BRPI0711093A2

BRPI0711093A2 - composto, composição farmacêutica, uso de um composto, métodos para o tratamento de um doença, e para a produção de um composto, cepa engenheirada, e uso de uma cepa engenheirada

Info

Publication number: BRPI0711093A2
Application number: BRPI0711093-6A
Authority: BR
Inventors: Christine Martin; Ming Zhang; Nigel Coates; William Vousden; Steven Moss; Sabine Gaisser
Original assignee: Biotica Tech Ltd
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2007-05-09
Publication date: 2011-08-23
Also published as: AU2007247121A1; EP1928837A2; WO2007128829A3; US20090253667A1; JP2009536181A; WO2007128829A2; KR20090005376A; CA2651558A1; MX2008014278A

Abstract

COMPOSTO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, USO DE UM COMPOSTO, METODOS PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENçA, E PARA A PRODUçãO DE UM COMPOSTO, CEPA ENGENITEIRADA, E, USO DE UMA CEPA ENGENREIRADA A presente invenção refere-se a análogos de 18,21- didesoximacbecina que são úteis, p. ex., no tratamento de câncer, malignidades de células B, malária, infecção fúngica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes e/ou como um pré-tratamento profilático para câncer. A presente invenção também proporciona métodos para a produção destes compostos e seu uso na medicina, em particular no tratamento e/ou profilaxia de câncer ou malignidades de células B.

Description

"COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UMCOMPOSTO, MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENÇA,E PARA A PRODUÇÃO DE UM COMPOSTO, CEPA ENGENHEIRADA,E, USO DE UMA CEPA ENGENHEIRADA"

Fundamentos da invenção

A proteína de choque térmico de 90 kDa (Hsp90, 90 kDa) éuma guia molecular abundante envolvida na dobragem e montagem deproteínas, muitas das quais estão envolvidas em vias de transdução de sinal(para revisões ver Neckers, 2002; Sreedhar et al., 2004a; Wegele et al., 2004 ereferências ali contidas). Desde que aproximadamente 50 destas assim-chamadas proteínas-clientes tenham sido identificadas e incluam receptoresde esteróides, tirosina quinases não-receptoras, p. ex. família src, quinasesdependentes de ciclina, p. ex., cdk4 e cdkó, o regulador de transmembranacístico, óxido nítrico sintase e outros (Donzé e Picard, 1999; McLaughlin etal., 2002; Chiosis et al., 2004; Wegele et al., 2004;http://www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf). Adicionalmente,Hsp90 desempenha um papel-chave na resposta ao estresse e proteção dacélula contra os efeitos da mutação (Bagatell e Whitesell, 2004; Chiosis et al.,2004). A função da Hsp90 é complicada e envolve a formação de complexosde multi-enzimas dinâmicos (Bohen, 1998; Liu et al., 1999; Young et al.,2001; Takahashi et al., 2003; Sreedhar et al., 2004; Wegele et al., 2004).Hsp90 é um alvo para inibidores (Fang et al., 1998; Liu et al., 1999;Blagosklonny, 2002; Neckers, 2003; Takahashi et al., 2003; Beliakoff eWhitesell, 2004; Wegele et al., 2004) resultando na degradação de proteínas-clientes, desregulação do ciclo celular e apoptose. Mais recentemente, Hsp90foi identificada como um importante mediador extracelular para invasão detumor (Eustace et al., 2004). Hsp90 foi identificada como um novo alvoterapêutico importante para terapia de câncer que se reflete na pesquisaintensa e detalhada sobre a função da Hsp90 (Blagosklonny et al., 1996;Neckers, 2002; Workman e Kaye, 2002; Beliakoff e Whitesell, 2004; Harriset al., 2004; Jez et ai., 2003; Lee et al., 2004) e o desenvolvimento de ensaiosde seleção de alta vazão (Carreras et al., 2003; Rowlands et al., 2004).Inibidores de Hsp90 incluem classes de compostos, como ansamicinas,macrólidos, purinas, pirazóis, antibióticos de cumarina e outros (para umarevisão ver Bagatell e Whitesell, 2004; Chiosis et al., 2004 e referências alicontidas).

As ansamicinas benzenóides são uma ampla classe deestruturas químicas caracterizadas por um anel alifático de comprimentovariável conjugado de cada lado de uma estrutura de anel aromático.Ansamicinas naturalmente ocorrentes incluem: macbecina e 18,21-diidromacbecina (também conhecida como macbecina I e macbecina II,respectivamente) (1 & 2; Tanida et al., 1980), geldanamicina (3; DeBoer etal., 1970; DeBoer e Dietz, 1976; WO 03/106653 e referências ali contidas), ea família de herbimicinas (4; 5, 6, Omura et al., 1979, Iwai et al., 1980 eShibata et al, 1986a, WO 03/106653 e referências ali contidas).

<formula>formula see original document page 3</formula>

Ansamicinas foram identificadas originalmente com base emsua atividade antibacteriana e antiviral, no entanto, recentemente sua utilidadepotencial como agentes anticâncer tornou-se de maior importância (Beliakoffe Whitesell, 2004). Muitos inibidores de Hsp90 estão sendo avaliadoscorrentemente em ensaios clínicos (Csermely e Soti, 2003; Workman, 2003).Em particular, a geldanamicina apresenta potência nanomolar e aparenteespecificidade por células de tumor dependentes de proteína quinase aberrante(Chiosis et al., 2003; Workman, 2003).

Mostrou-se que tratamento com inibidores de Hsp90 acentua aindução de morte de células de tumor por meio de radiação e capacidadescrescentes de eliminação de células (p. ex. câncer de mama, leucemiamielóide crônica e câncer do pulmão de células não-pequenas) por meio decombinação de inibidores de Hsp90 com agentes citotóxicos também foidemonstrado (Neckers, 2002; Beliakoff e Whitesell, 2004). O potencial paraatividade anti-angiogênica também é interessante: a proteína cliente Hsp90HIF-Iα desempenha um papel-chave na progressão de tumores sólidos (Huret al., 2002; Workman e Kaye, 2002; Kaur et al., 2004).

Inibidores de Hsp90 também funcionam comoimunossupressivos e estão envolvidos na Iise induzida por complemento devários tipos de células de tumor após inibição de Hsp90 (Sreedhar et al.,2004). Tratamento com inibidores de Hsp90 também pode resultar emprodução de superóxido induzida (Sreedhar et al., 2004a) associada com Iisemediada por células imunes (Sreedhar et al., 2004). O uso de inibidores deHsp90 como drogas potenciais anti-maláricas também foi discutido (Kumar etal., 2003). Adicionalmente, mostrou-se que a geldanamicina interfere com aformação de proteína de príon mamífera glicosilada complexa PrPc(Winklhofer et al., 2003).

Como descrito acima, ansamicinas são de interesse comocompostos potencial anticâncer e anti-malignidade de células B, no entanto,as ansamicinas correntemente obteníveis apresentam baixas propriedadesfarmacológicas ou farmacêuticas, por exemplo, elas apresentam baixasolubilidade em água, baixa estabilidade metabólica, baixa disponibilidade oubaixa capacidade de formulação (Goetz et al., 2003; Workman 2003; Chiosis2004). Ambas, herbimicina A e geldanamicina, foram identificadas comocandidatos fracos para ensaios clínicos devido a sua forte hepatotoxicidade(revisão Workman, 2003) e a geldanamicina foi retirada de ensaios clínicos deFase I devido à hepatotoxicidade (Supko et al., 1995; WO 03/106653).

A Geldanamicina foi isolada de filtrados de cultura deStreptomyces hygroscopicus e mostra forte atividade in vitro contraprotozários e fraca atividade contra bactérias e fungos. Em 1994 mostrou-se aassociação da geldanamicina com Hsp90 (Whitesell et al., 1994). Oaglomerado de genes biossintéticos para geldanamicina foi clonado eseqüenciado (Allen e Ritchie, 1994; Rascher et al., 2003; WO 03/106653). Aseqüência de DNA é obtenível sob o número de acesso do NCBI (CentroNacional para Informação de Biotecnologia, ou National Center forBiotechnology Information) AYl 79507. O isolamento de cepas produtoras degeldanamicina manipuladas geneticamente derivadas de S. hygroscopicussubespécie duamyceticus JCM4427 e o isolamento de 4,5-diidro-7-0-descarbamoil-7-hidroxigeldanamicina e 4,5-diidro-7-0-descarbamoil-7-hidróxi-17-O-demetilgeldanamicina foram descritos recentemente (Hong etal., 2004). Introduzindo-se geldanamicina na cepa produtora de herbimicinaStreptomyces hygroscopicus AM-3672 os compostos 15-hidroxigeldanamicina, o análogo de geldanamicina tricíclico KOSN-1633 emetil-geldanamicinato foram isolados (Hu et al., 2004). Os dois compostos17-formil-17-demetóxi-18-0-21 -O-diidrogeldanamicina e 17-hidroximetil-17-desmetoxigeldanamicina foram isolados de S. hygroscopicus K279-78. S.hygroscopicus K279-78 é S. hygroscopicus NRRL 3602 contendo cosmídeopKOS279-78 que apresenta um inserto de 44 kbp que contém diversos genesda cepa produtora de herbimicina Streptomyces hygroscopicus AM-3672 (Huet al., 2004). Substituições de domínios de aciltransferase foram realizadas emquatro dos módulos da policetídeo sintase do aglomerado biossintético dageldanamicina (Patel et al., 2004). Substituições de AT foram realizados nosmódulos 1, 4 e 5 levando aos análogos totalmente processados 14-desmetil-geldanamicina, 8-desmetil-geldanamicina e 6-desmetóxi-geldanamicina e a4,5-diidro-6-desmetóxi-geldanamicina não totalmente processada. Asubstituição do módulo 7 AT leva à produção de três compostos 2-desmetilacompostos, KOSNl 619, KOSN1558 e KOSN1559, um dos quais(KOSN1559), um derivado de 2-dimetil-4,5-diidro-17-demetóxi-21-deóxi dageldanamicina, leva a Hsp90 com uma afinidade de ligação 4 vezes maior doque a geldanamicina e uma afinidade de ligação 8 vezes maiores do que 17-AAG. No entanto, isto não é refietivo em um aperfeiçoamento na medição deIC50 usando SKBr3. Outro análogo, uma geldanamicina não-benzoquinóideinédita, denominada KOS-1806 apresenta uma estrutura monofenólica(Rascher et al., 2005). Não se forneceu dados de atividade para KOS-1806.

Em 1979 o antibiótico ansamicina herbimicina A foi isoladodo caldo de fermentação da cepa de Streptomyces hygroscopicus n° AM-3672e denominada de acordo com sua potente atividade herbicida. A atividadeantitumor foi estabelecida usando-se células de uma linha de rim de ratoinfectada com uma quantidade, sensível a temperatura, de vírus do sarcomade Rous (RSV, Rous sarcoma virus) para selecionar drogas que reverteram amorfologia transformada destas células (para uma revisão ver Uehara, 2003).Postulou-se que a herbimicina A atua primariamente através da ligação comproteínas de guia de Hsp90, mas a ligação direta com os radicais cisteínaconservados e subseqüente inativação de quinases também foi discutida(Uehara, 2003).

Derivados químicos foram isolados, e compostos comsubstituintes alterados em C19 do núcleo de benzoquinona e compostoshalogenados na cadeia ansa apresentaram menos toxicidade e maioresatividades antitumor do que a herbimicina A (Omura et al., 1984; Shibata etal., 1986b). A seqüência do aglomerado de genes biossintéticos deherbimicina foi identificada no WO 03/106653 e em um documento recente(Rascher et al., 2005).

Os compostos de ansamicina macbecina (1) e 18,21-diidromacbecina (2) (C-14919E-1 e C-14919E-1), identificados por suaatividade antifungica e antiprotozoária, foram isolados dos sobrenadantes decultura de Nocardia sp No. C-14919 (Actinosynnema pretiosum subespéciepretiosum ATCC 31280) (Tanida et al., 1980; Muroi et al., 1980; Muroi et al.,1981; US 4.315.989 e US 4.187.292). 18,21-Diidromacbecina é caracterizadapor conter a forma diidroquinona do núcleo. Ambas, macbecina e 18,21-diidromacbecina, mostraram possuir atividades antibacterianas e antitumorsimilares contra linhas de células de câncer, como a linhas de células deleucemia murina P388 (Ono et al., 1982). Atividades de transcriptaseinvertida e de desoxinucleotidil transferase terminal não foram inibidas pelamacbecina (Ono et al., 1982). A função inibidora de Hsp90 da macbecina foireportada na literatura (Bohen, 1998; Liu et al., 1999). A conversão demacbecina e 18,21-diidromacbecina após adição de um caldo de culturamicrobiana em um composto com um grupo hidróxi em lugar de um grupometóxi numa determinada posição ou posições encontra-se descrita naspatentes US 4.421.687 e US 4.512.975.

Durante uma seleção de uma ampla variedade demicroorganismos do solo, os compostos TAN-420A a E foram identificadosde cepas produtoras pertencentes ao gênero Streptomyces (7-11, EP 0 110710).<formula>formula see original document page 8</formula>

Em 2000 descreveu-se o isolamento do metabólito deansamicina não-benzoquinona, relacionada com geldanamicina, reblastatinadas culturas de células de Streptomyces sp. S6699 e seu valor terapêuticopotencial no tratamento de artrite reumatóide (Stead et al., 2000).

Um inibidor de Hsp90 adicional, diferente das ansamicinas debenzoquinona quimicamente não-relacionadas é o Radicicol (monorden) quefoi descoberto originalmente em virtude de sua atividade antifungica do fungoMonosporium bonorden (para uma revisão ver Uehara, 2003) e verificou-seque a estrutura é idêntica ao macrólido de 14 membros isolado de Nectriaradicicola. Adicionalmente a sua atividade antifungica, antibacteriana, anti-protozoária e atividade citotóxica, ele foi identificado subseqüentementecomo um inibidor de proteínas de guia de Hsp90 (para uma revisão verUehara, 2003; Schulte et al., 1999). A atividade anti-angiogênica do radicicol(Hur et al., 2002) e de seus derivados semi-sintéticos (Kurebayashi et al.,2001) também foi descrita.

Interesse recente focalizou derivados 17-amino dageldanamicina como uma nova geração de compostos anticâncer deansamicina (Bagatell e Whitesell, 2004), por exemplo, 17-(alilamino)-17-desmetóxi geldanamicina (17-AAG, 12) (Hostein et al., 2001; Neckers, 2002;Nimmanapalli et al., 2003; Vasilevskaya et al., 2003; Smith-Jones et al.,2004) e 17-desmetóxi-17-N,N-dimetilaminoetilamino-geldanamicina (17-DMAG, 13) (Egorin et al., 2002; Jez et al., 2003). Mais recentemente, ageldanamicina foi derivatizada na posição 17 para criar amidas de 17-geldanamicina, carbamatos, uréias e 17-arilgeldanamicina (Le Brazidec et al.,2003). Reportou-se acerca de uma biblioteca de mais do que sessentaanálogos de 17-alquilamino-17-desmetoxigeldanamicina, que foi testadaquanto a sua afinidade por Hsp90 e solubilidade em água (Tian et al., 2004).Uma abordagem adicional para reduzir a toxicidade da geldanamicina é aobjetivação seletiva e o fornecimento de um composto ativo de geldanamicinaem células malignas por meio de conjugação com um anticorpo monoclonalobjetivador de tumor (Mandler et al., 2000).

<formula>formula see original document page 9</formula>

Embora muitos destes derivados apresentem reduzidahepatotoxicidade, eles ainda apresentam apenas limitada solubilidade emágua. Por exemplo, 17-AAG requer o uso de um veículo solubilizador (p. ex.,Cremophore®, DMSO-lecitina de ovo) que, por si só, pode resultar em efeitossecundários em alguns pacientes (Hu et al., 2004).

A maior parte da classe ansamicina de inibidores de Hsp90porta a porção estrutural comum: a benzoquinona que é um receptor deMichael que pode formar facilmente ligações covalentes com nucleófilos,como proteínas, glutationa, etc. A porção benzoquinona também sofreequilíbrio redox com diidroquinona, durante o qual formam-se radicaisoxigênio, que dão origem a toxicidade não específica adicional (Dikalov etal., 2002). Por exemplo, tratamento com geldanamicina pode resultar emprodução de superóxido induzida (Sreedhar et al., 2004a).

Portanto, permanece uma necessidade de identificar derivadosde ansamicina inéditos, que podem apresentar utilidade no tratamento decâncer e/ou de malignidades de células B, de preferência, referidasansamicinas têm melhorado a solubilidade em água, um perfil farmacológicoaperfeiçoado e/ou reduzido perfil de efeitos secundários para administração.A presente invenção revela análogos de ansamicina inéditos gerados por meiode biotransformação e opcionalmente manipulação genética da cepa produtoraparental. Em particular, a presente invenção revela análogos de 18,21-didesoximacbecina inéditos, que geralmente apresentam propriedadesfarmacêuticas aperfeiçoadas em comparação com as ansamicinaspresentemente obteníveis; em particular, espera-se que apresentemaperfeiçoamentos com relação a uma ou mais das propriedades a seguir:atividade contra diferentes subtipos de câncer, toxicidade, solubilidade emágua, estabilidade metabólia, biodisponibilidade e capacidade de formulação.De preferência, os análogos de 18,21-didesoximacbecina apresentambiodisponibilidade aperfeiçoada.

Sumário da invenção

Na presente invenção, unidades iniciadoras não naturais foramintroduzidas em uma cepa produtora de macbecina, opcionalmente emcombinação com deleção ou inativação objetivada dos genes responsáveispelas modificações pós-PKS da macbecina para produzir análogos demacbecina inéditos formados por meio de incorporação de uma unidadeiniciadora não natural. Especificamente, nós descrevemos análogos demacbecina inéditos formados por meio de incorporação de uma unidadeiniciadora que resulta em uma porção de benzeno que, ou não é substituídanas posições 17, 18 e 21 ou que é substituída em parte de, ou em todas, estasposições por flúor. Opcionalmente os genes ou reguladores responsáveis pelabiossíntese da unidade iniciadora podem ser manipulados por meio de deleçãoou inativação objetivada ou modificados por outros meios, como exposição decélulas a radiação UV e seleção do fenótipo, indicando que a biossíntese daunidade iniciadora foi interrompida. A objetivação opcional dos genes pós-PKS pode°Correr via uma variedade de mecanismos, p. ex., por meio deintegração, deleção objetivada de uma região do aglomerado de macbecinaincluindo todos ou alguns dos genes pós-PKS opcionalmente seguido deinserção de gene(s) outros métodos de tornar os genes pós-PKS ou suasenzimas codificadas não-funcionais, p. ex., inibição química, mutagênesedirigida para sítio ou mutagênese da célula, por exemplo, por meio do uso deradiação UV. Como um resultado, a presente invenção proporciona análogosde 18,21-didesoximacbecina, métodos para a preparação destes compostos, emétodos para o uso destes compostos na medicina ou como intermediários naprodução de compostos adicionais.

proporciona análogos de macbecina que não apresentam a unidade de partidausual, e que, ao invés, apresentam incorporada uma unidade iniciadora queresultados em análogos de 18,21-didesoximacbecina que, ou não sãosubstituídos nas posições 17, 18 e 21 ou que são substituídos em algumas ouem todas estas posições por flúor.

proporciona análogos de 18,21-didesoximacbecina de acordo com a fórmula(!) abaixo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmos:

Portanto, em um primeiro aspecto a presente invenção

Em um aspecto mais específico a presente invençãoR-2 representa H ou Me;

R3 representa H ou CONH2;

R4 e R5 representam, ambos, H ou, em conjunto, representamuma ligação (i.e. de C4 a C5 é uma ligação dupla);

R6 representa H ou F;

R7 representa H ou F; e

R8 representa H ou F.

Análogos de 18,21-didesoximacbecina também são referidosaqui como "compostos da invenção", referidos termos são usados aqui deforma intercambiável.

A estrutura acima mostra um tautômero representativo e ainvenção abrange todos os tautômeros dos compostos de fórmula (I), porexemplo, compostos ceto em que compostos enol são ilustrados e vice versa.

A invenção compreende todos os estereoisômeros doscompostos definidos pela estrutura (I) como mostrado acima.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporcionaanálogos de 18,21-didesoximacbecina, como compostos de fórmula (I) ou umsal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, para uso como umfarmacêutico.

Definições

Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para referir a um oumais do que um (i.e. pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. Atítulo de exemplo "um análogo" significa um análogo ou mais do que umanálogo.

Como usado aqui o termo "análogo(s)" refere-se a compostosquímicos que são estruturalmente similares entre si mas que diferemligeiramente no que se refere à composição (como na substituição de umátomo por outro ou na presença ou ausência de um grupo particular).

Como usado aqui, o termo "homólogo(s)" refere-se a umhomólogo de um gene ou de uma proteína codificada por um gene aquidivulgado de, ou um aglomerado biossintético de macbecina alternativo deuma cepa diferente produtora de macbecina ou um homólogo de umaglomerado de genes biossintéticos de ansamicina alternativo, p. ex., degeldanamicina, herbimicina ou reblastatina. Referido(s) homólogo(s)codifica(m) uma proteína que realiza a mesma função ou pode realizar, elaprópria, a mesma função que referido gene ou proteína na síntese demacbecina ou de um policetídeo de ansamicina relacionado. De preferência,referido(s) homólogo(s) apresenta(m) pelo menos 40 % de identidade deseqüências, de preferência, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos80 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % de identidade de seqüência coma seqüência do gene particular aqui divulgado (Tabela 3, SEQ DD NO: 11 queé uma seqüência de todos os genes no aglomerado, de que as seqüências degenes particulares podem ser deduzidas). O percentual de identidade pode sercalculado usando-se um programa conhecido por uma pessoa com prática naarte, como BLASTn ou BLASTp, obtenível no endereço da rede mundial decomputadores (website) do NCBI.

Como usado aqui, o termo "câncer" refere-se a um novocrescimento de células, que pode ser benigno ou maligno, na pele ou emórgãos do corpo, por exemplo, mas sem limitação, mama, próstata, pulmão,rim, pâncreas, cérebro, estômago ou intestino. Um câncer tende a infiltrar-seno tecido adjacente e disseminar-disseminar-se (sofrer metástase) para órgãosdistantes, por exemplo, para ossos, fígado, pulmão ou o cérebro. Como usadoaqui, o termo câncer inclui tanto tipos de células de tumor metastático, como,embora sem limitação, melanoma, linfoma, leucemia, fibrossarcoma,rabdomiossarcoma, e mastocitoma e tipos de carcinoma dos tecidos, como,embora sem limitação, câncer colo-retal, câncer da próstata, câncer do pulmãode células pequenas e câncer do pulmão de células não-pequenas, câncer demama, câncer pancreático, câncer da bexiga, câncer renal, câncer gástrico,gliobastoma, câncer de fígado primário e câncer ovariano.

Como usado aqui o termo "malignidades de células B" incluium grupo de distúrbios que incluem leucemia linfocítica crônica (CLL),mieloma múltiplo, e linfoma não-Hodgkin (NHL). Eles são doençasneoplásticas do sangue e órgãos formadores de sangue. Eles causamdisfunção da medula óssea e do sistema imune, que torna o hospedeiroaltamente suscetível a infecção e sangramento.

Como usado aqui, o termo "biodisponibilidade" refere-se aograu em que, ou à taxa em que um medicamento outra substância é absorvidaou torna-se disponível no sítio de atividade biológica após administração. Estapropriedade é dependente de uma variedade de fatores incluindo asolubilidade do composto, taxa de absorção no intestino, a extensão daligação de proteína e metabolismo etc. Vários testes para biodisponibilidadeque poderiam ser familiares para uma pessoa com prática na arte sãodescritos, por exemplo, por Egorin et al. (2002).

O termo "solubilidade em água" como usado nesta aplicaçãorefere-se à solubilidade em meio aquoso, p. ex., solução salina tamponadacom fosfato (PBS) em pH 7,3. Um ensaio exemplar de solubilidade em água éapresentado nos Exemplos abaixo.

O termo "cepa produtora de macbecina" como usado nestaaplicação refere-se a cepas, por exemplo, cepas de tipo selvagem comoexemplificado por A pretiosum e A mirum, que produzem macbecina quandocultivados em condições vantajosas, por exemplo, quando introduzidos naalimentação de partida natural de ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico.

Como usado aqui, o termo "gene(s) pós-PKS" refere-se aosgenes requeridos para modificações de pós-policetídeo sintase do policetídeo,por exemplo, mas sem limitação, monooxigenases, O-metiltransferases ecarbamoiltransferases. Especificamente, no sistema de macbecina estes genesmodificadores incluem mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450.Como usado aqui, o termo "gene(s) de biossíntese da unidadeiniciadora" refere-se aos genes requeridos para a produção da unidadeiniciadora naturalmente incorporada, ácido 3-amino-5-hidroxibenzóico(AHBA). Especificamente, no sistema de macbecina estes genes debiossíntese da unidade iniciadora incluem AHk (AHBA quinase), Adh (aDHQaesiaroquinase), AHs (AHBA sintase), OX (oxidorredutase), PH (fosfatase).Outras cepas que produzem AHBA também contêm genes de biossíntese deAHBA.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos dainvenção, como os compostos de fórmula (I) incluem sais convencionaisformados de bases ou ácidos orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamenteaceitáveis e também sais de adição de ácido de amônio quaternário. Exemplosmais específicos de sais de ácidos vantajosos incluem clorídrico, bromídrico,sulfürico, fosfórico, nítrico, perclórico, fumárico, acético, propiônico,succínico, glicólico, fórmico, láctico, maléico, tartárico, cítrico, palmóico,malônico, hidroximaléico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico,fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, naftaleno-2-sulfônico,benzenossulfônico hidroxinaftóico, iodídrico, málico, esteróico, tânico eanálogos. Outros ácidos, como oxálico, embora não sejam, eles próprios,farmaceuticamente aceitáveis, podem ser úteis na preparação de sais úteiscomo intermediários na obtenção dos compostos da invenção e seus saisfarmaceuticamente aceitáveis. Exemplos mais específicos de sais básicosvantajosos incluem sais de sódio, lítio, potássio, magnésio, alumínio, cálcio,zinco, Ν,Ν'-dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina,etilenodiamina, N-metilglucamina e procaína. Referências a seguir a umcomposto de acordo com a invenção incluem tanto compostos de fórmula (I)como também seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Como usado aqui os termos "18,21-diidromacbecina" e"macbecina II" (a forma diidroquinona da macbecina) são usada de formaintercambiável.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1: Representação da biossíntese da macbecinamostrando o primeiro intermediário livre de enzima putativa, pré-macbecina eo processamento pós-PKS a macbecina. A lista de etapas de processamento dePKS na figura não se destina a representar a ordem de eventos. Asabreviaturas a seguir são usadas para genes particulares no aglomerado: ALO -domínio de carregamento AHBA; ACP - proteína de suporte de acila; KS -β-cetosinase; AT - acil transferase; DH - desidratase; ER - enoil redutase; KR- β-cetorredutase.

Figura 2: Ilustração dos sítios de processamento pós-PKS depré-macbecina para dar macbecina.

Figura 3: Representação diagramática da geração da cepaengenheirada BIOT-3806 em que o plasmídeo pLSS308 foi integrado nocromossoma por meio de recombinação homóloga resultando em disrupçãodo gene mbcM.

Figura 4: Representação diagramática da construção dadeleção na-matriz de mbcM descrita no exemplo 2.

Figura 5: A - mostra a seqüência do produto de PCRPCRwv308, SEQ ID NO: 16

B - mostra a seqüência do produto de PCR PCRwv309, SEQID NO: 19

Figura 6: A - mostra a seqüência de DNA resultante dadeleção na-matriz de 502 aminoácidos em mbcM como descrito no exemplo 3(SEQ ID NO: 20 e 21),

Chave: 1-21 bp codifica ponta 3' da fosfatase da biossíntese doácido 3-amino-5-hidroxibenzóico, 136-68 bp codifica a proteína de deleção dembcM, 161-141 bp codifica ponta 3' de mbcF.

B: mostra a seqüência de aminaturalmente ocorrentes daproteína (SEQ ID NO: 22). A seqüência de proteínas é gerada do filamento decomplemento mostrado na Figura 6A.

Figura 7: Representação diagramática da geração de uma cepade Actinosynnema pretiosum em que os genes mbcP, mbcP450, mbcMTl embcMT2 foram deletados na matriz.

Figura 8: Seqüência do produto de PCR amplificado l+2a(SEQ ID NO: 25)

Figura 9: Seqüência do produto de PCR amplificado 3b+4(SEQ ID NO: 28)

Figura 10:Estruturas dos compostos( 14-20) produzidos nos

Exemplos.

Descrição da invenção

A presente invenção proporciona análogos de 18,21-didesoximacbecina, como indicado acima, métodos para a preparação destescompostos, métodos para o uso destes compostos na medicina e o uso destescompostos como intermediários ou modelos para derivatização semi-sintéticaadicional ou para derivatização por meio de métodos de biotransformação.

De maneira vantajosa R1 representa H ou OH. Em umaconcretização Ri representa H. Em outra concretização Ri representa OH.

De maneira vantajosa R2 representa H.

De maneira vantajosa R3 representa CONH2.

Em uma concretização, de maneira vantajosa, R4 e R5representam, em conjunto, uma ligação.

Em outra concretização, de maneira vantajosa R4 e R5, cadaum, representam H.

Em um conjunto exemplar de compostos R6, R7 e R8, todos,representam hidrogênio.

Em outro conjunto exemplar de compostos R6, R7 e R8' todos,não representam hidrogênio.Em uma concretização, R1 representa H, R2 representa H, R3representa CONH2 e R4 e R5 representam, cada um, H.

Em outra concretização, R1 representa OH, R2 representa H, R3representa CONH2 e R4 e R5 representam, cada um, H.

Em uma concretização vantajosa da invenção R1 representa H,R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um, H, R6,R7 e R8 representam, cada um, H.

Em uma concretização vantajosa da invenção R1 representaOH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um,H, R6, R7 e R8 representam, cada um, H.

Em uma concretização vantajosa da invenção R1 representa H,R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um, H, R6representa F e R7 e R8 representam, cada um, H.

Em outra concretização vantajosa da invenção R1 representaOH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um,H, R6 representa F e R7 e R8 representam, cada um, H.

Em outra concretização vantajosa da invenção R1 representaH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um, H,R6 representa H, R7 representa F e R8 representa H.

Em outra concretização vantajosa da invenção R1 representaOH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um,H, R6 representa H, R7 representa F e R8 representa H.

Em outra concretização vantajosa da invenção R1 representaH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um, H,R6 e R7 representam, cada um, F e R8 representa H, por exemplo, comorepresentado na estrutura a seguir,<formula>formula see original document page 19</formula>

Em outra concretização vantajosa da invenção R1 representaOH, R2 representa Η, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um,H, R6 e R7 representam, cada um, F e R8 representa H.

Em outra concretização vantajosa da invenção R1 representaH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 e R5 representam, cada um, H,R6, R7 e R8 representam, cada um, F.

A estereoquímica preferida das cadeias laterais não-hidrogêniocom relação ao anel ansa é como mostrado nas Figuras 1 e 2 abaixo (ou seja,a estereoquímica preferida segue aquela da macbecina).

A presente invenção também proporciona o uso de um análogode 18,21-didesoximacbecina como um substrato para modificação adicionalseja por biotransformação ou por química sintética.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um análogode 18,21-didesoximacbecina para uso como um medicamento. Em umaconcretização adicional a presente invenção proporciona um análogo de18,21-didesoximacbecina para uso no tratamento de câncer, malignidades decélulas B, malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central edoenças neurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doençasautoimunes e/ou como um pré-tratamento profilático para câncer.Em outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso deum análogo de 18,21-didesoximacbecina na fabricação de um medicamento.Em uma concretização adicional, a presente invenção proporciona o uso deum análogo de 18,21-didesoximacbecina na fabricação de um medicamentopara o tratamento dê câncer, malignidades de células B, malária, infecçãofungica, doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas,doenças dependentes de angiogênese, doenças autoimunes e/ou como um pré-tratamento profilático para câncer.

Em uma concretização adicional, a presente invençãoproporciona um método de tratamento de câncer, malignidades de células B,malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doençasneurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doençasautoimunes e/ou um pré-tratamento profilático para câncer, sendo quereferido método compreende administrar a um paciente que disto necessitauma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo de 18,21-didesoximacbecina.

Como indicado acima, pode-se esperar que compostos dainvenção sejam úteis no tratamento de câncer e/ou malignidades de células B.Compostos da invenção também podem ser efetivos no tratamento de outrasindicações, por exemplo, embora sem limitação, malária, infecção fungica,doenças do sistema nervoso central e doenças neurodegenerativas, doençasdependentes de angiogênese, doenças autoimunes, como artrite reumatóide oucomo um pré-tratamento profilático para câncer.

Doenças do sistema nervoso central e doençasneurodegenerativas incluem, embora sem limitação, mal de Alzheimer, malde Parkinson, doença de Huntington, doenças de príon, atrofia muscularbulbar e espinhal (SBMA) e esclerose lateral amiotrófica (ALS).

Doenças dependentes de angiogênese incluem, embora semlimitação, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabéticae diversas outras distúrbios oftálmicas, aterosclerose e artrite reumatóide.

Doenças autoimunes incluem, embora sem limitação, artritereumatóide, esclerose múltipla, diabetes de tipo I, lúpus eritematoso sistêmicoe psoríase,

"Paciente" abrange sujeitos humanos e outros animais(particularmente mamíferos), de preferência, sujeitos humanos. Assim, osmétodos e usos dos análogos de 18,21-didesoximacbecina da invenção sãoúteis na medicina humana e veterinária, de preferência, medicina humana.

Os compostos previamente indicados da invenção ou umaformulação dos mesmos podem ser administrados por meio de qualquermétodo convencional, por exemplo, mas sem limitação, eles podem seradministrados parenteralmente (incluindo administração intravenosa),oralmente, topicamente (incluindo administração bucal, sublingual outransdérmica), via um dispositivo médico (p. ex., um stent), por meio deinalação, ou via injeção (subcutânea ou intramuscular). O tratamento podeconsistir de uma dose única ou uma pluralidade de doses ao longo de umdeterminado período.

Embora seja possível administrar sozinho um composto dainvenção, é preferível apresentá-lo como uma formulação farmacêutica,juntamente com um ou mais veículos ou diluentes aceitáveis. Assim,proporciona-se uma composição farmacêutica compreendendo um compostoda invenção juntamente com um ou mais veículos ou diluentesfarmaceuticamente aceitáveis. O(s) diluente(s) ou veículo(s) precisa(m) ser"aceitáveis" no sentido de serem compatíveis com o composto da invenção enão prejudiciais aos seus recipientes. Exemplos de veículos vantajosos sãodescritos mais detalhadamente abaixo.

Os compostos da invenção podem ser administrados sozinhosou em combinação com outros agentes terapêuticos. A co-administração dedois (ou mais) agentes pode permitir usar doses significativamente menoresde cada um, reduzindo com isto os efeitos secundários obsevados. Elatambém poderia permitir a ressensibilização de uma doença, como câncer,para os efeitos de uma terapia prévia à qual a doença se tornou resistente.Proporciona-se também uma composição farmacêutica compreendendo umcomposto da invenção e um agente terapêutico adicional juntamente com umou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona ouso de um composto da invenção em terapia de combinação com um segundoagente, p. ex., um segundo agente para o tratamento de câncer oumalignidades de células B, como um agente citotóxico ou citostático.

Em uma concretização, um composto da invenção écoadministrado com outro agente terapêutico, p. ex., um agente terapêutico,como um agente citotóxico ou citostático para o tratamento de câncer oumalignidades de células B. Agentes exemplares adicionais incluem agentescitotóxicos, como agentes alquiladores e inibidores mitóticos (incluindoinibidores de topoisomerase II e inibidores de tubulina). Outros agentesexemplares adicionais incluem ligantes de DNA, antimetabólitos e agentescitoststáticos, como inibidores de proteína quinase e bloqueadores de receptorde tirosina quinase. Agentes vantajosos incluem, embora sem limitação,metotrexato, leucovorina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracila, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorelbina,doxorubicina (adriamicina), tamoxifeno, toremifeno, acetato de megestrol,anastrozol, goserelina, anticorpo monoclonal anti-HER2 (p. ex., trastuzumab,nome comercial Herceptin™), capecitabina, cloridrato de raloxifeno,inibidores de EGFR (p. ex., gefitinib, nome comercial Iressa erlotinib,nome comercial Tarceva™, cetuximab, nome comercial Erbitux™),inibidores de VEGF (p. ex., bevacizumab, nome comercial Avastin™) einibidores de proteasoma (p. ex., bortezomib, nome comercial Velcade™).Agentes vantajosos adicionais incluem, embora sem limitação,quimioterápicos convencionais, como cisplatina, citarabina,cicloexilcloroetilnitrosuréia, gemcitabina, Ifosfamida, leucovorina,mitomicina, mitoxantona, oxaliplatina, taxanos incluindo taxol e vindesina;terapias hormonais; terapias com anticorpos monoclonais, como cetuximab(anti-EGFR); inibidores de proteína quinase, como dasatinib, lapatinib;inibidores de histona desacetilase (HDAC), como vorinostat; inibidores deangiogênese, como sunitinib, sorafenib, lenalidomida; inibidores de mTOR,como temsirolimus; e imatinib, nome comercial Glivec Adicionalmente,um composto da invenção pode ser administrado em combinação com outrasterapias incluindo, embora sem limitação, radioterapia ou cirurgia.

As formulações podem ser apresentadas vantajosamente emforma de dosagem unitária e podem ser preparadas por meio de qualquer umdos métodos bem conhecidos na arte da farmácia. Referidos métodos incluema etapa de colocar em associação o ingrediente ativo (composto da invenção)com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. De umaforma geral, as formulações são preparadas colocando-se em associação, deforma uniforme e íntima, o ingrediente ativo com veículos líquidos ouveículos sólidos finamente divididos, ou ambos, e, então, se necessário,modelando-se o produto.

Os compostos da invenção normalmente serão administradosoralmente ou por meio de qualquer via parenteral, na forma de umaformulação farmacêutica compreendendo o ingrediente ativo, opcionalmenteem forma de um ácido inorgânico ou orgânico não-tóxico, ou base, sal deadição, em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável. Dependendoda desordem e do paciente a ser tratado, e também da via de administração, ascomposições podem ser administradas em doses variáveis.

Por exemplo, os compostos da invenção podem seradministrados oralmente, bucalmente ou por via sublingual em forma detabletes, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, que podem conteragentes aromatizantes ou corantes, para aplicações de liberação imediata,retardada ou controlada.

Referidos tabletes podem conter excipientes, como celulosemicrocristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálciodibásico e glicina, desintegrantes, como amido (de preferência, amido demilho, batata ou tapioca), amido glicolato de sódio, croscarmelose sódio edeterminados silicatos complexos, e ligantes de granulação, comopolivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidróxi-propilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia. Adicionalmente, é possívelincluir agentes lubrificantes, como estearato de magnésio, ácido esteárico,beenato de glicerila e talco.

Também é possível empregar composições sólidos de um tiposimilar como cargas em cápsulas de gelatina. Excipientes preferidos nesteaspecto incluem lactose, amido, uma celulose, lactose ou polietileno glicóiscom alto peso molecular. Para elixires e/ou suspensões aquosas, os compostosda invenção podem ser combinados com diversos agentes aromatizantes ouadoçantes, material corante ou corantes, com agentes emulsificantes e/ou desuspensão e com diluentes, como água, etanol, propileno glicol e glicerina, ecombinações dos mesmos.

E possível preparar um tablete por meio de compressão oumoldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Tabletescomprimidos podem ser preparados por meio de compressão do ingredienteativo em uma máquina apropriada a uma forma de fluxo livre, como um pó ougrânulos, opcionalmente misturados com um ligante (p. ex., povidona,gelatina, hidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte,conservante, z (ρ. ex., amido glicolato de sódio, povidona reticulada,carboximetil celulose de sódio reticulada), agente dispersante ou tensoativo.Tabletes moldados podem ser preparados por meio de moldagem, em umamáquina apropriada, de uma mistura do composto pulverizado umidificadocom um diluente líquido inerte. Opcionalmente, os tabletes podem serrevestidos ou ranhurados e podem ser formulados de forma a proporcionarliberação lenta ou controlada do ingrediente ativo, usando-se, por exemplo,hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis para proporcionar o perfilde liberação desejado.

Formulações de acordo com a presente invenção vantajosaspara administração oral podem ser apresentadas como unidades distintas,como cápsulas, cápsulas revestidas ou tabletes, cada um contendo umaquantidade predeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos;como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquidonão-aquoso ; ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou como umaemulsão líquida água-em-óleo. O ingrediente ativo também pode serapresentado como um bolus, electuário ou pasta.

Formulações vantajosas para administração tópica na bocaincluem losangos compreendendo o ingrediente ativo em uma basearomatizada, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhascompreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte, como gelatina eglicerina, ou sacarose e acácia; e líquidos para limpeza bucal compreendendoo ingrediente ativo em um veículo líquido vantajoso.

Deve-se compreende que adicionalmente aos ingredientesparticularmente mencionados acima as formulações desta invenção podemincluir outros agentes convencionais na arte considerando o tipo deformulação em questão, por exemplo, aqueles vantajosos para administraçãooral podem incluir agentes aromatizantes.

Composições farmacêuticas adaptadas para administraçãotópica podem ser formuladas como ungüentos, cremes, suspensões, loções,pós, soluções, pastas, géis, curativos impregnados, sprays, aerossóis ou óleos,dispositivos transdérmicos, pós para polvilhamento, e análogos. Estascomposições podem ser preparadas via métodos convencionais contendo oagente ativo. Assim, elas também podem compreender aditivos e veículosconvencionais compatíveis, como conservantes, solventes para auxiliar apenetração da droga, emolientes em cremes ou unguentos e etanol ou álcoolde oleíla para loções. Referidos veículos podem estar presentes de cerca de 1% até cerca de 98 % da composição. Mais usualmente eles constituirão atécerca de 80 % da composição. Apenas como ilustração, prepara-se umunguento ou creme por meio de misturação de quantidades suficientes dematerial hidrofílico e água, contendo de cerca de 5 a 10 % em peso docomposto, em quantidades suficientes para produzir um creme ou unguentoapresentando a consistência desejada.

Composições farmacêuticas adaptadas para administraçãotransdérmica podem ser apresentadas como adesivos distintos destinados apermanecer em contato íntimo com a epiderme do recipiente durante umperíodo prolongado. Por exemplo, o agente ativo pode ser fornecido a partirdo adesivo por meio de iontoforese.

Para aplicações em tecidos externos, por exemplo, na boca ena pele, as composições são aplicadas, de preferência, como um creme ouunguento tópico. Quando formulado em um unguento, o agente ativo pode serempregado com uma base de unguento parafínica ou miscível em água.

Alternativamente, o agente ativo pode ser formulado em umcreme com uma base de creme óleo-em-água ou uma base de creme água-em-óleo.

Para administração parenteral, prepara-se formas de dosagemunitária fluida empregando o ingrediente ativo e um veículo estéril, porexemplo, mas sem limitação, água, alcoóis, polióis, glicerina e óleos vegetais,sendo que se prefere água. O ingrediente ativo, dependendo do veículo econcentração usados, pode ser suspenso ou dissolvido no veículo. Napreparação, o ingrediente ativo pode ser dissolvido em água para injeção eesterilizado por filtração antes do enchimento em um frasco ou ampolavantajosa, e fechamento hermético.

De forma vantajosa, agentes, como anestésicos locais,conservantes e agentes tamponadores podem ser dissolvidos no veículo. Paraincrementar a estabilidade, a composição pode ser congelada após enchimentono frasco e a água removida em vácuo. O pó secado por liofilização é entãofechado hermeticamente no frasco e é possível fornecer um frasco anexo comágua para injeção para reconstituir o líquido antes do uso.

Suspensões parenterais são preparadas substancialmente damesma maneira que soluções, exceto que o ingrediente ativo é suspenso noveículo em lugar de ser dissolvido e a esterilização não pode ser realizada pormeio de filtração. O ingrediente ativo pode ser esterilizado por meio deexposição a óxido de etileno antes de suspender no veículo estéril. De formavantajosa, inclui-se um agente tensoativo ou agente umectante na composiçãopara facilitar a distribuição uniforme do ingrediente ativo.

Os compostos da invenção também podem ser administradosusando-se dispositivos médicos conhecidos na arte. Por exemplo, em umaconcretização, uma composição farmacêutica da invenção pode seradministrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, comoos dispositivos divulgados nas Patentes dos Estados Unidos nums. 5.399,163;U.S. 5.383.851; U.S. 5.312.335; U.S. 5.064.413; U.S. 4.941.880; U.S.4.790.824; ou U.S. 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bemconhecidos na presente invenção incluem: US 4.487.603, que revela umabomba de micro-infusão implantável para fornecer droga numa taxacontrolada; US 4.486.194, que revela um dispositivo terapêutico paraadministrar drogas através da pele; US 4.447.233, que revela uma bomba parainfusão de droga para fornecer droga numa taxa de infusão precisa; US4.447.224, que revela um dispositivo de infusão implantável de fluxo variávelpara fornecimento contínuo de droga; US 4.439,196, que revela um sistemade fornecimento osmótico de droga apresentando compartimentos demúltiplas câmaras; e US 4.475.196, que revela um sistema de fornecimentoosmótico de droga. Aqueles com prática na arte conhecem muitos outrosimlantes, sistemas de fornecimento, e módulos do tipo referido.

A dosagem a ser administrada de um composto da invençãovariará de acordo com o composto particular, a doença envolvida, o sujeito, ea natureza e gravidade da doença e da condição física do sujeito, e a via deadministração selecionada. A dosagem apropriada pode ser facilmentedeterminada por uma pessoa versada na arte.

As composições podem conter de 0,1 % em peso, depreferência, de 5-60 %, mais preferivelmente, de 10 a 30 % em peso, de umcomposto da invenção, dependendo do método de administração.

Alguém com prática na arte poderá perceber que a quantidadee o espaçamento ótimos de dosagens individuais de um composto da invençãoserão determinados pela natureza e extensão da condição que está sendotratada, a forma, via e sítio de administração, e a idade e condição do sujeitoparticular que está sendo tratado, e que um médico determinará finalmente asdosagens apropriadas a serem usadas. Esta dosagem pode ser repetida tãofreqüentemente como apropriado. Caso se desenvolvam efeitos colaterais, aquantidade e/ou freqüência da dosagem podem ser alteradas ou reduzidas, deacordo com prática clínica normal.

Em um aspecto adicional a presente invenção proporcionamétodos para a produção de análogos de 18,21-didesoximacbecina.

Pode-se considerar biossintetizar a macbecina em doisestágios. No primeiro estágio os genes núcleo-PKS montam o núcleo demacrólido por meio da montagem repetida de precursores simples de ácidocarboxílico dando uma cadeia de policetídeo que, então, é ciclizada paraformar o primeiro intermediário livre de enzima "pré-macbecina", ver Figura1. No segundo estágio uma série de enzimas ajustadoras "pós-PKS" (p. ex.,monooxigenases P450, metiltransferases, oxigenases dependentes de FAD euma carbamoiltransferase) atua adicionando os diversos grupos adicionais aomodelo pré-macbecina resultando na estrutura final do composto parental, verFigura 2. Os análogos de 18,21-didesoximacbecina podem ser biossínteziadosde uma maneira similar.

Esta produção biossintética pode ser explorada por meio debiotransformação combinada opcionalmente com manipulação genética decepas produtoras vantajosas resultando na produção de compostos inéditos.Em particular, a presente invenção proporciona um método de produziranálogos de 18,21-didesoximacbecina, sendo que referido métodocompreende:

a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produzmacbecina ou um análogo quando cultivada em condições apropriadas

b) introduzir um ácido de partida não-natural em referida

cepa

c) cultivar referida cepa em condições vantajosas para aprodução de análogos de 18,21-didesoximacbecina; e

d) opcionalmente, isolar os compostos produzidos.

O método pode compreender adicionalmente a etapa de:

e) deletar ou inativar um ou mais dos genes da biossíntese daunidade iniciadora, ou um homólogo dos mesmos, sendo que referida etapaocorre usualmente antes da etapa c) e/ou o método pode compreenderadicionalmente a etapa de:

f) deletar ou inativar um ou mais genes pós-PKS, sendo quereferida etapa ocorre usualmente antes da etapa c).

Na etapa (a) com "uma cepa hospedeira que produz macbecinaou um análogo da mesma" compreende-se uma cepa que produz macbecinaou aqueles análogos de macbecina, particularmente análogos de 18,21-didesoximacbecina, que são compreendidos pelas definições de Ri-Rs quandocultivada em condições apropriadas. Condições apropriadas (e condiçõesvantajosas na etapa (c)) incluem a provisão de uma alimentação de partida eum meio de crescimento apropriado, de composição vantajosa, (que serãoconhecidos por uma pessoa versada na arte ou que podem ser determinadospor meio de métodos conhecidos per se).

De maneira vantajosa, a alimentação de partida não-natural éum ácido benzóico substituído (não sendo um ácido 3-amino-5-hidróxi-benzóico que o ácido de partida natural). Da forma mais vantajosa, aalimentação de partida não-natural é ácido 3-amino-benzóico, sendo que oanel de benzeno é opcionalmente substituído por de um a três átomos de flúor.

Em uma concretização vantajosa a alimentação de ácido departida não-natural é ácido 3-aminobenzóico.

Em outra concretização vantajosa a alimentação de ácido departida não-natural é ácido 5-amino-2-fluorobenzóico.

Em outra concretização vantajosa a alimentação de ácido departida não-natural é ácido 5-amino-3-fluorobenzóico.

Em outra concretização vantajosa a alimentação de ácido departida não-natural é ácido 5-amino-2,3-di-fluorobenzóico.

Em outra concretização vantajosa a alimentação de ácido departida não-natural é ácido 5-amino-2,3,6-tri-fluorobenzóico.

Alguém versado na arte perceberá que há unidades de partidaalternativas não-naturais que poderiam ser introduzidas na cepa hospedeirapara produzir o(s) mesmo(s) composto(s), por exemplo, embora semlimitação, o metil éster, o etil éster, o tioéster de N-acetil-cisteamina do ácidobenzóico substituído e o análogo de dicetídeo do intermediário biossintéticoativado apropriadamente para incorporação, por exemplo, como o tioéster deN-acetil-cisteamina.

Em uma primeira concretização da invenção a cepa hospedeiraé uma cepa produtora de macbecina.

Em uma concretização alternativa, a cepa hospedeira é umacepa engenheirada baseada numa cepa produtora de macbecina em que um oumais dos genes biossintéticos de unidade iniciadora foram deletados ouinativados.

Em uma concretização adicional a cepa hospedeira é uma cepaengenheirada baseada numa cepa produtora de macbecina em que um ou maisdos genes pós-PKS foram deletados ou inativados. Por exemplo, a cepahospedeira pode ser uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtorade macbecina em que mbcM e, opcionalmente, outros genes pós-PKS foramdeletados ou inativados. Especificamente, a cepa hospedeira pode ser umacepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de macbecina em quembcM foi deletado ou inativado. Alternativamente, a cepa hospedeira podeser uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora de macbecina emque mbcM, mbcMTl, mbcMT2, mbcP e mbcP450 foram deletados ouinativados.

De maneira vantajosa, o um ou mais genes biossintéticos deunidade iniciadora e/ou genes pós-PKS serão deletados ou inativadosseletivamente.

Em uma concretização adicional, um ou mais genesbiossintéticos de unidade iniciadora ou genes pós-PKS são inativados emreferida cepa engenheirada por meio de integração do DNA no(s) gene(s/), detal forma que a proteína funcional não seja produzida. Em uma concretizaçãoalternativa, um ou mais dos referidos genes de unidade iniciadora ou genespós-PKS são deletados em referida cepa engenheirada por meio de preparaçãode uma deleção ou de deleções objetivadas. Em uma concretização adicional,um ou mais genes biossintéticos de unidade iniciadora ou genes pós-PKS sãoinativados em referida cepa engenheirada por meio de mutagênese dirigidapara sítio. Em uma concretização adicional uma cepa hospedeira produtora demacbecina é submetida a mutagênese, química ou por UV, e seleciona-se umacepa modificada em que uma ou mais das enzimas biossintéticas de unidadeiniciadora ou enzimas pós-PKS não são funcionais. A presente invençãotambém compreende mutações dos reguladores que controlam a expressão deum ou mais dos genes biossintéticos de unidade iniciadora ou genes pós-PKS,uma pessoa versada na arte perceberá que deleção ou inativação de umregulador pode ter o mesmo resultado que deleção ou inativação do gene.

Em uma concretização adicional uma cepa engenheirada emque um ou mais genes pós-PKS foram deletados ou inativados como acima,foi reintroduzida em um ou mais dos mesmos genes pós-PKS, ou seushomólogos de uma cepa alternativa produtora de macbecina.

Em uma concretização adicional uma cepa engenheirada emque um ou mais genes foi deletada ou inativada é complementada por um oumais dos genes pós-PKS do aglomerado de PKS heterólogo incluindo,embora sem limitação, os aglomerados que dirigem a biossíntese darifamicina, ansamitocina, geldanamicina ou herbimicina.

Um método de deletar ou inativar seletivamente um gene pós-PKS compreende:

(i) determinar oligos degenerados com base em homólogo(s)do gene de interesse (p. ex., dos aglomerados biossintéticos de rifamicina,geldanamicina ou herbimicina e/outras seqüências obteníveis) e isolar ofragmento interno do gene de interesse de uma cepa produtora de macbecinavantajosa por meio do uso destes iniciadores em uma reação de PCR,

(ii) integrar um plasmídeo contendo este fragmento na mesma,ou em uma cepa produtora diferente, de macbecina seguido de recombinaçãohomóloga, o que resulta na disrupção do gene objetivado,

(iii) cultivar a cepa assim produzida em condições vantajosaspara a produção dos análogos de macbecina, i.e. análogos de 18,21-didesoximacbecina.

Em uma concretização específica, a cepa produtora demacbecina na etapa (i) é Actinosynnema mirum (A. mirum). Em umaconcretização específica adicional, a cepa produtora de macbecina na etapa(ii) é Actinosynnema pretiosum (A. pretiosum).

Uma pessoa versada na arte perceberá que é possível obteruma cepa equivalente usando métodos alternativos àqueles descritos acima, p.ex.:

■ Oligos degenerados podem ser usados para amplificar ogene de interesse de qualquer cepa produtora de macbecina por exemplo,embora sem limitação, A. pretiosum, ou A. mirum

■ É possível projetar diferentes oligos degenerados queamplificarão com êxito uma região apropriada do gene pós-PKS, ou umhomólogo do mesmo, de um produtor de macbecina, ou cepa produtora de umhomólogo do mesmo.

■ A seqüência do gene da cepa de A. pretiosum pode serusada para gerar os oligos que podem ser específicos para o gene de A.pretiosum e, então, o fragmento interno pode ser amplificado de qualquercepa produtora de macbecina, p. ex., A. pretiosum ou A. mirum.

■ A seqüência do gene da cepa de A. pretiosum pode serusada juntamente com a seqüência de genes homólogos para gerar oligosdegenerados para o gene de A. pretiosum e, então, o fragmento interno podeser amplificado de qualquer cepa produtora de macbecina, p. ex., A.pretiosum ou A. mirum.

A Figura 2 mostra a atividade dos genes pós-PKS noaglomerado biossintético de macbecina. Assim, uma pessoa versada na artepoderia ser capaz de identificar quais genes pós-PKS adicionais poderia sernecessário deletar ou inativar para se chegar a uma cepa que produzirá o(s)composto(s) de interesse.

Pode-se observar nestes sistemas que quando se gera uma cepaem que um ou mais dos genes pós-PKS não funcionam como um resultado deum dos métodos descritos incluindo inativação ou deleção, é possívelproduzir mais de um análogo de 18,21-didesoximacbecina. Há umaquantidade de razões possíveis para isto, e poderão ser compreendidas poraqueles versados na arte. Por exemplo, pode haver uma ordem preferida deetapas pós-PKS e a remoção de uma única atividade leva a que todas as etapassubseqüentes podem ser realizadas sobre substratos que não são naturais paraa enzimas envolvidas. Isto pode levar ao acúmulo de intermediários no caldode cultura devido a uma menor eficiência no sentido dos substratos inéditosapresentados às enzimas pós-PKs, ou a produtos desviados [shunt] que nãosão mais substratos para as enzimas remanescentes possivelmente em virtudeda alteração da ordem de etapas.

Uma pessoa versada na arte perceberá que a relação decompostos observada em uma mistura pode ser manipulada por meio do usode variações nas condições de crescimento.

Alguém versado na arte perceberá que em um aglomeradobiossintético alguns genes são organizados em óperons e a disrupção de umgene freqüentemente terá um efeito sobre a expressão de genes subseqüentesno mesmo óperon.

Quando se observa uma mistura de compostos, estes podemser facilmente separados usando-se técnicas convencionais, sendo quealgumas destas encontram-se descritas nos exemplos a seguir.

Análogos de 18,21-didesoximacbecina podem ser selecionadospor uma variedade de métodos, como descrito aqui, e no caso em que umcomposto simples mostra um perfil favorável, uma cepa pode ser manipuladapara preparar este composto preferivelmente. No caso incomum em que istonão é possível, é possível gerar um intermediário que, então, ébiotransformado para produzir o composto desejado.

A presente invenção proporciona análogos de macbecinainéditos gerados pela seleção ou inativação selecionada de um ou mais genespós-PKS do aglomerado de genes de PKS macbecina. Em particular, apresente invenção refere-se a análogos de 18,21-didesoximacbecina inéditosproduzidos por meio de introdução de uma unidade iniciadora não natural emuma cepa produtora de macbecina, opcionalmente combinada com a deleçãoou inativação selecionada de um ou mais genes pós-PKS, do aglomerado degenes de PKS macbecina.

Uma pessoa versada na arte perceberá que um gene nãoprecisa ser completamente deletado para que o produto gênico seja tornadonão-funcional, conseqüentemente o termo "deletado ou inativado" comousado aqui compreende qualquer método por meio do qual o produto gênico étornado não-funcional incluindo, embora sem limitação: deleção do geneintegralmente, deleção de parte do gene, inativação por meio de inserção nogene-alvo, mutagênese dirigida para sítio que resulta no gene, ou não serexpresso ou ser expresso para produzir proteína nativa, mutagênese da cepahospedeira que resulta no gene, ou não ser expresso ou ser expresso paraproduzir proteína nativa (p. ex., por meio de radiação ou exposição aquímicos mutagênicos, fusão de protoplasto ou mutagênese de transpóson).Alternativamente, a função de um produto gênico pode ser prejudicadaquimicamente com inibidores, por exemplo, metapirona (nome alternativo 2-metil-l,2-di(3-piridil-l-propanona), EP O 627 009) e ancimidol são inibidoresde oxigenases e estes compostos podem ser adicionados ao meio de produçãopara gerar análogos. Adicionalmente, sinefungina é um inibidor de metiltransferase que pode ser usado de forma similar, menos para a inibição daatividade de metil transferase in vivo (McCammon e Parks, 1981).

Em uma concretização alternativa, todos os genes pós-PKSpodem ser deletados ou inativados e, então, um ou mais dos genes podem serreintroduzidos por meio de complementação (p. ex., em um sítio de ligação,em um plasmídeo auto-replicante ou por meio de inserção em uma regiãohomóloga do cromossomo). Portanto, em uma concretização particular apresente invenção refere-se a métodos para a geração de análogos de 18,21-didesoximacbecina, sendo que referido método compreende:

a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produzmacbecina quando cultivada em condições apropriadas

b) opcionalmente, deletar ou inativar seletivamente todos osgenes pós-PKS,

c) introduzir uma unidade iniciadora não natural em referida cepa

d) cultivar referida cepa hospedeira modificada em condiçõesvantajosas para a produção de análogos de 18,21-didesoximacbecina; e

e) opcionalmente, isolar os compostos produzidos.

Em uma concretização alternativa, um ou mais dos genes pós-PKS deletados são reintroduzidos. Em uma concretização adicional, 1 ou maisdos genes pós-PKS selecionados do grupo que consiste de mbcM, mbcN,mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos. Em umaconcretização adicional, 2 ou mais dos genes pós-PKS selecionados do grupoque consiste de mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450 sãoreintroduzidos. Em uma concretização adicional, 3 ou mais dos genes pós-PKS selecionados do grupo que consiste de mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl,mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos. Em uma concretização adicional, 4ou mais dos genes pós-PKS selecionados do grupo que consiste de mbcM,mbcN, mbcP, mbcMTl, mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos. Em umaconcretização alternativa adicional, 5 ou mais dos genes pós-PKSselecionados do grupo que consiste de mbcM, mbcN, mbcP, mbcMTl,mbcMT2 e mbcP450 são reintroduzidos. Opcionalmente genes de outrosaglomerados biossintéticos de PKS, como embora sem limitação, as vias degeldanamicina ou herbimicina podem ser introduzidas de forma apropriada.

Adicionalmente, uma pessoa com prática na arte perceberá queum subconjunto dos genes pós-PKS, poderia ser deletado ou inativado e,opcionalmente, um subconjunto menor de referidos genes pós-PKS poderiaser reintroduzido para se chegar a uma cepa que, quando introduzida em umaunidade iniciadora não natural, produz análogos de 18,21-didesoximacbecina.

Portanto, em uma concretização preferida, a presente invençãorefere-se a métodos para a geração de análogos de 18,21-didesoximacbecina,sendo que referido método compreende:

b) deletar ou inativar seletivamente mbcM,

c) introduzir uma unidade iniciadora não natural em referidacepa

e) opcionalmente, isolar os compostos produzidos.

Em uma concretização preferida adicional a presente invençãorefere-se a métodos para a geração de análogos de 18,21-didesoximacbecina,sendo que referido método compreende:

b) deletar ou inativar seletivamente mbcM e mbcP450

c) opcionalmente, deletar ou inativar seletivamente genesadicionais pós-PKS

d) introduzir uma unidade iniciadora não natural em referidacepa

e) cultivar referida cepa hospedeira modificada em condiçõesvantajosas para a produção de análogos de 18,21-didesoximacbecina; e

f) opcionalmente, isolar os compostos produzidos.

Em uma concretização preferida adicional a presente invençãorefere-se a métodos para a geração de análogos de 18,21-didesoximacbecina,sendo que referido método compreende:a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produzmacbecina quando cultivada em condições apropriadas

b) deletar ou inativar seletivamente mbcM, mbcMTl,mbcMT2, mbcP e mbcP450

c) opcionalmente, deletar ou inativar seletivamente genesadicionais pós-PKS ou genes de biossíntese da unidade iniciadora

d) introduzir uma unidade iniciadora não natural em referidacepa

f) opcionalmente, isolar os compostos produzidos.

E de conhecimento geral por parte daqueles versados na arteque aglomerados de genes de policetídeo podem ser expressos emhospedeiros heterólogos (Pfeifer e Khosla, 2001). Assim, a presente invençãoinclui a transferência do aglomerado de genes biossintéticos de macbecina,com ou sem genes reguladores e de resistência, sendo de outra formacompletos ou contendo deleções, para um hospedeiro heterólogo.Alternativamente, o aglomerado completo biossintético de macbecina podeser transferido para um hospedeiro heterólogo, com ou sem genes reguladorese de resistência, e pode então ser manipulado pelos métodos aqui descritospara deletar ou inativar um ou mais dos genes pós-PKS ou genes debiossíntese da unidade iniciadora. Métodos e vetores para a transferênciacomo definido acima de referidas porções grandes de DNA são bemconhecidos na arte (Rawlings, 2001; Staunton e Weissman, 2001) ou sãoproporcionados aqui, nos métodos revelados. Neste contexto, uma cepa decélulas hospedeiras preferida seja um procarionte, mais preferivelmente, umactinomiceto ou Escherichia coli, ainda mais preferivelmente, incluem,embora sem limitação, Actinosynnema mirum (A. mirum), Actinosynnemapretiosum subespécie pretiosum (A. pretiosum), S. hygroscopicus, S.hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomycestsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyees lividans,Saccharopolyspora erythraea, Streptomyees fradiae, Streptomyees avermitilis,Streptomyees cinnamonensis, Streptomyees rimosus, Streptomyees albus,Streptomyees griseofuscus, Streptomyees longisporoflavus, Streptomyeesvenezuelae, Streptomyees albus, Micromonospora sp., Micromonosporagriseorubida, Amycolatopsis mediterranei ou Actinoplanes sp. N902-109,Exemplos adicionais incluem Streptomyces hygroscopicus subespéciegeldanus e Streptomyces violaceusniger.

Em uma concretização, todo o aglomerado biossintético étransferido. Em uma concretização alternativa, todo o PKS é transferido semqualquer um dos genes de biossíntese da unidade iniciadora e/ou genes pós-PKS associados.

Em uma concretização adicional, todo o aglomeradobiossintético de macbecina é transferido e, depois, manipulado de acordo coma descrição aqui.

Em um aspecto alternativo da invenção, o(s) análogo(s) de18,21-didesoximacbecina da presente invenção podem ser processadosadicionalmente por meio de biotransformação com uma cepa apropriada. Acepa apropriada pode ser uma cepa de tipo selvagem obtenível, por exemplo,embora sem limitação, Actinosynnema mirum, Actinosynnema pretiosumsubespécie pretiosum, S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp..Alternativamente, uma cepa apropriada pode ser manipulada de forma apermitir biotransformação com enzimas particulares pós-PKS, por exemplo,embora sem limitação, aquelas codificadas por mbcM, mbcN, mbcP,mbcMT2, mbcP450 (como definido aqui), gdmN, gdmM, gdmL, gdmP,(Rascher et ai., 2003) a geldanamicina O-metila transferase, hbmN, hbmL,hbmP, (Rascher et ai., 2005) herbimicina O-metil transferases e, também,herbimicina mono-oxigenases, asm7, asmlO, asmll, asml2, asml9 e asm21(Cassady et al., 2004, Spiteller et ai., 2003). Onde genes ainda restam por seridentificados ou as seqüências não se encontrem no domínio público é rotina,por parte daqueles com prática na arte, adquirir referidas seqüências por meiode métodos convencionais. Por exemplo, a seqüência do gene que codifica ageldanamicina O-metil transferase não é de domínio público, mas alguémcom prática na arte será capaz de gerar uma sonda, seja uma sonda heterólogausando uma O-metil transferase similar, ou uma sonda homóloga por meio dedeterminação de iniciadores degenerados dentre genes homólogos disponíveispara realizar Southern blotting em uma cepa produtora de geldanamicina e,assim, requerem este gene para gerar sistemas de biotransformação.

Em uma concretização particular, a cepa pode ter apresentadoa deleção de um ou mais aglomerados de policetídeos nativos, sejaseparadamente ou em parte, ou de outra forma inativados, de forma a prevenira produção do policetídeo produzido por referido aglomerados de policetídeonativo. Referida cepa engenheirada pode ser selecionada do grupo que inclui,por exemplo, mas sem limitação, Actinosynnema mirum, Actinosynnemapretiosum subespécie pretiosum, S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S.hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomycescoelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomycesfradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces cinnamonensis, Streptomycesrimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyceslongisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora sp.,Micromonospora griseorubida, Amycolatopsis mediterranei ou Actinoplanessp. N902-109, Cepas possíveis adicionais incluem Streptomyceshygroscopicus subespécie geldanus e Streptomyces violaceusniger.

Embora o processo para a preparação dos análogos de 18,21-didesoximacbecina da invenção como descrito acima seja substancialmenteou totalmente biossintético, não se exclui a produção ou interconversão deanálogos de 18,21-didesoximacbecina da invenção por meio de um processoque compreende métodos químicos sintéticos convencionais.

Para permitir a manipulação genética do aglomerado de genesPKS de macbecina, primeiramente o aglomerado de genes foi seqüenciado deActinosynnema pretiosum subespécie pretiosum, no entanto, uma pessoaversada na arte perceberá que há cepas alternativas que produzem macbecina,por exemplo, mas sem limitação, Actinosynnema miram. Os aglomerados degenes biossintéticos de macbecina destas cepas podem ser seqüenciados comodescrito aqui para Actinosynnema pretiosum subespécie pretiosum, e aformulação usada para gerar cepas equivalentes.

Aspectos adicionais da invenção incluem:

- Uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora demacbecina em que mbcM e, opcionalmente, outros genes pós-PKS foramdeletados ou inativados, particularmente uma cepa engenheirada do tiporeferido em que mbcM foi deletado ou inativado ou uma cepa engenheiradado tipo referido em que mbcM, mbcMTl, mbcMT2, mbcP e mbcP450 foramdeletados ou inativados. De maneira vantajosa, a cepa produtora demacbecina é A pretiosum ou A mirum.

- Uma cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora demacbecina em que mbcM e, opcionalmente, outros genes pós-PKS e/ou genesde biossíntese da unidade iniciadora foram deletados ou inativados,particularmente uma cepa engenheirada do tipo referido em que mbcM foideletado ou inativado ou uma cepa engenheirada do tipo referido em quembcM, mbcMTl, mbcMT2, mbcP e mbcP450 foram deletados ou inativados.

De maneira vantajosa, a cepa produtora de macbecina é A pretiosum ou Amirum.

- Uso de uma cepa engenheirada do tipo referido napreparação de um análogo de 18,21-didesoximacbecina.

Compostos da invenção são vantajosos pelo fato de que sepode esperar que os mesmos possuam uma ou mais das seguintespropriedades: estreita ligação com Hsp90, rápida na taxa de ligação comHsp90, boa atividade contra uma ou mais subtipos diferentes de câncer emcomparação com o composto parental; bom perfil toxicológico, como bomperfil de hepatotoxicidade, boa nefrotoxicidade, boa segurança cardíaca; boasolubilidade em água; boa estabilidade metabólica; boa capacidade deformulação; boa biodisponibilidade; boas propriedades farmacocinéticas oufarmacodinâmicas, como estreita ligação com Hsp90, rápida on-rate deligação com Hsp90 e/ou boa farmacocinética no cérebro; boa absorção decélulas; e baixa ligação a eritrócitos.

Exemplos

Métodos gerais

Fermentação de culturas

Condições usadas para o desenvolvimento das cepasbacterianas de Actinosynnema pretiosum subespécie pretiosum ATCC 31280(US 4.315.989) e Actinosynnema mirum DSM 43827 (KCC A-0225,Watanabe et al., 1982) foram descritas nas patentes US 4.315.989 e US4.187.292. Métodos aqui usados foram adaptados destes e são como a seguirpara cultivo de caldos em tubos ou frascos em incubadoras agitadas, variaçõesdos protocolos publicados são indicadas nos exemplos. Cepas foramdesenvolvidas em agar ISP2 (Meio 3, Shirling, E.B. e Gottlieb, D., 1966) a28°C durante de 2 a 3 dias e usadas para inocular meio de semeadura (Meio 1,ver abaixo e US 4.315.989 e US 4.187.292). Em seguida, o meio desemeadura inoculado foi incubado com agitação entre 200 e 300 rpm comuma extensão da oscilação de 5 ou 2,5 cm a 28°C durante 48 h. Para aprodução de macbecina, análogos de 18,21-diidromacbecina e macbecina,como análogos de 18,21-didesoximacbecina o meio de fermentação (Meio 2,ver abaixo e US 4.315.989 e US 4.187.292) foi inoculado com 2,5 % - 10 %da cultura de semeadura e incubado com agitação entre 200 e 300 rpm comuma extensão da oscilação de 5 ou 2,5 cm a 26 0C durante seis dias excetoonde indicado de outra forma nos exemplos. A cultura foi então colhida para

extração.

Meios

Meio 1 - Meio de semeadura

Em 1 1 de água destilada

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Esterilização por meio de autoclavagem a 121°C durante 20minutos.

Adicionou-se apramicina quando apropriado apósautoclavagem para dar uma concentração final de 50 mg/l.Meio 2 - Meio de fermentaçãoEm 1 1 de água destilada

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Esterilização por meio de autoclavagem a 121°C durante 20minutos.

Meio 3 - Meio ISP2Em 1 1 de água destilada

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Esterilização por meio de autoclavagem a 121°C durante 20minutos.43

Meio 4 - MAM

Em 1 1 de água destilada

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Esterilização por meio de autoclavagem a 121°C durante 20minutos.

Extração de caldos de cultura para análise de LCMS

Caldo de cultura (1 ml) e acetato de etila (1 ml) forammisturados vigorosamente durante de 15 a 30 min seguido de centrifiigaçãodurante 10 min. 0,5 ml desta camada orgânica foram recolhidos, evaporados àsecura e, então, redissolvidos em 0,25 ml de metanol.

Procedimento de análise de LCMS

LCMS analítica foi realizada usando método 1 de LCMS emum sistema de HPLC Agilent HPl 100 em combinação com um espectrômetrode massa por eletrospray Bruker Daltonics Esquire 3000+ operando em modode íon positivo e/ou negativo. Método 1 de LCMS: cromatografia foirealizada em uma coluna Phenomenex Hyperclone (Cj8 BDS, tamanho daspartículas de 3 mícrons, 150 χ 4,6 mm) eluindo a uma taxa de fluxo de 1ml/min usando-se o seguinte processo de eluição de gradiente; T=O, 10 % deB; T=2, 10 % de B; T=20, 100 % de B; T=22, 100 % de B; T=22,05, 10 % deB; T=25, 10 % de B. Fase móvel A = água + 0,1 % de ácido fórmico; fasemóvel B = acetonitrilo + 0,1 % de ácido fórmico. Espectros de UV foramregistrados entre 190 e 400 nm, com cromatogramas extraídos obtidos a 210,254 e 276 nm. Espectros de massa foram registrados entre 100 e 1500 amu.

Métodos de elucidação de estrutura de RMN

Espectros de RMN foram registrados em um espectrômetroBruker Advance 500 a 298 K operando a 500 MHz e 125 MHz para 1H e 13Crespectivamente. Usou-se seqüências de pulso Standard Bruker para adquirirespectros 1H-1H COSY, APT5 HMBC e HMQC. Espectros de RMN foramreferidos às ressonâncias residual do próton ou padrão do carbono, dossolventes em que elas foram run/*.

Avaliação da pureza do composto

Compostos purificados foram analisados usando LCMSmétodo 2 descrito. LCMS método 2: cromatografia foi realizada em umacoluna Phenomenex HyperClone Cig-BDS (4,6 χ 150 mm, tamanho daspartículas de 3 mícrons) eluindo com um gradiente de água + 0,1 % de ácidofórmico:acetonitrilo + 0,1 % de ácido fórmico, (90:10) a (0:100), a 1 ml/minao longo de 20 min. A pureza foi avaliada por meio de MS e comcomprimentos de onda múltiplos (210, 254 & 276 nm). Todos os compostosforam >95 % puros em todos os comprimentos de onda. A pureza foiconfirmada finalmente por meio de inspeção dos espectros de RMN do 1H e 13C.

Avaliação da solubilidade em água

Solubilidade em água pode ser testada como a seguir: Umasolução de consumo de 10 mM do análogo de 18,21-didesoximacbecina épreparado em 100 % de DMSO à temperatura ambiente. Prepara-se frações de0,01 ml em triplicata até 0,5 ml com 0,1 M de PBS, solução a pH 7,3 ou 100% de DMSO em frascos de cor âmbar. As soluções 0,2 mM resultantes sãoagitadas no escuro, à temperatura ambiente em um agitador IKA® vibraxVXR durante 6 horas, seguido de transferência das soluções ou suspensõesresultantes para tubos de Eppendorf de 2 ml e centrifugação durante 30 min a13200 rpm. Analisa-se então frações do fluido sobrenadante por meio dométodo 1 de LCMS como descrito acima.

Ensaio biológico in vitro para determinação da atividade anticâncer

Avaliação in vitro de compostos quanto à atividade anticâncerem um grupo de linhas de células de tumor humanas em um ensaio deproliferação de monocamada foi realizada na Oncotest Testing Facility,Institute for Experimental

Tabela 1 - Linhas de células de teste

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Oncology, Oncotest GmbH, Freiburg. As características daslinhas de células selecionadas encontram-se resumidas na Tabela 1.

As linhas de células Oncotest foram estabelecidas a partir deenxertos exógenos de tumor humano como descrito por Roth et al., (1999). Aorigem dos enxertos exógenos doadores foi descrita por Fiebig et al., (1999).Outras linhas de células foram, ou obtidas do NCI (DU145, MCF-7) ouadquiridas da DSMZ, Braunschweig, Alemanha.

Todas as linhas de células, exceto se especificado de outraforma, foram desenvolvidas a 37°C em uma atmosfera umidificada (95 % dear, 5 % de CO2) em um meio mistura pronta 'ready-mix' contendo meioRPMI 1640, 10 % fetal calf serum, e 0,1 mg/ml gentamicina (PAA, Cõlbe,Alemanha).

Usou-se um ensaio de iodeto de propídio modificado paraavaliar os efeitos do(s) composto(s) de teste sobre o crescimento de linhas decélulas de tumor humano (Dengler et al., (1995)).

Em resumo, células foram colhidas de culturas de faseexponencial por meio de tripsinização, contadas e plaqueadas em placas demicrotitulação de fundo plano e 96 poços com uma densidade de célulasdependente da linha de células (5 - 10.000 células viáveis/poço). Após umarecuperação de 24 horas para permitir que as células retomem o crescimentoexponencial, adicionou-se nos poços 0,010 ml de meio de cultura (6 poços decontrole por placa) ou meio de cultura contendo o análogo de 18,21-didesoximacbecina. Cada concentração foi plaqueada em triplicata.Compostos foram aplicados em cinco concentrações (100; 10; 1; 0,1 e 0,01μ§/Γη1). Após 4 dias de exposição contínua, meio de cultura de células com ousem composto de teste foi substituído por 0,2 ml de uma solução aquosa deiodeto de propídio (PI) (7 mg/l). Para medir a proporção de células vivas,células podem ser permeabilizadas por meio de congelamento das placas.Após descongelamento das placas, fluorescência foi medida usando-se aleitora de microplacas Cytofluor 4000 (excitação a 530 nm, emissão a 620nm), dando uma relação direta com o número total de células viáveis. Ainibição do crescimento pode ser expressa como tratadas/controle χ 100 (%T/C). Isto pode ser plotado como um gráfico de % T/C contra a concentraçãodo composto de teste aplicado, que então pode ser usado para calcular aconcentração necessária para inibir o crescimento de células em 70 % (IC7o).

Exemplo 1 - Seqüenciamento do aglomerado de genes de PKS de macbecina

DNA genômico foi isolado de Actinosynnema pretiosum(ATCC 31280) e Actinosynnema mirum (DSM 43827, ATCC 29888) usandoprotocolos convencionais descritos por Kieser et al., (2000). Seqüenciamentode DNA foi realizado pela instalação de seqüenciamento do BiochemistryDepartment, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB21QW usando procedimentos padrão.

Iniciadores BIOSGl 04 5'-GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT-3' (SEQ ID NO: 1) eBIOSGl05 5'-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-3' (SEQ ID NO:2) foram empregados para amplificar o gene codificante paracarbamoiltransferase gdmN do aglomerado de genes biossintéticos degeldanamicina de Streptomyces hygroscopicus NRRL 3602 (Número deacesso da seqüência: AYl79507) usando-se técnicas convencionais. Realizou-se experimentos de Southern blotting usando o DIG Reagents and Kits forNon-Radioactive Nucleic Acid Labelling and Detection [Reagentes e Kitspara Detecção e Marcação Não-Radioativa de Ácidos Nucleicos] de acordocom as instruções do fabricante (Roche). O fragmento de DNA de dgmNmarcado com DIG foi usado como uma sonda heteróloga. Usando a sondagerada de gdmN e DNA genômico isolado de A. pretiosum 2112 identificou-se um fragmento EcoRI de aproximadamente 8 kb por meio de análise deSouthern blotting. O fragmento foi clonado em Litmus 28 aplicando-seprocedimentos convencionais e transformantes foram identificados por meiode hibridização de colônias. O clone p3 foi isolado e o inserto deaproximadamente 7,7 kb foi seqüenciado. DNA isolado do clone p3 foidigerido com EcoRI e EcoRI/SacI e as bandas em torno de 7,7 kb e a cerca de1,2 kb foram isoladas, respectivamente. Realizou-se reações de marcação deacordo com os protocolos dos fabricantes. Criou-se bibliotecas de cosmídeosdas duas cepas indicadas acima usando o vetor SuperCos 1 e o kit deempacotamento Gigapack III XL (Stratagene) de acordo com as instruções dofabricante. Estas duas bibliotecas foram selecionadas usando-se protocolosconvencionais e como uma sonda, usou-se os fragmentos marcados com DIGdo fragmento EcorI de 7,7 kb derivado do clone p3. O cosmídeo 52 foiidentificado da biblioteca de cosmídeos de A. pretiosum e submetido paraseqüenciamento na instalação de seqüenciamento do Departamento deBioquímica da Universidade de Cambridge. De maneira análoga, cosmídeo43 e cosmídeo 46 foram identificados da biblioteca de cosmídeos de A.miram. Todos os três cosmídeos contêm o fragmento EcoRI de 7,7 kb comomostrado por meio de análise de Southern blotting.

um fragmento de aproximadamente 0,7 kbp da região de PKSdo cosmídeo 43 foi amplificado usando iniciadores BIOSGl24 5'-CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-3' (SEQ IDNO: 3) e BIOSG125 5'-GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC-3' (SEQ IDNO: 4) aplicando-se protocolos convencionais, clonado e usado como umasonda para seleção da biblioteca de cosmídeo de A. pretiosum cosmídeoquando a clones que se superpõem. A formulação de seqüência do cosmídeo52 também foi usada para criar sondas derivadas de fragmentos de DNAamplificados com iniciadores BIOSGl 30 5'-

CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG-3' (SEQ ID NO:5) e BIOSG131 5'-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGC AGCTGCTGT-5' (SEQ ID NO: 6) e também BIOSG132 5'-GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC-3' (SEQ ID NO:7)eBIOSG133 5'-GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3' (SEQ ID NO:

8) que foram usados para seleção da biblioteca de cosmídeos de A. pretiosum.Cosmídeos 311 e 352 foram isolados e cosmídeo 352 foi enviado paraseqüenciamento. Cosmídeo 352 contém uma superposição deaproximadamente 2,7 kb com o cosmídeo 52. Para selecionar cosmídeosadicionais, um fragmento de PCR com aproximadamente 0,6 kb foiamplificado usando iniciadores BIOSGl 36 5'-

CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGG CTGC-3' (SEQID NO: 9) e BIOSG 137 5'-

CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGC ACAGCGAG-3' (SEQID NO: 10) e cosmídeo 311 como modelo, aplicando-se protocolosconvencionais. A biblioteca de cosmídeo de A. pretiosum foi selecionados ecosmídeo 410 foi isolado. Ele se sobrepõe em aproximadamente 17 kb com ocosmídeo 352 e foi enviado para seqüenciamento. A seqüência dos trêscosmídeos que se sobrepõem (cosmídeo 52, cosmídeo 352 e cosmídeo 410)foi montada. A região seqüenciada compreende cerca de 100 kbp eidentificou-se 23 matrizes de leitura aberta constituindo potencialmente oaglomerado de genes biossintéticos de macbecina. A localização de cada umadas matrizes de leitura aberta na SEQ ID NO: 11 é mostrada na Tabela 3Tabela 2 - Sumário dos cosmídeos

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Tabela 3 - Localização de cada uma das matrizes de leitura aberta para osgenes pós-PKS e os genes de biossíntese da unidade iniciadora

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[Nota 1: c indica que o gene é codificado pelo filamento deDNA de complemento; Nota 2: algumas vezes é o caso de se poder identificarmais do que um códon iniciador candidato potencial. Alguém versado na arteperceberá isto e será capaz de identificar códons iniciadores alternativospossíveis. Nós indicamos aqueles genes que apresentam mais do que umcódon iniciador possível com um símbolo '*'. Nesta descrição nós indicamosque acreditamos que se trata do códon iniciador, no entanto, uma pessoaversada na arte perceberá que pode ser possível gerar proteína ativa usando-seum códon iniciador alternativo.]

Exemplo 2 - Geração da cepa BIOT-3806: uma cepa de Actinosynnemapretiosum em que o gdmM homólogo mcbM foi interrompido por meio deinserção de um plasmídeo.

Um resumo da construção do pLSS308 é mostrado na Figura3.

2.1. Construção do plasmídeo pLSS308

As seqüências de DNA do gene gdmM do aglomerado degenes biossintéticos de geldanamicina de Streptomyces hygroscopicus cepaNRRL 3602 (AY179507) e orf19 do aglomerado de genes biossintéticos derifamicina de Amycolatopsis mediterranei (AF040570 AF040571) foramalinhadas usando-se o programa de alinhamento de seqüências VectorNTI.Este alinhamento identificou regiões de homologia que foram vantajosas parao projeto de oligos degenerados que foram usados para amplificar umfragmento do gene homólogo de Actinosynnema mirum (BIOT-3134;DSM43827; ATCC29888). Os oligos degenerados são:

FPLS1: 5': ccscgggcgnycngsttcgacngygag 3'; (SEQ ID NO: 12)

FPLS3: 5': cgtcncggannccggagcacatgccctg 3'; (SEQ ID NO: 13)em que N= G, A, T ou C; Y = C ou T; S = G ou C

O modelo para amplificação de PCR foi Actinosynnemamirum cosmídeo 43. A geração do cosmídeo 43 é descrita no Exemplo 1acima.

Oligos FPLS1 e FPLS3 foram usados para amplificar ofragmento interno de um homólogo de gdmM de Actinosynnema mirum emuma reação PCR convencional usando o cosmídeo 43 como o modelo e TaqDNA polimerase. O produto de PCR resultante com 793 bp foi clonado empUC19 que havia sido linearizado com SmaI, resultando no plasmídeopLSS301. Postulou-se que a seqüência amplificada é do gene mcbM doaglomerado de macbecina de A. mirum. Plasmídeo pLSS301 foi digerido comEcoRI/HindIII e o fragmento clonado no plasmídeo pKCl 132 (Bierman et al.,1992) que havia sido digerido com EcoRI/HindIII. O plasmídeo resultante,denominado pLSS308, é resistente à apramicina e contém um fragmentointerno do gene mbcM de A. mirum.

2.2 Transformação de Actinosynnema pretiosum subespécie pretiosum

Escherichia coli ET12567, abrigando o plasmídeo pUZ8002foi transformado com pLSS308 por meio de eletroporação para gerar a cepadoadora de E. coli para conjugação. Esta cepa foi usada para transformarActinosynnema pretiosum subespécie pretiosum por meio de conjugaçãovegetativa (Matsushima et al., 1994). Exconjugantes foram plaqueados emMeio 4 e incubados a 28°C. Placas foram sobrepostas após 24 h com 50 mg/lde apramicina e 25 mg/l de ácido naldíxico. Como pLSS308 é incapaz dereplicar em Actinosynnema pretiosum subespécie pretiosum, antecipou-sequaisquer colônias resistentes à apramicina são transformantes que continhamplasmídeo integrado no gene mbcM do cromossomo por meio derecombinação homóloga via o fragmento interno mcbM portado porplasmídeo (Figura 3). Isto resulta em duas cópias truncadas do gene mbcM nocromossomo. Transformantes foram confirmados por meio de análise de PCRe o fragmento amplificado foi seqüenciado.

Colônias foram aplicadas sobre Meio 4 (com 50 mg/l deapramicina e 25 mg/l de ácido naldíxico). Usou-se um tampão circular de 6mm de cada emplastro/pedaço* para inocular tubos falcon individuais de 50ml contendo 10 ml de meio de semeadura (variante do Meio 1 - 2 % deglicose, 3 % de amido solúvel, 0,5 % de sólidos de milho macerados, 1 % defarinha de soja, 0,5 % de peptona, 0,3 % de cloreto de sódio, 0,5 % decarbonato de cálcio) mais 50 mg/l de apramicina. Estas culturas de semeaduraforam incubadas durante 2 dias a 28°C, 200 rpm com uma extensão daoscilação de 5 cm. Estes foram usados então para inocular (5 % v/v) meio defermentação (Meio 2) e foram desenvolvidos a 28°C durante 24 horas e,então, a 26°C durante mais 5 dias. Metabólitos foram extraídos destes deacordo com o protocolo convencional descrito acima. Amostras foramavaliadas para a produção de análogos de macbecina por meio de HPLCusando-se o protocolo convencional descrito acima.

O isolado produtivo selecionado foi denominado BIOT-3806.2.3 Identificação de compostos de BIQT-3806

Amostras foram analisadas como descrito em Métodos Geraisusando LCMS método 1.

Tabela 4 - compostos identificados por LCMS

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Exemplo 3 - Geração de BIOT-3870: uma cepa deActinosynnema pretiosum em que o homólogo de gdmM, mbcM, apresentauma deleção na-matriz.

3.1 Clonagem de DNA homólogo à região flanqueadora a jusante dembcM.

Oligos BV145 (SEQ ID NO: 14) e BV146 (SEQ ID NO: 15)foram usados para amplificar uma região de 1421 bp de DNA deActinosynnema pretiosum (ATCC 31280) em uma reação PCR convencionalusando cosmídeo 52 (do exemplo 1) como o modelo e Pfu DNA polimerase.Projetou-se uma extensão a 5' em cada oligo para introduzir sítios de restriçãopara auxiliar a clonagem do fragmento amplificado (Figura 4). O produto dePCR amplificado (PCRwv308, SEQ ID NO: 16, Figura 5A) codificou 33 bpda ponta 3' de mbcM e mais 1368 bp de homologia a jusante. Este fragmentode 1421 bp foi clonado em pUC19 que havia sido linearizado com SmaI,resultando no plasmídeo pWV308.

BVl 45 ATATACf AGTCÃCGTC&CCGGCGCGGTGTCCGCGGÃCTTCGTCÃ&CG

SpeJ(SEQ ID NO: 14)

BV146 ATATCCTAGGCTGGTGGCGGACCTGCGCGCGCGGTTGGGGTGAvrII

(SEQ ID NO: 15)

3.2 Clonagem de DNA homólogo à região de flanqueamento a jusante dembcM.

Oligos BV147 (SEQ ID NO: 17) e BV148 (SEQ ID NO: 18)foram usados para amplificar uma região de DNA de 1423 bp deActinosynnema pretiosum (ATCC 31280) em uma reação PCR convencionalusando cosmídeo 52 (do exemplo 1) como o modelo e Pfii DNA polimerase.Projetou-se uma extensão a 5' em cada oligo para introduzir sítios de restriçãopara auxiliar a clonagem do fragmento amplificado (Figura 4). O produto dePCR amplificado (PCRwv309, SEQ ID NO: 19, Figura 5B) codificou 30 bpda ponta 5' do mbcM e mais 1373 bp de homologia a montante. Estefragmento de 1423 bp foi clonado em pUC19 que havia sido linearizado com

SmaI, resultando no plasmideo pWV309.

BVl47 ATATCCTAGGCACCACGTCGTGCTCGACCTCGCCCGCCACGCAvrII

(SEQ ID NO: 17)

BVl48 ATATTCTAGACGCTGTTCGACGCGGGCGCGGTCACCACGGGCXbaI

(SEQ ID NO: 18)

Os produtos PCRwv308 e PCRwv309 foram clonados empUC19 na mesma orientação para usar o sítio PstI no poliligante pUC19 paraa próxima etapa de clonagem.

O fragmento de 1443 bp AvrII/Pstl do pWV309 foi clonado nofragmento de 4073 bp AvrII/PstI do pWV308 para preparar pWV310.Portanto, pWV310 continha um fragmento Spel/Xbal codificando DNAhomólogo às regiões flanqueadoras de mbcM fundidas em um sítio AvrII.Este fragmento de 2816 bp SpeI/XbaI foi clonada em pKC1132 (Bierman etal., 1992) que havia sido linearizado com SpeI para criar pWV320.

3.3 Transformação de Actinosynnema pretiosum subespécie pretiosumEscherichia coli ΕΤ12567, abrigando o plasmídeo pUZ8002foi transformado com pWV320 por meio de eletroporação para gerar a cepadoadora de E. coli para conjugação. Esta cepa foi usada para transformarActinosynnema pretiosum subespécie pretiosum por meio de conjugaçãovegetativa (Matsushima et al, 1994). Exconjugantes foram plaqueados emMeio 4 e incubados a 28°C. Placas foram sobrepostas após 24 h com 50 mg/lde apramicina e 25 mg/l de ácido naldíxico. Como pWV320 é incapaz dereplicar em Actinosynnema pretiosum subespécie pretiosum, antecipou-se quecolônias resistentes à apramicina são transformantes que continhamplasmídeo pWV320 integrado no cromossomo por meio de recombinaçãohomóloga via uma das regiões de homologia de flanqueamento de mbcMportadas pelo plasmídeo.

DNA genômico foi isolado de seis exconjugantes e foidigerido e analisado com Southern blotting. O manchamento mostrou que emquatro dos seis isolados havia ocorrido integração na região de homologia amontante e, em dois dos seis isolados, ocorrera integração homóloga naregião a jusante. Uma cepa resultante de integração homóloga na região amontante (denominada BIOT-3831) foi selecionada para seleção decruzamentos secundários. Uma cepa resultante de integração homóloga naregião a jusante (BIOT-3832) também foi selecionada para seleção decruzamentos secundários.

3.4 Seleção de cruzamentos secundários

Cepas foram aplicadas em pedaços sobre meio 4(suplementado com 50 mg/l de apramicina) e desenvolvidas a 28°C durantequatro dias. Usou-se uma seção de 1 cm de cada pedaço* para inocular 7 mlde ISP2 modificado (0,4 % de extrato de levedura, 1 % de extrato de malte,0,4 % de dextrose em 1 litro de água destilada) sem antibiótico em um tubofalcon de 50 ml. Culturas foram desenvolvidas durante de 2 a 3 dias, depoissubcultivadas em (5 % de inóculo) em mais 7 ml de ISP2 modificado (veracima) em um tubo falcon de 50 ml. Após de 4 a 5 gerações de subcultivo asculturas foram sonicadas, diluídas serialmente, plaqueadas sobre Meio 4 eincubadas a 28°C durante quatro dias. Em seguida, colônias simples foramplaqueadas em duplicata em Meio 4 contendo apramicina e sobre Meio 4 nãocontendo antibiótico e as placas foram incubadas a 28°C durante quatro dias.Pedaços que se desenvolveram sobre a placa sem antibiótico mas que não sedesenvolveram sobre a placa de apramicina foram re-aplicadas sobre +/-placas de apramicina para confirmar que haviam perdido o marcador deantibiótico. A cepa mutante codifica uma proteína de mbcmM com umadeleção na-matriz de 502 aminoácidos (Figura 6A, SEQ ID NOs: 20 e 21;Figura 6B mostra a seqüência de proteína codificada, SEQ ID NO: 22).

Mutantes de deleção de mbcM foram aplicados sobre Meio 4 edesenvolvidos a 28°C durante quatro dias. Usou-se um tampão circular de 6mm de cada pedaço para inocular tubos falcon individuais de 50 ml contendo10 ml meio de semeadura (adaptado de Meio 1 - 2 % de glicose, 3 % deamido solúvel, 0,5 % de sólidos de milho macerados, 1 % de farinha de soja,0,5 % de peptona, 0,3 % de cloreto de sódio, 0,5 % de carbonato de cálcio).Estas culturas de semeadura foram incubadas durante 2 dias a 28°C, 200 rpmcom uma extensão de oscilação de 2 polegadas (5,08 cm). Estes foram usadosentão para inocular (0,5 ml em 10 ml) meio de produção (meio 2 - 5 % deglicerol, 1 % de sólidos de milho macerados, 2 % de extrato de levedura, 2 %de diidrogênio fosfato de potássio, 0,5 % de cloreto de magnésio, 0,1 % decarbonato de cálcio) e foram desenvolvidos a 28°C durante 24 horas e, então,a 26°C durante mais 5 dias. Metabólitos secundários foram extraídos eanalisados por meio de LCMS para a produção de análogos de macbecinacomo descrito em Métodos Gerais.

3.5 Identificação de 14 e 15 de BIOT-3 872

Extratos da fermentação descritos no Exemplo 3.4 foramgerados e analisados por meio de LCMS como descrito em Métodos Geraisusando LCMS método 1. Não se observou macbecina e observou-se doiscomponentes novos importantes. Os compostos apresentaram ascaracterísticas físico-químicas mostradas na Tabela 5 abaixo:

Tabela 5 - compostos identificados por LCMS

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Mostrou-se que os compostos 14 e 15 são idênticos aosanálogos de mabceína 7-O-carbamoil-pré-macbecina e 7-0-carbamoil-15-hidroxi-pré-macbecina que foram indicados previamente

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Note-se que a remoção da função de MbcM5 seja porintegração em mbcM (Exemplo 2) ou deleção do gene mbcM produz osmesmos compostos; 14 e 15. Análise da relação entre as estruturas observadase a via biossintética indica que uma quantidade de enzimas não funcionaadicionalmente a MbcM. No caso do composto 15 estes são MbcP, MbcMTle MbcMT2 e, no caso do composto 14, também não se observa a função deMbcP450. Como descrito acima pode haver diversas razões porque estasproteínas podem não ser funcionais neste sistema, por exemplo, compostos 14

3.6 Seleção de colônias individuais por meio de geração de protoplastos deBIOT-3872

Protoplastos foram gerados de BIOT-3872 usando-se ummétodo adaptado de Weber e Losick 1988 com as seguintes alterações demeios; Actinosynnema pretiosum culturas foram desenvolvidas em placasISP2 (meio 3) durante 3 dias a 28°C e usou-se um produto de raspagem de 5mm2 para inocular 40 ml de caldo de ISP2 suplementado com 2 ml de glicinaestéril a 10 % (peso/volume) em água. Protoplastos foram gerados comodescrito por Weber e Losick 1988 e, então, regenerados em placas R2 (receitaR2 - sacarose 103 g, K2SO4 0,25 g, MgCl2«6H20 10,12 g, glicose 10 g, DifcoCasaminoacids 0,1 g, Difco Bacto agar 22 g, água destilada a 800 ml, amistura foi esterilizada por meio de autoclavagem a 121°C durante 20minutos. Após autoclavagem, adicionou-se as seguintes soluçõesautoclavadas; KH2PO4 a 0,5 % 10 ml, CaCl2«2H20 a 3,68 % 80 ml, L-prolinaa 20 % 15 ml, tamponador TES a 5,73 % (pH 7,2) 100 ml. Solução de traçosde elementos (ZnC1"2 40mg, FeC1"3•6H2O 200 mg, CuC1"2•2H2O 10 mg,MnC1"2•4H20 10 mg, Na2B4O7•10H2O 10 mg, (NH4) 6Μο7O24•4Η20 10 mg,água destilada a 1 litro) 2 ml, NaOH (1N)(não esterilizado)5 ml).

80 colônias individuais foram aplicadas sobre placas MAM(meio 4) e analisadas quanto à produção de análogos de macbecina comodescrito acima. A maior parte dos pedaços gerados de protoplastosproduziram em níveis baixos similares à cepa parental. 15 das 80 amostrastestadas produziram significamente mais 14 e 15 do que a cepa parenteral.Observou-se que a melhor cepa produtora, BIOT-3870 (também denominadaWV4a-33) produz 14 e 15 em níveis significativamente maiores do que a cepaparental e foi selecionada para uso em experimentos futuros.

Exemplo 4 - Introdução em WV4a-33 para gerar 4,5-diidro-11-O-desmetil-15-desmetóxi-18,21 -didesoximacbecina

4.1 Biotransformação de ácido 3-amino-benzóico com WV4a-33 (ΒΙΟΤ-3870)

WV4a-33 foi aplicado sobre placas MAM (meio 4) edesenvolvidas a 28°C durante três dias. Usou-se um tampão circular de 6 mmpara inocular tubos falcon individuais de 50 ml contendo 10 ml meio desemeadura (adaptado de meio 1 - 2 % de glicose, 3 % de amido solúvel, 0,5 %de sólidos de milho macerados, 1 % de farinha de soja, 0,5 % de peptona, 0,3% de cloreto de sódio, 0,5 % de carbonato de cálcio). Estas culturas desemeadura foram incubadas durante 65 horas a 28°C, 200 rpm com umaextensão de oscilação de 2 polegadas (5,08 cm). Estes foram usados entãopara inocular (1 ml em 10 ml) meio de produção modificado (adaptado demeio 2 - 5 % de glicerol, 1 % de sólidos de milho macerados, 2 % de extratode levedura, 2 % de diidrogênio fosfato de potássio, 0,5 % de cloreto demagnésio, 0,1 % de meio de carbonato de cálcio é deixado sedimentar durantede 2 a 60 dias e a camada de topo é tomada como o meio de produção) eforam desenvolvidos a 26°C durante 24 horas. Adicionou-se 0,1 ml de umasolução de consumo de 200 mM (ácido 3-aminobenzóico dissolvido emmetanol) em cada tubo falcon dando uma concentração de alimentação finalde 2 mM. Tubos foram incubados durante mais 6 dias a 26°C. Em paralelo,usou-se culturas de semeadura para inocular meio 2. Análise destas culturas(ver abaixo) mostrou que compostos idênticos foram produzidos em ambos ostipos de meio de produção, porém observou-se titulações maiores quando seusa o meio modificado.

4.2 Identificação de 4,5-diidro-11-O-desmetil-15-desmetóxi-18,21-didesoximacbecina de culturas de WV4a-33 alimentadas com ácido 3-aminobenzóico

Extratos da fermentação descrita no exemplo 2,7 foramgerados e analisados por meio de LCMS como descrito em Métodos Gerais.Os compostos 14 e 15 foram produzidos como esperado. Adicionalmente,observou-se claramente um composto novo 16 que não pôde ser observadoem extratos de quaisquer fermentações que não receberam alimentação deácido 3-aminobenzóico. 16 eluiu mais tarde do que 14 ou 15 e apresentou ascaracterísticas físico-químicas como descrito na Tabela 6 abaixo.Com base nos dados disponíveis 16 foi identificado como 4,5-diidro-11 -O-desmetil-15-desmetóxi-18,21 -didesoximacbecina.

Tabela 6 - compostos identificados por LCMS

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Exemplo 5 - Produção e Isolamento de 4,5-diidro-11-O-desmetil-15-desmetóxi-18,21-didesoximacbecina (método alternativo)

5.1 Fermentação de 4,5-diidro-11-O-desmetil-15-desmetóxi-18,21-didesoximacbecina de culturas de WV4a-33 alimentadas com ácido 3-aminobenzóico

WV4a-33 foi aplicado em placas MAM (meio 4) edesenvolvido a 289C durante três dias. Usou-se dois tampões circulares de 6mm para inocular 250 ml de frascos de agitação cônicos contendo 30 ml demeio de semeadura (adaptado de meio 1 - 2 % de glicose, 3 % de amidosolúvel, 0,5 % de sólidos de milho macerados, 1 % de farinha de soja, 0,5 %de peptona, 0,3 % de cloreto de sódio, 0,5 % de carbonato de cálcio). Seisfrascos foram inoculados. Estas culturas de semeadura foram incubadasdurante 65 horas a 28°C, 200 rpm com uma extensão da oscilação de 1polegada (2,54 cm). Estes foram usados então para inocular (1 ml em 10 ml)170 tubos falcon, cada um contendo 10 ml de meio de produção modificado(adaptado de meio 2 - 5 % de glicerol, 1 % de sólidos de milho macerados, 2% de extrato de levedura, 2 % de diidrogênio fosfato de potássio, 0,5 % decloreto de magnésio, 0,1 % de meio de carbonato de cálcio é deixadosedimentar durante de 2 a 60 dias e a camada de topo é tomada como o meiode produção) e foram desenvolvidos a 26°C durante 24 horas. Adicionou-se0,1 ml de uma solução de consumo 200 mM (ácido 3-aminobenzóicodissolvido em metanol) em cada tubo falcon dando uma concentração final desemeadura de 2 mM. Tubos foram incubados durante mais 6 dias a 26°C. Asculturas foram combinadas (aproximadamente 1,4 1) e os tubos falcon foramlavados (cada um com 7 ml de água). O líquido de lavagem foi combinado(aproximadamente 1,4 1). As culturas combinadas e líquidos de lavagemforam usados para isolamento de 4,5-diidro-ll-0-desmetil-15-desmetóxi-18,21-didesoximacbecina (aproximadamente 3 1 no total). Em paralelo, asculturas de semeadura foram usadas para inocular 30 ml de meio de produçãomodificado (3 ml) seguido do mesmo regime de incubação e alimentaçãocomo descrito acima (concentração final de alimentação de 2 mM). Os frascosforam incubados em um agitador de extensão da oscilação de 2 polegadas(5,08 cm). Níveis de produção foram estimados por meio de LCMS comosendo aproximadamente entre 50 % e 90 % daqueles medidos para as culturasde produção em tubos falcon.

5.2 Isolamento e caracterização de 4,5-diidro-11 -O-desmetil-15-desmetóxi-18,21-didesoximacbecina

O caldo de fermentação (31) foi extraído duas vezes com umvolume igual de acetato de etila (EtOAc). Os extratos orgânicos foramcombinados e o solvente removido in vácuo a 40°C dando 1,2 g de umresíduo oleoso. Este resíduo foi então cromatografado em coluna de sílica-gel60 (30 χ 2,5 cm) com um gradiente escalonado de 100 % de CHCI3 aCHClsiMeOH (97:3) e frações coletadas de aproximadamente 250 ml. Asfrações foram monitoradas por meio de HPLC analítica. Frações contendo 16foram combinadas e solvente removido in vácuo a 40°C dando 435 mg de 16semi-puro. Este material semi-puro foi purificado adicionalmente por meio deHPLC de fase invertida em uma coluna Phenomenex-Luna C88-BDS (21,2 χ250 mm, tamanho de partículas de 5 mícrons) eluindo com um gradiente deágua:acetonitrilo, (77:23) a (20:80), ao longo de 25 min a uma taxa de fluxode 21 ml/min. 16 eluiu a 17 min e as frações relevantes foram combinadas, osolvente foi removido a pressão reduzida dando 16 como um pó branco (125mg).

A pureza de 16 foi confirmada por meio de LCMS usando-semétodo 1 como descrito em Métodos Gerais. LCMS: 16, RT [tempo deretenção] = 12,9 min ([M+Na]+, m/z = 509,4; [M-H]", m/z = 485,5.

Dados de RMN do próton coletados a 400 MELz foramconsistentes com a estrutura mostrada.

<formula>formula see original document page 62</formula>

Composto 16

Exemplo 6 Geração de 4,5-diidro-11 -O-desmetil-15-desmetóxi-17-fluoro-18,21-didesoximacbecina por meio de introdução de ácido 5-amino-2-fluorobenzóico a BIOT-3870

6.1 Biotransformação de ácido 5-amino-2-fluorobenzóico com BIQT-3870

BIOT-3870 foi aplicado em placas MAM (meio 4) e isto foidesenvolvido a 28°C durante três dias. Usou-se um tampão circular de 6 mmpara inocular tubos falcon individuais de 50 ml contendo 10 ml de meio desemeadura (adaptado de meio 1 - 2 % de glicose, 3 % de amido solúvel, 0,5 %de sólidos de milho macerados, 1 % de farinha de soja, 0,5 % de peptona, 0,3% de cloreto de sódio, 0,5 % de carbonato de cálcio). Estas culturas desemeadura foram incubadas durante 65 horas a 28°C, 200 rpm com umaextensão de oscilação de 2 polegadas (5,08 cm). Estes foram usados entãopara inocular (1 ml em 10 ml) meio de produção modificado (adaptado demeio 2 - 5 % de glicerol, 1 % de sólidos de milho macerados, 2 % de extratode levedura, 2 % de diidrogênio fosfato de potássio, 0,5 % de cloreto demagnésio, 0,1 % de meio de carbonato de cálcio é deixado sedimentar durantede 2 a 60 dias e a camada de topo é tomada como o meio de produção) eforam desenvolvidos a 26°C durante 24 horas. Adicionou-se 0,1 ml de umasolução de consumo de alimentação 200 mM (ácido 5-amino-2-fluorobenzóico dissolvido em metanol) em cada tubo falcon dando umaconcentração final de alimentação 2 mM. Tubos foram incubados durantemais 6 dias a 26°C.

6.2 Identificação de 4,5-diidro-11-O-desmetil-15-desmetóxi-17-fluoro-18,21-didesoximacbecina, 17

Análise foi realizada como descrito em Métodos Gerais

usando LCMS método 1. Adicionalmente a 14 e 15, observou-se umcomposto novo com características de LCMS descritas na Tabela 7. Estesdados foram consistente com o composto titular.

Tabela 7.

<table>table see original document page 63</column></row><table>

6.3 Produção e extração de 4,5-diidro-11-O-desmetil-15-desmetóxi-17-fluoro-18,21 -didesoximacbecina, 17

BIOT-3870 foi aplicado em placas MAM (meio 4) edesenvolvido a 28°C durante três dias. Usou-se dois tampões circulares de 6mm para inocular 250 ml de frascos de agitação cônicos contendo 30 ml demeio de semeadura (adaptado de meio 1 - 2 % de glicose, 3 % de amidosolúvel, 0,5 % de sólidos de milho macerados, 1 % de farinha de soja, 0,5 %de peptona, 0,3 % de cloreto de sódio, 0,5 % de carbonato de cálcio). Seisfrascos foram inoculados. Estas culturas de semeadura foram incubadasdurante 65 horas a 28°C, 200 rpm com uma extensão de oscilação de 1polegada (2,54 cm). Estes foram usados então para inocular (1 ml em 10 ml)170 tubos falcon cada um contendo 10 ml de meio de produção modificado(adaptado de meio 2 - 5 % de glicerol, 1 % de sólidos de milho macerados, 2% de extrato de levedura, 2 % de diidrogênio fosfato de potássio, 0,5 % decloreto de magnésio, 0,1 % de meio de carbonato de cálcio é deixadosedimentar durante de 2 a 60 dias e a camada de topo é tomada como o meiode produção) e foram desenvolvidos a 26°C durante 24 horas. Adicionou-se0,1 ml de uma solução de consumo de alimentação 200 mM (ácido 5-amino-2-fiuorobenzóico dissolvido em metanol) em cada tubo falcon dando umaconcentração final de alimentação de 2 mM. Tubos foram incubados durantemais 6 dias a 26°C. As culturas foram combinadas (aproximadamente 1,4 1) eos tubos falcon foram lavados (cada um com 7 ml de água). O líquido delavagem foi combinado (aproximadamente 1,4 1). As culturas combinadas elíquidos de lavagem foram usados para isolamento de 4,5-diidro-l I-O-desmetil-15-desmetóxi-17-fluoro-18,21 -didesoximacbecina ver abaixo.6.4 Purificação e caracterização de 4,5-diidro-l 1-O-desmetil-15-desmetóxi-17-fluoro-18,21 -didesoximacbecina, 17

O caldo de fermentação (~3 1) foi extraído duas vezes com umvolume igual de acetato de etila (EtOAc). Os extratos orgânicos foramcombinados e o solvente removido in vácuo a 40°C dando 3,0 g de umresíduo oleoso. Este resíduo foi então cromatografado em coluna de sílica-gel60 eluindo com 2 % de metanol em CHCl3 e frações coletadasaproximadamente 250 ml. As frações foram monitoradas por meio de HPLCanalítica. Frações contendo foram combinadas e o solvente removido in vácuoa 40°C. Este material semi-puro foi purificado adicionalmente por meio deHPLC de fase invertida numa coluna Phenomenex-Luna Cis-BDS (21,2 χ 250mm, tamanho de partículas de 5 mícrons) eluindo com um gradiente deágua:acetonitrilo, (77:23) a (20:80), ao longo de 25 min a uma taxa de fluxode 21 ml/min. 17 eluiu a 18 min e as frações relevantes foram combinadas e osolvente removido a pressão reduzida dando [] como um pó branco (54 mg).Dados de RMN adquiridos em d6-acetona foram inteiramente consistentescom a estrutura reportada.A pureza de 17 foi confirmada como descrito em MétodosGerais usando LCMS método 2. Realizou-se medições com comprimentos deonda múltiplos e usando análise MS tanto em modo positivo como em modonegativo. LCMS: 17, RT [tempo de retenção] = 11,3 min ([M-H]-, m/z =503,3 ; [M+Na]+, m/z = 527,3 ; [2M+Na]+, m/z = 1032,0).

<formula>formula see original document page 65</formula>

Exemplo 7 Geração de 4,5-diidro-ll-Q-desmetil-15-desmetóxi-18-fluoro-18,21-didesoximacbecina por meio de introdução de ácido 5-amino-3-fluorobenzóico em BIQT-3870

7.1 Biotransformação de ácido 5-amino-3-fluorobenzóico com BIQT-3870BIOT-3870 foi aplicado em placas MAM (meio 4) edesenvolvido a 28°C durante três dias. Usou-se um tampão circular de 6 mmpara inocular tubos falcon individuais de 50 ml contendo 10 ml meio desemeadura (adaptado de meio 1 - 2 % de glicose, 3 % de amido solúvel, 0,5 %de sólidos de milho macerados, 1 % de farinha de soja, 0,5 % de peptona, 0,3% de cloreto de sódio, 0,5 % de carbonato de cálcio). Estas culturas desemeadura foram incubadas durante 65 horas a 28°C, 200 rpm com umaextensão de oscilação de 2 polegadas (5,08 cm). Estes foram usados entãopara inocular (1 ml em 10 ml) meio de produção modificado (adaptado demeio 2 - 5 % de glicerol, 1 % de sólidos de milho macerados, 2 % de extratode levedura, 2 % de diidrogênio fosfato de potássio, 0,5 % de cloreto demagnésio, 0,1 % de meio de carbonato de cálcio é deixado sedimentar durantede 2 a 60 dias e a camada de topo é tomada como o meio de produção) e

18

0

Composto 17foram desenvolvidos a 26°C durante 24 horas. Adicionou-se 0,1 ml de umasolução de consumo 200 mM (ácido 5-amino-3-fluorobenzóico dissolvido emmetanol) em cada tubo falcon dando uma concentração final de alimentaçãode 2 mM. Tubos foram incubados durante mais 6 dias a 26°C.7.2 Identificação de 4,5-diidro-l l-O-desmetil-15-desmetóxi -18-fluoro-18,21 -didesoximacbecina, 18

Análise foi realizada como descrito em Métodos Geraisusando LCMS método 1. Adicionalmente a 14 e 15, observou-se dois novoscompostos com características de LCMS descritas na Tabela 8. Estes dadosforam consistentes com o composto titular, 18 e seu análogo C15-hidroxilado,19.

Tabela 8.

<table>table see original document page 66</column></row><table>

7.3 Produção e extração de 4,5-diidro-l 1-O-desmetil-15-desmetóxi-18-fluoro-18,21 -didesoximacbecina, 18

BIOT-3870 foi aplicado em placas MAM (meio 4) edesenvolvido a 28°C durante três dias. Usou-se dois tampões circulares de 6mm para inocular 250 ml frascos de agitação cônicos contendo 30 ml de meiode semeadura (adaptado de meio 1 - 2 % de glicose, 3 % de amido solúvel,0,5 % de sólidos de milho macerados, 1 % de farinha de soja, 0,5 % depeptona, 0,3 % de cloreto de sódio, 0,5 % de carbonato de cálcio). Seisfrascos foram inoculados. Estas culturas de semeadura foram incubadasdurante 65 horas a 28°C, 200 rpm com uma extensão da oscilação de 1polegada (2,54 cm). Estes foram usados então para inocular (1 ml em 10 ml)170 tubos falcon cada contendo 10 ml de meio de produção modificado(adaptado do meio 2 - 5 % de glicerol, 1 % de sólidos de milho macerados, 2% de extrato de levedura, 2 % de diidrogênio fosfato de potássio, 0,5 % decloreto de magnésio, 0,1 % de meio de carbonato de cálcio é deixadosedimentar durante de 2 a 60 dias e a camada de topo é tomada como o meiode produção) e foram desenvolvidos a 26°C durante 24 horas. Adicionou-se0,1 ml de uma solução de consumo de alimentação 200 mM (ácido 5-amino-3-fluorobenzóico dissolvido em metanol) em cada tubo falcon dando umaconcentração final de alimentação de 2 mM. Tubos foram incubados durantemais 6 dias a 26°C. As culturas foram combinadas (aproximadamente 1,4 1) eos tubos falcon foram lavados (cada um com 7 ml de água). O líquido delavagem foi combinado (aproximadamente 1,4 1). As culturas combinadas elíquidos de lavagem foram usados para isolamento de 4,5-diidro-11-O-desmetil-15-desmetóxi-18-fluoro-18,21 -didesoximacbecina, ver abaixo.

7.4 Isolamento e caracterização de 4,5-diidro-ll-Q-desmetil-15-desmetóxi-18-fluoro-18,21 -didesoximacbecina, 18

O caldo de fermentação (~3 1) foi extraído duas vezes com umvolume igual de EtOAc. Os extratos orgânicos foram combinados e o solventeremovido in vácuo a 40°C dando 3,4 g de um resíduo oleoso. Este resíduo foientão cromatografado sobre sílica-gel 60 (coluna de 30 x 2,5 cm) com umgradiente escalonado de 100 % de CHCl3 a CHCl3 :MeOH (96:4) e coleta defrações de aproximadamente 250 ml. As frações foram monitoradas por meiode HPLC analítica. Frações contendo 18 foram combinadas e o solventeremovido in vácuo a 40°C dando 528 mg de 18 semi-puro. Este materialsemi-puro foi purificado adicionalmente por meio de HPLC de fase invertidaem uma coluna Phenomenex-Luna Cis-BDS (21,2 x 250 mm, tamanho departículas de 5 mícrons) eluindo com um gradiente de água:acetonitrilo,(77:23) a (20:80), ao longo de 25 min a uma taxa de fluxo de 21 ml/min. 18eluiu a 20 min e as frações relevantes foram combinadas, o solvente removidoa pressão reduzida dando 18 como um pó branco (224 mg). Dados adquiridosem d6-acetona foram inteiramente consistentes com a estrutura reportada.

A pureza de 18 foi confirmada como descrito em MétodosGerais usando LCMS método 2. Realizou-se medições com comprimentos deonda múltiplos e usando MS análise tanto em modo positivo como em modonegativo. LCMS: 18, RT [tempo de retenção] = 11,9 min ([M-H]", m/z =503,1; [M+Na]+, m/z = 527,2; [2M+Na]+, 1031,5).

<formula>formula see original document page 68</formula>

Exemplo 8 - Geração de 4,5-diidro-ll-Q-desmetil-15-desmetóxi-18,21-didesóxi-17,18,21-trifluoromacbecina por meio de introdução de ácido 5-amino-2,3,6-tri-fluorobenzóico em BIQT-3870

8.1 Biotransformação de ácido 5-amino-2,3,6-tri-fluorobenzóico comBIQT-3870

BIOT-3870 foi aplicado em placas MAM (meio 4) edesenvolvido a 28°C durante três dias. Usou-se um tampão circular de 6 mmpara inocular tubos falcon individuais de 50 ml contendo 10 ml meio desemeadura (adaptado de meio 1 - 2 % de glicose, 3 % de amido solúvel, 0,5 %de sólidos de milho macerados, 1 % de farinha de soja, 0,5 % de peptona, 0,3% de cloreto de sódio, 0,5 % de carbonato de cálcio). Estas culturas desemeadura foram incubadas durante 65 horas a 28°C, 200 rpm com umaextensão de oscilação de 2 polegadas (5,08 cm). Estes foram usados entãopara inocular (1 ml em 10 ml) meio de produção modificado (adaptado demeio 2 - 5 % de glicerol, 1 % de sólidos de milho macerados, 2 % de extratode levedura, 2 % de diidrogênio fosfato de potássio, 0,5 % de cloreto demagnésio, 0,1 % de meio de carbonato de cálcio é deixado sedimentar durantede 2 a 60 dias e a camada de topo é tomada como o meio de produção) eforam desenvolvidos a 26°C durante 24 horas. Adicionou-se 0,1 ml de umasolução de consumo de alimentação 200 mM (ácido 5-amino-2,3,6-tri-fluorobenzóico dissolvido em metanol) em cada tubo falcon dando umaconcentração final de alimentação de 2 mM. Tubos foram incubados durantemais 6 dias a 26°C.

8.2 Identificação de 4,5-diidro-11-O-desmetil-15-desmetóxi-18,21 -didesóxi-17,18,21 -trifluoromacbecina, 20

Análise foi realizada como descrito em. Métodos Geraisusando LCMS método 1. Adicionalmente a 14 e 15, observou-se umcomposto novo com características de LCMS descritas na Tabela 9. Estesdados foram consistentes com o composto titular.

Tabela 9.

<table>table see original document page 69</column></row><table>

<formula>formula see original document page 69</formula>

Exemplo 9 - Geração de uma cepa de Actinosynnema pretiosum em quembcM apresenta uma deleção na-matriz e mbcMTl, mbcMT2, mbcP embcP450 foram deletados adicionalmente.

9.1 Clonagem de DNA homólogo à região flanqueadora a jusante dembcMT2

Oligos Is4de11(SEQ ID NO: 23) e Is4de12a (SEQ ID NO: 24)foram usados para amplificar uma região de DNA de 1595 bp deActinosynnema pretiosum (ATCC 31280) em uma reação PCR convencionalusando cosmídeo 52 (do exemplo 1) como o modelo e Pfu DNA polimerase.Uma extensão a 5' foi projetada no oligo Is4del2a para introduzir um sítioAvrII para auxiliar a clonagem do fragmento amplificado (Figura 7). Oproduto de PCR amplificado (l+2a, Figura 8 SEQ ID NO: 25) codificou 196bp da ponta 3' de mbcMT2 e mais 1393 bp da homologia a jusante. Estefragmento de 1595 bp foi clonada em pUC19 que havia sido linearizado comSmaI, resultando no plasmídeo pLSSl+2a.

Is4del1 (SEQ !D NO: 23)

5' - GGTCACTGGCCGfcAGCGCACG GTGTCATGG - 3'

Is4del2a (SEQ ID NO: 24)

S' - CCTAG GCG ACTAC CCCGC&CTACTACACCG AGCAGG - 3'

9.2 Clonagem de DNA homólogo à região de flanqueamento a jusante dembcM.

Oligos Is4del3b (SEQ ID NO: 26) e Is4del4 (SEQ ID NO: 27)foram usados para amplificar uma região de DNA de 1541 bp deActinosynnema pretiosum (ATCC 31280) em uma reação PCR convencionalusando cosmídeo 52 (do exemplo 1) como o modelo e Pfu DNA polimerase.projetou-se uma extensão em 5' no oligo Is4del3b para introduzir um sítioAvrII para auxiliar a clonagem do fragmento amplificado (Figura 7). Oproduto de PCR amplificado (3b+4, Figura 9, SEQ ID NO: 28) codificou-100 bp da ponta 5' de mbcP e mais -1450 bp de homologia a montante. Estefragmento de -1550 bp foi clonada em pUC19 que havia sido linearizado comSmaI, resultando no plasmídeo pLSS3b+4.

Is4del3b (SEQ (D NO: 26)

5' - CCTAG GAACGiJQTAGGCGG SC AGGTCGGTÇ - 3*

Is4del4 (SEQ ID NO: 27)

5' - GTGTGCGGGCCAGCTCGCCCAGCACGCeC&C - 3'

Os produtos l+2a e 3b+4 foram clonados em pUC19 para usaros sítios HindIII e BamHI no poliligante pUC19 para a próxima etapa declonagem.

O fragmento AvrIl/HindIII de 1621 bp de pLSSl+2a e ofragmento AvrII/BamHI de 1543 bp de pLSS3b+4 foram clonados nofragmento HindIII/BamHI de 3556 bp do pKC1132 para preparar pLSS315.Portanto, pLSS315 continha um fragmento de HindIII/BamHI codificandoDNA homólogo às regiões flanqueadoras das quatro regiões de deleção deORF desejadas em um sítio AvrII (Figura 7).

9.3 Transformação de BIOT-3870 com pLSS315

Escherichia coli ET12567, abrigando o plasmídeo pUZ8002foi transformado com pLSS315 por meio de eletroporação para gerar a cepadoadora de E. coli para conjugação. Esta cepa foi usada para transformarBIOT-3870 por meio de conjugação vegetativa (Matsushima et al, 1994).Exconjugantes foram plaqueados em meio MAM (1 % de amido de trigo,0,25 % de sólidos de milho macerados, 0,3 % de extrato de levedura, 0,3 % decarbonato de cálcio, 0,03 % de sulfato de ferro, 2 % de agar) e incubados a28°C. Placas foram sobrepostas após 24 h com 50 mg/l de apramicina e 25mg/l de ácido naldíxico. Como pLSS315 é incapaz de replicar em BIOT-3870, antecipou-se que colônias resistentes à apramicina são transformantesque continham plasmídeo integrado no cromossomo por meio derecombinação homóloga via as regiões de homologia portadas por plasmídeo.

9.4 Seleção de cruzamentos secundários

Três transformantes primários de BIOT-3870:pLSS315 foramselecionados para subcultivo visando selecionar cruzamentos secundários.

Cepas foram aplicadas sobre meio MAM (suplementado com50 mg/l de apramicina) e desenvolvidas a 28°C durante quatro dias. Usou-sedois tampões circulares de 6 mm para inocular 30 ml de ISP2 (0,4 % deextrato de levedura, 1 % de extrato de malte, 0,4 % de dextrose, nãosuplementado com antibiótico) em um frasco cônico de 250 ml. Culturasforam desenvolvidas durante de 2 a 3 dias, depois subcultivadas (5 % deinóculo) em 30 ml de ISP2 em um frasco cônico de 250 ml. Após de 4 a 5ciclos de subcultivo as culturas foram protoplastadas como descrito noexemplo 3,6, os protoplastos foram diluídos serialmente, plaqueados em meiode regeneração (ver Exemplo 3.6) e incubados a 28°C durante quatro dias. Emseguida, colônias simples foram aplicadas em duplicata em meio MAMcontendo apramicina e em meio MAM não contendo antibiótico e as placasforam incubadas a 28°C durante quatro dias. Sete pedaços derivados do clonen° 1 (n° de 32 a 37) e quatro pedaços derivados do clone n° 3 (n° de 38 a 41)que se desenvolveram na placa sem antibiótico, mas que não sedesenvolveram sobre a placa de apramicina, foram re-aplicadas sobre placasde apramicina +/- para confirmar que haviam perdido o marcador deantibiótico.

Produção de análogos de macbecina foi realizada comodescrito na seção de Métodos Gerais. A análise foi realizada como descritoem Métodos Gerais usando LCMS método 1. Composto 14 foi produzidocom rendimentos comparáveis com a cepa parental BIOT-3870 e não seobservou qualquer produção de composto 15 para pedaços 33, 34, 35, 37, 39 e41. Este resultado mostra que as cepas mutantes desejadas apresentam umadeleção de 3892 bp do aglomerado de macbecina contendo os genes mbcP,mbcP450, mbcMTl e mbcMT2 adicionalmente à deleção original de mbcM.

Exemplo 10 - Ligação a Hsp90

Determinações de Kd e calorimetria de titulação isotérmica.

Hsp90 de levedura foi dialisada contra 20 mM de Tris pH 7,5contendo 1 mM de EDTA e 5 mM de NaCl e então diluída a 0,008 mM nomesmo tamponador, porém contendo 2 % de DMSO. Os compostos de testeforam dissolvidos em 100 % de DMSO a uma concentração de 50 mM esubseqüentemente diluídos a 0,1 mM no mesmo tamponador como paraHsp90 com 2 % de DMSO. Calores de interação foram medidos a 30°C emum sistema MSC (Microcal), com um volume de células de 1,458 ml. 10frações de 0,027 ml de 0,100 mM de cada composto de teste foram injetadasem 0,008 mM de Hsp90 de levedura. Calores de diluição foram determinadosem um experimento separado por meio de injeção do composto de teste notamponador contendo 2 % de DMSO, e os dados corrigidos foram ajustadosusando-se um algoritmo não-linear de menos quadrados para ajuste da curva(Microcal Origin) com três variáveis flutuantes: estequiometria, constante deligação e alteração na entalpia de interação. Os resultados são mostradosabaixo na Tabela 10.

Tabela 10 - Valores de Kd para ligação de Hsp90

<table>table see original document page 73</column></row><table>

Exemplo 11 - Dados biológicos - avaliação in vitro da atividade anticâncer deanálogos de 18,21 -didesoximacbecina

Avaliação in vitro dos compostos de teste quanto à atividadeanticâncer em um grupo de linhas de células de tumor humanas em um ensaiode proliferação de monocamada foi realizada como descrito em MétodosGerais usando-se um ensaio modificado de iodeto de propídio.

Os resultados são apresentados na Tabela 11 abaixo, todos osvalores de tratados/controle (% de T/C) mostrados são a média de pelo menos3 experimentos separados. Tabela 12 mostra a IC7o média para os compostosno grupo de linha de células testado, com a macbecina mostrada como umareferência (sendo que a média é calculada como a média geométrica de todasas replicatas).

Tabela 11 - Dados de linhas de células in vitro

<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>

Tabela 12 - Valor médio de ICto do grupo de linha de células

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Todas as referências incluindo patentes e pedidos de patentesreferidos neste pedido são incorporados aqui por referência em sua extensãomais ampla possível.

Nesta descrição e nas reivindicações a seguir, exceto se ocontexto o determinar de outra forma, a palavra 'compreendem', e variações,como 'compreende' e 'compreendendo', serão compreendidas comoimplicando a inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de númerosinteiros indicado, mas sem excluir qualquer outro número inteiro ou etapa ougrupo de números inteiros ou de etapas.

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The application, of which this description and claims formpart, may be used as a basis for priority in respect of any subsequentapplication. The claims of such subsequent application may be directed to anyfeature or combination of features described herein. They may take the formof product, composition, process, or use claims and may include, by way ofexample and without limitation, the following claims:

O pedido, do qual esta descrição e reivindicações fazem parte,pode ser usado como uma base para prioridade com relação a qualquer pedidosubseqüente. As reivindicações do referido pedido subseqüente podem serdirigidas a qualquer característica ou combinação de características aquidescritas. Elas podem apresentar a forma de reivindicações de produto,composição, processo, ou de uso e podem incluir, a título de exemplo e semlimitação, as reivindicações a seguir:LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Biotica Technology Limited

<120> NOVOS COMPOSTOS

<130> IP0042-GB01

<160> 20

<170> PatentIn versão 3.2

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<213> Actinosynnema pretiosum

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cgtgctcgcc gggatcgggc tgcgcggcga ccgcgaccgg ccgggcgggg acgcgacggc 840

gctgctggcc gccgagctgg cggcgcgcag gtcggtgctg ctgctggaca actgcgagca 900

cctggtcgac gccgtggccc acctggtcgc gctcctgctc ccccgctgcc ccgagctgcg 960

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cggggcgctc gcgctggcgc tgtcgctggt ctggtactgg caggtgttcg gccgccagtc 1800

cgagggcgcg cactggctcg ggcgggcgct ggcggtgccc ggcgggccgt ccccggagcg 1860

ggactgcgcg cgggccgccc acctgctcgg cctggccgac ggcgggcacg gggtgggtga 1920

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caagcgcggcgatgctcggccgagacgcaccaaggaggtcccgcgcgccccaacgccaagcacgctcaaccgagcagcgccgacctgacccaagatcgacgctggcgctggcagcgcatccgcggagagcgctgctggtgccggacccgcggacgtgcggtaggcgaggccgcgcgcccgccgacatggcggtcgggtttgtgcgcggacccaggtcacccgcggcccagcgaacgtaactacccacagcagcaccggtggtgtgggattaactcatccggagcgagacagaagaccattaccgcacgacacccgaccccgaaccgcctccttctggcgtaactgctctcgccctgttccccgttcgcgcggggagccgcttacccctgacgaacaacccatcggcccgggtgatggtcgctgcggggcacgggcgctcggacgcggccagtcgccgcgggtgttcacccgtctcggcgggacgtgcagggtcggggcgactgcgccacgacccggtgggatgcgggttc

97440975009756097620976809774097800978609792097980980409810098160982209828098340984009846098520985809864098700987609882098880989409900099060991209918099240993009936099420994809954099600996609972099780998409990099960100020100080100140100200100260100320100380100440100500100560100588

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador30

<220>

<221>

<222>

<223>

misc_feature

(3) . . (3)

s é g ou c

<220>

<221>

<222>

<223>

misc_feature

(10)..(10)

n é g, a, t ou c

<220>

<221>

<222>

<223>

misc_feature

(11) · · (H)

y é c ou t

<220>

<221>

<222>

<223>

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(13)..(13)

n é g, a, t ou c

<220>

<221>

<222>

<223>

misc_feature

(15)..(15)

s é g ou c

<220>

<221>

<222>

<223>

misc_feature

(22)..(22)

n é g, a, t ou c

<220>

<221>

<222>

<223>

misc_feature

(24) .. (24)

y é c ou t

<400> 12

ccscgggcgn ycngsttcga cngygag

27

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n é a, c, g ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(11)

<223> n é a, c, g ou t

<400> 13

cgtcncggan nccggagcac atgccctg

28<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador<400> 14

atatactagt cacgtcaccg gcgcggtgtc cgcggacttc gtcaacg 47

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador<400> 15

atatcctagg ctggtggcgg acctgcgcgc gcggttgggg tg 42

<210> 16

<211> 1421

<212> DNA

<213> Actinosynnema pretiosum

<400> 16

atatactagt

ggccgcctgg

cgccaggggg

ctcgcaccag

gctgcgctgc

caccgacggc

cgcccagctc

gtccggggcg

gcggtgcgcc

accaccggac

accgcggttc

cggcacgtcc

gtcaacagct

gacgggcccg

atgcggatca

ctggcgggtg

cacggcttcg

accaccctcg

cccaagcccg

cgggtggtga

ccggcgctgg

gacgcggtgg

gaccggacgt

accccaaccg

cacgtcaccgcgcggcgacgttcctcgtcagcgctggacaaccttcggctcgcaccacccgcgagcctgccgctggatcggaacgacgacagaccaaccccggcgcccgcccggcgcgactcgccgtcatcgccgttcgatggacctgccaggtggaggtgcaccgccgtgcatggcgggcgccggacattggtgggcgaccgcgctgtgtccgcaagccgacgcgcgagcgcgcgcagg

gcgcggtgtcgggcgccggtcccggtcgggccacggtcgttcagcccgaacggtcgagctccacccgcctcgggcgcgatacgcgccggtccgagtcgtgggccccgcgcctacgaccgggcggcaggcgggagtacaacgctggagatggttcgagggcggtcaccggcgctgttcgacgctcctgctgcgccctgacggggcgagacgctcgcaggtgcaggccccggtccgccacca

cgcggacttcggacccggtggatctcgatcgcgcgtggagccgcgagggcgcccgccgagggccgacccccgaacgggtccgacctcgtccgggcccgagcccctcgcccgccgtgctgtttcgagatcgcggcacctgggagggtccgtgcgccggagcaagagcgggccatatcatcggccaccggccgacctggccagacgaggcggctcgactggtcgcggcacgtgcctaggata

gtcaacgaccgtcggcgacgggggtgcgcgggcagcggcgccgtcgcggcccggtgggcggccacgcgcgtaccgcgccgccgacgggagccggggacgacgccgacccctcgacctcgacctacgccgaggcggtactttcgtccgcgatgctggcggacgcgcgcccggctccgacgatgctcgacgtgcgcccgcgcagctgctggcgcctggcccagccggggcctt

acgcgttccgtggaggacaccggcctgggcgcacggcggatcctgctcacccgagtacgagcgaggcggcccgacaccgtccccgtgatggcgggccgcgcgcgccccaccggggtgctgggtcgtcggccccggacatcgagctaccggcctgcggcaggtcgctgctgggtcgcgaaccccggccgaccgcgggctacggcgaacccgcctcgccgacgcggggcgtc

6012018024030036042048054060066072078084090096010201080114012001260132013801421

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador<400> 17

atatcctagg caccacgtcg tgctcgacct cgcccgccac gc

42

<210> 18<211> 42<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 18

atattctaga cgctgttcga cgcgggcgcg gtcaccacgg gc

42

<210> 19

<211> 1423

<212> DNA

<213> Actinosynnema pretiosum

<400> 19

atatcctagg

atcgactcgg

ccgtccagca

cgaccccgga

aaccgcaccg

tgccacgccc

cggtaggcgc

gacgggccga

aacgagtgct

atcagcacct

cagaccccgc

gcgagccccc

atcaggtgcc

tccacgccga

cggtcgggtc

aatgccctgc

gtcgctcgcg

cgggcaggcg

agtcgaagcc

cgagcacggc

ccgacagccc

gggagagcga

cgcgcgcgga

cgcccgtggt

caccacgtcgtgacgcgggccggtgaagtaacgtggtgcccctcccagcccgtccctgggagccgtactgcgaaccccaccctcgtccggcgtagcccagcgttgcggccggttcggcgggcttgtgcagtgcgccgcagggtggactgcgcccggctgccagcgcctcgcagcccggtggatctcgaagggcggccaggggccaggcgcgcgccgcgcgggcgcgcagcgaccgcgccc

tgctcgacctgaactcgtccgcggcggccgcgccagcaccgtcccggtcccctgcgctccctcctgctcggtccaccagccccgaaccggcgcggtgagcggtcaccacgcaaccggtcgcgcccgcaacgtactcggcccctgcgcctgcctgcgcccggcggcgatcggcggtgttcaaacgcgtcgttcgcggaccagcccgcaaccgcggggacgagccgccaggtgcgtcgaaca

cgcccgccacttcttcacgaatcagcacgtgagtcccgcggcccgccccgaccacgtgcgaccgccgacacaggtccgcctcgtcggccaagggcgtggatgcgcgaacagccgcgccgcgactccagcgacgtcgatcaatcgccctgcattgccctgacgggcgtcgggccggttccgccgggcccacgctcggtgagcggccggggggcgcgcgcagccagcggcaggcgtctagaa

gcgctcacccgcacccgcgtgctgcccgttcgtagtcgtcgccggaaccgcgtccccgcggctccagcggcgtccaggcggccggatcgcagagccggttcacggggcagcgttgtcgtatcgggctcggtgctggtgctgctcgactgcgcccgattgcctggtcgaaccagctgcacgcgcgcccttccacggcctcccgcggcctgccagcgcgggccggcacgacctat

cccgatcatgcgtctccaccctccgccgcccagcccgtccgtacaccgccctccacgaccctccaggtagcaccaggttgcgccgcgaccgagctcgtagcgggatctccgggcacggaccacgccgccccacctctcgtcctgcgcctgtcggcggccaagcagcgcgggccgtcatggtcgccgtgcctgctcgtcgcccggtggcggaccgcctcgtagcgccgggc

6012018024030036042048054060066072078084090096010201080114012001260132013801423

<210> 20<211> 161<212> DNA

<213> Actinosynnema pretiosum<400> 20

ctcgccgacg accggacgtg acgcgcgagc aggccccggc gcggcacgtg ccggggcctgcggggcgtca ccccaaccgc gcgcgcaggt ccgccaccag cctaggcacc acgtcgtgctcgacctcgcc cgccacgcgc tcaccccccg atcatgatcg a

60120161

<210> 21<211> 161<212> DNA<213> Actinosynnema pretiosum

<400> 21

tcgatcatga tcggggggtg agcgcgtggc gggcgaggtc gagcacgacg tggtgcctag 60gctggtggcg gacctgcgcg cgcggttggg gtgacgcccc gcaggccccg gcacgtgccg 120 cgccggggcc tgctcgcgcg tcacgtccgg tcgtcggcga g 161

<210> 22

<211> 22<212> PRT

<213> Actinosynnema pretiosum<4 00> 22

Val Ala Gly Glu Val Glu His Asp Val Val Pro Arg Leu Val Ala Asp1 5 10 15

Leu Arg Ala Arg Leu Gly20

<210> 23<211> 30<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Iniciador

<400> 23ggtcactggc cgaagcgcac ggtgtcatgg 30

<210> 24<211> 36<212> DNA<213> Artificial

<220><223> Iniciador

<400> 24cctaggcgac taccccgcac tactacaccg agcagg 36

<210> 25<211> 1595<212> DNA<213> Actinosynnema pretiosum

<400> 25cctaggcgac taccccgcac tactacaccg agcaggccta cgcctacggg aactcctgga 60

catcaccgac cacaccgtcc aacgcaactt ccgcgaactg gccgatctgg taggcgacgc 120

gaagggcctg ctgttccacc cacgcgacct ggtgggcgtc ccagaattcg gctgcttcct 180

agcagtagcc gaacacccgt aaccacgcgg tggcgtcccc cacggacgcc accgcctcgc 240

gggctgcggg gcgagcgcag cgagcccgcg cagccccact cccgcgtccc tcttctccgt 300gtggcctggc gcatgtcaaa ttcccactga ctgccaacag atcatgtgcc gtttgagcag 360

gtcagcgact tgtcgcgctt cggtgcctta aggccgagct gggatggggg cactgtttcc 420

ggactgagcg gggcagcttg gaaggtggag ttcggtgagc agaggcagca cgtcccgtcg 480

cacgtagagg tggttgtaca cgcggtggcg ggacctgcgc agtaggccgc tatccgcaag 540

ctgctccaag atcaggagtg cggcgcggtg cgtatagccg agttcggcgg tcagcatggt 600

gctgttgagc agtggggcga cgagcagcgg ggcgggaagc gctttgacct tcctccgccc 660

ggtgcgcatc gcccaggtgg gcgatcgcgc gagcctcacg gatcgcggtc acctcatgca 720

ggctggcgct caacctggaa cgcgcgactg tttcgtccag acgtgccagg gcggtgtagg 780

cgtgcaacaa ggtcttgctg gtttcggagc gcagtctgag ccgggaccag gacgacaact 840

ccgcgatcct cgcggacggg ggcggcctcg tgtcttcacc ggtggtagtt gacctgcgcg 900

gggcggaggt gccctattgc tgccgggacg aggtcatccc ccggagcagt ttctcagcac 960

gccgtgaatc gagatccggg gcgctgagcg cggtgaacgc ctcgtccagc gagtcgcacg 1020

cgcacgtcgt cctgacatcg ggccgcgcat ggcccgaggt ggtcagcggt gagcgggaag 1080

gcgcggcagg gtgtgtgcga gacactccgg gactccgtgc agaaggtcga tcaggcgaaa 1140

gggttgaact gcgaatcgca aagcggcccg gccgcaaagg ggtcgggccg cctgcgacga 1200

ttggtcacgc tgctgcggcg cggtcccgcc ggaactgctt gccgagcagg tcgatccgcc 1260

ccttgtgatc ttctgccagc gcctccagaa ccgagagcag tcgtcgggcg tgcagtgcat 1320

ggccaatacc atcgtcgcgt accccagagg gtgtcgctcc cgttcagggg cgaccatttc 1380

ccacgcccgc ttggcctcct tggcggcccg gccaagatcg ccgagcatca ggtaggtgcc 1440

cgacaacccg acaaccctgc ctgccaacgc ggcttccggc accccgcgcg cctcgtcggc 1500

ttccaacgcc cgaacaccgt gccacagcac ggcccgcgcg ttgccctcgc tcgtctccag 1560

ccatcccatg acaccgtgcg cttcggccag tgacc 1595

<210> 26<211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Iniciador <400> 26 cctaggaacg ggtaggcggg caggtcggtg 30

<210> 27<211> 31<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> Iniciador<400> 27

gtgtgcgggc cagctcgccc agcacgccca c 31

<210> 28

<211> 1541

<212> DNA

<213> Actinosynnema pretiosum

<400> 28

gtgtgcgggc cagctcgccc agcacgccca cgagggtctc cagcgcgtcc gcgccggtgc 60gcgcgccccg gacgacctcg accgtgggga tcaggtacgg cgggttcatg aagtgcgtgc 120cgatcagccg cgccgggtcg gggacgtgcc cggccagctc gtcgatcggg atcgaggagg 180tgttggacac cagcggcacg cgcggcccgg tgagcgcggc ggccccggcc agcacctcgg 240ccttgaccgg cagctcctcg gtgaccgcct ccaccaccag cgagacgtcc gcgacgtcgg 300cgagcgaggt ggtggtgagc agctcgcccc gctcgcggtc ctcgggcagc gcccgcatca 360gcctggccat gcgcagctgg gcggccaccg cctcccgcgc ccgcccgacc ttggcccggt 420cggtctcgac cagcaccacc ggcacgccgt gcccgacggc cagggaggtg atccccaggc 480ccatcgtgcc cgcgccgaga acggcgagca ccgtcctgcc gtcctgctct cccatcgcgc 540tcccccgccg cggccaccgc ggccgccgtc cggtccgcgc gccgtcccgg cacgcgcatt 600ccaccctcga tcgtgtgccg ggaaaggcgc gcccgacccc ctgacctgcc cccctgaacc 660cccctcaacg gaaccggaaa tcgaatgtcc cgaacgcgcc gtcaaatcgt cgattgacag 720ccgcagaact gttcatagac tgtggcggca gtaccgatct ccgaattcca cggaagagtc 780ctcccccatg gctcagcaga tcagcgccac ctcggaaatc ctcgactacg tccgcgcgac 840ctcgttgcgc gacgacgacg tgctcgccgg tctgcgggag cggaccgcgg ttctcccggc 900cgcgtccgcg ctgcaggtgg ccccggagga ggggcagctg ctcggcctgc tggtgcgcct 960ggtcggcgcg cgctcggtgc tggaggtcgg cacctacacc gggtacagca cgctgtgcat 1020ggcccgcgcc ctcccgcccg gcggacgtgt cgtgacctgc gacgtcgtcg cgaagtggcc 1080ggacatgggc aggccgttct gggagcgggc gggcgtcgcg gaccgcatcg acgtccgcgt 1140cggcgacgcc cgcgccaccc tggccggcct gcacgccgag cacgccgtgt tcgacctggt 1200gttcatcgac gcgaacaagt cggattacgt ccactactac gagcgcgcgc tgacgctgct 1260gcgcaccggc ggcctggtcg tcgtggacaa cacgctcttt ttcgggcggg tcgccgatcc 1320gtccgcgacc gatccggaca ccaccgccgt gcgcgagctg aacgcgctgc tgcacgccga 1380cgagcgggtc gacatgtgcc tgctgccgat cgcggacgga atcacgctcg ccgtgaagcg 1440gtgaacccgc ccgaatcgcg ccgaattccc ccggagagaa aggccgccgc agtgttcacc 1500gaggacgtgg ccaccgacct gcccgcctac ccgttcctag g 1541

Claims

1. Composto sendo análogo de 18,21-didesoximacbecina ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, o composto caracterizado pelofato de que é de acordo com a fórmula (I) abaixo:<formula>formula see original document page 121</formula>sendo que:R1 representa H, OH5 OMe;R2 representa H ou MeR3 representa H ou CONH2;R4 e R5 representam, ambos, H ou, em conjunto, representampelo fato de que R1 representa H.R6 representa H ou F;R7 representa H ou F; eRg representa H ou F.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que R1 representa H.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que R1 representa OH.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 3, caracterizado pelo fato de que R2 representa H.

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 4, caracterizado pelo fato de que R3 representa CONH2.

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 5, caracterizado pelo fato de que R4 e R5 em conjunto, representam umaligação.

7. Composto de acordo com a reivindicação de 1 a 5,caracterizado pelo fato de que R4 e R5 representam, cada um, H.

8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 7, caracterizado pelo fato de que R6, R7 e R8 representam, todos, H.

9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 1 a 7, caracterizado pelo fato de que R6, R7 e R8 não representam, todos, H.

10. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Rj representa H, R2 representa H e R3 representa CONH2 eR4 e R5 representam, cada um, H.

11. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Rj representa OH, R2 representa H e R3 representa CONH2 eR4 e R5 representam, cada um, H.

12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 eR5 representam, cada um, H, R6, R7 e R8 representam, cada um, H.

13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Ri representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4e R5 representam, cada um, H, R6, R7 e R8 representam, cada um, H.

14. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 eR5 representam, cada um, H, R6 representa F e R7 e R8 representam, cada um,H.

15. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que R1 representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4e R5 representam, cada um, H, R6 representa F e R7 e R8 representam, cadaum, H.

16. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Rj representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 eR5 representam, cada um, H, R6 representa H, R7 representa F e R8 representaH.

17. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Rj representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4e R5 representam, cada um, H, R6 representa H, R7 representa F e R8representa H.

18. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que R1 representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 eR5 representam, cada um, H, R6 e R7 representam, cada um, F e R8 representaH.

19. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Ri representa OH, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4e R5 representam, cada um, H, R6 e R7 representam, cada um, F e R8representa H.

20. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Ri representa H, R2 representa H, R3 representa CONH2, R4 eR5 representam, cada um, H, R6, R7 e R8 representam, cada um, F.

21. Composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizadopelo fato de que é<formula>formula see original document page 124</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

22. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é<formula>formula see original document page 124</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

23. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é<formula>formula see original document page 125</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitavel do mesmo.

24. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado<formula>formula see original document page 125</formula>

25. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é<formula>formula see original document page 126</formula>ou um sal farmaceuticamente aceitavel do mesmo

26. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que e<formula>formula see original document page 126</formula>

27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um análogo de 18,21-didesoximacbecina ou um salfarmaceuticamente aceitável da mesma como definida em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 26, juntamente com um ou mais veículos ou diluentesfarmaceuticamente aceitáveis.

28. Composto sendo análogo de 18,21-didesoximacbecina ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 26, caracterizado pelo fato de que é para uso comoum medicamento.

29. Uso de um composto sendo análogo de 18,21-didesoximacbecina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 26, caracterizado pelofato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer,malignidades de células B, malária, infecção fungica, doenças do sistemanervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes deangiogênese, doenças autoimunes e/ou como um pré-tratamento profiláticopara câncer.

30. Composto sendo análogo de 18,21-didesoximacbecina ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 26, caracterizado pelo fato de que é para uso comoum medicamento para o tratamento de câncer, malignidades de células B,malária, infecção fungica, doenças do sistema nervoso central e doençasneurodegenerativas, doenças dependentes de angiogênese, doençasautoimunes e/ou como um pré-tratamento profilático para câncer.

31. Método para o tratamento de uma doença sendo câncer,malignidades de células B, malária, infecção fungica, doenças do sistemanervoso central e doenças neurodegenerativas, doenças dependentes deangiogênese, doenças autoimunes e/ou como um pré-tratamento profiláticopara câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a umpaciente que disto necessita uma quantidade eficaz de um análogo de 18,21-didesoximacbecina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 26.

32. Composto sendo análogo de 18,21-didesoximacbecina ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição, uso ou métodode acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 31, caracterizados pelofato de que o análogo de 18,21-didesoximacbecina ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado em combinação comoutro tratamento.

33. Composto sendo análogo de 18,21-didesoximacbecina ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição, uso ou métodode acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que o outrotratamento é selecionado do grupo que consiste de: metotrexato, leucovorina,prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracila, paclitaxel, docetaxel,vincristina, vinblastina, vinorelbina, doxorubicina, tamoxifeno, toremifeno,acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticorpo monoclonal anti-HER2(p. ex., Herceptin™), capecitabina, cloridrato de raloxifeno, inibidores deEGFR, inibidores de VEGF, inibidores de proteasoma (p. ex., Velcade™),radioterapia e cirurgia.

34. Composto sendo análogo de 18,21-didesoximacbecina ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição, uso ou métodode acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que o outrotratamento é selecionado do grupo que consiste de: bleomicina, capecitabina,cisplatina, citarabina, ciclofosfamida, doxorubicina, 5-fluorouracila,gemcitabina, leucovorina, metotrexato, mitoxantona, os taxanos incluindopaclitaxel e docetaxel, vincristina, vinblastina e vinorelbina; as terapiashormonais, anastrozol, goserelina, acetato de megestrol, prenisona,tamoxifeno e toremifeno; as terapias com anticorpos monoclonais, comotrastuzumab (ani-Her2), cetuximab (ant-EGFR) e bevacizumab (anti-VEGF);e inibidores de proteína quinase, como imatinib, dasatinib, gefitinib, erlotinib,lapatinib, temsirolimus; os inibidores de proteasoma, como bortezomib;inibidores de histona desacetilase (HDAC), como vorinostat; inibidores deangiogênese, como sunitinib, sorafenib, lenalidomida, radioterapia e cirurgia.

35. Composto sendo análogo de 18,21-didesoximacbecina ouum sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição, uso ou métodode acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo fato de que o outrotratamento é selecionado do grupo que consiste de quimioterápicosconvencionais, como cisplatina, citarabina, cicloexilcloroetilnitrosuréia,ciclofosfamida, gemcitabina, ifosfamida, leucovorina, mitomicina,mitoxantona, oxaliplatina e taxanos incluindo taxol e vindesina; terapiashormonais, como anastrozol, goserelina, acetato de megestrol e prenisona;terapias com anticorpos monoclonais, como cetuximab (anti-EGFR);inibidores de proteína quinase, como dasatinib, lapatinib; inibidores dehistona desacetilase (HDAC), como vorinostat; inibidores de angiogênese,como sunitinib, sorafenib, lenalidomida; inibidores de mTOR, comotemsirolimus; e imatinib.

36. Método para a produção de um composto sendo análogo de-18,21-didesoximacbecina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmocomo definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 26, caracterizadopelo fato de que referido método compreende:a) proporcionar uma primeira cepa hospedeira que produzmacbecina ou um análogo do mesmo quando cultivada em condiçõesapropriadasb) alimentar uma unidade iniciadora não natural em referidacepac) cultivar referida cepa hospedeira em condições vantajosaspara a produção de análogos de 18,21-didesoximacbecina; ed) opcionalmente, isolar os compostos produzidos.

37. Método de acordo com a reivindicação 36 caracterizadopelo fato de que o método adicional compreende a etapa de:e) deletar ou inativar um ou mais dos genes da biossíntese daunidade iniciadora, ou um homólogo dos mesmos, sendo que referida etapaocorre usualmente antes da etapa c).

38. Método de acordo com a reivindicação 36 ou reivindicação-37, caracterizado pelo fato de que o método adicional compreende a etapa de:f) deletar ou inativar um ou mais genes pós-PKS, sendo quereferida etapa ocorre usualmente antes da etapa c).

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-36 a 38, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não natural daetapa b) é ácido 3-amino-benzóico.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-36 a 38, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não natural daetapa b) é ácido 5-amino-2-fluorobenzóico.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-36 a 38, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não natural daetapa b) é ácido 5-amino-3-fluorobenzóico.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-36 a 38, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não natural daetapa b) é ácido 5-amino-2,3-di-fluorobenzóico.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-36 a 38, caracterizado pelo fato de que a unidade iniciadora não natural daetapa b) é ácido 5-amino-2,3,6-tri-fluorobenzóico.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-36 a 43, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) a cepa é uma cepaprodutora de macbecina.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-36 a 44, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) a cepa é uma cepaengenheirada baseada em uma cepa produtora de macbecina em que um oumais dos genes de biossíntese da unidade iniciadora foram deletados ouinativados.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-36 a 45, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) a cepa é uma cepaengenheirada baseada em uma cepa produtora de macbecina em que um oumais dos genes pós-PKS foram deletados ou inativados.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em umacepa produtora de macbecina em que mbcM e, opcionalmente, outros genespós-PKS foram deletados ou inativados.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em umacepa produtora de macbecina em que mbcM foi deletado ou inativado.

49. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que na etapa (a) a cepa é uma cepa engenheirada baseada em umacepa produtora de macbecina em que mbcM, mbcMTl, mbcMT2, mbcP embcP450 foram deletados ou inativados.

50. Cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora demacbecina, caracterizada pelo fato de que mbcM e, opcionalmente, outrosgenes pós-PKS foram deletados ou inativados.

51. Cepa engenheirada baseada em uma cepa produtora demacbecina, caracterizada pelo fato de que mbcM e, opcionalmente, outrosgenes pós-PKS e/ou genes de biossíntese da unidade iniciadora foramdeletados ou inativados.

52. Cepa engenheirada de acordo com a reivindicação 50 ou-51, caracterizada pelo fato de que mbcM foi deletado ou inativado.

53. Cepa engenheirada de acordo com a reivindicação 50 ou-51, caracterizada pelo fato de que mbcM, mbcMTl, mbcMT2, mbcP embcP450 foram deletados ou inativados.

54. Cepa engenheirada de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 50 a 53, caracterizada pelo fato de que a cepa produtora demacbecina é A pretiosum ou A mirum.

55. Uso de uma cepa engenheirada como definida em qualqueruma das reivindicações de 50 a 54 caracterizado pelo fato de que é napreparação de um análogo de 18,21-didesoximacbecina ou um salfarmaceuticamente aceitável do mesmo.

56. Uso de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o análogo de 18,21-didesoximacbecina é definido por qualqueruma das reivindicações de 1 a 26.