BRPI0710626A2

BRPI0710626A2 - ácido nucleico isolado, vetor de expressão, métodos para produzir um rna genÈmico da influenza e um vìrus da influenza recombinante, célula, método para gerar em células caninas cultivadas um vìrus de rna, vìrus da influenza, e, sequência de ácido nucleico isolado

Info

Publication number: BRPI0710626A2
Application number: BRPI0710626-2A
Authority: BR
Inventors: Gregory Duke; George Kemble; Zhaoti Wang; James Young
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2007-04-18
Publication date: 2011-08-16
Also published as: EP2016194B1; AU2007240448B8; RU2457250C2; MX2008013388A; WO2007124327A2; KR101436176B1; HK1136849A1; EP2016194A4; KR20090032030A; AU2007240448A8; ES2539514T3; CN101528941A; WO2007124327A3; PT2016194E; DK2016194T3; JP5491173B2; RU2008145226A; CA2646526A1; CA2646526C; EP2016194A2

Abstract

ACIDO NUCLEìCO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSãO, MéTODOS PARA PRODUZIR UM RNA GENÈMICO DA INFLUENZA E UM VìRUS DA INFLUENZA RECOMBINANTE, CéLULA, MéTODO PARA GERAR EM CéLULAS CANINAS CULTIVADAS UM VìRUS DE RNA, VìRUS DA INFLUENZA, E, SEQüêNCIA DE áCIDO NUCLEìCO ISOLADO. A presente invenção fornece novas seqúêneias de ácido nucleico reguladoras por caninas úteis para a expressão de seqúências de ácido nucleico em células caninas tais como células MDCK. A invenção fornece ainda vetores de expressão e células compreendendo tais ácidos nucleicos assim como métodos de usar tais ácidos nucleicos para fabricar o vírus influenza, incluindo o vírus influenza infeccioso.

Description

"ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, MÉTODOSPARA PRODUZIR UM RNA GENÔMICO DA INFLUENZA E UM VÍRUSDA INFLUENZA RECOMBINANTE, CÉLULA, MÉTODO PARA GERAREM CÉLULAS CANINAS CULTIVADAS UM VÍRUS DE RNA, VÍRUSDA INFLUENZA, E, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO"

1. Campo da invenção

Em um aspecto, a presente invenção fornece um ácidonucleico isolado. que compreende um seqüência reguladora da RNApolimerase I canina. Em outros aspectos, a invenção fornece vetores deexpressão e células que compreende tais ácidos nucleicos assim comométodos de usar tais ácidos nucleicos para fabricar vírus da influenza,incluindo o vírus da influenza infeccioso.

2. Fundamentos

As pandemias da influenza são definidas por um aumentoglobal dramático em morbidez e mortalidade devido a doença da influenza.Diversos fatores combinam-se para modular a severidade e a extensão depandemia incluindo o grau baixo da imunidade na população e a eficiênciacom que o vírus pode transmitir entre os seres humanos. O último é no geralinfluenciado não apenas pelo vírus por si só mas pela densidade da populaçãoe facilidade de viajar para dentro e para fora dentro de uma região. O vírusresponsável pela pandemia é no geral uma variante antigênica recentementeemergida que a maioria da população não teve experiência anterior com e,portanto, tem pouca ou nenhuma imunidade para. Além disso, a transmissãode ser humana para ser humano eficiente é um pré requisito para adisseminação rápida e, no caso da introdução zoonótica de vírus animais empopulações humanas, o vírus deve adaptar-se para replicação em sereshumanos e ser capaz transmissão eficiente.

A influenza pandêmica espalha-se muito rapidamente e podeter impacto devastador. A pandemia mais severa no século 20, a pandemia de1918, matou mais de 500.000 cidadãos U.S. e entre 20 a 40 milhões depessoas por todo mundo. A pandemia pode produzir ondas de doença, compicos de incidência separados por várias semanas a meses. O início e adisseminação relativamente rápidos da influenza pandêmica apresentamdiversos problemas para responder a um ataque global desta magnitude eimpõem cargas esmagadoras sobre atendentes de emergência e os técnicos decuidado de saúde. A identificação e resposta rápidas para a pandemiaemergente é claramente um elemento necessário da solução; diversosprogramas estão correntemente em andamento pelo mundo inteiro paramonitorar o vírus da influenza emergente incluindo vírus da influenza aviáriaque freqüentemente cause doença em seres humanos. Estes dados devigilância são usados em conjunção com níveis de alerta de pandemiapredefinidos de modo a identificar a probabilidade da ameaça e fornecerorientação para uma resposta eficaz .

A vacinação é a medida de saúde pública mais importante paraprevenir doença causado pelas epidemias anuais de influenza. O curtointervalo entre a identificação de uma pandemia potencial e o início de níveisde doença significantemente aumentados apresentam desafios significantespara produzir vacina suficiente para proteger um segmento amplo dapopulação. Tendo a tecnologia da vacina e infra-estrutura de fabricação emandamento antes da emergência da pandemia seguinte será crítico emmelhorar uma quantidade significante de doença e morte. Os tempos deresposta curtos necessários para produzir uma "vacina pandêmica" nãopermitirá que pesquisa ou desenvolvimento de processo prolongados sejamconduzidos de modo a fornecer uma resposta eficaz.

Até agora, todas as vacinas de influenza comercialmentedisponíveis para as cepas não pandêmicas nos Estados Unidos forampropagadas em ovos de galinha embrionados. Embora o vírus da influenzadesenvolva bem em ovos de galinha, a produção de vacina é dependente dadisponibilidade de ovos. O fornecimento de ovos deve ser organizado, e cepaspara a produção de vacinas selecionadas meses a frente da seção de gripeseguinte, limitando a flexibilidade deste método, e freqüentemente resultandoem atrasos e faltas na produção e distribuição. Infelizmente, algumas cepas devacina da influenza, tais como o protótipo A/Fujian/cepa 411/02 quecircularam durante a estação de 2003 - 04, não replicam bem em ovos degalinha, e tiveram que ser isolados pela cultura de célula em um procedimentocaro e consumidor de tempo .

Os sistemas para produzir vírus da influenza em cultura decélula também foram desenvolvidos em anos recentes (Ver, por exemplo,Furminger. Vaccine Production, em Nicholson et al. (eds) Textbook ofInfluenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of Influenza vírus incell cultures for vaccine preparation, em Cohen & Shafferman (eds) NovelStrategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151). Tipicamente,estes métodos envolvem a infecção de células hospedeiras imortalizadasadequadas com cepa selecionada de vírus. Embora eliminando muitas dasdificuldades relacionadas com a produção de vacina em ovos de galinha, nemtodas as cepas patogênicas da influenza cresce bem e podem ser produzidasde acordo com os métodos de cultura de tecido estabelecidos. Além disso,muitas cepas com características desejáveis, por exemplo, atenuação,sensíveis a temperatura e adaptação ao frio, adequadas para a produção devacinas atenuadas vivas, não foram cultivadas com êxito em cultura de tecidousando métodos estabelecidos.

Além dos métodos com base em cultura de célula quedependem de infectar a cultura de célula com vírus vivo, os vírus da influenzatotalmente infecciosos foram produzidos em cultura de célula usandotecnologia de DNA recombinante. A produção de o vírus da influenza a partirde DNA recombinante significantemente aumenta a flexibilidade e utilidadedos métodos de cultura de tecido para produção da vacina da influenza.Recentemente, os sistemas para produzir os vírus A e B da influenza decDNAs que incorporam plasmídeos recombinantes que codificam o genomaviral foram relatados Ver, por exemplo, Neumann et al. (1999) Generation ofinfluenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA96:9345-9350; Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A viras fromrecombinant DNA. J. Virol 73:9679-9682; Hoffinann et al. (2000) A DNAtransfection system for generation of influenza A vírus from eight plasmidsProc Natl Acad Sci USAS 97:6108-6113; WO 01/83794; Hoffinann eWebster (2000), Unidirectional RNA polymerase I-polymerase IItranscription system for the generation of influenza A vírus from eightplasmids, 81:2843-2847; Hoffmann et al. (2002), Rescue of influenza B vírusfrom 8 plasmids, 99(17): 11411-11416; patente U.S. números 6.649.372 e6.951.754; publicações U.S. números 20050003349 e 20050037487, que sãoincorporadas aqui por referência. Este sistema, freqüentemente aludido como"recuperação de plasmídeo," oferece o potencial para produzir vírusrecombinantes expressando as proteínas HA e NA imunogênicas de qualquercepa selecionada.

Entretanto, estes métodos recombinantes dependem do uso devetores de expressão que compreendem elementos reguladores da RNApolimerase I (RNA pol I) para direcionar a transcrição do rRNA genômicoviral. Tais elementos reguladores são necessários para produzir asextremidades 5' e 3' definidas do RNA genômico da influenza tal que umvírus da influenza totalmente infeccioso pode ser fabricado. Os sistemasrecombinantes correntes, tais como aqueles descritos acima, usam o sistemaregulador RNA pol I humano para expressar RNA viral. Por causa deespecificidade da espécie do promotor RNA pol I, estes elementosreguladores são ativos apensa em células humanas ou de primata. Assim, arecuperação de plasmídeo do vírus da influenza até agora foi possível apenaspela transfecção de plasmídeos apropriados em células humanas ou deprimatas.

Além disso, tais células humanas ou de primatasfreqüentemente não produzem um título suficiente do vírus da influenzarequerido para fabricar vacina. Ao contrário, as células renais caninas deMadin-Darby (células MDCK) podem ser usadas para replicar as cepas devacina a um título suficiente para fabricar vacinas comerciais. Assim, aprodução de uma vacina da influenza usando a recuperação de plasmídeopresentemente requer o uso de pelo menos duas culturas de células diferentes.A identificação e a clonagem das seqüências reguladoras de RNA pol Icaninas possibilitaria que a recuperação de plasmídeo fosse realizada namesmo cultura de célula como replicação viral, eliminando a necessidadequanto a uma cultura de recuperação separada. Como tal, permanece umanecessidade para a identificação e a clonagem dos elementos reguladores deRNA pol I que podem ser utilizados para construir vetores apropriados para arecuperação de plasmídeo em MDCK e outras células caninas. Estas e outrasnecessidades não atingidas são fornecidas pela presente invenção.

A citação ou debate de uma referência aqui não devem serinterpretados como uma admissão que tal seja técnica anterior em relação àinvenção. Além disso, a citação de uma patente não deve ser interpretadacomo uma admissão de sua validade.

3. Sumário

São aqui divulgados ácidos nucleicos que compreendemelementos reguladores que podem ser usados para expressar, por exemplo,RNA genômico da influenza em células caninas. As composições tais comoácidos nucleicos isolados, vetores, e células que compreendem as seqüênciasreguladoras caninas da invenção, e métodos de usar as mesmas são formas derealização da invenção objeto.

Conseqüentemente, em certos aspectos, ácidos nucleicosisolados da invenção compreendem uma seqüência reguladora da RNApolimerase I (pol I) canina. Em certas formas de realização, a seqüênciareguladora compreende um promotor. Em certas formas de realização, aseqüência reguladora compreende um realçador. Em certas formas derealização, a seqüência reguladora compreende tanto um promotor quanto umrealçador. Em uma forma de realização, a seqüência reguladora compreendenucleotídeos -250 a -1 (em relação ao primeiro nucleotídeo transcrito a partirdo promotor, também conhecido como nucleotídeo +1) do promotor nativocorrespondente ou um derivado funcional deste. Em uma forma de realização,a seqüência reguladora é operavelmente ligada a um DNA viral, por exemplo,um cDNA viral clonado. Em uma forma de realização, o cDNA viral clonadocodifica RNA viral de um vírus de filamento negativo ou positivo ou o cRNAcorrespondente. Em certas formas de realização, o cDNA viral clonadocodifica RNA viral genômico (ou o cRNA correspondente) de um vírus dainfluenza.

Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos isolados dainvenção compreendem uma seqüência reguladora da RNA polimerase Icanina e uma seqüência de terminação transcricional. Em certas formas derealização, a seqüência de terminação transcricional é um RNA polimerase Iseqüência de terminação. Em uma forma de realização específica, a seqüênciade terminação transcricional é uma seqüência de terminação de pol I humanade macaco ou canina.

Em certos aspectos, a presente invenção fornece um ácidonucleico isolado que compreende um promotor da RNA pol I canina.Preferivelmente, o promotor da RNA pol I canina é operavelmente ligada aum ácido nucleico a ser transcrito, tal como, por exemplo, um RNA genômico da influenza. Em uma forma de realização, a introdução do ácido nucleico emuma célula canina resultante na transcrição do RNA genômico da influenza e,na presença de proteínas adequadas da influenza, o transcrito de RNA podeser empacotada em um vírus da influenza infeccioso. Em uma forma derealização, os ácidos nucleicos isolados são fornecidas que compreendem umaseqüência reguladora de RNA canino da invenção (por exemplo, um promotorda RNA pol I canina), em que a seqüência reguladora é operavelmente ligadaa um ácido nucleico a ser transcrito e, na presença de proteínas adequadas(por exemplo, um complexo de RNP no caso de um ácido nucleico quecodifica um segmento de vRNA da influenza) in vitro ou in vivo, é transcrito.Em uma forma de realização, o ácido nucleico operavelmente ligado a ditaseqüência reguladora é um segmento de vRNA da influenza.

Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos dainvenção compreendem uma seqüência de polinucleotídeo ou um fragmentodesta funcionalmente ativo, por exemplo, uma seqüência reguladora da RNApol I canina, que liga um polipeptídeo de pol I de ser humano, primata,camundongo ou canino e é de pelo menos 100 % ou cerca de 99 %, 98 %, 97%, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 % ou 65 % idêntica a uma oumais seqüências de nucleotídeo selecionadas do grupo que consiste de: SEQID Nos 1 a 28. Em uma forma de realização, a seqüência de polinucleotídeo oufragmento desta funcionalmente ativa ainda retém a capacidade para iniciar atranscrição, na presença de polipeptídeos apropriados (polipeptídeos de pol Ide ser humano, primata, camundongo ou canino), de uma segunda seqüênciade polinucleotídeo operavelmente ligada com a seqüência de nucleotídeo. Emuma forma de realização, "fragmentos funcionalmente ativos" dos ácidosnucleicos apresentados na SEQ ID Nos 1 a 28 retêm um ou mais atividadesfuncionais aqui descritas das seqüências de tamanho natural da SEQ ID Nos 1a 28. Por exemplo, os fragmentos funcionalmente ativos da seqüênciareguladora apresentada como SEQ ID NO: 1 são fornecidos por meio do qualo fragmento da seqüência reguladora é operavelmente ligado a um ácidonucleico a ser transcrito e, na presença de proteínas adequadas in vitro ou invivo, é transcrito.

Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos dainvenção compreendem uma seqüência de polinucleotídeo ou um fragmentodeste, por exemplo, uma seqüência reguladora da RNA pol I canina, que ligaum polipeptídeo de pol I de ser humano, primata, camundongo ou canino e/oué 100 % ou pelo menos ou cerca de 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85%, 80 %, 75 %, 70 % ou 65 % idêntica a uma ou mais seqüências denucleotídeo selecionadas do grupo que consiste de: SEQ ID Nos 1 a 28. Emuma forma de realização, a seqüência de polinucleotídeo ou fragmento desteainda retém a capacidade para iniciar a transcrição, na presença depolipeptídeos apropriados (polipeptídeos de pol I de ser humano, primata,camundongo ou canino), de uma segunda seqüência de polinucleotídeooperavelmente ligada com a seqüência de nucleotídeo.

Em outras formas de realização, os ácidos nucleicos isoladosda invenção compreendem uma seqüência reguladora da RNA polimerase Icanina e uma seqüência de ribozima. Esta pode ser, por exemplo, a seqüênciade ribozima do genômica do vírus delta da hepatite ou um derivado funcionaldeste.

Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos da invençãocodificam RNA viral genômico de qualquer vírus de RNA de filamentonegativo conhecido por uma pessoa de habilidade na técnica sem limitação.Em certas formas de realização, o RNA viral codifica RNA viral genômico deum vírus da ordem dos Mononegavirales. Em certas formas de realização, oRNA viral codifica RNA viral genômico de um vírus da famíliaParamyxoviridae, Pneumovirinae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Bornaviridae,Orthomyxoviridae, Bunyaviridae ou Arenaviridae. Em certas formas derealização, o RNA viral codifica RNA viral genômico de um vírus do gêneroRespirovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, Henipavirus, Avulavirus,Pneumovirus, Metapneumovirus, Vesiculovirus, Lyssavirus, Ephemerovirus,Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus, Novirhabdovirus, Marburgvirus,Ebolavirus, Bornavirus, Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C,Thogotovirus, Isavirus, Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus,Phlebovirus, Tospovirus, Arenavirus, Ophiovirus, Tenuivirus ou Deltavirus.Em certas formas de realização, o RNA viral codifica RNA viral genômico deum vírus selecionado do grupo que consiste de vírus Sendai, vírus dosarampo, vírus da caxumba, vírus Hendra, vírus da doença de Newcastle,vírus sincicial respiratório humano, pneumovírus aviário, vírus da estomatitevesicular indiana, vírus da raiva, vírus da febre efêmera bovina, vírus doamarelamento necrótico da alface, vírus do nanismo amarelo da batata, vírusda necrose hematopoiética infecciosa, marburgvírus do Lago Vitória, vírus doebola do Zaire, vírus da doença de Borna, vírus da Influenza A, vírus daInfluenza B, vírus da Influenza C, vírus Thogoto, vírus da anemia do salmãoinfecciosa, vírus Bunyamwera, vírus Hantaan, vírus Dugbe, vírus da febre deRift Valley, vírus da murchação pintada do tomate, vírus da coriomeningitelinfocítica, vírus da psorose cítrica, vírus da listra do arroz, e vírus delta dahepatite.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um vetor quecompreende um ácido nucleico da invenção. Em certas formas de realização,o vetor é um vetor de expressão. Em certas formas de realização, o vetorcompreende uma origem bacteriana de replicação. Em certas formas derealização, o vetor compreende uma origem eucariótica de replicação. Emcertas formas de realização, o vetor compreende um marcador selecionávelque pode ser selecionado em uma célula procariótica. Em certas formas derealização, o vetor compreende um marcador selecionável que pode serselecionado em uma célula eucariótica. Em certas formas de realização, ovetor compreende um sítio de clonagem múltipla. Em certas formas derealização, o sítio de clonagem múltipla é orientado em relação à seqüênciareguladora da RNA polimerase I canina para permitir a transcrição daseqüência de polinucleotídeo introduzida no sítio de clonagem múltipla daseqüência reguladora. Em certas formas de realização, o vetor compreendeuma seqüência de polinucleotídeo que pode ser expressada em célulascaninas, por exemplo, em células MDCK.

Em uma forma de realização, a invenção fornece vetores deexpressão úteis para recuperar recombinantemente um vírus da cultura decélula, por exemplo, culturas de célula MDCK. No geral, os vetores são úteispara recuperar qualquer vírus conhecido por uma pessoa habilitada na técnicapara requerer a produção de RNA com extremidades definidas durante o seuciclo de vida. Tais vírus incluem, mas não são limitados aos vírus de RNA defilamento de sentido negativo, tais como aqueles descritos acima.Preferivelmente, o vírus é um vírus da influenza, por exemplo, um vírus dainfluenza A, influenza B ou vírus da influenza C.

Em certas formas de realização, um ou mais dos vetores dainvenção compreendem ainda uma seqüência de terminação de transcrição deRNA. Em certas formas de realização, a seqüência de terminação detranscrição é selecionada do grupo que consiste de uma seqüência determinação de transcrição da RNA polimerase I, seqüência de terminação detranscrição da RNA polimerase II, seqüência de terminação de transcrição daRNA polimerase III, e uma ribozima.

Em certas formas de realização, os vetores de expressão sãovetores de expressão unidirecionais. Em outras formas de realização, osvetores de expressão são vetores de expressão bidirecionais. Em algumasformas de realização, os vetores de expressão bidirecionais da invençãoincorporam um primeiro promotor inserido entre um segundo promotor e umsítio de poliadenilação, por exemplo, um Sítio de poliadenilação de SV40. Emcertas formas de realização, o primeiro promotor é um promotor da RNA pol Icanina. Em certas formas de realização, o segundo promotor é um promotorda RNA pol I canina. Em uma forma de realização, o primeiro promotor e osegundo promotor estar situados orientações opostas flanqueando pelo menosum sítio de clonagem.Em certas formas de realização, os vetores de expressãocompreendem uma seqüência de ribozima ou seqüência de terminação detranscrição 3' de pelo menos um sítio de clonagem em relação ao promotor daRNA pol I canina. Em certas formas de realização, os vetores de expressãocompreendem uma seqüência de ribozima ou seqüência de terminação detranscrição 3' de pelo menos um sítio de clonagem em relação ao promotor daRNA pol I canina tal que o vRNA pode ser intracelularmente sintetizado comextremidades 5'e 3'exatas.

Em uma forma de realização, nos vetores de expressão bi-direcionais da invenção, um gene ou cDNA estão localizados entre umpromotor de pol II à montante e uma seqüência reguladora de pol I canina àjusante (por exemplo, um promotor de pol I) da invenção. A transcrição dogene ou cDNA a partir do promotor de pol II produz mRNA viral de sentidopositivo capeado e a transcrição a partir da seqüência reguladora de pol Icanina produz vRNA de sentido negativo, não capeado. Alternativamente, emum sistema de vetor unidirecional da invenção, o gene ou cDNA estãolocalizados à jusante de um promotor de pol I e um de pol II. O promotor depol I produz mRNA viral de sentido positivo capeado e o promotor de pol Iproduz cRNA viral de sentido positivo não capeado.

Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição quecompreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze,doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis ou dezessete vetores, em que osvetores compreendem um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção (porexemplo, uma seqüência reguladora de pol I canina da invenção)operavelmente ligada ao cDNA viral, por exemplo, cDNA viral da influenza.

Em certas formas de realização, um, dois, três, quatro, cinco,seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais do que doze dos vetores dainvenção estão presentes em um único plasmídeo. Em certas formas derealização, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez,onze ou doze dos vetores estão presentes em um plasmídeo separado. Emcertas formas de realização, cada vetor está em um plasmídeo separado.

Em certas formas de realização, os vetores da invenção são osvetores de expressão bi-direcionais. Um vetor de expressão bi-direcional dainvenção tipicamente inclui um primeiro promotor e um segundo promotor,em que o primeiro e segundo promotores estão operavelmente ligados aosfilamentos alternativos do mesmo cDNA de filamento duplo que codifica oácido nucleico viral incluindo um segmento do genoma do vírus da influenza.No geral, pelo menos um destes promotores é um promotor da RNA pol Icanina. Opcionalmente, o vetor de expressão bi-direcional pode incluir umsinal de poliadenilação e/ou uma seqüência de terminação. Por exemplo, osinal de poliadenilação e/ou a seqüência de terminação podem estarlocalizados flanqueando um segmento do genoma do vírus da influenzainterno em relação aos dois promotores. Um sinal de poliadenilação favorávelé um Sinal de poliadenilação de SV40.

Em uma forma de realização, a invenção compreende umsistema de expressão com base em plasmídeo bidirecional e um sistema deexpressão com base em plasmídeo unidirecional, em que cDNA viral éinserido entre uma seqüência reguladora de pol I canina (por exemplo, umpromotor de pol I) da invenção e seqüências de terminação (unidade detranscrição interna). Esta unidade de transcrição interna é flanqueada por umpromotor da RNA polimerase II (pol II) e um sítio de poliadenilação (unidadede transcrição externa). Neste sistema unidirecional, os promotores de pol I ede pol II estão à montante do cDNA produzem cRNA não capeado de sentidopositivo (a partir do promotor de pol I) e mRNA capeado de sentido positivo(a partir do promotor de pol II). O promotor de pol I, seqüência de terminaçãode pol I, promotor de pol II e sinal de poliadenilação neste sistemaunidirecional pode ser aludido como compreendendo uma "orientação demontante para jusante". No sistema bidirecional, os promotores de pol I e depol II estão em lados opostos do cDNA em que um promotor de pol II àmontante produz mRNA capeado de sentido positivo e um promotor de pol Ià jusante produz RNA viral não capeado de sentido negativo (vRNA). Estessistemas de pol I-pol II começam com a iniciação de transcrição de duasenzimas de polimerase de RNA celular a partir de seus próprios promotores,presumivelmente em compartimentos diferentes do núcleo. O promotor de polI e seqüência de terminação de pol I no sistema bidirecional pode ser aludidocomo compreendendo uma "orientação de jusante para montante" ao passoque o promotor de pol I e sinal de poliadenilação no sistema bidirecional podeser aludido como compreendendo uma "orientação de montante para jusante."

Em outros aspectos, a invenção aqui divulgada incluicomposições que compreendem um vetor de expressão que compreende umaseqüência de polinucleotídeo transcritível pela RNA polimerase I canina. Emcertas formas de realização, o polinucleotídeo produz um vRNA da influenzaou cRNA. Em certas formas de realização, a composição compreende umapluralidade de vetores de expressão cada um compreendendo uma seqüênciade polinucleotídeo transcritível pela RNA polimerase I canina. Em certasformas de realização, os polinucleotídeos produzem uma pluralidade devRNAs ou cRNAs da influenza. Em certas formas de realização, ospolinucleotídeos produzem todos os oito vRNAs ou cRNAs da influenza

Em outros aspectos, a invenção aqui divulgada incluicomposições que compreendem uma pluralidade de vetores de expressão dainvenção que quando introduzidos em uma célula canina na ausência/presençade um vírus auxiliar, resulta na produção de um genoma da influenza.

Em certas formas de realização, as composições da invençãocompreendem uma pluralidade de vetores de expressão que quandointroduzidos em uma célula canina na ausência/presença de um vírus auxiliar,resulta na produção de um vírus da influenza infeccioso. Em certas formas derealização, o vírus da influenza infeccioso é um vírus da influenza sensível aofrio. Em certas formas de realização, o vírus da influenza infeccioso é umvírus da influenza atenuado. Em certas formas de realização, o vírus dainfluenza infeccioso é um vírus da influenza sensível à temperatura. Em certasformas de realização, o vírus da influenza infeccioso é um vírus da influenzaadaptado ao frio. Em certas formas de realização, o vírus da influenzainfeccioso é um vírus da influenza atenuado, sensível à temperatura, adaptadoao frio.

Em certas formas de realização, as composições da invençãocompreendem um vetor que compreende, de 5' para 3', um promotoroperavelmente ligado às seqüências do vírus da influenza não codificadoras 5'ligadas ao cDNA ligado às seqüências do vírus da influenza não codificadoras3' ligadas a uma seqüência de terminação de transcrição. Em certas formas derealização, um ou mais dos cDNAs nos vetores está na orientação de sentido.Em certas formas de realização, um ou mais dos cDNAs nos vetores está naorientação de anti-sentido.

Em certas formas de realização, a invenção fornececomposições que compreendem uma pluralidade de vetores, em que apluralidade dos vetores compreende um vetor que compreende uma seqüênciareguladora canina da invenção operavelmente ligada a um cDNA da proteínaácida (PA) da polimerase do vírus da influenza ligado a uma seqüência determinação de transcrição, um vetor que compreende uma seqüênciareguladora canina operavelmente ligada a um cDNA da proteína 1 básica(PBl) da polimerase do vírus da influenza ligado a uma seqüência determinação de transcrição, um vetor que compreende uma seqüênciareguladora canina operavelmente ligada a um cDNA da proteína 2 básica(PB2) da polimerase do vírus da influenza ligado a uma seqüência determinação de transcrição, um vetor que compreende uma seqüênciareguladora canina operavelmente ligada a um cDNA da hemaglutinina (HA)do vírus da influenza ligado a uma seqüência de terminação de transcrição,um vetor que compreende uma seqüência reguladora canina operavelmenteligada a um cDNA de nucleoproteína (NP) do vírus da influenza ligado a umaseqüência de terminação de transcrição, um vetor que compreende umaseqüência reguladora canina operavelmente ligada a um cDNA deneuraminidase (NA) do vírus da influenza ligado a uma seqüência determinação de transcrição, um vetor que compreende uma seqüênciareguladora canina operavelmente ligada a um cDNA da proteína de matriz dovírus da influenza ligado a uma seqüência de terminação de transcrição, e umvetor que compreende uma seqüência reguladora canina operavelmente ligadaa um cDNA de NS do vírus da influenza ligado a uma seqüência determinação de transcrição. Em certas formas de realização, a composiçãocompreende ainda um ou mais vetores de expressão que expressam ummRNA que codifica um ou mais polipeptídeos da influenza selecionados dogrupo que consiste de: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, proteína 1 da matriz(Ml), proteína 2 da matriz (M2), e proteínas 1 e 2 não estruturais (NS1 eNS2).

Em uma forma de realização, a composição, quandointroduzida em uma célula canina, resulta na produção de o vírus da influenzainfeccioso. Em certas formas de realização, o vírus da influenza infeccioso éum vírus da influenza sensível ao frio. Em certas formas de realização, o vírusda influenza infeccioso é um vírus da influenza atenuado. Em certas formasde realização, o vírus da influenza infeccioso é um vírus da influenza sensívelà temperatura. Em certas formas de realização, o vírus da influenza infecciosoé um vírus da influenza adaptado ao frio. Em certas formas de realização, ovírus da influenza infeccioso é um vírus da influenza atenuado, sensível àtemperatura, adaptado ao frio.

Em certas formas de realização, a invenção fornece umacomposição que gera o vírus da influenza infeccioso a partir do cDNA viralclonado, que compreende um conjunto de plasmídeos em que cada plasmídeocompreende cDNA que codifica pelo menos um segmento genômico viral, eem que cDNA viral que corresponde ao segmento genômico viral é inseridoentre uma seqüência reguladora da RNA polimerase I canina da invenção eum elemento regulador (por exemplo, uma seqüência de terminação de pol Icanina ) para a síntese de vRNA ou cRNA com uma extremidade 3' exata,que resulta na expressão de vRNA ou cRNA.

Em certas formas de realização, a invenção fornece umacomposição que gera o vírus da influenza infeccioso a partir do cDNA viralclonado, que compreende um conjunto de plasmídeos em que cada plasmídeocompreende cDNA que codifica pelo menos um segmento genômico viral, eem que cDNA viral que corresponde ao segmento genômico viral é inseridoentre uma seqüência reguladora da RNA polimerase I canina da invenção eum elemento regulador (por exemplo, uma seqüência de terminação de pol Icanina) para a síntese de vRNA ou cRNA com uma extremidade 3' exata, queresulta na expressão de vRNA ou cRNA, em que a seqüência reguladora daRNA polimerase I canina, cDNA viral, e um elemento regulador para asíntese de vRNA ou cRNA com uma extremidade 3' exata são por sua vezinseridos entre um promotor da RNA polimerase II (pol II) e um sinal depoliadenilação, que resulta na expressão do mRNA viral e uma proteína viralcorrespondente, em que a expressão do conjunto completo de vRNAs oucRNAs e proteínas virais resultantes na montagem de um vírus da influenzainfeccioso.

Em certas formas de realização, o elemento regulador para asíntese de vRNA ou cRNA com uma extremidade 3' exata é uma seqüênciade terminação de RNA polimerase I (pol I). Como uma pessoa habilitada natécnica está ciente, a replicação e transcrição eficientes de vRNA da influenzarequerem seqüências muito específicas nas extremidades 5' e 3' do vRNA. Otécnico habilitado podo uso uma seqüência de terminação de RNA polimeraseI (pol I) para garantir que a seqüência da extremidade 3' do transcrito do RNAfabricado seja definida como sendo a extremidade desejada para a replicaçãoe/ou transcrição eficientes deste RNA genômico. Em certas formas derealização, o elemento regulador para a síntese de vRNA ou cRNA com umaextremidade 3' exata é uma seqüência de ribozima. Em certas formas derealização, o promotor de pol I está próxima ao sinal de poliadenilação e aseqüência de terminação de pol I está próxima ao promotor de pol I. Emcertas formas de realização, o promotor de pol I está próximo ao promotor depol Iea seqüência de terminação de pol I está próxima ao sinal depoliadenilação. Em certas formas de realização, o vírus da influenza é umvírus da influenza A. Em certas formas de realização, o vírus da influenza éum vírus da influenza B.

Em um outro aspecto, a invenção fornecer um método paraproduzir um RNA genômico da influenza, que compreende transcrever umácido nucleico da invenção, produzindo deste modo um RNA genômico dainfluenza. Em certas formas de realização, o RNA genômico da influenza étranscrito em um sistema isento de célula. Em certas formas de realização, oRNA genômico da influenza é transcrito em um célula canina, por exemplo,uma célula MDCK.

Em uma forma de realização, os métodos compreendemtranscrever uma pluralidade dos ácidos nucleicos da invenção, produzindodeste modo uma pluralidade de moléculas de RNA, por exemplo, umapluralidade dos RNAs genômicos da influenza. Em certas formas derealização, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito RNAs genômicos dainfluenza são transcritos. Em certas formas de realização, um conjuntocompleto dos RNAs genômicos da influenza são transcritos. Em certas formasde realização, o RNA genômico da influenza, quando transcrito em um célulacanina, por exemplo, uma célula MDCK, na presença de PA, PB1, PB2, e NP,expressa uma proteína da influenza. Em certas formas de realização, aproteína da influenza é selecionada do grupo que consiste de PB2, PB1, PA,HA, NP, NA, Ml, M2, NS1, e NS2. Em certas formas de realização, oconjunto completo dos RNAs genômicos da influenza, quando transcritos emum célula canina, por exemplo, uma célula MDCK, na presença de PA, PB1,PB2, e NP, expressa um vírus da influenza infeccioso. Em certas formas derealização, os métodos compreendem introduzir PA, PB1, PB2, e NP juntocom RNAs genômicos da influenza. Em certas formas de realização, PA,PB1, PB2, e NP são fornecidos por um vírus auxiliar. Em certas formas derealização, o conjunto completo dos RNAs genômicos da influenza é de umvírus da influenza atenuado, adaptado ao frio, sensível à temperatura.

Em uma forma de realização, um método de transcrever umsegmento de vRNA de um vírus da influenza é fornecido, o dito métodocompreendendo as etapas de 1) contatar um polinucleotídeo que compreendeum ácido nucleico (ou fragmento ativo deste) selecionado do grupo queconsiste de: Nos 1 a 28 com um ou mais proteínas da influenza PB1, PB2, NP,e PA, em que o dito ácido nucleico é operavelmente ligado a uma molécula decDNA que codifica o dito segmento de vRNA; e 2) isolar um segmento detranscrito de vRNA. Em uma forma de realização específica, o vírus auxiliar éusado no método.

Em um aspecto, a invenção fornece um método de produzirvírus recombinantes infecciosos recombinantes que compreendem umgenoma de RNA segmentado (por exemplo, um vírus da influenzainfeccioso), que compreende as etapas de cultivar células hospedeiras caninas,por exemplo, células MDCK, que compreendem um ou mais vetores deexpressão da invenção que compreendem cDNA viral que corresponde a cadagene no genoma viral e um ou mais vetores de expressão que expressammRNA viral que codifica um ou mais polipeptídeos virais; e isolar umapopulação de vírus infeccioso. Em uma forma de realização, a população devírus infeccioso é uma população de o vírus da influenza. Em uma forma derealização, o método compreende ainda a etapa de introduzir o um ou maisvetores de expressão nas células hospedeiras caninas antes da dita etapa decultivo. Em uma forma de realização, o método compreende ainda a etapa defabricas o um ou mais vetores de expressão antes da dita etapa de introdução.

Em uma forma de realização, um método de produzir vírusrecombinantes infecciosos recombinantes que compreendem um genoma deRNA segmentado (por exemplo, um vírus da influenza infeccioso) éfornecido em que o método compreende as etapas de: a) inserir em um oumais vetores de expressão da invenção de cDNA viral que corresponde a cadagene no genoma viral; (b) introduzir (por exemplo, por eletroporação) os ditosvetores de expressão e um ou mais vetores de expressão que expressammRNA viral que codifica um ou mais polipeptídeos virais em uma célulahospedeira (por exemplo, um célula canina) ou uma população de célulashospedeiras; (c) incubar as ditas células hospedeiras; e d), isolar umapopulação de vírus infeccioso. Em uma forma de realização, o vírusinfeccioso recombinante é influenza. Em certas formas de realização, o vírusda influenza é um vírus da influenza atenuado, adaptado ao frio, sensível àtemperatura.

Em uma forma de realização, um método de produzir um vírusinfeccioso recombinante que compreende um genoma de RNA segmentado(por exemplo, um vírus da influenza infeccioso) é fornecido em que o métodocompreende as etapas de: a) inserir em um ou mais vetores de expressão dainvenção um cDNA viral que corresponde a cada gene no genoma viral; (b)introduzir (por exemplo, por eletroporação) os ditos vetores de expressão emuma célula hospedeira (por exemplo, um célula canina) ou uma população decélulas hospedeiras; (c) incubar as ditas células hospedeiras; e d), isolar umapopulação de vírus infeccioso. Em uma forma de realização, o vírusinfeccioso recombinante é influenza. Em certas formas de realização, o vírusda influenza é um vírus da influenza atenuado, adaptado ao frio, sensível àtemperatura.Em uma forma de realização, a presente invenção fornecemétodos de gerar vírus da influenza infeccioso recombinante na célulashospedeiras usando os vetores de expressão da invenção para expressar ossegmentos de vRNA ou cRNAs correspondentes e as proteínas do vírus dainfluenza, em particular PB1, PB2, PA e NA. De acordo com esta forma derealização, o vírus auxiliar pode ser usado ou não para gerar os vírusinfecciosos recombinantes da influenza.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece ummétodo para produzir um vírus da influenza recombinante, que compreendecultivar células caninas que compreendem uma pluralidade de ácidosnucleicos que compreendem uma seqüência reguladora da RNA polimerase Icanina operavelmente ligada a um ou mais cDNAs que codificam cada RNAgenômico da influenza e um ou mais vetores de expressão que expressammRNA viral que codifica um ou mais polipeptídeos da influenza: PB2, PB1,PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS 1 e NS2; e isolar o dito vírus da influenzarecombinante das células.

Em certas formas de realização, os métodos compreendemintroduzir nos vetores de expressão de células que direcionam a expressão nascélulas de segmentos genômicos ou anti-RNA viral genômicos, uma núcleoproteína, e uma polimerase dependente de RNA, de modo que os complexosde ribonucleoproteína possam ser formados e partículas virais possam sermontadas na ausência do vírus auxiliar; e (b) cultivar as células em que aspartículas virais são empacotadas e recuperadas. Em certas formas derealização, o vírus de filamento negativo recombinante é um vírus nãosegmentado. Em certas formas de realização, o vírus de RNA de filamentonegativo recombinante é um vírus segmentado. Em certas formas derealização, o vírus de RNA de filamento negativo é um vírus da influenza.

Em certas formas de realização, os métodos compreendemintroduzir em células caninas cultivadas vetores de expressão que direcionama expressão segmentos de RNA genômicos ou antigenômicos de um vírus deRNA de filamento negativo segmentado, uma núcleo proteína, e umapolimerase dependente de RNA sob condições que permitam a formação doscomplexos de RNP contendo os segmentos de RNA genômico do vírus emontagem das partículas virais na ausência do vírus auxiliar; e cultivar ascélulas em que as partículas virais são produzidas. Em certas formas derealização, os vetores de expressão direcionam a expressão de segmentos deRNA genômico do vírus.

Em certas formas de realização, as células caninas usadas nosmétodos da invenção compreendem um ou mais vetores de expressão queexpressam uma ou mais proteínas selecionadas a partir de nucleoproteína e assubunidades do RNA polimerase dependente de RNA. Em certas formas derealização, os vetores de expressão direcionam a expressão de uma ou maisdas nucleoproteínas e as subunidades da dita RNA polimerase dependente daRNA. Em certas formas de realização, a expressão de uma ou mais proteínasvirais dos vetores de expressão está sob o controle de uma seqüênciareguladora selecionada do promotor tardio principal do adenovírus 2 ligada àseqüência líder tripartida unida de adenovírus humano tipo 2 ou do promotorinicial imediato do citomegalovírus humano ou um derivado funcional daseqüência reguladora.

Em certas formas de realização, o vírus é um vírus dainfluenza do tipo A, B ou C. Em certas formas de realização, o vírus é umvírus recontaminante tendo segmentos de vRNA derivados de mais do que umvírus percursor.

Em certas formas de realização, os métodos da invençãocompreendem introduzir uma pluralidade de vetores da invenção, cada umdos quais incorpora um porção de um vírus da influenza em uma populaçãode células hospedeiras capazes de suportar a replicação viral. As célulashospedeiras podem ser cultivadas sob condições permissíveis para ocrescimento viral, e o vírus da influenza pode ser recuperado. Em algumasformas de realização, os vírus da influenza são vírus atenuados, vírusadaptados ao frio e/ou vírus sensíveis a temperatura. Por exemplo, em certasformas de realização, os vírus da influenza recombinantes derivados de vetorpodem ser atenuados, adaptados ao frio, vírus sensíveis a temperatura, taiscomo são adequados para administração como uma vacina atenuada viva, porexemplo, em uma formulação de vacina intranasal. Em uma forma derealização exemplar, os vírus são produzidos pela introdução de umapluralidade de vetores que incorporam todo ou parte de um genoma do vírusB/Ann Arbor/1/66 da influenza, por exemplo, um genoma do vírus ca B/AnnArbor/1/66.

Em algumas formas de realização, uma pluralidade de vetoresque compreendem cDNA que codifica pelo menos os 6 segmentos de genomainternos (por exemplo, segmentos de genoma que codificam todas asproteínas da influenza exceto para HA e NA) de uma cepa da influenza ecDNA que codificam um ou mais segmentos de genoma (por exemplo,segmentos de vRNA de HA e NA) de uma cepa da influenza diferente podeser introduzido em uma população de células hospedeiras. Por exemplo, pelomenos os 6 segmentos de genoma internos ("a cadeia principal") de uma cepaA ou B da influenza atenuada, adaptada ao frio e/ou sensível a temperaturaselecionada, por exemplo, uma cepa de ca, att, ts de B/Ann Arbor/1/66 ouuma cepa A ou B da influenza ca, att, ts artificialmente engenheirada, podemser introduzidos em uma população de células hospedeiras junto com um oumais segmentos que codificam antígenos imunogênicos derivados de umaoutra cepa viral. Tipicamente os antígenos de superfície imunogênica incluemcada um ou ambos dos antígenos de hemaglutinina (HA) e/ou neuraminidase(NA). Em formas de realização onde um segmento único que codifica umantígeno de superfície imunogênica é introduzido, os 7 segmentoscomplementares do vírus selecionado também são introduzidos nas célulashospedeiras.

Em certas formas de realização, os vetores de expressão sãotransfectados nas células por eletroporação. Em certas formas de realização,os vetores de expressão são introduzidos nas células pela transfecção emcélulas na presença de um reagente de transfecção lipossômica ou por meio daprecipitação de fosfato de cálcio. Em certas formas de realização, os vetoresde expressão são plasmídeos. Em certas formas de realização, os vetores deexpressão compreendem um vetor de expressão separado para a expressão decada segmento de RNA genômico do dito vírus ou os RNAs codificadorescorrespondentes. Em certas formas de realização, a expressão de cadasegmento de RNA genômico ou RNA codificado está sob o controle de umaseqüência promotora derivada de um promotor de Pol I canina como aquidescrito.

Em certas formas de realização, uma pluralidade de vetoresplasmídicos que incorporam o genoma do vírus da influenza os segmentos sãointroduzidos em uma população de células hospedeiras. Por exemplo, emcertas formas de realização, 8 plasmídeos, cada um dos quais incorpora umsegmento de genoma diferente pode ser utilizado para introduzir um genomada influenza completo nas células hospedeiras. Alternativamente, um númeroenorme de plasmídeos, que incorporam subseqüências genômicas menorespode ser utilizado.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um métodopara gerar em células infecciosas cultivadas partículas virais de um vírus deRNA de filamento negativo segmentado tendo mais do que 3 segmentos devRNA genômico, por exemplo um vírus da influenza tal como um vírus dainfluenza A, o dito método compreendendo: (a) introduzir em uma populaçãode células capazes de sustentar o crescimento do dito vírus um primeiroconjunto de vetores de expressão capazes de expressar nas ditas célulassegmentos de vRNA genômico para fornecer os segmentos de vRNAgenômico completos do dito vírus; (b) introduzir nas ditas células um segundoconjunto de vetores de expressão capazes de expressar mRNA que codificaum ou mais polipeptídeos do dito vírus; e (c) cultivar as ditas células por meiodas quais as ditas partículas virais são produzidas. Em certas formas derealização, as células são células caninas. Em certas formas de realização, ascélulas são células MDCK. Em certas formas de realização, o vírus é o vírusda influenza B. Em certas formas de realização, o primeiro conjunto devetores de expressão está contido em 1 a 8 plasmídeos. Em certas formas derealização, o primeiro conjunto de vetores de expressão está contido em umplasmídeo. Em certas formas de realização, o segundo conjunto de vetores deexpressão está contido em 1 a 8 plasmídeos. Em certas formas de realização,o segundo conjunto de vetores de expressão está contido em um plasmídeo.Em certas formas de realização, o primeiro, segundo ou ambos os conjuntosde vetores de expressão são introduzidos por eletroporação. Em certas formasde realização, o primeiro conjunto de vetores de expressão codificam cadasegmento de vRNA de um vírus da influenza. Em certas formas de realização,o segundo conjunto de vetores de expressão codificam o mRNA de um oumais polipeptídeos da influenza. Em certas formas de realização, o primeiroconjunto ou segundo conjunto de vetores de expressão (ou ambos osconjuntos) compreendem um ácido nucleico da invenção, por exemplo, umaseqüência reguladora canina da invenção (por exemplo, pol I canina). Emcertas formas de realização, o primeiro conjunto ou segundo conjunto devetores de expressão (ou ambos os conjuntos) codificam um vRNA ou mRNAde um segundo vírus. Por exemplo, um conjunto de vetores compreende umou mais vetores que codificam o mRNA e/ou vRNA de HA e/ou NA de umsegundo vírus da influenza.

A presente invenção também fornece um método para gerarem células infecciosas cultivadas partículas virais de um vírus de RNA defilamento negativo segmentado tendo mais do que 3 segmentos de vRNAgenômico, por exemplo um vírus da influenza tal como um vírus da influenzaA, o dito método compreendendo: (a) introduzir em uma população de célulascapazes de sustentar o crescimento do dito vírus em um conjunto de vetoresde expressão capazes tanto de expressar nas ditas células segmentos de vRNAgenômico para fornecer os segmentos de vRNA genômico completos do ditovírus quanto capazes de expressar mRNA que codifica um ou maispolipeptídeos do dito vírus; (b) cultivar as ditas células por meio do qual asditas partículas virais são produzidas. Em certas formas de realização, ascélulas são células caninas. Em certas formas de realização, as células sãocélulas MDCK. Em certas formas de realização, o vírus é o vírus B dainfluenza. Em certas formas de realização, o conjunto de vetores de expressãoestá contido nos plasmídeos de 1 a 17. Em certas formas de realização, oconjunto de vetores de expressão está contido em plasmídeo de 1 a 8. Emcertas formas de realização, o conjunto de vetores de expressão está contidoem plasmídeos de 1 a 3. Em certas formas de realização, os conjuntos devetores de expressão são introduzidos por eletroporação. Em certas formas derealização, o conjunto de vetores de expressão codifica cada segmento devRNA de um vírus da influenza. Em certas formas de realização, o conjuntode vetores de expressão codifica o mRNA de um ou mais polipeptídeos dainfluenza. Em certas formas de realização, o conjunto de vetores de expressãocodifica cada segmento de vRNA de um vírus da influenza e o mRNA de umou mais polipeptídeos da influenza. Em certas formas de realização, oconjunto de vetores de expressão compreende um ácido nucleico da invenção,por exemplo, uma seqüência reguladora canina da invenção (por exemplo, polI canina). Em certas formas de realização, o conjunto de vetores de expressãocodifica um vRNA ou mRNA de um segundo vírus. Por exemplo, o conjuntode vetores compreende um ou mais vetores que codificam o mRNA e/ouvRNA de HA e/ou NA de um segundo vírus da influenza. Em certas formasde realização, o primeiro conjunto ou segundo conjunto de vetores deexpressão (ou ambos os conjuntos) codificam um vRNA ou mRNA de umsegundo vírus. Por exemplo, um conjunto de vetores compreende um ou maisvetores que codificam o mRNA e/ou vRNA de HA e/ou NA de um segundovírus da influenza.

Em certas formas de realização, os métodos aindacompreendem amplificar as partículas virais produzidas pelas células caninaspor uma ou mais etapas de infecção celular adicionais utilizando células quesão as mesmas ou diferentes das células caninas. Em certas formas derealização, os métodos ainda compreendem isolar partículas viraisinfecciosas. Em certas formas de realização, os métodos ainda compreendemé uma etapa de atenuação ou morte do vírus. Em certas formas de realização,os métodos ainda compreendem a incorporam de partículas virais atenuadasou mortas em uma composição de vacina.

Em uma forma de realização, os métodos de produzir os vírusda invenção resultam em títulos virais (24 horas ou 36 ou 48 horas ou 3 diasou 4 dias depois de introduzir os vetores da invenção nas células hospedeiras)de pelo menos 0,1 χ 1O3 PFU/ml ou pelo menos 0,5 χ 1O3 PFU/ml ou pelomenos 1,0 χ 1O3 PFU/ml ou pelo menos 2 χ 1O3 PFU/ml ou pelo menos 3 χ1O3 PFU/ml ou pelo menos 4 χ 103 PFU/ml ou pelo menos 5 χ 1O3 PFU/ml oupelo menos 6 χ 10 PFU/ml ou pelo menos 7 χ 10 PFU/ml ou pelo menos 8 χ1O3 PFU/ml ou pelo menos 9 χ 1O3 PFU/ml ou pelo menos 1 χ 1O4 PFU/ml oupelo menos 5 χ 1O4 PFU/ml ou pelo menos 1 χ 1O5 PFU/ml ou pelo menos 5 χ1O5 PFU/ml ou pelo menos 1 χ 106 PFU/ml ou pelo menos 5 χ 1O6 PFU/ml oupelo menos 1xlO' PFU/ml ou na faixa de 0,1-1 χ 103 PFU/ml ou na faixa de1 χ 1O3-1 χ 1O4 PFU/ml ou na faixa de 1 χ 1O4-1x 105 PFU/ml ou na faixa de1 χ 1O5-1 χ 1O6PFU/ml ou na faixa de 1 χ 1O6-1 χ 1O7 PFU/ml ou mais do que1 χ 10 PFU/ml. Conseqüentemente, a presente invenção fornece métodospara recuperar vírus, em que o título dos vírus recuperados de 24 a 36 horasou 2 a 3 dias é de pelo menos 0,1 χ 10 PFU/ml ou pelo menos 0,5 χ 10PFU/ml ou pelo menos 1,0 χ 103 PFU/ml ou pelo menos 2 χ 103 PFU/ml oupelo menos 3 χ 103 PFU/ml ou pelo menos 4 χ 103 PFU/ml ou pelo menos 5 χ103 PFU/ml ou pelo menos 6 χ 103 PFU/ml ou pelo menos 7 χ 103 PFU/ml oupelo menos 8 χ 103 PFU/ml ou pelo menos 9 χ 103 PFU/ml ou pelo menos 1 χ104 PFU/ml ou pelo menos 5 χ 104 PFU/ml ou pelo menos 1 χ 105 PFU/ml oupelo menos 5 χ 105 PFU/ml ou pelo menos 1 χ 106 PFU/ml ou pelo menos 5 χ106 PFU/ml ou pelo menos 1 χ 107 PFU/ml ou na faixa de 0,1-1 χ 103PFU/ml ou na faixa de 1 χ 103-1 χ 104 PFU/ml ou na faixa de 1 χ 104-1 χ 105PFU/ml ou na faixa de 1 χ 105-1 χ 106 PFU/ml ou na faixa de 1 χ 106-1 χ 107PFU/ml ou mais do que 1 χ 107 PFU/ml.

Em algumas formas de realização, o vírus da influenzacorresponde a um o vírus B da influenza. Em algumas formas de realização, ovírus da influenza corresponde a um vírus da influenza A. Em certas formasde realização, os métodos incluem recuperar vírus da influenza recombinantee/ou recontaminante capazes de evocar uma resposta imune na administração,por exemplo, administração intranasal, a um paciente. Em algumas formas derealização, os vírus são inativados antes da administração, em outras formasde realização, vírus atenuados vivos são administrados. Os vírus da influenzaAeB recombinantes e recontaminantes produzidos de acordo com osmétodos da invenção também são uma característica da invenção. Em certasformas de realização, os vírus incluem um vírus da influenza atenuado, umvírus da influenza adaptado ao frio, um vírus da influenza sensível àtemperatura ou um vírus com qualquer combinação destas propriedadesdesejáveis. Em uma forma de realização, o vírus da influenza incorpora umviras da cepa B/Ann Arbor/1/66 da influenza, por exemplo, uma cepaadaptada ao frio, sensível a temperatura, atenuada de B/Ann Arbor/1/66. Emuma outra forma de realização, o vírus da influenza incorpora um vírus dacepa A/Ann Arbor/6/60 da influenza, por exemplo, uma cepa adaptada aofrio, sensível a temperatura, atenuada de A/Ann Arbor/6/60.Opcionalmente, os vírus recontaminante são produzidos pelaintrodução de vetores que codificam os seis vRNAs internos de uma cepaviral selecionada quanto as suas propriedades favoráveis com respeito àprodução de vacina, em combinação com os vetores que codificam ossegmentos de vRNA dos antígenos de superfície (HA e NA) de uma cepaselecionada, por exemplo, patogênica. Por exemplo, o segmento HA pode serfavoravelmente selecionado a partir de uma cepa Hl, H3 ou Bpatogenicamente relevante, como é rotineiramente realizado para a produçãode vacinas. Similarmente, o segmento HA pode ser selecionado a partir deuma cepa patogênica emergente tal como uma cepa H2 (por exemplo, H2N2),uma cepa H5 (por exemplo, H5N1) ou uma cepa H7 (por exemplo, H7N7).Alternativamente, os sete segmentos de gene complementares da primeiracepa são introduzidos em combinação com o segmento que codifica HA ouNA. Em certas formas de realização, os segmentos de gene internos sãoderivados a partir da cepa B/Ann Arbor/1/66 ou da A/Ann Arbor/6/60 deinfluenza. Além disso, um vírus da influenza pode ser produzido (porexemplo, um H5N1, H9N2, H7N7 ou HxNy (onde x=la9ey=lal5) quecompreende um gene HA modificado. Por exemplo, o gene HA pode sermodificado pela remoção do sítio de clivagem polibásico.

Em um outro aspecto, a invenção fornece uma célulahospedeira que compreende um ácido nucleico ou vetor de expressão dainvenção. Em certas formas de realização, a célula é um célula canina. Emcertas formas de realização, a célula canina é um célula renal. Em certasformas de realização, a célula renal canina é uma célula MDCK. Em outrasformas de realização, a célula é selecionada do grupo que consiste de célulasVero, células Per.Có, células BHK, células PCK, células MDCK, célulasMDBK, células 293 (por exemplo, células 293T), e células COS. Em algumasformas de realização, as co-culturas de uma mistura de pelo menos duasdestas linhagens celulares, por exemplo, uma combinação de células COS eMDCK ou uma combinação de células 293T e MDCK, constituem apopulação de células hospedeiras.

As células hospedeiras que compreendem os vetores dainfluenza da invenção podem ser cultivados em cultura sob condiçõespermissíveis para a replicação e montagem de vírus. Tipicamente, célulashospedeiras que incorporam os plasmídeos da influenza podem ser cultivadasem uma temperatura abaixo 37 °C, preferivelmente em uma temperatura iguala ou menor do que, 35 °C. Em certas formas de realização, as células sãocultivadas em uma temperatura entre 32 0C e 35 °C. Em algumas formas derealização, as células são cultivadas em uma temperatura entre cerca de 32 0Ce 34 °C, por exemplo, a cerca de 33 0C. A seguir da cultura por um períodoadequado de tempo para permitir a replicação do vírus até o título particular,os vírus recombinantes podem ser recuperados. Opcionalmente, os vírusrecuperados podem ser inativados.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um métodopara engendrar um vírus da influenza tal que o seu cultivo seja restrito a tiposde células particulares incluindo, mas não limitado aos tipos MRC-5, WI-38,FRhL-2, PerC6, 293, NIH 3T3, CEF, CEK, DF-1, Vero, MDCK, MvlLu,células epiteliais humanas e célula SF9. Em uma forma de realização, ocultivo é restrito tal que um vírus da influenza pode não crescer em umacélula primária humana (por exemplo, PerC6). Em uma outra forma derealização, o cultivo é restrito tal que um vírus da influenza pode não crescerem uma célula epitelial humana. Uma pessoa habilitada na técnicareconhecerá que o fenótipo de restrição de crescimento pode ser combinadocom um ou mais fenótipos adicionais tais como adaptados ao frio, sensível atemperatura, atenuado, etc. Também será reconhecido que uma mutaçãoresponsável por um fenótipo restrito ao cultivo também pode contribuir e/ouser responsável por fenótipos adicionais tais como aqueles listados acima.

Em um outro aspecto, a invenção fornece novos métodos pararecuperar os vírus da influenza A ou da influenza B recombinantes ourecontaminante (isto é, cepas do tipo selvagem e variantes da influenza A e/ouvírus da influenza B) das células MDCK em cultura. Em certas formas derealização, uma pluralidade de vetores que incorporam um genoma do vírusda influenza cuja a transcrição é controlada por uma seqüência reguladoracanina da invenção é eletroporada em uma população de células MDCK. Ascélulas podem ser cultivadas sob condições permissíveis para a replicaçãoviral, por exemplo, no caso de cepas virais adaptados ao frio, atenuado,sensível a temperatura, as células MDCK são cultivadas em uma temperaturaabaixo de 37 °C, preferivelmente em uma temperatura igual a ou menor doque, 35 °C. Tipicamente, as células são cultivadas em uma temperatura entre32 °C e 35 °C. Em algumas formas de realização, as células são cultivadas emuma temperatura entre cerca de 32 °C e 34 °C, por exemplo, a cerca de 33 °C.Opcionalmente (por exemplo, para a produção de vacinas), as células MDCKsão cultivadas em meio isento de soro sem quaisquer produtos derivados deanimal.

Em algumas formas de realização dos métodos descritosacima, os vírus da influenza podem ser recuperados a seguir da cultura dascélulas hospedeiras que incorporam os plasmídeos do genoma da influenza.Em algumas formas de realização, os vírus recuperados são os vírusrecombinantes. Em algumas formas de realização, os vírus são vírus dainfluenza recontaminante tendo contribuições genéticas de mais do que umacepa precursora de vírus. Opcionalmente, os vírus recombinantes ourecontaminantes recuperados são ainda amplificados pela passagem emcélulas cultivadas ou em ovos de galinha.

Opcionalmente, os vírus recuperados podem ser inativados.Em algumas formas de realização, os vírus recuperados compreendem umavacina da influenza. Por exemplo, a vacina da influenza recuperada pode serum vírus da influenza recontaminante (por exemplo, 6:2 ou 7:1 os vírusrecontaminante) tendo um antígeno HA e/ou NA derivado da cepaselecionada da influenza A ou influenza B. Em uma forma de realização, oantígeno HA ou NA é modificado. Em certas formas de realização favoráveis,os vírus da influenza recontaminante têm um fenótipo atenuado.Opcionalmente, os vírus recontaminante são adaptados ao frio e/ou sensíveisa temperatura, por exemplo, um o vírus da influenza A ou B atenuado,adaptado ao frio ou sensível a temperatura. Tais vírus da influenza são úteis,por exemplo, como vacinas atenuadas vivas para a produção profilática deuma resposta imune específica para uma cepa da influenza selecionada, porexemplo, patogênica. Os vírus da influenza, por exemplo, os vírusrecontaminante atenuados, produzidos de acordo com os métodos da invençãosão uma característica adicional da invenção.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a métodos paraproduzir uma vacina do vírus da influenza recombinante que compreendeintroduzir uma pluralidade de vetores que incorporam um genoma do vírus dainfluenza cuja a transcrição é controlada por uma seqüência reguladora caninada invenção (por exemplo, um promotor da RNA pol I canina) em umapopulação de células hospedeiras capazes de sustentar a replicação do vírusda influenza, cultivar as células hospedeiras em uma temperatura menor doque ou igual a 35 °C, e recuperar um vírus da influenza capaz de evocar umaresposta imune na administração a um paciente. As vacinas podemcompreender os vírus da cepa da influenza A ou da influenza B.

Em algumas formas de realização, os vírus da vacina dainfluenza incluem um vírus da influenza atenuado, um vírus da influenzaadaptado ao frio ou um vírus da influenza sensível à temperatura. Em certasformas de realização, os vírus possuem uma combinação destas propriedadesdesejáveis. Em uma forma de realização, o vírus da influenza contém umvírus da cepa A/Ann Arbor/6/60 da influenza. Em uma outra forma derealização, o vírus da influenza incorpora um virus da cepa B/Ann Arbor/1/66da influenza. Alternativamente, a vacina inclui os vírus da influenza A ou dainfluenza B artificialmente engenheirados que incorporam pelo menos umaminoácido substituído que influencia as características das propriedadesbiológicas de ca A/Ann Arbor/6/60 ou ca/B/Ann Arbor/1/66, tal como um único aminoácido destas cepas.

Em uma forma de realização, um vacina que compreende umapopulação dos vírus recombinantes (ou os vírus derivados destes) produzidospelos métodos da invenção é fornecida. Em uma forma de realizaçãoespecífica, a vacina compreende um vírus vivo produzido pelos métodos. Em uma outra forma de realização específica, a vacina compreende um virusmorto ou inativado produzido pelos métodos. Em uma outra forma derealização específica, a vacina compreende uma composição imunogênicapreparada a partir de um vírus vivo, morto ou inativado produzido pelosmétodos. Em uma outra forma de realização específica, a vacina compreende uma composição imunogênica preparada a partir de um vírus da influenzavivo, atenuado, adaptado ao frio, sensível a temperatura produzido pelométodo. Em uma outra forma de realização específica, a vacina compreendeum vírus da influenza vivo, atenuado, adaptado ao frio, sensível a temperaturaproduzido pelo método ou um vírus derivado destes.

4. Descrição Resumida das Figuras

A Figura 1 apresenta as curvas de crescimento das cepas wt eca B (B/Beijing/243/97) tanto na célula PerC6 quanto na MDCK; título dovírus para cada ponto de tempo foi determinado pelo ensaio de TCID50.

A Figura 2 apresenta as curvas de crescimento das cepas wt e ca A (A/Sydney/05/97 e A/Beijing/262/95) tanto na célula PerC6 quanto naMDCK; título do vírus para cada ponto de tempo foi determinado pelo ensaiode TCID50.

A Figura 3 apresenta as curvas de crescimento das cepas wt eca A (A/Ann Arbor/6/60) tanto na célula PerC6 quanto na MDCK; título dovírus para cada ponto de tempo foi determinado pelo ensaio de TCID50.

A Figura 4 apresenta a análise em tempo real do RNA viral deA/Sydney em células PerC6 e MDCK, usando sondas Taqman® (RocheMolecular Systems; Palo Alto, CA) específicas para o segmento M do RNAviral.

A Figura 5 apresenta as curvas de crescimento de caA/Vietnam/1203/2004 (H5N1) em células MDCK; título do vírus para cadaponto de tempo foi determinado pelo ensaio de TCID50.

A Figura 6 apresenta um diagrama que mostra a recuperaçãode cada segmento do gene da influenza como um recontaminante 7:1 geradopela técnica de recuperação por oito plasmídeos.

A Figura 7 apresenta as curvas de crescimento de cada um dosrecontaminantes 7:1 em células PerC6; título do vírus para cada ponto detempo foi determinado pelo ensaio de TCED50.

A Figura 8 apresenta um mapa de restrição de um Fragmentode Eco RI que compreende uma seqüência reguladora da RNA pol I canina.

As Figuras 9A, 9B e 9C apresentam a seqüência denucleotídeo (SEQ ID NO: 1) de um ácido nucleico clonado deaproximadamente de 3,5 kB do DNA genômico canino, que codifica pelomenos uma porção do gene rRNA 18s, começando no nucleotídeo 1809 (+1)na seqüência apresentada.

A Figura 10 apresenta um mapa do plasmídeo do pAD3000,que pode ser prontamente adaptado para fabricar um vetor de expressão dainvenção.

A Figura 11 apresenta um diagrama das construções depromotor de pol 1 de MDCK usado no ensaio de mini-genôma.

A Figura 12 apresenta o resultado de um ensaio de mini-genoma. O sinal de EGFP gerado a partir das construções do promotor pol 1de MDCK -1, +1 e +2 são mostradas nos painéis à esquerda, centro e direitade topo, respectivamente. Um controle de promotor negativo mostra apenasfluorescência de fundo (esquerda fundo). Como células de controle positivotambém foram transfectadas com uma construção de CMV-EGFP (direitafundo).

A Figura 13 apresenta a seqüência do plasmídeo do vetor deexpressão pAD4000 (SEQ ID NO: 29) que compreende um fragmento de 469pares de base (bases 1 a 469 em pAD4000) do subclone EcoRI-BamHl deMDCK (bases 1340-1808 da SEQ ID NO: 1). Nota: O fragmento de 469 paresde base é mostrado na orientação de complemento reversa e a seqüêncialigadora está sublinhada e em negrito.

A Figura 14 indicou as posições de recozimento dosiniciadores usados para conduzir as reações de RT-PCR no RNA do vírusrecuperado.

A Figura 15 apresenta a seqüências de iniciadores usados paraconduzir as reações de RT-PCR no RNA do vírus recuperado.

A Figuras 16 A-B mostra que a seqüência parcial de segmentosNS e PB1 e as posições das mutações silenciosas introduzidas.5. Descrição Detalhada da Invenção

A recuperação de plasmídeo do vírus da influenza no geralcompreende a introdução de vetores de expressão para expressar proteínasvirais e transcrever o RNA genômico viral em células hospedeiras adequadas.A transcrição do RNA genômico viral é no geral realizada com uma enzimade RNA polimerase I, visto que estas enzimas produzem transcritos comextremidades adequadas para o uso como genomas virais. Assim, ospromotores de RNA pol I e outros elementos reguladores são usados parainiciar a transcrição de RNA genômicos durante a recuperação de plasmídeo.Infelizmente, os promotores de RNA pol I são altamente específicos deespécie. Isto é, RNA pol I de uma espécie pode ligar eficientemente ou não aum promotor RNA pol I de uma espécie não relacionada. Conseqüentemente,a disponibilidade dos promotores de RNA pol I limita as células em que arecuperação de plasmídeo pode ser realizada. Antes da presente invenção, arecuperação de plasmídeo não foi possível em células caninas. Pela primeiravez, a recuperação de plasmídeo em células caninas é possível com base nadivulgação da presente invenção como segue.

Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, os ácidosnucleicos isolados da invenção que compreendem uma seqüência reguladorada RNA polimerase I canina são fornecidos. Em certas formas de realização, aseqüência reguladora é um promotor. Em uma forma de realização, aseqüência reguladora é uma seqüência de promotor de Pol I canina. Em umaoutra forma de realização, a seqüência reguladora é operavelmente ligada aocDNA viral clonado. Ainda em uma outra forma de realização, o cDNA viralclonado codifica RNA viral de um vírus de filamento negativo ou positivo ou

0 cRNA correspondente. Em uma forma de realização específica, o cDNAviral clonado codifica RNA viral genômico (ou o cRNA correspondente) deum vírus da influenza.

Em uma forma de realização específica, os ácidos nucleicosisolados da invenção compreendem uma seqüência reguladora da RNApolimerase I canina e uma seqüência de terminação transcricional. Em certasformas de realização, as seqüência de terminação transcricional é umaseqüência de terminação de pol I. Em certas formas de realização, asseqüências de terminação transcricional é uma seqüência de terminação de polhumana de macaco ou canina.

Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos dainvenção compreendem uma seqüência de polinucleotídeo ou um fragmentodesta funcionalmente ativo, por exemplo, uma seqüência reguladora da RNApol I canina, que liga um polipeptídeo de pol I de ser humano, primata,camundongo ou canino e é de pelo menos 100 % ou cerca de 99 %, 98 %, 97%, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 % ou 65 % idêntica a uma oumais seqüências de nucleotídeo selecionadas do grupo que consiste de: SEQID Nos: 1 a 28. Em uma forma de realização, a seqüência de polinucleotídeoou fragmento desta funcionalmente ativa ainda retém a capacidade parainiciar a transcrição, na presença de polipeptídeos apropriados (polipeptídeosde pol I de ser humano, primata, camundongo ou canino), de uma segundaseqüência de polinucleotídeo operavelmente ligada com a seqüência denucleotídeo. Em uma forma de realização, "os fragmentos funcionalmenteativos" dos ácidos nucleicos apresentados na SEQ ID Nos: 1 a 28 retêm um oumais atividades funcionais aqui descritas das seqüências de tamanho naturalda SEQ ID Nos: 1 a 28. Por exemplo, os fragmentos funcionalmente ativos daseqüência reguladora apresentada como SEQ ID NO: 1 são fornecidos pormeio do qual o fragmento da seqüência reguladora é operavelmente ligada aum ácido nucleico a ser transcrito e, na presença de proteínas adequadas invitro ou in vivo, é transcrito. Em uma forma de realização particular, os ácidosnucleicos da invenção compreendem uma seqüência de polinucleotídeo doácido nucleico apresentado na SEQ ID NO: 26.

Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos dainvenção compreendem uma seqüência de polinucleotídeo ou um fragmentodeste, por exemplo, uma seqüência reguladora da RNA pol I canina, que ligaum polipeptídeo de pol I de ser humano, primata, camundongo ou canino e/oué 100 % ou pelo menos ou cerca de 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85%, 80 %, 75 %, 70 % ou 65 % idêntica a uma ou mais seqüências denucleotídeo selecionadas do grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1 a 28. Emuma forma de realização, a seqüência de polinucleotídeo ou fragmento desteainda retém a capacidade para iniciar a transcrição, na presença depolipeptídeos apropriados (polipeptídeos de pol I de ser humano, primata,camundongo ou canino), de uma segunda seqüência de polinucleotídeooperavelmente ligada com a seqüência de nucleotídeo.

Em certos aspectos, a presente invenção fornece um ácidonucleico isolado que compreende um promotor da RNA pol I canina.Preferivelmente, o promotor da RNA pol I canina é operavelmente ligado aum ácido nucleico a ser transcrito, tal como, por exemplo, um RNA genômicoda influenza. A introdução do ácido nucleico em uma célula canina resultantena transcrição do RNA genômico da influenza, e, na presença de proteínasadequadas da influenza, o transcrito de RNA pode ser empacotado em umvírus da influenza infeccioso. Em uma forma de realização, os ácidosnucleicos isolados são fornecidos que compreendem uma seqüênciareguladora de RNA canino da invenção (por exemplo, um promotor da RNApol I canina), em que a seqüência reguladora é operavelmente ligada a umácido nucleico a ser transcrito e, na presença de proteínas adequadas in vitroou in vivo, é transcrito. Em uma forma de realização, o ácido nucleicooperavelmente ligado a dita seqüência reguladora é um segmento de vRNA dainfluenza.

Em um outro aspecto, a invenção fornece vetores e métodospara produzir vírus da influenza recombinantes em cultura de célula caninatotalmente a partir do DNA viral clonado. Por exemplo, os vírus da influenzapodem ser produzidos pela introdução de uma pluralidade de vetores quecompreendem cDNA clonado que codifica cada segmento do genoma viralsob o controle transcricional de uma seqüência reguladora de RNA canino(por exemplo, um promotor de Pol I canina) da invenção nas célulashospedeiras caninas, cultivar as células caninas, e isolar os vírus da influenzarecombinantes produzidos a partir d cultura de célula. Quando os vetores quecodificam um genoma do vírus da influenza são assim introduzidos (porexemplo, por eletroporação) nas células caninas, os vírus recombinantesadequados como vacinas podem ser recuperados pelos procedimentos depurificação padrão. Usando o sistema de vetor e métodos da invenção, osvírus recontaminante que incorporam os seis segmentos de gene inertes deuma cepa selecionada quanto as suas propriedades desejáveis com respeito àprodução de vacina, e os segmentos HA e NA imunogênicos de uma cepaselecionada, por exemplo, patogênica, pode se rápida e eficientementeproduzida em cultura de tecido. Assim, o sistema e métodos aqui descritos sãoúteis para a produção rápida em cultura de célula canina dos vírus dainfluenza AeB recombinantes e recontaminante, incluindo os vírusadequados para o uso como vacinas, incluindo vacinas atenuadas vivas.Vacinas preparadas de acordo com os métodos da invenção podem ser dadasintranasal ou intramuscularmente.

Tipicamente, uma cepa de vírus doador mestre (MDV) única éselecionada de cada um dos subtipos AeB. No caso de uma vacina atenuadaviva, a cepa de vírus doador mestre é tipicamente escolhida quanto as suaspropriedades favoráveis, por exemplo, sensíveis a temperatura, adaptação aofrio e/ou atenuação, relativo à produção de vacina. Por exemplo, CepasMestra Donor exemplares incluem tais cepas sensíveis a temperatura,atenuado e adaptados ao frio de A/Ann Arbor/6/60 e B/Ann Arbor/1/66,respectivamente.

Por exemplo, um vírus mestra donor tipo A selecionado(MDV-A) ou vírus mestra donor tipo B (MDV-B), podem ser produzidos apartir de uma pluralidade de cDNAs viral clonado que constituem o genomaviral. Em uma forma de realização exemplar, os vírus recombinantes sãoproduzidas a partir de oito cDNAs viral clonados. Os oito cDNAs viraisrepresentam as seqüências de MDV-A ou MDV-B selecionadas de PB2, PB1, PA, NP, HA, NA, M e NS são clonados em um vetor de expressão, porexemplo, um vetor de expressão bi-direcional tal como um plasmídeo (porexemplo, pAD3000 ou pAD4000), tal que o RNA genômico viral pode sertranscrito a partir de um promotor de RNA polimerase I (pol I) canina de umfilamento e os mRNAs virais podem ser sintetizados a partir de um Promotorda RNA polimerase II (pol II) de outro filamento. Opcionalmente, qualquersegmento de gene pode ser modificado, incluindo o segmento HA (porexemplo, para remover o sítio de clivagem multi-básico).

Vírus MDV-A ou MDV-B recombinante infeccioso é depoisrecuperado seguindo a transfecção do plasmídeo carrega os oito cDNAs viraisem células hospedeiras apropriadas , por exemplo, células MDCK. Usando osplasmídeos e métodos aqui descritos, a invenção é útil, por exemplo, paragerar vacinas da influenza recontaminante 6:2 pela co-transfecção dos 6 genesinertes (PB1, PB2, PA, NP, M e NS) do vírus selecionado (por exemplo,MDV-A, MDV-B, PR8) junto com o derivado de HA e NA do vírus dainfluenza do tipo (A ou B) correspondente diferente. Por exemplo, osegmento HA é favoravelmente selecionado a partir de uma cepa Hl, H3 ouB patogenicamente relevante, como é rotineiramente realizado para aprodução de vacinas. Similarmente, o segmento HA pode ser selecionado apartir de uma cepa com relevância emergente como uma cepa patogênica talcomo uma cepa H2 (por exemplo, H2N2), uma cepa H5 (por exemplo, H5N1)ou uma cepa H7 (por exemplo, H7N7). Recontaminantes que incorporam setesegmentos de genoma do MDV e o gene de HA ou NA da cepa selecionada(recontaminantes 7:1) também podem ser produzidas. Além disso, estesistema é útil para determinar a base molecular das características fenotípicas,por exemplo, o atenuado (att), adaptados ao frio (ca), e sensível a temperatura(ts) fenótipos, relevante à produção de vacina.5.1 Definições

A menos que de outro modo definido, todos os termoscientíficos e técnicos são entendidos ter o mesmo significado comohabitualmente usado na técnica a qual eles pertencem. Para o propósito dapresente invenção os seguintes termos são definido abaixo.

Os termos "ácido nucleico," "polinucleotídeo," "seqüência depolinucleotídeo" e "seqüência de ácido nucleico" referem-se a polímeros dedesoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo de filamento único ou defilamento duplo ou quimeras ou análogos destes. Como aqui usado, o termoopcionalmente inclui polímeros de análogos de nucleotídeos que ocorremnormalmente tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais em que eleshibridizam a ácidos nucleicos de filamento único de uma maneira similar aosnucleotídeos que ocorrem naturalmente (por exemplo, peptídeo de ácidonucleico). A menos que de outro modo indicado, uma seqüência particular deácido nucleico desta invenção abrange seqüências complementares, além daseqüência explicitamente indicou.

O termo "gene" é amplamente usado para se referir a qualquerácido nucleico associado com uma função biológica. Assim, os genes incluemseqüências codificadoras e/ou as seqüências reguladoras requeridas para suaexpressão. O termo "gene" aplica-se a uma seqüência genômica específica,assim como a um cDNA ou um mRNA codificados pôr aquela seqüênciagenômica.

Os genes também incluem segmentos de ácido nucleico nãoexpressado que, por exemplo, formam seqüências de reconhecimento paraoutras proteínas. As seqüências reguladoras não expressadas incluem"promotores" e "realçadores," para que as proteínas reguladoras tais comofatores de transcrição se liguem, resultando na transcrição de seqüênciasadjacentes ou vizinhas. Um promotor ou realçador "específica de tecido" éum que regula a transcrição em um tipo de tecido ou tipo ou tipos de célulaespecíficos.

Um "promotor" ou "seqüência promotora" é uma regiãoreguladora de DNA capaz de iniciar a transcrição de uma seqüência de ácidonucleico para que a mesma seja operavelmente ligada, quando as enzimasrelacionadas com a transcrição apropriadas, por exemplo, RNA polimerase,estão presente sob condições, por exemplo, condições de cultura oufisiológicas, por meio do qual as enzimas são funcionais. Um promotor podeestar presente à montante ou à jusante da seqüência de ácido nucleico cuja atranscrição o mesmo inicia. De uma seqüência promotora que é situada àmontante de um cDNA é ligada no seu término 3' por um sítio de início detranscrição e estende-se à montante (direção 5') para incluir o número mínimode bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveisdetectáveis acima do fundo. De uma seqüência promotora que é localizada àjusante de um cDNA (para expressar um (-)RNA) é ligada no seu término 5'por um sítio de início de transcrição e estende-se à jusante (direção 3') paraincluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar atranscrição em níveis detectáveis acima do fundo. O sistema direcional dainvenção inclui promotores tanto à montante quanto à jusante; o sistemaunidirecional inclui apenas promotores à montante. Dentro ou adjacente àseqüência promotora será encontrado um sítio de iniciação de transcrição(convenientemente definido por exemplo, pelo mapeamento com a nucleaseSI), e também pode incluir domínios de ligação de proteína (seqüências deconsenso) que promovem, regulam, realçam ou são de outro modoresponsáveis pela ligação do RNA polimerase.

Uma seqüência reguladora da RNA polimerase I canina" ou"elemento regulador de RNA polimerase I canina" (ou os fragmentosfuncionalmente ativos destes), como aqui usado, refere-se a uma seqüência deácido nucleico que é capaz de aumentar a transcrição de uma seqüência deácido nucleico para que a mesma seja operavelmente ligada, quando RNApolimerase I canina e, opcionalmente, fatores de transcrição associados, estãopresentes sob condições, por exemplo, condições de cultura ou fisiológicas,por meio do qual as enzimas são funcionais. Os exemplos da seqüênciasreguladoras da RNA polimerase I canina incluem um promotor de RNApolimerase I canina, que aumenta a transcrição de um ácido nucleicooperavelmente ligado ele acima do fundo, e um realçador de RNA polimeraseI canina, que aumenta a transcrição de um ácido nucleico operavelmenteligado a um promotor de RNA polimerase I canino acima do nível observadona ausência de um realçador de RNA polimerase I canino. Um teste paraidentificar um elemento regulador de RNA polimerase I canina é introduzir oelemento regulador de RNA polimerase I canina putativo, operavelmenteligado a um ácido nucleico de interesse, em uma célula canina adequada, porexemplo, uma célula MDCK, e detectar a transcrição do ácido nucleico deinteresse usando um ensaio convencional, por exemplo, um Northern blot. Acomparação dos níveis de transcrição do ácido nucleico na presença eausência do elemento regulador de RNA polimerase I canina putativo permiteao técnico habilitado determinar se o elemento do ácido nucleico é umelemento regulador de RNA polimerase I canina.

O termo "vetor" refere-se a um ácido nucleico, por exemplo,um plasmídeo, vetor viral, ácido nucleico recombinante ou cDNA que podemser usados para introduzir seqüências heterólogas de ácido nucleico em umacélula. UM vetor da invenção tipicamente compreenderá uma seqüênciareguladora da invenção. Os vetores podem ser que replicam de modoautônomo ou que não replicam de modo autônomo. Um vetor também podeser um polinucleotídeo de RNA nu, um polinucleotídeo de DNA nu, umpolinucleotídeo composto tanto de DNA quanto de RNA dentro do mesmofilamento, um DNA ou RNA conjugados com poli-lisina, um DNA ou RNAconjugados com peptídeo, um DNA conjugado com lipossoma ou semelhante,que não replicam de modo autônomo. Mais habitualmente, os vetores dapresente invenção são plasmídeos.

Um "vetor de expressão" é um vetor, tal como um plasmídeo,que é capazes de promover a expressão, por exemplo, transcrição, de umácido nucleico incorporado nele. Um vetor de expressão da invençãotipicamente compreenderá uma seqüência reguladora da invenção. Os vetoresde expressão podem ser de replicação autônoma ou que não replicam de modoautônomo. Tipicamente, o ácido nucleico a ser expressado é "operavelmenteligado" a um promotor e/ou realçador, e é o objeto para o controle reguladorda transcrição pelo promotor e/ou realçador.Um "vetor de expressão bi-direcional" é tipicamentecaracterizado por dois promotores alternativos orientados direção opostarelativa a um ácido nucleico situado entre os dois promotores, tal que aexpressão possa ser iniciada em ambas as orientações resultando, porexemplo, na transcrição tanto do RNA positivo (+) ou filamento de sentido,quanto o negativo (-) ou filamento anti-sentido. Alternativamente, o vetor deexpressão bi-direcional pode ser um vetor de ambissentido, em que o mRNAviral e o RNA genômico viral (como um cRNA) são expressados a partir domesmo filamento.

No contexto da invenção, o termo "isolado" refere-se a ummaterial biológico, tal como um ácido nucleico ou uma proteína, que ésubstancialmente livre dos componentes que normalmente acompanham ouinteragem com o mesmo no seu ambiente de ocorrência natural. O materialisolado opcionalmente compreende o material não encontrado com o materialno seu ambiente natural, por exemplo, uma célula. Por exemplo, se o materialé no seu ambiente natural, tal como uma célula, o material foi colocado emum local na célula (por exemplo, genoma ou elemento genético) não nativo aum material encontrado naquele ambiente. Por exemplo, um ácido nucleico deocorrência natural (por exemplo, uma seqüência codificadora, um promotor,um realçador, etc.) torna-se isolado se o mesmo é introduzido pelos meios quenão ocorrem naturalmente a um local do genoma (por exemplo, um vetor, talcomo um plasmídeo ou vetor viral ou amplicon) não nativo para estenucleico. Tais ácidos nucleicos também são aludidos como ácidos nucleicos"heterólogos".

O termo "recombinante" indica que o material (por exemplo,um ácido nucleico ou proteína) foi artificial ou sinteticamente (nãonaturalmente) alternado pela intervenção humana. A alteração pode serrealizada no material dento ou removido do, no seu meio natural ou estado.Especificamente, quando da referência a um vírus, por exemplo, um vírus dainfluenza, o vírus é recombinante quando o mesmo é produzido pelaexpressão de um ácido nucleico recombinante.

O termo "recontaminante," quando da referência a um vírus,indica que o vírus inclui componentes genéticos e/ou polipeptídeos derivadosde mais do que uma cepa ou fonte virais precursoras. Por exemplo, umrecontaminante 7:1 inclui 7 segmentos genômicos virais (ou segmentos degene) derivado de um primeiro vírus precursor, e um segmento genômicoviral complementar único, por exemplo, que codifica hemaglutinina ouneuraminidase, de um segundo vírus precursor. Um recontaminante 6:2 inclui6 segmentos genômicos, mais habitualmente os 6 genes internos de umprimeiro vírus precursor, e dois segmentos complementares, por exemplo,hemaglutinina e neuraminidase, de um diferente vírus precursor.

O termo "introduzido" quando da referência a um heterólogoou ácido nucleico isolado refere-se à incorporação de um ácido nucleico emuma célula eucariótica ou procariótica onde o ácido nucleico pode serincorporado no genoma da célula (por exemplo, DNA cromossômico,plasmídico, plastídeo ou mitocondrial), convertido em um réplicon autônomoou transitoriamente expressado (por exemplo, mRNA transfectado). O termoinclui tais métodos como "infecção," "transfecção," "transformação" e"transdução." No contexto da invenção uma variedade de métodos pode serutilizada para introduzir ácidos nucleicos na células procarióticas, incluindoeletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada pelolipídeo (lipofecção), etc.

O termo "célula hospedeira" significa uma célula que podeabsorver ou absorveu um ácido nucleico, tal como um vetor, e sustenta areplicação e/ou expressão do ácido nucleico, e opcionalmente a produção deum ou mais produtos codificados incluindo um polipeptídeo e/ou um vírus.As células hospedeiras podem ser células procarióticas tais como célulaseucarióticas de E. coli tais como células de levedura, inseto, anfíbio, aviáriasou de mamífero, incluindo células humanas. As células hospedeirasexemplares no contexto da invenção incluem células Vero (Rim de macacoverde africano), células Per.Có (células retinais embrionárias humanas),células BHK (rim de hamster bebê), células renais de pintainho primárias(PCK), células Renais Caninas de Madin-Darby (MDCK), células RenaisBovinas de Madin-Darby (MDBK), células 293 (por exemplo, células 293T),e células COS (por exemplo, células COS 1, COST). O termo célulahospedeira abrange as combinações ou misturas de células incluindo, porexemplo, culturas mistas de tipos de célula ou linhagens de células diferentes(por exemplo, células Vero e CEK). Um co-cultivo de células SF Veroeletroporadas é descrito por exemplo na PCT/US04/42669 depositada em 22de dezembro de 2004, que é incorporada por referência em sua totalidade.

A expressão "artificialmente engenheirado" é aqui usada paraindicar que o vírus, o ácido nucleico viral ou produto viralmente codificado,por exemplo, um polipeptídeo, uma vacina, compreendem pelo menos umamutação introduzida pelos métodos recombinantes, por exemplo, mutagênesedirecionada ao sítio, Mutagênese de PCR, etc. A expressão "artificialmenteengenheirado" quando da referência a um vírus (ou componente ou produtovirais) que compreende uma ou mais mutações de nucleotídeo e/ousubstituições de aminoácido indica que o genoma ou segmento de genomavirais que codificam o vírus (ou componente ou produto virais) não éderivado de fontes que ocorrem naturalmente, tal como uma cepa viral queocorre naturalmente ou de laboratório anteriormente existente produzidospelos métodos não recombinantes (tal como passagem progressiva a 25 °C),por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou adaptada ao frio A/Ann Arbor/6/60ou B/Ann Arbor/1/66.

O termo "% de identidade de seqüência" é aqui usadointercambiavelmente com o termo " % de identidade" e refere-se ao nível deidentidade de seqüência de aminoácido duas ou mais seqüências de peptídeoou ao nível de identidade de seqüência de nucleotídeo entre duas ou maisseqüências de nucleotídeo, quando alinhadas usando um programa dealinhamento de seqüência. Por exemplo, como aqui usado, 80 % de identidadesignifica mesma coisa como 80 % de identidade de seqüência determinadapor um algoritmo definido, e significa que uma dada seqüência é de pelomenos 80 % idêntica a um outro comprimento de uma outra seqüência. Osníveis exemplares de identidade de seqüência incluem, mas não são limitadosa, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 % ou mais identidade de seqüência a uma dadaseqüência.

O termo "% de homologia de seqüência" é aqui usadointercambiavelmente com o termo " % de homologia" e refere-se ao nívelhomologia de seqüência de aminoácido duas ou mais seqüências de peptídeoou ao nível de homologia de seqüência de nucleotídeo entre duas ou maisseqüências de nucleotídeo, quando alinhadas usando um programa dealinhamento de seqüência. Por exemplo, como aqui usado, 80 % dehomologia significa mesma coisa como 80 % de homologia de seqüênciadeterminada por um algoritmo definido, e conseqüentemente um homólogo deuma dada seqüência tem mais do que 80 % de homologia de seqüência em umcomprimento da seqüência dada. Os níveis exemplares da homologia deseqüência incluem, mas não são limitados a, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 % oumais homologia de seqüência a uma dada seqüência.

Os programas de computador exemplares que podem serusados para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, mas nãosão limitados a, aos conjuntos de programas de BLAST, por exemplo,BLASTN, BLASTX, e TBLASTX, BLASTP e TBLASTN, publicamentedisponíveis na Internet no sítio da web NCBI. Ver também Altschul I., 1990,J. Mol. Biol. 215:403-10 (com referência especial ao à colocação de valorpadrão publicada, isto é, parâmetros w = 4, t = 17) e Altschul et al., 1997,Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402. As pesquisas de seqüência sãotipicamente realizadas usando o programa BLASTP quando da avaliação deuma dada seqüência de aminoácido em relação à seqüências de aminoácidonas Seqüências de Proteína do GenBank e outras bases de dados públicas. Oprograma BLASTX é preferido para pesquisar seqüências de ácido nucleicoque foram traduzidas em todas as matrizes de leitura contra seqüências deaminoácido nas Seqüências de Proteína do GenBank e outras bases de dadospúblicas. Tanto BLASTP quanto BLASTX são conduzidos usandoparâmetros de valor padrão de uma penalidade de intervalo aberto de 11,0, euma penalidade de intervalo prolongado de 1,0, e utiliza a matriz BLOSUM-62. Ver id.

Um alinhamento preferido de seqüências selecionadas demodo a determinar a "% de identidade" entre duas ou mais seqüências, érealizado usando por exemplo, o programa CLUSTAL-W em MacVectorversão 6.5, operado com parâmetros de valor padrão, incluindo umapenalidade de intervalo aberto de 10,0, um penalidade de intervaloprolongado de 0,1, e uma matriz de similaridade BLOSUM 30.

"Hibridizar especificamente a" ou "hibridização específica" ou"hibridizar seletivamente a", refere-se à ligação, formação de duplexação ouhibridização de uma molécula de ácido nucleico preferencialmente a umaseqüência de nucleotídeo particular sob condições severas quando estaseqüência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, celular total)de DNA ou RNA.

O termo "condições severas" refere-se a condições sob asquais uma sonda hibridizará preferencialmente com a sua subseqüência alvo,e a uma extensão menor a ou não a todas as outras seqüências. "Hibridizaçãosevera" e "condições de lavagem de hibridização severa" no contexto deexperimentos de hibridização de ácido nucleico tal como as hibridizações deSouthern e Northern são dependente de seqüência, e são diferentes sobparâmetros ambientais diferentes. Uma orientação extensiva para ahibridização de ácidos nucleicos pode ser encontrada em Tijssen, 1993,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Acids Probes, parte I, capítulo 2, "Overview ofprincipies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays",Elsevier, NY; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3a ed., NY; e Ausubel et al., eds.,Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience, NY.

No geral, a hibridização e as condições de lavagem altamenteseveras são selecionadas para serem cerca de 5 0C mais baixas do que o pontode fusão térmica (Tm) para a seqüência específica em uma concentraçãoiônica e pH definidas. A Tm é a temperatura (sob concentração iônica e pHdefinidos) em que 50 % da seqüência alvo hibridiza a uma sondaperfeitamente emparelhada. As condições muito severas são selecionadas paraserem iguais à Tm para uma sonda particular.

Um exemplo de condições de hibridização severas para ahibridização de ácidos nucleicos complementares que têm mais do que cercade 100 resíduos complementares em um filtro em um Southern ou northernblot é de 50 % de formalina com 1 mg de heparina a 42 °C, com ahibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo de condições delavagem altamente severas é 0,15 M de NaCl a 72 0C por cerca de 15minutos. Um exemplo de condições de lavagem severas é uma lavagem com0,2X SSC a 65 0C por 15 minutos. Ver Sambrook et al. para uma descrição detampão SSC. Uma lavagem de severidade alta pode ser precedida por umalavagem de severidade baixa para remover sina de sonda de fundo. Umalavagem de severidade média exemplar para um duplex, por exemplo, de maisdo que cerca de 100 nucleotídeos, é Ix SSC a 45 0C por 15 minutos. Umalavagem de severidade baixa exemplar para um duplex de, por exemplo, maisdo que cerca de 100 nucleotídeos, é 4 a 6x SSC a 40 0C por 15 minutos. Nogeral, uma razão de sinal para ruído de 2x (ou mais alta) do que aquelaobservada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridizaçãoparticular indica a detecção de uma hibridização específica.

O termo "cerca de," como aqui usado, a menos que de outromodo indicado, refere-se a um valor que não é maior do que 10 % acima ouabaixo do valor que é modificado pelo termo. Por exemplo, o termo "cerca de

significa uma faixa de 4,5 μg/kg a 5,5 μg/kg. Como um outroexemplo, "cerca de 1 hora" significa uma faixa de 48 minutos a 72 minutos.

O termo "codificar," como aqui usado, refere-se à propriedadede um ácido nucleico, por exemplo, ácido desoxirribonucleico, paratranscrever um ácido nucleico complementar, incluindo um ácido nucleicoque pode se traduzido em um polipeptídeo. Por exemplo, um ácidodesoxirribonucleico pode codificar um RNA que é transcrito a partir do ácidodesoxirribonucleico. Similarmente, o ácido desoxirribonucleico podecodificar um polipeptídeo traduzido a partir de um RNA transcrito do ácidodesoxirribonucleico.

5.2 Ácidos Nucleicos Que Compreendem Elementos Reguladores da RNAPol I Canina

Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos isolados sãofornecidos que compreendem uma seqüência reguladora de RNA canino dainvenção (por exemplo, um promotor da RNA pol I canina). A seqüênciareguladora, por exemplo, pode estar operavelmente ligada a um ácidonucleico a ser transcrito e, na presença de proteínas adequadas in vitro ou invivo, pode ser transcrita. Em uma forma de realização, o ácido nucleicooperavelmente ligado à dita seqüência reguladora é um segmento de vRNA dainfluenza.

Em certos aspectos, a presente invenção fornece um ácidonucleico isolado que compreende um promotor da RNA pol I canina.Preferivelmente, o promotor da RNA pol I canina é operavelmente ligado aum ácido nucleico a ser transcrito, tal como, por exemplo, um RNA genômicoda influenza. A introdução do ácido nucleico em uma célula canina poderesultar na transcrição do RNA genômico da influenza, e, na presença deproteínas adequadas da influenza, o transcrito ou transcritos de RNA podemser empacotados em um vírus da influenza, por exemplo, um vírus dainfluenza infeccioso.

Em certas formas de realização, ácidos nucleicos da invençãocompreendem uma seqüência reguladora da RNA pol I canina ou fragmentodesta que liga um polipeptídeo de pol I de ser humano, primata, camundongoou canino e é de pelo menos ou cerca de 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94%, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82%, 81 %, 80 % 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70%, 69 %, 68 %, 67 %, 66 %, 65 %, 64 %, 63 %, 62 %, 61 % ou 60 % idênticaa uma ou mais seqüências de nucleotídeo selecionadas do grupo que consistede: SEQ ID Nos: 1 a 28. Em uma forma de realização, a seqüência reguladorada RNA pol I ou fragmento desta ainda retém a capacidade para iniciar atranscrição de um gene operavelmente ligado com a seqüência de nucleotídeo.Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos da invençãocompreendem uma seqüência de polinucleotídeo que é de pelo menos oucerca de 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89%, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 % 79 %, 78 %, 77%, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 69 %, 68 %, 67 %, 66 %, 65%, 64 %, 63 %, 62 %, 61 % ou 60 % idêntica à seqüência da SEQ ID NO: 29.

Além disso, os ácidos nucleicos da invenção tambémabrangem versões derivadas de ácidos nucleicos que compreendem umpromotor da RNA pol I canina. Tais derivados podem ser fabricados porqualquer método conhecido por uma pessoa de habilidade na técnica semlimitação das seqüências reguladoras da RNA pol I canina identificadas aseguir. Por exemplo, derivados podem ser fabricados pela mutagêneseespecífica de sítio, incluindo substituição, inserção ou deleção de um, dois,três, cinco, dez ou mais nucleotídeos, dos ácidos nucleicos. Alternativamente,derivados podem ser fabricados pela mutagênese aleatória. Um método paramutagenizar aleatoriamente um ácido nucleico compreende amplificar o ácidonucleico em uma reação de PCR na presença de 0,1 mM de MnCl2 econcentrações de nucleotídeo desbalanceadas. Estas condições aumentam ataxa de má incorporação da polimerase usada na reação de PCR e resultamem mutagênese aleatória do ácido nucleico amplificado. Preferivelmente, osácidos nucleicos derivados retêm a capacidade para iniciar a transcrição deum gene operavelmente ligado com a seqüência de nucleotídeo. Em certasformas de realização, o ácido nucleico da invenção compreende pelo menoscerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 325,350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,950 ou 1000 nucleotídeos consecutivos de uma ou mais seqüências denucleotídeo selecionadas do grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1 a 28.Preferivelmente, o ácido nucleico compreende uma seqüência que podeiniciar a transcrição de um gene operavelmente ligado com a seqüência denucleotídeo em células caninas, e assim é um derivado funcional. Em umaforma de realização, o ácido nucleico compreende uma seqüência que podeligar polipeptídeos de pol I canina e iniciar (in vitro ou in vivo) a transcriçãode um vRNA da influenza em células caninas. Em uma forma de realização,uma seqüência de ácido nucleico isolada é fornecida que compreende pelomenos 250 ou pelo menos 350 ou pelo menos 450 nucleotídeos contíguos daseqüência apresentada como SEQ ID NO: 26, em que as ditas seqüências deácido nucleico quando operavelmente ligadas ao cDNA que codifica umvRNA da influenza e introduzidas em uma célula MDCK são capazes dedirecionar a expressão do dito vRNA da influenza. Em uma outra forma derealização, uma seqüência de ácido nucleico isolada é fornecida quecompreende um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade com aseqüência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID NO: 26, em que a ditaseqüência de ácido nucleico quando operavelmente ligada ao cDNA quecodifica um vRNA da influenza e introduzida em uma célula MDCK é capazde direcionar a expressão do dito vRNA da influenza. Em uma outra forma derealização, uma seqüência de ácido nucleico isolada é fornecida quecompreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridizaçãoseveras a um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste de: SEQ IDNos 1 a 26, em que a dita seqüência de ácido nucleico quando operavelmenteligada ao cDNA que codifica um vRNA da influenza e introduzida em umacélula MDCK é capaz de direcionar a expressão do dito vRNA da influenza.Em certas formas de realização, os ácidos nucleicos da invençãocompreendem pelo menos cerca de 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800,850, 900, 950, 1000, 2000 ou 3000 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID No.29.

Em certas formas de realização, uma seqüência de ácidonucleico da invenção compreende ou alternativamente consiste dosnucleotídeos -469 a -1 (em relação ao primeiro nucleotídeo transcrito a partirdo promotor, também conhecido como nucleotídeo +1) da seqüênciaapresentada como a SEQ ID NO: 1 ou um derivado funcional desta. Emoutras formas de realização, uma seqüência de ácido nucleico da invençãocompreende ou alternativamente consiste dos nucleotídeos -250 a -1 (emrelação ao primeiro nucleotídeo transcrito a partir do promotor, tambémconhecido como nucleotídeo +1) da seqüência apresentada como SEQ IDNO: 1 ou um derivado funcional desta. O nucleotídeo +1 para o RNAribossômico 18S expressado a partir da seqüência reguladora de pol I caninaencontrada na SEQ ID NO: 1 é o nucleotídeo na posição 1809 da SEQ IDNO: 1. Em uma forma de realização, um ácido nucleico é fornecido quecompreende os nucleotídeos de 1 a 469 da SEQ ID NO: 26, o complementodesta, o complemento reverso desta ou um fragmento desta funcionalmenteativos.

A presente invenção também fornece os fragmentosfuncionalmente ativos da SEQ ID NO: 1 (uma subseqüência da seqüência denucleotídeo presente no clone depositado A.T.C.C. Acesso N0 PTA-7540).Conseqüentemente, a presente invenção fornece ainda polinucleotídeos tendoum ou mais resíduos de ácido nucleico deletado do terminal amino daseqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1. As deleções de terminal N daSEQ ID NO: 1 podem ser descritas pela fórmula geral m - 3537, onde m é umnúmero inteiro de 2 a 3512, onde m corresponde à posição do nucleotídeoidentificado na SEQ ID NO: 1 ou a seqüência de nucleotídeo presente noclone depositado (A.T.C.C. Acesso N0 PTA-7540). A presente invençãotambém fornece polinucleotídeos tendo um ou mais resíduos de ácidonucleico deletados do término carbóxi da seqüência de nucleotídeo da SEQID NO: 1. As deleções de terminal C da SEQ ID NO: 1 podem ser descritaspela fórmula geral 1 - n, onde n é um número inteiro de 2 a 3512, onde ncorresponde à posição de nucleotídeo identificada na SEQ ID NO: 1 ou aseqüência de nucleotídeo presente no clone depositado (A.T.C.C. Acesso N0PTA-7540).

A presente invenção também fornece os fragmentosfuncionalmente ativos da SEQ ID NO: 26 (uma subseqüência da seqüência denucleotídeo presente no clone depositado A.T.C.C. Acesso No. PTA-7540).Conseqüentemente, a presente invenção fornece ainda polinucleotídeos tendoum ou mais resíduos de ácido nucleico deletados do término amino da25 seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 26. As deleções de terminal N daSEQ ID NO: 26 podem ser descritas pela fórmula geral m - 469, onde m é umnúmero inteiro de 2 a 450, onde m corresponde à posição do resíduo de ácidonucleico identificado na SEQ ID NO: 26. A presente invenção tambémfornece polinucleotídeos tendo um ou mais resíduos de ácido nucleicodeletados do término carbóxi da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 26.As deleções de terminal C da SEQ ID NO: 26 podem ser descritas pelafórmula geral 1 - n, onde n é um número inteiro de 2 a 450, onde ncorresponde à posição de resíduo de ácido nucleico identificado na SEQ IDNO: 26.

Em certas formas de realização, a seqüência reguladora da polI canina da invenção compreende ou alternativamente consiste de um ácidonucleico isolado (ou a sua seqüência de complemento) que hibridiza sobcondições de hibridização severas a um ácido nucleico que compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1 a 28 epode iniciar a transcrição de um gene operavelmente ligado à seqüênciareguladora em células caninas.

Em uma forma de realização, a seqüência reguladora da pol Icanina da invenção compreende uma seqüência de ácido nucleico que pode ligar um polipeptídeo da RNA pol I canina e, em uma forma de realização,iniciar a transcrição de um gene operavelmente ligado com a seqüência denucleotídeo em células caninas. Em uma forma de realização, o ácidonucleico compreende uma seqüência que pode ligar um polipeptídeo de pol Ieucariótico e iniciar {in vitro ou in vivo) a transcrição de um vRNA da influenza. Em certas formas de realização, a ligação de polipeptídeo da RNApol I canina a uma seqüência reguladora de pol I canina é ensaiada com umensaio de proteção da nuclease. Em certas formas de realização, a ligação depolipeptídeo da RNA pol I canina a uma seqüência reguladora de pol I caninaé ensaiada com um sistema BIACORE para avaliar interações de proteína (Biacore International AG, Uppsala, Suécia).

Em certas formas de realização, o ácido nucleico compreendeuma seqüência que liga RNA pol I canina. Em certas formas de realização, aseqüência liga RNA pol I canina com afinidade maior do que uma RNApolimerase selecionada do grupo que consiste de: uma RNA pol I de primata,uma pol I humana, e uma pol I de camundongo. Em certas formas derealização, a seqüência liga a RNA pol I canina com afinidade maior do que aRNA pol II canina. Em certas formas de realização, a seqüência liga a RNApol I canina com afinidade maior do que a RNA pol III canina. Em certasformas de realização, a ligação a uma seqüência reguladora de pol I canina éensaiada com um sistema BIACORE para avaliar as interações de proteína(Biacore International AG, Uppsala, Suécia).

Em certas formas de realização, o promotor da RNA pol Icanina compreende ou alternativamente consiste da seguinte seqüência denucleotídeo:

ATTCCCGGTGAGGCTGCCTCTGCCGCGCGTGGCCCTCCACCTCCCC

TGGCCCGAGCCGGGGTTGGGGACGGCGGTAGGCACGGGGCGGTCC

TGAGGGCCGCGGGGGACGGCCTCCGCACGGTGCCTGCCTCCGGAG

AACTTTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTG

GCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGC

GTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCC

CCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGG

GGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTG

GCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCC

CCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTT

GTTGCCAGGTAGGT (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 26),

que é uma subseqüência da seqüência de nucleotídeo presenteno clone depositado A.T.C.C. Acesso N0 PTA-7540.

Em certas formas de realização, o promotor da RNA pol Icanina compreende ou alternativamente consiste da seguinte seqüência de.nucleotídeo:

TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ ID NO:2)

TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGG

CGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGG

CGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCC

CCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGT

GGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCC

GTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCG

CCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTT

GCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ ID NO: 20).

GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ ID NO: 3).

GCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ ID NO: 4).

TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ ID NO: 5).

GTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ IDNO: 6).

AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ ID NO: 7).

TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTG (SEQ ID NO: 8).

TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTG (SEQ ID NO: 21).

TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCC(SEQ ID NO: 9).

TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 22).

TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC (SEQ ID NO: 10).

TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATC (SEQ ID NO: 23).Em certas formas de realização, o promotor da RNA pol Icanina compreende ou alternativamente consiste da seguinte seqüência denucleotídeo:

TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT (SEQ ID NO: 11).

TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT (SEQ ID NO: 24).

TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 12).

TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 25).

GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGT ATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 13).

GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCG

ACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGG

GTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGG

GCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCC

CGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCG

GTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 27).

GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 14).

GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG

(SEQ ID NO: 15).

GCÇGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 16).

TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 17).

GGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 18).

GGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 28).

TCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 19).5.3 Vetores e vetores de expressão

Em um outro aspecto, a invenção fornece vetores quecompreendem um ácido nucleico da invenção, incluindo vetores de expressãoúteis para recuperar recombinantemente um vírus da cultura de célula. Nogeral, os vetores de expressão são úteis para recuperar qualquer vírusconhecido por uma pessoa habilitada na técnica para requerer a produção deRNA com extremidades definidas durante o seu ciclo de vida. Por exemplo,como debatido acima, o RNA genômico do vírus da influenza deve ter umaextremidade 5' e 3' definida para ser eficazmente replicado e empacotado emum sistema recombinante. Ver, também revisão em Neumann et al. (2002),83: 2635-2662, que é aqui incorporada por referência. O seguinte debatefocaliza nos vetores de expressão adequados para o uso com a influenza;entretanto, deve ser mencionado que outros vírus também podem serrecuperados usando os vetores da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, em uma forma derealização, o cDNA que codifica o RNA genômico viral que corresponde acada um dos oito segmentos genômicos da influenza (segmentos podem serde vírus da influenza diferentes, por exemplo, 6 da cepa X e 2 da cepa Y)pode ser inserido em um vetor recombinante para a manipulação e a produçãodo vírus da influenza. Uma variedade de vetores, incluindo vetores virais,plasmídeos, cosmídeos, fago e cromossomas artificiais, pode ser utilizada nocontexto da invenção. Tipicamente, para facilidade de manipulação, o cDNAé inserido em um vetor plasmídico, fornecendo uma ou mais origens dereplicação funcional em células bacterianas e eucarióticas, e, opcionalmente,um marcador conveniente para triar ou selecionar células que incorporam a5 seqüência de plasmídeo. Ver, por exemplo, Neumann et ai., 1999, PNAS.USA 96: 9345-9350.

Em uma forma de realização, os vetores da invenção são osvetores de expressão bi-direcionais capazes de iniciar a transcrição de umsegmento genômico viral do cDNA inserido em cada direção, isto é, dandoorigem às moléculas de RNA viral tanto do filamento (+) quanto do filamento(-). Para efetuar a transcrição bi-direcional, cada um dos segmentosgenômicos virais é inserido em um vetor de expressão tendo pelo menos doispromotores independentes, tal que as cópias do RNA genômico viral sãotranscritas por um primeiro promotor da RNA polimerase (por exemplo, umpromotor da RNA pol I canina), de um filamento, e mRNA virais sãosintetizados de um segundo promotor da RNA polimerase (por exemplo, umPromotor da RNA pol II canina ou outro promotor que possa iniciar atranscrição pelo RNA pol II em células caninas). Conseqüentemente, os doispromotores podem ser dispostos em orientações opostas flanqueadas por pelomenos um sítio de clonagem (isto é, uma seqüência de reconhecimento deenzima de restrição) preferivelmente um sítio de clonagem único, adequadopara a inserção de segmentos de RNA genômico viral. Alternativamente, umvetor de expressão "ambissentido" pode ser utilizado em que o mRNA defilamento (+) e o RNA de filamento (-) viral (como um cRNA) são transcritosdo mesmo filamento do vetor. Como debatido acima, o promotor de pol I paratranscrever o RNA genômico viral é preferivelmente um promotor de Pol Icanina.

Para garantir a extremidade 3' correta de cada vRNA oucRNA expressado, cada vetor de expressão de vRNA ou cRNA podeincorporar uma seqüência de ribozima ou seqüência de terminaçãoapropriadas (por exemplo, seqüência de terminação da RNA polimerase Ihumana, camundongo, primata ou canina) à jusante da seqüência que codificao RNA. Este pode ser, por exemplo, a seqüência de ribozima genômica dovírus delta da hepatite ou um derivado funcional desta ou a seqüência determinação de rDNA de murino (Genbank Acesso Número M12074).Alternativamente, por exemplo, uma seqüência de terminação de pol I podeser utilizada (Neumann et al., 1994, Virology 202: 477-479). Os vetores deexpressão de RNA podem ser construídos da mesma maneira como os vetoresde expressão de vRNA descritos em Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70: 4188-4192; Hoffmann e Webster, 2000, J. Gen Virol. 81: 2843-2847; Hoffinann etal., 2002, Vaccine 20: 3165-3170; Fodor et al., 1999, J. Virol. 73: 9679-9682;Neumann et al., 1999, P.N.A.S. USA 96: 9345-9350; e Hoffinann et al.,2000, Virology 267: 310-317, cada um dos quais é aqui incorporado porreferência em sua totalidade.

Em outros sistemas, as seqüências virais transcritas pelospromotores de pol I e de pol II podem ser transcritas a partir de vetores deexpressão diferentes. Nestas formas de realização, os vetores que codificamcada um dos segmentos genômicos virais sob o controle de uma seqüênciareguladora canina da invenção, por exemplo, um promotor de Pol I canina("vetores de expressão vRNA") e vetores que codificam um ou maispolipeptídeos virais, por exemplo, polipeptídeos PA, PB1, PB2 e NP dainfluenza ("vetores de expressão de proteína") sob o controle de um promotorde pol II podem ser usados.

Em cada caso, com respeito ao promotor de pol I, o segmentode genoma do vírus da influenza a ser expressado pode ser operavelmenteligado a uma seqüência de controle de transcrição apropriada (promotor) paradirecionar a síntese do mRNA. Uma variedade de promotores são adequadospara o uso em vetores de expressão para regular a transcrição dos segmentosdo genoma do vírus da influenza. Em certas formas de realização, o promotorda RNA Polimerase II (Pol II) dependente do DNA de citomegalovírus(CMV) é utilizado. Se desejado, por exemplo, para regular a expressãocondicional, outros promotores podem ser substituídos que induzam atranscrição do RNA sob as condições especificadas ou nos tecidos ou célulasespecificadas. Numerosos promotores virais e de mamífero, por exemplo, deser humano são disponíveis ou podem ser isolados de acordo com a aplicaçãoespecífica considerada. Por exemplo, promotores alternativos obtidos dosgenomas de vírus de animal e humanos incluem tais promotores como oadenovírus (tais como Adenovírus 2), vírus do papiloma, vírus da hepatite B evírus do polioma e vários promotores retrovirais. Os promotores mamíferosincluem, entre muitos outros, o promotor da actina, promotores daimunoglobulina, promotores de choque térmico e outros. Em uma forma derealização específica, a seqüência reguladora compreende o promotor tardioprincipal do adenovírus 2 ligado à seqüência líder tripartida unida deadenovírus humano 2, como descrito por Berg et al., Bio Techniques 14: 972-978. Além disso, os promotores de bacteriófago podem ser utilizados emconjunção com a RNA polimerase cognata, por exemplo, o promotor T7.

Os vetores de expressão usados para expressar proteínas virais,em particular proteínas virais para a formação do complexo de RNP,preferivelmente expressará proteínas virais homólogas ao vírus desejado. Aexpressão de proteínas virais por estes vetores de expressão pode ser reguladapor qualquer seqüência reguladora conhecida por aqueles de habilidade natécnica. A seqüência reguladora pode ser um promotor constitutivo, umpromotor indutível ou um promotor específico de tecido. Outros exemplos depromotores que podem ser usados para controlar a expressão de proteínasvirais em vetores de expressão de proteína incluem, mas não são limitados àregião promotora inicial de SV40 (Bernoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-310), o promotor contido na repetição de terminal longo 3' do vírus dosarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797), o promotortimidina quinase do herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA78: 1441-1445), as seqüências reguladoras do gene da metalotioneína(Brinster et al., 1982, Nature 296: 3942); vetores de expressão procarióticostais como o promotor da β-lactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 75: 3727-3731) ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25); ver também "Usefiil proteins fromrecombinant bactéria" no Scientific American, 1980, 242: 74-94; vetores deexpressão vegetais que compreendem a região promotora da nopalinasintetase (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213) ou o promotor doRNA do vírus mosaico da couve-flor 35S (Gardner et al., 1981, Nucl. AcidsRes. 9: 2871) e o promotor da enzima fotossintética ribulose bifosfatocarboxilase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115-120); elementospromotores de levedura ou outros fungos tais como o promotor Gal 4, opromotor ADC (álcool desidrogenase), promotor PGK (fosfoglicerolquinase), promotor da alcalino fosfatase e as regiões de controle transcricionalanimal seguintes, que exibem especificidade de tecido e foram utilizadas emanimais transgênicos: região de controle do gene da elastase I que é ativo nascélulas acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Omitz etal., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald,1987, Hepatology 7: 425-515); região de controle do gene da insulina que éativo em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122),região de controle de gene da imunoglobulina que é ativo em células linfóides(Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), região decontrole do vírus do tumor mamário que é ativo em células testiculares,mamárias, linfóides e mastóides (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), regiãode controle do gene da albumina que é ativo no fígado (Pinkert et al., 1987,Genes and Devei. 1: 268-276), região de controle do gene da alfa-fetoproteínaque é ativo no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648;Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58; região de controle do gene da 1-antitripsina alfa que é ativo no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei.1: 161-171), região de controle do gene da beta-globina que é ativo em célulasmielóides (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986,Cell 46: 89-94; região de controle do gene da proteína básica de mielina que éativo em células oligodendrocíticas no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell48: 703-712), região de controle do gene da cadeia leve de miosina 2 que éativo em músculo esqueletal (Sani, 1985, Nature 314: 283-286) e região decontrole do gene do hormônio de liberação gonadotrópico que é ativo nohipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).

Em uma forma de realização específica, os vetores deexpressão de proteína da invenção compreendem um promotor operavelmenteligado a uma seqüência de ácido nucleico, uma ou mais origens de replicação,e, opcionalmente, um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, umgene de resistência a antibiótico). Em uma outra forma de realização, umvetor de expressão de proteína da invenção que é capaz de produzir mRNAbicistrônico pode ser produzido pela inserção de seqüência de mRNAbicistrônico. Certas seqüências de sítio de entrada de ribossoma interno(IRES) podem ser utilizadas. Os elementos IRES preferidos incluem, mas nãosão limitados ao IRES BiP de mamífero e o IRES do vírus da hepatite C.

Em uma forma de realização, um ácido nucleico da invenção éinserido no plasmídeo pAD3000 ou um derivado deste. Ver, publicação dopedido de patente US 20050266026 e Figura 10. Assim, em certas formas derealização, o vetor de expressão é um vetor de expressão bi-direcional. Emcertas formas de realização, o vetor de expressão compreende um sinal depoliadenilação de SV40 flanqueando um segmento do genoma do vírus dainfluenza interno em relação aos dois promotores. Em certas formas derealização, o vetor de expressão compreende o Promotor da RNA pol IIdependente de DNA de citomegalovírus (CMV). Em uma forma derealização, um ácido nucleico da invenção é inserido no plasmídeo pAD4000ou um derivado deste. Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos dainvenção compreendem ou alternativamente consistem da seqüência depAD4000 apresentada como SEQ ID NO: 29.

Os insertos de gene contendo vetores podem ser identificados,por exemplo, por três métodos gerais: (a) hibridização de ácido nucleico; (b)presença ou ausência de funções de gene "marcador"; e, no caso de vetores deexpressão, (c) expressão de seqüências inseridas. No primeiro método, apresença do gene viral inserido em um vetor(es) pode ser detectada pelahibridização de ácido nucleico usando sondas que compreendem seqüênciasque são homólogas ao(s) gene(s) inserido(s). No segundo método, o sistemade vetor/hospedeiro recombinante pode ser identificado e selecionado combase na presença ou ausência de certas funções de gene "marcador" (porexemplo, resistência aos antibióticos ou fenótipo de transformação) causadaspela inserção do((s) gene(s) no(s) vetor(es). No terceiro método, vetores deexpressão podem ser identificados ensaiando-se o produto de geneexpressado. Tais ensaios podem ser fundamentados, por exemplo, naspropriedades físicas ou funcionais da proteína viral em sistemas de ensaio invitro, por exemplo, ligação de proteínas virais aos anticorpos.

Em uma forma de realização específica, um ou mais vetores deexpressão de proteína codificam e expressam as proteínas virais necessáriaspara a formação de complexos de RNP. Em uma outra forma de realização,um ou mais vetores de expressão de proteína codificam e expressam asproteínas virais necessárias para formar partículas virais. Ainda em uma outraforma de realização, um ou mais vetores de expressão de proteína codificam eexpressam o todo das proteínas virais de um vírus de RNA de filamentonegativo particular.

A transcrição de vetores de expressão pode ser opcionalmenteaumentada pela inclusão de uma seqüência realçadora. Os realçadores sãotipicamente elementos de DNA que atuam em eis curtos, por exemplo, de 10a 500 pares de base, que atuam de comum acordo com um promotor paraaumentar a transcrição. Muitas seqüências realçadoras foram isoladas degenes de mamífero (hemoglobina, elastase, albumina, alfa-fetoproteína einsulina) e vírus de célula eucariótica. O realçador pode ser unido no vetor emuma posição 5' ou 3' em relação à seqüência codificadora heteróloga, mas étipicamente inserido em um sítio 5' em relação ao promotor. Tipicamente, opromotor e se desejado, as seqüências realçadoras de transcrição adicionaissão escolhidas para otimizar a expressão no tipo de célula hospedeira na qualo DNA heterólogo deva ser introduzido (Scharf et al. (1994) Heat stresspromoters and transcription factors Results Probl Cell Differ 20: 125-62;Kriegler et ai. (1990) Assembly of enhancers, promoters and splice signals tocontrol expression of transferred genes Methods in Enzymol 185: 512-27).Opcionalmente, o amplicon também pode conter um sítio de ligação deribossoma ou um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) para o iníciode tradução.

Os vetores de expressão da invenção também podem incluirseqüências para a terminação de transcrição e para a estabilização do mRNA,tal como um sítio de poliadenilação ou uma seqüência de terminação (porexemplo, seqüência de terminação da RNA polimerase I humana, decamundongo, primata ou canina). Tais seqüências são habitualmentedisponíveis das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs oucDNAs eucarióticos ou virais. Em algumas formas de realização, asseqüências de poliadenilação de SV40 fornecem um sinal de poliadenilação.

Além disso, como descrito acima, os vetores opcionalmenteincluem um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer um traçofenotípico para a seleção de células hospedeiras transformadas, além dosgenes anteriormente listados, marcadores tais como os da diidrofoliatoredutase ou resistência à neomicina são adequados para a seleção em culturade célula eucariótica.

O vetor de expressão contendo a seqüência de DNAapropriada como descrito acima, assim como um promotor ou seqüência decontrole apropriados, pode ser utilizado para transformar uma célulahospedeira que permite a expressão da proteína. Embora os vetores deexpressão da invenção possam ser replicados em células bacterianas, maisfreqüentemente será desejável introduzi-las em células de mamífero, porexemplo, células Vero, células BHK, célula MDCK, células 293, célulasCOS, mais preferivelmente células MDCK, para o propósito de expressão.

Os vetores de expressão da invenção podem ser usados paradirecionar a expressão de vRNA(s) genômico(s) ou cRNA(s)correspondente(s) que têm uma ou mais mutações (por exemplo, remoção ouinativação de um sítio de clivagem polibásico no gene HA de cepas dapandemia de influenza particular tais como H5N1). Estas mutações podemresultar na atenuação do vírus. Por exemplo, os segmentos de vRNA podemser os segmentos de vRNA de um vírus da influenza A tendo umasubstituição de par de base atenuado em uma região promotora duplex cabode' frigideira, em particular, por exemplo, a substituição de par de baseatenuante conhecido de A no lugar de C e U no lugar de G na posição 11-12'na região de duplex do vRNA específica de NA (Fodor et al., 1998, J. Virol.6923-6290). Usando-se os métodos da invenção para produzir vírus de RNAde filamento negativo recombinante, novas mutações atenuantes podem seridentificadas.

Além disso, qualquer um dos vetores de expressão descritosnas Patentes U.S. números 6.951.754, 6.887.699, 6.649.372, 6.544.785,6.001.634, 5.854.037, 5.824.536, 5.840.520, 5.820.871, 5.786.199 e5.166.057 e Publicação do Pedido de Patente U.S. Nos 20060019350,20050158342, 20050037487, 20050266026, 20050186563, 20050221489,20050032043, 20040142003, 20030035814 e 20020164770 podem ser usadosde acordo com a presente invenção. No geral, os vetores descritos nestaspublicações podem ser adaptados para o uso de acordo com a presenteinvenção introduzindo-se um ácido nucleico da invenção (por exemplo, umaseqüência reguladora canina da invenção tal como uma seqüência promotorapoli canina) como aqui descrito nos vetores de expressão para direcionar asíntese de vRNA ou cRNA virais.

5.3.1 Elementos de Expressão Adicionais

Mais habitualmente, o segmento de genoma que codifica aproteína do vírus da influenza inclui quaisquer seqüências adicionaisnecessárias para a sua expressão, incluindo a tradução em uma proteína viralfuncional. Em outras situações, um minigene ou outra construção artificialque codifica as proteínas virais, por exemplo, uma proteína HA ou NA,podem ser utilizados. Neste caso, é freqüentemente desejável incluir sinais deiniciação específicos que ajudam na tradução eficiente da seqüênciacodificadora heteróloga. Estes sinais podem incluir, por exemplo, o códon deinício de tradução ATG e seqüências adjacentes. Para garantir a tradução doinserto inteiro, o códon de início é inserido na matriz de leitura correta emrelação à proteína viral. Elementos transcricionais exógenos e códons deiniciação podem ser de várias origens, tanto naturais e sintéticas. A eficiênciada expressão pode ser realçada pela inclusão de realçadores apropriados parao sistema de célula em uso.

Se desejado, as seqüências de polinucleotídeo que codificamelementos expressados adicionais, tais como seqüências de sinal, seqüênciasde secreção ou localização e outros podem ser incorporados no vetor,usualmente, na matriz com a seqüência de polinucleotídeo de interesse, porexemplo, para alvejar a expressão de polipeptídeo a um compartimentocelular, membrana ou organela desejados ou no meio de cultura de célula.Tais seqüências são conhecidas por aqueles de habilidade e incluem peptídeoslíder de secreção, seqüências que alvejam organela (por exemplo, seqüênciasde localização nuclear, sinais de retenção ER, seqüências de trânsitomitocondriais), seqüências de localização/âncora de membrana (por exemplo,seqüências de parada de transferência, seqüências âncora GPI) e outros.5.4 Vetores de expressão para Fabricar Vírus Quiméricos

Os vetores de expressão da invenção também podem serusados para fabricar vírus quiméricos que expressem seqüências heterólogas aum genoma viral. Os vetores de expressão que direcionam a expressão devRNA(s) ou cRNA(s) correspondente(s) são introduzidos nas célulashospedeiras junto com os vetores de expressão direcionados à expressão deproteínas virais para gerar novos vírus de RNA de filamento negativorecombinantes infecciosos ou vírus quiméricos. Ver, por exemplo, apublicação do pedido de patente US N0 US20040002061. As seqüênciasheterólogas que podem ser engenheiradas nestes vírus incluem ácidosnucleicos de anti-sentido e ácido nucleico tal como uma ribozima.Alternativamente, as seqüências heterólogas que expressam um peptídeo oupolipeptídeo podem ser engenheiradas nestes vírus. As seqüências heterólogasque codificam os seguintes peptídeos ou polipeptídeos podem serengenheiradas nestes vírus incluem: 1) antígenos que são característicos deum patógeno; 2) antígenos que são característicos de doença autoimune; 3)antígenos que são característicos de um alérgeno; e 4) antígenos que sãocaracterísticos de um tumor. Por exemplo, seqüências de gene heterólogo quepodem ser engenheiradas no vírus quiméricos da invenção incluem, mas nãosão limitados a, epítopos do vírus da imunodeficiência humana (HIV) talcomo gpl60; antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg); asglicoproteínas do vírus do herpes (por exemplo, gD, gE); VPl de poliovírus; edeterminantes antigênicos de patógenos não virais tais como bactérias eparasitas para mencionar apenas uns poucos.

Os antígenos que são característicos de doença autoimunetipicamente serão derivados da superfície da célula, citoplasma, núcleo,mitocôndria e outros de tecidos de mamífero, incluindo antígenoscaracterísticos da diabete melito, esclerose múltipla, Iupo eritematososistêmico, artrite reumatóide, anemia perniciosa, doença de Addison,escleroderma, gastrite atrófica autoimune, diabete juvenil e Iupo eritrematosodiscóide.

Os antígenos que são alérgenos são no geral proteínas ouglicoproteínas, incluindo antígenos derivados de pólens, poeiras, mofos,esporos, caspa, insetos e alimentos.

Os antígenos que são característicos de antígenos de tumortipicamente serão derivados da superfície da célula, citoplasma, núcleo,organelas e outros de células de tecido de tumor. Os exemplos incluemantígenos característicos de proteínas de tumor, incluindo proteínascodificadas pelos oncogenes mutados; proteínas virais associadas comtumores; e glicoproteínas. Os tumores incluem, mas não são limitados àquelesderivados dos tipos de câncer: lábio, nasofaringe, faringe e cavidade oral,esôfago, estômago, cólon, reto, fígado, bexiga biliar, pâncreas, laringe,pulmão e brônquio, melanoma de pele, mama, cerviz, uterino, ovariano,bexiga, rim, útero, cérebro e outras partes do sistema nervoso, tireóide,próstata, testículos, doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, mielomamúltiplo e leucemia.

Em uma forma de realização específica da invenção, asseqüências heterólogas são derivadas do genoma do vírus daimunodeficiência humana (HIV), preferivelmente vírus da imunodeficiênciahumana 1 ou vírus da imunodeficiência humana 2. Em uma outra forma derealização da invenção, as seqüências heterólogas codificadoras podem serinseridas dentro de uma seqüência codificadora de gene viral de RNA defilamento negativo tal que um produto de gene quimérico é expressado quecontém a seqüência de peptídeo heterólogo dentro da proteína viral. Em umatal forma de realização da invenção, as seqüências heterólogas tambémpodem ser derivadas do genoma de um vírus da imunodeficiência humana,preferivelmente de vírus da imunodefíciência humana 1 ou vírus daimunodeficiência humana 2.

Em casos por meio dos quais as seqüências heterólogas sãoderivadas do HIV, tais seqüências podem incluir, mas não são limitados àsseqüências derivadas do gene env (isto é, seqüências que codificam todo ouparte de gpl60, gpl20, e/ou gp41), do gene pol (isto é, seqüências quecodificam todo ou parte da transcriptase, endonuclease, protease, e/ouintegrase reversas), do gene gag (isto é, seqüências que codificam todo ouparte de p7, p6, p55, pl7/18, p24/25) tat, rev, nef, vif, vpu, vpr e/ou vpx.

Um método para construir estas moléculas híbridas é inserir aseqüência codificadora heteróloga em um complemento de DNA de um genedo vírus de RNA de filamento negativo de modo que a seqüência heteróloga éflanqueada pelas seqüências virais requeridas para a atividade da polimeraseviral; por exemplo, um promotor da RNA pol I canina e um sítio depoliadenilação. Em um método alternativo, oligonucleotídeos que codificamum promotor da RNA pol I canina, por exemplo, o complemento do término3' ou ambos os términos dos segmentos genômicos virais podem ser ligados àseqüência codificadora heteróloga para construir a molécula híbrida. Acolocação de um gene ou segmento estranho de um gene estranho dentro deuma seqüência alvo foi em tempos passados ditado pela presença de sítios deenzima de restrição apropriados dentro da seqüência alvo. Entretanto, avançosrecentes na biologia molecular têm diminuído este problema enormemente.Os sítios de enzima de restrição podem ser facilmente colocados em qualquerlugar dentro de uma seqüência alvo através do uso da mutagênese direcionadaao sítio (por exemplo, ver, por exemplo, as técnicas descritas por Kunkel,1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82: 488). Variações na tecnologia dareação da cadeia da polimerase (PCR), descrita, também permitem a inserçãoespecífica das seqüências (isto é, sítios de enzima de restrição) e permitem aconstrução fácil de moléculas híbridas. Alternativamente, as reações de PCRseriam usadas para preparar padrões recombinantes sem a necessidade daclonagem. Por exemplo, as reações de PCR podem ser usadas para prepararmoléculas de DNA de filamento duplo contendo um promotor da RNApolimerase direcionada por DNA (por exemplo, bacteriofase T3, T7 ou SP6) ea seqüência híbrida contendo o gene heterólogo e um promotor da RNA pol Icanina. Padrões de RNA podem ser depois transcritos diretamente deste DNArecombinante. Ainda em uma outra forma de realização, os vRNAs ou cRNAsrecombinantes correspondentes podem ser preparados ligando-se RNAs queespecificam a polaridade negativa do gene heterólogo e o promotor da RNApol I canina usando uma RNA ligase.

O mRNA bicistrônico pode ser construído para permitir ainiciação interna da tradução de seqüências virais e permitir a expressão deseqüências codificadoras de proteína estranha a partir do sítio de iniciaçãoterminal regular. Alternativamente, uma seqüência de mRNA bicistrônicapode ser construída em que a seqüência viral é traduzida a partir da matriz deleitura aberta terminal regular, enquanto que a seqüência estranha é iniciada apartir de um sítio interno. Certas seqüências de sítio de entrada de ribossomainterno (IRES) podem ser utilizadas. As seqüências IRES que são escolhidasdevem ser curtas o bastante para não interferir com limitações deempacotamento de vírus. Assim, é preferível que o ERES escolhido para umtal método bicistrônico não tenha mais do que 500 nucleotídeos nocomprimento, com menos do que 250 nucleotídeos sendo preferido. Alémdisso, é preferível que o IRES utilizado não compartilhe homologia deseqüência ou estrutural com elementos picornavirais. Os elementos IRESpreferidos incluem, mas não são limitados ao IRES BiP de mamífero e oIRES do vírus da hepatite C.

Alternativamente, uma proteína estranha pode ser expressada apartir de uma unidade transcricional interna em que a unidade transcricionaltem um sítio de iniciação e sítio de poliadenilação. Em uma outra forma derealização, o gene estranho é inserido em um gene de vírus de RNA defilamento negativo tal que a proteína expressada resultante é uma proteína defusão.

5.5 Métodos de Gerar Vírus Recombinantes

A presente invenção fornece métodos de gerar vírus de RNAde filamento negativo recombinante infeccioso pela introdução de vetores deexpressão de proteína e vRNA ou vetores de expressão que expressam cRNAcorrespondente da invenção nas células hospedeiras na ausência do vírusauxiliar. Preferivelmente, as células hospedeiras são células caninas, porexemplo, células MDCK. A presente invenção também fornece métodos degerar vírus de RNA de filamento negativo recombinante infeccioso pelaintrodução de vetores de expressão de proteína e vRNA ou vetores deexpressão que expressam cRNA correspondentes da invenção nas célulashospedeiras na presença do vírus auxiliar. As células hospedeiras podem ser,por exemplo, células caninas (tais como células MDCK), células Vero,células Per.Có, células BHK, células PCK, células MDCK, células MDBK,células 293 (por exemplo, células 293T) e células COS.

Os vetores de expressão de proteína e vetores de expressão quedirecionam a expressão de vRNAs ou cRNAs correspondentes podem serintroduzidos nas células hospedeiras usando qualquer técnica conhecida poraqueles de habilidade na técnica sem limitação. Por exemplo, vetores deexpressão da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeirasutilizando-se a eletroporação, DEAE-dextrano, precipitação de fosfato decálcio, lipossomas, microinjeção e bombardeamento de micropartícula (ver,por exemplo, Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2aed., 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Os vetoresde expressão da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeirassimultânea ou seqüencialmente.

Em uma forma de realização, um ou mais vetores de expressãoque direcionam a expressão de vRNA(s) ou cRNA(s) correspondente(s) sãointroduzidos nas células hospedeiras antes da introdução de vetores deexpressão que direcionam a expressão de proteínas virais. Em uma outraforma de realização, um ou mais vetores de expressão que direcionam aexpressão de proteínas virais são introduzidos nas células hospedeiras antesda introdução do um ou mais vetores de expressão que direcionam aexpressão de vRNA(s) ou cRNA(s) correspondente(s). De acordo com estasformas de realização, os vetores de expressão que direcionam a expressão devRNA(s) ou cRNA(s) correspondente(s) podem ser introduzidos juntos ouseparadamente em transfecções diferentes. Além disso, de acordo com estasformas de realização, os vetores de expressão que direcionam a expressão dasproteínas virais podem ser introduzidos juntos ou separadamente emtransfecções diferentes.

Em uma outra forma de realização, um ou mais vetores deexpressão que direcionam a expressão de vRNA(s) ou cRNA(s)correspondente(s) e um ou mais vetores de expressão que direcionam aexpressão de proteínas virais são introduzidos nas células hospedeirassimultaneamente. Em certas formas de realização, todos os vetores deexpressão são introduzidos nas células hospedeiras usando lipossomas.

Em uma forma de realização um método para produzir umvírus da influenza recombinante é fornecido que compreende introduzir emuma população de vetores de expressão de células caninas capazes deexpressar nas ditas células segmentos de vRNA genômico para fornecer ossegmentos de vRNA genômico completos do dito vírus, em que os ditosvetores de expressão compreendem os nucleotídeos de 1 a 469 da SEQ IDNO: 26 ou um fragmento desta funcionalmente ativo; (b) introduzir nas ditascélulas vetores de expressão capazes de expressar mRNA que codifica um oumais polipeptídeos do dito vírus; e (c) cultivar as ditas células por meio dasquais partículas virais da influenza são produzidas. Em uma forma derealização, os títulos das partículas virais da influenza produzidas no cultivodas ditas células por 48 a 72 horas são de pelo menos 1,0 χ IO4 PFU/ml oupelo menos 1,0 χ 105 PFU/ml.

Em uma forma de realização, um método para produzir osvírus da influenza recombinantes é fornecido em que o método compreendeintroduzir em uma população de vetores de expressão de células caninascapazes de expressar nas ditas células segmentos de vRNA genômico parafornecer os segmentos de vRNA genômico completos do dito vírus, em queos ditos vetores de expressão compreendem os nucleotídeos de 1 a 469 daSEQ ID NO: 26 ou um fragmento desta funcionalmente ativo; (b) introduzirnas ditas células vetores de expressão capazes de expressar mRNA quecodifica um ou mais polipeptídeos do dito vírus; e (c) cultivar as ditas célulaspor meio das quais as partículas virais da influenza são produzidas. Em umaforma de realização, os títulos das partículas virais da influenza produzidas nocultivo das ditas células por 48 a 72 horas são de pelo menos 1,0 χ IO4PFU/ml ou pelo menos 1,0 χ IO5 PFU/ml.

As quantidades e razões apropriadas dos vetores de expressãopara realizar um método da invenção podem ser determinadas pelaexperimentação de rotina. Como orientação, no caso de transfecçãolipossômica ou precipitação com cálcio do plasmídeo nas células hospedeiras,é considerado que cada plasmídeo pode ser utilizado em uns poucos μg, porexemplo, I a lO μg, por exemplo, diluído a uma concentração de DNA totalfinal de cerca de 0,1 μg/ml antes de misturar com reagente de transfecção emmaneira convencional. Pode ser preferido usar vetores que expressam NP e/ousubunidades de RNA polimerase dependentes de RNA em uma concentraçãomais alta do que aquelas que expressam segmentos de vRNA. Uma pessoahabilitada na técnica avaliará que as quantidades e razões dos vetores deexpressão podem variar dependendo das células hospedeiras.

Em uma forma de realização, pelo menos 0,5preferivelmente pelo menos 1 pelo menos 2,5 μg, pelo menos 5 μg, pelomenos 8 μg, pelo menos 10 μg, pelo menos 15 μg, pelo menos 20 μg, pelomenos 25 μg ou pelo menos 50 μg de um ou mais vetores de expressão deproteína da invenção são introduzidos nas células hospedeiras para gerar vírusde RNA de filamento negativo recombinante infeccioso. Em uma outra formade realização, pelo menos 0,5 μg, preferivelmente pelo menos 1 μg, pelomenos 2,5 μg, pelo menos 5 μg, pelo menos 8 μg, pelo menos 10 μg, pelomenos 15 μg, pelo menos 20 μg, pelo menos 25 μg ou pelo menos 50 μg deum ou mais vetores de expressão da invenção para direcionar a expressão devRNAs ou cRNAs são introduzidos nas células hospedeiras para gerar vírusde RNA de filamento negativo recombinante infeccioso.

As células hospedeiras que podem ser usadas para gerar ovírus de RNA de filamento negativo da invenção incluem células primárias,cultivadas ou células secundárias e transformadas ou células imortalizadas(por exemplo, células 293, células 293T, células CHO, células Vero, PK,MDBK, OMK e células MDCK). As células hospedeiras são preferivelmentecélulas de animal, mais preferivelmente células de mamífero e maispreferivelmente células caninas. Em uma forma de realização preferida, osvírus de RNA de filamento negativo recombinantes infecciosos da invençãosão gerados em células MDCK.

A presente invenção fornece métodos de gerar vírus de RNAde filamento negativo recombinante infeccioso em linhagens de célulahospedeira estavelmente transduzida. As linhagens de célula hospedeiraestavelmente transduzidas da invenção podem ser produzidas introduzindo-secDNA controlado pelos elementos de controle de expressão apropriados (porexemplo, promotor, realçador, seqüências, seqüências de terminação detranscrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável nascélulas hospedeiras. A seguir da introdução do DNA estranho, as célulastransduzidas podem ser deixadas crescer por 1 a 2 dias em um meioenriquecido e depois são trocadas para um meio seletivo. O marcadorselecionável confere resistência às células e permite que as células integremestavelmente o DNA nos seus cromossomas. As células hospedeirastransduzidas com o DNA estavelmente integrado podem ser clonadas eexpandidas em linhagens de célula.

Vários sistemas de seleção podem ser usados, incluindo masnão limitados aos genes da timidina quinase do vírus simples do herpes(Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxantina-guanina fosforibosil-transferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:2026) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817)podem ser utilizados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também,a resistência a antimetabólito pode ser usada como a base de seleção para osgenes dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl.Acad. Sei. USA 77: 3567; 0'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA78: 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan &Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2072); neo, que confereresistência ao aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol.Biol. 150: 1); e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al.,1984, Gene 30: 147).

Os vírus de RNA de filamento negativo recombinantesinfecciosos gerados pelos métodos da invenção que não são atenuados, podemser atenuados ou mortos, por exemplo, pelos métodos clássicos. Por exemplo,o vírus de RNA de filamento negativo recombinante da invenção pode sermorto por calor ou tratamento com formalina, de modo que o vírus não sejacapaz de replicar. Os vírus de RNA de filamento negativo recombinantes dainvenção que não são atenuados podem ser atenuados, por exemplo, pelapassagem através de hospedeiros não naturais para produzir vírus progêniesque são imunogênicos, mas não patogênicos.

Os vírus atenuados, vivos ou mortos produzidos de acordocom a invenção podem ser subseqüentemente incorporados em umacomposição de vacina na maneira convencional ou usados para produzir vírusadicional, por exemplo, em ovos. Onde um tal vírus tem um segmento devRNA quimérico como debatido acima que codifica um antígeno estranho, omesmo pode ser formulado para se obter a vacinação contra mais do que umpatógeno simultaneamente. Os vírus recombinantes atenuados produzidos deacordo com a invenção que possuem um segmento quimérico de vRNAtambém podem ser planejados para outros usos terapêuticos, por exemplo, umagente anti-tumor ou ferramenta de terapia de gene, caso este em que aprodução do vírus será seguida pela sua incorporação em uma composiçãofarmacêutica apropriada junto com um carregador ou diluentefarmaceuticamente aceitáveis.

A recuperação isenta de vírus auxiliar de acordo com ainvenção é particularmente favorecida quanto a geração dos vírusrecontaminantes, especialmente vírus da influenza recontaminante desejadopara o uso em vacina particularmente visto que métodos de seleção não sãonecessários para livrar a cultura do vírus auxiliar.

Os métodos da presente invenção podem ser modificados paraincorporar aspectos de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica,de modo a melhorar a eficiência da recuperação de partículas viraisinfecciosas. Por exemplo, as técnicas de genéticas reversas envolve apreparação de RNA viral recombinante sintético que contém as regiões nãocodificadoras do RNA viral de filamento negativo que são essenciais para oreconhecimento pelas polimerases virais e para os sinais de empacotamentonecessários para gerar um virion maduro. Os RNAs recombinantes sãosintetizados a partir de um padrão de DNA recombinante e reconstituídos invitro com complexo de polimerase viral purificada para formarribonucleoproteína recombinante (KNPs) que pode ser usada para transfectarcélulas. Uma transfecção more eficiente é obtida se as proteínas da polimeraseviral estiverem presentes durante a transcrição dos RNAs sintéticos in vitro ouin vivo. As RNPs recombinantes sintéticas podem ser recuperadas empartículas virais infecciosas. As técnicas estranhas são descritas na Pat. U.S.N0 5.166.057 concedida em 24 de Nov. de 1992; na Pat. U.S. N0 5.854.037concedida em 29 de Dez. de 1998; na Pat. U.S. N0 5.789.229 concedida em 4de agosto de 1998; na Publicação de Patente Européia EP 0702085A1,publicada em 20 de fev. de 1996; no pedido de Pat. U.S. Ser. N0 09/152.845;nas Publicações de Patente Internacionais PCR W097/12032 publicada em 3de abril de 1997; W096/34625 publicada em 7 de nov. de 1996; naPublicação de Patente Européia EP-A780475; W099/02657 publicada em 21de jan de 1999; W098/53078 publicada em 26 de nov de 1998; W098/02530publicada em 22 de jan. de 1998; W099/15672 publicada em 1 de abril de1999; W098/13501 publicada em 2 de abril de 1998; W097/06720 publicadaem 20 de fev. de 1997; e EPO 780 47SA1 publicada em 25 de Jun. de 1997,cada um dos quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.5.5.1 Formas de Realização de Vírus de RNA de Filamento NegativoSegmentado Específico

A presente invenção fornece um método para gerar em célulasinfecciosas cultivadas recombinantes partículas virais de um vírus de RNA defilamento negativo segmentado tendo mais do que 3 segmentos de vRNAgenômico, por exemplo um vírus da influenza tal como um vírus da influenzaA, o dito método compreendendo: (a) introduzir em uma população de célulascapazes de sustentar o crescimento do dito vírus um primeiro conjunto devetores de expressão capazes de expressar nas ditas células segmentos devRNA genômico para fornecer os segmentos de vRNA genômico completosdo dito vírus; (b) introduzir nas ditas células um segundo conjunto de vetoresde expressão capazes de expressar mRNA que codifica um ou maispolipeptídeos do dito vírus; e (c) cultivar as ditas células por meio do qual asditas partículas virais são produzidas. Em certas formas de realização, ascélulas são células caninas. Em certas formas de realização, as células sãocélulas MDCK. Em certas formas de realização, o vírus recombinante é ovírus da influenza A ou B. Em certas formas de realização, o primeiroconjunto de vetores de expressão está contido em plasmídeos de 1 a 8. Emcertas formas de realização, o primeiro conjunto de vetores de expressão estácontido em um plasmídeo. Em certas formas de realização, o segundoconjunto de vetores de expressão está contido em plasmídeos de 1 a 8. Emcertas formas de realização, o segundo conjunto de vetores de expressão estácontido em um plasmídeo. Em certas formas de realização, o primeiro,segundo ou ambos os conjuntos de vetores de expressão são introduzidos poreletroporação. Em certas formas de realização, o primeiro conjunto de vetoresde expressão codifica cada segmento de vRNA de um vírus da influenza. Emcertas formas de realização, o segundo conjunto de vetores de expressãocodifica o mRNA de um ou mais ou todos os polipeptídeos da influenza. Emcertas formas de realização, o primeiro conjunto ou segundo conjunto devetores de expressão (ou ambos os conjuntos) compreendem um ácidonucleico da invenção, por exemplo, uma seqüência reguladora da RNA pol Icanina da invenção (por exemplo, um promotor da RNA pol I canina). Emcertas formas de realização, o primeiro conjunto ou segundo conjunto devetores de expressão (ou ambos os conjuntos) codificam um vRNA ou mRNAde um segundo vírus. Por exemplo, um conjunto de vetores compreende umou mais vetores que codificam o mRNA e/ou vRNA de HA e/ou NA de umsegundo vírus da influenza. Em uma forma de realização, o vírus auxiliar éusado no método. Em uma forma de realização, as células cultivadas usadasno método são células caninas.

A presente invenção fornece um método para gerar em célulasinfecciosas cultivadas recombinante partículas virais de um vírus de RNA defilamento negativo segmentado tendo mais do que 3 segmentos de vRNAgenômico, por exemplo um vírus da influenza tal como um vírus da influenzaA, o dito método compreendendo: (a) introduzir em uma população de célulascapazes de sustentar o crescimento do dito vírus em um conjunto de vetoresde expressão capazes tanto de expressar nas ditas células segmentos de vRNAgenômico para fornecer os segmentos de vRNA genômico completos do ditovírus quanto capazes de expressar mRNA que codifica um ou maispolipeptídeos do dito vírus; (b) cultivar as ditas células por meio das quais asditas partículas virais são produzidas. Em certas formas de realização, ascélulas são células caninas. Em certas formas de realização, as células sãocélulas MDCK. Em certas formas de realização, o vírus é o vírus da influenzaA ou B. Em certas formas de realização, o conjunto de vetores de expressãosão compreendidos nos plasmídeos de 1 a 17. Em certas formas de realização,o conjunto de vetores de expressão está contido em plasmídeo de 1 a 8. Emcertas formas de realização, o conjunto de vetores de expressão está contidoem plasmídeos de 1 a 3. Em certas formas de realização, o conjunto devetores de expressão está contido em um plasmídeo. Em certas formas derealização, os conjuntos de vetores de expressão são introduzidos poreletroporação. Em certas formas de realização, o conjunto de vetores deexpressão codifica cada segmento de vRNA de um vírus da influenza. Emcertas formas de realização, o conjunto de vetores de expressão codifica omRNA de um ou mais polipeptídeos da influenza. Em certas formas derealização, o conjunto de vetores de expressão codifica cada segmento devRNA de um vírus da influenza e o mRNA de um ou mais polipeptídeos dainfluenza. Em certas formas de realização, o conjunto de vetores de expressãocompreende um ácido nucleico da invenção, por exemplo, uma seqüênciareguladora da RNA pol I canina da invenção (por exemplo, um promotor daRNA pol I canina). Em certas formas de realização, o conjunto de vetores deexpressão codifica um vRNA ou mRNA de um segundo vírus. Por exemplo, oconjunto de vetores compreende um ou mais vetores que codificam o mRNAe/ou vRNA de HA e/ou NA de um segundo vírus da influenza. Em certasformas de realização, o primeiro conjunto ou segundo conjunto de vetores deexpressão (ou ambos os conjuntos) codificam um vRNA ou mRNA de umsegundo vírus. Por exemplo, um conjunto de vetores compreende um ou maisvetores que codificam o mRNA e/ou vRNA de HA e/ou NA de um segundovírus da influenza. Em uma forma de realização, o vírus auxiliar é usado nométodo. Em uma forma de realização, as células cultivadas usadas no métodosão células caninas.

A presente invenção fornece um método para gerar em célulasinfecciosas cultivadas recombinante partículas virais de um vírus de RNA defilamento negativo, o dito método compreendendo: (a) introduzir em umapopulação de células capazes de sustentar o crescimento do dito vírus umprimeiro conjunto de vetores de expressão capazes de expressar nas ditascélulas genômica vRNA para fornecer o vRNA genômico completo do ditovírus; (b) introduzir nas ditas células um segundo conjunto de vetores deexpressão capazes de expressar mRNA que codifica um ou mais polipeptídeosdo dito vírus; e (c) cultivar as ditas células por meio das quais as ditaspartículas virais são produzidas. Em certas formas de realização, as célulassão células caninas. Em certas formas de realização, as células são célulasMDCK. Em certas formas de realização, o vírus é o vírus B da influenza. Emcertas formas de realização, o primeiro conjunto de vetores de expressão estácontido em plasmídeos de 1 a 8. Em certas formas de realização, o primeiroconjunto de vetores de expressão está contido em um plasmídeo. Em certasformas de realização, o segundo conjunto de vetores de expressão está contidoem plasmídeos de 1 a 8. Em certas formas de realização, o segundo conjuntode vetores de expressão está contido em um plasmídeo. Em certas formas derealização, o primeiro, segundo ou ambos os conjuntos de vetores deexpressão são introduzidos por eletroporação. Em certas formas de realização,o primeiro conjunto de vetores de expressão codifica cada segmento de vRNAde um vírus da influenza. Em certas formas de realização, o segundo conjuntode vetores de expressão codifica o mRNA de um ou mais polipeptídeos dainfluenza. Em certas formas de realização, o primeiro conjunto ou segundoconjunto de vetores de expressão (ou ambos os conjuntos) compreendem umácido nucleico da invenção, por exemplo, uma seqüência reguladora da RNApol I canina da invenção (por exemplo, um promotor da RNA pol I canina).Em uma forma de realização, o vírus auxiliar é usado no método. Em umaforma de realização, as células cultivadas usadas no método são célulascaninas.

A presente invenção fornece um método para gerar em célulasinfecciosas cultivadas partículas virais de um vírus de RNA de filamentonegativo, o dito método compreendendo: (a) introduzir em uma população decélulas capazes de sustentar o crescimento do dito vírus em um conjunto devetores de expressão capazes tanto de expressar nas ditas células genômicavRNA para fornecer o vRNA genômico completo do dito vírus quantocapazes de expressar mRNA que codifica um ou mais polipeptídeos do ditovírus; (b) cultivar as ditas células por meio do qual as ditas partículas viraissão produzidas. Em certas formas de realização, as células são célulascaninas. Em certas formas de realização, as células são células MDCK. Emcertas formas de realização, o vírus é o vírus B da influenza. Em certas formasde realização, o conjunto de vetores de expressão está contido nos plasmídeosde 1 a 17. Em certas formas de realização, o conjunto de vetores de expressãoestá contido em plasmídeo de 1 a 8. Em certas formas de realização, oconjunto de vetores de expressão está contido em plasmídeos de 1 a 3. Emcertas formas de realização, os conjuntos de vetores de expressão sãointroduzidos por eletroporação. Em certas formas de realização, o conjunto devetores de expressão codifica cada segmento de vRNA de um vírus dainfluenza. Em certas formas de realização, o conjunto de vetores de expressãocodifica o mRNA de um ou mais polipeptídeos da influenza. Em certasformas de realização, o conjunto de vetores de expressão codifica cadasegmento de vRNA de um vírus da influenza e o mRNA de um ou maispolipeptídeos da influenza. Em certas formas de realização, o conjunto devetores de expressão compreende um ácido nucleico da invenção, porexemplo, uma seqüência reguladora da RNA pol I canina da invenção (porexemplo, um promotor da RNA pol I canina). Em certas formas de realização,o conjunto de vetores de expressão codifica um vRNA ou mRNA de umsegundo vírus. Por exemplo, o conjunto de vetores compreende um ou maisvetores que codificam o mRNA e/ou vRNA de HA e/ou NA de um segundovírus da influenza. Em uma forma de realização, o vírus auxiliar é usado nométodo. Em uma forma de realização, as células cultivadas usadas no métodosão células caninas.

A presente invenção fornece um método para gerar em célulascultivadas caninas partículas virais infecciosas de um vírus de RNA defilamento negativo segmentado tendo mais do que 3 segmentos de vRNAgenômico, por exemplo um vírus da influenza tal como um vírus da influenzaA, o dito método compreendendo: (a) fornecer uma primeira população decélulas caninas capazes de sustentar o crescimento do dito vírus e tendointroduzido um primeiro conjunto de vetores de expressão capazes deexpressar diretamente nas ditas células caninas segmentos de vRNAgenômico para fornecer os segmentos de vRNA genômico completos do ditovírus ou o cRNA correspondentes, na ausência de um vírus auxiliar parafornecer qualquer um de tais segmentos de RNA, as ditas células caninastambém sendo capazes de fornecer uma proteína de núcleo e RNA polimerasedependente de RNA por meio do qual os complexos de RNP contendo ossegmentos de vRNA genômico do dito vírus podem ser formados e as ditaspartículas virais podem ser montadas dentro das ditas células caninas; e (b)cultivar as ditas células caninas por meio do qual as ditas partículas virais sãoproduzidas. Em certas formas de realização, as células caninas são célulasMDCK.

A presente invenção também fornece um método para gerarem células cultivadas caninas partículas virais infecciosas de um vírus deRNA de filamento negativo segmentado, o dito método compreendendo: (i)fornecer uma primeira população de células caninas que são capazes desustentar o cultivo do dito vírus e que são modificadas de modo a seremcapazes de fornecer (a) os vRNAs genômicos do dito vírus na ausência de umvírus auxiliar e (b) uma proteína de núcleo e RNA polimerase dependente deRNA por meio da qual os complexos de RNA contendo os ditos vRNAsgenômicos podem ser formados e as ditas partículas virais podem sermontadas, os ditos vRNAs genômicos sendo diretamente expressados nasditas células sob o controle de uma seqüência reguladora de RNA Pol I caninaou derivado funcional deste; e (ii) cultivar as ditas células caninas por meiodas quais as ditas partículas virais são produzidas.

O presente relatório descritivo também fornece um métodopara gerar em células infecciosas cultivadas partículas virais de um vírus deRNA de filamento negativo segmentado, o dito método compreendendo: (i)fornecer uma população de células caninas que são capazes de sustentar ocultivo do dito vírus e que são modificadas de modo a serem capazes defornecer (a) os vRNAs genômicos do dito vírus na ausência de um vírusauxiliar e (b) uma proteína de núcleo e RNA polimerase dependente de RNApor meio da qual o complexo ou complexos de RNP que contêm os ditosvRNAs genômicos podem ser formados e as ditas partículas virais possam sermontadas, os ditos RNAs genômicos sendo diretamente expressados nas ditascélulas caninas sob o controle de uma seqüência reguladora de RNA Pol Icanina ou um derivado funcional deste, por exemplo, um promotor da RNAPol I canina como descrito acima; e (ii) cultivar as ditas células caninas pormeio das quais as ditas partículas virais são produzidas.Em uma forma de realização específica, um vírus de RNA defilamento negativo recombinante infeccioso tendo, pelo menos 4, pelo menos5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou pelo menos 8 segmentos de vRNAgenômico em uma célula hospedeira canina são gerados usando os métodos aqui descritos.

Em uma forma de realização específica, a presente invençãofornece métodos de gerar vírus da influenza infeccioso recombinante nascélulas hospedeiras usando os vetores de expressão para expressar ossegmentos de vRNA ou cRNAs correspondentes e as proteínas do vírus da influenza, em particular PB1, PB2, PA e NA. De acordo com esta forma derealização, o vírus auxiliar pode estar incluído ou não para gerar os vírusinfecciosos recombinantes da influenza.

Os vírus infecciosos recombinantes da influenza da invençãopodem replicar ou não e produzir progênie. Preferivelmente, os vírus infecciosos recombinantes da influenza da invenção são atenuados. Os vírusda influenza recombinantes infecciosos atenuados, por exemplo, podem teruma mutação no gene NS 1.

Em certas formas de realização, um dos vírus recombinantesinfecciosos da invenção pode ser usado para produzir outros vírus úteis para preparar uma composição de vacina da invenção. Em uma forma derealização, os vírus recombinantes ou recontaminantes produzidos por ummétodo da invenção são usados para a produção de vírus adicional para o usocomo uma vacina. Por exemplo, uma população de vírus recombinantes ourecontaminantes produzidos pelos métodos da invenção que incorporam uma seqüência reguladora da RNA pol I canina da invenção (por exemplo, umpromotor da RNA pol I canina). Subseqüentemente, a população de vírus écultivada em ovos ou uma outra cultura tal que os vírus adicionais sãoproduzidos para a preparação de vacinas ou uma composição imunogênica.

Em certas formas de realização, os vírus infecciososrecombinantes da influenza da invenção expressam seqüências heterólogo(isto é, vírus que não da influenza). Em uma outra forma de realização, osvírus infecciosos recombinantes da influenza da invenção expressam asproteínas do vírus da influenza de cepas da influenza diferentes. Já em umaoutra forma de realização preferida, os vírus infecciosos recombinantes dainfluenza da invenção expressam proteínas de fusão.5.5.2 Introdução de vetores nas células hospedeiras

Os vetores que compreendem segmentos do genoma dainfluenza podem ser introduzidos (por exemplo, transfectados) nas célulashospedeiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica (ver, porexemplo, as publicações de pedido de patente US Nos US20050266026 e20050158342) para introduzir ácidos nucleicos heterólogos em célulaseucarióticas, incluindo, por exemplo, a co-precipitação com fosfato de cálcio,eletroporação, microinjeção, lipofecção e transfecção utilizando reagentes detransfecção de poliamina. Por exemplo, vetores, por exemplo, plasmídeos,podem ser transfectados nas células hospedeiras, tais como, por exemplo,células MDCK, células COS, células 293T ou combinações destas, usando oreagente de transfecção de poliamina TransIT-LTl (Mims) de acordo com asinstruções do fabricante. Aproximadamente 1 μg de cada vetor a serintroduzido na população de células hospedeiras pode ser combinados comaproximadamente 2 μl de TransIT-LTl diluído em 160 μl de meio,preferivelmente meio isento de soro, em um volume total de 200 μl. Asmisturas de DNA:reagente de transfecção pode ser incubado na temperaturaambiente por 45 min seguido pela adição de 800 μl de meio. A mistura detransfecção é depois adicionada às células hospedeiras e as células sãocultivadas como descrito acima. Conseqüentemente, para a produção de vírusrecombinante ou recontaminante em cultura de célula, vetores que incorporamcada um dos 8 segmentos de genoma, (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA e NA)são misturados com aproximadamente 20 μl TranslT-LTl e transfectados nascélulas hospedeiras. Opcionalmente, meio contendo soro é substituído antesda transfecção com meio isento de soro, por exemplo, Opti-MEM I eincubado por 4 a 6 horas.

Alternativamente, a eletroporação pode ser utilizada paraintroduzir vetores que incorporam segmentos do genoma da influenza nascélulas hospedeiras. Ver, por exemplo, as publicações de pedido de patenteUS US20050266026 e 20050158342, que são aqui incorporadas porreferência. Por exemplo, vetores plasmídicos que incorporam um vírus dainfluenza A ou da influenza B são introduzidos nas células MDCK usandoeletroporação de acordo com o seguinte procedimento. Em resumo, 5 χ IO6células MDCK, por exemplo, cultivadas em Meio de Eagle Modificado(MEM) suplementado com 10 % de Soro Bovino Fetal (FBS) são recolocadasem suspensão em 0,3 ml de OptiMEM e colocadas em uma cubeta deeletroporação. Vinte microgramas de DNA em um volume de até 25 μΐ sãoadicionados às células na cubeta, que é depois misturada batendo-sesuavemente. A eletroporação é realizada de acordo com as instruções dofabricante (por exemplo, BioRad Gene Pulser II com Capacitance ExtenderPlus conectado) a 300 volts, 950 microFarads com um tempo constante dentre35 a 45 ms. As células são remisturadas batendo-se suavemente eaproximadamente 1 a 2 minutos a seguir da eletroporação 0,7 ml de OPTI-MEM é adicionado diretamente à cubeta. As células são depois transferidas adois reservatórios de uma placa de cultura de tecido de 6 reservatórios padrãocontendo 2 ml de OPTI-MEM sem soro. A cubeta é lavada para recuperarquaisquer células remanescentes e a suspensão de lavagem é dividida entre osdois reservatórios. O volume final é de aproximadamente 3,5 ml. As célulassão depois incubadas sob condições permissíveis para o crescimento viral, porexemplo, a aproximadamente 33 °C para as cepas adaptadas ao frio.

Orientação adicional sobre a introdução de vetores nas célulashospedeiras pode ser encontrada, por exemplo, nas Patentes U.S. números6.951.754, 6.887.699, 6.649.372, 6.544.785, 6.001.634, 5.854.037, 5.824.536,5.840.520, 5.820.871, 5.786.199 e 5.166.057 e Publicação do Pedido dePatente U.S. Nos 20060019350, 20050158342, 20050037487, 20050266026,20050186563, 20050221489, 20050032043, 20040142003, 20030035814 e20020164770.

5.6 Cultura de célula

Tipicamente, a propagação do vírus é realizada nascomposições de meio em que a célula hospedeira é habitualmente cultivada.As células hospedeiras adequadas para a replicação do vírus da influenzaincluem, por exemplo, células Vero, células Per.C6, células BHK5 célulasMDCK, células 293 e células COS, incluindo células 293T, células COS7,células MDCK são preferidas no contexto da presente invenção. O uso decélulas MDCK não tumorigênicas como células hospedeiras também é umaforma de realização da invenção. Co-culturas incluindo duas das linhagens decélula acima, por exemplo, células MDCK e células 293T ou COS tambémpodem ser utilizadas em uma razão, por exemplo, de 1:1, para melhorar aeficiência da replicação. Ver, por exemplo, 20050158342. Tipicamente, ascélulas são cultivadas em um meio de cultura comercial padrão, tal comomeio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado com soro (porexemplo, 10 % de soros bovinos fetais) ou em meio isento de soro, sobumidade e concentração de CO2 controlados adequados para manter o pHtamponado neutro (por exemplo, no pH entre 7,0 e 7,2). Opcionalmente, omeio contém antibióticos para prevenir o crescimento bacteriano, porexemplo, penicilina, estreptomicina, etc., e/ou nutrientes adicionais, tais comoL-glutamina, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais, suplementosadicionais para promover as características de cultivo favoráveis, porexemplo, tripsina, β-mercaptoetanol e outros.

Procedimentos para manter as células de mamífero em culturaforam extensivamente relatados e são conhecidos por aqueles de habilidade natécnica. Protocolos gerais são fornecidos, por exemplo, em Freshney (1983)Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, NovaIorque; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5a ed., Livingston, Edinburgh;Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Cell Culture for Biochemists, Work e Burdon (eds.) Elsevier,Amsterdam. Os detalhes adicionais com respeito aos procedimentos decultura de tecido de interesse particular na produção do vírus da influenza invitro incluem, por exemplo, Merdez et ai. (1996) Production of influenzavirus in cell cultures for vaccine preparation. Em Cohen e Shafferman (eds)Novel Strategies in Design and Production of Vaccine, que é aqui incorporadana sua totalidade. Adicionalmente, variações em tais procedimentos adaptadosà presente invenção são facilmente determinadas através da experimentaçãode rotina.

As células para a produção do vírus da influenza podem sercultivadas em meio contendo soro ou isento de soro. Em alguns casos, porexemplo, para a preparação de vírus purificados, é desejável cultivar ascélulas hospedeiras em condições isentas de soro. As células podem sercultivadas em escala pequena, por exemplo, menos do que 25 ml de tubos oufrascos de cultura médios ou em frascos grandes com agitação, em garrafasrotativas ou nas contas microcarreadoras (por exemplo, contasmicrocarreadoras de DEAE-Dextrano, tais como Dormacell, Pfeifer &Langen; Superbead, Flow Laboratories; contas de estireno copolímero-tri-metilamina, tais como Hillex, SoloHill, Ann Arbor) em culturas em frascos,garrafas ou reator. As contas microcarreadoras são esferas pequenas (na faixade 100 a 200 mícrons no diâmetro) que fornecem uma área de superfíciegrande para o cultivo de célula aderente por volume de cultura de célula. Porexemplo um único litro de meio pode incluir mais do que 20 milhões decontas microcarreadoras que fornecem mais do que 8000 centímetrosquadrados da superfície de cultivo. Para a produção comercial de vírus, porexemplo, para a produção de vacinas, é freqüentemente desejável cultivar ascélulas em um biorreator ou fermentador. Os biorreatores são disponíveis emvolumes abaixo de 1 litro até em excesso de 100 litros, por exemplo,Biorreator Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, MN); biorreatores NBS (NewBrunswick Scientific, Edison, N.J.); biorreatores em escala de laboratório ecomercial da B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen,Alemanha).

Independente do volume de cultura, no contexto da presenteinvenção, as culturas podem ser mantidas em uma temperatura menor do queou igual a 35 °C, para garantir a recuperação eficiente do vírus da influenzarecombinante e/ou recontaminante, particularmente o vírus da influenzarecombinante e/ou recontaminante adaptado ao frio, sensível à temperatura,atenuado. Por exemplo, as células são cultivadas em uma temperatura entrecerca de 32 °C e 35 °C, tipicamente em uma temperatura entre cerca de 32 °Ce cerca de 34 °C, usualmente a cerca de 33 °C.

Tipicamente, um regulador, por exemplo, um termostato ououtro dispositivo para sentir e manter a temperatura do sistema de cultura decélula é utilizado para garantir que a temperatura não exceda 35 °C durante operíodo da replicação viral.

5.7 Recuperação Viral

Vírus são tipicamente recuperados a partir do meio de cultura,em que células infectadas (transfectadas) foram cultivadas. Tipicamente omeio bruto é clarificado antes da concentração de vírus da influenza. Osmétodos comuns incluem filtração, ultrafiltração, absorção em sulfato debário e eluição e centrifugação. Por exemplo, meio bruto de culturasinfectadas pode ser primeiro clarificado pela centrifugação, por exemplo, de1000 a 2000 χ g por um tempo suficiente para remover os fragmentos decélula e outras matérias particuladas grandes, por exemplo, entre 10 e 30minutos. Alternativamente, o meio é filtrado através de um filtro de acetato decelulose de 0,8 μπι para remove células intactas e outro material particuladogrande. Opcionalmente, o sobrenadante do meio clarificado é depoiscentrifugado para pelotizar o vírus da influenza, por exemplo, a 15.000 χ g,por aproximadamente 3 a 5 horas. A seguir da recolocação em suspensão dapelota do vírus em um tampão apropriado, tal como STE (0,01 M de Tris-HCl; 0,15 M de NaCl; 0,0001 M de EDTA) ou solução salina tamponada comfosfato (PBS) no pH 7,4, o vírus é concentrado pela centrifugação degradiente de densidade em sacarose (60 % a 12 %) ou tartarato de potássio(50 % a 10 %). Os gradientes contínuos ou escalonados, por exemplo, umgradiente de sacarose entre 12 % e 60 % em quatro etapas de 12 %, sãoadequados. Os gradientes são centrifugados a uma velocidade e por umtempo, suficiente para os vírus concentrarem em uma faixa visível para arecuperação. Alternativamente e para a maioria das aplicações em largaescala, o vírus é decantado a partir de gradientes de densidade usando umrotor de centrífuga zonal operando no modo contínuo. Detalhes adicionaissuficientes para guiar uma pessoa de habilidade através da preparação devírus da influenza a partir de cultura de tecido são fornecidos, por exemplo,em Furminger. Vaccine Production, em Nicholson et al. (eds) Textbook ofinfluenza pp. 324-332; Merdez et ai. (1996) Production of influenza viras incell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds) NovelStrategies in Design and Vaccine Production pp. 141-151 e Patente dosEstados Unidos N0 5.690.937, Pedidos de publicação U.S. Nos 20040265987,20050266026 e 20050158342, que são aqui incorporadas por referência. Sedesejado, os vírus recuperados podem ser armazenados a -80 0C na presençade sacarose-fosfato-glutamato (SPG) como um estabilizador.5.8 Vírus da influenza

O genoma do vírus da influenza é composto de oito segmentosde ácido ribonucleico (RNA) de filamento (-) lineares, que codificam asproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) imunogênica e seispolipeptídeos de núcleo interno: a nucleoproteína nucleocapsídica (NP);proteínas de matriz (M); proteínas não estruturais (NS); e 3 proteínas da RNApolimerase (PA, PB1, PB2). Durante a replicação, o RNA viral genômico étranscrito em RNA mensageiro de filamento (+) e cRNA genômico defilamento (-) no núcleo da célula hospedeira. Cada um dos oito segmentosgenômicos é empacotado em complexos de ribonucleoproteína que contêm,além do RNA, NP e um complexo da polimerase (PB 1, PB2 e PA).

Os vírus da influenza que podem ser produzidos pelosprocessos da invenção nas células MDCK da invenção incluem mas não sãolimitados aos vírus recontaminantes que incorporam antígenos dahemaglutinina e/ou neuraminidase selecionados no contexto de uma cepamestra atenuada, sensível à temperatura, aprovada. Por exemplo, os víruspodem compreender cepas mestras que são uma ou mais, por exemplo, desensível à temperatura (ts), adaptada ao frio (ca) ou uma atenuada (att) (porexemplo, A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, PR8, B/ Leningrad/14/17/55,B/14/5/1, B/US SR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55,B/England/2608/76,A/Puerto Rico/8/34 (isto é, PR8), etc. ou variantesantigênicas ou derivados destas).

5.9 Vacinas contra o vírus da influenza

Historicamente, as vacinas contra o vírus da influenza foramproduzidas em ovos de galinhas embrionados usando cepas de vírusselecionadas com base em prognósticos empíricos de cepas relevantes. Maisrecentemente, os vírus recontaminantes foram produzidos que incorporamantígenos de hemaglutinina e neuraminidase selecionados no contexto de umacepa mestra atenuada, sensível à temperatura aprovada. A seguir da cultura dovírus através de passagens múltiplas em ovos de galinha, os vírus da influenzasão recuperados e, opcionalmente, inativados, por exemplo, usandoformaldeído e/ou β-propiolactona. Entretanto, a produção da vacina contra ainfluenza desta maneira tem diversas desvantagens significantes. Oscontaminantes remanescentes dos ovos de galinhas são altamente antigênicos,pirogênicos e freqüentemente resultam em efeitos colaterais significantes naadministração. Mais importantemente, as cepas designadas para a produçãodeve ser selecionada e distribuída, tipicamente meses adiantado da seção degripe seguinte para permitir tempo para a produção e inativação da vacinacontra a influenza. Tentativas em produzir vacinas recombinantes erecontaminantes em cultura de célula foram dificultadas pela incapacidade dequalquer uma das cepas aprovadas para a produção de vacinas para crescereficientemente sob condições de cultura de célula padrão.

A presente invenção fornece um sistema de vetor,composições e métodos para produzir os vírus recombinante e recontaminanteem cultura o que torna possível produzir rapidamente vacinas quecorrespondem a uma ou muitas cepas antigênicas selecionadas do vírus. Emparticular, as condições e cepas são fornecidas que resultam na produção devírus eficiente a partir de um sistema de plasmídeo múltiplo em cultura decélula. Opcionalmente, se desejado, os vírus podem ser ainda amplificadosem ovos de galinha ou cultura de células que difiram das culturas usadas pararecuperar o vírus.

Por exemplo, não foi possível cultivar a cepa mestra dainfluenza B, a B/Ann Arbor/1/66 sob condições de cultura de célula padrão,por exemplo, a 37 0C. Nos métodos da presente invenção, plasmídeosmúltiplos, cada um incorporando um segmento de um genoma do vírus dainfluenza são introduzidos em células adequadas e mantidas em cultura emuma temperatura menor do que ou igual a 35 °C. Tipicamente, as culturas sãomantidas entre cerca de 32 0C e 35 °C, preferivelmente entre cerca de 32 0C ecerca de 34 °C, por exemplo, a cerca de 33 °C.

Tipicamente, as culturas são mantidas em um sistema, talcomo um incubador de cultura de célula, sob umidade e CO2 controlados, emtemperatura constante usando um regulador de temperatura, tal como umtermostato para garantir que a temperatura não exceda 35 °C.

O vírus da influenza recontaminante pode ser facilmenteobtido introduzindo-se um subconjunto de vetores que compreendam o cDNAque codifica segmentos genômicos de um vírus mestre da influenza, emcombinação com segmentos complementares derivados das cepas de interesse(por exemplo, variantes antigênicas de interesse). Tipicamente, as cepasmestras são selecionadas com base nas propriedades desejáveis relevantespara a administração de vacina. Por exemplo, para a produção de vacinas, porexemplo, para a produção de uma vacina atenuada viva, a cepa de vírusdoador mestre pode ser selecionado quanto a um fenótipo atenuado,adaptação ao frio e/ou sensível à temperatura. Neste contexto, a cepa caA/Ann Arbor/6/60 da influenza A; cepa ca B/Ann Arbor/1/66 da influenza B;ou uma outra cepa selecionada quanto às suas propriedades fenotípicasdesejáveis, por exemplo, uma cepa atenuada, adaptada ao frio e/ou sensível àtemperatura, é favoravelmente selecionada como cepa doadora mestra.

Em uma forma de realização, plasmídeos que compreendemcDNA que codifica os seis segmentos de vRNA internos da cepa viral mestrada influenza, (isto é, PB1, PB2, PA, NP, NB, Ml, BM2, NSl e NS2) sãotransfectados em células hospedeiras adequadas em combinação comsegmentos de vRNA de hemaglutinina e neuraminidase que codificam cDNAde uma cepa antigenicamente desejável, por exemplo, uma cepaprognosticada causar infecção da influenza local ou global significante. Aseguir da replicação do vírus recontaminante em cultura de célula emtemperaturas apropriadas para a recuperação eficiente, por exemplo, igual aou menor do que 35 °C, tal como entre cerca de 32 °C e 35 °C, por exemploentre cerca de 32 °C e cerca de 34 °C ou a cerca de 33 °C, os vírusrecontaminantes são recuperados. Opcionalmente, o vírus recuperado pode serinativado usando um agente desnaturante tal como formaldeído ou β-propiolactona.5.10 Métodos e composições para a administração profilática de vacinas

Os vírus recombinantes e recontaminantes da invenção podemser administrados profilaticamente em um carregador ou excipienteapropriados para estimular uma resposta imune específica para uma ou maiscepas do vírus da influenza. Tipicamente, o carregador ou excipiente são umcarregador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, tais como água estéril,solução salina aquosa, soluções salinas tamponadas aquosas, soluções dedextrose aquosas, soluções de glicerol aquosas, etanol, fluído alantóico deovos de galinhas não infectadas (isto é, fluido alantóico normal "NAF") oucombinações destes. A preparação de tais soluções que garantem aesterilidade, pH, isotonicidade e estabilidade é efetuada de acordo comprotocolos estabelecidos na técnica. No geral, um carregador ou excipientesão selecionados para minimizar efeitos alérgicos e outros efeitos indesejáveise para adaptar a via particular de administração, por exemplo, subcutânea,intramuscular, intranasal, etc.

No geral, os vírus da influenza da invenção são administradosem uma quantidade suficiente para estimular uma resposta imune específicapara uma ou mais cepas do vírus da influenza. Preferivelmente, aadministração do vírus da influenza evoca uma resposta imune protetora.Dosagens e métodos para evocar uma resposta imune protetora contra uma oumais cepas da influenza são conhecidos por aqueles de habilidade na técnica.Por exemplo, vírus da influenza inativado são fornecidos na faixa de cerca de1 a 1000 HID50 (dose infecciosa humana), isto é, de cerca de 105 a 108 pfu(unidades formadoras de placa) por dose administrada. Alternativamente, decerca de 10 a 50 μg, por exemplo, cerca de 15 μg de HA são administradossem um adjuvante, com doses menores sendo administradas com umadjuvante. Tipicamente, à dose será ajustada dentro desta faixa com base, porexemplo, na idade, condição física, peso corporal, sexo, dieta, tempo deadministração e outros fatores clínicos. A formulação de vacina profilática ésistemicamente administrada, por exemplo, pela injeção subcutânea ouintramuscular usando uma agulha e seringa ou um dispositivo de injeção semagulha. Alternativamente, a formulação de vacina é administradaintranasalmente, por gotas, aerossol de partícula grande (mais do que cerca de10 mícrons) ou pulverização no trato respiratório superior. Embora qualqueruma das vias acima de liberação resulte em uma resposta imune sistêmica, aadministração intranasal confere o benefício adicional de evocar imunidademucósica no local de entrada do vírus da influenza. Para a administraçãointranasal, vacinas vivas de vírus atenuado são freqüentemente preferidas, porexemplo, um vírus da influenza atenuado, adaptado ao frio e/ou sensível atemperatura recombinante ou recontaminante. Embora a estimulação de umaresposta imuno protetora com uma dose única seja preferida, dosagensadicionais podem ser administradas, pelas mesmas vias ou diferentes, para seobter o efeito profilático desejado.

Alternativamente, uma resposta imune pode ser estimuladapelo alvejamento ex vivo ou in vivo de células dendríticas com o vírus dainfluenza. Por exemplo, células dendríticas proliferantes são expostas aosvírus em uma quantidade suficiente e por um período suficiente de tempo parapermitir a captura dos antígenos da influenza pelas células dendríticas. Ascélulas são depois transferidas em um paciente a ser vacinado pelos métodosde transplante intravenoso padrão.

Opcionalmente, a formulação para a administração profiláticado vírus da influenza ou subunidades deste, também contém um ou maisadjuvantes para realçar a resposta imune aos antígenos da influenza. Osadjuvantes adequados incluem: saponina, géis minerais tais como hidróxidode alumínio, substâncias ativas na superfície tais como lisolecitina, polióisplurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas ou de hidrocarboneto,bacilo Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum e os adjuvantessintéticos QS-21 e MF59.Se desejado, a administração de vacina profilática de vírus dainfluenza pode ser realizada em conjunção com a administração de uma oumais moléculas imunoestimulatórias. As moléculas imunoestimulatóriasincluem várias citocinas, linfocinas e quimiocinas com atividadesimunoestimulatórias, imunopotenciadoras e pró-inflamatórias, tais comointerleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); os fatores decultivo (por exemplo, fator estimulador de colônia (CSF) de granulócito-macrófago (GM)); e outras moléculas imunoestimulatórias, tais como fatorinflamatório de macrófago, ligando Flt3, B7,l; B7,2, etc. As moléculasimunoestimulatórias podem ser administradas na mesma formulação como ovírus da influenza ou podem ser administradas separadamente. A proteína ouum vetor de expressão que codifica a proteína podem ser administrados paraproduzir um efeito imunoestimulatório.

Em uma outra forma de realização, os vetores da invençãoincluindo os segmentos do genoma da influenza podem ser utilizados paraintroduzir ácidos nucleicos heterólogos em um organismo hospedeiro oucélula hospedeira, tal como uma célula de mamífero, por exemplo, célulasderivadas de um paciente humano, em combinação com um carregador ouexcipiente farmacêuticos adequados como descritos acima. Tipicamente, oácido nucleico heterólogo é inserido em uma região não essencial de um geneou segmento de gene, por exemplo, o gene M do segmento 7. A seqüência depolinucleotídeo heteróloga pode codificar um polipeptídeo ou peptídeo ou umRNA tal como um RNA de anti-sentido ou ribozima. O ácido nucleicoheterólogo é depois introduzido em um hospedeiro ou células hospedeiraspela produção dos vírus recombinantes que incorporam o ácido nucleicoheterólogo e os vírus são administrados como descrito acima. Em uma formade realização, a seqüência de polinucleotídeo heteróloga não é derivada de umvírus da influenza.

Alternativamente, um vetor da invenção incluindo um ácidonucleico heterólogo pode ser introduzido e expressado em uma célulahospedeira co-transfectando-se o vetor em uma célula infectada com um vírusda influenza. Opcionalmente, as células são depois retornadas ou liberadas aopaciente, tipicamente para o sítio a partir do qual elas foram obtidas. Emalgumas aplicações, as células são enxertadas em um tecido, órgão ou sítio dosistema (como descrito acima) de interesse, usando procedimentos detransferência ou enxerto de célula estabelecidos. Por exemplo, células troncoda linhagem hematopoiética, tais como medula óssea, sangue do cordão ousangue periférico derivado de células tronco hematopoiéticas podem serliberadas a um paciente usando técnicas de liberação ou transfusão padrão.

Alternativamente, os vírus que compreendem um ácidonucleico heterólogo podem ser liberados às células de um paciente in vivo.Tipicamente, tais métodos envolvem a administração de partículas de vetor auma população de célula alvo (por exemplo, células sangüíneas, célulastronco, células hepáticas, células neurais (incluindo cerebrais), células renais,células uterinas, células musculares, células intestinais, células cervicais,células vaginais, células prostáticas, etc., assim como células de tumorderivadas de uma variedade de células, tecidos e/ou órgãos. A administraçãopode ser sistêmica, por exemplo, pela administração intravenosa de partículasvirais ou pela liberação das partículas virais diretamente a um sítio ou sítiosde interesse por uma variedade de métodos, incluindo injeção (por exemplo,usando uma agulha ou seringa), liberação de vacina sem agulha,administração tópica ou impulsionando em um sítio de tecido, órgão ou pele.Por exemplo, as partículas de vetor viral podem ser liberadas pela inalação,oral, intravenosa, subcutânea, subdérmica, intradérmica, intramuscular,intraperitoneal, intratecalmente, pela administração vaginal ou retal oucolocando-se as partículas virais dentro de uma cavidade ou outro sítio docorpo, por exemplo, durante cirurgia.

Os métodos descritos acima são úteis para o tratamentoterapêutico e/ou profilaticamente tratando uma doença ou distúrbio pelaintrodução de um vetor da invenção que compreende um polinucleotídeoheterólogo que codifica um polipeptídeo (ou peptídeo) terapêutica ouprofilaticamente eficaz ou RNA (por exemplo, um RNA de anti-senti do ouribozima) em uma população de células alvo in vitro, ex vivo ou in vivo.Tipicamente, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo (ou peptídeo) ouRNA, de interesse é operavelmente ligado a seqüências reguladorasapropriadas como descrito acima nas seções intituladas "Vetores deexpressão" e "Elementos de Expressão Adicionais." Opcionalmente, mais doque uma seqüência codificadora heteróloga é incorporada em um único vetorou vírus. Por exemplo, além de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo ou RNA terapêutica ou profilaticamente ativo, o vetor tambémpode incluir polipeptídeos terapêuticos ou profiláticos adicionais, porexemplo, antígenos, moléculas co-estimulatórias, citocinas, anticorpos, etc.,e/ou marcadores e outros.

Em uma forma de realização, a invenção fornece composiçõesque compreendem os vírus recontaminantes e recombinantes da invenção (ouporções destes) que foram tratados com um agente tal como benzonase, paraeliminar oncogenes potenciais. Conseqüentemente, uma composição devacina isenta de oncogene é especificamente incluída dentro das formas derealização da invenção.

Os métodos e vetores da presente invenção podem ser usadospara tratar terapêutica ou profilaticamente uma ampla variedade de distúrbios,incluindo distúrbios genéticos e adquiridos, por exemplo, como vacinas paradoenças infecciosas, devido aos vírus, bactérias e outros.5.11 Kits

Para facilitar o uso dos vetores e sistemas de vetor dainvenção, qualquer um dos vetores, por exemplo, plasmídeos de consenso dovírus da influenza, plasmídeos de polipeptídeo da influenza variantes,plasmídeos da biblioteca de polipeptídeo da influenza, etc. e componentesadicionais, tais como, tampão, células, meio de cultura, úteis paraempacotamento e infecção de vírus da influenza com propósitosexperimentais ou terapêuticos, podem ser embalados na forma de um kit.

Tipicamente, o kit contém, além dos componentes acima, materiais adicionaisque podem incluir, por exemplo, instruções para realizar os métodos dainvenção, material de embalagem e um recipiente.5.12 Manipulação de ácidos nucleicos e proteínas virais

No contexto da invenção, ácidos nucleicos que compreendemseqüências reguladoras da RNA pol I canina ou outros ácidos nucleicos dainvenção, vetores de expressão, ácidos nucleicos e/ou proteínas do vírus dainfluenza e outros são manipulados de acordo com técnicas da biologiamolecular bem conhecidas. Os protocolos detalhados para numerosos de taisprocedimentos, incluindo amplificação, clonagem, mutagênese,transformação e outros, são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. CurrentProtocols in Molecular Biology (suplementado até 2000) John Wiley & Sons,Nova Iorque ("Ausubel"); Sambrook et ai. Molecular Cloning - A LaboratoryManual (2a Ed.), Vol. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, Nova Iorque, 1989 ("Sambrook") e Berger e Kimmel Guide toMolecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger").

Além das referências acima, protocolos para as técnicas deamplificação in vitro, tais como a reação da cadeia da polimerase (PCR), areação da cadeia da ligase (LCR), amplificação de Qp-replicase e outrastécnicas mediadas pela RNA polimerase (por exemplo, NASBA), úteis porexemplo, para amplificar sondas de cDNA da invenção, são encontradas emMullis et ai. (1987) Patente U.S. N0 4.683.202; PCR Protocols A Guide toMethods e Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA(1990) ("Innis"); Arnheim e Levinson (1990) C&EN 36; The Journal OfNIHResearch (1991) 3:81; Kwoh et al. (1989) Proc Natl Aead Sei USA 86, 1173;Guatelli et al. (1990) Proc Natl Aead Sei USA 87:1874; Lomell et al. (1989) JClin Chem 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241:1077; Van Brunt(1990) Biotechnology 8:291; Wu e Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer etal. (1990) Gene 89:117 e Sooknanan e Malek (1995) Biotechnology 13: 563.Métodos adicionais, úteis para clonar ácidos nucleicos no contexto dapresente invenção, incluem Wallace et al. Pat. U.S. N0 5.426.039. Métodosmelhorados de amplificar ácidos nucleicos grandes pela PCR são resumidosem Cheng et al. (1994) Nature 369: 684 e as referências nesta.

Certos polinucleotídeos da invenção, por exemplo,oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando várias estratégias de fasesólida incluindo a química da ligação de fosforamidita com base emmononucleotídeo e/ou trinucleotídeo. Por exemplo, as seqüências de ácidonucleico podem ser sintetizadas pela adição seqüencial de monômeros e/outrímeros ativados a uma cadeia de polinucleotídeo que se alonga. Ver porexemplo, Caruthers, Μ. H. et al. (1992) Meth Enzymol 211:3.

Em vez de sintetizar as seqüências desejadas, essencialmentequalquer ácido nucleico pode ser solicitado por encomenda de qualquer umade uma variedade de fontes comerciais, tais como The Midland CertifiedReagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company(www.genco.com), ExpressGen, Inc. (www.expressgen.com), OperonTechnologies, Inc. (www.operon.com) e muitas outras.

Além disso, substituições de resíduos de aminoácidoselecionados em polipeptídeos virais podem ser realizadas, por exemplo, pelamutagênese direcionada ao sítio. Por exemplo, polipeptídeos virais comsubstituições de aminoácido funcionalmente correlacionadas comcaracterísticas fenotípicas desejáveis, por exemplo, um fenótipo atenuado,adaptação ao frio, sensíveis a temperatura, podem ser produzidosintroduzindo-se mutações específicas em um segmento de ácido nucleico viralque codifica o polipeptídeo. Métodos para a mutagênese direcionada ao sítiosão bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Ausubel,Sambrook e Berger, supra. Numerosos kits para realizar a mutagênesedirecionada ao sítio são comercialmente disponíveis, por exemplo, o Kit deMutagênese Direcionada ao Sítio Chameleon (Stratagene, La Jolla) e pode serusado de acordo com as instruções do fabricante para introduzir, por exemplo,uma ou mais substituições de aminoácido, em um segmento de genoma quecodifica um polipeptídeo da influenza A ou B, respectivamente.5.13 Outros Vírus

Os ácidos nucleicos, vetores e métodos da presente invençãotambém podem ser usados para a expressão e purificação de outros vírusrecombinantes. O seguinte debate fornece orientação quanto a consideraçõesimportantes na adaptação dos vetores para o uso com outros tais vírus.

Se o vírus alvo compreende um genoma de RNA de filamentopositive, segmentado, um promotor da RNA pol I canina está,preferivelmente, localizado à montante do cDNA na unidade de transcriçãointerna (sistema unidirecional). Nesta forma de realização, o RNA defilamento positivo é gerado para a incorporação direta em novos vírus.Entretanto, as formas de realização em que os vírus alvos compreendemgenomas de RNA de filamento negativo, segmentados são produzidos usandoo sistema unidirecional estão dentro do escopo da invenção.

Se o vírus alvo compreende um genoma de RNA de filamentonegativo, segmentado, o promotor da RNA pol I canina está, preferivelmente,localizado à jusante do cDNA na unidade de transcrição interna (sistemabidirecional). Nesta forma de realização, o RNA de filamento negativo égerado para a incorporação direta em novos vírus. As formas de realização emque os vírus alvos que compreendem genomas de RNA de filamento positivo,segmentados são produzidos com o sistema direcional estão dentro do escopoda invenção.A presente invenção também pode ser usada para produzirvírus que compreendem genomas de RNA não segmentados infecciosos ounão infecciosos (de filamento único ou de filamento duplo). No geral, aintrodução simples de RNA genômico viral infeccioso em uma célulahospedeira é suficiente para causar iniciação do ciclo de vida viral dentro dacélula e a eventual produção de vírus completos. Por exemplo, a introduçãosimples de RNA genômico picornaviral em uma célula hospedeira é suficientepara causar a geração de picornavírus completos. A iniciação do ciclo de vidade um vírus que compreende RNA genômico não infeccioso, tipicamente,requer a introdução adicional de outras proteínas virais que são usualmentecarregadas dentro da partícula viral junto com o genoma. Por exemplo, vírusda parainfluenza III carrega um RNA polimerase dependente de RNA cujapresença é requerida dentro de uma célula hospedeira recém infectada para ainiciação da replicação do RNA genômico viral e transcrição do mRNA viral;na ausência da polimerase, o RNA genômico da parainfluenza III não éinfeccioso. Em formas de realização da presente invenção em que os vírusque compreendem RNAs genômicos infecciosos, não segmentados sãogerados, a introdução simples de um plasmídeo de expressão dual dainvenção, que carrega um ácido nucleico incluindo o genoma viral, em umacélula hospedeira adequada é suficiente para causar a geração de víruscompleta. Em formas de realização em que os vírus que compreendem RNAgenômico não infeccioso não segmentado são gerados, plasmídeos deexpressão adicionais também podem ter que ser introduzido em uma célulahospedeira junto com o plasmídeo de expressão dual que carrega o genomaviral. O plasmídeo adicional deve expressar a(s) proteína(s) requerida(s) paraa iniciação do ciclo de vida viral que é/são normalmente introduzida(s) emuma célula hospedeira na infecção (por exemplo, RNA polimerasesdependentes de RNA).

Em formas de realização em que picornavírus, quecompreende um genoma de RNA não segmentado, infeccioso é produzido, ocDNA que compreende o genoma viral completo é inserido em um plasmídeode expressão de promotor dual da invenção. Um promotor à montante emuma unidade de transcrição externa, preferivelmente, um promotor de pol II,direciona a produção de um mRNA de filamento positivo que compreende ogenoma viral completo — uma poliproteína é traduzida a partir do mRNA eproteínas individuais são clivadas e liberadas da poliproteína (por exemplo,por uma protease dentro da poliproteína). Visto que o genoma viralcompreende RNA de filamento positivo, um segundo promotor à montanteem um unidade de transcrição interna (sistema unidirecional), preferivelmentea RNA pol I canina, direciona a produção de uma copia de filamento positivodo genoma. Se o genoma viral compreendeu RNA de filamento negativo, umsegundo promotor à jusante, em uma unidade de transcrição interna (sistemabidirecional), preferivelmente RNA pol I canina, pode direcionar a produçãode uma cópia de filamento negativo do genoma. As formas de realização emque os vírus de RNA de filamento negativo, não segmentado são produzidasusando o sistema unidirecional estão dentro do escopo da invenção.Similarmente, as formas de realização em que os vírus de RNA de filamentopositivo, não segmentado são produzidos usando o sistema direcional estãodentro do escopo da invenção.

Os vírus que compreendem genomas de RNA não infecciosos,não segmentados em que uma poliproteína não é produzida também pode sergerado com a presente invenção. Por exemplo, o presente sistema pode serusado para produzir vírus rhabdoviridae ou vírus paramyxoviridae,preferivelmente o vírus da parainfluenza III, cujo ciclo de vida normalmenteinclui a produção de mRNAs monocistrônicos múltiplos de RNA genômico,de filamento negativo por uma RNA polimerase dependente de RNAviralmente derivada; proteínas individuais são expressadas a partir de mRNAsmonocistrônicos. Nestas formas de realização, uma unidade de transcriçãoexterna que compreende um promotor, preferivelmente um promotor de polII, direciona a produção de uma cópia de filamento positivo, policistrônica dogenoma viral a partir do qual, no geral, apenas o primeiro gene (NP) étraduzido. Adicionalmente, uma unidade de transcrição interna quecompreende um promotor, preferivelmente um promotor de Pol I canina,direciona a expressão de uma cópia de RNA do genoma para a incorporaçãonos novos vírus. Visto que o genoma viral da parainfluenza III compreende oRNA de filamento negativo, o promotor da unidade de transcrição interna estápreferivelmente localizada à jusante do cDNA (sistema bidirecional). Se ogenoma viral compreende RNA de filamento positivo, o promotor da unidadede transcrição interna está preferivelmente localizado à montante do cDNA(sistema unidirecional). As formas de realização em que os vírus quecompreendem um genoma de RNA de filamento positivo são produzidosusando o sistema direcional e formas de realização em que os vírus quecompreendem um genoma de RNA de filamento negativo são produzidosusando o sistema unidirecional estão dentro do escopo da invenção. Asproteínas virais adicionais (outras que não a proteína expressada a partir domRNA policistrônico) são requeridas para a transcrição e replicação virais (Le P) e estas proteínas são fornecidas individualmente em plasmídeos deexpressão separadas.

A invenção também pode incluir formas de realização em queos vírus que compreendem genoma de RNA de filamento duplo, segmentadossão gerados. Nestas formas de realização, um plasmídeo que compreendecada gene no genoma viral alvo pode ser inserido em um plasmídeo deexpressão de promotor dual da invenção. O plasmídeo pode ser um plasmídeounidirecional ou um plasmídeo bidirecional. Um promotor em uma unidadede transcrição externa, preferivelmente um promotor de pol II, direciona aexpressão de um transcrito do mRNA de cada gene que é traduzido naproteína codificada. Um promotor em uma unidade de transcrição interna,preferivelmente um promotor de Pol I canina, direciona a transcrição de umfilamento positivo (sistema unidirecional) ou um filamento negativo (sistemabidirecional). Subseqüentemente, o primeiro filamento que é produzido podeatuar como um padrão para a produção do filamento complementar pela RNApolimerase viral. O produto de RNA de filamento duplo resultante éincorporado nos novos vírus.

6. Formas de Realização Específicas

1. Um ácido nucleico isolado que compreende uma seqüênciareguladora da RNA polimerase I canina.

2. O ácido nucleico da forma de realização 1, em que aseqüência reguladora é um promotor.

3. O ácido nucleico da forma de realização 1, em que aseqüência reguladora é um realçador.

4. O ácido nucleico da forma de realização 1, em que aseqüência reguladora é tanto um realçador quanto um promotor.

5. O ácido nucleico da forma de realização 1, em que aseqüência reguladora da RNA polimerase compreende nucleotídeos de 1 a1808 da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento desta funcionalmente ativo.

6. O ácido nucleico da forma de realização 1, 2, 3, 4 ou 5, emque a seqüência reguladora é operavelmente ligada ao cDNA que codifica umRNA genômico viral de filamento negativo ou o cRNA correspondente.

7. O ácido nucleico da forma de realização 6, em que o RNAgenômico viral de filamento negativo é um RNA genômico da influenza.

8. O ácido nucleico das formas de realização 6 ou 7, em que oácido nucleico compreende ainda uma seqüência de terminação detranscrição.

9. Um vetor de expressão que compreende o ácido nucleicodas formas de realização 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

10. O vetor de expressão da forma de realização 9, em que ovetor de expressão compreende uma origem bacteriana de replicação.

11. O vetor de expressão da forma de realização 9, em que ovetor de expressão compreende um marcador selecionável que pode serselecionado em uma célula procariótica.

12. O vetor de expressão da forma de realização 9, em que ovetor de expressão compreende um marcador selecionável que pode serselecionado em uma célula eucariótica.

13. O vetor de expressão da forma de realização 9, em que ovetor de expressão compreende um sítio de clonagem múltipla.

14. O vetor de expressão da forma de realização 13, em que osítio de clonagem múltipla é orientado em relação à seqüência reguladora daRNA polimerase I canina para permitir a expressão de uma seqüênciacodificadora introduzida no sítio de clonagem múltipla da seqüênciareguladora.

15. Um método para produzir um RNA genômico dainfluenza, que compreende transcrever o ácido nucleico da forma derealização 7, produzindo deste modo um RNA genômico da influenza.

16. Um método para produzir um vírus da influenzarecombinante, que compreende cultivar uma célula canina que compreende ovetor de expressão das formas de realização 9, 10, 11, 12 13 ou 14e um oumais vetores de expressão que expressam um mRNA que codifica um ou maispolipeptídeos da influenza selecionados do grupo que consiste de: PB2, PB1,PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NSl e NS2; e isolar o vírus da influenzarecombinante.

17. O método da forma de realização 16, em que um vírusauxiliar é usado.

18. O método da forma de realização 16, em que o vírus dainfluenza produzido é infeccioso.

19. O método das formas de realização 16, 17 ou 18, em que ométodo resulta na produção de pelo menos 1 χ IO3 PFU/ml do vírus dainfluenza.

20. Uma célula que compreende o ácido nucleico das formasde realização 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

21. Uma célula que compreende o vetor de expressão dasformas de realização 9, 10, 11, 12, 13 ou 14.

22. A célula das formas de realização 20 ou 21, em que acélula é uma célula canina.

23. A célula canina da forma de realização 22, em que a célulacanina é uma célula renal.

24. A célula renal canina da forma de realização 23, em que acélula renal canina é uma célula MDCK.

25. Um método para gerar em células caninas cultivadas umvírus de RNA de filamento negativo segmentado recombinante tendo mais doque 3 segmentos de vRNA genômico, o dito método compreendendo: (a)introduzir em uma população de células caninas um primeiro conjunto devetores de expressão capazes de expressar nas ditas células segmentos devRNA genômico para fornecer os segmentos de vRNA genômico completosdo dito vírus; (b) introduzir nas ditas células um segundo conjunto de vetoresde expressão capazes de expressar mRNA que codifica um ou maispolipeptídeos do dito vírus; e (c) cultivar as ditas células por meio das quaispartículas virais são produzidas.

26. O método da forma de realização 25, em que partículasvirais infecciosas da influenza são produzidas.

27. O método das formas de realização 25 ou 26, em que ovírus auxiliar é usado.

28. Um método para gerar em células cultivadas caninaspartículas virais infecciosas da influenza, o dito método compreendendo: (a)introduzir em uma população de células caninas um conjunto de vetores deexpressão capazes de expressar nas ditas células i) segmentos de vRNAgenômico para fornecer os segmentos de vRNA genômico completos do ditovírus e (ii) mRNA que codifica um ou mais polipeptídeos do dito vírus; (b)cultivar as ditas células por meio do qual as ditas partículas virais sãoproduzidas.

29. Um método de transcrever um segmento de vRNA de umvírus da influenza, que compreende contatar um polipeptídeo da polimerasepol I canina com um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleicoselecionado do grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1 a 28, em que o ditoácido nucleico é operavelmente ligado a uma molécula de cDNA que codificao dito segmento de vRNA do dito vírus de filamento negativo; e isolar umsegmento de transcrito de vRNA.

30. O método da forma de realização 29, em que o vRNA étranscrito em uma célula hospedeira.

31. O método da forma de realização 16, 17, 18, 19, 25,-26, 27 ou 28, em que cada vetor de expressão está em um plasmídeoseparado.

32. Uma composição que compreende uma pluralidade devetores, em que a pluralidade dos vetores compreende um vetor quecompreende um promotor de Pol I canina operavelmente ligado, a um PAcDNA do vírus da influenza ligado a uma seqüência de terminação detranscrição, um vetor que compreende um promotor de Pol I caninaoperavelmente ligado a um PBl cDNA do vírus da influenza ligado a umaseqüência de terminação de transcrição, um vetor que compreende umpromotor de Pol I canina operavelmente ligado a um PB2 cDNA do vírus dainfluenza ligado a uma seqüência de terminação de transcrição, um vetor quecompreende um promotor de Pol I canina operavelmente ligado a um HAcDNA do vírus da influenza ligado a uma seqüência de terminação detranscrição, um vetor que compreende um promotor de Pol I caninaoperavelmente ligado a um NP cDNA do vírus da influenza ligado a umaseqüência de terminação de transcrição, um vetor que compreende umpromotor de Pol I canina operavelmente ligado a um NA cDNA do vírus dainfluenza ligado a uma seqüência de terminação de transcrição, um vetor quecompreende um promotor de Pol I canina operavelmente ligada a um McDNA do vírus da influenza ligado a uma seqüência de terminação detranscrição e um vetor que compreende um promotor de Pol I caninaoperavelmente ligado a um NS cDNA do vírus da influenza ligado a umaseqüência de terminação de transcrição.

33. A composição da forma de realização 32 que compreendeainda um ou mais vetores de expressão que expressam um mRNA quecodifica um ou mais polipeptídeos da influenza selecionados do grupo queconsiste de: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NSl e NS2.

34. Uma célula hospedeira que compreende a composição dasformas de realização 32 ou 33.

35. Uma vacina que compreende um vírus produzido pelométodo das formas de realização 16, 17, 18, 19, 25, 26, 27 ou 28.

36. Uma vacina que compreende uma composiçãoimunogênica preparada a partir de um vírus produzido a partir do método dasformas de realização 16, 17, 18, 19, 25, 26 27 ou 28.

37. A composição das formas de realização 35 ou 36, em quecada vetor de expressão está em um plasmídeo separado.7. Exemplos

Os seguintes exemplos servem meramente para ilustrar ainvenção e não são intencionados a limitar a invenção de nenhum modo.7.1 Exemplo 1: Cultivo das Cepas da Influenza em Células MDCK

Este exemplo descreve a caracterização de diversas linhagensde célula para o cultivar influenza. Diversas linhagens de célula diferentes ecélulas primárias foram avaliadas para a produção de tanto derivados do tiposelvagem (wt) quanto recontaminantes genéticos adaptado em laboratório, porexemplo, cepas da influenza, adaptadas ao frio (ca), tipo A e tipo B, incluindoMRC-5, WI-38, FRhL-2, PerCó, 293, NIH 3T3, CEF, CEK, DF-1, Vero eMDCK. Embora muitos tipos de célula sustentaram a replicação de algumascepas da influenza adaptadas ao frio a um grau limitado, apenas MDCKcompativelmente produziu títulos altos de vírus tanto do tipo A quanto do tipoB. Por exemplo, células PerC6 foram descobertas sustentar a replicação decertos vírus tipo B wt e ca a um nível similar como aquele observado emcélulas MDCK embora as cinéticas de cultivo fossem diferentes (ver a Figura1). Ao contrário, PerCó foi incapaz de sustentar a replicação de vários vírustipo A ca. A Figura 2 mostra as curvas de crescimento para os vírusA/Sydney/05/97 e A/Beijing/262/95 wt e ca. Em ambos os casos a cepa canão replica bem em células PerCó. Igualmente, a Figura 3 mostra as curvas decrescimento para A/Ann Arbor/6/60 wt e ca demonstrando que a cepa ca nãoreplica eficientemente em células PerCó e a replicação de A/Ann Arbor/6/60wt não é tão robusta quanto em células MDCK. A análise de PCR em temporeal da replicação do vírus da influenza em células PerC6 mostrou que o RNAviral (vRNA) das cepas do vírus da influenza A tanto ca quanto wt aumentoudurante as primeiras 24 horas após a infecção entretanto apenas as cepas wtcontinuaram a aumentar por 120 horas, as cepas ca não. Ao contrário, vRNAtanto wt quanto ca aumentou e atingiu o platô no dia 3 em células MDCK.Ver a Figura 4.

As células MDCK também foram testadas quanto a suacapacidade para sustentar a replicação de uma vacina de pandemia potencial,ca A/Vietnam/1203/2004. As células MDCK foram infectadas em umamultiplicidade baixa de infecção com ca A/Vietnam/1203/2004 e o vírus nosobrenadante foi quantificado em vários tempos após a infecção. Em 48 horasapós a infecção, os títulos de ca A/Vietnam/1203/2004 atingiramaproximadamente 8 Iog10 TCID50/ml e permaneceu estável pelos 3 a 4 diasseguintes. Ver a Figura 5.

Nos experimentos, as células MDCK obtidas do ATCC(Acesso N0 CCL-34) foram expandidas a um número de tempos limitados emmeio contendo 10 % de soro bovino fetal de fonte dos Estados Unidos ou emum meio isento de soro apropriado (por exemplo, SFMV 100) para produzirestoques de célula pré-mestra para estudos de caracterização iniciais. Osmeios isentos de soro apropriados são descritos no Pedido Provisório U.S. N060/638.166, depositado em 23 de Dezembro de 2004; Pedido Provisório U.S.N° 60/641.139, depositado em 5 de janeiro de 2005; e Pedido U.S. N011/304.589 depositado em 16 de dezembro de 2005, cada uma das quais é pormeio deste incorporada por referência em sua totalidade. As células foramfacilmente cultivadas em ambos os tipos de meio e ambos os estoques decélulas sustentaram a replicação de cepas de vacina adaptadas ao frio e cepasde pandemia como mostrado na Tabela 1, abaixo e na Figura 5,respectivamente.

Tabela 1

Comparação da produtividade de cepas da influenza adaptadas ao frio emcélulas MDCK cultivadas em soro e isentas de soro.

<table>table see original document page 117</column></row><table>

Para investigar os segmentos de gene responsáveis pelo cultivorestrito em células PerC6 a técnica de recuperação de oito plasmídeos foiutilizada para gerar um recontaminante 7:1 para cada segmento da cepa degene da influenza A/AA/6/60. Ver, por exemplo, a Patente U.S. 6.951.754para uma descrição representativa do sistema de recuperação da influenza deoito plasmídeos. A Figura 6 mostra um diagrama esquemático e a estratégiade nomeação para cada recontaminante 7:1. Os recontaminantes resultantesforam depois ensaiados quanto a sua capacidade para replicar em célulasPerC6. Ver a Figura 7. O fenótipo de restrição de cultivo parece mapear paraos segmentos de gene PB2 e PB1. O mapeamento dedetalhes finos da localização exata responsável por este fenótipo pode serrealizado usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, acomparação de seqüência das cepas wt e ca nos segmentos de geneidentificados permitirá a identificação de diferenças específicas que podemdepois ser retro mutadas em uma cepa wt ou ca. Tais mutantes são depoisanalisados quanto a sua capacidade para crescer em células PerC6. Qualquermutação que impeça o cultivo de uma cepa wt ou permita o cultivo de umacepa ca é identificada como uma que contribua para o fenótipo de restrição decultivo.

7.2 Exemplo 2: Tumorigenicidade de Linhagens de Célula MDCK

A tumorigenicidade potencial dos dois estoques de célula pré-mestra de células MDCK, um cultivo em meio contendo soro e o outro emmeio isento de soro, foi avaliada no modelo de camundongo nu atímico emum estágio que poderia representar 5 passagens de célula depois daquelaesperada ser usada para a produção de vacinas. Para avaliar atumorigenicidade, 10 células foram injetadas subcutaneamente em grupos de10 camundongos e depois de 84 dias os animais foram sacrificados eexaminados. As neoplasias foram observadas em seis dos 10 animaisinoculados com as células passadas em meio isento de soro. Ao contrário, nãohouve evidência de neoplasia em nenhum dos animais inoculados com célulaspassadas em meio suplementado com 10 % de soro bovino fetal; emboraalguns fibrossarcomas fossem observados no sítio de inoculação, as célulaspassadas em soro não foram tumorigênicas como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2

Tumorigenicidade e Cariologia de Células MDCK passadas em dois meios<table>table see original document page 119</column></row><table>

TP50: Número de células requeridas para induzir tumores em 50 % dos animais ND: Nãofeito

Como mostrado na Tabela 2, as análises de cariótipo tambémforam realizadas nestes dois estoques de célula pré mestra tanto na quartaquanto na vigésima passagem em seus respectivos meios. As células nãotumorigênicas passadas em 10 % de FCS tiveram um número médio de 78cromossomos na metáfase com distribuição relativamente limitada de célulascom outros números de cromossoma (70 a 82). Enquanto que as célulaspassadas em meios isentos de soro também tiveram um número médio de 78cromossomas na metáfase, significantemente mais células foram observadascom um número de cromossoma aneuplóide variando de 52 a 82cromossomos na metáfase. Em ambos os casos, a cariologia não muda aseguir da passagem.

7.3 Exemplo 3: Adaptação das Células MDCK para Crescerem em MeioIsento de Soro

As células MDCK da ATCC são passadas em meio contendo FBSgama irradiado. Estas células são depois passadas por um número limitado detempos em uma formulação de meio isenta de soro escolhida para sustentar aprodução de banco de célula. Os meios isentos de soro são descritos no PedidoProvisório U.S. Nos 60/638.166 e 60/641.139 e Pedido de Patente U.S. 11/304.589.

Estas passagens adicionais podem ser realizadas a 37 0C ou 33 °C. A passagem decélulas MDCK em três meios contendo suplementos derivados de planta ao invésde células produzidas em soro com cariótipos similares àquele de células MDCKpassadas em meio contendo FCS (dados não mostrados).

7.4 Exemplo 4: Clonagem de Células MDCK

As células foram biologicamente clonadas através da diluiçãolimitante de modo para garantir que as células da produção fossem derivadasde uma única plêiade genética. Os clones foram triados quanto a váriaspropriedades fenotípicas incluindo tempo de duplicação e tumorigenicidaderelativa, assim como produção viral. Em um experimento de prova inicial deconceito, cinqüenta e quatro clones MDCK foram obtidos em meio contendo FCS.Estes clones foram passados e cada um foi infectado com uma multiplicidade baixade infecção de ca A/New Caledonia/20/99. Vários dias depois da infecção, osobrenadante foi removido e a quantidade de vírus no sobrenadante foi medida pelaTCID5O. Uma minoria dos clones produziram títulos de vírus relativamente altos,mais do que foi produzido nas células precursoras não clonadas. Os clones compropriedades biológicas e fisiológicas superiores são usados para estabelecer umBanco de Célula Mestra (MCB) como descrito abaixo.

7.5 Exemplo 5: Teste e Caracterização de um Banco de Célula Mestra

O MCB é extensivamente testado para garantir que não hajanenhuma evidência de agentes adventícios. Por exemplo, um ou mais dosdiversos testes de PCR e/ou específicos de anticorpo quanto aos agentes viraisdisponíveis são conduzidos, como mostrado na Tabela 3, abaixo.

Tabela 3

<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table>

7.6 Exemplo 6: Caracterização Pré Clínica do Vírus da Influenza Derivado deCultura de Célula

Este exemplo descreve a caracterização das cepas da influenzaproduzidas a partir de cultura de célula assim como a partir de ovos e comparaos vírus produzidos a partir dos sistemas. No geral, os vírus da influenza sãoadequados para o uso como vacinas em seres humanos e têm propriedadesbiológicas que tornam os vírus adequados para tal uso. Neste exemplo, osvírus da influenza são adaptados ao frio (ca; têm a capacidade de replicareficientemente em temperaturas mais baixas), sensíveis à temperatura (ts; têmreplicação restrita in vitro em temperaturas mais altas) e atenuados (att;nenhuma replicação detectável em tecidos pulmonares de furões) e são aquialudidos como cepas catsatt. A comparação inclui: as avaliações bioquímica,antigênica e genética (seqüenciamento) de produto viral; caracterizaçãobiológica e bioquímica do vírus a seguir da replicação em células humanas; areplicação em um modelo de animal permissivo; e imunogenicidade em ummodelo de animal permissivo.

7.6.1 Comparabilidades Genética, Bioquímica e Antigênica

As cepas ca ts att do tipo A/H1N1, A/H5N1, A/H3N2 e Breplicaram a títulos relativamente altos em células MDCK. Além disso,passando estas cepas ca ts att em células MDCK não alteram a sua seqüênciagenômica. Três cepas ca ts att, ca A/Sydney/05/97, ca A/Beijing/262/95 e caB/Ann Arbor/1/94 foram passadas uma vez ou duas vezes em células MDCKe as regiões codificadoras inteiras de todos os 6 genes internos foramseqüenciadas e comparadas com o material de partida. Nenhuma mudança denucleotídeo foi observada, demonstrando que esta passagem através destesubstrato não mudou a composição genética destas cepas. Outrascaracterizações de seqüência são realizadas em cepas de vacina diferentesproduzidas em células MDCK sob condições que são esperadas imitar osprocessos de produção incluindo composição de meio, dose de entrada (moi),temperatura de incubação e tempo de colheita. Com base nos dadospreliminares, é esperado que não haja nenhuma mudança na seqüênciagenômica do vírus produzido em MDCK.

Por que o genoma foi geneticamente estável a seguir da passagemem célula MDCK, espera-se que os traços biológicos da vacina produzidos em ovosou células MDCK sejam indistinguíveis. Entretanto, o produto viral primário dacultura de célula pode ter algumas diferenças sutis comparado com o produto combase em ovo, particularmente com respeito à modificação pós-translacional deproteínas virais incluindo HA e NA ou composição de lipídeos na membrana viral;ambos os quais podem mudar potencialmente as propriedades físicas globais dovirion. Os dados pré-clínicos preliminares sobre a antigenicidade de vacina produzidaem culturas de célula e produzida em ovo demonstraram que não houve nenhumadiferença detectável neste parâmetro importante. Os estoques de ovo de diversascepas de vacina foram passadas através das células MDCK e a antigenicidade deambos os produtos foi determinada medindo-se os títulos HAI usando anti-soros dereferência. Como mostrado na Tabela 4, todos os títulos HAI estavam dentro de 2vezes um do outro, indicando que a replicação da vacina em células não mudou aantigenicidade da vacina comparada com material derivado de ovo.

Tabela 4

Títulos HAI das cepas produzidas em ovos e células MDCK

<table>table see original document page 122</column></row><table>Em uma forma de realização, para avaliar as similaridadesbioquímicas, biológicas e estruturais a seguir da replicação de vacinas produzidascom MDCK e ovo em células de origem humana, as vacinas podem ser passadasuma vez em células humanas diplóides relevantes, tais como células epiteliaisbrônquicas humanas normais (NHBE). Esta passagem servirá para imitar um únicoevento de infecção nas vias aéreas humanas e depois permitir a comparação dovírus da progênie, o vírus que é por fim responsável por evocar uma resposta imuneeficaz. Estudos das atividades de hemaglutinina (ligação e fusão) e neuraminidasedas vacinas podem ser medidos nestes materiais assim como em outros estudosbioquímicos e estruturais incluindo a microscopia eletrônica, razões de partículasinfecciosas para total e equivalentes em genoma viral podem ser avaliados. Além detudo, estas comparações servirão para demonstrar a comparabilidade da vacinaderivada de célula com a vacina produzida em ovo eficaz e segura. Um resumo deestudos analíticos está resumido na Tabela 5.

Tabela 5

Estudos pré clínicos para comparar vacinas produzidas com célula e ovo

<table>table see original document page 123</column></row><table>

* Comparar produtos primários e depois de uma passagem em células humanas

7.8 Exemplo 8: Modelos de Animal Pré-Clínicos

O furão é um modelo de animal robusto usado para avaliar aatenuação e imunogenicidade de vacina atenuada contra as cepas de vacinacontra a influenza e de componente. O desempenho de cepas da influenzaderivadas de célula produzidas a partir de MCB são comparadas com asmesmas cepas produzidas em ovos. de igual para igual a comparação destesmateriais em estudos controlados permite um alto nível de garantia dacomparabilidade destes produtos virais.

De modo a avaliar a capacidade das duas vacinas para infectarou obter um "take" no furão, os animais são levemente anestesiados einoculados intranasalmente com as preparações virais produzidas com célulaou ovo. O material da lavagem nasal é coletado em diversos pontos no tempoa seguir da inoculação e a quantidade de vírus é avaliada por um de diversosmétodos disponíveis de modo a avaliar as cinéticas e extensão da replicaçãoviral no trato respiratório dos animais. Os experimentos são realizados comuma faixa de dose e incluem cepas múltiplas e misturas trivalentes diferentespara generalizar a infectividade relativa das cepas que crescem em cultura decélula em relação á cepas produzidas de ovo. Estes mesmos estudos tambémsão usados para avaliar a imunogenicidade das cepas da influenza, umapropriedade que é inerentemente ligada à capacidade do vírus para iniciar ainfecção. Os animais são sangrados e as lavagens nasais são colhidas emvários pontos (semanas) após a inoculação; estes espécimes são usados paraavaliar o anticorpo sérico e as respostas IgA nasais à infecção. A culminaçãodestes dados, infectividade, respostas de anticorpo sérico e anticorpomucósico, será usada para comparar e avaliar a infectividade relativa davacina produzida com célula em relação à vacina produzida com ovo. Oresultado mais provável é prognosticado ser que as cepas de vacinaproduzidas com célula e ovo têm infectividade e imunogenicidade similares.Se a vacina derivada de célula pareceu ser mais infectiva ou maisimunogênica do que o produto derivado de ovo, outros estudos avaliando apossibilidade de dosagem mais baixa são realizados.

Vários estudos de imunogenicidade e replicação são realizadosno modelo do furão para avaliar as vacinas derivadas de cultura de célula comuma única dose humana unitária. A infecção com as cepas ca ts att no geralevoca respostas de anticorpo fortes e rápidas nos furões. Além disso, as cepasca ts att individuais são rotineiramente testadas e mostram expressar ofenótipo atenuado (att) pela replicação em títulos relativamente altos nanasofaringe mas a níveis indetectáveis nos pulmões destes animais. O impactodo cultivo em cultura de célula sobre estes traços biológicos também éavaliado. Entretanto, é improvável que quaisquer diferenças sejamobservadas, visto que o fenótipo att é uma parte integral da composiçãogenética destas cepas. As cinéticas de cultivo e a reatividade cruzada destascepas são avaliadas a seguir da administração de uma única dose humananestes animais. Isto evoca anticorpos séricos que reagem cruzado com cepasmúltiplas dentro de uma linhagem genética; e é esperado que uma vacinaderivada de célula tenha a mesma capacidade.

Estas avaliações de comparabilidade devem fornecercompreensão significante nas diferenças bioquímicas e/ou biofísicaspotenciais do produto viral primário e demonstram o impacto destasdiferenças epigenéticas sobre o desempenho das cepas ca ts att medidas pelaprimeira passagem do vírus em células humanas ou estudos de animal. Combase na informação de seqüência até agora, não existe nenhum impactoesperado sobre o desempenho das cepas ca ts att imunogênicas que resultamda produção nas células MDCK.

Furões são um modelo de animal bem documentado para ainfluenza e são usados rotineiramente para avaliar o fenótipo de atenuação eimunogenicidade de cepas ca ts att. No geral, animais de 8 a 10 semanas deidade são usados para avaliar a atenuação; tipicamente planejamentos deestudo avaliam η = 3 a 5 animais por teste ou grupo de controle. Os estudosde imunogenicidade são avaliados em animais de 8 semanas a 6 meses deidade e no geral requerem η = 3 a 5 animais por artigo de teste ou grupo decontrole. Estes números fornecem informação suficiente para se obtercomparações estatisticamente válidas ou observacionalmente importantesentre os grupos. Durante a maior parte dos estudos sinais como a da influenzapodem ser observados, mas não são prováveis. Os furões não demonstramsinais de diminuição no apetite ou peso, descarga nasal ou ocular; observarsinais de doença equivalentes a da influenza é uma parte necessária do estudoe intervenções tais como analgésicos não são asseguradas. Outros sinais dedesconforto, tais como feridas abertas ou perda de peso significante,resultariam em descarte apropriado do animal a seguir do debate com oveterinário atendente.

7.9 Exemplo 9: Desenvolvimento de Semente de Vírus Mestre (MVS)

Correntemente a vacina contra as cepas da influenza sãogeradas co-infectando-se células aviárias com um vírus tipo selvagem e oMDV tipo A ou tipo B e isolação e triagem da progênie quanto a plêiadegenética 6:2 desejada. Este processo requer diversas passagens do vírusatravés de culturas de célula aviária e/ou ovos SPF. Recentemente, arecuperação de plasmídeo foi introduzido para produzir preparação viralcontra a influenza. Neste processo, as células Vero (macaco verde africano)de um banco de célula extensivamente testado e caracterizado sãoeletroporada, por exemplo, com 8 plasmídeos de DNA, cada um contendouma cópia de cDNA de um dos 8 segmentos de RNA da influenza. Váriosdias depois da eletroporação o sobrenadante destas células eletroporadascontém o vírus da influenza. Os sobrenadantes são depois inoculados em ovosSPF para amplificar e clonar biologicamente a cepa de vacina. Ambos destesprocedimentos resultam em uma cepa de vacina que é inoculada em ovos SPFpara produzir o MVS. Embora a recuperação de plasmídeo tenha diversasvantagens incluindo controle de tempo mais confiável, segmentos de genemais geneticamente precisos e contaminação menos potencial com agentesadventícios de isolados do tipo selvagem, MVS's individuais geradas pelosdois métodos são indistinguíveis um do outro e podem ser usados para iniciarprodução de vacina volumosa. Usando os métodos e composição da invenção,este método é adaptado para usar células MDCK ao contrário das célulasVero para a recuperação de plasmídeo.

A amplificação final das cepas de vacina é conduzida emcélulas derivadas dos bancos de célula MDCK. Esta amplificação final podeser obtenível com culturas em escala pequena (<20 L) de células MDCK. Osobrenadante destas células é coletado, concentrado e caracterizado/testadopara produzir o MVS.

7.10 Exemplo 10: Clonagem de seqüências reguladoras da RNA pol I canina

Este exemplo descreve a clonagem do gene de RNAribossômico 18S canino e as seqüências de ácido nucleico 5' para este gene.

Primeiro, o DNA genômico das células MDCK (Acesso N0CCL-34, ATCC) foi isolado usando um kit de Purificação de DNAMestraPure (EPICENTRE Biotechnologies; Madison, WI). O alinhamento deseqüência indica que o rRNA 18s do gene é cerca de 90 % idêntico no cão,ser humano, camundongo, rato e galinha. Um par de iniciadores foramplanejados com base nas seqüências na região conservada próxima àextremidade 5' do rRNA 18s do gene para a PCR para amplificar uma regiãode - 500 pares de base do DNA genômico de MDCK como uma sonda paradetectar os fragmentos de digestão na membrana que tem seqüênciascomplementares através da hibridização de Southern. Um único fragmento derestrição foi identificado no DNA genômico digerido separadamente comBamHI (-2,2 kb) e EcoRI (-7,4 kb). Ambos os fragmentos foram clonados novetor pGEM 7 (Promega Corp.; Madison, WI) para outra análise. Oplasmídeo contendo o fragmento EcoRI foi submetido para depósito com aAmerican Type Culture Collection em 19 de abril de 2006 e foi designado oAcesso A.T.C.C. N0 PTA-7540 e a data de depósito de 20 de abril de 2006.

Os dois clones obtidos pela análise de digestão de restriçãoforam alinhados e a orientação dos dois clones foi confirmada sequenciando-se ambas as extremidades dos dois clones. Um mapa de restrição dofragmento de EcoRI é apresentado como a Figura 8. Em seguida, asseqüências de ácido nucleico completas do fragmento entre o sítio 5' EcoRI eo sítio BamHI seguinte na direção 3' foram determinadas e montadas em umaseqüência de nucleotídeo contendo cerca de 3536 bases. Esta seqüência éapresentada como Figuras 9A-C (SEQ ID NO: 1).

Em seguida, experimentos de extensão de iniciador foramrealizados para identificar o nucleotídeo inicial de transcritos expressados apartir de elementos reguladores da RNA pol I canina. Em resumo, o RNAtotal foi isolado das células MDCK. Um iniciador de oligonucleotídeorotulado foi recozido ao RNA e usado para a síntese do DNA iniciadorvoltada para a extremidade 5' do rRNA 18s. A identificação do primeironucleotídeo no transcrito, do mesmo iniciador foi usado para seqüenciar orRNA usando um protocolo com base em didesoxinucleotídeo convencional.Comparando o comprimento do ácido nucleico obtido na extensão deiniciador para os vários ácidos nucleicos obtidos na reação deseqüenciamento, a primeira base do rRNA 18s pôde ser identificada. Oprimeiro nucleotídeo transcrito (a posição +1) está na base 1809 da seqüênciade nucleotídeo apresentada como as Figuras 9A-C.

Para confirmar que as seqüências à montante deste nucleotídeocontinham elementos reguladores suficientes para direcionar a transcrição degenes à jusante, uma construção que compreende um gene EGFP sob ocontrole das seqüências reguladoras foi construído usando técnicas padrão. Ogene EGFP usado nesta construção é o gene EGFP descrito em Hoffmann etal. (2000) "Ambisense" approach for the generation of influenza A viras:vRNA and mRNA synthesis from a template Virology 15: 267(2): 310-7).Esta construção foi depois transfectada nas células MDCK usando técnicasconvencionais. 24 horas a seguir da transfecção, o RNA foi isolado dascélulas transfectadas e submetidas à análise de Northern blot com um DNArotulado que codifica um gene EGFP. A detecção de transcritosapropriadamente dimensionados confirmou que os plasmídeos transfectadosnas células MDCK continham as seqüências reguladoras que direcionaram atranscrição da seqüências 3' em relação aos elementos reguladores.7.11 Exemplo 11: Identificação de Elementos Reguladores da RNAPolimerase I Canina

Este exemplo descreve a identificação e caracterização de umelemento regulador da RNA polimerase I canina, o promotor da RNApolimerase I canina.

Os promotores da RNA pol I canina e outras regiõesregulatórias são identificados inspecionando-se as seqüências 5' em relaçãoao início de transcrição do rRNA 18s para as seqüências promotorascanônicas. Além disso, experimentos de deleção simples são realizados paraidentificar as seqüências requeridas para a iniciação transcricional eficiente.Em um tal experimento de deleção, um sítio de restrição é introduzido no ouidentificado em um plasmídeo que codifica a seqüência de nucleotídeo dasFiguras 9A-C pela mutagênese direcionada ao sítio. O sítio de restrição éintroduzido cerca de 50 nucleotídeos 3' do nucleotídeo +1 identificado acima,o nucleotídeo 1809 na seqüência apresentada como Figuras 9A-C. Um outrosítio de restrição 5' com a seqüência de nucleotídeo das Figuras 9A-C emrelação à posição +1 é identificado ou introduzido pela mutagênesedirecionada ao sítio.

Os vetores contendo estes sítios de restrição são depoislinearizados pela digestão com a enzima de restrição apropriada. Em seguida,uma nuclease apropriada (por exemplo, Exonuclease I, Exonuclease III eoutras) é usada para digerir os ácidos nucleicos lineares. Interrompendo-se areação em pontos no tempo diferentes, tamanhos diferentes de deleções nasregiões 5' em relação ao início de transcrição podem ser obtidos. Em seguida,os plasmídeos lineares são recircularizados e transformados em célulashospedeiras apropriadas, depois triados para identificar plasmídeos contendoas deleções desejadas. Alternativamente, os oligonucleotídeos apropriadospodem ser sintetizados que contêm as seqüências flanqueando uma deleção aser introduzida. Tais oligonucleotídeos são depois usados para fabricarderivados contendo deleções fora da alça usando técnicas padrão. Osoligonucleotídeos também podem ser usados para fabricar substituiçõesdirecionadas ao sítio usando técnicas padrão.

A capacidade dos mutantes de deleção ou substituiçãodiferentes para iniciar a transcrição é determinada transfectando-se osplasmídeos nas células MDCK e detectando o transcrito de RNA dosplasmídeos pela Northern Blot como descrito acima. Comparando-se asseqüências do plasmídeo que permitem a transcrição com aquelas que nãopermitem a transcrição, a seqüência do promotor da RNA polimerase I caninaé identificada. Técnicas convencionais são depois usadas para clonar umácido nucleico que codifica esta seqüência.

Alternativamente, o promotor da RNA pol I canina pode sermapeado a partir do ácido nucleico fornecido como a SEQ ID NO: 1 poroutros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando-se um método deminigenoma. Ver, por exemplo, Pedido U.S. publicado 20050266026 para ouso de um repórter de minigenoma da influenza designado pFlu-CAT, queconteve o gene CAT de sentido negativo clonado sob o controle do promotorda pol I. Também ver, o minigenoma EGFP em Hoffmann et al. (2000)"Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA andmRNA synthesis from a template Virology 15: 267(2): 310-7); e sistema deminigenoma CAT pPOLI-CAT-RT em Pleschka et al. (1996) J. Virol. 70(6):4188-4192.

Para usar este sistema para identificar e caracterizar asseqüências requeridas para o início transcricional eficiente, os mutantes dedeleção/substituição diferentes descritos acima ou outras subseqüências daSEQ ID NO: 1 são introduzidos no plasmídeo repórter selecionado (porexemplo, Pflu-CAT, o minigenoma EGFP) tal que a transcrição de uma cópiade sentido negativo do gene repórter depende da iniciação de transcrição peladeleção ou mutante de substituição. A construção contendo EGFP descritaacima pode ser convenientemente usada para fabricar tal deleção ou mutantesde substituição. Em seguida, a RNA polimerase dependente do RNA viralsintetiza mRNA de filamento positivo a partir do transcrito de RNA defilamento negativo do plasmídeo repórter. Este mRNA de filamento positivo édepois traduzido pelo mecanismo celular de modo que a atividade da proteínarepórter (EGFP ou CAT) pode ser detectada.

Nos ensaios, um conjunto de plasmídeos de expressão quecontém os cDNAs de PBl, PB2, PA e NP ou PBl, PA, NP (-PB2 como umcontrole negativo) é transfectado nas células MDCKjunto com um plasmídeoque compreende um minigenoma de EGFP do vírus da influenza A ou orepórter pFlu-CAT sob o controle de uma seqüência reguladora da pol Icanina putativa. As células são depois cultivadas sob condições que permitama transcrição e tradução da seqüência repórter.

A atividade da proteína repórter é detectada usando técnicasconvencionais. No caso de EGFP, as células transfectadas são observadas sobmicroscópio de contraste de fase ou microscópio de fluorescência em 48horas após a transfecção. Alternativamente, a citometria de fluxo é utilizadapara detectar a expressão de EGFP. Em ensaios com um minigenoma quecompreende o gene CAT, designado pFlu-CAT é utilizado para medir aatividade da polimerase. Em um tal ensaio, a expressão de CAT é medidadetectando-se a proteína CAT diretamente (por exemplo, por ELISA),detectando-se o mRNA que codifica CAT (por exemplo, pela Northern blot)ou detectando-se a atividade de CAT (por exemplo, detectando-se atransferência de grupos acetila radiorrotulados a um substrato apropriado)como um indicador da atividade de repórter.

Por exemplo, os fragmentos de DNA do clone MDCK queexibiu a atividade de promotor (ver os ensaios de extensão e transcrição deiniciador acima) foram clonados à montante de um inserto que conteve asregiões não traduzidas 5' e 3' da influenza fundidas às extremidades 5' e 3',respectivamente, de um gene EGFP de sentido negativo seguido por umterminador de Pol I de murino (Ver, a Figura 11). Três construções separadasforam fabricadas que diferiram nas seqüências de MDCK inseridas:seqüências de 1 a 1807 (-1), 1 a 1808 (+1) e 1 a 1809 (+2) da SEQ ID NO: 1.Cada uma destas construções foram separadamente combinadas complasmídeos de expressão para as proteínas de replicação da influenza (PB1,PB2, PA e NP) e eletroporadas nas células MDCK. Em 24 horas após aeletroporação, as células foram examinadas pela microscopia defluorescência. Como mostrado na Figura 12, todos os três fragmentos MDCK,-1, +1 e +2 (esquerda, meio e direita no topo, respectivamente) resultaram nafluorescência de EGFP enquanto a construção que carece da atividade dopromotor exibiu apenas fluorescência de fundo (esquerda fundo). Ofragmento 1-1808 (+1) resultou no nível mais alto de fluorescência. Umplasmídeo com um promotor CMV que direciona a expressão de EGFP éusado como um controle positivo (direita fundo).

As proteínas de replicação da influenza apenas replicaramextremidades do vRNA da influenza autênticas. O sinal de EGFP de cada umdos plasmídeos contendo uma seqüência da pol I de MDCK indica que ofragmento das seqüências reguladoras caninas contiveram a atividade depromotor que produziu um RNA com as extremidades do vRNA da influenzacorretas capazes de sustentar a replicação da influenza.

Outros ensaios úteis para identificar e caracterizar asseqüências reguladoras da RNA pol I canina incluem experimentos deimpressão de RNA. Em tais procedimentos, as moléculas de RNA quecompreendem, por exemplo, a seqüência apresentada nas Figuras 9A-C, sãocontatadas a uma ou mais subunidades da RNA polimerase I canina. As umaou mais subunidades da RNA pol I canina ligam-se às seqüências de RNAapropriadas de acordo com as suas afinidades particulares. Em seguida, umaRNAse, por exemplo, RNAse I, é usada para degradar o RNA desprotegidopelas uma ou mais subunidades da RNA polimerase canina. A RNAse édepois inativada e os fragmentos de RNA protegidos isolados da proteção deuma ou mais subunidades da RNA polimerase I. Os fragmentos isoladoscontêm seqüências ligadas pela uma ou mais subunidades da RNA polimeraseI e são candidatos excelentes para seqüências tendo atividade depromotor/realçador. Além disso, estes experimentos de impressão podem serrealizados na presença de subunidades diferentes da RNA polimerase I caninapara identificar quais subunidade liga esta seqüência de RNA. Estesexperimentos podem ajudar a determinar a atividade das seqüências ligadasdiferentes, por exemplo, comparando-se as seqüências das subunidades da polI polimerase canina diferentes da subunidades da RNA polimerase I de outrasespécies com seqüências e especificidades de ligação conhecidas.

As técnicas in vitro também podem ser usadas para monitorara transcrição de seqüências reguladoras da pol I canina putativas. Nestastécnicas, os mutantes de deleção/substituição diferentes descritos acima ououtras subseqüências da SEQ ID NO: 1 ou 26 estão operavelmente ligados aum transcrito de interesse. O conjunto de proteínas da RNA polimerase Icanina requeridas para a transcrição são depois adicionadas aos transcritos. Atranscrição eficaz é detectada detectando-se o transcrito de RNA fabricadopelas proteínas da RNA polimerase I canina, por exemplo, pela Northernblotting.

Ensaios similares podem ser usados a identificar outroselementos reguladores da RNA pol I canina, por exemplo, realçador,repressor ou outros elementos que afetam a transcrição pela RNA pol I. Nogeral, em tais ensaios, os níveis de expressão de construções repórter quecompreendem deleções, substituições ou subseqüências da SEQ ID NO.:l sãocomparados para expressar níveis de uma RNA pol I promotora mínimaidentificada como descrito acima. Comparando-se os níveis de expressão, apresença de um elemento associado com a transcrição realçada ou diminuídapode ser identificada.

7.12 Exemplo 12: Recuperação da Influenza em Células MDCK

Este exemplo descreve o uso de elementos reguladores daRNA pol I canina clonados no Exemplo 10 para recuperar o vírus dainfluenza em cultura de célula MDCK.

Oito vetores de expressão que codificam os RNAs genômicosvirais sob o controle do promotor da RNA pol I canina foram construídosusando técnicas da biologia molecular convencionais. Em particular, o vetorde expressão plasmídico pAD4000 (SEQ ID NO: 29, Figura 13) foiconstruído a partir de um vetor pAD3000 (Hoffman et al. PNAS (2002),99(17): 11411-11416, Figura 10) pela substituição dos 213 pares de base dasseqüências promotoras de Pol I humanas em pAD3000 com um fragmento de469 pares de base (bases 1 a 469 em pAD4000) a partir do subclone EcoRI-BamHI de MDCK (bases 1808 a 1340 da SEQ ID NO: 1). Nota: o fragmentode 469 pares de base na Figura 13 é mostrada como as bases 1 a 469, mas naorientação de complemento reversa. Os 469 pares de base do fragmento deMDCK contêm um promotor funcional da Pol I canina. Além disso, aseqüência ligadora de 18 pares de base em pAD3000AGGAGACGGTACCGTC TC (SEQ ID NO: 30) foi substituída com aseqüência ligadora de 24 pares de baseAGAGTCTTCTCGAGTAGAAGACCG (SEQ ID NO: 31) em pAD4000.

Oito segmentos da influenza que codificam o genoma MDV B,dois dos quais (o NS, SEQ ID NO: 32 e PB1, SEQ ID NO: 40) contiverammutações silenciosas (SEQ ID NOS: 33 e 41, respectivamente e Figura 16)foram clonados em oito vetores de expressão de pAD4000 separados (sob ocontrole de um promotor funcional da Pol I canina). Os oito vetores deexpressão foram depois eletroporados nas células MDCK em meio Opti-ΜΕΜ® I isento de soro (Invitrogen) e os sobrenadantes das células foramusados para inocular ovos. Depois de 72 horas de incubação a 33 0C o vírusfoi colhido de ovos positivos em HA. As reações de RT-PCR foramrealizadas (ver, seqüências iniciadoras (SEQ ID NOS: 34 a 39) e as posiçõesde recozimento nas Figuras 14 e 15) no RNA extraído do vírus seguido pelaanálise de seqüência de nucleotídeo dos produtos de PCR. Com base napresença de segmentos PBl e NS contendo as mutações silenciosas, foideterminado que o vírus da influenza infeccioso vivo foi recuperado emcélulas MDCK.

Surpreendentemente títulos dos vírus recuperados altos (tantode MDV-B quanto de MDV-Bm [MDV-B com mutações silenciosas]) foramdescobertos nos sobrenadantes. Ver, a Tabela 6. Por exemplo, 4 a 5 Iogi0PFU/ml de vírus foram medidos no dia 3. Tipicamente, os títulos de vírusrecuperados usando sistemas promotores da poli humana com base nascélulas Vero são apenas <100 pfu nos dias 2 a 3. Conseqüentemente, osistema de recuperação de plasmídeo da poli canina aqui descrito parecemuito mais eficiente que a tecnologia de recuperação de plasmídeo existentedescrita por outros.

Tabela 6

<table>table see original document page 135</column></row><table>

A robustez do sistema de recuperação de plasmídeo da policanina foi demonstrada pela recuperação de um vírus doador mestre ca tantoda cepa B quanto de uma cepa A (MDV), assim como, numerososrecontaminantes da cepa AeB. Para os recontaminantes os seis segmentos degene inertes do MDV apropriado (cepa A ou B) foram combinados com ossegmentos HA e NA de uma cepa A dos seguintes subtipos: H1N1, H2N2,H3N2, H5N1 ou uma cepa B das linhagens Yamagata ou B/Victoria. As cepasde MDV recuperadas e recontaminantes estão resumidas na Tabela 7. Estesvírus foram recuperados essencialmente como descrito acima. Os segmentosda influenza que codificam os genomas da cepa A ou B foram clonados emvetores de expressão pAD4000 separados (que compreende o promotorfuncional da Pol I canina descrita acima). Os oitos vetores de expressão quecodificam todos os oito segmentos da influenza da cepa a ser recuperadaforam depois transfectados nas células MDCK em meio Opti-MEM® I isentode soro (Invitrogen) e os sobrenadantes das células foram usados parainocular ovos. Nestes experimentos a transfecção foi realizada usando umreagente de transfecção não lipossômico (PromoFectin Cat. N° PK-CT2000,PromoKine, Alemanha), seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante.Depois de 72 horas de incubação a 33 °C o vírus foi colhido de ovos positivosem HA.

Tabela 7

<table>table see original document page 136</column></row><table>

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algunsdetalhes para os propósitos de clareza e entendimento, estará claro para umapessoa habilitada na técnica a partir de uma leitura desta divulgação quevárias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas sem divergir doverdadeiro escopo da invenção. Por exemplo, todas as técnicas e aparelhosdescritos acima podem ser usados em várias combinações. Todas aspublicações, patentes, pedidos de patente ou outros documentos citados nestepedido são incorporados por referência em sua totalidade para todos ospropósitos até o mesmo grau como se cada publicação individual, patente,pedido de patente ou outro documento fossem individualmente indicadoscomo sendo incorporados por referência para todos os propósitos. Além disso,o pedido de patente PCT Ser. N0 PCT/US2006/023867, depositado em 20 dejunho de 2006; pedidos de patente U.S. Ser. Nos 11/455.734, depositado em20 de junho de 2006; 11/501.067, depositado em 9 de agosto de 2006;Pedidos de Patente Provisórios U.S. Nos: 60/793.522, depositado em 19 deabril de 2006; U.S. 60/793.525, depositado em 19 de abril de 2006; U.S.60/702.006, depositado em 26 de julho de 2005; U.S. 60/699.556, depositadoem 15 de julho de 2005; U.S. 60/699.555, depositado em 15 de julho de 2005;U.S. 60/692.965 depositado em 21 de junho de 2005; e U.S. 60/692.978depositado em 21 de junho de 2005 são incorporados por referência em suatotalidade para todos os propósitos.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> MedImmune Vaccines, IncDuke, GregoryKemble, GeorgeYoung, JamesWang, Zhaoti

<120> Métodos e composições para expressar RNA viral de sentido

negativo em células caninas.

<130> FL412PCT2

<150> 11/501,067

<151> 2007-08-09

<150> 11/455,734

<151> 2006-06-20

<150> 60/793,522

<151> 2006-04-19

<150> 60/793,525

<151> 2006-04-19

<160> 41

<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 3537<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 1

aattctggag aaacagattg tgttataaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 60

gagaaaatcc ttatgttctt tgagcctccc ctccccccca gaattgagtt cctcttccac 120

gacctcttct cattcaaccc aatagacaag tatttggggg ggggggtcag gtcccagacg 180

ctgagagggt ggaggtgaag gtggtgcggg gggggggggg cacaccgtcc tctccagcgc 240

ctttggttca gacctccttc gtgacctccc tccctccctc cctccctcct ccctcctcct 300

cctcctccct cttcgtctta taaatatata aataaaatcc taaagaaaag aaaaagaaaa 360

aaaaaaaaag gaaggacacg agaaaaaacg gtgcatccgt tgccgtcctg agagtcctcg 420

cctggtttcg gctctacgtt ccctccctga cctcggaaac gtgcctgagt cgtcccggga 480

gccccgcgcg gcgagcgcga ccccctttcg ggcggcagcg ggcccggacg gacggacgga 54 0

cggacggacg ggttttccaa ggctcccccg ccccgggagg acgggggttc gcggtgcgcg 600

gccgtgtgct ccggggccct ccgccgtccc cgggccgaga ggcgagatcc gaggcgcctg 660

acggcctcgc cgcccggatc tgtcccgctg tcgttcgcgc cggttgtcgg gtgccactgg 720

cggccgcttt tatagagcgt gtccctccgg aggctcggcg gcgacaggca aggaacagct 780

ttggtgtcgg tttcccgggg ccgagttcca ggaggagggc ggctccggcg cgagcgtctg 840

tcgccggggc ctcggcgcga tgcgctcgcc ggagattgga ctccggagct gcgagggagt 900

gtcgccgtcg cccgtgtcgc ccgtgtccgc tccgcctcgc tcccggagga ggccgtgcgg 960

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tgggcgcctc gggggcgggg gacagggtgt gtcccgccgt ccgtcctgtg gctccgggcg 1080

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cgtgtggggg tcccgggcgt cggacgcgat tttctcccct ttttccgagg cccgctgcgg 1260

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gcgtccggcc ccggtggcga ttcccggtga ggctgcctct gccgcgcgtg gccctccacc 1380

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ctcccggaga tcactggctt ggcggcgtgg cggcgtggcg gcgtggcggc gtggcggcgt 1560

ggcggcgtgg cgtctccacc gaccgcgtat cgcccctcct cccctccccc cccccccccg 1620

ttccctgggt cgaccagata gccctggggg ctccgtgggg tgggggtggg ggggcgccgt 1680

ggggcaggtt ttggggacag ttggccgtgt cacggtcccg ggaggtcgcg gtgacctgtg 1740

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aggtaggtgc tgacacgttg tgtttcggcg acaggcagac agacgacagg cagacgtaaa 18 60

agacagccgg tccgtccgtc gctcgcctta gagatgtggg cctctgggcg cgggtggggt 1920

tccgggcttg accgcgcggc cgagccggtc cctgtcctcg ctcgctggag cctgagccgt 1980ccgcctgggc ctgcgcgccg gctctcgtgc tggactccag gtggcccggg tcgcggtgtc 2040

gccctccggt ctccggcacc cgagggaggg cggtgtgggc aggtggcggt gggtctttta 2100cccccgtgcg ctccatgccg tgggcacccg gccgttggcc gtgacaaccc ctgtctcgca 2160

aggctccgtg ccgcgtgtca ggcgtccccc gctgtgtctg gggttgtccg gtcgctcctg 2220cccccccccc cccgggggtc gaggggcttggccgtcctcg ctgggctttt gctcctcgggatcgatcgat gtggtgatct cgtgctctccgacgggcgtc cacggcggat gcgaccgctcccggctcctc cgcgcccggc cgtcgtggcgggtggtgcgg actccggccc gaccccggccgaccggggtc ctcggacgcg gcggacactcgtggcgagcg gccctcccct cctccgcgggcgcccggcct gggcgcgctt gagcgcgttgctccaggtcg cctcaggtgc ctgaggccgacccctcgggc tgccgccgcc gtcgtcggcggcaagggagg cgcacccgtg cccctggcggtcctctcctc ccccctcgcg cgccggcgggaggacttggc ggggctcgtg aggccgcggccgaggggctg cccctctctc cggcacgggtgctcgcggga ggcggggagc tctctcctctcgaggcgggg gtggcgtcct cgagggggcacctgtccctt gccggagatc cgccccccgcctggtggggc ccgtttggga ggacgaacggttctctagcg atccgagagg gtgccttgggctgcgcgtgt agtgtggcca gcgacgcggggagtgccgct ctttgcctac ctacccgcgc<210> 2<211> 333<212> DNA

<213> Canis familiaris<400> 2

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<213> Canis familiaris<4 00> 3

gggctccgtg gggtgggggt gggggggcgctgtcacggtc ccgggaggtc gcggtgacctttttcttgcc cgagatgaac attttttgtt<210> 4<211> 140<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 4

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<210> 5

<211> 114

<212> DNA

<213> Canis familiaris<400> 5

tggccgtgtc acggtcccgg gaggtcgcggcggttatttt cttgcccgag atgaacattt<210> 6<211> 85<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 6

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ccggtgaggcaagccccctctgggccgggcttctcgttctggtgcgcgggtcccgccttctcgccggcctggagggccggcgcccggcccgcggtggcgttgtccgaggagggcgcgggcgggtgggtgggggccgggcccgtgtccccggggcggtgacccggccgcgacccgcgagccgtggggcgatgtaccggagcgttggactcctgcgctcccc

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cactggcttggtctccaccgaccagatagcggggacagttcggcaggcgcaca

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gcggcgtggc ggcgtggcgg 60acccgtatcg cccctcctcc 120cctgggggct ccgtggggtg 180ggccgtgtca cggtcccggg 240ggttattttc ttgcccgaga 300 333

60120168

60120140

60114

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6085<210> 7<211> 59<212> DNA

<213> Canis familiaris<400> 7

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<210> 8<211> 164<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 8

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<210> 9<211> 137<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 9

ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60

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<210> 10<211> 109<212> DNA

<213> Canis familiaris<400> 10

ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60

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<210> 11<211> 55<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 11

ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgt 55

<210> 12<211> 299<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 12

ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60

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<210> 13<211> 244<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 13

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<210> 14<211> 190<212> DNA

<213> Canis familiaris<400> 14

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<210> 15<211> 134<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 15

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<210> 16<211> 106<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 16

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<210> 17<211> 80<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 17

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<210> 18<211> 217<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 18

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<213> Canis familiaris<4 00> 19

tcgcggtgac ctgtggctgg tccccgccgg caggcgcggt tattttcttg cccgag 56

<210> 20<211> 336<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 20

ttgatgattt ttcaaagtct cctcccggag atcactggct tggcggcgtg gcggcgtggc 60

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<210> 21<211> 167<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 21

ttgatgattt ttcaaagtct cctcccggag atcactggct tggcggcgtg gcggcgtggc 60

ggcgtggcgg cgtggcggcg tggcggcgtg gcgtctccac cgaccgcgta tcgcccctcc 120tcccctcccc cccccccccc gttccctggg tcgaccagat agccctg 167

<210> 22<211> 140<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 22

ttgatgattt ttcaaagtct cctcccggag atcactggct tggcggcgtg gcggcgtggc 60ggcgtggcgg cgtggcggcg tggcggcgtg

tcccctcccc cccccccccc

<210> 23

<211> 112

<212> DNA

<213> Canis familiaris<400> 23

ttgatgattt ttcaaagtct cctcccggagggcgtggcgg cgtggcggcg tggcggcgtg<210> 24<211> 57<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 24

ttgatgattt ttcaaagtct cctcccggag<210> 25<211> 302<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 25

ttgatgattt ttcaaagtct cctcccggagggcgtggcgg cgtggcggcg tggcggcgtgtcccctcccc cccccccccc gttccctggggtgggggtgg gggggcgccg tggggcaggtgggaggtcgc ggtgacctgt ggctggtcccag

<210> 26<211> 469<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 26

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<213> Canis familiaris<4 00> 27

ggcggcgtgg cggcgtggcg gcgtggcggctcctcccctc cccccccccc cccgttccctggggtggggg tgggggggcg ccgtggggcacccgggaggt cgcggtgacc tgtggctggtccgag<210> 28<211> 218<212> DNA

<213> Canis familiaris<4 00> 28

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gcaggttttg gggacagttg gccgtgtcac

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<210> 29

<211> 3100

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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120140

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60112

57

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60120180240300360420469

60120180240245

60120180218<223> plasmídeo<400> 29

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<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

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<212><213><220><223><400>

ligador sintét

ICO

aggagacggt accgtctc<210> 31<211> 24<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> ligador sintético<400> 31

agagtcttct cgagtagaag accg 24

<210> 32<211> 119<212> DNA

<213> Virus B de influenza<400> 32

aaaaattcct caaatagcaa ctgtccaaac tgcaattgga ccgattaccc tccaacacca 60

ggaaagtgcc ttgatgacat agaagaagaa ccggagaatg ttgatgaccc aactgaaat 119

<210> 33<211> 119<212> DNA

<213> Virus B de inflaenza<400> 33

aaaaattcct caaatagcaa ctgtccaaac tgcaattgga ccgattaccc tccaacgcca 60

ggaaagtgcc ttgatgacat agaagaagaa ccggagaatg ttgatgaccc aactgaaat 119

<210> 34<211> 20<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciador sintético<400> 34

ggcactaatg gtcacaactg 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador sintético<400> 35

atcagagggt ttgtattagt ag 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador sintético<400> 36

tgggctgtct ctggttattc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador sintético<400> 37

tctctttatg aggaaaccct 20

<210> 38<211> 20<212> DNA

<213> Canis familiaris<400> 38

gtgagcctga aagtaaaagg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> iniciador sintético<400> 39

gcaacaagtt tagcaacaag 20

<210> 40<211> 423<212> DNA

<213> Virus B de influenza<400> 40

tcattgattc attggacaaa cctgaaatga ctttcttctc ggtaaagaat ataaagaaaa 60

aattgcctgc taaaaacaga aagggtttcc tcataaagag aataccaatg aaggtaaaag 120acagaataac cagagtggaa tacatcaaaa gagcattatc attaaacaca atgacaaaag 180atgctgaaag aggcaaacta aaaagaagag caattgccac cgctgggata caaatcagag 240ggtttgtatt agtagttgaa aacttggcta aaaatatctg tgaaaatcta gaacaaagtg 300gtttgccagt aggtgggaac gagaagaagg ccaaactgtc aaatgcagtg gccaaaatgc 360tcagtaactg cccaccagga gggatcagca tgacagtgac aggagacaat actaaatgga 420atg 423

<210> 41<211> 423<212> DNA

<213> Virus B de influenza<4 00> 41

tcattgattc attggacaaa cctgaaatga ccttcttctc ggtaaagaat ataaagaaaa 60

aattgcctgc taaaaacaga aagggtttcc tcataaagag aataccaatg aaggtaaaag 120acagaataac cagagtggaa tacatcaaaa gagcattatc attaaacaca atgacaaaag 180atgctgaaag aggcaaacta aaaagaagag caattgccac cgctgggata caaatcagag 240ggtttgtatt agtagttgaa aacttggcta aaaatatctg tgaaaatcta gaacaaagtg 300gtttgccagt aggtgggaac gagaagaagg ccaaactgtc aaatgcagtg gccaaaatgc 360tcagtaactg cccaccagga gggatcagca tgacggtgac aggagacaat actaaatgga 420atg

Claims

1. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de quecompreende uma seqüência reguladora da RNA polimerase I canina.

2. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a seqüência reguladora é um promotor.

3. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a seqüência reguladora da RNA polimerase Icompreende os nucleotídeos de 1 a 469 da SEQ ID NO: 26, o complementoda mesma, o complemento reverso da mesma ou um fragmentofuncionalmente ativo da mesma.

4. Ácido nucleico de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3,caracterizado pelo fato de que a seqüência reguladora é operavelmente ligadaao cDNA que codifica um RNA genômico viral de filamento negativo ou ocRNA correspondente.

5. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda umaseqüência de terminação de transcrição.

6. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o RNA genômico viral de filamento negativo éum RNA genômico da influenza.

7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de quecompreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 6.

8. Método para produzir um RNA genômico da influenza,caracterizado pelo fato de que compreende transcrever o ácido nucleico comodefinido na reivindicação 6 em uma célula, produzindo deste modo um RNAgenômico da influenza.

9. Método para produzir um vírus da influenza recombinante,caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula canina quecompreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 7 e um oumais vetores de expressão que expressem um mRNA que codifica um ou maispolipeptídeo da influenza selecionado do grupo que consiste de: PB2, PB1,PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NSl e NS2; e isolar o vírus da influenzarecombinante.

10. Método para produzir um vírus da influenza recombinante,caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em uma população devetores de expressão de células caninas capazes de expressar nas ditas célulassegmentos de vRNA genômico para fornecer os segmentos de vRNAgenômico completos do dito vírus, em que os ditos vetores de expressãocompreendem os nucleotídeos de 1 a 469 da SEQ ID NO: 26 ou umfragmento funcionalmente ativo da mesma; (b) introduzir nas ditas célulasvetores de expressão capazes de expressar mRNA que codifica um ou maispolipeptídeos do dito vírus; e (c) cultivar as ditas células por meio do qual aspartículas virais da influenza são produzidas.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o título das partículas virais da influenza produzidas nocultivo das ditas células por 48 a 72 horas é de pelo menos 1,0 χ IO4 PFU/ml.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o título das partículas da influenza produzidas no cultivo dasditas células por 48 a 72 horas é de pelo menos 1,0 χ IO5 PFU/ml.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que as partículas virais da influenza produzidas são infecciosas.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que as partículas virais da influenza produzidas são infecciosas.

15. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o vetorde expressão como definido na reivindicação 7.

16. Célula de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que a célula é uma célula canina.

17. Célula canina de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que a célula canina é uma célula renal.

18. Célula renal canina de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que a célula renal canina é uma célula MDCK.

19. Método para gerar em células caninas cultivadas um vírusde RNA de filamento negativo segmentado recombinante tendo mais do que 3segmentos de vRNA genômico, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) introduzir em uma população de células caninas um primeiro conjunto devetores de expressão capazes de expressar nas ditas células segmentos devRNA genômico para fornecer os segmentos de vRNA genômico completodo dito vírus; (b) introduzir nas ditas células um segundo conjunto de vetoresde expressão capazes de expressar mRNA que codifica um ou maispolipeptídeos do dito vírus; e (c) cultivar as ditas células por meio das quaispartículas virais são produzidas.

20. Método para produzir um vírus da influenza recombinante,caracterizado pelo fato de que compreende i) introduzir em uma população devetores de expressão de células caninasa) capazes de expressar nas ditas células segmentos de vRNAgenômico para fornecer os segmentos de vRNA genômico completos do ditovírus, em que um ou mais dos ditos vetores de expressão compreendemnucleotídeos de 1 a 469 da SEQ ID NO: 26 ou um fragmento funcionalmenteativo da mesma, eb) também capazes de expressar nas ditas células mRNA quecodifica um ou mais polipeptídeo da influenza selecionado do grupo queconsiste de: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1, e NS2; eii) cultivar as ditas células por meio das quais partículas viraisda influenza são produzidas.

21. Método de acordo com as reivindicações 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que o título das partículas virais da influenzaproduzidas no cultivo das ditas células por 48 a 72 horas é de pelo menos 1,0χ 10^4 PFU/ml.

22. Método de acordo com as reivindicações 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que o título das partículas virais da influenzaproduzidas no cultivo das ditas células por 48 a 72 horas é de pelo menos 1,0χ 10^5 PFU/ml.

23. Vírus da influenza, caracterizados pelo fato de que sãoproduzidos pelo método como definido na reivindicação 20.

24. Método de acordo com as reivindicações 10, 19, 20,caracterizado pelo fato de que o vírus auxiliar é usado.

25. Vetor de expressão pAD4000, caracterizado pelo fato deque é apresentado como a SEQ ID NO: 29.

26. Seqüência de ácido nucleico isolado, caracterizada pelofato de que compreende pelo menos 250 ou pelo menos 350 ou pelo menos-450 nucleotídeos contíguos da seqüência apresentada como a SEQ ID NO: 26,em que a dita seqüência de ácido nucleico quando operavelmente ligada aocDNA que codifica um vRNA da influenza e introduzido em uma célulaMDCK é capaz de direcionar a expressão do dito vRNA da influenza.

27. Seqüência de ácido nucleico isolado, caracterizada pelofato de que compreende um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % deidentidade com a seqüência de nucleotídeo apresentada como a SEQ ID NO:-26, em que a dita seqüência de ácido nucleico quando operavelmente ligadaao cDNA que codifica um vRNA da influenza e introduzida em uma célulaMDCK é capaz de direcionar a expressão do dito vRNA da influenza.

28. Seqüência de ácido nucleico isolado, caracterizada pelofato de que compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições dehibridização severas a um ácido nucleico selecionado do grupo que consistede: SEQ ID Nos 1 a 26, em que a dita seqüência de ácido nucleico quandooperavelmente ligada ao cDNA que codifica um vRNA da influenza eintroduzida em uma célula MDCK é capaz de direcionar a expressão do ditovRNA da influenza.

29. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de quecompreende o ácido nucleico como definido nas reivindicações 26, 27 ou 28.

30. Método para produzir um RNA genômico da influenza,caracterizado pelo fato de que compreende introduzir o vetor de expressãocomo definido na reivindicação 29 em uma célula produzindo deste modo umRNA genômico da influenza.

31. Método para produzir um RNA genômico da influenza,caracterizado pelo fato de que compreende introduzir o vetor de expressãocomo definido na reivindicação 7 em uma célula produzindo deste modo umRNA genômico da influenza.