BRPI0710636A2 - antagonistas de cxcl 31 e o uso dos mesmos para o tratamento de doenças inflamatórias - Google Patents

Abstract

ANTAGONISTAS DE CXCL13 E O USO DOS MESMOS PARA O TRATAMENTO DE DOENçAS INFLAMATóRIAS A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de doenças relacionadas com a atividade de OXCLi 3, utilizando antagonistas de CXCL13 e, opcionalmente, antagonistas de TNFu, como anticorpos, incluindo partes especificadas ou variantes, polipeptídeos, polinucleotídeos, sIRNA, shRNA, ribozimas e DNAzimas. As doenças relacionadas com atividade de CXCL13 incluem doenças inflamatórias, como doenças pulmonares, por exemplo, asma, enfisema e DPOC, e lúpus eritematoso sistêmico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTAGONISTASDE CXCL13 E O USO DOS MESMOS PARA O TRATAMENTO DE DOEN-ÇAS INFLAM ATÓRIAS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a antagonistas de CXCL13 e a ummétodo de uso destes antagonistas para tratamento de doenças, sintomas econdições pulmonares, bem como de doenças e condições relacionadas. Ainvenção refere-se mais especificamente a métodos de tratamento destasdoenças pelo uso de antagonistas de CXCL13, isoladamente ou associado aantagonistas de TNFα, como RNA interferente, DNAzimas e anticorpos dire-cionados contra CXCL13, incluindo partes ou variantes especificadas, espe-cíficas para pelo menos uma proteína ou fragmento da mesma, em quanti-dade que efetivamente iniba a atividade da CXCL13. A presente invençãorefere-se também a um método de uso de antagonistas de CXCL13 e anta-gonistas de TNFa para tratar um animal com outras doenças inflamatórias,como lúpus eritematoso sistêmico.

Antecedentes da Invenção

Asma é uma doença complexa crônica com componente genéti-co e ambiental (1). É caracterizada por obstrução reversível, hiper-responsi-vidade, inflamação e remodelagem das vias aéreas (2). A asma afeta umnúmero estimado de 15 milhões de americanos sendo que a morbidez emortalidade associadas à mesma estão crescendo em países industrializa-dos (3,4). Na asma alérgica, a inflamação nas vias aéreas está associada àinfiltração na mucosa por um subconjunto de células T "helper" (Th)2, com-posto por células T CD4+ e eosinófilos (5,6). A interação entre estas célulasleva à produção de vários mediadores pró-ínflamatórios, envolvidos na pato-gênese da asma (7,8). Existem outras formas de asma que são induzidaspor exercício, vírus, aspirina e ocupação. Embora o mecanismo responsávelpor estas formas de asma possa envolver linfócitos Th2 linfócitos e citocinas,talvez este seja desencadeado de modo diferente (9-12). Muitas citocinas equimiocinas estão envolvidas na patogênese da asma (13,14). Especifica-mente, as citocinas derivadas de Th2 (interleucina 4, 5, 9 e 13) desempe-nham papel importante em doenças alérgicas, incluindo asma.

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma inflamaçãopulmonar crônica caracterizada pela infiltração de neutrófilos, macrófagos,células B e T. Estas células imunocompetentes são ativadas por uma varie-dade de citocinas e quimiocinas que são liberadas no pulmão em resposta àexposição prolongada a gases e partículas tóxicas (15). Bronquite e enfise-ma, juntamente com obstrução irreversível do fluxo aéreo, são as manifesta-ções clínicas da doença. Não há agentes conhecidos que retardem o declí-nio acelerado na função pulmonar que caracteriza DOPC.

Recentemente, foi observado que a progressão da DPOC estavafortemente associada à infiltração no parênquima por células imunes infla-matórias inatas e de adaptação que formam um folículo linfóide ectópicocontendo um centro germinativo. A presença do folículo linfóide foi associa-da a um processo de remodelação que resultava em espessamento das pe-quenas paredes distais das vias aéreas (16). Esse resultado sugere enfati-camente o possível papel patológico dos folículos linfóides ectópicos na DOPC.

Empenhando-se para identificar novos genes envolvidos na pa-togênese da asma, pesquisadores utilizaram a tecnologia de microarranjosde DNA para analisar perfis de genes que se expressam de modo diferenci-ado em modelos animais de asma (17,18). A tecnologia de microarranjos éuma ferramenta poderosa uma vez que permite a análise da expressão demilhares de genes simultaneamente, além de poder ser automatizada permi-tindo uma configuração de alto eficiência. Em doenças multifatoriais, os re-sultados obtidos por microarranjos fornecem um perfil de expressão gênicaque pode provar ser muito útil na concepção de novas terapias. Além disso,esta tecnologia pode demonstrar ser de grande eficiência na identificação denovos genes e observação de genes de função desconhecida (19).

CXCL13 (também conhecida como BLC (quimiocina "hominçf'residente em células B) ou BCA-1 (quimiocina 1 promotora de atração decélulas B) ou Angie 2) é o fator quimiotático que mais atrai seletivamentecélulas B. Ela promove também a migração de certas células T e macrófa-gos por meio do receptor CXCR5 (20). CXCL13 é expressa nos folículos dasplacas de Peyer, baço e linfonodos, e acredita-se que seja importante nodesenvolvimento de folículos e homeostase (21).

Foi observado durante anos que, nos locais de inflamação crôni-ca, o arranjo do infiltrado inflamatório (células Τ, B e estromais) compartilhamuitas características arquitetônicas com o tecido linfóide que forma estrutu-ras também conhecidas como folículos linfóides ectópicos (21). Ademais, aalta produção ectópica de CXCL13 está associada a acúmulo de linfócito eformação de folículo linfóide ectópico em doenças inflamatórias crônicas,como artrite reumatóide (21), síndrome de Sjogren (22), várias formas delúpus, como lúpus eritematoso sistêmico (23, 24), colite ulcerativa (25, 26),esclerose múltipla (27-29), diabetes tipo I (30-32) e doenças autoimunes datiróide (33, 34). Embora o papel patogênico exato dos folículos linfóides ec-tópicos não seja claro, evidências sugerem a sua importância na evoluçãode inflamação aguda para crônica persistente por permitir o acúmulo de Iin-fócitos no local onde o tecido está inflamado (35). Por conseguinte, o rompi-mento ou eliminação dos folículos linfóides ectópicos proporcionaria umanova abordagem terapêutica para controlar doenças inflamatórias crônicas.CXCL13 é um agente terapêutico ideal em decorrência de seu alto nível deexpressão nos folículos linfóides ectópicos e sua participação na manuten-ção de suas microestruturas e na atração de células B.

Lúpus eritematoso sistêmico (LES ou lúpus) é uma doença auto-imune crônica potencialmente debilitante e às vezes fatal, uma vez que osistema imune ataca as células e tecidos do corpo, resultando em inflama-ção e dano celular. LES pode afetar qualquer parte do corpo, porém, provo-ca mais freqüentemente lesões no coração, articulações, pele, pulmões, va-sos sangüíneos, fígado, rins e sistema nervoso.

O gene da CXCL13 gene (N° de acesso do GenBank: NM_006419,SEQ ID NO:1) reside no cromossomo humano 4q21. CXCL13 pertence à famí-lia CXC de quimiocinas. CXCL13 é fundamental para a formação/desenvol-vimento de órgãos linfóides, formação de folículos de célula B e recrutamen-to de células B. Os tecidos inflamados de múltiplas doenças inflamatóriascrônicas exibem alto nível de produção ectópica desta quimiocina, a qualacredita-se que desempenhe um papel importante na manutenção local deativação e inflamação por células B e T.

A expressão gênica pode ser modulada em várias maneiras dife-rentes, inclusive pelo uso de siRNAs, shRNAs, moléculas anti-sentido eDNAzimas. SiRNAs e shRNAs atuam através da via do RNAi e foram utiliza-dos com êxito para suprimir a expressão de genes. RNAi foi descoberto ini-cialmente em larvas, e o fenômeno de silenciamento gênico, relacionadocom dsRNA, foi relatado pela primeira vez em plantas por Fire e Mello, esupostamente uma via pela qual, células vegetais combatem infecção porvírus de RNA. Nesta via, o dsRNA longo produzido pelo vírus é processadoem fragmentos menores de 21-25 bp em extensão, por uma enzima similar aDICER e, em seguida a molécula de dupla fita é desenrolada e introduzida nocomplexo de RNA indutor de silenciamento (RISC). Uma via similar foi identi-ficada em células de mamíferos, notadamente com a diferença de que a ex-tensão das moléculas de dsRNA precisa conter menos que 30 bp para evitara indução da assim chamada resposta de interíeron, que não é específicopara o gene e que leva à interrupção total de síntese protéica na célula.

É possível sintetizar siRNAs que tenham como alvo específicoum único gene e que podem ser facilmente liberados para células in vitro ein vivo. ShRNAs são os equivalentes a DNA de moléculas de siRNA e pos-suem a vantagem de ser incorporados no genoma das células e serem, emseguida, replicados durante cada ciclo mitótico.

DNAzimas foram utilizadas também para modular expressãogênica. DNAzimas são moléculas de DNA com ação catalisadora que fazema clivagem de RNA de fita simples. São altamente seletivas para a seqüên-cia-alvo de RNA e, em virtude dessa seleção, podem ser utilizadas para ini-bir a produção de genes específicos, usando como alvo o RNA mensageiro.

De acordo com o mesmo, é necessário identificar e caracterizarnovos métodos para o diagnóstico e tratamento de doenças pulmonares,relacionadas com CXCL13, como asma, e doenças e condições relaciona-das. Adicionalmente, é necessário identificar e caracterizar novos métodospara tratamento de doenças como lúpus eritematoso sistêmico.Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a agonistas e/ou antagonistas daCXCL13 ou de seu receptor, CXCR5, e/ou de uma ou ambas as suas ativi-dades (doravante, "antagonistas de CXCL13"), e a um método para o uso deantagonistas de CXCL13, incluindo anticorpos direcionados contra CXCL13,e partes ou variantes especificadas do mesmo, específicos para pelo menosuma proteína ou fragmento desta da CXCL13, para tratamento de doençaspulmonares relacionadas. Estes antagonistas de CXCL13 podem ser admi-nistrados junto com antagonistas de TNFa1 como anticorpos contra TNFa1por exemplo, infliximab et al. Um antagonista de CXCL13, como um anticor-po monoclonal, inibe o recrutamento local de células BeTe ativação sub-seqüente, proporcionando uma nova estratégia para controlar doenças in-flamatórias crônicas mediadas por sistema imune.

Em uma concretização, o antagonista de CXCL13 é um anticor-po que se liga especificamente à CXCL13 ou ao seu receptor. Uma vanta-gem especial destes anticorpos é que estes são capazes de se ligarem àCXCL13 ou a seu receptor de maneira que impeça a sua ação. O método dapresente invenção emprega, portanto, anticorpos com a propriedade desejá-vel de neutralização que os torna idealmente adequados para tratamentoterapêutico e preventivo de estados de doença associados a várias doençaspulmonares relacionadas em pacientes humanos ou não humanos. De acor-do com o mesmo, a presente invenção é direcionada a um método de trata-mento de doença ou condição pulmonar relacionada em um paciente emnecessidade deste tratamento, o qual compreende a administração para opaciente de uma quantidade de anticorpo que neutraliza CXCL13 para inibira doença ou condição pulmonar relacionada.

Em uma outra característica, a invenção provê métodos paramodular a atividade de CXCL13 ou de seu receptor, compreendendo o con-tato de uma célula com um agente (por exemplo, antagonista ou agonista)que modula (inibe ou intensifica) a atividade ou expressão de CXCL13 ou deseu receptor, de forma que a atividade ou expressão na célula é modulada.Em uma concretização preferida, o agente é um anticorpo que se liga espe-cificamente à CXCL13 ou a seu receptor. Em outras concretizações, o mo-dulador é um peptídeo, peptídeo mimético ou outra molécula pequena.

Em uma outra concretização, a presente invenção é direcionadaa um método de tratamento de doença ou condição pulmonar relacionadaem um paciente em necessidade deste tratamento, o qual compreende aadministração, para o paciente, de uma quantidade de anticorpo que neutra-liza CXCL13 ou de outro antagonista, juntamente com um ou mais antago-nistas de TNFa para inibir a doença ou condição pulmonar relacionada.

A presente invenção provê também métodos de tratamento deum sujeito com doença pulmonar ou relacionada, em que a doença pode seratenuada por modulação do nível ou atividade da CXCL13. A presente in-venção provê também métodos de tratamento de um sujeito com uma doen-ça caracterizada por atividade anormal de CXCL13, ou de seu polinucleotí-deo codificador, pela administração para o sujeito de um agente que modulea atividade ou a expressão de CXCL13.

Em uma concretização, o modulador é um polipeptídeo ou com-posto de molécula pequena. Em uma outra concretização, o modulador é umpolinucleotídeo. Em uma concretização especial, o antagonista de CXCL13 éuma molécula de siRNA, molécula de shRNA ou uma DNAzima capaz deimpedir a produção celular de CXCL13.

Uma outra característica da invenção é um método para o trata-mento de um animal com lúpus eritematoso sistêmico, compreendendo ofornecimento de um antagonista de CXCL-13 para o animal, além de o for-necimento de um antagonista de TNF alfa para o animal; em que cada anta-gonista é fornecido em quantidade que efetivamente causa diminuição emum sintoma de lúpus eritematoso sistêmico no animal. Em uma concretiza-ção deste método, o antagonista de CXCL-13 é um anticorpo que se liga àCXCL-13 ou fragmento de anticorpo que se liga à CXCL-13, e o antagonistade TNFa é um anticorpo que se liga ao TNFa ou um fragmento de anticorpoque se liga ao TNFa.

Em uma outra concretização deste método, o animal é um ma-mífero. Em uma outra concretização deste método, o mamífero é um serhumano. Em uma outra concretização deste método, a quantidade fornecidade cada anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação é de aproximada-mente 25 mg por kg de peso corporal do animal a aproximadamente 40 mgpor kg de peso corporal do animal . Em uma outra concretização deste mé-todo, o sintoma de lúpus eritematoso sistêmico é o número de focos de infil-trado linfocitário periarterial, identificados por exame de tecidos renais. Emuma outra concretização deste método, o sintoma é a relação entre proteínatotal urinária e creatinina total urinária. Em uma outra concretização destemétodo, o antagonista de CXCL-13 é um anticorpo que se liga à CXCL-13ou fragmento de anticorpo que se liga à CXCL-13, e o antagonista de TNFaé um anticorpo que se liga ao TNFa ou um fragmento de anticorpo que seliga ao TNFa. Em uma outra concretização deste método, o antagonista deCXCL-13 é um anticorpo que se liga à CXCL-13 ou fragmento de anticorpoque se liga à CXCL-13, e o antagonista de TNFa é o anticorpo infliximab quese liga ao TNFa.

A presente invenção provê ainda qualquer invenção descritanesta exposição.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra que os níveis de transcrição de mRNA de CX-CL13 estão elevados em tecido pulmonar com doença.

A figura 2 mostra que o tratamento concomitante com anticorposmonoclonais específicos contra TNF-α e CXCL13 alivia sintomas de doençapulmonar, conforme avaliada por tamanho de folículo ectópico em tecidopulmonar com doença.

A figura 3 mostra que o tratamento concomitante com anticorposmonoclonais específicos contra TNF-α e CXCL13 diminui a infiltração porcélulas B que expressam CD22.2 em tecidos pulmonares.

A figura 4 mostra que o tratamento concomitante com anticorposmonoclonais específicos contra TNF-α e CXCL13 diminui a infiltração porcélulas B que expressam CD19 em tecidos pulmonares.

A figura 5 mostra que o tratamento concomitante com anticorposmonoclonais específicos contra TNF-α e CXCL13 diminui a infiltração porcélulas B que expressam CD45R/B220 em tecidos pulmonares.

A figura 6 mostra que o tratamento concomitante com anticorposmonoclonais específicos contra TNF-α e CXCL13 diminui a infiltração porcélulas B que expressam CD4 em tecidos pulmonares.

A figura 7 mostra que a co-administração de mAbs específicoscontra CXCL-13 e TNF-α diminui glomerulonefrite associada a níveis protéi-cos na urina de camundongos NZB/W F1 que exibem sintomas de lúpus eri-tematoso sistêmico (LES), em relação àqueles de camundongos NZB/W F1de controle não tratados que receberam veículo contendo somente PBS.

A figura 8 mostra que a co-administração de mAbs específicoscontra CXCL-13 e TNF-α diminui a pontuação na classificação de gravidadede lúpus eritematoso sistêmico (LES), associado a doença renal em camun-dongos (SLE) NZB/W F1 exibindo sintomas de LES1 para níveis abaixo da-queles de camundongos NZB/WF1 de controle não tratados que receberamveículo contendo somente PBS (figura 8).Descrição Detalhada da InvençãoDefinições

As definições seguintes são estabelecidas para ilustrar e definiro significado e abrangência de vários termos utilizados para descrever apresente invenção.

"Atividade" biológica e funcional de um polipeptídeo refere-seàquela exercida pela CXCL13 ou por seu receptor em resposta a sua intera-ção específica com outra proteína ou molécula, conforme determinada invivo, in situ ou in vitro, de acordo com técnicas convencionais. Estas ativida-des podem ser direta, como quando associadas a uma segunda proteína ouexercendo atividade enzimática sobre uma segunda proteína, ou indiretacomo em processo celular mediado por interação da proteína com uma se-gunda proteína ou uma série de interações, como ocorre na sinalização in-tracelular ou a cascata de coagulação.

"Anticorpo" inclui qualquer polipeptídeo ou peptídeo cuja molécu-la compreenda, pelo menos, parte da molécula de uma imunoglobulina, co-mo, mas sem estarem restritas a estas, pelo menos uma região determinan-te de complementaridade (CDR) de cadeia pesada ou de leve, ou uma partedo sítio de ligação a Iigante da mesma, uma região variável de cadeia pesa-da ou de leve, uma região constante de cadeia pesada ou de leve, uma regi-ão framework, ou qualquer parte, fragmento ou variante destas. O termo "an-ticorpo" pretende ainda incluir anticorpos, fragmentos digeridos, partes e va-riantes especificados dos mesmos, incluindo anticorpos miméticos, ou com-preendendo partes de anticorpos que imitam a estrutura e/ou função de umanticorpo ou fragmento ou parte especificada do mesmo, incluindo anticor-pos de cadeia simples, anticorpos de domínio simples e fragmentos dosmesmos. Por exemplo, fragmentos de anticorpos incluem, entre outros, osfragmentos Fab (por exemplo, por digestão com papaína), Fab' (por exem-plo, por digestão com pepsina e redução parcial) e F(ab')2 (por exemplo, pordigestão com pepsina), facb (por exemplo, por digestão com plasmina), pFc'(por exemplo, por digestão com pepsina ou plasmina), Fd (por exemplo, pordigestão com pepsina, redução parcial e reagrupamento), Fv ou scFv (porexemplo, por técnicas da biologia molecular) que são abrangidos pela invenção(vide, por exemplo, Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocole inPolipeptid Science, John Wiley & Sons, NY (1997-2001)).

Moléculas "quiméricas" ou "de fusão" são ácidos nucléicos oupolipeptídeos criados por combinação, por exemplo, de um ou mais antago-nistas de CXCL13 (ou suas partes) com seqüência(s) adicional(is) de ácidonucléico. Estas seqüências combinadas podem ser introduzidas em um vetorapropriado e expressas dando origem a um polipeptídeo quimérico ou defusão.

"Complemento de" ou "complementaridade com" uma seqüênciade ácido nucléico da invenção refere-se a uma molécula de polinucleotídeocom complementaridade de bases em uma seqüência e orientação inversa,quando comparada a um primeiro polinucleotídeo.

"Fragmento" é um variante de polipeptídeo com seqüência deaminoácidos inteiramente igual à parte, porém não a toda a seqüência deaminoácidos, de um antagonista de CXCL13, ou variante de polinucleotídeocom seqüência de ácido nucléico inteiramente igual à parte, porém não atoda seqüência de ácido nucléico de um polinucleotídeo de qualquerantagonista de CXCL13. Fragmentos podem incluir, por exemplo, polipeptí-deos truncados, ou variantes dos mesmos, como uma série contínua de re-síduos que inclui uma seqüência heteróloga de aminoácidos na posição a-mino e/ou carbóxi terminal. Formas de degradação dos antagonistas de CX-CL13, produzidas por ou em uma célula hospedeira estão incluídas também.Outros fragmentos representativos são aqueles caracterizados por atributosestruturais ou funcionais, como fragmentos compreendendo hélice alfa ouregiões formadoras de hélice alfa, folha beta ou regiões formadoras de folhabeta, voltas ou regiões formadoras de voltas, enovelamento ou regiões for-madoras de enovelamento, regiões hidrofílicas, regiões hidrofóbicas, regiõesalfa-anfipáticas, regiões beta-anfipáticas, regiões flexíveis, regiões formado-ras de superfícies, regiões de ligação a substratos, regiões extracelulares eregiões de alto índice antigênico.

"Identidade", conforme conhecida na técnica, é a relação entreduas ou mais seqüências de polipeptídeos ou duas ou mais seqüências depolinucleotídeos, conforme determinada por comparação das seqüências.Na técnica, "identidade" significa também o grau no qual seqüências de poli-peptídeos ou de polinucleotídeos estão relacionadas entre si, conforme de-terminado pela combinação entre cadeias destas seqüências. A "identidade"e "similaridade" podem ser rapidamente calculadas por métodos conhecidos,incluindo, entre outros, aqueles descritos em Computational Molecular Bio-logy, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocompu-ting:lnformatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press,New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. eGriffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Seqüência Analysis inMolecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence A-nalysis Iniciador, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press,New York, 1991; e Carillo, H. e Lipman, D., Siam J. Applied Math., 48:1073(1988). Ademais, valores percentuais de identidade podem ser obtidos a par-tir de alinhamentos de seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos, gera-dos por configurações padronizadas para o componente AIignX do programaVector NTI Suite 8.0 (Informax1 Frederick1 MD).

Métodos preferidos de determinação de identidade são aquelescriados para fornecerem o maior número de combinações entre as seqüênciastestadas. Métodos para determinar a identidade e similar são codificados emprogramas de computador disponíveis publicamente. Os métodos preferidosde programas de computador para determinar identidade e similaridade en-tre duas seqüências incluem, entre outros, o pacote de programas GCG(Devereux, J. et ai, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP,BLASTN e FASTA (Atschul, S. F. et ai., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)).O programa BLAST X é publicamente disponibilizado pelo NCBI e por outrasfontes (BLAST Manual, Altschul, S. et ai, NCBINLM NIH Bethesda, Md.20894: Altschul, S. et ai, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O algoritmo bemconhecido de Smith Waterman pode ser utilizado também para determinaridentidade.

Entre os parâmetros preferidos para comparação de seqüênciasde polipeptídeos estão os seguintes:

(1) Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453(1970) Matriz de comparação: BLOSSUM62 de Hentikoff e Hentikoff, Proc.Natl. Acad. Sei, USA. 89:10915-10919 (1992)

Penalidade de gap: 12

Penalidade para a extensão do gap: 4

O programa "gap" do Genetics Computer Group, Madison, Wis.é um dos programas disponibilizados publicamente que pode ser utilizadocom estes parâmetros. Os parâmetros supramencionados são os padroniza-dos para comparações entre seqüências de peptídeos (junto com ausênciade penalidade para gaps finais).

Entre os parâmetros preferidos para comparação entre polinu-cleotídeos estão os seguintes:

(1) Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)Matriz de comparação: combinações = +10, erros de combina-ção =0

Penalidade para a abertura de gap: 50

Penalidade para a extensão do gap. 3

Disponibilizado como: O programa "gap" do Genetics ComputerGroup, Madison, Wis. Estes são os parâmetros padronizados para compara-ções entre seqüências de ácido nucléico.

A título de exemplo, uma seqüência de polinucleotídeo pode seridêntica a uma seqüência, ou seja, 100% idêntica, ou pode incluir até umcerto número inteiro de alterações em nucleotídeos, quando comparada àseqüência de referência. Estas alterações são selecionadas do grupo consti-tuído por, pelo menos, uma deleção ou substituição de nucleotídeo, incluindotransição e transversão ou inserção, e em que as alterações podem ocorrernas posições terminais 5' ou 3' da seqüência de nucleotídeos de referênciaou em qualquer local entre estas posições terminais, intercaladas quer indi-vidualmente entre os nucleotídeos na seqüência de referência ou em entreum ou mais grupos contíguos na seqüência de referência. O número de alte-rações em nucleotídeos é determinado, multiplicando-se o número total denucleotídeos na seqüência pelo percentual numérico do respectivo percen-tual de identidade (dividido por 100) e subtraindo aquele produto do númerototal de nucleotídeos na seqüência, ou:

n.sub.n.ltorsim.x.sub.n -(x.sub.n.y), em que n.sub.n é o númerode alterações em nucleotídeos, x.sub.n é o número total de nucleotídeos naseqüência e y é, por exemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, etc., e em que qualquer produto quenão seja inteiro de x.sub.n e y é arredondado para baixo até o número inteiromais próximo, antes de ser subtraído de x.sub.n.

Alterações em seqüências de polinucleotídeos que codificam aseqüência podem criar mutações do tipo sem sentido, sentido trocado ou(altera o quadro de leitura) "frameshift" nesta seqüência codificadora e, pelomesmo, alterar o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo após estasalterações. Semelhantemente, uma seqüência de polipeptídeos pode seridêntica à seqüência de referência, ou seja, 100% idêntica, ou pode incluiraté um certo número inteiro de alterações em aminoácidos, quando compa-rada à seqüência de referência seqüência, de forma que o percentual deidentidade é inferior a 100%. Estas alterações são selecionadas do grupoconstituído por deleção, substituição, incluindo a conservadora e a não con-servadora, ou inserção de, pelo menos, um aminoácido, e em que as altera-ções podem ocorrer nas posições amino ou carbóxi terminal da seqüênciade polipeptídeos de referência, ou em qualquer lugar entre estas posiçõesterminais, intercaladas quer individualmente entre os aminoácidos na se-qüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos na seqüência dereferência. O número de alterações em aminoácidos para um determinado %de identidade é determinado, multiplicando-se o número total de aminoáci-dos na seqüência pelo percentual número do respectivo percentual de iden-tidade (dividido por 100) e, em seguida, subtraindo aquele produto do núme-ro total de aminoácidos na seqüência, ou:

n.sub.a.ltorsim.x.sub.a -(x.sub.a.y), em que n.sub.a é o númerode alterações em aminoácidos, x.sub.a é o número total de aminoácidos naseqüência e y é, por exemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%etc., e em quer qualquer produto não inteiro de x.sub.a e y é arredondadopara baixo até o próximo número inteiro antes de ser subtraído de x.sub.a.

"Ácidos nucléicos" são polímeros de nucleotídeos, em que umnucleotídeo compreende uma base ligada a um açúcar, os quais, por seuturno, estão ligados entre si por pelo menos uma molécula bivalente inter-mediária, como ácido fosfórico. Em ácidos nucléicos naturais, o açúcar é 2'-desoxirribose (DNA) ou ribose (RNA). Poli ou oligonucleotídeos não naturaiscontêm bases, açúcares ou moléculas de ligação modificados, porém, con-forme geralmente entendido, imitam a natureza, em termos de complemen-taridade, dos ácidos nucléicos naturais a partir dos quais foram criados. Umexemplo de oligonucleotídeo não natural é a composição molecular anti-sentido que possui cadeia principal de fosforotiorato. Oligonucleotídeo" refe-re-se geralmente a uma molécula de ácido nucléico com menos do que 30nucleotídeos."Polipeptídeo" é um polímero de resíduos de aminoácidos, uni-dos por ligações peptídicas, e peptídeo refere-se geralmente a polímeros deaminoácidos formados por 12 ou menos resíduos. Ligações peptídicas po-dem ser produzidas naturalmente, conforme orientado pelo modelo de ácidonucléico, ou sinteticamente por métodos bem conhecidos na técnica.

"Proteína" é uma macromolécula compreendendo uma ou maiscadeias de polipeptídeos. Uma proteína pode compreender ainda grupossubstituintes, unidos aos grupos laterais dos aminoácidos não envolvidos naformação das ligações peptídicas. Tipicamente, proteínas formadas por ex-pressão de células eucarióticas contêm também carboidratos. As proteínassão definidas nesta exposição em termos de suas seqüência de aminoáci-dos ou cadeia principal, e substituintes não são especificados, quer conheci-dos ou não.

O termo "receptor" indica uma molécula com capacidade paraafetar atividade biológica em, por exemplo, célula, resultante de sua intera-ção com Iigante específico ou parceiro de ligação. Receptores ligados àmembrana celular são caracterizados por um domínio extracelular de ligaçãoa ligante, um ou mais domínios de expansão de membrana ou transmem-brana, e um domínio efetor intracelular que está tipicamente envolvido emtransdução de sinal. A ligação de Iigantes a receptores da membrana celularcausa alterações no domínio extracelular que são comunicadas através damembrana celular, por interação direta ou indireta com uma ou mais proteí-nas intracelulares, e altera propriedades celulares como atividade enzimáti-ca, forma celular ou perfil de expressão gênica. Os receptores podem tam-bém não estarem presos à superfície celular e serem citosólicos, nuclearesou estarem totalmente liberados da célula. Receptores não associados acélulas são denominados receptores solúveis.

Todas as publicações ou patentes citados neste pedido de pa-tente são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência, quer especifi-camente designado ou não de acordo, para apresentar o estado da técnicaexistente na data da presente invenção e/ou descrever e permitir a presenteinvenção. Publicações referem-se a quaisquer entre científicas e de paten-tes, ou a qualquer outra informação disponível em qualquer formato, incluin-do formatos de gravação, eletrônicos ou impressos. As referências seguintessão aqui incorporadas, em sua totalidade, por referência neste pedido depatente: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wi-ley & Sons, Inc., NY (1987-2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A La-boratory Manual, 2th Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane,antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan etal., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY(1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley& Sons, NY (1997-2001).

Função biológica de CXCL13

Foram identificadas novas expressões e funções da CXCL13,além de a sua função biológica na formação/desenvolvimento de órgãos Iin-fóides, formação de folículo de célula B e recrutamento de células B em vá-rias doenças humanas e modelos de animais. Pela primeira vez, a expres-são ectópica foi vinculada à formação de folículos linfóides, associada a do-enças pulmonares, especialmente, porém sem restrição, DPOC.

As composições de CXCL13 podem incluir uma ou mais isofor-mas de proteínas, porções imunogênicas destas ou polinucleotídeos quecodificam estas porções. Alternativamente, uma composição terapêutica po-de incluir uma célula que expresse a proteína CXCL13 ou célula T específicapara células que expressam um polipeptídeo codificado pelo gene, ou outrotipo de agonistas; e agentes antagonistas, como anticorpos monoclonais(mAb) neutralizadores, terapias à base de ácido nucléico ou de compostosformados por pequenas moléculas de qualquer parte de seu DNA, RNA ouda proteína CXCL13. Estas composições podem ser utilizadas, por exemplo,para a prevenção e tratamento de uma gama de doenças inflamatórias me-diadas por sistema imune. São expostos métodos diagnóstico e prognóstico,baseados na detecção da proteína CXCL13 ou de seu mRNA codificador,em uma amostra.

As proteínas CXCL13 e seu receptor, moléculas de polipeptí-deos e de ácido nucléico que as codificam estão incluídas em uma famíliacuja molécula exibe certas características estruturais e funcionais conservadas.Todas estas moléculas são incluídas na definição de CXCL13. Conformeutilizado nesta exposição, o termo "família" pretende significar duas ou maisproteínas ou moléculas de ácido nucléico que possuam estrutura de domínioem comum ou similar e com identidade suficiente de seqüência de aminoá-cidos ou de nucleotídeos, conforme aqui definida. Membros da família po-dem ser da mesma espécie ou de diferentes. Por exemplo, uma família podecompreender duas ou mais proteínas de origem humana e uma ou mais deorigem não humana.

Proteínas CXCL13 podem conter domínio referente a uma se-qüência de sinalização. Conforme utilizado nesta exposição, uma "seqüênciade sinalização" inclui um peptídeo com pelo menos, aproximadamente, 10resíduos de aminoácidos, em extensão, em posição amino-terminal de prote-ínas ligadas à membrana e que contém pelo menos, aproximadamente, 45%de resíduos aminoácidos hidrofóbicos, como alanina, leucina, isoleucina,fenilalanina, prolina, tirosina, triptofano ou valina. Em uma concretização pre-ferida, uma seqüência de sinalização contém pelo menos, aproximadamente10 a 35 resíduos de aminoácidos, de preferência, aproximadamente 10 a 20resíduos de aminoácidos e, pelo menos, aproximadamente 35-60%, maispreferivelmente 40-50% e ainda mais preferivelmente, pelo menos, aproxi-madamente 45% de resíduos hidrofóbicos. A função da seqüência de sinali-zação é direcionar a proteína que a contenha para bicamada lipídica. Porconseguinte, em uma concretização, uma proteína CXCL13 pode conteruma seqüência de sinalização. A seqüência de sinalização é clivada duranteo processamento de amadurecimento da proteína.

Proteínas CXCL13 incluem um domínio extracelular. Conformeutilizado nesta exposição, "domínio extracelular" refere-se a parte de umaproteína que se situa no lado não citoplasmático da bicamada lipídica deuma célula quando ocorre a expressão de ácido nucléico codificador da pro-teína na célula.

Ademais, uma proteína CXCL13 inclui um domínio transmem-brana. Conforme utilizado nesta exposição, "domínio transmembrana" refe-re-se a uma seqüência de aminoácidos, contendo, em sua extensão, pelomenos, aproximadamente 15 resíduos de aminoácidos e constituída por,pelo menos, aproximadamente 65-70% de resíduos de aminoácidos hidrofó-bicos como alanina, leucina, fenilalanina, prolina, tirosina, triptofano ou valina(Erik et al. Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligerit Systems for Molecular Bio-logy, ρ 175-182). Em uma concretização preferida, um domínio transmem-brana contém aproximadamente 15-30 resíduos de aminoácidos, de prefe-rência aproximadamente 20-25 resíduos de aminoácidos, e possui, pelo me-nos, aproximadamente 60-80%, de preferência 65-75% e, preferivelmente,pelo menos, aproximadamente 70% de resíduos hidrofóbicos.

Proteínas CXCL13 possuem um domínio citoplasmático, incluin-do especialmente proteínas com domínio citoplasmático carboxila-terminal.Conforme utilizado nesta exposição, "domínio citoplasmático" refere-se aparte de uma proteína que se situa no lado citoplasmático da bicamada lipí-dica de uma célula quando ocorre expressão de ácido nucléico codificadorda proteína na célula. Proteínas CXCL13 contêm tipicamente vários possí-veis sítios de modificação pós-tradução (freqüentemente em um domínioextracelular).

Antaaonistas de CXCL13

Conforme utilizado nesta exposição, o termo "antagonistas deCXCL13" refere-se a substâncias que inibem ou neutralizam a atividade bio-lógica da CXCL13 ou de seu receptor, CXCR5. Estes antagonistas atingemesse efeito em várias maneiras diferentes. Uma classe de antagonistas deCXCL13 liga-se à proteína CXCL13 com afinidade e especificidade suficien-tes para neutralizar os efeitos biológicos da CXCL13. Anticorpos e fragmen-tos de anticorpos (como, por exemplo, moléculas de F(ab) ou de F(ab')2) es-tão incluídos nessa classe. Uma outra classe de antagonistas de CXCL13compreende fragmentos das proteínas CXCL13, muteínas ou pequenas mo-léculas orgânicas, isto é, peptídeo miméticos, que se ligam a CXCL13 ou aseus parceiros de ligação, inibindo pelo mesmo a atividade biológica da CX-CL13. Os antagonistas de CXCL13 podem pertencer a qualquer uma destasclasses, desde que seja uma substância que iniba a atividade biológica daCXCL13. Antagonistas de CXCL13 incluem anticorpo contra CXCL13, anti-corpo contra receptor de CXCL13, CXCL13 modificada e peptídeos parciaisda CXCL13. Uma outra classe de antagonistas de CXCL13 inclui siRNAs,shRNAs, moléculas anti-sentido e DNAzimas que têm como alvo a seqüên-cia gênica da CXCL13, conforme conhecidos na técnica, são aqui expostos.

De acordo com o mesmo, conforme utilizado nesta exposição,"anticorpo contra CXCL13", "anticorpo anti-CXCL13", "parte de anticorpoanti-CXCL13" ou "fragmento de anticorpo anti-CXCL13" e/ou "variante deanticorpo anti-CXCL13" são os mesmos e incluem qualquer proteína oupolipeptídeo que contenha uma molécula compreendendo, pelo menos, umaparte da molécula de uma imunoglobulina, como, mas sem restrição, pelomenos uma região determinante de complementaridade (CDR) de cadeiapesada ou de leve ou uma parte do sítio de ligação a Iigante desta, uma re-gião variável de cadeia pesada ou de leve, uma região constante de cadeiapesada ou de leve, uma região framework, ou qualquer parte das mesmas,ou, pelo menos, uma parte da proteína de ligação a CXCL13 derivada deproteína ou peptídeo da CXCL13 que pode ser incorporada em um anticorpoa ser utilizado na presente invenção. Este anticorpo pode, opcionalmente,afetar ainda um Iigante específico, por exemplo, quando este anticorpo, en-tre outros efeitos, modula, diminui, aumenta, antagoniza, agoniza, reduz,aliava, bloqueia, inibe, anula e/ou interfere com a atividade da CXCL13 invitro, in situ e/ou in vivo. Entre os exemplos existentes, uma parte ou varian-te especificado de anticorpo anti-CXCL13 adequado da presente invenção écapaz de ligar-se a pelo menos uma proteína ou peptídeo de CXCL13, ou departes, variantes ou domínios especificados dos mesmos. Um anticorpo anti-CXCL13 adequado, parte especificada ou variante afeta a função da CX-CL13 em várias maneiras, como, entre outras, síntese de RNA, DNA ou deproteína, liberação de CXCL13, sinalização de CXCL13, ligação de CXCL13,produção e/ou síntese de CXCL13.

Anticorpos podem incluir uma ou mais entre pelo menos umaCDR, pelo menos uma região variável, pelo menos uma região constante,pelo menos uma cadeia pesada (por exemplo, g1, g2, g3, g4, m, a1, a2, d,e), pelo menos uma cadeia leve (por exemplo, k e I), ou qualquer parte oufragmento destas, e pode compreender ainda ligações dissulfeto no interiorda cadeia, regiões de articulação, sítios de glicosilação que podem ser sepa-rados por uma região de articulação, bem como cadeias pesadas e cadeiasleves. Cadeias leves possuem geralmente peso molecular de aproximada-mente 25 Kd, e cadeias pesadas variam tipicamente de aproximadamente50 K-77 Kd. Cadeias leves podem estar presentes sob duas formas distintasou isotipos, kapa (k) e Iambda (I), as quais podem combinar-se com qualquertipo das cadeias pesadas. Todas as cadeias leves possuem, pelo menos,uma região variável e, pelo menos, uma constante. A estrutura do anticorpoIgG é considerada típica e possui duas ligações dissulfeto entre as cadeias ouma estrutura típica de anticorpo e possui duas ligações dissulfeto no interiorda cadeia leve (uma na região variável e outra na constante), com quatro nacadeia pesada, e esta ligação inclui uma alça peptídica de aproximadamente60-70 aminoácidos, compreendendo um "domínio" de aproximadamente 110aminoácidos na cadeia. Anticorpos IgG anticorpos podem ser caracterizadosem quatro classes, IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4. Cada classe de imunoglobulinapossui um conjunto diferente de funções. A Tabela 1 resume as proprieda-des físico-químicas de cada classe e subclasse das imunoglobulinas.Tabela 1 <table>table see original document page 21</column></row><table>

A Tabela 2 resume alguns entre os exemplos existentesde funcoes efetorasde anticorpo por classes e subclassesde anticorpos humanos. <table>table see original document page 21</column></row><table>De acordo com o mesmo, o tipo de anticorpo ou de seu fragmen-to pode ser selecionado para uso de acordo com a presente invenção, combase nas características e funções desejadas para um uso diagnóstico outerapêutico em particular, como, entre outras, meia-vida sérica, distribuiçãointravascular, fixação de complemento, etc.

Polipeptídeo isolado de CXCL13, ou fragmento do mesmo, podeser utilizado como imunogene para geração de anticorpos por técnicas con-vencionais de preparo de anticorpos policlonal e monoclonal. É possível utili-zar toda a extensão do polipeptídeo ou da proteína ou, alternativamente, ainvenção provê fragmentos peptídicos antigênicos para uso como imunoge-nes. O peptídeo antigênico de uma proteína CXCL13 compreende pelo me-nos 8 (de preferência, 10, 15, 20, 30 ou mais) resíduos de aminoácidos einclui um epítopo da proteína de forma que um anticorpo gerado contra ostipos de peptídeos forme um complexo imune específico com a proteína.

Imunogenes são tipicamente utilizados para preparar anticorpospela imunização de um recipiente adequado (isto é, imunocompetente), co-mo coelho, ovelha, camundongo ou outro mamífero ou vertebrado. Um pre-parado imunogênico apropriado pode conter, por exemplo, polipeptídeosexpressos por recombinação ou sintetizados quimicamente. O preparadopode incluir ainda um adjuvante, como o adjuvante completo ou incompletode Freund, ou outro agente imunoestimulador similar.

Células produtoras de anticorpos podem ser obtidas do sangueperiférico ou, de preferência, do baço ou Iinfonodos de seres humanos ou deoutros animais adequados que tenham sido imunizados com o imunogenede interesse. Qualquer outra célula hospedeira adequada pode ser tambémutilizada para expressão de ácido nucléico heterólogo ou endógeno que co-difique um anticorpo, fragmento ou variante especificado do mesmo dapresente invenção. As células fundidas (hibridomas) ou células recombinan-tes podem ser isoladas por condições seletivas de cultura, ou por outros mé-todos adequados conhecidos, e clonadas por diluição limite ou separaçãocelular, ou por outros métodos conhecidos. Células que produzem anti-corpos com a especificidade desejada podem ser selecionadas, empregandoum ensaio adequado (por exemplo, ELISA).

Em uma abordagem, é produzido um hibridoma por fusão deuma linhagem celular imortal adequada (por exemplo, linhagem celular demieloma, tal como, mas não limitada a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1,NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS,RAJI1 NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMALWA, NEURO 2A ou similares), oude heteromielomas, produtos de fusão dos mesmos, ou por qualquer célulaou célula fundida derivada dos mesmos, ou ainda qualquer outra linhagemcelular adequada, conforme conhecida na técnica (vide por exemplo,www.atcc.org,www.lifetech.com e outros sites similares) que usem célulasprodutoras de anticorpo, como, entre outras, células isoladas ou clonadas debaço, sangue periférico, linfa, amídala, ou de outras células imunes ou Bcontendo células, ou outras células imune ou B, ou quaisquer outras queexpressem seqüências constantes ou variáveis de cadeia pesada ou de leveou de região framework ou de CDR, sob a forma de ácido nucléico endóge-no ou heterólogo, recombinante ou endógeno, viral, bacteriano, de alga, pro-cariótico, anfíbio, de inseto, réptil, peixe, mamífero, roedor, eqüino, ovino,caprino, de ovelha, primata, eucariótico, DNA genômico, cDNA, rDNA, DNAou RNA mitocondriano, DNA ou RNA cloroplástico, hnRNA, mRNA, tRNA, defita simples, dupla ou tripla, hibridizado e similares, ou qualquer combinaçãodos mesmos. Vide, por exemplo, Ausubel, supra, e Colligan, Immunology,supra, capítulo 2, integralmente aqui incorporados por referência neste pedi-do de patente.

Outros métodos adequados para produção e isolamento deanticorpos da especificidade requerida podem ser utilizados, incluindo, entreoutros, métodos que selecionam anticorpo recombinante em biblioteca depeptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, as não limitada a, bibliotecas deexibição em bacteriófagos, ribossomo, oligonucleotídeos, RNA, cDNA ousimilares; por exemplo, como a disponibilizada por Cambridge Antibody Te-chnologies, Cambridgeshire, Reino Unido; MorphoSys, Martinsreid/Planegg,DE; Biovation, Aberdeen, Escócia, Reino Unido; Biolnvent, Lund1 Suécia;Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley1 CA; lxsys. Vide, porexemplo, a Publicação EP Nº 368 684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755;PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; Patente U.S. 5 962255; PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC);

WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; WO92/18619;WO96/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); WO95/16027 (Biolnvent);WO88/06630; WO90/3809 (Dyax); US 4 704 692 (Enzon); PCT/US91/02989(Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046;PCT/US91/07149 (Ixsys); ou peptídeos ou polipeptídeos gerados por método estocástico - Patente U.S. 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514e 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, atualmente Applied MolecularEvolution (AME), cada um dos quais aqui incorporados, em sua totalidadepor referência neste pedido) ou que se baseiam em imunização de animaistransgênicos (por exemplo, camundongos SCID, Nguyen et al., Microbioi Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et ai., Crit. fíev. Biotechnol. 16:95-118(1996); Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998), cada um dos quais aquiincorporados, em sua totalidade por referência neste pedido, bem como pa-tentes e pedidos de patentes relacionados) que são capazes de produzir umrepertório de anticorpos humanos, conforme conhecido na técnica e/ou aqui exposto. Estas técnicas, incluem, entre outras, exibição em ribossomo (Ha-nes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)); tecnologiasque produzem anticorpo a partir de célula única (por exemplo, método deseleção de anticorpo de ativação de linfócito ("SLAM") (Patente U.S. N2 5 627 052, Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 93:7843-7848 (1996)); microgotícula em gel e citome-tria de fluxo (Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems,Cambridge, MA; Gray et ai, J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny et al.,Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); seleção de células B (Steenbakkers et al., Molec. Biol Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol.5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., ElsevierScience Publishers B.V., Amsterdã, Países Baixos (1988)).Métodos para engenharia ou humanização de anticorpos nãohumanos ou humanos podem ser utilizados também e são bem conhecidosna técnica. Geralmente, o anticorpo humanizado ou construído possui um oumais resíduos de aminoácidos provenientes de origem diferente da humana,por exemplo, entre outras, de camundongo, rato, coelho, primata não humanoou de outro mamífero. Os resíduos de aminoácidos humanos são freqüente-mente referidos como resíduos "importados", tipicamente obtidos de um do-mínio variável, constante ou outro "importado" de uma seqüência humanaconhecida. Seqüências de Ig humana conhecidas são expostas, por exemplo,em www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast;www.atcc.org/phage/hdb.html; www. mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php;www.kabatdatabase.com/top.html; ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat;www.sciquest.com; www.abcam.com;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html;www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;www. hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab;www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmu-nology.html;

www.immunologylink.com; pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html;www.appliedbiosystems.com;www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody;www.m.ehime-u.ac.jp/~vasuhito/Elisa.html;www.biodesiqn.com:www.cancerresearchuk.org;www.biotech.ufl.edu;

www.isac-net.org; baserv.uci.kun.nl/~jraats/links1.html;www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu;www. mrc-cpe.cam.ac.uk;www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;

http://www. bioinf.org.uk/abs; antibody.bath.ac.uk;www. unizh.chwww.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s;www. nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html;www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html;www. ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.htmI;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;www.jerini.de; Kabat et ai, Protein Sequences of Immunological Interest,U.S. Dept. Health (1983), cada um dos quais aqui incorporados, em sua tota-lidade, por referência neste pedido de patente.

Estas seqüências importadas podem ser utilizadas para reduzirimunogenicidade ou reduzir, intensificar ou modificar a ligação, afinidade, emtaxa, fora de taxa, avidez, especificidade, meia-vida ou qualquer outra carac-terística adequada, conforme conhecidas na técnica. Geralmente, parte outoda a seqüência de CDR humana ou não humana são mantidas, enquantoas seqüências não humanas das regiões variável e constante são substituí-das por aminoácidos humanos ou outros aminoácidos. É possível tambémhumanizar anticorpos fazendo com que estes conservem, opcionalmente, asua alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis.Para tanto, os anticorpos humanizados podem ser opcionalmente prepara-dos por um processo de análise das seqüências ancestrais e dos vários pro-dutos humanizados teóricos, utilizando modelos tridimensionais das seqüên-cias ancestrais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulinaencontram-se comumente disponíveis e são conhecidos pelos versados natécnica. Existem programas de computador disponíveis que ilustram e queexibem estruturas tridimensionais de conformações prováveis de seqüênciascandidatas selecionadas de imunoglobulina. A inspeção destas estruturasexibidas permite analisar o possível papel dos resíduos, exercido no funcio-namento da seqüência candidata da imunoglobulina, ou seja, a análise deresíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de ligar-se a seu antígeno. Dessa maneira, resíduos da FR podem ser selecionadose combinados, a partir das seqüências de consenso e das importadas, paraser obtido um anticorpo com as características desejadas, como afinidadeaumentada para o(s) antígeno(s) de interesse. Em geral, os resíduos daCDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos em influênciasobre ligação com antígeno. A humanização ou construção de anticorpos dapresente invenção pode ser conduzida por qualquer método conhecido, co-mo, entre outros, aqueles descritos em Winter (Jones et al., Nature 321:522(1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Clothia w Lesk, J.MoL Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 89:4285(1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Patente U.S. N2s 5723323;5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886;5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539 e4816567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939;US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; W090/ 14443;W090/14424 e W090/14430; EP 229246; cada um aqui incorporado, emsua totalidade, por referência neste pedido de patente, incluindo as referên-cias citadas nos mesmos.

O anticorpo contra CXCL13 pode ser opcionalmente gerado poranimal transgênico (por exemplo, camundongo, rato, hamster, primata nãohumano e similares), capaz de produzir um repertório de anticorpos huma-nos, conforme aqui descritos e/ou conhecidos na técnica. Células que pro-duzem anticorpo contra CXCL13 humana podem ser isoladas destes ani-mais e imortalizadas por métodos adequados, como aqueles descritos nestaexposição.

Camundongos transgênicos produtores de um repertório de anti-corpos humanos que se ligam a antígeno humano podem ser produzidos pormétodos conhecidos (por exemplo, entre outros, aqueles descritos nas Pa-tentes U.S. Nos: 5 770 428, 5 569 825, 5 545 806, 5 625 126, 5 625 825,5 633 425, 5 661 016 e 5 789 650, concedidas para Lonberg et al.·, Jakobo-vits et al. WO 98/50433, Jakobovits et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO98/24884, Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO 94/25585, Ku-cherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et al. EP 0463 151 B1, Kucher-lapate et al. EP 0710 719 A1, Surani et al. Patente US. N2 5 545 807, Brug-gemann et al. WO 90/04036, Bruggemann etal. EP 0438 474 B1, Lonberg etal. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2 272 440 A, Lonberg et al. Nature368:856-859 (1994), Taylor et al., Int. ImmunoL 6(4)579-591 (1994), Green etal, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992),Tuaillon et al., Proc Natl Acad Sei USA 90(8)3720-3724 (1993), Lonberg etal., Int Rev Immunol 13(1):65-93 (1995) e Fishwald et al., Nat Biotechnol14(7):845-851 (1996), os conteúdos dos quais são aqui incorporados porreferência neste pedido de patente). Em geral, estes camundongos contêm,pelo menos, um transgene compreendendo DNA de, pelo menos, um locode imunoglobulina humana que é funcionalmente rearranjado, ou que podepassar por rearranjo funcional. Os Iocos de imunoglobulina endógena, nes-tes camundongos, podem ser rompidos ou deletados para fazer com que oanimal não seja mais capaz de produzir anticorpos codificados por genesendógenos.

Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos tambémem leite pela administração de, pelo menos, um ácido nucléico codificadorde anticorpo anti-CXCL13 para animais transgênicos ou mamíferos, comocabras, vacas, éguas, ovelhas e similares que produzem anticorpos em seusleites. Estes animais podem ser providos por métodos conhecidos. Vide, porexemplo, entre outros, as Patentes U.S. Nes 5 827 690, 5 849 992, 4 873 316,5 849 992, 5 994 616, 5 565 362 , 5 304 489 e similares, cada uma dasquais aqui incorporada, em sua totalidade, por referência neste pedido.Adicionalmente, anticorpos da presente invenção podem ser preparados,empregando, pelo menos, um ácido nucléico codificador de anticorpo contraCXCL13 para serem obtidas plantas transgênicas e culturas de células vege-tais (por exemplo, mas não limitada a, tabaco e milho) que produzem estesanticorpos, partes ou variantes especificados em partes da planta ou em cul-turas de células destas plantas.

Os anticorpos da invenção podem ligar-se à CXCL13 humanacom uma ampla gama de afinidades (KD). Em uma concretização preferida,pelo menos um mAB humano da presente invenção pode ligar-se opcional-mente à CXCL13 humana com alta afinidade. Por exemplo, um mAb huma-no pode ligar-se à CXCL13 humana com K0 igual ou inferior a aproximada-mente 10"7 M, tal como, mas não limitada a, 0,1 - 9,9 (ou qualquer intervaloou valor entre os mesmos) X 10"7, 10"8, 10"9,10"1°, 10~11, 10"12, 10"13ou qual-quer intervalo ou valor entre os mesmos.

A afinidade ou avidez de um anticorpo pode ser determinadaexperimentalmente por qualquer método adequado. (Vide, por exemplo,Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," em Fundamental Immuno-logy, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Im-munology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); e por méto-dos aqui descritos). A afinidade medida de uma interação anticorpo-antígenoem particular pode variar se medida em condições diferentes (por exemplo,concentração de sal, pH). Dessa forma, medições de afinidade e de outrosparâmetros de ligação a antígeno (por exemplo, KD, Ka, Kd) são conduzidas,de preferência, com soluções padronizadas de anticorpo e de antígeno etampão padronizado, como do tampão descrito nesta exposição.

Um antagonista de CXCL13 (por exemplo, anticorpo monoclonal)pode ser utilizado para isolar o polipeptídeo da CXCL13 por técnicas conven-cionais, como cromatografia por afinidade ou imunoprecipitação. Ademais,este anticorpo pode ser utilizado para detectar a proteína (por exemplo, emIisado celular ou sobrenadante celular) para avaliar a abundância e padrãode expressão do polipeptídeo. Os anticorpos podem ser utilizados também,como ferramenta diagnostica, para monitorar níveis protéicos em tecido, co-mo parte de um procedimento de análises clínicas, por exemplo, paradeterminar a eficácia de um dado regime de tratamento. A detecção podeser facilitada pelo acoplamento do anticorpo a uma substância detectável.Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos pros-téticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais biolumi-nescnetes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluemperoxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase e acetil-colinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequadosincluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluo-rescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato defluoresceína, rodamina, dicloro triazinil amina de fluoresceína, cloreto dedansila ou ficoeritrina; Iuminol é um exemplo de material luminescente; e-xemplos de materiais bioluminescente incluem luciferase, Iuciferina e aquori-na, e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I1 131I, 35S ou 3H.

O termo "anticorpo" pretende ainda incluir anticorpos, fragmen-tos digeridos, partes e variantes especificados destes, incluindo anticorpomiméticos ou compreendendo partes de anticorpos que imitam a estruturae/ou função de um anticorpo ou fragmento ou parte especificada do mesmo,incluindo anticorpos de cadeia simples e fragmentos dos mesmos. Fragmen-tos funcionais incluem fragmentos do sítio de ligação a antígeno que se li-gam a CXCL13 de mamífero. Por exemplo, fragmentos de anticorpo capazesde se ligarem a CXCL13 ou partes da mesma, incluindo, mas não limitada a,fragmentos Fab (por exemplo, por digestão com papaína), Fab1 (por exem-plo, por digestão com pepsina e redução parcial) e F(ab')2 (por exemplo, pordigestão com pepsina), facb (por exemplo, por digestão com plasmina), pFc'(por exemplo, por digestão com pepsina ou plasmina), Fd (por exemplo, pordigestão com pepsina, redução partical e reagregação), Fv ou scFv (por e-xemplo, por técnicas de biologia molecular), são abrangidos pela invenção(vide, por exemplo, Colligan, Immunology, supra).

Estes fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimáti-ca, técnicas sintéticas ou de recombinação, conforme conhecidas na técnicae/ou conforme aqui descritas. Anticorpos podem ser produzidos também emuma variedade de formas truncadas, utilizando genes de anticorpos nosquais um ou mais códons de parada tenham sido introduzidos, em sentidoascendente em relação ao sítio normal de parada. Por exemplo, é possívelcriar um gene combinado, codificador de uma parte da cadeia pesada deF(ab')2, de forma que inclua seqüências de DNA que codificam o domínioCH1 e/ou a região de articulação da cadeia pesada. As várias partes de anti-corpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, ou po-dem ser preparadas sob a forma de proteína contígua, empregando técnicasde engenharia genética.

O anticorpo anti-CXCL13 pode ser de primata, roedor, ou anti-corpo humano, quimérico ou humanizado. Conforme utilizado nesta exposição,o termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo no qual, substancial-mente, cada parte da proteína (por exemplo, domínios de CDR, framework,CL, CH (por exemplo, CH1, CH2, CH3), articulação, (VL, VH)) é substan-cíalmente não imunogênica em seres humanos, com somente alterações ouvariações mínimas de seqüência e/ou construídos para, derivados de oucontendo componentes conhecidos de anticorpo humano. Igualmente anti-corpos designados de primata (macaco, babuíno, chimpanzé, etc.), roedor(camundongo, rato, coelho, cobaia, hamster e similares) e de outros mamífe-ros designam anticorpos específicos destas espécies, subgêneros, gêneros,subfamílias e famílias. Ademais, anticorpos quiméricos da invenção podemincluir também qualquer combinação dos precedentes. Estas alterações ouvariações, opcionalmente e de preferência, retêm ou reduzem a imunogeni-cidade em seres humanos ou em outras espécies, em relação a anticorposnão modificados. Dessa forma, um anticorpo humano é distinto de um anti-corpo quimérico ou humanizado. Cabe observar que um anticorpo humanopode ser produzido por célula de animal não humano ou procariótica ou eu-cariótica que sejam capazes de expressar genes funcionalmente rearranja-dos de imunoglobulina humana (por exemplo, cadeia pesada e/ou cadeialeve). Ademais , quando do tipo de cadeia simples, o anticorpo humano podecompreender um peptídeo de ligação, não encontrado em anticorpos huma-nos nativos. Por exemplo, um fragmento Fv pode compreender um peptídeode ligação, contendo de 2 a aproximadamente 8 resíduos de glicina ou deoutros aminoácidos, unindo a região variável da cadeia pesada à região va-riável da cadeia leve. Estes peptídeos de ligação são considerados comosendo de origem humana.

Anticorpos biespecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugadosou similares podem ser utilizados também, se foram anticorpos monoclonais,de preferência humanos ou humanizados, com especificidades de ligaçãopara pelo menos dois antígenos diferentes. No presente caso, uma das es-pecificidades de ligação é, pelo menos, por uma proteína CXCL13 e a outrapor qualquer outro antígeno, por exemplo, receptor de CXCL13 ou TNFa.Métodos de produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técni-ca. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficosbaseia-se na co-expressão dos dois pares de cadeia pesada-cadeia leve daimunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas possuem especificidadesdiferentes (Milstein e Cuello, Nature 305:537 (1983)). Em resultado ao sorti-mento aleatório de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, esses hibri-domas (quadromas) produzem uma possível mistura de 10 moléculas dife-rentes de anticorpo, das quais somente uma possui a estrutura biespecíficacorreta. A purificação da molécula correta, habitualmente realizada por cro-matografia por afinidade em etapas, é bastante trabalhosa com rendimentobaixo de produtos. Procedimentos similares são descritos, por exemplo, emWO 93/08829, Patentes US N°s 6210668, 6193967, 6132992, 6106833,6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448,5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549 e4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker et ai, EMBOJ. 10:3655 (1991), Suresh et ai, Methods in Enzymology 121:210 (1986),cada um aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido depatente.

Anticorpos anti-CXCL13, úteis nos métodos e composições dapresente invenção, podem ser opcionalmente caracterizados por alta afini-dade de ligação a CXCL13 e, opcionalmente e de preferência, baixa toxici-dade. Em especial, anticorpo, fragmento ou variante especificado da inven-ção, no qual cada componente, como a região variável, região constante eframework, individual e/ou coletivamente, opcionalmente e de preferência,possua baixa imunogenicidade, é útil na presente invenção. Os anticorposque podem ser utilizados na invenção são caracterizados opcionalmente porserem capazes de tratar pacientes por períodos prolongados com aliviomensurável de sintomas e toxicidade baixa ou aceitável. Imunogenicidadebaixa ou aceitável e/ou alta afinidade, bem como outras propriedades ade-quadas, podem contribuir para os resultados terapêuticos obtidos. "Baixaimunogenicidade" é definida, no presente, como elevação significativa derespostas do tipo HAHA, HACA ou HAMA em menos de aproximadamente75% ou, de preferência, em menos de aproximadamente 50% dos pacientestratados e/ou elevação baixas de títulos nos pacientes tratados (menos deaproximadamente 300, de preferência, menos de aproximadamente 100,medidos com imunoensaio enzimático com dois antígenos) (Elliott et ai.,Lancet 344:1125-1127 (1994), aqui incorporado integralmente por referêncianeste pedido).

Anticorpos adequados incluem aqueles que competem pela liga-ção à CXCL13 humana com anticorpos monoclonais que bloqueiam a ativa-ção de CXCL13.

Antagonistas de CXCL13 sob a forma de siRNA, shRNA, anti-sentido, ribozimas e DNAzimas

Uma terapia que vise o indutor da CXCL13 pode oferecer melho-res chances de êxito. A expressão gênica pode ser modulada em várias ma-neiras diferentes, incluindo pelo uso de siRNAs, shRNAs, moléculas anti-sen-tido, ribozimas e DNAzimas. siRNAs, shRNAs, ribozimas e DNAzimas sinté-ticos podem ser criados para terem como alvos específicos um ou mais ge-nes e podem ser facilmente liberados a células in vitro ou in vivo.

A presente invenção abrange moléculas de ácido nucléico, ouseja, moléculas que complementam ácido nucléico sentido, codificador depolipeptídeo de CXCL13, por exemplo, complemente a fita codificante de umamolécula de cDNA de fita dupla ou complemente uma seqüência de mRNA.

De acordo com o mesmo, um ácido nucléico anti-sentido podeligar-se por hidrogênio a um ácido nucléico sentido. O ácido nucléico anti-sentido pode ser complementar de toda fita codificante ou de somente umaparte da mesma, por exemplo toda ou parte da região codificante da proteí-na (ou quadro de leitura aberta). Uma molécula de ácido nucléico anti-sentido pode ser anti-sentido em relação à toda ou parte de uma região nãocodificante da fita codificante de uma seqüência de nucleotídeos, codificado-ra de polipeptídeo de CXCL13. As regiões não codificantes ("regiões 5' e 3'não traduzidas") são as seqüências 5' e 3' que flanqueiam a região codifican-te e que não são traduzidas em aminoácidos.

Um oligonucleotídeo anti-sentido oligonucleotídeo pode conter,por exemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou maisnucleotídeos em extensão. Um ácido nucléico anti-sentido da invenção podeser construído por síntese química e reações enzimáticas de ligação, em-pregando procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, em ácido nu-cléico anti-sentido (por exemplo, oligonucleotídeo antisentido) pode ser sin-tetizado quimicamente com nucleotídeos naturais ou modificados de váriasmaneiras, planejados para aumentar a estabilidade biológica das moléculasou para aumentar a estabilidade física do duplex formado entre os ácidosnucléicos anti-sentido e sentido, por exemplo, podem ser utilizados deriva-dos de fosforotioato, ácidos nucléicos peptídicos (PNAs) e nucleotídeossubstituídos com acridina. Exemplos de nucleotídeos modificados que podemser utilizados para gerar o ácido nucléico anti-sentido incluem 5-fIuoruracil,5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcito-sina, 5-(carboxihidroximetil)uracil, 5-carboximetilaminoetil-2-tiouridina, 5-car-boximetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galactosilqueosina, inosina,Ν-6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina,2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, Ν-6-adenina,7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudou-racil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metil-uracil, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v),5-metil-2- tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracil, (acp3)w e 2,6- di-aminopurina. Alternativamente, o ácido nucléico anti-sentido ácido nucléicopode ser produzido biologicamente utilizando um vetor de expressão no qualum ácido nucléico tenha sido subclonado em orientação anti-sentido (ou se-ja, o RNA transcrito do ácido nucléico inserido terá orientação anti-sentidoem relação a um ácido nucléico visado de interesse, descrito posteriormentena subseção seguinte).

As moléculas do ácido nucléico anti-sentido da invenção sãoadministradas tipicamente a um sujeito ou geradas in situ, de forma que sehibridizem ou se liguem a mRNA celular e/ou DNA genômico codificador deum polipeptídeo selecionado de CXCL13 para, pelo mesmo, inibir expres-são, por exemplo, inibindo a sua transcrição e/ou tradução. A hibridizaçãopode ser por complementaridade convencional de nucleotídeos com forma-ção de duplex estável ou, no caso de molécula de ácido nucléico anti-sentidoque se liga a vários duplex de DNA, através de interações específicas nosulco maior da dupla hélice. A injeção direta local em tecido é uma das viasde administração de moléculas de ácido nucléico anti-sentido da invenção.Alternativamente, as moléculas de ácido nucléico anti-sentido podem sermodificadas para serem direcionadas a células selecionadas e, em seguida,administradas por via sistêmica. Por exemplo, para administração sistêmica,as moléculas anti-sentido podem ser modificadas de forma que se Iigem es-pecificamente a receptores ou antígenos expressos em uma superfície celu-lar selecionada, por exemplo, pela ligação das moléculas de ácido nucléicoanti-sentido a peptídeos ou anticorpos que se ligam a receptores ou antíge-nos de superfície celular. As moléculas de ácido nucléico anti-sentido podemser também liberadas para células utilizando os vetores aqui descritos. Paraatingir concentrações intracelulares suficientes das moléculas anti-sentido,os vetores preferidos são aqueles construídos nos quais a molécula de ácidonucléico anti-sentido é posta sobcontrole de um promotor potente do tipo polII ou pol III.

Moléculas de ácido nucléico anti-sentido da invenção podem serdo tipo α-anomérica. Molécula de ácido nucléico α-anoméricas formam hí-bridos de dupla fita específicos com RNA complementar, nos quais, ao con-trário das α-unidades habituais, as fitas correm em paralelo (Gaultier et al.(1987) Nucieic Acids Res. 15:6625-6641). A molécula de ácido nucléico anti-sentido pode compreender também um 2'-o-metilribonucleotídeo (Inoue et al.(1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) ou um análogo quimérico de RNA-DNA (Inoue etal. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

A invenção abrange também ribozimas. Ribozimas são moléculascatalíticas de RNA com atividade de ribonuclease, capazes de clivar ácido nu-cléico de fita simples, como mRNA, em relação ao qual exibam uma região decomplementaridade. Portanto, ribozimas (por exemplo, ribozimas hammerheadcomo as descritas em Haselhoff e Gerlach (1988) Nature 334:585-591) po-dem ser utilizadas para catalizar a clivagem de mRNA transcrito e, pelomesmo, inibir a tradução da proteína por ele codificada. Ribozimas com es-pecificidade para uma molécula de ácido nucléico codificadora de polipeptí-deo de CXCL13 podem ser criadas com base na seqüência de nucleotídeosde um cDNA aqui descrito. Por exemplo, é possível construir um derivado deRNA de Tetrahymena L-19 IVS, no qual a seqüência de nucleotídeos do sítioativo complemente a seqüência de nucleotídeos a ser clivada, de acordocom Cech et ai, Patente U.S. N° 4 987 071; e Cech et ai, Patente U.S. Ns5 116 742. Alternativamente, pode ser utilizado um mRNA que codifica umpolipeptídeo de CXCL13 polipeptídeo para selecionar um RNA catalítico comatividade específica de ribonuclease de um pool de moléculas de RNA. Vide,por exemplo, Haselhoff e Gerlach supra; Bartel e Szostak (1993) Science261:1411-1418.

A invenção inclui também moléculas de ácido ribonucléico quesão complementares de anti-sentido, homólogos de fita dupla, siRNA, ou sãoRNAs de fita simples com seqüência específica, formadores de estruturascurtas do tipo hairpin, shRNA (coletivamente, RNA interferente), que podemser utilizados para modular negativamente uma expressão gênica específica,nesse caso, CXCL13, e, por conseguinte, inibir a expressão de proteínas eelucidar as suas respectivas funções biológicas. (Fire, A. et aí. (1998) Nature391: 806-811; Paddison, P.J. et al. (2002) Genes Develop 16:948-958).

A invenção abrange ainda DNAzimas que são capazes de clivarmoléculas de RNA (Breaker e Joyce, 1994; Santoro e Joyce1 1997) ou deDNA (Carmi et aí., 1996) . A taxa de clivagem catalítica destas enzimas deácido nucléico depende da presença e concentração de íons metálicos diva-lentes, como Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+ e Pb2+ (Santoro eJoyce, 1998; Brown etal., 2003).

DNAzimas catalíticas, como as DNAzimas 10:23 e 8:17, possu-em múltiplos domínios. Estas moléculas possuem um domínio catalítico con-servado (núcleo catalítico), ladeado por dois domínios de ligação a substratonão conservados (braços de hibridização) que são regiões da seqüência quese ligam especificamente ao substrato. As DNAzimas 10:23 e 8:17 DNAzi-mas são capazes de clivar substratos de ácido nucléico em ligações especi-ficas fosfodiéster de RNA (Santoro e Joyce, 1997). A DNAzima 10:23 possuium domínio catalítico formado por 15 desoxinucleotídeos, ladeado por doisbraços de reconhecimento de substrato. A DNAzima 8:17 DNAzima possuitamanho similar.

Um ácido nucléico catalítico é capaz de clivar um substrato deácido nucléico, contendo uma seqüência visada, com exigências mínimas. Aseqüência do substrato precisa ser substancialmente complementar dosbraços de hibridização do ácido nucléico catalítico, e o substrato precisaconter uma seqüência específica no sítio de clivagem. As exigências de se-qüência específica, no sítio de clivagem, incluem, por exemplo, uma se-qüência de ribopurina:pirimidina de nucleotídeos para clivagem pela DNAzi-ma 10:23 (Santoro e Joyce, 1997).

Em várias concretizações, as moléculas de ácido nucléico dainvenção podem ser modificadas no grupamento básico, grupamento de a -çúcar ou na cadeia principal de fosfato para melhorar, por exemplo, a estabi-lidade, hibridização ou solubilidade da molécula. Por exemplo, os análogosde nucleotídeos, conforme descritos acima, podem ser substituídos pelosnucleotídeos que ocorrem naturalmente.

Em um outro exemplo, a cadeia principal formada por desoxirri-bose e fosfato dos ácidos nucléicos pode ser modificada para gerar ácidosnucléicos peptídicos (vide Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Che-mistry 4(1): 5-23). Conforme utilizados nesta exposição, os termos "ácidosnucléicos peptídicos" ou "PNAs" referem-se a imitadores de ácido nucléico,por exemplo, imitadores de DNA1 nos quais a cadeia principal de desoxirri-bose e fosfato é substituída por outra pseudopeptídica e somente as quatronucleobases são conservadas. Foi demonstrado que a cadeia principal neu-tra de PNAs possibilita hibridização específica para DNA e RNA, sob condi-ções de baixa resistência iônica. A síntese de oligômeros de PNA pode serrealizada por protocolos convencionais de síntese de peptídeos em fase só-lida, conforme descritos em Hyrup et al. (1996), supra-, Perry-O1Keefe et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 14670-675.

PNAs podem ser utilizados em aplicações terapêuticas e diag-nosticas. Por exemplo, PNAs podem ser utilizados como agentes anti-sentido ou antígeno para modulação específica de seqüências de expressãogênica, por exemplo, induzindo a interrupção de transcrição ou tradução ouinibindo a replicação. PNAs podem ser utilizados também, por exemplo, naanálise de mutações de um único par de base em um gene, por exemplo,por travamento de PCR dirigida por PNA; como enzimas artificiais de restri-ção, quando utilizados em combinação com outras enzimas, por exemplo,S1 nucleases (Hyrup (1996), supra; ou como sondas ou iniciadores para se-qüência de DNA seqüência e hibridização (Hyrup (1996), supra; Perry-O'Keefe et aL (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 14670-675).

Em uma outra concretização, PNAs podem ser modificados pa-ra, por exemplo, aumentar a sua estabilidade ou absorção celular, pela liga-ção com grupos lipofílicos ou outros grupos auxiliares ao PNA, pela forma-ção de quimeras PNA-DNA ou pelo uso de lipossomas ou outras técnicas deliberação de fármacos, conhecidas na técnica. Por exemplo, podem ser ge-radas quimeras de PNA-DNA que combinem as propriedades favoráveis doPNA e do DNA. Estas quimeras permitem que enzimas de reconhecimentode DNA, por exemplo, RNASE H e DNA polimerases, interajam com a partedo DNA, enquanto a parte do PNA forneceria alta afinidade de ligação e es-pecificidade. Quimeras de PNA-DNA podem ser ligadas, utilizando ligantesde extensões apropriadas, selecionados em termos de empilhamento debase, número de ligações entre as nucleobases e orientação (Hyrup (1996),supra). A síntese de quimeras de PNA-DNA pode ser realizada conformedescrito em Hyrup (1996), supra, e Finn et al. (1996) Nucleic Aeids Res.24(17): 3357-63. Por exemplo, uma cadeia de DNA pode ser sintetizada so-bre um suporte sólido, empregando química convencional de acoplamentoem fosforamidita e análogos de nucleosídeos modificados. Compostos, co-mo 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxi-timidina fosforamidita, pode ser utilizadacomo um elo entre o PNA e a extremidade 5' do DNA (Mag et al. (1989)Nueleie Aeids Res. 17:5973-88). Monômeros de PNA são acoplados, emseguida, em etapas, para produzir uma molécula quimérica com um seg-mento 5' de PNA e um 3' de DNA (Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res.24(17):3357-63). Alternativamente, moléculas quiméricas podem ser sinteti-zadas com um segmento 5' de DNA e um 3' de PNA (Peterser et ai (1975)Bioorganie Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).

Em outras concretizações, o oligonucleotídeo pode incluir gruposanexados, como peptídeos (por exemplo, visando receptores em célula hos-pedeira irt vivo), ou agentes que facilitam o transporte através da membranacelular (consultar, por exemplo, Letsinger et aí. (1989) Proe. Nati Acad. Sei.USA 86:6553-6556; Lemaitre et ai. (1987) Proe. Natl. Acad. Sei. USA84:648-652; Publicação PCT N2 WO 88/09810) ou a barreira hematoencefá-Iica (vide, por exemplo, a Publicação PCT N2 WO 89/10134). Ademais,oligonucleotídeos podem ser modificados com agentes de hibridização de-sencadeada por clivagem (vide, por exemplo, Krol et al. (1988) Bio/Teehniques6:958-976) ou agentes intercalantes (vide, por exemplo, Zon (1988) Pharm.Res. 5:539-549). Para tanto, o oligonucleotídeo pode ser conjugado a umaoutra molécula, por exemplo, um peptídeo, agente de hibridização desenca-deada por ligação cruzada, agente de transporte, agente de hibridização de-sencadeada por clivagem, etc.

Proteínas

A invenção provê também proteínas quiméricas ou de fusão.Conforme utilizados nesta exposição, os termos "proteína quimérica" ou"proteína de fusão" compreende todo ou parte (de preferência, biologica-mente ativo) de um polipeptídeo de CXCL13, ligado operacionalmente a umpolipeptídeo heterólogo (isto é, um polipeptídeo diferente do mesmo poli-peptídeo de CXCL13). No contexto de proteína de fusão, o termo "operaci-onalmente ligado" pretende indicar que o polipeptídeo de CXCL13 e o poli-peptídeo heterólogo estão fundidos "in-frame" em relação ao outro. O poli-peptídeo heterólogo pode ser fundido ao grupamento amino-terminal ou ogrupamento carboxila-terminal do polipeptídeo de CXCL13. Em uma outraconcretização, um polipeptídeo de CXCL13 ou um domínio ou fragmentoativo deste pode ser fundido com uma seqüência de proteína heteróloga, oufragmento da mesma, para formar uma proteína quimérica, em que os poli-peptídeos, domínios ou fragmentos não são fundidos de extremidade paraextremidade, porém são interpostos na estrutura da proteína heteróloga.

Entre as proteínas de fusão úteis está incluída proteína de fusãoGST, na qual o polipeptídeo de CXCL13 está fundido ao grupamento carbo-xila terminal das seqüências GST. Estas proteínas de fusão podem facilitar apurificação de polipeptídeos recombinantes de CXCL13.

Em uma outra concretização, a proteína de fusão contém umaseqüência de sinalização heteróloga em seu grupamento amina terminal. Porexemplo, a seqüência de sinalização nativa de um polipeptídeo de CXCL13pode ser removida e substituída pela seqüência de sinalização de uma outraproteína. Por exemplo, a seqüência secretora gp67 da proteína do envelopedo baculovírus pode ser utilizada como seqüência de sinalização heteróloga(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et ai, eds., John Wiley &Sons, 1992). Outros exemplos de seqüências de sinalização heterólogas deeucarióticos incluem as seqüências que sinalizam a secreção de melitina ede fosfatase alcalina humana placentária (Stratagene; La Jolla, Calif.). Emainda um outro exemplo, seqüências de sinalização heterólogas úteis deprocarióticos incluem a de sinalização de secreção de phoA (Sambrook etai, supra) e a de sinalização de secreção de proteína A (Pharmacia Biotech;Piscataway, N.J.).

Em ainda uma outra concretização, a proteína de fusão é umaproteína de fusão de imunoglobulina, na qual todo ou parte de um polipeptídeode CXCL13 é fundido a seqüências derivadas de um membro da família deproteínas do tipo imunoglobulina. As proteína de fusão de imunoglobulina dainvenção podem ser incorporadas em composições farmacêuticas e adminis-trada a um sujeito para inibir uma interação entre Iigante (solúvel ou ligado àmembrana) e proteína presente na superfície de uma célula (receptor), e,pelo mesmo, suprimir a transdução de sinal in vivo. A proteína de fusão deimunoglobulina pode ser utilizada para afetar a biodisponibilidade de um Ii-gante cognato de polipeptídeo de CXCL13. A inibição da interação Iigan-te/receptor pode ser útil, em termos terapêuticos, para o tratamento de do-enças proliferativas e diferenciadas e para modular (por exemplo, promoverou inibir) a sobrevida celular. Uma concretização preferida de proteína qui-mérica de imunoglobulina é uma imunoglobulina com domínio Ch1 deletadoou "mimeticorpo" contendo fragmento polipeptídico ativo interposto em umaregião modificada da estrutura, conforme exposto em no pedido de patentetambém pendente PCT WO/04002417. Além disso, as proteínas de fusão deimunoglobulina da invenção podem ser utilizadas, como imunogenes, paraproduzir anticorpos orientados contra polipeptídeo de CXCL13 em um sujei-to, para purificar Iigantes e em ensaios de varredura para identificar molécu-las que inibem a interação de receptores com ligantes.

Proteínas quiméricas e de fusão da invenção podem ser produ-zidas por técnicas convencionais de DNA recombinante. Em uma outra con-cretização, o gene fundido pode ser sintetizado por técnicas convencionais,incluindo sintetizadores de DNA automáticos. Alternativamente, a amplifica-ção por PCR de fragmentos gênicos pode ser conduzida com iniciadoresâncoras que dão origem a sobreposições complementares entre dois frag-mentos gênicos consecutivos que podem subseqüentemente ser anelados ere-amplificados para gerar uma seqüência gênica quimérica (consultar, porexemplo, Ausubel et al., supra). Ademais, existem muitos vetores de expres-são à disposição no mercado que já codificam um grupamento de fusão (porexemplo, polipeptídeo GST ). É possível clonar um ácido nucléico que codifi-ca um polipeptídeo de CXCL13 em um vetor de expressão de forma que ogrupamento de fusão seja unido "in-frame"ao polipeptídeo de CXCL13.

Uma seqüência de sinalização de polipeptídeo de CXCL13 podeser utilizada para facilitar a secreção e isolamento da proteína secretada oude outras proteínas de interesse. Seqüências de sinalização são caracteri-zadas tipicamente por um núcleo contendo aminoácidos hidrofóbicos quesão geralmente clivados da proteína madura, durante a secreção em um oumais eventos de clivagem. Estes peptídeos de sinalização contêm sítios deprocessamento que permitem a clivagem da seqüência de sinalização dasproteínas maduras, à medida que elas passam pela via de secreção. Porconseguinte, a invenção refere-se aos polipeptídeos descritos com seqüên-cia de sinalização, bem como a própria seqüência de sinalização e ao poli-peptídeo sem a seqüência de sinalização (isto é, os produtos da clivagem).Em uma concretização, uma seqüência de ácido nucléico, codificadora deseqüência de sinalização da invenção, pode ser operacionalmente ligada,em vetor de expressão, a uma proteína de interesse, como uma proteínaque não habitualmente secretadas ou é, de outra forma, difícil de ser isolada.A seqüência de sinalização direciona a secreção da proteína, como de umhospedeiro eucariótico no qual o vetor de expressão é transformado, e é,subseqüente ou concomitantemente, clivada. A proteína pode ser, em se-guida, purificada de imediato do meio extracelular por métodos reconhecidosna técnica. Alternativamente, a seqüência de sinalização pode ser ligada àproteína de interesse, utilizando uma seqüência que facilita a purificação,como uma com domínio GST.

Em uma outra concretização, as seqüências de sinalização dapresente invenção podem ser utilizadas para identificar seqüências regula-doras, por exemplo, promotoras, intensificadoras e/ou repressoras. Uma vezque seqüência de sinalização são, em grande parte, seqüências amino-terminal de um peptídeo, os ácidos nucléicos que flanqueiam esta seqüên-cia, em seu lado amino-terminal são, possivelmente, seqüências que afetamtranscrição. Dessa forma, uma seqüência de nucleotídeos que codifica todaou parte de uma seqüência de sinalização pode ser utilizada como sondapara identificar e isolar seqüências de sinalização e suas regiões laterais, eestas regiões laterais podem ser analisadas para identificar elementos regu-ladores em seu interior.

A presente invenção refere-se também a variantes dos polipep-tídeos de CXCL13 e pode incluir uma ou mais substituições, deleções ouadições de aminoácidos, que resultantes de mutações naturais ou por mani-pulação humana, conforme especificado no presente. Estas mutações ousubstituições podem incluir muteínas, cujas mutações podem ser suficienteso bastante para alterar as propriedades do peptídeo sem alterar a sua ativi-dade biológica de inibir a ligação de CXCL13 humana a seu ligante. Eviden-temente, o número de substituições de aminoácidos que um versado efetua-ria depende de muitos fatores, inclusive aqueles descritos acima. Em certasconcretizações da invenção, o número de substituições, inserções ou dele-ções de aminoácidos, para qualquer determinado polipeptídeo, fragmento ouvariante de CXCL13, não será acima de 1-5, ou qualquer intervalo ou valorno mesmos, conforme especificado no presente.

Os polipeptídeos de CXCL13 podem compreender também ami-noácidos modificados, não naturais e pouco comuns, substituídos ou acres-centados a suas seqüências. Uma lista de exemplos de aminoácidos modifi-cados, não naturais e pouco comuns é fornecida abaixo.

Aminoácido modificado (pouco comum) SímboloÁcido 2-aminoadípico AadÁcido 3-aminoadípico BaadÁcido beta-alanina, beta-aminopropiônico bAlaÁcido 2-aminobutírico AbuÁcido 4-aminobutírico, ácido piperidínico 4AbuÁcido 6-aminocapróico AcpÁcido 2-aminoheptanóico AheÁcido 2-aminoisobutílico AibÁcido 3-aminoisobutírico BaibÁcido 2-aminopimélico ApmÁcido 2,4-diaminobutírico DbuDesmosina DesÁcido 2,2'-diaminopimélico DpmÁcido 2,3-diaminopropiônico DprN-etilglicina EtGIiN-etilasparagina EtAsnHidroxilisina HilAlo-hidroxilisina Ahil3-hidroxiprolina 3HipAminoácido modificado (pouco comum) Símbolo

4-hidroxiprolina 4Hip

Isodesmosina Ide

Alo-isoleucina Aile

N-metilglicina, sarcosina MeGIi

N-metilisoleucina Melle

6-N-metillisina MeLis

N-metilvalina MeVaI

Norvalina Nva

Norleucina Nle

Ornitina Orn

Aminoácidos em um polipeptídeo de CXCL13, essenciais parafunção, podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica, comomutagênese sítio-dirigido ou mutagênese de varredura de alanina (por exem-plo, Ausubel, supra, Capítulos 8 e 15; Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). O último procedimento introduz mutações únicas em a-lanina, em cada resíduo na molécula. As moléculas resultantes são testadas,em seguida, quanto à atividade biológica, como, mas não limitada a, pelomenos, uma ação de neutralização de CXCL13.

Estes variantes possuem uma seqüência alterada de aminoáci-dos e podem funcionar como agonistas (miméticos) ou antagonistas. Varian-tes podem ser gerados por mutagênese, por exemplo, mutação pontual dis-tinta ou trucagem. Um agonista pode reter substancialmente a mesma, ouum subconjunto, das atividades biológicas da forma natural existente da pro-teína. Um antagonista de uma proteína pode inibir uma ou mais atividadesda forma natural existente da proteína, por exemplo, competindo por ligaçãoa um membro, em sentido descendente ou ascendente, de uma cascata desinalização celular que inclua a proteína de interesse. Dessa forma, efeitosbiológicos específicos podem ser provocados por tratamento com um varian-te de função limitada. O tratamento de um sujeito com variante, exibindo umsubconjunto de atividades biológicas da forma natural existente da proteína,pode apresentar menos efeitos colaterais, em um sujeito, do que aquele coma forma natural existente da proteína.

Variantes de polipeptídeo de CXCL13 que funcione como ago-nistas (miméticos) ou antagonistas podem ser identificados por varreduracombinatória em bibliotecas de mutantes, por exemplo, mutantes de truca-gem, da proteína da invenção, quanto à atividade agonista ou antagonista.Em uma concretização, é gerada uma biblioteca diversificada de variantes,por mutagênese combinatória, em nível de ácido nucléico, e é codificada poruma biblioteca diversificada de genes. É possível produzir uma bibliotecadiversificada de variantes, por exemplo, efetuando a ligação, por via enzimá-tica, de oligonucleotídeos misturados em seqüências gênicas, de forma queum conjunto degenerado de possíveis seqüências protéicas possa ser ex-primido sob a forma de polipeptídeos individualizados ou, alternativamente,sob a forma de conjunto de proteínas de fusão maiores (por exemplo, paraexibição em fagos). Existem vários métodos que podem ser utilizados paraproduzir bibliotecas de possíveis variantes do polipeptídeo de CXCL13, apartir de uma seqüência degenerada de oligonucleotídeos. Métodos parasíntese de oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na técnica (videpor exemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et aí. (1984) Annu.Rev. Biochem. 53:323; Itakura et ai (1984) Science 198:1056; Ike et al.(1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

Além disso, bibliotecas de fragmentos da seqüência codificantede polipeptídeos de CXCL13 podem ser utilizadas para gerar uma populaçãodiversificada de polipeptídeos para varredura e seleção subseqüente de va-riantes. Por exemplo, é possível gerar uma biblioteca de fragmentos de se-qüência codificante pelo tratamento de um fragmento de fita dupla, resultan-tes de PCR, da seqüência codificante de interesse com uma nuclease, sobcondições em que cortes ocorrem somente aproximadamente uma vez pormolécula, desnaturação do DNA de fita dupla, renaturação do DNA paraformação de DNA de fita dupla que pode incluir pares em orientaçãosentido/anti-sentido dos diferentes produtos cortados, remoção de partes defita simples dos duplex reformados, por tratamento com S1 nuclease, e liga-ção do fragmento resultante da biblioteca em um vetor de expressão. Poreste método, é possível derivar uma biblioteca de expressão que codifiquefragmentos amino terminal e internos de vários tamanhos da proteína deinteresse.

Existem várias técnicas conhecidas na técnica para varredura deprodutos gênicos de bibliotecas combinatoriais, produzidos por mutaçõespontuais ou trucagem, e para varredura de bibliotecas de cDNA de produtosgênicos com propriedade selecionada. As técnicas mais amplamente utiliza-das, que permitem análise de alto rendimento em varredura de grandes bi-bliotecas gênicas, inclui tipicamente clonagem dos genes da biblioteca emvetores de expressão replicáveis, transformação de células apropriadas coma biblioteca resultante de vetores e expressão dos genes combinatoriais, sobcondições nas quais a detecção de uma atividade desejada facilita o isola-mento do vetor codificador do gene cujo produto foi detectado. Mutagênesepor funções recursivas(REM), técnica que intensifica a freqüência de mutan-tes funcionais nas bibliotecas, pode ser utilizada, associada aos ensaios devarredura para identificar variantes de antagonistas de polipeptídeos deCXCL13 (Arkin e Yourvan (1992) Proc. Nati Acad. Sei. USA 89:7811-7815;Delgrave et ai (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Composições e seus usos

De acordo com a invenção, os antagonistas neutralizadores deCXCL13, como anticorpos monoclonais, descritos nesta exposição podemser utilizados para inibir a atividade da CXCL13. Adicionalmente, estesantagonistas podem ser utilizados para inibir doenças inflamatórias relacio-nadas com CXCL13 afetadas por este tratamento, as quais podem incluir,mas não limitada a, doenças pulmonares relacionadas. O indivíduo a sertratado pode ser qualquer mamífero e é, de preferência, primata, animal deestimação mamífero e, mais preferivelmente, um paciente humano. A quan-tidade de antagonista administrada variará de acordo com a finalidade paraa qual está sendo utilizado e o modo de administração.

Os anti-antagonistas de CXCL13 podem ser administrados poralguns métodos, cujo efeito resultante ocorra em tecidos nos quais a pre-venção ou interrupção da atividade de CXCL13 é desejada. Além disso, nãoé preciso que os antagonistas de CXCL13 estejam presentes a nível localpara afetar a atividade da CXCL13; por conseguinte, podem ser administra-dos sempre que o acesso a compartimentos ou líquidos do corpo contendoCXCL13 for possível. No caso de tecidos inflamados, malignos ou, de outraforma, comprometidos, estes métodos podem incluir aplicação direta de umaformulação contendo os antagonistas. Estes incluem administração intrave-nosa de composição líquida, administração transdérmica de formulação lí-quida ou sólida, administração oral, tópica ou intersticial ou intra-operatória.A administração pode ser afetada pelo implante de dispositivo cuja funçãoprimária possa não ser a de veículo de liberação de fármaco.

A administração pode ser oral ou por injeção local em tumor outecido, porém geralmente, anticorpo monoclonal é administrado por via intra-venosa. Em geral, a dose varia de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproxi-madamente 12,0 mg/kg, podendo ser administrada sob a forma de bolus ouinfusão lenta ou contínua que permite ser controlada por bomba com micro-processador controlado ou programável.

Alternativamente, DNA codificador, de preferência, de um frag-mento de anticorpo monoclonal pode ser isolado de células de hibridoma eadministrado a um mamífero. O DNA pode ser administrado na forma des-nuda ou inserido em vetor recombinante, por exemplo, vírus vaccinia, demaneira que resulte em expressão do DNA nas células do paciente e libera-ção do anticorpo.

O anticorpo monoclonal utilizado no método da presente inven-ção pode ser formulado por qualquer um dos métodos estabelecidos de for-mulação de composições farmacêuticas, por exemplo, conforme descritosem Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985. Para facilitar a administra-ção, o anticorpo monoclonal será combinado tipicamente com veículo farma-ceuticamente aceitável. Estes veículos incluem água, solução salina fisioló-gica ou óleos.

Formulações adequadas para administração parenteral incluemsoluções injetáveis estéreis aquosas e não aquosas que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornem a formulação iso-tônica em relação ao sangue do pretendido recipiente; e suspensões esté-reis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes suspensores e es-pessantes. Desde que não exista incompatibilidade entre qualquer meioconvencional e o ingrediente ativo e seu uso pretendido, é contemplado ouso deste meio em quaisquer composições.

As formulações podem estar contidas em recipientes de doseúnica ou dose múltipla, por exemplo, ampolas e frascos lacrados, e podemser armazenadas em estado Iiofilizado que requer somente a adição do veí-culo líquido estéril, por exemplo, água para injetáveis, imediatamente antesde uso.

As moléculas de ácido nucléico, polipeptídeos e anticorpos an-tagonistas de CXCL13 podem ser incorporados em composições farmacêu-ticas adequadas para administração. Estas composições compreendem tipi-camente a molécula de ácido nucléico, proteína ou anticorpo e um veículofarmaceuticamente aceitável. Conforme utilizada nesta exposição, a expres-são "veículo farmaceuticamente aceitável" pretende incluir todos e quaisquersolventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos eantifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e similares, com-patíveis com administração farmacêutica. O uso destes meios e agentes pa-ra substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Des-de que não exista incompatibilidade entre qualquer meio convencional ouagente convencional e o composto ativo, é contemplado o uso dos mesmosnas composições. Compostos ativos suplementares também podem ser in-corporados na composições.

Em uma outra característica, a invenção refere-se a antagonis-tas de CXCL13, conforme descritos nesta exposição, que são modificadospela ligação covalente de um grupamento. Esta modificação pode produzirantagonistas de CXCL13 com propriedades farmacocinéticas melhores (porexemplo, aumento de meia-vida sérica ir> vivo). O grupamento orgânico podeser um grupo polimérico hidrofílico linear ou ramificado, grupo de ácidos gra-xos ou grupo de éster de ácido graxo. Em concretizações especiais, o pesomolecular do grupo polimérico hidrofílico pode ser de aproximadamente 800a aproximadamente 120.000 Dáltons e pode ser um polialcano glicol (porexemplo, polietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol (PPG)), polímero de car-boidratos, polímero de aminoácidos ou polivinil pirrolidona, e o grupo de áci-do graxo ou grupo de éster de ácido graxo pode conter de aproximadamenteoito a aproximadamente quarenta átomos de carbono. Conforme utilizadonesta exposição, o termo "ácido graxo" abrange ácidos monocarboxílicos edicarboxílicos. Ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para mo-dificar anticorpos da invenção podem ser saturados ou conterem uma oumais unidades não saturadas. Ácidos graxos adequados para modificar anti-corpos da invenção incluem, por exemplo, n-dodecanoato (C12, laurato),n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (C-ιβ, estearato), n-eicosa-noato (C20, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato(C30), n-tetracontanoato (C4o), eis- delta 9-octadecanoato (C-|8, oleato), todosos c/s-delta-5,8,11,14-eicosatetraenoato (C2o, araquidonoato), ácido octano-dióico, ácido tetradecanodióico, ácido octadecanodióico, ácido docosanodi-óico e os similares. Ésteres de ácido graxo adequados incluem monoésteresde ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo alquila baixo linear ouramificado. O grupo alquila baixo pode compreender de um a aproximada-mente doze, de preferência, de um a aproximadamente seis átomos de car-bono.

Os polipeptídeos e anticorpos humanos modificados podem serpreparados por métodos adequados, como por reação com um ou mais a-gentes modificadores. "Agente modificador", conforme o termo é utilizadonesta exposição, refere-se a um grupo orgânico adequado (por exemplo,polímero hidrofílico, ácido graxo, éster de ácido graxo) que compreenda umgrupo de ativação. "Grupo de ativação" é um grupamento químico ou grupofuncional que pode, sob condições apropriadas, reagir com um segundogrupo químico e, pelo mesmo, formar uma ligação covalente entre o agentemodificador e o segundo grupo químico. Por exemplo, grupos de ativaçãoamina-reativos incluem grupos eletrofílicos como tosilato, mesilato, halo (clo-ro, bromo, flúor, iodo), N-hidroxissuccinimidil ésteres (NHS) e os similares.Grupos de ativação que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, ma-leimida, iodoacetila, acrilolila, dissulfetos de piridila, ácido 5-tiol-2-nitrobóico-tiol (TNB-tiol) e os similares. Grupos aldeído funcionais podem ser acopla-dos a moléculas contendo amina ou hidrazida, e grupo azida pode reagircom grupo fosforoso trivalente, formando ligações fosforamidato ou fosfori-mida. Métodos adequados para introdução de grupos de ativação em molé-culas são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Hermanson, G. T., Bio-conjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)).

A invenção inclui métodos para o preparo de composições far-macêuticas que modulem a expressão ou atividade de polipeptídeo, ácidonucléico ou anticorpo contra CXCL13. Esses métodos compreendem a for-mulação de um veículo farmaceuticamente aceitável com um agente quemodula a expressão ou atividade de um polipeptídeo, ácido nucléico ou anti-corpo contra CXCL13. Estas composições podem incluir ainda agentes ati-vos adicionais. Dessa forma, a invenção inclui ainda métodos de preparo decomposição farmacêutica pela formulação de um veículo farmaceuticamenteativo com um agente que modula a expressão ou atividade de polipeptídeo,ácido nucléico ou anticorpo contra CXCL1 e um ou mais compostos ativosadicionais.

Este agente modulador de expressão ou atividade pode ser, porexemplo, uma molécula pequena. Estas moléculas pequenas podem incluir,por exemplo, peptídeos, peptídeo miméticos, aminoácidos, análogos de a-minoácidos, polinucleotídeos, análogos de polinucleotídeos, nucleotídeos,análogos de nucleotídeos, compostos orgânicos ou inorgânicos (isto é, com-postos heteroorgânicos ou organometálicos) com peso molecular inferior aaproximadamente 5.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgâni-cos com peso molecular inferior a aproximadamente 1.000 gramas por mol,compostos orgânicos ou inorgânicos com peso molecular inferior a aproxi-madamente 500 gramas por mol e sais, ésteres e outras formas farmaceuti-camente aceitáveis destes compostos.

Fica entendido que doses apropriadas de agentes de pequenasmoléculas e agentes protéicos ou polipeptídicos dependem de alguns fatoresa alcance do conhecimento de qualquer médico, veterinário ou pesquisadorespecializado no assunto. A(s) dose(s) destes agentes variará, por exemplo,em função do tipo, tamanho e condição do sujeito ou amostra a ser tratado,dependendo ainda da via pela qual a composição deverá ser administrada,se aplicável, e o efeito que o clínico pretende do polipeptídeo, ácido nucléicoou anticorpo contra CXCL13. Doses representativas de molécula pequenaincluem quantidades em miligramas ou microgramas por quilo de peso indi-vidual ou de amostra (por exemplo, de aproximadamente 1 micrograma porquilo a aproximadamente 500 miligramas por quilo, de aproximadamente100 microgramas por quilo a aproximadamente 5 miligramas por quilo, ou deaproximadamente 1 micrograma por quilo a aproximadamente 50 microgra-mas por quilo. Doses representativas de proteína ou polipeptídeo incluemquantidades em grama, miligrama ou micrograma por quilo de peso individu-al ou de amostra (por exemplo, de aproximadamente 1 micrograma por quiloa aproximadamente 5 gramas por quilo, de aproximadamente 100 micro-gramas por quilo a aproximadamente 500 miligramas por quilo, ou de apro-ximadamente 1 miligrama por quilo a aproximadamente 50 miligramas porquilo). Fica ainda entendido que doses apropriadas de um destes agentesdependem da potência do agente, em termos de expressão ou atividade aser modulada. Estas doses apropriadas podem ser determinadas pelos en-saios aqui descritos.

Quando um ou mais destes agentes tiverem que ser administra-dos a um animal (por exemplo, humano), para modular a expressão ou ativi-dade de polipeptídeos, ácido nucléicos ou anticorpos contra CXCL13, o mé-dico, veterinário ou pesquisador pode, por exemplo, prescrever uma doseinicial relativamente baixa, aumentando subseqüentemente a dose até serobtida uma resposta apropriada. Ademais, fica entendido que o nível especí-fico da dose, para sujeitos da classe animal, dependerá de uma variedadede fatores, incluindo a atividade do agente específico empregado, a idade,peso corporal, condições gerais de saúde, sexo e dieta do sujeito, o horário deadministração, a via de administração, a taxa de excreção, qualquer combi-nação de fármacos e o grau de expressão ou atividade a ser modulado.Composições farmacêuticas da invenção são formuladas deforma a serem compatíveis com a sua via de administração pretendida. Exem-plos de vias de administração incluem parenteral, por exemplo, intravenosa,intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, por inalação ou bucal), trans-dérmica (tópica), transmucosa e administração retal. Soluções ou suspen-sões utilizadas para aplicação parenteral, intradérmica ou subcutânea po-dem incluir um dos seguintes componentes: diluente estéril, como água parainjetáveis, solução salina, óleos fixados, polietilenoglicóis, glicerina, propile-noglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, como álcoolbenzílico ou metil parabenos; antioxidantes, como ácido ascórbico ou bissul-feto de sódio; agentes quelantes, como etilenodiamina-ácido acético; tam-pões, como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste de tonicida-de, como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ebases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. O preparado parenteralpode estar contido em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dosesmúltiplas feitos de vidro ou plástico.

Composições farmacêuticas adequadas para uso injetável inclu-em soluções estéreis aquosas (quando solúveis em água) ou dispersões oupós estéreis para o preparado extemporâneo de soluções ou dispersões es-téreis injetáveis. Para administração intravenosa, veículos adequados inclu-em solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremofor EL (BASF; Par-sippany, N.J.) ou solução salina com tampão fosfato (PBS). Em todas assituações, a composição deverá ser estéril e suficientemente fluída para faci-litar o uso em seringas, quando apropriado. Deverá ser estável sob as con-dições de fabricação e armazenamento, e conservada contra a ação conta-minadora de microorganismos, como bactérias e fungos. O veículo pode serum solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, po-liol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e os simi-lares), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode sermantida, por exemplo, pelo uso de revestimento, como de lecitina, pela ma-nutenção do tamanho de partícula exigido, no caso de dispersão, e pelo usode tensoativos. Em muitas situações, será preferível incluir agentes isotôni-cos, por exemplo, açúcares, polialcóois, como manitol, sorbitol ou cloreto desódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveispode ser obtida pela inclusão, na composição, de um agente que retarde aabsorção, por exemplo monoestearato de alumínio e gelatina. Excipientes eaditivos farmacêuticos, úteis na estabilização da presente composição, in-cluem, entre outros, polipeptídeos, peptídeos, aminoácidos, lipídeos ecarboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di, tri, tetrae oligossacarídeos; derivados de açúcares, como alditóis, ácidos aldônico,açúcares esterificados e os similares; e polissacarídeos ou polímeros deaçúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em combinação, com-preendendo, isoladamente ou em combinação, 1 - 99,99% em peso ou vo-lume. Entre os excipientes polipeptídicos, estão incluídos albumina sérica,como albumina sérica humana (HSA), albumina humana recombinante(rHA), gelatina, caseína e os similares. Aminoácidos representativos quepodem funcionar também como tampões incluem alanina, glicina, arginina,betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina,isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e os similares. Glicina éum dos aminoácidos preferidos.

Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas por incorpo-ração do composto ativo (por exemplo, polipeptídeo ou anticorpo), na quan-tidade exigida, em solvente apropriado com um ou uma combinação dos in-gredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por filtraçãoesterilizada. Em geral, dispersões são preparadas por incorporação do com-posto ativo em veículo estéril, contendo meio de dispersão básico, seguidopor incorporação dos outros ingredientes exigidos entre aqueles enumera-dos acima. No caso de pó estéril, para o preparo de soluções estéreis injetá-veis, os métodos preferidos de preparo são secagem a vácuo e liofilizaçãoque resultam em ingrediente ativo em pó, acrescido de qualquer ingredientedesejado da solução estéril filtrada previamente do mesmo. Entre os exem-pios destas soluções estéreis, e métodos de preparo das mesmas bem co-nhecidos na técnica, incluem aqueles descritos em Remington's Pharmaceu-tical Sciences, Gennaro, Ed., 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA)1990.

Composições orais incluem geralmente diluente inerte ou veículocomestível. Elas podem estar contidas em cápsulas de gelatina ou serempreparadas sob a forma de comprimidos. Para administração terapêuticaoral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e utilizado naforma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas. Composições orais podem serpreparadas também com veículo líquido para uso como solução de lavagembucal, em que o composto no veículo líquido é aplicado oralmente e cuspidoe expectorado ou engolido.

Agentes diluentes e/ou materiais adjuvantes farmaceuticamentecompatíveis podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimi-dos, pílulas, cápsulas, pastilhas, e similares, podem conter qualquer um en-tre os seguintes ingredientes, ou compostos de natureza similar: diluente,como celulose microcristalina, goma tragacanta ou gelatina; excipiente, co-mo amido ou lactose, agente desintegrante, como ácido algínico, Primogelou amido de milho; lubrificante, como estearato de magnésio ou Sterotes;deslizante, como dióxido de silicone coloidal; agente adoçante, como saca-rose ou sacarina; ou um agente de sabor, como menta, salicilato de metilaou sabor de laranja.

Para administração por inalação, os compostos são liberadossob a forma de partículas aerossolizadas de recipiente pressurizado ou dis-pensador que contém propelente adequado, por exemplo, gás como dióxidode carbono, ou de um nebulizador. Alternativamente, composições formula-das sob a forma de partículas podem ser dispersas por meios eletrostáticos,mecânicos, incluindo vibrações, ou meios ultra-sônicos, conforme expostonas Patentes U.S. N2S: 4530464, 4533082, 5838350, 6113001, 6514496,5518179, 5152456, 5261601 e 4605167.

A administração sistêmica pode ser realizada também por meiostransmucosa ou transdérmico. Para administração transmucosa ou trans-dérmica, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utili-zados na formulação. Estes penetrantes são geralmente conhecidos na téc-nica e incluem, por exemplo, para administração transmucosa, detergentes,sais biliares e derivados de ácido fusídico. Administração transmucosa podeser obtida pelo uso de sprays nasais ou supositórios. Para administraçãotransdérmica, os compostos ativos são formulados em pomadas, curativos,géis ou cremes, conforme geralmente conhecidos na técnica.

Os compostos podem ser preparados também sob a forma desupositórios (por exemplo, com bases convencionais para supositórios, co-mo manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção paraliberação retal.

Em uma concretização, os compostos ativos são preparadoscom veículos que servem para sua proteção contra eliminação rápida docorpo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes esistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e bio-compatíveis podem ser utilizados, como etileno vinil acetato, polianidridos,ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Métodos depreparo destas formulações serão evidentes para especialistas na técnica.Suspensões Iipossomais (incluindo Iipossomas com anticorpos monoclonaisincorporados nos mesmos ou sobre os mesmos) podem ser utilizados tam-bém como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Composições e métodosespecialmente preferidos são expostos nas Patentes U.S. Nos 5 891 468 e6316 024.

É especialmente vantajoso formular composições orais ou pa-renterais sob apresentação de dose unitária por facilidade de administraçãoe uniformidade de dose. Apresentação de dose unitária, conforme utilizadanesta exposição, refere-se a unidades fisicamente distintas, adequadas co-mo doses unitárias para o sujeito a ser tratado, cada unidade contendo umaquantidade pré-determinada de composto ativo, calculada para produzir oefeito terapêutico desejado, associada ao veículo farmacêutico exigido. Aespecificação para as apresentações de dose unitária da invenção é ditadapor, e diretamente dependente, as características únicas do composto ativoe o efeito terapêutico em particular a ser atingido, e as limitações inerentesna técnica para composição deste composto ativo para o tratamento de indi-víduos.Para anticorpos, a dose preferida é de aproximadamente 0,1mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal (geralmente, de aproximadamente 10mg/kg a 20 mg/kg). Se a atuação pretendida do anticorpo ocorrer no cére-bro, a dose de aproximadamente 50 mg/kg a 100 mg/kg é habitualmente aapropriada. Em geral, anticorpos parcialmente humanos e anticorpos intei-ramente humanos possuem meia-vida mais longa no corpo humano do queoutros anticorpos. De acordo com o mesmo, o uso de doses mais baixas eadministração menos freqüente são geralmente possíveis. Modificações,como lipidização, podem ser utilizadas para estabilizar anticorpos e melhorara sua absorção e penetração em tecidos (por exemplo, no cérebro). Um mé-todo para lipidização de anticorpos é descrito por Cruikshank et ai ((1997) J.Acquired Immune Deficiency Syridromes and Human Retrovirology 14:193).

As moléculas de ácido nucléico antagonistas de CXCL13 podemser inseridas em vetores e utilizadas como vetores de geneterapia. Vetoresde geneterapia podem ser liberados para um sujeito, por exemplo, por inje-ção intravenosa, administração local (Pat. U.S. N2 5 328 470), ou por injeçãoestereotática (vide, por exemplo, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 91:3054- 3057). O preparado farmacêutico do vetor de geneterapia po-de incluir este vetor em diluente aceitável, ou pode compreender uma matrizde liberação lenta na qual o veículo de liberação do gene é embebido. Alter-nativamente, quando o vetor de liberação de gene completo pode ser produ-zido a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, opreparado farmacêutico pode incluir uma ou mais células que produzem osistema de liberação do gene.

As composições farmacêuticas podem estar contidas em recipi-ente, embalagem ou dispensador, acompanhadas por instruções para admi-nistração.Farmacoqenômica

Agentes ou moduladores com efeito estimulador ou inibidor so-bre atividade ou expressão de um polipeptídeo de CXCL13, conforme identi-ficados por ensaio de varredura descrito nesta exposição, podem ser admi-nistrados a indivíduos para tratamento (profilático ou terapêutico) de doen-ças associadas à atividade anormal do polipeptídeo. Associada a este trata-mento, a farmacogenômica (ou seja, o estudo da relação entre o genótipo deum indivíduo e a resposta daquele indivíduo a um composto estranho oufármaco) pessoal pode ser considerada. Diferenças em metabolismo de me-dicamentos podem levar à toxicidade grave ou falha de tratamento por alte-ração da relação entre dose e concentração sangüínea do fármaco farmaco-logicamente ativo. Dessa forma, a farmacogenômica do indivíduo permite aseleção de agentes efetivos (ou seja, fármacos) para tratamentos profiláticosou terapêuticos, com base em consideração ao genótipo pessoal. Esta far-macogenômica pode ser utilizada ainda para determinar doses e regimesterapêuticos apropriados. Dessa forma, a atividade de um polipeptídeo deCXCL13, expressão de um ácido nucléico de CXCL13 ou quantidade de mu-tação em gene de CXCL13, em um indivíduo, podem ser determinados paraselecionar, pelo mesmo, os agente(s) apropriado(s) para tratamento terapêu-tico ou profilático do indivíduo.

Farmacogenômica diz respeito a variações hereditárias clinica-mente significativas na resposta a fármacos, decorrente de disposição alte-rada do fármaco e ação anormal em pessoas afetadas. Vide, por exemplo,Linder (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266. Em geral, é possível diferenciardois tipos de condições farmacogenéticas. Condições genéticas, cuja trans-missão é a de um único fator que altera a maneira que os fármacos atuamno corpo, são referidas como "ação farmacológica alterada". Condições ge-néticas, cuja transmissão é a de fatores únicos que alteram a maneira que ocorpo atua sobre fármacos, são referidas como "metabolismo farmacológicoalterado". Estas condições farmacogenéticas podem ocorrer como defeitosraros ou polimorfismos. Por exemplo, deficiência de glicose-6-fosfato desi-drogenase (G6PD) é uma enzimopatia hereditária comum na qual a principalcomplicação clínica é hemólise após ingestão de fármacos oxidantes (anti-maláricos, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) e consumo de grãos defava.

A título de concretização ilustrativa, a atividade de enzimas me-tabolizadoras de fármacos é um dos principais determinantes tanto da inten-sidade como da duração de sua ação. A descoberta de polimorfismos gené-ticos de enzimas metabolizadoras de fármacos (por exemplo, N-acetiltrans-ferase 2 (NAT 2) e enzimas do citocromo P450, CYP2D6 e CYP2C19) forne-ceu uma explicação para o motivo porque alguns pacientes não obtém osefeitos farmacológicos esperados ou exibem resposta farmacológica exacer-bada e toxicidade séria após tomarem a dose padrão e segura de um fárma-co. Estes polimorfismo são expressados em dois fenótipos na população, ometabolizador extensivo(EM) e metabolizador ineficiente (PM). A prevalênciade PM é diferente entre populações distintas. Por exemplo, o gene codifica-dor de CYP2D6 é altamente polimórfico e várias mutações foram identifica-das em PM1 todas estas levando à ausência de CYP2D6 funcional. Metabo-lizadores ineficientes de CYP2D6 e CYP2C19 experimentam com freqüênciaresposta farmacológica exagerada, quando recebem doses convencionais.Se um metabólito é o grupamento terapêutico ativo, PM não exibirá respostaterapêutica, conforme demonstrado pelo efeito analgésico de codeína, medi-ado por seu metabólito de morfina formado por CYP2D6. O outro extremoinclui os assim chamados metabolizadores ultra-rápidos que não respondema doses padrão. Recentemente, a base molecular de metabolismo ultra-rápido foi identificada como sendo decorrente de amplificação do gene deCYP2D6.

Dessa forma, a atividade de um polipeptídeo de CXCL13, ex-pressão de um ácido nucléico codificador do polipeptídeo ou quantidade demutação de um gene codificador do polipeptídeo, em um indivíduo, podemser demonstrados para selecionar, pelo mesmo, o(s) agente(s) apropriado(s)para o indivíduo. Ademais, estudos farmacogenéticos podem ser utilizadospara aplicar genotipagem de alelos polimórficos que codificam enzimas me-tabolizadoras de fármacos em um indivíduo para a identificação de fenótipode responsividade farmacológica individual. Esse conhecimento, quandoaplicado à seleção de dose ou fármaco, pode prevenir reações adversas oufalha terapêutica e, dessa forma, aumentar a eficiência terapêutica ou profi-lática no tratamento de um sujeito com modulador de atividade ou expressãodo polipeptídeo, como um daqueles identificados em exemplos dos ensaiosde varredura, descritos nesta exposição.

Métodos de Tratamento

A presente invenção provê métodos profiláticos e terapêuticospara o tratamento de um sujeito em risco (ou susceptível) de doença ou comuma doença associada a expressão ou atividade anormal de um polipeptí-deo de CXCL13 e/ou na qual o polipeptídeo de CXCL13 está envolvido.

A presente invenção provê um método de modulação ou trata-mento de, pelo menos, uma doença ou condição relacionada com CXCL13, emcélula, tecido, órgão, animal ou paciente, conforme conhecido na técnica oudescrito no presente, empregando, pelo menos, um antagonista de CXCL13.

Composições de antagonistas de CXCL13 podem encontrar usoterapêutico no tratamento de condições relacionadas com doença pulmonar,como asma, enfisema, DPOC e doença pulmonar crônica neonatal.

A presente invenção provê também um método de modulaçãoou tratamento de, pelo menos, uma doença relacionada com sistema imune,em célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, entre outras, artritereumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite reumatóide juvenil de apareci-mento sistêmico, artrite psoriática, espondilite anquilosante, úlcera gástrica,artropatias soronegativas, osteoartrite, doença intestinal inflamatória, coliteulcerativa, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome do anticorpo antifosfolipí-deo, iridociclite/uveíte/neurite óptica, fibrose pulmonar idiopática, vasculitesistêmica/granulomatose de Wegener, sarcoidose, orquite/procedimentospara reversão de vasectomia, doenças alérgicas/atópicas, rinite alérgica,eczema, dermatite de contato alérgica, conjuntivite alérgica, pneumonite porhipersensibilidade, transplantes, rejeição de órgão transplantado, doença doenxerto versus hospedeiro, síndrome da resposta inflamatória sistêmica,síndrome séptica, sepse por gram positivos, sepse por gram negativos, sep-se de cultura negativa, sepse por fungos, febre neutropênica, urosepse, me-ningococcemia, trauma/hemorragia, queimaduras, exposição à radiação io-nizante, pancreatite aguda, síndrome da angústia respiratória em adultos,artrite reumatóide, hepatite induzida por álcool, patologias inflamatórias crô-nicas, sarcoidose, doença de Crohn1 anemia falciforme, diabetes, nefrose,doenças atópicas, reações de hipersensibilidade, rinite alérgica, febre dofeno, rinite perenial, conjuntivite, endometriose, urticária, anafilaxia sistêmi-ca, dermatite, anemia perniciosa, doença hemolítica, trombocitopenia, rejei-ção de enxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição em transplante de rim,rejeição em transplante de coração, rejeição em transplante de fígado, rejei-ção em transplante de pâncreas, rejeição em transplante de pulmão, rejeiçãoem transplante de medula óssea (BMT), rejeição de aloenxerto cutâneo, re-jeição em transplante de cartilagem, rejeição de enxerto ósseo, rejeição emtransplante de intestino delgado, rejeição em implante de timo fetal, rejeiçãoem transplante de paratireóide, rejeição de xenoenxerto de qualquer órgãoou tecido, rejeição de aloenxerto, reações de hipersensibilidade anti-receptor, doença de Graves, doença de Raynoud, diabetes tipo B insulino-resistente, miastenia grave, citotoxicidade mediada por anticorpos, reaçõesde hipersensibilidade tipo III, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de PO-EMS (síndrome de polineuropatia, organomegalia, gamopatia monoclonal ealterações cutâneas), síndrome de anticorpos antifosfolipídeos, pênfigo, es-clerodermia, doença mista do tecido conjunto, doença de Addison idiopática,diabetes mellitus, hepatite crônica ativa, cirrose biliar primária, vitiligo, vascu-lite, síndrome de cardiotomia pós-IM, hipersensibilidade tipo IV, dermatite decontato, pneumonite por hipersensibilidade, rejeição de aloenxerto, granulo-mas decorrentes de organismos intracelulares, sensibilidade farmacológica,metabólica/idiopática, doença de Wilson, hemocromatose, deficiência dealfa-1-antitripsina, retinopatia diabética, tireoidite de Hashimoto, osteoporo-se, avaliação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, cirrose biliar primária, ti-reoidite, encefalomielite, caquexia, fibrose cística, Iinfohistiocitose hematofa-gocítica familiar, condições dermatológicas, psoríase, alopecia, síndromenefrótica, nefrite, glomerulonefrite, insuficiência renal aguda, hemodiálise,uremia, toxicidade, pré-eclâmpsia, terapia com okt3, terapia com anti-cd3,terapia com citocina, quimioterapia, radioterapia (por exemplo, incluindo en-tre outras, toastenia, anemia, caquexia e similares), intoxicação crônica porsalicilato, e os similares. Vide, por exemplo, o Merck Manual, 12§ - M- edi-ções, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999),Pharmacotherapy Handbook, Wells et ai, eds., Second Edition, Appletonand Lange1 Stamford, Conn. (1998, 2000), aqui incorporados, em sua totali-dade, por referência neste pedido de patente.

A presente invenção provê também um método de modulaçãoou tratamento de, pelo menos, uma doença maligna em célula, tecido, ór-gão, animal ou paciente, incluindo, entre outras, leucemia, leucemia aguda,leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA de célula B, célula T ou FAB, leu-cemia mielóide aguda (LMA), leucemia promielocítica aguda (LPA), leucemiamielocítica crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (LCL), leucemia decélulas pilosas, síndrome mielodisplásica (SMD), linfoma, doença de Hodg-kin, linfoma maligno, linfoma não de Hodgkin, mieloma múltiplo, sarcoma deKaposi, carcinoma colorretal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofarin-geano, histiocitose maligna, síndrome paraneoplásica/ hipercalcemia malig-na, tumores sólidos, adenocarcinomas, melanoma maligno, hemangioma,doença metastática, reabsorção óssea relacionada com câncer, dor óssearelacionada com câncer, e similares.

Distúrbios caracterizados por expressão ou atividade anormaldos polipeptídeos de CXCL13 são ainda descritas em outros locais nestaexposição.

1. Métodos profiláticos

Em uma característica, a invenção provê um método para, pelomesmo, prevenir substancialmente uma doença ou condição associada àexpressão ou atividade anormal de um polipeptídeo de CXCL13, por admi-nistração para o sujeito de um agente que modula a expressão ou, pelo me-nos, uma atividade do polipeptídeo. Sujeitos em risco de doença causada oucontribuída por expressão ou atividade anormal de polipeptídeos de CXCL13podem ser identificados, por exemplo, por qualquer ensaio diagnóstico ouprognóstico, ou combinação, descrito nesta exposição. A administração deagente profilático pode ser efetuada antes que ocorra a manifestação de sin-tomas característicos da anormalidade, de forma que ocorra prevenção dedoença ou distúrbio ou, alternativamente, a sua progressão seja retardada.Dependendo do tipo de anormalidade, por exemplo, um agente agonista ouantagonista pode ser utilizado para o tratamento do sujeito. O agente apro-priado pode ser determinado com base em ensaios de varredura descritosno presente.

2. Métodos terapêuticos

Uma outra característica da invenção diz respeito a métodos demodulação de expressão ou atividade de polipeptídeos de CXCL13 para finsterapêuticos. O método de modulação da invenção envolve o contato deuma célula com um agente modulador de uma ou mais entre as atividadesdo polipeptídeo. Este agente modulador da atividade pode ser do tipo descri-to nesta exposição, como ácido nucléico ou proteína, Iigante cognato naturaldo polipeptídeo, peptídeo, peptídeo mimético ou outra molécula pequena.Em uma concretização, o agente estimula uma ou mais entre as atividadesbiológicas do polipeptídeo. Em uma outra concretização, o agente inibe umaou mais entre as atividades biológicas do polipeptídeo de CXCL13. Exem-pios destes agentes inibidores incluem moléculas de ácido nucléico anti-sentido e anticorpos, além de outros métodos descritos nesta exposição.Estes métodos de modulação podem ser conduzidos in vitro (por exemplo,por cultura da célula com o agente) ou, alternativamente, in vivo (por exem-plo, por administração do agente para um sujeito). Como tanto, a presenteinvenção provê métodos de tratamento de um indivíduo acometido por do-ença ou distúrbio, caracterizado por expressão ou atividade anormal de umpolipeptídeo de CXCL13. Em uma concretização, o método envolve adminis-tração de um agente (por exemplo, um agente identificado por um ensaio devarredura descrito nesta exposição) ou combinação de agentes que modu-lam (por exemplo, regula positivamente ou negativamente) a expressão ouatividade. A inibição de atividade é desejável em situações nas quais a ativi-dade ou expressão é anormalmente alta ou regulada positivamente e/ou naqual a diminuição da atividade possivelmente terá efeito benéfico.

Um método da presente invenção compreende a administraçãode uma quantidade efetiva de uma composição ou composição farmacêuti-ca, contendo, pelo menos, um antagonista de CXCL13, parte ou varianteespecificado deste, para célula, tecido, órgão, animal ou paciente em neces-sidade desta modulação, tratamento ou terapia. Este método pode compre-ender ainda, opcionalmente, co-administração ou terapia combinada paratratamento destas doenças imunes, em que a administração do referido, pe-lo menos, um antagonista de CXCL13, parte ou variante especificado deste,compreende ainda a administração prévia, concomitante e/ou posterior de,pelo menos, um selecionado entre acetato de glutiramer (por exemplo, Co-paxona), ciclofosfamida, azatioprina, glicocorticóides, metotrexato, Paclita-xel, 2-clorodesoxiadenosina, mitoxantrona, IL-10, TGBb, CD4, CD52, ante-gren, CD11, CD18, TNF alfa, IL-1, IL-2 e/ou anticorpo contra CD4 ou antí-corpo fundido contra receptor, interferon alfa, imunoglobulina, Lismide (Re-quinimax™), fator de crescimento similar à insulina 1 (IGF-1), elprodil, pirfe-nidona, mielina oral ou compostos que atuam sobre um ou mais de, pelomenos, um entre: supressão auto-imune de destruição de mielina, regulaçãoimune, ativação, proliferação, migração e/ou função de supressor celular decélulas T, inibição de interação de células T/peptídeo/MHC-ll, indução deanergia de célula T, deleção de células T autorreativas, redução de tráfegoatravés da barreira hematoencefálica, alteração do equilíbrio de citocinaspró-inflamatórias (Th1) e imunomoduladoras (Th2), inibição de inibidores dematriz de metaloproteases, neuroproteção, redução de gliose, promoção dere-mielinização, antagonista de TNF (por exemplo, entre outros, proteína oufragmento derivado de Ig TNF, receptor solúvel de TNF, ou fragmento e pro-teínas de fusão deste, ou um antagonista de TNF de molécula pequena),anti-reumático, relaxante muscular, narcótico, fármaco antiinflamatório nãoesteroidal (NSAID), analgésico, anestésico, sedativo, anestésico local, blo-queador neuromuscular, antimicrobiano (por exemplo, aminoglicosídeo, anti-fúngico, antiparasitário, antiviral, carbapenem, cefalosporina, fluorquinolona,macrolídeo, penicilina, sulfonamida, tetraciclina, um outro antimicrobiano),antipsoriático, corticosteróide, esteróide anabólico, mineral, agente nutritivo,agente tiroidiano, vitamina, hormônio relacionado com cálcio, antidiarréico,antitussígeno, antiemético, antiúlcera, laxativo, anticoagulante, eritropoeitina(por exemplo, epoeitina alfa), filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen),sargramostim (GM-CSF, Leucina), imunização, imunoglobulina, imunossu-pressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), hormônio decrescimento, fármaco de reposição hormonal, modulador de receptor de es-trogênio, midriático, cicloplégico, agente de alquilação, antimetabólito, inibi-dor mitótico, produto radiofarmacêutico, antidepressivo, agente antimaníaco, antipsicótico, ansiolítico, hipnótico, simpaticomimético, estimulante, donepezil,tacrina, medicação para asma, beta agonista, esteróide inalado, inibidor deleucotrieno, metilxantina, cromolina, epinefrina ou análogo, dornase alfa(Pulmozyme), citocina ou antagonista de citocina. Doses adequadas sãobem conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Wells et ai, eds., Pharmaco- therapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000);PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Editi-on, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada um dos quais aquiincorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.

Antagonistas de TNF adequados para composições, terapiacombinada, co-administração, dispositivos e/ou métodos da presente inven-ção (compreendendo ainda, pelo menos, um anticorpo, porção especificadaou variante deste, da presente invenção), incluem, entre outros, proteínasderivadas de Ig anti-TNF, fragmentos destas de ligação a antígeno, molécu-las de receptores que se ligam especificamente a TNF; compostos que im-pedem e/ou inibem a síntese de TNF, liberação de TNF ou sua ação sobrecélulas-alvo, como talidomida, tenidap, inibidores de fosfodiesterase (porexemplo, pentoxifilina e rolipram), agonistas de receptores de adenosinaA2B e promotores de receptores de adenosina A2b; compostos que impe-dem e/ou inibem a sinalização de receptores de TNF, inibidores de proteínaquinase ativada por mitógeno (MAP); compostos que bloqueiam e/ou inibemclivagem de TNF em membrana, como inibidores de metaloproteinases;compostos que bloqueiam e/ou inibem a atividade de TNF, como inibidoresda enzima conversora de angiotensina (ACE) (por exemplo, captopril); ecompostos que bloqueiam e/ou inibem a produção e/ou síntese de TNF, comoinibidores de quinase MAP.

Conforme utilizados nesta exposição, "proteína derivada de Ig defator de necrose tumoral", "proteína derivada de Ig de TNF", "proteína deri-vada de Ig de TNFa" ou fragmento e similares diminuem, bloqueiam, inibem,anulam ou interferem com a atividade de TNFa in vitro, in situ e/ou, de prefe-rência, in vivo. Por exemplo, uma proteína derivada de Ig de TNF humanoadequada da presente invenção pode ligar-se a TNFa e inclui proteínas de-rivadas de Ig anti-TNF, fragmentos de ligação a antígeno destas, e mutantesou domínios especificados destas que se ligam especificamente a TNFa. Umanticorpo ou fragmento adequado contra TNF pode também diminuir, blo-quear, anular, interferir, impedir e/ou inibir a síntese de RNA, DNA ou protéi-ca de TNF, liberação de TNF, sinalização do receptor de TNF, clivagem deTNF na membrana, atividade de TNF, produção e/ou síntese de TNF.

Proteína quimérica cA2 derivada de Ig consiste na região variá-vel de ligação a antígeno da proteína neutralizadora derivada de Ig de IgGIde camundongo anti-TNFa humano de alta afinidade, designada A2, e asregiões constantes de uma IgGI humana, kapa imunoglobulina. A região Fcda IgGI humana melhora a função efetora da proteína alogênica derivada deIg, aumenta a meia-vida sérica circulante e diminui a imunogenicidade daproteína derivada de lg. A avidez e especificidade de epítopo da proteínaquimérica cA2 derivada de Ig são derivadas da região variável da proteínaA2 derivada de Ig murina. Em uma concretização especial, a linhagem celu-lar do hibridoma A2 é uma das fontes preferidas de ácidos nucléicos codifi-cadores da região variável da proteína A2 derivada de Ig murina.

A2 quimérica (cA2) neutraliza o efeito citotóxico de TNFa huma-no, natural e recombinante, de maneira dose-dependente. A constante deafinidade da proteína quimérica cA2 derivada de Ig foi calculada, a partir deensaios de ligação de proteína quimérica derivada de Ig e TNFa humanorecombinante, como sendo de 1,04 χ IO10 M"1. Métodos preferidos para de-terminação da especificidade e afinidade de proteína derivada de Ig mono-clonal, por inibição competitiva, podem ser encontrados em Harlow et al., Igderived proteins: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocolsin lmmunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley lnterscience, New York,(1992-2003); Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel et al.,eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience, New York(1987-2003); e Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983), cujos conteúdossão aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido depatente.

Em uma concretização especial, a proteína A2 derivada de Igmonoclonal murina é produzida por uma linhagem celular designada c134A.A proteína quimérica cA2 derivada de Ig é produzida por uma linhagem celu-lar designada c168A.

Exemplos adicionais de proteínas derivadas de Ig monoclonalanti-TNF que podem ser utilizados na presente invenção são descritos natécnica (vide, por exemplo, a Patente U.S. N- 5 231 024; Móller, A. et ai.,Cytokine 2(3): 162-169 (1990); Pedido de Patente U.S. N2 07/943 852(depositado em 11 de setembro de 1992); Rathjen et ai, Publicação Interna-cional N2WO 91/02078 (publicada em 21 de fevereiro de 1991); Rubin et ai,Publicação de Patente EPO N2 0 218 868 (publicada em 22 de abril de1987); Yone et ai, Publicação de Patente EPO N2 0 288 088 (26 de outubrode 1988); Liang, et ai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986);Meager, et ai, Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et ai, Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman1 et ai, Hybridoma 6:489-507 (1987); e Hirai, et ai, J.Immunol. Meth. 96:57-62 (1987), cujas referências são aqui incorporadas,em sua totalidade, por referência neste pedido de patente).Moléculas de receptor de TNF

Moléculas preferidas de receptor de TNF, úteis na presente in-venção, são aquelas que se ligam a TNFa com alta afinidade (vide, por e-xemplo, Feldmann et ai, Publicação Internacional N2 WO 92/07076 (publi-cada em 30 de abril de 1992); Schall et al., Cell 61:361-370 (1990); e Loets-cher et al., Cell 67:351-359 (1990), cujas referências são aqui incorporadas,em sua totalidade, por referência neste pedido de patente) e possuem, op-cionalmente baixa imunogenicidade. Em particular, os receptores de superfí-cie celular de TNF com 55 kDa (p55 TNF-R) e 75 kDa (p75 TNF-R) são úteisna presente invenção. Formas truncadas destes receptores, compreendendoos seus domínios extracelulares (ECD) ou partes funcionais destes (vide, porexemplo, Corcoran et ai, Eur. J. Biochem. 223:831-840 (1994)), são úteistambém na presente invenção. Formas truncadas dos receptores de TNF,compreendendo o ECD1 foram detectadas na urina e soro como proteínasinibidoras de ligação de TNFa com 30 kDa e 40 kDa (Engelmann, H. et ai,J. Biol. Chem. 255:1531-1536 (1990)). As moléculas multiméricas de recep-tores de TNF e moléculas fundidas de imunorreceptores de TNF, e deriva-dos e fragmentos ou partes destas, são exemplos adicionais de moléculasdo receptor de TNF que são úteis nos métodos e composições da presenteinvenção. As moléculas do receptor de TNF que podem ser utilizadas nainvenção são caracterizadas por serem capazes de tratar pacientes por pe-ríodos prolongados com alivio de bom a excelente de sintomas e baixa toxi-cidade. Baixa imunogenicidade e/ou alta afinidade, bem como outras propri-edades não definidas, podem contribuir para os resultados terapêuticos obti-dos.

Moléculas multiméricas de receptores de TNF, úteis na presenteinvenção, compreende todo ou uma parte funcional do ECD de dois ou maisreceptores de TNF, unidas por um ou mais Iigantes polipeptídicos ou outrosligantes não peptídicos, como polietilenoglicol (PEG). As moléculas multimé-ricas podem compreender ainda um peptídeo de sinalização de uma proteí-na secretada para direcionar a expressão da molécula multimérica. Estasmoléculas multiméricas e métodos para a sua produção foram descritos noPedido de Patente U.S. N2 08/437 533 (depositado em 09 de maio de 1995),cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência nestepedido de patente.

Moléculas fundidas de imunorreceptores de TNF, úteis nos mé-todos e composições da presente invenção, compreendem, pelo menos,uma parte de uma ou mais moléculas de imunoglobulinas e toda ou umaparte funcional de um ou mais receptores de TNF. Estas moléculas fundidasde imunorreceptores podem ser montadas sob a forma de monômeros ouhetero ou homo-multímeros. As moléculas fundidas de imunorreceptorespodem ser também monovalentes ou multivalentes. A proteína de fusão,formada por receptor de TNF/lgG é um exemplo de molécula fundida de i-munorreceptor de TNF. Moléculas fundidas de imunorreceptores de TNF emétodos para a sua produção foram descritos na técnica (Lesslauer et ai,Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); Ashkenazi et ai, Proc. Nati Acad.Sei. USA 88:10535-10539 (1991); Peppel et ai, J. Exp. Med. 774:1483-1489(1991); Kolls et al., Proc. NatL Acad. Sei. USA 97:215-219 (1994); Butler et ai,Cytokine 6(6):616-623 (1994); Baker et ai, Eur. J. Immunol. 24:2040-2048(1994); Beutler et ai, Patente U.S. N- 5 447 851; e Pedido de Patente U.S.N2 08/442,133 (depositado em 16 de maio de 1995), cujas referências sãoaqui incorporadas, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente).Métodos de produção de moléculas fundidas de imunorreceptores podem serencontrados também em Capon et al., Patente U.S. N2 5 116 964; Capon etai, Patente U.S. N2 5 225 538; e Capon et ai, Nature 337:525-531 (1989),cujas referências são aqui incorporadas, em sua totalidade, por referêncianeste pedido de patente.

Equivalente, derivado, fragmento ou região funcional de molécu-la do receptor de TNF refere-se àquela parte da seqüência desta moléculaque codifica a molécula do receptor de TNF de tamanho suficiente eseqüências, funcionalmente similares às moléculas do receptor de TNF quepodem ser utilizadas na presente invenção (ou seja, ligam-se a TNFa comalta afinidade e possuem baixa imunogenicidade). Equivalentes funcionaisda molécula do receptor de TNF incluem também moléculas modificadas doreceptor de TNF que assemelham-se funcionalmente às moléculas do recep-tor de TNF que podem ser utilizadas na presente invenção (por exemplo,ligam-se a TNFa com alta afinidade e possuem baixa imunogenicidade). Porexemplo, um equivalente funcional da molécula do receptor de TNF podeconter um códon "SILENCIOSO" ou uma ou mais substituições, deleções ouadições de aminoácidos (por exemplo, substituição de um aminoácido ácidopor um outro aminoácido ácido; ou substituição de um códon codificador domesmo aminoácido hidrofóbico ou de diferente por outro códon que codificafórum aminoácido hidrofóbico). Vide Ausubel et al., Current Protocols in Mo-lecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience, New York(1987-2003).Embora a invenção tenha sido descrita em termos gerais, asconcretizações da invenção será expostas ainda nos exemplos seguintesque não devem ser interpretados de forma a limitar o escopo das reivindica-ções.

Exemplo 1

Níveis elevados de transcritos de mRNA de CXCL13 em tecidos pulmonarescom doença

Os níveis de transcritos de mRNA, codificador da proteína CX-CL13, estão elevados no tecido pulmonar de camundongos SP-C/TNFa nãotratados e de camundongos SP-C/TNFa tratados com mAb específico paraTNFα, em relação a camundongos C57BL6 de controle (figura 1). Camun-dongos SP-C/TNF-alfa são camundongos transgênicos derivado da linha-gem do camundongo C57BL6 que superexpressa constitutivamente TNFamurino nos tecidos pulmonares. A superexpressão de TNFa no pulmão (ca- mundongo transgênico SP-C/TNFα) causa muitas alterações patológicas,similares àquelas encontradas em pacientes com DPOC, incluindo inflama-ção pulmonar, enfisema, fibrose pulmonar [16] e a formação de folículos Iin-fóides ectópicos. Os camundongos SP-C/TNFα são um modelo para doen-ças pulmonares, como inflamação pulmonar, enfisema, fibrose pulmonar e Doença Pulmonar Congestiva Obstrutiva (DPOC). A formação de folículoslinfóides ectópicos, nos pulmões, é uma patologia associada com cada umadestas doenças pulmonares. Folículos linfóides ectópicos, nos pulmões, po-dem ser formados através de infiltração por células B no pulmão e em outrostecidos pulmonares. Os resultados na figura 1 indicam que níveis aumentados da proteína CXCL13, nos tecidos pulmonares de camundongos SP-C/TNFα,contribuem para a formação de folículos linfóides ectópicos nos pulmões epara o aparecimento de doenças pulmonares associadas nestes animais.

Para este experimento, camundongos de doze semanas do tipoC57BL6, usado como controle, e do tipo SP-C/TNFα não tratados, recebe- ram injeções intraperitoneais contendo 200 μl de PBS, às segundas e sex-tas-feiras por seis semanas. Os camundongos SP-C/TNFa receberam 0,5mg do mAb cV1q específico para TNFα, em 200 μl de PBS, por injeção intra-peritoneal a cada segunda e sexta-feira por seis semanas, o mAb cV1q é umanticorpo monoclonal de rato contra o isotipo IgGI que se liga ao TNFa mu-rino. O mAb cV1q foi gerado por métodos convencionais. Seis semanas a-pós o início das injeções, os camundongos foram sacrificados, seguindo asdiretrizes institucionais para cuidado e uso de animais.

Foram retirados os pulmões dos animais sacrificados, homoge-neizados e o mRNA foi extraído e isolado empregando métodos convencio-nais. RT-PCR específicas para mRNAs de CXCL13 mRNAs e mRNAs deGAPDH mRNAs foram conduzidas também de acordo com métodos conven-cionais. Os níveis de mRNAs de CXCL13 e de GAPDH foram quantificados, emseguida, por métodos convencionais, e os níveis de mRNA de CXCL13 foramnormalizados em relação aos níveis do gene constitutivo do mRNA de GAP-DH. Os dados apresentados representam a média +/- o desvio padrão dosníveis normalizados de mRNA de CXCL13, obtidos de 5 camundongos dife-rentes (figura 1).

Exemplo 2

Tratamento concomitante com anticorpos monoclonais específicos para TNFa eCXCL13

Alívio de sintomas de doenças pulmonares

A co-administração de mAbs específicos para TNFa e CXCL13alivia sintomas associados a doença pulmonar em camundongos SP-C/TNFa(figura 2). O tamanho dos folículos ectópicos foi reduzido significativamente emcamundongos SP-C/TNFa tratados concomitantemente com mAbs especí-ficos para TNFa e CXCL13, em relação a animais de controle não tratados(figura 2). Em camundongos transgênicos SP-C/TNFa tratados com mAbanti-TNFa por 8 semanas, a infiltração das vias aéreas por neutrófilos foireduzida significativamente; no entanto, o tratamento teve pouco impactosobre os folículos linfóídes ectópicos. Esse achado indica que uma vez for-mados, os folículos linfóides ectópicos mantêm sua homeostase de maneiraindependente de TNFa.

Para este experimento, camundongos SP-C/TNFa de doze se-manas de controle receberam injeções intraperitoneais às segundas e sex-tas-feiras por seis semanas. Animais de controle receberam somente inje-ções de 200 μL de PBS. Animais tratados com Anti-TNFa receberam 0,5 mgdo mAb cV1q específico para TNFa1 em 200 μL de PBS. Animais tratadosconcomitantemente receberam ,5 mg do mAb cV1q, específico para TNFa1 e0,5 mg do mAb MAB4701, específico para CXCL13 em 200 μL de PBS.MAB4701 é um anticorpo monoclonal de rato contra o isotipo IgGI que seliga a CXCL13 murina. O mAb MAB4701 foi gerado por métodos convencionaise encontra-se à disposição no mercado (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN).Seis semanas após o início das injeções, os camundongos foram sacri-ficados de acordo com as diretrizes institucionais para cuidado e uso de a-nimais. Os pulmões foram retirados dos animais sacrificados, seccionados,lâminas foram preparadas e análises histopatológicas, conduzidas para quan-tificar o tamanho e formação de folículos ectópicos, empregando métodosconvencionais. Foi utilizado um Sistema para Imagens de Fase 3 (Glen Mills,PA) e o software analítico associado, utilizado para microscopia e mediçãodo tamanho de 10-20 folículos por lâmina de tecido por camundongo. Osdados apresentados (figura 2) representam a média +/- o desvio padrão dosresultados de 5 camundongos diferentes de cada grupo de tratamento.

Foi sugerido que os resultados descritos acima podem indicarque a terapia anti-CXCL13 isolada pode ser útil no tratamento de doençasrespiratórias relacionadas. Uma vez que o modelo com camundongos au-mentou a expressão de TNFa, a inibição de TNFa associada à terapia anti-CXCL13 pode ser necessária para ser mostrado melhora do estado da do-ença neste modelo. Para modelos, nos quais TNFa não está superexpresso,a inibição de CXCL13 pode ser suficiente para a melhora do estado da do-ença. Adicionalmente, no modelo descrito acima, a expressão de TNF é a-través de animais transgênicos e independente da progressão da doença.Em uma situação patológica, por exemplo, tratamento de pacientes, a ex-pressão de TNF será mais possivelmente reduzida com a redução da infla-mação, assim, se um antagonista de CXCL13 puder reduzir a migração eacúmulo de células produtoras de TNFa1 o seu uso isolado poderia surtirefeito terapêutico. Esse dado foi testado em modelos da doença in vivo.Exemplo 3

Tratamento concomitante com anticorpos monoclonais específicos paraTNF-alfa e CXCL13

Diminuição da infiltração por células B em tecidos pulmonares

A co-administração de mAbs específicos para TNFa e CXCL13diminui a infiltração por células B em tecidos pulmonares (figura 3, 4, 5 e 6).A infiltração por células B foi analisada por citometria de fluxo pela detecçãodos marcadores de células B CD22.2, CD19, CD45FÍ/B220 e CD4, respecti-vamente. O infiltrado por células B, em tecido pulmonar, foi reduzido signifi-cativamente em camundongos SP-C/TNFa, tratados concomitantementecom mAbs específicos para TNFa e CXCL13, em relação a animais de con-trole não tratados (figura 3, 4, 5 e 6).

Os animais foram preparados e os tratamentos, conduzidos con-forme descritos no Exemplo 2 acima. Seis semanas após o início das inje-ções, os camundongos foram sacrificados de acordo com as diretrizes insti-tuições para cuidado e uso de animais. Tecidos de pulmões foram moídos edigeridos com colagenase Vll (1500 lU/ml) a 37 0C por 45 minutos para libe-rar células individualizadas. Os preparados celulares foram incubados, emseguida, com mAbs específicos marcados, disponibilizados no mercado,CD22.2 (figura 3), CD19 (figura 4), CD45R/B220 (figura 5) e CD4 (figura 6),empregando métodos convencionais. Células B, na população celular prepa-rada, carregam os marcadores CD22.2, CD19, CD45R/B220 ou CD4, e po-dem ser detectadas, por essa marcação, após incubação com os mAbsCD22.2, CD19, CD45FI/B220 CD4, à disposição no comércio. Esta marca-ção é a base para a identificação de células B por citometria de fluxo. A aná-lise por citometria de fluxo foi conduzida em populações celulares, empre-gando métodos convencionais, e o percentual de células B presentes na po-pulação celular foi determinado, em seguida, para cada marcador, por méto-dos convencionais. Os dados apresentados (figura 3, 4, 5 e 6) representama média +/- o desvio padrão dos resultados de análises de preparados decélulas pulmonares de 5 camundongos diferentes de cada grupo de trata-mento.As seqüências de CXCL13, CXCR5 e TNFa1 aqui descritas, sãoas seguintes:Tabela 3

<table>table see original document page 73</column></row><table>Exemplo 4

Co-administracão de anticorpos monoclonais Específicos para TNFae CXCL13Tratamento de patologias renais associadas a lúpus eritematoso sistêmico

A co-administração de mAbs específicos para CXCL-13 e TNFafoi utilizada para o tratamento de patologias renais associadas a lúpus erite-matoso sistêmico (LES) em um modelo murino de LES. A glomerulonefrite éuma inflamação de estruturas renais internas, denominadas glomérulos, e éum marco do LES. A proteinúria é a secreção excessiva de proteínas séricasna urina e é uma medida de doença renal resultante de glomerulonefrite as-sociada a LES. Alterações histológicas nos tecidos renais, como formaçãode focos periarteriais de infiltrado linfocitário, representam um outro marcode doença renal resultante de glomerulonefrite associada a LES.

A co-administração de mAbs específicos para CXCL-13 e TNFadiminuiu níveis protéicos associados a glomerulonefrite na urina de camun-dongos NZB/W F1, exibindo sintomas de LES, para níveis abaixo daquelesapresentados por camundongos NZB/W F1 não tratados de controle quereceberam veículo contendo somente PBS (figura 7).

Adicionalmente, a co-administração de mAbs específicos paraCXCL-13 e TNFa diminuiu o escore na classificação de gravidade de doen-ça renal associada a LES em camundongos NZB/W F1, exibindo sintomasde LES1 para níveis abaixo daqueles de camundongos NZB/WF1 não trata-dos de controle que receberam veículo contendo somente PBS (figura 8). Agravidade da doença renal associada a LES, em camundongos NZB/W F1,foi determinada por um sistema de classificação por pontuação. Os escoresforam baseados no número de focos de infiltrado linfocitário periarterial, poranálise histológica dos tecidos renais, e a gravidade da glomerulonefrite as-sociada a níveis protéicos nos tecidos renais de camundongos NZB/W F1 decada grupo de tratamento (figura 8).

Para estes experimentos, foram obtidos camundongos NZB/WF1 de doze semanas de Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Os camundongosNZB/W F1 apresentam sintomas similares aos de lúpus eritematoso sistêmi-co (LES), à medida que envelhecem e são um modelo murino reconhecidode LES. No Dia O, os animais do estudo foram designados aleatoriamentepara grupos de controle ou de tratamento (n = 15/grupo). Foi administrada,aos animais, injeção intraperitoneal de veículo contendo PBS (animais decontrole) mAb anti-CXCL13 (1 mg por camundongo, em PBS), mAb anti-TNFa (1 mg por camundongo, em PBS), ou ambos, o mAb anti-CXCL13 (1mg por camundongo, em PBS) e o mAb anti-TNFa (1 mg por camundongo,em PBS), semanalmente de 18 semanas até 38 semanas de vida. O mAbanti-CXCL13 mAb é um mAb neutralizador de rato anti-CXCL13 (R&D Sys-tems Inc., Minneapolis, MN). O mAb anti-TNF-alfa é um mAb quimerizado derato anti-TNF-alfa fornecido por Centocor, Inc., que foi gerado utilizando mé-todos convencionais. Os animais foram monitorados semanalmente. A urinafoi coletada periodicamente, por jato livre, e armazenada a -80°C. Os ani-mais foram sacrificados no final do estudo, e os rins recolhidos em tampõesapropriados para armazenamento antes de análise posterior. Os animaisforam tratados, manuseados e sacrificados de acordo com diretrizes institu-cionais aprovadas para tratamento e uso de animais.A proteína total e creatina, presentes na urina coletada, foi de-terminada por métodos convencionais e um Analisador Ace (Alpha Wasser-man, West Caldwell1 NJ). A proteína urinária total foi medida em 100 μL deamostras de urina não diluídas e creatinina, em 100 μL de amostras de urinaem diluição de 1:10 de H2O deionizada destilada. Os valores foram utiliza-dos, em seguida, para calcular a relação entre proteína urinária total e crea-tinina. Esta relação foi expressa em média mais ou menos o erro padrão, ediferenças estatisticamente significativas, entre as amostras, foram determi-nadas utilizando uma análise de caudas laterais de variância por teste-t pa-drão em valor-p <0,05.

A análise histológica foi realizada em rins retirados dos animaisquando atingiram 38 semanas de vida. Os rins retirados foram imediatamen-te imersos em tampão de paraformaldeído de periodato de Iisina a 0,7%(PLP), composto por tampão fosfato a 0,1 M, 0,7% de formaldeído, L-Iisina a75 mM e NalÜ4 a 10 mM. Os rins foram embebidos em blocos de parafinaapós fixação durante a noite com tampão PLP. Foram utilizados métodosconvencionais para o preparo de cortes de 7 μΜ e coloração com hematoxi-Iina e eosina. As amostras foram examinadas e pontuadas, quanto à gravi-dade de doença renal associada a LES, sob código cego. A pontuação foibaseada no número de focos de infiltrado linfocitário periarterial, identifica-dos por análise histológica dos tecidos renais, e a gravidade de glomerulone-frite associada a níveis protéicos nos tecidos renais de camundongosNZB/W F1 de cada grupo de tratamento. Foi conduzida análise de Variânciade Kruskal-Wallis, em análise de Pontuações, com correção de Dunn paracomparações múltiplas, e valor-p <0,05 foi utilizado para identificar diferen-ças entre grupos de tratamento para serem aceitas como estatisticamentesignificativas.

Embora ilustrada e descrita acima com referência a certas con-cretizações específicas, a presente invenção não pretende, ainda assim, aser limitada pelos detalhes expostos. Mais exatamente, a presente invençãoé direcionada aos polipeptídeos, polinucleotídeos, anticorpos, dispositivos ekits antagonistas de CXCL13, expostos neste pedido e usos dos mesmos, ea métodos para controle dos níveis de CXCL13, opcionalmente a controledos níveis de TNF-α, e várias modificações poderão ser efetuadas nos deta-lhes no escopo e gama de equivalentes das reivindicações, sem se distanci-ar do espírito da invenção.

Claims (34)

1. Método para o tratamento de doença relacionada com ativida-de de CXCL13 em célula, tecido, órgão ou animal, compreendendo:a administração para a célula, tecido, órgão ou animal de umantagonista de CXCL13, em quantidade efetiva que iniba a atividade de CX-CL13 na referida célula, tecido, órgão ou animal; ea administração para a célula, tecido, órgão ou animal de umantagonista de TNFoc, em quantidade efetiva que iniba a atividade de TNFana referida célula, tecido, órgão ou animal.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonis-ta de CXCL13 é um anticorpo monoclonal que se liga a CXCL13, ou umfragmento do mesmo, e o antagonista de TNFa é um anticorpo monoclonalque se liga a TNFa, ou um fragmento do mesmo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o fragmentodo anticorpo é um fragmento Fab, Fab' ou F(ab')2, ou derivado dos mesmos.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o animal éum mamífero.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que pelo menosum anticorpo monoclonal ou fragmento é administrado por, pelo menos, ummodo selecionado entre parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso,intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilagino-so, intracavitário, intracelíaco, intracerebelar, intracerebroventricular, intracó-lico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intra-ósseo,intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, in-trapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retiniano, intra-espinhal, intra-sinovial, intratorácico, intra-uterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal,retal, bucal, sublingual, intranasal e transdérmica.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a quantida-de administrada de pelo menos um anticorpo monoclonal ou fragmento é deaproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 30,0 mg/kg de peso cor-poral do referido mamífero.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o mamíferoé um paciente humano.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, em que pelo menosum anticorpo monoclonal ou fragmento é administrado por via intraperitoneal.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a dose depelo menos um anticorpo monoclonal ou do fragmento é administrada embolus, seguido por infusão do referido anticorpo.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a doençarelacionada com a atividade de CXCL13 é uma doença inflamatória.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a doença rela-cionada com a atividade de CXCL13 é uma doença relacionada a pulmão.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a doençarelacionada com a atividade de CXCL13 é selecionada do grupo constituídopor asma, enfisema, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), inflama-ção pulmonar, fibrose pulmonar e formação de folículo linfóide ectópico.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o antago-nista de CXCL13 ou antagonista de TNFa é selecionado do grupo constituí-do por polinucleotídeo e polipeptídeo.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o antago-nista de CXCL13 ou antagonista de TNFa é selecionado do grupo constituí-do por molécula de siRNA, shRNA, anti-sentido, ribozima e de DNAzima.

15. Método para o tratamento de uma doença relacionada com opulmão em uma célula, tecido, órgão ou animal, compreendendo a adminis-tração para a célula, tecido, órgão ou animal de um antagonista de CXCL13,em quantidade efetiva que iniba a atividade de CXCL13 na referida célula,tecido, órgão ou animal.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o antago-nista de CXCL13 é um anticorpo monoclonal que se liga a CXCL13, ou umfragmento do mesmo.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o anticor-po monoclonal ou fragmento contra CXCL13 é administrado por, pelo me-nos, um modo selecionado entre parenteral, subcutâneo, intramuscular, in-travenoso, intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, in-tracartilaginoso, intracavitário, intracelíaco, intracerebelar, intracerebroventri-cular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico,intra-ósseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intra-prostático, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retiniano, intraespinhal,intra-sinovial, intratorácico, intra-uterino, intravesical, intralesional, bolus, va-ginal, retal, bucal, sublingual, intranasal e transdérmica.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a quanti-dade administrada do anticorpo monoclonal ou do fragmento contra CXCL13varia de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 30,0 mg/kg dopeso corporal do referido mamífero.

19. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o anticorpomonoclonal ou fragmento contra CXCL13 é administrado por via intraperitoneal.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a dose doanticorpo monoclonal ou do fragmento é administrada em bolus, seguido porinfusão do referido anticorpo.

21. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a doençapulmonar relacionada é selecionada do grupo constituído por asma, enfise-ma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), inflamação pulmonar, fi-brose pulmonar e formação de folículo linfóide ectópico.

22. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o antago-nista de CXCL13 é selecionado do grupo constituído por polinucleotídeo epolipeptídeo.

23. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o antago-nista de CXCL13 é selecionado do grupo constituído por molécula de siRNA,shRNA, anti-sentido, ribozima e de DNAzima.

24. Método para tratamento de um animal com lúpus eritemato-so sistêmico, compreendendo:a) fornecimento de um antagonista de CXCL-13 para o animal, eb) fornecimento de um antagonista de TNFa para o animal;em que a quantidade fornecida de cada antagonista é efetivapara fazer com que ocorra diminuição em um sintoma de lúpus eritematososistêmica no animal.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o antago-nista de CXCL-13 é um anticorpo que se liga a CXCL-13, ou fragmento quese liga a CXCL-13 de um anticorpo, e o antagonista de TNFa é um anticorpoque se liga a TNFa ou um fragmento que se liga a TNFa de um anticorpo.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o animalé um mamífero.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o mamífe-ro é humano.

28. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a quanti-dade fornecida de cada anticorpo ou fragmento de ligação de um anticorpo éde aproximadamente 0,05 mg por kg a aproximadamente 50,0 mg por kg depeso corporal do animal.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a quanti-dade fornecida de cada anticorpo ou fragmento de ligação de um anticorpo éde aproximadamente 25 mg por kg de peso corporal do animal a aproxima-damente 40 mg por kg de peso corporal do animal.

30. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o sintomado lúpus eritematoso sistêmico é o número de focos de infiltrado de linfócitosperiarterial, identificado por exame dos tecidos renais.

31. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o sintomado lúpus eritematoso sistêmico é a relação entre proteína urinária total ecreatinina urinária total.

32. Método de acordo com a reivindicação 30 ou reivindicação-31, em que o antagonista de CXCL-13 é um anticorpo que se liga a CXCL--13 ou um fragmento que se liga a CXCL-13 de um anticorpo, e o antagonistade TNFa é um anticorpo que se liga a TNFa ou fragmento que se liga a TN-Fa de um anticorpo.

33. Método de acordo com a reivindicação 30 ou 31, em que oantagonista de CXCL-13 é um anticorpo que se liga a CXCL-13 ou fragmen-to que se liga a CXCL-13 de um anticorpo, e o antagonista de TNFa é o an-ticorpo infliximab que se liga ao TNFa, ou fragmento do mesmo.

34. Qualquer invenção descrita neste pedido de patente.