, proteínas recombinantes, e fragmentosdesses. Enquanto que em modalidades particulares, o terceiro agente deligação é Proteína A ou estreptavidina. Em muitas modalidades, a proteína éeluída do reagente utilizando vácuo. Em muitas modalidades, a seleção daslinhagens celulares incubadas utiliza uma estação de trabalho automática.

Em certas modalidades, a condição que será testada é o meiode crescimento celular. Em outras modalidades, a condição que será testadaé a temperatura. Ainda em outras modalidades, a condição que será testadaé a umidade. Ainda em mais modalidades, a condição que será testada é apressão. Ainda em mais modalidades, a condição que será testada é a pres-são de oxigênio.

Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um método pa-ra a seleção de alto rendimento de linhagens celulares para produção deproteína. O método inclui uma primeira etapa para incubar as linhagens ce-lulares em meio. Uma amostra de cada linhagem celular é colocada sobreum suporte sólido, ou seja, o suporte sólido é colocado em contato com ca-da amostra. Deve ser observado que o suporte sólido possui um primeiroagente de ligação ligado à sua superfície que se liga a uma proteína em ca-da amostra. O primeiro agente de ligação liga a proteína na amostra de célu-la. A proteína entra em contato com um segundo agente de ligação, que éligado de maneira operável a um marcador detectável, que se liga à proteí-na. O nível de expressão protéica é determinado em cada amostra ao detec-tar o marcador ligado de maneira operável ao segundo agente de ligaçãoligado à proteína. As linhagens celulares são selecionadas para produção deproteína baseado na possibilidade de a linhagem celular possuir um níveldesejado de expressão protéica quando comparado com o nível médio deexpressão protéica nas linhagens celulares selecionadas.

Em algumas modalidades, a proteína é um anticorpo, ligante,receptor, subunidade de proteína, fragmento de proteína, proteína de fusão,proteína recombinante, e fragmento desses. Em certas modalidades, a pro-teína é um anticorpo, um anticorpo recombinante, ou um fragmento F(ab')2.

Ainda em outras modalidades, o marcador detectável é um fluo-róforo, corante químico, agente de ligação radioativo, agente de ligação qui-emiluminescente, agente eletroqumiluminescente, agente de ligação magné-tica, agente de ligação paramagnética, agente de ligação promagnética, en-zima que produz um produto colorido, enzima que produz um produto quimi-luminescente1 e enzima que produz um produto magnético. Em modalidadesmuito particulares, o marcador detectável é rutênio ou múltiplos marcadoresà base de rutênio. Em certas modalidades, o método compreende adicio-nalmente um teste de ácido siálico.Breve Descrição das figurasA descrição anterior e outros objetivos da presente invenção, asvárias características dessa, bem como a própria invenção podem ser maiscompletamente entendidos a partir da seguinte descrição, quando lida jun-tamente com os desenhos em anexo, nos quais:

A figura 1 é uma representação pictórica de um teste de expres-são protéica de alto rendimento que mostra a detecção de um anticorpo emuma amostra de célula.

A figura 2 é uma representação gráfica de um teste de seleçãode alto rendimento que mostra a razão de sinal para fundo utilizando váriosfragmentos F(ab')2 conjugados com rutênio.

A figura 3 é uma representação gráfica de um teste de seleçãode alto rendimento que mostra a razão de sinal para fundo utilizando váriosfragmentos F(ab')2 conjugados com rutênio.

A figura 4 é uma representação gráfica de um plano que mostraa sensibilidade de testes de seleção de alto rendimento para detectarGP1ba, receptor ILI3, e proteína de fusão TNFR em concentrações diferen-tes.

A figura 5 é uma representação gráfica de um plano que mostraa sensibilidade de testes de seleção de alto rendimento para detectar anti-corpos anti-GDF8, anti-CD22, e anti-Lewis Y em concentrações diferentes.

A figura 6 é uma representação gráfica de um plano que mostrao tempo de teste requerido para o teste de seleção de título de alto rendi-mento e um teste HPLC.

A figura 7 é uma representação gráfica que mostra uma compa-ração entre o teste de seleção de alto rendimento e HPLC na determinaçãodos níveos de proteína de fusão TNFR nas amostras.

A figura 8 é uma representação gráfica que mostra os níveis deexpressão em clones como determinado por um teste de seleção de título dealto rendimento.

A figura 9 é uma representação gráfica que mostra uma compa-ração entre o teste de seleção de alto rendimento e HPLC na determinaçãodos níveis de anticorpos anti-Lewis Y nas amostras.A figura 10 é uma representação gráfica que mostra uma com-paração entre o teste de seleção de alto rendimento e HPLC na determina-ção dos níveis de PSGL e GPIba nas amostras.

A figura 11 é uma representação gráfica que mostra uma com-paração entre o teste de seleção de alto rendimento e HPLC na determina-ção dos níveis de anti-Αβ nas amostras.

A figura 12 é uma representação gráfica que mostra a porcenta-gem de proteína de alto peso molecular encontrada em amostras purificadasutilizando procedimentos de purificação diferentes.

A figura 13 é uma representação gráfica que mostra a porcenta-gem de proteína de alto peso molecular encontrada em amostras purificadasutilizando procedimentos de purificação diferentes.

A figura 14 é uma representação gráfica de um gráfico de barrasque mostra a quantidade de proteína de alto peso molecular encontrada emamostras isoladas de linhagens celulares diferentes desenvolvidas em con-dições diferentes.

Descrição Detalhada da Invenção

A patente e literatura científica referidas aqui estabelecem o co-nhecimento que está disponível aos elementos versados na técnica. As pa-tentes US depositadas, pedidos autorizados, pedidos estrangeiros publica-dos, e referências, inclusive seqüências de banco de dados do GenBank,que são citados aqui estão incorporados a título de referência com a mesmaabrangência como se cada um estivesse específica e individualmente indi-cado para ser incorporado a título de referência.1.1. Geral

Uma modalidade da presente invenção, em parte, proporcionamétodos para selecionar linhagens celulares em termos de capacidade deproduzir uma proteína de interesse. A invenção também descreve processosem termos de eficiência aprimorada na produção em escala industrial deproteínas para estudos farmacêuticos e biológicos. Em particular, a presenteinvenção permite a produção eficaz de proteínas que podem ser utilizadasem tratamentos farmacêuticos de doenças, tais como, câncer, doença deAlzheimer, e diabetes. Além disso, as modalidades da invenção proporcio-nam um método para a seleção de alto rendimento de linhagens celularespara determinar a quantidade e qualidade de uma proteína de interesse pro-duzida pelas linhagens celulares.

Consequentemente, um aspecto da invenção proporciona ummétodo de seleção de alto rendimento de linhagens celulares para expres-são protéica. O método utiliza um primeiro agente de ligação que se liga àproteína de interesse e um segundo agente de ligação que é ligado de ma-neira operável a um marcador detectável que se liga à proteína de interesse.Em algumas modalidades, o primeiro agente de ligação é ligado a um supor-ei te sólido, tais como, microesfera, microesfera magnética, uma placa, ou chipde microarranjo. O método também usa um reagente que se liga à proteínade interesse, e permite que a proteína seja purificada a partir de uma amos-tra derivada da linhagem celular. Em algumas modalidades da invenção, aproteína é purificada a partir do reagente por meio de um vácuo que removea proteína eluída do reagente e por meio de um filtro. Ainda em outras mo-dalidades, a solução é permitida para fluir através do reagente por fluxo degravidade.

Como usado aqui, o termo "proteína terapêutica" é uma proteínaou peptídeo que possui um efeito biológico sobre uma região no corpo ondeessa atua ou sobre uma região do corpo onde essa atua remotamente atra-vés de intermediários. Uma proteína terapêutica pode ser, por exemplo, umaproteína secretada, tal como, um anticorpo, um fragmento de ligação a antí-geno de um anticorpo, um receptor solúvel, uma fusão de receptor, uma ci-tocina, um fator de crescimento, uma enzima, ou um fator de coagulação,como descrito em mais detalhes abaixo no presente documento. A lista aci-ma de proteínas é meramente exemplificativa em natureza, e não se destinaa ser uma recitação limitativa. Um elemento versado na técnica irá entenderque qualquer proteína pode ser usada de acordo com a presente invenção eserá capaz de selecionar a proteína particular que será produzida conformenecessário.

Como usado aqui no relatório descritivo, os termos polipeptídeo,proteína e peptídeo são sinônimos e são usados de maneira intercambiável.Consequentemente, como usado aqui, o tamanho de uma proteína, peptídeoou polipeptídeo geralmente compreende mais de 2 aminoácidos. Por exem-plo, uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo pode compreender de cerca de2 a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 20 a cerca de 40 aminoácidos, decerca de 40 a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 100 aminoácidos acerca de 200 aminoácidos, de cerca de 200 aminoácidos a cerca de 300 a-minoácidos, e assim por diante.

Como usado aqui, um aminoácido se refere a qualquer aminoá-cido naturalmente ocorrente, qualquer derivado de aminoácido ou qualquermimetizador de aminoácido conhecido na técnica. Em certas modalidades,os resíduos da proteína ou peptídeo são seqüenciais, sendo que nenhumnão-aminoácido interrompe a seqüência de resíduos de aminoácido. Em ou-tras modalidades, a seqüência pode compreender uma ou mais porções denão-aminoácido. Em modalidades particulares, a seqüência de resíduos daproteína ou peptídeo pode ser interrompida por uma ou mais porções denão-aminoácido.

Como usado aqui, o termo "anticorpo" é usado para se referir aqualquer molécula tipo anticorpo que possui uma região de ligação de antí-geno, e inclui fragmentos de anticorpo, tais como, Fab', Fab, F(ab').sub.2,anticorpos de domínio único (DABs), Fv, scFv (Fv de cadeia simples), e simi-lares. As técnicas para preparar e utilizar várias construções à base de anti-corpo são bem conhecidas. Os meios para preparar e caracterizar os anti-corpos também são bem conhecidos na técnica (Veja, por exemplo, Harlowand Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988; incorporado aqui a título de referência). Por exemplo, um anticorpopode incluir ao menos uma, e de preferência, duas cadeias pesadas decomprimento total, e ao menos uma, e de preferência, duas cadeias leves. Otermo "anticorpo" como usado aqui inclui um fragmento de anticorpo ou umamolécula variante, tal como, fragmento de ligação de antígeno (por exemplo,um Fab, F(ab')2, Fv, um fragmento Fv de cadeia simples, um fragmento decadeia pesada (por exemplo, um camelídeo VHH) e uma fusão de imuno-globulina de domínio de ligação (por exemplo, SMIP™).

O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou de especifici-dade única. O anticorpo também pode ser um anticorpo humano, humaniza-do, quimérico, enxertado por CDR, ou gerado in vitro. Ainda em outras mo-dalidades, o anticorpo possui uma região constante de cadeia pesada sele-cionada entre, por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, ou lgG4. Em outra modalida-de, o anticorpo possui uma cadeia leve selecionada entre, por exemplo,kappa ou lambda. Em outra modalidade, a região constante é alterada, porexemplo, modificada, para modificar as propriedades do anticorpo (por e-xemplo, para aumentar ou reduzir um ou mais entre: ligação de receptor Fc,glicosilação de anticorpo, inúmeros resíduos de cisteína, função de célulaefetora, ou função complementar). Tipicamente, o anticorpo se liga especifi-camente a um antígeno predeterminado, por exemplo, um antígeno associa-do com um distúrbio, por exemplo, um distúrbio neurodegenerativo, metabó-lico, inflamatório, auto-imune e/ou maligno.

Small Modular ImmunoPharmaceuticaIs (SMIP™) proporcionamum exemplo de uma molécula variante que compreende um polipeptídeo dedomínio de ligação. SMIPs e seus usos e aplicações estão descritos, porexemplo, no Pedido de Patente U.S. Publicado. Nos. 2003/0118592,2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614,2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023,2005/0202028, 2005/0202534, e 2005/0238646, e elementos da família depatente relacionada desses, estando todos aqui incorporadas por referênciaem sua totalidade.

Os anticorpos de domínio único podem incluir anticorpos cujasregiões de determinação complementares são parte de um polipeptídeo dedomínio único. Exemplos incluem, porém sem caráter limitativo, anticorposde cadeia pesada, anticorpos naturalmente desprovido de cadeias leves,anticorpos de domínio único derivados de anticorpos de 4 cadeias conven-cionais, anticorpos engenheirados e arcabouços de domínio único excetoaqueles derivados de anticorpos. Os anticorpos de domínio único podem serqualquer um da técnica, ou quaisquer anticorpos de domínio único futuros.Os anticorpos de domínio único podem ser derivados de qualquer espécieinclusive, porém sem caráter limitativo, camundongo, humano, camelo, Iha-ma, cabra, coelho, bovino. De acordo com um aspecto da invenção, um an-ticorpo de domínio único como usado aqui é um anticorpo de domínio úniconaturalmente ocorrente conhecido como anticorpo de cadeia pesada des-provido de cadeias leves. Tais anticorpos de domínio único estão descritosno documento WO 9404678, por exemplo. Por razões de objetividade, essedomínio variável derivado de um anticorpo de cadeia pesada naturalmentedesprovido de cadeia leve, é conhecido aqui como VHH ou nanocorpo (na-nobody) para distinguir o mesmo do VH convencional de imunoglobulinas dequatro cadeias. Tal molécula de VHH pode ser derivada de anticorpos ele-vados em espécie Camelidae, por exemplo, em camelo, lhama, dromedário,alpaca e guanaco. Outras espécies além da Camelidae podem produzir anti-corpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeia leve; tais co-mo, VHHs estão dentro do escopo da invenção.

Exemplos de fragmentos de ligação incluídos dentro do termo"fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmentoFab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL eCH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreendedois fragmentos Fab ligados por uma ponte de bissulfeto ma região de do-bradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) umfragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de an-ticorpo, (v) um fragmento dAb, que consiste em um domínio VH; (vi) um do-mínio variável de camelídeo ou camelizado, por exemplo, um domínio VHH;(vii) um Fv de cadeia simples (scFv); (viii) um anticorpo bi-específico; e (ix)um ou mais fragmentos de uma molécula de imunoglobulina fundida em umaregião Fc. Ademais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH,seja codificados por genes separados, esses podem ser unidos, utilizandométodos recombinantes, por um Iigante sintético que permite que esses se-jam feitos como uma proteína de cadeia simples em que as regiões de VL eVH se unem para formar moléculas monovalentes (conhecido como Fv decadeia simples (scFv); veja, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:5879-83). Tais anti-corpos de cadeia simples também são destinados a serem incluídos dentrodo termo "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo. Esses frag-mentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conheci-das pelos elementos versados na técnica, e os fragmentos são avaliadospara funcionarem da mesma maneira que os anticorpos intactos.

Exceto os anticorpos "bí-específicos" ou "bifuncionais", entende-se que um anticorpo tenha sítios de ligação idênticos. Um anticorpo "bi-específico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial que possui doispares de cadeia pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação diferentes.I Os anticorpos bi-específicos podem ser produzidos por uma variedade demétodos que incluem fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'.Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990); Kostelnyetal., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Como usado aqui, o termo "linhagem celular" significa uma célu-la que é mantida em cultura e adquiriu a capacidade de se desenvolver emcondições ex vivo. As linhagens celulares podem ser tanto imortalizadascomo transientoriamente estabelecidas como "linhagens celulares primá-rias". Em certas modalidades, as linhagens celulares são estabelecidas portécnicas conhecidas (veja, por exemplo, Kwak et al. (2006) Anim. Biotechnol.17(1): 51-8). Em algumas modalidades, as linhagens celulares são célulasprodutoras de anticorpo, que podem ser produzidas por técnicas conhecidas(veja, por exemplo, Dessain et al. (2004) J. Immunol. Methods. 291(1-2):109-22.). As linhagens celulares também podem ser obtidas de fontes co-merciais, tais como, coleções de biologia celular ATCC (American Type Cul-ture Collections, Mannassas, VA).

Como usado aqui, o termo "agente de ligação" significa uma mo-lécula que pode se associar a qualquer outra molécula por meio de ligaçõescovalentes, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de Van der Wa-ais, forças de London, ou qualquer combinação das forças. Os agentes deligação incluem, porém sem caráter limitativo, proteínas e fragmentos des-sas, compostos peptidomiméticos, anticorpos e fragmentos desses, ácidosnucléicos, toxinas, e moléculas pequenas.

Os agentes de ligação podem ficar dispostos sobre um suportesólido derivatizado através de métodos bem conhecidos na técnica. Os su-portes sólidos incluem, porém sem caráter limitativo, microesferas, microes-feras magnéticas, chips de microarranjo, membranas de nitrocelulose, mem-branas de náilon, placas de múltiplos poços, e membranas de PVDF. Emalgumas modalidades, o suporte sólido é uma placa em que um eletrodo ficadisposto abaixo da placa, criando um campo magnético que atrai um agentede ligação ligado a um material magnético. As placas são usadas de acordocom os protocolos do fabricante (veja Meso Scale Discovery, Gaithersburg,MD).

Os suportes sólidos podem ser compostos de vidro, poliestireno,plástico, metais magnéticos, tais como, ferro, poliacrilamida, sefarose, celu-lose, ou qualquer suporte inerte que não afeta a capacidade de os agentesde ligação se ligarem a uma proteína. Os suportes sólidos são obtidos co-mercialmente junto a, por exemplo, Applied Biosystems, (Foster City, CA).

Ademais, em algumas modalidades, os agentes de ligação ficamdispostos sobre um suporte sólido tal como um chip de microarranjo utilizan-do métodos praticados pelos elementos versados na técnica por meio de umprocesso chamado "impressão" (veja, por exemplo, Schena et. ai, (1995)Science, 270(5235): 467-470). O termo "impressão," como usado aqui, serefere à colocação de pontos sobre o suporte sólido em tal estreita proximi-dade que permita que um número máximo de pontos seja disposto sobre umsuporte sólido. O processo de impressão pode ser realizado, por exemplo,por uma impressora robotizada. VersArray CHIP Writer Prosystem (BioRadLaboratories) que utiliza Stealth Micro Spotting Pins (Telechem International,Inc, Sunnyvale, CA) é um exemplo não-limitativo de um dispositivo de im-pressão de chip que pode ser usado para produzir o microarranjo concen-trado para esse aspecto.

Como usado aqui, o termo "qualidade apropriada" se refere àqualidade que está particularmente relacionada à proteína de interesse.Uma qualidade apropriada inclui, porém sem caráter limitativo, reações en-zimáticas, interações de anticorpo-epítopo, e interações de ácido nucléico-proteína. Uma qualidade apropriada pode ser avaliada ao analisar um as-pecto físico-químico particular da proteína de interesse. Por exemplo, a qua-lidade apropriada pode estar, se limitar aos tipos de testes que podem serusados, relacionada ao tamanho, carga, teor de carboidrato da proteína, ati-vidade de ligação, e atividade enzimática. Análises de estrutura física, talcomo, NMR podem ser usadas para determinar a estrutura terciária e se-cundária total da proteína. Ademais, os testes baseados em Iectina e testesbaseados em ácido siálico, que serão descritos de maneira mais completaabaixo, podem ser usados para determinar os aspectos físico-químicos daI proteína de interesse. Em outras palavras, a qualidade apropriada pode serdeterminada visando não só as atividades químicas da proteína de interes-se, como também a estrutura física da proteína de interesse.

Como usado aqui, o termo "eluir" significa extrair de uma resinaou agente de ligação mediante o uso de um solvente. O processo de eluiruma proteína de interesse de uma resina ou agente de ligação pode envol-ver uma solução que contém uma molécula capaz de desalojar a proteína deinteresse do agente de ligação. Ademais, a solução pode possuir um pH quealtera as características de ligação da resina ou agente de ligação de modoque a proteína de interesse não se associe mais à proteína de interesse.Deve ser observado que qualquer solução pode ser usada para eluir umaproteína na presente invenção desde que o processo não afete a funcionali-dade ou qualidade total da proteína de interesse.

Como usado aqui, o termo "resina" significa qualquer produtoorgânico sólido ou semi-sólido de origem natural ou sintética. As resinas in-cluem qualquer material que pode ser conjugado a uma porção que permitea purificação de uma molécula de uma mistura complexa. As porções úteisna presente invenção incluem moléculas catiônicas, moléculas aniônicas,metais, metalóides, polissacarídeos, polipeptídeos, proteínas, ácidos nucléi-cos, peptídeos, moléculas orgânicas pequenas e compostos peptidomiméti-cos. Em particular, as próprias resinas podem ser compostas de qualquercomposto inerte inclusive, porém sem caráter limitativo, sephadex, poliesti-reno, poliacrilamida, ou polissacarídeos neutros. As resinas podem ser co-mercialmente obtidas junto a, por exemplo, Clontech Laboratories, Inc.(Mountain View, CA).

O termo "alto rendimento" como usado aqui significa permitir queuma metodologia rápida e simples determine a presença de expressão pro-téica desejada em uma linhagem celular. A expressão protéica desejada serefere tanto à quantidade como qualidade das moléculas biológicas expres-sas pelas linhagens celulares selecionadas pelas técnicas de alto rendimen-to. A metodologia de alto rendimento também pode incluir sistemas automá-ticos para processar as moléculas biológicas e processar dados automáticospara seleção em grande escala.

Como usado aqui, o termo "seleção de título de alto rendimento"se refere a um procedimento usado para determinar a quantidade de proteí-na expressa por uma célula. A seleção de título de alto rendimento inclui ouso de agentes de ligação para identificar uma proteína de interesse emuma amostra derivada de uma célula. Os agentes de ligação podem ser li-gados de maneira operável a um marcador detectável ou um suporte sólido,sendo que todos serão descritos de maneira mais detalhada abaixo.

Como usado aqui, o termo "purificação de alto rendimento" signi-fica o processo para purificar proteínas de múltiplas amostras de células aomesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo.

Como usado aqui, o termo "desenvolvimento de processo decultura celular" se refere a procedimentos para produzir a otimização dascondições necessárias para produzir proteínas em quantidades e qualidadessuficientes para produção industrial ou em pequena escala. As condiçõesque podem ser testadas utilizando processo de cultura celular incluem, po-rém sem caráter limitativo, concentração de sal, conteúdo do meio, tempera-tura de crescimento, pressão atmosférica, teor de oxigênio atmosférico, agi-tação de cultura, e teor de dióxido de carbono. O desenvolvimento de pro-cesso de cultura celular inclui as etapas de determinar a quantidade de umaproteína (seleção de título de alto rendimento) e a qualidade de uma proteí-na (purificação de alto rendimento).Os métodos para determinar a qualidade de uma proteína parapropósitos de desenvolvimento de processo de cultura celular incluem, po-rém sem caráter limitativo, testes de ligação, testes baseados em lectina,testes baseados em ácido siálico, NMR1 dicroísmo circular, espectrometria de massa, MALDI-TOF, análises enzimáticas, testes colorimétricos, e se-quenciamento de aminoácido. Essas análises podem ser usadas em qual-quer momento durante o método de desenvolvimento de processo de culturacelular. Em certas modalidades, os testes são realizados após o término dapurificação de alto rendimento da proteína de interesse.

O termo "proteína de interesse" como usado aqui significa qual-quer proteína, ou molécula tipo proteína, produzida para propósitos biológi-cos, médicos, medicinais, ou farmacêuticos. Por exemplo, uma proteína deinteresse pode ser uma proteína terapêutica. As proteínas de interesse po-dem ser produzidas a partir de seqüências de ácido nucléico, seja cromos- somais ou extracromossomais, que incluem, porém sem caráter limitativo,RNA pré-mensageiro, RNA mensageiro, RNA de transferência, RNA hetero-nuclear ("HnRNA"), RNA ribossômico, DNA de cadeia simples, e RNA decadeia dupla. As fontes extracromossomais de seqüências de ácido nucléicopodem incluir genomas virais de DNA de cadeia dupla, genomas virais de DNA de cadeia simples, genomas virais de RNA de cadeia dupla, genomasvirais de RNA de cadeia simples, DNA bacteriano, DNA genômico mitocon-drial, cDNA ou qualquer outra fonte externa de ácido nucléico que é capazde gerar uma t proteína de interesse. Uma proteína de interesse pode serqualquer estrutura ou combinação de estruturas. Por exemplo, as proteínas de interesse incluem, porém sem caráter limitativo, proteínas recombinantes,proteínas que contêm uma estrutura quaternária, proteínas glicosiladas, pro-teínas lipidadas, oligopeptídeos, peptídeos, domínios de proteína, subunida-des de proteína, anticorpos ou fragmentos desses, e moléculas tipo anticor-po. As proteínas de interesse também incluem, por exemplo, proteínas de fusão. As proteínas de fusão possuem geralmente todo ou uma parte subs-tancial de um peptídeo de marcação, ligado na terminação N ou C1 a todo ouuma parte de um segundo polipeptídeo ou proteína. Por exemplo, as fusõespodem empregar seqüências líderes de outras espécies para permitir a ex-pressão recombinante de uma proteína em um hospedeiro heterólogo. Outrafusão útil inclui a adição de um domínio imunologicamente ativo, tal como,um epítopo de anticorpo, para facilitar a purificação da proteína de fusão.

Uma proteína de fusão pode incluir uma porção de marcação, por exemplo,um fragmento de receptor solúvel ou um ligante, e uma cadeia de imunoglo-bulina, um fragmento Fc, regiões constantes de cadeia pesada dos váriosisotipos, inclusive: IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA1, lgA2, IgD, e IgE). Porexemplo, a proteína de fusão pode incluir o domínio extracelular de um re-ceptor, e, por exemplo, fundida, uma cadeia Fc de imunoglobulina humana(por exemplo, IgG humano, por exemplo, IgGI humano ou lgG4 humano, ouuma forma modificada desses). Em uma modalidade, a seqüência Fc huma-na foi modificada em um ou mais aminoácidos, por exemplo, modificada nosresíduos 254 e 257 da seqüência tipo selvagem para reduzir a ligação dereceptor Fe. As proteínas de fusão podem incluir adicionalmente uma se-qüência ligante que une a primeira porção à segunda porção, por exemplo, ofragmento de imunoglobulina. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluirum ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico de cerca de 4 a 20,mais preferivelmente, 5 a 10, aminoácidos de comprimento; o ligante peptí-dico possui 8 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, a proteína de fu-são pode incluir um ligante peptídico que possui a fórmula (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y onde y é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8. Em outras modalidades, as seqüên-cias de aminoácido adicionais podem ser adicionadas à terminação N ou Cda proteína de fusão para facilitar a expressão, flexibilidade estérica, detec-ção e/ou isolamento ou purificação.

A inclusão de um sítio de clivagem na ou próxima à junção defusão irá facilitar a remoção do polipeptídeo estranho após a purificação.Outras fusões úteis incluem a ligação de domínios funcionais, tais como,sítios ativos de enzimas, domínios de glicosilação, sinais de marcação celu-lar ou regiões de transmembrana. Exemplos de proteínas ou peptídeos quepodem ser incorporados em uma proteína de fusão incluem proteínas citos-táticas, proteínas citocidais, agentes pró-apoptose, agentes anti-angiogênicos, hormônios, citocinas, fatores de crescimento, fármacos à basede peptídeo, anticorpos, anticorpos de fragmentos Fab, antígenos, proteínasreceptoras, enzimas, lectinas, proteínas MHC, proteínas de adesão celular eproteínas de ligação. Os métodos para gerar as proteínas de fusão são bemconhecidos pelos versados na técnica. Tais proteínas podem ser produzi-das, por exemplo, por ligação química utilizando reagentes de reticulaçãobifuncionais, por meio da síntese da proteína de fusão completa, ou por liga-ção de uma seqüência de DNA que codifica o peptídeo de marcação a umaseqüência de DNA que codifica o segundo peptídeo ou proteína, seguidaspela expressão da proteína de fusão intacta.

Em certas modalidades, uma proteína de fusão é um inibidor dofator de necrose tumoral, por exemplo, na forma de alfa e beta receptores defator de necrose tumoral (TNFR-1; EP 417.563 publicado em 20 de marçode 1991; e TNFR-2, EP 417.014 publicado em 20 de março de 1991, cadaum está incorporado aqui a título de referência em sua totalidade), e é anali-sado de acordo com a presente invenção (para revisão, veja Naismith andSprang, J Inflamm. 47(1-2): 1-7, 1995-96, incorporado aqui a título de refe-rência em sua totalidade). De acordo com algumas modalidades, um inibidordo fator de necrose tumoral compreende um receptor TNF solúvel. Em cer-tas modalidades, um inibidor do fator de necrose tumoral compreende umTNF solúvel fundido com qualquer parte de uma proteína imunoglobulina,inclusive a região Fc de uma imunoglobulina. Em certas modalidades, osinibidores de TNF da presente invenção são formas solúveis de TNFR I eTNFR II. Em certas modalidades, os inibidores de TNF da presente invençãosão proteínas de ligação de TNF solúveis. Em certas modalidades, os inibi-dores de TNF da presente invenção são TNFR-Fc, por exemplo, etanercept.Como usado aqui, "etanercept", se refere a um TNFR-Fc, que é um dímerode duas moléculas da parte extracelular do receptor p75 TNF-α, cada molé-cula consiste em uma parte Fc de 235 aminoácidos de IgGI humana. Deacordo com a invenção, um composto anti-envelhecimento, tal como carno-sina, é usado para reduzir a quantidade de proteína mal-enovelada e/ou a-gregada durante a produção de TNFR-Fc.As proteínas ou peptídeos podem ser feitos por meio de qual-quer técnica conhecida pelos elementos versados na técnica, inclusive aexpressão de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos através de técnicas bio-lógicas moleculares padrão, o isolamento de proteínas ou peptídeos de fon-tes naturais, ou a síntese química de proteínas ou peptídeos. As regiões decodificação de genes conhecidos podem ser amplificadas e/ou expressasutilizando as técnicas descritas aqui ou como conhecidas pelos elementosversados na técnica (veja, por exemplo, Kaleeba et al. (2006) Science 311(5769):1921-4). Alternativamente, várias preparações comerciais de proteí-nas, polipeptídeos e peptídeos são conhecidas pelos elementos versados natécnica.

Ademais, como usado aqui, o termo "níveo desejado de expres-são" significa a quantidade de proteína necessária, dependendo das carac-terísticas físico-químicas da proteína, para permitir a purificação subseqüen-te da proteína. Os níveis desejados de expressão de uma proteína de inte-resse dependem de inúmeros fatores relacionados aos métodos de produ-ção que serão utilizados. Por exemplo, o nível de expressão de uma linha-gem celular particular permite a análise de qualidade e quantidade de prote-ína bem como a purificação eficaz da proteína. O nível desejado de expres-são protéica de uma linhagem celular, portanto, é determinado por um ele-mento versado na técnica e, vista das características da proteína e os méto-dos de purificação e teste que serão usados nas proteína.

Em certas modalidades, os níveis desejados de expressão pro-téica são selecionados com base nas exigências particulares da proteína deinteresse. Por exemplo, um elemento versado na técnica pode selecionarum nível desejado de expressão protéica que será um nível aumentado deexpressão de uma proteína de interesse para aumentar a quantidade de pro-teína produzida. Em outras modalidades, um nível reduzido de expressão daproteína de interesse é selecionado para ser o nível desejado de expressãoprotéica no caso de proteínas, tal como, uma toxina, que são tóxicas em al-tos níveis na célula que produz a toxina. Ademais, um nível reduzido de ex-pressão protéica é selecionado em situações quando a proteína de interesseforma corpos de inclusão em altos níveis de concentração. Portanto, o nívelde expressão protéica selecionado por um elemento versado na técnica de-pende das características da proteína de interesse.

Ao determinar a quantidade e qualidade de uma proteína produ-zida por uma linhagem celular, uma amostra de linhagem celular é tipica-mente necessária para a avaliação de expressão protéica e qualidade deproteína. Em certas modalidades, uma amostra de linhagem celular é isola-da utilizando meios que são conhecidos na técnica, tal como, Iise celular eisolamento de sobrenadante (veja, por exemplo, Vara et al. (2005) Biomate-riais 26(18): 3987-93; Iyer et al. (1998) J. Bioi Chem. 273(5):2692-7). Alter-I nativamente, as amostras de linhagem celular são isoladas de um meio quepossui uma proteína secretada, tal como, um anticorpo, proteína de matrizextracelular, ou proteína do soro. Em tais modalidades, o meio é a amostraque será testada em termos de quantidade e qualidade de proteína. Em umamodalidade, a amostra de meio é usada em um ensaio para testar a quanti-dade de proteína, na ausência de qualquer etapa de purificação anterior,como adicionalmente descrito aqui.

Outro aspecto da invenção proporciona um método de seleçãode alto rendimento de linhagens celulares para produção de proteína. Nessemétodo, os níveis de expressão protéica são determinados ao colocar umsuporte sólido em contato com uma amostra de linhagem celular que contémuma proteína. Em uma modalidade, a amostra de linhagem celular é o meiode cultura celular. O suporte sólido ligou à sua superfície um primeiro agentede ligação que é capaz de se ligar à proteína. O método também inclui umsegundo agente de ligação que se liga à proteína ligada pelo primeiro agen-te de ligação e imobilizada sobre o suporte sólido. O segundo agente de li-gação é ligado de maneira operável a um marcador detectável. As linhagenscelulares são selecionadas com base no nível desejado de expressão reque-rido pela proteína.

O nível de expressão de uma proteína particular pode ser medi-do pela técnica de "dot blot" em que um primeiro agente de ligação é imobili-zado sobre uma membrana tal como nitrocelulose, náilon, ou PVDF (veja,por exemplo, Heinicke et al. (1992) J. Immunol. Methods. 152(2): 227-36.)· Atecnologia de microarranjo de proteína também pode ser usada para deter-minar a expressão de proteínas em uma amostra. Alternativamente, umaamostra é colocada em um poço de uma placa de múltiplos poços que con-tém o primeiro agente de ligação. Em tais modalidades, técnicas similares,tais como, ensaios ELISA são comuns (veja, por exemplo, Ausubel, et al.(1996)Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, pp. 4.2.1-4.2.9, JohnWiley & Sons, Inc.

Em algumas modalidades, a seleção de alto rendimento e/oupurificação das amostras de linhagem celular são realizadas utilizando umaestação de trabalho automática. Ademais, o desenvolvimento de processode cultura celular pode ser realizado utilizando estações de trabalho automá-ticas. As estações de trabalho automáticas são comumente utilizadas natécnica para realizar diversos experimentos em um curto período de tempo.Exemplos de estações de trabalho automáticas incluem, porém sem caráterlimitativo, TECAN Genesis Workstation (TECAN Schweiz AG, Mannedorf,CH) and the Biomek FX Workstation (Beckman Coulter1 Fullerton, CA). Osmétodos de uso podem ser obtidos a partir dos fabricantes de estações detrabalho automáticas e são bem conhecidos na técnica.

1.2. Agentes de ligação

Os aspectos da invenção utilizam agentes de ligação para ligaruma proteína de interesse. Em certas modalidades, um agente de ligação éum anticorpo ou fragmento desse. Quando o agente de ligação que se ligaespecificamente a uma proteína for um anticorpo, o anticorpo pode ser, semcaráter limitativo, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anti-corpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo geneticamenteengenheirado, um anticorpo bi-específico (quando uma das especificidadesdo anticorpo bi-específico se ligar especificamente à proteína triosefosfatoisomerase), fragmentos de anticorpo (inclusive, porém sem caráter limitativo,"Fv," "F(ab')2", "F(ab)", e "Dab"); e cadeias simples que representam a partereativa de um anticorpo ("SC-MAb"). Os métodos para formar anticorpos eoutros agentes de ligação são bem conhecidos (veja, por exemplo, Coliganet ai. (1991) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.;Jones etal. (1986) Nature 321: 522-525; Marx (1985) Science 229: 455-456;Rodwell (1989) Nature 342: 99-100; Clackson (1991) Br. J. Rheumatol.3052: 36-39; Reichman etal. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen, etal.(1988) Science 239: 1534-1536).

O agente de ligação pode ser um anticorpo ou fragmento desseque se liga à parte Fc de um anticorpo. Em certas modalidades, o agente deligação permite a detecção de anticorpos em uma amostra de linhagem celu-lar. Em modalidades particulares, um anticorpo, que é o segundo agente deligação, é marcado de maneira detectável com um marcador eletroquimilu-minescente detectável, tal como, rutênio. Ademais, o segundo agente deligação pode ser um fragmento F(ab')2 marcador de maneira detectável comum marcador eletroqumiluminescente detectável, tal como, rutênio.

A detecção de uma proteína de interesse utilizando fragmentosF(ab')2 é mostrada na figura 1. O fragmento F(ab')2 é ligado de maneira ope-rável a um marcador detectável, tal como, um Ori-Tag. Na figura 1, o frag-mento F(ab')2 reconhece a parte Fc de um anticorpo, que é uma proteína deinteresse nesse exemplo pictorial. O anticorpo foi imobilizado sobre uma mi-croesfera, que possui Proteína A ou estreptavidina conjugada com esse (fi-gura 1). A ligação do fragmento F(ab')2 é observada como uma geração deluz (figura 1).

É importante observar que os anticorpos usados como um pri-meiro agente de ligação em um aspecto da presente invenção podem seracoplados à superfície de um suporte sólido. O acoplamento do primeiro a-gente de ligação aprimora a resistência de sinal da reação e produz resulta-dos aprimorados. Os agentes de acoplamento comuns incluem, porém semcaráter limitativo, silanização utilizando (3-mercaptopropil) trimetoxisilano,revestimento de agarose, e películas poli-L-lisina. Adicionalmente, os anti-corpos recombinantes podem ser engenheirados para incluir um marcadorque facilita o acoplamento ao suporte. Por exemplo, um anticorpo recombi-nante que possui um marcador histidina pode ser acoplado a suportes re-vestidos com níquel.Ademais, os compostos, tais como, peptídeos, compostos pepti-domiméticos, e moléculas pequenas podem ser usados como agentes deligação. Os agentes de ligação podem ser sintetizados a partir de peptídeosou outras biomoléculas, inclusive, porém sem caráter limitativo, sacarídeos,ácidos graxos, esteróis, isoprenóides, purinas, pirimidinas, derivados ou aná-logos estruturais desses, ou suas combinações e similares. As bibliotecas deexibição de fagos e bibliotecas combinatórias químicas podem ser usadaspara desenvolver e selecionar compostos sintéticos que são agentes de li-gação aceitáveis de uma proteína de interesse. O uso de agentes de ligaçãopotenciais feitos de peptóides, bio-oligômeros aleatórios (Patente No. U.S.5.650.489), benzodiazepinas, diversômeros, tais como, didantoínas, benzo-diazepinas e dipeptídeos, peptidomiméticos não-peptidais com um arcabou-ço de beta-D-glucose, oligocarbamatos ou peptidil fosfonatos também é pre-visto na invenção.

Em certos exemplos, os agentes de ligação podem ser peptí-deos que são projetados especificamente para interagir, se ligar, ou se as-sociar a uma proteína. Os agentes de ligação peptídicos também podeminteragir, se associar, ou se ligar a uma seqüência de aminoácido de qual-quer outra proteína. Os peptídeos podem ser submetidos a modificaçõesquímicas direcionadas ou aleatórias, tais como, acilação, alquilação, esterifi-cação, amidificação, etc.

A identificação e seleção de agentes de ligação peptídicos é a-dicionalmente facilitada ao determinar as características estruturais da prote-ína de interesse, por exemplo, utilizando cristalografia de raio-X, difração denêutrons, espectrometria de ressonância magnética nuclear, e outras técni-cas para determinação de estrutura. Os algoritmos de computador podemfacilitar ainda a identificação do agente de ligação. Tais algoritmos de com-putador que são empregados são capazes de selecionar um banco de da-dos de peptídeos e moléculas pequenas de estrutura tridimensional conhe-cida para candidatos que se adaptam geometricamente no sítio da proteínaalvo (veja, por exemplo, Chen and Kellogg (2005) J. Comput. Aided MoiDes. 19(2):69-82). A maioria dos algoritmos desse tipo proporciona um mé-todo para encontrar uma ampla classificação de estruturas químicas que sãocomplementares ao formato de uma bolsa de ligação ou região de um domí-nio de uma proteína. Cada conjunto de peptídeos de um banco de dadosparticular pode ser comparado para determinar os peptídeos particularesque possuem maior potencial para interagir com uma proteína de interesse.

Os compostos da presente invenção também podem ser com-postos peptidomiméticos que podem ser ao menos parcialmente não-naturais. O composto peptidomimético pode ser um mimetizador de molécu-la pequena de uma parte de qualquer seqüência de aminoácido desejada. Ocomposto pode possuir estabilidade, eficácia, potência e biodisponibilidadeI aumentadas devido ao mimetizador. Ademais, o composto pode possuir to-xicidade reduzida. O composto peptidomimético pode possuir permeabilida-de da mucosa intestinal. O composto pode ser sinteticamente preparado. Ocomposto da presente invenção pode incluir aminoácidos L1D ou não-naturais, alfa aminoácidos, alfa aminoácidos dissubstituídos, N-alquil amino-ácidos, ácido láctico (um análogo isoeletrônico de alanina). A cadeia princi-pal de peptídeo do composto pode ter ao menos uma ligação substituída porPSI-[CH=CH] (Kempf et ai. (1991) Int. J. Pept. Protein Res. 38(3): 237-41). Ocomposto pode incluir adicionalmente trifluorotirosina, p-CI-fenilalanina, p-Br-fenilalanina, poli-L-propargilglicina, poli-D,L-alil glicina, ou poli-L-alil glicina.

Um exemplo da presente invenção é um composto peptidomimé-tico em que o composto possui uma ligação, uma cadeia principal de peptí-deo ou um componente aminoácido substituído por um mimetizador ade-quado. Exemplos de aminoácidos não-naturais que podem ser mimetizado-res de aminoácido adequados incluem, porém sem caráter limitativo, β-alanina, ácido L-a-amino butírico, ácido L-Y-amino butírico, ácido L-a-aminoisobutírico, ácido L-e-amino capróico, ácido 7-amino heptanóico, ácido L-aspártico, ácido L-glutâmico, cisteína (acetamindometil), N-s-Boc-N-a-CBZ-L-lisina, N-s-Boc-N-a-Fmoc-L-lisina, sulfona L-metionina, L-norleucina, L-norvalina, N-a-Boc-N-õ-CBZ-L-ornitina, N-õ-Boc-N-a-CBZ-L-ornitina, Boc-p-nitro-L-fenilalanina, Boc-hidroxiprolina, Boc-L-tioprolina. (Blondelle, et ai.(1994) Antimicrob. Agents Chemother. 38(10): 2280-6; Pinilla, et ai. (1995)Biopolymers. 37(3): 221-40).

Às vezes, os agentes de ligação podem ser moléculas pequenasque se ligam, interagem, ou se associam a uma proteína. Tal molécula pe-quena pode ser uma molécula orgânica que é capaz de penetrar na bicama-da lipídica de uma célula. As moléculas pequenas incluem, porém sem cará-ter limitativo, toxinas, agentes quelantes, metais, e compostos metalóides.As moléculas pequenas podem ser ligadas ou conjugadas a um agente alvopara guiar especificamente a molécula pequena até uma célula particular.

Em algumas modalidades, um agente de ligação é uma seqüên-cia de ácido nucléico, que pode ser uma seqüência de comprimento total,fragmentos de seqüências de comprimento total ou oligonucleotídeos sinteti-zados que se ligam sob condições fisiológicas a uma proteína tal como umfator de transcrição. O "ácido nucléico" se refere a um polímero que com-preende dois ou mais nucleotídeos e inclui polímeros de cadeia simples, du-pla e tripla. "Nucleotídeo" se refere tanto a compostos naturalmente ocorren-tes como não-naturalmente ocorrentes e compreende uma base heterocícli-ca, um açúcar, e um grupo de ligação, tal como, um éster fosfato. Por exem-plo, os grupos estruturais podem ser adicionados à unidade ribosil ou deso-xirribosil do nucleotídeo, tal como, um grupo metila ou alila na posição 2'-0ou um grupo flúor que substitui o grupo 2'-0. O grupo de ligação, tal comoum fosfodiéster, do ácido nucléico pode ser substituído ou modificado, porexemplo, por metil fosfonatos ou O-metil fosfatos. As bases e açúcares tam-bém podem ser modificados, como conhecido na técnica. O "ácido nucléico",para os propósitos dessa descrição, também inclui "ácidos nucléicos peptídi-cos" em que as bases de ácido nucléico nativas ou modificadas são ligadasa uma cadeia principal de poliamida.

Os agentes de ligação da presente invenção podem ser conju-gados a um marcador detectável. De acordo com a invenção, um "marcadordetectável" é uma porção que pode ser percebida. Em algumas modalida-des, um marcador detectável é ligado de maneira operável a um agente deligação. Por "ligado de maneira operável", entende-se que o marcador de-tectável é ligado ao agente de ligação tanto por uma ligação covalente comonão-covalente (por exemplo, iônica). Os métodos para criar ligações cova-Ientes são conhecidos (veja protocolos gerais, por exemplo, em Wong, S. S.(1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press;Burkhart et ai. (.1999) The Chemistry and Application of Amino CrossiinkingAgents or Aminopiasts, John Wiley & Sons Inc.).

De acordo com a invenção, um agente de ligação marcado demaneira detectável que é conjugado a uma porção detectável. Outro agentede ligação marcado de maneira detectável da invenção é uma proteína defusão, onde parceiro é o agente de ligação e o outro parceiro é um marcadordetectável. Ainda um exemplo não-limitativo adicional de um agente de Iiga-ção marcado de maneira detectável é uma primeira proteína de fusão quecompreende um agente de ligação e uma primeira porção com alta afinidadee uma segunda porção, e uma segunda proteína de fusão que compreendeuma segunda porção e um marcador detectável. Por exemplo, um agente deligação que se liga especificamente a uma proteína é ligado de maneira ope-rável a uma porção de estreptavidina. Uma segunda proteína de fusão quecompreende uma porção de biotina ligada de maneira operável a uma por-ção de fluoresceína é adicionada à proteína de fusão de agente de ligação-estreptavidina, onde a combinação da segunda proteína de fusão com a pro-teína de fusão de agente de ligação-estreptavidina resulta em um agente deligação marcado de maneira detectável (ou seja, um agente de ligação mar-cado de maneira operável a um marcador detectável). Em modalidades par-ticulares, o marcador detectável é detectável por um dispositivo ou sistemade imagens médico. Por exemplo, quando o sistema de imagens médico foruma máquina de raio-X, o marcador detectável que pode ser detectado pelamáquina de raio-X é um marcador radioativo (por exemplo, 32P). Nota-se queum agente de ligação não precisa ser diretamente conjugado à porção de-tectável. Por exemplo, um agente de ligação (por exemplo, um anticorpo)que é especificamente ligado a si mesmo ou por um agente de ligação de-tectável secundário (por exemplo, um anticorpo secundário de cabra anti-camundongo marcado FITC) é ligado de maneira operável a uma porçãodetectável {ou seja, a porção FITC).Os marcadores detectáveis pode ser, sem caráter Iimitativo1 fluo-róforos (por exemplo, fluoresceína (FITC), ficoeritrina, rodamina), corantesquímicos, ou compostos que são radioativos, quimiluminescentes, eletro-quimiluminescentes, magnéticos, paramagnéticos, promagnéticos, ou enzi-mas que produzem um produto que pode ser colorido, quimiluminescente,ou magnético. O sinal é detectável por qualquer meio adequado, inclusivemeio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, ópti-co ou químico. Em certos casos, o sinal é detectável por dois ou mais meios.Em certas modalidades, os marcadores de proteína incluem corantes fluo- rescentes, radiomarcadores, marcadores eletroquimiluminescentes, e quimi-luminescentes.

Por exemplo, os aminoácidos de agentes de ligação podem serconjugados aos corantes fluorescentes Cy5/ Cy3. Esses corantes são fre-qüentemente usados na técnica (veja, por exemplo, Linder et al. (2002) Elec- trophoresis. 23(5): 740-9). Os marcadores fluorescentes podem ser selecio-nados a partir de uma variedade de classes estruturais, inclusive os exem-plos não-limitativos, tais como, 1 e 2-aminonaftaleno, p,p'diaminostilbenos,pirenos, sais de fenantridina quaternários, 9-aminoacridinas, p,p'-diaminobenzofenona iminas, antracenos, oxacarbocianina, marocianina, 3-aminoequilenina, perileno, bisbenzoxazol, bis-p-oxazolil benzeno, 1,2-benzofenazina, retinol, sais bis-3-aminopridínio, helebrigenina, tetraciclina,esterofenol, enzimidazolil fenilamina, 2-oxo-3-cromo, indol, xanteno, 7-hidroxicumarina, fenoxazina, salicilato, estrofantidina, porfirinas, triarilmeta-nos, flavina, corantes xanteno (por exemplo, corantes fluoresceína e roda- mina); corantes cianina; corantes 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenoe proteínas fluorescentes (por exemplo, proteína verde fluorescente, ficobili-proteína).

Outros corantes úteis são corantes quimiluminescentes e podemincluir, sem caráter limitativo, aminoácidos conjugados com biotína. Em mo- dalidades particulares, as sondas eletroquimiluminescentes são conjugadascom os agentes de ligação. Como usado aqui, "eletroquimiluminescência" éuma reação quimiluminescente que ocorre subseqüentemente a uma reaçãoeletroquímica. As sondas eletroquimiluminescentes incluem, porém sem ca-ráter limitativo, luminol, éster acridan, rutênio, quelato de rutênio, e tribipiridi-na de rutênio, éster NHS. As sondas eletroquimiluminescentes podem sercomercialmente obtidas junto a, por exemplo, BioVeris Corp. (Gaithersburg, MD).

1.3 Análises Analíticas

Os aspectos da presente invenção também utilizam análises daqualidade da proteína. Essas análises podem ser utilizadas durante a sele-ção de título de alto rendimento da proteína de interesse. A qualidade daproteína também pode ser determinada durante o desenvolvimento de pro-cesso de cultura celular. Como parte da qualidade da proteína, a estruturada proteína inclui a estrutura primária, secundária, terciária, e quaternária deuma proteína bem como modificações pós-traducionais, tais como, glicosila-ção, lipidação, e fosforilação. Ademais, o tamanho, formato, e carga da pro-teína afetam a qualidade da proteína. A estrutura física de uma proteínapossui um efeito significativo sobre a capacidade de uma proteína para rea-lizar suas funções normais. No contexto de reações enzimáticas, a estruturada proteína é essencialmente importante para qualidade enzimática total. Nocontexto de anticorpos ou fragmentos desses, o tamanho, formato, carga desuperfície, glicosilação, e fosforilação de aminoácidos do anticorpo possuium efeito significativo sobre a especificidade do epítopo do anticorpo.

Em algumas modalidades, NMR, análises Matrix assisted laserdesorption/time-of-flight ("MALDI-TOF"), e dicroísmo circular são usados pa-ra determinar a estrutura física de uma proteína (veja, por exemplo, PatenteNos. U.S. 6.930.305; 7.005.272; e 7.029.872). Tais técnicas proporcionamuma análise detalhada da estrutura física total da proteína. Essas técnicassão bem conhecidas.

Em modalidades particulares, a cromatografia de exclusão portamanho é usada para determinar o tamanho da proteína de interesse (veja,por exemplo, Brooks et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97(13): 7064-7067). Ademais, a cromatografia de troca catiônica pode ser usada para de-terminar a carga de uma proteína (veja, por exemplo, Zhang and Glatz(1999) Biotechnol. Prog. 15(1): 12-18). Outras técnicas que podem ser utili-zadas para identificar a estrutura de uma proteína de interesse incluem, po-rém sem caráter limitativo, HPLC em fase reversa, eletroforese capilar SDS,eletroforese de zona capilar, e HPLC de troca aniônica e alto pH. Essas téc-nicas podem ser praticadas utilizando procedimentos que são bem conheci-dos.

Outros testes estruturais incluem o teste baseado em ácido siáli-co e o teste baseado em lectina. Esses testes identificam o nível de gliosila-ção encontrado sobre a superfície de uma proteína, que informa sobre aqualidade da proteína. Os testes baseados em ácido siálico foram usadospara determinar o nível de carboidratos presente em uma amostra, e essastécnicas são conhecidas (veja, por exemplo, Patente Nos. U.S. 5.807.553 e5.855.901). Os testes baseados em lectina também detectam a presença decarboidrato em uma amostra, porém através de um mecanismo de uma inte-ração proteína-carboidrato (veja, por exemplo, Patente No. U.S. 5.633.148).Os testes baseados em lectina foram usados amplamente na técnica paraligação de carboidrato, e estão descritos, por exemplo, na Patente No. U.S.6.331.319.

Além de determinar a estrutura física de uma proteína, a capaci-dade de uma proteína realizar certas funções pode ser avaliada (veja, porexemplo, Patente No. U.S. 7.029.862). Também, a função de ligação deuma proteína ou polipeptídeo (por exemplo, codificada por hibridização deácido nucléico) pode ser detectada em testes de ligação ou inibição de liga-ção, utilizando frações de membrana que contêm receptor ou receptor deexpressão celular, por exemplo (veja, por exemplo, Van Riper et al. (1993) J.Exp. Med., 177: 851 856; Sledziewski etal., U.S. Pat. No. 5,284,746). Assim,a capacidade de a proteína ou polipeptídeo codificado se ligar a um ligante,um inibidor e/ou promotor, pode ser avaliada. As propriedades antigênicasde proteínas ou polipeptídeos codificados por ácidos nucléicos da presenteinvenção podem ser determinadas por métodos imunológicos que empre-gam anticorpos que se ligam a uma proteína, tal como, immunoblotting, imu-noprecipitação e imunoensaio (por exemplo, radioimunoensaio, ELISA).A função de sinalização de uma proteína ou polipeptídeo (porexemplo, codificada por hibridização de ácido nucléico) pode ser detectadapor análises enzimáticas. A função estimulatória de uma proteína ou polipep-tídeo (por exemplo, codificada por hibridização de ácido nucléico) pode serdetectada por testes padrão de quimiotaxia ou liberação de mediador, utili-zando células que expressam a proteína ou polipeptídeo (por exemplo, tes-tes que monitoram a quimiotaxia, exocitose (por exemplo, degranulação deenzimas, tais como, esterases (por exemplo, serina esterases), perforina,granzimas) ou liberação de mediador (por exemplo, histamina, leucotrieno)em resposta a um Iigante ou um promotor (veja, por exemplo, Taub et ai(1995) J. Immunol., 155: 3877-3888; Baggliolini, M. and C. A. Dahinden(1994) Immunology Today, 15: 127-133 e referências citadas aqui). As fun-ções características de um receptor de proteína também podem ser avalia-das por outros métodos adequados.

Para demonstrar os métodos de acordo com a invenção, os mé-todos de seleção como descrito acima foram realizados em várias linhagenscelulares como propósito de identificar aquelas linhagens celulares que pro-duziram tanto uma quantidade suficiente de proteína como qualidade sufici-ente de proteína.

Exemplos

Os elementos versados na técnica irão reconhecer, ou ser capa-zes de verificar, utilizando não mais que a experimentação comum, inúme-ros equivalentes às substâncias e procedimentos específicos descritos aqui.Tais equivalentes são destinados a serem incluídos no escopo das reivindi-cações que seguem os exemplos abaixo.

Exemplo 1

Seleção de alto rendimento de Análise Protéica de Fc Humano

1. Preparação de Padrões Anti-A3

Um tampão de curva padrão (SCB) foi preparado ao misturar 20ul de Meio R5CD1, e 24 ml de tampão de análise (PBS w/ 0,05 % de Tweene 1 % de albumina de soro bovino) em 16 placas de análise (Cor-ning/Costar, Corning, NY). 0,3 mg/ml de um padrão intermediário foi prepa-rado utilizando 6 ul de 32,5 mg/ml de padrão de referência e 644 ul de SCB(preparados frescos toda vez). Um ug/ml padrão foi colocado em um poçodesignado A1 e em um poço adicional designado H1 em uma placa de poçoprofundo de 2ml. O poço A1 continha 6 ul de 0,3 mg/ml de intermediário pa-drão e 1794 ul de SCB em 16 placas de análise. Esse processo foi repetidopara o poço H1. As diluições em série foram preparadas ao aprisionar 900 ulde solução nos poços e adicionar 900 ul de SCB a cada uma das 16 placasde análise. Foram distribuídos 50 ul das diluições por poço padrão.

2. Preparação de Controles

Os controles foram preparados para produzir uma concentraçãode 120 ug/ml de controle intermediário. Resumidamente, 6 ul de 32,5 mg/mlde padrão de referência e 1619 ul de Meio R5CD1 foram misturados. As di-luições de 1:40 foram preparadas ao misturar 5 ul de 120ug/ml de controleintermediário e 195 ul de Tampão de Análise, enquanto que as diluições de1:400 foram preparadas ao misturar 20 ul de controle diluído de 1:40 e 180ul de Tampão de Análise. As diluições de diluição 1:1200 foram preparadasao obter 80 ul de controle diluído 1:400 e misturar em 160 ul de Tampão deAnálise a cada duas placas de análise. As diluições 1:1200 foram distribuí-das em quantidades de 50 ul por 0,1 poço de controle.

Ademais, os controles que contêm 0,01 pg/ml de controle forampreparados ao misturar 150 ul de 120 ug/ml de controle intermediário em(preparado como descrito acima) 1350 ul de Meio. A diluição 1:40 foi prepa-rada ao misturar 5 ul de 12ug/ml de controle intermediário em 195 ul deTampão de Análise. A diluição 1:400 foi preparada ao misturar 20 ul de con-trole diluído 1:40 em 180 ul de Tampão de Análise e a diluição 1:1200 foipreparada ao misturar 80 ul de controle diluído 1:400 em 160 ul de Tampãode Análise /2 placas de análise. Os controles foram distribuídos em alíquotasde 50 ul de controle diluído 1:1200 por 0,01 poço de controle.

2. Preparação de Fragmento F(ab% Marcado por ORI

A preparação de fragmento F(ab')2 Anti-Fc marcado por ORI(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) foi realizadautilizando o seguinte protocolo. Resumidamente, 50 μΙ de DMSO foram adi-cionados a um frasco de éster ORITAG NHS (BioVeris, Gaithersburg, MD).A mistura foi turbilhonada no ajuste máximo até ORITAG no fundo do frascose dissolver. Então, 1638 μΙ de anticorpo IgG de cabra Anti-Humano deFragmento F(ab')2 affiniPure foram adicionados a 50 μΙ de éster ORITAGNHS dissolvido a 1638 ul. A mistura foi turbilhonada e incubada em tempera-tura ambiente durante 60 minutos em um invólucro escuro. O frasco foi gira-do sobre um oscilador durante a incubação.

A reação foi interrompida ao adicionar 20 μΙ de 2M de glicina, e otubo foi envolvido com uma folha metálica e incubado durante 10 minutosem temperatura ambiente. Durante a incubação, duas colunas PD10 (Phar-I macia, Piscataway, NJ) com PBS foram equilibradas com 0,1% de NaN3 eusadas de acordo com o protocolo do fabricante. Os tubos de reação foramcentrifugados durante 5 segundos para coletar todo o volume no tubo. En-tão, 854 ul da reação foram adicionados a cada coluna PD10. As amostrasforam carregadas nas colunas e eventualmente 8 tubos de alíquotas de 0,5ml foram coletados de cada coluna.

A concentração de proteína foi determinada pelo kit BCA ProteinAssay. Ademais, o anticorpo restante não-marcado da segunda etapa foiusado como padrão para determinar a concentração de proteína. A absor-bância das amostras de proteína foi medida em 455 nm.

As frações com concentrações de proteína apropriadas e boarazão de ORI-TAG: Proteína foram acumuladas. A albumina de soro bovinofoi adicionada ao frasco final para formar 1% de soluções BSA. Os frascosforam armazenados a 40 °C.

3. Preparação e Reação de Amostra de Linhagem Celular

Uma diluição de 1:40 foi preparada ao misturar 5 ul de uma a-mostra de uma linhagem celular que gera GP1ba, IL13R, anticorpo anti-CD22, anticorpo anti-Lewis Y, anticorpo anti-Αβ, ou proteína de fusão TNFRe 195 ul de Tampão de Análise, enquanto uma diluição 1:400 de amostra foipreparada ao misturar 20 ul de amostra diluída 1:40 e 180 ul de Tampão deAnálise. Por fim, uma diluição de 1:1200 foi preparada obtendo 70 ul de a-mostras diluídas 1:400 e misturando as amostras com 140 ul Tampão deAnálise. Essa diluição final foi distribuída em 50 ul a cada poço de amostra.1:400 também foram distribuídos nos poços de amostra em outra placa deanálise.

O fragmento F(ab')2 marcado foi distribuído em alíquotas de5350 μl que compreendem 6 ul de fragmento F(ab')2 em 5344 ul de Tampãoa cada placa de análise. Havia 50 ul de solução por poço.

As microesferas de proteína A foram obtidas junto a Dynal Bio-tech (Carlsbad, CA). As microesferas foram distribuídas em 30 ul de quanti-dades em 5 ml de tampão de análise por placa. As soluções foram distribuí-das em volumes de 50 ul por poço.

Todos os reagentes e amostras foram distribuídos às placascomo se segue: O padrão de carga, controle, e amostras, primeiramente,foram carregados nos poços. Então, o fragmento F(ab')2 marcado por ORIanti-Fc foi carregado. Por fim, as microesferas de Proteína A foram carrega-das.

A mistura foi incubada durante 2 horas em temperatura ambientecom mistura, e estudada no analisador M8 ou M384 com o método "FcHu-man150."

4. Análise de Dados

As Diretrizes de Aceitação Padrão (Standard Acceptance Guide-lines) usadas para os experimentos foram ao menos 8 dentre 10 padrões oCV das leituras entre as réplicas de ponto padrão deveriam ser cerca de20%. Ademais, as Diretrizes de Aceitação de Controle devem estar dentrode 80 a 120 %. Também, as Diretrizes de Aceitação de Amostra requeremque o CV das leituras entre as réplicas de amostra seja cerca de 20%. Ape-nas as leituras que estão dentro dessas faixas foram levadas em considera-ção

5. Resultados

A marcação do fragmento F(ab')2 com rutênio direcionado contraPSGL mostrou um sinal significativamente maior às razões de ruído (figura2). Os dados de 0,1 Mg/ ml e 0,4 pg/ ml de fragmentos F(ab')2 foram normali-zados contra ruído e colocados sobre o gráfico de barras. Os fragmentosF(ab')2 de Jackson 1, Jackson 2, Roekland 1 e Southern Bioteeh aumenta-ram as razões de sinal para ruído quando marcados com rutênio (figura 2).Esses experimentos foram confirmados utilizando fragmentos F(ab')2 dire-cionados contra anti-CD22 (figura 3).

Esses resultados foram adicionalmente detalhados em experi-mentos utilizando fragmentos F(ab')2 direcionados contra as proteínas defusão Fc GP1ba, receptor IL13, e proteína de fusão TNFR (figura 4). O gráfi-co mostra que à medida que a concentração das proteínas de fusão alvoaumenta, a detecção das proteínas com os fragmentos F(ab')2 aumenta (fi-gura 4). Resultados similares também foram obtidos utilizando anticorposanti-GDF8, anti-CD22, e anti-Lewis Y como o alvo em vez das proteínas defusão Fc (figura 5).

Ao utilizar os fragmentos F(ab')2 marcados para identificar aquantidade de proteína em uma amostra, a metodologia de seleção de títulofoi testada contra os procedimentos de coluna padrão, tal como, HPLC. Osresultados mostraram que a metodologia de seleção de título obteve umataxa muito mais rápida do que a cromatografia HPLC para determinar o títulodas proteínas (figura 6). O tempo requerido para obter as leituras de quanti-dade de proteína foi mais de 10 vezes maior utilizando HPLC comparadacom a seleção de título de alto rendimento quando acima de até 700 amos-tras foram analisadas (figura 6).

Além de a seleção de alto rendimento ser mais rápida do que osprocedimentos em coluna padrão, essa é bastante precisa ao determinar aquantidade de proteína (figuras 7, 9, 10 e 11). Quando HPLC e os procedi-mentos de seleção de título detalhados acima forem comparados, quantida-des de título quase idênticas foram identificadas em proteína anti-Lewis Y,PSGL, anti-Αβ, e proteína de fusão TNFR (figuras 7, 9, 10 e 11). Conse-quentemente, o teste de seleção de título detalhado aqui foi mais rápido eapresentou eficácia similar às técnicas em coluna padrão para determinar aquantidade de proteína.

A seleção de alto rendimento utilizada acima foi capaz de identi-ficar linhagens celulares que expressam a quantidade de anticorpo apropria-da (figura 8). Como mostrado na figura 8, a seleção de título de alto rendi-mento permitida para a identificação dos maiores produtores do anticorpo deinteresse, que é indicada pelo título crescente (ug/ ml) por clone. Nessesexperimentos, o clone de título superior está com o número 1, o segundoclone de título superior está com número dois, e assim por diante. Portanto,os clones superiores foram rapidamente identificados pela análise.

Exemplo 2

Purificação e Identificação de Alto rendimento de Condições de Cultura Ce-lular Adequadas

1. Purificação Manual de Proteínas Utilizando Centrifugação

O procedimento de seleção de título de alto rendimento do E-xemplo 1 pode estar associado ao procedimento de purificação de alto ren-dimento detalhado abaixo para aprimorar o desenvolvimento potencial dedesenvolvimento de cultura celular.

A resina fina surgiu em 20% de Etanol. A solução de 20% deEtanol Adicional foi adicionada para constituir 50% do volume determinado.A solução foi cuidadosamente misturada e dispensada em alíquotas de 200uL por poço de uma placa de filtro (Whatman 7700-2804, Iong drip, 25 um,96 poços χ 800 uL, Whatman LabSciences, Orange, NJ). As placas de filtroforam empilhadas em cima de microplacas vazias (Corning/Costar, Corning,NY), e centrifugadas (Sorvall Legend RT) durante 3 min a 700 rpm (aproxi-madamente igual a 104 G) para remover os 20% de Etanol. Então, 200 uLpor poço de água RODI foram adicionados, e as placas foram centrifugadasdurante 3 minutos sobre microplacas vazias. Esse processo foi repetido du-as vezes.

O tampão de lavagem foi adicionado a alíquotas de 200 uL porpoço. As placas foram centrifugadas durante 3 minutos sobre microplacasvazias. Esse processo foi repetido mais duas vezes. Quando todas as amos-tras atingirem ao menos 170 ug/mL, a diluição mínima foi realizada para queos títulos do mesmo conjunto de amostras estejam aproximadamente namesma faixa (+/- 20%). As amostras foram diluídas para ficarem próximas àconcentração mais baixa. Qualquer amostra sob 170 ug/mL foi carregadamais de uma vez. Quando o carregamento múltiplo for requerido, as amos-tras são diluídas apenas para garantir que a massa total de proteína carre-gada fique na mesma faixa (+/- 20%). Quando o carregamento múltiplo forrealizado, as amostras requeridas foram adicionadas primeiro e adicionadasnos poços vazios de 200 uL de tampão de lavagem. As placas de filtro foramcentrifugadas conforme necessário.

Todas as amostras foram carregadas juntamente com os refor-ços de material de referência e amostras padrão de meio como de costume.As amostras foram carregadas na resina de Proteína A (Proteína A Mab Se-lect, Amersham Biosciences) em um volume de carga de 500 uL. Um padrãoI de reforço foi preparado em meio com a concentração próxima ao conjuntototal de amostras de teste. O material de reforço e amostra padrão em meioforam carregados em 500ul/poço.

A resina foi ressuspensa com a amostra ao misturar-se com umapipeta de múltiplos canais. A resina e amostra foram incubadas durante 5 a10 minutos em temperatura ambiente. A mistura foi então centrifugada a 700rpm durante 3 minutos, e o fluxo de amostra foi coletado em uma microplacade poço profundo (Whatman 7710-5750, Whatman LabSciences, Orange,NJ). Então, 200 uL por poço de tampão de lavagem (5 mM de Tris, 20, 50 ou100 mM de NaCI, pH 7,5) foram adicionados e a mistura foi centrifugada du-rante 3 minutos sobre microplacas vazias. O tampão de lavagem foi adicio-nado a 200 uL por poço. As amostras foram centrifugadas durante 3 minutossobre microplacas vazias. Então, 4uL de Tris (2,0 M de Tris, pH 8,5, ou 1,0M de Tris pH 8,5) foram adicionados à mistura para neutralização à placa decoleta de UV (Corning/Costar, Corning, NY) antes de realizar a eluição. Otampão de eluição (50 mM de Glicina, 20 ou 50 ou 100 mM de NaCI, pH 2,5ou 3,0) foi adicionado a volumes de 200 uL por poço à placa de filtro. A resi-na e o tampão de eluição foram misturados com uma pipeta de múltiploscanais. A placa de filtro foi então centrifugada durante 3 minutos sobre aplaca de coleta. As placas foram lidas a A280 sobre um leitor de placa Spec-tra Max (Molecular Devices).

2. Determinações de Qualidade de Proteína Utilizando Cromatoqrafia emColuna

Para teste CEX: A eluição foi transferida em alíquotas de 50 uLem uma placa Agilent que contém 100 uL de CEX em fase móvel A. A solu-ção foi misturada. Os procedimentos de purificação em coluna foram reali-zados utilizando procedimentos padrão.

Para teste SEC: A eluição foi transferida em volumes de 130 uLpara uma placa Agilent. A solução foi misturada. Os procedimentos de purifi-cação em coluna foram realizados utilizando procedimentos padrão.

Para teste baseado em HIC e ácido siálico: Quatro microlitrosde 2M de Tris foram adicionados à placa de UV e diretamente eluídos emplaca de UV. A solução foi misturada e analisada em A2so sobre um leitor deplaca Spectra Max.

3. Resultados

Também, a purificação de alto rendimento de amostras utilizan-do as técnicas acima permitiu uma purificação rápida de até 96 amostras porplaca. As técnicas de purificação produziram uma purificação rápida de a-mostras sem uma redução no nível de purificação (figura 12 e 13). Comodeterminado pela quantidade de proteína de alto peso molecular presenteem cada amostra, as técnicas de purificação de alto rendimento bem comooutras técnicas (figuras 12 e 13). Em particular, quando se compara a purifi-cação de alto rendimento com a purificação de Proteína A padrão (figuras 12e 13).

Ademais, a quantidade de proteína de alto peso molecular foiusada para determinar a qualidade da proteína gerada por células que sedesenvolvem em condições de cultura celular diferentes (figura 14). Comomostrado na figura 14, os vários meios testados mostraram quantidades di-ferentes de proteína de alto peso molecular após a purificação que pareciamser dependentes do meio. Em particular, certas condições de meio mostra-ram estatisticamente aprimoramentos significativos na quantidade de proteí-na de alto peso molecular quando comparadas com outros meios (figura 14,setas grandes). Portanto, o procedimento de desenvolvimento de processode cultura celular utilizado acima identificou o meio que mostrou característi-cas de crescimento aprimoradas para purificação a jusante.Equivalentes

Os elementos versados na técnica irão reconhecer, ou ser capa-zes de verificar, utilizando apenas a experimentação comum, inúmeros equi-valentes às composições e procedimentos específicos descritos aqui. Taisequivalentes são considerados para estarem dentro do escopo dessa inven-ção, e são cobertos pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Método de seleção de alto rendimento de linhagens celularespara expressão protéica, que compreende:a) selecionar amostras obtidas de linhagens celulares para de- terminar o nível de expressão de uma proteína de interesse em cada linha-gem celular ao colocar as amostras em contato com um primeiro agente deligação;b) colocar a proteína de interesse em contato com um segundoagente de ligação ligado de maneira operável a um marcador detectável; c) determinar o nível de expressão da proteína de interesse;d) determinar a qualidade apropriada da proteína de interesse;e) selecionar a linhagem celular de expressão protéica de altorendimento da proteína de interesse;onde uma linhagem celular é selecionada se a linhagem celular produzir um nível desejado de expressão e a qualidade apropriada da proteína de inte-resse.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a proteínade interesse é selecionada do grupo que consiste em anticorpos, ligantes,receptores, subunidades de proteínas, fragmentos de proteínas, proteínas de fusão, proteínas recombinantes, e fragmentos desses.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a proteínade interesse é um anticorpo, um anticorpo recombinante, ou um fragmentoF(ab')2.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiroagente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos, ligan-tes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteínasrecombinantes, e fragmentos desses.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o primeiroagente de ligação é Proteína A ou estreptavidina.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o primeiroagente de ligação pode ser ligado a um suporte sólido selecionado do grupoque consiste em microesferas, placas, e chips de microarranjo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o suportesólido compreende celulose, sefarose, poliacrilamida, vidro ou poliestireno.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que uma quali-dade apropriada da proteína de interesse é selecionada do grupo que con-siste em carga, tamanho, atividade enzimática, interação anticorpo-epítopo,ligação de ácido nucléico, teor de carboidrato, estrutura secundária, estrutu-ra terciária, e atividade de ligação.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o segundoagente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos, ligan-tes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteínasrecombinantes, e fragmentos desses.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que o segundoagente de ligação é um anticorpo ou fragmentos desse.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, o anticorpo é umfragmento F(ab')2.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o frag-mento F(ab')2 se liga especificamente à parte Fc de um anticorpo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o segundoagente de ligação marcado com rutênio é marcado com um segundo marca-dor detectável selecionado do grupo que consiste em fluoróforos, corantesquímicos, agentes de ligação radioativos, agentes de ligação quimilumines-centes, agentes eletroqumiluminescente, agentes de ligação magnética, a-gentes de ligação paramagnética, agentes de ligação promagnética, enzi-mas que produzem um produto colorido, enzimas que produzem um produtoquimiluminescente, e enzimas que produzem um produto magnético

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que o frag-mento F(ab')2 é ligado de maneira operável a dois ou mais marcadores àbase de rutênio.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que as amos-tras entram em contato por meio de um terceiro agente de ligação ligado auma resina.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o terceiroagente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos, Iigan-tes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteínasrecombinantes, e fragmentos desses.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, em que o terceiroagente de ligação é Proteína A ou estreptavidina.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o terceiroagente de ligação é ligado a um suporte sólido.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a resina éisolada da mistura e a proteína de interesse expressa é eluída a partir doterceiro agente de ligação.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que a proteí-na de interesse é eluída por um método selecionado do grupo que consisteem eluição a vácuo e fluxo de gravidade.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que as Iinha-gens celulares são selecionadas utilizando uma estação de trabalho automá-tica.

22. Método de seleção de alto rendimento de linhagens celularespara expressão e produção protéica, que compreende:a) colocar um suporte sólido em contato com uma amostra iso-Iada de uma linhagem celular, sendo que o suporte sólido possui um primei-ro agente de ligação ligado à sua superfície, sendo que o primeiro agente deligação é capaz de se ligar a uma proteína de interesse;b) colocar a amostra em contato com um segundo agente deligação que se liga à proteína de interesse, sendo que o segundo agente deligação é ligado de maneira operável a um marcador detectável;c) determinar o nível de expressão da proteína de interesse aodetectar o marcador ligado de maneira operável ao segundo agente de liga-ção que é ligado à proteína de interesse; ed) comparar o nível de expressão da proteína de interesse emcada linhagem celular com o nível médio de expressão da proteína de inte-resse e selecionar a linhagem celular com base na comparação,em que a linhagem celular é selecionada em termos de produ-ção de proteína se o nível de expressão da proteína de interesse na linha-gem celular for maior ou menor que o nível médio de expressão da proteínade interesse em todas as linhagens celulares.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, que compreendeadicionalmente isolar os sobrenadantes das linhagens celulares seleciona-das, e colocar os sobrenadantes em contato com um reagente que se liga àproteína de interesse.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que o rea-gente é ligado a um suporte sólido.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que o suportesólido é uma placa de múltiplos poços.

26. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a proteí-na de interesse ligada é eluída do reagente e avaliada em termos de quali-dade apropriada.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que a linha-gem celular é selecionada em termos de expressão protéica se a linhagemcelular for selecionada na etapa e), e a proteína de interesse expressa pos-sui a qualidade apropriada.

28. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que a proteí-na de interesse é selecionada do grupo que consistem em anticorpos, Iigan-tes, receptores, subunidades de proteínas, fragmentos de proteínas, proteí-nas de fusão, proteínas recombinantes, e fragmentos desses.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a proteí-na de interesse é um anticorpo, um anticorpo recombinante, ou um fragmen-to F(ab')2.

30. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o primei-ro agente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos,ligantes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteí-nas recombinantes, e fragmentos desses.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que o primei-ro agente de ligação é Proteína A ou estreptavidina.

32. Método,de acordo com a reivindicação 22, em que os agen-tes de ligação podem ser ligados a um suporte sólido selecionado do grupoque consiste em microesferas, placas, e chips de microarranjo.

33. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que o suportesólido compreende celulose, sefarose, poliacrilamida, vidro, ou poliestireno.

34. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o segun-do agente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos,ligantes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteí-nas recombinantes, e fragmentos desses.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o segun-do agente de ligação é um anticorpo ou fragmentos desse.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o anti-corpo é um fragmento F(ab')2.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o anti-corpo é um fragmento F(ab')2 que se liga especificamente à parte Fc de umanticorpo.

38. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o marca-dor detectável é selecionado do grupo que consiste em fluoróforos, corantesquímicos, agentes de ligação radioativos, agentes de ligação quimilumines-centes, agentes eletroquimiluminescentes, agentes de ligação magnética,agentes de ligação paramagnética, agentes de ligação promagnética, enzi-mas que produzem um produto colorido, enzimas que produzem um produtoquimiluminescente, e enzimas que produzem um produto magnético.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, em que o marca-dor detectável é rutênio.

40. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que um rea-gente compreende uma resina que possui um terceiro agente de ligação li-gado a essa, sendo que o terceiro agente de ligação é capaz de se ligar àproteína de interesse.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, em que o terceiroagente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos, ligan-tes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteínasrecombinantes, e fragmentos desses.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, em que o terceiroagente de ligação é Proteína A ou estreptavidina.

43. Método, de acordo com a reivindicação 40, em que a resinaé isolada, e a proteína de interesse é eluída a partir do terceiro agente deligação.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que a proteí-na de interesse é eluída a partir do terceiro agente de ligação utilizando ummétodo selecionado do grupo que consiste em eluição a vácuo e fluxo degravidade.

45. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que a sele-ção das linhagens celulares incubadas utiliza uma estação de trabalho au-tomática.

46. Método para desenvolvimento de processo de cultura celu-lar, que compreende:a) incubar cada linhagem celular em uma condição de culturacelular diferente;b) colocar cada amostra de linhagem celular em contato com oprimeiro agente de ligação ligado a um suporte sólido, sendo que o primeiroagente de ligação se liga a uma proteína de interesse nas amostras de Ii-nhagem celular;c) colocar a proteína de interesse ligada pelo primeiro agente deligação em contato com um segundo agente de ligação, que é ligado de ma-neira operável a um marcador detectável;d) determinar o nível de expressão da proteína de interesse aodetectar o marcador ligado de maneira operável ao segundo agente de liga-ção que é ligado à proteína de interesse; ee) selecionar a linhagem celular baseada no nível detectado deexpressão da proteína de interesse,em que uma linhagem celular é selecionada se o nível de expres-são da proteína de interesse na linhagem celular for maior ou menor q eu onível médio de expressão da proteína de interesse em todas as linhagenscelulares.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, que compreendeadicionalmente isolar os sobrenadantes das linhagens celulares seleciona-das, e colocar os sobrenadantes em contato com um reagente que se liga àproteína de interesse.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, em que o rea-gente é ligado a um suporte sólido.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que o suportesólido é uma placa de múltiplos poços.

50. Método, de acordo com a reivindicação 47, em que a proteí-na de interesse ligada é eluída a partir do reagente e avaliada em termos dequalidade apropriada.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, em que a linha-gem celular é selecionada em termo de expressão protéica se a linhagemcelular for selecionada na etapa e), e a proteína de interesse expressa pos-sui a qualidade apropriada.

52. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que a proteí-na de interesse é selecionada do grupo que consiste em anticorpos, Iigan-tes, receptores, subunidades de proteínas, fragmentos de proteínas, proteí-nas de fusão, proteínas recombinantes, e fragmentos desses.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, em que a proteí-na de interesse é um anticorpo, um anticorpo recombinante, ou um fragmen-to F(ab')2.

54. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que o primei-ro agente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos,ligantes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteí-nas recombinantes, e fragmentos desses.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, em que o primei-ro agente de ligação é Proteína A ou estreptavidina.

56. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que os agen-tes de ligação podem ser ligados a um suporte sólido selecionado do grupoque consiste em microesferas, placas, e chips de microarranjo.

57. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que o suportesólido compreende celulose, sefarose, poliacrilamida, vidro ou poliestireno.

58. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que o segun-do agente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos,ligantes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteí-nas recombinantes, e fragmentos desses.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, em que o segun-do agente de ligação é um anticorpo ou fragmentos desse.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, em que o anti-corpo é um fragmento F(ab')2.

61. Método, de acordo com a reivindicação 59, em que o anti-corpo é um fragmento F(ab')2 que se liga especificamente à parte Fc de umanticorpo.

62. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que o marca-dor detectável é selecionado do grupo que consiste em fluoróforos, corantesquímicos, agentes de ligação radioativos, agentes de ligação quimilumines-centes, agentes eletroquimiluminescentes, agentes de ligação magnética,agentes de ligação paramagnética, agentes de ligação promagnética, enzi-mas que produzem um produto colorido, enzimas que produzem um produtoquimiluminescente, e enzimas que produzem um produto magnético.

63. Método, de acordo com a reivindicação 62, em que o marca-dor detectável é rutênio.

64. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que um rea-gente compreende uma resina que se liga a um terceiro agente de ligaçãoligado a essa, sendo que o terceiro agente de ligação é capaz de se ligar àproteína de interesse.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, em que o terceiroagente de ligação é selecionado do grupo que consiste em anticorpos, ligan-tes, receptores, proteínas de fusão, subunidades de proteínas, proteínasrecombinantes, e fragmentos desses.

66. Método, de acordo com a reivindicação 65, em que o terceiroagente de ligação é Proteína A ou estreptavidina.

67. Método, de acordo com a reivindicação 64, em que a resinaé isolada, e a proteína de interesse é eluída do terceiro agente de ligação.

68. Método, de acordo com a reivindicação 67, em que a proteí-na de interesse é eluída a partir do terceiro agente de ligação utilizando ummétodo selecionado do grupo que consiste em eluição a vácuo e fluxo degravidade.

69. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que a sele-ção das linhagens celulares incubadas utiliza uma estação de trabalho au-tomática.