BRPI0710508B1 - composição de pepticorpo terapêutico liofilizado estável, kit para preparar uma composição farmacêutica aquosa, e métodos para fabricar um pepticorpo terapêutico liofilizado e para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico reconstituído - Google Patents

Abstract

composição de pepticorpo terapêutico liofilizado, métodos para fabricar um pepticorpo terapêutico liofilizado e para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico reconstituído, e, kit para preparar uma composição farmacêutica aquosa. a presente invenção fornece formulações estáveis de longa duração de um pepticorpo terapêutico liofilizado e métodos para fabricar uma composição liofilizada compreendendo um pepticorpo terapêutico.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO DE PEPTICORPO TERAPÊUTICO LIOFIL1ZADO ESTÁVEL, KIT PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA, E MÉTODOS PARA FABRICAR UM PEPTICORPO TERAPÊUTICO LIOFILIZADO E PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE PEPTICORPO TERAPÊUTICO RECONSTITUÍDO (51) lnt.CI.: A61K 39/395; A61K 39/00 (30) Prioridade Unionista: 19/04/2007 US 11/788,697, 21/04/2006 US 60/793,997 (73) Titular(es): AMGEN INC.

(72) Inventor(es): WILLIAM J. CALLAHAN; RICHARD L. REMMELE JR; GAYATHRI RATNASWAMY; RAMIL F. LATYPOV; DINGJIANG LIU (85) Data do Início da Fase Nacional: 20/10/2008 “COMPOSIÇÃO DE PEPTICORPO TERAPÊUTICO LIOFILIZADO ESTÁVEL, KIT PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA AQUOSA, E MÉTODOS PARA FABRICAR UM PEPTICORPO TERAPÊUTICO LIOFILIZADO E PARA PREPARAR

UMA COMPOSIÇÃO DE PEPTICORPO TERAPÊUTICO RECONSTITUÍDO”

CAMPO DA INVENÇÃO

No geral, a invenção diz respeito às formulações de pepticorpos terapêuticos liofilizados e métodos para fabricar uma composição bofibzada compreendendo os pepticorpos terapêuticos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As proteínas recombinantes são uma classe emergente de agentes terapêuticos. Tais produtos terapêuticos recombinantes têm engendrado avanços na formulação e modificação química de proteína.

Modificações foram identificadas que podem proteger proteínas terapêuticas, primariamente pelo bloqueio da sua exposição às enzimas proteolíticas. As modificações de proteína também podem aumentar a estabibdade da proteína terapêutica, tempo de circulação e atividade biológica. Um artigo de revisão que descreve a modificação de proteína e proteínas de fusão é Francis (1992),

Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Mediscript, Londres), que é aqui incorporada por referência.

Uma modificação útil é a combinação de um polipeptídeo com um domínio “Fc” de um anticorpo. Os anticorpos compreendem duas partes funcionalmente independentes, um domínio variável conhecido como “Fab,” que bga antígeno e um domínio constante conhecido como “Fc,” que se bga a tais funções efetoras como ativação de complemento e ataca pelas células fagocíticas. Um Fc tem uma meia vida sérica longa, ao passo que um Fab é de vida curta. Capon et al. (1989), Nature 337: 525-31. Ver também, por exemplo, Patente U.S. N° 5.428.130. Quando construído junto com um pepticorpo ou proteína terapêuticos, um domínio Fc pode fornecer meia vida

Petição 870180009400, de 02/02/2018, pág. 10/18 mais longa ou incorporar funções tais como ligação de receptor de Fc, ligação de proteína A, fixação de complemento e talvez até a transferência placentária. Id. A Tabela 1 resume o uso de fusões de Fc com proteínas terapêuticas conhecidas na técnica.

Tabela 1 - Fusão de Fc com proteínas terapêuticas

Forma de Fc	Parceiro de fusão	Implicações Terapêuticas Referência
IgGl	término N de CD30-L	Doença de Hodgkin; linfoma anaplástico; Leucemia de célula T	Patente U.S. No. 5.480.981
Fcy2a de murino IL-10	anti-inflamatório; rejeição de transplante	Zheng et al. (1995), J. Immunol. 154: 5590-600
IgG	Receptor de TNF	choque séptico	Fisher et al. (1996), N. Engl. J. Med. 334: 16971702; Van Zee, K. et al. (1996), J. Immunol. 156: 2221-30
IgG, IgA, IgM,	Receptor de TNF	inflamação, distúrbiosPat. U.S. No. 5.808.029,
ou IgE (excluindo o primeiro domínio)		autoimunes	concedida em 15 de setembro de 1998
Trvf71		A TTAC	~1 /mon\ ___ ν^αρυπ vt ai. ç 137037 j, i^atuic 337: 525-31
	IVVVVJJlVi WV- V/JL/T
IgGl,	término N	anticâncer, antiviral	Harvilletal. (1995),
IgG3	de IL-2		Immunotech. 1: 95-105
IgGl	término C de	osteoartrite;	WO 97/23614, publicada em 3 de
	OPG	densidade óssea	julho de 1997
IgGl	término N de leptina	anti-obesidade	PCT/US 97/23183, depositada em 11 de dezembro de 1997
lg Cyl Humana	CTLA-4	distúrbios autoimunes	Linsley (1991), J. Exp. Med. 174:561-9

Polietileno glicol (“PEG”) conjugado ou proteínas de fusão e peptídeos também foram estudados para o uso em produtos farmacêuticos, em implantes artificiais e outras aplicações onde a biocompatibilidade é de importância. Vários derivados de PEG foram propostos que têm uma porção ativa para permitir que o PEG seja ligado a produtos farmacêuticos e implantes e às moléculas e superfícies no geral. Por exemplo, derivados de PEG foram propostos para ligar PEG às superfícies para controlar umectação, desenvolvimento de estática e ligação de outros tipos de moléculas à superfície, incluindo proteínas ou resíduos de proteína.

Em outros estudos, a ligação de PEG (“PEGuilação”) tem sido mostrada ser desejável na superação de obstáculos encontrados em uso clínico de moléculas biologicamente ativas. A Publicação PCT publicada N° WO 92/16221 estabelece, por exemplo, que muitas proteínas potencialmente terapêuticas foram descobertas ter uma meia vida curta no soro sangüíneo.

A PEGuilação diminui a taxa de depuração da corrente sangüínea aumentando-se o peso molecular aparente da molécula. Até um certo tamanho, a taxa de filtração glomerular de proteínas é inversamente proporcional ao tamanho da proteína. A capacidade de PEGuilação para diminuir a depuração, portanto, no geral não é uma função de quantos grupos de PEG estão ligados à proteína, mas do peso molecular global da proteína conjugada. A depuração diminuída pode levar à eficácia aumentada em relação ao material não PEGuilado. Ver, por exemplo, Conforti et al., Pharm. Research Commun. vol. 19, pg. 287 (1987) e Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. vol. 84, pg. 1487 (1987).

Além disso, a PEGuilação pode diminuir a agregação de proteína, (Suzuki et al., Biochem. Biophys. Acta vol. 788, pg. 248 (1984)), alterar (i.e.,) a imunogenicidade da proteína (Abuchowski et al., J. Biol. Chem. vol. 252 pg. 3582 (1977)) e aumentar a solubilidade da proteína como descrito, por exemplo, na Publicação PCT N° WO 92/16221.

No geral, a interação de um ligando de proteína com seu receptor freqüentemente ocorre em uma interface relativamente grande. Entretanto, como demonstrado no caso do hormônio do crescimento humano ligado ao seu receptor, apenas uns poucos resíduos chave na interface realmente contribuem para a maior parte da energia de ligação. Clackson, T. et al., Science 267: 383-386 (1995). Esta observação e o fato de que o grosso do ligando de proteína remanescente serve apenas para demonstrar os epítopos de ligação na topologia certa toma possível descobrir ligandos ativos de tamanho muito menor. Assim, moléculas de comprimento apenas de “peptídeo” como aqui definidas podem ligar-se à proteína receptora de um dado ligando de proteína grande. Tais peptídeos podem imitar a bioatividade do ligando de proteína grande (“agonistas de peptídeo”) ou, através da ligação competitiva, inibem a bioatividade do ligando de proteína grande (“antagonistas de peptídeo”).

As bibliotecas de peptídeo de demonstração de fago têm emergido como um método poderoso na identificação de tais agonistas e antagonistas de peptídeo. Ver, por exemplo, Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devim et al. (1990), Science 249: 404; Pat. U.S. N° 5.223.409, concedida em 29 de junho de 1993; Pat. U.S. N° 5.733.731, concedida em 31 de março de 1998; Pat. U.S. N° 5.498.530, concedida em 12 de março de 1996; Pat. U.S. N° 5.432.018, concedida em 11 de julho de 1995; Pat. U.S. N° 5.338.665, concedida em 16 de agosto de 1994; Pat. U.S. N° 5.922.545, concedida em 13 de julho de 1999; WO 96/40987, publicada em 19 de dezembro de 1996; e WO 98/15833, publicada em 16 de abril de 1998, cada uma da qual é incorporada por referência. Em tais bibliotecas, as seqüências de peptídeo aleatórias são demonstradas pela fusão com proteínas de revestimento de fago filamentoso. Tipicamente, os peptídeos demonstrados são eluídos por afinidade contra um domínio extracelular imobilizado por anticorpo de um receptor. Os fagos retidos podem ser enriquecidos pelas rodadas sucessivas de purificação por afinidade e repropagação e os melhores peptídeos de ligação são seqüenciados para identificar resíduos chave dentro de uma ou mais famílias estruturalmente relacionadas de peptídeos. Ver, por exemplo, Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, em que duas famílias distintas foram identificadas. As seqüências de peptídeo também podem sugerir que resíduos podem ser substituídos com segurança pela varredura de alanina ou pela mutagênese ao nível de DNA. As bibliotecas de mutagênese podem ser criadas e triados para otimizar ainda mais a seqüência dos melhores aglutinantes. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24.

Outros métodos competem com a demonstração de fago na pesquisa de peptídeo. Uma biblioteca de peptídeo pode ser fundida ao terminal carboxila do repressor lac e expressada na E. coli. Um outro método com base na E. coli permite demonstrar na membrana externa da célula pela fusão com uma lipoproteína associada com peptidoglicano (PAL). Estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como “demonstração de E. coli.” Um outro método biológico para triar misturas de peptídeo solúveis usa levedura para a expressão e secreção. Ver Smith et al. (1993), Mol. Pharmacol. 43: 741-8. O método de Smith et al. e métodos relacionados são aludidos como “triagem com base em levedura.” Em um outro método, a tradução de RNA aleatório é parada antes da liberação de ribossoma, resultando em uma biblioteca de polipeptídeos com seu RNA associado ainda ligado. Estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como “demonstração dc ribossoma.” Outros métodos utilizam a ligação química de peptídeos ao RNA; ver, por exemplo, Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 94: 12297-303. Estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como “triagem de RNA-peptídeo.” As bibliotecas de peptídeo quimicamente derivadas foram desenvolvidas em que peptídeos são imobilizados em materiais estáveis, não biológicos, tais como varetas de polietileno ou resinas permeáveis a solvente. Uma outra biblioteca de peptídeo quimicamente derivada usa fotolitografia para varrer peptídeos imobilizados em lâminas de vidro. Estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como “triagem química de peptídeo.” A triagem química de peptídeo pode ser vantajosa em que a mesma permite o uso de Daminoácidos e outros análogos não naturais, assim como elementos não peptídicos. Os métodos tanto biológicos quanto químicos são revisados em Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62.

No caso de peptídeos bioativos conhecidos, o planejamento racional de ligandos de peptídeo com propriedades terapêuticas favoráveis pode ser realizado. Em um tal método, mudanças escalonadas são feitas a uma seqüência de peptídeo e o efeito da substituição na bioatividade ou em uma propriedade biofísica previsível do peptídeo (por exemplo, estrutura da solução) é determinado. Estas técnicas são coletivamente aludidas como “planejamento racional.” Em uma tal técnica, uma série de peptídeos é fabricada em que um único resíduo de uma vez é substituído com alanina. Esta técnica é habitualmente aludida como uma “marcha de alanina” ou uma “varredura de alanina.” Quando dois resíduos (contíguos ou espaçados) são substituídos, é aludido como uma “marcha de alanina dupla.” As substituições de aminoácido resultantes podem ser usadas sozinhas ou em combinação para resultar em uma nova entidade de peptídeo com propriedades terapêuticas favoráveis.

A análise estrutural da interação de proteína-proteína também pode ser usada para sugerir peptídeos que imitem a atividade de ligação de ligandos de proteína grandes. Em uma tal análise, a estrutura cristalina pode sugerir a identidade e orientação relativa de resíduos críticos do ligando de proteína grande, a partir do qual um peptídeo pode ser planejado. Ver, por exemplo, Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70. Estes e métodos relacionados são aludidos como “análise estrutural de proteína.” Estes métodos analíticos também podem ser usados para investigar a interação entre uma proteína receptora e peptídeos selecionados pela demonstração de fago, que pode sugerir outra modificação dos peptídeos para aumentar a afinidade de ligação.

Conceitualmente, miméticos de peptídeo de qualquer proteína podem ser identificados usando a demonstração de fago e os outros métodos mencionados acima. Estes métodos também foram usados para o mapeamento de epítopo, para a identificação de aminoácidos críticos nas interações de proteína-proteína e como guias para a descoberta de novos agentes terapêuticos. Por exemplo, Cortese et al. (1996), Curr. Opin. Biotech. 7: 61621. As bibliotecas de peptídeo estão agora sendo usadas mais freqüentemente em estudos imunológicos, tais como no mapeamento de epítopo. Kreeger (1996), The Scientist 10(13): 19-20.

De interesse particular é o uso de bibliotecas de peptídeo e outra técnicas na descoberta de peptídeos farmacologicamente ativos. Vários de tais peptídeos identificados na técnica são resumidos na Tabela 2. Os peptídeos são descritos nas publicações listadas, cada uma da qual é aqui incorporada por referência. A atividade farmacológica dos peptídeos é descrita e em muitos casos é seguida por um termo resumido para a mesma em parênteses. Alguns destes peptídeos foram modificados (por exemplo, para formar dímeros reticulados de terminal C). Tipicamente, bibliotecas de peptídeo foram tríadas quanto a ligação a um receptor para uma proteína farmacologicamente ativa (por exemplo, receptor EPO). Em pelo menos um caso (CTLA4), a biblioteca de peptídeo foi triada quanto a ligação a um anticorpo monoclonal.

Tabela 2 - Peptídeos farmacologicamente ativos

Forma de peptídeo	Parceiro de ligação/proteína de interesse1	'Atividade 'farmacológica	Referência
T , ,,, Receptor de EPO Intrapeptideo ligado a dissulfeto	Mimético de EPO	Wrighton et al. (1996), Science 273: 458-63; Pat. U.S. No. 5.773.569, concedida em 30 de junho de 1998 concedida a Wrighton et al.
Dímero reticulado terminal C	Receptor de EPO de	Mimético de EPO	Livnah et al. (1996), Science 273: 464-71; Wrighton et al. (1997), Nature Biotechnology 15: 1261-5; Pedido de Patente Internacional WO 96/40772, publicado em 19 de dezembro de 1996
linear	Receptor de EPO	Mimético de EPO	Naranda et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96: 7569-74; WO 99/47151, publicada em 23 de setembro de 1999
linear	c-Mpl	Mimético de TPO	Cwirla et al. (1997) Science 276: 1696-9; Pat. U.S. No. 5.869.451, concedida em 9 de fevereiro de 1999; Pat. U.S. No. 5.932.946, concedida em 3 de agosto de 1999
Dímero reticulado terminal C	c-Mpl de	Mimético de TPO	Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9
Dímero ligado dissulfeto —t-. r~.	a	estimulação hematopoiese (mimético de 1 CSF)	daPaukovits et al. (1984), Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 365: 303- G-ll; Laerum et al. (1988), Exp. Hemat. 16: 274-80

¹ A proteína listada nesta coluna pode ser ligada pelo peptídeo associado (por exemplo, receptor de EPO, receptor de DL-1) ou imitado pelo peptídeo associado. As referências listadas para cada esclarecimento de se a molécula está ligada aos ou imitada pelos peptídeos.

Bhatnagar et al. (1996), J.

Med. Chem. 39: 3814-9;

• '*· j r- Cuthbertson et al. (1997), J.

Dímero ligado mimetico de G-CSF Med. _{chem 4θ; 2876}._{82; Külg}

a alquileno			et al. (1991), Exp. Hematol. 19: 481; King et al. (1995), Blood 86 (Supl. 1): 309a
Linear	receptor IL-1	Doenças inflamatórias e autoimunes (“antagonista de EL-1” ou “mimético de IL-Ira-”)	Pat. U.S. No. 5.608.035; Pat. U.S. No. 5.786.331; Pat. U.S. No. 5.880.096; Yanofsky et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 7381-6; Alceson et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 30517-23; Wiekzorek et al. (1997), Pol. J. Pharmacol. 49: 107-17; Yanofsky (1996), PNAs, 93: 7381-7386.
linear	Fator Tímico SéricoEstimulação de linfócitos (FTS) (“mimético de FTS”)	Inagaki-Ohara et al. (1996), Cellular Immunol. 171: 30-40; Yoshida (1984), Int. J. Immunopharmacol, 6: 141-6.
intrapeptídeo ligado dissulfeto	CTLA4 MAb a	Mimético de CTLA4	Fukumoto et al. (1998), Nature Biotech. 16: 267-70
exocíclico	Receptor de TNF-α Antagonista de TNF-a	Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 126670; WO 98/53842, publicada em 3 de dezembro de 1998
linear	τ> x j -Π.ΤΓ Antagonista de TNF-a Receptor de TNF-a	Chirinos-Rojas (1998), J. Imm., 5621-5626.
intrapeptídeo ligado dissulfeto	C3b a	inibição da ativação deSahu et al. (1996), J. complemento; doençaslmmunol. 157: 884-91; autoimunes Morikis et al. (1998), (“antagonista de C3b”) Protein Sei. 7: 619-27
linear	vinculina	Processos de adesão celular crescimento, diferenciaçãoAdey et al. (1997), celulares, cicatrização deBiochem. J. 324: 523-8 ferimento, metástase de tumor (“ligação de vinculina”)
linear	p, , , , .. _ anti-trombótico Proteína de ligaçao de C4 (C4BP)	Linse et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 14658-65
linear	Receptor uroquinase	daprocessos associados com a„ , ~ , - Goodsonetal. (1994), mteraçao da uroquinase comn _T \ ’ x , Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 0 seu receptor (por exemplo,^ pedjdo lntcrnacl0na| angtogenese, wo 97/35969, publicado em 2 mvasao de célula de tumor e , , ’ 5. _ ., . , , de outubro de 1997 metastase); ( antagonista de UKR”)
linear	Mdm2, Hdm2	Inibição da inativação de Picksley et al. (1994), p53 mediada por Mdm2 ouOncogene 9: 2523-9;

hdm2; anti-tumor

Bottger et al. (1997) J. Mol.

(“antagonista de Mdm/hdm”) Biol. 269: 744-56; Bottger et al. (1996), Oncogene 13: 2141-7
linear	p21wsn	anti-tumor pela imitação daBall et al. (1997), Curr. atividade de p21WAF1 Biol. 7: 71-80
linear	famesil transferase	anticâncer pela prevenção daGibbs et al. (1994), Cell ativação de oncogene ras 77: 175-178
linear	Domínio efetor Ras	deanticâncer pela inibição daMoodie et al. (1994), função biológica do Trends Genet 10: 44-48 oncogene ras Rodriguez et al. (1994), Nature 370: 527-532 76:933-945; Rickles et al. (1994), EMBO J. 13: 5598-5604; Sparks et al. (1994), J. Biol. Chem. 269: 23853-6; Sparks et al. (1996), 6; Sparks et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 1540-4; Pat. US No. 5.886.150, concedida em 23 de março de 1999; Pat. US No. 5.888.763, concedida em 30 de março de 1999
linear	P161NK4	anticâncer pela imitação da atividade de pl6; por exemplo, inibição do complexo ciclina D-Cdk FAhraeus et al. (1996), (“mimético de pl6”) Curr. Biol. 6: 84-91
linear	Src, Lyn	inibição da ativação de mastóide, condições Stauffer et al. (1997), relacionadas com IgE,Biochem. 36: 9388-94 hipersensibilidade tipo I (“antagonista de mastóide”)
linear	Protease mastóide	de tratamento de distúrbios^ , T . . mflamatorios mediados pela„„ ... , ... ~ · x z- 98/33812, publicado em liberaçao de triptase-6 , , ’ , , /«· v-j j x -i 6 de agosto de 1998 ( inibidores da protease de mastóide”)
linear	Antígeno de nucleotratamento de infecções viraisP^ XT .1 * e · À deHBV(HBcAg) de HBV (“anti-HBV ) 21948
linear	selectinas	A, ~ , ,c, Martens et al. (1995), J. Adesão de neutrofilo; . . r. . „ . Biol. Chem. 270: 21129-36; Doenças inflamatórias _ ... , ’ . . . , , . · „x Pedido de patente europeia EP ( antagonista de selectma ) θ ?]4 912 Ppublicada / 5 de junho de 1996
linear, ciclizadaCalmodulina	Pierce et al. (1995), Molec. Diversity 1: 259-65; Antagonista de calmodulina Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 2302530; Adey & Kay (1996), Gene 169: 133-4
linear, ciclizada	integrinas	Autodireção de tumor; Pedidos Internacionais tratamento para WO 95/14714, publicado em 1 condições relacionadas de junho de 1995; WO com eventos celulares97/08203, publicado em 6 de mediados pela integrina,março de 1997; WO 98/10795,

	incluindo agregação depublicado em 19 de março de plaqueta, trombose, 1998; cicatrização de ferimento, WO 99/24462, publicado em osteoporose, reparo de tecido, 20 de maio de 1999; Kraft et al. angiogênese (por exemplo,(1999), J. Biol. Chem. 274: para o tratamento de câncer) e 1979-1985 invasão de tumor (“ligação de integrina”)
cíclico, linear fibronectina	etratamento de condições WO 98/09985, publicada em 12

componentes dainflamatórias e autoimunes de março de 1998 matriz extracelular de células T e macrófagos

Linear	somatostatina e	tratamento ou prevenção	dePedido de patente europeu	0
	cortistatina	tumores que produzem911 393, publicado em 28 hormônio, acromegalia, abril de 1999 gigantismo, demência, úlcera gástrica, crescimento de tumor, inibição da secreção de hormônio, modulação do sono ou atividade neural	de
linear	Lipopolissacarídeo	antibiótico; choque séptico;	Pat. U.S.N2 5.877.151,
	bacteriano	distúrbios moduláveis por CAP37	concedida em 2 de março 1999	de
linear ou cíclico, incluindo Daminoácidos	pardaxin, melitina	antipatogênico	WO 97/31019, publicada em 28 de agosto de 1997
linear, cíclico	VIP	impotência,	WO 97/40070, publicada em

distúrbios neurodegenerativos30 de outubro de 1997

linear	CTLs	câncer	EP 0 770 624, publicada em 2 de maio de 1997
linear	THF-gama2		Bumstein (1988), Biochem., 27: 4066-71.
linear	Amilina		Cooper (1987), Proc. Natl. Acad. Sei., 84: 8628-32.
linear	Adrenomedulina		Kitamura (1993), BBRC, 192: 553-60.
cíclico, linear	VEGF	anti-angiogênico; câncer,	Fairbrother (1998),

artrite reumatóide, retinopatiaBiochem., 37: 17754-17764.

diabética, psoríase
cíclico	MMP	inflamação e distúrbios autoimunes; crescimento de tumor	Koivunen (1999), Nature Biotech., 17: 768-774.
	Fragmento HGH	tratamento de obesidade	Pat. U.S. No. 5.869.452
linear	Autoanticorpo SFE	SFE	WO 96/30057, publicada em 3 de outubro de 1996
	GDlalpha	supressão da metástase tumor	delshikawa et al. (1998), FEBS Lett. 441 (1): 20-4

anticorpos Ativação de célula endotelial, antifosfolipídicos síndrome de antifosfolipídeo de beta-2-(APS), fenômeno glicoproteína-1 tromboembólico, (132 GPI) trombocitopenia e perda fetal

Blank et al. (1999), Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 96:

5164-8 __recorrente linear Cadeia beta do diabete

Receptor de Célula T

WO 96/11214, publicada em 18 de abril de 1996.

Antiproliferativa, antiviral WO 00/01402, publicada em _ _13 de janeiro de 2000._ anti-isquêmica, liberação doWO 99/62539, publicada em hormônio do crescimento 9 de dezembro de 1999.

anti-angiogênico WO 99/61476, publicada em de dezembro de 1999.

linear	Agonista	de	Apoptose; WO 99/38526, publicada em
	tratamento	de	distúrbios 5 de agosto de 1999.
	associados	com	a célula T
	(por exemplo,	doenças

autoimunes, infecção viral, leucemia de célula T, linfoma de célula T)

linear	MHC classe II	tratamento de doençasPat. US No. 5.880.103,
autoimunes	concedida em 9 de março de 1999.
linear	androgênio R, p75,Proapoptótico, útil	noWO 99/45944, publicada em
	MJD, DCC, huntingtina	tratamento de câncer	16 de setembro de 1999.

linear Fator de voninibição da interação do FatorWO 97/41220, publicada em

	Willebrand; FatorVIII; anticoagulantes VIII	29 de abril de 1997.
linear	lentivírus LLP1	antimicrobiano	Pat. US Ns 5.945.507, concedida em 31 de agosto de 1999.
linear	Peptídeo indutor doDistúrbios do sono sono delta	Graf (1986), Peptides 7: 1165.
linear	Proteína Reativa C (CRP)	inflamação e câncer	Bama (1994), Câncer Immunol. Immunother. 38: 38(1994).
linear	Peptídeos ativadores. c .... , , infertilidade de esperma	Suzuki (1992), Comp. Biochem. Physiol. 102B: 679.
linear	angiotensinas	fatores hematopoiéticos condições hematocitopênicas de câncer, AIDS, etc.	ParaLundergan (1999), J. Periodontal Res. 34(4): 223228.
linear	HIV-1 gp41	anti-AIDS	Chan(1998), Cell 93: 681684.
linear	PKC	, Moonga (1998), Exp. mib.çao da reabsorçao ossea physi » ?1'??2ξ
linear	defensinas (HNP1, -2, -3, -4)	antimicrobiano	Harvig (1994), Methods Enz. 236: 160-172.
linear	pl 85^^, C- erbB-2	Miméticos de AHNP: tumor	anti-Park (2000), Nat. Biotechnol. 18: 194-198.
linear	gp 130	Antagonista de IL-6	WO 99/60013, publicada em 25 de novembro de 1999.
linear	colágeno, outras Doenças autoimunes juntas, cartilagem, proteínas	WO 99/50282, publicada em 7 de outubro de 1999.

relacionadas com tratamento de doenças WO 99/51254, publicada em degenerativas neurológicas 14 de outubro de 1999.

artrite linear linear

Proteína de envelope do HTV-1

IL-2 distúrbios autoimunes (porWO 00/04048, publicada em exemplo, rejeição de enxerto,27 de janeiro de 2000; WO artrite reumatoide) 00/11028, publicada em 2 de março de 2000,

Os peptídeos identificados pela triagem de biblioteca de peptídeo foram considerados como “guias” no desenvolvimento de agentes terapêuticos ao invés de serem usados como os próprios agentes terapêuticos. Como outras proteínas e peptídeos, estes podem ser rapidamente removidos in vivo pela filtração renal, mecanismos de depuração celular no sistema reticuloendotelial ou degradação proteolítica. (Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-11.) Como um resultado, a técnica presentemente usa os peptídeos identificados para validar alvos medicamentosos ou como esqueletos para o planejamento de compostos orgânicos que não teriam sido tão facilmente ou tão rapidamente identificados através da triagem de biblioteca química. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8.

Tipicamente, os peptídeos purificados são apenas marginalmente estáveis em um estado aquoso e sofrem de degradação química e física resultando em uma perda de atividade biológica durante o processamento e armazenagem. Adicionalmente, as composições de peptídeo em solução aquosa sofre hidrólise, tal como a desamidação e divagem de ligação de peptídeo. Estes efeitos representam um sério problema para os peptídeos terapeuticamente ativos que são intencionados a serem administrados aos seres humanos dentro de uma faixa de dosagem definida com base na atividade biológica.

A administração de peptídeos purificados permanece uma estratégia de tratamento promisssora para muitas doenças que afetam a população humana. Entretanto, a capacidade do pepticorpo terapêutico para permanecer em uma composição farmacêutica estável com o tempo em uma variedade de condições de armazenagem e ser então eficaz para os pacientes in vivo não foi tratada. Assim, permanece uma necessidade na técnica para fornecer pepticorpos terapêuticos em formulações estáveis que são úteis como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças e distúrbios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece formulações úteis para a liofilização de pepticorpos terapêuticos, resultando em um produto de pepticorpo terapêutico altamente estável. O produto de pepticorpo terapêutico estável é útil como um agente terapêutico no tratamento de indivíduos que sofrem de distúrbios ou condições que podem se beneficiar da administração do pepticorpo terapêutico.

Em um aspecto, a invenção fornece uma composição de pepticorpo terapêutico liofilizado que compreende um tampão, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e opcionalmente um tensoativo; em que o tampão é compreendido de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de of cerca de 5 mM a cerca de 20 mM e em que o pH está em uma faixa de cerca de 3,0 a cerca de 8,0; em que o agente de encorpamento está em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 4,5 % p/v; em que o agente estabilizante está em uma concentração de cerca de 0,1 % a cerca de 20 % p/v; em que o tensoativo está em uma concentração de cerca de 0,004 % a cerca de 0,4 % p/v; e em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula I,

Fórmula I: [(X¹), - FXx^KLlWSPd em que:

F¹ é um domínio Fc;

X¹ é selecionado de

P‘-(L²)eP²(L³)rP'-(L²)_e14 pUVpUVp¹-^²),- e pVvp^lVp²^³)^¹-^2

X é selecionado de:

-(L^e-P¹

-(lVp^lVp²

-(L²)e-P¹-(L³)f-P²-(L⁴)g-P³ e

-(L²)e-P¹-(L³)rP²-(L⁴)g-P³-(L⁵)_h-P⁴ em que P¹, P², P³ e P⁴ são cada um independentemente seqüências de peptídeos farmacologicamente ativos;

L¹, L², L³, L⁴ e L⁵ são cada um independentemente ligadores; a, b, c, e, f, g e h são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de a e b seja 1; d é 0 1 nu maior do mie 1; e ’ ,----------- --- -χ-· >

WSP é um polímero solúvel em água, a ligação do qual é efetuada em qualquer porção reativa em F¹.

Em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula II

Fórmula II: [X^Kl/jc-WSPa em que o domínio Fc está ligado no término C de X¹ e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Ainda em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula III

Fórmula III: [F^X^-CL^c-WSPd em que o domínio Fc está ligado ao término N de X e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Ainda em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula IV

Fórmula IV: [F^CL^e-P^-CL^c-WSPd em que o domínio Fc está ligado ao término N de -(L^-P¹ e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula V

Fórmula V: [F^CL^e-P^CL^^-CL^c-WSPa em que o domínio Fc é ligado ao término N de -L -P -L -P e zero, um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico é um multímero ou dímero. Em uma outra forma de realização, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que P¹, P², P³ e/ou P⁴ são independentemente selecionados de um peptídeo apresentado em qualquer uma das Tabelas de 4 até 38. Em uma forma de realização relacionada, P , P , P³ e/ou P⁴ têm a mesma seqüência de aminoácido. Em uma outra forma de realização, o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1. Em uma outra forma de realização, WSP é PEG. Ainda em uma outra forma de realização, o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1 e WSP é PEG. Em uma outra forma de realização, o PEG tem um peso molecular dentre cerca de 2 kDa e 100 kDa, ou entre 6 kDa e 25 kDa. Em uma outra forma de realização, a composição compreende pelo menos 50 %, 75 %, 85 %, 90 %, ou 95 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.

Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é selecionado do grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato e aspartato. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de encorpamento é selecionado do grupo que consiste de manitol, glicina, sacarose, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol.

Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente estabilizante é selecionado do grupo que consiste de sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafmose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HC1, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio.

Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o tensoativo selecionado do grupo que consiste de lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio, dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido 1-octanossulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio, sal sódico do ácido glicodesoxicólico, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado, brometo de hexadeciltrimetilamônio, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, digitonina,

Triton X-100, Triton X-114, lauromacrogol 400, esterarato de polioxil 40, óleo de mamona polioxietileno hidrogenado 10, 40, 50 e 60, monoesterarato de glicerol, polissorbato 20, 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja, DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico está entre cerca de 0,25 mg/ml e 250 mg/ml.

Em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,004 % p/v. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P¹ compreende uma seqüência apresentada na Tabela 6. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 0,5 mg/ml. Em uma outra forma de realização, o pepticorpo terapêutico é qualquer uma da SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016 ou SEQ ID NO: 1017.

Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 7,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P¹ compreende uma seqüência apresentada na Tabela 32. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.

Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 20 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 3,3 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P¹ compreende uma seqüência apresentada na Tabela 4. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 100 mg/ml.

Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 2,5 % p/v; e em que o agente estabilizante é sacarose a 3,5 % p/v. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P¹ compreende uma seqüência apresentada na Tabela 31. Ainda em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.

Em uma outra forma de realização da invenção, uma composição anteriormente mencionada é fornecida em que a composição é selecionada do grupo que consiste de: a) histidina a 10 mM, pH 4,7, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; b) histidina a 10 mM, pH 5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; c) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose com e sem 0,004 % de polissorbato20; d) succinato a 10 mM, pH

4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 9 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; f) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de sacarose, 1 % de hidroxietil amido, 0,004 % de polissorbato-20; g) glutamato a 5 mM, pH 4,5, 2 % de manitol, 1 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e h) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de trealose, 0,004 % de polissorbato20. Em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que P¹ compreende uma seqüência apresentada nas Tabelas 21a 24. Ainda em uma outra forma de realização, a composição anteriormente mencionada é fornecida em que a concentração de pepticorpo terapêutico é selecionada do grupo que consiste de 1, 30, 85 e 100 mg/ml.

A presente invenção também considera métodos de fabricar pepticorpos terapêuticos liofilizados da presente invenção. Em uma forma de realização, a invenção fornece um método para fabricar um pepticorpo terapêutico liofilizado que compreende as etapas de: a) preparar uma solução de um tampão, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e opcionalmente um tensoativo; em que o tampão é compreendido de um agente de tamponamento de pH em uma faixa de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM e em que o pH está em uma faixa de cerca de 3,0 a cerca de 8,0; em que o agente de encorpamento está em uma concentração de cerca de 2,5 % a cerca de 4 % p/v; em que o agente estabilizante está em uma concentração de cerca de 0,1 % a cerca de 5 % p/v; em que o tensoativo está em uma concentração de cerca de 0,004 % a cerca de 0,04 % p/v; e b) liofilizar o pepticorpo terapêutico; em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula I,

Fórmula I: [(X ¹),-F^,-PC²)b]-(L¹)cWSP_<1 em que:

F é um domínio Fc;

X é selecionado de

P‘-(L²)eP²(L³)rP'-(L²)eP³(L⁴)g-P²(L³)rP'-(L²)e- e

P⁴(L⁵)h-P³(L⁴)g-P²(L³)rP¹-(L²)eX é selecionado de:

-(L^e-P¹

-(L²)e-P‘-(L³)rP²

-(L²)e-P¹-(L³)f-P^(L⁴)g-P³ e

-(L²)e-P¹-(L³)rP²-(L⁴)g-P³-(L⁵)h-P⁴ em que P¹, P², P³ e P⁴ são cada um independentemente seqüências de peptídeos farmacologicamente ativos;

L¹, L², L³, L⁴ e L⁵ são cada um independentemente ligadores; a, b, c, e, f, g e h são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de a e b seja 1; d é 0, 1, ou maior do que 1; e

WSP é um polímero solúvel em água, a ligação do qual é efetuada em qualquer porção reativa em F¹.

Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula II

Fórmula II: [X^F¹ ]-(!?)<;-WSP_d em que o domínio Fc é ligado ao término C de X¹ e zero, um ou mais WSP são ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula III

Fórmula III: [F¹-X²]-(L¹)_c-WSP_d em que o domínio Fc é ligado ao término N de X e zero, um ou mais WSP são ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula IV

Fórmula IV: ^-(ΐΛ-Ρ¹]-^¹ )_c-WSP_d em que o domínio Fc é ligado ao término N de -(L¹)^?¹ e zero, um ou mais WSP são ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico compreende uma estrutura apresentada na Fórmula V

Fórmula V: [FL(L V^-CLV^^c-WSPd em que o domínio Fc é ligado ao término N de -L -P -L -P e zero, um ou mais WSP são ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o pepticorpo terapêutico é um multímero ou dímero. Em uma outra forma de realização, o P¹, P², P³ e/ou P⁴ são independentemente selecionados de um peptídeo apresentado em qualquer uma das Tabelas 4 até 38. Em uma outra forma de realização, o P¹, P², P³ e/ou P⁴ têm a mesma seqüência de aminoácido. Em uma outra forma de realização, o domínio Fc é apresentado in SEQ ID NO: 1. Em uma outra forma de realização, WSP é PEG. Em uma outra forma de realização, o domínio Fc é apresentado na SEQ ID NO: 1 e WSP é PEG. Em uma outra forma de realização, PEG tem um peso molecular dentre cerca de 2 kDa e 100 kDa ou entre cerca de 6 kDa e 25 kDa. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a composição compreende pelo menos 50 %, 75 %, 85 %, 90 % ou 95 % de pepticorpo terapêutico PEGuilado.

Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é selecionado do grupo que consiste de glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato e aspartato. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de encorpamento é selecionado do grupo que consiste de manitol, glicina, sacarose, dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente estabilizante é selecionado do grupo que consiste de sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, ffutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HC1, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio.

Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que o tensoativo selecionados do grupo que consiste de lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio, dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido 1-octanossulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio, sal sódico do ácido glicodesoxicólico, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado, brometo de hexadeciltrimetilamônio, CHAPS, CHAPSO, SB310, SB3-12, digitonina, Triton X-100, Triton X-114, lauromacrogol 400, esterarato de polioxil 40, óleo de mamona polioxietileno hidrogenado 10, 40, 50 e 60, monoesterarato de glicerol, polissorbato 20, 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja, DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico está entre cerca de 0,25 mg/ml e 250 mg/ml.

Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,004 % p/v. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P¹ compreende uma seqüência apresentada na Tabela 6. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 0,5 mg/ml.

Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 7,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 4 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P¹ compreende uma seqüência apresentada na Tabela 32. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.

Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 20 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a 3,3 % p/v; em que o agente estabilizante é sacarose a 2 % p/v; e em que o tensoativo é polissorbato-20 a 0,01 % p/v. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P¹ compreende uma seqüência apresentada na Tabela 4. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 100 mg/ml.

Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido em que o agente de tamponamento de pH é histidina a 10 mM e em que o pH é 5,0; em que o agente de encorpamento é manitol a

2,5 % p/v; e em que o agente estabilizante é sacarose a 3,5 % p/v. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P¹ compreende uma seqüência apresentada na Tabela 31. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é de 30 mg/ml.

Em uma outra forma de realização da invenção, um método anteriormente mencionado é fornecido em que a composição é selecionada do grupo que consiste de: a) histidina a 10 mM, pH 4,7, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; b) histidina a 10 mM, pH 5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, com e sem 0,004 % de polissorbato-20; c) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose com e sem 0,004 % de polissorbato20; d) succinato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol e 2 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 9 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; f) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de sacarose, 1 % de hidroxietil amido, 0,004 % de polissorbato-20; g) glutamato a 5 mM, pH 4,5, 2 % de manitol, 1 % de sacarose, 0,004 % de polissorbato-20; e h) glutamato a 10 mM, pH 4,5, 4 % de manitol, 2 % de trealose, 0,004 % de polissorbato-20. Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que P¹ compreende uma seqüência apresentada nas Tabelas de 21 a 24. Ainda em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que a concentração de pepticorpo terapêutico é selecionada do grupo que consiste de 1, 30, 85 e 100 mg/ml.

Em uma outra forma de realização, um método anteriormente mencionado é fornecido compreendendo ainda, antes da liofilização, as etapas de: b) ajustar o pH da solução a um pH entre cerca de 4,0 e cerca de 8,0; c) preparar uma solução contendo o pepticorpo terapêutico; d) trocar o tampão da solução da etapa (c) na solução da etapa (b); e) adicionar uma quantidade apropriada de um tensoativo; e f) liofilizar a mistura da etapa (e).

Em uma outra forma de realização, o método anteriormente mencionado é fornecido em que um método para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico reconstituído é fornecido que compreende as etapas de:

a) liofilizar uma composição de pepticorpo terapêutico anteriormente mencionada; e b) reconstituir a composição de pepticorpo terapêutico liofilizado.

Em uma outra forma de realização, um kit para preparar uma composição farmacêutica aquosa é fornecida que compreende um primeiro recipiente tendo uma composição de pepticorpo terapêutico anteriormente mencionada liofilizada e um segundo recipiente tendo um solvente fisiologicamente aceitável para a composição liofilizada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definição de termos

O termo “compreendendo,” com respeito a um composto de 10 peptídeo, significa que um composto pode incluir aminoácidos adicionais em cada um ou ambos dos terminais amino ou carbóxi da seqüência dada. Naturalmente, estes aminoácidos adicionais não devem interferir significantemente com a atividade do composto. Com respeito a uma composição da presente invenção, o termo “compreendendo” significa que uma composição pode incluir componentes adicionais. Estes componentes adicionais não devem interferir significantemente com a atividade da composição.

O termo “pepticorpo” refere-se a uma molécula que compreende peptídeo(s) fundido(s) direta ou indiretamente a outras moléculas tais como um domínio Fc de um anticorpo, onde a porção de peptídeo especificamente se liga a um alvo desejado. O(s) peptídeo(s) pode(m) ser fundido(s) a uma região Fc ou inserido(s) em uma Alça Fc, uma molécula Fc modificada. As Alças Fc são descritas na Publicação do Pedido de Patente U.S. N° US2006/0140934 aqui incorporada por referência em sua totalidade.

A invenção inclui tais moléculas que compreendem um domínio Fc modificado para compreender um peptídeo como uma seqüência interna (preferivelmente em uma região de alça) do domínio Fc. As moléculas de peptídeo Fc internas podem incluir mais do que uma seqüência de peptídeo em tandem em uma região interna particular e elas podem incluir outros peptídeos em outras regiões internas. Embora as regiões de alça putativas sejam exemplificadas, inserções em quaisquer outros domínios que não de terminal do Fc também são consideradas parte desta invenção. O termo “pepticorpo” não inclui proteínas de fusão de Fc (por exemplo, proteínas de tamanho natural fundidas a um domínio Fc).

O termo “veículo” refere-se a uma molécula que impede a degradação e/ou aumenta a meia vida, reduz a toxicidade, reduz a imunogenicidade ou aumenta a atividade biológica de uma proteína terapêutica. Os veículos exemplares incluem um domínio Fc como descrito na Patente U.S. N^fi 5.428.130 concedida a Capon et al., concedida em 27 de junho de 1995.

O termo “Fc nativo” refere-se à molécula ou seqüência que compreende a seqüência de um fragmento de ligação a não antígeno que resulta da digestão de anticorpo inteiro, seja na forma monomérica ou multimérica. Tipicamente, um Fc nativo compreende um domínio CH2 e CH3. A fonte de imunoglobulina original da Fc nativa é em um aspecto de origem humana e pode ser qualquer uma das imunoglobulinas. Um Fc nativo é um polipeptídeo monomérico que pode estar ligado em formas diméricas ou multiméricas pela associação covalente (isto é, ligações de dissulfeto), associação não covalente ou uma combinação de ambos. O número de ligações de dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo varia de um a quatro dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA, IgE) ou subclasse (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Um exemplo de um Fc nativo é um diéter ligado a dissulfeto que resulta da digestão com papaína de uma IgG. Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9. O termo “Fc nativo” como aqui usado é genérico para as formas monoméricas, diméricas e multiméricas.

O termo “variante de Fc” refere-se a uma molécula ou seqüência que é modificada a partir de um Fc nativo, mas ainda compreende um sítio de ligação para o receptor de recuperação, FcRn. Os pedidos internacionais WO 97/34631 (publicado em 25 de setembro de 1997) e WO 96/32478 descrevem variantes de Fc exemplares, assim como a interação com o receptor de recuperação e são aqui incorporadas por referência. Em um aspecto, o termo “variante de Fc” compreende uma molécula ou seqüência que é humanizada a partir de um Fc nativo não humano. Em um outro aspecto, um Fc nativo compreende sítios que podem ser removidos porque eles fornecem características estruturais ou atividade biológica que não são requeridos para as moléculas de fusão da presente invenção. Assim, o termo “variante de Fc” compreende uma molécula ou seqüência que carece de um ou mais sítios Fc nativos ou resíduos que afetam ou estão envolvidos na (1) formação da ligação de dissulfeto, (2) incompatibilidade com uma célula hospedeira selecionada (3) heterogeneidade de terminal N na expressão em uma célula hospedeira selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com complemento, (6) ligação a um receptor Fc outro que não um receptor de recuperação ou (7) citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). As variantes Fc são descritas em mais detalhes em seguida.

O termo “domínio Fc” abrange Fc nativo e moléculas e seqüências variantes de Fc como definido acima. Como com variantes de Fc e Fc nativos, o termo “domínio de Fc” inclui moléculas nas formas monoméricas ou multiméricas, sejam digeridas a partir de anticorpo inteiro ou produzidas por outros meios. Em uma forma de realização, por exemplo, a região de Fc pode ser:

K(SEQIDNO:1).

As seqüências de Fc adicionais são conhecidas na técnica e são consideradas para o uso na invenção. Por exemplo, IgGl de Fc (Acesso no

GenBank N^s P01857), IgG2 de Fc (Acesso no GenBank N² P01859), IgG3 de Fc (Acesso no GenBank N² P01860), IgG4 de Fc (Acesso no GenBank N² P01861), IgAl de Fc (Acesso no GenBank N² P01876), IgA2 de Fc (Acesso no GenBank N² P01877), IgD de Fc (Acesso no GenBank N² P01880), IgM de Fc (Acesso no GenBank N² P01871) e IgE de Fc (Acesso no GenBank N² P01854) são algumas seqüências Fc adicionais consideradas para o uso aqui.

Opcionalmente, uma seqüência de aminoácido de terminal N pode ser adicionada às seqüências acima (por exemplo, quando expressadas em bactérias).

O termo “multímero” como aplicado aos domínios Fcs ou moléculas que compreendem os domínios Fcs refere-se às moléculas tendo duas ou mais cadeias de polipeptídeo covalentemente associadas, não covalentemente ou pelas interações tanto covalentes quanto não covalentes. As moléculas de IgG tipicamente formam dímeros; IgM, pentâmeros; IgD, dímeros; e IgA, monômeros, dímeros, trímeros ou tetrâmeros. Os multímeros podem ser formados explorando-se a seqüência e a atividade resultante da fonte de Ig nativa do Fc ou pela derivatização (como definido abaixo) tal um Fc nativo.

Os termos “derivatização,” “derivado” ou “derivatizado” significam processos e compostos resultantes em que, por exemplo e sem limitação, (1) o composto tem uma porção cíclica; por exemplo, reticulação entre resíduos de cisteinila dentro do composto; (2) o composto é reticulado ou tem um sítio de reticulação; por exemplo, o composto tem um resíduo de cisteinila e assim forma dímeros reticulados em cultura ou in vivo; (3) uma ou mais ligações de peptidila é substituído por uma ligação não peptidílica; (4) o término N é substituído por - NRR_b NRC(O)R_b -NRC(O)OR_b -NRS(O)₂Ri, -NHC(O)NHR, um grupo succinimida ou benziloxicarbonil-NH- substituído ou não substituído, em que R e Rj e os substituintes do anel são como definidos em seguida; (5) o término C é substituído por -C(O)R₂ ou -NR3R4 em que R2, R3 e R4 são como definidos em seguida; e (6) compostos em que porções de aminoácido individuais são modificadas através do tratamento com agentes capazes de reagir com cadeias laterais ou resíduos de terminal selecionados. Derivados são ainda descritos em seguida.

Como aqui usado o termo “peptídeo” refere-se a moléculas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ,14 ,15, 16 ,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,

46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,

67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,

88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou mais aminoácidos ligados pelas ligações de peptídeo. Os peptídeos tipicamente contêm conformações aleatórias e/ou flexíveis, tais como espirais aleatórias; e tipicamente carecem de conformações estáveis, tais como aquelas observadas em proteínas/polipeptídeos maiores, tipicamente por intermédio de estruturas secundárias e terciárias. Em formas de realização particulares, numerosas faixas de tamanho de peptídeos são aqui consideradas, Tais como de cerca de: 3 a 90, 3 a 80, 3 a 70, 3 a 60, 3 a 50; 5 a 90, 5 a 80, 5 a 70, 5 a 60, 5 a 50, 5 a 40, 5 a 30, 10 a 90, 10 a 80, 10 a 70, 10 a 60, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 10 a 20 aminoácidos no comprimento e outros. Em outras formas de realização, os peptídeos aqui usados não têm mais do que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 ou 20 aminoácidos no comprimento. Os peptídeos exemplares podem ser gerados por qualquer um dos métodos aqui apresentados, tais como os realizados em uma biblioteca de peptídeo (por exemplo, uma biblioteca de demonstração de fago), gerados pela síntese química, derivados pela digestão de proteínas ou gerados usando técnicas de DNA recombinantes. Os peptídeos incluem as formas D e L, purificada ou em uma mistura das duas formas.

Adicionalmente, os sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos desta invenção também são considerados. Por “sais fisiologicamente aceitáveis” é intencionado quaisquer sais que são conhecidos ou mais tarde descobertos como sendo farmaceuticamente aceitáveis. Alguns exemplos específicos são: acetato, trifluoroacetato; hidrohaletos, tais como cloridreto e bromidreto; sulfato; citrato; tartarato; glicolato; e oxalato.

O termo “randomizado” como usado para se referir às seqüências de peptídeo refere-se às seqüências aleatórias completas (por exemplo, selecionadas pelos métodos de demonstração de fago) e seqüências em que um ou mais resíduos de uma molécula que ocorre naturalmente é substituído por um resíduo de aminoácido que não aparece naquela posição na molécula que ocorre naturalmente. Os métodos exemplares para identificar seqüências de peptídeo incluem demonstração de fago, demonstração de E. coli, demonstração de ribossoma, triagem com base em levedura, triagem de RNA-peptídeo, triagem química, planejamento racional, análise estrutural de proteína e outros.

O termo “farmacologicamente ativo” significa que uma substância assim descrita é determinada ter atividade que afeta um parâmetro médico (por exemplo, mas não limitado a pressão sangüínea, contagem de célula sangüínea, nível de colesterol) ou estado de doença (por exemplo, mas não limitado a câncer, distúrbios autoimunes). Assim, os peptídeos farmacologicamente ativos compreendem peptídeos agonísticos ou miméticos e antagonísticos como definidos abaixo.

Os termos “peptídeo mimético” e “peptídeo agonista” referemse a um peptídeo tendo atividade biológica comparável com uma proteína (por exemplo, mas não limitado a EPO, TPO, G-CSF e outras proteínas aqui descritas) que interage com uma proteína de interesse. Estes termos incluem ainda peptídeos que indiretamente imitam a atividade de uma proteína de interesse, tal como pela potenciação dos efeitos do ligando natural da proteína de interesse; ver, por exemplo, os peptídeos miméticos de GCSF listados nas Tabelas 2 e 7. Como um exemplo, o termo “peptídeo mimético de EPO” compreende quaisquer peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Wrighton et al. (1996), Science 273: 458-63, Naranda et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 756974 ou qualquer outra referência na Tabela 2 identificados como tendo o assunto objeto de mimético de EPO. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.

Como um outro exemplo, o termo “peptídeo mimético de TPO” ou “TMP” refere-se a peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, Pat. U.S. N— 5.869.451 e 5.932.946 e qualquer outra referência na Tabela 2 identificados como tendo o assunto objeto de mimético de TPO, assim como o Pedido Internacional WO 00/24770 publicado em 4 de maio de 2000, aqui incorporada por referência. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.

Como um outro exemplo, o termo “peptídeo mimético de GCSF” refere-se a quaisquer peptídeos que podem ser identificados ou descritos em Paukovits et al. (1984), Hoppe-Seilers Z. Physiol. Chem. 365: 303-11 ou qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo o assunto objeto de mimético de G-CSF. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.

O termo “peptídeo mimético de CTLA4” refere-se a quaisquer peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Fukumoto et al. (1998), Nature Biotech. 16: 267-70. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.

O termo “peptídeo antagonista” ou “peptídeo inibidor” referese a um peptídeo que bloqueia ou de algum modo interfere com a atividade biológica da proteína associada de interesse ou tem atividade biológica comparável com um antagonista ou inibidor conhecidos da proteína associada de interesse. Assim, o termo “peptídeo antagonista de TNF” compreende peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70 ou qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo a matéria objeto de antagonístico de TNF. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.

Os termos “antagonista de IL-1” e “peptídeo mimético de ILlra” referem-se aos peptídeos que inibem ou infra-regulam a ativação do receptor IL-1 pelo IL-1. A ativação do receptor de IL-1 resulta da formação de um complexo entre IL-1, receptor de IL-1 e proteína acessória do receptor de IL-1. Antagonista de IL-1 ou peptídeos miméticos IL-lra se ligam ao IL-1, receptor de IL-1 ou proteína acessória do receptor de IL-1 e obstruem a formação de complexo entre quaisquer dois ou três componentes do complexo. Os antagonistas de IL-1 ou peptídeos miméticos de IL-lra exemplares podem ser identificados ou derivados como descrito na Pat. U.S. N— 5.608.035, 5.786.331, 5.880.096; ou qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo o assunto objeto de mimético de IL-lra ou antagonístico de IL-1. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.

O termo “peptídeo antagonista de VEGF” refere-se a peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Fairbrother (1998), Biochem. 37: 17754-64 e em qualquer uma das referências na Tabela

2 identificadas como tendo o assunto objeto de antagonístico de VEGF.

Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.

O termo “peptídeo inibidor de MMP” refere-se a peptídeos que podem ser identificados ou derivados como descrito em Koivunen (1999), Nature Biotech. 17: 768-74 e em qualquer uma das referências na Tabela 2 identificadas como tendo o assunto objeto de inibidor de MMP. Aqueles de habilidade comum na técnica avaliam que cada uma destas referências possibilita que uma pessoa selecione peptídeos diferentes do que os realmente aí divulgados pelos seguintes procedimentos divulgados com bibliotecas de peptídeo diferentes.

O termo “peptídeo inibidor de miostatina” refere-se a peptídeos que podem ser identificados pela sua capacidade para reduzir ou bloquear a atividade ou sinalização de miostatina como demonstrado em ensaios in vitro tais como, por exemplo o ensaio de atividade de miostatina com base em célula pMARE C2C12 ou pelo teste em animal in vivo como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. N² US20040181033A1 e publicação do pedido PCT N² W02004/058988. Os peptídeos inibidores de miostatina exemplares são apresentados nas Tabelas 21 a 24.

O termo “antagonista de integrina/adesão” refere-se a peptídeos que inibem ou inffa-regulam a atividade de integrinas, selectinas, moléculas de adesão celular, receptores de integrina, receptores de selectina ou receptores de molécula de adesão celular. Os antagonistas de integrina/adesão exemplares compreendem laminina, equistatina, os peptídeos descritos nas Tabelas de 25 a 28.

O termo “inibidor da reabsorção óssea” refere-se a moléculas tais como determinadas pelos ensaios de Exemplos 4 e 11 da WO 97/23614:, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Os inibidores da reabsorção óssea exemplares incluem anticorpo OPG e OPG-L, que são descritos na WO 97/23614 e WO98/46751, respectivamente, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

O termo “inibidor de fator de crescimento de nervo” ou “agonista de fator de crescimento de nervo” refere-se a um peptídeo que se liga a e inibe a atividade ou sinalização do fator de crescimento de nervo (NGF). Os peptídeos exemplares deste tipo são apresentados na Tabela 29.

O termo “domínio modulador de TALL-1” refere-se a qualquer seqüência de aminoácido que se liga ao TALL-1 e compreende seqüências que ocorrem naturalmente ou seqüências randomizadas. Os domínios moduladores TALL-1 exemplares podem ser identificados ou derivados pela demonstração de fago ou outros métodos aqui mencionados. Os peptídeos exemplares deste tipo são apresentados nas Tabelas 30 e 31.

O termo “antagonista de TALL-1” refere-se a uma molécula que se liga ao TALL-1 e aumenta ou diminui um ou mais parâmetros de ensaio oposto do efeito naqueles parâmetros pelo TALL-1 nativo de tamanho natural. Tal atividade pode ser determinada, por exemplo, por ensaios tais como descritos na subseção intitulada “Atividade biológica de AGP-3” na seção Materials & Methods do pedido de patente intitulada, “TNL-RELATED PROTEINS”, WO 00/47740, publicado em 17 de agosto de 2000.

O termo “peptídeo antagonista de Ang 2” refere-se a peptídeos que podem ser identificados ou derivados como tendo características antagonísticas de Ang-2. Os peptídeos exemplares deste tipo são apresentados nas Tabelas 32 a 38.

O termo “WSP” refere-se a um polímero solúvel em água que impede um peptídeo, proteína ou outro composto ao qual o mesmo é ligado de precipitar em um ambiente aquoso, tal como, por via de exemplo, um ambiente fisiológico. Uma descrição mais detalhada de várias formas de realização de WSP considerada pela invenção segue.

Liofilização e Administração

Pepticorpos terapêuticos são úteis em formulações farmacêuticas de modo a tratar doenças humanas como aqui descritas. Em uma forma de realização as composições de pepticorpo terapêutico são liofilizadas. A liofilização é realizada usando técnicas comuns na técnica e devem ser otimizadas para a composição que é desenvolvida [Tang et al., Pharm Res. 21: 191-200, (2004) e Chang et al., Pharm Res. 13: 243-9 (1996)].

Um ciclo de liofilização é, em um aspecto, composto de três etapas: congelamento, secagem primária e secagem secundária [A. P.

Mackenzie, Phil Trans R Soc Londres, Ser B, Biol 278: 167 (1977)]. Na etapa de congelamento, a solução é esfriada para iniciar a formação de gelo. Além disso, esta etapa induz a cristalização do agente de encorpamento. O gelo sublima no estágio de secagem primária, que é conduzida pela redução da pressão da câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, usando um vácuo e introduzindo calor para promover a sublimação. Finalmente, a água absorvida ou ligada é removida no estágio de secagem secundária sob pressão reduzida da câmara e em uma temperatura de prateleira elevada. O processo produz um material conhecido como uma torta liofilizada. Em seguida a torta pode ser reconstituída com água estéril ou diluente adequado para injeção.

O ciclo de liofilização não apenas determina o estado físico final dos excipientes mas também afeta outros parâmetros tais como tempo de reconstituição, aspecto, estabilidade e teor de umidade final. A estrutura da composição no estado congelado prossegue através de várias transições (por exemplo, transições vítreas, umectações e cristalizações) que ocorrem em temperaturas específicas e podem ser usadas para entender e otimizar o processo de liofilização. A temperatura de transição vítrea (Tg e/ou Tg’) pode fornecer informação a cerca do estado físico de um soluto e pode ser determinado pela calorimetria de varredura diferencial (DSC). A Tg e Tg’ são um parâmetro importante que devem ser levados em conta quando da designação do ciclo de liofilização. Por exemplo, a Tg’ é importante para a secagem primária. Além disso, no estado seco, a temperatura de transição vítrea fornece informação sobre a temperatura de armazenagem do produto final.

Excipientes no geral

Os excipientes são aditivos que são incluídos em uma formulação porque eles comunicam ou realçam a estabilidade, liberação e manufaturabilidade de um produto medicamentoso. Independente da razão para a sua inclusão, os excipientes são um componente integral de um produto medicamentoso e portanto necessitam ser seguros e bem tolerados pelos pacientes. Para os medicamentos de proteína, a escolha de excipientes é particularmente importante porque eles podem afetar tanto a eficácia quanto a imunogenicidade do medicamento. Por este motivo, as formulações de proteína necessitam ser desenvolvidas com seleção apropriada de excipientes que proporcionam estabilidade, segurança e negociabilidade adequadas.

Uma formulação liofilizada é usualmente compreendida de um tampão, um agente de encorpamento e um estabilizador. A utilidade de um tensoativo pode ser avaliada e selecionada em casos onde a agregação durante a etapa de liofilização ou durante a reconstituição toma-se um problema. Um agente de tamponamento apropriado é incluído para manter a formulação dentro de zonas estáveis de pH durante a liofilização. Uma comparação dos componentes de excipiente nas formulações de proteína líquidas e liofilizadas é fornecida na Tabela A.

Tabela A: Componentes de excipiente de formulações de proteína liofilizadas

Componente excipiente	Função na formulação liofilizada
Tampão	o Manter o pH da formulação durante a liofilização e na reconstituição
Agente de tonicidade/ estabilizador	β Os estabilizadores incluem crio e lioprotetores o Os exemplos incluem polióis, açúcares e polímeros β Crioprotetores que protegem as proteínas dos estresses do congelamento β Lioprotetores estabilizam as proteínas no estado de seco por congelamento
Agente de encorpamento	o Usado para realçar a elegância do produto e para prevenir colapso β Fornece resistência estrutural para a torta liofilizada o Os exemplos incluem manitol e glicina
Tensoativo	β Utilizado se a agregação durante o processo de liofilização for um problema o Pode servir para reduzir os tempos de reconstituição o Os exemplos incluem polissorbato 20 e 80
Anti-oxidante	β Usualmente não utilizado, as reações moleculares na torta liofilizada são enormemente retardadas
íons metálicos /agente quelador	o Podem ser incluídos se um íon metálico específico é incluído apenas como um co-fator ou onde o metal é requerido para a atividade de protease β Os agentes queladores no geral não são necessários nas formulações liofilizadas
Conservante	o Apenas para as formulações de dose múltipla o Fornece proteção contra o crescimento microbiano na formulação β É usualmente incluído no diluente de reconstituição (por exemplo bWFI)

O desafio principal nas formulações de desenvolvimento para proteínas terapêuticas é estabilizar o produto contra os estresses de fabricação, envio e armazenagem. O papel dos excipientes de formulação é fornecer estabilização contra estes estresses. Os excipientes também podem ser utilizados para reduzir a viscosidade de formulações de proteína de alta concentração de modo a permitir a sua liberação e realçar a conveniência do paciente. No geral, excipientes podem ser classificados com base nos mecanismos pelos quais eles estabilizam as proteínas contra vários estresses químicos e físicos. Alguns excipientes são usados para aliviar os efeitos de um estresse específico ou para regular uma suscetibilidade particular de uma proteína específica. Outros excipientes têm efeitos mais gerais sobre as estabilidades físicas e covalentes de proteínas. Os excipientes aqui descritos são organizados pelo seu tipo químico ou seu papel funcional nas formulações. Descrições resumidas dos modos de estabilização são fornecidas quando do debate de cada tipo de excipiente.

Dadas as divulgações e orientações aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica saberão que a quantidade ou faixa de excipiente que podem ser incluídas em qualquer formulação particular para se obter uma formulação biofarmacêutica da invenção que promova a retenção em estabilidade do biofarmacêutico. Por exemplo, a quantidade e tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção podem ser selecionados com base na osmolalidade desejada (isto é, isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução final assim como as quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem incluídos na formulação. Similarmente, pela exemplificação com referência ao tipo de poliol ou açúcar incluídos em uma formulação, a quantidade de um tal excipiente dependerá da sua osmolalidade.

Por via de exemplo, a inclusão de cerca de 5 % de sorbitol pode obter isotonicidade enquanto que cerca de 9 % de um excipiente de sacarose é necessário para se obter isotonicidade. A seleção da quantidade ou faixa de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos dentro de uma formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificada acima por referência aos sais, polióis e açúcares. Entretanto, aqueles habilitados na técnica entenderão que as considerações aqui descritas e ainda exemplificadas por referência aos excipientes específicos são igualmente aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes incluindo, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de tonicidade, tensoativos, estabilizadores, agentes de encorpamento, crioprotetores, lioprotetores, antioxidantes, íons metálicos, agentes queladores e/ou conservantes.

Além disso, onde um excipiente particular é relatado em uma formulação, por exemplo, pelo percentual (%) p/v, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a concentração molar equivalente deste excipiente também é considerada.

Naturalmente, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconhecería que as concentrações dos excipientes anteriormente mencionados compartilham uma interdependência dentro de uma formulação particular. Por via de exemplo, a concentração de um agente de encorpamento pode ser diminuída onde, por exemplo, existe uma alta concentração de proteína/peptídeo ou onde, por exemplo, existe uma alta concentração de agente estabilizante. Além disso, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconhecería que, de modo a manter a isotonicidade de uma formulação particular em que não existe nenhum agente de encorpamento, a concentração de um agente estabilizante seria ajustada conseqüentemente (isto é, uma quantidade “tonificante” de estabilizador seria usada). Outros excipientes são conhecidos na técnica e podem ser encontrados em Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sei. Technology, 52: 238-311.

Tampões

A estabilidade de um medicamento de proteína é usualmente observada ser máxima em uma faixa de pH estreita. Esta faixa de pH de estabilidade ótima precisa ser identificada cedo durante os estudos de préformulação. Diversos métodos tais como os estudos de estabilidade acelerada e os estudos de triagens calorimétricas têm demonstrado serem úteis neste empenho (Remmele R. L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999)). Uma vez que uma formulação é finalizada, o produto medicamentoso deve ser fabricado e mantido dentro de uma especificação pré definida por toda a sua vida de prateleira. Por este motivo, agentes de tamponamento são quase sempre utilizado para controlar o pH na formulação.

Ácidos orgânicos, fosfatos e Tris têm sido rotineiramente utilizados como tampões nas formulações de proteína (Tabela Β). A capacidade das espécies de tamponamento é máxima em um pH igual ao pKa e diminui conforme o pH aumenta ou diminui fora deste valor. Noventa porcento da capacidade de tamponamento existe dentro de uma unidade de pH do seu pKa. A capacidade de tamponamento também aumenta proporcionalmente com a concentração de tampão crescente.

Diversos fatores necessitam ser considerados quando da escolha de um tampão. Primeiramente, a espécie de tampão e a sua concentração necessitam ser definidas com base no seu pKa e no pH da formulação desejada. Igualmente importante é garantir que o tampão seja compatível com o medicamento de proteína, outros excipientes de formulação e não catalise quaisquer reações de degradação. Recentemente, tampões de carboxilato polianiônicos tais como citrato e succinato foram mostrados formar adutos covalentes com os resíduos de cadeia lateral de proteínas. Um terceiro aspecto importante a ser considerado é a sensação de pungência e irritação que o tampão pode induzir. Por exemplo, o citrato é conhecido por causar pungência na injeção (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). O potencial para pungência e irritação é maior para os medicamentos que são administrados por intermédio das vias SC ou IM, onde a solução de medicamento permanece no local por um período relativamente mais longo de tempo do que quando administrados pela via IV onde a formulação é diluída rapidamente no sangue na administração. Para as formulações que são administradas pela infusão IV direta, a quantidade total de tampão (e qualquer outro componente de formulação) necessita ser monitorada. Uma pessoa deve ser particularmente cuidadosa a cerca de íons potássio administrados na forma do tampão de fosfato de potássio, que pode induzir efeitos cardiovasculares em um paciente (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).

Tampões para formulações liofilizadas necessitam consideração adicional. Alguns tampões como fosfato de sódio podem cristalizar da fase amorfa da proteína durante o congelamento resultando em mudanças muito maiores no pH. Outros tampões comuns tais como acetato e imidazol devem ser evitados visto que eles podem sublimar ou evaporar durante o processo de liofilização, mudando deste modo o pH da formulação durante a liofilização ou depois da reconstituição.

Tabela B: Agentes de tamponamento habitualmente usados e seus valores de pH

Tampão	pKa	Produto medicamentoso de exemplo
Acetato	4,8	Neupogen, Neulasta
Succinato	pKai = 4,8, pKa2 = 5,5	Actimmune
Citrato	pKai =3,1, pKa2= 4,8, ρΚώ = 6,4	Humira
Histidina (imidazol)	6,0	Xolair
Fosfato	pKal =2,15, pKa2 = 7,2, ρΚώ = 12,3	Enbrel (formulação líquida)
Tris	8,1	Leukine

O sistema de tampão presente nas composições é selecionado para ser fisiologicamente compatível e para manter um pH desejado na solução reconstituída assim como na solução antes da liofilização. Em uma forma de realização, o pH da solução antes da liofilização está entre pH 2,0 e pH 12,0. Por exemplo, em uma forma de realização o pH da solução antes da liofilização é 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3,

5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 ou 12,0. Em uma outra forma de realização, o pH da solução reconstituída está entre 4,5 e 9,0. Em uma forma de realização, o pH na solução reconstituída é 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0,

6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7 ou 9,0.

Em uma forma de realização, o agente de tamponamento de pH usado na formulação é um aminoácido ou mistura de aminoácidos. Em um aspecto, o agente de tamponamento de pH é histidina ou uma mistura de aminoácidos um dos quais sendo histidina.

O composto de tamponamento de pH pode estar presente em qualquer quantidade adequada para manter o pH da formulação em um nível pré-determinado. Em uma forma de realização, quando o agente de tamponamento de pH é um aminoácido, a concentração do aminoácido está entre 0,1 mM e 1000 mM (1 M). Em uma forma de realização, o agente de tamponamento de pH é de pelo menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700 ou 900 mM. Em uma outra forma de realização, a concentração do agente de tamponamento de pH está entre 1, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 mM e 100 mM. Ainda em uma outra forma de realização, a concentração do agente de tamponamento de pH está entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 ou 40 mM e 50 mM. Ainda em uma outra forma de realização, a concentração do agente de tamponamento de pH é de 10 mM.

Outros agentes de tamponamento de pH exemplares usados para tamponizar a formulação como aqui apresentada incluem, mas não são limitados a glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato e aspartato.

Estabilizadores e agentes de encorpamento

Os agentes de encorpamento são tipicamente usados em formulações liofilizadas para realçar a elegância do produto e para prevenir colapso. As condições na formulação são no geral planejadas de modo que o agente de encorpamento cristalize da fase amorfa congelada (durante o congelamento ou recozimento acima da Tg’) dando à torta estrutura e volume. Manitol e glicina são exemplos de agentes de encorpamento habitualmente usados.

Os estabilizadores incluem uma classe de compostos que podem servir como crioprotetores, lioprotetores e agentes formadores de vidro. Os crioprotetores atuam para estabilizar proteínas durante o congelamento ou no estado congelado em temperaturas baixas (P. Cameron, ed., Good Pharmaceutic Freeze-Drying Practice, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, (1997)). Os lioprotetores estabilizam as proteínas na forma de dosagem sólida secada por congelamento pela preservação das propriedades conformacionais equivalentes às naturais da proteína durante os estágios de desidratação da secagem por congelamento. As propriedades de estado vítreo foram classificadas como “forte” ou “frágil” dependendo das suas propriedades de relaxação como uma função da temperatura. E importante que os crioprotetores, lioprotetores e agentes formadores de vidro permaneçam na mesma fase com a proteína de modo a comunicar estabilidade. Açúcares, polímeros e polióis caem dentro desta categoria e pode algumas vezes servir a todos os três papéis.

Os polióis abrangem uma classe de excipientes que inclui açúcares, (por exemplo manitol, sacarose, sorbitol) e outros álcoois poliídricos (por exemplo, glicerol e propileno glicol). O polímero polietileno glicol (PEG) é incluído nesta categoria. Os polióis são habitualmente usados como excipientes de estabilização e/ou agentes de isotonicidade nas formulações de proteína parenterais tanto líquidas quanto liofilizadas. Com respeito à série Hofmeister, os polióis são cosmotrópicos e são preferencialmente excluídas da superfície da proteína. Os polióis podem proteger proteínas dos caminhos da degradação tanto física quanto química. Preferencialmente excluídos os co-solventes aumentam a tensão de superfície eficaz do solvente na interface da proteína por meio do qual as conformações de proteína mais energeticamente favoráveis são aquelas com as áreas de superfície menores.

Manitol é um agente de encorpamento popular em formulações liofílizadas porque o mesmo cristaliza da fase de proteína amorfa durante a secagem por congelamento levando à estabilidade estrutural da torta (por exemplo Leukine Enbrel - Lyo, Betaseron®). Este é no geral usado em combinação com um crio e/ou lioprotetores como a sacarose. Por causa da propensão do manitol para cristalizar sob as condições de congelamento, sorbitol e sacarose são os agentes de tonicidade/ estabilizadores preferidos em formulações líquidas para proteger o produto contra estresses do congelamento-descongelamento encontrados durante o transporte ou quando do congelamento volumoso antes da fabricação. Sorbitol e sacarose são muito mais resistentes à cristalização e portanto menos prováveis de separar de fase da proteína. E interessante mencionar que embora o manitol tenha sido usado nas quantidades tonificantes em diversas formulações líquidas comercializadas tais como Actimmune®, Forteo® e Rebit®, os rótulos de produto destes medicamentos portam uma advertência ‘Não Congelar’. O uso de açúcares redutores (contendo grupos de aldeído ou cetona livres) tais como glicose e lactose devem ser evitados porque eles podem reagir e glicar resíduos de lisina e arginina da superfície de proteínas por intermédio da reação de Maillard de aldeídos e aminas primárias (Chevalier F, et al., Nahrung, 46(2): 58-63 (2002); Humeny A, et al., J Agric Food Chem. 50(7): 2153-60 (2002)). A sacarose pode hidrolisar para frutose e glicose sob condições ácidas (Kautz C. F. e Robinson A. L., JACS, 50(4) 1022-30 (1928)) e conseqüentemente pode causar glicação.

O polímero polietileno glicol (PEG) pode estabilizar proteínas por dois mecanismos dependentes de temperatura diferentes. Em temperaturas mais baixa, é preferencialmente excluído da superfície da proteína mas foi mostrado interagir com a forma não dobrada da proteína em temperatura mais alta dada a sua natureza anfipática (Lee L. L. e Lee J. C., Biochemistry, 26(24): 7813-9 (1987)). Assim em temperaturas mais baixas o mesmo pode proteger proteínas por intermédio do mecanismo de exclusão preferencial, mas em temperaturas mais altas possivelmente pela redução do número de colisões produtivas entre moléculas não dobradas. PEG também é um crioprotetor e foi utilizado no Recombinate®, uma formulação liofilizada do Fator Anti-hemofílico recombinante, que utiliza PEG 3350 a uma concentração de 1,5 mg/ml. Os PEGs líquidos de peso molecular baixo (PEG 300 a 600) podem estar contaminados com peróxidos e causam a oxidação da proteína. Se usados, o teor de peróxido na matéria prima deve ser minimizado e controlado por toda a sua vida de prateleira. O mesmo é verdadeiro para os polissorbatos.

Em uma forma de realização particular das presentes composições, um estabilizador (ou uma combinação de estabilizadores) é adicionada à formulação de liofilização para prevenir ou reduzir a agregação e degradação química induzida pela liofilização ou induzida pela armazenagem. Uma solução nebulosa ou turva na reconstituição indica que a proteína precipitou. O termo “estabilizador” significa um excipiente capaz de prevenir a agregação ou outra degradação física, assim como degradação química (por exemplo, autólise, desamidação, oxidação, etc.) em um estado aquoso e sólido. Os estabilizadores que são convencionalmente utilizado em composições farmacêuticas incluem, mas não são limitados a, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCI, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio, [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74: 225, (1991)]. Em uma forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 40 % p/v. Em uma outra forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de pelo menos 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 ou 40 % p/v. Em uma outra forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8, 9 % a cerca de 10 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de cerca de 2 % a cerca de % p/v. Ainda em uma outra forma de realização, o estabilizador é incorporado em uma concentração de cerca de 2 % p/v.

Se desejado, as composições liofilizadas também incluem quantidades apropriadas de agentes de encorpamento e reguladores de osmolaridade adequadas para formar uma “torta” liofilizada. Os agentes de encorpamento podem ser cristalinos (por exemplo, manitol, glicina) ou amorfo (por exemplo, sacarose, polímeros tais como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose). Outros agentes de encorpamento exemplares incluem lactose, sorbitol, trealose ou xilitol. Em uma forma de realização, o agente de encorpamento é manitol. Em uma outra forma de realização, o agente de encorpamento é incorporado em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 10 % p/v. Em uma outra forma de realização, o agente de encorpamento é incorporado em uma concentração de pelo menos 0,2, 0,5, 0,7, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0,

8,5, 9,0 ou 9,5 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização em uma concentração de cerca de 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 % a 5,0 % p/v, para produzir uma torta mecânica e farmaceuticamente estável e elegante. Em uma outra forma de realização, a concentração de manitol é de 4 % p/v.

Tensoativos

As moléculas de proteína têm uma alta propensão para interagir com superfícies tomando-as suscetíveis à adsorção e desnaturação nas interfaces ar-líquido, frasco-líquido e líquido-líquido (óleo de silicona). Este caminho de degradação foi observado ser inversamente dependente da concentração de proteína e resulta na formação de agregados de proteína solúveis e insolúveis ou a perda de proteína da solução por intermédio da adsorção nas superfícies. Além da adsorção na superfície do recipiente, a degradação induzida pela superfície é exacerbada com a agitação física, como seria experienciado durante o envio e manuseio do produto.

Os tensoativos são habitualmente usados em formulações de proteína para prevenir a degradação induzida pela superfície. Os tensoativos são moléculas anfipáticas com a capacidade de proteínas que competem quanto as posições interfaciais. As porções hidrofóbicas das moléculas tensoativas ocupam posições interfaciais (por exemplo, ar/ líquido), enquanto que as porções hidrofílicas das moléculas permanecem orientadas na direção do solvente volumoso. Nas concentrações suficientes (tipicamente em tomo da concentração da micelar crítica do detergente), uma camada de superfície de moléculas de tensoativo serve para prevenir as moléculas de proteína de adsorver na interface. Deste modo, a degradação induzida pela superfície é minimizada. Os tensoativos mais habitualmente usados são ésteres de ácido graxo de polietoxilatos de sorbitano, isto é, polissorbato 20 e polissorbato 80 (por exemplo, Avonex®, Neupogen®, Neulasta®). Os dois diferem apenas no comprimento da cadeia alifática que comunica caráter hidrofóbico às moléculas, C-12 e C-18, respectivamente. Conseqüentemente, polissorbato-80 é mais ativo na superfície e tem uma concentração micelar crítica mais baixa do que o polissorbato-20. O tensoativo poloxâmero 188 também foi usadas em diversos produtos líquidos comercializados tais como Gonal-F®, Norditropin® e Ovidrel®.

Os detergentes também podem afetar a estabilidade conformacional termodinâmica de proteínas. Aqui mais uma vez, os efeitos de um dado excipiente será específico de proteína. Por exemplo, polissorbatos foram mostrados reduzir a estabilidade de algumas proteínas e aumentar a estabilidade de outras. A desestabilização pelo detergente de proteínas pode ser racionalizada em termos das caudas hidrofóbicas das moléculas de detergente que podem prender na ligação específica com estados de proteína parcial ou totalmente desdobrados. Estes tipos de interações causariam uma mudança no equilíbrio conformacional voltado para os estados de proteína mais expandidos (isto é, aumentando a exposição de porções hidrofóbicas da molécula de proteína no complemento para a ligação de polissorbato). Altemativamente, se o estado nativo da proteína exibe algumas superfícies hidrofóbicas, a ligação de detergente ao estado nativo pode estabilizar esta conformação.

Um outro aspecto dos polissorbatos é que eles são inerentemente suscetíveis à degradação oxidativa. Freqüentemente, como matérias primas, eles contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar a oxidação de cadeias laterais de resíduo proteína, especialmente metionina. O potencial para o dano oxidativo que surge da adição de estabilizador enfatiza o ponto que concentrações eficazes mais baixas de excipientes devem ser usadas nas formulações. Para os tensoativos, a concentração eficaz para uma dada proteína dependerá do mecanismo de estabilização. Foi postulado que se o mecanismo de estabilização de tensoativo está relacionado para prevenir a desnaturação da superfície a concentração eficaz estará em tomo da concentração micelar crítica do detergente. Ao contrário, se o mecanismo de estabilização está associado com interações de proteína-detergente específicas, a concentração de tensoativo eficaz estará relacionada com a concentração de proteína e a estequiometria da interação (Randolph T. W., et al., Pharm Biotechnol., 13: 159-75 (2002)).

Os tensoativos também podem ser adicionados em quantidades apropriadas para prevenir o fenômeno de agregação relacionado com a superfície durante o congelamento e secagem [Chang, B, J. Pharm. Sei. 85:

1325, (1996)]. Os tensoativos exemplares incluem tensoativos aniônicos, catiônicos, não iônicos, zwitteriônicos e anfotéricos incluindo tensoativos derivados de aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os tensoativos aniônicos incluem, mas não são limitados a, lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroil-sarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido 1-octano-sulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio e sal sódico do ácido glicodesoxicólico. Os tensoativos catiônicos incluem, mas não são limitados a, cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado e brometo de hexadeciltrimetilamônio. Os tensoativos zwitteriônicos incluem, mas não são limitados a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 e SB3-12. Os tensoativos não iônicos incluem, mas não são limitados a, digitonina, Triton X-100, Tríton X-114, TWEEN-20 e TWEEN-80. Em uma outra forma de realização, os tensoativos incluem lauromacrogol 400, esterarato de polioxil 40, óleo de mamona polioxietileno hidrogenado 10, 40, 50 e 60, monoesterarato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja e outros fosfolipídeos tais como DOPC, DMPG, DMPC e DOPG; éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. As composições que compreendem estes tensoativos, individualmente ou como uma mistura em razões diferentes, são portanto ainda fornecidas. Em uma forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0 % a cerca de 5 % p/v. Em uma outra forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de pelo menos 0,001, 0,002, 0,005, 0,007, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 ou 4,5 % p/v. Em uma outra forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,001 % a cerca de 0,5 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,004, 0,005, 0,007, 0,01, 0,05 ou 0,1 % p/v a cerca de 0,2 % p/v. Ainda em uma outra forma de realização, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,01 % a cerca de 0,1 % p/v.

Sais

Os sais são freqüentemente adicionados para aumentar a concentração iônica da formulação, que pode ser importante para a solubilidade, estabilidade física e isotonicidade da proteína. Os sais podem afetar a estabilidade física das proteínas em uma variedade de modos. Ions podem estabilizar o estado nativo das proteínas pela ligação aos resíduos carregados na superfície da proteína. Alternativamente, estes podem estabilizar o estado desnaturado pela ligação aos grupos de peptídeo ao longo da cadeia principal da proteína (-CONH-). Os sais também podem estabilizar a conformação da proteína nativa pela proteção de interações eletrostáticas repulsivas entre resíduos dentro de uma molécula de proteína. Os eletrólitos nas formulações de proteína também podem proteger das interações eletrostáticas atrativas entre as moléculas de proteína que podem levar à agregação e insolubilidade da proteína.

O efeito de sal sobre a estabilidade e solubilidade de proteínas varia significantemente com as características das espécies iônicas. A série Hofmeister originada nos idos de 1880 como um caminho para classificar os eletrólitos com base na sua capacidade para precipitar proteínas (Cacace M. G., et al., Quarterly Reviews of Biophysics., 30(3): 241-277 (1997)). Neste relato, a série Hofmeister é usada para ilustrar uma escala de efeitos de estabilização de proteína pelos co-solutos iônicos e não iônicos. Na Tabela C, os co-solutos são ordemados com respeito a aos seus efeitos gerais sobre as proteínas no estado de solução, de estabilizante (cosmotrópico) a desestabilizante (caotrópico). No geral, as diferenças nos efeitos através dos ânions são muito maiores do que aquelas observadas para os cátions, e, para ambos os tipos, os efeitos são mais evidentes em concentrações mais altas do que são aceitáveis nas formulações parenterais. As concentrações altas de cosmótropos (por exemplo, sulfato de amônio >1 molar) são habitualmente usadas para precipitar proteínas da solução por um processo chamado ‘precipitação’ onde o cosmótropo é preferencialmente excluído da superfície da proteína reduzindo a solubilidade da proteína na sua conformação nativa (dobrada). A remoção ou diluição do sal retomará a proteína à solução. O termo ‘dissolução’ refere-se ao uso de íons desestabilizantes (por exemplo, como guanidina e cloreto) que aumentam a solubilidade de proteínas pela solvatação das ligações de peptídeo da cadeia de proteína. Aumentando as concentrações do caótropo favorecerá a conformação no estado desnaturado (não dobrado) da proteína conforme a solubilidade da cadeia de peptídeo aumenta. A eficácia relativa dos íons para ‘dissolver’ e ‘precipitar’ define a sua posição na série de Hofmeister.

De modo a manter a isotonicidade em uma formulação parenteral, as concentrações salinas são no geral limitadas a menos do que

150 mM para as combinações iônicas monovalentes. Nesta faixa de concentração, o mecanismo de estabilização salina é provavelmente devido à triagem de forças intramoleculares repulsivas eletrostáticas ou forças intermoleculares atrativas (triagem de Debye-Huckel). De maneira interessante, os sais caotrópicos foram mostrados serem mais eficazes na estabilização da estrutura de proteína do que as concentrações similares de cosmótropos por este mecanismo. Acredita-se que os ânions caotrópicos se liguem mais fortemente do que os íons cosmotrópicos. Com respeito à degradação da proteína covalente, efeitos diferenciais de concentração iônica neste mecanismo são esperados através da teoria de Debye-Huckel.

Conseqüentemente, relatos publicados de estabilização de proteína pelo cloreto de sódio são acompanhados por aqueles onde o cloreto de sódio acelerou a degradação covalente. Os mecanismos pelos quais os sais afetam a estabilidade da proteína são específicos de proteína e podem variar significantemente como uma função do pH da solução. Um exemplo onde um excipiente pode ser útil em permitir que a liberação de um medicamento de proteína seja aquela de formulações de anticorpo de concentração um tanto alto. Recentemente, os sais foram mostrados serem eficazes na redução da viscosidade de tais formulações (Liu J., et al., J. Pharm Sei., 94(9): 1928-40 (2005); Errata em: J Pharm Sei., 95(1): 234-5. (2006)).

Tabela C: A série de Hofineister de sais

Co-soluto	Escalas de	estabilização
Ânion	Cátion	Outros
F	(CHsjX	Glicerol/Sorbitol	Estabilização	Cosmotrópico
PO4’	(ch3)2niT	Sacarose/Trealose	(precipitação)
SO4’	NH?	TMAO
CHCOO'	k+		2	k	2
cr	Na+
Br	Cs+
r	Li+
	Mg+	Guanidina
	Ca2+	Arginina		7	5
	Ba2+	Uréia	Desestabilização (dissolução)	Caotrópicos

Aminoácidos

Os aminoácidos têm encontrado uso versátil em formulações de proteína como tampões, agentes de encorpamento, estabilizadores e antioxidantes. A histidina e o ácido glutâmico são utilizados para tamponar formulações de proteína na faixa de pH de 5,5 a 6,5 e 4,0 a 5,5 respectivamente. O grupo imidazol de histidina tem um pKa = 6,0 e o grupo carboxila da cadeia lateral do ácido glutâmico tem um pKa de 4,3 que os tomam adequados para tamponar nas suas respectivas faixas de pH. O acetato, o tampão mais habitualmente usado na faixa de pH ácido de 4,0 a 5,5, sublima durante a liofilização e por este motivo não devem ser usados em formulações secadas por congelamento. O ácido glutâmico é particularmente útil em tais casos (por exemplo, Stemgen®). A histidina é habitualmente encontrada em formulações de proteína comercializadas (por exemplo, Xolair®, Herceptin®, Recombinate®). Esta fornece uma boa alternativa ao citrato, um tampão conhecido por causar dor na injeção. De maneira interessante, a histidina também foi relatada ter um efeito estabilizante sobre ABX-IL8 (um anticorpo de IgG2) com respeito à agregação quando usada em concentrações altas tanto em apresentações líquidas e liofilizadas (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). A histidina (até 60 mM) também foi observada reduzir a viscosidade de uma formulação de concentração alta deste anticorpo. Entretanto, no mesmo estudo, os autores observaram agregação e descoloração aumentadas em formulações contendo histidina durante os estudos de congelamento-descongelamento do anticorpo em recipientes de aço inoxidável. Os autores atribuíram isto a um efeito de íons ferro lixiviados da corrosão de recipientes de aço. Uma outra precaução com a histidina é que ela sofre foto-oxidação na presença de íons metálicos (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). O uso de metionina como um antioxidante nas formulações parece promissor; o mesmo foi observado ser eficaz contra vários estresses oxidativos (Lam XM, et al., J Pharm Sei., 86(11): 12505 (1997)).

Os aminoácidos glicina, prolina, serina e alanina foram mostrados estabilizar proteínas pelo mecanismo de exclusão preferencial. A glicina também é um agente de encorpamento habitualmente usado em formulações liofilizadas (por exemplo, Neumega®, Genotropin®, Humatrope®). A mesma cristaliza da fase amorfa congelada dando à torta estrutura e volume. A arginina tem mostrado ser um agente eficaz na inibição da agregação e tem sido usada em formulações tanto líquida quanto liofilizada (por exemplo, Activase®, Avonex®, Enbrel® líquidos). Além disso, a eficiência realçada de redobrar de certas proteínas na presença de arginina tem sido atribuída à sua supressão da reação de agregação competidora durante a redobra.

Antioxidantes

A oxidação de resíduos de proteína surge de várias fontes diferentes. Além da adição de antioxidantes específicos, a prevenção do dano oxidativo à proteína envolve o controle cuidadoso de vários fatores por todo o processo de fabricação e armazenagem do produto tais como oxigênio atmosférico, temperatura, exposição à luz e contaminação química. Os antioxidantes farmacêuticos mais habitualmente usados são agentes redutores, descontaminantes de oxigênio/radical livre ou agentes queladores. Os antioxidantes nas formulações de proteína terapêuticas devem ser solúveis em água e permanecem ativos por toda a vida de prateleira do produto. Os agentes redutores e descontaminantes de oxigênio/radical livre funcionam pela remoção de espécies de oxigênio ativo em solução. Agentes queladores tais como EDTA podem ser eficazes pela ligação de contaminantes de metal traço que promovem a formação de radical livre. Por exemplo, EDTA foi utilizado na formulação líquida do fator de crescimento de fibroblasto ácido para inibir a oxidação catalisada por íon metálico de resíduos de cisteína. EDTA foi usado em produtos comercializados como Kineret® e Ontak®.

Além de avaliar a eficácia de vários excipientes na prevenção da oxidação de proteína, os cientista de formulação devem estar cientes do potencial para os próprios antioxidantes induzirem outras mudanças covalentes ou físicas à proteína. Vários de tais casos foram relatados na literatura. Os agentes redutores (como glutationa) pode causar o rompimento de ligações de dissulfeto intramoleculares, que podem levar ao embaralhamento de dissulfeto. Na presença de íons metálicos de transição, ácido ascórbico e EDTA foram mostrados promover a oxidação da metionina em várias proteínas e peptídeos (Akers MJ e Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. Em: Pharmaceutic Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editores. Pharmaceutic Science. Tailor e Francis, UK (1999)); Fransson J. R., J. Pharm. Sei. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). O tiossulfato de sódio foi relatado reduzir os níveis de oxidação da metionina induzida por luz e temperatura em rhuMab HER2; entretanto, a formação de um aduto de tiossulfato-proteína também foi relatado neste estudo (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sei. 86(11): 1250-5 (1997)). A seleção de um antioxidante apropriado é feito de acordo com os estresses e sensibilidades específicos da proteína.

íons metálicos

No geral, os íons metálicos de transição são indesejados nas formulações de proteína porque eles podem catalisar reações de degradação física e química em proteínas. Entretanto, íons metálicos específicos são incluídos nas formulações quando eles são co-fatores para proteínas e em formulações de proteínas em suspensão onde eles formam complexos de coordenação (por exemplo, suspensão de zinco de insulina). Recentemente, o uso de íons magnésio (10 a 120 mM) foi proposto para inibir a isomerização de ácido aspártico ao ácido isoaspártico (WO 2004039337).

Dois exemplos onde íons metálicos conferem estabilidade ou atividade aumentada em proteínas são desoxirribonuclease humana (rhDNase, Pulmozyme®) e Fator VIII. No caso de rhDNase, os íons Ca⁺² (até 100 mM) aumentaram a estabilidade da enzima através de um sítio de ligação específico (Chen B, et al., J Pharm Sei., 88(4): 477-82 (1999)). De fato, a remoção de íons cálcio da solução com EGTA causou um aumento na desamidação e agregação. Entretanto, este efeito foi observado apenas com íons Ca⁺²; outros cátions divalentes - Mg⁺², Mn⁺² e Zn⁺² foram observados desestabilizar a rhDNase. Efeitos similares foram observados no Fator VIII. Os íons Ca⁺² e Sr⁺² estabilizaram a proteína enquanto que outros como Mg⁺², Mn e Zn , Cu e Fe desestabilizaram a enzima (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). Em um estudo separado com o Fator VIII, um aumento significante na taxa de agregação foi observada na presença de íons Al⁺³ (Derrick TS, et al., Pharm. Sei., 93(10): 2549-57 (2004)). Os autores mencionam que outros excipientes como sais de tampão são ffeqüentemente contaminados com íons Al⁺³ e ilustram a necessidade de usar excipientes de qualidade apropriada nos produtos formulados.

Conservantes

Os conservantes são necessários quando do desenvolvimento de formulações parenterais de uso múltiplo que envolvem mais do que uma extração do mesmo recipiente. A sua função primária é inibir o crescimento microbiano e garantir a esterilidade do produto por toda a vida de prateleira ou data de vencimento de uso do produto medicamentoso. Os conservantes habitualmente usados incluem álcool benzilíco, fenol e m-cresol. Embora os conservantes tenham uma longa história de uso, o desenvolvimento de formulações de proteína que incluem conservantes pode ser desafiador. Os conservantes quase sempre têm um efeito desestabilizante (agregação) sobre as proteínas e isto tem se tomado um fator principal na limitação de seu uso em formulações de proteína de dose múltipla (Roy S, et al., J Pharm Sei., 94(2): 38296 (2005)).

Até agora, a maioria dos medicamentos de proteína foram formulados apenas para o uso único. Entretanto, quando formulações de dose múltipla são possíveis, estas têm a vantagem adicional de permitir a conveniência do paciente e negociabilidade aumentada. Um bom exemplo é aquele de hormônio do crescimento humano (hGH) onde o desenvolvimento de formulações preservadas tem levado à comercialização de apresentações de mais canetas de injeção de uso múltiplo, convenientes. Pelo menos quatro de tais dispositivos de caneta contendo formulações preservadas de hGH são correntemente disponíveis no mercado. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) & Genotropin (liofilizado cartucho de câmara dupla, Pharmacia & Upjohn) contêm fenol enquanto Somatrope® (Eli Lilly) é formulado com m-cresol.

Diversos aspectos necessitam ser considerados durante o desenvolvimento da formulação de formas de dosagem preservadas. A concentração conservante eficaz no produto medicamentoso deve ser otimizado. Isto requer testar um dado conservante na forma de dosagem com faixas de concentração que conferem eficácia antimicrobiana sem comprometer a estabilidade da proteína. Por exemplo, três conservantes foram triados com êxito no desenvolvimento de uma formulação líquida para o receptor de interleucina 1 (Tipo I), usando calorimetria de varredura diferencial (DSC). Os conservantes foram classificados com base no seu impacto na estabilidade em concentrações habitualmente usadas em produtos comercializados (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)).

Como seria esperado, o desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes é mais desafiador do que as formulações liofilizadas. Os produtos secados por congelamento podem ser liofilizados sem o conservante e reconstituído com um diluente contendo conservante no momento de uso. Isto encurta o tempo para que um conservante esteja em contato com a proteína minimizando significantemente os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, a eficácia de conservante e estabilidade tem que ser mantida durante a vida de prateleira do produto inteira (~ 18 a 24 meses). Um ponto importante a mencionar é que a eficácia conservante tem que ser demonstrada na formulação final contendo o medicamento ativo e todos os componentes excipientes.

Alguns conservantes podem causar reações no local da injeção, que é um outro fator que necessita consideração quando da escolha de um conservante. Em testes clínicos que focalizaram na avaliação de conservantes e tampões em Norditropin, a percepção de dor foi observada ser mais baixa nas formulações contendo fenol e álcool benzilíco quando comparadas com uma formulação contendo m-cresol (Kappelgaard A. M.,

Harm Res. 62 Supl 3: 98-103 (2004)). De maneira interessante, entre os conservantes habitualmente usados, o álcool benzilíco possui propriedades anestésicas (Minogue SC e Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)).

Dadas as divulgações e orientação aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica saberão qual quantidade ou faixa de excipiente pode ser incluída em qualquer formulação particular para se obter uma formulação biofarmacêutica da invenção que promova a retenção em estabilidade do produto biofarmacêutico. Por exemplo, a quantidade e tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção podem ser selecionados com base na osmolalidade desejada (isto é, isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução fmal assim como as quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem incluídos na formulação. Similarmente, pela exemplificação com referência ao tipo de poliol ou açúcar incluídos em uma formulação, a quantidade de um tal excipiente dependerá da sua osmolalidade.

Por via de exemplo, a inclusão de cerca de 5 % de sorbitol pode alcançar a isotonicidade enquanto cerca de 9 % de um excipiente de sacarose são necessários para se obter isotonicidade. A seleção da quantidade ou faixa de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos dentro de uma formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificada acima por referência aos sais, polióis e açúcares. Entretanto, aqueles habilitados na técnica entenderão que as considerações aqui descritas e outras exemplificadas por referência aos excipientes específicos são igualmente aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes incluindo, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de tonicidade, tensoativos, estabilizadores, agentes de encorpamento, crioprotetores, lioprotetores, antioxidantes, íons metálicos, agentes queladores e/ou conservantes.

Além disso, onde um excipiente particular é relatado em uma formulação, por exemplo, em porcentagem (%) p/v, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a concentração molar equivalente deste excipiente também é considerada.

Naturalmente, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconhecería que as concentrações dos excipientes anteriormente mencionados compartilham uma interdependência dentro de uma formulação particular. Por via de exemplo, a concentração de um agente de encorpamento pode ser diminuída onde, por exemplo, existe uma alta concentração de proteína/peptídeo ou onde, por exemplo, existe uma alta concentração de agente estabilizante. Além disso, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica reconhecería que, de modo a manter a isotonicidade de uma formulação particular em que não existe nenhum agente de encorpamento, a concentração de um agente estabilizante seria ajustada conseqüentemente (isto é, uma quantidade “tonificante” de estabilizador seria usada).

As composições são estáveis por pelo menos dois anos de 2° C a 8° C no estado liofilizado. Esta estabilidade de longa duração é benéfica para prolongar a vida de prateleira do produto farmacêutico.

Métodos de Preparação

A presente invenção considera ainda métodos para a preparação de formulações de proteína terapêutica. Em um aspecto, métodos para preparar uma formulação de pepticorpo terapêutico liofilizado que compreende a etapa de liofilizar uma composição de pepticorpo terapêutico em um tampão que compreende um agente de tamponamento, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e um tensoativo;

Os presentes métodos compreendem ainda uma ou mais das seguintes etapas: adicionar um agente estabilizante à dita mistura antes de liofilizar, adicionar pelo menos um agente selecionado de um agente de encorpamento, um agente regulador de osmolaridade e um tensoativo à dita mistura antes da liofilização. O agente de encorpamento pode ser qualquer agente de encorpamento aqui descrito. Em um aspecto, o agente de encorpamento é manitol. Em uma outra forma de realização, o agente estabilizante é sacarose. O tensoativo pode ser qualquer tensoativo aqui descrito. Em uma forma de realização, o tensoativo é polissorbato-20.

A prática da reconstituição padrão para material liofilizado é adicionar de volta um volume de água pura ou água estéril para injeção (WFI) (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam algumas vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para a administração parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18: 1311-1354 (1992)]. Conseqüentemente, os métodos são fornecidos para a preparação de pepticorpos terapêuticos reconstituídos que compreendem a etapa de adicionar um diluente a uma composição de pepticorpo terapêutico liofilizado da invenção.

A composição de pepticorpo terapêutico liofilizado pode ser reconstituída como uma solução aquosa. Uma variedade de carregadores aquosos, por exemplo, água estéril para injeção, água com conservantes para uso em dose múltipla ou água com quantidades apropriadas de tensoativos (por exemplo, polissorbato-20), 0,4 % de solução salina, 0,3 % de glicina ou as suspensões podem conter o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas. Em vários aspectos, tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropil-metilcelulose, alginato, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes de dispersão ou umectação podem ser um fosfatídeo que ocorra naturalmente, por exemplo lecitina ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo esterarato de polioxietileno ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo heptadecaetileno-oxicetanol ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol tal como monooleato de polioxietileno sorbitol ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo monooleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo etil ou n-propil, p-hidroxibenzoato.

Para administrar composições a seres humanos ou animais de teste, em um aspecto, as composições compreendem um ou mais carregadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases “farmaceuticamente” ou “farmacologicamente aceitável” referem-se às entidades e composições moleculares que são estáveis, inibem a degradação da proteína tais como agregação e produtos de divagem e além disso não produzem reações alérgicas ou outras adversas quando administradas usando vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. “Carregadores farmaceuticamente aceitáveis” incluem qualquer e todos os solventes clinicamente úteis, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifüngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e outros, incluindo aqueles agentes divulgados acima.

As composições de pepticorpo terapêutico podem ser administradas oral, tópica, transdérmica, parenteral, pela pulverização de inalação, vaginal, retalmente ou pela injeção intracraniana. O termo parenteral como aqui usado inclui injeções subcutâneas, técnicas de injeção ou infusão intravenosas, intramusculares, intracistémicas. A administração pela injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneai, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e ou implantação cirúrgica em um sítio particular também é considerada. No geral, as composições são essencialmente livres de pirogênios, assim como de outras impurezas que seriam nocivas ao receptor.

As administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas com os níveis de dose e padrão que são selecionados pelo médico tratador. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da gravidade e curso da doença, se o medicamento é administrado com propósitos preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, da história clínica do paciente e da resposta ao medicamento e do critério do médico atendente.

Kits

Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem um ou mais compostos liofilizados ou composições empacotadas em uma maneira que facilita o seu uso para a administração aos pacientes. Em uma forma de realização, um tal kit inclui um composto ou composição aqui descritos (por exemplo, uma composição que compreende uma proteína ou peptídeo terapêuticos), embalados em um recipiente tal como um frasco ou recipiente selados, com um rótulo fixado ao recipiente ou incluído na embalagem que descreve o uso do composto ou composição na prática do método. Em uma forma de realização, o kit contém um primeiro recipiente tendo uma composição de proteína ou peptídeo terapêuticos liofilizada e um segundo recipiente tendo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição liofilizada. Em um aspecto, o composto ou composição são embalados em uma forma de dosagem unitária. O kit pode incluir ainda um dispositivo adequado para a administração da composição de acordo com uma via específica de administração. Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve o uso da composição terapêutica de proteína ou peptídeo.

Dosagens

O regime de dosagem envolvido em um método para tratar uma condição aqui descrita será determinada pelo médico atendente, considerando vários fatores que modificam a ação de medicamentos, por exemplo a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos. Em vários aspectos, o regime diário está na faixa de 0,1 a 1000 pg de uma preparação por quilograma de peso corporal (calculando a massa da proteína sozinha, sem modificação química) ou de 0,1 a 150 pg/kg. Em algumas formas de realização da invenção, a dose pode exceder 1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg.

As preparações da invenção podem ser administradas por um bolo inicial seguido por uma infusão contínua para manter os níveis circulantes terapêuticos de produto medicamentoso. Como um outro exemplo, o composto inventivo pode ser administrado como uma dose de tempo único.

Aqueles de habilidade comum na técnica facilmente otimizarão dosagens eficazes e regimes de administração como determinado pela boa prática médica e a condição clínica do paciente individual. A freqüência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e da via de administração. A formulação farmacêutica ótima será determinada por uma pessoa habilitada na técnica dependendo da via de administração e dosagem desejada. Ver por exemplo, Remington’s Pharmaceutic Sciences, 18^a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435 a 1712, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência. Tais formulações podem influenciar o estado físico, a estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de depuração in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, uma dose adequada pode ser calculada de acordo com o peso corporal, área de superfície corporal ou tamanho do órgão. Refinamentos dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento que envolve cada uma das formulações acima mencionadas é rotineiramente feita por aqueles de habilidade comum na técnica sem experimentação indevida, especialmente considerando-se a informação de dosagem e os ensaios aqui divulgados, assim como os dados farmacocinéticos observados nos testes clínicos humanos debatidos acima. As dosagens apropriadas podem ser averiguadas através do uso de ensaios estabelecidos para a determinação de dosagens de nível sangüíneo em conjunção com dados de dose-resposta apropriados. O regime de dosagem final será determinado pelo médico atendente, considerando vários fatores que modificam a ação de medicamentos, por exemplo a atividade específica do medicamento, a severidade do dano e a responsividade do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos. Conforme os estudos são conduzidos, informação adicional emergirá com respeito aos níveis de dosagem apropriada e duração de tratamento para várias doenças e condições. Estrutura dos compostos

No Geral.

Nas preparações de acordo com a invenção, um peptídeo é ligado a um veículo através do término N do peptídeo, término C do peptídeo ou ambos e a estrutura resultante pode ser modificados ainda com um WSP covalentemente ligado que é ligado à porção de veículo no produto veículopeptídeo. Assim, as moléculas de pepticorpo terapêutico desta invenção podem ser descritas pela seguinte Fórmula I:

i [(x')_a - Fqx^j-ff-^wsp,, em que:

F¹ é um veículo;

X¹ é selecionado de

P'-(L²)eP²(L³)f-P‘-(L²)_ePUVPUYP'-^- e

P⁴(L⁵)h-P³(L⁴)g-P²(L³)rP' -(L²)eX é selecionado de:

-(L²)_e-P‘

-(L²)e-P‘-(L³)rP²

-(L²)e-P'-(L³)rP²-(L⁴)g-P³ e

-(lVp^^^lVp^lVp⁴ em que P¹, P², P³ e P⁴ são cada um seqüências independentes de peptídeos farmacologicamente ativos;

L¹, L², L³, L⁴ e L⁵ são cada um independentemente ligadores; a, b, c, e, f, g e h são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de a e b seja 1; d é 0, 1, ou maior do que 1; e

WSP é um polímero solúvel em água, a ligação do qual é efetuada em qualquer porção reativa em F¹.

Assim, o composto I compreende os compostos das fórmulas

II [X^KLVwSPd incluindo seus multímeros em que F¹ é um domínio Fc e está ligado ao término C de X¹ e um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

III [F^Kl/VWSPd incluindo seus multímeros em que F¹ é um domínio Fc e está ligado ao término N de X² e um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

IV [F¹-(L¹)e-P¹]-(L¹)c-WSP_d incluindo seus multímeros em que F¹ é um domínio Fc e está ligado ao término N de -(L^c-P¹ e um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹ e

V [FLCL^e-PLCLVP^-CL^e-WSPd incluindo seus multímeros em que F¹ é um domínio Fc e está ligado ao término N de -L -P -L -P e um ou mais WSP estão ligados ao domínio Fc, opcionalmente através do ligador L¹.

Em uma forma de realização, F¹ é um domínio Fc e é ligado ao término N ou término C de um peptídeo. Em uma forma de realização relacionada, o Fc é ligado em uma forma dimérica como aqui descrita à qual 2 (ou mais) peptídeos são ligados. Os peptídeos podem ser homodiméricos (isto é, a mesma seqüência de aminoácido) ou heterodinâmica (isto é, seqüências de aminoácido diferentes que ligam o mesmo alvo ou que ligam alvos diferentes).

Em uma outra forma de realização, as Alças Fc que compreendem um peptídeo ou peptídeos são fornecidas. As Alças Fc que compreendem um peptídeo ou peptídeos são preparadas em um processo em que pelo menos um peptídeo biologicamente ativo é incorporado como uma seqüência interna em um domínio Fc. Uma tal seqüência interna pode ser adicionada pela inserção (isto é, entre aminoácidos no domínio Fc anteriormente existente) ou pela substituição de aminoácidos no domínio Fc anteriormente existente (isto é, removendo aminoácidos no domínio Fc anteriormente existente e adicionando aminoácidos peptídicos). No último caso, o número de aminoácidos de peptídeo adicionados não precisam corresponder ao número de aminoácidos removidos do domínio Fc anteriormente existente. Por exemplo, em um aspecto, uma molécula em que 10 aminoácidos são removidos e 15 aminoácidos são adicionados é fornecida. Os compostos farmacologicamente ativos fornecidos são preparados por um processo que compreende: a) selecionar pelo menos um peptídeo que module a atividade de uma proteína de interesse; e b) preparar um agente farmacológico que compreenda uma seqüência de aminoácido do peptídeo selecionado como uma seqüência interna de um domínio Fc. Este processo pode ser utilizado para modificar um domínio Fc que já está ligado através de um terminal N ou C ou cadeia lateral a um peptídeo, por exemplo, como descrito nos Pedidos de Pat. U.S. N~ 2003/0195156, 2003/0176352, 2003/0229023 e 2003/0236193 e publicação internacional números WO 00/24770 e WO 04/026329. O processo descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. N^s US2006/0140934 também pode ser utilizado para modificar um domínio Fc que é parte de um anticorpo. Deste modo, moléculas diferentes podem ser produzidas que têm funcionalidades adicionais, tais como um domínio de ligação a um epítopo diferente ou um domínio de ligação adicional ao epítopo existente da molécula precursora. As moléculas que compreendem uma seqüência de peptídeo interna também são aludidas como “pepticorpos Fc internos” ou “moléculas de peptídeo de Fc interno.”

As moléculas de peptídeo de Fc interno podem incluir mais do que uma seqüência de peptídeo em tandem em uma região interna particular e estas podem incluir outros peptídeos em outras regiões internas. Embora as regiões de alça putativas sejam preferidas, as inserções em quaisquer outros domínios não terminais do Fc também são considerados parte desta invenção.

As variantes e derivados dos compostos acima (descritos abaixo) também são abrangidos por esta invenção.

Os compostos desta invenção podem ser preparados pelos métodos sintéticos padrão, técnicas de DNA recombinante ou quaisquer outros métodos de preparar peptídeos e proteínas de fusão.

Um uso considerado para as moléculas de peptídeo de Fc interno é como um agente terapêutico ou um profilático. Um peptídeo selecionado pode ter atividade comparável com — ou ainda maior do que — o ligando natural imitado pelo peptídeo. Além disso, certos agentes terapêuticos com base em ligando natural podem induzir anticorpos contra o ligando endógeno do próprio paciente. Ao contrário, a seqüência única do peptídeo ligado ao veículo evita este cilada por ter pouca ou tipicamente nenhuma identidade de seqüência com o ligando natural. Além disso, os pepticorpos internos de Fc podem ter vantagens na redobra e purificação em moléculas Fc terminalmente ligados em N ou C. Além disso ainda, pepticorpos internos de Fc podem ser mais estáveis tanto termodinamicamente, devido à estabilização de domínios quiméricos quanto quimicamente, devido à resistência aumentada à degradação proteolítica de amino- e carbóxi-peptidases. Os pepticorpos internos de Fc também podem exibir propriedades farmacocinéticas melhoradas.

Peptídeos.

Qualquer número de peptídeos pode ser usado em conjunção com a presente invenção. De interesse particular são peptídeos que imitam a atividade de EPO, TPO, hormônio do crescimento, G-CSF, GM-CSF, IL-lra, CTLA4, TRAIL, TNF, VEGF, MMP, miostatina, integrina, OPG, OPG-L, NGF, TALL-1, Ang-2 parceiro(s) de ligação, TGF-α e TGF-β. Os antagonistas de peptídeo são também de interesse, particularmente aqueles antagonísticos para a atividade de TNF, qualquer uma das interleucinas (IL-1, 2, 3, ...) e proteínas envolvidas na ativação de complemento (por exemplo,

C3b). Os peptídeos alvejadores também são de interesse, incluindo peptídeos autodirecionais de tumor, peptídeos que transportam membrana e outros. Todas destas classes de peptídeos podem ser descobertas pelos métodos descritos nas referências citadas neste relatório descritivo e outras referências.

A demonstração de fago, em particular, é útil na geração de peptídeos para o uso na presente invenção. Foi estabelecido que a seleção por afinidade a partir de bibliotecas de peptídeos aleatórios pode ser usada para identificar ligandos de peptídeo para qualquer sítio de qualquer produto de gene. Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025-30. A demonstração de fago é particularmente bem adaptada para identificar peptídeos que ligam a tais proteínas de interesse como receptores de superfície celular ou quaisquer proteínas tendo epítopos lineares. Wilson et al. (1998), Can. J. Microbiol. 44: 313-29; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Tais proteínas são extensivamente revisadas em Herz et al. (1997), J. Receptor & Signal Transduction Res. 17(5): 671-776, que é aqui incorporada por referência. Tais proteínas de interesse são preferidas para o uso nesta invenção.

Por via de exemplo e sem limitação, um grupo de peptídeos que se ligam aos receptores de citocina é fornecido. As citocinas foram recentemente classificadas de acordo com seu código de receptor. Ver Inglot (1997), Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45: 353-7, que é aqui incorporada por referência. Entre estes receptores estão os CKRs (família I na Tabela 3). A classificação de receptor aparece na Tabela 3.

Citocinas (ligandos)	Tipo de Receptor
família subfamília	família	subfamília
1. IL-2, IL-4, IL-7,		1. yCr compartilhado,
1L-9, IL-13, IL-15	I. Citocina R	IL-9R, IL-4R
I.Citocinas 2. IL-3, IL-5, GM-	(CKR)	2. GP 140 compartilhado PR
Hematopoiéticas
CSF		3. RP130 3.compartilado,
3.IL-6, IL-11,IL-		IL-6R, Leptina R

12, LIF, OSM, CNTF, Leptina (OB) 4. G-CSF, EPO, TPO, PRL, GH 5. IL-17, HVS-IL- 17	4. “cadeia única” R, GCSF-R, TPO-R, GH-R 5. outro R2
II. Ligandos de IL-IL-10, BCRF-1, 10 HSV-1L-10	II. IL-10 R
III. Interferons 1. IFN-al, α2, a4, m,t, SE-Ν-β3 2. ΙΕΝ-γ	III. Interferon R l.IFNAR 2. IFNGR
IV. IL-1 e ligandos l.IL-la., IL-Ιβ, IL- equivalentes a IL- IRa 1 2. IL-18, IL-18BP	1. IL-1R, IL-IRAcP IV. IL-1R 2. IL-18R, IL-18RAcP
V. família TNF 1. TNF-a, TNF-β (LT), FASL, CD40 L, CD3OL, CD27 L, OX4OL, OPGL, TRAIL, APRIL, AGP-3, BLys, TL5, Ntn-2, KAY, Neutrocina-a	3. NGF/TNF R4 TNF-RI, AGP-3R, DR4, DR5, 0X40, OPG, TACT, CD40, FAS, ODR
VI. Quimiocinas 1. α quimiocinas:	4. Quimicina R 1. CXCR

IL-17R - pertence à família CKR mas não é designado para as 4 subfamílias indicadas.

² Outros subtipos de IFN tipo I permanecem não designados. Citocinas hematopoiéticas, ligandos de IL-10 e interferons não possuem quinases de proteína intrínsecas funcionais. As moléculas de sinalização para as citocinas são JAK’s, STATs e moléculas não receptoras relacionadas. IL-14, IL-16 e IL-18 foram clonadas mas de acordo com o código de receptor elas permanecem não designadas.

³ Receptores de TNF de uso múltiplo, moléculas intracelulares distintas para a transdução de sinal incluindo “domínio morto” de FAS R e 55 kDa TNF-DR que participa em seus efeitos citotóxicos. NGF/TNF R podem ligar-se tanto a NGF quanto a fatores relacionados assim como ligandos de TNF. Os receptores de quimiocina são sete receptores de domínio de transmembrana (7TM, serpentina). Estes são ligados à proteína G.

IL-8, GRO α, β, γ,	2. CCR
SE-10, PF-4, SDF-1	3. CR
2. β quimiocinas:	4. DARC5
ΜΕΡΙα,ΜΙΡΙβ,

MCP-1,2,3,4, RANTES, eotaxina 3. γ quimiocinas: linfotactina
VII. Fatores dej M crescimento Pdgf.aa, AB, BB, KDR, FLT-1, FLT-3L, VEGF, SSVPDGF, HGF, SF 1.2 FGFa, FGFp 1.3 EGF, TGF-a, W-F19 (equivalente a EGF) 1.4 IGF-I, 1GF-II, Insulina 1.5 NGF, BDNF, NT-3, NT-46 2. TGF-β 1,β2, β3	VII. RKF 1. subfamíliaTK 1.1 IgTKDIR, VEGF-RI, VEGF-RII 1.2IgTKIVR 1.3 TK-1 rico em Cisteína 1.4 TK-H rico em cisteína, IGF-R1 1.5 Nó de cisteína TKV 2. Subfamília da serinatreonina quinase (STKS)7

Outras proteínas de interesse como alvos para a geração de peptídeo na presente invenção incluem os seguintes:

ανβ3 α,νβΐ

Ang-2

B7 ⁴ O antígeno de grupo sangüíneo Duffy (DARC) é um receptor de eritrócito que pode ligar diversas quimiocinas diferentes. EL-1 R pertence à superfamília da imunoglobulina mas os seus eventos de transdução de sinal característicos permanecem incertos.

⁵ As citocinas neurotrópicas podem associar-se também com receptores de NGF/TNF.

⁶ STKS pode abranger muitos outros fatores relacionados com TGF-β que permanecem não designados. As quinases de proteína são partes intrínsecas do domínio intracelular da família quinase de receptor (RKF). As enzimas participam na transmissão de sinais por intermédio dos receptores.

B7RP1

CRP1

Calcitonina

CD28

CETP cMet

Fator de complemento B

C4b

CTLA4

Glucagon

Receptor de Glucagon

LIPG

MPL variantes de junção de moléculas preferencialmente expressadas em célula de tumor; por exemplo, CD44, variantes não glicosiladas CD30 de mucina e glicoproteínas de superfície Y de Lewis

CD 19, CD20, CD33, CD45 antígeno de membrana específico da próstata e antígeno de célula específica da próstata metaloproteinases de matriz (MMPs), tanto secretadas quanto ligadas a membrana (por exemplo, MMP-9)

Catepsinas Receptor TIE-2 heparanase

Ativador de plasminogênio da uroquinase (UPA), receptor

UPA

Hormônio da paratireóide (PTH), proteína relacionada com o hormônio da paratireóide (PTHrP), PTH-RI, PTH-RII

Her2

Her3

Insulina

Miostatina

TALL-1

Fator de crescimento de nervo

Integrinas e receptores

Selectinas e seus receptores moléculas de adesão celular e seus receptores

Os peptídeos exemplares aparecem nas Tabelas 4 até 38 abaixo. Estes peptídeos podem ser preparados por quaisquer métodos divulgados na técnica, muitos dos quais são aqui debatidos. Na maioria das tabelas que seguem, as abreviações de aminoácido de letra única são usadas. Ο “X” nestas seqüências (e por todo este relatório descritivo, a menos que de outro modo especificado em um caso particular) significa que qualquer um dos 20 resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente podem estar presentes. Qualquer um destes peptídeos podem ser ligados em tandem (isto é, seqüencialmente), com ou sem ligadores e uns poucos exemplos ligados em tandem são fornecidos na tabela. Os ligadores são listados como “A” e podem ser qualquer um dos ligadores aqui descritos. As repetições e ligadores em tandem são mostrados separadamente por traços para clareza. Qualquer peptídeo contendo um resíduo de cisteinila pode ser reticulado com um outro peptídeo contendo Cys, cada um ou ambos dos quais podem ser ligados a um veículo. Uns poucos exemplos reticulados são fornecidos na tabela. Qualquer peptídeo tendo mais do que um resíduo Cys também pode formar uma ligação de dissulfeto intrapeptídico; ver, por exemplo, peptídeos Mimético de EPO na Tabela 5. Uns poucos exemplos de peptídeos ligados a dissulfeto intrapeptídicos são especificados na tabela. Qualquer um destes peptídeos podem ser derivatizados como aqui descritos e uns poucos exemplos derivatizados são fornecidos na tabela. Os peptídeos derivatizados nas tabelas são exemplares ao invés de limitantes, como os peptídeos não derivatizados associados também podem ser utilizados nesta invenção. Para derivados em que a carboxila terminal pode ser encapuzada com um grupo amino, o grupo amino encapuzado é mostrado como -NH₂. Para os derivados em que resíduos de aminoácido são substituídos por porções outras que não de resíduos de aminoácido, as substituições são denotadas por σ, que significa qualquer uma das porções descritas em Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9 e Cuthbertson et al. (1997), J. Med. Chem. 40: 2876-82, que são incorporadas por referência. O substituinte J e os substituintes Z (Z₅, Z₆, ...Z₄₀) são como definidos nas Pat. U.S. N~ 5.608.035, 5.786.331 e 5.880.096, que são incorporadas por referência. Para as seqüências Miméticas de EPO (Tabela 5), os substituintes X₂ até Xn e o número inteiro “n” são como definidos na WO 96/40772, que é incorporada por referência. Também para as seqüências Miméticas de EPO, os substituintes X_na, Xi_a, X_2a, X3a, X_4a, Xs_a e X_ca seguem as definições de X_n, X_b X₂, X₃, X₄, X5 e X_c, respectivamente, da WO 99/47151, que também é incorporada por referência. Os substituintes “Ψ”, “Θ” e “+” são como definidos em Sparks et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 1540-4, que é aqui incorporada por referência. X₄, X₅, Xó e X₇ são como definidos na Pat. U.S. N^fi 5.773.569, que é aqui incorporada por referência, exceto que: para peptídeos de ligação de integrina, X_b X₂, X₃, X₄, X₅, Xó, X7 e Xs são como definidos nos Pedidos Internacionais WO 95/14714, publicado em 1 de junho de 1995 e WO 97/08203, publicado em 6 de março de 1997, que também são incorporadas por referência; e para peptídeos miméticos VIP, X_b Xf, Xf’, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ e Z e os números inteiros m e n são como definidos na WO 97/40070, publicado em 30 de outubro de 1997, que é também incorporada por referência. Xaa e Yaa abaixo são como definidos na WO 98/09985, publicado em 12 de março de 1998, que é incorporada por referência. AA_b AA₂, AB_b AB₂ e AC são como definidos no Pedido Internacional WO 98/53842, publicado em 3 de dezembro de 1998, que é incorporada por referência. X¹, X², X³ e X⁴ na Tabela 17 apenas são como definidos no pedido Europeu EP 0 911 393, publicado em 28 de abril de 1999. Os resíduos que aparecem em negrito são D-aminoácidos. Todos os peptídeos são ligados através de ligações de peptídeo a menos que de outro modo mencionado. As abreviações são listadas no final deste relatório descritivo. Na coluna “SEQ ID NO.”, “NR” significa que nenhuma listagem de seqüência é requerida para a dada seqüência.

Tabela 4 - Seqüências de peptídeo antagonistas de IL-1

S eqüàicia/Estnitura	SEQ ID NO?
Z, iZiZíQZíYZôZíZjo	3
XXQZjYZftXX	4
ZiXQZjYZÚtX	5
ZAOZjY^ZsZ,*	6
ΖπΖ,ΖβΟΖ,Υ^Ζ,ο	7
ZfzZÉíZMZ.sZísZnZ^^Z^j.Z^ZHZiZíQZjYZíZeZusL	8
Z^jNZ^Zjw^jZjisZíTZMZaçZjjZtn	9
TANVSSFEWTPYYWQFYALPL	10
SWTDYGYWQPYAtPiSGL	1!
ETPFT WEESNA Y Υ WQP Y ALPL	12
entyspnwadsmywqpyalpl	13
svgedhwwtseywqpyalpl	14
DGYÜRWRQSGER.YWQPYALPL	15
FEWTPGYWQPY	16
FEWTPGYWQHY	17
FEWTPGWYQJY	18
AcFEWlTGWYQJY	19
FEWTPGWpYQJY	20
FAWTPGYWQJY	21
feWapgywqjy	22
FEWVFGYWQJY	23
FEWTPGYWQJY	24
AcFEWTPGYWQJY	25

FEWTPaWYQJY	26
FEWTPSarWYQJY	27
FEWTPGYYQPY	28
FEWTPGWWQPY	29
FEWTPNYWQPY	30
FEWTPvYWQÍY	31
FEWTPecGYWQjY	32
FEWTPAibYWQJY	33
FEWTSarGYWQJY	34
FEWTPGYWQFY	35
FEWTPGYWQHY	36
FEWTPGWYQJY	37
AcFÉWTPGWYQJY	38
FEWTPGW-pY-QJY	39
fãwtpgywqjy	40
FEWAPGYWQJY	41
FEWVPGYWQJY	42
FEWTPGYWQJY	43
AcFEWTPGYWQJY	44
FEWTPAWYQJY	45
FEWTPSãrWYQJY	46
FEWTPGYYQPY	47
FEWTPGWWQPY	48
FEWTPNYWQPY	49
FEWTPVYWQJY	50
FEWTPecGYWQjY	51
FEWTPAibYWQJY	52
FEWTSarGYWQJY	53
FEWTPGYWQPYALPL	54
INapEWTPGYYQJY	55
YEWTPGYYQJY	56
FÊWVPGYYQJY	57
FEWTPSYYQJY	58
FEWTPNYYQJY	59
TKPR	60
RKSSK	61
RKQJDK	62
NRKQDK	63

RKQDKR	64
ENRKQDKRF	65
VTKFYF	66
VTKFY	67
VTDFY	68
SHLYWQPYSVQ	69
TLVYWQPYSLQT	70
RGDYWQPYSVQS	71
VHVYWQPYSVQT	72
RLVYWQPYSVQT	73
SRVWFQPYSLQS	74
NMVYWQPYSIQT	75
svvfwqpysvqt	76
TFVYWQPYALPL	77
TLVYWQPYSIQR	78
RLVYWQPYSVQR	79
SPVFWQPYSIQI	80
WIEWWQPYSVQS	81
SUYWQPYSLQM	82
trlywqpysvqr	83
RCDYWQPYSVQT	84
MRVFWQPYSVQN	85
KÍVYWQPYSVQT	86
RHLYWQPYSVQR	87
ALVWWQPYSEQI	88
SRVWFQPYSLQS	89
WEQPYÃLPLÉ	90
QLVWWQPYSVQR	91
DLRYWQPYSVQV	92
ELVWWQPYSLQL	93
DLVWWQPYSVQW	94
NGNYWQPYSFQV	95
ELVYWQPYSIQR	96
ELMYWQPYSVQE	97
NLLYWQPYSMQD	98
àYEWYQPYSVQR	99
SRVWYQPYSVQR	100
LSEQYQPYSVQR	101

GGGWWQFYSVQR	102
VGRWYQPYSVQR	103
VHVYWQPYSVQR	104
QARWYQPYSVQR	105
VHVYWQPYSVQT	106
RSVYWQPYSVQR	107
TRVWFQPYSVQR	108
GR1WFQPYSVQR	109
GRVWFQPYSVQR	110
ARTWYQPYSVQR	111
ARVWWQPYSVQM	112
RLMFYQPYSVQR	113
êSMWYQPYSVQR	114
H FG WWQPYS VHM	115
ARJFWWQPYSVQR	116
RLVYWQ PYAPIY	117
RLVYWQPYSYQT	118
RLVYWQ PYSLPl	Í19
RLVYWQ PYSVQA	120
srvwyqpyakgl	121
SRVWYQPYAQGL	122
SRVWYQPYAMPL	123
SRVWYQ PYSVQA	124
SRVWYQPYSLGL	125
SR VWYQ PYAREL	126
SRVWYQ PYSRQP	127
SRVWYQ PYFVQP	128
EYEWYQ PYALPL	129
IPEYWQ PYALPL	130
SR1W WQ PYALPL	131
DPLFWQ PYALPL	132
SRQWVQ PYALPL	133
1RSWWQ PYALPL	134
RGYWQ PYALPL	135
RJLLWVQ PYALPL	136
EYRWFQ PYALPL	137
DAYWVQ PYALPL	138
WSGYFQ PYALPL	139

NIEFWQ PYALPL	140
TRDWVQ PYALPL	141
DSSWYQ PYALPL	142
ignwyqpyãlpl	143
NLK.WDQ PYALPL	144
l.PEFWQ PYALPL	145
DSYWWQ PYALPL	146
RSQYYQ PYALPL	147
ARJFWLQ PYALPL	148
NSYFWQ PYALPL	149
RFMYWQPYSVQR	150
AHLFWQPYSVQR	151
WWQPYALPL	152
YYQPYALPL	153
YFQPYALGL	154
YWYQPYALPL	155
RWWQPYATPL	156
GWYQPYALGF	157
YWYQPYALGL	158
IWYQPYAMPL	159
SNMQPYQRLS	160
TFVYWQPY ÁVGLPAAETACN	161
TFVYWQPY SVQMTITGKVTM	162
TFVYWQPY SSHXXVPXGFPL	163
TFVYWQPY YGNPQWAlHVRH	164
TFVYWQPY VLLELPEGAVRA	16S
TFVYWQPY VDYVWPIPÍAQV	166
GWYQPYVDGWR	167
RWEQPYVKDGWS	168
EWYQPYALGWAR	169
GWWQPYARGL	170
LFEQFYAKALGL	171
GWEQPYARGLAG	172
awvqpyatpldè	173
MWYQPYSSQPAE	174
GWTQPYSQQGEV	175
DWFQPYSIQSDE	176
PWÍQPYARGFG	177

Ί9

RPLYWQPYSVQV	178
TLIYWQPYSVQl	179
RFDYWQPYSDQT	ISO
WHQFVQPYALPL	181
EWÜS VYWQPYSVQ TLLR	182
WEQN VYWQPYSVQ SFAD	183
SDV VYWQPYSVQ SLEM	184
YYDG VYWQPYSVQ VMPA	185
SDIWYQ FY ALPL	186
QRJWWQ PYALFL	187
SRJWWQPYALPL	188
RSLYWQ PYÀÍJPL	189
TÍIWEQ PYALPL	190
WÉTWYQ PYALPL	191
SYDWEQ PYALPL	192
SRIWCQ PYALPL	193
ÊIMFWQ PYALPL	194
DYVWQQ PYALPL	195
MOLLVQ WYQPYALPL	196
GSKVIL WYQPYALPL	197
RQGANI WYQPYALPL	198
GGGDEP WYQPYALPL	199
SQLERT WYQPYALPL	200
ETWVRE WYQPYALPL	201
KKGSTQ WYQPYALPL	202
LQARMN WYQPYAU»L	203
EPRSQK WYQPYALPL	204
VKQKWR WYQPYALPL	205
LRRHDV WYQPYALPL	206
RSTÀS1 WYQPYALPL	207
ESKEPQ WYQPYALPL	208
EGLTMK WYQPYALPL	209
EGSRJEG WYQPYALPL	210
V1EWWQ PYALPL	211
VWYWEQ PYALPL	212
ASEWWQ PYALPL	213
FYEWWQ PYALPL	214
EGWWVQ PYALPL	215

wgewlq pyalpl	216
DYVWEQ PYALPL	217
AHTWWQ PYALPL	218
FlEWfQ PYALPL	219
WLAWEQ PYALPL	220
VMEWWQ PYALPL	221
ERMWQ PYALPL	222
NXXWXX PYALPL	223
WGNWYQ PYALPL	224
TLYWEQ PYALPL	225
VWRWEQ PYALPL	226
LLWTQ PYALPL	227
SRÍWXX PYALPL	228
SOI WYQ PYALPL	229
WGYYXX PYALPL	230
TSGWYQ PYALPL	231
VHPYXX PYALPL	232
EHSYFQ PYALPL	233
XXIWYQ PYALPL	234
AQLHSQ PYALPL	235
WANWFQ PYALPL	236
SRLYSQ PYALPL	237
GVTFSQ PYÀLPL	238
S1VWSQ PYALPL	239
SRDLVQ PYALPL	240
HWGH VYWQPYSVQ DDLG	241
SWHS VYWQPYSVQ SVPE	242
WRT>S VYWQPYSVQ PESA	243
TWDA VYWQPYSVQ KWLD	244
TPPW VYWQPYSVQ SLDP	245
YWSS VYWQPYSVQ SVHS	246
YWYQPYALGL	247
YWYQFY ALPL	248
EWIQPY ATGL	249
NWÉ QPY AKPL	250
AF Y QPY ALPL	251
FLYQPY ALPL	252
VCK QPY LEWÇ	253

ETFFrWEESNAYYWQPYALPL	254
QGWLTAVQDSVDMYWQPYALPL	255
FSEAGYTWPENTYWQPYALPL	256
TESPGGLDWAKIYWQPYALPL	257
DGYDRWRQSGERYWQPYALPL	258
TÂNVSSFEWTPGYWQPYALPL	259
SVGEDHNFWTSE YWQPYÂLPL	260
MNDQTSÊVSTFP YWQPYÂLPL	261
SWSEAFEQPRNL YWQPYALPL	262
QYAEPSALNDWG YWQPYÂLPL	263
NGDW ATADWSNY YWQPYÂLPL	264
THDEHt YWQPYÂLPL	265
MLEKTYTTWTPG YWQPYÂLPL	266
WSDPLTRDADL YWQPYÂLPL	267
SDAFTTQDSQAM YWQPYÂLPL	268
GDDAAWRTDSLf YWQPYÂLPL	269
ÀÍIRQLYKWSEM YWQPYÂLPL	270
ENTYSPNWADSM YWQPYÂLPL	271
MNDQTSÊVSTFP YWQPYÂLPL	272
SVGEDHNFWTSE YWQPYÂLPL	273
QTPFTWEESNAY YWQPYÂLPL	274
ENPFTWQESNAY YWQPYÂLPL	275
VTPFTWEDSNVF YWQPYÂLPL	276
QIPFTWEQSNAY YWQPYÂLPL	277
QAPLTWQÈSAAY YWQPYÂLPL	278
EPTFTWEESKAT YWQPYÂLPL	279
rrrLTWEESNAY ywqpyalpl	280
ESPLTWEESSAL YWQPYALPL	281
ETPLTWEESNAY YWQPYALPL	282
EATFTWAESNAY YWQPYALPL	283
EALFTWKESTAY YWQPYALPL	284
STP-TWEESNAY YWQPYÂLPL	285
ETPFTWEESNAY YWQPYALPL	286
KAPFTWEÉSQAY YWQPYALPL	287
STSFTWEESNAY YWQPYALPL	288
DSTFTWEESNAY YWQPYALPL	289
YIPFTWEESNAY YWQPYALPL	290
QTAFTWEESNAY YWQPYALPL	291

ÉTLFTWE4BSNAT YWQPYALPL	292
VSSFTWÉESNAY YWQPYALPL	293
QPYÀLPL	294
Py-l-NapPYQJ YaLPL	295
TANVSSFEWTPG YWQPYALPL	296
FEWWGYWQPYALPL	297
FEWTPGYWQJYALPL	298
FEWTPGYYQJYALPL	299
etpftweesnayywqpyalpl	360
FTWEESNAYYWQJYALPL	301
ajdvl ywqpya pvtlwv	302
GDVÃÉ YWQPYA LPLTSL	303
SWTDYG YWQPYA LPISGL	304
FEWWG YWQPYALPL	305
FEWTPGYWQJYALPL	306
FÉWWGWYQPYaLPL	307
FEWTPGWYQJYALPL	308
FEWTTGYYQPYALPL	309
FEWTPGYYQJYALPL	310
TANVSSFEWTPGYWQPYALPL	311
SWTDYGYWQPYALP1SGL	312
EWFTWÉÉSNAYYWQPYALPL	313
ENTYSPNWADSMYWQPYALPL	314
SVGEDHNFWTSEYWQPYALPL	315
DGYDRWRQSGERYWQPYALPL	316
FE WTFG YWQPY ALPL	317
fewtpgywqpy	318
FEWTPGYWQJY	319
EWTPGYWQPY	320
FEWTPGWYQJY	321
ÀÉWTPGYWQJY	322
FAWTPGYWQJY	323
FEATPGYWQJY	324
FEWAPGYWQJY	325
FEWTÃGYWQJY	326
FEWTPÃYWQJY	327
FEWTPGAWQJY	328
fewtpgyaqjy	329

FEWTPGYWQJA	330
FEWTGGYWQJY	331
fewtpgywqjy	332
FEWTJGYWQJY	333
FEWTPecGYWQFY	334
FEWTPAibYWQJY	335
PEWTPSarWYQJY	336
FEWTSarGYWQJY	337
FÈWTPNYWQJY	338
FEWTPVYWQJY	339
FEWTVPYWQJY	340
AcFEWTPGWYQJY	341
AcFFWTPGYWQJY	342
INap-EWTPGYYQJY	343
YEWTPGYYQJY	344
FEWVPGYYQJY	345
FEWTPGYYQJY	346
FEWTPsYYQJY	347
FEWTPnYYQIY	348
SHLY-Nap-QPYSVQ.M	349
TLVY-Nap-QPYSLQT	350
RGDY-Nap-QPYSVQS	351
NMVY-Nap-QPYStQT	352
VYWQPYSVQ	353
VY-Nap-QPYSVQ	354
TFVYWQJYAEPL	355
FEWTPGYYQJ-Bpa	356
XaaFEWTTGYYQJ-Bpa	357
FÉWTPGY-Bpa-QJY	358
AcFEWTPGY-Bpa-QJY	359
FÉWTPG-Bpa-YQJY	360
AcFEWTPG-Bpa-YQJY	361
AcFE-Bpa-TPGYYQJY	362
AcFE-Bpa-TPGYYQJY	363
Bpa-EWTPGYYQJY	364
AcBpa-EWTPGYYQJY	365
VYWQPYSVQ	366
RLVYWQPYSVQR	367

RLVY-Nap~QPYSVQR	368
RLDYWQPYSVQR	369
rlvwfqpysvqr	370
RLVYWQPYS1QR	371
DNSSWYDSFLL	372
DNTAWYESFLA	373
DNTAWYENFLL	374
PARÈ DNTAWYDSFL1 WC	375
TSEY DNTTWYEKFLA SQ	376
SQIP DNTAWYQSFLL HG	377
SPF1 DNTÃWYêNFIXTY	378
EQIY DNTAWVDHFLL SY	379
TFF1 DNTAWYENFLL TY	380
TYTY DNTA WYERFLM SY	381
FMTQ DNTAWYENFLL SY	382
Tl DNTÀWYANLVQ TYPQ	383
Tl DNTAWYERFLA QYPD	384
H1 DNTAWYENFLL TYTP	385
SQ DNTÀWYÉNFLL syka	386
Qí DNTAWYERFLL QYN A	387
NQ DNTAWYESFÍA QYNT	388
Tl DNTAWYENFLL NHNL	389
HY DNTAWYÊRFLQ QGWH	390
ÉTPFTWEESNAYYWQPYALPL	391
Y1PFTWEESNÀYYWQPYALPL	392
DGYDRWRQSGERYWQPYALPL	393
pY-ÍNap-pY-QJYALPL	394
TANVSSFEWTPGYWQPYALPL	395
FEWTPGYWQJYALPL	396
FEWTPGYWQPYALPLSD	397
FEWTPGYYQJYALPL	398
FEWTPGYWQíY	399
AcFEWTPGYWQJY	400
AcFEWTPGWYQJY	401
AcFEWTPGYYQJY	402
AcFEWTPaYWQJY	403
AcFEWTPaWYQJY	404
AcPÉWTPaYYQJY	405

EEWTPGYYQJYALPL	40$
FEWTFGYWQJYALPL	407
FEWTPGWYQJYALPL	408
TANVSSFEWTPGYWQPYALPL	409
AcFEWTPGYWQJY	410
AcFEWJPGWYQJ Y	411
AcFEWTPGYYQJY	412
AcPÊWTPÀYWQJY	413
AcFEWTPAWYQJY	414
AcFEWTPAYYQJY	415

Tabela 5 - Seqüências de peptídeo miméticas de EPO

S eqüêneia/Estrutura	SEQ ID NO:
yxcxxgpxtwxcxp	416
YXCXXGPXTWXCXP-YXCXXGPXTWXCXP	417
YXCXXGPXTWXCXP-A-YXCXXGPXTWXCXP	418
yxcxxgpxtwxcxp-a- , . K \ (ε- amina) > ,PÁ yxcxxgpxtwxcxp-a/ (a-anima)	4Í9
ggtyschfgpltwvckpqgg	420
ggdyhcrmgpltwvckplgg	421
ggvyacrmgpitwvcsplgg	422
VGNYMCHFGPJTWVCRPGGG	423
gglylcrfgpvtwdcgykgg	424
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG- GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	425
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG -ΛGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	426
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK	427
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK- GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK	428
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-Λ- GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK	429

GGTYSCHFGPLTWVCKPGGGS3. , - % anima) z* ZPA x ggtyschfgpltwvckpqggss (a-anima)	430
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(A -biotina)	431
CXiXsGPXíTWXjC	432
GGTYSCHGPLrWVCKPQGG	433
VGNYMAUMGPITWVCRPGG	434
ggphhvyacrmgpltwic	435
GGTYSCHFGPLTWVCKPQ	436
GGLYACHMGFMTWVCQPLB.G	43?
TIAQYICYMGPETWECRPSPKA	438
YSCHFGPLTWVCK	439
YCHFGPLTWVC	440
X^GXjGPXeTWXíXg	441
YXjXpGXsGPX^TWXíXa	442
X, YX2X,X4X5G PX6TWX7X,X^Í Í&X,,	443
X, YXjCX4X3GPX6TWX,CXs>X!0X> t	444
GGLYLCKFGPVTWDCGYKGG	445
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	446
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG	447
VGNYMCHFGPITWVCRPGGG	448
GGVYACRMGPITWVCSPLGG	449
VGMYMAHMGPITWVCRPGG	450
GGTYSCHFGPLTWVCKPQ	451
GGLYACHMGPMTWVCQPLRG	452
tiaqyicymgpetwecrpspka	453
YSCHFGPLTWVCK	454
YCHFGPLTWVC	455
SCHFGPLTWVCK	456
(AX2)nX3X^X5GPX&TWX,X8	45?
X„CX,X3GWVGX,CX.XsWXc	458

Tabela 6 - Seqüências de peptídeo miméticas de TPO

Seqüência/Estrutura	SEQ
	ID NO:
IEGPTLRQWLAARA	459

íEGPTLRQWLAAKA	460
iegptlrjewlaara	461
lEGPTI.RQWLAARA-A-lEGPTLRQWLAARA	462
IEGPTLRQWLAAKA-A-IEGPTLRQWLaAKA	463
lEGFrLRQCLAARA- Λ-IEGPTLRQCLAARA i ............ i	464
JEGPTLRQWLAARA-A-K(BrAcTA-EEGPTLRQWLAARA	465
IEGPTLRQWLAARA-A-K(PEG)-A-[EGPTLRQWLAARA	466
IEGPTLRQCLAARA-A-JEGPTLRQWLAARA 1 1EGPTLRQCLAARA-A-IEGPTLRQWLAARA	467
iegptlrqwlaara-a-iegptlrqclaara 1 lEGPTLRQWLAARA-A-IEGPTLRQCLAARA	468
VRDQ1XXXL	469
TLRÉWL	470
GRVRDQVAGW	471
GRVKDQ1AQL	472
GVRDQVSWAL	473
ESVREQVMKY	474
SVRSQISASL	475
GVRETVYRHM	476
GVREVtVMHML	477
GRVRDQlWAAL	478
AGVRDQILIWL	479
grvrdqimlsl	480
GRVRDQ1(X)jL	481
CTLRQWLQGC	482
CTLQEFLEGC	483
CTRTEWLHGC	484
CTLREWLHGGFC	485
CTLREWVFAGLC	486
CTLRQWLtLLGMC	487
CTLAEFLASGVEQC	488
CSLQEELSHGGYVC	489
CTLREFLDPTTAVC	490
CTLKEWLVSHEVWC	491
GTLRÉWL(Xh*C	492

REGPTLRQWM	493
EGPTLRQWLA	494
ERGPFWAKÂC	495
REGPRCVMWM	496
CGTEGPTLSTWLDC	497
CEQDGPTLLEWLKC	498
CELVGPSLMSWLTC	499
CLTGPFVTQWLYEC	500
CRAGPTLLEWLTLC	SOI
CADGPTLREWISFC	502
C(X)i.jEGPTLREWL(X)i^C	503
GGCTLREWLHGGFCGG	504
GGCADGPTLREW1SFCGG	505
GNADGPTLRQWUSGRRPKN	506
LAIEGPTLRQWLHCNG RDT	507
HGRVGPTLREWKTQVATKK	508
TIKGPTLRQWLKSREHTS	509
ISDGPTLKLWLSVTRGAS	510
SIEGPTLREWLTSRTPHS	511

Tabela 7 - Seqüências de peptídeo miméticas de G-CSF

S eqüèneiaZEstnitui a	SEQ ID NO:
EEDCK	512
EEDCK	513
1 EEDCK
EEDoK	514
EEDoK	515
1 EEDoK
pGluEDoK	516
pGluEDoK 1 pGluEDoK	51?
PicSDoK	518
PicSDoK I	519

PicSDoK
EEDCK-Λ-EEDCK	520
EEDXK-A-EEDXK	521

Tabela 8 - Seqüências de peptídeo antagonistas de TNF

Sequência/Estrutura	SEQ ID NO;
YCFrASENHCY	522
YCFTNSENHCY	523
YCFTRSÉNHCY	524
FCÀSÊNHCY	525 ·
YCASENHCY	526
'FCNSK4HCY	527
FCNSENRCY	528
FCNSVENRCY	529
YCSQSVSNDCF	530
FCVSNDRCY	531
YCRKELGQVCY	532
YCKÉPGQCY	533
YCRKEMGCY	534
FCRKEMGCY	535
YCWSQNLCY	536
YCELSQYLCY	537
YCWSQNYCY	538
YCWSQYLCY	539
DFLPHYKNTSLGHRP	540
AA|*AB| \ AC t AAj-ABi	NR

Tabela 9 - Seqüências de peptídeo de ligação de integrina

Sequência Artificial	SEQ ID NO;
RXjETXsWXj	541
RXjSTXjWX,	542

RGDGX	543
CRGDGXC	544
CXiXíRI-DXjX^C	545
CARRLDAPC	546
CÉSRLDSPC	547
X.XjXjRGDX^XpQ	548
CXjCRGDCXíC	549
CDCRGDCFC	550
CDCRGDCLC	551
CLCRGDCIC	552
Χ,Χ,ΏϋΧ,Χ,ΧγΧ,	553
χ,χ,χ,βοχ,χ,χρί,χ,	554
CWDDGWLC	555
CWDDLWWLC	556
CWDDGLMC	557
CWDDGWMC	558
CSWDDGWLC	559
CPDDLWWLC	560
NGR	NR
GSL	NR
RGD	NR
CGRECPRLCQSSC	561
CNGRCVSGGAGRC	562
CLSGSLSC	563
RGD	NR
NGR	NR
GSL	NR
NGRAH.A	564
CNGRC	565
CDCRGDCFC	566
CGSLVRC	567
DLXXL	568
RTDLDSLRTYTL	569
RTDLDSLRTY	570
RTDLDSLRT	571
RTDLDSLR	572
GDLDLLXJLRLTL	573
GDLHSLRQLLSR	574

RDDLHMLRLQLW	575
SSDLHALKXRYG	576
RGDLKQLSÉLTW	577
RGDLAALSAPPV	578

Tabela 10 - Seqüências de peptídeo de antagonista de selectina

Seqüêiicia/Estrutura	SEQ ID NO:
DITWDQLWDLMK	579
D1TWDELWKIMN	580
DYTWFELWDMMQ	581
QITWAQLWNMMK	582
DMTWHDLWTLMS	583
dyswhdlwemms	584
EITWDQLWEVMN	585
hvsweqlwdiimS	586
HlTWbQLWRIMT	587
RNMSWLELWEHMK	585
aewtwdqlwhvmnpaesq	589
HRAEWLALWEQMSP	590
KKEDWLALWRIMSV	591
ITWDQLWDLMK	592
DITWDQLWDLMK	593
DITWDQLWDLMK	594
DITWDQLWDLMK	595
CQNRYTDLVA1QNKNE	596
ALNWADNEPNNKRNNED	597
RKNNKTWTWVGTKKALTNE	598
KKALTNEAENWAD	599
CQXRYTDLVAIQNKXE	600
RKXNXXWTWVGTXKXLTEE	601
aenwadgepnnkxnxed	602
CXXXYTXLVA3QNKXE	603
RKXXXXWXWVGTXKXLTXE	604
AXNWXXXÊPNNXXXED	605
XKXKTXEAXNWXX	606

Tabela 11 - Seqüências de peptídeo de antipatogênicas

S eqüência/Estnitura	SEQ ID NO;
GFFALtPKJISSPLFKTLLSAVGSAl.SSSGGQQ	6Õ7
GFFAUPKnSSPLFKTLLSAVGSALSSSGGQE	608
gffalipkjissplfktllsav	609
GFFALIPKJ1SSPLFKTLLSAV	610
KGFFALIPK1ISSPLFKTLLSAV	611
KKGFFALlPKilSSPLFKTLLSAV	612
KKGFFALlPKilSSPLFKTLLSAV	613
GFFAITPKÜS	614
G1GAVLKVLTTGLPAL1SWIKRKRQQ	615
GlGAVLKVLTTGLPALlSWJKRJKRQQ	616
GJGAVLXVLTTGLPaLISWIKKKRQQ	617
GIGAVLKVLTTGLFALISWJKR	618
AVLKVLTTGLPAUSWIKR	619
KLLLLLKLLLLK	620
KLLLKLLLKLLK	621
KLLLKLKLKLLK	622
KKLLKLKLKLKK	623
KLLLKLLLKLLK	624
KLLLKLKLKLLK	625
kllllk	626
KLLLKLLK	627
KLLLKLKLKLLK	628
KLLLKLKLKLLK	629
KLLLKLKLKLLK	630
KAAAKAAAKAAK	631
KVVVKVVVKWK	632
KVWKVKVKVVK	633
KVVVKVKVKVK	634
KVWKVKVKVVK	635
KLILKL	636
kvlhll	637
LKLRLL	638
KPLHLL	639
KLILKLVR	640
KVFHLLHL	641
HKFRJLKL	642

KJPFHILHL	643
κ,ϊίικίίακιικ	644
κϊϊικϊκπαικ	645
ΚΙΙΙΚΙΚΪΚΙΙΚ	646
KJPÍKJKIKIPK	647
K1PIKIKIKIVK	648
RnrRJRJRnR	649
RIIIRIRIRÍIR	650
RIIIRIRIRÍIR	651
RJV1RJRXRUR	652
RI1VRJRLR11R	653
R1GIRLRVRHR	654
KÍVIRJRÍRLIR	655
R1AVKWRLRFIK	656
KIGWKLRVRI1R	657
KKIGWLHRVRR	658
R1VIRJRJRLIRIR	659
RIIVRÍRLRIIRVR	660
RÍGÍRLRVRURRV	661
kivirírarjurjrir	662
RllVKllUjUtKKIRL	663
KJGIKARVRlíRVkíl	664
RJIVHIRLRltHHIRL	665
HÍGIKAHVRIIRVHII	666
R1YVKIHLRYIKKIRL	667
KlGHKARVHHRYKH	668
RIYVKPHPRYIKKIRL	669
KJPGHKARPHMRYKII	670
KJVÍRIRIRURIRIRKJV	671
RIIVKIRLRllKKIRLtKK	672
kigwklrvrhrvkjgrlr	673
KIVIRIRÍRLIROURKIVKVKRIR	674
Rf AVKIRLRIIKKÍRLIKKIRKRVIK	675
KAGWKLRVRJIRVKIGRLRKIGWKKRVR1K	676
RIYVKPHPRYIKKIRL	677
KPGHKARPHUIRYKH	678
KTVIRIRIRLJRIRIRKIV	679
RIIVKIRLRHKKIRUKK	680

R3YVSK1S1YIKK1RL	681
KIVIFTR1RJLTSIR.IRSIV	682
KPJHKARPTI1RYKM1	683
cyc1ícCKGFFAUPKHSSPI.FKTI.LSAVC	684
CKKGFFALIPKIISSPLFKTLLSAVC	685
CKKKGFFAL5PKI1SSPLFKTLLSAVC	686
CyclicCRIVÍRIRIRLtRIRC	687
CyclicCKPGHKARPHIlRYKIIC	688
CyclicCRFAVKIRLRIIKKJRLIKKIRKRVÍRC	689
KLLLKLLL KLLKC	690
KLLLKLLLKLLK	691
KLLLKLKLKLLKC	692
KLLLKLLLKLLK	693

Tabela 12 - Seqüências de peptídeo de miméticas de VIP

Seqüência/Estrutiira	SEQ ID NO:
HSDAVFYDNYTR LRKQMAVKKYLN SILN	694
Ntc HSDAVFYDNYTR LRKQMAVKKYLN SILN	695
X, X,‘X,X2	696
X,SX«LN	697
NHCHCOKKYX5NHCHCOX6	698
t 1 (CH2)m Z £CH2)n
KKYL	699
NSILN	700
KKYL	701
KKYA	702
AVKKYL	703
NSILN	704
KKYV	705
SÍLauN	706
KKYLNÍe	707
NSYLN	708
NSIYN	709
KKYLPPNSILN	710
LauKKYL	711
CapKKYL	712

KYL	713.......
KKYNle	714
VKKYL	715
LNSILN	716
YLNSILN	717
KKYLN	718
KKYLNS	719
KKYLNSI	730
KKYLNSIL	721
KKYL	722
KKYDA	723
AVKKYL	724
j NS1LN	725
KKYV	726
SILauN	727
NSYLN	728
NSIYN	729
KKYLNle	730
KKYLPPNSfLN	731
KKYL	732
KKYDA	733
AVKKYL	734
NSILN	735
KKYV	736
SILauN	737
LauKKYL	738
CapKKYL	739
KYL	740
KYL	741
KKYNle	742
VKKYL	743
LNSILN	744
YLNSILN	745
KKYLNle	746
KKYLN	747
KKYLNS	748
KKYLNSÍ	749
KKYLNSiL	250

KKKYLD	75J
cyclicCKKYLC	752
CKKYLK 1 I S-CHi-CO	753
KKYA	754
WWTDTGLW	755
WWTDDGLW	756
WWDTRGLWVWTI	757
FWGNDGIWLÊSG	758
DWDQFGLWRGAA	759
RWDDNGLWWVL	760
SGMWSHYG1WMG	761
ggrwdqaglwva	762
KFWSEQGIWMGE	763
CWSMHGLWLC	764
GCWDNTGIWVPC	765
dwdtrglwvy	766
SLWDENGAWI	767
KWDDRGLWMH	768
QAWNERGLWT	769
QWDTRGLWVA	770
WNVHGIWQE	771
SWDTRÚLWVÊ	772
DWDTRGLWVA	773
SWGRDGLWIE	774
EWTDNGLWAL	775
SWOEKGLWSA	776
SWDSSGLWMD	777

Tabela 13 - Seqüências de peptídeo de antagonistas de Mdm/hdm

S eqüência/Estmtura	SEQ ID NO:
TFSDLW	778
QÉTFSDLWKLLP	779
QPTFSDLWKLLP	780
QETFSDYWKLLP	781
QPTFSDYWKLLP	782

MPRFMDYWEGLN	783
VQNfiDYWTQQF	784
TGPAFTHYWATF	785
JDRAPTFRJDHWFALV	786
PRPALVFADYWETLY	787
FAFSRFWSDLSAGAH	788
pafsrfwsklsagah	789
PXFXDYWXXL	790
QETFSDLWKLLP	791
QPTFSDLWKLLP	792
qetfsdywkllp	793
QPTFSDYWKLLP	794

Tabela 14 - Seqüências de peptídeo de antagonistas de Calmodulina

S eqüàicia/Estrutura	SEQ IBNOí
SCVKWGKKEFCGS	795
SCWKYWGKECGS	796
SCYEWGKLRWCGS	797
SCLRWGKWSNCGS	798
SCWRWGKYQICGS	799
SCVSWGALKLCGS	800
SCIRWGQNTFCGS	80»
SCWQWGNLK1CGS	802
SCVRWGQLS1CGS	803
LKKFNARKKLKÜA1LITMLAK	804
RRWKKNFIAVSAANRFKK	805
rkwqktghavraigrlss	806
INLKALAALAKKJI.	807
KIWSÍLAPLGTTLVKLVÀ	808
LKKLLKLLKKLLKL	809
LK WKKLLKLLKKLLKK LL	810
AEWPSLTEIKTLSHFSV	811
aewpsptrvisttyfgs	812
AELAHWPPVKTVLRSFT	813
AEGSWLQLLNLMKQMNN	814
AEWPSLTEIK	815

Tabela 15 - Seqüências de peptídeo antagonistas de mastóide/inibidoras de protease de mastóide

S eqüênciaZEstmtura	SEQ IDNO;
SGSGVLKRPLPiLPVTR	816
RWLSSRPLPPLPLPPRT	817
GSGSYDTEALPSLPLWPMSS	818
gsgsydtralpslplhpmss	819
GSGSSGVTMYPKLPPHWSMA	820
GSGSSGVRMYPKLPPHWSMA	821
GSGSSSMRMVPTIPGSAKJIG	822
RNR	NR
QT	NR
RQK	NR
NRQ	NR
RQK	NR
RNRQKT	823
RNRQ	824
RNRQK	825
NRQKT	826
RQKT	827

Tabela 16 - Seqüências de peptídeo antagonistas de SH3

S eqüêiicia/Estmtura	SEQ ID NO:
RPLPPLP	828
RLLPPLP	829
SPLPPLP	830
GPLPPLP	831
RPLPIPP	832
RPLPIPP	833
RRLPPTP	834
RQLPPTP	835
RPLPSRJP	836
RPLPTRP	837
SRLPPLP	838
RALPSPP	839
RRLPRTP	840

RFVPP1T	841
1LAPPVP	842
RPLPMLP	843
RPLPILF	844
RPLPSLP	845
RPLPSLP	846
RPLPMIP	847
RPLPLtP	848
RPLPPTP	849
RSLPPLP	850
RPQPPPP	851
RQLPIPP	852
XXXRPLPPLPXP	855
XXXRPLPPIPXX	854
XXXRPLPPLPXX	855
RXXRPLPPLPXP	856
rxxrpljpplpípp	857
PPPYPPPPIPXX	858
PPPYPPPPVPXX	859
LXXRPLPXTP	860
VXXRPLPXLP	861
ΡΡΧΘΧΡΡΡΨΡ	862
+PPVPXKPXWL	863
ΚΡΧΨΡΨΧ+5ΧΡ	864
PPVPPRPXXTL	865
ΨΡΨΕΡΨΚ	866
• ODXPLPXLP	867

Tabela 17 - Seqüências de peptídeo miméticas de somatostatina cortistatina ou

S eqüàiciaZEstnitura	SEQ ID NO:
X1-X<Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phç-XJ-Scr-X'	868
Asp Arg Mc* Pro Cys Ajg Asn phc Phe Trp Lys Thr Phe Ser Ser Cy3 Lys	869
Meí Pro Cys Arg Asn Phe Pbe Trp Lys Thr Phe Ser Ser Cys Lys	870
Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser Ser Cys Lys	871
Asp Arg Mei Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser Ser Cys	872
Mel Pro Cys Arg Asn Phe Phc Trp Lys Thr Phe Ser Ser Cys	873

100

Cys Arg Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Ser Ser Cys	874
Asp Aíg Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Ser Ser Cys	875
Met Pro Cys Lys Asa Pbe Phe Τφ Lys Thr Phe Ser Ser Cys Lys	876
Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Ser Ser Cys Lys	877
Ásp Arg Met Pro Cys Lys Asn Pbe Phe Τφ Lys Thr Phe Ser Ser Cyâ	878
Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Ser Ser Cys	879
Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Ser Ser Cys	880
Asp Arg Met Pro Cys Arg Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Ser Cys Lys	881
Met Pro Cys Arg Asn Phe Phe Trp Lys Thr Pbe Thr Ser Cys Lys	882
Cys Arg Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Ser Cys Lys	883
Asp Arg Met Pró Cys Arg Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Ser Cys	884
Met Pro Cys Arg As» Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Ser Cys	885
Cys Arg Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Ser Cys	886
Asp Arg Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Pbe Thr Ser Cys Lys	887
Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Ser Cys Lys	888
Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Ser Cys Lys	889
Asp Arg Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys	890
Met Pro Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Scr Cys	891
Cys Lys Asn Phe Phe Τφ Lys Thr Phe Thr Ser Cys	892

Tabela 18 - Seqüências de peptídeo antagonistas de UKR

S eqüèneia/Estrutura	SEQ ID NO:
AÉPMPHSLNFSQYLWYT	893
AEHTYSSLWDTYSPLAF	894
AE1.OLWMRHYPLSFSNR	895
AESSLWTRYAWPSMPSY	896
AÊWHPG LSFGSYLWSKT	897
aepallnwsfffnpglh	898
aewseynlhlpepqtif	899
AEPLDLWSLYSLPPLAM	900
aeptlwqlyqfplrlsg	901
AEISFS ELMWLRSTPAF	902
AELSEADLWTTWFGMGS	903
AESSLWBJFSPS ALMM S	904
AESLPTLTSILWGKéSV	905
AETLFMDLWMDKHíLLT	906
aeilnfplwheplwste	907

101

AESQTGTI.NTLFWNTLR	908
AEPVYQYÉLDSYLRSYY	909
aeldlstfydiqyllrt	910
aeffklgpngyvylhsa	911
FKLXXXGYVYL	912
AESTYHHLSLGYMYTLN	913
YHXLXXGYMYT	914

Tabela 19 - Seqüências de peptídeo inibidoras de macrófago e/ou célula T

Seqüêucia/Estrutuia	SEQ IO NO:
Xaa-Yaa-Ajrg	NR
Arg-Yaa-Xaa	NR
Xaá-Arg-Yaa	NR
Yaa-Arg-Xaa	NR
Alá-Arg	NR
Arg-Arg	NR
Asn-Aíg	NR
Asp-Arg	NR
Cys-Arg	NR
Gtn-Afg	NR
Gtu-Arg	NR
Gly-Arg	NR
His-arg	NR
He-Arg	NR
Leu-Arg	NR
Lys-Arg	NR
Met-Arg	NR
Pfae-Arg	NR
Scr-Arg	NR
Thr-Arg	NR
Τηρ-Aíg	NR
Tyr-Arg	NR
Val-Afg	NR
Àía-Giu-Aig	NR
Arg-Glu-Arg	NR

102

Asn-Glu-Aig	NR
Asp-Glu-Arg	NR
Cys-GJu-Arg	NR
Gtn-Gtu-Arg	NR
Glu-GIu-Arg	NR
Gly-GIu-Arg	NR
His-Glu-Arg	NR
Ite-Glu-Arg	NR
Leu-Glu-Arg	NR
Lys-Glu-Arg	NR
Met-Glu-Arg	NR
Phe-Glu-Arg	NR
Pro-Glu-Arg	NR
Ser-Glu-Arg	NR
Thr-Glu-Arg	' NR
Trp-GIu-Axg	NR
Tyr-Gtu-Arg	NR
Vat-Glu-Arg	NR
Arg-Ala	NR
Arg-Asp	NR
Arg-Cys	NR
Arg-Gln	NR
Arg-Glu	NR
Àrg-Gly	nr
Arg-His	NR
Aig-lle	NR
Arg-Leu	NR
Arg-Lys	NR
Arg»Met	NR
Afg-Phc	NR
Arg-Pro	NR
Arg-Ser	NR
Arg-Thr	NR
Arg-Trp	NR
Arg-Tyr	NR
Arg-Val	NR
Arg-Glu-Ala	NR
Arg-Glu-A$it	NR

Tabela 20 - Peptídeos farmacologicamente ativos exemplares adicionais

Seqüência/Estrutura	SEQ ID NO:	Atividade
VEPNCDIHVMWEWECFERL	915	antagonista de VEGF

103

GERWCFDGPLTWVCGEES	916	antagonista de VEGF
RGWVEICVADDNGMCVTEAQ	917	antagonista de VEGF
G WDECDV ARM WE WECF AGV	918	antagonista de VEGF
GERWCFDGPRAWVCGWEI	919	antagonista de VEGF
EELWCFDGPRAWVCGYVK	920	antagonista de VEGF
RGWVEICAADDYG RCLTEAQ	921	antagonista de VEGF
RGWVEICESDVWGRCL	922	antagonista de VEGF
RGWVEICESDVWGRCL	923	antagonista de VEGF
GGNECDIARMWEWECFERL	924	antagonista de VEGF
RGWVEICAADDYGRCL	925	antagonista de VEGF
CTTHWGFTLC	926	Inibidor de MMP
CLRSGXGC	927	Inibidor de MMP
CXXHWGFXXC	928	Inibidor de MMP
CXPXC	929	Inibidor de MMP
CRRHWGFEFC	930	Inibidor de MMP
STTHWGFTLS	931	Inibidor de MMP
CSLHWGFWWC	932	mimético de CTLA4
GFVCSGIFAVGVGRC	933	mimético de CTLA4
APGVRLGCAVLGRYC	934	mimético de CTLA4
LLGRMK	935	Antiviral (HBV)
ICVVQDWGHHRCTAGHMANLTSHASAI	936	antagonista de C3b
ICWQDWGHHRCT	937	antagonista de C3b
CVVQDWGHHAC	938	antagonista de C3b
STGGFDDVYD WARGVS S ALTTTLVATR	939	ligação de Vinculina
STGGFDDVYDWARRVSSALTTTLVATR	940	ligação de Vinculina
SRGVNFSEWLYDMSAAMKEASNVFPSRRSR	941	ligação de Vinculina
S SQNWDMEAGVEDLTAAMLGLLSTIHS S SR	942	ligação de Vinculina
SSPSLYTQFLVNYESAATRIQDLLIASRPSR	943	ligação de Vinculina
SSTGWVDLLGALQRAADATRTSIPPSLQNSR	944	ligação de Vinculina
DVYTKKELIECARRVSEK	945	ligação de Vinculina
EKGSYYPGSGIAQFHDDYNNVS	946	ligação de C4BP
SGIAQFHIDYNNVSSAEGWHVN	947	ligação de C4BP
LVTVEKGSYYPGSGIAQFHIDYNNVSSAEGWHVN	948	ligação de C4BP
SGIAQFHIDYNNVS	949	ligação de C4BP
LLGRMK	950	anti-HBV
ALLGRMKG	951	anti-HBV
LDPAFR	952	anti-HBV
CXXRGDC	953	Inibição da agregação de plaqueta
RPLPPLP	954	antagonista de Src

104

PPVPPR	955	antagonista de Src
XFXDXWXXLXX	956	Anticâncer [particularmente para sarcomas))
KACRRLFGPVDSEQLSRDCD	957	miméticos de pl6
RERWNFDFVTETPLEGDFAW	958	miméticos de pl6
KRRQTSMTDFYHSKRRLIFS	959	miméticos de pl6
TSMTDFYHSKRRLIFSKRKP	960	miméticos de pl6
RRLIF	961	miméticos de pl6
KRRQTSATDFYHSKRRLIFSRQIKIWFQNRRMKWKK	962	miméticos de p 16
KRRLIFSKRQIKIWFQNRRMKWKK	963	miméticos de pl6
Asn Gin Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Vai Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gin	964	miméticos de CAP37/ligação de LPS
Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Vai Met Thr Ala Ala Ser Cys	965	miméticos de CAP37/ligação de LPS
Gly Thr Arg Cys Gin Vai Ala Gly Trp Gly Ser Gin Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Vai Asn Vai	966	miméticos de CAP37/ligação de LPS
WHWRHRIPLQLAAGR	967	mimético de carboidrato (GDI alfa)
LKTPRV	968	ligação P2GPI Ab
NTLKTPRV	969	ligação P2GPI Ab
NTLKTPRVGGC	970	ligação P2GPI Ab
KDKATF	971	ligação 32GPI Ab
KDKATFGCHD	972	ligação 32GPI Ab
KDKATFGCHDGC	973	ligação P2GPI Ab
TLRVYK	974	ligação P2GPI Ab
ATLRVYKGG	975	ligação P2GPI Ab
CATLRVYKGG	976	ligação β2ΟΡΙ Ab
INLKALAALAKKIL	977	Transporte de membrana
GWT	NR	Transporte de membrana
GWTLNSAGYLLG	978	Transporte

105

		de membrana
GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKK1L	979	Transporte de membrana
CVHAYRS	980	Antiproliferativo,anti viral
CVHAYRA	981	Antiproliferativo,anti viral
CVHAPRS	982	Antiproliferativo,anti viral
CVHAPRA	983	Antiproliferativo,anti viral
CVHSYRS	984	Antiproliferativo,anti viral
CVHSYRA	985	Antiproliferativo,anti viral
CVHSPRS	986	Antiproliferativo,anti viral
CVHTPRA	987	Antiproliferativo,anti viral
CVHTYRS	988	Antiproliferativo,anti viral
CVHTYRA	989	Antiproliferativo,anti viral
CVHTP RS	990	Antiproliferativo,anti viral
CVHTPRA	991	Antiproliferativo,anti viral
HWAWFK	992	anti-isquêmico, liberação do hormônio do crescimento

Tabela 21 Inibidores de peptídeo de miostatina

NOME DO SEQ ID PEPTICORPO	SEQÜÊNCIA DE PEPTÍDEO
Miostatina -TN8-1036 Conl	KDKCKMWHWMCKPP
Miostatina -ΤΝ8-1037 Con2	ICDLCAMWHWMCKPP

106

Miostatina -TN8-1038 Con3	ICDLCICMWKWMCKPP
Miostatina -TN8-Con41039	KDLCICMWHWMCKP K
Miostatina -TN8- Con5	1040	WYPCYEFHFWCYDL
Miostatina -TN8- Con6	1041	WYPCYEGHFWCYDL
Miostatina -TN8- Con7	1042	1FGCKWWDVQCYQF
Miostatina -TN8- Con8	1043	IFGCKWWDVDCYQF
Miostatina -TN8- Con9	1044	ADWCVSPNWFCMVM
Miostatina -TN8- ConlO	1045	HKFCPWWALFCWDF
Miostatina -TN8-1	1046	KDLCKMWHWMCKP P
Miostatina -TN8-2	1047	IDKCAIWGWMCPPL
Miostatina -TN8-3	1048	WYPCGEFGMWCLNV
Miostatina -TN8-4	1049	WFTCLWNCDNE
Miostatina -TN8-5	1050	HTPCPWFAPLCVEW
Miostatina -TN8-6	1051	KE WCWRWK WMCKP E
Miostatina-TN8-7	1052	FETCPSWAYFCLDI
Miostatina-TN8-8	1053	AYKCEANDWGCWWL
Miostatina-TN 8-9	1054	NSWCEDQWHRCWWL
Miostatina-TN8-10	1055	WSACYAGHFWCYDL
Miostatina-TN8-11	1056	ANWCVSPNWFCMVM
Miostatina-TN8-12	1057	WTECYQQEFWCWNL
Miostatina-TN8-13	1058	ENTCERWKWMCPPK
Miostatina-TN 8-14	1059	WLPCHQEGFWCMNF
Miostatina-TN8-15	1060	STMCSQWHWMCNPF
Miostatina-TN8-16	1061	IFGCHWWDVDCYQF
Miostatina-TN8-17	1062	IYGCKWWDIQCYDI
Miostatina-TN 8-18	1063	PDWCIDPDWWCKFW
Miostatina-TN 8-19	1064	QGHCTRWPWMCPPY
Miostatina-TN8-20	1065	WQECYREGFWCLQT
Miostatina-TN8-21	1066	WFDCYGPGFKCWSP
Miostatina-TN8-22	1067	G VRCPKGHLWCLYP
Miostatina-TN 8-23	1068	HWACGYWPWSCKWV
Miostatina-TN 8-24	1069	GPACHSPWWWCVFG
Miostatina-TN8-25	1070	TTNVCISPMWFCSQQ
Miostatina-TN8-26	1071	HKFCPPWAIFCWDF
Miostatina-TN8-27	1072	PD WC V SPRWYCNM W
Miostatina-TN8-28	1073	VWKCHWFGMDCEPT
Miostatina-TN8-29	1074	1CKHCQIWTWMCAPK
Miostatina-TN8-30	1075	WFQCGSTLFWCYNL
Miostatina-TN8-31	1076	WSPCYDHYFYCYTI
Miostatina-TN 8-32	1077	SWMCGFFKEVCMWV
Miostatina-TN8-33	1078	EMLCMIHPVFCNPH
Miostatina-TN8-34	1079	LKTCNLWPWMCPPL
Miostatina-TN8-35	1080	VVGCKWYEAWCYNK
Miostatina-TN8-36	1081	PIFICTQWAWMCPPT
Miostatina: TN8-3 7	1082	DSNCPWYFLSCVIF
Miostatina-TN8-3 8	1083	HIWCNLAMMKCVEM

107

Miostatina-TN8-39	1084	NLQCIYFLGKCIYF
Miostatina-TN 8-40	1085	AWRCMWFSDVCTPG
Miostatina-TN8-41	1086	WFRCFLD ADWCTS V
Miostatina-TN8-42	1087	EKICQMWSWMCAPP
Miostatina-TN8-43	1088	WFYCHLNKSECTEP
Miostatina-TN 8-44	1089	FWRCAIGIDKCKRV
Miostatina-TN8-45	1090	NLGCKWYEVWCFTY
Miostatina-TN 8-46	1091	[DLCNIvIWDGMCYPP
Miostatina-TN8-47	1092	EMPCNIWGWMCPP V
Miostatina-TN 12-1	1093	WFRCVLTGIVDWSECFGL
Miostatina-TN 12-2	1094	GFSCTFGLDEFYVDCSPF
Miostatina-TN 12-3	1095	LPWCHDQVNADWGFCMLW
Miostatina-TN 12-4	1096	YPTCSEKFWIYGQTCVLW
Miostatina-TN 12-5	1097	LGPCPIHHGPWPQYCVYW
Miostatina-TN 12-6	1098	PFPCETHQISWLGHCLSF
Miostatina-TN 12-7	1099	HWGCEDLMWSWHPLCRRP
Miostatina-TN 12-8	1100	FPFCDADMMPTIGFCVAY
Miostatina-TN 12-9	1101	SHWCETTFWMNYAKCVHA
Miostatina-TN 12-10	1102	LPKCTHVPFDQGGFCLWY
Miostatina-TN 12-11	1103	FSSCWSPVSRQDMFCVFY
Miostatina-TN 12-13	1104	SHKCEYSGWLQPLCYRP
Miostatina-TN 12-14	1105	PWWCQDNYVQHMLHCDSP
Miostatina-TN 12-15	1106	WFRCMFMNSFDAFQCVSY
Miostatina-TN 12-16	1107	PDACRDQPWYMFMGCMLG
Miostatina-TN 12-17	1108	FFACFVEFEFCFDS
Miostatina-TN 12-18	1109	SAYCIITESDPYVLCVPL
Miostatina-TN 12-19	1110	PSICESYSTMWLPMCQHN
Miostatina-TN 12-20	1111	WLDCHDDSWAWTKMCRSH
Miostatina-TN 12-21	1112	YLNCVMMNTSPFVECVFN
Miostatina-TN 12-22	1113	YPWCDGFMIQQGITCMFY
Miostatina-TN 12-23	1114	FDYCTWFNGFKDWKCWSR
Miostatina-TNI2-24	1115	LPLCNLKEISHVQACVLF
Miostatina-TN 12-25	1116	SPECAFARWLGIEQCQRD
Miostatina-TN 12-26	1117	YPQCFNFHLLEWTECDWF
Miostatina-TNI2-27	1118	RWRCEIYDSEFLPKCWFF
Miostatina-TN 12-28	1119	LVGCDNVWHRCKLF
Miostatina-TN12-29	1120	AGWCHVWGEMFGMGCSAL
Miostatina-TN 12-30	1121	HHECEWMARWMSLDCVGL
Miostatina-TN 12-3 I	1122	FPMCGIAGMKDFDFCVWY
Miostatina-TN12-32	1123	RDDCTFWPEWLWKLCERP
Miostatina-TN12-33	1124	YNFCSYLFGVSKEACQLP
Miostatina-IN12-34	1125	AHWCEQGPWRYGNICMAY
Miostatina-TN 12-35	1126	NLVCGKISAWGDEACARA
Miostatina-TN 12-3 6	1127	HNVCTIMGPSMKWFCWND
Miostatina-TN 12-3 7	1128	NDLCAMWGWRNTIWCQNS
Miostatina-TN 12-3 8	1129	PPFCQNDNDMLQSLCKLL
M yostatín-TN 12-39	1130	WYDCNVPNELLSGLCRLF
Miostatina-TN 12-40	1131	YGDCDQNHWMWPFTCLSF
Miostatina-TN 12-41	1132	GWMCHFDLHDWGATCQPD
Miostatina-TN12-42	1133	YFHCMFGGHEFEVHCESF
Miostatina-TN 12^13	1134	AYWCWHGQCVRF
Miostatina-Linear-1	1135	SEHWIFIDWDGNEWWVRPF
Miostatina-Linear-2	1136	MEMLDSLFELLKDMVPISKA

108

Miostatína-Linear-3	1137	SPPEEALMEWLGWQYGKFT
Miostatina-Linear-4	1138	SP ENLLNDLY1LMTKQEWYG
Miostatina-Linear-5	1139	fhweegipfhvvtpysydrm
Miostatina-Linear-6	1140	KRLLEQFMNDLAELVSG H S
Miostatina-Linear-7	1141	DTRDALFQEFYEFVRSRLVI
Miostatina-Linear-8	1142	RMS AAPRP LTYRDIMDQY WH
Miostatina-Linear-9	1143	NDKAHFFEMFMFDVHNFVES
Miostatina-Linear-10	1144	QTQ AQK1DGLWELLQSIRNQ
Miostatina-Linear-11	1145	MLSEFEEFLGNLVHRQEA
Miostatina-Linear-12	1146	YTPICMGSEWTSFWHNRIHYL
Miostatina-Linear-13	1147	LNDTLLREL1CMVLN S LS DM K
Miostatina-Linear-I4	1148	FDVERDLMRWLEGFMQSAAT
Miostatina-Linear-15	1149	HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV
Miostatina-Linear-16	1150	VESLHQLQMWLDQKLASGPH
Miostatina-Linear-17	1151	RATLLKDFWQLVEGYGDN
Miostatina-Linear-18	1152	EELLREFYRFVSAFDY
Miostatina-Linear-19	1153	GLLDEFSHFIAEQFYQMPGG
Miostatina-Linear-20	1154	YREMSMLEGLLDVLERLQHY
Miostatina -Linear-21	1155	HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ
Miostatina-Linear-22	1156	WREHFLNSDYIRDKLLAIDG
Miostatina-Linear-23	1157	QFP FYVFDDLPAQLEYW IA
Miostatina-Linear-24	1158	EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN
Miostatina -Linear-25	1159	EALFQNFFRDVLTLSEREY
Miostatina-Linear-26	1160	QYWEQQWMTYFRENG LH VQY
Miostatina-Linear-27	1161	NQRMMLEDLWRIMTPMFGRS
Miostatina-Linear-29	1162	FLDELKAELSREYALDDLDE
Miostatina-Linear-3 0	1163	GKLIEGLLNELMQLETFMPD
Miostatina-Linear-31	1164	ILLLDEYKKDWKSWF
Miostatina-2xTN8-19 kc	1165	QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGSGSTASSGSGS ATG QGHCTRWPWMCPPY
Miostatina-2xTN8- con6	1166	WYPCYEGHFWCYDLGSGSTASSGSGSATGWYP CYEG HFWCYDL
Miostatina-2xTN8-5 kc 1167	HTPCPWFAPLCVEWGSGSATGGSGSTASSGSGSA TGH TPCPWFAPLCVEW
Miostati na-2xTN 8-18 kc	1168	PDWC1DPDWWC1C FWGSGSATGGSGSTASSGSGSA TG PD WCDDPD WWCICF W
Miostatina-2xTN8-11 kc	1169	ANWCVSPNWFCMVMGSG SATGGSG STASSGSG SAT GANWCVSPNWFCMVM
Miostatina-2xTN8-25 kc	1170	PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGSGSTASSGSG SATG PDWCIDPDWWC1CFW
Miostatina-2xTN8-23 kc	1171	HWACGYWPWSCKWVGSGSATGGSGSTAS SGSGS AT GHWACGYWPWSCKWV
Miostatina-TN8-29-19 1172 kc	KICHCQIWTWMCAPKGSGSATGGSGSTASSGSG SATG QGHCTRWPWMCPPY
Miostatina-TN8-19-29 kc	1173	QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGSGSTASSGSG SATG KKHCQIWTWMCAPK
Miostatina-IN8-29-19 1174 kn	KKHCQIWTWMCAPKGSG SATGGSGSTASS G SG SATG QGHCTRWPWMCPPY
Miostatina-TN8-29- 19-8g	1175	KKHCQIWTWMCAPKGGGGGGGGQGHCTRWP WMCP PY
Miostatina-TN8-19- 29-6gc	1176	QGHCTRWPWMCPPYGGGGGGICICHCQIWTW MCAPK

109

Tabela 22 Inibidores de peptídeo de miostatina

Pepticorpo maturado por afinidade	SEQ ID NO:	Seqüência de peptídeo
mTN8-l94	1177	VALHGQCTRWPWMCPPQREG
mTN8-19-2	1178	YPEQGLCTRWPWMCPPQTLA
tnTN8-19-3	1179	GLNQGHCTRWPWMCPPQPSN
írfTN8d9-4	1180	MJTQGQCTRWPWMCPPQPSG
mTNS-19~5	1181	agaqehctrwpwmcapndwi
naTN8-19-6	1182	GVNQGQCTRWRWMCPPNGWE
mTN8-19-7	1183	LADHGQCÍRWPWMCPPEGWÉ
mTN8-I9-8	1134	ILEQAQCTRWPWMCPPQRGG
mTN8~19-9	1185	TQTHAQCTRWPWMCPPQWEG
rtiTN8-19-10	1186	WTQGHCTLWPWMCPPQRWR

110

mTN8-19-l1 mTN849-12	1187 1188	IYPHDQCTRWPWMCPPQPYP SYWQGQCfRWP WMCPPQWRG
mTN8-19-i3	1189	MWQQGHCTRWPWMGPPQGWG
mTN8-19-14	1190	EFTQWHCTRWPWMCPPQRSQ
mTNS-] 9-IS	1191	LDDQWQCTRWPWMCPPQGFS
mTNS-Ι 94 6	1192	YQTQGLCTRWPWMCPPQSQR
mTNS-1947	1193	ESNQGQCTRWPWMCPPQGGW
mTNS-194 8	1194	wtdrgpctrwpwmcppqang
mTNS4949	1195	VGTQGQCTRWPWMCPPYETG
mTNS-19-20	1196	PYEQGKCTRWPWMCPPYEVE
mTN8-19-2t	1197	SEYQGLCTRWPWMCPPQGWK
mTN849-22	1198	TFSQGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN849-23	1199	PGÂHDHCTRWPWMCFPQSRY
mTN849-24	1200	vaeewhcrrwpwmcppqdwr
mTN849-25	1201	VGTQGHCTRWPWMCPPQPAG
mTN8-19-26	1202	EEDQAHCRSWPWMCPPQÇWV
mTN849-27	1203	ADTQGHCTRWPWMCPPQHWF
mTN849-28	1204	SGPQGHCTRWPWMCAPQGWF
mTN849-29	1205	TLVQGHCTRWPWMCPPQRWV
mTN849-30	1206	gmahgkctrwawmcppqswk
mTN8-19-31	1207	ELYHGQCTRWPWMCPPQSWA
mTNS-19-32	1208	VADHGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN849-33	1209	PESQGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN849-34	1210	IPAHGHCTRWPWMCPPQRWR
mTN849-35	1211	FTVHGHCTRWPWMCPPYGWV
mTN8-19-36	1212	PDFPGHCTRWRWMCPPQGWE
mTN849-37	1213	Qlwqgpctqwpwmcppkgry
mTNS-19-38	1214	HANDGHCTRWQWMCPPQWGG
mTN8-19-39	1215	ETDHGLCTRWPWMCPPYGAR
mTNS-19-40	1216	gtwqglctrwpwmcppqgwq
mTN849 conl	1217	VATQGQCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19 con2	1218	vatqgqctrwpwmcppqrwg
mTNS con6-l	1219	qrewypcygghlwcydlhka
mTNS eon6-2	1220	1SÃWYSCYAGHFWCWDLKQK
mTNS con$-3	1221	WTGWYQCYGGHLWCYDLRRK

mTN8 con6-4	1222	KTFWYPCYBG HFWC YNLKSS
mTNS con6-5	1223	lESRWYPCYEGHLWCFDLTET

111

Tabela 23 Inibidores de peptídeo de miostatina

Pepticorpo maturado por afinidade	SEQID NO:	Seqüência de peptídeo
L2	1224	MEMLDSLFELLKDMVPISKA
mL2-Conl	1225	RMEMLESLLELLKEIVFMSKAG
mL2-Con2	1226	RMEMLESLLELLKEIVPMSKAR
mL2-l	1227	RMEMLESELELLKDIVPMSKPS
mL2-2	1228	GMEMLES LFELLQFJ VPMSKAP
tnl.2-3	1229	RMEMLESLLELLKDIVPISNPP
mL2-4	1230	RIEMLESLLELLQEiVPlSKAE
niL2-5	»231	RMEMLQSLLELLKD1VPMSNAR
mL2-6	»232	RMEMLESLLELLKEÍVPTSNGT
»»L2-7	1233	RMEMLESLFELLKEÍVPMSKAG
mL2-8	»234	RMEMLGSLLELLKEIVPMSKAR
mL2-9	»235	QMELLDSLEELLKEIVPKSQPA
mL2-10	»236	RMEMLDSLLELLKEIVPMSNAR
mL2-ll	1237	RMEMLESLLBLLHEIVPMSQAG
mL2-t2	1238	QM EMLESLLQLEKEI VPMSKAS
mL2-13	1239	RMEMLDSLLELLKDMVPMTTGA
mL2-14	1240	riemlesllellkdmvpmanas
mL2-I5	1241	RMÊMLBSLLQLLNEIVPMSRAR
mL2-16	1242	RMEMLESLFD1.LKELVPMSKGV
IWL2-17	1243	RJEMLESU.ELLKDJVPlQKAR
««L2-18	1244	RMELLESLFELLKDMVPMSDSS
mL2-19	1245	rmemlesllevlqeivprakga
mL2-20	1246	RMEMLÜSLLQLLNEIVPMSHAR
mL2-21	1247	RMÊMLES LLELLKDIVPMSN AG

112

mL2-22	1248	RMEMLQSLFELLKGMVP1SKAG
mL2-23	1249	rmemlesllellkeivpnstaa
mL2-24	1250	RMEMLQSLLELLKEIVPiSKAG
mL2-25	1251	R1EMLDSLLELLNELVPMSKAR
L-15	1252	HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV
mL15-conl	1253	qveslqqllmwldqklasgpqg
mLí5-l	1254	RMELLESLFELIXEMVPRSKAV
mL15-2	1255	QA VS LQHLLM WLDQKL ASGPQH
mLI5-3	1256	dedslqqllmwldqklasgpql
mLlS-4	1257	PVASLQQLL1WLDQKLAQGPHA
mL15-5	1258	evdelqqllnwldhklasgplq
mL15-6	1259	DVESLEQLLMWLDHQLASGPHG
mL15-7	1260	QVDSLQQVLLWLEHKLALGPQV
mLlS-8	1261	gdeslqhllmwleqklalgphg
mU5-9	1262	QIEMLESLLDLLRDMVPMSNAE'
iriLlS-IO	1263	EVD5LQQLLMWLDQKLASGPQA
mLIS-H	1264	EDES LQQLLIYLDKM LSSG PQV
niLl.5-12	1265	AMDQLHQLLIWLDHKEASGPQA
mü$-13	1266	RJEMLíLSLLELLDEIALIPKAW
mL15-14	1267	EVVSLQHLI24WLEHKLASGPDG
mL15-15	1268	GGESLQQLLMWUX3QLASGPQR
mLtS-ló	1269	G VES LQQLUFLDHMLVSGPHD
mU 5-17	1270	N VES LEHLMM WLERLLASGP Y A
mLÍ5-18	1271	QVDSLQQLL1WLDHQLASGPKK
ittLlS-19	1272	EVESLQQLLMWLEHKLAQGPQG
mL15-20	1273	EVDSLQQLLMWLDQfLLASGPHA
mL 15-21	1274	evdslqqllmwldqqlasgpqk
mLl5-22	1275	GVEQLPQLLMWLEQKLA5GPQK
mL15-23	1276	GEDSLQQLLMWLDQQIAAGPQV
IHL15-24	1277	ADDSLQQLLMWLDRKLASGPHV
mL15-25	1278	pvds lqqlliwldqklasgpqg
L-17	1279	RãTLLKDFWQLVEGYGDN
mLlT-çont	1280	dwratllkefwqlveglgdnlv
mL17-cotí2	1231	qsratllkefwqlveglgdkqa
mL17-J	1282	dgratlltefwqlvqglgqkea

113

«L17-2	1283	LARATLLKEFWQLVEGLGEKW
«L17-3	1284	gsrdtllkefwqlvvglgdmqt
«LI 7-4	1285	daratllkefwqlvdaygdrmv
«L17-5	1286	NDRAQLLRDFWQLVDGLGVKSW
ml, 17-6	1287	GVRETLLYF-LWYLLKGLGANQG
«LI 7-7	1288	QARATLLKEZECQLVGCQGDKLS
«LI 7-8	1289	QERATLLREFWQLVAGLGQNMR
«LI 7-9	1290	SGRATLLKEFWQLVQGLGEYRW
«LI 7-10	1291	TMRATLLKEFWLFVDGQREMQW
«LI 7-11	1292	GERATLLNDFWQLVDGQGDNTG
«LI7-12	1293	deretllkefwqlvhgwgdnva
«LI 7-13	1294	ggratllkelwqllegqganlv
«LI 7-14	1295	TARATLLNEL VQLVKG YGDKLV
«LI 7-15	1295	GMRATLLQEFWQLVGGQGDNWM
«LI 7-16	1297	STRATLLNDLWQLMKGWAEDRG
«LI 7-17	1298	SERATLLKELWQLVGG WGDNFG
«L17-18	1299	vgratlekefwqlveglvgqsr
«LI 7-19	1300	EIRATLLKÉfWQLVDEWREQPN
«LI 7-20	1301	QLRATLLKEFLQLVHGLGETDS
«LI 7-21	1302	TQRATLLKEFWQLIEGLGGKJHV
mL 17-22	1303	HYRATLI.KEFWQEVEGLREQGV
«LI 7-23	1304	QSRVTLLREFWQLVESYRPIVN
mL 17-24	1305	LSRATLLNEFWQFVDGQRDKRM
«LI 7-25	1306	wdratllndfwhlmêelsqkpg
«L17-26	1307	qeratllkefwrmveglgknrg
«LI 7-27	1308	nbratllrefwqlvggygvnqr
L-20	1309	yremsmleglldvlbrlqhy
«L20-I	1310	hqrdmsmlwelldvldglrqys
«L20-2	1311	TQRDMSMLDGLLEVLDQ1.RQQR
«L20-3	1312	TSRDMSLLWELLEELDR1.GHQR
«L20-4	1313	MQHDMSM LYGLVELLESLGHQI
«L20-5	1314	WNRDMRM LES LFEVLDGLRQQV
mL20-6	1315	□YRDMSMLEGLLAVLDRLGPQL
«L20conl	1316	TQRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR

114

mL20 con2	131?	WYRDMSMLEGELEVLDRLGQQR
L-21	1318	HNSSQMLLSELiMLVGSMMQ
mL2i-i	1319	TQNSRQMLLSDFMMLVGSMIQG
mL21-2	1320	MQTSRHILLSEFMMLVGStMHG
»iE2l-3	1321	hdnsrqmllsdllhlvgtmiqg
mL2l-4	1322	MENSRQNLLRELIMLVGNMSHQ
mL2l-5	1323	QDTSRHMELREFMMLVGEMIQG
mL21 conl	1324	DQNSRQMLLSDLMTLVGSMIQG
L-24	»325	EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN
mL24-t	1326	NVTFQWVQKHGRWYQWLDINV
mL24-2	1327	FDELQWLQNHRSEVEHWLVMDV

Tabela 24 Inibidores de peptídeo de miostatina

Nome do pepticorpo	Peptídeo
2x mTN8—Con6— (N)-1K	M-GAQ-WYPCYEGHFWCYDL- GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-WYPCYEGHFWCYDL— LE-5G-FC (SEQ1DNO: 1328)
2x mTN8—Con6- (C)-1K	FC5G-AQ-WYPCYEGHFWCYDL- GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-WYPCYEGHFWCYDL·- LE {SEQlDNO: 1329)
2x mTN8-Çon7™ (NMK	M-GAQ-1FGCKWWDVQCYQF- GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-IFGCKWWDVQCYQFLE-5G-FC (SEQIDNO: 1330)
2x mTN8-Con7— fO-tK	FC-5G-AQ-1FGCKWWDVQCYQF- GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-IFGCKWWDVQCYQFUE (SEQ ID NO: 1331)

115

2x mTN8~Con8— (Ν)- 1Κ	M-GAQ-IFGCKWWDVDCYQF- GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-IFGCKWWDVDCYQFLE-5C-FC (SEQIDNO: 1332)
2χ mTN8-Con8- (CMK	fc-sg-aqtfgckwwdvdcyqf- GSGSATGGSGSTASSGSGSATG-IFGCKWWDVDCYQF- LE (SEQIDNO; 1333)
2XmTN8~19~7	FC-5G-AQ- LADHGQCÍRWPWMCPPEGWELFGSGSATGGSGSTASSG SGSATGLADNGQQRWPWMCPPEGWE-IJE (SEQ ID NO; 1334)
2X mTN8~19-7 ST—GG dci2.T LE	FC-5G-AQ- LADHGQClRWPWMCPPEG WEGSGSATGG SGGG ASSGSG SATGLADHGQCIRWPWMCPPEGWE (SEQIDNO: 1335)
2X mTNS-19-21	FC-5G-AQ- SEYQGLCTRWPWMCPPQGWKLEGSGSATGGSGSTASSG SGSÁTGSEYQGLÇTRWPWMCPPQGWK-LE (SEQ ID NO: 1336)
2X mTNS-19—21 ST—GG det2x LE	FC-SG~AQ- SEYQGLCTRWPWMCPPQGWKGSGSATGGSGGGASSGS GSATGSEYQGLCTRWPWMCPPQGWK (SEQ ID NO: 1337)

116

2X mTNS— 19-22	PC-5G-AQ- TFSQGKCTRWPWMCPPQG WGLEGSGS ATGGSG ST ASSG SGS ATGTFSQGHCTR WPWMCPPQG WG-L E (SEQ ID NO: 133S)
2X mTNS-19—32	FC-SG-AQ- vadhghctrwpwmcppqgwglegsgsatggsgstass GSGSATGVADHGHCTRWPWMCPPQGWG-LE (SEQ ID NO; 1339)
2X mTNS-19-32 ST—GG del2x LE	FC-5G-AQ— vadhghctrwpwmcppqgwggsgsatggsgggassgs GSATGVADHGHCTRWPWVCPPQGWG (SEQ ID NO: 1340)
2X mTNS-19-33	FC-5G-AQ- pesqghctrwpwmçpfqgwglegsgsatggsgstassc· SGSATGPESQGHCTRWPWMCPPQGWGLE (SEQ 1DNO: 1341)
2X mTN8-»9-33 ST—GG de!2x LE	FC-5G-AQ- pesqghctrwpwmcppqgwggsgsatggsgggassgs GSATGPESQGHCTRWPWMCP PQGWG (SEQ ID NO; 1342)

Tabela 25 Seqüências de peptídeo de antagonista de integrina

117

S equêuciaZEstnitura	SEQ. ID NO;
CLCÍRGDCIC	1344
CWDDGWLC	1345
CWDDLWWLC	1346
CWDDGLMC	1347
CWDDGWMC	1348
CSWDDGWLC	1349
ÇPDDLWWLC	1350
NGR	1351
GSL	1352
RGD	1353
CGRÊCPRLCQSSC	1354
CNGRCVSGCAGRC	1355
CLSGSLSC	1356
GSL	1357
NGRAHA	1358
CNGRC	1359
CDCRGDCFC	1360
CGSLVRC	1361
DLXXL	1362
RTDLDSLRTYTL	1363
RTDLDSLRTY	1364
RTDLDSLRT	1365
RTOLDSLR	1366
G0LOLLKLRLTL	1367
GDLHSLRQLLSR	1368
RDDtHMLRLQLW	1369
SSDLHALKKRYG	1370
RGDLKQLSELTW	1371
:CXXRGDC	1372
STGGFDDVYDWARGVSSAL1TTLVATR	1373
stggfddvydwarrvssaltttlvafr	1374
srgvnfsewlydmsaamkeasnvfpsrrsr	1375

118

SSQNWDMEAGVEDLTAAMLGLLSTIHSSSR	1376
SSPSLYTQFLVNYESAATRJQDLLIASRPSR	1377
ssigwvdllgalqraadatrtsippslqnsr	1378
DVYTKKELIECARRVSEK	1379
RGDGX	1380
CRCDGXC	1381
CARRLDAPC	1382
CPSRLDSPC	1383
CDCRGDCFC	1384
CDCRGDCLC	1385
RGDLAALSAPPV	1386

Tabela 26 Seqüências de peptídeo de antagonista de selectina

SeqüêneiaZEstnitura	SEQ IDNO:
DITWDQLWDLMK	1387
DITWDÊEWKlMN	1388
DYTWFE1.WDMMQ	1389
Q1TWAQLWNMMK	5 390
DMTWHDLWTLMS	1391
DYSWHDLWÈMMS	1392
FTTWDQLWEVMN	1393
HVSWÊQLWDIMN	1394
HITWDQLWRÍMT	1395
RNMSWLELWEHMK	1396
AEWTWDQLWHVMNPAESQ	1397
HRAEWLALWEQMSP	1398
KKEDWLALWR1MSV	1399
ÍTWDQLWDLMK	1400
DITWDQLWDLMK	1401
DITWDQLWDLMK	1402
DITWDQLWDLMK	1403
CQNRYTDLVA1QNKNE	1404
aenwadnépnnkrnnêd	1405
rknnktwtwvgtkkaltne	1406
KKALTNEAENWAD	1407

CQXRYTDLVAJQNKXE	1408
AENWADGEPNNKXNXED	1409

Tabela 27 Peptídeos de ligação de vinculina

119

S eqüência. Estrutura	SEQ ID NO:
SSQNWDMEAGVEDLTAAMLGLLST1HSSSR	1410
sspslytqflvnyesaatriqdllíasrpsr	1411
sstgwvdllgalqraadatrtsippslqnsr	1412
DVYTKKELIECARRVSBK	1413
STGGFDDVYDWARGVSSALTTTI.VATR	1414
stggfddvydwarrvssaltttlvatr	1415
srgvnfsewlydmsaamkeasnvfpsrrsk	1416

Tabela 28 Seqüências de peptídeo relacionadas com laminina

S eqüêucia/Estrutura	SEQ ID NO:
YIGSRY1GSR [t.e., (YIGSR),]	1417
YIGSRYIGSRYIGSR (í.e.t (YIGSRb]	1418
YIGSRY1GSRYIGSRYIGSR (i.e., (YIGSRM	1419
YiGSRYtGSRYIGSRYlGSRYlGSR (U, (YTGSRfc]	1420
ipcnnkgahsvglmwwmLar	1421
Y1GSRREDVÊILD VPDSG R	1422
RGDRGDYIGSRRGD	1423
YIGSRYIGSRYIGSRY1GSRY1GSR	1424
REDVEILDVYIGSRPDSGR	1425
Y1GSRREDVEILDVPDSGR	1426

Tabela 29 Peptídeos Moduladores de NGF

SEQ ID NO:	Seqüência da Porção de Peptídeo de Produto da Fusão Fc
1427	TGYTEYTEEWPMGFGYQWSF
1428	TDWLSDFPFYEQYFG1.MPPG

120

1429	FMRFPNPWKLVEPPQGWYYG
1430	VVKÀPHFEFLAPPHFHEFPF
1431	FSYIWIDETPSNIDRYMLWL
1432	VNFPKVPEDVBPWPWSLKLY
1433	TWHPKTYEEFALPFFVPEAP
1434	WHFGTPY1QQQPGVYWEQAP
1435	VWXYGPFFMNFPDSTYFUTE
1436	WR1HSKPLDYSHVWFFPADF
1437	FWDGNQPPDILVDWPWNPPV
1438	FYSLEWLKDHSEFFQTVTEW
1439	QFMELLKFFNSPGDSSHHFt
1440	tnvdwisnnwehmksffted
1441	PNEKPYQMQSWFPPDWPVPY
1442	WSHTEWVPQVWWKPPNHFYV
1443	WGEWrNDAQVHMHEGFÍSES
1444	VPWEHDHDLWEHSQDWHlÀ
1445	VLHLQDPRGWSNFPPGVLEL
1446	ÍHGCWFTEEGCVWQ
1447	ymqcqfardgcpqw
1448	KLQCQYSESGCPTI
1449	FLQCEISGGACPAP
1450	KLQCEFSTSGGPDL
1451	KLQCEFSTQGCPDL
1452	KLQCJEFSTSGCPWL
1453	ÍQGCWFTEEGCPWQ
1454	SFDCDNPWGHVLQSCFGF
1455	SFDCDNPWGHKLQSCFGF

Tabela 30 Peptídeos moduladores TALL

S eqüência/estrutura	SEQ 1E> NO:
LPGCKWDLUKQWVCDPLA-V'	1456
V1- A - LPGCKWDLLIKQWVCDPL	1457
LPGCKWDLLIKQWVCDPL - Λ LPGCKWDLLIKQWVCDPL - Λ -V1	1458
V‘- A - LPGCKWDLLIKQWVCDPL - Λ - LPGCKWDLLIKQWVCDPL	1459

121

SADCYFDILTKSDVCTSS* Λ -V’	1460
V*-a - SADCYFDILTKSDVCTSS	1461
SADCYFDÍLTKSDVTSS- Λ - SADCYFDÍLTKSDVTSS - Λ -V	1462
V- Λ - SADCYFDÍLTKSDVTSS - Λ - SADCYFDÍLTKSDVTSS	1463
FHDCKWDLLTKQWVCHGL- Λ -V	1464
V'- Λ - FHDCKWDLLTKQWVCHGL	1465
FHDCKWDLLTKQWVCHGL - Λ FHDCKWDLLTKQWVCHGL - Λ -V1	1466
V’- Λ - FHDCKWDLLTKQWVCHGL - Λ - FHDCKWDLLTKQWVCHGL	1467

Tabela 31 Pepticorpos inibidores de TALL-1.

Pepticorpo	Pepticorpo SEQ ID NO	Seqüência de Pepticorpo
TALL-1 -8- La	1468	MPGTCFPFPW ECTHAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSD1AV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SkSLSPGK
TALL-1-8-2-a	1469	MWGACWPFPW ECFKEGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPFKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVKNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSD1AV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
TALL-l-8-4-8	1470	MVPFCDLLTK HCFEAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSOIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK

122

		SLSLSFGK
TALL-1-12^ a.	1471	MGSRCKYKWD VLTKQCFHHG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
a	1472	MLPGCKWDLL TKQWVCDPLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLFPSR DELTKNQVSLTCLVKCFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-12’5- a	1473	MSADCYFDIL TKSDVCTSSG GGGG VDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLFPSR DELTKNQVSLTCLVKCFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
TALL-M2’S’ a	1474	MSDDCMYDQLTRMnCSNLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLFPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL4-l2-$- a	1475	MDLNCKYDEL TYKEWCQFNG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-L12- lO~a	1476	MFHDCKYDLL TRQMVCHGLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR

123

		DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
TÃLL-1-12- It-a	1477	MRNHCFWDH1. LKQDJCPSPG GGGGVPKTMT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPWTLM1 SR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
TALL-l-12- 14-a	1478	MANQCWWDSL TKKNVCEFFG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1- consenso	1479	MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS D1AVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-l 12-3 dúnero em tandem	1480	MLPGCKWDLL IKQWVCDPLG SGSATGGSGS TASSGSGSAT HMLPGCKWDL LÍKQW VCDPL GGGGCVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLM1S RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPÍEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SD1AVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
TALL-l dúnero em tandem de consenso	148)	MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG SGSATGGSGS TASSGSGSAT HMFHDCKWDL LTKQWVCHGL GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLM1S RTPEVTCWV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPÍEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

Tabela 32 Inibidores peptídeo de ANG-2

124

PEPTÍDEO	SEQ ID NO.	SEQÜÊNCIA DE PEPTÍDEO
Con4M4	1482	PIRQEECDWDPWTCEHMWEV
CtK»4-4Ô	1483	TN1QEECEWDPWTCDHMPGK
Cõn4*4	1484	WYEQDACEWDPWTCEHMAEV
Con4-31	1485	NRLQEVCEWDPWTCEHMENV
Con4-C5	1486	AATQEECEWDPWTCEHMPRS
Con4-42	1487	LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW
Con4-35	1488	VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG
Con4M3	1489	SlSHÊECEWDPWTCEHMQVG
Con4-49	1490	WAAQEECEWDPWTCEHMGRM
Con4-27	1491	TWPQDKCEWDPWTCEHMGST
Con4-48	1492	GHSQEECGWDPWTCEHMGTS
Con4-46	1493	QHWQEECEWDPWTCDHMPSK
Çori4-41	1494	NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR
Con4-36	1495	KSGQVECNWDPWTCEHMPRN
Con4-34	1496	VKTQEHCDWDPWTCEHMRÊW
Ces4-28	1497	AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM
^«^*8** ψ'*’'	1498	PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM
Con4-2S	1499	rapqedcewdpwtcahmdik
Cen4-50	1500	HGQNMECEWDFWTCÊHMfRY
Con4 38	1501	PRLQEECVWDPWTCEHMPLR
Con4-29	1502	RITQEKCEWDPWTCEHMESQ
Côft4-47	1503	QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS
Ce »4-20	1504	QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL
Coo4-45	1505	WAQQEECAWDPWTCDHMVÜL
Con4-3?	1506	LPGQEDCÊWDPWTCEHMVRS
Con4-33	1507	PMNQVECDWDFWTCEHMFRS
AC2-Con4	1508	FGWSHGCEWDPWTCEHMGST
Con4-32	1509	KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP
Co»4-17	1510	GPRJSTCQWDPWTCEHMDQL
Cô»4-8	1511	STIGOMCEWDPWTCAHMQVD
AC4-C«n4	1512	VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW

125

Coo4“l	1513	vlggqgcqwdpwtcshledg
Con4-Cl	1514	TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG
Coft4-21	1515	TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG
Coo4-C2	1516	TnCSMCQWDPWTCAHMQGG
Coa4-i8	1517	WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP
Con4-19	1518	WQVGMCQWDPWTCKHMRLQ
Con4-16	1519	AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV
Con4-l 1	1520	QGMKMPCEWOPWTCAH3VYR
Con4-C4	Í52Í	TTLGS MCQWDP WTCEHMQGG
Cói»4-23	1522	TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT
Con4-15	1523	QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS
Con4-9	1524	GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG
TN8-Con4·	1525	QEECEWDPWTCEHM

Tabela 33 Inibidores de peptídeo de ANG-2

Peptídeo	SEQ ID NO.	Seqüência de Peptídeo
Ll-l	1526	QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT
Ll-2	1527	LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS
Ll-3	1528	TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ
Ll-4	1529	vkfkpldaleqtlyehwmfqqa
Ll-5	1530	VKYKPLDELDEILYEQQTFQER
Ll-7	1531	rWMPMDDLFQRLYEQFILQQG
Ll-9	1532	SKFKPLÜELEQTLYEQWTLQHA
LI-IO	1533	QKFQPLDELEQTLYÊQFMLQQA
Ll-ll	1534	QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS
LEI2	1535	YKFTPEDDLEQTLYEQWTLQIIV
Ll-13	1536	QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR
Ll-14	1537	SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ
Ll-15	(538	QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG
Ll-16	1539	QkFQPLDÉLEETLYKQWTLQQR
LW7	1540	VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ
LWI	1541	QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS

126

Lt-19	1542	QTFQPLDDLEEYLYEQWÍRRYH
LI-20	1543	BDYMFLDALDAQLYEQFILLHG
Ll-2t	1544	HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL
Ll-22	1545	YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA
AC6-L1	1546	ENYKPLDELDATLYEHWILQHS
Ll-Cl	1547	QKEKPLDELEQTLYEQWTLQQR
L1-C2	1548	rKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR
L1-C3	1549	YNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR
LI	1550	KFNPLDELEETLYEQFTFQQ

Tabela 34 Inibidores de peptídeo de ANG-2

Peptídeo	SEQ Π) NO.	Seqüência
Conl-1	1551	AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA
Conl-2	1552	QTWDDPCMHILGPVTWRRCI
Conl-3	1553	APGQRPYDGMLGWPTYQRIV
Conl-4	1554	SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL
Conl-5	1555	FGDKRPLECMFGGPIQLCPR
Conl-6	1556	GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG
Conl	1557	KRPCEEEFGGCTYQ

Tabela 35 Inibidores de peptídeo de ANG-2

Peptídeo	SEQ Π) NO:	Seqüência
12-9-1	1558	GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT
12-9-2	1559	KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS
12-9-3	1560	LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR
12-9-4	1561	AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK
12-9-5	1562	LLDYCEGVQDPFTFGCENLD
12-9-6	1563	HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG
12-9-7	1564	MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM
12-9-C2	1565	LQDYCEGVEDPFTFGCENQR
12-9-C1	1566	LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR
12-9	1567	FDYCEGVEDPFTFGCDNH

Tabela 36 Peptídeos de ligação de ANG-2

Peptídeo	Seq Id No.	Seqüência
TN8-8	1568	KRPCEEMWGGCNYD
TN8-14	1569	HQICKWDPWTCKHW
TN8-Conl	1570	KRPCEEIFGGCTYQ
TN8-Con4	1571	QEECEWDPWTCEHM
TN12-9	1572	FDYCEGVEDPFTFGCDNH
LI	1573	KFNPLDELEETLYEQFTFQQ
C17	1574	QYGCDGFLYGCMIN

Tabela 37 Peptídeos de ligação de ANG-2

Pepticorpo	Seqüência de Pepticorpo
L1(N)	MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc NO: 1575)	(SEQ ID
LI (N)WT	MKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1576)

127

LI (N) 1K WT	MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHL EGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1577)
2xLl (N)	MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGGKFNPLDELEET LYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1578)
2xLl (N) WT	MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGKFNPLDELEETLYEQF TFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1579)
Con4 (N)	MGAQQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1580)
Con4 (N) 1K-WT	MQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEGGG GG-Fc (SEQ ID NO: 1581)
2xCon4 (N) 1K	MGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQE ECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1582)
LI (C)	M-Fc-GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLE (SEQ ID NO:1583)
LI(C)1K	M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELEETLYEQ FTFQQLE (SEQ ID NO: 1584)
2xLl (C)	M-Fc- GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGGKFNPLDEL EETLYEQFTFQQLE (SEQ DD NO: 1585)
Con4(C)	M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 1586)
Con4 (C) 1K	M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEH MLE (SEQ ID NO: 1587)
2xCon4 (C) 1K	M-Fc- GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSAT HQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 1588)
Con4-Ll (N)	MGAQEECEWDPWTCEHMGGGGGGGGKFNPLDELEETLYEQFT FQQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1589)
Con4-Ll (C)	M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELEETLYEQ FTFQQGGGGGQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 1590)
TN-12-9ÇN)	MGAQ-FDYCEGVEDPFTFGCDNHLE-GGGGG-Fc (SEQ ID NO:1591)
C17 (N)	MGAQ-QYGCDGFLYGCMINLE-GGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1592)
TN8-8 (N)	MGAQ-KRPCEEMWGGCNYDLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1593)
TN8-14 (N)	MGAQ-HQICKWDPWTCKHWLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1594)
Conl(N)	MGAQ-KRPCEEEFGGCTYQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1595)

128

Tabela 38 Peptídeos de Ligação de Ang-2

Pbs maturado por afinidade derivado de Con4	Sequência de pepticorpo (Seq Id No:)
Cor4 44 (C)	M-Fc-GGGGGAQ-PIRQEECDWDPWtC£HMWEVLE [SEQ ID NO 1596)
Con4-4O (C)	M-Fc-GGGGGAQ-TNIQEECEWDPW.TCDHMPGK-LE (SEQ íD NO: 1597)
Con4-4 (C)	M-FcGGGGGAQ-WYEQDACEWDPWTCEHMAEVLE [SEQ ID NO: 1598)
Cor4-31 (C)	M-Fc-GGGGGaQ-NRLQEVCEWDPWTCEHMEN\FLE 'SEQ1DNO: 1599)
Con4-C5 (C)	M-Fc-GGGGGAQ.AATQEECEWDPWTCEHMPRS-LE [SEQ1DNO: 1600)
Con4M2 (C)	M-Fc-GGGGGAQ.LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW.LE (SEQ1DNO: 1602)
Con4-35 (C)	M.Fc-GGGGCAQ-VPRQKDCEWDPWTCEHMYVGLE fSEQEDNO: 1602)
Con-4-43 (C)	M-Fc-GGGGGAQ-SiSHEECEWDPWTCFHMQVG-LE [SEQ ΓΟΝΟ. IÓ03)
Con4-49 (C)	M-Fc-GGGGGAQWAAQSÉCEWDPWTCEHMGRM-LE [SEQÍÕNO: 1604)
Con4-27(C)	M-Fc-GGGGGAQ-TWPQDKCEWDPWTCÊHMGST-LE (SEQ1DNO: 1605}
Cq«4-48 (C)	M-Fc-GGGGGAQGHSQEECGWDPWTCEHMGTS-LE (SEQ ID NO: 1606)
Con4~46 (C)	M-Fe-GGGGGAQ-QHWQEECEWDPWTCDHMPSKLE (SEQ I© NO: 1607)
.................... Con4-4Í(C)	M-Fc-CGGGGAQ-NVRQEKCEWDPWrCEHMPVR-LE (SEQ1DNO: 1608)
Con4-36 (C)	M-Fc-GGGGGAQKSGQVECNWDPWTCEHMPRN-LE [SEQlDNOí 1609)
Cen4-34(C)	M-Fc-GCGCGAQ-VKrQEHCDWDPWTCEHMR£W-LE (SEQtDNO: 1610}
Con4-28 (C)	M-Fe-GGGGGAQ-ÁWGQ£GCDWDPWTCEHMLPM-LE

129

	(SEQ flDNOc 1649)
Con4-6 (C)	M-Fc-GCGGGAQ-WPQTEGCQWDPWTCRLLHGWL£ (SEQ ID NO: 1650)
Çon4-24 (C)	M-Pc-GGGGGAQ-PDTWQGOQWDPWTÇRLYGMW-LE (SEQIDNO 1651)
ACi-Con4(C)	M-Fc-<XXXXÍAQ-TWÍ^KCEWDPWTCRLLQGW.LÊ <SBQÜ>NO 1652)
AC3-Coh4 (C)	M-Pe-GGGOGAQ-DKILEEÇEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQIDNOt 1653)
AC5-Con4 (C)	M-FcX3GGGGAQ-AA1QEECEW0PWTCRLLQGW-LE (SEQIDNO 1654)
Pbs maturado per afinidade derivado de LI	Sequência de pepticoipo (SeqHnO.)
L1-7(N)	mgaq-tnfmfmddleqrlyeqfilqqg-legggggtc [SEQIDNO: 1655)
ACÓ-LI (N)	MÜAQ-TNYKPI.DELDATl^YEHWILQHS LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 1656)
L1-15(N)	MGAQ-QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1657)
Ll-2 (N)	MGAQ-LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 1658)
L1-IO(N)	MGAQ-QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA LEGGGGG-Fc [SEQ IO NO: 1659)
LÍ-I3(N)	MGAQ-QEYEPLDELDETLYNQW.MFHQR LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 1660)
LS-S (N)	MG AQ-VKYKPLDELDEILYEQQTFQER LEGGGGG-Fc (SEQIDNO; 1661)
L1-C2ÍN)	MGAQ-TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 1662)
L1-C3 (N)	MGAQ-TNTQPLDELW<TYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 1663)
Ll-II (N>	MGAQ-QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS LEGGGGG-Fc (SEQ tD NO: 1664)
Lt-I7(N)	MG AQ-VKYKPLDELDFWLYHQFTLHHQ LEGGGCG Fc (SEQIDNO: 1665)
LI-12 (N)	MGAQ-YKFTPLDDLEQTLYEQWYLQHV LEGGGGG-Fc [SEQIDNO: 1666)
LI-1 (N)	MGAQ-QNYKPLDELOATLYEHFIFHYT LEGGGGG-Fc

130

	{SEQ IDNO; t«57)
U-4 (N)	MGaQ-VKFKPLDALEQTI-YEHWMFQQA i.EOCGCSG-Fc (SEQ IO NO: 1668)
L1-26(N)	MGAQ-£DYMÍ>LDALDaQLYEQF1LLHG LEGGGGG-Fc (SEQ IDNO: 1669)
LI -22 (N)	MG AQ-YK.FNPMDELEQTLYEEFL.FQHA LEGCGCG-Fc (SEQ IO NO; 1670)
U.M(N)	MGAQ-SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ LEGGGGC-Fç (SEQ IDNO: 1671)
Ll-I6(N)	MGAQQKFQPLDELEETLYKQWTLQQR LEGGGGG-fc (SEQ IDNO; 1672)
Ll-ÍÍ(N)	MGAQ-QKFMPLDELDEíL YEQFMFQQS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO 1673)
Ll-3 (N)	MG AQ-TKENPLDELEQTt.YI-.QWTLQHQ LEGGGCGFc (SEQ ID NO: 1674)
LI-2l{N)	MGAQ-HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 1675)
U«C1 (N)	MGAQ-QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ CDNO: 1676)
	MGaQ-QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH LEGGGGG-Fc (SEQ IO NO: 1677)
Ll-9 (N)	MGaQ-SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA LEGGGGG-Fc (SEQ IDNO: 167«)
fitatiirado por afinidade derivado deConl	Seqitóntía <fe peptitotpo (Seq HNo:>
CojiI-4 (C)	M-Fc-GGGGGAQ-SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL-LE [SEQ ID NO: 1679)
Conl-I (C)	M-FcGGGCGAQ-AGGMRPYDGMLGWPNYDVQaLB (SEQ ID NO: 1680}
CooJ.fi (C)	M-Fc-GGGGGAQ.GQDLRPCEDMFGCGrKOWYG-LE (SEQ 10 NO; 1681}
ConI-3 (C)	MFc-GGGGGAQ.APGQRPYDCMLGWPTYQKJV-LE (SEQ IDNO: 1682)
Conl-2 (C)	M-fe-GGGGGAQ-QTWD0PCMH<LGf'VTWR_ROLE (SEQ IDNO: 1683)
Cói5l-5(Q	M-Fc-GGGGGAQ-ÉGDKRPLECMFGGPIQLCPR-LE (SEQ 10 NO 1684)
	MEcGGGCGAQ-KRPCEEIFGGCTYQ.LE

131

	(SEQID NO: 1685)
rft&iwnuÍo ρϋχ ofSniÂaide <Eozzvad»	Se^aênci* de jfepíiteipe (Se< Ii No:}
12-9-3(0	MFc-GGGGGAQ-LQEWCFGVEDPFTFGCEKQRLE [SEQ 10 NO: 1686)
12-9-7(0	M-fc-GGOGGAQ-MLDYCEGMDDPFTFOCDKQM-LE (SEQID NO: 1687)
12-9 6(0	M-Fc-GGGOGAQ-HQEYCEGMEÜPFIFGCEYQG-LE (SEQID NO: I6M)
12-9-C2ÍC)	M-Fc-GGGGGAQ-t.QDYCEGVEDPFTFCCENQR-LÊ (SEQID NO 1689)
12-9-S (O	M-Fc-CGGGGAQ.LLDVCEGVQOPrn-CCENU>LE (SEQID NÓ: 1690)
12-9-» (C)	M-Fc-GGGGGAQ-GFEYCDGÍMEDPFTTGCDKQT-LB [SEQID NO: 1691)
12-9-4(0	M-Fc-GGCGGAQ-AQDYCEGMEOPFTFGCEMQIC-LE (SEQID NO: 1692)
S2-9-C] (O	M-fc-GGGGGAQ-LQDYClíGVJ-UKfTFGCEKQR-LE [SEQID NO: 1693)
12-9-2 (O	M-Kc-GGGGGAQ-KLEYCDGMEDrrrQCCONQS-LE (SEQIDNO: 1694)
( Precwsej·: 12-S (C)	M-Fc-GCGGGAQ.FDYCEGVEDPSFTFGCDNH-LE (SEQ ID NO: 1695)

Além dos compostos de TMP apresentados na Tabela 6, a invenção fornece numerosos outros compostos de TMP. Em um aspecto, os compostos TMP compreendem a seguinte estrutura geral:

TMP₁-(L,)_n-TMP₂ em que TMPj e TMP₂ são cada um independentemente selecionados do grupo de compostos que compreendem a estrutura de núcleo:

Χ₂-Χ3-Χ4-Χ₅-Χ₆-Χ₇-Χ₈-Χ₉-Χ₁₀, em que,

X₂ é selecionado do grupo que consiste de Glu, Asp, Lys e

Vai;

X₃ é selecionado do grupo que consiste de Gly e Ala;

X₄ é Pro;

X5 é selecionado do grupo que consiste de Thr e Ser;

X₆ é selecionado do grupo que consiste de Leu, Ile, Vai, Ala e

Phe;

X₇ é selecionado do grupo que consiste de Arg e Lys;

132

X₈ é selecionado do grupo que consiste de Gin, Asn e Glu;

X₉ é selecionado do grupo que consiste de Trp, Tyr e Phe;

Xio é selecionado do grupo que consiste de Leu, Ile, Vai, Ala, Phe, Met e Lys;

Li é um ligador como aqui descrito; e n é 0 ou 1;

e sais destes fisiologicamente aceitáveis.

Em uma forma de realização, Li compreende (Gly)_n, em que n é de 1 a 20 e quando n é maior do que 1, até metade dos resíduos Gly podem ser substituídos por um outro aminoácido selecionado dos 19 aminoácidos naturais remanescentes ou um estereoisômero destes.

Além da estrutura de núcleo X₂-Xio apresentada acima para TMP] e TMP₂, outras estruturas relacionadas também são possíveis em que uma ou mais das seguintes são adicionadas às estruturas de núcleo TMP_t e/ou TMP₂: Xi é ligado ao término N e/ou X_]b X₁₂, X₁₃, e/ou X₁₄ são ligados ao término C, em que X_b X_J2, X₁₃ e X₁₄ são como segue:

Xi é selecionado do grupo que consiste de Ile, Ala, Vai, Leu,

Ser e Arg;

Xn é selecionado do grupo que consiste de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His e Glu;

X₁₂ é selecionado do grupo que consiste de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Gly, Ser e Gin;

X₁₃ é selecionado do grupo que consiste de Arg, Lys, Thr, Vai, Asn, Gin e Gly; e

X₁₄ é selecionado do grupo que consiste de Ala, Ile, Vai, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu e Gly.

Os compostos TMP da invenção são fabricados de, isto é, compreendendo, pelo menos 9 subunidades (X₂-Xi₀), em que X₂-Xio compreendem a estrutura de núcleo. As subunidades X2-X14 são aminoácidos

133 independentemente selecionados dentre os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente, entretanto, a invenção abrange compostos onde X₂-Xi4 são independentemente selecionados do grupo de aminoácidos atípicos, que não ocorrem naturalmente bem conhecidos na técnica. Os aminoácidos específicos são identificados para cada posição. Por exemplo, X₂ podem ser Glu, Asp, Lys ou Vai.

Tanto as abreviações de três letras quanto as de letra única para os aminoácidos são aqui usados; em cada caso, as abreviações são aquelas padrão usadas para os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente ou variações bem conhecidas destes. Estes aminoácidos podem ter estereoquímica L ou D (exceto para Gly, que não é nem L nem D) e os TMPs (assim como todos os outros compostos da invenção) podem compreender uma combinação de estereoquímicas. A invenção também fornece moléculas TMP reversas (assim como para todos os outros peptídeos aqui divulgados) em que a seqüência do terminal amino ao terminal carbóxi dos aminoácidos é invertida. Por exemplo, o inverso de uma molécula tendo a seqüência normal Xi-X₂-X₃ seria X₃-X₂-Xi. A invenção também fornece moléculas de TMP retro-reversas (assim como para todas as outras moléculas da invenção aqui descritas) em que, como um TMP reverso, a seqüência do terminal amino para o terminal carbóxi de aminoácidos é invertida e os resíduos que são normalmente enanciômeros “L” no TMP são alterados para a forma estereoisomérica “D”.

Os compostos de TMP exemplares da invenção portanto incluem sem limitação os seguintes compostos:

134

IEGPTLRQWLAARA-GPNG-ÍEGPTLRQWLAARA (SEQ. IDNO: 993)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (Cíclico)

S ' | (SEQ, IDNO: 994)

IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ. IDNO- 995) lEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-lEGPTLRQALAARA (SEQ. ID NO. 996) IÊGPTLRQWLAARA GGGKGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 997) IEGPTLRQWLAARA-GGGK(BrAc)GGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ, IDNO: 998)

IEGPTLRQWLãARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ, ID NO: 999)

IEGPTLRQWLAARA-GGGK(PEG)GGGGGEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1000)

IEGPTLRQWLAARA-GGGC(PEG)GGGG-íEGPTLRQWLAARA (SEQ. IDNO: 100!)

IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1002) IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

I [IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG4EGPTLRQWLAARA (SEQ, ID NO: 1003)

135 lECPTLROWLAARA-GGGGCGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. IDNO: 1004)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1005)

Fc-IEGPrLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA-Fc (SEQ. ID NO: 1006)

1EGPTLRQWLAARA-GGGGGCGG-IEGPTLRQWLAARA-Fc(SEQ- IDNO: 1007)

Fc-GG-IEGPTLRQWLAARA-GPNG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1008)

FcIEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. ID NO: 1009)

FoIEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (cíclico)

I .................... _.......| (SEQ. ID NO: 1010)

Fc-IEGPTLRQCLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQCLAARA (linear) (SEQ. IDNO: 1011)

Fc-ÍEGPTLRQALAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQALAARA (SEQ. IDNO: 1012)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGKGGGG-1EGPTLRQWLAARA(SEQ. IDNO: 1013)

Fc-1EGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA(SEQ. IDNO: 1014)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGNGSGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. IDNO: 1015)

Fc-IEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA

Fc-íEGPTLRQWLAARA-GGGCGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. IDNO: 1016)

Fc-GGGGG-IEGPTLRQWLAARA-GGGGGGGG-IEGPTLRQWLAARA (SEQ. IDNO: 1017)

Derivados

A invenção também considera a derivatização da porção de peptídeo e/ou veículo (como debatido abaixo) dos compostos. Tais derivados podem melhorar a solubilidade, absorção, meia vida biológica e outros dos

137 consiste de alquila C1-C4, alcóxi C1-C4, cloro e bromo.

5.0 término C livre é derivatizado. Tipicamente, o término C é esterificado ou amidado. Por exemplo, pode-se usar métodos descritos na técnica para adicionar (NH-CH2-CH2-NH2)2 aos compostos desta invenção. Do mesmo modo, pode-se usar métodos descritos na técnica para adicionar NH2 aos compostos desta invenção. Os grupos derivados de terminal V exemplares incluem, por exemplo, -C(O)R2 em que R2 é alcóxi inferior ou NR3R4 em que R3 e R4 são independentemente hidrogênio ou alquila C1-C8 (preferivelmente alquila C1-C4).

ó.Uma ligação de dissulfeto é substituída com uma outra, preferivelmente porção de reticulação, mais estável (por exemplo, um alquileno). Ver, por exemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 38149; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9.

7.Um ou mais resíduos de aminoácido individuais são modificados. Vários agentes derivatizantes são conhecidos por reagir especificamente com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais, como descrito em detalhes abaixo.

8.Os polímeros heterobifuncionais são tipicamente usados para ligar a proteínas. Um exemplo é SMCC ou Succinimidil-4-(Nmaleimidometilcicloexano-l-carboxilato. A extremidade de NHS (NHiroxilsuccinimida) reage com as aminas primárias, que na conjugação no pH ~ 7 é ótimo. Uma vez que o complexo é formado, a reação da porção de maleimida de SMCC pode se processar com uma outra proteína/peptídeo contendo um grupo sulfidrila livre, que ocorre em uma taxa muito mais rápida do que a formação da amida na reação inicial. O resultado é uma ligação entre duas proteínas, por exemplo, conjugados de anticorpo-enzima. Uma aplicação é ilustrada pela preparação de fragmentos de Fab’ reticulados à peroxidase de rábano (Ishikwa, et al., 1983a,b; Yoshitake et al., 1982a,b; Imagawa et al., 1982; Uto et al., 1991). O uso de Sulfo SMCC (Sulfossuccinimidil-4-(N136 compostos. As porções podem altemativamente eliminar ou atenuar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis dos compostos e outros. Os derivados exemplares incluem compostos em que:

1.0 composto ou alguma porção deste são cíclicos. Por exemplo, a porção de peptídeo pode ser modificada para conter dois ou mais resíduos Cys (por exemplo, no ligador), que pode ciclizar pela formação da ligação de dissulfeto. Para citações às referências na preparação de derivados ciclizados, ver a Tabela 2.

2.0 composto é reticulado ou é tomado capaz de reticulação entre as moléculas. Por exemplo, a porção de peptídeo pode ser modificada para conter um resíduo Cys e deste modo ser capaz de formar uma ligação de dissulfeto intermolecular com uma molécula equivalente. O composto também pode ser reticulado através do seu término C, como na molécula mostrada abaixo.

h

F¹/xWN-^qA_Hj

F¹-{X¹ VCO-Η^ύ NH o

3.Uma ou mais ligações de peptidila [-C(O)NR-] (uniões) são substituídas por uma ligação que não de peptidila. As ligações que não de peptidila exemplares são -CH₂-carbamato [-CH₂-OC(O)NR-], fosfonato, CH₂-sulfonamida [-CH₂-S(O)₂NR-], uréia [-NHC(O)NH-], -CH₂-amina secundária e peptídeo alquilado [-C(O)NR6- em que R6 é alquila inferior].

4.0 término N é derivatizado. Tipicamente, o término N pode ser acilado ou modificado para uma amina substituída. Os grupos derivados de terminal N exemplares incluem -NRR1 (outro que não -NH2), NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, succinimida ou benziloxicarbonil-NH- (CBZ-NH-), em que R e Rl são cada um independentemente hidrogênio ou alquila inferior e em que o anel de fenila pode ser substituído com 1 a 3 substituintes selecionados do grupo que

138 maleimidometil) cicloexano-l-carboxilato) permite quanto a solubilidade em água de modo que uma etapa de solubilização orgânica não é necessária, permitindo maior flexibilidade e menos rompimento de atividade na reação com proteínas.

Os resíduos de lisina e resíduos de terminal amino podem ser reagidos com anidridos do ácido succínico ou outro ácido carboxílico, que inverte a carga dos resíduos de lisina. Outros reagentes adequados para derivatizar resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metila; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroboroidreto;

ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilisouréia; 2,4 pentanodiona; e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

Os resíduos de arginila podem ser modificados pela reação com qualquer um ou combinação de diversos reagentes convencionais, incluindo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-cicloexanodiona e ninidrina. A derivatização de resíduos de arginila requer que a reação seja realizada em condições alcalinas por causa do pKa alto do grupo funcional de guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como o grupo épsilon-amino da arginina.

A modificação específica de resíduos de tirosila tem sido extensivamente estudada, com interesse particular na introdução de rótulos espectrais dentro de resíduos de tirosila pela reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais habitualmente, Nacetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosila e derivados 3-nitro, respectivamente.

Os grupos de cadeia lateral de carboxila (aspartila ou glutamila) podem ser seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R’-N=C=N-R’) tais como l-cicloexil-3-(2-morfolinil-(4- etil) carbodiimida ou l-etil-3-(4-azônia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, os resíduos de aspartila e glutamila podem ser convertidos para

139 resíduos de asparaginila e glutaminila pela reação com íons amônio.

Os resíduos de glutaminila e asparaginila podem ser desamidados para os resíduos de glutamila e aspartila correspondentes.

Altemativamente, estes resíduos são desamidados sob condições ácidas brandas. Cada forma destes resíduos cai dentro do escopo desta invenção.

Os resíduos de cisteinila podem ser substituídos por resíduos de aminoácido ou outras porções para eliminar a ligação de dissulfeto ou, ao contrário, para estabilizar a reticulação. Ver, por exemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9.

A derivatização com agentes bifuncionais é útil para a reticulação dos peptídeos ou seus derivados funcionais a uma matriz de suporte insolúvel em água ou a outros veículos macromoleculares. Os agentes de reticulação habitualmente usados incluem, por exemplo, 1,1bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidróxi-succinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílicos, imidoésteres homobifuncional, incluindo ésteres de dissuccinimidila tais como 3,3’ditiobis(succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais tais como bis-Nmaleimido-l,8-octano. Os agentes derivatizantes tais como 3-[(pazidofenil)ditio]propioimidato de metila produziram intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulação na presença de luz. Altemativamente, as matrizes insolúveis em água reativas tais como carboidratos ativados pelo brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Pat. U.S. N- 3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 e 4.330.440 são utilizados para a imobilização de proteína.

Os grupos de carboidrato (oligossacarídeo) podem ser convenientemente ligados aos sítios que são conhecidos como sendo sítios de glicosilação em proteínas. No geral, oligossacarídeos ligados em O são ligados aos resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto que os oligossacarídeos ligados em N são ligados aos resíduos de asparagina (Asn)

140 quando eles são parte da seqüência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos que ocorrem naturalmente outros que não prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é habitualmente encontrado em ambos é o ácido N-acetilneuramínico (aludido como ácido siálico). O ácido siálico é usualmente o resíduo terminal de oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em O e, em virtude da sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas ao composto glicosilado. Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporado(s) no ligador dos compostos desta invenção e são preferivelmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos de polipeptídeo (por exemplo, em células de mamífero tais como CHO, BHK, COS). Entretanto, tais sítios podem ser ainda glicosilados pelos procedimentos sintéticos ou semisintéticos conhecidos na técnica.

Outras modificações possíveis incluem a hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, a oxidação do átomo de enxofre em Cys, metilação dos grupos alfaamino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983).

Os compostos da presente invenção também podem ser trocados ao nível do DNA. As seqüências de DNA de qualquer porção do composto podem ser trocados para códons mais compatíveis com a célula hospedeira escolhida. Para a E. coli, que é a célula hospedeira preferida, os códons otimizados são conhecidos na técnica. Os códons podem ser substituídos para eliminar sítios de restrição ou para incluir sítios de restrição silenciosos, que podem ajudar no processamento do DNA na célula hospedeira selecionada. O veículo, ligador e seqüências de DNA peptídicas

141 podem ser modificados para incluir qualquer uma das mudanças de seqüência precedentes.

Derivados conjugados a isótopo e toxina. Um outro conjunto de derivados úteis são as moléculas descritas acima conjugadas às toxinas, traçadores ou radioisótopos. Tal conjugação é especialmente útil para as moléculas que compreendem seqüências de peptídeo que se ligam às células de tumor ou patógenos. Tais moléculas podem ser usadas como agentes terapêuticos ou como um auxiliar em cirurgia (por exemplo, cirurgia radioimunoguiada ou RIGS) ou como agentes de diagnóstico (por exemplo, radioimunodiagnósticos ou RID).

Como agentes terapêuticos, estes conjugado derivados possuem várias vantagens. Eles facilitam o uso de toxinas e radioisótopos que seriam tóxicos se administrados sem a ligação específica fornecida pela seqüência de peptídeo. Estes também podem reduzir os efeitos colaterais que acompanham o uso de radiação e quimioterapia pela facilitação de doses eficazes mais baixas do parceiro de conjugação.

Os parceiros de conjugação úteis incluem:

• radioisótopos, tais como 90Itrio, 131Iodo, 225Actínio e

213Bismuto;

• toxina de ricina A, toxinas microbianamente derivadas tais como endotoxina de Pseudomonas (por exemplo, PE38, PE40) e outras;

• moléculas parceiras em sistemas de captura (ver abaixo);

• biotina, estreptavidina (úteis como moléculas parceiras em sistemas de captura ou como traçadores, especialmente para o uso em diagnóstico); e • agentes citotóxicos (por exemplo, doxorrubicina).

Uma adaptação útil destes derivados conjugados é o uso em um sistema de captura. Em um tal sistema, a molécula da presente invenção compreendería uma molécula de captura benigna. Esta molécula de captura

142 seria capaz de ligar-se especificamente a uma molécula efetora separada que compreende, por exemplo, uma toxina ou radioisótopo. Ambas as molécula conjugadas a veículo e a molécula efetora seriam administradas ao paciente. Em um tal sistema, a molécula efetora teria uma meia vida curta exceto quando ligada à molécula de captura conjugada ao veículo, minimizando assim quaisquer efeitos colaterais tóxicos. A molécula conjugada a veículo teria uma meia vida relativamente longa mas seria benigna e não tóxica. As porções de ligação específica de ambas as moléculas podem ser parte de um par de ligação específica conhecida (por exemplo, biotina, estreptavidina) ou pode resultar de métodos de geração de peptídeo tais como aqueles aqui descritos.

Tais derivados conjugados podem ser preparados pelos métodos conhecidos na técnica. No caso de moléculas efetoras de proteína (por exemplo, endotoxina de Pseudomonas), tais moléculas podem ser expressadas como proteínas de fusão de construções de DNA correlativas. Os derivados conjugados a radioisótopo podem ser preparados, por exemplo, como descrito para o anticorpo BEXA (Coulter). Os derivados que compreendem agentes citotóxicos ou toxinas microbianas podem ser preparados, por exemplo, como descrito para o anticorpo BR96 (BristolMyers Squibb). As moléculas utilizadas em sistemas de captura podem ser preparadas, por exemplo, como descrito pelas patentes, pedidos de patente e publicações da NeoRx. As moléculas utilizadas para RIGS e RID podem ser preparadas, por exemplo, pelas patentes, pedidos de patente e publicações da NeoProbe.

Veículos

A invenção requer a presença de pelo menos um veículo ligado a um peptídeo através do término N, término C ou uma cadeia lateral de um dos resíduos de aminoácido. Os veículos múltiplos também podem ser usados. Em um aspecto, um domínio Fc é o veículo. O domínio Fc pode ser

143 fundido aos terminais N ou C dos peptídeos ou tanto ao terminal N quanto ao

C.

Em várias formas de realização da invenção, o componente Fc é um Fc nativo ou uma variante de Fc. A fonte de imunoglobulina do Fc nativo é, em um aspecto, de origem humana e, em formas de realização alternativas, pode ser de qualquer classe de imunoglobulina. Os domínios Fc nativos são fabricados de polipeptídeos monoméricos que podem ser ligados em formas diméricas ou multiméricas pela associação covalente (isto é, ligações de dissulfeto) e/ou não covalente. O número de ligações de dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo varia de um a quatro dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA, IgE) ou subclasse (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Um exemplo de um Fc nativo é um dímero ligado a dissulfeto resultante da digestão com papaína de uma IgG (ver Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 40719)·

Deve ser mencionado que os monômeros Fc espontaneamente dimerizarão quando os resíduos de cisteína apropriados estão presentes, a menos que condições particulares estejam presentes que impedem a dimerização através da formação da ligação de dissulfeto. Mesmo se os resíduos de cisteína que normalmente formam ligações de dissulfeto no dímero de Fc são removidos ou substituídos por outros resíduos, as cadeias monoméricas no geral formarão um dímero através de interações não covalentes. O termo “Fc” aqui é usado para significar qualquer uma destas formas: o monômero nativo, o dímero nativo (ligados pela ligação de dissulfeto), dímeros modificados (por dissulfeto e/ou não covalentemente ligados) e monômeros modificados (isto é, derivados).

Como mencionado, variantes de Fc são veículos adequados dentro do escopo desta invenção. Um Fc nativo pode ser extensivamente modificado para formar uma variante de Fc, contanto que a ligação ao

144 receptor de recuperação seja mantida; ver, por exemplo a WO 97/34631 e WO 96/32478. Em tais variantes de Fc, pode-se remover um ou mais sítios de um Fc nativo que forneça características estruturais ou atividade funcional não requerida pelas moléculas de fusão desta invenção. Pode-se remover estes sítios, por exemplo, pela substituição ou deleção de resíduos, inserção de resíduos no sítio ou porções truncadas contendo o sítio. Os resíduos inseridos ou substituídos também podem ser aminoácidos alterados, tais como peptidomiméticos ou D-aminoácidos. As variantes de Fc podem ser desejáveis por várias razões, diversas das quais são aqui descritas. As variantes de Fc exemplares incluem moléculas e seqüências em que:

1. Os sítios envolvidos na formação da ligação de dissulfeto são removidos. Tal remoção pode evitar a reação com outras proteínas contendo cisteína presentes na célula hospedeira usadas para produzir as moléculas da invenção. Para este propósito, o segmento contendo cisteína ao término N pode ser truncado ou resíduos de cisteína podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos (por exemplo, alanila, serila). Mesmo quando resíduos de cisteína são removidos, os domínios de cadeia única Fc podem ainda formar um domínio dimérico Fc que é mantido junto não covalentemente.

2. Um Fc nativo é modificado para tomá-lo mais compatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exemplo, pode-se remover a seqüência de PA próxima ao término N de um Fc nativo típico, que pode ser reconhecido por uma enzima digestiva na E. coli tal como prolina iminopeptidase. Pode-se também adicionar um resíduo de metionina de terminal N, especialmente quando a molécula é expressada recombinantemente em uma célula bacteriana tal como a E. coli.

3. Uma porção do término N de um Fc nativo é removida para prevenir a heterogeneidade de terminal N quando expressada em uma célula hospedeira selecionada. Para este propósito, pode-se deletar qualquer um dos

145 primeiros 20 resíduos de aminoácido do término N, particularmente aqueles nas posições 1, 2, 3, 4 e 5.

4. Um ou mais sítios de glicosilação são removidos. Os resíduos que são tipicamente glicosilados (por exemplo, asparagina) podem conferir resposta citolítica. Tais resíduos podem ser deletados ou substituídos com resíduos não glicosilados (por exemplo, alanina).

5. Os sítios envolvidos na interação com complemento, tais como o sítio de ligação Clq, são removidos. Por exemplo, pode-se deletar ou substituir a seqüência EKK de lgGl humana. O recrutamento de complemento pode não ser vantajoso para as moléculas desta invenção e assim pode ser evitado com uma tal variante de Fc.

6. Os sítios são removidos que afetam a ligação aos receptores Fc outros que não um receptor de recuperação. Um Fc nativo pode ter sítios para a interação com certas células brancas do sangue que não são requeridas para as moléculas de fusão da presente invenção e assim podem ser removidos.

7. O sítio ADCC é removido. Os sítios ADCC são conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) com respeito aos sítios ADCC em IgGl. Estes sítios, também, não são requeridos para as moléculas de fusão da presente invenção e assim podem ser removidos.

8. Quando o Fc nativo é derivado de um anticorpo não humano, o Fc nativo pode ser humanizado. Tipicamente, para humanizar um Fc nativo, substituir-se-á resíduos selecionados no Fc nativo não humano com resíduos que são normalmente encontrados no Fc nativo humano. As técnicas para a humanização de anticorpo são bem conhecidas na técnica.

Um veículo alternativo seria uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula pequena (por exemplo, um composto peptidomimético) capazes de ligarem-se a um

146 receptor de recuperação. Por exemplo, usar-se-ia como um veículo um polipeptídeo como descrito na Pat. U.S. N° 5.739.277, concedida em 14 de abril de 1998 concedida a Presta et al. Os peptídeos também podem ser selecionados pela demonstração de fago quanto a ligação ao receptor de recuperação FcRn. Tais compostos de ligação ao receptor de recuperação também são incluídos dentro do significado de “veículo” e estão dentro do escopo desta invenção. Tais veículos devem ser selecionados quanto à meia vida aumentada (por exemplo, evitando-se seqüências reconhecidas pelas proteases) e imunogenicidade diminuída (por exemplo, favorecendo-se seqüências não imunogênicas, como descoberto na humanização de anticorpo).

Variantes, análogos ou derivados da porção Fc podem ser construídos, por exemplo, fabricando-se várias substituições de resíduos ou seqüências.

Os polipeptídeos variantes (ou análogos) incluem variantes de inserção, em que um ou mais resíduos de aminoácido suplementam uma seqüência de aminoácido Fc. As inserções podem estar localizadas em cada um ou ambos os terminais da proteína ou podem estar posicionados dentro de regiões internas da seqüência de aminoácido de Fc. As variantes de inserção, com resíduos adicionais em cada um ou em ambos os terminais, podem incluir por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo etiquetas ou rótulos de aminoácido.

Por exemplo, a molécula de Fc pode opcionalmente conter um terminal N Met, especialmente quando a molécula é expressada recombinantemente em uma célula bacteriana tal como E. coli.

Nas variantes de deleção de Fc, um ou mais resíduos de aminoácido em um polipeptídeo Fc são removidos. As deleções podem ser efetuadas em um ou ambos os terminais do polipeptídeo Fc ou com a remoção de um ou mais resíduos dentro da seqüência de aminoácido Fc. As variantes

147 de deleção, portanto, incluem todos os fragmentos de uma seqüência de polipeptídeo Fc.

Nas variantes de substituição Fc, um ou mais resíduos de aminoácido de um polipeptídeo Fc são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Em um aspecto, as substituições são conservativas por natureza e as substituições conservativas deste tipo são bem conhecidas na técnica. Altemativamente, a invenção abrange substituições que também são não conservativas. As substituições conservativas exemplares são descritas em Lehninger, [Biochemistry, 2^a Edição; Worth Publishers, Inc. Nova Iorque (1975), pp. 71-77] e apresentadas imediatamente abaixo. SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS I

CARACTERÍSTICAS DA CADEIA LATERAL AMINOÁCIDO
Não polar (hidrofóbicas):
A. Alifática	ALI VP
B. Aromática	F W
C. Contendo enxofre	M
D. Limítrofe	G
Polar não carregado:
A. Hidroxila	STY
B. Amidas	NQ
C. Sulfidrila	C
D. Limítrofe	G
Positivamente carregada (básica)	KRH
Negativamente carregada (ácida)	DE
As substituições	conservativas exemplares.
apresentadas imediatamente abaixo.
SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS II
RESÍDUO ORIGINAL	SUBSTITUIÇÃO EXEMPLAR
Ala (A)	Vai, Leu, Ile
Arg(R)	Lys, Gin, Asn
Asn (N)	Gin, His, Lys, Arg
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln(Q)	Asn
Glu (E)	Asp
His (H)	Asn, Gin, Lys, Arg
Ile (I)	Leu, Vai, Met, Ala, Phe,

148

Leu (L)	Ile, Vai, Met, Ala, Phe
Lys(K)	Arg, Gin, Asn
Met (M)	Leu, Phe, Ile
Phe(F)	Leu, Vai, Ile, Ala
Pro (P)	Gly
Ser(S)	Thr
Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr
Tyr(Y)	Trp, Phe, Thr, Ser
Vai (V)	Ile, Leu, Met, Phe, Ala

Por exemplo, os resíduos de cisteína podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para prevenir a formação de algumas ou todas as reticulações de dissulfeto das seqüências de Fc. Cada resíduo de cisteína pode ser removido e/ou substituído com outros aminoácidos, tais como Ala ou Ser. Como um outro exemplo, modificações também podem ser feitas para introduzir substituições de aminoácido para (1) remover o sítio de ligação de receptor de Fc; (2) remover o sítio de ligação de complemento (Clq); e/ou para (3) remover a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Tais sítios são conhecidos na técnica e quaisquer substituições conhecidas estão dentro do escopo de Fc como aqui usado. Por exemplo, ver Molecular Immunology, Vol. 29, N° 5, 633-639 (1992) com respeito aos sítios ADCC na IgGl.

Do mesmo modo, um ou mais resíduos de tirosina podem ser substituídos pelos resíduos de fenilalanina. Além disso, outras inserções, deleções e/ou substituições de aminoácido variante também são consideradas e estão dentro do escopo da presente invenção. As substituições de aminoácido conservativas no geral serão preferidas. Além disso, as alterações podem estar na forma de aminoácidos alterados, tais como peptidomiméticos ou D-aminoácidos.

As seqüências de Fc do composto também podem ser derivatizadas como aqui descrito para peptídeos, isto é, carregando modificações outras que não inserção, deleção ou substituição de resíduos de aminoácido. Preferivelmente, as modificações são covalentes por natureza e incluem por exemplo, ligação química com polímeros, lipídeos, outras

149 porções orgânicas e inorgânicas. Os derivados da invenção podem ser preparados para aumentar a meia vida circulante ou podem ser planejados para melhorar a capacidade alvej adora para o polipeptídeo às células, tecidos ou órgãos desejados.

Também é possível usar o domínio de ligação do receptor de recuperação da molécula de Fc intacta como a parte Fc de um composto da invenção, tal como descrito na WO 96/32478, intitulada “Altered Polypeptides with Increased Half-lives.” Os membros adicionais da classe de moléculas designadas como Fc aqui são aquelas que são descritos na WO 97/34631, intitulada “Immunoglobulin-Like Domains with Increased HalfLives.” Ambos os pedidos PCT publicados citados neste parágrafo são aqui incorporados por referência.

Componentes WSP

Os compostos da invenção podem incluir ainda pelo menos um WSP. A porção WPS da molécula pode ser ramificada ou não ramificada. Para o uso terapêutico da preparação de produto final, o polímero é farmaceuticamente aceitável. No geral, um polímero desejado é selecionado com base em considerações tais como se o conjugado polimérico será usado terapeuticamente e se assim, a dosagem desejada, tempo de circulação, resistência à proteólise e outras considerações. Em vários aspectos, o peso molecular médio de cada polímero solúvel em água está entre cerca de 2 kDa e cerca de 100 kDa, entre cerca de 5 kDa e cerca de 50 kDa, entre cerca de 12 kDa e cerca de 40 kDa e entre cerca de 20 kDa e cerca de 35 kDa. Ainda em um outro aspecto o peso molecular de cada polímero está entre cerca de 6 kDa e cerca de 25 kDa. O termo “cerca de” como aqui usado e do começo ao fim, indica que em preparações de um polímero solúvel em água, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que o peso molecular estabelecido. No geral, quanto mais alto o peso molecular ou quanto mais ramificações, mais alta a razão de polímero/proteína. Outros tamanhos podem

150 ser usados, dependendo do perfil terapêutico desejado incluindo por exemplo, a duração da liberação prolongada; os efeitos, se algum, sobre a atividade biológica; a facilidade no manuseio; o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos de um polímero solúvel em água on uma proteína terapêutica.

O WSP deve ser ligado a um polipeptídeo ou peptídeo com consideração dada aos efeitos sobre os domínios funcionais ou antigênicos do polipeptídeo ou peptídeo. No geral, a derivatização química pode ser realizada sob qualquer condição adequada usada para reagir uma proteína com uma molécula polimérica ativada. Os grupos ativadores que podem ser usados para ligar o polímero solúvel em água a uma ou mais proteínas incluem sem limitação sulfona, maleimida, sulfidrila, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano e 5-piridila. Se ligados ao peptídeo pela alquilação redutiva, os polímeros selecionados devem ter um único aldeído reativo de modo que o grau de polimerização seja controlado.

Os polímeros solúveis em água, clinicamente aceitáveis, adequados incluem sem limitação, PEG, polietileno glicol propionaldeído, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, monometóxi-polietileno glicol, carboximetilcelulose, poliacetais, álcool polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona, poli-l,3-dioxolano, poli-1,3,6- trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poli (beta-aminoácidos) (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol (PPG) e outros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (POG) (por exemplo, glicerol) e outros polióis polioxietilados, sorbitol polioxietilado ou glicose polioxietilada, ácidos colônicos ou outros polímeros de carboidrato, Ficoll ou dextrano e misturas destes.

Os polímeros solúveis em água também podem ser fabricados para serem termicamente sensíveis, como na formação de géis térmicos

151 reversos. Os exemplos incluem Tetronics, com cadeias principais armadas em tetra e copolímeros de PEG-PLGA. A hidrofilicidade de polímeros pode ser variada substituindo-se as porções hidrofóbicas na cadeia polimérica. Um exemplo disto está na fabricação de PLGA, em que a razão de ácido láctico para ácido glicólico pode ser aumentada para permitir a solubilidade em água mais baixa. Os polímeros solúveis em água inferiores podem ser desejados em certas aplicações, por exemplo no aumento do potencial para interagir com membranas celulares. Na reconstituição, uma razão apropriada de fosfolipídeos pode ser usada para induzir a formação de micelas ou lipossomas em solução. A vantagem de um tal sistema pode estar na capacidade para incorporar um pouco da proteína dentro da micela, com o benefício potencial de prolongar a liberação. Os fosfolipídeos capazes de formar lipossomas ou micelas incluem DMPG, DMPC, DOPC, DOPG e componentes reforçadores de lipossoma secundário apropriados tais como colesterol. Certos excipientes, tais como DEA olet-10 fosfato e olet 10fosfato, são capazes de formar micelas em solução.

Os polímeros de polissacarídeo são um outro tipo de polímero solúvel em água que pode ser usado para a modificação de proteína ou peptídeo. A modificação de proteínas ou peptídeos pela adição de polissacarídeo(s), por exemplo, glicosilação, pode aumentar a meia vida, diminuir a antigenicidade, aumentar a estabilidade e diminuir a proteólise. Dextranos são polímeros de polissacarídeo compreendidos de subunidades individuais de glicose predominantemente ligadas pelas ligações otl-6. O próprio dextrano está disponível em muitas faixas de peso molecular e é facilmente disponível em pesos moleculares de cerca de 1 kD a cerca de 70 kD. O dextrano é um polímero solúvel em água adequado para o uso na presente invenção como um veículo por si só ou em combinação com um outro veículo (por exemplo, Fc). Ver, por exemplo, WO 96/11953 e WO 96/05309. O uso de dextrano conjugado a imunoglobulinas terapêuticas ou de

152 diagnóstico tem sido relatado; ver, por exemplo, Publicação de Patente Européia N² 0 315 456, que é aqui incorporada por referência. O dextrano de cerca de 1 kD a cerca de 20 kD é preferido quando dextrano é usado como um veículo de acordo com a presente invenção.

Em uma forma de realização, o WSP é PEG e a invenção considera preparações em que um composto é modificado para incluir qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como e sem limitação mono-alcóxi (Cl-CIO) ou arilóxipolietileno glicol. O polietileno glicol propionaldeído pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água. O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio de PEG considerado para o uso na invenção varia de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Em um outro aspecto, a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 6 kDa a cerca de 25 kDa. Os grupos PEG no geral são ligados aos peptídeos ou proteínas por intermédio da acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo na porção de PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reativo no peptídeo ou proteína alvos (por exemplo, um grupo aldeído, amino ou éster). Usando métodos aqui descritos, uma mistura de moléculas conjugadas de polímero/peptídeo pode ser preparada e a vantagem aqui fornecida é a capacidade para selecionar a proporção de conjugado de polímero/peptídeo para incluir na mistura. Assim, se desejado, uma mistura de peptídeos com vários números de porções poliméricas ligadas (isto é, zero, uma ou duas) pode ser preparada com uma proporção pré determinada de conjugado de polímero/proteína.

Uma estratégia útil para a PEGuilação (outros métodos são debatidos aqui em mais detalhes) de peptídeos sintéticos consiste de combinar, através da formação de uma ligação conjugada em solução, um

153 peptídeo e uma porção de PEG, cada uma carregando uma funcionalidade especial que é mutuamente reativa contra a outra. Os peptídeos podem ser facilmente preparados com a síntese de fase sólida convencional. Os peptídeos são “pré ativados” com um grupo funcional apropriado em um sítio específico. Os precursores são purificados e totalmente caracterizados antes de reagir com a porção de PEG. A ligação do peptídeo com PEG usualmente ocorre em fase aquosa e pode ser facilmente monitorada pela HPLC analítica de fase reversa. Os peptídeos PEGuilados podem ser facilmente purificados pela HPLC preparativa e caracterizados pela HPLC analítica, análise de aminoácido e espectrometria de dessorção a laser.

Ligadores

Qualquer grupo “ligador” é opcional, seja posicionado entre peptídeos, peptídeo e veículo ou veículo e WSP. Quando presente, a sua estrutura química não é crítica, visto que o mesmo serve primariamente como um espaçador. O ligador é preferivelmente fabricado de aminoácidos ligados juntos pelas ligações de peptídeo. Assim, nas formas de realização preferidas, o ligador é fabricado de 1 a 20 aminoácidos ligados pelas ligações de peptídeo, em que os aminoácidos são selecionados dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente. Alguns destes aminoácidos podem ser glicosilados, como é bem entendido por aqueles na técnica. Em uma forma de realização mais preferida, o 1 a 20 aminoácidos são selecionados de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Ainda mais preferivelmente, um ligador é fabricado de uma maioria de aminoácidos que não são estericamente impedidos, tais como glicina e alanina. Assim, os ligadores preferidos são poliglicinas (particularmente (Gly)4, (Gly)5, (Gly)8, poli(Gly-Ala) e polialaninas. Outros exemplos específicos de ligadores são:

(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 1018);

(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 1019);

(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 1020); e

154

GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 1021).

Para explicar a nomenclatura acima, por exemplo, (Gly)3Lys(Gly)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Combinações de Gly e Ala também são preferidas. Os ligadores aqui mostrados são exemplares; ligadores dentro do escopo desta invenção podem ser muito mais longos e podem incluir outros resíduos.

Ligadores não peptídicos também são possíveis. Por exemplo, ligadores de alquila tais como -NH(CH₂)s-C(O)-, em que s = 2 a 20 podem ser usados. Estes ligadores de alquila podem ser ainda substituídos por qualquer grupo não estericamente impedido tais como alquila inferior (por exemplo, C1-C6) acila inferior, halogênio (por exemplo, Cl, Br), CN, NH₂, fenila, etc. Um ligador não peptídico exemplar é um ligador de PEG,

em que n é tal que o ligador tenha um peso molecular de 100 a 5000 kD, preferivelmente de 100 a 500 kD. Os ligadores de peptídeo podem ser alterados para formar derivados da mesma maneira como descrito acima. Produção de polipeptídeo e Peptídeo

Um peptídeo tendo sido identificado pode ser fabricado em células hospedeiras transformadas usando técnicas de DNA recombinantes. Se o componente de veículo é um polipeptídeo, o produto de fusão do polipeptídeo ou peptídeo-veículo pode ser expressado como um. Para assim fazê-lo, uma molécula de DNA recombinante que codifica o peptídeo é primeiro preparada usando métodos bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as seqüências que codificam os peptídeos podem ser excisadas do DNA usando enzimas de restrição adequadas. Altemativamente, a molécula de DNA pode ser sintetizada usando técnicas de síntese química, tais como o método do fosforamidato. Também, uma combinação destas técnicas pode ser

155 usada. A invenção portanto fornece polinucleotídeos que codificam um composto da invenção.

A invenção também fornece vetores que codificam compostos da invenção em um hospedeiro apropriado. O vetor compreende o polinucleotídeo que codifica o composto operativamente ligado às seqüências de controle de expressão apropriadas. Os métodos de efetuar esta ligação operativa, antes ou depois que o polinucleotídeo seja inserido no vetor, são bem conhecidos. As seqüências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, realçadores, operadores, sítios de ligação de ribossoma, sinais de início, sinais de parada, sinais de encapuzamento, sinais de poliadenilação e outros sinais envolvidos com o controle de transcrição ou tradução.

O vetor resultante tendo o polinucleotídeo nele é usado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na técnica.

Qualquer uma de um grande número de células hospedeiras disponíveis e bem conhecidas pode ser usada na prática desta invenção. A seleção de um hospedeiro particular é dependente de vários fatores reconhecidos pela técnica. Estes incluem, por exemplo, a compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, a toxicidade dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, taxa de transformação, facilidade de recuperação dos peptídeos, características de expressão, bio-segurança e custos. Um equilíbrio destes fatores deve ser encontrado com o entendimento de que nem todos os hospedeiros podem ser igualmente eficazes para a expressão de uma seqüência de DNA particular. Dentro destas diretrizes gerais, os hospedeiros microbianos úteis incluem bactérias (tais como E. coli), levedura (tais como Saccharomyces) e outras células de fungos, insetos, plantas, mamíferos (incluindo o ser humano) em cultura ou outros hospedeiros conhecidos na técnica.

Em seguida, o hospedeiro transformado é cultivado e

156 purificado. As células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições de fermentação convencionais de modo que os compostos desejados sejam expressados. Tais condições de fermentação são bem conhecidas na técnica.

Finalmente, os peptídeos são purificados a partir da cultura pelos métodos bem conhecidos na técnica.

Dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar um composto da invenção, grupos de carboidrato (oligossacarídeo) podem ser convenientemente ligados aos sítios que são conhecidos serem sítios de glicosilação em proteínas. No geral, os oligossacarídeos ligados em O são ligados aos resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto que os oligossacarídeos ligados em N são ligados aos resíduos de asparagina (Asn) quando eles são parte da seqüência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos que ocorrem naturalmente não contando prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é habitualmente encontrado em ambas é o ácido N-acetilneuramínico (aludido como ácido siálico). O ácido siálico é usualmente o resíduo terminal dos oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em O e, em virtude da sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas ao composto glicosilado. Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporado(s) no ligador dos compostos desta invenção e são preferivelmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos de polipeptídeo (por exemplo, em células de mamífero tais como CHO, BHK, COS). Entretanto, tais sítios podem ser ainda glicosilados pelos procedimentos sintéticos ou semi-sintéticos conhecidos na técnica.

Altemativamente, os compostos podem ser fabricados pelos métodos sintéticos. Por exemplo, as técnicas de síntese de fase sólida podem ser usadas. As técnicas adequadas são bem conhecidas no ramo e incluem aquelas descritas em Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61

157 (Katsoyannis e Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart e Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Pat. U.S. N“ 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3^a ed.) 2: 105-253; e Erickson et al. (1976), The Proteins (3^a ed.) 2: 257-527. A síntese de fase sólida é a técnica preferida de fabricar peptídeos individuais visto que é o método mais eficaz em custo de fabricar peptídeos pequenos.

Os compostos que contêm peptídeos derivatizados ou que contêm grupos não peptídicos são particularmente passíveis de sintetizar pelas técnicas da química orgânica bem conhecidas.

Modificação de WSP

Para a obtenção de um composto covalentemente ligado a um WSP, qualquer método aqui descrito ou de outro modo conhecido na técnica é utilizado. Os métodos para preparar derivados químicos de polipeptídeos ou peptídeos no geral compreenderão as etapas de (a) reagir o peptídeo com a molécula de polímero ativada (tal como um éster reativo ou aldeído derivado da molécula polimérica) sob condições por meio das quais o polipeptídeo toma-se ligado a uma ou mais moléculas poliméricas e (b) obter o(s) produto(s) de reação. As condições de reação ótimas serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e nos resultados desejados. Por exemplo, quanto maior a razão das moléculas de polímero :proteína, maior a porcentagem de moléculas de polímero ligadas.

Uma molécula biologicamente ativa pode ser ligada a um polímero através de qualquer grupo funcional disponível usando métodos padrão bem conhecidos na técnica. Os exemplos de grupos funcionais na molécula polimérica ou biologicamente ativa que podem ser usados para formar tais ligações incluem grupos amina e carbóxi, grupos tiol tais como em resíduos de cisteína, aldeídos e cetonas e grupos hidróxi como podem ser encontrados em resíduos de serina, treonina, tirosina, hidroxiprolina e

158 hidroxilisina.

O polímero pode ser ativado pela ligação de um grupo reativo tal como tricloro-estriazina [Abuchowski, et al., (1977), J. Biol. Chem. 252: 3582-3586, aqui incorporada por referência em sua totalidade], carbonilimidazol [Beauchamp, et al., (1983), Anal. Biochem. 131: 25-33, aqui incorporada por referência em sua totalidade] ou succinato de succinimidila [Abuchowski, et al., (1984), Câncer Biochem. Biophys. 7: 175-186, aqui incorporada por referência em sua totalidade] de modo a reagir com uma funcionalidade de amina na molécula biologicamente ativa. Um outro método de ligação envolve a formação de um grupo glioxilila em uma molécula e um grupo aminoóxi, hidrazida ou semicarbazida na outra molécula a ser conjugada [Fields e Dixon, (1968), Biochem. J. 108: 883-887; Gaertner, et al., (1992), Bioconjugate Chem. 3: 262-268; Geoghegan e Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138146; Gaertner, et al., (1994), J. Biol. Chem. 269:

7224-7230, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade]. Outros métodos envolvem a formação de um éster ativo em um grupo de álcool livre da primeira molécula a ser conjugada usando cloroformiato ou carbonato de dissuccinimidila, que podem ser depois conjugados a um grupo amina na outra molécula a ser ligada [Veronese, et al., (1985), Biochem. e Biotech. 11: 141-152; Nitecki, et al., Patente U.S. N^s

5.089.261; Nitecki, Patente U.S. N^s 5.281.698, cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade]. Outros grupos reativos que podem ser ligados por intermédio dos grupos de álcool livres são apresentados em Wright, EP 0539167A2 (aqui incorporada por referência em sua totalidade), que também descreve o uso de imidatos para a ligação por intermédio de grupos de amina livres.

Uma outra química envolve a acilação das aminas primárias de um alvo usando o NHS-éster de metóxi-PEG (O-[(Nsuccinimidiloxicarbonil)-metil]-O’-metilpolietileno glicol). A acilação com

159 metóxi-PEG-NHS resulta em uma ligação de amida que eliminará a carga da amina primária original. Outros métodos utilizam a oxidação branda de um alvo sob condições selecionadas para alvejar o diol pendente da penúltima unidade de glicosila do ácido siálico para a oxidação a um aldeído. O glicoaldeído resultante foi depois reagido com um metóxi-PEG-hidrazida (O(Hidrazinocarbonilmetil)-O’metil-polietileno glicol) para formar uma hidrazona semi-estável entre PEG e o alvo. A hidrazona é subseqüentemente reduzida pelo cianoboroidreto de sódio para produzir um conjugado de PEG estável. Ver por exemplo, a Patente U.S. N² 6.586.398 (Kinstler, et al., 1 de julho de 2003), aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Em aplicações específicas de técnicas para a modificação química, por exemplo, a Patente U.S. N² 4.002.531 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) estabelece que a alquilação redutiva foi usada para a ligação de moléculas de polietileno glicol a uma enzima. A Patente U.S. N² 4.179.337 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) divulga PEG: conjugados de proteína que envolvem, por exemplo, enzimas e insulina. A Patente U.S. N² 4.904.584 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) divulga a modificação do número de resíduos de lisina em proteínas para a ligação de moléculas de polietileno glicol por intermédio de grupos amina reativos. A Patente U.S. N² 5.834.594 (aqui incorporada por referência em sua totalidade) divulga conjugados de PEG:proteína solúveis em água substancialmente não imunogênicos, envolvendo por exemplo, as proteínas IL-2, interferon alfa e IL-lra. Os métodos de Hakimi et al. envolvem a utilização de ligadores únicos para conectar os vários grupos amino livre na proteína a PEG. As Patentes U.S. N^os 5.824.784 e 5.985.265 (cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade) divulgam métodos que permitem proteínas quimicamente modificadas seletivamente de terminal N e análogos destas, incluindo G-CSF e interferon de consenso. De maneira importante, estas proteínas modificadas têm

160 vantagens com respeito à estabilidade da proteína, assim como fornecendo vantagens de processamento.

A modificação de WSP também é descrita em Francis et al., Em: Stability of protein pharmaceutics: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahem., T. e Manning, M. C.) Plenum,

N. Y., 1991 (aqui incorporada por referência em sua totalidade), é usada. Ainda em um outro aspecto, o método descrito em Delgado et al., “Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Clhoride, Applications In Immunoaffmity Cell Preparation”, Em: Fisher et al., eds., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y., N.Y., 1989 pp. 211-213 (aqui incorporada por referência em sua totalidade), que envolve o uso de cloreto de tresila, que resulta em nenhum grupo de ligação entre a porção WSP e a porção de polipeptídeo. Em outros aspectos, a ligação de um WSP é efetuada através do uso de ésteres de N-hidróxi succinimidila de carboximetil metóxi polietileno glicol, como bem conhecido na técnica.

Para outras descrições de modificação de um alvo com um WSP, ver, por exemplo, o pedido de patente U.S. N° 20030096400; EP 0 442724A2; EP 0154316; EP 0401384; WO 94/13322; Patentes U.S. N5.362.852, 5.089.261, 5.281.698, 6.423.685, 6.635.646, 6.433.135, Pedido Internacional WO 90/07938; Gaertner e Offord, (1996), Bioconjugate Chem. 7: 38-44; Greenwald et al., Crit Rev Therap Drug Carrier Syst. 2000; 17: 101161; Kopecek et al., J Controlled Release., 74: 147-158, 2001; Harris et al., Clin Pharmacokinet. 2001; 40(7): 539-51; Zalipsky et al., Bioconjug Chem. 1997;8: 111-118; Nathan et al., Macromolecules. 1992; 25: 4476-4484; Nathan et al., Bioconj Chem. 1993; 4: 5462; e Francis et al., Focus on Growth Factors, 3: 4-10 (1992), as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Alquilação redutiva

161

Em um aspecto, a ligação covalente de um WSP é realizada pelos procedimentos de modificação química pela alquilação redutiva como aqui fornecida para modificar seletivamente o grupo ct-amino de terminal N e testando o produto resultante quanto a característica biológica desejada, tal como os ensaios de atividade biológica aqui fornecidos.

A alquilação redutiva para a ligação de um WSP a uma proteína ou peptídeo explora a reatividade diferencial de tipos diferentes de grupos amino primário (por exemplo, lisina versus o terminal N) disponível para a derivatização em uma proteína particular. Sob as condições de reação apropriadas, a derivatização substancialmente seletiva da proteína ao término N com um polímero contendo grupo carbonila é obtida.

Para a alquilação redutiva, o(s) polímero(s) selecionado(s) podem ter um único grupo aldeído reativo. Um aldeído reativo é, por exemplo, propionaldeído de polietileno glicol, que é estável em água ou mono alcóxi Ci-Cio ou derivados de arilóxi destes (ver a Patente U.S. N² 5.252.714, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Em um método, a alquilação redutiva é utilizada para conjugar um PEG-aldeído (O-(3oxopropil)-O’-metilpolietileno glicol) a uma amina primária. Sob condições apropriadas, este método foi demonstrado produzir conjugados de PEG predominantemente modificados através da ot-amina no término N da proteína.

Uma funcionalidade de aldeído útil para conjugar a molécula biologicamente ativa pode ser gerada a partir de uma funcionalidade tendo grupos amino e álcool adjacentes. Em um polipeptídeo, por exemplo, uma serina, treonina ou hidroxilisina de terminal N pode ser usada para gerar uma funcionalidade de aldeído por intermédio da divagem oxidativa sob condições brandas usando periodato. Estes resíduos ou seus equivalentes, podem estar normalmente presentes, por exemplo no término N de um polipeptídeo, podem ser expostos por intermédio da digestão química ou

162 enzimática ou podem ser introduzidos por intermédio de métodos recombinantes ou químicos. As condições de reação para gerar o aldeído tipicamente envolve a adição de um excesso molar de meta periodato de sódio e sob condições brandas para evitar a oxidação em outras posições na proteína. O pH é preferivelmente de cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de um excesso molar de 1,5 vezes de meta periodato de sódio, seguida pela incubação por 10 minutos na temperatura ambiente no escuro.

O grupo funcional de aldeído pode ser ligado a um polímero ativado contendo uma funcionalidade hidrazida ou semicarbazida para formar uma ligação de hidrazona ou semicarbazona. Os polímeros contendo hidrazina são comercialmente disponíveis e podem ser sintetizados, se necessário, usando técnicas padrão. As PEG hidrazidas para o uso na invenção podem ser obtidas da Shearwater Polymers, Inc., 2307 Spring Branch Road, Huntsville, Ala. 35801 (agora parte da Nektar Therapeutics, 150 Industrial Road, San Carlos, CA 94070-6256). O aldeído é ligado ao polímero misturando-se a solução dos dois componentes juntos e aquecendo a cerca de 37° C até que a reação esteja substancialmente completa. Um excesso da hidrazida polimérica é tipicamente usada para aumentar a quantidade de conjugado obtido. Um tempo de reação típico é de 26 horas. Dependendo da estabilidade térmica dos reagentes, a temperatura e o tempo de reação podem ser alterados para fornecer resultados adequados. A determinação detalhada de condições de reação tanto para a oxidação quanto para a ligação é apresentada em Geoghegan e Stroh, (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138-146 e em Geoghegan, Patente U.S. N° 5.362.852, cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Usando a alquilação redutiva, o agente de redução deve ser estável em solução aquosa e preferivelmente ser capaz de reduzir apenas a base de Schiff formada no processo inicial de alquilação redutiva. Os agentes redutores são selecionados de e sem limitação, boroidreto de sódio,

163 cianoboroidreto de sódio, borato de dimetilamina, borato de trimetilamina e borato de piridina.

O pH da reação afeta a razão de polímero para proteína a ser usada. No geral, se o pH da reação é mais baixo do que o pK_a de um grupo reativo alvo, um excesso grande de polímero para proteína será desejado. Se o pH é mais alto do que o pK_a alvo, a razão de polímero:proteína não precisa ser tão grande (isto é, mais grupos reativos estão disponíveis, de modo que menos moléculas de polímero são necessárias).

Conseqüentemente, a reação é realizada em um aspecto em um pH que permite que se tire vantagem das diferenças de pKa entre os grupos εamino dos resíduos de lisina e aquele do grupo α-amino do resíduo de terminal N da proteína. Por tal derivatização seletiva, a ligação de um polímero solúvel em água a uma proteína é controlada; a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no término N da proteína e nenhuma modificação significante de outros grupos reativos, tais como os grupos amino da cadeia lateral de lisina, ocorra.

Em um aspecto, portanto, métodos são fornecidos para a ligação covalente de um WSP a um composto alvo e que fornecem uma preparação substancialmente homogênea de conjugado de moléculas WSP/proteína, na ausência de outra purificação extensiva como é requerido usando outras químicas de modificação química. Mais especificamente, se polietileno glicol é usado, os métodos descritos permitem a produção de uma proteína carecendo possivelmente de grupos de ligação antigênica, isto é, a porção de polietileno glicol é diretamente ligada à porção de proteína sem subprodutos potencialmente tóxicos.

Dependendo do método de ligação de WSP escolhido, a proporção de moléculas de WSP ligada ao peptídeo ou molécula de proteína alvos variará, como as suas concentrações na mistura de reação. No geral, a razão ótima (em termos de eficiência de reação em que não existe nenhum

164 excesso de proteína ou polímero não reagidos) é determinada pelo peso molecular do WSP selecionado. Além disso, quando do uso de métodos que envolvam ligação não específica e posteriormente purificação de uma espécie desejada, a razão pode depender do número de grupos reativos (tipicamente grupos amino) disponíveis.

Purificação

O método de obtenção de uma preparação modificada por WSP substancialmente homogênea é, em um aspecto, pela purificação de uma espécie predominantemente única de composto modificado de uma mistura de espécie. Por via de exemplo, uma espécie substancialmente homogênea é primeiro separada pela cromatografia de troca iônica para se obter material tendo uma característica de carga de uma espécie única (embora outras espécies tendo a mesma carga aparente possam estar presentes) e depois a espécie desejada é separada usando a cromatografia de exclusão de tamanho. Outros métodos são relatados e considerados pela invenção, incluindo por exemplo, a PCT WO 90/04606, publicada em 3 de maio de 1990, que descreve um processo para o fracionamento de uma mistura de adutos de PEG-proteína que compreendem dividir os adutos de PEG/proteína em um sistema bifásico aquoso contendo PEG.

Assim, um aspecto da presente invenção é um método para preparar um conjugado de composto modificado por WSP compreendido de (a) reagir um composto tendo mais do que um grupo amino com uma porção de polímero solúvel em água sob condições de alquilação redutiva, em um pH adequado para ativar seletivamente o grupo α-amino no terminal amino da porção de proteína de modo que o dito polímero solúvel em água seletivamente se ligue ao dito grupo ct-amino; e (b) obter o produto de reação. Opcional e particularmente para um produto terapêutico, os produtos de reação são separados das porções não reagidas.

Como averiguado pelo mapeamento de peptídeo e

165 seqüenciamento de terminal N, uma preparação é fornecida que compreende pelo menos 50 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido. Em outras formas de realização, as preparações são fornecidas compreendendo pelo menos 75 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido; pelo menos 85 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido; pelo menos 90 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido; pelo menos 95 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido; e pelo menos 99 % de peptídeo PEGuilado em uma mistura de peptídeo PEGuilado e peptídeo não reagido.

Os seguintes exemplos não são intencionados a serem limitantes mas apenas exemplares de formas de realização específicas da invenção.

Exemplo 1

Montagem de Construção de Expressão de mFc-TMP

Um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de TMP que compreende uma região Fc de murino (mFc-TMP) foi construída combinando-se seqüências de nucleotídeo que codificam individualmente Fc de murino e um TMP (descrito na EP01124961A2). Na primeira rodada de PCR, o componente que codifica Fc de murino foi amplificado com iniciadores de PCR 3155-58 (SEQ ID NO: 1022) e 1388-00 (SEQ ID NO:

1023) .

3155-58: CCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTATCGA (SEQ ID NO:

1024)

3155-59: CCACCTCCACCTTTACCCGGAGAGTGGGAG (SEQ ID NO:

1025)

Em uma reação separada, um polinucleotídeo que codifica TMP foi amplificado com os iniciadores 1209-85 (SEQ ID NO: 1026) e 3155166 (SEQ IDNO: 1027).

1209-85: CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (SEQ ID NO: 1028) 1388-00: CTAGTTATTGCTCAGCGG (SEQ ID NO: 1029)

Os fragmentos de PCR resultantes foram purificados em gel e combinados em um único tubo para uma segunda rodada de PCR com os iniciadores 1209-85 (SEQ ID NO: 1030) e 1388-00 (SEQ ID NO: 1031). O produto de PCR desta segunda rodada de amplificação foi purificada em gel e digerida com enzimas de restrição Ndel e Xhol. O fragmento de digestão foi purificado e ligado no vetor pAMG21, previamente digerido com as mesmas enzimas. Esta mistura de ligação foi transformada por intermédio da eletroporação na E. coli e plaqueada em meios de LB + Canamicina. As colônias foram triadas por intermédio da PCR e seqüenciamento de DNA. Um clone positivo com uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1032) que codifica a proteína de fusão mFc-TMP (SEQ ID NO: 1033) foi identificada e designada 6397.

O polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão Fc-TMP de murino (SEQ ID NO: 1034)

167

1	GATTTGATTC	TAGATTTGTT	TTAACTAATT	AAAGGAGGAA	taacat
RP Aberta ATGGTCGACGGTTG	TAAGCCATGC	ATTTGTACAG	TCCCAGAAGT	ATCATCTGTC
101	TTCATCTTCC	CCCCAAAGCC	CAAGGATGTG	CTCACCATTA	CTCTGACTCC
151	TAAGGTCACG	TGTGTTGTGG	TAGACATCAG	CAAGGATC-AT	CCCGAGGTCC
201	AGTTCAGCTG	GTTTGTAGAT	GATGTGGAGG	TGCACACAGC	TCAGACGCAA
251	CCCCGGGAGG	AGCAGTTCAA	cagcactttc	CGCTCAGTCA	GTGAACTTCC
301	CATGATGCAC	CAGGACTGGC	TCAATGGCAA	GGAGTTCAAA	TGCAGGGTCA
351	ACAGTGCAGC	TTTCCCTGCC	CCCATCGAGA	AAACCATCTC	CAAAACCAAA
401	GGCAGACCGA	AGGCTCCACA	GGTGTACACC	ATTCCACCTC	CCAAGGAGCA
451	GATGGCCAAG	GATAAAGTCA	CTCTCACCTG	CATGATAACA	GACTTCTTCC
501	CTGAAGACAT	tactgtggag	TGGCAOTGGA	ATGGGCAGCC	AGCGGAGAAC
551	TACAAGAACA	ctçagcccat	CATGGACACA	GATGGCTCTT	ACTTCGTCTA
601	CAGCAAGCTC	aatgtgcaga	agagcaactg	GGAGGCAGGA	ÂATACTTTCA
651	CCTGCTCTGT	GTTACATGAG	GGCCTGCACA	ACCACCATAC	TGAGAAGAGC
701	CTCTCCCACT	CTCCGGGTAA	AGGTGGAOGT	ÔGTGGTATCG	AAGGTCCGAC
751	TCTGCGTCAG	TGGCTGGCTG	CTCGTGCTGG	TGGTGGAGGT	GGCGGCGGAG
801	GTATTGAGGG	CCCAACCCTT	CGCCAATGGC	TTGCAGCÃCG	CGCATAA
	Seqüência 3	5 .

TCTCGAGGATCCG CGGAAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAAGCCCG AAAGG

A seqüência de proteína Fc-TMP de murino (SEQ ID NO

1035)

168 l MVDGCKPCIC TVPEVSSVFI FFPKPKDVVF 2TLTPKVTCV WDISKDDPE

VQFSWFVOTV EVMTAQTQPR gEQFNSTFRS VSELPIHHQü WLNGKEFKCR

101 VNSAAFPAPI EKTISKTXGR PKAPQVYTIP PPX2QMAKDK VSLTCMlTOF

151 FPED1TVEWQ WNGQPAENYX NTQPIMDTDG SYFVYSXENV QKSNWEAGNT

201 FTCSVLFiEGL HXHHTEKSLS HSPGKGGGGG IBGPTtRQWI» AARAGGGGGG

251 GGÍEGPTLRQ WLAARA*

Exemplo 2

Fermentação da Cepa 6397

A fermentação da cepa 6397 foi iniciada pela inoculação de 500 ml de caldo de Luria esterilizado com uma cultura de semente da cepa em um frasco agitado. Quando a densidade de célula atingiu 0,9 a 600 nm, os conteúdos foram usados para inocular um fermentador de 15 L contendo 10 L de meio de crescimento com base no complexo (800 g de glicerol, 500 g de tripticase, 3 g de citrato de sódio, 40 g de KH₂PO₄, 20 g de (NH^SC^, 5 ml de anti-espumante Fluka P-2000, 10 ml de metais traço (cloreto férrico 27,0 g/L, cloreto de zinco 2,00 g/L, cloreto de cobalto 2,00 g/L, molibdato de sódio 2,00 g/L, cloreto de cálcio 1,00 g/L, sulfato cúprico 1,90 g/L, ácido bórico 0,50 g/L, cloreto de manganês 1,60 g/L, citrato de sódio diidratado 73,5 g/L), 10 ml de vitaminas (biotina 0,060 g/L, ácido fólico 0,040 g/L, riboflavina 0,42 g/L, piridoxina HC1 1,40 g/L, niacina 6,10 g/L, ácido pantotênico 5,40 g/L, hidróxido de sódio 5,30 ml/L), adicionar água para levar a 10 L). O fermentador foi mantido a 37° C e pH 7 com os níveis de oxigênio dissolvido mantidos a um mínimo de 30 % de saturação. Quando a densidade de célula atingiu 13,1 unidades OD a 600 nm, a cultura foi induzida pela adição de 10 ml de 0,5 mg/ml de N-(3-oxo-hexanoil) homosserina lactona. Em 6 horas após a indução, o caldo foi esfriado a 10° C e as células foram colhidas pela centrifugação a 4550g por 60 min a 5° C. A pasta de célula foi depois armazenada a -80° C.

169

Exemplo 3 Redobra da Proteína

A pasta de E. coli (300 g) da cepa 6397 que expressa mFcTMP foi dissolvida em 2250 ml de tampão de lise (50 mM de Tris HCI, 5 mM de EDTA, pH 8,0) e passada através de um microfluidizador gelado duas vezes a 13.000 PSI (89,6 MPa). O homogeneizado foi depois centrifugado a 11.300g por 60 minutos a 4° C. O sobrenadante foi descartado e a pelota foi recolocada em suspensão em 2400 ml de água usando um triturador de tecido. O homogeneizado foi depois centrifugado a 11.300g por 60 minutos a 4° C. O sobrenandante foi descartado e a pelota foi recolocada em suspensão em 200 ml volumes de água usando um triturador de tecido. O homogeneizado foi centrifugado a 27.200g por 30 minutos a 4° C e o sobrenandante foi descartado. Cerca de 12,5 % da pelota foi recolocada em suspensão em 28 ml de Tris HCI a 20 mM, pH 8,0, com 35 mg de lisozima da clara de ovo de galinha (Sigma, St Louis, MO) usando um triturador de tecido e incubados a 37° C por 20 min. A seguir da incubação, a suspensão foi centrifugada a 27.200g por 30 minutos a 22° Ceo sobrenandante foi descartado. A pelota foi recolocada em suspensão em 35 ml de guanidina HCI a 8 M,50 mM de Tris HCI, pH 8,0, depois que 350 μΐ de DTT a 1 M (Sigma, St Louis, MO) foram adicionados e o material foi incubado a 37° C por 30 minutos. A solução foi depois centrifugada a 27.200g por 30 minutos a 22° C. O sobrenandante foi depois transferido para 3,5 L de tampão de redobra (50 mM de Tris base, 160 mM de arginina HCI, 3 M de uréia, 20 % de glicerol, pH

9,5, 1 mM de cisteína, 1 mM de cistamina HO) a 1 ml/min com agitação suave a 4° C.

Exemplo 4

Purificação da Construção

Depois de cerca de 40 horas de incubação a 4° C com agitação suave, a solução de redobra descrita no Exemplo 3 foi concentrada a 500 μΐ

170 usando um aparelho de ultrafiltração de fluxo tangencial com um cartucho de 30 kDa (Satorius, Goettingen, Alemanha) seguido pela diafiltração contra 3 L de Q-Tampão A (20 mM de Tris HCI, pH 8,0). O material concentrados foi filtrado através de um filtro Whatman GF/A e carregado em uma coluna de fluxo rápido Q-Sepharose de 86 ml (2,6 cm Dl) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a 15 ml/min. Depois de lavar a resina com vários volumes da coluna de Q-Tampão A, a proteína foi eluída usando um gradiente linear de volume da coluna de 20 a 60 % de Q-Tampão B (20 mM de Tris HCI, 1 M de NaCI, pH 8,0) a 10 ml/min. As frações de pico foram reunidas e a reunião foi passada através de um filtro de seringa Mustang E (Pall Corporation, East Hills, NY) a 1 ml/min. O material filtrado foi filtrado uma segunda vez através de um filtro de acetato de celulose a 0,22 pm e armazenado a -80° C. Exemplo 5

PEGuilação de Proteína

A uma solução esfriada (4° C), agitada de mFc-TMP (3,5 ml, 0,8 mg/ml) em um tampão de acetato de sódio a 100 mM, pH 5, contendo 20 mM de NaCNBH₃, foi adicionado um excesso molar de 3,8 vezes de metoxipolietileno glicol aldeído (MPEG) (peso molecular médio, 20 kDa) (Nektar). A agitação da mistura de reação foi continuada na mesma temperatura. O grau da modificação de proteína durante o curso da reação foi monitorado pela HPLC SEC usando uma coluna Superose 6 HR 10/30 (Amersham Biosciences) eluída com um tampão de fosfato de 0,05 M com 0,15 M de NaCI, pH 7,0 a 0,4 ml/min. Depois de 16 horas a análise pela HPLC SEC indicou que a maioria da proteína foi conjugada ao MPEG. Neste tempo a mistura de reação foi trocada de tampão em um tampão de Tris 20 mM/HCl, pH 8,12. Os conjugados de MPEG-mFc-AMP2 foram isolados pela cromatografia de troca iônica usando uma coluna Hi Trap HP Q de 1 ml (Amersham Biosciences) equilibrada com um tampão de Tris 20 mM/HCl, pH 8 ,12. A mistura de reação foi carregada na coluna a uma taxa de fluxo de

171

0,5 ml/min e o aldeído MPEG não reagido foi eluído com três volumes de coluna do tampão de partida. Um gradiente linear de 20 volumes da coluna de 0 % a 100 % de tampão de Tris 20 mM/HCl, pH 8,12, contendo 0,5 M de NaCl foi usado para eluir os conjugados de proteína-polímero. As frações (2 ml) coletadas durante a separação pela cromatografia de troca iônica foram analisadas pela HPLC SEC como descrito acima. Uma fração contendo os conjugados de mono- e di-MPEG-mFc-TMP em uma razão aproximada de 2,3 para 1 (como determinado pela EtPLC SEC) foi concentrada e filtrada estéril.

Exemplo 6

Teste In Vivo

Camundongos BDF1 (Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts) foram divididos em grupos de 10 e injetados nos dias 0, 21 e 42 subcutaneamente com agente de diluição (PBS de Dulbecco com 0,1 % de albumina sérica bovina) ou agente de diluição com 50 pg de proteína conjugada mono- e di-MPEG-mFc-TMP de teste (como descrito acima) por kg de animal. Cada grupo foi dividido na metade e sangrado (140 pl) a partir do sino retro-orbital em pontos de tempo alternados (dias 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 19, 24, 26, 28, 31, 33, 40, 45, 47, 49, 52 e 59). No dia 59, os camundongos foram anestesiados com isoflurano antes da sangria. O sangue coletado foi analisado quanto a uma contagem completa e diferencial usando um analisador de sangue automatizado ADVIA 120 com software de murino (Bayer Diagnostics, Nova Iorque, ΝΎ).

Exemplo 7

Fc-TMP Humano Liofilizado

Estudos de Triagem de Formulação Liofilizada Inicial

O pepticorpo Fc-TMP humano aqui descrito no Exemplo 7 corresponde a uma forma dimérica da SEQ ID NO: 1017, em que o Fc humano é a SEQ ID NO: 1, tendo uma metionina iniciadora no término N.

172

A estabilidade de Fc-TMP foi avaliada por diversas técnicas cromatográficas: HPLC de Fase Reversa, HPLC de Troca Iônica, HPLC de Exclusão de Tamanho e SDS-PAGE, todas as quais indicaram estabilidade em temperatura elevada. As formulações variando em concentração de 0,1 a 40 mg/ml foram examinadas tanto quanto à degradação química quanto à física na temperatura acelerada, refrigerada e congelada. A estabilidade de FcTMP foi avaliada com respeito ao pH variável e a inclusão de manitol ou glicina como agentes formadores de torta e sacarose como um lioprotetor. Manitol e sacarose foram eventualmente escolhidos para otimização adicional depois que o outro candidato (glicina) não apresentou nenhuma melhora na estabilidade da proteína. Tween-20 (polissorbato-20) também foi mostrado inibir a agregação na liofilização em uma faixa de concentração de 0,002 a 0,1 %. Os seguintes tampões foram examinados em estudos de triagem em uma faixa de pH de 4 a 8: glicina, succinato, histidina, fosfato e Tris. A partir destes estudos de triagem, Fc-TMP formulado em tampão de histidina no pH 5 com uma quantidade pequena de Tween-20 (0,004 %) adicionado foi mostrado ser mais ideal para a estabilidade.

A Validação da Sacarose e Tween-20 na formulação de Fc-TMP

Os esforços de desenvolvimento subseqüentes foram focalizados na validação do nível de sacarose, manitol e Tween-20 na formulação a uma concentração de proteína de aproximadamente 0,5 mg/ml (para acomodar as exigências de dosagem previstas na clínica). O efeito de sacarose, manitol e Tween-20 na otimização da estabilidade foi demonstrado nestes estudos. Seguimento dos estudos também foram iniciados com o propósito de prever problemas e preocupações de fabricação.

A Sacarose é Benéfica em Minimizar a Degradação Química em Temperatura

Elevada

O efeito de variar as concentrações de sacarose e manitol na estabilidade de Fc-TMP foi testado. A proteína foi formulada a 0,3 e 2 mg/ml

173 de modo a agrupar a faixa de concentração prevista na clínica. Além disso, amostras foram preparadas com e sem 0,004 % de Tween-20. A razão de sacarose:manitol foi mudada variando-se a quantidade de sacarose e ajustando-se o nível de manitol em cada concentração de sacarose para manter a isotonicidade. As seguintes razões de sacarose:manitol foram examinadas (expressadas como porcentagem em peso por volume): 0,2:5,1; 0,5:4,8; 1:4,5; 1,5:4,3 e 2:4.

Razões mais altas de sacarose:manitol são mostradas minimizar a degradação química quando monitoradas pela HPLC de Troca de Cátion e Fase-Reversa. Como é mostrado na Tabela 39, a porcentagem de pico inicial é comparada inicialmente e depois da armazenagem em temperatura elevada de Fc-TMP por 18 semanas a 37° C. A perda maior de pico principal na troca de cátion ocorre na formulação líquida (Fc-TMP formulado em 10 mM de acetato, 5 % de sorbitol no pH 5), seguido pelas formulações liofilizadas com 0,2, 0,5 e 1,0 % de sacarose, respectivamente. O efeito protetor da sacarose na minimização da degradação químico também foi observado pela análise pela HPLC de Fase Reversa de amostras depois da armazenagem em temperatura elevada (Tabela 39). A porcentagem de pico inicial (determinada a partir da análise de HPLC de fase reversa de Fc-TMP) cai significantemente nos níveis de sacarose baixos, mas não parecem mudar significativamente nas formulações com concentrações de sacarose de mais do que 1 %. Interpretados juntos, estes resultados indicam que manter os níveis de sacarose a 1,5 % ou mais altos é crítico para a estabilidade de FcTMP na liofilização.

Tabela 39

Fc-TMP em 10 mM de Histidina, tamponado no pH 5 com Tween-20

Perda do Pico Principal de RP e CEX-HPLC Depois de 18 Semanas a 37° C

Formulação

0,2 % de Sacarose, 5,1 % de Manitol 0,5 % de Sacarose, 4,8 % de Manitol 1 % de Sacarose, 4,5 % de Manitol

RP-HPLC CEX-HPLC

Tempo Zero	18 semanas	Tempo Zero	18 semanas
78,6	72,2	79,8	62,6
77,3	73,1	78,9	71,6
78,4	78,0	80,5	73,9

174

1,5 % de Sacarose, 4,3 % de Manitol	73,2	79,8	80,5	78,7
2 % de Sacarose, 4 % de Manitol	79,2	81,3	78,6	78,9
10 mM de Acetato, 5 % de Sorbitol, pH 5	74,7	42,8	75,5	34,1

(controle líquido)

Ao passo que Fc-TMP no controle líquido (a formulação de 10 mM de acetato, 5 % de sorbitol, pH 5) tem crescimento significante na área do pico pré- e pós-principal, a proteína mostra mais degradação na região de pico pós-principal na análise de amostras liofilizadas com quantidades mais baixas de sacarose. Trabalho anterior com amostras de estabilidade líquida (depois da armazenagem em temperatura elevada) tem mostrado que a desamidação surge de glutamina e arginina na proteína, o que contribui para o crescimento na região de pré-pico em amostras líquidas.

Em temperatura refrigerada, a degradação química não é observada pela troca de cátion e HPLC de fase reversa na formulação liofilizada depois da armazenagem de longa duração. Por exemplo, cromatogramas de troca de cátion não mostram mudanças evidentes sob temperaturas variadas (-80° C, 4° C e temperatura ambiente controlada por 6 meses). Devido à falta de degradação químico na formulação liofilizada com o tempo em temperatura ambiente controlada e mais baixa, muito do trabalho de desenvolvimento de formulação centralizou na minimização da agregação física associada com a secagem por congelamento.

Tween-20 Minimiza a Agregação Induzida pela Liofilização

A inclusão de Tween-20 em uma concentração baixa (0,004 %) é necessária para minimizar uma quantidade pequena de agregação que é evidente a seguir da liofilização. Isto pode ser demonstrado examinando-se os resultados relevantes de diversos estudos de estabilidade em que as amostras são avaliadas quanto a estabilidade com e sem a adição de Tween-20.

Uma concentração de proteína mais alta de Fc-TMP foi primeiro usada para explorar uma ampla faixa de Tween-20 de modo a investigar a quantidade necessária para minimizar a agregação. A concentração de Fc-TMP neste estudo foi de 20 mg/ml, com os níveis de

175

Tween-20 ajustados em 0,002, 0,004, 0,006 e 0,01 %. Depois da armazenagem por um ano a 4° C, a agregação é limitada a < 0,1 % em todas as formulações com Tween-20. Resultados de seis meses também não apresentaram nenhuma agregação significativa. Tween-20 a 0,004 % foi escolhido para consideração adicionais nos estudos de formulação, como aqui debatido, designado para Fc-TMP a 0,5 mg/ml.

A Tabela 40 mostra a quantidade de agregação em Fc-TMP monitorado em tempo zero, 3 e 11 meses depois de armazenagem a 4° C. Neste estudo, Fc-TMP foi liofilizado a 0,5 mg/ml na formulação anteriormente mencionada e nas formulações com razões de sacarose:manitol variáveis sem Tween-20 adicionado. Além disso, a estabilidade foi seguida na formulação corrente sem Tween-20 e tamponada no pH 4,5, 5 e 5,5. Os resultados mostram que apenas a formulação anteriormente mencionada teve agregação mínima no pH 5. Nas formulações sem Tween-20, a agregação varia de 0,5 % até em tomo de 5 %. A agregação também é mais alta no pH 4,5 e 5,5 comparada com aquela detectada no pH 5. Razões de sacarose:manitol mais baixas (formulações a 0,2, 0,5 e 1 % de sacarose) têm agregação mais alta, quando os níveis estão tipicamente em tomo de 5 %. Com o tempo, o nível de agregação permanece compatível na formulação anteriormente mencionada e na formulação sem Tween-20 dentro do ponto de tempo de 1 ano.

Tabela 40

Fc -TMP em 10 mM de Histidina, formulações variadas, 0,5 mg/ml

Agregação Percentual Medido pela SEC-HPLC

Formulação	Tempo Zero	3 Meses	11 Meses
2% de Sacarose, 4% de Manitol, pH 5,0	<0,1	<0,1	<0,1
(com 0,004% de Tween-20)
2% de Sacarose, 4% de Manitol, pH 4,5	2,4	2,9	-
2% de Sacarose, 4% de Manitol, pH 5,0	0,5	1,6	0,8
2% de Sacarose, 4% de Manitol, pH 5,5	2,3	2,5	-
0,2% de Sacarose, 5,1% de Manitol, pH 5,0	4,8	7,3	-
0,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol, pH 5,0	5,1	4,4	-
1% de Sacarose, 4,5% de Manitol, pH 5,0	4,5	4,3	-

As amostras de formulação otimizadas foram selecionadas para avaliação no ponto de tempo de 11 meses.

176

Estudos de formulação adicionais foram planejados para confirmar o efeito benéfico de Tween-20 na minimização da agregação. Todas as amostras nestes estudos foram formulados no pH 5 com e sem 0,004% de Tween-20. A Tabela 41 lista a agregação percentual depois da armazenagem a 4°C para os intervalos de tempo de zero, 18 semanas e 1 ano na estabilidade. No tempo zero, imediatamente a seguir da liofilização, a agregação é minimizada em todas as amostras com 0,004% de Tween-20. Quantidades pequenas de agregação são observadas nas amostras sem Tween20, com a quantidade mais alta encontrada na formulação com 0,2% de sacarose. A eficácia de Tween-20 na minimização da agregação também estende-se ao ponto de tempo de 18 semanas, com percentual mais alto de agregação encontrado em amostras que carecem de Tween-20 e nas razões de sacarose:manitol baixas. Depois da armazenagem por um ano a 4°C, a agregação é também compativelmente baixa nas amostras contendo Tween15 20.

Tabela 41

Fc -TMP em 10 mM de Histidina, formulações variadas, 0,3 mg/ml, pH 5

Agregação Percentual Medida pela SEC-HPLC depois da Armazenagem a

4°C

Formulação	Tempo Zero	4 Meses	1 Ano
2% de Sacarose, 4% de Manitol	<0,1	0,2	<0,1
(com 0,004% de Tween-20)
2% de Sacarose, 4% de Manitol	0,2	0,2	-
0,2% de Sacarose, 5,1% de Manitol	<0,1	<0,1	<0,1
(com 0,004% de Tween-20)
0,2% de Sacarose, 5,1% de Manitol	1,1	1,3	-
0,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol	<0,1	0,2	<0,1
(com 0,004% de Tween-20)
0,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol	0,2	0,8	-
1% de Sacarose, 4,5% de Manitol	<0,1	<0,1	<0,1
(com 0,004% de Tween-20)
1% de Sacarose, 4,5% de Manitol	0,1	0,3	-
1,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol	<0,1	<0,1	<0,1
(com 0,004% de Tween-20)
1,5% de Sacarose, 4,8% de Manitol	0,1	0,3	-

As amostras com Tween-20 foram selecionadas para a avaliação no ponto de tempo de 1 ano.

Um outro estudo de estabilidade, planejado para testar a

177 eficácia de antioxidantes na minimização da degradação química, reforçou o efeito protetor de Tween-20. Os antioxidantes não têm um impacto na minimização da degradação química da armazenagem em temperatura elevada. Entretanto, a formulação anteriormente mencionada, com 0,004% de Tween-20 e em uma concentração de Fc-TMP de 0,2 mg/ml, tiveram < 0,1% de agregação no tempo zero e 0,1% depois de 5 meses de armazenagem a 4°C. A mesma formulação sem Tween-20 teve 0,4% de agregação no tempo zero e 1% de agregação depois da armazenagem por 5 meses.

Os resultados do estudo de estabilidade apresentados nas Tabelas II, III e os estudos anteriormente mencionados ilustram o efeito protetor de Tween-20 na minimização da agregação na liofilização. O crescimento de agregação com o tempo é mínima, quando os pontos de tempo se estendem a 1 ano a 4°C não apresentam nenhum aumento significativo na agregação em amostras formuladas com 0,004% de Tween-20. Com base nestes resultados do estudo de estabilidade que mostram que a adição de Tween-20 minimiza a agregação na liofilização, o trabalho escalonado foi iniciado com a formulação recomendada.

Estudos de Aumento em Proporção

Agregação é Dependente da Concentração

Um estudo de aumento em proporção inicial foi planejado para simular as condições de fabricação e examinar a robustez da formulação com respeito ao estresse de envio e estabilidade na reconstituição. Fc-TMP foi trocado de tampão no tampão de formulação usando um dispositivo de filtração em fluxo tangencial, similar aos processos em escala maior. A proteína foi subseqüentemente diluída nas concentrações de 0,5 e 0,1 mg/ml com Tween-20 também adicionado antes da etapa de filtração final. Depois que as amostras foram enchidas, a liofilização foi realizada. Um processo de liofilização exemplar é apresentado abaixo:

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Etapas de Tratamento Térmico

Etapa #1	Temp -50	Tempo 120	Ascensão/Contenção A
Etapa #2	-50	120	C
Etapa #3	-13	60	A
Etapa #4	-13	360	C
Etapa #5	-50	60	A
Etapa #6	-50	60	C

Temp de Congelamento -50 C

Congelamento adicional 0 min

Ponto de fixação do Condensador -60 C

Ponto de fixação do Vácuo lOOmTorr

Etapas de secagem primária

Etapa #1	temp -50	Tempo 15	Vac 100	Ascensão/Contenção c
Etapa #2	-25	120	100	A
Etapa #3	-25	600	100	C
Etapa #4	-25	600	100	c
Etapa #5	0	800	100	A
Etapa #6	25	800	100	A
Etapa #7	25	800	100	C
Etapa #8	25	800	100	C
Etapa #9	25	0	100	c
Etapa #10	25	0	100	c
Etapa #11	25	0	100	c
Etapa #12	25	0	100	c
Etapa #13	25	0	100	c
Etapa #14	25	0	100	c
Etapa #15	25	0	100	c
Etapa#16	25	0	100	c
Pós Aquecimento	25	100	100	c

Temperatura Secundária 28 C

A armazenagem passiva a 4°C resultou em mais agregação na concentração de Fc-TMP baixa (0,1 mg/ml). No tempo zero, a agregação foi determinada pela SEC-HPLC ser de 0,4% na formulação de 0,1 mg/ml, ao passo que 0,1% de agregação foi detectado nas proteínas formuladas a 0,5 mg/ml. Depois de seis meses de armazenagem na temperatura refrigerada, a agregação permaneceu nos mesmos níveis como observados para as amostras em tempo zero para ambas as concentrações de Fc-TMP, de acordo com os resultados dos estudos de estabilidade anterior. Devido à quantidade mais alta de agregação observada na concentração mais baixa (0,1 mg/ml) foi decidido que 0,5 mg/ml seria melhor adaptado como a concentração de escolha para o trabalho de aumento em proporção adicional.

179

A Agregação Não Aumenta No Estresse de Cisalhamento Simulado

As amostras liofilizadas (não reconstituídas) do estudo de aumento em proporção inicial também foram submetidas ao transporte por terra e por ar simulados com a ajuda de equipamento de simulação de estresse. Em resumo, o protocolo como esboçado na ASTM (American Society of Testing Methods), Método # D-4728, foi seguido. O transporte por terra e ar simulado foi realizado usando uma Mesa de Vibração Eletrodinâmica, Modelo S202 e um Amplificador de Energia, Modelo # TA240 (Unholtz-Dickie Corporation, Wallingford, CT). A seguir do estresse de transporte, o aspecto físico das tortas liofilizadas foi comparado com controles passivos, com o resultado de que nenhuma mudança morfológica da torta foi óbvia. A estabilidade tanto química quanto física foi aceitável, com agregação compatível nas amostras estressadas e controles passivos (<0,1% nas amostras de 0,5 mg/ml comparadas com 0,4% nas amostras de 0,1 mg/ml).

A estabilidade na reconstituição foi examinada neste estudo preparando-se amostras recém reconstituídas e incubando por 3, 7 e 14 dias passivamente, com balançar lento ou agitação vigorosa. A Tabela 42 mostra os resultados para as formulações de 0,1 e 0,5 mg/ml. Como é esperado, a quantidade de agregação é minimizada nas formulações a 0,5 mg/ml. Comparado com o balançar lento com o tempo vs. as amostras não balançadas, nenhum aumento significativo na agregação é evidente durante o período de 14 dias. A quantidade de dimerização nestas formulações (Não Balançadas e Balançadas) também é compatível. De maneira interessante, os resultados de agitação parecem demonstrar uma tendência; isto é, a agregação cai a menos do que os níveis detectáveis depois do tempo zero tanto nas amostras de 0,1 quanto nas de 0,5 mg/ml. Entretanto, existe um aumento correspondente na quantidade de dimerização observada na maioria das amostras agitadas em cada ponto de tempo, sugerindo que existe alguma

180 reversibilidade em ir do estado de agregado para o de dímero no Fc-TMP estressado pelo cisalhamento.

Tabela 42

Fc -TMP em 10 mM de Histidina, com 2% de Sacarose, 4% de Manitol e

0,004% de Tween-20, pH 5

Agregação e Dimerização Percentuais Medidas pela SEG-HPLC depois da armazenagem a

	Tempo Zero	3 Dias	7 Dias	14 Dias
0,1 mg/ml	agreg, dímero	agreg, dímero	agreg, dímero	agreg, dímero
Não Balançada	0,4, 0,3	1,2, 0,6	1,1,0,4	1,0, 0,4
Balançada	0,4, 0,3	0,7, 0,4	0,7, 0,3	1,1,0,3
Agitação	0,4, 0,3	<0,1, 0,9	<0,1, 0,1	<0,1, 1,6
0,5 mg/ml
Não Balançada	0,1,0,5	0,2, 0,5	0,2, 0,5	0,2, 0,6
Balançada	0,1, 0,5	0,2, 0,6	0,1,0,6	0,1, 0,6
Agitação	0,1,0,5	<0,1, 0,9	<0,1, 1,0	<0,1, 2,2

A Secagem Secundária por 12 Horas no Ciclo de Liofilização é Suficiente para Minimizar a Umidade Residual

Um segundo estudo de aumento em proporção foi realizado em que Fc-TMP foi trocado de tampão e diluído a 0,5 mg/ml na formulação recomendada. A liofilização foi obtida com um ciclo consistindo de uma etapa de congelamento inicial a -50°C, seguida por recozimento a -13°C. A temperatura foi depois reduzida para -50°C, mantida por uma hora e a secagem primária iniciada a -50°C com um ponto de fixação do vácuo de 100 mTorr. A seguir de um breve período de contenção a -50 C, a temperatura foi reduzida para -25°C em um período de duas horas, mantida a -25°C por 20 horas e depois gradualmente elevada para 25°C depois em tomo de 27 horas para o começo da secagem secundária. A secagem secundária foi continuada por um mínimo de 12 horas a 25°C. Durante o ciclo de liofilização, as amostras foram puxadas depois de 12, 18 e 24 horas de secagem secundária de modo a checar a estabilidade e comparar o nível de umidade residual. Os resultados mostram que a umidade residual, como medida pela titulação de Karl Fisher, está em tomo de 0,6% ou menos (Tabela 43) em todas as amostras examinadas. A umidade é similarmente baixa nas tortas de placebo

181 de tampão. Com base neste trabalho, o tempo de secagem secundária do ciclo de liofilização pode ser encurtado para uma faixa entre 12 a 18 horas.

Tabela 43

Umidade Residual em Fc -TMP

Tempos de Secagem Secundária Mantida a 12, 18 e 24 Horas

Tempo de Secagem Secundária Umidade Percentual por Karl Fisher horas 12 horas

Placebo de Tampão 18 horas 18 horas

Placebo de Tampão 24 horas 24 horas

Placebo de Tampão

0,23

0,38

0,43

0,63

0,28

0,3

0,46

0,37

0,31

Os resultados de estabilidade também são comparáveis em relação a esta faixa de faixa tempo de secagem secundária, visto que as amostras não têm diferenças com respeito à estabilidade química ou física. Por exemplo, a quantidade de agregação é <0,1% para todas as amostras examinadas, enquanto que a porcentagem de dímero está compativelmente a 0,1%. Estes resultados confirmam que o tempo de secagem secundária pode ser encurtado a menos do que 24 horas sem afetar a estabilidade inicial da proteína.

Trabalho adicional foi realizado para avaliar a robustez da formulação com respeito às concentrações de excipiente variáveis. Visto que o trabalho de estabilidade anterior mostrou que a sacarose, por exemplo, pode ter um impacto sobre a estabilidade, foi necessário examinar a robustez de FcTMP nas mudanças menores nos níveis de excipiente.

Estudo Estatístico de Fc-TMP

182

Robustez da Formulação

Um estudo estatístico inicial foi planejado para examinar mudanças menores nas variáveis da formulação tais como o pH da formulação, concentração de tampão de histidina e a razão de sacarose:manitol, usando um pacote de software E-chip. Estas amostras foram liofilizadas mas um ciclo de secagem por congelamento não ótimo foi usado que resultou em agregação mais alta do que tipicamente observada. O estudo foi um estudo de triagem, assumindo uma superfície de resposta linear. Os resultados da avaliação de estabilidade mostrou que o pH (4,7 a 5,3) e a concentração de tampão de histidina, (variada de 5 a 15 mM), tiveram pouco impacto sobre a estabilidade de Fc-TMP. De modo a verificar a contribuição de Tween-20 e da razão de sacarose:manitol na estabilidade global de FcTMP, um estudo de planejamento estatístico de acompanhamento foi iniciado usando o ciclo de liofilização mais ideal.

Estudo da Estabilidade Estatística Quadrática

O segundo estudo de planejamento estatístico examinou variações em Tween-20 (0,001%, 0,0045% e 0,008%), na razão de sacarose:manitol (1,7:4,2, 2:4 e 2,3:3,8) e variações na concentração de proteína (0,3, 0,65 e 1 mg/ml). O pH das formulações foi também ajustado a 4,7, 5 e 5,3 e a concentração do tampão de histidina variou de 7, 10 e 13 mM. As amostras foram preparadas e liofilizadas usando um liofilizador Virtis (SP Industries, Inc., Gardiner, NY), com um ciclo conservativo otimizado usado para os estudos de estabilidade anteriores. Os resultados de estabilidade foram interpretados usando E-chip (pacote de software de planejamento estatístico, Hockessin, DE) em duas maneiras: uma avaliação do impacto das variáveis da formulação sobre a quantidade de agregação e dimerização observada no tempo zero e o efeito das variáveis da formulação em afetar a estabilidade de armazenagem em temperatura elevada (37°C) como medida pelas taxas de mudança de tempo zero.

Resultados de Formulação em Tempo Zero de Estudo Estatístico Quadrático

183

Os resultados da avaliação em tempo zero mostrou que, como esperado, Tween-20 minimiza a agregação, entretanto a concentração de proteína também foi significante em reduzir a tendência para agregar na secagem por congelamento. O programa de software E-chip avalia os efeitos que diferentes variáveis que entram (as condições de formulação) têm sobre a agregação e dimerização de Fc-TMP durante a secagem por congelamento. Com respeito à dimerização de Fc-TMP no tempo zero, nenhum excipiente da formulação foi considerado (com base nos resultados de E-chip) ter um efeito significante. Diversas variáveis de formulação impactaram a quantidade de agregação observada na secagem por congelamento de Fc-TMP. Com base nos resultados resumidos fornecidos por E-chip, a concentração de Fc-TMP teve o maior efeito sobre o grau de agregação observada no tempo zero, seguido pelo nível de Tween-20. A agregação é observada ser a mais alta, no tempo zero, nas amostras de concentração baixa. Do mesmo modo, quantidades mais altas de Tween-20 têm mais de um efeito protetor na minimização da agregação em tempo zero, embora esta tendência não seja tão significativa como o efeito de concentração de proteína. Quantidades mais altas de agregação foram observadas neste estudo comparada com resultados de estudo anterior e em tomo de 0,5% de agregação foi observada em algumas amostras nas concentrações de proteína mais baixas com Tween-20.

Foi observado que a variabilidade na agregação cai conforme a concentração de proteína aumenta. Em 0,5 mg/ml e concentrações mais altas, Fc-TMP tem agregação mais baixa média do que em amostras formuladas em ou abaixo de 0,3 mg/ml.

Tween-20 a 0,004% é eficaz em Minimizar a Agregação na Armazenagem em

Temperatura Elevada

O estudo de planejamento estatístico também foi usado para avaliar mudanças na armazenagem em temperatura elevada. As taxas de agregação foram comparadas nas condições de formulação variada depois de

184 dias a 37°C subtraindo-se os resultados de temperatura elevada dos resultados iniciais (tempo zero) e normalizando para o tempo de um mês. As taxas que são negativas assim se referem a uma perda aparente da propriedade medida com o tempo. As vaiáveis de resposta (correspondendo aos resultados dos ensaios) foram determinados através da RP-HPLC (pureza de pico principal percentual e porcentagem pré-pico), HPLC de troca de cátion (pureza de pico principal percentual), HPLC de exclusão de tamanho (agregação e formação de dímero) e NIR-água (umidade residual pela espectroscopia de infra vermelho, que foi correlacionada com os resultados da Titulação de Karl Fisher em algumas amostras para verificar a precisão).

Os resultados de uma comparação das taxas de mudança obtidas de cada técnica de ensaio mostra que as mudanças na agregação e oxidação pela RP-HPLC foram estatisticamente significantes com respeito à concentração de Fc-TMP e concentração elevada ao quadrado de Tween-20, dentro de dois desvios padrão. O termo quadrado de Tween-20 mais provavelmente surge da natureza quadrática do estudo que assume uma superfície de resposta de curva. Neste caso, o termo Tween-20 elevado ao quadrado ajusta-se ao melhor modelo, além de possivelmente sugerir que exista um efeito interativo consigo mesmo que afeta a estabilidade. As outras respostas medidas, tais como a pureza de pico principal da HPLC ou as condições de pH variadas, por exemplo, não exibiram nenhuma resposta significante que afetasse a estabilidade da proteína.

Como é o caso com o estudo de aumento em proporção inicial anteriormente debatido (amostras balançadas, não balançadas e amostras agitadas), a quantidade de agregação é mais baixa depois armazenagem em temperatura alta. A taxa de mudança nestas amostras foi usada para fazer prognósticos com base no modelo estatístico (estudo quadrático) para prever o efeito protetor de Tween-20. A Tabela 44 mostra prognósticos quanto a quantidade de agregação esperada, com base no modelo de planejamento

185 estatístico, conforme a concentração de Tween-20 é elevada de 0 a 0,008%. Como é mostrado, a taxa de agregação, normalizada a um mês a 37°C, é negativa (indicando a perda de agregado nestas condições) com a exceção de 0% de Tween-20, caso este em que a agregação seria prognosticada crescer. A taxa de perda de agregado parece atingir o platô nas concentrações de Tween20 de 0,002% e mais altas, sugerindo que o Tween-20 em níveis baixos (0,002-0,006%) é suficiente na minimização da degradação física. A taxa de crescimento de dímero é correspondentemente similar sob estas condições e não foi estatisticamente correlacionada com qualquer um dos excipientes de formulação, como anteriormente mencionado.

Tabela 44

Prognósticos de Modelo Quadrático Estatístico

Concentração de Tween-20 e Fc-TMP Variadas com base em 16 Dias de

Incubação a 37°C (normalizado para um mês)

% de Tween-20	Fc-TMP (mg/ml)	% de Agregação SEC	Limites de prognósticos	% de oxidação pela RP-HPLC	Limites de prognósticos
0	0,5	0,09	(-0,32, 0,50)	0,47	(-2,59, 1,65)
0,002	0,5	-0,35	(-0,69, -0,0)	-0,68	(-2,44, 1,08)
0,004	0,5	-0,53	(-0,87, -0,19)	-0,58	(-2,32, 1,17)
0,006	0,5	-0,45	(-0,78, -0,12)	-0,17	(-1,86, 1,52)
0,008	0,5	-0,12	(-0,46, 0,21)	0,54	(-1,18, 2,26)
0,004	0,3	-0,59	(-0,94, -0,25)	0,58	(-1,18, 2,34)
0,004	0,1	-0,63	(-1,10, -0,16)	2,69	(0,28, 5,09)

A taxa de mudança na oxidação medida pela RP-HPLC a 0,5 mg/ml, assumindo que isto corresponde às mudanças na região de pré-pico de cada cromatograma, não é estatisticamente significante com respeito ao termo elevado ao quadrado de Tween-20. Neste caso, o modelo (como mostrado na Tabela 44) prognostica que conforme a concentração de Tween-20 é variada a taxa de oxidação é compatível com os limites dos intervalos de prognóstico. A concentração de proteína afeta a oxidação, conforme a taxa de crescimento aumenta de 0,58 a 2,69 conforme a concentração de proteína cai de 0,3 a 0,1 mg/ml (enquanto se mantém o Tween-20 constante a 0,004%).

Estes resultados sugerem que manter a concentração de Tween-20 entre 0,002 a 0,006% é desejável de um ponto de vista de

186 estabilidade. A quantidade de proteína é também importante, visto que a estabilidade é pior nas concentrações abaixo de 0,5 mg/ml.

Estabilidade em Temperatura Refrigerada

Considerando o acima, a seguinte formulação foi usada para avaliar a estabilidade em temperatura refrigerada de Fc-TMP liofilizado: 0,5 mg/ml de Fc-TMP em 10 mM de Histidina tamponada no pH 5, 2% de Sacarose, 4% de Manitol e 0,004% de Tween-20.

A formulação foi monitorada quanto a estabilidade em temperatura refrigerada por um período de um ano. A Tabela 45 mostra os resultados de estabilidade deste estudo, com resultados de tempo zero, 3 meses e 1 ano listados. Como é mostrado, a pureza de pico principal percentual, como medida pela HPLC de Fase Reversa e Troca de Cátion, não parece diminuir com tempo. As diferenças menores na pureza de pico principal com o tempo são típicas da variação normal na resolução das colunas cromatográficas e também são observadas no padrão congelado. A agregação percentual é compatível e não parece crescer depois de um ano. Tabela 45

Pico Principal Percentual na HPLC de Fase Reversa

Ponto no Tempo

Concentração	0	3 meses	1 Ano
0,3	81,0	82,5	82,4
0,5	69,0	82,7	83,4
1,0	80,6	82,4	83,2
Material de Partida Congelado	82,4	84,0	84,5

Pico Principal Percentual na HPLC de Troca de Cátion

Ponto no Tempo

Concentração	0	3 meses	1 Ano
0,3	67,0	71,8	81,8
0,5	73,5	83,1	80,0
1,0	74,2	79,7	80,5
Material de Partida Congelado	75,3	77,0	83,6

Agregação Percentual na HPLC de Exclusão de Tamanho

Concentração	0	Ponto no Tempo 3 meses	1 Ano
0,3	<0,1	0,1	0,1
0,5	<0,1	<0,1	0,1
1,0	<0,1	<0,1	<0,1
Material de Partida Congelado	0,1	0,1	<0,1

187

Fc-TMP é formulado em 10 mM de Histidina, tamponado no pH 5,0 com 2% de sacarose, 4% de manitol e 0,004% de Tween-20. Foi mostrado que o pH 5 é mais ideal para a estabilidade e que a razão de sacarose rmanitol é crítica na minimização da degradação química na armazenagem em temperatura elevada para este sistema de proteína. Tween20 é necessário em uma concentração baixa de modo a minimizar a quantidade de agregação que ocorre como um resultado do processo de liofilização. Os estudos de estabilidade para aplicações de aumento em proporção sustentam estas conclusões. Os estudos estatísticos também foram planejados que validam o nível de cada excipiente na formulação, incluindo a necessidade quanto a concentração de proteína estar a 0,5 mg/ml. A estabilidade em temperatura refrigerada da formulação recomendada não mostra degradação significativa depois da armazenagem por um ano a 4°C. Exemplo 8

Peptídeo de Ligação de Fc-Ang-2 Liofílizado

De modo a determinar a formulação ótima para peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 liofílizado, as análises foram realizadas que avaliaram a agregação e estabilidade do peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 em vários valores de pH, as concentrações excipientes e concentrações de proteína.

O peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 consiste de duas moléculas de polipeptídeo farmaceuticamente ativo ligadas ao término C da porção Fc de uma molécula de anticorpo de IgGl. A molécula é compreendida de 574 resíduos de aminoácido com um peso molecular total de 63.511 Daltons. O pl da molécula é de 5,45. Existem duas ligações de dissulfeto em cada um dos polipeptídeos ativos. Existe um total de 20 resíduos de cisteína por toda a molécula, a maior parte dos quais são oxidados em pontes de dissulfeto. A seqüência de peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 é como segue:

MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVS

HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD

188

WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS

KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGA

QQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPW

TCEHMLE (SEQ ID NO: 2)

A porção Fc da IgGl termina em K228. G229-G233 compõem uma seqüência ligadora. O polipeptídeo ativo começa em A234 e estende-se ao resto da seqüência.

Triagem de pH do Peptídeo de Ligação de Fc-Ang-2 Liofílizado

A triagem de pH testou a estabilidade de um peptídeo de ligação de Fc-Ang-2 no pH 4,0, 7,0 e 8,0. No pH 4,0, os tampões triados incluíram ácido glutâmico, citrato de sódio e succinato de sódio, cada um em uma concentração de 10 mM. No pH 7,0, os tampões triados foram histidina e tris, ambos a 10 mM de concentração. Hisitidina e Tris foram também triados no pH 8,0, cada um a 10 mM. Cada um dos tampões contiveram 4% de manitol como um agente de formação de torta por liofilização e 2% de sacarose como um excipiente. Além disso, o tampão de histidina no pH 7,0 foi examinado com e sem a presença de um tensoativo, 0,01% de Tween 20 (p/p). A proteína foi diluída a 5 mg/ml com cada um dos tampões de formulação. Esta solução foi depois dialisada em cada um dos tampões da formulação usando tubo de diálise com um limite de exclusão de peso molecular de 10.000 Da, onde um total de 6 trocas foi realizada com um mínimo de 4 horas de equilíbrio entre as trocas. Depois da diálise, a proteína foi aliquotada em frascos de vidro de 3 cc com um volume de enchimento de 1 ml. Estes frascos foram depois liofilizados usando um instrumento de secagem por congelamento em escala de laboratório. Depois da liofilização, os frascos foram selados e armazenados para a incubação a 4°C, 29°C e 37°C, onde os frascos individuais foram rompidos e analisados em vários pontos de tempo, começando imediatamente depois da liofilização e estendendo-se a um

189 período de 24 meses. As amostras foram reconstituídas com o volume apropriado de água e analisado quanto a estabilidade da proteína usando a cromatografia líquida de exclusão de tamanho e eletroforese em gel (que detecta a agregação, dimerização e clivagem proteolítica), cromatografia líquida de troca aniônica (que detecta a oxidação). Além disso, as propriedades da torta tais como tempos de reconstituição e umidade e propriedades da solução líquida reconstituídas foram analisadas (tais como pH).

Estudo de Excipiente de Peptídeo de Ligação de Fc-Ang-2 Liofílizado

A triagem de excipiente foi realizada em um único tampão, 10 mM de histidina no pH 7,0. Os dois excipientes comparados neste estudo foram 0,85% de arginina e 1% de sacarose. O agente de formação de torta usado com a arginina foi 4% de manitol e o agente de formação de torta usado com a sacarose foi 2% de glicina. Cada uma das formulações foi testada nas concentrações de proteína de 1 mg/ml, 30 mg/ml e 60 mg/ml. Além disso, uma formulação contendo uma combinação de manitol sacarose foi testada a 30 mg/ml. Cada uma das formulações conteve 0,01% de Tween 20. A proteína foi primeiro concentrada a 70 mg/ml e dialisada na formulação apropriada usando um dispositivo de ultrafiltração/diafiltração em escala de laboratório. A proteína foi depois diluído a cada uma das três concentrações com o tampão de formulação apropriado. A proteína foi depois aliquotada em frascos de vidro de 3 cc com um volume de enchimento de 1 ml. Os frascos foram depois liofilizados usando um instrumento de secagem por congelamento de escala de laboratório. Depois da liofilização, os frascos foram selados e armazenados para incubação a 4°C, 29°C, 37°C e 52°C, onde os frascos individuais foram rompidos e analisados em vários pontos no tempo, começando imediatamente depois da liofilização e estendendo-se a um período de 24 meses. As amostras foram analisadas quanto a estabilidade da proteína usando a cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de

190 troca aniônica e SDS-PAGE. As propriedades da torta liofilizada e soluções líquidas reconstituídas também foram analisadas.

Triagem da Concentração de Peptídeo de Ligação de Fc-Ang-2 Liofilizado

A triagem de concentração foi realizada em histidina a 10 mM no pH 7,2, com 4% de manitol como o agente formador de torta e 2% de sacarose como um excipiente. A proteína foi concentrada a aproximadamente 140 mg/ml e dialisada na formulação usando um dispositivo de ultrafiltração/diafiltração em escala de laboratório. A proteína dialisada foi depois diluída a 30 mg/ml, 60 mg/ml e 120 mg/ml no tampão de formulação. As soluções foram depois aliquotadas em frascos de vidro de 3 cc a um volume de enchimento de 1 ml. Os frascos foram liofilizados usando um instrumento de secagem por congelamento de escala de laboratório. Depois da liofilização, os frascos foram selados e armazenados para incubação a 4°C, 29°C, 37°C e 52°C, onde os frascos individuais foram rompidos e analisados em vários pontos com o tempo, começando imediatamente depois da liofilização e estendendo-se a um período de 24 meses. As amostras foram analisadas quanto a estabilidade da proteína usando a cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca aniônica e SDS-PAGE. As propriedades da torta liofilizada e as soluções líquidas reconstituídas também foram analisadas.

Conclusão

Considerando o acima, a(s) formulação(ões) ótima(s) compreende(m) histidina a 10 mM, 4% de manitol, 2% de sacarose, 0,01% de Tween-20, pH 7,0.

Exemplo 9

Peptídeo de Ligação de Fc-Agp-3 Liofilizado

De modo a determinar a formulação ótima para o peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 Liofilizado, as análises foram realizadas que avaliaram a agregação e estabilidade do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 em vários

191 valores de pH, concentrações de excipiente e concentrações de proteína.

O peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 é um pepticorpo ligado em

N contra o fator de ativação de célula B (BAFF) intencionado contra doenças relacionadas com a célula B. O pepticorpo é construído de dois polipeptídeos ligados em dissulfeto não glicosilados com uma massa total de -63,6 kD. O ponto isoelétrico para este pepticorpo foi estimado ser no pH 7,36. SEQÜÊNCIA de Fc (SEQ ID NO: 1696):

VDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA

KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQÜÊNCIA DO PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE Agp-3 (SEQ ID NO:

1697):

GCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSG

SATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGG

Assim, a seqüência do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 é como segue:

GCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSG SATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1698)

192

Triagem em pH Amplo do Peptídeo de Ligação de Fc-Agp-3 Liofilizado a 10 mg/ml

A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicadora de estabilidade em temperaturas elevadas. Para avaliar as propriedades de estabilidade e reconstituição de peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 liofilizado na faixa de pH de 3,85 a 7,6, 10 mg/ml de peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 foram formulados em vários tampões a 10 mM na presença de 2,5% de manitol e 2,0% de sacarose. Os seguintes tampões foram testados em incrementos unitários de pH de aproximadamente 0,5: acetato, succinato, histidina, pirofosfato, fosfato e Tris.

Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material volumoso purificado foi obtido na formulação líquida congelada de 30 mg/ml. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A etapa de recozimento foi realizada a -20°C e durou 4 horas para permitir a cristalização do manitol. A secagem primária foi realizada na temperatura de prateleira de 25°C por 20 horas. A secagem primária atingiu a conclusão a -25°C visto que nenhum pico no vácuo foi observado conforme a temperatura de prateleira foi aumentada até 0°C. Nenhum colapso maior foi observado e as amostras ocorreram com sucesso através da secagem secundária primeiro a 0°C e depois a 25°C. Na reconstituição as formulações com pH em ou acima de 7 foram levemente turvas, enquanto que todas as outras formulações foram claras. Isto foi explicado pela proximidade das formulações em pH alto para o ponto isoelétrico do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 (pi = 7,36). A análise de SE-HPLC revelou um dímero como a espécie de peso molecular alto principal. Foi observado que a% relativa de dímero foi fortemente dependente do pH com o acúmulo mais baixo no pH 5 e abaixo. A quantidade de agregados solúveis também mostrou alguma dependência do pH. Nenhum

193 agregado solúvel foi observado nas amostras antes da liofilização. Ao contrário, uma quantidade pequena de dímero foi presente em todas as formulações antes da liofilização e a mesma aumentou ainda mais nas amostras reconstituídas, após a liofilização. Nenhum corte significante foi observado em todas as formulações. A quantidade mais alta do monômero intacto foi no caso de acetato, succinato e histidina no pH 5 e abaixo.

Triagem de pH Amplo de Peptídeo de Ligação de Fc-Agp-3 Liofilizado a 30 mg/ml: efeito de estabilização de sacarose e manitol

A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Para avaliar o efeito da presença de 2,5% de manitol e 3,5% de sacarose nas propriedades de estabilidade e reconstituição de peptídeo de ligação de FcAgp-3 liofilizado na faixa de pH de 4,5 a 7,5, o peptídeo de ligação de FcAgp-3 foi formulado a 30 mg/ml em succinato a 10 mM, tampões de histidina e fosfato. Os tampões de pirofosfato e Tris foram excluídos deste estudo devido ao desempenho deficiente na triagem de pH amplo anterior. O tampão de acetato foi excluído devido pela possibilidade de mudanças de pH nas amostras reconstituídas como um resultado da sublimação de acetato durante a secagem por congelamento.

Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, material volumoso purificado foi obtido no 30 mg/ml de formulação líquida congelada. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A etapa de recozimento foi realizada a -20°C e durou 5 horas para permitir a cristalização de manitol mais completa. A secagem primária foi realizada na temperatura de prateleira de -25°C por 20 horas. A secagem primária não atingiu completamente a conclusão a -25°C e algum pico no vácuo foi observado conforme a temperatura de prateleira foi aumentada até 0°C. Nenhum colapso maior foi observado e as amostras se processaram com êxito através da

194 secagem secundária primeiro a 0°C e depois a 25°C. Nas formulações de reconstituição com pH em tomo de 7 foram levemente turvas, enquanto todas as outras formulações foram claras. Conforme foi mencionado anteriormente, isto pode ser explicado pela proximidade das formulações de pH alto do ponto isoelétrico do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3. A análise de SE-HPLC revelou o dímero como a espécie de peso molecular alto principal. Mais uma vez, foi observado que a% relativa de dímero foi fortemente dependente do pH com o acúmulo mais baixo no pH 5 e abaixo. A quantidade de agregados solúveis não mostra dependência de pH evidente. Nenhum agregado solúvel foi observado nas amostras antes da liofilização. —0,6% de dímero foi observado no volume não GMP antes da formulação e o mesmo aumentou até 3,0% para as formulações de pH alto antes da liofilização como um resultado de troca/concentração de tampão. A dependência do pH do acúmulo de dímero também foi confirmada pela correspondência próxima da quantidade relativa de dímero em um dado pH independente do tipo de tampão. A% de dímero não aumenta significantemente após a liofilização como evidenciado pelas amostras T = 0. A única exceção foi as amostras não contendo ambos, sacarose e manitol, que mostrou aumento perceptível, de -0,25 a 0,5% na% de dímero. Na presença de sacarose a perda de pico principal foi mínima mesmo depois da troca de tampão/liofilização para formulações de succinato e histidina com pH 4,1 e 4,7, respectivamente. Comparado com estas, todas as formulações de fosfato mostraram -3% de perda do pico principal antes da liofilização. Contudo, a torta foi formada mesmo na ausência tanto de sacarose quanto de manitol, o pico principal correspondente caiu em 0,5 a 0,7% comparado com as formulações contendo açúcar. Além disso, a reconstituição das formulações que não de açúcar foi muito mais longa (>2 min) e requereram alguma agitação. De modo a garantir a robustez da torta manitol ou glicina foram incluídos como agentes de encorpamento em todas as formulações subseqüentes embora a sacarose sozinha fosse mostrada

195 conferir estabilidade de proteína suficiente.

Triagem de pH do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 liofilizado estreita a 30 mg/ml

A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC) e HPLC de fase reversa (RP-HPLC), que foram indicativas da estabilidade em temperaturas elevadas. Visto que a% de recuperação do pico principal foi mais alto no pH 5 e abaixo, o tampão de fosfate foi omitido da triagem de pH estreito. Além dos tampões de succinato e histidina, que desempenharam bem nas triagens de pH amplo, as triagens de pH estreitas incluíram glutamato a 10 mM, pH 4 a 6. As formulações foram testadas em incrementos unitários de pH de 0,2. O teor de sacarose e manitol foi mantido constante a 3,5% e 2,5%, respectivamente, exceto para duas formulações de succinato no pH 4,5 com 2,0% e 5,0% de sacarose. Também, seis formulações liofilizadas genérico potenciais foram testadas em cada um dos incrementos de unidade de pH, tais como:

1) histidina a 20 mM, 2,0% de glicina, 1,0% de sacarose no pH 5,0

2) histidina a 20 mM, 2,0% de glicina, 1,0% de sacarose no pH 6,0

3) histidina a 20 mM, 2,0% de glicina, 1,0% de sacarose no pH 7,0

4) histidina a 20 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 5,0

5) histidina a 20 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 6,0

6) histidina a 20 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 7,0

Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material volumétrico purificado foi obtido na formulação líquida congelada de 30 mg/ml. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. O ciclo de liofilização ciclo ainda modificado. A etapa de recozimento foi realizada a 15°C para permitir a cristalização da glicina e durou 5 horas. A secagem primária foi realizada inicialmente a -30°C por um período mais curto de tempo (4 h). Depois a temperatura de prateleira foi elevada a -25°C e mantida

196 constante por 24 horas. Entretanto, a secagem primária não atingiu completamente a conclusão a -25 °C como evidenciado por um pico pequeno no vácuo conforme a temperatura de prateleira foi aumentada ainda mais até 0°C. Não obstante, nenhum colapso maior foi observado e as amostras se processaram com êxito até a secagem secundária primeiro a 0°C e depois a 25°C. Até 6 meses os dados de estabilidade no estado de liofilizado foram gerados a 37°C para avaliar a estabilidade de longa duração do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3. Aumentos no pH resulta na perda do pico principal para todas as formulações de histidina. Apenas formulações genéricas foram monitoradas até 6 meses, mas a vantagem do pH próximo a 5,0 já foi óbvia para os pontos de tempo de 1 e 3 meses. Além disso, os dados de 6 meses para as formulações genéricas sugerem que as formulações de manitol + sacarose são mais estáveis do que a glicina + sacarose, especialmente no pH 6 e mais alto.

No caso de formulações de glutamato e succinato houve também um aumento dependente de pH evidente na quantidade de dímero, o produto de degradação principal, conforme o pH tomou-se menos ácido. A dependência de pH similar é observada para os agregados. A recuperação mais alta do pico principal foi observada para o pH 5 e abaixo. A perda inicial do pico principal para T = 0 pode ser explicada pela degradação de proteína durante a troca de tampão e concentração como evidenciado por uma perda similar para as formulações antes da liofilização. Entretanto, os dados de estabilidade de 3 meses sugerem que as formulações de glutamato tiveram estabilidade física mais alta do que as suas contrapartes de succinato (com o mesmo pH). Deve ser mencionado que neste estudo nós também testamos o efeito das concentrações de sacarose aumentadas sobre a estabilidade das formulações de succinato. Além de 3,5% de sacarose, nós comparamos as formulações de 2,0% e 5,0% de sacarose em succinato, pH 4,5. O aumento na sacarose diminuiu as espécie de peso molecular alto em algum grau, mas a

197 mesma não afetou significantemente a quantidade do pico principal. Portanto, 3,5% de sacarose foram considerados ótimos visto que tais formulações mais intimamente se igualaram com a tonicidade fisiológica.

Uma das espécies cortadas foi observada crescer em pH baixo pela RP-HPLC. Uma porção significante do corte dependente do pH nas formulações liofilizadas ocorreu antes da liofilização como um resultado da troca de tampão consumidora de tempo e etapas de concentração de proteína. Depois da liofilização nenhum aumento significante na quantidade de cortes foi observado mesmo depois da armazenagem por 3 a 6 meses a 37°C. No geral os dados sugerem usar formulações de pH mais alto para mitigar o corte visto que o mesmo não é observável no pH 6 e acima. Entretanto, a quantidade do dímero é significante no pH mais alto e pode ser tão alto quanto 2,5 a 4,5% no pH 6 e acima. Portanto, uma ajuste pode ser encontrado na formulação do peptídeo de ligação de Fc-Agp-3 no pH 5, onde o corte é moderado, especialmente nos tampões de glutamato e histidina e quando a formação de dímero é ainda suficientemente suprimida.

Conclusão

2,5% de manitol e 3,5% de sacarose forneceram estabilidade de torta e proteína suficiente como confirmado pelo estudo de prateleira em 6 meses a 37°C. Portanto, a histidina a 10 mM, 2,5% de manitol, 3,5% de sacarose no pH 5,0 e glutamato a 10 mM, 2,5% de manitol, 3,5% de sacarose no pH 5,0 podem ser usados para formular 30 mg/ml de peptídeo de ligação de Fc-Agp-3. Além disso, este estudo mostra que a histidina a 20 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 5,0 também desempenha bem e pode ser considerada como uma formulação de liofilização genérica possível para os pepticorpos.

Exemplo 10

Peptídeo de ligação de Fc-Myo Liofilizado

De modo a determinar a formulação ótima para o peptídeo de

198 ligação de Fc-Myo liofilizado, análises foram realizadas que avaliaram a agregação e estabilidade do peptídeo de ligação de Fc-Myo em vários valores de pH, as concentrações excipientes e concentrações de proteína.

O peptídeo de ligação de Fc-Myo é um pepticorpo ligado em C contra a proteína de miostatina intencionada contra as doenças relacionadas com o enfraquecimento muscular. O pepticorpo é construído de dois polipeptídeos ligados dissulfeto não glicosilados com uma massa total de —59,1 kD. O ponto isoelétrico para este pepticorpo foi estimado estar no pH 6,88.

SEQÜÊNCIA Fc (SEQ ID NQ: 1699):

MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRD

ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQÜÊNCIA DE PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE MIOSTATINA (SEQ ID

NO: 1700):

GGGGGAQLADHGQCIRWPWMCPPEGWE

Assim, a seqüência de peptídeo de ligação de Fc-Myo é como segue:

MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA

KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQLAD

199

HGQCIRWPWMCPPEGWE (SEQ ID NO: 1701)

Determinação da condição de pH para o peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado

A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade em temperaturas elevadas. Um estudo de triagem de pH foi planejado e realizado para determinar o pH de formulação ótimo no estado líquido antes da liofilização. A proteína foi formulada nos pHs 4,5, 4,75, 5,0, 5,5 e 6,0 com agentes de tampão de acetato e histidina e sacarose como o estabilizador (ou lio protetores). Os frascos formulados foram armazenados a 29 C por até 1 ano. A estabilidade foi monitorada usando SE-HPLC. As constantes de taxa de agregação foram calculadas para cada uma das condições de formulação. A taxa de agregação no pH 4,5 foi descoberta ser a mínima, portanto o pH 4,5 foi selecionado como a condição de pH de formulação preferida.

Estudo do agente de tampão do peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado a mg/ml.

A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Uma forma de dosagem de 30 mg/ml como investigada usando três agentes de tamponamento diferentes: glutamato a 10 mM, histidina a 10 mM e succinato a 10 mM no pH 4,5. Todas as formulações contêm 0,004% de polissorbato 20.

Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material de volume purificado foi obtido na formulação líquida congelada de 30 mg/ml. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A formulação de proteína liofilizada demonstrou elegância de torta aceitável. Na reconstituição as formulações foram claras. O peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado foi armazenado a 4, 29, 37 e 52°C. Os estudos de estabilidade em

200 tempo real foram realizados a 4°C e descobertos ser comparáveis para estas formulações por até 3 meses. Entretanto em 3 meses de armazenagem a 52°C, a formulação contendo histidina foi levemente melhor do que a formulação contendo glutamato. A formulação contendo succinato foi significantemente menos estável do que as outras duas formulações. Com base nestes resultados, a histidina e glutamato foram consideradas como os agentes de tampão preferidos para a formulação de peptídeo de ligação de Fc-Myo final.

Estudo de Excipiente de Peptídeo de Ligação de Fc-Myo Liofilizado a 30 mg/ml: efeito de estabilização da sacarose, trealose e hidroxietil amido

A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Para avaliar o efeito da presença de trealose, hidroxietil amido e sacarose sobre a estabilidade do peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado, o peptídeo de ligação de Fc-Myo foi formulado a 30 mg/ml em tampão de glutamato a 10 mM com 4% de manitol. A concentração de trealose e sacarose usada foi de 2,0%, 1% de hidroxietil amido foi adicionado à formulação de sacarose para compor uma formulação final de glutamato a 10 mM, 4% de manitol, 2% de sacarose, 1% de hidroxietil amido. Todas as formulações contêm 0,004% de polissorbato 20.

Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material volumoso purificado foi obtido na formulação líquida a 30 mg/ml congelada. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A formulação de proteína liofilizada demonstrou elegância aceitável. Na reconstituição as formulações foram claras.

A estabilidade destas formulações foi monitorada usando a

SE-HPLC.

O peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado foi armazenado a 4, 29, 37 e 52°C. A estabilidade na condição de tempo de prateleira em tempo

201 real (4°C) foi descoberto ser comparável entre estas formulações por até 3 meses. Entretanto sob condição de armazenagem a 52°C por 3 meses, a formulação contendo sacarose foi levemente melhor do que a formulação contendo trealose. A adição de hidroxietil amido não demonstra nenhum impacto negativo sobre a estabilidade, com base nestes resultados, a sacarose foi considerada como o estabilizador preferido para a formulação de peptídeo de ligação de Fc-Myo final.

Estudo de Excipiente de Peptídeo de Ligação de Fc-Myo Liofílizado a 30 mg/ml: efeito estabilizante de sacarose e manitol

A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Para avaliar o efeito da presença de quantidade variável de manitol e sacarose sobre as propriedades de estabilidade e reconstituição de peptídeo de ligação de Fc-Myo liofílizado na faixa de manitol de 4,0 a 8% e a faixa de sacarose de 1,0% a 4,0%, o peptídeo de ligação de Fc-Myo foi formulado a 30 mg/ml em tampão de glutamato a 10 mM. Todas as formulações contiveram 0,004% de polissorbato 20.

Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material de volume purificado foi obtido na formulação líquida congelada de 30 mg/ml. O material foi dialisado nos tampões de formulação apropriados e liofilizados em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A formulação de proteína Iiofilizada demonstrou elegância de torta aceitável. Na reconstituição as formulações foram claras.

A estabilidade destas formulações foi monitorada usando o método de SE-HPLC. O peptídeo de ligação de Fc-Myo liofílizado foi armazenado a 4, 29, 37 e 52°C. A estabilidade na condição de prateleira em tempo real (4°C) foi descoberta ser comparável entre estas formulações por até 3 meses. Entretanto quando armazenadas a 52°C por 3 meses, uma quantidade crescente de sacarose foi descoberta contribuir para o aumento na

202 estabilidade contra a agregação. Devido a um interesse em manter a condição isotônica para a formulação final que limita a quantidade total de dissacarídeos e para manter uma razão apropriada de manitol e sacarose para preservar a propriedade da torta liofilizada, 4,0% de manitol e 2,0% de sacarose foram os excipientes preferidos para a formulação final.

Estudo de Excipiente de Peptídeo de Ligação de Fc-Myo Liofilizado a 1, 30, mg/ml

A estabilidade foi avaliada primariamente pela HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC), que foi indicativa de estabilidade. Para avaliar o efeito da concentração da proteína sobre as propriedades de estabilidade e reconstituição do peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado, o peptídeo de ligação de Fc-Myo foi formulado a 1, 30, 85 mg/ml em tampão de glutamato a 10 mM com 4% de manitol e 2% de sacarose. Todas as formulações contêm 0,004% de polissorbato 20.

Para o trabalho de desenvolvimento de formulação, o material volumoso purificado foi obtido na formulação líquida congelada a 30 mg/ml. O material foi trocado de tampão nos tampões de formulação apropriados usando UF/DF e liofilizado em um liofilizador Virtis usando um ciclo conservativo. A formulação de proteína liofilizada demonstrou elegância de torta aceitável. Na reconstituição as formulações foram claras.

A estabilidade destas formulações foi monitorada usando o método de SE-HPLC. O peptídeo de ligação de Fc-Myo liofilizado foi armazenado a 4, 29, 37°C. a estabilidade na condição de tempo de prateleira em tempo real (4°C) foi descoberta ser comparável entre estas formulações por até 6 meses. A estabilidade é provavelmente aceitável para todas as concentrações estudadas como a formulação de produto comercial.

Conclusão

4,0% de manitol e 2,0% de sacarose forneceram estabilidade de torta e proteína suficientes como confirmado pelo estudo de prateleira de

203 meses a 4°C. Portanto, a histidina a 10 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 4,5 e glutamato a 10 mM, 4,0% de manitol, 2,0% de sacarose no pH 4,5 podem ser usados para formular de 1 a 100 mg/ml de peptídeo de ligação de Fc-Myo.

A presente invenção foi descrita em termos das formas de realização particulares descobertas ou propostas para compreender os modos preferidos para a prática da invenção. Será avaliado por aqueles de habilidade comum na técnica que, considerando a presente divulgação, numerosas modificações e mudanças podem ser feitas nas formas de realização particulares exemplificadas sem divergir do escopo pretendido da invenção.

1/2

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição de pepticorpo terapêutico liofílizado estável, caracterizada pelo fato de que compreende um tampão, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e um tensoativo, em que:

   o dito tampão é histidina a lOmM; o pH é 5,0;

   o dito agente de encorpamento é manitol a 4% p/v; o dito agente estabilizante é sacarose a 2% p/v; o dito tensoativo é polissorbato-20 a 0,004% p/v; a dita concentração de pepticorpo terapêutico é 0,5 mg/mL; e o dito pepticorpo terapêutico é um dímero compreendendo uma estrutura da Fórmula

   F^Uy pcq^yp² em que:

   P¹-^²)^² é SEQ ID NO: 1017;

   F¹ é um domínio Fc apresentado na SEQ ID NO: 1, em que o domínio Fc está ligado no término N de -(L')_C-P^I-(L²)|-P².
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que metionina está no término N do pepticorpo, SEQ ID NO: 1 está no término C da dita metionina e a SEQ ID NO: 1017 está no término C do pepticorpo.
3. 3. Kit para preparar uma composição farmacêutica aquosa, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro recipiente tendo uma composição de pepticorpo terapêutico liofílizado como definida na reivindicação 1 e um segundo recipiente tendo um solvente fisiologicamente aceitável para a composição liofilizada.
4. 4. Método para fabricar um pepticorpo terapêutico liofílizado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a) preparar uma solução de pepticorpo terapêutico

   Petição 870180057095, de 02/07/2018, pág. 9/10

   2/2 compreendendo um tampão, um agente de encorpamento, um agente estabilizante e um tensoativo como definida na reivindicação 1; e

   b) liofilizar o dito pepticorpo terapêutico;

   em que o dito pepticorpo terapêutico é um dímero compreendendo uma estrutura apresentada na Fórmula

   F¹-^- ^-(LVP² em que:

   F¹- (L^e-P¹¹^²)^² é SEQ ID NO: 1017

   F¹ é um domínio Fc apresentado na SEQ ID NO: 1, em que o domínio Fc está ligado no término N de L'-P'-L²-P²;

   em que a concentração de pepticorpo terapêutico é 0,5 mg/mL.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que ainda compreende, antes da liofilização, as etapas de:

   b) ajustar o pH da solução a um pH entre cerca de 4,0 e cerca de 8,0;

   c) preparar uma solução contendo o dito pepticorpo terapêutico;

   d) trocar o tampão da solução da etapa (c) na solução da etapa (b);

   e) adicionar um tensoativo; e

   f) liofilizar a mistura da etapa (e).
6. 6. Método para preparar uma composição de pepticorpo terapêutico reconstituído, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a) liofilizar uma composição de pepticorpo terapêutico como definida na reivindicação 1 ou 2; e

   b) reconstituir a dita composição liofilizada de pepticorpo terapêutico.

   Petição 870180057095, de 02/07/2018, pág. 10/10