BRPI0710758A2 - processo para a produÇço de uma preparaÇço de protease prolina-especÍfica, preparaÇço de protease prolina-especÍfica e uso da preparaÇço de protease prolina-especÍfica - Google Patents
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Abstract
PROCESSO PARA A PRODUÇçO DE UMA PREPARAÇçO DE PROTEASE PROLINA-ESPECÍFICA, PREPARAÇçO DE PROTEASE PROLINA ESPECÍFICA E USO DA PREPARAÇçO DE PROTEASE PROLINA- ESPECÍFICA. A invenção se refere a uma preparação de protease prolina-específica livre de atividade amilolítica e um método de purificação para obter a preparação da enzima de acordo com a invenção.
Description
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO DE PROTEASEPROLINA-ESPECÍFICA, PREPARAÇÃO DE PROTEASE PROLINA-ESPECÍFICA E USO DA PREPARAÇÃO DE PROTEASE PROLINA-
ESPECÍFICA
A invenção se refere a um processo para a produção deuma preparação de protease prolina-específica a qual ésubstancialmente livre de atividades secundáriasamioliticas contaminantes, a preparação de proteaseprolina-específica desse modo obtida e seus usos.
Proteases prolina-específica formam uma classeemergente de enzimas industriais com propriedadesvantajosas para a produção de hidrolisados de proteínaassim como para prevenir formação de turgidez em váriosprodutos alimentícios líquidos. Por exemplo, no WO 02/45523um desamargamento substancial de hidrolisados produzidos desubstratos de proteína rica em prolina por proteasesprolina-específica é descrito. Hidrolisados de proteína sãofreqüentemente usados em fórmula infantil e nutriçãoclínica. Objetivo desses produtos é evitar odesenvolvimento de alergia à proteína e assegurar umametabolização eficiente da proteína fornecida. Hidrolisadosde proteína em produtos destinados aos consumidores comnecessidades não médicas, por exemplo, atletas ou pessoasem uma dieta de emagrecimento, devem ser produzidos paraproduzir boas características de sabor. A maioria de taishidrolisados de proteína são obtidos de proteína do leiteda vaca, quase exclusivamente da fração da proteína do sorodo leite do leite da vaca. A popularidade das proteínas dosoro do leite para esse propósito não é somente baseada nofato que em muitos países as proteínas do soro do leite sãomais baratas que as caseínas, mas também porque sobhidrólise enzimática a caseína se tornou notoriamente maisamarga em contraste com a proteína do soro do leite. Porque80% das proteínas presentes no leite da vaca são caseínas,parece seguro assumir que essas caseínas preenchem um papelnutricional que não é satisfeito pela fração do soro doleite. Portanto, tornando hidrolisados de caseínadisponíveis para consumo humano tem uma relevânciaconsiderável nutricional e desse modo econômica.
Outra aplicação útil de proteases prolina-específica édescrita no WO 02/046381. Nesse pedido um método enzimáticoé descrito em que a qual formação da turgidez em cerveja,vinho e sucos de fruta pode ser evitada. A turgidez formadanessas bebidas usualmente representa um precipitadocoloidal de agregados entre proteínas rica em prolina("turgidez ativa") e polifenóis de planta. Durante aprodução de cerveja, vinhos e sucos de fruta, ambas asproteínas e polifenóis são extraídos da planta e/ou tecidode fruta rompido durante a fase de produção inicial.
Na produção de cerveja, as proteínas ativas daturgidez assim como a maior parte dos polifenóis, sãoextraídos da cevada maltada. O precipitado de proteína-polifenol resultante que se desenvolve durante afermentação e maturação da cerveja, pode eventualmentelevar uma "turdigez a frio" assim chamada em cervejaengarrafada. A prevenção dessa formação de turgidez a frioem cerveja é um processo caro e tecnicamente difícil para oqual tratamentos convencionalmente com polivinilpirrolidona(PVPP) ou sílica hidrogel estão sendo usados. Em contrastecom os métodos convencionais, a abordagem de prevenção deturgidez a frio enzimática de acordo com o WO 02/046381 érelativamente barata e simples. Na produção de cervejaprotease prolina-específica é adicionada durante a etapa defermentação minimizando o risco de oxidação da cerveja.
Tempos longos de incubação (durante a fase de fermentaçãototal) garantem que níveis mínimos da protease prolina-específ ica satisfaçam para degradar todas as proteínasativas da turgidez. Devido a essas vantagens e levando emconsideração os grandes volumes de produção de cerveja, as economias que podem ser obtidas por esse método enzimáticosão consideráveis.
Nós revelamos que sob uso de uma protease prolina-específ ica em qualquer das aplicações acima mencionadas, éde importância suprema que a protease prolina-específicaseja desprovida de atividades secundárias amilolíticas.Níveis muito altos dessas atividades secundáriasamilolíticas na preparação da protease prolina-específica,podem ter efeitos colaterais prejudiciais como conseqüênciada decomposição de polissacarídeos presentes nos produtosfinais relevantes. Essa decomposição da fração depolissacarídeo pode levar a, por exemplo, amolecimento oumesmo liquefação de produtos finais sólidos ou uma sensaçãona boca enfraquecida de uma bebida tal como cerveja. É,portanto, um objeto da presente invenção fornecer uma preparação de protease prolina-específica a qual sejasubstancialmente livre de atividades secundáriasamilolíticas contaminantes.
Com o termo "protease prolina-específica" significaqualquer endoprotease ou exopeptidase a qual seja capaz declivar uma ligação peptídica envolvendo um resíduo prolina.Isto é, a "protease prolina-específ ica" é aquela a qualcliva um peptldeo ou proteína em uma posição onde opeptídeo ou proteína compreende um resíduo prolina.Exemplos de endoproteases capazes de clivar tais ligaçõespeptídicas são polioligopeptidases (EC 3.4.21.26; Fulop etal., Cell 1998, 94, 161-170) assim como as endoproteasesque pertencem à família S28 da linhagem SC de proteasesserina (Edens et al. , J.Agric Food Chem 53:7950-7957, 2005;Handbook of Proteolytic Enzymes; Barrett A.j.; RawlingsN.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, Londres, GB,1998, 369-415) . Entre as exoproteases capazes de clivarligações peptídicas envolvendo resíduos prolina as enzimasdipeptidil peptidase IV (EC 3.4.14.4) e dipeptidilpeptidase II (EC 3.4.14.2) são mencionadas.
Com o termo "atividades secundárias amilolíticas"significa qualquer atividade enzimática que pode hidrolisarligações 1,4-alfa-D-glicosídicas em polissacarídeos taiscomo amido, dextrinas, glicogênio, etc. Portanto, o termo"atividades secundárias amilolíticas" compreende enzimastais como α-amilase (EC 3.2.1.1), β-amilase (EC 3.2.1.2),glucoamilase (EC 3.2.1.3), glucan, 1,4-alfa-maltohidrolase(EC 3.2.1.133) assim como misturas dessas atividades.
Pelo termo "substancialmente livre de atividadessecundárias amilolíticas" significa que as atividadessecundárias amilolíticas estão presentes em tal um baixonível que, sob dosagem eficaz da atividade da proteaseprolina-específica no processo de produção respectivo,nenhuma decomposição observável de poli- e oligossacarídeoscom os efeitos negativos associados como descrito acimaocorre em dito processo de produção. Isso significa que onível permisslvel de atividades secundárias amilolíticascontaminantes nas proteases prolina-específica pode variarde processo de produção para processo de produção,dependendo das condições do processo particular assim comodo nível e tipo de polissacarídeos presentes.
O termo "substancialmente livre de atividadessecundárias amilolíticas" pode também ser expresso como umarelação da atividade de uma atividade secundáriaamilolítica dada (em certas unidades) dividido pelaatividade de uma atividade de protease prolina-específicadada (em certas unidades) . Essa relação pode variar deprocesso de produção para processo de produção e irádepender da protease prolina-específica particular usada noprocesso de produção, assim como a atividade secundáriaamilolítica particular que está presente na proteaseprolina-específica usada.
Vantagens do método de separação de acordo com ainvenção são, que com o método da invenção a produção daprotease prolina-específica é pelo menos 65%,preferivelmente pelo menos 75%, enquanto a atividadeamilolítica residual, por exemplo, atividade alfa-amilolítica, é geralmente 5,0 ou menor de FAU por PPU, talcomo 0,5 ou menor de FAU por PPU, por exemplo, 0,05 oumenor de FAU por PPU, tal como 0,005 ou menor de FAU por PPU, preferivelmente 0,0005 ou menor de FAU/PPU. Aatividade de amiloglucosidase irá geralmente ser 1 ou menosde AGI por PPU, por exemplo, 0,5 ou menos de AGI por PPU,tal como 0,1 de AGI por PPU, ou 0,01 ou menor de AGI porPPI. As definições de FAU e PPU são especificadas na seçãode materiais e métodos desse pedido. Também, a definiçãopara atividades de glucoamilase ("AGI") é fornecida naquelaseção.
No caso que a protease prolina-específica tenha um pHótimo maior que 5,5, a medição de PPU é tipicamenterealização em pH 6,5, por exemplo, a 37°C, em vez de 4,6 e37 ° C.
Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um processopara a produção de uma protease prolina-específica que ésubstancialmente livre de atividades secundáriasamilolíticas, compreendendo uma ou mais etapas de separaçãocromatográfica líquida, preferivelmente uma única etapa deseparação cromatográfica. Muitos métodos de separaçãocromatográfica diferentes são conhecidos na técnica e essespodem ser adaptados de modo a fornecer a protease prolina-específica da presente invenção. Métodos de separaçãocromatográfica adequados compreendem cromatografia de trocaiônica, cromatografia de afinidade, cromatografia deexclusão por tamanho, cromatografia de interaçãohidrofóbica e outros. Para a presente invençãopreferivelmente cromatografia de troca iônica e/oucromatografia de interação hidrofóbica são usadas.
A protease prolina-específica de interesse pode serproduzida por processos de fermentação usandomicroorganismos tais como fungo, levedura e bactéria, queproduz e preferivelmente secreta a protease prolina-específ ica de interesse no caldo da fermentação. Natécnica, tais processos de fermentação são conhecidos, ver,por exemplo, WO 02/45524. Nos processos da técnicaanterior, a protease prolina-específica pode ser recuperadado caldo da fermentação por técnicas também conhecidas natécnica. Como uma primeira etapa, as células do organismode produção podem ser separadas do caldo por centrifugaçãoou filtração.
No caso da protease prolina-específica ser secretadapelo microorganismo no caldo, o caldo livre de célula podeser concentrado, por exemplo, por ultrafiltração, e apreparação da protease prolina-específica desse modo obtidapode ser estabilizada por estabilizantes conhecidos taiscomo glicerol ou outros polióis.
No caso da protease prolina-específ ica não sersecretada pelo microorganismo, mas permanecer intracelular,o organismo de produção tem de ser lisado para liberar aatividade da protease prolina-específica relevante. Apósoutra etapa de filtração ou centrifugação para remover osfragmentos da célula, a fração líquida pode ser concentradae estabilizada conforme descrito acima para a proteaseprolina-específica excretada. Uma preparação sólida podeser obtida das soluções de protease prolina-específicaopcionalmente concentrada por técnicas conhecidas deprecipitação e/ou evaporação e/ou secagem por pulverização.
De acordo com o processo da presente invenção, o caldolivre de célula ou fração líquida livre de fragmento decélula, pode ser submetido a uma ou mais etapas deseparação cromatográfica de modo a fornecer a preparação daprotease prolina-específica da invenção que ésubstancialmente livre de atividades secundáriasamilolíticas. Preferivelmente, tal uma etapa de separaçãocromatográf ica é realizada em preparações que não foramainda estabilizadas por adições de glicerol ou poliol.Selecionado os métodos de separação cromatográfica maisapropriados é altamente dependente de, por exemplo, ascaracterísticas moleculares da protease prolina-específicae as atividades amilolíticas contaminantes. Característicasrelevantes incluem ponto isoelétrico, hidrofobicidade,distribuição da carga de superfície molecular, pesomolecular e várias- outras propriedades químicas daproteína. Um fundamento prático do uso dessascaracterísticas na purificação da enzima pode ser reveladoem "The Protein Purification Handbook" (lançado porAmersham Pharmacia Biotech, atualmente GE Healthcare Bio-Science, Diegem, Bélgica).
Entretanto, a etapa de separação cromatográfica iráser consideravelmente mais complicada naqueles casos em quea protease prolina-específica não é secretada pelosmicroorganismos ou se as atividades secundáriasamilolíticas exibem características moleculares as quaissão muito similares as características moleculares daprotease prolina-específica. Por exemplo, pontosisoelétricos similares apresentam uma complicação típicaem, por exemplo, cromatografia de troca iônica e segundo oqual o microorganismo produtor secreta uma grande variedadede enzimas, uma das quais é a protease prolina-específica.
Nesses casos a purificação da protease prolina-específicadesejada das enzimas contaminantes não é trivial,certamente não se essa purificação tiver que ocorrer deforma econômica e em uma grande escala industrial. Após umainvestigação extensiva de uma grande variedade de resinascromatográficas e protocolos de eluição, nós fomos capazesde desenvolver um protocolo de separação de uma colunaindustrialmente aplicável resultando na separação completade múltiplas atividades amiloliticas e proteolíticastipicamente tendo pontos isoelétricos muito similares.Métodos de purificação preferidos para endoproteaseprolina-especifica de A. niger de acordo com a invençãofazem uso de cromatografia de interação hidrofóbica ou detroca iônica. — Esses - métodos— de purificação são.exemplificados no exemplo 2 do presente pedido.
Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece umaprotease prolina-especifica que é substancialmente livre deatividades secundárias amiloliticas. Tais proteasesprolina-especifica podem vantajosamente ser usadas naquelasaplicações segundo a qual a decomposição dospolissacarídeos é indesejada ou não requerida. Como algumasatividades amiloliticas são relativamente termo-estáveis,elas tendem a sobreviver a protocolos de inativação deenzima ou protocolos de pasteurização do produto comumenteusados. Como conseqüência, hidrolisados de proteínaproduzidos usando proteases prolina-especifica podem contertraços de atividades amiloliticas residuais causandoproblemas sérios se formulados em combinação com poli- ouoligossacarídeos. Desse modo, a protease prolina-especificaobtenível por um método da invenção é preferivelmente usadapara todos os produtos em que o hidrolisado de proteínaresultante é combinado com compostos contendo amido oumaltodextrina. Preferivelmente esse produto é sólido, porexemplo, energia ou barra de proteína, um pó, por exemplo,um pó a ser incorporado em uma fórmula infantil ou um pópara preparar misturas de nutrientes na forma de um shake(vitamina), ou o produto pode ser um líquido, tal como umafórmula infantil líquida ou um drink (bebida) em pó.Além disso, a protease prolina-específica obtenívelpor um método da invenção pode vantajosamente ser usada emum produto final contendo altas quantidades da enzimaativa. Tais produtos finais têm sido descritos em, entreoutros, WO 2005/027953 e nosso pedido pendentePCT/EP2007/000896. Esses produtos Mnats- são- consumidosjunto com produtos que podem conter glúten de trigo com ainvenção para minimizar o efeito de epítopes de glútentóxicos e são de particular relevância para pessoasintolerantes ao glúten, tais como pacientes celíacos.
Finalmente, a protease prolina-específica obtenívelpor um método da invenção pode ser usada na prevenção daturdigez em todos os produtos líquidos derivados de planta.Preferivelmente esse produto líquido derivado de planta écerveja. Na última aplicação uso da protease prolina-específica obtenível por um método da invenção evita umasuper degradação de poli- e oligossacarídeos desse modoconduzindo a uma sensação na boca melhorada da cervejafinal.
MATERIAIS E MÉTODOS
Atividade endoproteolítica de prolina-específicaAtividade endoproteolítica de prolina específicaderivada de A. niger foi testada usando CBZ-Gli-Pro-pNA(Bachem, Budendorf, Suíça) como um substrato à 37°C em umtampão de fosfato dissódico/citrato, pH 4,6. Os produtos dareação foram monitorados espectrofotometricamente a 405 nM.O aumento na absorbância a 405 nm em tempo é uma mediçãopara atividade da enzima. Uma unidade de protease prolina(PPU) é definida como a quantidade de enzima que libera 1μmol de p-nitroanilida por minuto sob as condiçõesespecificadas e em uma concentração de substrato de 0,37 nMde Z-Gli-Pro-pNA.
Atividade de alfa-amilaseO método de medição de alfa-amilase usado é baseado nokit de teste Ceralfa conforme fornecido por Megazime (R-" CAAR-4; Megazyme International Ir-eland Ltd., Bray Ireland.),Nesse método, a amostra é incubada com um p-nitrofenilmaltoheptaosídeo (BNPG7) de extremidade bloqueadae não redutor mais níveis excessivos de amiloglucosidase ealfa-glucosidase. Sob a hidrólise desse oligossacarídeo poruma alfa-amilase endo-atuante, as quantidades em excesso deamiloglucosidase e alfa-glucosidase presentes na mistura,levam a hidrólise instantânea e quantitativa do substratoligado ao p-nitrofenol. Na incubação, 90 microlitros desolução do substrato reagem com 10 microlitros de soluçãoda amostra, contendo entre 0,001 e 0,01 de FAU por ml. Após425 segundos de incubação (em pH de 5,2 e 37°C), a reaçãode incubação é terminada e a cor é desenvolvida adicionando75 microlitros de solução de TRIS alcalina (20,5 g/l). 0aumento na cor a 4 05 nm é proporcional à atividade daenzima amilolítica presente na amostra. Para esse métodouma preparação padrão contendo alfa-amilase de Aspergillusoryzae foi usada para calibração do sistema. A atividadedesse padrão é expressa em FAU (unidades de amilasefúngica) . Um FAU é definido como a quantidade de enzima queconverte um grama de amido solúvel por hora em um produtotendo uma absorção igual a uma cor de referência a 620 nmapós reação com iodo a pH 5,0 e 30°C e um tempo de reaçãoentre 15 e 25 minutos. A cor de referência é definida comoa absorbância de um padrão de cor de CoCl2 consistindo de25,0 g de CoCl2-H2O e 3,84 de dicromato de potássio em 100ml de ácido clorídrico a 0,01 N. Conseqüentemente, umaumento na absorbância de 0,54 a 405 nm corresponde a umaatividade de amilase de 0,005 FAU por unidade. A faixa demedição do método é de 0,001 a 0,01 FAU por ml o quecorresponde a um aumento na absorbância entre 0,11 e- 1,1.—
Atividade de amiloglucosidasePara quantificar exo-atividade amilolítica nasamostras, atividades de amiloglucosidase foram medidas. 0reagente do ensaio de amiloglucosidase (R-AMGR3) conformefornecido por Megazyme International Ireland Ltd foi usado.Atividade de amiloglucosidase é determinada a 37°C e pH 4,5usando p-nitrofenil-p-maltosídeo como o substrato. Umaunidade amiloglucosidase (AGI) é definida como a quantidadede enzima que produz 1 pmol de glicose por minuto de amidosolúvel em pH 4,3 e 60°C. Hidrólise enzimática de p-nitrofenil-p-maltosídeo resulta na liberação de p-nitrofenol e celobiose. A presença de β-glucosidase emexcesso, adicionada via o reagente, assegura hidrólise decelobiose em glucose, evitando inibição competitiva deamiloglucosidase por celobiose. Liberação quantitativa dep-nitrofenol, determinada sob condições alcalinas, é medidapela atividade enzimática. Na incubação, 90 microlitros desolução do substrato reage com 10 microlitros de solução daamostra contendo entre 1 e 6 AGI por ml. Após 425 segundosde incubação, a reação enzimática é paralisada adicionando75 microlitros de solução de TRIS alcalina (41,0 g/l).Subseqüentemente a absorbância é medida em um comprimentode onda de 4 05 nm. Para esse método uma preparação padrãode amiloglucosidase de Aspergillus niger foi usada paracalibração do sistema. Conseqüentemente um aumento naabsorbância de 0,4 a 405 nm corresponde a uma atividade deamiloglucosidase de 3 AGI por ml. A faixa de medição dométodo é de 1 a 6 AGI por ml em que corresponde a umaumento de absorbância entre 0,14 e 0,80.
Análise do perfil do açúcar
As amostras da protease prolina-específica porcromatografia de troca iônica foram 10 vezes diluídas emcerveja desgaseifiçada (Heineken Pilsener, Premium Quality)e incubadas durante a noite a 37°C. Os perfis do açúcar dascervejas incubadas foram analisados em uma coluna de 7,8 mmde 3 00 x, Biard Aminex HPX42A, usando um trocador de cátione ânion Bioard para remover excesso de sais. Hidrato demaltose, maltotriose e alfa-ciclodextrina foram usados comoreferências de peso molecular. Informação quantitativa foiobtida por uma calibração com glucose. Temperatura dacoluna era 85°C com um fluxo de 0,5 ml/min de água MilliQ.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Efeito de atividades secundárias amiloliticas sobrecomposição de polissacarídeo e açúcar da cervejaPara avaliar o efeito negativo de atividadessecundárias amiloliticas, a preparação de endoproteaseprolina-específica derivada de Ά. niger bruta (cf.WO02/046381) foi adicionada a uma cerveja Lagerdesgaseifiçada e incubada durante a noite a 37°C. Parailustrar o caso, nesse experimento uma overdose da enzimaproteolítica (1,0 PPU/L de cerveja enquanto uma dosagem de0,25 PPU/L de cerveja poderia ser mais que suficiente paraevitar turgidez) foi usada. Como uma referência o mesmovolume de tampão (mas sem qualquer atividade enzimática)também foi adicionado à cerveja e também incubado durante anoite. Na manhã seguinte ambas as amostras de cerveja foramsubmetidas a uma análise do açúcar de acordo com oprocedimento detalhado na seção de Materiais e Métodos. Dosresultados obtidos (ver tabela 1) é óbvio que comoconseqüência da incubação da enzima com a preparação brutada endoprotease prolina-específica, os polissacarideospresentes na cerveja Lager são quase completamentedegradados para gerar muitos oligosaçúcares diferentesassim como glucose. Por exemplo, glucose, não presente naamostra de cerveja de referência, está abundantementepresente na cerveja tratada com enzima. Se tal umaconversão poderia ocorrer durante a fase de fermentação deprodução da cerveja, as leveduras poderiam rapidamenteconsumir toda a glucose e maltose gerando etanol adicional.Tais mudanças são claramente perceptíveis conforme elasmudam a sensação na boca assim como a percentagem de etanolda cerveja final. Esse experimento simples demonstra queatividades amilolíticas indesejáveis estão presentes napreparação de endoprotease prolina-específica, bruta.
Tabela 1
<table>table see original document page 15</column></row><table>Exemplo 2
Remoção cromatográfica de atividades secundáriasamilolíticas da endoprotease prolina-específica deAspergillus niger
De modo a -remover as atividades -secundáriasamilolíticas da preparação de endoprotease prolina-específica derivada de A. niger detalhada em WO 02/046381,um número de resinas cromatográficas foram avaliadas. Paraesse propósito a resina do trocador de cátion SP Sepharose6FF e de interação hidrofóbica (HIC) butil Sepharose 6FF(Amersham Biosciences Europe) foram selecionados. Ambasresinas foram testadas em colunas Tricom 5/100 (CV-2,2 ml)usando um AKTA Explorer 100 controlado por UNIC0RN 3,20 eum purificador AKTA controlado por UNIC0RN 3,21 emcombinação com um coletor de fração FRAC-950. Após eluiçãotodas frações geradas foram testadas para atividadeendoprotease prolina-específica e atividades amilolíticasusando métodos específicos na seção de Materiais e Métodos.
Usando um diafiltrado da endoprotease prolina-específica derivada de A. niger com uma atividadeenzimática de 10 PPU/ml, um pH de 4 e uma condutividade decerca de 4mS/cm como material de partida, a cromatografiaSP-Sepharose-6FF foi conduzida sob as condições a seguir:
Tampão A 20 mM de citrato; 0,085 M de NaCl, pH 3,0
Tampão B 20 mM de citrato; 1,0 M de NaCl, pH 3,0
Cone. de partida B (%)/cond. de partida (mS/cm) 0/10,7<table>table see original document page 17</column></row><table>
Sob as condições de cromatografia como usadas, aprotease foi ligada à resina enquanto que as atividadesamilolíticas contaminantes principais mostraram nenhumaligação. A cromatografia SP Sepharose mostrou uma separaçãoaceitável de atividades amilolíticas e proteolíticas mesmoatravés dos pontos isoelétricos da protease e as atividadesamilolíticas foram reveladas ser menores que 0,8 unidadesde pH à parte.
A cromatografia HIC foi conduzida sob as condições aseguir. Também, aqui um diafiltrado da endoproteaseprolina-específica derivada de A. niger tendo uma atividadede 10 PPU/ml e um pH de 4 foi usado como o material departida. Esse diafiltrado foi diluído duas vezes com tampãode citrato a 20 mM contendo 2M de Na2SO4 (pH 4,2, G = 121mS/cm) e foi subseqüentemente esterilizado por filtração(0,2 pm) antes do carregamento na coluna._
<table>table see original document page 17</column></row><table><table>table see original document page 18</column></row><table>
Como conseqüência de um ajuste considerável apóscarregamento da enzima na coluna, um longo procedimento delavagem foi requerido para obter uma separação em base delinha. Finalmente, a endoprotease prolina-específicapoderia ser eluida da coluna com tampão B. Após a união dasfrações contendo a atividade proteolítica prolina-específica e medir as atividades secundárias amilolíticasrestantes, os dados resumidos na tabela 2 foram obtidos.
Embora diluído, o material purificado mostrou atividadessecundárias amilolíticas significativamente menores, tambémse calculado em relação à atividade proteolítica original(ver figuras em parênteses).Tabela 2
<table>table see original document page 19</column></row><table>
Exemplo 3
Ά endoprotease prolina-específica purificada de A. nigerdeixa a composição de maltodextrina de cerveja inafetadaPara testar o desempenho da endoprotease prolina-específica cromatograficamente purificada em cerveja, oexperimento como descrito no exemplo 1 foi repetido.Entretanto, nesse caso dosagens da enzima mais realísticasforam usadas, isto é, a enzima bruta assim como purificadafoi dosada em uma atividade de 0,25 PPU/L de cerveja.Novamente tampão sem atividade enzimática foi usado como umbranco. Após outra incubação a 37 0C durante a noite,novamente os perfis de açúcar nas várias amostras de açúcarforam medidos. Os dados obtidos (tabela 3) ilustram que operfil de açúcar na cerveja incubada com a enzimapurificada é idêntico ao perfil de açúcar na cerveja dereferência. O perfil de açúcar da cerveja incubada com aenzima bruta (mas nesse momento em uma concentraçãorealística), difere somente levemente, massignificativamente do material de referência por causa deseu teor mais alto de resíduos DP2 e DP3. Por favor observeque sob condições realísticas de aplicação da cerveja, aenzima irá estar presente durante todo o processo dematuração e fermentação, de modo que mesmo contaminaçõesamilolíticas menores irão se tornar perceptíveis.
Tabela 3
<table>table see original document page 20</column></row><table>
Claims (5)
1. Processo para a produção de uma preparação deprotease prolina-específica, caracterizado pelo fato de queé substancialmente livre de atividades secundáriascontaminantes compreendendo purificação de uma preparaçãocie protease pro 1 ina- especifica bruta usando cromatograf.ialíquida.
2. Preparação de protease prolina-específica,caracterizada pelo fato de que é substancial livre deatividades secundárias amilolíticas contaminantesobteníveis pelo processo da reivindicação 1.
3. Uso da preparação de protease prolina-específica que é substancialmente livre de atividadessecundárias amilolíticas contaminantes caracterizado pelofato de ser para a preparação de bebidas.
4. Uso da preparação de protease prolina-específica que é substancialmente livre de atividadessecundárias amilolíticas contaminantes caracterizado pelofato de ser para a preparação de hidrolisados de proteína.
5. Uso da preparação de protease prolina-específica que é substancialmente livre de atividadessecundárias amilolíticas contaminantes caracterizado pelofato de ser para aumentar a tolerância a epítopes tóxicosde glúten de trigo.
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