BRPI0710889A2 - método para a detecção e quantificação múltipla e simultánea de patogênicos mediante a reação em cadeia da polimerasa em tempo real - Google Patents
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Abstract
<B>MéTODO PARA A DETECçãO E QUANTIFICAçãO MúLTIPLA E SIMULTáNEA DE PATOGENICOS MEDIANTE A REAçãO EM CADEIA DA POLIMERASA EM TEMPO REAL.<D> A presente invenção refere-se a um método para a detecção e quantificação múltipla e simultânea de qualquer combinação de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni e/ou Escherichia coli O157:H7, em amostra(s) de ensaio por reação de amplificação múltiplex com emprego da reação em cadeia da polimerasa (PCR) em tempo real, o método utiliza as seguintes etapas: (a) extrair ADN presente na amostra ou amostras de ensaio; (b) preparar uma mistura de reação específica para os patogênicos a detectar e quantificar, com a mistura de reação contendo os reagentes necessários para a amplificação enzimática do ADN extraído e identificação dos patogênicos; (c) amplificar, mediante reação de amplificação múltiplex empregando POR, a mistura de reação; e (d) determinar simultaneamente a presença ou ausência e quantificação dos patogênicos na amostra ou amostras de ensaio. o método apresenta a particularidade de que: (i) a mistura de reação para a amplificação enzimática do ADN conta jogos de pares de iniciadores oligonucleotideos identificados como SFQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, e SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11, e sondas com seqüências oligonucleotideos identificadas como SEQ ID NO: 3, SF0 ID NO: 6, SEO lO NO: 9 e SF0 ID NO: 12; (ii) a presença ou ausência e quantificação de patogênicos em qualquer combinação é determinada por sinal fluorescente ou emissão de fluorescência especifica de cada patogênico.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA A DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO MÚLTIPLA E SIMULTÂNEA DEPATOGÊNICOS MEDIANTE A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASAEM TEMPO REAL".
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se em geral, à detecção, identifica-ção e quantificação de bactérias patogênicas, e particularmente a um méto-do para a detecção e a quantificação múltipla de qualquer combinação depatogênicos, tais como Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacterjejuni e/ou Eseheriehia eoli 0157:H7, mediante reação de amplificação múlti-plex empregando a reação em cadeia da polimerasa em tempo real.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A detecção de bactérias patogênicas transmissíveis por alimen-tos, como Listeria sp, Staphyloeoeeus aureus, Campylobaeter jejuni e Esehe-ríchia eoli 0157:H7, é uma importantíssima tarefa nos campos da medicina eda higiene pública e de muito interesse na indústria agroalimentícia, seja naprodução como na distribuição de produtos alimentícios (matérias primase/ou produtos elaborados), e serão descritos diversos métodos para suasdetecção e identificação.
Das metodologias atuais, consideradas entre as mais efetivaspara a detecção, quantificação e identificação de patogênicos, é aquela ba-seada em técnicas moleculares, como o método de reação em cadeia dapolimerasa (PCR), o procedimento PCR é geralmente considerado como ametodologia mais sensível e rápida, empregada para detectar ácidos nucléi-cos de patogênicos em uma determinada amostra de ensaio em particular, epodemos encontrar a descrição de sua técnica por Kary B. Mullis et al. nafamília de patentes estadunidenses US-4683195, US-4683202, US-4800159,US-4889818, US-4965188, US-5008182, US-5038852, US-5079352, US-5176995, US-5310652, US-5310893, US-5322770, US-5333675, US-5352600, US-5374553, US-5386022, US-5405774, US-5407800, US-5418149, US-5420029 entre outras.
Para realizar a técnica PCR, necessita se contar com pelo me-nos um par de iniciadores oligonucleotídeos para cada patogênico a identifi-car, de maneira que cada par de iniciadores compreenda uma primeira se-qüência nucleotídea complementar a uma seqüência que coincida com oextremo 5' em uma seqüência de ácido nucléico objetivo e uma segunda seqüência nucleotídea complementar a uma seqüência que coincida com oextremo 3' da seqüência de ácido nucléico objetivo. As seqüências de nu-cleotídeos devem possuir cada par de iniciadores de oligonucleotídeos es-pecíficos ao patogênico a detectar, de maneira a não reagir ou cruzar comoutros patogênicos.
A técnica PCR é um método sensível e rápido para detectar pa-togênicos em forma individual, também pode ser empregada para detectarsimultaneamente múltiplos patogênicos presentes em uma amostra. No en-tanto, empregar a metodologia PCR para a detecção simultânea de múltiplospatogênicos em uma amostra possui uma problemática, e o principal obstá- culo radica na reação cruzada que possa se apresentar devido ao empregode múltiplas seqüências de nucleotídeos para obter a amplificação preferên-cial de certas seqüências-alvo presentes na amostra às custos de outrasseqüências-alvo também presentes.
Exemplos de aplicações de detecção múltipla e simultânea de patogênicos, com emprego da metodologia PCR, são descritas por John W.Czajka na publicação de solicitação de patente internacional WO-0314704, epor Linxian Wo e outros na família de patentes estadunidenses US-5612473,US-5738995, US-5753444, US-5756701 e US-5846783.
Na publicação de solicitação de patente internacional WO- 0314704 é descrito o método para detectar específica e simultaneamenteespécies patogênicas de Campylobacter em amostra de ensaio complexa.As espécies patogênicas de Campylobacter a detectar podem ser Campylo-bacter jejuni ou Campylobacter coli. A amostra de ensaio complexa pode serde alimento, água ou uma matriz enriquecida de alimento. O método utiliza a amplificação PCR com ou sem um controle positivo interno e pares apropri-ados de iniciadores. Múltiplas espécies podem ser detectadas na mesmareação.Entretanto na família de patentes estadunidenses US-5612473,US-5738995, US-5753444, US-5756701 e US-5846783 é descrito um méto-do PCR múltiplex para detectar rápida e simultaneamente agentes infeccio-sos em uma amostra. Os agentes infecciosos detectados são Salmonellaspp, Shigella spp, Campylobacter spp, Yersinia spp e Escherichia coli emparticular Escherichia coli O157:H7. A Iimitante do método descrito nestaspatentes é que permite uma reação cruzada mínima entre os oligonucleotí-deos e sondas, assim como destes com outras seqüências de ácido nucléicodurante a amplificação.
Entre outros métodos moleculares empregados atualmente, e-xistem alguns comercializados para detectar patogênicos em alimentos, me-diante hibridação de ADN (Gene-Trak systems, Unipath), que é muito sensí-vel, porém tarda em torno de 50 horas, ou mediante amplificação de ácidosnucléicos (ΒΑΧ, FOMS Dupont e Probelia, Sanofi Diagnostic Pasteur) querequer, pelo menos, 24 horas. Nenhum dos métodos proporciona resultadosno mesmo dia da produção do alimento e nem realiza a quantificação dacontaminação patogênica presente.
Nos métodos descritos, em alguns casos será necessário ape-nas aumentar a sensibilidade para detectar de forma confiável e rápida apresença ou ausência de patogênicos em particular, enquanto que em ou-tros casos será necessário, adicionalmente, quantificar os patogênicos even-tualmente presentes com o fim de estabelecer os limites de concentração apartir dos quais a presença do patogênico pode apresentar um problemapara a saúde do consumidor.
É de muito interesse para as indústrias de alimentos e de saúdedispor de um método rápido, que em menos de 5 horas, detecte e quantifi-que simultaneamente quatro dos mais importantes agentes infecciosos oupatogênicos transmissíveis por alimentos e/ou superfícies ambientais con-taminadas: Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobaeter jejuni e Es-cherichia coli O157:H. A detecção e quantificação múltipla, simultânea e rá-pida de patogênicos, mediante reação de amplificação múltiplex empregan-do a reação em cadeia da polimerasa em tempo real, permitirá economizarcustos e tempo na indústria onde tempos de estoque dos produtos são ex-tremadamente cruciais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Para solucionar as limitantes, é objetivo da invenção oferecer ummétodo para a detecção e quantificação múltipla e simultânea de qualquercombinação de patogênicos, como Listeria sp, Staphylococcus aureus,Campyiobacter jejuni e/ou Eseheriehia eoli 0157:H7, em amostra(s) de en-saio mediante reação de amplificação múltiplex empregando a reação emcadeia da polimerasa (PCR) em tempo real.
As etapas do método são:
I (a) extrair ADN da(s) amostra(s) de ensaio;
(b) preparar uma mistura de reação específica para os patogê-nicos a detectar e quantificar, que contenha os reagentesnecessários para a amplificação enzimática do ADN extraí-do e identificação dos patogênicos a detectar e quantificar;
(c) amplificar, mediante reação de amplificação múltiplex em-pregando PCR, a mistura de reação; e
(d) determinar simultaneamente a presença ou ausência equantificação dos patogênicos na(s) amostra(s) de ensaio
O método permite que:
(i) a mistura de reação para a amplificação enzimática do ADNextraído e identificação de qualquer combinação de Listeria sp, Staphylococ-eus aureus, Campylobaeter jejuni e/ou Eseheriehia eoli 0157Ή7 a detectar equantificar contém:
(a) um primeiro par de iniciadores oligonucleotídeos identifica-dos como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 e uma sonda identificada comoSEQ ID NO: 3 que reagem com uma primeira seqüência-alvo de ácido nu-cléico de Listeria sp,
(b) um segundo par de iniciadores oligonucleotídeos identifi-cados como SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 e uma sonda identificada comoSEQ ID NO: 6 que reagem com uma segunda seqüência-alvo de ácido nu-cléico de Staphyloeoeeus aureus-,(c) um terceiro par de iniciadores oligonucleotídeos identifica-dos como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e uma sonda identificada comoSEQ ID NO: 9 que reagem com uma terceira seqüência-alvo de ácido nu-cléico de Campylobacter jejunr, e/ou
(d) um quarto par de iniciadores oligonucleotídeos identifica-dos como SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 e uma sonda identificada comoSEQ ID NO: 12 que reagem com uma quarta seqüência-alvo de ácido nu-cléico de Escherichia coli 0157:H7\
(ii) a presença ou ausência e quantificação dos referidos pa-togênicos em qualquer combinação de Listeria sp, Staphylococcus aureus,Campylobaeter jejuni e/ou Eseheriehia coli 0157:H7 na(s) amostra(s) de en-saio se determina por sinal fluorescente ou emissão de fluorescência especi-fica de cada produto amplificado.
Outros objetivos da invenção são:
- oferecer um oligonucleotídeo com a seqüência de nucleotídeos seleciona-da do grupo formado pelas seqüências identificadas como SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
- oferecer um oligonucleotídeo com uma seqüência de nucle-otídeos selecionada do grupo formado pelas seqüências i-dentificadas como SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ IDNO: 6.
- oferecer um oligonucleotídeo com uma seqüência de nucle-otídeos selecionada do grupo formado pelas seqüências i-dentificadas como SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ IDNO: 9.
- oferecer um oligonucleotídeo com uma seqüência de nucle-otídeos selecionada do grupo formado pelas seqüências i-dentificadas como SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQID NO: 12.
- oferecer uma sonda marcada compreendendo um oligonu-cleotídeo identificado como SEQ ID NO: 3; e pelo menosum marcador.oferecer uma sonda marcada compreendendo um oligonu-cleotídeo identificado como SEQ ID NO: 6; e pelo menosum marcador.
oferecer uma sonda marcada que compreende um oligonu-cleotídeo identificado como SEQ ID NO: 9; e pelo menosum marcador.
oferecer uma sonda marcada que compreende um oligonu-cleotídeo identificado como SEQ ID NO: 12; e pelo menosum marcador.
- finalmente oferecer um jogo de diagnóstico para a detecçãoe quantificação múltipla e simultânea de qualquer combina-ção de patogênicos, tais como Listeria sp, Staphylococcusaureus, Campylobaeter jejuni e/ou Eseheriehia coli 0157:H7, em amostra(s) de ensaio mediante reação de amplifica-ção multiplex empregando a reação em cadeia da polime-rasa em tempo real.O jogo de diagnóstico possui:
(a) um ou mais oligonucleotídeos de qualquer dos grupos dasseqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO:9; e/ou SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12;
(b) uma ou mais sondas marcadas que possuem quaisqueroligonucleotídeos com as seqüências SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 9 e SEQ ID NO: 12; e um marcador diferente para cada seqüência; e
(c) outros reagentes ou composições necessárias para con-
cretização do ensaio.BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Detalhes característicos da invenção são descritos abaixo e ilus-trados com figuras, para defini-la porém sem limitar seu alcance.
figura 1: ilustra uma curva de calibração para Listeria sp, onde
A1 é referência de maior concentração e A4 é de menor concentração. Aleitura de uma amostra se interpola nas leituras das referências para conhe-cer as UFC/ml.
figura 2: ilustra uma curva de calibração para Staphylococcusaureus, onde A1 é a referência de maior concentração e A4 a de menor con-centração. A leitura de uma amostra se interpola nas leituras das referênciaspara conhecer as UFC/ml.
figura 3: ilustra uma curva de calibração para Campylobacterjejuni, onde A1 é a referência de maior concentração e A2 a de menor con-centração. A leitura de uma amostra se interpola nas leituras das referênciaspara conhecer as UFC/ml.
figura 4: ilustra uma curva de calibração para Escheriehia eoliO157:H7, onde A1 é a referência de maior concentração e A3 é uma de me-nor concentração. A leitura de uma amostra se interpola nas leituras das re-ferências para conhecer as UFC/ml.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O termo "amplificação enzimática de ADN", empregado nestadescrição, significa o emprego da reação em cadeia da polimerasa (PCR)para incrementar a concentração de uma seqüência em particular de ADN1dentro de uma mistura de seqüências de ADN. A seqüência particular deADN amplificada é referida como uma "seqüência-alvo".
O termo "par de iniciadores" é empregado com o significado deum par de iniciadores oligonucleotídeos que são complementares às se-qüências que coincidem com a seqüência-alvo. Consiste em um iniciador"corrente acima" que possui uma seqüência de ácido nucléico que comple-menta uma seqüência "corrente acima" da seqüência-alvo, e um iniciador"corrente abaixo" que possui uma seqüência de ácido nucléico complemen-tar a uma seqüência "corrente abaixo" da seqüência-alvo.
O termo "reação de amplificação múltiplex" significa a amplifica-ção, por procedimento de PCR, de múltiplas seqüências-alvo de ADN emuma amostra de ensaio em particular.
Na invenção foram detectadas e quantificadas simultaneamentequatro bactérias utilizando a técnica de PCR em tempo real, que em compa-ração com as outras técnicas, não necessitou pré-enriquecimento, nem pre-parar uma série de tubos com mistura de reação específica para cada bacté-ria a detectar. É necessário ressaltar que é um avanço o fato de detectarquatro bactérias de maneira simultânea e reduzir o tempo total de análise a2.5 horas, vantagem competitiva na redução do custo de análise utilizando amesma mistura para a prova de detecção. Além de propiciar uma maior sen-sibilidade, pois a preparação da amostra (incluída no tempo de 2.5 horas)permite obter melhores resultados porque não existem fatores que possaminfluir desfavoravelmente na amplificação.
O método permite detectar, identificar e quantificar simultanea-mente múltiplos patogênicos transmissíveis por alimentos, superfícies ouambientes contaminados, tais como Listeria sp, Staphylococcus aureus,Campylobacter jejuni e/ou Eseheriehia eoli 0157.H7, em amostra(s) de en-saio, mediante reação de amplificação múltiplex empregando a reação emcadeia da polimerasa em tempo real. A amostra de ensaio pode ser qualquerque contenha ADN e na qual se deseja conhecer a possível contaminaçãopor patogênicos. A(s) amostra(s) de ensaio podem ser de produto alimentí-cio (carne e lácteos), ou de superfícies ou ambientes contaminados.OLIGONUCLEOTÍDEOS: DESENHO E INFORMAÇÃO DE SEQÜÊNCIA
Os oligonucleotídeos da invenção foram desenhados para identi-ficar especificamente Listeria sp, Staphyloeoeeus aureus, Campylobaeterjejuni e Eseheriehia eoli 0157:H7 que possam estar presentes em amostrade ensaio sem dar falsos positivos devido a presença de outros patogênicosna mesma.
Há um par de iniciadores oligonucleotídeos para cada patogêni-co a identificar (Listeria sp, Staphyloeoeeus aureus, Campylobaeter jejuni yEseheriehia eoli 0157:H7), e cada par de iniciadores compreende uma pri-meira seqüência nucleotídea sintética "corrente acima" complementar a umaseqüência nucleotídea "corrente acima" que coincide com o extremo 5' deuma seqüência de ácido nucléico objetivo e uma segunda seqüência nucleo-tídea sintética "corrente abaixo" complementar a uma seqüência "correnteabaixo" que coincide com o extremo 3' da seqüência de ácido nucléico obje-tivo. As seqüências de nucleotídeos devem possuir cada par de iniciadoresde oligonucleotídeos específicos ao patogênico a detectar, de maneira quenão reajam ou cruzem com outros patogênicos. Mesmo assim, para cada umdos patogênicos a identificar foi desenvolvida uma seqüência sintética deprova para sonda. Os oligonucleotídeos desenvolvidos são mostrados na tabela 1.
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Tabela 1
Em uma concretização preferida da invenção as seqüênciasSEQ ID NO: 3, SEO ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 12 empregadascomo sondas de prova são marcadas no extremo 5' com um fluoróforo oucolorante capaz de emitir energia, e no extremo 3' com um apagador ou co-lorante capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo. Os fluo-róforos e apagadores, empregados como marcadores para detectar e identi-ficar Listeria sp, Staphyiococeus aureus, Campyiobacter jejuni e Escheriehiaeoli 01'57:H7 sem produzir reações cruzadas entre eles e os demais compo-nentes, são mostrados na tabela 2.<table>table see original document page 11</column></row><table>
Tabela 2
PREPARAÇÃO DA(S) AMOSTRA(S) DE ENSAIO DE ADN
No desenvolvimento da metodologia da invenção foram execu-tadas as seguintes etapas para a preparação de uma amostra de ensaio:
- foi procedida uma etapa de lavagem, onde a amostra de ali-mento, superfície ou ambiente foi submetida a uma solução salina formandouma suspensão, posteriormente centrifugada para a obtenção de um primei-ro sedimento pela eliminação de substâncias hidrossolúveis.
O sedimento da amostra, foi incubado com Iisozima para rompera parede celular das bactérias presentes, e posteriormente a uma incubaçãocom proteinase K para provocar a hidrolise das proteínas e do Iisozima pre-viamente adicionado.
A extração das proteínas e demais compostos lipossolúveis pre-sentes se realiza por meio da aplicação de fenol-clorofórmio-álcool, para quequando extraídas, por meio de precipitação com etanol, se suceda uma pre-cipitação seletiva do ADN presente, formando uma concentração de ADNque então foi secada.
Finalmente, com a concentração de ADN obtida, forma-se umasuspensão então aquecida a aproximadamente 659C e que origina uma rá-pida dissolução da amostra de ADN.
Em cada elemento provado foram aplicadas provas de quantida-de de reagente adicionado, tempos de centrifugação - incubação, repetiçãodos lavados, até encontrar as condições ótimas. A preparação da amostrafoi realizada considerando que todos os reagentes e amostras devam sermantidos em temperatura de refrigeração durante o processo.
Exemplos do processo de preparação de amostra(s) de ensaiode ADN :
Exemplo 1: Preparação de amostra de ADN a partir de uma amostrade alimento de produtos de carne ou queijos.
1. Colocar 25 g da amostra de alimento em um tubo cônicode 50 ml estéril, e aferir a 40 ml com solução salina estérilà temperatura ambiente.
2. Deixar repousar o tubo com a amostra de alimento por 10minutos em posição vertical.
3. Eliminar o alimento, centrifugar a 3,500 min"1 (rpm) por 15minutos e extrair cuidadosamente o flutuante para nãoperder o sedimento.
4. Agitar em vórtex o sedimento por 10 segundos.
5. TransferiratotalidadedosedimentoaumtuboEppendorfde 2 ml, enxaguar o tubo cônico com 1 ml de solução sali-na estéril e reunir o lavado com o obtido previamente.
6. Centrifugar a 14,000 min"1 (rpm) por 8 minutos.
7. Eliminar todo o flutuante com pipeta automática.
8. Acrescentar 100 μΙ de Tris-HCI de 100 mmol e pH=8, e 30 μg de lisozima, e misturar em vórtex por 10 segundos.
9. Incubar a 37 2C por 30 minutos em banho de água.
10. Acrescentar 100 μΙ de TE 1X com SDS ali % e 3 μΙ de Pro-teinasa K (20 mg/ml).
11. Misturar e incubar a 55 sC por 30 minutos.
12. Agregar 500 μΙ de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico(24:24:1) e 100 μΙ de TE 1X e agitar 5 minutos por inver-são.
13. Centrifugar por 8 minutos a 13,500 min"1 (rpm) e transferir250 μΙ da fase superior a outro tubo.
14. Acrescentar 582.5 μΙ de etanol absoluto e manter no con-gelador por 10 minutos.15. Centrifugar por 8 minutos a 13,500 min"1 (rpm).
16. Decantar e secar.
17. Redissolver em 25 μΙ de TE 1X e assegurar que o botão deADN se dissolva.
18. Aquecera 65°C por 15 minutos.
19. Deixar à temperatura ambiente por 30 minutos e processar.Exemplo 2: Preparação de amostra de ADN a partir de uma amostra de am-biente ou de superfície.
1. Passar uma esponja estéril por uma superfície de 20 cm χ20 cm a analisar para obter uma amostra.
2. Exprimir a esponja em uma bolsa para proceder a decantaro líquido em um tubo cônico de 50 ml, e aferir a 40 ml com solução salinaestéril.
3. Centrifugar a 3500 min"1 (rpm) por 15 minutos e extrair cui-dadosamente o flutuante para não perder o sedimento.
4. Agitar em vórtex o sedimento por 10 segundos.
5. Transferir a totalidade do sedimento a um tubo Eppendorfde 2 ml. Enxaguar o tubo cônico com 1 ml de solução salina estéril e reunir olavado com o obtido previamente.
6. Centrifugar a 14,000 min"1 (rpm) por 8 minutos.
7. Lavar mais 2 vezes com 1.5 ml de solução salina estéril.
8. Eliminar todo o flutuante com pipeta automática.
9. Acrescentar 100 μΙ de Tris-HCI de 100 mmol e pH=8, e 30μg de lisozima, e misturar em vórtex por 10 segundos.
10. Incubar a 37ÕC por 30 minutos em banho de água.
11. Acrescentar 100 μΙ de TE 1X com SDS a 1% e 3 μΙ de Pro-teinasa K (20 mg/ml).
12. Misturar e incubar a 55 2C por 30 minutos.
13. Agregar 500 μΙ de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico(24:24:1) e 100 μΙ de TE 1X e agitar 5 minutos por inversão.
14. Centrifugar por 8 minutos a 13,500 min"1 (rpm) e transferir250 μΙ da fase superior a outro tubo.15. Acrescentar 582.5 μl de etanol absoluto e manter no conge-lador por 10 minutos.
16. Centrifugar por 8 minutos a 13,500 min"1 (rpm).
17. Decantar e secar.
18. Redissolver em 25 μl de TE 1X. Assegurar-se que o botãode ADN se dissolva.
19. Aquecer a 65 °C por 15 minutos.
20. Deixar a temperatura ambiente por 30 minutos e processar.
PREPARAÇÃO DA MISTURA DE REAÇÃO
Obtida a(s) amostra(s) de ensaio de ADN é preparada a misturade reação com os componentes da Tabela 3.
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Tabela 3Posteriormente, é executada a preparação de um coquetel dereação para 100 reações misturando os componentes da Tabela 4.
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Tabela 4
O coquetel preparado se mistura perfeitamente por inversão e sedispensam 19,75 μl em tubos Eppendorf de 0,5 ml para ser armazenadosem congelamento protegidos da luz.
REAÇÃO DE AMPLIFICACÂO MÚLTIPLEX EMPREGANDO PCR EM TEM-PO REAL E DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PATOGÊNICOS
Na invenção, a reação de amplificação múltiplex empregandoPCR em tempo real proporciona vantagens sobre o método de PCR conven-cional de um só objetivo a detectar. A reação de amplificação múltiplex em-pregando PCR requer o desenvolvimento de iniciadores oligonucleotídeos esondas específicas para a seqüência-alvo do patogênico a detectar, de for-ma que os iniciadores oligonucleotídeos e sondas sejam compatíveis entre sidentro de uma mesma temperatura ótima, entre 40 °C e 65 °C, e submetidasàs mesmas condições de reação química para permitir o cruzamento ou ata-dura, por hibridação, de dois segmentos de ácido nucléico complementares.
Além disso, os jogos de iniciadores oligonucleotídeos e sondas não devemreagir cruzadamente nem se cruzar ou atar, durante a amplificação, a outrasseqüências de ácido nucléico para as quais não foram desenhados.
Considerando o acima, os seguintes pares de iniciadores oligo-nucleotídeos são usados para amplificar cada uma das seqüências-alvo deácido nucléico de cada patogênico a detectar. Um par de iniciadores oligo-nucleotídeos de Listeria sp identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2 que se cruzam ou atam a uma sequencia objetivo do genoma de Listeriasp. Um par de iniciadores oligonucleotídeos de Staphylococcus aureus iden-tificados como SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 que se cruzam ou atam a umaseqüência-alvo do genoma de Staphylococcus aureus. Um par de iniciado-res oligonucleotídeos de Campylobaeter jejuni identificados como SEQ IDNO: 7 e SEQ ID NO: 8 que se cruzam ou atam a uma seqüência-alvo do ge-noma de Campylobaeter jejuni. E um par de iniciadores oligonucleotídeos deEseheriehia eoli 0157:H7 identificados como SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO:11 que se cruzam ou atam a uma seqüência-alvo do genoma de Eseheriehiacoli 0157.Ή7.
As sondas SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 e SEQID NO: 12, utilizadas na reação de amplificação múltiplex empregando PCRem tempo real, e uma seqüência oligonucleotídea duplamente marcada,complementar a cada uma das seqüências intermediárias nos produtos am-plificados obtidos. Cada uma das sondas estão marcadas em seu extremo 5'com um fluoróforo ou um colorante capaz de emitir energia, e no extremo 3'com um apagador ou colorante capaz de capturar a energia emitida da exci-tação do mesmo, como descreve Nazarenko et al. na patente estadunidenseUS-5866336 onde se mencionam fluoróforos que transferem energia e comosão aplicados nos iniciadores oligonucleotídeos em métodos de amplificaçãonucléica.
Na invenção, os fluoróforos empregados são ΤΕΤ, TxR, Cy5,FAM; enquanto os apagadores são BHQ-1, BHQ-2 e BHQ-3. As seqüênciasoligonucleotídeas empregadas como sondas (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 12) são marcadas nos extremos 5' e 3' confor-me a combinação indicada na tabela 2.
A amostra de ADN é preparada para sua amplificação nas se-guintes condições:
Amostra de lácteos ou de ambiente: Descongela-se um tubocom 19.75 μl de coquetel preparado e se acrescentam 0.25 μl de ADN poli-merasa Taq1 4 μl de água e 1 μl da amostra de ADN a analisar.
Amostra de produtos de carne ou queijos: Descongela-se umtubo com 19.75 μl de coquetel preparado e se acrescentam 0.25 μl de ADNpolimerasa Taq e 5 μl da amostra de ADN a analisar.
A reação de amplificação múltiplex empregando PCR é realizadapor um aparelho para o controle simultâneo de múltiplas amplificações deácido nucléico, como descrito por Russell G. Higuchi e Robert M. Watson napublicação de patente européia EP-640828. Geralmente consiste em umtermociclador com orifícios onde são introduzidos tubos contendo a misturade reação para amplificação enzimática de ADN dos patogênicos a detectare identificar; uma fonte de luz acoplada ao termociclador e adaptada paradistribuir a luz sobre os orifícios; e um sensor ou detector de fluorescênciaadaptado para detectar simultaneamente a luz emitida.
Para quantificar os microorganismos presentes na amostra, sãoelaboradas curvas de calibração preparando suspensões de cada patogêni-co a detectar (Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni eEseheriehia eoli 0157Ή7), ajustando a turbidez ao tubo 0.5 de Mc Farlandpara preparar diluições a 10"1 10"2, 10"3, 10"4, 10"5, 10"6, 10"7 e 10"8 para poste-riormente contaminar 25 g de alimento com cada uma destas suspensões(um alimento para cada diluição), depois se extrai o ADN como uma amostrae é preparada uma conta em placa de cada uma das diluições preparadaspara serem submetidas ao termociclador, designando a concentração depatogênicos correspondente. Finalmente se constrói a curva de cT contra logug/g, assim obtendo uma curva de calibração para Listeria sp (ver figura 1),Staphylocoeeus aureus (ver figura 2), Campylobaeter jejuni (ver figura 3) eEseheriehia eoli 0157:H7 (ver figura 4).
O aparelho utilizado compreende um termociclador rápido emtempo real unido a um sistema de detecção por fluorescência, permitindo asupervisão em tempo real do processo de amplificação depois de cada ciclo.Um exemplo de termociclador empregado no método da invenção é oSMART CYCLER® II de CEPHEID®.
DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PATOGÊNICOS PRESENTES NAAMOSTRA DE ADN
A presença ou ausência e quantificação de patogênicos emqualquer combinação de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacterjejuni e/ou Eseheriehia eoli 0157:H7 em amostra(s)de ensaio é determinadapor um sinal fluorescente ou emissão de fluorescência específica de cadaproduto ou amostra de ADN amplificada. Para isto se incide uma longitudede onda específica para a excitação de cada fluoróforo para detectar a emis-são a longitudes de onda específicas.RESULTADOS
Em exemplo, a tabela 5 indica as condições executadas na rea-ção de amplificação múltiplex, a tabela 6 os limites de detecção alcançadose a tabela 7 mostram as leituras das concentrações obtidas como resultadoda detecção e quantificação dos quatro patogênicos (Listeria sp, Staphylo-coccus aureus, Campylobacter jejuni e/ou Escherichia eoli 0157:H7) simul-taneamente em amostras de carnes frias, lácteos e ambiente, mediante autilização de um só dispositivo com uma única mistura de reagentes e quatrooligonucleotídeos específicos para diferentes patogênicos com apenas umacondição de temperatura e mistura para sua amplificação. As figuras 1,2,3e 4 também demonstram graficamente a detecção e quantificação.
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Tabela 5<table>table see original document page 19</column></row><table>
Tabela 6
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Tabela 7
A metodologia desta invenção dispensa um pre-enriquecimento,sendo o tempo de processo muito mais curto (aproximadamente 2.5 horas),existindo a capacidade de detectar e quantificar patogênicos viáveis cultivá-veis além de patogênicos viáveis não-cultiváveis simultaneamente.
JOGO DE DIAGNÓSTICO
Geralmente, os jogos de diagnóstico da invenção contém cadauma das duplas de iniciadores oligonucleotídeos correspondentes a cadapatogênico a detectar (Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacterjejuni e/ou Escheriehia eoli 0157:H7), e as sondas marcadas para cada pa-togênico individualmente, permitindo a opção de realizar a detecção de ape-nas um (usando só o par de iniciadores oligo nucleotídeos e sua sonda mar-cada), ou a detecção combinada ou simultânea dos quatro patogênicosmencionados.
Os jogos de diagnóstico proporcionados por esta invenção po-dem ser apresentados em forma de estojo contendo: recipientes com os pa-res de iniciadores oiigonucleotídeos e/ou sondas marcadas mencionadospreviamente e recipientes com o total ou parte do restante de reagentes ne-cessários para a concretização do método como água ultra pura, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, e dTTP), tampão adequado para a reação de amplifi-cação enzimática, ADN polimerasa termo estável como ADN polimerasaTaq, etc, sal magnésico (ex.: MgCl2), e outros. Opcionalmente, os jogos dediagnóstico podem incluir recipientes com ADN de Listeria sp, Staphylococ-cus aureus, Campylobacter jejuni e/ou Eseheriehia eoli 0157:H7 para em-prego como controles positivos.
Baseado nas concretizações executadas, as modificações dosambientes de concretização descritos, assim como os ambientes de concre-tização alternativos são considerados evidentes para um especialista na téc-nica apresentada. Portanto, as reivindicações abarcam as modificações ealternativas que se encontrem ao alcance da presente invenção ou equiva-lentes.LISTAGEM DE SEQUENCIAS
<110> SIGMA ALIMENTOS, S. A. DE C. V.
GARZA GONZÁLEZ, ELVIRABOSQUES PADILLA, FRANCISCO JAVIERMORENO CAMPANA, VÍCTOR MANUEL
<120> MÉTODO PARA A DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO MÚLTIPLA E SIMULTÂNEADE PATOGÊNICOS MEDIANTE A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASA EMTEMPO REAL
<130> PCT003SIGMA
<140> PCT/MX2007/000052
<141> 2007-04-19
<150> MXNL/a/2006/000028
<151> 2006-04-24
<160> 12
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo "corrente acima" F de Listeria sp<400> 1
agctgacgac aaccatgcac cacc 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo "corrente abaixo" R de Listeria sp
<400> 2
gacttaaccc aacatctcac gac 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo de prova P de Listeria sp
<400> 3
agctgacgac aaccatgcac cacc 24
<210> 4<211> 24<212> DNA<213> Artificial<220>
<223> Oligonucleotídeo "corrente acima" F de Staphylococcus aureus
<400> 4
aacaaaacag accatcttta agcg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo "corrente abaixo" R de Staphylococcus aureus
<400> 5
agatgagcta ccttcaagac cttc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo de prova P de Staphylococcus aureus
<400> 6
actcaaccga cgacaccgaa ccct 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo "corrente acima" F de Campylobacter jejuni
<400> 7
gcagcagtag ggaatattgc g 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo "corrente abaixo" R de Campylobacter jejuni
<400> 8
tacgctccga aaagtgtcat ce 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo de prova P de Campylobacter jejuni<400> 9
aaccctgacg cagcaacgcc gc 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo "corrente acima" F de Escherichia coli
<400> 10
gcagataaac tcatcgaaac aagg 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo "corrente abaixo" R de Escherichia col
<400> 11
taaattaatt ccacgccaac caag 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo de prova P de Escherichia coli
<400> 12
accctgtcca cacgatgcca atgt 24
Claims (45)
1. Método para a detecção e quantificação múltipla e simultâneade qualquer combinação de patogênicos, selecionados de um grupo consis-tente de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni e Escheri-chia coli O157.Η7, em amostra ou amostras de ensaio mediante reação deamplificação múltiplex com emprego da reação em cadeia da polimerasa(PCR) em tempo real, o método compreende as etapas de:a) extrair ADN presente na dita amostra ou amostras de en-saio;b) preparar a mistura de reação específica para patogênicos adetectar e quantificar, compreendendo os reagentes neces-sários para a amplificação enzimática do ADN extraído eidentificação dos patogênicos a detectar e quantificar;c) amplificar, mediante a reação de amplificação múltiplexempregando PCR, a mistura de reação; ed) determinar simultaneamente a presença ou ausência equantificação dos patogênicos na dita amostra ou amostrasde ensaio;onde o dito método caracteriza-se pelo fato de que:i) a mistura de reação para a amplificação enzimática do ADNextraído e identificação de qualquer combinação de Listeriasp, Staphylococcus aureus, Campylobaeter jejuni e/ou Es-cherichia coli O157:H7a detectar e quantificar compreende:um primeiro par de iniciadores oligonucleotídeos identificadoscomo SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 e uma sonda identificada como SEQ IDNO: 3, que se cruzam ou atam a uma primeira seqüência-alvo de ácido nu-cléico de Listeria sp;um segundo par de iniciadores oligonucleotídeos identificadoscomo SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 e uma sonda identificada como SEQ IDNO: 6, que se cruzam ou atam a uma segunda seqüência-alvo de ácido nu-cléico de Staphyloeoeeus aureus;um terceiro par de iniciadores oligonucleotídeos identificadoscomo SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 e uma sonda identificada como SEQ IDNO: 9, que se cruzam ou atam a uma terceira seqüência-alvo de ácido nu-cléico de Campylobacter jejum) e/ouum quarto par de iniciadores oligonucleotídeos identificados co-mo SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 e uma sonda identificada como SEQ IDNO: 12, que se cruzam ou atam a uma quarta seqüência-alvo de ácido nu-cléico de Escherichia coli 0157:H7;ii) a presença ou ausência e quantificação de patogênicos emqualquer combinação de Listeria sp, Staphyiococeus au-reus, Campylobaeter jejuni y/o Eseheriehia coli 0157.H7em dita amostra ou amostras de ensaio é determinada porsinal fluorescente ou emissão de fluorescência específicade cada patogênico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita amostra ou amostras de ensaio é amostra de alimentosprocessados ou de ambiente.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, para extrair ADNpresente em dita amostra ou amostras de ensaio, inclui as etapas de:colocar a(s) amostra(s) de ensaio em solução salina estéril; remover os elementos solúveis em água eobter um concentrado.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita mistura de reação compreende:pelo menos 200 pmol do iniciador oligonucleotídeo identificadocomo SEQ ID NO: 1;pelo menos 200 pmol do iniciador oligonucleotídeo identificadocomo SEQ ID NO: 2;pelo menos 50 pmol do oligonucleotídeo da sonda identificadacomo SEQ ID NO: 3;pelo menos 200 pmol do iniciador oligonucleotídeo identificadocomo SEQ ID NO: 4;pelo menos 200 pmol do iniciador oligonucleotídeo identificadocomo SEQ ID NO: 5;pelo menos 50 pmol do oligonucleotídeo da sonda identificadacomo SEQ ID NO: 6;pelo menos 300 pmol do iniciador oligonucleotídeo identificadocomo SEQ ID NO: 7;pelo menos 200 pmol do iniciador oligonucleotídeo identificadocomo SEQ ID NO: 8;pelo menos 350 pmol do oligonucleotídeo da sonda identificadacomo SEQ ID NO: 9;pelo menos 200 pmol do iniciador oligonucleotídeo identificadocomo SEQ ID NO: 10;pelo menos 200 pmol do iniciador oligonucleotídeo identificadocomo SEQ ID NO: 11; e/oupelo menos 50 pmol do oligonucleotídeo da sonda identificadacomo SEQ ID NO: 12.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a inclusão de sonda(s) para detectar produto(s) amplificados dePCR, onde cada sonda é complementar a uma seqüência dentro da seqüên-cia a detectar de qualquer combinação de Listeria sp, Staphylococcus au-reus, Campyiobacter jejuni e/ou Eseheriehia eoli 0157:H7.
6. Método da reivindicação 5, onde a primeira sonda compreen-de:um oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO: 3; epelo menos um marcador.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que a primeira sonda está marcada no extremo 5' com fluoróforo oucolorante capaz de emitir energia e no extremo 3' com apagador ou coloran-te capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o fluoróforo é ΤΕΤ.
9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o apagador é BHQ-1.
10. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que uma segunda sonda compreende:um oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO: 6; epelo menos um marcador.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe-lo fato de que a segunda sonda está marcada no extremo 5' com fluoróforoou um colorante capaz de emitir energia e no extremo 3' apagador ou colo-rante capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo,
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que o fluoróforo é TxR.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que o apagador é BHQ-2.
14. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de uma terceira sonda compreender:um oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO: 9; epelo menos um marcador.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pe-lo fato de que a terceira sonda está marcada no extremo 5' com fluoróforo oucolorante capaz de emitir energia e no extremo 3' com apagador ou coloran-te capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe-lo fato de que é fluoróforo Cy5.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe-lo apagador BHQ-3.
18. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que uma quarta sonda compreende:um oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO: 12; epelo menos um marcador.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que a dita quarta sonda marcada no extremo 5' com fluoróforo oucolorante capaz de emitir energia e no extremo 3' com apagador ou coloran-te capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de que o dito fluoróforo é FAM.
21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de que o apagador é BHQ-1.
22. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que as ditas sondas estão marcadas no extremo 5' com fluoróforo oucolorante capaz de emitir energia, e no extremo 3' com apagador ou coloran-te capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o fluoróforo é selecionado do grupo de ΤΕΤ, TxR, Cy5 y FAM.
24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o apagador é selecionado do grupo de BHQ-1, BHQ-2 y BHQ-3.
25. Oligonucleotídeo que possui uma seqüência de nucleotídeosselecionada do grupo formado pelas seqüências identificadas como SEQ IDNO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3.
26. Oligonucleotídeo que possui uma seqüência de nucleotídeosselecionada do grupo formado pelas seqüências identificadas como SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.
27. Oligonucleotídeo que possui a seqüência de nucleotídeosselecionada do grupo formado pelas seqüências identificadas como SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.
28. Oligonucleotídeo que possui uma seqüência de nucleotídeosselecionada do grupo formado pelas seqüências identificadas como SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.
29. Sonda marcada caracterizada pelo fato de compreender:um oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO: 3; epelo menos um marcador.
30. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 29, caracteri-zada pelo fato de que a dita sonda está marcada no extremo 5' com fluorófo-ro ou colorante capaz de emitir energia e no extremo 3' com apagador oucolorante capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo.
31. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 30, caracteri-zada pelo fato de que o fluoróforo é ΤΕΤ.
32. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 30, caracteri-zada pelo fato de que o apagador BHQ-1.
33. Sonda marcada caracterizada pelo fato de compreender:um oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO: 6; epelo menos um marcador.
34. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 33, caracteri-zada pelo fato de que a dita sonda está marcada no extremo 5' com fluorófo-ro ou colorante capaz de emitir energia e no extremo 3' com apagador oucolorante capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo.
35. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 34, caracte-rizada pelo fato de que o fluoróforo é TxR.
36. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 34, apagadoré BHQ 2.
37. Sonda marcada caracterizada por compreender:um oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO: 9; epelo menos um marcador.
38. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 37, marcadano extremo 5' com fluoróforo ou colorante capaz de emitir energia e no ex-tremo 3' com apagador ou colorante capaz de capturar a energia emitida daexcitação do mesmo fluoróforo.
39. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 38, caracteri-zada pelo fato de que o fluoróforo é Cy5.
40. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 38, caracteri-zada pelo fato de que o apagador é BHQ-3.
41. Sonda marcada caracterizada pelo fato de compreender:um oligonucleotídeo identificado como SEQ ID NO: 12; epelo menos um marcador.
42. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 41, caracteri-zada pelo fato da dita sonda está marcada no extremo 5' com fluoróforo oucolorante capaz de emitir energia e no extremo 3' com apagador ou coloran-te capaz de capturar a energia emitida da excitação do mesmo.
43. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 42, caracteri-zada pelo fato de que fluoróforo é FAM.
44. Sonda marcada de acordo com a reivindicação 42, caracte-rizada pelo fato de que o apagador é BHQ-1.
45. Jogo de diagnóstico para detecção e quantificação múltipla esimultânea de qualquer combinação de patogênicos, selecionados de umgrupo de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni e Esehe-richia coli 0157:H7, em amostra ou amostras de ensaio por reação de ampli-ficação múltiplex com emprego da reação em cadeia da polimerasa (PCR)em tempo real, onde o jogo se caracteriza por compreender:um ou mais oligonucleotídeos segundo qualquer uma das reivin-dicações 25 a 28;uma ou mais sondas marcadas segundo qualquer uma das rei-vindicações 29 a 44; eoutros reagentes ou composições necessárias para executar oensaio.
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