BRPI0711055A2

BRPI0711055A2 - processo de derivação de células-tronco hepáticas e de indução da expressão de hgp

Info

Publication number: BRPI0711055A2
Application number: BRPI0711055-3A
Authority: BR
Inventors: Jeffery M Gimble; John W Ludlow
Original assignee: Supervisors Of Lousiana State University And Agricultural And Mechanical College Board Of; Artecel Inc
Priority date: 2006-04-25
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2012-01-10
Also published as: CN101605884A

Abstract

PROCESSO DE DERIVAçãO DE CéLULAS-TRONCO HEPáTICAS E DE INDUçãO DA EXPRESSãO DE HGP. A presente invenção fornece um processo para derivar células-tronco hepáticas partindo de células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático. Em uma modalidade da invenção, as células-tronco hepáticas são derivadas de células-tronco adiposas. A invenção fornece ainda um processo de aumento da produção de citocinas hepáticas (por exemplo, HGF) partindo de ASCs, que podem ser úteis na regeneração do tecido hepático quando transplantadas in vivo. São fornecidas as condições de cultura de tecido, incluindo as condições de meios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE DERIVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO HEPÁTICAS E DE INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DE HGP".

REFERÊNCIA CRUZADA A DE PATENTES RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Paten- te U.S. Provisório N2 60/794.508, depositado em 25 de abril de 2006 e ao Pedido de Patente U.S. Provisório N2 60/894.128, depositado em 9 de março de 2007, cujas descrições são incorporadas aqui como referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se de forma geral ao campo de tera- pias baseadas^etCLçálütas. Mais especificamente, a presente invenção refe- re-se à derivação de células-tronco hepáticas partindo de células-tronco de- rivadas de células que não são do fígado.

A falência hepática secundária à hepatite, à exposição a hepato- toxinas e à cirrose põe em risco os fígados de milhares de pessoas apenas nos Estados Unidos da América. Estimativas de custos diretos anuais para o cuidado da saúde para doença do fígado nos EUA variam de $60 bilhões até mais de $100 bilhões. $20-40 bilhões adicionais para a incapacitação física são pagos anualmente para estes pacientes e suas famílias pela Social Se- curity Administration. Infelizmente, neste momento, o transplante de fígado é a única opção terapêutica disponível para os pacientes além de medidas paliativas.

Entretanto, devido à limitação de órgãos doadores, menos de um terço de todos os pacientes nas listas de espera para fígados realmente receberá um. De acordo com o United Network of Organ Sharing (UNOS), 15.700 pacientes aguardam transplante de fígado atualmente nos Estados Unidos da América, mas apenas 4.000 até 5.000 fígados doadores que po- dem ser transplantados estão disponíveis anualmente. Uma vez que, com algumas exceções, um órgão doador ajuda apenas um receptor, ao longo da última década uma lacuna crescente vem surgindo entre doadores disponí- veis e candidatos a transplante em espera. Portanto, são necessárias novas terapias.

Terapias com células-tronco apresentam uma opção terapêutica alternativa para aqueles que necessitam da reconstituição total ou parcial da função hepática. De muitas maneiras, as terapias com células hepáticas são uma alternativa desejável para o transplante de órgãos inteiros, porque um fígado pode ser utilizado para tratar vários pacientes e porque os procedi- mentos cirúrgicos envolvidos nas terapias celulares são mais seguros, mais fáceis e menos caros para o paciente. O transplante de células-tronco ofere- ce uma modalidade de tratamento que melhora de forma segura e eficiente a função bioquímica dentro do fígado em falência.

Assim, há uma necessidade de métodos para derivar células- tronco hepáticas partindo de tecido sem ser hepático.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido um mé- todo de derivação de células-tronco hepáticas partindo de células-tronco não hepáticas que compreende: (a) o fornecimento de células-tronco derivadas de tecido sem ser hepático; e (b) o cultivo das células-tronco sobre uma ma- triz extracelular que compreende pelo menos uma proteína de matriz fibrilar e em meio de cultura isento de soro que compreende o fator de crescimento hepático (HGF), em que as células-tronco derivadas de tecido sem ser hepá- tico se diferenciam em células-tronco hepáticas. Os exemplos de tecido sem ser hepático, incluem, mas não estão limitados ao baço, ao intestino e ao tecido adiposo. Em uma modalidade preferida, as células-tronco adiposas são derivadas de tecido adiposo à fonte de células-tronco não hepáticas; entretanto, o tecido que não hepático pode ser de qualquer mamífero adulto. A pelo menos uma proteína de matriz fibrilar é preferencialmente seleciona- da do grupo que consiste em colágeno I e colágeno III. Em algumas modali- dades da invenção, o meio de cultura pode compreender ainda Oncostatin M, DMSO ou ambos e a matriz extracelular pode compreender ainda fibro- nectina, matrigel, vitrogen ou combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, mais de aproximadamente 70% das células-tronco derivadas de tecido sem ser hepático se diferenciam em célu- las-tronco hepáticas.

Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método de indução da expressão de HGF partindo de células-tronco não hepáticas que compreende: (a) o fornecimento de células-tronco derivadas de tecido sem ser hepático; e (b) o cultivo das células-tronco sobre uma matriz extracelular que compreende pelo menos uma proteína de matriz fibrilar e em meio de cultura isento de soro que compreende EGF, bFGF ou ambos, em que as células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático produzem HGF. O meio de cultura pode compreender ainda difosfato ascórbico de sódio.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é a representação esquemática da derivação de célu- las-tronco hepáticas partindo de células-tronco não hepáticas (por exemplo, ASCs) de acordo com a presente invenção.

A figura 2 mostra a expressão de mRNA relativa de albumina (ALB) e alfa-fetoproteína (AFP) em células-tronco hepáticas derivadas de ASCs.

A figura 3 mostra o armazenamento de glicogênio em células- tronco hepáticas derivadas de ASCs.

A figura 4 mostra a morfologia de células-tronco hepáticas deri- vadas de ASCs.

A figura 5 fornece um gráfico que mostra que o EGF e o difosfato ascórbico de sódio possuem a capacidade combinada de induzir a expressão de HGF em ASCs humanas.

A figura 6 fornece um gráfico que compara a capacidade do EGF e do bFGF com ou sem difosfato ascórbico de induzir a expressão de HGF em ASCs.

A figura 7 é uma análise de RT-PCR de receptores expressos em ASCs.

A figura 8 mostra a secreção de citocinas selecionadas (n= 6 até 8 doadores de ASCs) em tempos variáveis após a exposição ao Iipopolissa- carídeo durante períodos de 0 até 24 horas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

A presente invenção se direciona a métodos para a derivação de células-tronco hepáticas partindo de tecido sem ser hepático. A invenção não está limitada ao tecido de qualquer um dos estágios de vida. Ou seja, os méto- dos da presente invenção podem compreender tecidos adultos, fetais ou embrionários. Além disso, a fonte de tecido é amplamente direcionada a qualquer tecido sem ser hepático. Os exemplos não Iimitantes de tecido "sem ser hepático" incluem tecido adiposo, intestino, cérebro, sangue do cordão umbilical e medula óssea. Assim, embora muito da invenção seja descrito aqui com referência ao tecido adiposo adulto, tal referência é mera- mente um exemplo e não deve ser interpretada como limitante.

Derivação de células-tronco não hepáticas partindo de tecido sem ser hepático

As células-tronco não hepáticas podem ser derivadas de tecido adiposo (isto é, células-tronco adiposas, "ASCs"), de fontes humanas ou de outros mamíferos. As ASCs humanas podem ser isoladas de tecido adiposo subcutâneo obtido preferencialmente de pacientes do sexo masculino ou feminino saudáveis, por exemplo, daqueles sofrendo procedimentos de Iipo- aspiração eletivos. As ASCs murinas também podem ser isoladas de tecido adiposo subcutâneo obtido preferencialmente partindo de camundongos C57BL76 machos e/ou camundongos ROSA-26 machos. Partindo destas fontes, dentro de um período de 5 dias de cultura, é típica a recuperação de aproximadamente 250.000 ASCs de um mililitro de aspirado de Iipoaspira- ção. A amostra de lipoaspiração humana média é maior que aproximada- mente 500 mL. Números ainda maiores de células são recuperados partindo de volumes equivalentes de tecido adiposo murino, presumidamente devido à idade jovem dos animais doadores.

Os métodos de derivação de células-tronco adiposas partindo de tecido adiposo são apresentados nos USP N2s 6153432, 6391297, 6429013, 6555374, 6841150, 7001746 e 7033587, cujas descrições são incorporadas aqui em sua totalidade como referência. Sucintamente, em um exemplo, uma vez que o tecido é obtido, este é submetido à centrifugação diferencial e é expandido em cultura. Um único grama de tecido produz tipicamente en- tre 50.000 até 100.000 células-tronco dentro do período de 24 horas de cul- tura. Os meios de expansão compreendem preferencialmente 60% de DMEM (baixo teor de glicose) e 40% de MCDB-201 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS); 5 pg/mL de insulina, 5 pg/mL de transferrina e 5 ng/mL de selênio; 10-9M de dexametasona; 10 ng/mL de fator de crescimen- to da epiderme (EGF) e/ou 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblasto, básico (bFGF); 10-4 M de ácido 2-fosfato ascórbico; 100 U/mL de penicilina; e 100 U/mL de estreptomicina. Sem ficar preso ou ligado à teoria, acredita- se que a adição de EGF, bFGF ou ambos, ao meio aumenta a capacidade das ASCs de se diferenciarem posteriormente em células-tronco hepáticas. O ácido 2-fosfato ascórbico pode ter um efeito similar sobre as ASCs particu- larmente em relação a sua capacidade de expressar HGF (discutido abaixo).

O HGF promove a diferenciação das células-tronco em direção à linhagem hepática. Acredita-se que a adição de HGF às presentes condições de cultura, quando indicado, é capaz de complementar o processo de dife- renciação. Assim, em uma modalidade da presente invenção, a produção de HGF partindo das populações de células descritas aqui pode ser utilizada in vitro e in vivo (por exemplo, após o transplante) para ajudar a diferenciação de células-troncos de outra maneira "nascentes" em hepatócitos funcionais.

Meios de diferenciação

Na presença de dexametasona, insulina, isobutilmetilxantina e uma tiazolidinadiona, as ASCs sofrem adipogênese. As células acumulam vacúolos lipídicos, que podem ser corados em relação ao lipídeo neutro e expressam marcadores específicos aos adipócitos, incluindo a Ieptina de citocina secretada e o ácido graxo que se liga à proteína aP2. Entretanto, o potencial de diferenciação das ASCs não está limitado à linhagem de adipó- citos. Para a diferenciação em células-tronco hepáticas e hepatócitos, o meio de expansão isento de soro é adicionalmente suplementado com 10 ng/mL de EGF e/ou 10 ng/mL de bFGF, 10 ng/mL de HGF, 10 ng/mL de On- costatin M (OSM), 1% de DMSO ou combinações dos mesmos.

Condições de diferenciação

As ASCs são inicialmente plaqueadas com meio de expansão a uma densidade de aproximadamente 5-15 X 103 células/cm2 em uma placa de tecido ou um poço pré-revestido com colágeno I. As placas de tecido re- vestidas com colágeno I estão disponíveis comercialmente (por exemplo, MATRIGEL da BectonDickinson, VITROGEN da PureGeI), das quais qual- quer uma pode ser utilizada com a presente invenção. Em adição, sem ficar preso ou ligado à teoria, os presentes inventores aprenderam que o uso de proteínas de matriz hepática fibrilar (por exemplo, colágenos, preferencial- mente colágenos I e colágeno III) é preferido no método da invenção uma vez que seu uso parece reproduzir melhor o ambiente in vivo das células- tronco encontradas no tecido hepático adulto. Em outras palavras, as proteí- nas de matriz fibrilar parecem fornecer sinais de diferenciação que não estão disponíveis ou não tão fortes com outras proteínas de matriz.

A fibronectina, por exemplo, é uma molécula não fibrilar; é uma glicoproteína (os colágenos não são glicoproteínas), que permite primaria- mente que as células se liguem às outras moléculas de matriz ou à placa de cultura de tecido. Ou seja, acredita-se que a fibronectina é uma ponte para ligar integrinas na superfície das células à matriz de colágeno de revestimen- to no órgão (in vivo) ou do fundo de uma placa de cultura de tecido (in vitro). Assim, provavelmente os sinais que são ativados pela ligação da fibronecti- na são bastante diferentes dos ativados pela ligação de colágeno. Embora o uso de proteínas não fibrilares, tal como a fibronectina não seja necessário, estas podem ser utilizadas em associação com as proteínas fibrilares de a - cordo com a invenção. Em algumas modalidades, a matriz extracelular não compreende fibronectina.

Desta maneira, acredita-se que o presente método direciona a "conversão" de células-tronco não hepáticas em células-tronco hepáticas, que, em alguns casos, podem então se diferenciar em hepatócitos maduros, ao invés de uma diferenciação direta das células-tronco não hepáticas dire- tamente em hepatócitos, pulando o estágio de célula-tronco hepática de uma vez só. Esta noção é representada de forma esquemática na Figura 1. Os exemplos de outras proteínas de matriz, que podem ser adequadas na pre- sente invenção, incluem proteínas de matriz hepáticas embrionárias.

Durante este período inicial, é permitido que as células atinjam mais de aproximadamente 80% de confluência, que pode levar até 3 dias e são incubadas no meio de expansão descrito anteriormente. Após atingir mais de aproximadamente 80% de confluência, as células são lavadas duas ou três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) isoladamen- te e subseqüentemente plaqueadas em meio de diferenciação isento de so- ro. As ASCs são mantidas sob estas condições de cultura durante um perío- do adicional de 4 até 20 dias para que a diferenciação ocorra. As culturas representativas podem ser coletadas em intervalos regulares para análise. EXEMPLO 1

As ASCs humanas foram plaqueadas em meio de expansão (i-

sento de soro). Após 2-3 passagens, a população de células foi dispersa com tripsina e inoculada e uma densidade de 5.000 até 10.000 células por cm2 em placas revestidas com colágeno I. As células foram propagadas até que aproximadamente 80% de confluência fossem atingidos, em cujo tempo 15 o meio foi trocado pelo meio de diferenciação hepática [compreendido de meio de expansão isento de soro suplementado com 10 ng/ml_ de HGF, 10 ng/mL de Oncostatin M (OSM) e 0,1% de DMSO]. O meio foi trocado a cada três dias.

Os Iisados de células foram coletados em vários pontos de tem- 20 po após a diferenciação para a análise de RT-PCR ou fixos para a análise histológica de biomarcadores hepáticos. Alguns dos biomarcadores utiliza- dos para avaliar a hepatogênese in vitro incluíam: (a) a expressão de albu- mina (ALB) e α-fetoproteína (AFP) por RT-PCR; e (b) o armazenamento de glicogênio (um marcador hepático de estágio tardio analisado através da 25 coloração de PAS positiva).

A figura 2 mostra a expressão de AFP e ALB das ASCs incuba- das durante 10 dias em diferenciação média. O RNA total foi purificado par- tindo de células utilizando kits disponíveis comercialmente. 2 pg de RNA to- tal foram transcritos de forma inversa utilizando MMLV-RT com Oligo dT a 30 42 eC durante 1 hora em uma reação de 20 pL. 40 ciclos de PCR foram rea- lizados utilizando 2 pL de cDNA diluído (1:10). 5 pL dos produtos amplifica- dos foram separados em um gel de agarose a 2% e visualizados com EtBr. (Α Ciclofilina B (CycIo) foi utilizada como controle para o cDNA de entrada).

Os dados mostram que embora a albumina seja expressa na população, pouca até nenhuma AFP está presente na mesma população, que é indicati- vo de uma população de células que compreende substancialmente células- tronco hepáticas. Na verdade, acredita-se que a expressão de AFP indica a presença de células hepáticas mais maduras que podem ter sido diferencia- das partindo das células-tronco hepáticas. Uma análise adicional confirmou que estas células exibiam outros marcadores de células-tronco hepáticas, incluindo a expressão positiva de Ep-CAM e ICAM-1 e a expressão negativa de MHC de classe Ia.

A figura 3 mostra ASCs de passagem inicial [p3] inoculadas em placas de 6 poços, cultivadas até aproximadamente 80% de confluência e transferidas para meio de diferenciação hepática. Os poços individuais foram fixos no dia O (painel A) e no dia 17 (painel B) e corados em relação ao gli- cogênio (sombreamento escuro). A figura 4 mostra ainda que as células, que foram incubadas durante 18 dias em condições de diferenciação, pos- suem morfologia de hepatócito.

Tomados juntos, estes dados indicam que as ASCs podem ser diferenciadas em células-tronco hepáticas. Algumas destas células-tronco podem então maturar em hepatócitos ou células biliares, (Figura 1) mas também podem se auto-regenerar.

Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método para induzir a expressão de citocinas que podem desempenhar uma função na regeneração do fígado partindo das ASCs. Tais citocinas podem incluir HGF, VEGF, IL-6, LIF, TNFa1 Ieptina e combinações dos mesmos. A presen- te invenção fornece condições de cultura para aumentar a produção de uma ou de todas estas citocinas. Novamente, sem ficar preso ou limitado à teoria, os presentes inventores aprenderam que o uso de proteínas de matriz fibrilar (por exemplo, colágeno I), geralmente, é preferido no método de invenção uma vez que seu uso parece reproduzir melhor o ambiente in vivo das célu- las-tronco hepáticas no tecido adulto. Além disso, a incorporação do EGF isoladamente ou com ascorbato de sódio parece aumentar substancialmente a produção de citocinas sob estas condições. Fatores/condições adicionais que podem contribuir para a produção de citocinas de regeneração hepática incluem, ésteres de forbol, FGFs, heparina, hipoxia (definida como < 5% de 02) ou combinações dos mesmos.

EXEMPLO 2

As ASCs humanas foram propagadas em meio DMEM/F12 su- plementado com 3% de soro e o efeito de EGF e ascorbato difosfato de só- dio sobre a produção de citocina foi determinado. Poços em triplicata, inocu- lados a 5-10 χ 103 células por cm2 foram incubados com EGF em concen- trações de 0, 0,1, 1 ou 10 ng/mL de +/- ascorbato difosfato de sódio. Após 72 horas, o meio foi coletado para a detecção por ELISA de HGF. A figura 5 é representativa dos dados, normalizados em pg de HGF/106 células (n=3). O meio isoladamente não continha HGF. Os dados demonstram que na au- sência de EGF e ascorbato de sódio, o HGF é sintetizado em mais de 10.680 pg/106 células. Entretanto, esta produção é aumentada quase 5 ve- zes na presença de ambos os fatores.

EXEMPLO 3

As ASCs humanas não diferenciadas foram propagadas em meio DMEM/F12 suplementado com 3% de soro e 10 ng/mL de ou de qual- quer um de EGF ou bFGF. A figura 6A mostra que na presença de EGF1 as ASCs não diferenciadas expressavam HGF em níveis maiores que 3000 ng/milhão de células, o que reflete um aumento de 2 vezes em relação aos níveis da linha de base. A presença de ácido 2-fosfato ascórbico aumentou adicionalmente o efeito indutor de EGF até uma indução de 25 vezes. Sob as mesmas condições, as ASCs diferenciadas de adipócitos expressavam níveis de HGF em 2,0 e 6,3 vezes adicionais, na ausência ou na presença de ácido 2-fosfato ascórbico, respectivamente. (Figura 6B) Na presença de bFGF, a expressão de HGF pelas huASCs não diferenciadas também era estatisticamente maior. (Figura 6C) Entretanto, o bFGF falhou em afetar a expressão de HGF partindo das ASCs diferenciadas partindo de adipócitos. (Figura 6D).

A análise subseqüente do RNA total por RT-PCR demonstrou que tanto as huASCs não diferenciadas quanto diferenciadas partindo de adipócitos expressavam o receptor de bFGF e de EGF receptor, assim como o receptor de HGF (c-met) (Figura 7). Expressão de Citocinas pelas ASCs

Em adição ao HGF, as ASCs humanas secretam uma faixa am- pla de citocinas hematopoiéticas e outras funcionais. Quando induzidas com lipopolissacarídeo (LPS, 100 ng/mL), culturas de ASC de outra maneira qui- escentes exibem um nível no estado estacionário maior dos mRNAs para as interleucinas 6, 7, 8 e 11 (IL-6,-7,-8,-11); o fator inibidor de leucemia (LIF); o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF); o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); o fator estimulador de colô- nias de granulócitos (G-CSF); o Iigante de flt-3 (Flt3L) como mostrado na Figura 8 assim como o Iigante de kit (KL, também conhecido com fator de células-tronco); o fator de necrose de tumor α (TNFa); e as proteínas morfo- gênicas ósseas 2 e 4 (BMP-2, -4). Tanto as células-tronco derivadas da me- dula óssea murina quanto humana também expressam estas mesmas cito- cinas. Como mostrado na Tabela 1 abaixo e na Figura 8, as ASCs aumen- tam significativamente sua secreção de IL-6, IL-7, IL-8, GM-CSF e M-CSF dentro de um período de 24 horas após o estímulo com LPS. Tabela 1. Indução com LPS de citocinas secretadas (ELISA, pg/mL)

<table>table see original document page 11</column></row><table>

Desta maneira, as ASCs transplantadas imediatamente ou logo após um dano hepático podem melhorar a regeneração do fígado, em parte, através da liberação local de HGF e VEGF. A introdução das ASCs em um mamífero pode ser realizada através de qualquer um dos métodos conheci- dos e disponíveis na técnica, incluindo a injeção. Em um outro método de fornecimento de células, as ASCs são transplantadas no mamífero receptor através de injeção intraparenquimal ou intra-hepática após encapsulamento. O transplante de células embebidas, por exemplo, em uma matriz de algina- to, oferece várias vantagens, incluindo: (a) fornecer às células um "ambiente 3-D" que aumenta a viabilidade após o implante; (b) permitir que um número maior de células seja implantado; (c) criar um microambiente que sustenta o crescimento e a diferenciação; e (d) permitir o co-encapsulamento de fatores (por exemplo, fatores de crescimento ou vários tipos de células como descri- to anteriormente) antes do transplante.

Em adição, uma vez que as células são embebidas em um hi- drogel, são menos propensas à dispersão para outros sítios do corpo como é freqüentemente observado quando suspensões de células são utilizadas para transplantes.

Sucintamente, o encapsulamento das células é realizado utili- zando um aparato de produção de esferas eletrostáticas após a mistura das células em uma solução de alginato de sódio. As esferas são ressuspensas em PBS em uma concentração de células equivalente a aproximadamente 107 células/mL. Uma incisão para minilaparotomia é realizada utilizando uma técnica de esterilização após atingir anestesia e sedação adequadas do re- ceptor. A suspensão de células é fornecida através da injeção direta com serin- ga na periferia do tecido (o fornecimento de 0,1 ml_ é comum em camun- dongos) com hemostase conseguira através da compressão tópica. Esta técnica pode ser igualmente aplicável a seres humanos e modelos de muri- nos.

Em uma segunda metodologia de transplante, até 106 células podem ser injetadas de forma intra-esplênica após a adesão a esferas mi- croveículos Cytodex 3TM (Amersham Pharmacia). Após o transplante, as células se translocam rapidamente para as sinuosidades do fígado e podem ser detectadas no fígado dentro do período de duas horas de transplante.

Dosagem

Para seres humanos, uma "dose" de aproximadamente 3 χ 109 células ou 1% de massa do fígado quando injetada no sistema circulatório hepático é preferida com base na experiência desta dose em estudos com camundongos. Na verdade, em camundongos, é preferida uma dose de 2 milhões de células. Os níveis de doses médias e altas de 4 e 6 milhões de células, respectivamente, se baseavam nos resultados de um estudo de Ieta- lidade aguda piloto em cujos grupos de 3 camundongos NOD-SCID machos cada receberam administrações de doses de O, 2,5, 5, 10, 20 e 40 milhões de células hepáticas humanas em um volume de um mililitro. O transplante de 10, 20 e 40 milhões de células resultou em uma mortalidade de 100% e o transplante de 5 milhões de células produziu mortalidade em 1 de 3 camun- dongos dentro do período de 20 horas, enquanto 2,5 milhões de células por camundongo foram bem tolerados. A dose alta de 6 milhões de células, que seriam administradas em um volume de dose de 0,2 mL, foi selecionada porque foi considerada como sendo a dose máxima que podia ser adminis- trada sem ruptura do baço e era esperado que a maioria dos animais tole- rasse a dose (isto é, uma MTD). A dose média de 4 milhões de células é preferida como um ponto médio entre os níveis de doses baixas e altas.

Particularmente, quando seres humanos são tratados, todas as etapas de processamento devem ser conduzidas de acordo com padrões de cGMP com SOPs apropriados. As ASCs humanas são preferencialmente isoladas através da digestão com tripsina. As células poderiam ser utilizadas imediatamente ou ser criopreservadas antes do uso. As ASCs humanas, se criopreservadas, seriam descongeladas e suspensas em um meio isoosmó- tico isento de soro adequado para a infusão a uma concentração de não menos que aproximadamente 0,1 e não mais que 10 milhões de células por mL. A viabilidade das células pode ser avaliada através da exclusão com "typhan blue" ou de um ensaio equivalente. As células seriam armazenadas à temperatura ambiente ou em gelo úmido e avaliadas através da verificação microscópica em relação à evidência de qualquer formação de grumos. Se observados, as células seriam submetidas à seleção através de um filtro de trama de náilon (40 microns) e a concentração final de células seria determi- nada novamente. As células seriam infundidas de forma intravenosa em um receptor sofrendo de danos no fígado (por exemplo, causados pela exposi- ção aguda a toxinas) a uma dose de 1 até 10 milhões de células por kg de peso corporal. Os receptores seriam monitorados em relação à evidência de quaisquer reações agudas, tal como febre, calafrios ou alteração na condi- ção mental e se estas fossem observadas, seriam tratadas sintomaticamente através de prática médica padronizada. Os indivíduos seriam então monito- rados ao longo do período de 2 meses seguintes através da química do soro semanalmente para avaliar a recuperação da função hepática.

Como tal, esta invenção pode beneficiar o tratamento de várias formas de falência hepática, tanto aguda quanto crônica. A disponibilidade de ASCs humanas autólogas ou alogênicas na forma de uma célula-tronco adulta para melhorar a função hepática possui valor para pacientes sofrendo danos no fígado secundários a uma exposição a toxinas (tetracloreto de car- bono, acetaminofeno), a um agente infeccioso (hepatite, citomegalovírus) ou à excisão cirúrgica devido à metástase de tumor ou trauma. A capacidade das ASCs humanas de se diferenciar em hepatócitos funcionais e/ou de Iibe- rar fatores de crescimento que sustentam a proliferação e a diferenciação progenitores de hepatócitos endógenos pode fornecer um mecanismo para melhorar e acelerar a recuperação da função hepática nestas condições.

Embora a invenção tenha sido descrita em associação com as modalidades específicas da mesma, será entendido que é capaz de sofrer modificações adicionais e é pretendido que este pedido de patente cubra quaisquer variações, usos ou alterações da invenção a seguir. Em geral, os princípios da invenção e inclusive tais variações da presente divulgação co- mo em relação à prática conhecida ou costumeira dentro da técnica à qual pertence a invenção e como podem ser aplicados às características essen- ciais apresentadas aqui antes e como a seguir no âmbito das reivindicações anexas.

Claims

1. Processo de derivação de células-tronco hepáticas partindo de células-tronco não hepáticas caracterizado pelo fato de que que compre- ende: (a) o fornecimento de células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático; e (b) o cultivo das células-tronco sobre uma matriz extracelular que compreende pelo menos uma proteína de matriz fibrilar e em meio de cultura isento de soro que compreende fator de crescimento hepático (HGF), em que as células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático se diferenciam em células-tronco hepáticas.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que que o tecido sem ser hepático é tecido adiposo.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido sem ser hepático é tecido de um mamífero adulto.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma proteína de matriz fibrilar é selecionada do grupo que consiste de colágeno I e colágeno III.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4 em que a pelo me- nos uma proteína de matriz fibrilar é colágeno I.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende ainda Oncostatin M, DMSO ou ambos.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz extracelular compreende ainda fibronectina, matrigel, vitrogen ou combinações dos mesmos.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que mais de aproximadamente 70% das células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático se diferenciam em células-tronco hepáticas.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático eram adicionalmente derivadas da passagem em cultura.

10. Processo de indução da expressão de HGF partindo de célu- las-tronco não hepáticas caracterizado pelo fato de que compreende: (a) o fornecimento de células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático; e (b) o cultivo das células-tronco sobre uma matriz extracelular que compreende pelo menos uma proteína de matriz fibrilar e em meio de cultura isento de soro que compreende EGF, bFGF ou ambos, em que as células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático produzem HGF.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende EGF e bFGF.

12. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende ainda difosfato ascórbico de sódio.

13. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende ainda difosfato ascórbico de sódio.