BRPI0710564A2 - agentes anti-cáncer a base de polìmero - Google Patents

Abstract

<B>AGENTES ANTI-CáNCER A BASE DE POLìMERO.<D> A presente invenção refere-se ao uso de copolímeros em bloco anfifílicos para o tratamento e prevenção de câncer, e em particular pela redução da taxa de proliferação de células cancerígenas. Os copolímeros em bloco preferidos compreendem uma cadeia hidrofóbica central, preferivelmente uma cadeia de óxido de polipropileno, à qual pelo menos duas cadeias laterais hidrofílicas, preferivelmente cadeias de óxido de polietileno, estão conectadas.

Description

AGENTES ΑΝΤΙ-CÂNCER A BASE DE POLÍMEROCAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se genericamente ao tratamento de câncer, e em particular ao uso de agentesanti-câncer a base de polímero em tal tratamento de câncer.

ANTECEDENTES

Câncer é uma classe de doenças caracterizada pordivisão celular descontrolada e pela capacidade destas células se espalharem, ou por crescimento direto em tecidoadjacente por invasão, ou por implante em locais distantesno interior do corpo por metástase.

Atualmente, o câncer é uma das causas principais demorte em humanos e o número de indivíduos afetados aumenta a cada ano. Embora os diferentes métodos de tratamentopara câncer, por exemplo, quimioterapia, terapia endócrina,radioterapia e cirurgia, tenham melhorado tremendamente nasúltimas décadas, estão longe de serem perfeitos em termosde resultados para diferentes tipos de câncer. Adicionalmente, vários dos tratamentos conhecidos de câncersão frustrados pelas desvantagens dos altos custos dotratamento, efeitos colaterais e sofrimento do paciente eineficiência relativa. Por estas razões, pesquisasextensivas são conduzidas para se encontrar uma alternativa ou formas complementares do tratamento de câncer.

O documento [1] descreve o uso de laxantes osmóticosnão fermentados como agentes ativos para a preparação de ummedicamento para o tratamento de cânceres do cólon e/oureto. Um exemplo de tal laxante é o PLURONIC® F68 disponibilizado pela BASF Corporation. Estes compostosapresentam propriedades laxantes e gelificantes. Oscompostos atraem e retêm água no interior do cólon devidoàs suas propriedades físico-químicas, e são capazes deaumentar a excreção fecal sem fibras. Acredita-se que aspropriedades laxantes, não fermentadas, osmóticas e deretenção de água, apresentam um efeito protetor em relaçãoa dois tipos específicos de câncer, câncer de cólon e reto.

O documento [2] discute a capacidade de célulastumorais em circulação de se desenvolverem em metástase,onde esta capacidade baseia-se em uma aderênciafisioquímica inerente ao endotélio e na formação de ummicro-coágulo. É descrito que substâncias que interferemcom o processo de coagulação poderiam ser utilizadas naprevenção de metástase tumoral. As substâncias sugeridasincluem heparina, warfarina sódica e PLURONIC® F68. Estassubstâncias podem ser utilizadas em conexão com cirurgiapara a prevenção de metástase secundária na manipulaçãocirúrgica do tumor.

SUMÁRIO

A presente invenção supera estas e outrasdesvantagens dos dispositivos do estado da técnica.

É um objetivo genérico da presente invenção prover ummedicamento a base de polímero que pode ser utilizada parao tratamento ou prevenção de câncer.

É um outro objetivo da invenção prover um medicamentoa base de polímero que reduz a proliferação de célulascancerígenas.

Estes e outros objetivos são alcançados pela invençãoconforme definida nas reivindicações anexas.Em resumo, a presente invenção envolve a utilizaçãodo efeito anti-câncer inesperado de copolímeros em blocoanfifílicos. Estes copolímeros são agentes quimioterápicosefetivos contra uma diversidade de tipos de câncer eapresentam um efeito de redução da taxa de proliferação emcélulas cancerígenas.

Os copolímeros em bloco anfifílicos da presenteinvenção preferivelmente compreendem uma cadeia poliméricahidrofóbica conectada a pelo menos duas cadeias lateraishidrofílicas. A cadeia polimérica hidrofóbica épreferivelmente uma cadeia central apresentando umaprimeira extremidade conectada a pelo menos uma,preferivelmente uma ou duas, cadeia lateral hidrofíIica eapresentando uma segunda extremidade conectada a pelo menosuma, preferivelmente uma ou duas, cadeia lateralhidrofílica.

Copolímeros em bloco anfifílicos preferidos sãoaqueles apresentando a estrutura (I) :

HO-(CH2CH2O)n-(CH2CHCH3O)m-(CH2CH2O)p-H (I)

Desta forma, copolímeros com uma cadeia poliméricacentral de óxido de propileno flanqueada por cadeiaslaterais de óxido de etileno são preferidos.

Adicionalmente, η é preferivelmente igual a p. Taiscopolímeros são disponibilizados sob a marca PLURONIC pelaBASF Corporation.

Copolímeros preferidos tais como PLURONIC dainvenção são aqueles que apresentam um teor médio de óxidode etileno de pelo menos 40% em peso e preferivelmente umteor médio de óxido de etileno abaixo de 80% em peso. Oteor de óxido de propileno médio do copolímero em blocoanfifílico é preferivelmente de pelo menos 2000 g/mol, maispreferivelmente de pelo menos 3000 g/mol, tal como cerca de4000 ± 500 g/mol. Um exemplo de um copolímero preferido éo PLURONIC® F127 apresentando um peso molecular médio de12 600 g/mol, um teor médio de óxido de etileno de 73,3 ±1,7% e xim ponto de fusão de 56aC.

Os inventores descobriram surpreendentemente queestes copolímeros apresentam efeito anti-câncer em termosde redução ou inibição da proliferação celular ou taxa decrescimento das células cancerígenas e de redução dasíntese de DNA das células cancerígenas. Este efeitosurpreendente pode ser devido parcialmente ao efeito daligação dos copolímeros às membranas celulares e bloqueioda ligação dos diferentes fatores de crescimento aos seusrespectivos receptores na membrana.

A composição farmacêutica da invenção preferivelmentecompreende um único copolímero em bloco anfifílico dainvenção ou uma mistura de pelo menos dois de taiscopolímeros como os únicos agentes quimioterapêuticos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção juntamente com objetivos e vantagensadicionais desta, podem ser melhor compreendidos comreferência à descrição a seguir tomada em conjunto com osdesenhos anexos, nos quais:

A Fig. 1 é um diagrama ilustrando os efeitos doPLURONIC® F127 sobre a taxa de crescimento da linhagemcelular MCF-7 de câncer de mama humano.A Fig. 2 é um diagrama ilustrando os efeitos doPLURONIC® F127 sobre a taxa de crescimento da linhagemcelular SK-BR-3 de câncer de mama humano.

A Fig. 3 é um diagrama ilustrando os efeitos doPLURONIC® F127 sobre a taxa de crescimento de célulasvasculares do músculo liso humano estimulado por FCS.

A Fig. 4 é um diagrama ilustrando os efeitos doPLURONIC® F127 sobre a taxa de crescimento de célulasaórticas do músculo liso de rato estimulado por FCS.

A Fig. 5 é um diagrama ilustrando uma comparação dacitotoxidade mediada por célula do PLURONIC® F127 e TritonX-100.

A Fig. 6 é um diagrama ilustrando o efeito deinibição do crescimento celular de diferentes copolimerosem bloco anfifílicos sobre células do músculo liso vascularhumano estimulado por FCS.

A Fig. 7 é um diagrama ilustrando a correlação entrea inibição da taxa de crescimento do PLURONIC® F127 sobrecélulas do músculo aórtico de rato estimuladas e o efeitodo PLURONIC® F127 no bloqueio da ligação do fator decrescimento de fibroblasto a receptores nas células demúsculo liso.

A Fig. 8 é um diagrama ilustrando o efeito doPLURONIC® F127 no bloqueio da ligação do fator decrescimento derivado de plaqueta aos receptores em célulasdo músculo liso aórtico de rato.

A Fig. 9 é um diagrama ilustrando a densidade celularem uma fibra oca com células cancerígenas U967/gtbimplantada em camundongos com ou sem tratamento comPLURONIC® P105.A Fig. 10 é um diagrama ilustrando a densidadecelular em uma fibra oca com células cancerígenas H69implantada em camundongos com ou sem tratamento comPLURONIC® Pl05.

A Fig. 11 é um diagrama ilustrando o índice desobrevivência de células cancerígenas U937/gtb expostas adiferentes copolímeros em bloco anfifílicos.

As Figs. 12A a 120 são diagramas ilustrando o índicede sobrevivência de células cancerígenas U937/gtb expostasa diferentes copolímeros em bloco anfifílicos.

E as Figs. 13A a 13 C são diagramas ilustrando oíndice de sobrevivência de diferentes linhagens de célulascancerígenas expostas a PLURONIC® P84, F127 ou L121.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção refere-se genericamente aotratamento de câncer e em particular ao uso de copolímerosem bloco anfifílicos para inibir e reduzir a taxa decrescimento e a taxa de proliferação de célulascancerígenas.

Os compostos ativos anti-câncer da presente invençãosão copolímeros em bloco anfifílicos de monômeroshidrofóbicos e hidrofílicos. Os copolímeros em bloco,desta forma, compreendem pelo menos uma parte solúvel emágua (hidrofílica) e pelo menos uma parte menos solúvel emágua ou mesmo insolúvel em água (hidrofóbica) . Noscopolímeros em bloco presentemente preferidos, uma cadeiacentral hidrofóbica é circundada por pelo menos duascadeias laterais hidrofílicas. Mais preferivelmente, acadeia central hidrofóbica apresenta uma primeiraextremidade de cadeia conectada a pelo menos uma,preferivelmente uma ou duas, cadeias laterais hidrofílicase apresenta uma segunda extremidade de cadeia conectada apelo menos uma, preferivelmente uma ou duas, cadeiaslaterais hidrofílicas. As fórmulas (II) e (III) abaixoilustram esquematicamente tais copolímeros em blocoanfifílicos:

X-Y-Z (II)

<formula>formula see original document page 8</formula>

onde Χ, Χ1, X2 e Z, Z1, Z2 representam uma cadeia lateralhidrofílica respectiva e Y representa uma cadeia centralhidrofóbica. Em uma implementação preferida X=Z, e X1=X2,Z1=Z2 e mais pref erivelmente X1=X2=Z1=Z2.

Em uma realização preferida, os copolímeros em blocoanfifílicos da presente invenção são copolímeros em blocode óxido de etileno. Vários de tais copolímeros diferentesestão disponíveis atualmente de diferentes fabricantes,

incluindo PLURONIC® e TETRONIC® da BASF Corporation.

Em resumo, o PLURONIC® e um copolímero de óxido deetileno (EO) e óxido de propileno (PO) apresentando aestrutura geral (III) :

(EO)n-(PO)m-(EO)p (IV)

ou a estrutura mais detalhada (I):

HO- (CH2CH2O)n- (CH2CHCH3O)m- (CH2CH2O)p-H (I)Em uma realização preferida n = p.

A Tabela I abaixo lista vários polímeros PLURONICdisponibilizados pela BASF e que podem ser utilizados deacordo com a presente invenção.

<table>table see original document page 9</column></row><table><table>table see original document page 10</column></row><table>

* Viscosidade [Brookfield] 25ºC** Viscosidade [Brookfield] a 60ºC*** Viscosidade [Brookfield] a 77ºC

Como sabido na técnica, a designação alfabética donome do produto PLURONIC® denota a forma física do produtoa 25SC, onde "L" representa a forma líquida, "P" representaa fora de pasta e "F" representa a forma sólida. Oprimeiro dígito ou os dois primeiros dígitos em um nome de produto com três dígitos multiplicados por 300 indicam opeso molecular médio aproximado da cadeia centralhidrofóbica de óxido de propileno. 0 último dígito, quandomultiplicado por 10, indica o teor de óxido de etilenoaproximado (em %) do polímero. Este teor de óxido de etileno pode ser calculado pela equação (1):

<formula>formula see original document page 10</formula>

onde m, n e ρ são definidos na estrutura (I).Se a parte hidrofóbica ou solúvel em lipídeo (PO) éreduzida em demasia, isto é, m é iam número integradorpequeno, o efeito inibidor de crescimento é reduzidoconsideravelmente. Como conseqüência, os copolimerosPLURONIC® preferidos da presente invenção são, por estarazão, aqueles que apresentam uma parte hidrofóbica que éde pelo menos 2000 g/mol, isto é, aqueles polímerosPLURONIC® da Tabela I que apresentam um nome de produto comtrês dígitos ou em que o primeiro dígito no nome do produtoé acima de seis.

Adicionalmente, mostrou-se também que os copolimerosPLURONIC® apresentando um teor hidrofílico alto, isto é, umteor de óxido de etileno aproximado de cerca de 80% oumais, apresentam o efeito anti-câncer menos efetivo doscopolimeros testados. Estes copolimeros apresentam um 8como último dígito no nome do produto na Tabela I.

Se o teor de óxido de etileno do copolímero em blocoé muito baixo em relação ao teor de óxido de propileno, ocopolímero é menos solúvel em água ou mesmo insolúvel emágua. Tais copolimeros em bloco podem ser menos úteisclinicamente na medida em que então um solvente não aquosodeve ser utilizado.

Além disto, se tanto m, n e ρ na estrutura (I) foremmuito baixos, tal como L31, L42, L43, L44, L61, L62 e L63,isto é, um copolímero em bloco hidrofóbico relativamentecurto, o polímero se torna tóxico tanto para ccecancerígenas quanto para células não cancerígenas. Comoconseqüência, concentrações farmacêuticas mais baixas devemser utilizadas para tais copolimeros.Exemplos de copolímeros PLURONIC® atualmentepreferidos incluem F127, P94, P105, P123, F87 e L121 e emparticular F127.

Foram conduzidos experimentos nos quais uma dascadeias laterais hidrofilicas de um copolímero PLURONIC® éremovida. Em tal caso, o efeito inibidor éconsideravelmente reduzido ou mesmo perdido. Comoconseqüência, copolímeros anfifílicos preferidos dapresente invenção compreendem pelo menos duas cadeiashidrofilicas (óxido de polietileno) conectadas a uma cadeiahidrofóbica (óxido de polipropileno).

Outros copolímeros relacionados que podem serutilizados de acordo com a invenção são os polímerosTETRONIC® também disponibilizados pela BASF Corporation.Estes copolímeros podem ser representados pela seguinteestrutura (V):

<formula>formula see original document page 12</formula>

A Tabela II abaixo lista algumas propriedades dospolímeros TETRONIC®.Tabela II - copolímeros TETRONIC <table>table see original document page 13</column></row><table>

* Viscosidade [Brookfield] 25°C** Viscosidade [Brookfield] a 60°C*** Viscosidade [Brookfield] a 77°C

Destes copolímeros TETRONIC® , o TETRONIC® 1307 é umcopolímero anfifílico atualmente preferido de acordo com apresente invenção. O copolímero 1307 apresenta um efeitoanti-câncer eficiente, enquanto sendo solúvel em água erelativamente não tóxico a células não em proliferação.

Também outros copolímeros em bloco anfipáticos(anfifílicos) podem ser utilizados de acordo com ainvenção. Por exemplo, um copolímero apresentando umacadeia central de poliestireno conectada as respectivascadeias laterais de óxido de polietileno, apresenta umefeito inibidor de crescimento. Desta forma, a presenteinvenção engloba também outro copolímero em blocoanfifílico além dos compreendendo uma cadeia de óxido depolietileno e cadeias laterais de óxido de polietilenomúltiplas.

A BASF Corporation tem também outros copolímeros embloco anfifílicos relacionados que se relacionam com oscopolímeros PLURONIC® e TETRONIC®. O PLURONIC® R é umcopolímero no qual o óxido de etileno e o óxido depropileno apresentam locais alterados em comparação com oPLURONIC . Em outras palavras, o polímero apresenta aseguinte estrutura geral:

<formula>formula see original document page 14</formula>

A Tabela III lista tais copolímeros disponíveis.

Tabela III - copolímeros PLURONIC® R

<table>table see original document page 14</column></row><table>

* Viscosidade [Brookfield] a 259C.

Correspondentemente, copolímeros nos quais o óxido deetileno e o oxido de propileno do TETRONIC® apresentamlocais alterados são denotados como polímeros TETRONIC® R.A Tabela IV lista tais polímeros disponibilizados pela BASFCorporation.

Tabela IV - copolímeros TETRONIC® R

<table>table see original document page 15</column></row><table>

* Viscosidade [Brookfield] a 25SC.

Deve ser observado que quando o peso molecular doscopolímeros é colocado neste documento, significa o pesomolecular teórico médio. Como bem conhecido de umespecialista na técnica, em uma dada batelada de umcopolímero particular nem todas as moléculas do polímeroirão apresentar comprimento e peso molecular idênticos.Desta forma, um dado peso molecular é um valor médio e háuma distribuição em torno deste valor médio. A mesmadiscussão da distribuição em torno de um valor médio seaplica à hidrofilicidade do copolímero, por exemplo, talcomo expressa pelo teor médio de óxido de etileno dopolímero.

Os copolímeros da invenção são inibidores efetivos docrescimento de câncer in vitro mesmo em doses muito baixas.0 efeito de inibição de crescimento é, além disto, maispronunciado em células cancerígenas de crescimento rápidoquando em comparação com células cancerígenas decrescimento lento. Adicionalmente, pelo menos alguns dospolímeros em bloco anfifílicos da presente invenção nãoapresentam qualquer função afetando a proliferação decélulas não cancerígenas, a não ser que sejam estimuladaspela adição de fatores de crescimento diferentes.

Os copolímeros podem ser utilizados para reduzir enormalizar a taxa de crescimento de diferentes tipos delinhagens de célula cancerígena. Os copolímeros, alémdisto, parecem reduzir a alta proliferação para a taxa decrescimento normal, mas não além. Como conseqüência, ascélulas não cancerígenas não serão afetadas uma vez que jáproliferam na taxa de crescimento normal baixa.

Uma vez a taxa de crescimento das célulascancerígenas ter sido reduzida, o sistema imunológico dopaciente (humano) pode mais efetivamente lidar com ecombater as células cancerígenas de maneira a eliminar ocâncer.

Os copolímeros da presente invenção podem tambématuar na prevenção ou pelo menos na redução da taxa na quala mutação ocorre nas células cancerígenas. Esta observaçãoé extremamente importante, uma vez que reduz o risco deformação de células cancerígenas que, devido às mutações,são mais propícias a evitar ou combater os mecanismos dedefesa inerentes ao câncer de um indivíduo.

De acordo com a invenção, os copolímeros em blocoanfifílicos podem ser providos como formulaçõesfarmaceuticamente aceitáveis, utilizando-se métodos deformulação conhecidos dos especialistas na técnica. Estasformulações podem ser administradas por rotas padrão. Emgeral, o copolímero pode ser administrado por viaintravenosa, subcutânea, bucal, retal, dérmica, nasal,oral, brônquica, tópica, por qualquer outra rota parenteralou por inalação, na forma de uma preparação farmacêuticacompreendendo o ingrediente ativo em uma forma de dosagemfarmaceuticamente aceitável.

Uma rota de administração atualmente preferida é umaadministração intravenosa, na qual a composiçãofarmacêutica compreende o copolímero anfifílico da invençãoem uma solução de um solvente selecionado.

Em uma realização de administração particular, asolução contendo o copolímero é injetada uma vez oupreferivelmente múltiplas vezes a uma pessoa necessitandode tratamento de câncer. É também possível se empregar umaadministração contínua ou semi-contínua do medicamento apartir, por exemplo, de uma bomba médica ou outro equipamento de administração. Também administrações pormeio da assim chamada liberação lenta é possível e dento doescopo da presente invenção.

Em uma outra realização particular, uma administraçãolocal no ou em conexão com o tumor pode ser utilizada parapossibilitar uma concentração local relativamente alta doingrediente ativo. Esta administração local pode seracompanhada de uma ou mais administrações sistêmicas.

Em geral, as formulações são preparadas por misturauniforme e íntima do ingrediente ativo em associação comveículos preferivelmente líquidos ou algumas vezes veículossólidos finamente divididos ou ambos, e então, senecessário, formatação do produto.

Formulações adequadas para administração parenteralincluem soluções injetáveis estéreis aquosas e não aquosasque podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostáticose solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue doreceptor a que se destina, e suspensões estéreis aquosas enão aquosas que podem incluir agentes de suspensão eagentes espessantes. As formulações podem ser apresentadasem recipientes de dose unitária ou de dose múltipla, porexemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadasem condições de liofilização requerendo apenas a adição doveículo líquido estéril, por exemplo, água injetável,imediatamente antes da utilização.

Em particular para os copolímeros insolúveis em águada presente invenção, outros meios além dos meios aquosospodem ser utilizados quando da injeção dos fármacos. Umexemplo de tal meio é polietilenoglicol (PEG). Outrosexemplos incluem emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo. Umóleo mineral ou outra substância oleosa tal como Drakeol6VR ou Drakeol 5 (Penreco, Butler, PA) pode ser utilizadocomo a fase oleosa da emulsão. A fase aquosa pode sersolução salina fisiológica tamponada com fosfato ou outrasolução salina fisiológica. A proporção de óleo para águaé preferivelmente entre aproximadamente 80:20 e 1:100.

Formulações adequadas para administração oral podemser apresentadas como cápsulas, pílulas ou tabletes cada umcontendo uma quantidade predeterminada do ingredienteativo, como pó ou grânulos; como uma solução ou umasuspensão ou emulsão em um líquido aquoso ou um líquido nãoaquoso. Formulações adequadas para administração tópica àpele podem ser apresentadas como ungüentos, cremes, géis epastas compreendendo o ingrediente a ser administrado em umveículo farmaceuticamente aceitável. Formulações paraadministração retal podem ser apresentadas como umsupôsitório com uma base adequada compreendendo, porexemplo, manteiga de cacau ou um salicilato. Formulaçõesadequadas para administração vaginal podem ser apresentadascomo pessários, cremes, géis, pastas, espumas ouformulações em spray contendo em adição ao ingredienteativo veículos conhecidos na técnica como apropriados.

Exemplos de formulações em dosagem unitária sãoaquelas contendo uma dose ou unidade diária, uma sub-dosediária, conforme mostrado acima, ou uma fração apropriadadesta, do ingrediente administrado.

A dosagem máxima permitida que pode ser utilizada deacordo com a presente invenção depende, entre outros, datoxidez do copolímero em bloco anfifílico particular, deseu efeito anti-câncer, isto é, do efeito inibidor sobre ataxa de crescimento, e da rota de administração. Aconcentração máxima permitida de um copolímero anfifílicopode ser estimada de acordo com o estudo de toxidezdescrito na seção dos Exemplos do presente documento. Oresultado de tal estudo de toxidez em camundongos ou outroanimal pode ser então correlacionado com as concentraçõesmáximas permitidas estimadas para outros animais, incluindohumanos, utilizando-se técnicas bem conhecidas. Porexemplo, pode ser utilizada a tabela de fator de conversãode dosagem de Freireich et al. [17]. De acordo com estatabela de fator de conversão vim fato de conversão decamundongo para humano de cerca de 1/12 é sugerido,implicando no fato de se uma concentração de polímeromáxima de X% é permitida em camundongos, a concentraçãomáxima estimada correspondente em humanos é de cerca deX/12%.Por exemplo, estudos de toxidez em camundongomostraram que a concentração de polímero máxima de cerca de30% em peso pode seguramente ser injetada em camundongossem qualquer efeito colateral. Isto então corresponderia aum limite de concentração de cerca de 2,5% em peso paraadministração a humanos. Alguns dos copolímerosanfifílicos listados acima da presente invenção, incluindoPLURONIC® , foram submetidos a estudos em fase clinica einvestigações extensivas quanto a toxidez.

As concentrações utilizadas para a administração dospolímeros podem ser determinadas pelo especialista natécnica com base nos procedimentos descritos acima.Espera-se que uma concentração de polímero de até 3 0% empeso, tal como até 25, 20, 25 ou 10% em peso, ou até 7,5%em peso, pref erivelmente 0,001 a 5% em peso, maispreferivelmente pelo menos 0,01% em peso, tal como pelomenos 0,1% em peso, pode ser uma concentração adequada.

Concentrações adequadas podem ser aquelas queproduzem uma concentração média no sangue abaixo de 5% empeso, provavelmente menos de 2,5% e especialmente menos de1% em peso. Uma faixa de concentração preferida é de entre0,0001% em peso e 1% em peso do polímero, tal como acima de0,01% em peso, ou acima de 0,1% em peso.

A presente invenção pode ser utilizada em conexão comindivíduos animais, preferivelmente indivíduos mamíferos emais preferivelmente indivíduos humanos.

Os copolímeros da presente invenção podem serutilizados para reduzir a taxa de crescimento de tumores dediferentes linhagens e tipos de câncer. A presenteinvenção é aplicável para diferentes tipos de câncer,incluindo, mas não se limitando a, sarcomas e carcinomashumanos, Por exemplo, fibrosarcoma, mixossarcoma,lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma,angiossarcoma, sarcoma endotelial, sarcoma linfângio,sarcoma linfângio endotelial, sinovioma, mesotelioma, tumorde Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, câncerpancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer depróstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célulabasal, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara,carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilífero,adenocarcinomas papilíferos, cistadenocarcinoma, carcinomamedular, carcinoma broncogênico, hepatoma, carcinoma doduto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinomaembrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, tumortesticular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar decélula pequena, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial,glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma,ependimoma, hemangioblastoma, oligodendroglioma, melanoma,neuroblastoma e retinomblastoma, leucemias, por exemplo,leucemia linfocítica aguda (ALL), e leucemia mielociticaaguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica,monocítica e eritoleucemia), leucemias crônicas (leucemiamielocitica crônica, leucemia granulocítica crônica eleucemia lifocítica crônica), policitemia vera, lifoma(doença de Hodgkin e doença não de Hodgkin), mielomamúltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e doença decadeia pesada.

A composição farmacêutica da presente invenção podeincluir um dos copolímeros em bloco anfifílicos dainvenção. Em uma realização alternativa, a composiçãocompreende uma mistura de pelo menos dois copolímeros embloco anfifílicos da invenção.

Além disto, a presente invenção pode ser utilizadacomo um complemento a outras técnicas de tratamento decâncer tradicionais, por exemplo, irradiação,quimioterapia, tratamento com hormônio, etc., para combatercâncer em um paciente.

Os polímeros da invenção podem ser vantajosamenteutilizados em conexão com outros fármacosquimioterapêuticos. Neste caso, pelo menos um de taisfármacos quimioterapêuticos pode ser administradosimultaneamente com ou seqüencialmente em relação àadministração do pelo menos um copolímero anfifílico dapresente invenção.

Exemplos de agentes quimioterapêuticos adequados quepodem ser utilizados em conexão com os copolímeros dainvenção incluem:

• Agentes alquilantes, tais como cisplatina,carboplatina, oxaplatina, mecloretamina,ciclofosfamida, clorambucil;

• Anti-metabólitos, tais como metotrexato,azatioprina, maercaptopurina, tioguanina,fludarabina, pentostatina, cladribina, 5-fluoracil, floxuridina, citostina arabinosídeo;

• antraciclinas, tais como daunorrubicina,doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina,mitoxantrona;

• alcalóides vinca, tais como vincristina,vinblastina, vinorelbina, vindesina;

• podofilotoxina, tais como etoposídeo, teniposídeo;• taxanos, tais como paclitaxel, docetaxel; e

• inibidores de topoisomerase, tais como irinotecan,topotecan, amsacrina, etoposídeo, etoposídeofosfato, teniposídeo.

Uma teoria possível para o efeito de inibição docrescimento dos copolímeros anfifílicos da invenção é dadaa seguir. A presente invenção, no entanto, não está presade forma alguma a esta teoria. Os copolímeros sãopref erivelmente solúveis em água de tal forma que, pelaadministração in vitro, podem alcançar e interagir com ascélulas cancerígenas. A parte hidrofóbica dos copolímerospode então penetrar na membrana celular e se ligar a esta.As partes hidrofílicas evitam que o copolímero penetreinteiramente na membrana. Isto significa que oscopolímeros tipicamente serão ancorados na superfície dacélula. Uma vez fixados na membrana, os copolímeros podemexercer sua ação inibidora de crescimento celular dediferentes formas.

Os copolímeros anfifílicos podem se ligar a fatoresde crescimento e, desta forma, os desativar ou pelo menosevitar que se liguem e ativem os receptores de crescimentonas membranas das células cancerígenas. Isto foi observadoem experimentos com um dos copolímeros em bloco anfifílicosda invenção que é capaz de bloquear a ligação do fator decrescimento de fibroblasto 2 (FGF2, também chamado de FGFbásico) e do fator de crescimento derivado de plaqueta(PDGF) aos respectivos receptores nas membranas celulares.

Adicionalmente, o copolímero anfifílico poderiabloquear receptores de crescimento na membrana e prevenirestes receptores de se unirem, o que é sempre necessáriopara o envio de um sinal para a célula.

Adicionalmente, ou alternativamente, os copolímerosanfifílicos podem ser ligar a receptores de crescimento e,desta forma, os desativar ou pelo menos os bloquearparcialmente e, desta forma, evitar que os fatores decrescimento se liguem e ativem os receptores.

Alguns dos copolímeros em bloco anfifílicos dapresente invenção foram previamente utilizados em conexãocom agentes anti-neoplásicos. Por exemplo, sabe-se [18]que uma combinação de um polímero PLURONIC e óxido depolietileno pode ser utilizada para reduzir a toxidez de umagente anti-neoplásico e para aumentar a atividade anti-câncer i) pelo aumento da estabilidade do agente nacorrente sangüínea, ii) tornando o agente mais solúvel ouiii) pelo aumento do transporte do agente através dasmembranas celulares. Sabe-se também [19] que oscopolímeros em bloco PLURONIC afetam vários mecanismos deresistência a droga distintos incluindo inibição dostransportadores de efluxo de fármaco, abolindo o seqüestrode fármaco em vesículas ácidas e inibindo o sistema dedesintoxicação de glutiona/glutationa S-transferase. Todosestes mecanismos de resistência a droga são dependentes deenergia e, desta forma, a depleção de ATP induzida peloscopolímeros em bloco PLURONIC em células cancerígenasresistentes a multi-drogas é considerada como a razão paraa quimiossensibilização experimentada pela administraçãocombinada do antibiótico antraciclina e copolímerosPLURONIC®.Entretanto, até o momento não foi mostrado quecopolímeros em bloco anfifílicos, tais como os copolímerosPLURONIC® , apresentam efeito anti-cancer per se na forma deinibição da proliferação e taxa de crescimento de célulascancerígenas. Assim, não foi mostrado que um medicamentoanti-câncer efetivo pode compreender um copolímero em blocoanfifílico da presente invenção sem qualquer dos agentesquimioterapêuticos do estado da técnica e ainda assim serefetivo na prevenção ou tratamento do câncer.

Um primeiro aspecto da invenção refere-se a umacomposição farmacêutica compreendendo um copolímero embloco anfifílico da presente invenção como agente anti-proliferação celular ou anti-crescimento celular. Esteaspecto refere-se também ao uso de um copolímero em blocoanfifílico da invenção na fabricação de um medicamentoanti-proliferação celular ou anti-crescimento celular. Ainvenção também engloba um método in vitro de modulação,isto é, de redução ou mesmo inibição, da taxa deproliferação ou taxa de crescimento de uma célula,preferivelmente uma célula cancerígena. Este métodoenvolve o contato da célula, preferivelmente a célulacancerígena, com um copolímero em bloco anfifílico. 0copolímero em bloco anfifílico é preferivelmente adicionadono meio de cultura utilizado para a célula. Uma realizaçãoadicional refere-se a um método in vivo de modulação, istoé, de redução da taxa de proliferação ou taxa decrescimento celular, preferivelmente uma célulacancerígena. 0 método envolve a administração de umacomposição farmacêutica de acordo com o primeiro aspecto dainvenção a um indivíduo, onde este indivíduo é um animal,preferivelmente um indivíduo mamífero e maispreferivelmente um indivíduo humano.

Um segundo aspecto da invenção refere-se a umacomposição farmacêutica compreendendo um copolímero embloco anfifílico da presente invenção como agentequimioterapêutico para o tratamento ou prevenção de câncerdesde que o copolímero em bloco anfifílico não seja oPLURONIC® F68 (peso molecular médio de 8400 g/mol, teormédio de óxido de etileno de 81,8 ± 1,9%, ponto de fusão de52°C e uma viscosidade Brookfield média de 1000 cps a 77 aCe uma estrutura química média de OH-(CH2CH2O)80-(CH(CH3)CH2O)2V-(CH2CH2O)8O-H). Uma outra realização refere-se ao uso de um copolímero em bloco anfifílico como agentequimioterapêutico (agente ativo anti-câncer) na fabricaçãode um medicamento para o tratamento ou prevenção de câncerdesde que o copolímero em bloco anfifílico não seja oPLURONIC® F68. Este aspecto refere-se também a um métodopara o tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo,preferivelmente um indivíduo mamífero e maispreferivelmente um indivíduo humano. 0 método envolve aadministração de uma composição farmacêutica de acordo como segundo aspecto ao indivíduo.

Um terceiro aspecto da invenção refere-se a umacomposição farmacêutica compreendendo um copolímero embloco anfifílico da presente invenção para a redução ouinibição da taxa de crescimento de células cancerígenas emum indivíduo, preferivelmente um indivíduo mamífero e maispreferivelmente um indivíduo humano, que sofre de câncer.Uma realização deste aspecto refere-se ao uso de umcopolímero em bloco anfifílico da invenção na fabricação deum medicamento para a inibi ção ou redução da taxa decrescimento de células cancerígenas no indivíduo que sofrede câncer. Este aspecto refere-se também a um método paraa redução da taxa de crescimento de células cancerígenas emum indivíduo sofrendo de câncer, onde o método envolve aadministração da composição farmacêutica do terceiroaspecto ao indivíduo.

Um quarto aspecto da invenção refere-se a umacomposição farmacêutica compreendendo um copolímero embloco anfifílico representado pela fórmula (IV):

HO- (CH2CH2O)n- (CH(CH3)CH2O)m- (CH2CH2O)p-H (IV)

onde m, n e ρ são cada um integradores, pref erivelmenteintegradores múltiplos, para o tratamento ou prevenção decâncer em um indivíduo, preferivelmente um indivíduomamífero e mais preferivelmente um indivíduo humano, desdeque o câncer não seja câncer do cólon ou câncer do reto.Uma realização ensina que a utilização da um copolímero embloco anfifílico representado pela fórmula (IV) como umagente quimioterapêutico na fabricação de um medicamentopara o tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduodesde que o dito câncer não seja câncer do cólon ou câncerdo reto. Este aspecto refere-se também a um método para otratamento ou prevenção de câncer diferente de câncer docólon ou do câncer do reto em um indivíduo pelaadministração da composição farmacêutica do quarto aspectoao indivíduo.

Um quinto aspecto da invenção refere-se a um método,incluindo um método in vitro, para o bloqueio da ligação deum fator de crescimento a um receptor de fator decrescimento em uma membrana celular de uma célula. 0método compreende o contato da célula com um copolimero embloco anfifílico de acordo com a presente invenção.

EXEMPLOS

Nos experimentos, diferentes copolímeros em blocoanfifílicos são utilizados. Os polímeros PLURONIC eTETRONIC® foram obtidos da BASF Corporation. 0 copolimeroem bloco anfifílico denotado por DORVAL 1 é uma variante de

um polímero PLURONIC® , mas com a cadeia de óxido de etilenocentral trocada por uma cadeia de poliestirenocorrespondente. 0 copolimero em bloco foi adquirido daPolymer Source Inc., Canadá. 0 copolimero apresentava aseguinte estrutura esquemática: (EO)x(St)y-(EO)x, onde χ «70 e y * 27, Mn: PEO (3100)-PSt (2800)-PEO (3100) e Mw/Mn =1, 11.

Inibição da taxa de crescimento de células de câncerde mama.

0 efeito do PLURONIC® F127 foi testado sobre ocrescimento celular de linhagens de célula de câncer demama humano cultivadas in vitro. A taxa de crescimento foideterminada com a incorporação de 3H-timidina. Foramexaminadas uma linhagem de célula de câncer de mama decrescimento agressivo, MCF-7, e uma linhagem de célula decâncer de mama de crescimento mais lento, SK-BR-3.

Resumidamente, cerca de 3 χ IO4 células foramsemeadas em placas micro-título de 24 poços em 1,0 ml demeio de cultura RPMI (Roswell Park Memorial Institute)suplementado com 10% de FCS (soro fetal bovino), insulina(1 mg/100 ml) e 1% de antibiótico, e incubadas (ar úmido,5% de CO2, 37ºC) durante a noite. Após a incubação por umanoite, o meio foi removido a vácuo utilizando-se pipetasPasteur esterilizadas e foi trocado por 1,0 ml de RPMI com0,1% de FCS por poço. Após incubação por uma noite, o RPMIsuplementado com diferentes concentrações (0,01, 0,1, 0,3,1 e 2% em peso) de PLURONIC® F127 modulador de taxa decrescimento e/ou 10% de FCS foram adicionados às células(n=3). Em todos os poços, exceto os poços de controle e ospoços com 1% de F127, foi também adicionado FCS aos poços.Os poços foram incubados por cerca de 15 horas.

Foi adicionado 1 μi/ml de 3H-timidina (Amersham-Pharmacia Biotech) por poço e incubou-se por 4 horas. Aofinal do período de rotulagem, o meio foi removido e ascélulas foram enxaguadas duas vezes em PBS e fixadas comTCA 10% (ácido tricloroacético) gelado (4ºC) por 10minutos. O TCA foi então removido e as monocamadas foramlavadas em etanol 95% e secadas ao ar à temperaturaambiente por 20 minutos.

Posteriormente, 1,0 ml de NaOH 0,2 M foi adicionadopor poço e incubou-se por pelo menos uma hora à temperaturaambiente para dissolver as células. 1,0 ml do conteúdo decada poço foi diluído em 4 ml de solução de cintilaçãoHighsafe II em tubos de cintilação de 5 ml. Aradioatividade foi medida em um contador beta.

Conforme pode ser observado nas Figs. 1 e 2, oPLURONIC® F127 reduziu nitidamente o crescimento de ambasas linhagens de célula de câncer de mama. 0 efeito foimais pronunciado no câncer de crescimento rápido (MCF-7)onde 1% de PLURONIC® F127 reduziu a proliferação celular emaproximadamente 80%. O efeito foi também pronunciado emSK-BR-3 onde o crescimento foi reduzido em aproximadamente60%.

A adição de um estímulo de crescimento de FCSaumentou a proliferação em SK-BR-3, mas não em MCF-7, provavelmente porque a MCF-7 prolifera em si na taxamáxima. Na SK-BR-3, o efeito do PLURONIC® F127 foiaumentado em células estimuladas por FCS em comparação comas células não estimuladas.

O PLURONIC® F127 foi efetivo como um inibidor da proliferação mesmo na concentração mais baixa testada(0,01% em peso).

Inibição da síntese de DNA em células de músculo lisoestimuladas.

Os experimentos descritos acima para a taxa de crescimento foram também conduzidos in vitro em células domúsculo liso de humano, de rato e de coelho. Osexperimentos confirmaram que o PLURONIC F127 inibiu asíntese de DNA de maneira dependente de dose conformemedida pela incorporação de timidina em células do músculoliso vascular com crescimento estimulado (presença de FCS10%) de humano, rato e coelho. Entretanto, o PLURONICF127 não afetou a taxa de crescimento de células de músculonão estimuladas.

Resumidamente, para vasos maiores, o vaso dissecado foi aberto e o endotélio foi retirado por raspagem com umbisturi. O vaso foi virado e adventício adicional foiretirado por raspagem. Para os vasos menores, o endotéliofoi removido por lavagem do lúmen do vaso com Triton X-IOO0,1% por 10 segundos, seguindo-se lavagem com meio decultura DMEM (meio de Eagle modificado da Dulbecco).O vaso foi cortado em peças menores, com cerca de Ixlmm. As peças do vaso foram transferidas para o frasco demeio de cultura com DMEM suplementado com FCS 10% eantibiótico 1% para incubação por 10 dias. Para célulashumanas, o meio DMEM foi suplementado também com sorohumano 10% (NHS).

Em uma passagem das células, o meio de cultura gastofoi retirado com pipeta e descartado. As células foramenxaguadas pela adição de PBS (10 ml/75 cm2 de frasco) aosfrascos, tomando-se cuidado para não destruir a monocamadacelular. A monocamada é enxaguada agitando-se brandamenteo frasco para frente e para trás. 0 PBS foi removido edescartado. Foi adicionada tripsina (3,5 ml/75 cm2 defrasco) aos frascos e os frascos foram agitados gentilmentepara se assegurar que as monocamadas por inteiro fossemcobertas com a solução de tripsina.

Os frascos foram incubados por cerca de 3-5 minutosaté que as células começassem a se soltar. Foramadicionados 3,5 ml de FCS 10% por frasco para "neutralizar"a tripsina e as soluções foram pipetadas para cima e parabaixo até que as células estivessem dispersas em umasuspensão única de célula.

A solução foi centrifugada a 3 00 g por 5 minutos e osobrenadante foi removido e descartado. 0 pélete de célulafoi dissolvido em DMEM e transferido para dois novosfrascos de cultura.

Os experimentos de taxa de crescimento celular(síntese de DNA) foram então conduzidos da mesma forma quepara as duas linhagens de célula de câncer de mamadescritas acima.A Fig. 3 ilustra os resultados da modulação da taxade crescimento do PLURONIC® F127 em células do músculo lisovascular humano. Observa-se que o PLURONIC® F127 apresentauma inibição da taxa de proliferação dependente da dose emcélulas de músculo estimuladas com FCS. Os resultadoscomparativos foram também obtidos para células de músculoliso de rato e de coelho.

Em um estudo comparativo, foi investigado o efeito dainibição da síntese de DNA em células de músculo lisoestimuladas com FCS (10%) do F127 e outros polímerosPLURONIC® . Os resultados são apresentados na Tabela Vabaixo normalizados para a síntese de DNA (conformedeterminada utilizando-se o método a base de timidinadescrito acima) das células de controle crescidas em meiosuplementado com FCS 10%. As células testadas foramcrescidas em meio suplementado com FCS 10% e um copolímeroa uma concentração de 10, 1 ou 0,1 mg/ml. Nestes testes, asíntese de DNA das células de controle é considerada como100% e as substâncias testadas foram expressas comopercentagem da síntese de DNA das células de controle.

Tabela IV - Inibição da síntese de DNA

<table>table see original document page 32</column></row><table>Estes experimentos confirmam que os polímeros

PLURONIC® podem ser utilizados para a inibição da síntesede DNA. Os experimentos mostram também que o PLURONIC ® F68não parece exercer qualquer efeito inibidor. Naconcentração mais alta testada (10 mg/ml) , o L31 apresentouuma tendência a matar as células.

Inibição do crescimento celular em células de músculoliso estimuladas.

De maneira a confirmar que a inibição da síntese deDNA foi devida ao número reduzido de células, isto é,inibição da taxa de proliferação, um método colorimétricofoi utilizado para mensurar o número de células depois dotratamento com PLURONIC® F127.

Células de músculo liso vascular de aorta de ratoforam obtidas utilizando-se o procedimento descrito acima.Foram semeadas 5000 células de aorta de rato em 200 μΐ deDMEM suplementado com FCS 10% por poço em uma placaCellTiter 96™ AQueous (Promega). As células foram deixadasem incubação por cerca de 1 dia. 0 meio foi retirado porpipeta e descartado e trocado por 200 μΐ de DMEM com FCS0,1% por poço.

Após 2 dias, foi adicionado meio DMEM (controlenegativo) , meio DMEM com FCS 10% (controle positivo) , meioDMEM com PLURONIC® Fl27 1 ou 5% ou meio DMEM com FCS 10% ePLURONIC® F127 1 ou 5%, a poços diferentes (n=3) e incubou-se de acordo com o protocolo fabricante do ensaio deproliferação/citotoxidade celular não radioativo CellTiter 96™.

Os poços foram então lavados três vezes com PBS deacordo com o protocolo do fabricante e foram entãoadicionados 20 μl de solução de MTS por poço. A placa foiincubada por 1-4 horas e a absorbância foi medida a 490 nm.

Os resultados são ilustrados na Fig. 4. Observa-seno diagrama que o método colorimétrico confirma a inibiçãoda taxa de proliferação celular do PLURONIC® F127 observadautilizando-se o método de síntese de DNA descrito acima. 0PLURONIC® F127 inibiu o efeito estimulante do crescimentodo FCS, mas não apresenta qualquer efeito sobre células nãoestimuladas.

Citotoxidade mediada por célula.

De maneira a se determinar se ao efeito de inibiçãoda proliferação celular do PLURONIC® F127 é devido a algumefeito tóxico do copolímero sobre as células, um teste decitotoxidade mediada por célula foi realizado onde acitotoxidade do PLURONIC F127 foi comparada com Triton X-100 1%, PEG 10000 e um outro polímero PLURONIC®, o P123.

0 procedimento descrito acima utilizando o ensaioproliferação/citotoxidade celular não radioativo CellTiter96™ da Promega foi realizado utilizando-se diferentesconcentrações de PLURONIC® F127, Triton X-100 1%, PEG 100001% e PLURONIC® P123 1%. A Fig. 5 ilustra o efeitocitotóxico de diferentes concentrações de PLURONIC F127expressos em percentagem da citotoxidade do Triton X-100.0 PLURONIC® F127 não exibe toxidez celular mesmo à maisalta concentração testada de 5%. Entretanto, o outropolímero PLURONIC® testado P123 exibiu citotoxidadesignificativa comparativamente mais alta.

Estudo comparativo de copolimeros em blocoanfifílicos.O efeito de inibição da taxa de crescimento de outroscopolímeros em bloco anfifilicos além do PLURONIC® F127,incluindo PLURONIC® F3 8, F68, F87, F98, P105, F108 eTETRONIC® T908, T1307 da BASF Corporation e DORVAL 1 daPolymer Source Inc., foram testados em células de músculoliso vascular humano estimuladas (FCS 10%).

Os experimentos foram realizados da mesma maneira queo experimento de síntese de DNA a base de timidina descritoacima e ilustrado na Fig. 3, com a diferença de que asconcentrações de 1, 0,1 e 0,01% em peso foram testadas porcopolímero em bloco.

Os resultados da inibição da taxa de crescimento sãoapresentados na Fig. 6, onde as taxas de crescimento foramnormalizadas em relação à taxa de crescimento celular maisalta (T908 e 0,01% em peso).

Pode se observar na figura que o copolímeroapresentando o teor hidrofílico mais alto (cerca de 80%) ,isto é, F38, F68, F108 e T908, mostrou o menor efeito deinibição de crescimento celular em células de músculo lisoestimuladas por FCS. 0 copolímero F87 apresentou efeitosimilar ao F127, enquanto que o P1058 alcançou o efeitoinibidor mais alto sob as condições experimentaispresentes.

Experimentos de ligação.

Experimentos de teste foram conduzidos para sedeterminar se o efeito inibidor da taxa de crescimento doPLURONIC® F127 poderia ser mediado através do bloqueio daligação de diferentes fatores de crescimento aosrespectivos receptores em células de músculo liso de aortade rato.Células de aorta de rato preparadas como descritopreviamente foram adicionadas em meio de cultura (+ FCS10%) a poços de uma placa micro-título de 24 poços a umaconcentração de cerca de 5000 células por poço. A placafoi incubada durante a noite para possibilitar às célulasformarem uma camada no fundo dos poços. 0 meio de culturafoi então substituído por meio de cultura suplementado comFCS 0,1% e deixou-se incubar por dois dias.

O meio de cultura foi então removido e os poços foramlavados duas vezes com PBS. Foram adicionados 150 μΐ deAima solução de NaCl com diferentes concentrações dePLURONIC® F127 (2, 1, 0,1, 0,01, 0,001 e 0,0001% em peso)juntamente com 1 μl de 125I-FGF2 (fator de crescimento defibroblasto 2 radiativamente rotulado) ou 1 μl de 125I-PDGF(fator de crescimento derivado de plaqueta) diluído em umasolução tampão (NaCl 0,237 M, KCl 0,0054 M, KH2PO4 0,00044M, CaCl2 0,00126 M, MgSO4 0,00018 M, HEPES 0,020 M e BSA0,3%) e incubado por 30 minutos a 372C. Os poços foramentão lavados cinco vezes com PBS (solução salina tamponadacom fosfato; 0,2 g de KCl, 0,2 g de KH2PO4, 1,35 g deNa2HPO4 e 8,0 g de NaCl por 1000 ml de H2O destilada). Foientão adicionado 1 ml de NaOH 0,2 M por poço e a placa foicolocada em um refrigerador durante a noite. A quantidadede ligação dos fatores de crescimento radiativamenterotulados foi então determinada por meio de determinaçãogama.

Concluiu-se que o PLURONIC bloqueia a ligação dosdois fatores de crescimento a seus respectivos receptoresnas células de maneira dependente de dose. Adicionalmente,como ilustrado na Fig. 7, existe uma correlação muito altaentre as concentrações do F127 necessárias para os efeitosinibidores de crescimento e para a inibição da ligação deFGF2. A Fig. 8 ilustra o correspondente efeito de bloqueiode ligação do polímero F127 sobre PDGF radiativamenterotulado. Como conseqüência, o bloqueio desta ligação dofator de crescimento aos receptores na membrana celularpode ser pelo menos um dos mecanismos da inibição da taxade crescimento dos copolímeros em bloco anfifílicos dapresente invenção.

Estudo de toxidez em camundongo.

Os experimentos foram conduzidos para investigar se o®PLURONIC P105 produz reações tóxicas após administraçãointravenosa em camundongos.

Dez camundongos albinos NMRI, pesando cerca de 25 gno início, foram utilizados para o experimento. Os animaisforam obtidas da Scanbur BK, e foram condicionados por umasemana antes do início do estudo. Os animais foramprovidos com alimento e água ad Iibitum.

A substancia ativa PLURONIC Pl05 foi provida em doisvolumes de solução de 10 e 50% em peso, respectivamente, docopolímero em NaCl (9 mg/l) para a solução a 10% e em NaCl(9 mg/l) e PEG para a solução a 50%.

Os animais foram separados em cinco grupos e foramtratados i.v. em uma veia da cauda, uma vez ao dia por 5dias. 0 volume injetado para todos os grupos foi de 150μΐ. As injeções foram realizadas durante 10 segundos.

• Grupo 1: PLURONIC® P105 50% (n=2)

• Grupo 2: PLURONIC® P105 40% (n=2)

• Grupo 3: PLURONIC® P105 30% (n=2)

• Grupo 4: PLURONIC® P105 20% (n=2)• Grupo 5: PLURONIC® P105 10% (n=2)

Os pesos corporais foram registrados antes daprimeira administração e no dia 6. Os animais foramobservados para sinais clínicos de toxidez (qualidade dopelo, salivação, lacrimação, diarréia, respiração,distúrbios motores, apatia, tremor, convulsões e coma)durante 0-3 0 minutos às 1, 2, 3, 4, 8, 24, 48 e 72 horasapós a administração da substância de teste.

Um estudo exploratório foi realizado em 2 camundongostratados com PLURONIC® Pl05 10% e em 2 camundongos tratadoscom PLURONIC® P105 50%. Observou-se que os animaistratados com a concentração de P105 mais baixa tolerarambem o tratamento repetido, mas aqueles tratados com P10550% mostraram caudas edematosas e hemolíticas já na segundainjeção. Adicionalmente, estes dois animais mostraramcomportamento motor reduzido e foram subseqüentementesacrificados no terceiro dia após o início do tratamento.Neste ponto, decidiu-se tratar 6 camundongos com aformulação 50% diluída com solução salina para 40%, 3 0% e20%.

Os animais tratados com P105 40% mostraramdescoloração hemolítica branda das caudas no dia 2, a qualpersistiu durante o período de tratamento. Algum edema foiobservado. Estes animais mostraram também iam ganho de pesoreduzido, ver Tabela VI.

Observou-se que os animais que receberam injeção comas diluições de 20% e 3 0% toleraram bem o tratamento.Tabela VI - ganho de peso dos camundongos

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Teste de implante de fibra oca.

Foram conduzidos testes para se investigar se oPLURONIC® P105 inibiu o crescimento de célula tumoral em ummodelo de fibra oca em camundongo.

Dezoito camundongos albinos NMRI, pesando cerca de 25g na chegada, foram utilizados para o experimento. Osanimais foram obtidos da Scanbur BK, e foram condicionadospor uma semana antes do inicio do estudo. Os animais foramprovidos com alimento e água ad Iibitum.

O enchimento das fibras foi realizado no Hospital daUniversidade de Uppsala, Departamento de FarmacologiaClínica. As fibras foram preenchidas com as seguintescélulas tumorais: fibras amarelas com U936/gtb e fibrasazuis com H69.

Após raspagem do pelo e desinfecção, uma pequenaincisão de pele foi feita, sob anestesia com isoflurano,nas costas dos animais. Três fibras, duas amarelas e umaazul, foram implantadas subcutaneamente de maneirarandômica e a incisão na pele foi fechada utilizando-segrampos.Os animais foram separados em três grupos e foramtratados como se segue intravenosamente em uma veia dacauda uma vez ao dia por 5 dias iniciando-se imediatamenteapós o implante:

• Grupo 1: PLURONIC® P105 10% diluído em NaCl (n=6)

• Grupo 2: PLURONIC® P105 25% diluído em PEG e NaCl(n=6)

• Grupo 3: veículo (n=6)

Os pesos corporais foram registrados antes daprimeira administração e antes da eutanásia. Os animaisforam observados diariamente para sinais de alteração naingestão de alimentos, atividade, etc., como sinais de umaalteração do estado de saúde geral. Seis dias depois doimplante das fibras, os animais foram anestesiados comisoflurano e aproximadamente 2 50 μΐ de sangue foram obtidosdo plexo orbital para a hematologia. Posteriormente osanimais foram sacrificados por deslocamento cervical e asfibras foram retiradas e colocadas em meio de culturacelular (37aC) antes da avaliação da densidade celular e daviabilidade celular.

A avaliação estatística foi realizada com autilização do programa Graph Pad Prism versão 4 (Graph PadSoftware Inc., San Diego, EUA) em um computador HP Compc dx2000 em Windows XP. Foi utilizado o teste One-way ANOVAcom as comparações múltiplas de Tukey para se testarestatisticamente as diferenças nos parâmetros dehematologia entre os grupos de tratamento. Foi utilizado oteste t pareado para testar estatisticamente as diferençasem pesos antes e depois dos tratamentos.Não ocorrem quaisquer sinais evidentes de alteraçãono estado de saúde em qualquer dos animais. Não ocorreramquaisquer diferenças estatisticamente significativas dentrodos grupos no que diz respeito aos pesos antes e depois do tratamento.

Foram encontradas diferenças estatisticamentesignificativas entre os grupos nos parâmetros dehematologia: RBs (p=0,0127, grupo 1 χ grupo 3 e grupo 2 χgrupo 3), HGB (p=0,021, grupo 1 χ grupo 3 e grupo 2 χ grupo 3) e PLT (p=0,0006, grupo 1 χ grupo 3 e grupo 2 χ grupo 3),ver Tabela VII.

<table>table see original document page 41</column></row><table>

A densidade celular nas fibras foi significativamentereduzida (p<0,05) nas fibras contendo U937/gtb tratadas coma dose alta de PLURONIC P105 em comparação com o controle.Uma tendência semelhante foi observada também para ascélulas implantadas nos animais tratados com a dose baixa de P105, ver Fig. 9. Uma tendência na direção dos valoresmais baixos de densidade celular médio foi também observadapara a linhagem celular H69 ns animais tratados com ocopolímero, ver Fig. 10.Estimativa in vitro da atividade citotóxica doscopolímeros.

O presente estudo tem por objetivo a investigação daatividade citotóxica de diferentes copolímeros PLURONIC® eTETRONIC® . Como sistemas modelo, foi utilizado um painelbem definido de 10 linhagens de célula tumoral humanaselecionadas e uma linhagem de célula de câncer depróstata. Três compostos, selecionados após varredura nalinhagem de célula de linfoma sensível U936/gtb, foraminvestigados em todas as linhagens celulares.

Um sistema modelo utilizado neste estudo é um painelde linhagem celular de dez linhagens de célula tumoralhumana [3]. Este conceito se origina do National CâncerInstitute (NCI) nos EUA, onde um painel de linhagem celularcom aproximadamente 60 linhagens celulares diferentes(representando a maioria das formas de câncer humano) écomumente utilizado para definir o perfil de atividade deum composto novo [4] . O painel de linhagem celular podeclassificar agentes com sucesso na medida em querelacionado com iam grupo mecanístico específico (porexemplo, inibidores de anti-metabólitos, alquilantes,topoisomerase II) pela utilização de análise de correlação[5] . Foi demonstrado no passado que um número maislimitado (10) de linhagens de célula de tumor humanorepresentando tipos definidos de resistência a drogacitotóxica pode ser utilizado com sucesso para a avaliaçãoinicial e classificação mecanística preliminar de agentesanti-câncer [6].

Células tumorais podem ganhar resistência a drogascitotóxicas, e exemplos de mecanismos de resistênciaconhecidos são a glicoproteína P (Pgp) e a proteínaassociada a resistência multi-droga (MRP) , atividadeaumentada dos sistemas de desintoxicação celular, funçãoalterada das enzimas nucleares alvo como a topoisomerase II(topo II) bem como função de ligação a tubulina alterada eredistribuição sub-celular do fármaco. 0 painel delinhagem celular utilizado contém linhagens celulares queexpressão alguns destes fenótipos [3].

As bombas de efluxo de fármaco, por exemplo, Pgp eMRP, mostram baixa especificidade para substratos e, destaforma, contribuem para a sensibilidade reduzida a agentesde várias classes, por exemplo, alcalóide vinca,antraciclinas, taxanos, epipodofilotoxinas e outrosfármacos [7].

Culturas primárias de células tumorais humanas são umsistema modelo alternativo que recebeu relativamente poucaatenção no contexto da seleção e desenvolvimento de novosfármacos. Entretanto, foi demonstrado que ensaios in vitrorealizados em culturas primárias de diferentes tumores secorrelacionam bem com a atividade específica clínica dotipo tumor [8].

A combinação de diferentes fármacos citotóxicos e acriação de preparações de fármacos incluindo compostos queaumentam a absorção do fármaco ou o efeito do fármaco, é umcampo crescente na quimioterapia de câncer. Foram

propostos numerosos métodos de realização e interpretaçãode estudos pré-clínicos a respeito de interações entrefármacos.Quando dados de agentes únicos e suascombinações são disponibilizados em concentrações fixadas,o "conceito multiplicativo" (modelo aditivo) é comumenteutilizado. Aqui, uma interação aditiva é definida como umacombinação de dois fármacos que resulta em uma fraçãosobrevivente iguala o produto das frações sobreviventes dosagentes em separado, o que poderia indicar uma açãoindependente dos fármacos [9] . Se o efeito da combinaçãosupera o efeito aditivo, a interação é sinérgica.

De maneira a avaliar os padrões de atividade dosfármacos, foi utilizado um painel de linhagem celularhumana de quatro linhagens celulares parentais sensíveis,cinco sub-linhagens resistentes a droga, representandodiferentes mecanismos de resistência, e uma linhagemcelular com resistência primária. As linhagens celularesincluídas eram a linhagem de célula de mieloma RPMI 8226/Se suas sub-linhagens 8226/Dox40 e 8226/LR-5 (cedidasgentilmente por W.S. Dalton, Dept. of Medicine, ArizonaCâncer Center, University of Arizona, Tucson, AZ), aslinhagens de célula de linfoma U-937/gtb e U-937-Vcr(cedidas gentilmente por K. Nilsson, Dept. of Pathology,University of Uppsala, Suécia), a linhagem celular SCLCNCI-H69 e suas sub-linhagens H69AR (American Type CultureCollection; ATCC, Rockville, MD) , a linhagem de célula deadenocarcinoma renal ACHN (ATCC) e a linhagem de célulaleucêmica CCRF-CEM e suas sub-linhagens CEM/VM-1 (cedidasgentilmente por W.T. Beck, Dept. of Pharmacology, Collegeof Medicine, University of Tennessee, Memphis, TN).

A 8226/Dox40 foi selecionada para resistência adoxorrubicina e mostra o fenótipo MDR clássico com super-expressão da glicoproteína P 170 (Pgp) [10]. A 8226/LR-5foi selecionada para resistência a melfalano, proposta comosendo associada com níveis aumentados de GSH [11] . AU-937-Vcr foi selecionada para resistência a vincristina,proposta como sendo associada à tubulina [12] . A H69AR,selecionada para resistência a doxorrubicina, expressa umfenótipo MDR proposto como sendo mediado por MRP [13]. ACEM/VM-1, selecionada para resistência de teniposídeo,expressa uma MDR atípica, a qual é proposta como sendoassociada a topoisomerase II (topo II) [14]. 0 mecanismoexato de resistência para a linhagem celular ACHBresistente não é conhecido e pode ser multifatorial [15].

As linhagens celulares foram cultivadas em meio decultura completo descrito acima a 37eC em atmosfera úmidacontendo 5% de CO2. A 8226/Dox40 foi tratada uma vez pormês com doxorrubicina a 0,24 μg/ml e a 8226/LR-5 a cadatroca do meio com melfalano a 1,53 μg/ml. A U-937-Vcr foicultivada continuamente na presença de 10 ng/ml devincristina e a H69AR foi alternadamente alimentada commeio livre de fármaco e meio contendo 0,46 μg/ml dedoxorrubicina. A linhagem celular CEM/VM-1 foi cultivadaem meio livre de fármaco sem qualquer perda de resistênciapor um período de 6-8 meses. Os padrões de resistência daslinhagens celulares foram confirmados rotineiramente emexperimentos de controle.

Células PC-3 de câncer de próstata humano foramobtidas da American Type Culture Collection (Rockville,MD) . Foram cultivadas em meio de Eaglé modificado daDulbecco suplementado com soro fetal bovino 10%, penicilinaG e estreptomicina.Tabela VIII - Linhagens celulares de tumor humano

Linhagem Origem Agente ResistênciaCelular selecionador associadaCCRF-CEM Leucemia CEM/VM-I Leucemia teniposídeo topoisomerase IIACHN Câncer renal resistência primáriaNCI-H69 Câncer pulmonar de célula pequena H69AR Câncer pulmonar de célula pequena doxorrubi c ina MRPRPMI 8226/S Mielona 8226/dox40 Mieloma doxorrubicina Pgp8226/LR5 Mieloma melfalano glutationaU-937 GTP Linfoma U-937-vcr Linfoma vincristina tubulinaPC-3 Câncer de próstata

Um meio completo consistindo no meio de cultura RPMI-1640 tamponado com carbonato (HyClone, Cramlington, UK)suplementado com FCS desativado 10%, glutamina 2 mM, 50μg/ml de estreptomicina e 60 μg/ml de penicilina, foiutilizado para todas as linhagens celulares. FDA (Sigma,St. Louis, MO) foi dissolvido em DMSO e mantido congelado(-2O2C) como uma solução estoque protegida da luz.Os compostos de teste foram dissolvidos de acordo com

a Tabela IX abaixo.Tabela IX - Substâncias de teste

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A parte principal da varredura primária foi realizadaem uma primeira batelada de substâncias (F127 e F68)dissolvidas em cloreto de sódio e etanol apenas. Em váriosexperimentos a atividade foi comparada entre copolímerosdissolvidos em NaCl e etanol e dissolvidos em PEG e etanol,e não ocorreram diferenças significativas na potência. Porsimplicidade, assumiu-se que a concentração da substânciade teste em todos os frascos recebidos como sendo de 50% empeso. Diluições adicionais destas foram realizadas comsolução salina tamponada com fosfato (PBS; Sigma Aldrich)para soluções claras.

Células tumorais foram semeadas nas placas de 96poços preparadas com o fármaco a uma densidade celular decerca de 20000 células/poço.Um ensaio de citotoxidade em micro-cultivofluorimétrico (FMCA) baseado na determinação dafluorescência gerada a partir da hidrólise de FDA afluoresceína por células com membranas plasmáticas intactase como previamente descrito em detalhes [16] foi utilizado.As placas foram incubadas a 37sC em atmosfera umedecidacontendo 5% de CO2 por 72 horas. Ao final do período deincubação, as placas foram centrifugadas (1000 rpm, 5minutos) e o meio foi removido por aspiração. Após umalavagem em PBS, foram adicionados 100 μΐ/poço de FDAdissolvido em um tampão fisiológico (10 μg/ml). As placasforam incubadas por 45 minutos e a fluorescência gerada porcada poço foi determinada em um fluorômetro de varredura de96 poços (Fluoroscan II, Labsystems Oy, Helsinki,Finlândia). A fluorescência é proporcional ao número decélulas intactas no poço.

Os critérios de qualidade para uma análise de sucessoincluíram um sinal de fluorescência nos poços de controlede mais de cinco vezes o valor do branco médio, umcoeficiente médio da variação (CV) nos poços de controle demenos de 30% e mais de 7 0% de células tumorais napreparação celular antes da incubação. Os experimentosforam realizados duas vezes, os valores médios foramutilizados.

A sobrevivência celular é apresentada como índice desobrevivência (SI), definido como a fluorescência nos poçosexperimentais em percentagem em relação aos poços decontrole, com valores dos poços de branco subtraídos.Todos os experimentos de linhagem celular foram realizadospelo menos duas vezes, e todos os dados foram incluídos naanálise.

Os dados de experimentos de painel de linhagem celularforam comparados com uma base de dados contendo dados demais de 150 diferentes compostos incluindo os agentescitotóxicos utilizados mais comuns. Para este propósito, umIC50 foi calculado para cada fármaco e cada linhagemcelular, definido como a concentração do fármaco incluindoum índice de sobrevivência de 50% utilizando-se regressãolog-linear simples. O conjunto de dez valores de IC50 paracada fármaco foi correlacionado utilizando-se o coeficientede correlação de Pearson com o correspondente conjunto dedados de outros fármacos na base de dados. A partir destesIC50s um padrão de atividade foi também apresentadoutilizando Delta, definido como o desvio do Iog de IC50 deuma linhagem celular do Iog médio de IC50 no painel delinhagem celular. Estes cálculos foram realizados de acordocom Dhar et al. [3], modificados a partir dos procedimentosutilizados no National Câncer Institute(www.dtp.nci .nih.gov) .

Os dados de concentração-efeito de ambos os painéis delinhagem celular foram ajustados para uma equação dose-resposta sigmoidal com inclinação variável, utilizando-se aregressão não linear no programa GraphPad Prism (GraphPadSoftware, San Diego, CA) . Os valores 0 e 100% desobrevivência celular foram estabelecidos como o efeitomáximo e a linha de base, respectivamente, e o EC50(concentração produzindo 50% de efeito) foi previsto peloajuste da curva. Os fatores de resistência foram calculadoscomo a razão entre o EC50 na linhagem celular resistente ena parental nos pares de linhagem celular [3].

Os compostos mantiveram sua atividade citotóxica após4 semanas de armazenamento em placas micro-título a -70ºC.As curvas concentração-efeito foram similares quando seutilizou placas que foram armazenadas por 4 semanas e quandose utilizou placas preparadas recentemente (não mostrado).

As curvas concentração-efeito para todos os compostostestados em U937gtb são mostradas na Fig. 11. Osrespectivos copolímeros testados são individualmentemostrados nas Figs. 12a a 120. Os valores de IC50 sãomostrados na Tabela X abaixo. Quando as amostras

dissolvidas em NaCl/EtOH e PEG/NaCl/EtOH foram comparadas,foram obtidos resultados similares (não mostrado).

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* L121 precipitou na diluição em PBS produzindo umasuspensão leitosa, considerada adequadamente homogênea parao teste.Novamente, os resultados confirmam que o copolímero®

PLURONIC com um teor hidrofilico médio de cerca de 80%apresenta de longe o efeito anti-câncer mais baixo. O EC50para todas as linhagens celulares são apresentados na

Tabela XI para os três copolímeros mais efetivos

selecionados da Tabela X. As Figs. 13A a 13C sãorepresentações gráficas dos resultados.

Tabela XI - Atividade EC50 no painel de linhagem celular

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* Valor aproximado, ajuste da curva não possível.

As substâncias foram testadas até um mínimo deconcentração de 0,0016% em peso. O valores de EC50 abaixodisto são estimados a partir da análise da regressão linearpermitindo a extrapolação da curva. Quando o ajusta dacurva era inadequado e uma maioria das células foi mortaquando se utilizou a concentração mais baixa de EC50<<0, 0016 .

Será entendido por um especialista na técnica quevárias modificações e alterações podem ser realizadas napresente invenção sem que se afastem de seu escopo, o qualé definido pelas reivindicações anexas.

REFERENCIAS

[1] US 2001/0051659 Al

[2] Silk et al.., Câncer 1972, 29, 171-172

[3] Dhar et al. , Br. J. Câncer. 1996, 74, 888-896

[4] Alley et al., Câncer Res. 1988, 48, 589-601

[5] Paull et al., J. Natl. Câncer Inst. 1989, 81, 1088-1092

[6] Dhar et al., Eur. J. Pharmacol. 1998, 346, 315-322

[7] Fisher et al. , Eur. J. Câncer 1996, 32A, 1082-1088

[8] Fridborg et al. , Eur. J. Câncer 1999, 35, 424-432

[9] Valeriote et al., Câncer Chemother. Rep. 1975, 59, 895-900

[10] Dalton et al., Câncer Res. 1986, 46, 5125-5130

[11] Bellamy et al., Câncer Res. 1991, 51, 995-1002

[12] Botling et al., Int. J. Câncer 1994, 58, 269-274

[13] Cole et al., Science 1992, 258, 1650-1654

[14] Danks et al., Biochemistry 1988, 27, 8861-8869

[15] Nygren et al., Biosci. Rep. 1990, 10, 231-237

[16] Larsson et al., Int. J. Câncer 1992, 50, 177-185

[17] Freireich et al., Câncer Chemother. Rep. 1966, 50, 219-244

[18] WO 98/07434

[19] Kabanov et al., Adv. Drug Delivery Rev. 2002, 54, 759-779

Claims (14)

1. Uso de um copolímero em bloco anfifílficoapresentando uma cadeia polimérica hidrofóbica central comuma primeira extremidade conectada a pelo menos uma cadeiapolimérica lateral de óxido de etileno hidrofílica e umasegunda extremidade conectada a pelo menos uma cadeiapolimérica lateral de óxido de etileno hidrofílica comoagente quimioterapêutico caracterizado pelo fato de ser nafabricação de um medicamento para o tratamento ou prevençãode câncer, desde que o dito câncer não seja câncer do cólonou câncer do reto, onde um teor médio do dito óxido deetileno constitui menos de 80% do dito copolímero em blocoanfifílico e o dito medicamento compreende o ditocopolímero em bloco anfifílico ou uma mistura de pelo menosdois copolímeros em bloco anfifílicos como agentesquimioterapêuticos.

2. Uso de um copolímero em bloco anfifílicoapresentando uma cadeia polimérica hidrofóbica central comuma primeira extremidade conectada a pelo menos uma cadeiapolimérica lateral de óxido de etileno hidrofílica e umasegunda extremidade conectada a pelo menos uma cadeiapolimérica lateral de óxido de etileno hidrofílica,caracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento para a redução de uma taxa de crescimento decélulas cancerígenas em um indivíduo que sofre de câncer,desde que o dito câncer não seja câncer do cólon ou câncerdo reto, onde o teor médio do dito óxido de etilenoconstitui menos de 80% do dito copolímero em blocoanfifílico e o dito medicamento compreende o ditocopolímero em bloco anfifílico ou uma mistura de pelo menosdois copolímeros em bloco anfifílicos como os únicosagentes redutores da taxa de crescimento.

3. Uso de um copolímero em bloco anfifílicoapresentando uma cadeia polimérica hidrofóbica central comuma primeira extremidade conectada a pelo menos uma cadeiapolimérica lateral de óxido de etileno hidrofílica e umasegunda extremidade conectada a pelo menos uma cadeiapolimérica lateral de óxido de etileno hidrofílica,caracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento anti-proliferação de célula, desde que a ditacélula não seja uma célula de câncer do cólon ou célula decâncer do reto, onde o teor médio do dito óxido de etilenoconstitui menos de 80% do dito copolímero em blocoanfifílico e o dito medicamento compreende o ditocopolímero em bloco anfifílico ou uma mistura de pelo menosdois copolímeros em bloco anfifílicos como os únicosagentes anti-proliferação de célula.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado pelo fato do copolímero em blocoanfifílico ser representado pela fórmula (I):HO- ( CH2CH2O ) n- ( CH ( CH3 ) CH2O ) m- ( CH2CH2O) P-H (I)onde m, n e ρ são números integradores.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de m, n e ρ serem selecionados de tal forma que<formula>formula see original document page 55</formula>

6. Uso de acordo com as reivindicações 4 ou 5,caracterizado pelo fato de η ser igual a p.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 6, caracterizado pelo fato de um teor de óxido deetileno médio do dito copolimero em bloco anfifílico ser depelo menos 40% em peso, mas abaixo de 80% em peso.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações-4 a 6, caracterizado pelo fato de um teor de óxido depropileno médio do dito copolimero em bloco anfifílico serde pelo menos 2000 g/mol.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato do dito teor de óxido de propileno médio ser depelo menos 3000 g/mol.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato do dito teor de óxido de propilenomédio ser em uma faixa de 3500 a 4500 g/mol,preferivelmente cerca de 4000 g/mol.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 10, caracterizado pelo fato do dito copolimero em blocoanfifílico apresentar um peso molecular médio de-12600g/mol, um teor de óxido de etileno médio de 73,2 ±-1,7% e um ponto de fusão de56aC.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato do dito câncer ser selecionado deum grupo consistindo em câncer renal, câncer pulmonar,mieloma, Iinfoma e câncer da próstata.

13. Método in vitro para a modulação da taxa deproliferação de uma célula, desde que a dita célula nãoseja uma célula de câncer do cólon ou uma célula de câncerdo reto, caracterizado pelo fato de compreender o contatoda dita célula com um copolímero em bloco anfifílicoapresentando uma cadeia polimérica hidrofóbica central comuma primeira extremidade conectada a pelo menos uma cadeiapolimérica lateral de óxido de etileno hidrofílica e umasegunda extremidade conectada a pelo menos uma cadeiapolimérica lateral de óxido de etileno hidrofílica, onde oteor médio do dito óxido de etileno constitui menos de 80%do dito copolímero em bloco anfifílico.

14. Método de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato da dita célula ser uma célulacancerígena, mas não uma célula de câncer do cólon ou umacélula de câncer do reto.