BRPI0710671A2 - métodos e composições relacionadas à partìculas de vìrus fago adenoassociadas - Google Patents

métodos e composições relacionadas à partìculas de vìrus fago adenoassociadas Download PDF

Info

Publication number
BRPI0710671A2
BRPI0710671A2 BRPI0710671-8A BRPI0710671A BRPI0710671A2 BR PI0710671 A2 BRPI0710671 A2 BR PI0710671A2 BR PI0710671 A BRPI0710671 A BR PI0710671A BR PI0710671 A2 BRPI0710671 A2 BR PI0710671A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
aavp
fluoro
reporter
uracil
cells
Prior art date
Application number
BRPI0710671-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Renata Pasqualini
Wadih Arap
Juri Gelovani
Frank C Marini Iii
Amin Hajitou
Mian Alauddin
Martin Trepel
Original Assignee
Univ Texas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Texas filed Critical Univ Texas
Publication of BRPI0710671A2 publication Critical patent/BRPI0710671A2/pt
Publication of BRPI0710671B1 publication Critical patent/BRPI0710671B1/pt
Publication of BRPI0710671B8 publication Critical patent/BRPI0710671B8/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/05—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves
    • A61B5/055—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves involving electronic [EMR] or nuclear [NMR] magnetic resonance, e.g. magnetic resonance imaging
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14111—Inoviridae
    • C12N2795/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
    • C12N2810/405—Vectors comprising RGD peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

MéTODOS E COMPOSIçõES RELACIONADAS à PARTìCULAS DE VìRUS FAGO ADENOASSOCIADAS. Modalidades da invenção são geralmente direcionadas a composições e métodos de liberação de um ou mais transgenes a uma célula alvo, tal como uma célula de tumor, em um sítio especifico de maneira a alcançar expressão aprimorada e para construções e composições úteis em tais aplicações. A invenção refere-se também ao uso para preparar medicamentos. Em certos aspectos, a expressão de um ácido nucléico terapêutico pode ser acessada antes da administração de um tratamento ou procedimento de diagnóstico em um individuo.

Description

"MÉTODOS E COMPOSIÇÕES RELACIONADAS A PARTÍCULAS DE VÍRUSFAGO ADENOASSOCIADAS"
Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente provisório US 60/744.492depositado em 7 de abril de 2005, que é aqui incorporado a título de referência em suatotalidade.
O Governo dos Estados Unidos possui direitos sobre esta invenção conforme umaconcessão do National Institutes of Health (NIH).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
CAMPO DA INVENÇÃO
I. CAMPO DA INVENÇÃO
As modalidades desta invenção são direcionadas geralmente à biologia e àmedicina. Em particular, a invenção é direcionada ao campo da terapia gênica usandoAAVP em combinação com imageamento para proporcionar terapia gênica a um paciente.
II. ANTECEDENTES
Uma limitação de muitas terapias com base biológica tem sido a incapacidade deconseguirem uma distribuição controlada e eficaz de moléculas biologicamente ativas àscélulas tumorais ou a sua matriz circundante. O objetivo de empregar terapia com base emgene é obter a distribuição eficaz dos produtos biológicos, como resultado da expressão degene, ao seu sítio de ação dentro da célula. A terapia com base em gene pode proporcionartambém controle sobre o nível, sincronização, e duração da ação desses produtosbiologicamente ativos por inclusão de elementos de promotor/ativador no material genéticotransferido, resultando em uma intervenção terapêutica eficaz. Métodos estão sendodesenvolvidos para a distribuição controlada de genes a vários tecidos somáticos e tumoresusando novas formulações de DNA, e para controlar a expressão de gene usando sistemasde expressão específica para célula, ativada por replicação e controlada por fármaco.
Em uma abordagem, a terapia gênica tenta alvejar células de um modo específico.Assim, um gene terapêutico é ligado, de alguma maneira, a uma molécula de alvejamentode modo a distribuir o gene em uma célula ou tecido alvo. Os métodos correntes envolvemtipicamente ligar uma molécula de alvejamento tal como um Iigante ou anticorpo quereconhece um receptor de internalização ao ou DNA simples ou um vírus de célulamamífera contendo o gene desejado. Quando o DNA simples é usado ele deve sercondensado in vitro em uma geometria compacta para entrar nas células. Um policátion, talcomo polilisina, é usado para neutralizar a carga sobre o DNA e condensá-lo em estruturastoroidais. Contudo, esse processo de condensação é pouco entendido e de controle difícil,fazendo, assim, com que a fabricação de fármacos homogêneos para terapia gênica sejaextremamente desafiadora.
Bacteriófago (fago), tal como fago Iambda e filamentoso, tem sido usado,ocasionalmente, nos esforços de transferir DNA ;para células de mamíferos. Em geral,verificou-se que a transdução de Iambda era um evento relativamente raro e a expressão dogene repórter era fraca. Em um esforço para intensificar a eficácia de transdução, métodosque utilizam fosfato de cálcio ou Iipossomos (que não alvejam tipicamente um receptor desuperfície de célula) foram usados em conjunto com lambda. Transferência de gene foiobservada via fago lambda usando co-precipitação de fosfato de cálcio, ou via fagofilamentoso usando DEAE-dextrana ou lipopoliamina. Contudo, esses métodos de introduzirDNA em células mamíferas não são práticas para aplicações de terapia gênica, já que aeficácia de transfecção tende a ser baixa, não específica; e a transfecção è não somenteinconveniente, mas também promíscua quanto ao tipo de célula.
Correntemente, vírus eucarióticos proporcionam, inquestionavelmente, adistribuição de transgene e transdução superiores (Kootstra e Verma, 2003; Machida1 2003),mas alvejamento direcionado por Iigante de tais vetores geralmente requer ablação de seutropismo nativo para receptores de células mamíferas (Miller et al., 2003; Mizuguchi eHayakawa, 2004; White et al., 2004). Em contraste, vírus procarióticos, tal comobacteriófago (fago), são geralmente considerados veículos fracos para a transdução decélulas mamíferas. Contudo, apesar de suas deficiências inerentes como vírus"eucarióticos", partículas de fago não têm tropismo para células mamárias (Zacher et al.,1980; Barrow e Soothill, 1997; Barbas et al., 2001) e foram ainda adaptadas para transduzirtais células (Ivanenkov et al., 1999; Larocca et al., 1999; Poul e Marks1 1999; Piersanti et al.,2004), embora com baixa eficácia.
Meios mais confiáveis para alvejar vetores a células específicas (ou receptores) epara assegurar um grau terapeuticamente útil de distribuição e expressão de gene sãoassim requeridos, se vetores úteis em aplicações terapêuticas têm que ser obtidos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
As modalidades da invenção são geralmente direcionadas a composições emétodos de distribuição de um ou mais transgenes para uma célula alvo, tal como umacélula tumoral, de um modo específico para sítio para obter expressão intensificada, e aconstruções e composições úteis em tais aplicações. Em certos aspectos, a expressão deum ácido nucléico terapêutico pode ser avaliada antes da administração de um tratamentoou procedimento diagnóstico a ou em um paciente. Em um outro aspecto, a determinaçãoou a avaliação de expressão na região ou localização necessária para benefício terapêuticoé avaliada e qualquer tratamento desnecessário ou benéfico marginal pode ser mantido emvista dos tratamentos alternativos.
Sem estar ligado a qualquer teoria ou mecanismo em particular, a presenteexposição é baseada na observação que a expressão de transgene pode ser aumentadaquando o transgene é integrado a um genoma com uma multiplicidade maior que um. Departicular interesse é a capacidade de certas partículas de· AWP quimérico de transduziremcélulas com mais que uma cópia do transgene, freqüentemente como um concatâmero.Células transduzidas podem ser também monitoradas pela expressão de um gene repórtertransportado pelas partículas de AAVP quimérico. Qualquer transgene pode ser incluído eme expresso de uma partícula de AWP desta exposição.
Certas modalidades da invenção incluem métodos e composições para detectartransferência de gene para e/ou expressão de gene em um tecido alvo de um paciente, quecompreende uma ou mais das seguintes etapas:
(a) Uma etapa que pode ser usada nos presentes métodos inclui distribuir para otecido alvo de um paciente um vetor de AAVP contendo um gene repórter que pode estar ounão presente no paciente hospedeiro. Tipicamente, o gene repórter não será expresso nolocal ou na região a ser imageada e/ou tratada. Em certos aspectos, o gene repórter é umtipo selvagem, um mutante, ou uma quinase geneticamente engenheirada. Em um outroaspecto, a quinase é uma timidina quinase. Em ainda um outro aspecto, a quinase é umgene da timidina quinase do vírus do herpes simples ou uma timidina quinase humana tipo2. Tipicamente, o vetor de transferência ou AAVP é introduzido nas células do tecido alvo, eo gene repórter é expresso nas células do tecido alvo, gerando, assim, um produto de generepórter (proteína) que se acumula somente nas células efetivamente transfectadas pelovetor AAVP.
(b) Uma outra etapa que pode ser usada é administrar ao paciente hospedeiro umsubstrato repórter marcado onde as células expressando um produto do gene repórter daetapa (a) metabolizam o substrato repórter marcado para produzir um metabólito repórtermarcado onde o substrato repórter marcado compreende um análogo de nucleosídeoradiomarcado; e
(c) Ainda uma outra etapa que pode ser usada nos presentes métodos inclui efetuaro imageamento não invasivo do tecido ou células alvo contendo o metabólito marcado dosubstrato repórter depois da depuração do substrato repórter. Em certos aspectos, opaciente é submetido ao imageamento depois da depuração do substrato repórter residualnão metabolizado pelo produto gênico repórter do paciente hospedeiro de modo a detectar atransferência de gene e expressão no tecido alvo. Em um outro aspecto, o paciente oupacientes são submetidos ao imageamento depois de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou maisminutos, horas, dias, ou semanas, dependendo do metabolismo de depuração do substratorepórter não metabolizado.
Os métodos podem compreender ainda esperar por um período de tempo depoisda etapa (b) suficiente para permitir que cerca de, pelo menos, ou no máximo, 60, 65, 67,70, 75, 77, 80, 85, 87, 90, 95, 97% ou mais, incluindo todos os valores e faixas entre elesnão metabolizados (substrato repórter não metabolizado pelo produto de expressão) peloproduto gênico repórter para depurar do paciente. O substrato não metabolizado pode incluirmarcação não específica derivada do substrato repórter residual não metabolizado. O vetorde AAVP pode ser introduzido nas células do tecido alvo por transfecção in vitro ou in vivo(transdução). Em certos aspectos, AAVP é administrado via intravenosa, intratumoral, intra-arterial, intrapleural, intrabrônquico, e/ou oral.
Em certos aspectos, um substrato repórter é marcado com um radioisótopoadequado por imageamento por tomografia de emissão de pósitron, câmera gama,tomografia computadorizada por emissão de fóton único. O substrato repórter e/oumetabólito do substrato repórter são compostos que contêm um nuclídeo de isótopo estávelque inclui, mas sem limitação, 2H, 13C, 15N e 19F. Em um outro aspecto, o metabólito derepórter marcado é submetido ao imageamento por câmera gama ou tomografiacomputadorizada por emissão de fóton único. Em ainda outros aspectos, o metabólito desubstrato repórter marcado é submetido ao imageamento por imageamento de ressonânciamagnética.
Um vetor de AAVP pode incorporar um gene repórter e promotor de transcriçãoadequados e elementos intensificadores, que asseguram a ativação transcricional específicade tecido, seletiva de tecido, ou específica de fator de transcrição, ou específica detransdução de sinal de co-expressão de gene repórter ou terapêutico. Em certos aspectos, oórgão, tecido, células, ou uma célula são transfectados com um gene repórter acopladooperavelmente a elementos reguladores de transcrição, tais como promotor e/ou elementosintensificadores ex vivo (in vitro) antes da administração das células ou uma célula a umpaciente. Um análogo de 2'-flúor-nucleosídeo marcado inclui, mas sem limitação, 2'-flúor-2'-desóxi-1 beta-D-arabionofuranosil-5-etil-uracil (FEAU); 5-[123l]-2'-flúor-5-iodo-1/?-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodo-1/?-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[131l]-2'-flúor-5-iodo-1jff-D-arabinofuranosil-uracil, 5-[18F]-2'-flúor-5-flúor-1/?-D-arabinofuranosil-uracil; 2-[11l]-e 5-([11C]-metil)-2'-flúor-5-metil-1-yff-D-arabinofuranosil-uracil; 2-[11C]-2'-flúor-5-etil-1-0-D-arabinofuranosil-uracil; 5-([11C]-etil)-2'-flúor-5-etil-1-yff-D-arabinofuranosil-uracil; 5-(2-[18F]-etil)-2'-flúor-5-(2-flúor-etil)-1-)ff-D-arabinofuranosil-uracil, 5-[123l]-2'-flúor-5-iodovinil-1-yff-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodovinil-1-^-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[131l]-2'-flúor-5-iodovinil-1 -β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[123l]-2'-flúor-5-iodo-1 -/?-D-ribofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodo-1 -0-D-ribofuranosil-uracil; 5-[131 l]-2'-flúor-5-iodo-1 -β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[123l]-2'-flúor-5-iodovinil-1-^-D-ribofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-fIúor-5-iodovinil-1 -/?-D-ribofuranosil-uracil; 5-[131 l]-2'-flúor-5-iodovinil-1 -/?-D-ribofuranosil-uracil; ou 9-4-[18F]flúor-3-(hidroximetil)butilguanina.
Òs dados de imageamento podem englobar, mas sem limitação, imageamentoobtido com imageamento de ressonância magnética nuclear (MRI), medicina nuclear,tomografia de emissão de pósitron (PET), tomografia computadorizada (CT), ultra-sonografia (US)1 imageamento óptico, imageamento no infravermelho, microscopia in vivo eradiografia com raios X. O imageamento pode ser acoplado a dispositivos médicos,fármacos ou compostos, agentes de contraste ou outros agentes ou estímulos que podemser usados para gerar informação adicional do imageamento. As imagens são obtidasusando essas modalidades da lesão, tecido, espécime, sistema, organismo, paciente ouindivíduo e podem ser imagens estáticas ou dinâmicas, ambas no tempo e/ou no espaço.
O imageamento pode ter correspondência com o tecido, espécime, sistema,organismo, ou paciente dos quais são obtidos dados biológicos em grande escala. Ainformação proveniente do imageamento é extraída de cada imagem, estudo ou estudos ouexames do imageamento, e pode consistir em características de imageamento quantitativasou qualitativas que podem englobar, mas sem limitação, diferenças na morfologia,composição, estrutura, fisiologia, expressão de gene, ou função de uma lesão, um tecido,espécime, sistema, organismo, ou do paciente. Exemplos de informação de imageamentoincluem, mas sem limitação, características de imageamento que podem ser extraídas deCT dinâmico intensificado em contraste multifásico, imageamento funcional, espectroscopiade ressonância magnética, imageamento por tensor de difusão, imageamento com base emdifusão ou perfusão, bem como imageamento alvejado encapsulado por medicina nuclearou PET. Como exemplo, vide as Publicações de Patente US 20030033616 e US20060223141, que são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.
Em certas modalidades, a invenção inclui métodos de tratamento de um pacienteque compreende uma ou mais das seguintes etapas:
(a) administrar um AAVP terapêutico que codifica um repórter a um paciente tendo,suspeito de ter ou em risco de desenvolver uma condição patológica ou doença;
(b) avaliar a expressão in situ do AAVP terapêutico em um tecido ou célula alvejadapara tratamento pela detecção do repórter codificado ou da atividade do repórter.
Em certos aspectos, os métodos podem compreender ainda administrar umtratamento de câncer ao paciente com base na expressão de um nível terapeuticamentesuficiente de um agente terapêutico expresso pelo ácido nucléico de AAVP no órgão, tecidoou célula alvos. Em um outro aspecto, o segundo AAVP terapêutico pode ser administradose a expressão do primeiro AAVP terapêutico não é expressa em um nível terapeuticamenteeficaz. O segundo AAVP terapêutico pode compreender um segundo Iigante de alvejamentoou uma combinação ou ligantes. Também, o segundo AAVP pode compreender umsegundo elemento de controle para a expressão no órgão, tecido, células ou célula, alvos. Aavaliação da expressão dó AAVP pode ser por detecção não invasiva do repórter ou de umaatividade do repórter (por exemplo, detecção do substrato marcado metabolizado por umaproteína repórter). Em certos aspectos, o repórter é uma proteína terapêutica. Em um outroaspecto, a proteína terapêutica é uma enzima conversora de pró-fármaco. Em ainda umoutro aspecto, o repórter é uma enzima, e particularmente uma quinase. Em certasmodalidades, a quinase é a timidina quinase, por exemplo, uma HSV-tk ou uma tk2 humana.Tipicamente, a quinase modifica ou metaboliza um componente detectavelmente marcadoou substrato marcado. Em certos aspectos, o substrato ou o composto compreende ummarcador detectável que é detectável por fluorescência, quimioluminescência,espectroscopia de raman intensificada (SERS), imageamento de ressonância magnética(MRI), tomografia computadorizada (CT), imageamento por tomografia de emissão depósitron (PET). Em certos aspectos, o composto detectavelmente marcado é um análogo denucleosídeo. O composto detectavelmente marcado pode incluir, mas sem limitação,fluordesoxiglicose (FDG); 2'-flúor-2'-desóxi-1beta-D-arabionofuranosil-5-etil-uracil (FEAU); 5-[123l]-2'-flúor-5-iodo-1β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodo-1β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[131l]-2'-flúor-5-iodo-1β-D-arabinofuranosil-uracil, 5-β-flúor-5-flúor-1β-D-arabinofuranosil-uracil; 2-[11l]- e 5-([11C]-metil)-2'-flúor-5-metil-1-)β-D-arabinofuranosil-uracil;2-[11C]-2'-flúor-5-etil-1-β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-([11C]-etil)-2'-flúor-5-etil-1-0-D-arabinofuranosil-uracil; 5-(2-[18F]-etil)-2'-flúor-5-(2-flúor-etil)-1 -β-D-arabinofuranosil-uracil, 5-[123l]-2'-flúor-5-iodovinil-1-β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodovinil-1-β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[131 l]-2'-flúor-5-iodovinil-1 -yff-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[123l]-2'-flúor-5-iodo-1 -β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodo-1 -β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[131 l]-2'-flúor-5-iodo-1-β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[123l]-2'-flúor-5-iodovinil-1 -0-D-ribofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodovinil-1-0-D-ribofuranosil-uracil; 5-[131 I]-2'-flúor-5-iodovinil-1 -β-D-ribofuranosil-uracil; ou 9-4-[18F]flúor-3-(hidroximetil)butilguanina.
Em um outro aspecto, o substrato ou composto marcado pode ser marcado com18F, 277Ac, 211At, 128Ba, 131Ba, 7Be, 204Bi, 205Bi, 206Bi1 76Br, 77Br, 82Br, 109Cd, 47Ca, 11C, 13C, 14C,36CI, 48Cr, 51Cr, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 165Dy, 155Eu, 153Gd, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 72Ga, 198Au, 2H, 3H,166Ho, 111In, 113In, 115In, 123I, 125I, 131I, 189Ir, 191Ir, 192Ir, 194Ir, 19F, 52Fe, 55Fe, 59Fe, 177Lu, 150,191Os, 109Pd, 32P, 33P, 42K, 226Ra, 186Re, 188Re, 82Rb, 153Sm, 46Sc, 47Sc, 72Se, 75Se, 105Ag, 15N,22Na, 24Na, 89Sr, 35S, 38S, 177Ta, 96Tc, 99mTc, 201TI, 202TI, 113Sn, 117mSn, 121Sn, 166Yb, 169Yb,175Yb, 88Y, 90Y, 62Zn, or 65Zn. Em aspectos particulares, o marcador detectável é o marcador131I, 125I, 123I, 111I, 99mTc, 90Y, 186Re, 188Re, 32P, 153Sml 67Ga, 201TI, 77Br, ou 18F.
Um AAVP da invenção pode compreender uma fração que alveja seletivamente umtecido ou célula alvejada para tratamento. Em certos aspectos, a fração é codificada por ouacoplada a uma proteína capsídeo e/ou uma proteína capsídeo recombinante de um AAVP.
Em certos aspectos, uma proteína capsídeo compreende um peptídeo de alvejamento. Opeptídeo de alvejamento pode ser um peptídeo cíclico, um peptídeo bicíclico e/ou umpeptídeo linear. O peptídeo de alvejamento se liga seletivamente a uma célula que expressauma integrina na superfície da célula. Uma integrina pode ser uma ανβ3 ou ανβδ integrina.Em um outro aspecto, o peptídeo compreende um motivo RGD. Em ainda um outro aspecto,o peptídeo pode se ligar especificamente a uma célula que expressa um receptor detransferrina, tal peptídeo pode incluir uma seqüência de aminoácidos que compreendeCRTIGPSVC.
Em certos aspectos, um paciente pode ter, estar suspeito de ter, ou em risco dedesenvolver uma doença hiperproliferativa. Doenças hiperproliferativas incluem, mas semlimitação, fibrossarcoma, miossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcomaosteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma,linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma,rabdomiossarcoma, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer retal, câncer pancreático,câncer ovariano, câncer da próstata, câncer uterino, câncer da cabeça e do pescoço, câncerde pele, câncer do cérebro, carcinoma de células escamosas, carcinoma da glândulasebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinomamedular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma do dutobiliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilm, câncer cervical,câncer testicular, carcinoma de pequenas células de pulmão, carcinoma de não pequenascélulas de pulmão, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma,meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuromaacústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma,leucemia, linfoma, ou sarcoma de Kaposi. Em um aspecto particular, a doençahiperproliferativa é glioma.
Em uma outra modalidade, um gene repórter e/ou terapêutico é operativamenteacoplado a um promotor seletivo de tecido ou de célula, ou um promotor específico detecido ou de célula. Em certos aspectos, avaliar a expressão compreende administrar umcomposto ou substrato marcado que é metabolizado por uma célula que expressa ácidonucléico de AAVP e que é tipicamente não metabolizado em uma extensão significativa portecidos não alvo.
Um AAVP terapêutico pode codificar também um segundo gene terapêutico. Osegundo gene terapêutico pode ser, mas sem limitação, um supressor de tumor, um RNAinibidor, um DNA inibidor, ou uma enzima conversora de pró-fármaco.
Em ainda outras modalidades, as composições da invenção podem incluir um ácidonucléico de AAVP terapêutico que compreende um segmento de ácido nucléicocompreendendo RNA inibidor ou um DNA inibidor. O RNA inibidor pode ser um siRNA, ummiRNA, ou RNA ou DNA anti-sentido. Em certos aspectos, um ácido nucléico de AAVP estácompreendido em uma partícula de fago. Em um outro aspecto, a partícula compreende umIigante de alvejamento conforme descrito aqui.
Certas modalidades incluem composições e métodos para modular a expressão deum gene que compreende um ácido nucléico de AAVP ou partícula que compreende tal.De acordo com a presente invenção, um gene ou polipeptídeo selecionado pode sereferir a qualquer proteína, polipeptídeo, ou peptídeo. Um gene ou polipeptídeo terapêutico éum gene ou polipeptídeo que pode ser administrado a um paciente com a finalidade detratar ou prevenir uma doença. Por exemplo, um gene terapêutico pode ser um geneadministrado a um paciente para o tratamento ou prevenção de câncer. Exemplos de genesterapêuticos incluem, mas sem limitação, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM1 APC,CTS-1, zac1, scFV ras, DCC1 NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL1 MMAC1,FCC1 MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF, G-CSF, timidina quinase, Bax, Bak, Bik1 Bim, Bid, Bad, Harakiri, Fas-L, mda-7, fus,interferon a, interferon β, interferon γ, p53, ABLI, BLC1, BLC6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA,ERBB, EBRB2, ETS1, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN,MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3, YES,MADH4, RB1, TP53, WT1, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5,ApoAI, ApoAIV, ApoE, RaplA, citosina desaminase, Fab, ScFv1 BRCA2, zac1, ATM, HIC-1,DPC-4, FHIT1 PTEN1 ING1, NOEY1, NOEY2, OVCA1, MADR2, 53BP2, IRF-1, zac1,DBCCR-1, rks-3, COX-1, TFPI, PGS1 Dp1 E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst,abi, E1A, p300, VEGF, FGF, trombospondina, BAI-1, GDAIF, ou MCC.
Outros exemplos de genes terapêuticos incluem genes que codificam enzimas.Exemplos incluem, mas sem limitação, ACP dessaturase, uma ACP hidroxilase, uma ADP-glicose piroforilase, uma ATPase, uma álcool desidrogenase, uma amilase, umaamiloglicosidase, uma catalase, uma celulase, uma ciclooxigenase, uma descarboxilase,uma dextrinase, uma esterase, uma DNA polimerase, uma RNA polimerase, a hialuronsintase, uma galactosidase, uma glucanase, uma glicose oxidase, uma GTPase, umahelicase, uma hemicelulase, uma hialuronidase, uma integrase, uma invertase, umaisomerase, uma quinase, uma lactase, uma lipase, uma lipoxigenase, uma liase, umalisozima1 uma pectinaesterase, umaa peroxidase, uma fosfatase, uma fosfolipase, umafosforilase, uma poligalacturonase, uma proteinase, uma peptidase, uma pulanase, umarecombinase, uma transcriptase reversa, uma topoisomerase, uma xilanase, um generepórter, uma interleucina, ou uma citocina.
Outros exemplos de genes terapêuticos incluem o gene que codifica a carbamoilsintetase I, ornitina transcarbamilase, arginossuccinato sintetase, arginossuccinato liase,arginase, fumarilacetoacetato hidrolase, fenilalanina hidroxilase, alfa-1 antitripsina, glicose-6-fosfatase, receptor de lipoproteína de baixa densidade receptor, porfobilinogêniodesaminase, fator VIII, fator IX, cistationa beta.-sintase, cetoácido de cadeia ramificadadescarboxilase, albumina, isovaleril-CoA desidrogenase, propionil CoA carboxilase, metilmalonil CoA mutase, glutaril CoA desidrogenase, insulina, -glicosidase, piruvato carboxilase,fosforilase hepática, fosforilase quinase, glicina descarboxilase, Η-proteína, T-proteína,ATPase transportadora de cobre da doença dé^Menkes, ATPase transportadora de cobre da·'νdoença de Wilson, citosina desaminase, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase,galactose-1-fosfato uridiltransferase, fenilalanina hidroxilase, glicocerbrosidase,esfingomielinase, -L-iduronidase, glicose-6-fosfato desidrogenase, HSV timidina quinase, outimidina quinase humana.
Genes terapêuticos incluem também genes que codificam hormônios. Exemplosincluem, mas sem limitação, genes que codificam o hormônio do crescimento, prolactina,lactogênio placentário, hormônio Iuteinizante1 hormônio folículo estimulante, gonadotropinacoriônica, hormônio estimulador da tireóide, leptina, adrenocorticotropina, angiotensina I,angiotensina II, β-endorfina, hormônio estimulador de β-melanócito, colecistocinina,endotelina I, galanina, peptídeo inibidor gástrico, glucagon, insulina, lipotropinas,neurofisinas, somatostatina, calcitonina, peptídeo relacionado ao gene de calcitonina,peptídeo relacionado ao gene de β-calcitonina, hipercalcemia de fator de malignidade,proteína relacionado ao hormônio paratireóide, peptídeo similar ao glucagon,pancreastatina, peptídeo pancreático, peptídeo YY, PHM, secretina, peptídeo intestinalvasoativo, oxitocina, vasopressina, vasotocina, encefalinamida, metorfinamida, hormônioestimulador de alfa melanócito, fator natriurético atrial, amilina, componente de amilóide P,hormônio Iiberador de corticotropina, fator Iiberador do hormônio de crescimento, hormônioliberador do hormônio luteinizante, neuropeptídeo Y, substância K, substância P, ouhormônio Iiberador de tirotropina.
Outras modalidades da invenção são discutas por todo este relatório descritivo.Qualquer modalidade discutida com respeito a um aspecto da invenção se aplica também aoutros aspectos da invenção e vice versa. As modalidades na seção de Exemplos devemser entendidas como modalidades da invenção que são aplicáveis a todos os aspectos dainvenção.
Os termos "inibir", "reduzir", ou "prevenção", ou qualquer variação destes termos,quando usados nas reivindicações e/ou no relatório descritivo, incluem qualquer decréscimomensurável ou inibição completa para alcançar um resultado desejado.
A palavra "um" ou "uma", quando usada em conjunto com o termo "compreender"nas reivindicações e/ou no relatório descritivo, pode significar "um (1)", mas é tambémconsistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um", e "um ou mais que um".
É contemplado que qualquer modalidade discutida aqui pode ser implementadacom respeito a qualquer método ou composição da invenção, e vice-versa. Além disso, ascomposições e kits da invenção podem ser usados para obter os métodos da invenção.
Por todo este relatório descritivo, o termo "cerca de" é usado para indicar que umvalor inclui um desvio padrão de erro para o dispositivo ou método que está sendoempregado para determinar o valor.O termo "ou" na reivindicações é usado com o significado de "e/ou" a menos queindicado explicitamente para referir-se somente a alternativas ou as alternativas sãomutuamente exclusivas, embora a descrição suporte uma definição que se refira àsalternativas apenas e "e/ou".
Como usadas neste relatório descritivo e na(s) reivindicação(coes), as palavras"compreendendo" (e qualquer forma de compreendendo, tais como "compreender" e"compreende"), "tendo" (e qualquer forma de ter, tais como "têm" e "tem"), "incluindo" (equalquer forma de incluindo, tais como "inclui" e "incluem") e "contendo" (e qualquer formade contendo, "tais como "contêm" e "contém") são inclusivas ou de terminações livres e nãoexcluem elementos adicionais não citados ou etapas dos métodos.
Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ãoaparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Contudo, deve ser entendido que adescrição detalhada e os exemplos específicos, quando indicando modalidades específicasda invenção, são dados tão-somente a título de ilustração, pois várias alterações emodificações dentro do espírito e escopo da invenção tornar-se-ão aparentes para aquelesversados na técnica a partir desta descrição detalhada.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
As seguintes figuras formam parte do presente relatório descritivo e estão incluídaspara demonstrar adicionalmente alguns aspectos da presente invenção. A invenção podeser mais bem entendida com referência a uma ou mais destas figuras em combinação coma descrição das modalidades específicas apresentadas aqui. Algumas modalidadesexemplares específicas da descrição podem ser entendidas, em parte, por referência àseguinte descrição e às figuras acompanhantes.
Figuras 1A-1E. A Figura 1A é um gráfico que mostra a ligação de RGD-4C AAVP àscélulas mamíferas que expressam αν integrinas, em contraste com o AAVP não alvejado ouAAVP que compreende peptídeos de controle negativo tais como RGE-4C ou várias versõesmisturadas da seqüência de RGD-4C. A Figura 1B é uma imagem que mostra RGD-4CAAVP transportando genes repórter indicando internalização direcionada por ligante. AFigura 1C mostra a transferência do gene alvajado mediada por RGD-4C AAVP-β-galactosidase para as células KS 1767. A Figura ID mostra inibição da transdução pelopeptídeo RGD-4C sintético, mas não por um peptídeo de controle não relacionado; níveis detransdução não específica foram determinados usando AAVP não alvejado. Um anticorpoanti-p-gal foi usado para coloração e a expressão do gene foi detectada porimunofluorescência. A Figura 1E mostra o resgate do AAV recombinante de célulasinfectadas com RGD-4C AAVP. Células 293 humanas foram incubadas com RGD-4C AAVP(106 unidades transdutoras/célula) ou controles negativos (RGD-4C fago-GFP nãoquimérico, alvejado, AAVP-GFP não alvejado). Quatro dias depois da infecção, as célulasforam infectadas com um plasmídeo de expressão de AAV rep e cap e superinfectadas comadenovírus tipo 5 do tipo selvagem (Ad). As células foram colhidas 72 horas pós-infecçãoadenoviral e os sobrenadantes foram então usados para infectar novas células 293. Aexpressão da GFP foi analisada por citometria de fluxo 48 horas mais tarde. São mostradosos aumentos médios de AAV-GFP produzida sobre o substrato depois do resgate de cadaconstrução.
As Figuras 2A-2C. A Figura 2A é um histograma que mostra um sumário deanálises de citometria de fluxo de clones 293 estavelmente transduzidos com AAVP-GFPneo (n=9) ou fago-GFPneo (n = 9). Os triângulos abertos indicam percentagens decélulas positivas à proteína fluorescente verde (GFP) e as barras pretas representam níveisde expressão da GFP (intensidade fluorescente média; MFI). A Figura 2B mostra análise deSouthern blot da persistência do cassete de transgene em linhas de células clonaistransduzidas com RGD-4C AAVP-GFPneo ou RGD-4C fago-GFPneo. DNA celular total decélulas parentais 293 não transduzidas ou cada um dos clones de células transduzidas (#1-9 para cada grupo) foi duplamente digerido com AFIII-XhoI (um sítio de digestão derestrição por cada enzima dentro da construção DNA que flanqueia o cassete de transgene).A Figura 2C mostra a análise de concatêmeros, de cabeça à cauda, potenciais do cassetede transgene por Southern blot. O DNA celular total foi digerido com Xho-I (sítio de digestãode restrição única dentro do cassete de transgene próximo à 3'ITR) antes do Southernblotting.
Figuras 3A-3B. A Figura 3A mostra a coloração imunoistoquímica contra fago emxenoenxertos derivados de KS 1767 depois da administração sistêmica (via intravenosa naveia da cauda) de RGD-4C AAVP (5 χ 1010 TU) ou controles negativos (AAVP não alvejado,RGD-4C AAVP misturado, ou RGE-4C AAVP) em camundongos sem pelagem (nude)profundamente anestesiados compreendendo xenoenxertos de tumores derivados deKS1767. As construções de AAVP foram deixadas em circulação por 5 minutos, seguido porperfusão e remoção cirúrgica dos tumores. Um anticorpo policlonal contra fago foi usadopara colorir em secções tumorais embutidas em parafina. As setas apontam para acoloração do fago em vasos sangüíneos tumorais. A Figura 3B mostra a análise deimunofluorescência da expressão da GFP em xenoenxertos derivados de KS1767 no dia 7depois da administração sistêmica ou de RGD 4C AAVP-GFP ou de controles negativos(não alvejados, misturados ou mutantes) conforme indicados.
Figuras 4A-4E. A Figura 4A mostra o imageamento bioluminescente in vivo daexpressão de Iuciferase de vagalume depois da distribuição sistêmica de AAVP alvejado.Camundongos sem pelagem (nude) contendo xenoenxertos de tumores derivados deDU145 receberam uma dose única sistêmica de ou RGD-4C AAVP-Iuc (5 χ 1011 TU, viaintravenoa) ou de controles (AAVP-Luc não alvejada, ou RGD-4C AAVP-Luc misturada).Dez dias depois, o imageamento por bioluminecência (BLI) de camundongos tendo tumor foirealizado para avaliar a expressão do transgene. As escalas de calibração estão fornecidasnos painéis. A Figura 4B mostra imageamento por PET com multi-traçador emcamundongos contendo tumor depois da distribuição sistêmica de RGD-4C AAVP-HSVtkalvejada. Os camundongos sem pelagem (nude) contendo xenoenxertos de tumoresderivados de DU145 (n = 9 camundongos contendo tumor por cada coorte) receberam umadose única sistêmica (5 χ 1011 UT1 via intravenosa) de RGD-4C AAVP-HSVtk ou de AAVP-HSVtk não alvejada. São apresentadas as imagens de PET com [18F]-FDG e [18F]-FEAUobtidos antes e depois do tratamento com GCV. T1 tumor; H, coração; BR, cérebro; BL,bexiga. As escalas de calibração estão fornecidas nos painéis. A sobreposição das imagenspor PET e as imagens fotográficas de camundongos contendo tumores representativosforam realizadas para simplificar a interpretação da biodistribuição de [18Fj-FDG e [18Fj-FEAU. A Figura 4C mostra as curvas de xenoenxertos de tumores individuais depois daadministração de AAVP. A Figura 4D mostra a dinâmica temporal da expressão do gene deHSVtk conforme avaliada por imageamento por PET repetitivo com [18F]-FEAU em diasdiferentes depois da administração de AAVP. A Figura 4E mostra as alterações naviabilidade do tumor antes e depois da terapia com GCV conforme avaliação com [18F]-FDGPET.
Figuras 5A-5G. A Figura 5A é um gráfico mostrando os volumes de tumor médios ±desvios padrão (DP) plotados versus tempo. Foram usadas coortes de camundongos sempelagem (nude) imunodeficientes com xenoenxertos humanos estabelecidos (tamanhocorrespondendo a aproximadamente 50 mm2) derivados de células KS 1767. Oscamundongos receberam uma administração sistêmica única (5 χ 1010 TU, via intravenosa)de ou RGD-4C AAVP-HSVtk ou de controles (AAP-HSVtk não alvejada, RGD-4C AAVP-GFP, ou o veículo sozinho). Ganciclovir (GCV) foi administrado aos camundongos a partirdo dia 2 pós-tratamento até o final dos experimentos. Posteriormente, todos oscamundongos receberam GCV exceto um grupo de controle adicional tratado com RGD-4CAAVP-HSVtk mas sem GCV. A Figura 5B é um gráfico mostrando os volumes de tumormédios ± desvios padrão (DP) plotados versus tempo. Foram usadas coortes de30 camundongos sem pelagem (nude) imunodeficientes com xenoenxertos humanosestabelecidos (tamanho correspondendo a aproximadamente 50 mm2) derivados de célulasde carcinoma UC3 da bexiga. Os camundongos receberam uma administração sistêmicaúnica (5 χ 1010 TU, via intravenosa) de ou RGD-4C AAVP-HSVtk ou de controles (AAP-HSVtk não alvejada, RGD-4C AAVP-GFP, ou o veículo sozinho). Ganciclovir (GCV) foi35 administrado aos camundongos a partir do dia 2 pós-tratamento até o final dosexperimentos. Posteriormente, todos os camundongos receberam GCV exceto um grupo decontrole adicional tratado com RGD-4C AAVP-HSVtk, mas sem GCV. A Figura 5C é umgráfico que mostra os volumes de tumor médios ± desvios padrão!(DP) plotados versustempo. Foram usadas coortes de camundongos sem pelagem (nude) imunodeficientes comxenoenxertos humanos estabelecidos (tamanho correspondendo a aproximadamente 50mm2) derivados de células de carcinoma DU145 da próstata. OS camundongos receberamuma administração sistêmica única (5 χ 1010 TU, via intravenosa) de ou RGD-4C AAVP-HSVtk ou de controles (AAP-HSVtk não alvejada, RGD-4C AAVP-GFP, ou o veículosozinho). Ganciclovir (GCV) foi administrado aos camundongos a partir do dia 2 pós-tratamento até o final dos experimentos. Posteriormente, todos os camundongos receberamGCV exceto um grupo de controle adicional tratado com RGD-4C AAVP-HSVtk1 mas semGCV. São mostrados os volumes de tumor médios ± desvios padrão (DP) plotados versustempo. A Figura 5D é um gráfico que mostra a inibição de crescimento de xenoenxertosderivados de DU145 grande (em aproximadamente 150 mm2) por uma dose sistêmica única(5 χ 1010 TU1 via intravenosa) de RGD-4C AAVP-HSVtk. A Figura 5E é um gráfico quemostra a inibição do crescimento de tumor do carcinoma mamário de camundongo EF43-FGF4 (tamanho correspondente a aproximadamente 50 mm2) em camundongos BALB/c,imunocompetentes, por uma dosa intravenosa única (5 χ 1010 TU) de RGD-4C AAVP-HSVtk.A Figura 5F é um gráfico que mostra a eficácia de longo prazo de RGD-4C AAVP-HSVtk eGCV por doses repetidas de AAVP (5 χ 1010 TU cada, via intravenosa) a camundongosBALB/c, imunocompetentes, contendo tumores EF43-FGR4 isogênicos. Os resultados daterapia foram consistentemente observados em experimentos independentes com coortesde camundongos contendo tumor (n = 10 camundongos por grupo de tratamento). As setasindicam os tempos de administração de AAVP. A Figura 5G é um gráfico que mostra o efeitoda imunorresposta humoral contra fago em terapia com RGD-4C AAVP-HSVtk.Camundongos BALB/C imunocompetentes (n = 7 camundongos por grupo) foraminicialmente "vacinados" recebendo três doses sistêmicas de RGD-4C AAVP-GFP (1010 TUpor semana, durante três semanas, via intravenosa). Os camundongos foram implantadoscom células EF43-FGF. Quando os tumores estavam estabilizados (tamanhocorrespondente a aproximadamente 50 mm2), os camundongos contendo tumor receberamuma dose sistêmica única de RGD-4C AAVP-HSVtk ou RGD-4C AAVP-HSVtk seguido pelamanutenção do GCV (iniciada no dia 2 depois da administração do AAVP). Amostras desoro foram coletadas de camundongos, pré- e pós vacinação foi iniciada e de novo no finaldo esquema de vacinação antes da administração de AAVP de modo a confirmar apresença de títulos altos (até aproximadamente 1:10.000) de IgG anti-fago circulante porELISA. A vacinação pareceu não afetar os efeitos antitumorais, apesar da presença deanticorpos anti-fago.
Figuras 6A-6B. A Figura 6A é uma imagem de camundongos contendo tumor(painel superior) e tumores removidos cirurgicamente correspondentes (painel inferior) detodos os grupos experimentais da terapia (tumores mamíferos EF43-FGF4 emcamundongos BALB/c imunocompetentes). A Figura 6B é uma análise histopatológica detumores tratados com EF43-FGF4. Tumores EF43-FGF4 foram recuperados, seccionados ecoloridos. Tumores tratados com AAVP-HSVtk não alvejadas (painéis esquerdos), as bordasentre os aros externos e as áreas tumorais centrais (painéis do meio), e áreas tumoraiscentrais de tumores tratados com RGD-4C AAVP-HSVtk (painel) são mostrados como vistasde alta ampliação dos insertos de baixa ampliação da secções tumorais em série. Comcoloração de hematoxilina e eosina (H&E), a imunocoloração anti-CD31 e a coloração deTUNEL de secções tumorais são mostradas. As setas apontam para vasos sangüíneos detumor e células apoptóticas.
Figura 7. A Figura 7 é um esquema mostrando a formação da construção de RGD-4C AAVP1 estratégia de clonagem e estrutura dos vetores resultantes.
Figuras 8A-8C. A Figura 8A mostra uma análise de Southern blot do DNA de RGD-4C AAVP-GFPneo ou RGD-4C fago-GFPneo em linhagens de células clonais transduzidas293. DNA celular total de células parentais 293 não transduzidas ou clones de célulasestáveis individuais transduzidas (#1-9 para cada vetor) foi incubada com Stul (sem sítio dedigestão de restrição dentro do DNA do vetor), Xba-I (sítio de digestão de restrição únicodentro do DNA do vetor), ou Sacl-Ml ul. Fragmentos de DNA resultantes foram espalhadosem gel da agarose a 0,8%, transferidos para uma membrana de náilon e hibridizados comuma neo sonda marcada como indicado. Plasmídeos de vetor digeridos foram tambémusados como controle. A Figura 8B mostra uma análise de PCR de concatêmeros docassete de transgêne em linhagens de células clonais 293 transduzidas estavelmente comRGD-4C fago-GFPneo ou RGD-4C AAVPGFPneo. Células parentais 293 transduzidasserviram como controle negativo; controles negativos adicionais e um marcador molecular100 bp (Invitrogen) são também mostrados conforme indicado. Nested PCR com iniciadoresanelando próximos à extremidade 5' e 3' do cassete de transgene foi realizado paraidentificar formas concateméricas nos DNAs correspondentes ao RGD-4C AAVP e ao fagoRGD-4C. As setas indicam iniciadores (H, cabeça; T, cauda). Produtos de ampliação porPCR foram detectados em géis de agarose a 2% e revelaram o DNA do vetor concateméricoexclusivamente nos clones de células transduzidos com AAVP. A Figura 8C mostra osresultados de seqüenciamento de formas concateméricas diferentes em DNA de AAVP(letras maiúsculas denotam a extremidade 3' do cassete de transgene, as letras em itálicodenotam a extremidade 5' do cassete de transgene), concatêmeros de Cabeça à Caudarevelados com ITRs..
Figura 9. A Figura 9 é uma imagem que mostra a imunocoloração da expressão degene repórter, GFP em órgãos de controle de cérebro, fígado, pâncreas e rim no dia 7depois de umá dose intravenosa (5 χ 1010 TU) de ou RGD-4C AAVP-GFP ou AAVP-GFP emcamundongos.
Figuras 10Α-10Β. A Figura 10A é uma imagem de coloração imunoistoquímicacontra AAVP depois da administração intravenosa de RGD-4C AAVP (painel direito) ouAAVP não alvejado (painel do meio) em camundongos BALB/c imunocompetentes contendotumores EF43-FGF4. As construções foram deixadas circularem por 5 minutos, seguido porperfusão e recuperação tecidual conforme descrição. Um anticorpo policlonal contra o fagofoi usado para coloração. O painel esquerdo mostra a coloração de vaso sangüíneo usandoum anticorpo anti-CD3 1. As setas apontam para os vasos sangüíneos tumorais. A Figura10B é uma imagem da análise da imunofluorescência da expressão de GFP em tumoresEF43-FGF4 em 1 semana depois da administração intravenosa do AAVP-GFP não marcado(painel esquerdo) ou RGD-4C AAVP-GFP (painel do meio) em camundongos contendotumores EF43-FGF4. É também mostrada a imunocoloração contra αν-integrina em tumoresEF43-FGF4 (painel direito).
Figura 11. A Figura 11 mostra imagens de análise histológica de órgãos decontrole. Fígado, coração e rim de camundongos tratados com AAVP-HSVtk não alvejada,vetores de RGD-4C AAVP-HSVtk1 ou o veículo sozinho mais a manutenção de GCV sãomostrados. Nenhum sinal histológico de toxicidade foi detectado nestes órgãos porcoloração de H&E.
Figuras 12A-12C. Células mamíferas infectadas com AAVP alvejado com RGDexpressam um produto gênico funcional. (Figura 12A) Células de melanoma humano, M21foram infectados com AAVP; TNF-α não alvejado expressando o fago fdTNF-α (painelsuperior) e TNF-α expressando o vírus RGDTNF-α (painel inferior) e detectado usando umanticorpo primário específico de fd seguido pelo anticorpo secundário marcado com FITC.(Figura 12B) Células M21 infectadas com PBS, vírus não alvejado vazio (fd), vírus alvejadovazio (RGD), vírus (fdTNF-α) expressando o TNFa não alvejado e o vírus RGDTNF-aexpressando o TNF-α alvejado. Cinco dias depois da infecção, o sobrenadante da cultura foianalisado para medir o TNF-α por ELIS. O sobrenadante da cultura, 12 dias depois dainfecção é também mostrado. (Figura 12C) Células endoteliais da veia umbilical humana(HUVEC) foram tratadas com o sobrenadante do dia 5 de vários grupos infectados comcélulas M21; PBS, fd (vírus nulo não marcado), RGD (vírus null alvejado), fdTNF (vírus queexpressa o TNF-α não alvejado) e RGDTNF (vírus que expressa o TNF-α alvejado) eanalisados quanto ao fator tecidual (TF). TNF-α recombinante foi usado como controlepositivo. Para checar a especificidade, O sobrenadante de M21 de células infectadas comRGDRNF incubadas com anticorpo específico de TNF-α, antes da aplicação no HUVEC. Osobrenadante do dia 23, depois da infecção, foi também testado quanto à secreção de TF.
Figuras 13A-13H AAVP está especificamente alvejado para a vasculatura do tumor.Xenoenxertos de melanoma injetados com ou PBS ou RGDTNF-α colorido com anticorpoespecífico de bacteriófago e anticorpo de vaso sangüíneo CD31. A detecção foi efetuadausando Alexa Flour 488, Alexa Flour 594 e DAPI para visualizar vasos sangüíneos, AAVP enúcleos de células, respectivamente (250X). Nenhum dos animais injetados com PBSmostrou a presença de AAVP em nenhum período de tempo. É mostrada uma secção dotumor representativa de um animal injetado com PBS por 15 minutos (Figura 13A). Osanimais injetados com AAVP expressando RGDTNF-α mostraram a co-localização departículas de vírus nos vasos sangüíneos tão cedo quando 15 minutos (Figura 13B) e empontos de tempo subseqüentes: dia 1 (Figura 13C), dia 2 (Figura 13D), dia 3 (Figura 13E),dia 4 (Figura 13F), dia 8 (Figura 13G), e dia 10 (Figura 13H).
Figuras 14A-14E. As partículas de AAVP não foram detectadas no tecido do fígadonormal. O fígado de animais com xenoenxertos de melanoma humano injetado comRGDTNF-α coloriram com anticorpo específico de bacteriófago e anticorpo de vasosangüíneo CD31. A detecção foi efetuada usando Alexa Flour 488, Alexa Flour 594 e DAPIpara visualizar os vasos sangüíneos, AAVP e os núcleos das células (250X),respectivamente. Os animais injetados com AWP expressando RGDTNF-α mostraramalguma coloração das partículas de vírus no dia 1 (Figura 14A) no tecido do fígado.Contudo, a coloração do vírus foi reduzida para os níveis mínimos no dia 2 (Figura 14B) comnenhuma coloração de vírus observada nos pontos de tempo do dia 3 (Figura 14C), dia 8(Figura 14D), e dia 10 (Figura 14E). Todos os tecidos de fígado em pontos de tempodiferentes mostraram boa coloração dos vasos.
Figuras 15A-15E. As partículas de AAVP não foram detectadas no tecido do rimnormal. O rim proveniente dos animais com xenoenxertos de melanoma humano injetadoscom RGDTNF-α foi colorido com o anticorpo específico de bacteriófago e anticorpo de vasosangüíneo CD31. A detecção foi efetuada usando Alexa Flour 488, Alex Flour 594 e DAPIpara visualizar os vasos sangüíneos, AAVP e os núcleos das células, respectivamente(250X). Não observamos a presença de AAVP no rim em nenhum dos pontos de tempotestados, dia 1 (Figura 15A), dia 2 (Figura 15B), dia 3 (Figura 15C), dia 8 (Figura 15D) e dia10 (Figura 15E). No entanto, todos os tecidos do rim em pontos de tempo diferentesmostram boa coloração dos vasos.
Figura 16. AAVP expressa o produto gênico específico, in vivo. Secçõescongeladas dos animais com xenoenxertos de melanoma humano injetados com ou PBS ouRGDTNF-α foram usados para extrair a proteína total. 50 μg da proteína total foram usadospara medir os níveis de proteína do TNF-α por ELISA, em duplicatas. Os níveis basais deexpressão de TNF-α, endógena, foram observados em todos os tecidos testados. Animaisinjetados com PBS não mostraram nenhum aumento sobre os níveis endógenos emquaisquer dos pontos de tempo testados. Os camundongos injetados com RGDTNF-αAAVP mostram expressão de TNF-α começando no dia 4 e aumentando gradualmente nodia 10.
Figuras 17A-17B. AAVP expressa TNF-α na vasculatura e produz apoptose in vivo.(Figura 17A) Secções congeladas dos animais com xenoenxertos de melanoma humanoinjetados com RGDTNF-α AAVP colorido com anticorpo específico de TNF-α usando análisehistoquímica. A coloração de TNF-α é vista como uma mancha de cor marrom em volta dosvasos sangüíneos (painel esquerdo, 100X; painel direito 400X). (Figura 17B). Secçõescongeladas dos animais com xenoenxertos de melanoma humano injetados com RGDTNF-α AAVP colorido para detectar células apoptóticas. O vaso sangüíneo e as células tumoraiscircundantes mostraram apoptose vista nas células coloridas de azul com o marcador azulTACS (painel esquerdo, 200X). As amostras foram contra-coloridas com vermelho rápidonuclear. O painel direito mostra vasos sangüíneos coloridos com o anticorpo específicoCD31 (200X).
Figuras 18A-18B. Tratamento do melanoma humano sensível ao TNF-ά, M21(Figura 18A) e melanoma humano resistente ao TNF-α, Pmel (Figura 18B), com AAVP.Camundongos sem pelagem (nude) com tumores M21/Pme! implantados subcutaneamenteforam tratados com AAVP sistemicamente através de injeção na veia da cauda e osvolumes tumorais foram medidos em diferentes pontos de tempo. Os volumes tumoraisplotados versus os dias diferentes pós-tratamento. (Figura 18A) Os animais tratados comRGDTNF-α mostraram redução estatisticamente significante (p<0,05) no volume do tumorcomeçando no dia direção axial 20. (Figura 18B) Melanoma humano resistente ao TNF-α foitornado sensível à terapia com TNF-α por distribuição de EMAP-II através de AAVP seguidopelo tratamento com TNF-α recombinante. Os camundongos tratados tanto com rTNF-acomo com AAVP expressando EMAP-II (RGDEMAP-II) sozinho mostraram muito poucoefeito e não estavam significantemente diferentes do grupo PBS ou fdEMAP-ll. Oscamundongos tratados com o vírus RGD-EMAP-II e rTNF-α mostraram redução significantede volume tumoral (p = 0,007).
Figuras 19A-19B Transdução de células de glioma humano em cultura porCRTIGPSVC (SEQ ID NO: 1) AAVP - Luc células de glioma humano derivadas deU87 foramsemeadas em placas de 24 poços na concentração de 40.000 células/poço /poço ecultivadas O.N. a 37°C. No dia seguinte, as células foram incubadas com AAVP, de acordocom o protocolo Nature Method. RGD-4C AAVP GFP e RGD-4C AAVP Luc foram usadascomo controle positivo para eficácia de transdução. As imagens foram tomadas no dia 7. Aabsorção de fago está baixa, mas aumenta dramaticamente quando as células sãocultivadas em hidrogel de Ferro AAVP (última coluna da placa e gráfico).
Embora a presente invenção seja suscetível de várias modificações e formasalternativas, as modalidades específicas nos exemplos foram mostradas nas figuras e sãoaqui descritas com mais detalhes. Contudo, deve ser entendido que a descrição dasmodalidades específicas nos exemplos não tem o objetivo de limitar a invenção às formasparticulares expostas, mas ao contrário, é para abranger todas as modificações eequivalentes conforme ilustrados em parte, pelas reivindicações apensas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente descrição, de acordo com certas modalidades, se refere, em geral, amétodos para distribuir um ou mais transgenes a uma célula alvo, tal como uma célula detumor, em um modo sítio-específico para obter uma expressão intensificada e àsconstruções e às composições úteis em tais aplicações. Em certos aspectos, a expressãode um ácido nucléico terapêutico pode ser avaliada antes da administração de umtratamento ou procedimento de diagnóstico a ou em um paciente. Em um outro aspecto, adeterminação ou avaliação da expressão na região ou local necessário para o benefícioterapêutico é avaliada e qualquer tratamento desnecessário ou benéfico marginal pode sermantido em vista de tratamentos alternativos.
Sem desejar estar ligado a qualquer teoria ou mecanismo, a presente invenção ébaseada na observação de que a expressão de transgene pode ser aumentada quando otransgene está integrado a um genoma com uma multiplicidade maior que um.Particularmente de interesse é a capacidade de certas partículas de AAVP quimérico detransduzirem células com mais que uma cópia do transgene, freqüentemente como umconcatâmero. Células transduzidas podem ser também monitoradas pela expressão de umgene repórter transportado pelas partículas de AAVP quimérico. Qualquer transgene podeser incluído em uma forma expressa de uma partícula de AWP desta invenção.
I. PARTÍCULA DE FAGO VIRAL ADENOASSOCIADO
Vírus adenoassociado (AAV) é um membro defeituoso da família de parvovírus. Ogenoma do AAV é encapsulado como uma molécula de DNA de fita simples de maior oumenor polaridade. Fitas de ambas as polaridades são acondicionadas, mas em partículas devírus separadas e ambas as fitas são infecciosas. O genoma do DNA de fita simples dovírus adenoassociado do tipo humano (AAV2) tem um comprimento de 4681 pares de basese é flanqueado por seqüências de repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 pares debase cada. Além disso, a proteína rep viral parece para mediar a recombinação nãohomóloga através das ITRs. Por conseguinte, como genomas parvovirais têm ITRs em cadaextremidade que desempenham um papel na recombinação e que são geralmenterequeridos para replicação parvoviral e acondicionamento, AAVPs da presente invençãocontêm geralmente toda ou uma porção de pelo menos uma das ITRs ou um equivalentefuncional destas.
AAVs podem ser prontamente obtidos e seu uso como vetores para distribuição degenes foram descritos, por exemplo, por Muzyczka, 1992; na Patente US 4.797.368, e napublicação de PCT WO 91/18088. A construção de vetores de AAV está descrita em váriaspublicações, incluindo Lebkowski et al., 1988; Tratshin et al., 1985; Hermonat e Muzyczka,1984.
A presente invenção proporciona os vetores de bacteriófagos viraisadenoassociados (AAV) (tais como os vetores AAV-M13) (AAVPs) que são produzidos embactérias e métodos para expressar um transgene em uma célula alvo, tal como uma célulade tumor, por transdução da célula com o AAVP. Uma vez purificada, a partícula debacteriófago alvejada contendo o bacteriófago e as seqüências de AAV com cassete detransgene é usada para transfectar células mamíferas. Seguinte à intemalização do vetordentro da célula mamífera, o transgene é integrado no genoma das células alvo. O termo"vetor" como usado aqui é definido como um veículo de ácido nucléico para a distribuição deum ácido nucléico de interesse a uma célula. O vetor pode ser uma molécula linear ou umamolécula circular.
Um AAVP combina elementos selecionados tanto do fago como dos sistemas devetor de AAV proporcionando um vetor que é simples para produção em bactéria sem limitede acondicionamento, enquanto permite a infecção das células mamíferas combinadas comintegração no cromossomo hospedeiro. Os vetores contendo muitos dos elementosapropriados estão comercialmente disponíveis, e podem ser ainda modificados pormetodologias padrão para incluir as seqüências necessárias. No mínino, para uso com osmétodos da presente invenção, o vetor deve aceitar um cassete contendo um promotor eum transgene. Os vetores de AAVP da presente invenção possibilitam uma expressão detransgene intensificada mediante incorporação no genoma de célula alvo. Em certasmodalidades, o transgene pode ser integrado no genoma da célula alvo como umconcatâmero.
Entre outras coisas, AAVPs não requerem vírus auxiliares ou fatores de transação.Além disso, o tropismo nativo do AAV para células mamíferas é eliminado já que não háformação de capsídeo de AAV.
A. Alvejando o AAVP
Os AAVPs da presente invenção podem ser alvejados a receptores específicos pelaexpressão de Iigante na superfície da partícula de fago. Em certas modalidades, ospeptídeos ou outras frações que permitem ou promovem o escape dos vetores (e dequalquer molécula ligada aos mesmos ou contida neles) do endossomo podem serincorporados e expressos na superfície do fago. Tais "outras frações" incluem moléculasque não são elas próprias peptídeos, mas que têm a capacidade de romper a membranaendossômica, facilitando, assim, o escape do vetor, e de moléculas que de outro modomimetizam as propriedades de escape endossômico das seqüências de peptídeo descritas(vide, por exemplo, a publicação PCT WO 96/10038 e Wagner et al., 1992).
Os AAVP da presente invenção são geralmente compreendidos de partículas defago filamentoso que expressam um ou mais Iigantes pré-selecionados sobre a superfície dapartícula, independente do modo pelo qual os Iigantes são ligados. Portanto, se o meio deligação para um Iigante for covalente ou via proteína do capsídeo, os AAVP da presenteinvenção são capazes de distribuir um ou mais transgenes para as células alvo por ligaçãodo Iigante a um receptor seguido por internalização dos vetores. Por exemplo, a partícula deIigante expressa sobre a superfície da partícula pode ser o peptídeo bicíclico CDCRGDCFC(RGD-4C) (SEQ ID NO:2) que se liga seletivamente às ανβ3 e <xvp5-integrinas. Essasintegrinas são altamente superexpressas na invasão das células endoteliais tumorais. Comousada aqui, "partícula de fago filamentoso" refere-se às partículas contendo tanto umgenoma de fago ou um genoma de fagemídeo. As partículas podem conter proteínas decapsídeo filamentosas. Como usado aqui, "ligante" refere-se a qualquer peptídeo,polipeptídeo, proteína ou não-proteína, tal como um peptidomimético, que é capaz de seligar a uma molécula da superfície celular e internalizar. Como usado aqui, "ligar a umreceptor" refere-se à capacidade de um ligante de reconhecer de modo específico e se ligara um receptor, como ensaiado por ensaios padrão in viiro ou in vivo.
Tipicamente, os AAVPs da presente invenção incluem uma inserção deoligonucleotídeo no genoma do plasmídeo do fago que codifica um peptídeo dealvejamento, que possibilita as propriedades de alvejamento do receptor de ligante dosvetores.
As proteínas do capsídeo do fago ou proteínas do capsídeo podem ser modificadaspor acoplamento ou fusão do total ou de parte de um polinucleotídeo de proteína decapsídeo ou de proteína codificada pelo polinucleotídeo a um ligante de alvejamento. Oligante de alvejamento pode direcionar, re-direcionar, alvejar ou intensificar a ligação doAAVP da invenção para uma célula específica, tecido e/ou órgão.
Os vírus alvejados foram originalmente criados para superar problemasencontrados por tropismos de célula hospedeira natural de vetores na terapia gênica. Nosanos recentes, foram expedidas muitas patentes sobre terapia gênica em que o vetorcontém um polipeptídeo heterólogo usado para alvejar o vetor a células específicas, taisvetores contendo glicoproteínas de fusão quimérica (Kayman et al, Patente US 5.643.756,aqui incorporada a título de referência) e vetores que contêm um anticorpo para umaproteína do capsídeo do vírus (Cotten et al., Patente US 5.693.509). Um AAVP da invençãopode ser geneticamente modificado de tal modo que a partícula é alvejada para um tipoparticular de célula (por exemplo, células da musculatura lisa, células hepáticas, célulasrenais, fibroblastos, queratinócitos, células-tronco, células-tronco mesênquimas, células damedula óssea, condrócito, células epiteliais, células intestinais, células neoplásicas oucancerosas e outras conhecidas da técnica) de modo que o genoma do ácido nucléico édistribuído para uma célula não divisora alvo, uma célula divisora alvo, ou uma célula alvoque tem um distúrbio proliferativo ou outro. Um modo de alvejar os vírus é direcionar o víruspara uma célula alvo por ligação preferencial a células tendo uma molécula na superfícieexterna da célula. Esse método de alvejar o vírus utiliza expressão ou incorporação de umligante de alvejamento sobre ou no capsídeo do vírus para auxiliar o alvejamento do vírus àscélulas ou tecidos que têm um receptor ou molécula ligante. Depois da infecção de umacélula pelo vírus, o material genético pode ser processado e expresso na célula hospedeira.O material genético pode ser integrado ao genoma da célula hospedeira ouepissomicamente mantido dentro da célula.
Em certas modalidades da invenção, uma proteína do capsídeo pode sermodificada para incluir uma fração alvejadora de modo que um AAVP pode ser distribuídopara tipos específicos de células ou de tecido. A especificidade de alvejamento dos sistemasde deliberação com base em ligante é baseada na distribuição dos receptores de ligante nostipos diferentes de células. Um ligante alvejador .pode estar associado tanto nãocovalentemente como covalentemente a uma proteína do capsídeo.
Em certas modalidades, uma seqüência de ácido nucléico heterólogo de interessepode ser inserida no vetor viral da invenção. Por exemplo, uma proteína do capsídeo podeser operativamente acoplada a um ligante para um receptor em uma célula alvo específica.
Ligantes alvejadores referem-se a qualquer ligante específico para um componentecaracterístico da região alvejada. Ligantes alvejadores preferidos incluem proteínas taiscomo anticorpos policlonais ou monoclonais, fragmentos de anticorpos, ou anticorposqujméricos, enzimas, peptídeos ou hormônios, ou açúcares tais como mono, oligo epolissacarídeos. Em certas modalidades da invenção, os Iigantes alvejadores contempladosinteragem com integrinas, proteglicanos, glicoproteínas, receptores, ou transportadores.Ligantes adequados incluem quaisquer deles que sejam específicos ou seletivos paracélulas do órgão alvo, ou para estruturas do órgão alvo exposto à circulação como resultadoda patologia local, tais como tumores.
Em certas modalidades da presente invenção, de modo a intensificar a transduçãode células resistentes, para aumentar a transdução de células alvo, ou para limitar atransdução de células indesejadas, anticorpo ou frações alvejadoras de peptídeo cíclico(ligantes) podem ser associados ao AAVP. A fração alvejadora de anticorpo, em umexemplo particular, é um anticorpo de receptor anti-EGF monoclonal. Os receptores de EGFsão distribuídos na superfície celular de vários órgãos e estão presentes em queimaduras,ferimentos, derme e tumores. A fração alvejadora de peptídeo pode ser também umpeptídeo cíclico contendo dentro de sua seqüência um motivo de ligação de RGD-integrina.Ligantes, tais como o RGD peptídeo, que se ligam às integrinas na superfície da célula,podem mediar a internalização, aumentando, assim, a eficácia de distribuição do complexoalvejado. O peptídeo alvejador pode incluir uma seqüência de RGDFV (SEQ ID NO:3), emque o peptídeo inclui a seqüência de RGD na qual o peptídeo tem um comprimento de 3 a30 aminoácidos. Em outras modalidades, o motivo de ligação de RGD-integrina tem umcomprimento de 3 a 20 aminoácidos ou um comprimento de 4 a 10 aminoácidos. Emmodalidades particulares da presente invenção, o motivo de ligação de RGD-integrina é umpeptídeo com um comprimento de 5 aminoácidos. Embora peptídeos cíclicos que contêm omotivo de ligação de RGD-integrina dentro de sua seqüência sejam preferidos, peptídeoslineares podem ser também utilizados na presente invenção. 20060239968 Composições emétodos de uso de peptídeos alvejadores para diagnóstico e terapia de câncer humano. AsPublicações de Patente US 20060094762, US 20050191294, US 20050187161, US20050074812, US 20050074747, US 20050037417, US 20050003466, US 20040170955,US 20040131623, US 200400966441, US 20040096441, US 20040071689, US20040071689, US 20040048243, US 20030152578, US 20030113320, e US 20010046498,bem como as publicações de PCT WO 2006/060171, WO 2006/010070, WO 2005/065418,WO 2005/026195, WO 2004/02099, WO 2003/02991, WO 2002/020822, WO 2002/020769,WO 2002/020723, e WO 2002/020722 descrevem várias composições e métodos paraidentificar ligantes alvejadores, cada um dos quais é aqui incorporado a título de referênciaem sua totalidade.
Como usado aqui, "ligante" refere-se a qualquer peptídeo, polipeptídeo, proteína ounão proteína, tal como um peptidomimético, que é capaz de se ligar a uma molécula nasuperfície celular e internalizar. Como usado aqui, "se ligar a um receptor" se refere àcapacidade de um ligante de reconhecer especificamente e se ligar detectavelmente a umreceptor, como ensaiado por ensaios padrão in vitro ou in vivo.
Dentro do contexto desta invenção, o ligante é acoplado a uma proteína de um fago(por exemplo, uma proteína do capsídeo), ou como uma proteína de fusão ou através deconjugação química, e é usado para distribuir um ácido nucléico para uma célula.Fragmentos de ligantes podem ser usados na presente invenção desde que o fragmentoretenha a capacidade de se ligar à molécula de superfície da célula apropriada. Igualmente,os ligantes com substituições e outras alterações, mas que retêm a capacidade de ligação,podem ser também usados. Ainda, um ligante particular se refere a um polipeptídeo oupolipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos do ligante nativo, bem como seqüênciasmodificadas (por exemplo, tendo substituições, deleções, inserções ou adições deaminoácidos em comparação com a proteína nativa (muteínas)), desde que o liganteretenha a capacidade de se ligar ao seu receptor em uma célula endotelial e resulte nadistribuição de um ácido nucléico a uma célula.
Os Iigantes podem englobar também muteínas ou proteínas mutantes que possuema capacidade de se ligarem a seu receptor expressando células e serem internalizadas. Taismuteínas incluem, mas sem limitação, aquelas produzidas por reposição de uma ou maisdas cisteínas com serina. Tipicamente, tais muteínas terão trocas de aminoácidosconservativos. DNA que codifica tais muteínas, a menos que modificado por reposição decódons regenerados, hibridizará sob condições de pelo menos baixa estringência para aseqüência de DNA nativo que codifica o Iigante do tipo selvagem.
DNA que codifica um Iigante pode ser preparado sinteticamente com base emseqüência de aminoácidos ou de DNA conhecida, isolada usando métodos conhecidosdaqueles versados na técnica (por exemplo, ampliação por PCR), ou obtida de fontescomerciais ou outras fontes. O DNA que codifica um Iigante pode diferir das seqüênciasacima por substituição de códons degenerados ou por codificação de aminoácidosdiferentes. Diferenças nas seqüências de aminoácidos, tais como aquelas que ocorrementre os Iigantes homólogos bem como organismos ou espécies individuais, são toleradosdesde que o Iigante se ligue a seu receptor. Os Iigantes podem ser isolados de fontesnaturais ou feitos sinteticamente, tais como por meios recombinantes ou síntese química.
Não é necessário que os Iigantes usados no contexto desta invenção retenhamquaisquer de suas atividades biológicas in vivo em vez de se ligarem a um receptor umacélula e serem internalizados. Se o Iigante foi modificado de modo a carecer de uma oumais atividades biológicas, ligação e internalização podem ser ainda prontamenteensaiadas, por exemplo, pelos seguintes testes ou outros testes conhecidos da técnica.Geralmente, esses testes envolvem a marcação do ligante, e incubação deste com célulasalvo, e visualização ou medição do marcador intracelular. Por exemplo, em resumo, oligante pode ser fluorescentemente marcado com FITCC ou radiomarcado com 125I,incubado com células e examinado microscopicamente por microscopia de fluorescência oumicroscopia confocal para internalização.
Os Iigantes podem ser produzidos por meios recombinantes ou outros meios empreparação para ligação às proteínas do capsídeo de fago. As seqüências de DNA emétodos para obter as seqüências destes Iigantes são Iigantes bem conhecidos. Com basenas seqüências de DNA, os genes podem ser sintetizados tanto sinteticamente (paraproteínas pequenas), ampliados de célula genômica ou cDNA, isolados de bibliotecasgenômicas ou de cDNA. Os sítios de restrição para facilitar a clonagem no vetor do fago oudo fagemídeo podem ser incorporados, tais como em iniciadores para ampliação.
Tais moléculas incluem, sem limitação, proteínas que se ligam a célulascancerosas, células endoteliais, células estromais e similares. Tais Iigantes incluem fatoresde crescimento e citocinas. Muitos fatores de crescimento e famílias de fatores decrescimento compartilham características estruturais e funcionais e podem ser de utilidadena presente invenção. Famílias de fatores de crescimento incluem fatores de crescimento defibroblastos FGF-1 até FGF-15, e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Outrosfatores de crescimento, tais como PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas), TGF-α, HB-EGF1 angiotensina, bombese, eritropoietina, fator de célula-tronco, M-CSF1 G-CSF1GM-CSF1 e endoglina também se ligam aos receptores identificados específicos sobre assuperfícies celulares e podem ser usados na presente invenção. Citocinasf incluindointerleucinas, CSFs (fatores estimuladores de colônias), e interferonas, têm receptoresespecíficos, e podem ser usados conforme descrição aqui.
Por exemplo, Iigantes e pares de ligante/receptor incluem uroquinase/receptor deuroquinase (GenBank Nos de Acesso X02760/X74309); a-1,3 fucosil transferase, a1-antitripsina/E-selectina (GenBank Nos de Acesso M98825, D38257/M87862); Iigante de P-selectina glicoproteína, Iigante de P-selectina/P-selectina (GenBank Nos de Acesso U25955,U02297/L23088), VCAM1/VLA-4 (GenBank Nos de Acesso X53051/X16983); antígeno E9(Blann et al., Atherosclerosis 120:221, 1996)/receptor de TGFP; Fibronectina (GenBank N0de Acesso X02761); a1-colágeno tipo I (GenBank N0 Z74615), p2-colágeno tipo I (GenBnakN0 de Acesso Z74616), ácido hialurônico/CD44 (GenBank N0 de Acesso M59040); Iigante deCD40 (GenBank N0 de Acesso L07414)/CD40 (GenBank N0 de Acesso L07414)/CD40(GenBank N0 de Acesso M83312); EFL-3, Iigantes LERTK-2 (GenBank Nos de AcessoL37361, U09304) para elk-1 (GenBank N0 de Acesso M25269); VE-caderina (GenBank N0de Acesso X79981); Iigante para cateninas; ICAM-3 (GenBank N0 de Acesso X669819)ligante para LFA-1, e Fator de von Willebrand (GenBank N0 de Acesso X04385), fibrinogênioe fibronectina (GenBank N0 de Acesso X92461), ligantes para ανβ3 integrina GenBank Nosde Acesso U07375, L28832).
Outros Iigantes incluem CSF-1 (GenBank Nos de Acesso M11038, M37435); GM-CSF (GenBank N0 de Acesso X03021); INF-α (interferon) (GenBank N0 de Acesso A02076;WO 8502862-A); IFN-γ (GenBank N0 de Acesso A02137; WO 8502624-A); IL-1-β(interleucina 1 alfa) (GenBank N0 de Acesso X02531, M15329); IL-1-β (interleucina 1 beta)(GenBank N0 de Acesso X02532, M15330, M15840); IL-1 (GenBank N0 de Acesso K02770,M54933, M38756); IL-2 (GenBank N0 de Acesso A14844, A21785, X00695, X00200,X00201, X00202); IL-3 (GenBank N0 de Acesso M14743, M20137); IL-4 (GenBank N0 deAcesso M13982); IL-5 (GenBank N0 de Acesso X04688, J03478); IL-6 (GenBank N0 deAcesso Y00081, X04602, M54894, M38669, M14584); IL-7 (GenBank N0 de Acesso30 J04156); IL-8 (GenBank N0 de Acesso Z11686); IL-10 (GenBank N0 de Acesso X78437,M57627); IL-11 (GenBank N0 de Acesso M57765 M37006); IL-13 (GenBank N0 de AcessoX69079, U10307); TNF-α (Fator de necrose tumoral) (GenBank N0 de Acesso A21522);TNF-β (GenBank N0 de Acesso D12614); Iigante GP30 (S68256) para erbB2; e transferrina(GenBank N0 de Acesso DQ923758) para o receptor de transferrina.
Ainda outros ligantes incluem PDGF (GenBank Nos de Acesso X03795, X02811),angiotensina (GenBank N0 de Acesso K02215), e peptídeos contendo RGD e proteínas, taiscomo ICAM-1 (GenBanI N0 de Acesso X06990) e VCAM-1 (GenBank N0 de Acesso X53051)qúe se ligam aos receptores de integrina. Outros ligantes incluem TNF-α (GenBank Nv deAcesso A21522, X01394), IFN-γ (GenBank N° de Acesso A11033, A11034), IGF-I (GenBankAccession No. A29117, X56773, S61841, X56774, S61860), IGF-II (GenBank N° de Acesso.A00738, X06159, Y00693), peptídeo naturiético atrial (GenBank N° de Acesso X54669),endotelina-1 (GenBank N° de Acesso Y00749), fator de coagulação Xa (GenBank N° deAcesso L00395, L00396, L29433, N00045, M14327), TGF-βΙ (GenBank N° de AcessoA23751), IL-1 β (GenBank N° de Acesso X03833), IL-Ιβ (GenBank N° de Acesso M15330), eendoglina (GenBank N° de Acesso X72012).
A família de proteínas de FGF inclui presentemente FGF-1 (FGF ácido ou aFGF),FGF-2 (FGF básico ou bFGF), FGF-3 (int-2), FGF-4 (hst-1/K-FGF), FGF-5, FGF-6 (hst-2),FGF-7 (fator de crescimento de queratinócito ou KGF), FGF-8, FGF-9, FGF-11 (WO96/39507), FGF-13 (WO 96/39508), FGF-14 (WO 96/39506), e FGF-15 (WO 96/39509).Outros polipeptídeos que são reativos com um receptor de FGF, que é qualquerpolipeptídeo que interage especificamente com um receptor de FGF, preferivelmente oreceptor de FGF de alta afinidade, e é transportado por meio de endossomas para a célulaem virtude de sua interação com o receptor de FGF, são adequados na presente invenção.Os Iigantes também incluem 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais fragmentos deaminoácidos dos Iigantes identificados aqui.
Também contempladas como frações alvejadoras são anticorpos e fragmentosdestes. Fragmentos de anticorpos monoclonais podem ser usados para distribuição alvo aórgãos específicos nos animais incluindo o cérebro, coração, pulmões ou fígado. Ummétodo exemplar para alvejar as partículas virais nas células que carecem de um marcadorespecífico de célula simples está descrito (Patente US 5.849.718). Por exemplo, o anticorpoA pode ter uma especificidade para tumor, mas também para tecido normal do coração epulmão, enquanto que o anticorpo B tem especificidade para tumor, mas também paracélulas do fígado normal. Claramente, o uso de anticorpo A ou anticorpo B sozinho paradistribuir um ácido nucléico anti-proliferativo ao tumor resultaria possivelmente em dano nãodesejado às células do coração, do pulmão e do fígado. Contudo, o anticorpo Aeoanticorpo B podem ser usados juntos para alvejamento das células aperfeiçoado. Assim, oanticorpo A é acoplado a um gene de codifica um ácido nucléico anti-proliferativo e édistribuído, via um sistema de absorção mediado por receptor, ao tumor, bem como aotecido do coração e do pulmão. Contudo, o gene não é transcrito ou ativo nessas células. Oanticorpo B pode ser acoplado a um ativador ou a um gene universalmente ativo quecodifica um fator necessário para a transcrição ou ativação do ácido nucléico anti-proliferativo e é distribuído às células tumorais e do fígado. Portanto, em células do coraçãoe do fígado, somente o ácido nucléico anti-proliferativo inativo é distribuído, onde ele nãoestá descrito, não acarretando efeitos adversos. Nas células do fígado, o gene que codificao fator de ativação é distribuído, mas não tem efeito porque nenhum gene de ácido nucléicoanti-proliferativo está presente. Contudo, em células tumorais, ambos os genes sãodistribuídos e o fator de ativação pode ativar o ácido nucléico anti-proliferativo, acarretandoefeitos tóxicos específicos do tumor.
Anticorpos para moléculas expressas sobre a superfície das células são úteis nocontexto da presente invenção. Tais anticorpos incluem, mas sem limitação, anticorpos parareceptores de FGF, receptores de VEGF, receptor de uroquinase, E- e P-selectinas, VCAM-1, receptor de PDGF, receptor de TGF, endossialina, ανβ3 integrina, LFA-1, antígeno E9,CD40, caderinas, e elk-1. Os anticorpos que são específicos para moléculas da superfíciecelular expressas por células são prontamente gerados como anti-soro monoclonal oupoliclonal. Muitos de tais anticorpos estão disponíveis (por exemplo, da American TypeCulture Collection, Rockville, Md.). Alternativamente, os anticorpos para Iigantes queligam/inernalizam podem ser também usados. Em tal estratégica, as partículas de fago terãoanticorpo em sua superfície, que serão então complexados ao ligante.
Muitos outros ligantes podem ser empregados para a etapa alvejadora depreparações de AAVP, dependendo do sítio alvejado para distribuição de AAVP. Em certasmodalidades, é contemplado que AAVPs são alvejados para tipos específicos de células porendocitose mediada por receptor. Por exemplo, Iactosil ceramida, e peptídeos que alvejamas proteínas relacionadas ao receptor de LDL, tal como apoliproteína E3 ("Apo E") têm sidoúteis para alvejar Iipossomas no fígado (Spanjer e Scherphof, 1983; WO 98/0748). Aasialoglicoproteína, asialofetuína, que contém resíduos de galactosila terminais, tambémdemonstrou alvejar Iipossoma no fígado (Spanjer e Scherphof, 1983; Hara et ai., 1995). Osaçúcares manosil, fucosil ou N-acetil glicosamina, quando acoplados à cadeia principal deum polipeptídeo, se ligam a receptor de manose com alta afinidade (Patente US 5.432.260,especificamente aqui incorporada a título de referência em sua totalidade). Assim, essasglicoproteínas podem ser conjugadas ao AAVP da presente invenção e são contempladascomo úteis para alvejar células específicas (por exemplo, macrófagos).
Folato e o receptor de folato foram também descritos como úteis para alvejamentocelular (Patente US 5.871.727). Nesse exemplo, a vitamina folato é acoplada à(s)proteína(s) do capsídeo. O receptor de folato tem afinidade alta para seu ligante e ésuperexpresso na superfície de várias linhagens de células malignas, incluindo tumores dopulmão, da mama e do cérebro. Os sistemas de distribuição mediada por transferinaalvejam uma ampla faixa de células replicadoras que expressam o receptor de transferrina(Gilliland etal., 1980).
A adição de Iigantes alvejantes para distribuição de gene no tratamento de doençashiperproliferativas permite a distribuição de genes cujos produtos gênicos são mais tóxicosque os dos sistemas não alvejados. Exemplos dos genes mais tóxicos que podem serdistribuídos incluem genes pró-apoptóticos tais como Bax e Bak mais genes derivados devírus e outros patógenos tais como E4orf4 adenoviral e a purina nucleosídeo fosforilase deE. coli, um assim chamado "gene suicida", que converte o pró-fármaco 6-metilpurinadesoxirribosídeo na purina 6-metil purina tóxica. Outros exemplos de genes suicidas usadoscom terapia de pró-fármaco são o gene citosina desaminase da E. coli e o gene timidinaquinase de HSV.
Em certos aspectos, AAVP pode ser usado para alvejar a vasculatura do tumoralvo. O endotélio tumoral é um alvo importante na terapia do câncer. Alvejar um geneterapêutico de interesse ao endotélio tumoral com toxicidade mínima em outros tecidospermanece a meta primária da terapia gênica antivascular. Recentemente, AAVP alvejandoendotélio tumoral foi descrito. Os inventores estudaram a capacidade desse vetor dedistribuir um agente antivascular potente, fator-α de necrose tumoral humano (TNF-α) paramelanomas humanos. Melanoma resistente ao TNF-α foi tomado sensível ao tratamento deTNF-α por distribuição de monócito endotelial que ativa o polipeptídeo-ll (EMAP-II) via AAVP.
Vetores de AAVP transportando dois genes, TNF-α e EMAP-II foram avaliados invitro e in vivo. Células de melanoma humano (M21) foram estudadas para internalização deAAVP e expressão do gene de TNF-α in vivo. Tumores crescidos subcutaneamente,M21/Pmel, em camundongos sem pelagem (nude) foram tratados sistemicamente atravésde injeções na veia da cauda. A localização do AAVP alvejado para a vasculatura tumoral, aexpressão do gene de TNF-α e a apoptose foram examinadas usando coloração comimunofluorescência, análise TaqMan RT-PCR e imunoistoquímica.
A internalização do AAVP alvejado foi observada em células M21, resultando emníveis altos de TNF-α funcionalmente ativo no sobrenadante da cultura. Nenhumainternalização do vetor não alvejado foi observada nessas células. A injeção sistêmica deAAVP mostrou a distribuição de vírus alvejado no tumor com localização de vírus mínimaem órgãos normais. A distribuição de AAVP resultou na expressão do produto gênico deTNF-α. A expressão de TNF-α induziu a apoptose nos vasos sangüíneos e células tumoraiscircundantes resultando em regressão significante do tumor. Adicionalmente, a distribuiçãoalvejada de AAVP expressando EMPA-II sensibilizou um melanoma humano resistente aTNF-α a um tratamento com TNF-α. Os vetores de AAVP podem ser usados para distribuiragentes antivasculares especificamente para a vasculatura tumoral, reduzindo, assim, atoxicidade sistêmica.
O AAVP da invenção pode ser alvejado a regiões específicas do corpo por ligaçãode Iigantes alvejadores específicos para proporcionarem acúmulo rápido e concentração deAAVP e, por conseguinte, de moléculas de ácido nucléico, em um tecido designado. OsIigantes contemplados para uso na presente invenção podem ser conjugados ao AAVP poruma variedade de- métodos. Várias composições e métodos vpara acoplar um Iigantealvejador a uma proteína do capsídeo são conhecidos da técnica.
II. ÁCIDOS NUCLÉICOS
O AAVP da presente invenção tem a capacidade de distribuir um ou maistransgenes para o núcleo da célula alvo, intensificando, assim, a expressão do transgene nacélula alvo. Um AAVP pode também render uma vantagem na expressão gênica por meiode um destino alterado do cassete de transgene através da formação de concatâmeros docassete de transgene, levando assim a uma expressão do gene aumentada.
O termo "transgene", como usado aqui, refere-se a um gene ou material genéticoque foi transferido de um organismo para outro. Um transgene pode compreender um oumais genes e/ou um ou mais oligonucleotídeos. Por exemplo, um transgene podecompreender um gene repórter, um gene suicida, uma enzima conversora de pró-fármaco,e/ou um ou mais genes terapêuticos. Como usado aqui, "oligonucleotídeo" refere-se a umaseqüência curta de ácidos nucléicos com vinte ou menos pares de base. O termo "geneterapêutico", como usado aqui, é definido como uma região de ácido nucléico, queproporciona um efeito terapêutico em uma doença, condição médica, órgão, tecido, célulaou característica fisiológica de um organismo. Como usado, o termo "cassete" como usado éum ácido nucléico que pode expressar uma proteína, polipeptídeo, ou RNA de interesse.
Além dos ligantes, um AAVP pode conter um transgene compreendendo um generepórter cujo produto pode ser selecionado ou detectado. Como referido aqui, um "generepórter" é uma região de ácido nucléico que codifica um produto que pode ser detectado,tal como por fluorescência, atividade enzimática, em um composto detectavelmentemarcado ou substrato cromogênico, ou substrato fluorescente, e similar; ou selecionado pormeio das condições de crescimento. Tais genes repórter incluem, sem limitação, proteínafluorescente verde (GFP), β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), lucifease,neomicina fosfotransferase, fosfatase alcalina secretada (SEAP)1 hormônio do crescimentohumano (HGH), timidina quinase, e similares. Marcadores selecionáveis incluem resistentesa fármacos, tais como neomicina (G418), higromicina, e similares. Em certas modalidades,um gene repórter que codifica uma proteína secretada que pode ser detectada no sangue,outros fluidos corpóreos, ou tecidos, pode ser usado para medir a expressão de nível dogene repórter.
Além de um gene repórter, o transgene pode compreender também um geneterapêutico. AAVPs transportando tais transgenes podem possibilitar, entre outras coisas, oimageamento de um paciente (por exemplo, um humano), tanto in vitro como in vivo.Imageamento in vitro pode permitir o imageamento não invasivo do paciente todo ou deáreas alvo do paciente. Depois da introdução desses transgenes, a expressão pode sersubmetida ao imageamento usando técnicas de imageamento conhecidas da tecnologia (porexemplo, imageamento por BLI1 imageamento por PET1 imageamento fluorescente, esimilar). Um "paciente", como usado aqui, refére-se a qualquer entidade mamífera, porexemplo, um paciente pode ser um humano que necessite de terapia gênica ou de outrotratamento.
Em outras modalidades, o AAVP pode conter um gene suicida. O termo "genesuicida", como usado aqui, é definido como um ácido nucléico que, mediante administraçãode um pró-fármaco, efetua a transição de um produto gênico para um composto que matasua célula hospedeira. Exemplos de combinações de gene suicida/pró-fármaco, que podemser usados são Vírus do Herpes Simples-timidina quinase (HSV-tk) e ganciclovir, aciclovir ouFIAU; oxidorredutase e cicloeximida; citosina desaminase e 5-fluorcitosina; timidina quinasetimidilato quinase (Tdk::Tmk) e AZT; e desoxicitidina quinase e citosina arabinosídeo. Emcertas modalidades, um gene suicida por agir no modo de um gene terapêutico porproporcionar um efeito terapêutico em uma doença ou condição médica como resultado dadestruição de sua célula hospedeira.
O termo "ácido nucléico" é bem conhecido da técnica. Um "ácido nucléico", comousado aqui, irá se referir a uma molécula (i.e., uma fita) de DNA, RNA ou um derivado ouanálogo destes, compreendendo uma nucleobase. Uma nucleobase inclui, por exemplo,base purina ou pirimidina, naturais, encontradas no DNA (por exemplo, uma adenina "A",uma guanina "G", uma timina "T" ou uma citosina "C") ou no RNA (por exemplo, uma A, umaG, um uracil "U" ou uma C). O termo "ácido nucléico" engloba os termos "oligonucleotídeo" e"polinucleotídeo", cada um como um subgênero do termo "ácido nucléico". O termo"oligonucleotídeo" refere-se a uma molécula tendo um comprimento de entre cerca de 8 ecerca de 100 nucleobases. O termo "polinucleotídeo" refere-se a pelo menos uma moléculamaior que cerca de 100 nucleobases de comprimento.
Aqui, em certas modalidades, um "gene" refere-se a um ácido nucléico que étranscrito. Em certos aspectos, o gene inclui seqüências envolvidas na transcrição, ou naprodução de mensagem ou composição. Como será entendido por aqueles versados natécnica, esse termo funcional "gene" inclui ambas as seqüências genômicas, seqüências deRNA ou de cDNA ou segmentos de ácido nucléico engenheirados, menoress, inclusivesegmentos de ácido nucléico de uma parte não transcrita de um gene, incluindo, mas semlimitação, o promotor não transcrito ou as regiões intensificadoras de um gene. Segmentosde ácido nucléico de gene engenheirado, menores, podem expressar, ou podem seradaptados para expressarem tecnologia de manipulação de ácido necléico, proteínas,polipeptídeos, domínios, peptídeos, proteínas de fusão, mutantes e/ou similares.
Um polinucleotídeo da invenção pode formar um "cassete de expressão". Um"cassete de expressão" é um polinucleotídeo que proporciona a expressão de uma unidadede transcrição particular. Ou seja, ele inclui elementos de promotor e outros várioselementos que funcionam na transcrição de um gene ou unidade de transcrição. Um cassetede expressão pode ser também parte de um polinucleotídeo de replicação maior ou vetor deexpressão ou construção.
Essas definições referem-se em geral a uma molécula de fita simples, mas emmodalidades específicas, também englobarão um fita adicional que é parcial, substancial ouinteiramente complementar à molécula de fita simples. Assim, um ácido nucléico podeenglobar uma molécula de dupla fita que compreende uma ou mais fitas complementares ou"complemento(s)" de um uma seqüência particular que compreende uma molécula.
"Substancialmente isolados de outras seqüências de codificação" significa que ogene de interesse forma a parte significante da região de codificação do ácido nucléico, ouque o ácido nucléico não contém grandes porções de ácido nucléicos codificadores naturais,tais como fragmentos cromossômicos grandes, outros genes funcionais, regiões decodificação de RNA ou de cDNA. Naturalmente, isso se refere ao ácido nucléico comooriginalmente isolado, e não exclui genes ou regiões de codificação adicionadas ao ácidonucléico pelo homem.
Como usada aqui, uma "nucleobase" refere-se a uma base heterocíclica, tal comouma nucleobase natural (i.e., A, T, G, C ou U), encontrada em pelo menos um ácidonucléico natural (i.e., DNA e RNA), e derivado(s) natural(naturais) ou não naturais eanálogos de tal nucleobase. Uma nucleobase geralmente pode formar uma ou mais ligaçõesde hidrogênio ("anelar" ou "hibridizar") com pelo menos uma nucleobase natural de modoque pode substituir o pareamento de nucleobases, natural (por exemplo, a ponte dehidrogênio entre A e T, G e C, e A e U).
Como usado aqui, um "nucleotídeo" refere-se a um nucleosídeo que compreendeainda uma fração de "cadeia principal". Uma fração da cadeia principal liga geralmente, demodo covalente, um nucleotídeo a uma outra molécula que compreende um nucleotídeo, oua um outro nucleotídeo para formar um ácido nucléico. A "fração de estrutura principal" emnucleotídeos naturais compreende tipicamente compreende uma fração de fósforo, que écovalentemente ligada a um açúcar de 5 carbonos. A ligação da fração de cadeia principalocorre tipicamente tanto na posição 3' como na posição 5' do açúcar de 5 carbonos.Contudo, outros tipos de ligações são conhecidos na técnica, particularmente quando umnucleotídeo compreende derivados ou análogos de açúcar natural de 5 carbonos ou fraçãode fósforo.
A. Construções de Expressão
As construções de expressão da invenção podem incluir ácidos nucléicos quecodificam um ácido nucléico terapêutico e/ou uma proteína para imageamento. Em outrosaspectos, a construção de expressão pode ser uma construção de expressão terapêuticaque pode ser usada em composições terapêuticas e nos métodos da invenção. Em certasmodalidades, o material genético pode ser manipulado para produzir cassetes de expressãoe/ou construções de expressão que codificam proteínas de imageamento, proteínasalvejadoras e/ou genes terapêuticos.
As modalidades da invenção podem incluir dois tipos separados do cassete deexpressão ou da construção de expressão compreendendo um cassete de expressão. Umcassete é usado na expressão de uma proteína de imageamento, i.e., uma proteína que édiretamente detectável ou tem uma atividade da propriedade que é indiretamente detectável.Um outro cassete de expressão pode codificar um gene terapêutico. No contexto de umvetor terapêutico, um gene terapêutico pode ser um gene terapêutico discutido aqui útil notratamento profilático ou terapêutico de uma condição de doença. No contexto da terapiagênica, o gene pode ser um DNA heterólogo, com o significado de incluir DNA derivado deuma fonte diferente do genoma viral que proporciona a cadeia principal do vetor. O genepode ser derivado de uma fonte procariótica ou eucariótica tais como bactéria, vírus,levedura, parasita, planta, ou mesmo um animal. O DNA heterólogo pode ser tambémderivado de mais que uma fonte, i.e., uma construção multigênica ou uma proteína de fusão.O DNA heterólogo pode incluir também uma seqüência reguladora que pode ser derivada deuma fonte e o gene de uma fonte diferente.
B. Regiões de Controle
Cassetes e/ou construções de expressão da invenção, se codificam uma proteínade imageamento ou gene(s) terapêutico(s), incluirão tipicamente várias regiões de controle.Essas regiões de controle modulam tipicamente a expressão do gene de interesse.
1. Promotores
Por todo o relatório descritivo, o termo "construção de expressão" é para serentendido como incluindo qualquer tipo de construção genética contendo um ácido nucléicoque codifica produtos gênicos, onde parte ou toda a seqüência de codificação de ácidosnucléicos é capaz de ser transcrita, por exemplo, toda ou parte de uma proteína deimageamento ou proteína terapêutica. O transcrito pode ser traduzido em uma proteína, masnão é necessário. Em certas modalidades, a expressão inclui tanto a expressão de um genecomo a tradução de mRNA em um produto gênico. Em outras modalidades, a expressãoinclui somente a transcrição de um ácido nucléico terapêutico tais como RNAs ou DNAsinibidores.
O ácido nucléico que codifica um produto gênico está sob controle transcricional deum promotor. Um "promotor" refere-se a uma seqüência de DNA reconhecida pelomaquinário da célula, ou introduzida no maquinário introduzido, requerido para iniciar atranscrição específica de um gene. Em aspectos particulares, a transcrição pode serconstitutiva, induzível e/ou repressível A frase "sob controle transcricional" significa que opromotor está na localização e na orientação corretas em relação ao ácido nucléico paracontrola a iniciação de RNA polimerase e a expressão do gene.
O termo promotor será usado aqui para referir-se a um grupo de módulos decontrole transcricional que são agrupados em torno do sítio de iniciação para RNApolimerase II. Muito do que se pensa sobre como os promotores são organizados deriva deanálises de promotores virais severos, inclusive aqueles para vários promotores retrovirais,a HSV timidina quinase (tk) e as unidades de transcrição precoce de SV40.
Elementos de promotores adicionais regulam a freqüência da iniciaçãotranscricional. Tipicamente, esses estão localizados na região 30-110 bp a montante do sítiode iniciação, embora vários promotores tenham, também, sido mostrados recentementecomo contendo elementos funcionais a jusante do sítio de iniciação. O espaçamento entreos elementos de promotores é freqüentemente flexível, de modo que a função do promotor éconservada quando os elementos são invertidos ou movidos com relação um ao outro.Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar oucooperativamente ou independentemente para ativar a transcrição.
Não se acredita que o promotor particular empregado para controlar a expressão deuma seqüência de ácidos nucléicos de interesse seja importante, desde que ele seja capazde direcionar a expressão do ácido na célula alvejada. Assim, quando uma célula humana éalvejada, é preferível posicionar a região de codificação de ácido nucléico adjacente ao esob o controle de um promotor que é capaz de ser expresso em uma célula humanaalvejada. Falando de modo geral, tal promotor pode incluir tanto um promotor humano, viralou uma combinação deles.
Em várias modalidades, o promotor de gene precoce imediato do citomegalovírushumano (CMVIE), o promotor precoce de SV40, a repetição terminal longa do vírus desarcoma de Rous, β-actina, promotor de insulina de rato e gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase podem ser usados para obter alto nível de expressão da seqüência decodificação de interesse. O uso de outros promotores virais, retrovirais ou celularesmamíferos ou de fago bacteriano, que são bem conhecidos na técnica para obtenção deexpressão de uma seqüência de codificação de interesse é também contemplado, desdeque os níveis de expressão sejam suficientes para um determinado propósito. Ao seempregar um promotor com propriedades bem conhecidas, o nível e o padrão da expressãoda proteína de interesse seguinte à transfecção ou transformação podem ser otimizados.
A seleção de um promotor que é regulado em resposta a sinais fisiológicosespecíficos ou sintéticos pode possibilitar a expressão induzível do produto gênico emcomparação com a célula sob condições não induzíveis. Por exemplo, no caso onde aexpressão de um transgene, ou de transgenes quando um vetor multicistrônico é utilizado étóxica para as células onde o vetor é produzido, pode ser desejável proibir ou reduzir aexpressão de um ou mais dos transgenes. Exemplos de transgenes que podem ser tóxicospara a linhagem de célula produtora são genes pró-apoptóticos ou de citocina. Váriossistemas de promotores induzíveis estão disponíveis para a produção de vetores virais ondeo produto transgênico pode ser tóxico.
O sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad1 CA) é um desses sistemas. Essesistema é projetado para permitir a expressão regulada de um gene de interesse em célulasmamíferas. Ele consiste em um mecanismo de expressão rigorosamente regulado quevirtualmente não permite a expressão em nível basal do transgene, mas acima de 200 vezesde capacidade de indução. Um outro sistema induzível que seria útil é o sistema Tet-Off™ou Tet-On™ (Clontech, Palo Alto, CA) desenvolvido originalmente por Gossen e Bujard(Gossen e Bujard, 1992; Gossen et al., 1995). Esse sistema também permite que altosníveis de expressão de gene sejam regulados em resposta à tetraciclina ou aos derivadosde tetraciclina tal como doxiciclina.
Em algumas circunstâncias, pode ser desejável regular a expressão de umtransgene em um vetor de expressão terapêutica. Por exemplo, promotores virais diferentescom resistências variáveis de atividade podem ser utilizados dependendo do nível deexpressão desejado. Em células mamíferas, o promotor precoce imediato de CMV éfreqüentemente usado para proporcionar ativação transcricional forte. Versões modificadasdo promotor de CMV que são menos potentes têm sido também usadas quando níveisreduzidos de expressão de transgene são desejados. Quando se quer a expressão de umtransgene em células hematopoiéticas, os promotores retrovirais, tais como LTRs de MLVou de MMTV, são usados freqüentemente. Outros promotores virais que podem ser usadosdependendo do efeito desejado incluem SV40, RSV LTR, HIV-1 e HIV-2 LTR1 promotores deadenovírus tais como E1A, E2A, ou região de MLP, AAV LTR, vírus do mosaico da couve-flor, HSV-TK, e vírus do sarcoma aviário.
Similarmente, promotores específicos e seletivos podem ser usados para efetuar atranscrição em tecidos ou células específicas de modo a reduzir a toxidez potencial ouefeitos indesejáveis para tecidos não alvejados. Por exemplo, promotores tais como PSA,probasina, ácido prostático fosfatase ou calicreína glandular específica da próstata (hK2)podem ser usados para alvejar a expressão do gene alvo na próstata. Similarmente, osseguintes promotores podem ser usados para alvejar a expressão do gene alvo em outrostecidos (Tabela 1).
Em certas indicações, pode ser desejável ativar a transcrição em temposespecíficos depois da administração do vetor da terapia gênica. Isso pode ser feito com taispromotores como aqueles que são reguláveis por hormônio ou por citocina. Por exemplo,em aplicações terapêuticas onde a indicação é um tecido gonodal onde esteróidesespecíficos são produzidos ou enviados, o uso de promotores de androgênio ou estrogêniopode ser vantajoso. Tais promotores que são reguláveis por hormônios incluem MMTV, MT-1, esdisona e RuBisco. É esperado que outros promotores regulados por hormônios, taiscomo aqueles responsivos aos hormônios da tireóide, pituitários e adrenais, sejam úteis napresente invenção. Os promotores responsivos à citocina e proteína inflamatória quepoderiam ser usados incluem KeT Cininogênio (Kageyama et al., 1987), c-fos, TNF-alfa,proteína reativa C (Arcone et al., 1988), haptoglobina (Oliviero et al., 1987), amilóide A 2sérico, C/EBP alfa, IL-1, IL-5 (Poli e Cortese, 1989), Complemento C3 (Wislon et al., 1990),IL-8, glicoproteína ácido alfa-1 (Prowse e Baumann, 1988), alfa-1-antitipsina, lipoproteínalípase (Zechner et al., 1988), angiotensinogênio (Ron et al., 1990), fibrinogênio, c-jun(induzível por éstere forbol, TNF-alfa, radiação UV, ácido retinóico, e peróxido dehidrogênio), colagenase (induzida por ésteres forbol e ácido retinóico), metalotioneína(induzível por metal pesado e glicocorticóide), Estromelisina (induzível por éster forbol,interleucina-1 e EGF), alfa-2 macroglubulina e alfa-1 antiquimiotripsina. Promotoresespecíficos de tumor, tais como osteocalcina, elemento responsivo à hipoxia (HRE), MAGE-4, CEA, alfa-fetoproteína, GRP78/BÍP e tirosinase podem ser também usados para regular aexpressão gênica em células tumorais.
É contemplado que qualquer dos promotores acima sozinhos ou em combinaçãoum com o outro podem ser úteis de acordo com a presente invenção, dependendo da açãodesejada. Além disso, essa lista de promotores não deve ser interpretada como sendoexaustiva ou limitativa. Aqueles versados na técnica terão conhecimento de outrospromotores que podem ser usados em conjunto com os promotores e métodos descritosaqui.
TABELA 1. PROMOTORES ESPECÍFICOS DE TECIDOTECIDOPromotorPâncreasInsulinaElastinaFígadoAmilasepdr-1 pdx-1glicocinaseAlbumina PEPCKIntensificador de HBVα fetoproteínaapolipoproteína Cα-1 antitripsinavitelogenina, NF-ABTranstiretinaMúsculo esquelético Cadeia de Miosina HCreatina cinase do músculo<table>table see original document page 36</column></row><table>
2. Intensificadores
Os intensificadores são elementos genéticos que aumentam a transcrição de umpromotor localizado em uma posição distante na mesma molécula de DNA. Osintensificadores são organizados de modo bastante similar aos promotores. Ou seja, elessão compostos de muitos elementos individuais, cada um dos quais se liga a uma ou maisproteínas transcricionais. A distinção básica entre intensificadores e promotores éoperacional. Uma região intensificadora deve ser, como um todo, capaz de estimular atranscrição em uma distância; isso não precisa ser verdadeiro para uma região de promotorou seus elementos componentes. Por outro lado, um promotor deve ter um ou maiselementos que direcionam a iniciação da síntese de RNA em um sítio particular e em umaorientação particular, ao passo que os intensificadores carecem dessas especificidades.Promotores e intensificadores estão freqüentemente se sobrepondo e contíguos,freqüentemente parecendo ter uma organização modular muito similar.
Embaixo está uma lista de promotores adicionais para os promotores específicospara tecidos, listados acima, promotores/intensificadores celulares epromotores/intensificadores induzíveis que poderiam ser usados em combinação com oácido nucléico que codifica um gene de interesse em uma construção de expressão (Tabela2 e Tabela 3). Adicionalmente, qualquer combinação de promotor/intensificador (como aBase de Dados de Promotores Eucarióticos EPDB) poderia ser usada também para acionara expressão do gene. Células eucarióticas podem suportar a transcrição citoplásmica decertos promotores bacterianos se a polimerase bacteriana apropriada é provida ou comoparte do complexo de distribuição ou como uma construção de expressão genéticaadicional.
Em modalidades preferidas da invenção, uma construção de expressão terapêuticacompreende um vírus ou construção engenheirada derivada de um genoma viral. Acapacidade de certos vírus de entrarem nas células via endocitose mediada por receptor epara se integrarem ao genoma da célula hospedeira e expressarem os genes virais estáveise eficientemente fez com que eles se tornassem candidatos atraentes para a transferênciade genes estranhos para as células mamíferas (Ridgeway, 1988; Nicolas e Rubenstein,1988; Baichwal e Sugden, 1986; Temin, 1986).
TABELA 2
<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>
TABELA 3
<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>
C. Sinais de Poliadenilação
Os sinais de poliadenilação podem ser usados em vetores terapêuticos e/ou deimageamento. Quando uma inserção de cDNA é empregada, será tipicamente desejadoincluir um sinal de poliadenilação para efetuar a poliadenilação própria do transcrito do gene.
Não se acredita que a natureza do sinal de poliadenilação seja crucial para o sucesso daprática da invenção, e qualquer de tal seqüência pode ser empregada tais como sinais depoliadenilação do hormônio de crescimento humano ou bovino e de SV40. Tambémcontemplado como um elemento do cassete de expressão é um terminador. Esseselementos podem servir para intensificar os níveis de mensagem e minimizar a leituraatravés do cassete em outros processos.
D. Genes Terapêuticos
Partículas de AAVP da invenção podem ser usadas para distribuir uma variedadede agentes terapêuticos ou de imageamento, incluindo vetores de expressão terapêutica. Apresente invenção contempla o uso de uma variedade de genes terapêuticos diferentes. Porexemplo, genes que codificam enzimas, hormônios, citocinas, oncogenes, receptores,canais de íons, supressores de tumor, fatores de transcrição, marcadores selecionáveis defármacos, toxinas e vários antígenos são contemplados como genes adequados para uso deacordo com a presente invenção. Além disso, construções de RNA anti-sentido ou inibidor,derivadas de oncogenes, são outros "genes" de interesse de acordo com a presenteinvenção.
De acordo com a presente invenção, um gene ou polipeptídeo selecionado pode sereferir a qualquer proteína, polipeptídeo, ou peptídeo. Um gene ou polipeptídeo terapêutico éum gene ou polipeptídeo que pode ser administrado a um paciente com a finalidade detratar ou prevenir uma doença. Por exemplo, um gene terapêutico por ser um geneadministrado a um paciente para tratamento ou prevenção de câncer. Exemplos de genesterapêuticos incluem, mas sem limitação, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC1CTS-1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1,FCC1 MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF1 G-CSF1 timidina quinase, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad1 Harakiri1 Fas-L1 mda-7, fus,interferon a, interferon β, interferon γ, p53, ABLI, BLC1, BLC6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA,ERBB, EBRB2, ETS1, ETS2, ETV6, FGR1 FOX, FYN, HCR1 HRAS, JUN, KRAS, LCK1 LYN,MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC1 TAL1, TCL3, YES,MADH4, RB1, TP53, WT1, TNF, BDNF, CNTF1 NGF, IGF, GMF1 aFGF, bFGF, NT3, NT5,ApoAI, ApoAIV, ApoE, RaplA, citosina desaminase, Fab, ScFv, BRCA2, zacl, ATM, HIC-1,DPC-4, FHIT, PTEN1 ING1, NOEY1, NOEY2, OVCA1, MADR2, 53BP2, IRF-1, zacl,DBCCR-1, rks-3, COX-1, TFPI1 PGS1 Dp1 E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst,abi, E1A, p300, VEGF, FGF, trombospondina, BAI-1, GDAIF1 ou MCC.
Outros exemplos de genes terapêuticos incluem genes que codificam enzimas.Exemplos incluem, mas sem limitação, ACP dessaturase, uma ACP hidroxilase, uma ADP-glicose piroforilase, uma ATPase1 uma álcool desidrogenase, uma amilase, umaamiloglicosidase, uma catalase, uma celulase, uma ciclooxigenase, uma descarboxilase,uma dextrinase, uma esterase, uma DNA polimerase, uma RNA polimerase, uma hialuron-sintase, uma galactosidase, uma glucanase, uma glicose oxidase, uma GTPase, umahelicase, uma hemicelulase, uma hialuronidase, uma integrase, uma invertase, umaisomerase, uma quinase, uma lactase, uma lipase, uma Iipoxigenase1 uma liase, umalisozima, uma pectinaesterase, uma peroxidase, uma fosfatase, uma fosfolipase, umafosforilase, uma poligalacturonase, uma proteinase, uma peptidase, uma pulanase, umarecombinase, uma transcriptase reversa, uma topoisomerase, uma xilanase, um generepórter, uma interleucina, ou uma citocina.
Outros exemplos de genes terapêuticos incluem o gene que codifica carbamoilsintetase I, ornitina transcarbamilase, arginossuccinato sintetase, arginossuccinato Iiase1arginase, fumarilacetoacetato hidrolase, fenilalanine hidroxilase, alfa-1 antitripsina, glicose-6-fosfatase, receptor de lipoproteína de baixa densidade, porfobilinogênio desaminase, fatorVIII, fator IX, cistationa beta.-sintase, cetoácido de cadeia ramificada descarboxilase,albumina, isovaleril-CoA desidrogenase, propionil CoA carboxilase, metil malonil CoAmutase, glutaril CoA desidrogenase, insulina, -glicosidase, piruvato carboxilase, fosforilasehepática, fosforilase quinase, glicina descarboxilase, Η-proteína, T-proteína, ATPasetransportadora de cobre da doença de Menkes, ATPase transportadora de cobre da doençade Wilson, citosina desaminase, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase, galactose-1-fosfato uridiltransferase, fenilalanina hidroxilase, glicocerbrosidase, esfingomielinase, -L-iduronidase, glicose-6-fosfato desidrogenase, HSV timidina quinase, ou timidina quinasehumana.
Genes terapêuticos incluem também hormônios que codificam genes. Exemplosincluem, mas sem limitação, genes que codificam o hormônio do crescimento, prolactina,lactogênio placentário, hormônio luteinizante, hormônio folículo estimulante, gonadotropinacoriônica, hormônio estimulador da tireóide, leptina, adrenocorticotropina, angiotensina I,angiotensina II, β-endorfina, hormônio estimulador de β-melanócito, colecistocinina,endotelina I, galanina, peptídeo inibidor gástrico, glucagon, insulina, lipotropinas,neurofisinas, somatostatina, calcitonina, peptídeo relacionado ao gene de calcitonina,peptídeo relacionado ao gene de β-calcitonina, hipercalcemia do fator de malignidade,proteína relacionada ao hormônio paratireóide, peptídeo similar ao glucagon,pancreastatina, peptídeo pancreático, peptídeo YY, PHM, secretina, peptídeo intestinalvasoativo, oxitocina, vasopressina, vasotocina, encefalinamida, metorfinamida, hormônioestimulador de alfa melanócito, fator natriurético atrial, amilina, componente de amilóide P,hormônio Iiberador de corticotropina, fator Iiberador do hormônio de crescimento, hormônioliberador do hormônio luteinizante, neuropeptídeo Y, substância K, substância P, ouhormônio Iiberador de tirotropina
Em ainda uma outra modalidade, o gene heterólogo pode incluir um anticorpo decadeia simples. Métodos para a produção de anticorpos de cadeia simples são bemconhecidos daqueles versados na técnica. O técnico no assunto deve se referir à PatenteUS 5.359.046 (aqui incorporada a título de referência) para tais métodos. Um anticorpo decadeia simples é criado para se fundir juntamente com os domínios variáveis das cadeiaspesadas e leves usando um Iigante de peptídeo curto, reconstituindo, assim, um sítio deligação de antígeno em uma molécula simples.
E. Construções Multigênicas e IRES
Em certas modalidades da invenção, o uso de elementos de sítios de ligação deribossomos internos (IRES) é para criar mensagens policistrônicas multigênicas (Pelletier eSonenberg, 1988). Elementos de IRES de dois membros da família do picanovírus (pólio eencefalomiocardite) foram descritos (Pelletier e Sonenberg, 1988), bem como um IRES deuma mensagem mamífera (Macejak e Sarnow, 1991). Os elementos de IRES podem serligados a quadros de leitura aberta heterólogos. Quadros de leitura aberta múltiplos podemser transcritos juntos, em que cada um é separado por um IRES, criando mensagenspoliGistrônicas. Em virtude do elemento de IRES; cada quadro de leitura aberta é acessívelaos ribossomas para tradução eficiente. Genes múltiplos podem ser eficientementeexpressos usando um promotor/intensificador simples para transcrever uma mensagemsimples. Qualquer quadro de leitura aberta heterólogo pode ser ligado aos elementos deIRES. Isso inclui genes para proteínas secretadas, proteínas de subunidades múltiplas,codificadas por genes independentes, proteínas intracelulares ou ligadas à membrana emarcadores selecionáveis. Desse modo, a expressão de várias proteínas pode sersimultaneamente engenheirada em uma célula com uma construção simples e um marcadorselecionável simples.
F. Preparação dos Ácidos Nucléicos
Um ácido nucléico pode ser preparado por qualquer técnica conhecida por aquelecom conhecimento ordinário da técnica, tal como, por exemplo, síntese química, produçãoenzimática ou produção biológica. Um exemplo não Iimitativo de um ácido nucléicoproduzido enzimaticamente inclui aquele produzido por enzimas em reações de ampliaçãotal como PCR™ (vide, por exemplo, a Patente US 4.683.202 e a Patente US 4.682.195,cada uma aqui incorporada a título de referência), ou pela síntese de um oligonucleotídeodescrito na Patente US 5.645.897, aqui incorporada a título de referência. Um exemplo nãolimitativo de um ácido nucléico produzido biologicamente inclui um ácido nucléicorecombinante produzido (i.e., replicado) em uma célula viva, tal como um vetor de DNArecombinante replicado em bactérias (vide, por exemplo, Sambrook et al., 2001, aquiincorporado a título de referência).
III. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E VIAS DE ADMINISTRAÇÃOQuando aplicações clínicas são contempladas, será necessário prepararcomposições farmacêuticas das composições de AAVP (composições terapêuticas) em umaforma apropriada para a aplicação pretendida. Geralmente, isso permitirá prepararcomposições que são essencialmente isenta de pirogênios, bem como de outras impurezasque poderiam ser prejudiciais aos humanos ou animais.
Geralmente, será desejado empregar sais e tampões apropriados para tornar ascomposições adequadas para a introdução em um paciente. As composições aquosas dapresente invenção compreendem uma quantidade eficaz do AAVP ou de outro agentedissolvido ou disperso em um veículo ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável. A frase"farmacêutica ou farmacologicamente aceitável" refere-se a entidades moleculares ecomposições que não produzem reações adversas, alérgicas, ou outras reações imprópriasquando da administração a um animal ou a um humano.
Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todosos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos ou antifúngicos,agentes isotônicos ou retardadores de absorção e similares. O uso de tais meios e agentespara substâncias farmaceuticamente ativas em bem conhecido da técnica. Excetuando-seaté onde qualquer meio ou agente convencional for incompatível com as composições deAAVP da presente invenção, seu uso como um reagente de imageamento ou emcomposições terapêuticas é contemplado. Ingredientes suplementarmente ativos, tais comooutros agentes anticâncer, podem ser incorporados às composições. Sob condiçõesordinárias de armazenagem e uso, essas preparações contêm um conservante para impediro crescimento de microrganismos. Veículos intravenosos incluem repositores de fluido e denutrientes. Conservantes incluem agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantese gases inertes. O pH e a concentração exata dos vários componentes no produtofarmacêutico são ajustados de acordo com parâmetros bem conhecidos.
Uma quantidade eficaz da composição é determinada com base na metapretendida, tais como imageamento e/ou atenuação de uma condição ou doença, tal comocâncer. O termo "dose unitária" refere-se a uma unidade fisicamente separada e adequadapara uso em um paciente, em que cada unidade contém uma quantidade predeterminada dacomposição terapêutica calculada para produzir a resposta desejada em associação comsua administração, i.e., a via apropriada e o regime de tratamento. A quantidade a seradministrada, tanto de acordo o número de tratamentos como da dose unitária, depende deo paciente a ser tratado, o estado do paciente, e a proteção desejada. Quantidades precisasda composição terapêutica dependem também do critério do clínico e são peculiares paracada indivíduo.
São também contempladas composições em combinação que contêm doisingredientes ativos. Em particular, a presente invenção proporciona composições quecontêm composições de AAVP e pelo menos um segundo fármaco terapêutico, porexemplo, um fármaco anti-neoplásico.
A. Administração Parenteral
As composições ativas da presente invenção podem ser formuladas paraadministração parenteral, por exemplo, formuladas para injeção via intravenosa,intramuscular, subcutânea, e ainda vias intraperitoneais. A preparação de uma composiçãoaquosa que contem um ou mais segundos agentes, como ingredientes ativos, seráconhecida daqueles versados na técnica à luz da presente descrição. Tipicamente, taiscomposições podem ser preparadas como injetáveis, sejam na forma de soluções líquidassejam na forma de suspensões; podem ser também preparadas formas sólidas adequadasao uso na preparação de soluções ou suspensões, mediante a adição de um líquido antesda injeção; e as preparações podem ser também emuIsificadas.
As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções oudispersões aquosas estéreis; formulações incluindo óleo de gergelim, óleo de amendoim oupropileno glicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções oudispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluidaaté onde existir fácil seringabilidade.
O veículo pode ser também um meio solvente ou de dispersão contendo, porexemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicollíquido, e similar), misturas adequadas destes, e óleos vegetais. A fluidez própria pode sermantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção dotamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Aprevenção da ação de microrganismos pode ser obtida por vários agentes antibacterianos eantifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal esimilares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcaresou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguidapelo uso nas composições de agentes retardadores de absorção, por exemplo,monoestearato de alumínio e gelatina.
Soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação dos compostosativos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientesenumerados acima, conforme requerido, seguido por esterilização filtrada. Em geral, asdispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados emum veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientesrequeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação desoluções injetáveis estéreis, os métodos para preparação, em particular, são técnicas desecagem a vácuo e liofilização, que rendem um pó do ingrediente ativo mais qualqueringrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada e estéril deste.
Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a soluçãodeve ser adequadamente tamponada, se necessário e o diluente líquido inicialmentetornado isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Essas soluções aquosasparticulares são especificamente adequadas para administração intravenosa, intramuscular,subcutânea, e intraperitoneal. Nesse contexto, meios aquosos estéreis que podem serempregados serão bem conhecidos daqueles versados na técnica à luz da presenteexposição. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em 1 mL de solução de NaCIisotônico e adicionada a 1.000 mL de fluido hipodermóclise ou injetada no sítio de infusãoproposto (vide, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a Edição, páginas1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamentedependendo da condição do paciente que está sendo tratado. Aquele responsável pelaadministração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o paciente individual.
Para proporcionar uma melhor compreensão da presente invenção, os seguintesexemplos são dados. Os exemplos não devem, de nenhum modo, ser entendidos comolimitando ou definindo o inteiro escopo da invenção.IV. EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são fornecidos com a finalidade de ilustrar váriasmodalidades da invenção e não devem, de nenhum modo, serem considerados comolimitativos da invenção. Aquele versado na técnica apreciará que a presente invenção estábem adaptada para realizar outros objetivos e atingir as finalidades e as vantagensmencionadas, bem como aqueles objetivos, propósitos e vantagens inerentes a ela. Ospresentes exemplos, juntamente com os métodos descritos aqui, são presentementerepresentativos das modalidades preferidas, são exemplificativos, e não têm o propósito delimitar o escopo da invenção. Alterações neles e outros usos que estão englobados pelo espírito da invenção, conforme definida pelo escopo das reivindicações deverão ocorreràqueles versados na técnica.
EXEMPLO 1
ALVEJANDO O AAVP
A. Procedimentos Experimentais
Desenho, Construção, e Geração de Partículas de AAVP alvejado. O fago RGD-4Ce o RGD-4C AAVP foram engenheirados em processo de duas etapas: geração de umintermediário (RGD-4C fUSE5-MCS) e produção subseqüente da construção do fago RGD-4C e RGD-4C AAVP. RGD-4C fUSE5-MCS continha a inserção de oligonucleotídeo quecodifica o peptídeo alvejador específico RGD-4C e um fragmento do plasmídeo fMCS quetinha um sítio de multiclonagem (MCS) para inserção do cassete de expressão eucariótica.O fUSE5DNA derivado do fago RGD-4C e o fMCS DNA derivado do fago foram purificadosde Iisados de E. coli hospedeira (MC1061). Obtivemos o intermediário RGD-4C fUSE5-MCSpor ligação de um fragmento BamHIISacII de 5,4 kb do plasmídeo RGD-4C FUSE5 aofragmento BamHI/Sacll de 4,1 kb do plasmídeo fMCS. A seguir, criamos uma AAVP-GFPpor clonagem do fragmento Pacl (2,8 kb) do plasmídeo pAAV-eGFP (GFP intensificada;Stratagene) de ITR para ITR para o sítio Pstl do RGD-4C RJSE5-MCS. Em resumo, o pAAVfoi digerido com Pacl para liberar um fragmento de 2,8 kb, que foi "blunted" com DNApolimerase e clonado no sítio Pstl "blunted" do RGD-4C ÍUSE5-MCS. Para gerar asconstruções de fago alvejado sem ITRs, um fragmento de 2,3 kb localizado entre as ITRs depAAV-eGFP e contendo pCMV-GFP e SV40 poliA foi liberado por digestão em EcoRI,"blunted" com DNA polimerase, então clonado no MCS de RGD-4C fUSE5-MCS. Paraselecionar células que expressam GFP, o fragmento BamHI-Sac 1 do promotor de pQBIfosfoglicerato cinase-1 (PGK; QBIOgene) e contendo um seqüência de fusão de GFPneo foiclonado no sítio de Notl de AAVP ou nas construções de fago de controle para assegurarque a células expressando GFP fossem resistentes a G418. O fragmento de GFPneo depQBI PGK foi liberado por digestão com BamHI e Saci, e "blunted" com DNA polimerase;então os Iigantes fosforilados para Notl foram adicionados. Depois da digestão com Notl, ofragmento de GFPneo de 4,57 kb foi clonado no sítio Notl de AAVP ou na construção defago não quimérico. Finalmente, para gerar uma partícula de AAVP transportando o genepara HSVtk ou Luc, o fragmento de BamHI-NotI contendo a HSVtk foi subclonado no sítioBamHI-NotI do plasmídeo pAAV para repor a GfP. A ITR-HSVtk-ITR ou os fragmentos deITR-Luc-ITR foram removidos de pAAV-HSVtk e pAAV-Luc foi então inserida no RGD-4CfUSE5-MCS. As construções foram verificadas por seqüenciamento de DNA e análise derestrição, purificadas do sobrenadante da cultura de E. coli hospedeira (MC1061), re-suspensas em PBS e re-centrifugadas. Os sobrenadantes resultantes foram titulados em E.Coli (k91Kan). Diluições em série foram plaqueadas em placa de ágar Luria-Bertanicontendo tetraciclina e canamicina, e as unidades de transdução (TU) foram determinadaspor contagem das colônias.
Ensaios de Ligação na Superfície da Célula Mamífera e Internalização. Osinventores usaram o método de seleção ("biopanning") e análise rápida de Iigantesinterativos seletivos (denominado BRASIL) (Giordano et al., 2001) para avaliar a ligação defagos às células intactas. Em resumo, as células KS1767 foram desprendidas cometilenodiaminatetraacetato (EDTA) e re-suspensas em meios de Eagle modificado porDulbecco (DMEM) contendo BSA a 1% em 4 χ 10^6 células por mL. A suspensão de células(50 μl) foi incubada com 109 TU de ou clones de RGD-4C AAVP ou de AAVP exibindoversões misturadas (scrambled) de RGD-4C (CDCFGDCRC (SEQ ID NO:2), CDCGFDCRC(SEQ ID NO:3), CRCGFDC (SEQ ID N0:40, peptídeo RGE-4C mutante, ou controle nãoalvejado. Depois de 2 horas, a mistura de AAVP/célula (fase aquosa) foi transferida para otopo de uma fase orgânica imiscível (solução de 200 μl em um tubo Eppendorf de 400 μl)consistindo em ftalato de dibutila:cicloexano (9:1 [v:v], D = 1,03 g/mL) e centrifugada a10.000 g por 10 minutos, a 4°C. O tubo foi então congelado rapidamente em nitrogêniolíquido, o fundo do tubo foi cortado, e o precipitado de célula-AAVP foi isolado e o AAVPligado à membrana foi recuperado (Giordano et al., 2001).
Para internalização nas células, células KS1767 foram crescidas em lâminas decâmara de tecido (Sistema de Lâmina de Câmara Lab-Tek II; Nalge Nunc InternationalCorp.), lavadas duas vezes com PBS, incubadas com 109 TU de RGD-4C AAVP ou deAAVP de controle exibindo versões misturadas (scrambled) de RGD-4C ou de RGE-4C emDMEM contendo BSA a 1% a 37°C, e lavadas com PBS para remover AAVP ligado, depoisde 4 horas de incubação. Os clones ligados às membranas celulares foram eluídosquimicamente por rinsagem das células com glicina 20mM (pH 2,3). A seguir, as célulasforam lavadas três vezes com PBS, fixadas com PBS contendo paraformaldeído (PFA) a4%, à temperatura ambiente, por 15 minutos, lavadas com PBS, permeabilizadas com TritonX-100 a 0,2%, lavadas com PBS, e bloqueadas com PBS contendo BSA a 1%. As célulasforam então incubadas com uma diluição 1:2000 do anticorpo de bacteriófago anti-M13primário (Amersham) em PBS contendo BSA a 1% à temperatura ambiente, por 2 horas,lavadas com PBS, e incubadas com uma diluição 1:2000 de um anticorpo secundário anti-coelho conjugado a Cy3 em PBS contendo BSA a 1%, por 1 hora, à temperatura ambiente.Finalmente, as células foram lavadas com PBS, fixadas com PBS contendo PFA a 4%,montadas, e visualizadas em um microscópio óptico de fluorescência.
Resgate do AAV Recombinante de Células Transduzidas por Partículas de AAVP.Células 293 humanas foram infectadas com RGD-4C AAVP-GFPneo ou RGD-4C fago-GFPneo. Quatro dias depois da infecção, as células foram transfectadas com plasmídeo deexpressão de AAV rep e cap (pXX2) (Xiao et al., 1998) e superinfectadas com adenovírustipo 5 do tipo selvagem (Ad.). Assim, os genes de AAV rep e cap foram supridos portransfecção, e as funções auxiliadoras do adenovírus foram supridas por superinfecção. Ascélulas foram colhidas 72 horas após infecção adenoviral e os sobrenadantes foram entãousados para infectar novas células 293. A expressão GFP foi analisada usando FACS, 48horas depois. Nesse ensaio, um AAV recombinante funcional foi gerado das célulastransduzidas com a quimera de RGD 4C AAVP-GFP somente, mas não das célulastransduzidas com a GFP do fago não quimérico ou de vários controles. Resultados similaresforam também obtidos com todos os clones de RG-4C AAVP, mas com nenhum dos clonesdo fago.
Geração de Linhagens de Células Mamíferas Clonais. Células 293 humanas foraminfectadas com RGD-4C AAVP-GFPneo ou RGD-4C fago-GFPneo (a 106 TU por célula emcada caso). Clones simples (n = 9 por grupo) foram isolados sob seleção de G418 eanalisados quanto à expressão de GFP por FACS nas 12 semanas depois da seleção. OSclones estáveis foram denominados clones de fago #1-9 para fago-GFPneo e clones deAAVP #1-9 para AAVP-GFPneo.
Modelos de Tumor. A experimentação com animal foi revisada e aprovada peloInstitutional Animal Research Committee. Camundongos contendo tumor foramestabelecidos conforme descrito (Pasqualini et al., 1997; Arap et al.; Ellerby et al., 1999;Hajitou et al., 2001; Arap et al. 2004; Marchib et al., 2004). Os camundongos foramanestesiados por administração intraperitoneal de AvertinB ou por inalação de gás(isoflurano a 2% e oxigênio a 98%). Construções alvejadas ou de controle foramintravenosamente administradas. As células tumorais foram tripsinizadas, contadas,centrifugadas, e re-suspensas em meio isento de soro. Um total de 106 células de linhagensde sarcoma de Kaposi (KS 1767), carcinoma da bexiga (UC3) ou carcinoma da próstata(DU145) foi implantado subcutaneamente em camundongos sem pelagem (nude),imunodeficientes, de 6 semanas de idade. As células de tumor mamário de camundongoEF43-FGF4 (5 χ 104) foram implantadas subcutaneamente em camundongos fêmeasBALB/c, imunocompetentes, de 6 semanas de idade. Os volumes tumorais foram calculadosconforme descrito (Pasqualini et al., 1997; Arap et al., 1998; Ellerby et al., 1999; Hajitou etal., 2001; Arap et al., 2004; Marchib et al., 2004) e expressos como volume tumoral médio *desvio padrão (DP). Quando os tumores alcançaram um volume de xenoenxerto derivadosde DU145 de -50 mm2 (considerado pequeno) ou 150 mm (considerado grande) (dia 0), oscamundongos contendo tumor receberam uma dose intravenosa única de RGD-4C AAVP-HSVtk ou de controles. O tratamento com GVC (80 mg/kg por dia, via intraperitoneal) foiiniciado dois dias mais tarde nas coortes de camundongos contendo tumor correspondendoao tamanho maior.
Imageamento Molecular-Genético em Camundongos Contendo Tumor. Paraimageamento molecular não invasivo, usamos um modelo de câncer da próstata com basena linhagem de células humanas DU145 onde os camundongos sem pelagem (nude),machos, contendo xenoenxertos de tumor na área subcutânea do ombro direito foramusados. Para imagear a expressão de gene de Luc de vagalume, os camundongoscontendo tumor receberam uma dose única (1 50 mg/kg) do substrato D-Iuciferina(Xenogen) por administração intraperitoneal. A emissão fotônica foi submetida aoimageamento usando o Sistema de Imageamento In Vivo 200 (IVIS200; Xenogen, CA)depois da administração na veia da cauda do RGD-4C AAVP alvejado transportando o genede Luc ou controles (AAVP-Luc não alvejada não, ou RGD-4C AAVPLuc misturadas(scrambled)). Parâmetros de imageamento: tempo de aquisição da imagem, 1 minuto;binning, 2; sem filtro; flstop, 1; campo de vista, 10 cm. As Regiões de Interesse (ROI) foramdefinidas manualmente sobre os tumores para medir as intensidades de sinal, expressascomo fótons/s/cm2/sr.
Embora BLI possa avaliar a viabilidade da célula de expressar o transgene emsistemas experimentais, ele não é clinicamente aplicável. Assim, para avaliar a viabilidadedos xenoenxertos de tumor estabelecidos, os camundongos foram submetidos aoimageamento com escaneador microPET (Concorde Microsystems, TN), 2 horas depois daadministração intravenosa de [18Fj-FDG 100 μCi/camundongo. [18Fj-FDG foi adquiridocomercialmente (PETNet, Houston, TX). Para submeter a expressão do gene de HSVtk aoimageamento, o imageamento por PET foi realizado de 1 a 2 horas depois da administraçãointravenosa do análogo de nucleosídeo radiomarcado [18Fj-FEAU. O imageamento por PETfoi realizado em microPET R4 (Concorde Microsystems, Inc.) equipado com um leito deposicionamento controlado por computador, tem um campo de vista (FOV) transaxial de10,8 cm e axial de 8 cm, não tem septos e opera exclusivamente em modo de listagemtridimensional. Os dados do modo de listagem integralmente tridimensional foram coletadosusando uma janela de energia de 350-750 keV e uma janela de tempo de 6 ns. Todos osdados brutos foram inicialmente classificados em sinogramas tridimensionais, seguido porre-binnig de Fourier e reconstrução de imagem OSEM usando o software ASIPRO VM- (Concord Microsystems, TN). Tamanho de pixel de imagem foi de aproximadamente 1 mmtransaxialmente, com uma espessura de lâmina de 1,2 mm.
[18F]-FEAU radiomarcado foi sintetizado para pureza radioquímica maior que 99%pelo uso de éter 5-etiluracil-2,5-bis-trimetilsilílico como a base de pirimidina paracondensação com 1-bromo-2-desóxi-2-[18F]-flúor-3,5-di-0-benzoil-a-D-arabinofuranose,como originalmente descrito por Alauddin et al. (2003). Para quantificar a concentração deradioatividade derivada de [18FJ-FEAU ou de [18FJ-FDG em tumores e em outros órgãos etecidos, as regiões de interesse foram colocadas sobre imagens e os valores medidosconvertidos de nCi/mm2 para a % de dose injetada por grama (% de ID/g; Tjuvajev et al.,1998). Imageamento por PET, repetitivo, com [18Fj-FEAU, foi realizado nos dias 3, 5, 10 e 16depois da administração do AAVP transportando o gene de HSVtk ou o AAVP não alvejadode controle, conforme descrição acima; o tratamento com GCV foi administrado entre osdias 11 e 19. Deve ser esclarecido que o imageamento com PET no dia 1 foi realizado 24horas depois da dosagem de GCV para permitir que a eliminação de GCV fosse suficiente, oque, do contrário, competiria com FEAU para fosforilado pela enzima HSVtk. Imageamentopor PET com [18Fj-FDG foi repetido no dia 17 depois da administração do AAVP para avaliara viabilidade do tumor residual, se algum.
Imunoistoquímica. Camundongos anestesiados foram mortos e perfundidos comPBS contendo PFA a 4%. A vascularização do tumor foi avaliada em secções congeladasusando um anticorpo CD31 anti-camundongo (BD Biosciences). A análise da apoptose foirealizada nas secções embutidas em parafina com um kit TUNEL (Promega). Paraimunodetecção de fago nos tecidos, as secções de parafina foram incubadas com umanticorpo primário anti-fago de coelho (Sigma) seguido por um anticorpo secundário anti-coelho conjugado à peroxidase (Dako). Lâminas foram desenvolvidas com o substrato-cromógeno 3,3'-diaminobenzidina e contra-colorido com hematoxilina. Para imunocoloraçãoda GFP, os órgãos e tumores foram fixados por 2 horas em PBS contendo PFA a 2% eequilibrados por 48 horas em PBS contendo sacarose a 15%. As criossecções foram pós-fixadas em PBS contendo PFA a 4%, por 20 minutos, e bloqueadas com soro de cabra a 5%em PBS contendo BSA a 1% e Triton X-100 (PBS-T) a 0,1%. A seguir, a secções de tecidoforam incubadas com anticorpo de GFP purificados por afinidade com coelho (SondasMoleculares) em soro de cabra a 2% e BSA a 1%. As secções foram então coloridas com oanti-coelho de cabra conjugado com o anticorpo secundário Alexa Flour 488 (MolecularProbes) em PBS-T e BSA a 1%. Imunocolorações com αν integrina foram realizadas sobresecções congeladas fixadas em acetona de tumores removidos de animais perfundidos comPBS. As secções foram incubadas por 1 hora com o anticorpo primário monoclonal anti-avintegrina de rato (Chemicon), seguido pelo anticorpo secundário anti-rato de cabraconjugado com Cy3 (Jackson ImmunoResearch).Partículas Direcionadas A Ligantes São Funcionais em Células Mamíferas. Foramconstruídos um vírus quimérico alvejado compreendendo AAV recombinante e um clone defago fd-tet exibindo o peptídeo cíclico duplo CDCRGDCFC (SEQ ID NO:2) (denominadofago RGD-4C (Pasqualini et al., 1997; Arap et al., 1998). O peptídeo de RGD-4C se liga àsαν integrinas, um receptor de superfície de célula superexpresso em ambas as célulastumorais e no endotélio neo-angiogênico de vasos sangüíneos de tumor (Brooks et al.,1994; Pasqualini et al., 1997; Arap et al., 1998; Sipkins et al., 1998; Ellerby et al., 1999;Hood et al., 2002). Para obtenção de vírus quiméricos (ainda referidos como AAV/fago;AAVP), os inventores inseriram um cassete de gene eucariótico de AAV recombinante emuma região intergenômica de fago RGD-4C (RGD-4C AAVP), fago sem inserção (AAVP nãoalvejado), ou fago que exibe peptídeos de controle, tal como RGD-4C AAVP misturado{scrambled) ou AAVP mutante DaE (denominado RGE-4C) e acondicionado com o DNA dofago no capsídeo do fago (Figura 7). De modo a mostrar que os elementos eis do vírusquimérico alvejado com αν integrina, resultantes, permanecem funcionais, os inventoresavaliaram as propriedades do Iigante do peptídeo de RGD-4C e as propriedades resultantesdas repetições terminais invertidas (ITRs) no contexto do AAVP. Inicialmente, para avaliar aespecificidade de peptídeo, foi mostrado que o RGD-4C AAVP se liga às células mamíferasexpressando αν integrinas, em contraste com o AAVP não alvejado ou AAVP exibindopeptídeos de controle negativo tal como RGE-4C ou várias versões misturadas (scrambled)da seqüência de RGD-4C (Figura 1A), que não se liga nem infecta as células mamíferas. Foitambém demonstrado que o RGD-4C AAVP transportando genes repórter pode mediar ainternalização direcionada por Iigante (Figura 1B) e a transdução das células mamíferas(Figura 1C) com relação aos controles. Para experimentos de internalização em células, oscontroles negativos incluíram AAVP não alvejado, vários RGD-4C-AAVP misturados(scrambled), ou RGE-4C AAVP (Figura 1B); para experimentos de transdução de células,AAVP não alvejado (Figura 1C), RGD-4C AAVP misturados (scrambled), ou RGE-4C AAVPserviram como controles negativos. Consistente com esses resultados, os inventoresdemonstraram previamente que o peptídeo RGD-4C sintético inibe especificamente aligação celular e a internalização de várias construções com base no fago RGD-4C(Giordano et al., 2001; Chen et al., 2004, e resultados não publicados). Finalmente, foimostrado que a transdução de células mamíferas podem sofrer também de competiçãoespecífica pelo peptídeo RGD-4C sintético com relação aos controles negativos tal comoAAVP não alvejado (Figura ID), RGD-4C misturado (scrambled), ou RGE-4C. Para excluir apossibilidade de que alguns desses resultados (Figuras 1A e 1B) pudessem representar umartefato resultante da falha seletiva da etapa de lavagem de glicina (pH baixo) para removerAAVP de membranas celulares, experimentos de controle de temperatura (gelado) foramrealizados (Giordano et al., 2001) onde a ligação das células foi observada, mas seminternalização mediada por RGD-4C AAVP.
A seguir, para avaliar se as ITRs são ainda funcionais na partícula de AAVP1experimentos de resgate foram realizados. Mostramos que partículas de AAV recombinantefuncional são geradas de células mamíferas transduzidas somente com o RGD 4C AAVP1mas não das células transduzidas com construções de controle negativo (Figura 1E). Essesdados estabelecem que a quimerização genética resultante em uma partícula de RGD-4CAAVP não altera fundamentalmente (i) as propriedades alvejadoras do peptídeo do fagoRGD-4C direcionado a Iigante ou (ii) a capacidade de resgatar as partículas de AAVrecombinante de células mamíferas transduzidas por RGD-4C AAVP. Um curso de tempo,lado a lado, de uma expressão de transgene repórter revelou que a transdução de RGD-4CAAVP era detectável por muito mais tempo em comparação aquela do RGD-4C fago(Tabela 4).
Tabela 4. Expressão de transgene in vitro.
<table>table see original document page 51</column></row><table>
Dois observadores independentes calcularam a expressão de GFP semi-quantitativamente em poços em triplicata de células 293 por ponto de tempo.
Mecanismos Moleculares da Expressão de Transgene. Para se ter uma idéia dosmecanismos moleculares de expressão de transgene mediada por partículas de AAVP, osinventores investigaram o destino do genoma transduzido em células mamíferas.Inicialmente, linhagens de células transduzidas estavelmente foram geradas pelo uso deAAVP que expressam GFP-neo para possibilitar a seleção dos clones de célulastransduzidas, individuais. Tanto RGD-4C AAVP-GFPneo como fago RGD-4C-GFPneocarecendo de ITRs de AAV foram usados para transduzir células 293 que expressam ανintegrinas (Nakamura et al., 2002), e os clones foram isolados sob a seleção de G418.Experimentos de resgate mostraram AAV-GFPneo recombinante funcional gerado de todosos clones de células 293 RGD-4C AAVP-GFPneo1 mas nenhum gerado dos clones fagoRGD-4C-GFPneo, confirmando assim que os clones individuais quiméricos contêm ITRsfuncionais. Embora as células transduzidas com o fago RGD-4C-GFPneo não quiméricoretivesse resistência a G418, a expressão de GFP era geralmente mais fraca que aquelados clones RGD-4C AAVP-GFPneo (Figura 2A). Os inventores resolveram determinar odestino do cassete de transgene GFPneo em clones transduzidos instavelmente por umadigestão de enzima de restrição compreensiva de DNA genômico seguido por análise combase em Southern blotting e em reação em cadeia de polimerase (PCR) (Figura 2, Figura 8,e Tabela 5). Para provar a persistência do cassete de transgene, o DNA genômico foidigerido com Aflll e Xhol para detectar a liberação de cassetes de transgenes de tamanhonatural antes da análise. Tal liberação foi observada em 100% dos clones transduzidos porRGD-4C AAVP (n = 9 de 9 clones), em comparação com somente em 33% dos clones (n =3 de 9 clones) transduzidos pela construção de fago RGD-4C não quimérico (Figura 2B).
Um outro digestor de transição de DNA genômico foi desenhado para detectar formasconcataméricas potenciais do cassete de transgene (Lieber et al., 1999; Hsiao et al. 2001).A presença de concatâmeros de cabeça à cauda do cassete de transgene foi detectada em67% dos clones transduzidos por RGD-4C AAVP (n = 6 de 9 clones), embora nenhum detais concatâmeros tenha sido detectado em clones transduzidos pela construção de fagoRGD-4C não quimérico (Figura 2C). Para identificar formas concataméricas adicionais docassete de transgene, PCR multiplex foi realizada usando iniciadores que flanqueiam asextremidades 5' e 3' das construções. Novamente, nenhum concatâmero foi encontrado emclones transduzidos por construção do fago RDG-4C quimérico, ao passo que 100% dosclones transduzidos por RGD-4C AAVP continham formas concataméricas (n = 9 de 9clones), todos eles encontrados na orientação cabeça à cauda (Figura 8B). Além disso, aclonagem topo de produtos de PCR menores revelou a orientação de cabeça à cauda docassete de transgene com deleções de ITR (Figura 8C) (Yang et al., 1997). Finalmente,embora os produtos grandes de PCR não pudessem ser seqüenciados, seus tamanhossugerem a presença de concatâmeros com ITRs intactas no sítio de junção. Uma análise deDNA para cada clone simples está também detalhada (Tabela 5). Não desejando está ligadoa qualquer teoria ou mecanismo, esses dados sugerem que o AAVP pode render avantagem na expressão de gene por meios de um destino alterado do cassete de transgeneatravés da manutenção do cassete de transgene mamífero, inteiro, melhor persistência deDNA epissômico, formação de concatêmeros do cassete de transgene, ou talvez por umacombinação destes mecanismos não mutuamente exclusivos. Essas observações sãoconsistentes com os recentes desenvolvimentos no entendimento do AAV (McCarty et al., 2004).
Tabela 5. Destino do vetor DNA em clones de células 293 transduzidasestavelmente por RGD-4C AAVP-GFneo ou fago RGD-4C-GFneo.
<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>
Alvejando Tumor In Vivo e Imageamento Molecular-Genético. Depois dedemonstrar que os elementos centrais da partícula viral quimérica alvejada (i.e., o peptídeoRGD-4C e as ITRs de AAV) estão intactos e funcionais e depois da elucidação dosmecanismos moleculares da expressão de gene mediada por AAVP em células mamíferas,a especificidade e eficácia de distribuição de genes para o tumores depois da administraçãosistêmica de AAVP foi avaliada. Como um modelo pré-clínico inicial foi feito uso decamundongos sem pelagem (nude) contendo xenoenxertos tumorais subcutâneos derivadosde sarcoma de Kaposi humano KS 1767 (Arap et al., 1998; Ellerby et al, 1999).Primeiramente, para verificar que a construção viral alveja os xenoenxertos derivados deKS1767 em camundongos, RGD-4C AAVP ou um de vários controles negativos (AAVP nãoalvejado, RGD-4C AAVP misturado (scrambled), ou RGE-4C AAVP) foram administradosintravenosamente. Depois de um tempo de circulação de 3 a 5 minutos, uma coloração anti-AAVP forte na musculatura do tumor foi observada nos camundongos que receberam RGD-4C AAVP-HSV, mas não nos camundongos de controle (Figura 3A). Uma variante de RGD-4C AAVP que codifica o gene da proteína fluorescente verde (GFP) foi usada como umrepórter para determinar, pelo uso de imageamento microscópico de imunofluorescência insitu, se este vetor (RGD-4C AAVP-GFP) pode transduzir xenoenxertos derivados de KS1767. Imunocoloração contra GPF em tumores e em diferentes órgãos foi realizada setedias depois da administração sistêmica de ou RGD-4C AAVP-GFP ou construções decontroles negativos em camundongos contendo tumor. A imuofluorescência revelou aexpressão de GFP largamente nos vasos sangüíneos tumorais e células tumoraiscircundantes em camundongos que receberam RGD-4C AAVP-GFP. Em contraste, não foidetectada coloração de GFP em tumores de camundongos de controle que receberamAAVP-GFP não alvejada, misturada (scrambled), ou mutante (Figura 3B). Seu padrão decoloração sugere que a transdução direcionada por Iigante é mediada por alvejamento de ανintegrinas no endotélio vascular de tumores (Brooks et al., 1994; Pasqualini et al., 1997;Arap et al., 1998; Sipkins et al., 1998; Ellerby et al., 1999; Giordano et al., 2001; Hood et al.,2002; Chen et al., 2004). Consistentemente1 vários órgãos de controle não-alvo (cérebro,fígado, pâncreas e rim) careciam de expressão tecidual de GFP (Figura 9). Juntamente,esses resultados indicam que as partículas de RGD-4C AAVP podem alvejarespecificamente xenoenxertos de tumor por um mecanismo direcionado a Iigante etransduzir os mesmos depois da administração sistêmica in vivo.
A seguir, os inventores avaliaram a eficácia de imageamento por bioluminescênciapré-clínica (BLI) e imageamento por PET molecular-genético clinicamente aplicável com[18F]-FEAU para monitoramento não invasivo da dinâmica temporal e heterogeneidadeespacial da Iuciferase de vagalume (Luc) e da expressão do gene repórter de HSVtk,respectivamente, em camundongos, vivos, contendo tumor seguinte à administraçãosistêmica do RGD-4C AAVP. Esses estudos de imageamento molecular-genético foramconduzidos em um modelo pré-clínico de câncer da próstata humano já que este tumorparticularmente prevalente permanece um desafio para imageamento apropriado empacientes. Inicialmente, os inventores usaram uma configuração experimental padrão paraimageamento in vivo dos repórteres de transgene da Luciferase (Luc) de vagalume emcamundongos contendo tumor (Figura 4A). Os inventores selecionaram BLI de expressão deLuc porque é um método bastante sensível para imageamento de gene repórter emcamundongos e não tem virtualmente nenhuma atividade residual não específica nasimagens (Gross e Piwnica-Worms, 2005A/ Gelovani e Blasberg, 2003/ Uhrbom et al., 2004/Walensky et al., 2004). Uma expressão muito especifica de tumor de Luc foi preparada emtumores DU145 em camundongos recebendo RGD-4C AAVP-Luc. Em contraste, sinais debioluminescência associadas ao tumor não puderam ser observados em camundongos decontrole recebendo AAVP-Luc não alvejada ou RGD-4C AAVP-Lue misturada (scrambled).Com todos os tipos de vetores de AAVP (AAVP-Luc não alvejada, RGD-4C AAVP-Lucmisturada (scrambled), RGE-4C AAVP-Luc ou RGD-4C AAVP-Luc) nenhumabioluminescência foi observada em órgãos normais tais como fígado, baço, ou rins. Essesdados confirmam a especificidade de tumor de alvejamento mediada por RGD-4C AAVP e aexpressão de transgene observada com estudos de imageamento com microscopia deimunofluorescência com RGD-4C AAVP-GFP. Consistente com os resultados anterioresapresentados aqui (Figura 9), a cinética de distribuição sugere que apesar da depuraçãodas partículas de fago (Geier et al., 1973; Pasqualini et al., 1998; Barbas et al., 2001), talfenômeno não resulta em transdução de gene indesejável do fígado. Essas observaçõesestão em forte contraste com a transdução não específica bem documentada dos órgãosnormais (tal como o fígado) pelos vetores de distribuição de gene virais mamíferos(Shayakhmetov et al., 2005). Pelo uso de BLI in vivo, a expressão de transgene repórter deLuc dentro de tumores foi claramente detectada no dia 3 depois da administração de AAVPe aumentada gradualmente para alcançar os níveis máximos no dia 10. BLI bidimensionalrepetitiva da expressão de gene reporte de Luc foi realizada um dia sim um dia não eproporcionou uma estratégia de custo efetivo inicial para estudar a especificidade, dinâmicatemporal, e heterogeneicidade espacial da expressão de transgene repórter mediada porAAVP. Contudo, devido ao fato da BLI da expressão do gene repórter Luc não serclinicamente aplicável, inventores introduziram, a seguir, no vetor de AAVP o gene deHSVtk, que podem ambos servir como um gene suicida (quando em combinação comganciclovir; GCV) e como um transgene repórter para imageamento por PET clinicamenteaplicável com análogos de nucleosídeos, radiomarcados, específicos de HSVtik (porexemplo, [124I]-FAIU, [18F]-FHBG, e [18F]-FEAU).
Estudos anteriores estabeleceram que o imageamento por PET da expressão deHSVtk proporciona a capacidade de definir a localização, magnitude e duração daexpressão do transgene (Tjuvajev et al., 1998; Tjuvajev et al., 1999; Ray et al., 2001;Massoud e Gambhir, 2003). Foi também previamente determinado que a magnitude detraçadores radiomarcados acumulados em linhagens de células transduzidas com HSVtk etumores in vivo se correlaciona com o nível de expressão de HSVtk (Blasberg e Tjuvajev,2003; Gross e Piwnica-Worms, 2005a; Tai and Laforest, 2005). Nos estudos apresentadosaqui, os inventores selecionaram, sintetizaram e usaram o análogo de nucleosídeoradiomarcado 2'-[18F]-flúor-2'-desóxi-1-p-D-arabino-furanosil-5-etil-uracil ([18Fj-FEAU), que éum substrato radiomarcado melhor para a enzima HSVtk que outros análogos denucleosídeo de considerações farmacocinéticas (uma atividade residual muito baixa emtodos os órgãos e tecidos normais) (Kang et al., 2005). Ao se usar o imageamento de PETrepetitivo com ([18Fj-FEAU (nos dias 0, 3, 5, 10 e 16), os inventores visualizaram equantificaram a dinâmica temporal e a hetereogeneicidade de expressão do gene de HSVtkdepois de uma administração sistêmica única de RGD-4C AAVP-HSVtk ou AAVP-HSVtknão alvejada em xenoenxertos de tumor derivado de DU145 e de outros órgãos e tecidosem camundongos sem pelagem (nude) (Figura 4B). Os tamanhos dos xenoenxertos detumor (aproximadamente 150 mm2) antes, bem como taxas de crescimento de tumor depoisda administração de ou RGD-4C AAVP-HSVtk ou AAVP-HSVtk não alvejada foram similaresem ambas as coortes de camundongos (Figura 4C). Imageamento com PET com ([18Fj-FEAU revelou um aumento gradual do nível da expressão de transgene de HSVtk emtumores (aumento em % da dose, administrada, intravenosa, por grama) durante os cincodias iniciais depois da administração de RGD-4C AAVP-HSVtk1 seguido por estabilizaçãogradual dos níveis da expressão de HSVtk no dia 10 depois da administração do vetor. Emcontraste, em camundongos contendo tumor de controle que estavam recebendo AAVP-HSVtk não alvejada, somente uma menor quantidade de acúmulo tumoral de [18F]-FEAU foiobservada no dia 3, que rapidamente diminuiu para o nível residual (Figura 4D). Consistentecom os experimentos de BLI precedentes, nenhuma expressão de HSVtk detectável porPET com [18F]-FEAU foi observada nos órgãos ou tecidos não alvo (Figura 4B). Certamente,a atividade heterogênea de baixo nível nas imagens de PET representa uma atividaderesidual normal, que foi intencionalmente intensificada em imagens para demonstrar quenenhum truncamento de baixos níveis de radioatividade foi feito para "aperfeiçoar"artificialmente a expressão de HSVtk em tumores versus tecidos não alvo. Quando ostumores cresceram para tamanhos confiavelmente palpáveis (aproximadamente 350-400mm2), e o platô de expressão de HSVtk foi alcançado em tumores, o tratamento com GCVfoi iniciado em todas as coortes de animais (Figura 4C). Imageamento por PET com [18FJ-fluordesoxiglicose ([18FJ-FDG) serviu para monitorar o metabolismo da glicose e asalterações induzidas por GCV. Dois dias antes de iniciar a terapia com GCV (dia 9 depois daadministração do vetor), os tumores DU145 em ambos os grupos de camundongos estavamviáveis e acumularam [18FJ-FDG ativamente (Figura 4E). Depois da terapia com GCV, ovolume dos tumores em camundongos que receberam RGD-4C AAVP-HSKtk estavasignificantemente menor que nos camundongos que receberam AAVP-HSVtk não alvejada(p<0,05. Figura 4C). Além disso, xenoenxertos de tumores foram também metabolicamentesuprimidos como evidenciado por uma redução do acúmulo de [18FJ-FDG (Figura 4E). Osníveis de expressão de HSVtk nos tumores dos camundongos administrados com RGD-4CAAVP-HSVtk foram também significativamente reduzidos depois da terapia com GCV,conforme evidenciado por uma redução acentuada do acúmulo de [18FJ-FEAU nas imagenspor PET (Figura 4D), que foram obtidas 24 horas antes da última dose de GCV (para evitarcompetição com FEAU). Esses estudos confirmam a especificidade do alvejamento dotumor por RGD-4C AAVP e demonstram que o nível de expressão de transgene de HSVtk éadequadamente alto para ativação eficaz dos pró-fármacos de GCV.
De modo a avaliar a eficácia horizontalmente em outros modelos pré-clínicos,montamos um painel de linhagens de células tumorais de diferentes espécies e origenshistológicas e tumores gerados em camundongos imunossuprimidos ou imunocompetentes.Coortes de camundongos contendo tumores derivados de sarcoma de Kaposi (KS1767)receberam sistemicamente uma dose intravenosa única de ou RGD-4C AAVP-HSVtk ou deAAVP-HSVtk não alvejada (controle), seguido por tratamento com GCV em todos os grupos.A supressão acentuada de crescimento de tumor foi observada em camundongos contendotumor que receberam RGD-4C AAVP-HSVtk, em comparação com camundongos tratadoscom veículo ou cámundongos que receberam AAVP não alvejado (Figura 5A). Efeitossupressivos de crescimento de tumor similares foram observados em carcinomas da bexigaderivados de UC3 (Figura 5B) e carcinomas da próstata derivados de DU145 (Figura 5C) emcámundongos sem pelagem (nude), mesmo quando xenoenxertos tumorais foram tratados(Figura 5D) e consistentes com os resultados de imageamento apresentados (Figura 4).Para excluir a possibilidade de que os efeitos antitumor observados fossem ou específicosda espécie ou específicos dos xenoenxertos, procuramos analisar a eficácia da RGD-4CAAVP-HSVtk em um modelo de tumor de camundongo padrão. Escolhemos um tumorisogênico ao qual células mamárias de camundongo EF43-FGF4 são administradassubcutaneamente para induzir crescimento rápido dos tumores altamente vascularizados emcámundongos imunocompetentes (Hajitou et al., 2001). Inicialmente, mostramos "homing"direcionado a Iigante de RGD-4C AAVP para tumores derivados de EF43 FGF4 porimunocoloração anti-fago (Figura 10). RGD-4C AAVP-GFP ou RGD-4C AAVP não alvejadofoi administrado intravenosamente aos cámundongos contendo tumores mamáriosisogênicos por um tempo de circulação de 3 a 5 minutos. Diferentemente, o AAVP-GFP nãoalvejado, RGD-4C AAVP produziram uma forte coloração anti-fago em tumores (Figura10A). A seguir, foi realizada imunofluorescência com um anticorpo anti-GFP em sete diasdepois da administração intravenosa para revelar forte expressão de GFP nos tumores emcámundongos que receberam RGD-4C AAVP-GFP; em contraste, a coloração de GFP foidetectada em tumores de cámundongos que receberam AAVP-GFP; consistentemente, umanticorpo anti-αν integrina detectou forte expressão em tumores EF43-FGF4 (Figura 10B).Novamente, uma dose sistêmica única de RGD-4C AAVP-HSVtk seguida por GCV inibiuacentuadamente o crescimento de tumores EF43-FGF-4 (Figuras 5E-G e Figura 6). Alémdisso, quando os tumores voltaram a crescer depois do término da terapia, administraçõesrepetidas de RGD-4C AAVP-HSVtk inibiram novamente o crescimento do tumor EF43-FGF4e aperfeiçoaram a sobrevivência dos cámundongos contendo tumor (Figura 5F). Partículascom base em fago são conhecidas por serem imunogênicas, mas esta característica podeser modulada através do próprio alvejamento (Trepei et al., 2001). De fato, RGD-4C AAVP-HSVtk mais GCV permaneceram surpreendentemente eficazes em cámundongosimunocompetentes vacinados com fago apesar dos títulos muito altos de IgG anti-fagocirculante (Figura 5G). Em experimentos seletivos, foi usado um painel compreensivo decontroles experimentais negativos incluindo apenas veículo, veículo mais GCV, AAVP nãoalvejado, e RGD-4C AAVP-GFP alvejada mais GCV (transdução simulada (mock)) (Figura6A).
Para verificar os efeitos pós-tratamento, os inventores obtiveram análisehistopatológica detalhada dos tumores EF43 FGF4 recuperados sete dias depois da terapia.Destruição extensiva do tumor causada pela dose sistêmica única de RGD-4C AAVP-HSVtkmais GCV foi observadav Especificamente, a coloração com hematoxilina e eosina (H&E)revelou a destruição uniforme da área central do tumor e somente uma pequena bordaexterna viável; em contraste, AAVP-HSVtk não teve tal efeito (Figura 6B). Coloração comum anticorpo anti-CD31 confirmou tanto os vasos sangüíneos de tumor rompidos dentro daregião central do tumor como a vasculatura conservada em relação à borda externa, aopasso que nenhum dano foi observado nos tumores tratados com AAVP-HSVtk não alvejado(Figura 6B). Os inventores também avaliaram os tumores para coloração de marcação deextremidade por clivagem de dUTP biotina mediada por desoxinucleotidil transferaseterminal (TÚNEL), que marca células apoptóticas, porque a estratégia de HSVtk/GCV estáassociada à morte apoptótica das células (Hamel et al., 1996). Em tumores tratados comRGD-4C AAVP-HSVtk e GCV1 coloração com TUNEL detectou apoptose na região centraldo tumor, mas não dentro da borda externa, embora nenhuma apoptose tenha sidoobservada em tumores de camundongos que receberam quimera de AAVP-HSVtk naalvejada (Figura 6B). Órgãos de controle removidos dos camundongos contendo tumortratado pelo mesmo protocolo não revelaram anormalidades histopatológicas (Figura 11).Juntos, esses resultados mostram que a manutenção de uma única dose sistêmica de RGD-4C AAVP-HSVtk mais GCV pode suprimir o crescimento do tumor.
A contribuição relativa do alvejamento de cada compartimento de tumor (i.e.,células tumorais versus endotélio vascular tumoral e/ou estroma) dependerá do sistema deligante-receptor e do(s) modelo(s) usados. Por exemplo, a expressão do alvo de membrana(i.e., αν integrina) em células tumorais variará de baixa (EF43 FGF4) a forte (KS1767). Alémdisso, com exceção da dose ótima específica para transdução de cada modelo (e aplicação)usada, há também um tempo ótimo para examinar a expressão do transgene. Em outraspalavras, a estequiometria da expressão do gene repórter depende não somente dos níveise padrões da expressão de repórter em células individuais, mas também do número relativodas células que expressam o transgene que estão proliferando versus as células queexpressam o transgene que estão morrendo. Assim, enquanto os inventores usavamparâmetros fixos para estes exemplos, posterior determinação das doses ótimas de AAVPalvejado e os horários em uma base caso a caso ainda se aplicam.
Os inventores contemplam que uma ampla faixa de questões biológicascorrentemente não tratáveis bem além da oncologia molecular pode ser abordada usandoAAVP alvejado, especialmente em combinação com diferentes configurações deimageamento molecular-genético, pré-clínico e clínico. Por exemplo, a distribuição sistêmicadirecionada por Iigante das construções com tecido e/ou promotores específicos de doença(em vez do promotor CMV) para sítios alvo permitirá monitorar a expressão de seus genescorrespondentes in vivo; tal transcrição acionada por promotor da atividade de repórterpermitirá o estudo do tráfego e enxerto de células. Várias aplicações de imageamento nãoinvasivo podem ser empregadas, tais como monitoramento experimental da degradaçãoespecífica de substrato, interações de proteína-proteína e outros eventos moleculares viatransativação do repórter, complementação, ou estratégias de reconstituição (Luker et al.,2004; De e Gambhir, 2005; Gross e Piwnica-Worms 2005b) em células e em animaisinteiros. Os inventores descreveram recentemente redes de nanopartículas de ouro ebacteriófago como sensores biológicos e agentes alvejadores de células (Souza et al.,2006), tal tecnologia pode se combinada com AAVP direcionada por Iigante paraadicionalmente aperfeiçoar o imageamento molecular-genético. Em uma outra observação,o próprio AAVP pode proporcionar reagentes para estudar o papel mecânico das estruturasde ITR na persistência do transgene e integração cromossômica, pois (em contraste comvetores de AAV) as construções com base em fago sem ITRs podem servir como controlesexperimentais negativos. Assim, muitas outras aplicações de alvejamento sistêmico eimageamento molecular in tandem são possíveis em um espaço de tempo relativamentecurto com esta nova plataforma e suas ferramentas derivadas.
EXEMPLO 2
USO DE AAVP PARA ALVEJAR TNF-α EM VASCULATURA DO TUMOR
A. Métodos
Cultura de Células. Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foramobtidas da Cambrex (Walkersville, Maryland) e cultivadas em Meio-2 de Crescimento deCélulas Endoteliais conforme descrição prévia (Tandle et al., 2005). Todos os experimentosforam conduzidos com HUVEC na passagem 3-5. Células de melanoma humano M21 foramcrescidas em meio RPMI 1640 contendo soro a 10%, glutamina 2mM, 100 μ/mL depenicidila, 100 μ/mL de estreptomicina, 100 μ/mL de gentamicina e fungizona. Células Pmelforam crescidas em meio DMEM contendo soro a 10%, glutamina 2mM, 100 μ/mL depenicilina, 100 μ/mL de estreptomicina, 100 μ/mL de gentamicina e fungizona.
Construção de um AAVP Alvejado Expressando TNF-α/ΕΜΑΡ-ΙΙ. O desenho geral econstrução da cadeia principal de AAVP foi descrita por Hajitou et al. (2006). Umaconstrução de AAVP expressando TNF-α foi criada em duas etapas. Inicialmente, umfragmento de 880 bp de Notl/Hindlll do pG1 SiTNF foi digerido e ligado a um vetor de pAAV-eGFP/Notl/Hindlll repondo as seqüências de gene de GFP (Hwu et al., 1993). Na segundaetapa, fMCS/RGMCS e AAV-TNF foram digeridos por Pvull. Então AAV-TNF-α comrepetições terminais invertidas (ITRs) foi re-ligado ao sítio de ÍMCS-/RGDMCS Pvull paraobter um vetor de AAVP. Assim, pfdTNF-α é um vetor não alvejado, ao passo quepRGDTNF é um vetor alvejado com afinidade de ligação com os receptores de αν integrinana superfície celular.
Uma construção de AAVP expressando EPMAP-II foi criada em três etapas. Oplasmídeo pET-20b, expressando EMPA-II maduro foi um presente generoso de PaulSchimmel do The Scripps Research lnstitute, La Jolla, CA. Na primeira etapa, seqüências deEMAP-II foram ampliadas de pET-20bEMAP-II1 usando 3 iniciadores para incorporar sítiosde enzima de restrição e a seqüência de sinal secretável no produto de PCR. O iniciador 1 éum iniciador de avanço de 132 bp com o sítio de enzima de restrição Notl na extremidade 5'seguido por uma seqüência de sinal (desenhada a partir d o vetor pSecTag2, Invitrogen,Carlsbad, Califórnia) para secreção extracelular de produto gênico e seqüências de EMAP-II. O iniciador 2 é uma versão mais curta do iniciador 1 para facilitar a ampliação do produtode PCR. O iniciador 3 é um iniciador reverso com um sítio de enzima de restrição Hindlll naextremidade 3'. A ampliação de PCR gerou um produto de 667 bp com sítios de enzima Notle Hindlll e seqüência de sinal. Na segunda etapa, o produto de PCR de EMAP-II foi clonadono vetor de clonagem pCRIl-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia). Os clones resultantesforam seqüenciados, e então o fragmento de Notl/Hindlll de 667 bp foi ligado a um vetor depAAV-eG FP/Notl/Hind111 conforme explanação acima. Na terceira etapa, fMCS/RGDMCS eAAV-EMAP-II foram digeridos por Pvull e ligados para obtenção do vetor AAVP. Assim,pfdEMAP-ll é um vetor não alvejado, ao passo que pRGDEMAP-ll é um vetor alvejado comafinidade de ligação para receptores de αν integrina de células. O iniciador 1:5'ATTTG CGGCCG CTTTACCACCATGG AG ACAG ACACACTCCTG CTATG G GTACTG CTG CTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCCAGCCGGCCAGGCGCGCCGTAATGTCTAAG CCAATAG ATGTT 3' (SEQ ID NO:4); Iniciador 2:5'ATTTGCGGCCGCTTTACCACCATGG 3' (SEQ ID NO:5); Iniciador 3: 5'CCCAAGCTTGGGTTATTTGATTCCACTGTTGC 3' (SEQ ID NO:6).
Purificação das Partículas de AAVP. Para obter partículas de AAVP não alvejado ealvejado, DNA foi eletroporado em MC1061 E. coli. Células e partículas de vírus forampurificadas do sobrenadante da cultura. Partículas de AAVP em grande escala forampurificadas de células k91Kan permissivas. De modo a determinar o número de unidades detransdução bacteriana (TU), células k91 foram infectadas com diluições em série departículas de fago e plaqueadas em placas de ágar de Luria-Bertani contendo tetraciclina ecanamicina. Tu foi então determinado por contagem do número de colônias bacterianas.
Ensaio de Internalização de Fago In Vitro. Células M21 foram deixadas cresceremdurante a noite em placas de tecidos de 6 poços. Para estudar a internalização do vetor, ascélulas foram lavadas com o meio e então infectadas com partículas virais a 37°C, por 3horas. Depois da incubação, as placas foram colocadas sobre gelo, por 5 minutos, de modoa interromper a internalização viral. As partículas não ligadas foram removidas por lavagemextensiva das células na solução salina balanceada de Hank (HBSS). Partículas viraisextracelulares foram inativadas por tratamento com Subtilisina (3 mg/mL de subtilisina, Tris20mM pH 7,5, EDTA 2mM pH 8,0 em HBSS sem cálcio e sem magnésio) por 1 hora sobregelo (Ivanenkov et al., 1999). Então, as células foram desprendidas com pipetagemcuidadosa e a subtilisina foi inativada com EDTA 2mM sobre gelo, por 15 minutos. Ascélulas foram Iisadas pelo uso de tampão de Iise (Tris 10mM ph 7,5, EDTA 2mM pH 8,0 eortovanidato de sódio a 2%) para liberar as partículas de AAVP internalizadas. Aconcentração de AAVP internalizado foi então determinada como TU1 conforme descriçãoacima.
Ensaio de Imunofluorescência (IF). IF foi usada para observar as partículas viraisinternalizadas em células M21. Em resumo, as células crescidas em lâminas de vidro decâmara Lab-Tek de oito poços (Nunc, Rochester, Nova Iorque) foram infectadas compartículas de AAVP usando DEMEM contendo soro a 10%, a 37°C, por 16 horas. Depois dainfecção, as células foram lavadas com PBS1 as câmaras foram removidas e as célulasforam fixadas em formaldeído a 3,7% por 10 minutos. As células foram permeabilizadas comsaponina a 0,1% (Sigma, St. Louis, Missouri) em PBS, e bloqueadas com tampão debloqueio (PBS contendo BSA a 1%, azida sódica a 0,025%, e saponina a 0,1%) por 15minutos. Depois da lavagem com tampão de permeabilização, as células foram incubadascom anticorpo anti-bacteriófago de camundongo, por 1 hora, seguido por um anticorpo IgGanti-camundongo conjugado com FITC, por 1 hora. Gaxetas foram destacadas e as célulasforam montadas usando Antifade (MP Biomedicals, Solon, Ohio) e examinadas sob ummicroscópio fluorescente Zeiss Axiovert.
Expressão de Gene por Fago. As células M21 foram infectadas com partículas deAAVP como no ensaio de internalização. O meio foi reposto em 48 horas. No dia 4 e no dia12, o sobrenadante da cultura foi coletado par medir os níveis de citocina secretável porELISA (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia).
Ensaio do Fator Tecidual (FT). Para examinar se TNF-α/ΕΜΡΑ-ΙΙ é funcional,examinamos sua capacidade de induzir a síntese de TF em células endoteliais ECs. Emresumo, 2 χ 105 HUVEC foram plaqueadas em placas de cultura de tecido de 6 poços, porpoço. No dia seguinte, as células foram tratadas com os sobrenadantes de cultura de M21por 6 horas em meio RPMI isento de soro. As células foram lavadas com PBS e incubadascom Tris 25 mM pH 7,5, por 10 minutos, à temperatura ambiente. As placas de cultura foramentão incubadas a -80°C, por 2 horas. Os Iisados de células totais foram preparados emtampão de ensaio de fator tecidual (Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM e BSA a 0,1%). OsIisados foram clareados por centrifugação a 13.000 rpm, por 10 minutos. O Iisado de 100 μίfoi analisado quanto à presença de fator tecidual por medição do tempo requerido paracoagulação do plasma deficiente em FatorVIII (Geroge King Biomedical Inc., Overland Park,Kansas) em presença de CaCl2 (Sigma, St. Louis, Missouri) em um Analisador de Micro-Coagulação Amelung KC 4A (Sigma, St. Louis, Missouri). O tempo requerido para coagularplasma deficiente em Fator Vlll foi convertido em unidades de fator tecidual usando umacurva de calibração padrão plotada com concentrações conhecidas de fator tecidual.Distribuição de AAVP in vivo e Detecção por Coloração com Imunofluorescência.Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovadospelo NIH Animal Care and Use CommitTee. Camundongos sem pelagem (nude), fêmeas,atímicos, foram obtidos de Jackson Laboratories e alojados na unidade para animais, noNational Câncer Institutes. Células de melanoma humano (4 χ 106) foram inoculadassubcutaneamente no flanco direito dos camundongos sem pelagem (nude). O volumetumoral (mm3) foi medido em três dimensões e calculado como comprimento χ largura χaltura χ 0,52. Quando os volumes tumorais alcançaram em torno de 100 - 150 mm3, 1 χ 1011partículas de AAVP foram injetadas intravenosamente (via veia da cauda). Os animais forameutanizados em vários intervalos de tempo. Tecidos de tumores e tecidos de controle re-seccionados (rim e fígado) foram congelados para análise posterior.
Para detectar a presença de AAVP, secções congeladas, espessas, 5μΜ foramcoloridas usando coloração por IF dual. Em resumo, as secções foram fixadas emparaformaldeído a 4% por 5 minutos, seguido de 2 lavagens em PBS por 10 minutos. Apermeabilização foi efetuada em PBS contendo Triton-X-100 a 1%, por 10 minutos. Assecções foram incubadas com intensificador de sinal Image-iT FX por 30 minutos, àtemperatura ambiente (T.amb), seguido por três lavagens em PBS contendo Triton-X-100 a1%. Ligação não específica foi bloqueada usando soro de cabra a 5%, por 30 minutos, àtemperatura ambiente. Os anticorpos primários foram aplicados durante a noite, a 4°C:diluição de 1:2.000 do anticorpo de bacteriófago anti-fd (Sigma Louis, Missouri) e diluição de1:50 de CD31 anti-camundongo (BD Biosciences, San Jose, Califórnia). As secções foramlavadas três vezes em PBS contendo Triton-X-100 a 1% por 10 minutos, então incubadascom os anticorpos secundários (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia): diluições 1:400, cada umade Alexa Flour 594 anti-coelho de cabra e Alexa Flour 488 de anti-rato de cabra por 30minutos, no escuro. As secções foram lavadas três vezes em PBS contendo Triton-X-100 a1%, por 10 minutos e uma vez com PBS, seguido por montagem em um meio de montagemVectashield com DAPI (Vectór Labs, Burlingame, Califórnia).
Expressão de TNF-α in vivo. Para detectar expressão da proteína TNF-α, o Iisadode célula total foi preparado de secções de tecidos congelados de 5μΜ usando tampão delise (Tri 50mM pH 7,4, NaCI 140mM, SDS a 0,1%, NP40 a 1% e desoxicolato de sódio a0,5%) contendo coquetel de inibidor de protease (Roche, Branchburg, New Jersey). OsIisados foram clareados por centrifugação a 13.000 rpm, por 10 minutos. A quantidade deproteína foi quantificada usando reagente de ensaio de proteína da BioRAD. A quantidadede Iisado equivalente a 50 μg da proteína total foi ensaiada quanto ao TNF-α humano porELISA (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia).
Para examinar a localização da expressão de TNF-α, tecidos congelados de 5 μΜforam coloridos como a seguir. Em resumo, as secções foram fixadas em PBS contendoparaforrrialdeído a 4% por 20 minutos, lavadas com PBS três vezes por cinco minutos cadae ligação não específica foi bloqueada com soro de cabra a 5%, por 20 minutos. As secçõesforam incubadas ou com anticorpo anti-fd diluído 1:200 (Sigma, St. Louis, Missouri) ouanticorpo de TNF-α diluído 1:10 (Novus Biologicals, Littleton, Colorado), ou CD31 de anti-camundongo de rato (BD Biosciences, San Diego, Califórnia), por 1 hora, seguido por trêslavagens de 5 minutos cada, em tampão de lavagem (PBVS contendo Tris 50mM pH 7,6 eTween-20 a 0,02%). Peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3%,por cinco minutos, seguido de lavagem e incubação com diluição 1:200 do HRP anti-camundongo secundário ou anticorpo anti-rato de burro biotinilado, por 30 minutos. Assecções foram reveladas com o substrato de tetracloridrato de diaminobenzidina (Dako,Carpinteria, Califórnia) por 5 minutos e contra-coloridas com hematoxicilina por 30segundos, lavadas em água da bica, desidratadas, clareadas e montadas.
Ensaio de Apoptose. A apoptose foi detectada usando o kit de Detecção deApoptose In Situ, TACS TdT (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota), de acordo com asrecomendações do fabricante.
Análise do Crescimento de Tumor. Células de melanona humano (3 χ 106) foraminoculadas subcutaneamente no flanco direito dos camundongos sem pelagem (nude).Quando os volumes tumorais alcançaram aproximadamente 100 mm3, 1 χ 1011 partículas deAAVP foram administradas via a veia da cauda. A administração de partículas de AAVP foirepetida uma vez mais depois de 7 dias. Os camundongos contendo tumor foram seguidosdepois disso por medição dos volumes tumorais a cada três dias em um modo cego.
Análise Estatística. Os grupos foram comparados usando-se Análise de Variância(ANOVA) e pós-teste de comparação de Tukey (GraphPad Instat Software, Inc., San Diego,Califórnia). Os valores P<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
B. Resultados
Partículas de AAVP são Internalizadas por Células Mamíferas. Estudos préviosmostraram que partículas de fago podem ser internalizadas por internalização de receptormediada por integrina (Hajitou et al., 2006). Células M21 expressam receptores ανβ sobresua superfície celular (dados não mostrados). De modo a examinar se as células M21podem internalizar as partículas de AAVP, infectamos células com partículas de AAVP eentão fago internalizado contado. Depois da infecção, o vírus extracelular inteiro foi inativadopor tratamento de subsilisina, células foram Iisadas e o fago internalizado foi recuperado nolisado. A concentração de AAVP internalizada foi medida como TU (Tabela 6). Houveinternalização mínima do AAVP pelas células M21 infectadas com ou vírus null (fd) nãoalvejado ou vírus não alvejado (fdTNF-α) expressando TNF-α em contraste com as célulasinfectadas com AAVP (RGD) expressando null alvejado (RGD) ou TNF-α (RGDTNF-a)alvejado.Tabela 6: Ensaio de Internalização do Fago
<table>table see original document page 66</column></row><table>
IF foi usada para visualizar a localização de partículas de AAVP internalizadasdentro das células M21. As células infectadas com AAVP (fdTNF-α) expressando TNF-α nãoalvejado não mostraram a localização do fago (Figura 12A, painel superior). Em contraste,as células infectadas com AAVP expressando TNF-α (RGDTNF-a) mostraram a localizaçãointensificada dentro das células M21 (Figura 12A, painel inferior).
Expressão de Gene Mediada por AAVP. Depois de determinar que o AAVPalvejado pode infectar e se localizar dentro das células mamíferas, investigamos se ainfecção com vírus poderia levar à expressão do produto gênico. As células M21 foraminfectadas com AAVP expressando TNF-α, em duplicata, e a produção do produto gênico deTNF-α foi medida por ELISA. O produto gênico é secretável e pode ser detectado nossobrenadantes de cultura (Figura 12B). O sobrenadante testado depois de 5 dias deinfecção mostrou níveis de TNF-α de 800 pg/mL. O produto gênico testado no dia 12 foimaior que no dia 4. O controle diluente (PBS), o vírus vazio (fd), não alvejado, expressandoTNF-α (fdTNF-α) e AAVP null alvejado (RGD) não tinham níveis detectáveis de secreção deTNF-α (Figura 12B).
Para examinar se o TNF-α secretado por células M21 infectadas com AAVP erafuncional, testamos sua capacidade de induzir a síntese do fator tecidual (TF) em ECs. OTNF-α secretado foi capaz de induzir a expressão de TF em ECs (Figura 12C). O TNF-αrecombinante foi usado como um controle positivo. A indução por TF poderia ser bloqueadapor incubação do sobrenadante monoclonal de TNF-α. O sobrenadante da cultura analisado23 dias depois da infecção também mostrou secreção de TNF-α funcional (Figura 12C).Assim, uma infecção única com AAVP resultou na produção do produto gênico funcional até23 dias depois da infecção.
Alvejando Tumor In Vivo por AAVP. Observamos a infecção com AAVP de célulasmamárias e a expressão de gene de TNF-α in vitro. De modo a avaliar o alvejamento in vivode AAVP, o vírus foi injetado sistemicamente via a veia da cauda em camundongos sempelagem (nude) contendo tumor.Os camundongos injetados com ou um diluente (PBS) oü: RGDTNF-α AAVP forameutanizados aos 15 minutos, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 8 dias e 10 dias depois da injeção.As secções congeladas de tecidos tumorais foram analisadas quanto à presença daspartículas virisl como coloração com IF dual. Como mostrado na Figura 13, as partículas deAAVP coloridas de vermelho (Alexa Flour 594, vasos sangüíneos de verde (Alexa Flour 488)e DAPI mostraram coloração nuclear. Nenhum dos animais injetados com PBS mostroupresença de AAVP em nenhum ponto. Uma secção de tumor representativa de um animalinjetado com PBS por 15 minutos é mostrada (Figura 13A). Os animais injetados com AAVPexpressando RGDTNF-α mostraram a co-localização de partículas de vírus nos vasossangüíneos (Figura 13B-H). O maior acúmulo de partículas de vírus foi detectado emanimais injetados depois de 15 minutos (Figura 13B). A presença de AAVP foi detectada emtodos os pontos de tempo, dia 1 (Figura 13C), dia 2 (Figura 13D), dia 3 (Figura 13E), dia 4(Figura 13F), dia 8 (Figura 13G), e dia 10 (Figura 13H). Contudo, observamos umdecréscimo gradual das partículas de vírus com o tempo.
AAVP não Alveja Tecidos Normais In Vivo. De modo a examinar a especificidadedo AAVP alvejando vasos sangüíneos in vivo, examinamos dois tecidos de controle decamundongos sem pelagem (nude) injetados com ou PBS ou AAVP expressando RGDTNF-α em pontos de tempo diferentes (Figura 14 e Figura 15). A presença do vírus foi detectadausando coloração com IL dual conforme descrição anterior.
Como mostrado na Figura 14, observamos alguma coloração das partículas devírus no dia 1 (Figura 14A) no tecido do fígado. Contudo, a coloração do vírus foi reduzidapara níveis mínimos no dia 2 (Figura 14B) sem coloração de vírus observada no dia 3(Figura 14C), dia 8 (Figura 14D) e no dia 10 (Figura 14E). A Figura 15 mostra secções derim coloridas para verificação da presença de partículas de vírus. As partículas de AAVPnão foram detectadas no rim em nenhum dos pontos de tempo testados, dia 1 (Figura 15A),dia 2 (Figura 15B), dia 3 (Figura 15C), dia 8 (Figura 15D) e dia 10 (Figura 15E). No entanto,todos os tecidos de rim, em diferentes pontos de tempo, mostraram boa coloração dosvasos.
Expressão in vivo do Produto Gênico Funcional por AAVP. Para examinar se aspartículas de AAVP alvejado para a vasculatura tumoral podem expressar o produto gênico,analisamos, em duplicata, dia 3, dia 4, dia 8 e dia 10, tecidos tumorais quanto aos níveis deproteína TNF-α por ELISA (Figura 16). Observamos níveis endógenos basais da expressãode TNF-α em todos os tecidos testados. Os animais injetados com PBS não mostraramnenhum aumento dos níveis endógenos em nenhum dos pontos de tempo testados. Oscamundongos injetados com RGDTNF-α AAVP mostraram expressão de TNF-α começandono dia 4 e aumentando gradualmente até o dia 10 (Figura 16).
Para determinar o tipo de célula onde o produto gênico estava sendo produzido,colorimos secções de tecido usando um anticorpo específico para TNF-α. Observamos apresença de coloração do TNF-α em volta dos vasos sangüíneos (Figura 17A). Paraobservar o efeito da expressão de TNF-α, colorimos secções de tumor para apoptose. Afragmentação do DNA foi detectada usando marcador azul de TACS. As células apoptóticasse coloriram de azul (Figura 17B, painel esquerdo). Para discriminar as células apoptóticasdas células necróticas, as amostras foram contra-coloridas com vermelho rápido nuclearpara auxiliar a verificação morfológica da apoptose. Observamos vasos sangüíneos ecélulas de tumor circundantes passando por apoptose. O painel direito mostra vasossangüíneos coloridos com um anticorpo específico CD31 (Figura 17B, painel direito).
Análise do Crescimento do Tumor. Analisamos o efeito do AAVP em xenoenxertosde tumor crescidos em camundongos sem pelagem (nude) em dois modelos diferentes detumor, sensível a TNF-α (M21) e resistente a TNF-α (PmeI)1 para examinar a eficácia detratamento de AAVP expressando TNF-α. Tumores M21 de melanoma humano, que sãosensíveis ao TNF-α, foram crescidos subcutaneamente em camundongos sem pelagem(nude). Depois do desenvolvimento do tumor, os camundongos foram tratadossistemicamente via injeções na veia da cauda com várias construções de AAVP ou PBS. Osanimais foram acompanhados por 27 dias. O tratamento dos tumores M21 com AWPalvejado expressando TNF-α (RGDTNF-α) mostrou necrose do tumoral central eencolhimento do tumor. No dia 27, o ponto de tempo medido final para as coortes diferentes,o grupo tratado com PBS tinha um volume de tumor médio de 743+155 (±DP) mm3, o grupode fdTNF não alvejado tinha um volume de tumor médio de 613±141 (±DP) mm3, o fagoRGD alvejado null tinha um volume de tumor médio de 622±141 (±DP) mm3 e grupo queexpressa TNF-α alvejado tinha um valor médio de 358±98 (±DP) mm3 (p<0,048) (Figura18A). A redução em volume tumoral no grupo RGDTNF-α foi estatisticamente significante,começando no dia 20.
Em um modelo de tumor resistente ao TNF-α, tumores Pmel de melanoma humanoforam sensibilizados para o efeito de TNF-α por pré-tratamento deles com AAVPexpressando EMAP-II antes da administração de TNF-α. Em um estudo prévio,demonstramos que a distribuição do vetor viral de EMPA-II pode sensibilizar tumoresresistentes aos efeitos de TNF-α distribuído sistemicamente. Os tumores crescidossubcutaneamente em camundongos sem pelagem (nude) foram tratados sistemicamentecom AAVP expressando EMAP-II, seguido por tratamento sistêmico com TNF-αrecombinante (rTNF-α). Os tumores foram acompanhados por 2 semanas depois dotratamento. Como mostrado na Figura 18B, os camundongos tratados com AAVP nãoalvejado expressando EMAP-II (fdEMAP) mostraram crescimento de tumor similar emcomparação com camundongos tratados com PBS sozinho. Os camundongos tratados comou rTNF-α ou AAVP alvejado expressando EMPA-II (RGDEMAP-II) sozinho mostrarampouco efeito, e não foram significantemente diferentes do vírus RGD-EMAP-II, e rTNF-αmostrou redução significante do volume do tumor (p = 0,007).
EXEMPLO 3
PETÍDEO DE TRANSFERRINA HUMANA ALVEJA O SISTEMA DETRANSFERRINA/RECEPTOR DE TRANSFERRINA
A transdução de células de glioma humano em cultura por CRTIGPSVC (SEQ INDNO:1) - células de glioma derivadas de humanos de Luc U87 foram semeadas em umaplaca com 24 poços na concentração de 40.000 células/poço e cultivadas O.N a 37°C. No dia seguinte, as células foram incubadas com AAVP1 de acordo com o protocolo do NatureMethod. RGD-4C AAVP GFP e RGD-4C AAVP Luc foram usadas como controle positivopara eficácia de transdução. As imagens foram tomadas no dia 7. A absorção de fago estábaixa, mas aumenta dramaticamente quando as células são cultivadas em hidrogel de FerroAAVP (última coluna da placa e gráfico) (Figuras 19A-19B). Avaliamos a especificidade e eficácia do CRTIGPSVC (SEQ ID NO:1) AAVP - Luc depois da administração sistêmica emanimais contendo U87 humano - a atividade foi medida depois de 7 dias da injeção de fago.REFERÊNCIAS
As seguintes referências, na medida em que elas fornecem detalhes deprocedimento ou outros detalhes suplementares àqueles estabelecidos aqui, sãoespecificamente incorporadas aqui a título de referência.
Alauddin etal., J. Labelled Compds. Radiopharm. 46,285-289, (2003).
Arap etal., Science 279, 377-380, (1998).
Arap et ai, Câncer Cell 6,275-284, (2004).
Arcone etal., NucIeicAcidsRes., 16(8):3195-3207, 1988.
Baichwal e Sugden, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), NY, Plenum Press, 117-148, 1986.
Barbas et ai, Phage Display: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring HarborPress), (2001).
Barrow e Soothill, Trends Microbiol. 5,268-271, (1997).
Blasberg e Tjuvajev, J. Clin. Invest. 1 1 1, 1620-1 629, (2003).
Brooks etal., Cell 79, 1157-1 164, (1994).
Chen etal., Chem. Biol. 11, 1081-1091, (2004).
De e Gambhir, FASEB J. 19, 2017-2019, (2005).
Ellerby etal., Nature Med. 5, 1032-1 038, (1999).
Geier et ai, Nature 246,221-223, (1973).
Gelovani e Blasberg, Câncer Cell 3, 327-332, (2003).
Gilliland et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 77(8):4539-4543, 1980.
Giordano et ai, Nature Med. 11, 1249-1253, (2001).
Gossen e Bujard, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89(12):5547-5551, 1992.
Gross e Piwnica-Worms, Câncer Cell 7,5-15, (2005a).
Gross e Piwnica-Worms, Methods Enzymol. 399,5 12-530, (2005b).
Hajitou et ai, Câncer Res. 61,3450-3457, (2001).
Hajitou et ai, Trends Cardiovasc. Med. In press, (2006).
Hamel et ai, Câncer Res. 56,2697-2702, (1996).
Hara et ai, Gene Ther. Dec;2(10):784-8, (1995)
Hermonat e Muzyczka, Proc. Nat1I. Acad. Sei. USA 8 1 :6466-6470, (1984).Hood et ai, Science 296,2404-2407, (2002).Hsiao etal., Dev. Dyn. 220,323-336, (2001).Hwu et ai, J Immunol 151:4104-15, (1993)
Ivanenkov et al., Targeted delivery of multivalent phage display vectors intomammalian cells. Biochim. Biophys. Acta 1448, 463- 472, (1999).Kageyama etal, J. Biol. Chem., 262(5):2345-2351, 1987.Kootstra e Verma, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43,413-439, (2003).Larocca et ai, FASEB J. 13, 727-734., (1999).Lebkowski et ai, Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996, (1988).Lieber et ai, J. Virol. 73,93 14-9324, (1999).Luker et ai, PNAS 10 1, 12288-12293, (2004).Macejak e Sarnow, Nature, 353:90-94, 1991.Maehida, Viral Veetors for Gene Therapy (Totowa, NJ: Humana Press), (2003).Marehib et al., Câncer Cell 5, 15 1-162, (2004).Massoud e Gambhir, Genes Dev. 17, 545-580, (2003).MeCarty et ai, Annu. Rev. Genet. 38, 819-845, (2004).Miller et ai, Nature Biotechnol. 21, 1040-1046, (2003).Mizuguehi e Hayakawa, Hum. Gene Ther. 15, 1034-1044, (2004).Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129, (1992).Nakamura et ai, Hum. Gene Ther. 13, 613-626, (2002).Nieolas e Rubenstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and theiruses, Rodriguez e Denhardt (Eds.), Stoneham: Butterworth, 493-513, 1988.Oliviero et al., EMBOJ., 6(7):1905-1912, 1987.Pasqualini et ai., Nature Biotechnol. 15, 542-546, (1997).Pelletiere Sonenberg, Nature, 334:320-325, 1988.Piersanti et ai, J. Mol. Med. 82,467-476, (2004).Poul e Marks, J. Mol. Biol. 288,203-21 1, (1999).Prowse e Baumann, Mol. Cell Biol., 8(1 ):42-51, 1988.Ray et al., Semin. Nucl. Med. 3 1,3 12-320, (2001).Remington's Pharmaceutieal Sciences, 15th ed., pp. 1035-1038 e 1570-1580, MackPublishing Company, Easton, PA, 1980.Ridgeway, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses,Stoneham: Butterworth, 467-492, 1988.Ron et ai, Mol Cell Endocrinoi 21;74(3):C97-104,1990.Sambrook et ai, In: Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY1 2001.Spanjer e Scherphof, Biochim Biophys Acta.;734(1):40-7, 1983Shayakhmetov et al., J. Virol. 79,7478-749 1, (2005).Sipkins et ai, Nature Med. 4,623-626, (1998).Souza et ai, PNAS 103, 1215-1220,2006, (2006).Tai and Laforest, Annu. Rev. Biomed. Eng. 7,255-285, (2005).Tandle et al., Cytokine 30:347-58, (2005)Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), NY, Plenum Press, 149-188, 1986.Tjuvajev et ai, Câncer Res. 58,4333-4341, (1998).Tjuvajev et al., Câncer Res. 59,5 186-5193, (1999).Tratschin et ai, Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260, (1985).Trepei et ai, Câncer Res. 61, 8 1 10-8 1 12, (2001).Uhrbom et al., Nature Med. 10, 1257-1 260, (2004).Wagner et al., PNAS 89:7934-7938, (1992).
Walensky et ai, Science 305, 14 1 1 -14 13, (2004).White et al., Circulation 109, 5 13-5 19, (2004).Wilson et al., Moi CeIIBioI., 10(12):6181-6191, 1990.Xiao et ai, J. Virol. 72, 2224-2232, (1998).Yang et ai, J. Virol. 7 1, 923 1-9247, (1997).Zacher et ai, Gene 9, 127-140, (1980).Zechner et ai, Moi Cell Biol., 8(6):2394-2401, 1988.

Claims (50)

1. Método de tratamento de um sujeito, CARACTERIZADO pelo fato de compreen-der:(a) administrar um AAVP terapêutico codificando um repórter a um paciente tendo,suspeito de ter ou em risco de desenvolver uma condição patológica ou doença; e(b) calcular a expressão in situ do AAVP em um tecido ou célula marcada para tra-tamento pela detecção do repórter codificado ou atividade do repórter.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queadicionalmente compreende administrar um tratamento de câncer ao paciente, baseado naexpressão de um nível terapêutico suficiente de um gene terapêutico expresso pelo ácidonucléico do AAVP no órgão alvo, tecido ou célula.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de queum segundo AAVP é administrado se a expressão do primeiro AAVP terapêutico não é ex-presas em um nível terapeuticamente efetivo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ocálculo da expressão do AAVP é por uma detecção não invasiva do repórter ou de uma ati-vidade do repórter.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que orepórter é uma proteína terapêutica.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que aproteína terapêutica é um pró-medicamento convertendo enzima.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que orepórter é uma enzima.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que aenzima é uma quinase.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que aquinase é uma timidina quinase.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de quea quinase modifica um composto marcado detectável.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de queo composto marcado detectável é detectável por fluorescência, químio-luminescência, es-pectroscopia raman intensificada pela superfície (SERS), imagem de ressonância magnética(MRI), tomografia computadorizada (CT), e tomografia por emissão de pósitrons (PET).
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de queo composto marcado detectável é um análogo de nucleosídeo.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de queo composto marcado detectável é: fluordeoxiglicose (FDG); 2'-flúor-2'deoxi-lbeta-D-arabionofuranosil-5-etil-uracil (FEAU); 5-[123l]-2'-flúor-5-iodo-lβ-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[124l]-T-2'-flúor-5-iodo-lβ-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[131 l]-2'-flúor-5-iodo-l β-Ό-arabinofuranosil-uracil, 5-[18F]-2'-flúor-5-flúor-l-β-D-arabinofuranosil-uracil; 2-[11l] e 5-([11C]-metil)-2'-flúor-5-metil-l-β-D-arabinofuranosil-uracil; 2-[11C]-2'-flúor-5-etil-l-β-D--5 arabinofuranosil-uracil; 5-([11C]-etil)-2'-flúor-5-etil-l-)8-D-arabinofuranosil-uracil; 5-(2-[18F]-etil)-2'-flúor-5-(2-flúor-etil)-1-β-D-arabinofuranosil-uracil, 5-[123l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-£-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-)5-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[131l]-2'-flúor--5-iodovinil-l-β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[123l]-2'-flúor-5-iodo-l-β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodo-l-β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[131l]-2'-flúor-5-iodo-l-β-D-ribofuranosil-uracil;-5-[123l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[131 l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-β-D-ribofuranosil-uracil; ou 9-4-[18F]flúor-3-(hidroximetil)butilguanina.
14. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de queo composto marcado detectável compreende um 18F, 277Ac, 211At, 128Ba, 131Ba, 7Be, 204Bi,-205Bi, 206Bi, 76Br, 77Br, 82Br, 109Cd, 47Ca, 11C, 14C, 36CI, 48Cr, 51Cr, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 165Dy, 155Eu,-153Gd, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 72Ga, 198Au, 3H, 166Ho, 111In, 113In, 115In, 123I, 125I, 131I, 189Ir, 191Ir, 192Ir,-194Ir, 52Fe, 55Fe, 59Fe, 177Lu, 15O, 191Os, 109Pd, 32P, 33P, 42K, 226Ra, 186Re, 188Re, 82Rb, 153Sm,-46Sc, 47Sc, 72Se, 75Se, 105Ag, 22Na, 24Na, 89Sr, 35S, 38S, 177Ta, 96Tc, 99mTc, 201TI, 202TI, 113Sn,-17mSn, 121Sn, 166Yb, 169Yb, 175Yb, 88Y, 90Y, 62Zn ou 65Zn.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato deque o composto marcado detectável é 131I, 125I, 123I, 111I, 99mTc, 90Y, 186Re, 188Re, 32P, 153Sm,67Ga, 201TI, 77Br ou 18F marcado.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo AAVP compreende uma porção que seletivamente atinge um tecido ou célula alvo paratratamento.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de quea porção é codifiada por uma proteína capsulada do AAVP.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato da pro-teína da superfície ser proteína capsulada recombinante.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato da pro-teína capsulada recombinante compreender um peptídeo alvo.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato dopeptídeo alvo ser ummpeptídeo cíclico.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato dopeptídeo alvo ser um peptídeo linear.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato dopeptídeo alvo se ligar seletivamente à célula expressando um integrin sobre a superfície dacélula.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de queo integrin é um integrin ανβ3 ou σν/?5.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato dopeptídeo compreender um RGD modificado.
25. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato dopeptídeo se ligar seletivamente à célula expressando um receptor de transferência.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato dopeptídeo compreender uma seqüência de aminoácido compreendendo CRTIGPSVC.
27. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do pa-ciente possuir, ser suspeito de possuir, ou em risco desenvolver uma doença hiper-proliferativa.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de quea doença hiperproliferativa é fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sar-coma osteogênico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, Iinfangio-endoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing1 leiomiosarcoma, rabdomios-sarcoma, câncer gástrico câncer, câncer esofágico, câncer retal, câncer pancreático, câncerovariano, câncer de próstata, câncer uterino, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele,câncer do cérebro, carcinoma de células escamosas, carcinoma da glândula sebácea, car-cínoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcino-ma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarci-noma, seminoma, carcinoma embrional,tumor de Wilm, câncer cervical, câncer testicular,carcinoma de pequenas célulad do pulmão, carcinoma de células pulmonares não peque-nas, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, cranio-faringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendrogli-oma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, ou sarco-ma Kaposi.
29. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quegene repórter é operativamente acoplado a um promotor seletivo de tecido ou célula, ou umpromotor específico de tecido ou célula.
30. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quea expressão avaliada compreende a administração de um marcador que está seletivamentemetabolizado por uma expressão celular de ácido nucléico AAVP.
31. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo terapêutico AAVP codifica um segundo agente terapêutico.
32. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo um segundo agente terapêutico é enzima de conversão supressora de tumor, inibidora deRNA1 inibidora de DNA ou prodroga.
33. Ácido nucléico AAVP terapêutico, CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende um segmento de ácido nucléico compreendendo RNA inibitório e DNA inibitório.
34. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fatode que o RNA inibitório é um siRNA, miRNA ou RNA anti-sentido.
35. Partícula de fago, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ácido nu-cléico AAVP, conforme definido na reivindicação 33.
36. Partícula de fago, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADA pelofato de que compreende adicionalmente um Iigante almejado.
37. Método para modulação da expressão de um gene, CARACTERIZADO pelo fa-to de que compreende a administração de um ácido nucléico AAVP, de acordo com a reivin-dicação 26.
38. Método de detecção de transferência de gene e expressão de um tecido alme-jado de um paciente hospedeiro, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) distribuir ao tecido almejado do paciente hospedeiro um vetor AAVP contendogene repórter presente não naturalmente no paciente hospedeiro, em que o gene repórter éselecionado do grupo que consiste em tipo selvagem, mutante ou gene quinase vírus-timidina de herpes geneticamente modificado, ou quinase timidina tipo 2, e onde o vetor detransferência é introduzido às células do tecido desejado, e o gene repórter é expresso nascélulas do tecido almejado, de modo a gerar um produto de gene repórter (proteína) a qualacumula somente nas células efetivamente transfectadas pelo vetor AAVP;(b) administrar ao paciente hospedeiro um substrato repórter marcado onde célulasexpressando o gene o produto do gene repórter da etapa (a) metabolizam o substrato repór-ter marcado para produzir um metabólito repórter marcado onde o substrato repórter marca-do compreende um análogo de nucleosídeo radiomarcado;e(c) visualizar não-invasivamente o tecido ou célula marcada contendo o metabólitodo substrato repórter depois da liberação do substrato repórter residual não metabolizadopelo produto do gene repórter do referido paciente hospedeiro de modo a prover detecçãoda transferência de gene e expressão do tecido almejado.
39. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende adicionalmente um tempo de espera após o passo (b) suficiente para permitirpelo menos 67% de marcadores não específicos derivados de substrato repórter residualnão metabolizado pelo produto de gene repórter para retirá-lo do paciente.
40. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende adicionalmente um tempo de espera após o passo (b) suficiente para permitirpelo menos 80% de marcadores não específicos derivados de substrato repórter residualnão metabolizado pelo produto de gene repórter para retirá-lo do paciente.
41. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende adicionalmente um tempo de espera após o passo (b) suficiente para permitirpelo menos 90% de marcadores não específicos derivados de substrato repórter residualnão metabolizado pelo produto de gene repórter para retirá-lo do paciente.
42. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo vetor AAVP é introduzido às células do tecido almejado por transfecção(ou transdução) invitro ou in vivo.
43. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo substrato repórter é marcado com um radioisótopo adequado para visualização por tomo-grafia de emissão de pósitron, câmera gama, ou tomografia computadorizada de única e-missão de fóton.
44. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo substrato repórter e metabólito do substrato repórter são compostos contendo nuclídeoisótopo-estável selecionado do grupo que consiste em 2H113C, 15N e 19F.
45. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo metabólito do substrato repórter marcado é visualizado por tomografia de emissão de pósitron.
46. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo metabólito do substrato repórter marcado é visualizado por câmera gama ou tomografiacomputadorizada de única emissão de fóton.
47. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo metabólito do substrato repórter marcado é visualizado por ressonância magnética.
48. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queo vetor AAVP incorpora o gene repórter e o promotor de transcrição adequado e elementosmelhoradores, certificando-se de que o tecido específico, fator específico de transcrição, outransdução-específica de sinal sofrerão ativação transcricional do repórter e co- expressãodo gene terapêutico.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de queatravés do uso do vetor AAVP as células (ou a célula) são transfectadas com o gene repór-ter e o promotor de transcrição adequado e os elementos melhoradores ex vivo (in vitro)antes da administração das células (ou da célula) ao paciente hospedeiro.
50. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de queo análogo de 2'-flúor-nucleosídeo marcado é 5-[123l]-2'-flúor-5-iodo-1B-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[124l]-T-2'-flúor-5-iodo-1β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[131l]-2'-flúor-5-iodo-l0-D-arabinofuranosil-uracil, 5-[18F]-2'-flúor-5-flúor-1-β-D-arabinofuranosil-uracil; 2-[11I] e 5-([11C]-metil)-2'-flúor-5-metil-l-β-D-arabinofuranosil-uracil; 2-[11C]-2'-flúor-5-etil-1-0-D-arabinofuranosil-uracil; 5-([11C]-etil)-2'-flúor-5-etil-1-β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-(2-[18F]-etil)-2'-flúor-5-(2-flúor-etil)-1-β-D-arabinofuranosil-uracil, 5-[123l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[131l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-β-D-arabinofuranosil-uracil; 5-[123l]-2'-flúor-5-iodo-l-β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodo-l-β-D-ribofuranosil-urácil; 5-[131l]-2'-flúor-5-iodo-l-β-D-nbofuranosil-uracil;5-[123l]-2'-flúor-õ-iodovinil-l-β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[124l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-β-D-ribofuranosil-uracil; 5-[131l]-2'-flúor-5-iodovinil-l-β-D-ribofuranosil-uracil; ou 9-4-[18F] flúor-3-(hidroximetil)butilguanina.
BRPI0710671A 2006-04-07 2007-04-09 uso de um vetor de bacteriofágo viral adenoassociado (aavp) terapêutico para a fabricação de um medicamento para o tratamento e profilaxia de uma doença hiperproliferativa BRPI0710671B8 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74449206P 2006-04-07 2006-04-07
US60/744.492 2006-04-07
PCT/US2007/066265 WO2007118245A2 (en) 2006-04-07 2007-04-09 Methods and compositions related to adenoassociated virus-phage particles

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0710671A2 true BRPI0710671A2 (pt) 2011-08-16
BRPI0710671B1 BRPI0710671B1 (pt) 2020-08-11
BRPI0710671B8 BRPI0710671B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=38581871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0710671A BRPI0710671B8 (pt) 2006-04-07 2007-04-09 uso de um vetor de bacteriofágo viral adenoassociado (aavp) terapêutico para a fabricação de um medicamento para o tratamento e profilaxia de uma doença hiperproliferativa

Country Status (9)

Country Link
US (4) US20070274908A1 (pt)
EP (1) EP2009990B1 (pt)
JP (1) JP5479087B2 (pt)
CN (1) CN101460055A (pt)
AU (1) AU2007234698B2 (pt)
BR (1) BRPI0710671B8 (pt)
CA (1) CA2649182C (pt)
DK (1) DK2009990T3 (pt)
WO (1) WO2007118245A2 (pt)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101022401B1 (ko) * 2005-09-29 2011-03-15 아주대학교산학협력단 자살유전자를 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 암치료용 조성물
EP2128259A1 (en) * 2008-05-27 2009-12-02 Koninklijke Philips Electronics N.V. Therapy delivery and monitoring using a gene of interest-reporter fusion protein and optical imaging
FI3581650T3 (fi) * 2008-09-15 2023-03-23 Uniqure Biopharma B V IX-tekijän polypeptidimutantti, sen käyttöjä ja menetelmä sen valmistamiseksi
WO2011140365A1 (en) * 2010-05-05 2011-11-10 Auburn University Targeted particles comprising landscape phage fusion proteins and heterologous nucleic acid
EP2444101A1 (en) * 2010-10-21 2012-04-25 Universitätsklinikum Freiburg Selective targeting of the CD40L/Mac-1 interaction by small peptide inhibitors and its use for the treatment of inflammation and atherogenesis
US20130263296A1 (en) * 2010-10-28 2013-10-03 The Johns Hopkins University Cancer imaging with therapy: theranostics
US20140227182A1 (en) * 2013-02-19 2014-08-14 The Johns Hopkins University Cancer imaging with therapy: theranostics
GB201121069D0 (en) * 2011-12-07 2012-01-18 Isis Innovation Delivery system
CN102535760A (zh) * 2011-12-22 2012-07-04 彭长大 拼装型平屋面绿化种菜隔热装置
WO2017075537A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Aleta Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for treatment of cancer
CN108472365A (zh) 2015-10-30 2018-08-31 艾丽塔生物治疗剂公司 用于肿瘤转导的组合物和方法
GB201519303D0 (en) * 2015-11-02 2015-12-16 Imp Innovations Ltd Phagemid vector
KR20190141655A (ko) * 2017-02-22 2019-12-24 알레타 바이오쎄라퓨틱스, 인크. 종양 형질도입용 조성물 및 방법
GB201706451D0 (en) * 2017-04-24 2017-06-07 Imp Innovations Ltd Cancer treatment
MA51154A (fr) 2017-12-15 2020-10-21 Aleta Biotherapeutics Inc Variants de cd19
KR20210009317A (ko) 2018-04-18 2021-01-26 더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 미토콘드리아 dna 고갈 증후군을 포함하는 불균형 뉴클레오타이드 풀에 의해 초래된 질환에 대한 유전자 요법
CN120795059A (zh) 2018-08-27 2025-10-17 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
CN109517807A (zh) * 2018-11-20 2019-03-26 暨南大学 一种心脏血管靶向的噬菌体载体及其用途
US20220023434A1 (en) 2018-12-19 2022-01-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bifunctional Molecules for Lysosomal Targeting and Related Compositions and Methods
US11155835B2 (en) * 2019-08-19 2021-10-26 The Catholic University Of America Prokaryotic-eukaryotic hybrid viral vector for delivery of large cargos of genes and proteins into human cells
JP2022547570A (ja) * 2019-09-12 2022-11-14 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 操作済みのアデノ随伴ウイルスキャプシド
JP2024524614A (ja) 2021-07-14 2024-07-05 ライシア セラピューティクス， インコーポレイテッド Ａｓｇｐｒ細胞表面受容体結合化合物及びコンジュゲート
CN116790521A (zh) * 2023-06-20 2023-09-22 扬州大学 一种可识别肿瘤表面的cea蛋白与表达egfp蛋白的重组噬菌体及其构建与应用

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) * 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5246924A (en) * 1987-09-03 1993-09-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for treating hepatitis B virus infections using 1-(2'-deoxy-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil
US5432260A (en) * 1991-05-03 1995-07-11 Washington University High affinity mannose receptor ligands
USRE40792E1 (en) 1992-05-19 2009-06-23 Novogen Research Pty Ltd Health supplements containing phyto-oestrogens, analogues or metabolites thereof
US5643756A (en) * 1992-08-28 1997-07-01 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Fusion glycoproteins
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US6068829A (en) * 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US5871727A (en) * 1995-12-08 1999-02-16 Uab Research Foundation Targeted adenovirus vectors
CA2263705C (en) 1996-08-19 2007-12-04 Nancy Smyth-Templeton Novel sandwich liposome complexes comprising a biologically active agent
US6576239B1 (en) * 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
US6723512B2 (en) * 1997-08-29 2004-04-20 Selective Genetics Inc. Methods using genetic package display for detecting and identifying protein-protein interactions that facilitate internalization and transgene expression and cells or tissues competent for the same and methods for evolving gene delivery vectors
US6054312A (en) * 1997-08-29 2000-04-25 Selective Genetics, Inc. Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors
US6180084B1 (en) * 1998-08-25 2001-01-30 The Burnham Institute NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same
US6232287B1 (en) * 1998-03-13 2001-05-15 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
US20010046498A1 (en) * 2000-01-21 2001-11-29 Ruoslahti Erkki I. Chimeric prostate-homing peptides with pro-apoptotic activity
US7452964B2 (en) * 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
US20050074747A1 (en) * 2000-09-08 2005-04-07 Wadih Arap Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands (brasil)
US7420030B2 (en) * 2000-09-08 2008-09-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer
US20040170955A1 (en) * 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
TWI247609B (en) * 2001-01-23 2006-01-21 Nihon Mediphysics Co Ltd Agent for diagnosis of tissue proliferation activity or the treatment of proliferative disease
US20020122806A1 (en) * 2001-03-05 2002-09-05 Chinnaiyan Arul M. Compositions and methods for in situ and in vivo imaging of cells and tissues
WO2003011020A1 (en) * 2001-07-30 2003-02-13 Smithkline Beecham Corporation Imaging marker transgenes
US20040048243A1 (en) * 2001-09-07 2004-03-11 Wadih Arap Methods and compositions for in vitro targeting
US7671010B2 (en) * 2002-08-30 2010-03-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer
WO2003033723A2 (en) * 2001-10-18 2003-04-24 Aventis Pharmaceuticals Inc. Vectors for expressing multiple transgenes
US7527942B2 (en) * 2002-02-08 2009-05-05 The Regents Of The University Of California Transcription amplification system for molecular imaging
EP1546714A4 (en) * 2002-08-30 2007-12-05 Univ Texas COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE IN THE APPLICATION TO PEPTIDES FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPY OF CANCER IN HUMANS
US20040219098A1 (en) 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for the treatment of tumors
WO2005026195A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Biopanning as an approach to study the pathogenesis of and produce novel treatment modalities for invasive aspergillosis
HUE054805T2 (hu) * 2003-09-30 2021-09-28 Univ Pennsylvania Adeno-asszociált vírus (AAV) kládok, szekvenciák, az azokat tartalmazó vektorok és alkalmazásaik
WO2005065418A2 (en) * 2003-12-31 2005-07-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy
AU2005252699B2 (en) 2004-06-07 2010-12-23 Macrogenics West, Inc. Transferrin receptor antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
US8470528B2 (en) 2013-06-25
CN101460055A (zh) 2009-06-17
US9827327B2 (en) 2017-11-28
WO2007118245A8 (en) 2008-10-02
CA2649182A1 (en) 2007-10-18
JP5479087B2 (ja) 2014-04-23
AU2007234698A1 (en) 2007-10-18
DK2009990T3 (en) 2017-01-09
CA2649182C (en) 2018-01-02
EP2009990B1 (en) 2016-09-21
US20100254896A1 (en) 2010-10-07
BRPI0710671B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0710671B1 (pt) 2020-08-11
EP2009990A4 (en) 2010-12-01
US20180256740A1 (en) 2018-09-13
WO2007118245A2 (en) 2007-10-18
WO2007118245A3 (en) 2008-11-13
US20120178903A1 (en) 2012-07-12
US20070274908A1 (en) 2007-11-29
AU2007234698B2 (en) 2013-08-01
JP2009534314A (ja) 2009-09-24
EP2009990A2 (en) 2009-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2009990T3 (en) METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO adenoassociated VIRUSFAGPARTIKLER
US8658778B2 (en) hTMC promoter and vectors for the tumor-selective and high-efficient expression of cancer therapeutic genes
US10080774B2 (en) Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
US6962815B2 (en) AAV2 vectors and methods
US7749492B2 (en) AAV vectors and methods
ES2575364T3 (es) Pseudovirus de papilomavirus para detección y terapia de tumores
EP0963434A1 (en) Methods for optimization of gene therapy by recursive sequence shuffling and selection
KR20070119664A (ko) 유전자 발현의 ｉｎ ｖｉｖｏ 영상에 관련된 조성물 및방법
JP7320883B2 (ja) 遺伝子およびタンパク質の大きな運送物をヒト細胞に送達するための原核生物－真核生物ハイブリッドウイルスベクター
Brunetti-Pierri et al. Helper-dependent adenoviral vectors
CN120958136A (zh) 噬菌体载体
JP2025026213A (ja) 肝臓における遺伝子発現を増強する核酸エレメント及びその用途
Somiari Gene Therapy: Methods and Application
Fox Cardiovascular Gene Therapy: Principles and Clinical Applications
Nicol The development of genetically-targeted adenoviral vectors for in vivo delivery to the heart
Goldnau New strategies for the application of Adeno-Associated Virus type 2 targeting vectors
Fox Clinical Applications of Gene Therapy: Cardiovascular Disease
Wei Establishment and application of an embryonic yolk sac cell-derived mini-organ gene delivery system for gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 11/08/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 09/04/2007 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B21F Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time

Free format text: REFERENTE A 15A ANUIDADE.

B24J Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12)

Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2665 DE 01-02-2022 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.