BRPI0711096A2 - identificação de proteìnas de prion no leite - Google Patents

Abstract

IDENTIFICAçãO DE PROTEìNAS DE PRION NO LEITE.A presente invenção refere-se ao uso de leite ou um derivado do mesmo para identificação de proteínas de prion, de preferência proteínas de prion PrP~ sc~, em um mamífero. A presente invenção também é dirigida a um método para a identificação de proteínas de prion, de preferência proteínas de prion PrP~ sc~, em mamíferos, compreendendo a etapa de contato do leite ou um derivado do mesmo com um agente tendo afinidade e seletividade elevadas por proteínas de prion, de preferência por proteínas de prion PrP~ sc~. Além disso, um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para remoção de proteínas de prion PrP~ sc~ e/ou PrP^ c^, de preferência proteínas de prion PrP~ sc~, do leite ou um derivado de leite, em que o leite ou um derivado do mesmo é contatado com sepharose, de preferência sepharose compreendendo íons de metal divalente imobilizados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "IDENTIFICA-ÇÃO DE PROTEÍNAS DE PRION NO LEITE".

A presente invenção refere-se ao uso de leite ou um derivado domesmo para identificação de proteínas de prion, de preferência proteínas deprion PrPsc, em um mamífero, A presente invenção é também dirigida a ummétodo para identificação de proteínas de prion, de preferência proteínas deprion PrPsc, em mamíferos, compreendendo a etapa de contato do leite ouum derivado do mesmo com um agente tendo alta afinidade e seletividadepor proteínas de prion, de preferência por proteínas de prion PrPsc. Alémdisso, um outro aspecto da presente invenção se refere a um método pararemoção de proteínas de prion PrPc e/ou PrPsc, de preferência proteína deprion PrPsc, de leite ou um derivado de leite, em que leite ou um derivado domesmo é contatado com sepharose, de preferência sepharose compreen-dendo íons de metal divalente imobilizados.

Antecedentes da Invenção

A proteína de prion nativa, referida como "PrPc" para proteína deprion celular, está amplamente distribuída por toda a natureza e é proteínabem conservada em mamíferos. Acredita-se que a conversão da proteínaPrPc nativa em proteína infecciosa, referida como "PrPSc" para proteína pri-on de paraplexia enzoótica ou como "PrPres" para proteína de prion resisten-te à proteinase K, leve à propagação de várias doenças. Exemplos de doen-ças Jprion-associadas incluem, por exemplo, doença de kuru e Creutzfeldt-Jakob (CJD) em seres humanos, paraplexia enzoótica em ovelha, encefalo-patia espongiforme bovina (BSE) em gado, encefalopatia transmissível demarta e tuberculose em cervos e alces.

A BSE é uma forma de doença da "vaca louca" e é transmissívelpara uma ampla variedade de outros mamíferos, incluindo seres humanos. Aforma humana de BSE é referida como nova variante de doença de Creutz-feldt-Jakob ou vCJD. Estima-se que 40 milhões de pessoas no Reino Unidotenham ingerido carne contaminada com BSE durante metade até o final dadécada de 1980. Em virtude do fato de que o período de incubação para adoença oralmente transmitida pode ser de 20-30 anos, a verdadeira extensão dessa doença pode não se tornar evidente até após 2010.

Além da ingestão de carne infectada, há um potencial paratransmissão de doenças prion-associadas entre seres humanos através detransfusão de sangue. Uma vez que existem agora (duas) indicações diretasde transmissão de prion através de transfusões de sangue, há uma preocu-pação crescente sobre a segurança de produtos de sangue. Também, já foimostrado que os prions infectados estão presentes em linfócitos e tambémhá evidência indicando que prions estão presentes no plasma, além de se-rem célula-associados. Além disso, animais podem se tornar infectados comdoenças prion-associadas pastando sobre solo contaminado com prion ouingerindo feno que contém ácaros de feno infectados com prion.

Atualmente, proteínas de prion PrPsc são identificadas no siste-ma nervoso central, sangue e tecido linfático, em particular no baço, tonsilas,placas de Peyer e nódulos linfáticos de hospedeiros infectados. Estados in-flamatórios crônicos são acompanhados por extravasamento local de célulasB e outras células inflamatórias, as quais pode induzir à maturação Iinfotoxi-na-dependente de FDCs ectópicas (células dendríticas foliculares). Conse-qüentemente, a infecção paraplexia enzoótica de camundongos sofrendo denefrite, hepatite ou pancreatite induz a depósitos inesperados de prion noslocais de inflamação (Helkenwalder e outros, Science 307, 1107-1110,2005). Ligios e outros, (Nature Medicine, Vol. 11, N9 11, Novembro de 2005,páginas 1137-1138) mostraram um fenômeno análogo em animais de fazen-da. Eles demonstraram a presença de proteínas de prion em glândulas in-flamatórias de ovelhas afetadas com mastite e paraplexia enzoótica aomesmo tempo, um local onde o sangue e células linfocíticas são recrutadasapós eventos associados à inflamação.

Em resumo, proteínas de prion são encontradas em animaissaudáveis no sistema nervoso central, sangue e tecido linfóide, em particularno baço, tonsilas, placas de Peyer e nódulos linfáticos e também em hospe-deiros infectados com TSE (encefalopatia espongiforme transmissível) emlocais de inflamação, por exemplo, nefrite, hepatite, pancreatite, mastite, a -pós recrutamento de sangue e células linfocíticas. Conseqüentemente, ospresentes métodos para detecção de proteínas de prion requerem açõesinvasivas para obter material de amostra.

O leite contribui com 13% do suprinjento mundial de proteínapara seres humanos. A produção mundial de leite oscila em torno de 500milhões de toneladas por ano. Em média, uma "vaca marrom Swiss" produz6.500 litros de leite por ano (associação de criadores de Swiss "Braunvieh",Zug, Suíça). Antes que o leite fresco chegue ao consumidor, ele é usualmen-te homogeneizado e aquecido. O procedimento de homogeneização envolveredução do tamanho de partícula de gordura de forma a aumentar a tolerân-cia do consumidor. O aquecimento prolonga a vida útil e inativa patógenosexistentes. Durante pasteurização, o leite é aquecido entre 72°C e 75°C du-rante não mais do que 30 segundos e imediatamente esfriado para 4°C. Oleite pasteurizado é estável durante cerca de cinco dias e pode conter vita-mina e aditivos flavorizantes. Leite UHT (aquecido em temperatura ultra-elevada) é aquecido entre 1 e 4 segundos em temperaturas entre 135°C e150°C. Esse procedimento mata todos os patógenos convencionais e o leiteé adaptado para consumo durante várias semanas ou meses, mas tambémcontém uma quantidade reduzida de nutrientes.

Durante os últimos 10 anos, grupos científicos, agencias de ava-liação de risco e organizações de saúde pública (EC. Scientific VeterinaryCommittee, Report on the risk anaíysis for colostrum, milk and milk products(doc,umento Ns VI/8197/96 Versão J, Final, 1997); EC. Multidisciplinary Sci-entific Committee, Opinion on the possible risk related to the use of colos-trums, milk ánd products (1997) têm debatido o risco TSE-associado par aoleite e produtos de leite. Dados epidemiológicos e de bioensaio disponíveisaté o momento não fornecem evidência de que o leite abriga quaisquer pro-teínas de prion. Portanto, conclui-se que é improvável que o leite apresentequalquer risco de contaminação por TSE, contanto que ele se origine de a-nimais saudáveis.

É um objetivo da presente invenção identificar proteínas de pri-on, em particular proteínas de prion PrPsc, sem ter de aplicar métodos inva-sivos para obtenção de material de amostra. É ainda um outro objetivo iden-tificar proteínas de prion, em particular proteínas de prion PrPsc, de animaisde outro modo saudáveis, isto é, animais que não sofrem de condições in-flamatórias próximas da TSE (encefalopatia espongiforme transmissível).Outro objetivo da invenção se refere à remoção de proteínas de prion doleite ou derivados de leite.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Surpreendentemente, descobriu-se que o leite e mesmo produ-tos de leite processados de mamíferos contêm proteínas de prion, isto é,proteínás de prion PrPsc e/ou proteínas de prion PrPc.

Isso altamente inesperado para aqueles na técnica porque asproteínas PrPsc e PrPc tinham sido detectadas, até o momento, apenas emcélulas fixadas ou da fração celular do sangue. Sua presença em fluidoscorporais é marginal na melhor das hipóteses. Além disso, o número de cé-lulas normalmente contidas no leite está abaixo de 100000 por ml e, assim,extremamente baixo. Além disso, o leite contém uma quantidade relativa-mente alta de lipídios (35 mg/ml), o que é conhecido por tornar a análise de-proteína através de métodos bioquímicos comuns exigente.

Para produzir um litro de leite, cerca de 400 a 500 litros de san-gue devem passar através da teta da vaca. Embora não se deseje estar pre-so a qualquer teoria, parece, assim, possível que proteínas de prion encon-tradas no leite derivem de sangue ou, alternativamente, tenham sido secre-tadas de células epiteliais glandulares. Tipos de células que foram identifica-dos no leite de vacas saudáveis são principalmente macrófagos e outrosleucócitos. Contudo, em ensaios abaixo, é demonstrado que a presença decélulas de proteínas de prions é completamente removida através de centri-fugação (veja exemplo 1). Portanto, era improvável que as proteínas de pri-on recuperadas estivessem célula-associadas mas, antes, ligadas a outrasproteínas ou lipídios, resultando em complexos moleculares estáveis. O fatode que o leite contém PrPc de comprimento total provavelmente compreen-dendo a âncora glicolipídica indica que proteínas de prion no leite eram ori-ginalmente célula-ligadas e não representam qualquer um dos produtos detruncamento amino-terminal de PrPc conhecidos como sendo liberados decélulas normais sob condições fisiológicas (Laffont-Proust e outros, FEBSLett. 579, 6333-6337 (2005); Zhao e outros, Virus Res. 115: 43-55, 2006).

Portanto, em um primeiro aspecto, a presente invenção se refereao uso de leite ou um derivado do mesmo para identificação de proteínas deprion em um mamifero.

Os termos leite e derivado de leite se destinam a abranger leitenatural, bem como todas as formas processadas de leite tais como, por e-xemplo, leite homogeneizado, leite pasteurizado, leite desnatado, leite UHT(tratado em temperatura ultra-elevada), manteiga, etc. e produtos de leite,tais como iogurte, queijo, etc. e mesmo produtos altamente processadoscontendo leite, tais como bolos, pudins, etc.

O termo "proteína de prion" se refere a qualquer proteína de pri-on PrPc que ocorre naturalmente e proteína de prion PrPsc relacionada àTSE (encefalite espongiforme transmissível), bem como a seus derivadosresultantes de processamento posterior fora do corpo, por exemplo, proces-samento da amostra de leite para fins de análise ou processamento de ali-mento da referida proteína. De preferência, o termo "derivado de proteína deprion" se refere a quaisquer fragmentos de proteínas de prion que compre-endem pelo menos uma ou mais estruturas repetidas de prion, de preferên-cia 2 a 5, mais preferivelmente 5 estruturas repetidas de prion, de preferên-cia estruturas repetidas de prion que são um octapeptídeo, pseudo-octapeptídeo, hexapeptídeo ou pseudo-hexapeptídeo, mais preferivelmenteum octapeptídeo tendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo emPHGGGWGQ (humana), PHGGSWGQ (camundongo) e PHGGGWSQ (rato)ou um pseudo-octapeptídeo, hexapeptídeo ou pseudo-hexapeptídeo deriva-do das referidas seqüências. Estruturas repetidas exemplificativas são mos-tradas abaixo.

Ovelha: PHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGGWGQ (4 repeti-ções)

Gado: PHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQ-PHGGGGWGQ (5 repetições)

Um estudo recente mostrou que, em ovelhas naturalmente afe-tadas por paraplexia enzoótica e mastite linfocítica ou linfofolicular, o acúmu-lo de PrPsc estava presente adjacente aos dutos de leite (Ligios e outros,veja acima). Pelo menos em paraplexia enzoótica que ocorre naturalmenteem ovelhas, a replicação de prion pode ocorrer após uma infecção com víruslinfotrópico na glândula rnarnária inflamada. Esse estudo não detectou PrPc,PrPsc nem infectividade por prion no leite em si. Contudo, em virtude do fatode que, sob tais condições inflamatórias, o número total de células imunesaumenta no leite, é altamente provável que PrPsc infecciosa chegue ao leite.Nesse contexto, o leite de animais afetados com mastite e TSE também é,provavelmente, responsável pela disseminação de paraplexia enzoótica dasovelhas para seus filhotes em rebanhos de ovelhas ou cabra não afetados.Além disso, o leite de ovelha e cabra provavelmente também contribui paraum risco de exposição à TSE para seres humanos que consomem essesprodutos.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere aouso de leite ou um derivado dòmesmo para a identificação de proteínas deprion PrPsc em um mamífero.

Deve ser notado que a identificação de proteínas de prion nãorequer que a fonte mamífera sofra de mastite ou qualquer outra doença in-flamatória. Surpreendentemente, descobriu-se que proteínas de prion podemser identificadas no leite ou um derivado do mesmo de mamíferos saudáveisou mamíferos afetados com TSE apenas. Em uma modalidade preferida, ouso da presente invenção se refere ao uso de leite ou um derivado do mes-mo para a identificação de proteínas de prion, de preferência proteínas deprion PrPc, em mamíferos saudáveis, mais preferivelmente proteínas de pri-on PrPsc em mamíferos sem condições inflamatórias, mais preferivelmentesem mastite.

A presente invenção não está limitada à identificação de qual-quer proteína de prion de mamífero em particular ou derivado da mesma.Em uma modalidade preferida, o mamífero é selecionado do grupo consis-tindo em um ser humano, bovino, ovino, camundongo, hâmster, cervo, cabraou rato, de preferência bovino e ovino.O uso de leite ou um derivado de leite de acordo com a presenteinvenção para identificação de proteínas de prion em um mamífero, em par-ticular para a identificação de proteínas de prion .PrP^sc, não está limitado aqualquer método em particular para a identificação de proteínas de prion, namedida em que o método seja suficientemente seletivo para proteínas deprion PrP^sc e/ou proteínas de prion PrP^c.

Em um outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um mé-todo para identificação de proteínas de prion em mamíferos, isto é, proteínasde prion PrP^c e/ou proteínas de prion PrP^sc, compreendendo a etapa decontato do leite ou um derivado do mesmo com um agente tendo afinidade eseletividade suficientes pelas referidas proteínas de prion.

Agentes adequados são conhecidos e estão comercialmentedisponíveis para aqueles habilitados na técnica. Tipicamente, esses agentessão anticorpos policlonais ou monoclonais ou derivados padrão dos mes-mos. Anticorpos adequados são fornecidos nos exemplos em anexo. Contu-do, agerites adequados para a prática da presente invenção também inclu-em proteínas de ligação de domínios de não-imunoglobulina. Tais proteínasde ligação são revistas em Binz e outros, Nature Biotechnology, Vol. 23, Ns10, Outubro de 2005, páginas 1257-1268.

Conseqüentemente e em uma modalidade preferida, o referidoagenté tendo alta afinidade e seletividade pelas proteínas de prion PrPsce/ouç PrP^c é selecionado do grupo consistindo em anticorpos policlonais oumonoclonais ou c /ados dos mesmos e/ou proteínas de ligação de domí-nios de não-imunoglobulina.

Em um método preferido de acordo com a invenção, o métodose refere à identificação de proteínas de prion PrPsc em um mamífero e oreferido agente tem alta afinidade e seletividade por proteínas de prionPrP^sc.

Para a prática do método, o referido mamífero é, de preferência,selecionado do grupo consistindo em um ser humano, bovino, ovino, ca-mundongo, hâmster, cervo, cabra ou rato.

Em virtude do fato de que a quantidade de proteínas de prion noleite ou um derivado de leite é muito pequena, pode ser vantajoso, em al-guns casos, pré-tratar o leite ou derivado de forma a enriquecer, isto é, con-centrar e/ou purificar as proteínas de prion.

Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a in-venção compreende as etapas de:

(i) concentração e/ou purificação de proteínas de prion PrPsce/ou proteínas de prion PrPc do leite ou um derivado do mesmo,

(ii) contato do leite ou um derivado do mesmo com um agentetendo alta afinidade e seletividade por proteínas de prion PrPsc e/ou proteí-nas de prion PrPc.

O termo "concentração e/ou purificação", conforme usado aqui,se destina a indica que a concentração de proteínas de prion é elevada e/ouproteínas de não-prion e/ou material(is) não proteináceos são removidos.

Deve ser notado que a tecnologia em particular e métodos discu-tidos abaixo baseados em sepharose não ligada, bem como Iigante-modificada referentes à concentração e/ou purificação de proteínas de prionPrPc e/ou proteínas de prion PrPsc , à separação e/ou enriquecimento deproteínas de prion PrPsc a partir de proteínas PrPc e à remoção de proteínasde prion PrPc e/ou PrPsc é um assunto em questão dos pedidos de patenteinternacional co-pendentes do Requerente EP/2005/011565 depositado em28/10/2005 e PCT/EP2006/010272 depositado em 25/10/2006. Rara a práti-ca dos métodos da presente invenção, esses métodos em particular repre-sentam modalidades preferidas. Outros métodos de concentra-ção/purificação, separação e remoção adequados podem ser empregadostambém para a prática do método da presente invenção, contudo, os méto-dos identificados abaixo são considerados como o melhor modo para a prá-tica o assunto em questão da invenção.

Surpreendentemente, descobriu-se que a sepharose em si (istoé, como tal, nua, com Iigantes inativados, removidos, expostos) tem umaafinidade de ligação elevada e específica por proteínas PrPsc e/ou derivadosfuncionais das mesmas. Portanto, a ligação de sepharose a proteínas PrPsce/ou derivados funcionais da mesma é suficiente para sua concentraçãoe/ou purificação. É necessário, meramente, remover as proteínas de não-prion não ligadas da referida sepharose.

Portanto, em um método preferido desacordo com a invenção, aetapa (i) compreende as seguintes etapas:

a) contato de proteínas de prion PrPc e/ou proteínas de prionPrPsc de leite ou um derivado do mesmo com sepharose sob condições quepermitem a ligação, de preferência específica e em alta afinidade, da referidasepharose às referidas proteínas de prion PrPsc e/ou proteínas de prion PrPc(de preferência proteínas de prion PrPsc apenas);

b) remoção das proteínas de não-prion não ligadas da referidasepharose,em que a sepharose não é, de preferência, uma sepharose de quelação deCu2+.

Se a sepharose está não ligada, ela se ligará à proteínas PrPscapenas, deixando proteínas PrPc não ligadas. Surpreendentemente, a se-pharose para uso no método preferido da presente invenção não está limita-da a qualquer tipo em particular de sepharose, exceto que o núcleo de se-pharose deverá estar suficientemente acessível às proteínas de prion PrPsce/ou derivados funcionais das mesmas para ligação.

É preferido que, na etapa a), a sepharose se ligue com afinidadeespecífica e elevada às proteínas de prion PrPsc apenas e não a proteínasde prion PrPc, em particular quando detecção de proteínas de prion PrPscapenas é desejada.

O termo "ligação com afinidade específica e elevada de sepha-rose ao prion PrPsc", conforme usado aqui, se destina a indicar que a sepha-rose como tal (isto é, o núcleo de sepharose, mas não quaisquer Iigantessobre o mesmo) se liga especificamente à PrPsc, mas não à PrPc. De prefe-rência, ligação específica de sepharose, no contexto da invenção, significa aligação de sepharose como tal a multímeros de PrPsc, mas não à PrPc. Otermo ligação com alta afinidade, a esse respeito, se destina a se referir auma afinidade de ligação referente a uma constante de dissociação de 10"6 a10~12 M ou menor, de preferência 10-8 a 10-12 M ou menor. Aqueles habilita-dos pódem determinar facilmente uma afinidade de ligação específica e ele-vada de uma determinada sepharose pelo prion PrPsc através de ensaios deligação de rotina e simples. Por exemplo, um de tais ensaios compreenderiaas seguintes etapas:

a) fornecimento da sepharose a ser ensaiada e remoção, inati-vação e/ou exposição de quaisquer Iigante sobre o núcleo da referida sepha- rose se presentes,

b) diluição da PrPsc usada para uma concentração que evitaráremoção não específica, por exemplo, precipitação, ligação não específica, etc.,

c) incubação da sepharose de a) e PrPsc de b) em um tampãoadequado sob condições e durante um tempo que permitirão a ligação umada outra,

d) uma ou mais etapas de lavagem, de preferência em 3 a 10 volumes de tampão de incubação, para lavagem de qualquer proteína nãoligada da sepharose,

e) opcionalmente, lavagem com um excesso, de preferência umexcesso de 1000 vezes, de proteína de ligação não específica, de preferên-cia BSA (albumina de soro bovino), de forma a remover ou bloquear quais-quer sítios de ligação não específica sobre a sepharose,

f) uma otapa de eluiçao com um tampão compreendendo umagepte caotrópico, de preferência uréia e/ou cloreto de guanidínio e/ou SDS,de forma a remover a PrPsc sepharose-ligada,

g) detecção da PrPsc no tampão eluído e, desse modo, demons- trando a ligação em alta afinidade da sepharose à PrPsc como tal.

Para determinação da especificidade da sepharose ensaiada, oensaio acima é repetido, exceto que PrPc ao invés de PrPsc é incubada naetapa c) e PrPc é detectada na solução de lavagem, desse modo, indicandoa falta de ligação. Alternativamente, PrPsc e PrPc podem ser incubadas si- multaneamente com a sepharose na etapa c) e uma sepharose com afinida-de específica e elevada resultará em detecção de PrPc na solução de lava-gem e PrPsc no tampão de eluição caotrópico apenas.Em resumo, o termo "ligação com afinidade específica e elevadade sepharose a proteínas PrPsc" se destina a distinguir sepharoses e méto-dos de uso dessas sepharoses e os referidos métodos que meramente seligam à PrPsc não especificamente e com baixa afinidade, por exemplo, atra-vés de precipitação e/ou baixa adsorção.

Os termos "concentração e/ou purificação", conforme usado a-qui, se destinam a indicar que a concentração de proteínas PrPsc e/ou deri-vados funcionais das mesmas é elevada e/ou proteínas de não-PrPSc e/oumaterial(is) não proteináceos são removidos.

De preferência, a sepharose é selecionada de sepharoses nãoligadas, de preferência selecionadas do grupo consistindo em Sepharose2B®, 4B®, 6B®, Sepharose CL-4B®, Sepharose-6B®, Superdex 75®, Sephacr-yl 100HR® e Sephadex G10®.

Opcionalmente, outros Iigantes presentes sobre a sepharosepodem ser vantajosos, por exemplo, quando se deseja ligar PrPc também ouquando se deseja intensificar a ligação da sepharose à PrPsc e/ou PrPc.

Em uma modalidade mais preferida, a sepharose é selecionadade sepharoses ligante-modificadas, de preferência aquelas selecionadas dogrupo consistindo em sepharoses de quelação de metal, agaroses de lecti-na, sepharose iminodiacética, agarose de proteína A, sepharose de estrep-tavidina, sepharosede sulfopropila e sepharose de carboximetila.

Para a prática dos métodos preferidos da presente invenção, énecessário que os ligantes opcionais não expõem o núcleo de sepharose, demodo que proteínas de prion PrPsc e/ou derivados funcionais das mesmastenham acesso livre. Esse é o problema com muitas sepharoses ligante-modificadas empregadas na técnica anterior. Aqueles habilitados podemselecionar rotineiramente sepharoses ligante-modificadas que são suficien-temente acessíveis para ligação de PrPsc simplesmente testando a afinidadede ligação da sepharose a proteínas PrPsc e, se desejado, projetando se-pharoses ligante-modificadas apropriadas, por exemplo, empregando molé-culas espaçadoras que posicionam o ligante em uma distância apropriadapara que a sepharose não seja exposta pelo ligante.Quando de identificação de proteínas de prion, pode também serdesejado ou vantajoso separar e/ou enriquecer proteínas de prion PrPsc deproteínas PrPc.

Outra vantagem inesperada do método preferido da presenteinvenção é que a ligação de sepharose a proteínas de prion PrPsc á alta=mente seletiva com relação à proteínas de prion PrPc as quais não têmqualquer afinidade de ligação significativa pela sepharose em si.

Quando sepharoses ligante-modificadas são usadas, em que aparte do Iigante se liga à proteínas de prion PrPc e/ou derivados funcionaisdas mesmas, o método da presente invenção permite a concentração e/oupurificação simultâneas de proteínas de prion PrPsc e PrPc. As proteínas deprion PrPsc e PrPc podem, então, ser separadas através de remoção seleti-va de proteínas PrPc e/ou derivados funcionais das mesmas da sepharose.

Conseqüentemente, em uma modalidade mais preferida, o mé-todo da invenção compreende, adicionalmente, a etapa de separação e/ouenriquecimento de proteínas de prion PrPsc a partir de proteínas PrPc.

A etapa de separação e/ou enriquecimento de proteínas de prionPrPsc a partir de proteínas PrPc compreende, de preferência, as seguintesetapas adicionais:

a) contanto de proteínas de prion PrPsc e proteínas PrPc de leite ouum derivado funcional do mesmo com sepharose ligante-modificada sobcondições que permitem:

(i) a ligação da referida parte de sepharose às referidasproteínas de prion PrPsc e(ii) a ligação da referida parte de Iigante da sepharose aproteínas PrPc,

b) opcionalmente, remoção do material não ligado da referida se-pharose ligante-modificada,

c) opcionalmente, aguardar um período de tempo suficiente paraque algumas ou a maioria das proteínas PrPc Iigante-Iigadas e/ou derivadosfuncionais das mesmas se convertam em proteínas de prion PrPsc e/ou deri-vados funcionais em proximidade íntima com as proteínas de prion PrPSce/ou derivados funcionais das mesmas,

d) adição de uma agente de liberação seletivo às proteínas sepha-rose-ligadas e/ou derivados funcionais das mesmas da etapa a), b) ou c) sobcondições que permitem a liberação de proteínas PrPc e opcionalmente pro-teínas de nâo-prion da parte do Iigante da sepharose, mas não a liberaçãodas proteínas de prion PrPsc e/ou derivados funcionais das mesmas da partede sepharose e

e) remoção de PrPc e opcionalmente proteínas de não-prion dasepharose.

Quando proteínas de prion PrPsc e PrPc estavam presentes so-bre a sepharose ligante-modificada, inesperadamente, descobriu-se que aquantidade de PrPso é elevada, em muitos casos, às custas de PrPc. Acredi-ta-se que proteínas PrPc são convertidas através de uma alteração confor-macional espontânea na proximidade íntima da PrPsc que tem alteração se-melhante à chaperona. Essa descoberta está em concordância com a com-preensão de que a presénça de PrFsc é requerida para "produção" de PrPsca partir de precursores de PrPc.

Além disso, é preferido que o método acima ainda compreendaa etapa de:

f) liberação de proteínas de prion PrPsc e/ou derivados das mes-mas da sepharose.

Para liberação de proteínas de prion PrPsc e/ou derivados damesma da sepharose, é preferido adicionar agentes caotrópicos e/ou deter-gentes, de preferência uréia e/ou cloreto de guanidínio e/ou SDS, mais pre-ferivelmente adicionar uréia e/ou SDS, mais preferivelmente adicionar umtampão de carregamento de gel compreendendo uréia a 8 M e SDS a 5% eaplicar um campo elétrico. Naturalmente, qualquer outro método não destru-tivo rotineiramente aplicado para interrupção de afinidade de enzimas porpolímeros, de preferência polímeros derivados de açúcar, também pode serempregado.

Sepharoses de quelação de metal, bem como sepharoses nega-tivamente carregadas, tais como sepharose de sulfopropila e sepharose decarboximetila, podem se ligar a proteínas PrPsc, bem como PrPcl em virtudeda ligação da parte de sepharose e opcionalmente da parte de Iigante demetal e/ou negativamente carregado da sepharqse à PrPsc e da parte deligante de metal e/ou negativamente carregada da sepharose à PrPc.

O mecanismo que fundamenta o método de separação preferidoda presente invenção conta com as diferentes propriedades de ligação dePrPsc e PrPc com relação a íons de metal sepharose-imobilizados. Enquantoa PrPsc parece ter uma afinidade intrínseca pela sepharose, íons de metaldivalentes e cargas negativas, a PrPc parece ter uma afinidade intrínsecapor íons de metal divalente e cargas negativas apenas. Conseqüentemente,suas diferentes afinidades pela sepharose podem ser empregadas para se-paração das mesmas.

De preferência, os íons de metal da sepharose de quelação demetal são selecionados do grupo consistindo em Ni2+, Zn2+, Co2+, Mg2+, Ca2+e Mn2+.

A ligação de Ca2+e Mn2+ é mais fraca e ambos os íons se ligamapenas a monômeros de PrPsc e PrPc.

Os outros íons de metal mencionados, Ni2+, Co2+, Zn2+ e Mn2+,se ligam mais fortemente a monômeros e oligômeros de PrPsc e PrPc e sãopreferidos por essa razão. Em virtude de suas excelentes propriedades deligação e em virtude de sua falta de toxicidade sob condições fisiológicas invivo, Zn2+ é mais preferido para a sepharose de quelação de metal para aprática dos métodos preferidos da presente invenção.

Incidentalmente1 Cu-sepharose não reterá proteínas PrPsc efici-entemente. Conforme demonstrado no exemplo um do pedido de patente co-pendente acima mencionado, a recarga de Ni-High Performance Sepharosecom Cu2+ resulta em ligação não específica de grandes quantidades de BSAe, portanto, não é adequada para o enriquecimento de proteínas de prion emsoluções de proteína complexas. Portanto, geralmente é preferido, para to-dos os métodos da invenção, que a sepharose não seja uma sepharose dequelação de metal de Cu2+.

Para enriquecimento, isto é, concentração e/ou purificação deproteínas de prion ou separação e/ou enriquecimento de proteínas PrPsc apartir de proteínas PrPc, a sepharose de quelação de metal é, de preferên-cia, Ni-Sepharose, mais preferivelmente Ni Sepharose® High Performance(número de código 17-5268-01, 25 ml, 17-5268-02, 100 ml) da Ge Healthca-re (Amersham Biosciences Europe GmbH, Indusírienstrasse 30, CH-8112Otelfingen) ou HisTrap HP Column da mesma companhia (número de código1 dependente do volume 17-5247-01, 17-5247-05, 17-5248-01, 17-5248-02,17-5248-05 ou 17-5249-01).

Quando uma sepharose de quelação de metal é empregada pa-10 ra a prática de um método preferido da presente invenção, o agente de libe-ração seletivo é, de preferência, um agente de quelação de metal, de prefe-rência um agente selecionado de EDTA e/ou EGTA, mais preferivelmenteEDTA.

Para separação de proteínas PrPsc e PrPc e/ou derivados fun-cionais das mesmas de uma sepharose de quelação de metal em um méto-do preferido da invenção, é mais preferido que o metal seja Nf+ ou Zn2+ e oagente de quelação de metal seja EDTA.

Também, é preferido que as condições na etapa d) do métodopreferido da presente invenção para separação de proteínas PrPsc e PrPcque permite a liberação de PrPc e opcionalmente proteínas de não-prion dosíons de metal sepharose-imobilizados compreendam a-presença <^3 um a-gente de quelação de metal em uma concentração de 10 a 100 mM, maispreferivelmente 20 a 80 mM, ainda mais preferivelmente EDTA em uma con-centração de 40 a 80 mM.

Também, descobriu-se que a adição de pequenas quantidadesde queladores, tais como EDTA e/ou EGTA, à frações de proteína complexano leite ou derivados de leite pode ajudar a evitar ligação não específica e,portanto, ajuda na separação de material não específico de proteínas PrPsce/ou PrPc. Por exemplo, para alguns derivados, descobriu-se que EDTA a20 a 40 mM reduziu a ligação não específica eficazmente. Quando traba-lhando com íons de metal sepharose-imobilizados, deve-se tomar cuidadopara que os efeitos de redução de ligação não específica e liberação dePrPc por queladores não se sobreponha se a liberação de PrPc ainda não édesejada. Além disso, dependendo da presença e quantidades de proteínasde ligação não específicas, as faixas de concentração preferidas acima terãode ser adaptadas, isto é, aumentadas, para compensar a presença de prote-ínas não específicas que removem os queladores para liberação de PrPc.Tal otimização está dentro da rotina daqueles habilitados na técnica.

Embora a sepharose em si seja suficiente para ligar quantidadessignificativas de PrPc em si, se exposta, pode ser desejável empregar se-pharoses com pelo menos um Iigante adicional para ligação específica a pro-teínas de prion PrPsc e/ou PrPc, em que o referido Iigante é ligado direta ouindiretamente, por exemplo, por meio de uma molécula espaçadora, à se-pharose.

Em uma modalidade preferida, o Iigante adicional é selecionadodo grupo consistindo em proteínas de prion, derivados funcionais de proteí-nas de prion, proteínas de prion His-marcado, proteínas de ligação a proteí-nas de prion, anticorpos de ligação a proteínas de prion e Iigantes específi-cos para proteínas de prion.

Mais preferivelmente, o Iigante adicional é uma proteína de prione/ou um derivado funcional da mesma, por exemplo, um fragmento de priontal como, por exemplo, PrP bovina (25-241), isto é, direta ou indiretamenteligado, por exemplo, através de üm quelador de metal, à sepharose.

A agregação reversível de proteínas de prion ou derivados dasmesmas a uma ou mais estruturas de prion repetidas que oligomerizam comproteínas de prion em um pH de 6,2 a 7,8 e as quais podem se dissociarnovamente em um pH de 4,5 a 5,5 proporciona meios altamente seletivos eeficientes para ligação, concentração, purificação e/ou remoção de proteínasde prion e/ou derivados funcionais das mesmas (PCT/EP2004 003 060). Pa-ra a prática de um método preferido da presente invenção, estrutura(s) deprion repetida(s) pode(m) ser presa(s) à sepharose como Iigantes adicionaisde forma a oligomerizar especificamente com proteínas de prion e, dessemodo, se ligar às mesmas.

Em uma modalidade mais preferida, o Iigante adicional é umaproteína de prion e/ou um derivado funcional da mesma.

O ligante adicional sobre sepharoses para a prática dos métodospreferidos da presente invenção pode ser ligado à sepharose direta ou indi-retamente e é, de preferência, ligado através de uma porção espaçadoraentre a sepharose e o Iigante em si.

Embora os métodos preferidos da presente invenção não este-jam limitados a quaisquer proteínas de prion ou derivados das mesmas emparticular como o Iigante de sepharose, as proteínas de prion e/ou derivadosfuncionais das mesmas para a referida finalidade são selecionadas do grupoconsistindo em proteínas de prion originárias de ser humano, bovino, ovino,cabra, camundongo, hâmster, cervo ou rato e derivados das mesmas.

O termo "derivados funcionais de proteínas de prion", conformeele é usado na descrição e nas reivindicações, se refere a quaisquer deriva-dos de proteínas de prion, em particular fragmentos das mesmas, que com-preendem pelo menos uma ou mais estruturas de prion repetidas, de prefe-rência 2 a 5, mais preferivelmente 5 estruturas de prion repetidas.

Em uma modalidade preferida, o derivado funcional de uma pro-teína de prion para uso como um Iigante de sepharose tem pelo menos umaestrutura de prion repetida que é um octapeptídeo, pseudo-octapeptídeo,hexapeptídeo ou pseudo-hexapeptídeo, mais preferivelmente um octapeptí-deo tendó uma seqüência selecionada do grupo consistindo emPHG5GGWGQ (ser humano), PHGGSWGQ (camundongo) e PHGGGWSQ(rato) ou um pseudo-octapeptídeo derivado das referidas seqüências, depreferência selecionadas do grupo consistindo em PHGGGGWSQ (váriasespécies) e PHGGGSNWGQ (marsupial) ou um hexapeptídeo tendo umaseqüência selecionada do grupo consistindo em PHNPGY (galinha),PHNPSY, PHNPGY (tartaruga) ou é um pseudo-hexapeptídeo derivado dasreferidas seqüências.

Em uma modalidade mais preferida, pelo menos uma, de prefe-rência cada uma das estruturas repetidas de prion compreende uma confor-mação em loop N-terminal conectada a uma estrutura de □-giro C-terminal.

Mais preferivelmente, os derivados funcionais para uso comoligantes de sepharose são também capazes de agregação e/ou dissociaçãoreversível, isto é, oligomerização em um pH de 6,2 a 7,8 e/ou dissociação doagregado oligomérico em um pH de 4,5 a 5,5 emr um ambiente fluido aquo-so.

Os derivados funcionais de proteínas de prion úteis como iigan-tes de sepharose para a prática dos métodos preferidos da presente inven-ção podem também ser caracterizados pelo fato de que eles se ligam à se-pharose não exposta em um grau significativo. Um grau significativo significaque, de preferência, pelo menos 50, mais preferivelmente pelo menos 70,ainda mais preferivelmente pelo menos 80 e, ainda mais preferivelmentepelo menos 90% dos derivados se ligam à sepharose exposta com relação àproteína de prion que ocorre naturalmente a partir da qual o derivado é ori-undo. Para determinação da extensão de ligação de sepharose a derivadosde proteína de prion, a ligação à sepharose pode ser ensaiada usando, porexemplo, Sepharose® 4 B (Sigma, código de produto 4B-200). Os parâme-tros para tal ensaio podem ser rotineiramente determinados por aqueles ha-bilitados na técnica.

Conforme aqueles habilitados na técnica de proteínas de prionapreciarão, os derivados funcionais de proteínas de prion mencionados aquipodem ser rápida e suficientemente caracterizados pelo fato de que elescompreendem pelo menos uma das estruturas de~prion-repetidas acima esão capazes de ligação à sepharose não exposta. Para proteínas de prionbovinas ou derivados das mesmas, admite-se que a ligação de uma proteínade prion à sepharose seja realizada através do domínio 102-241, correspon-dendo aos resíduos de aminoácido 90 a 230 em PrP humana. Regiões aná-logas em proteínas de prion e derivados das mesmas de outras espéciestêm atividade de ligação à sepharose similar.

Em uma modalidade preferida, o derivado funcional para usocomo ligante de sepharose para a prática dos métodos preferidos da presen-te invenção é derivado de proteínas de prion através de uma ou mais dele-ções, substituições e/ou inserções de aminoácido(s) e/ou modificação(ões)covalente(s) de um ou mais aminoácidos.Em uma modalidade mais preferida, o derivado funcional parauso como um Iigante de sepharose compreende uma ou mais seqüênciasoctapeptídicas repetidas, de preferência os aminoócidos 51-90 e/ou o domí-nio C-terminal, de preferência os aminoácidos 121-230 de PrP humana.

As condições para contato das proteínas de prion PrP"sc comsepharose sob condições que permitem a ligação da referida sepharose àsreferidas proteínas de prion PrP"sc e, opcionalmente, a ligação da parte deligante da sepharose ligante-modificada à proteínas PrPc, se sepharose li-gante-modificada é empregada são, de preferência, condições fisiológicas,mais preferivelmente um pH de 5 a 8 e 2 a 39°C, ainda mais prèferivelmenteum pH de cerca de 7 e cerca de 20 a 25°C.

Outras condições para ligação de sepharose a proteínas de pri-on são resistência iônica, substâncias tampão, etc. Aqueles habilitados natécnica podem determinar rotineiramente as condições adequadas e otimi-zadas para ligação de sepharose a proteínas de prion.

Se sepharoses com os ligantes adicionais mencionados acimapara ligação a proteínas de prion através de agregação de proteína de prionsão usadas, naturalmente, um pH de 6,2 a 7,8 é preferido.

Em outra modalidade preferida, as condições para contato desepharose e proteínas de prion compreendem a presença de pelo menos-umdetergente e/ou um tampão de Iise de célula. Dessa forma, células e/ou fra-çõeé de membrana presentes em uma amostra de interesse podem ser tra-tadas através de um método de acordo com a presente invenção diretamen-te sem quaisquer etapas pré-requeridas para liberação das proteínas de pri-on ou derivados funcionais das mesmas e tomando as mesmas acessíveis.

Em um último aspecto, a presente invenção se refere a um mé-todo para remoção de proteínas de prion PrP"sc e/ou PrP"c do leite ou um de-rivado do leite, compreendendo a etapa de:

(a) contanto do leite ou um derivado do mesmo com sepharose sobcondições que permitem a ligação da referida sepharose às referidas proteí-nas de prion.

Sepharoses adequadas para remoção são discutidas acima. Pa-ra a remoção de proteínas de prion, sepharoses de quelação de metal sãopreferidas.

O termo remoção, conforme ele é usado no contexto da remo-ção de proteínas de prion, se refere a técnicas padrão para separação deproteínas e material de sepharose, tais como centrifugação, filtração, ultrafil-tração, etc.

Os referidos íons de metal de sepharoses de quelação de metaladequadas são, de preferência, selecionados do grupo consistindo em Ni2+,Co2+, Zn2+, Mg2+, Ca2+ e Mn2+, mais preferivelmente do grupo consistindo emNi2+, Co2+, Zn2+ e Mn2+, ainda mais preferivelmente Zn2+ e Ni2+.

Em uma modalidade particularmente preferida, a sepharose dequelação de metal para remoção de proteína de prion é Ni Sepharose® HighPerformance (número de código 17-5268-01, 25 ml, 17-5268-02, 100 ml) daGe Healthcare (Amersham Biosciences Europe GmbH, Industrienstrasse 30,CH-8112 Otelfingen) ou HisTrap HP Column da mesma companhia (númerode código depende do volume 17-5247-01, 17-5247-05, 17-5248-01, 17-5248-02, 17-5248-05 ou 17-5249-01).

Para remoção de proteínas de prion PrPsc e PrPc do leite ou umderivado de leite, cerca de 800 Dl de EDTA a 500 mM são, de preferência,adicionados a 10 ml de leite ou um derivado do mesmo antes da etapa (a).

Surpreendentemente, descobriu-se que proteínas de prion po-dem/ser removidas de modo fácil e essencialmente completo do leite, produ-tos de leite comerciais oú outros derivados do leite. Aqueles habilitados po-dem agora analisar a presença de proteínas de prion, remover as mesmasse desejado e verificar o resultado da remoção do leite e derivados do mes-mo.

Finalmente, deve ser notado que a tecnologia acima e métodosreferentes à concentração e/ou purificação de proteínas de prion PrPc e/ouproteínas de prion PrPsc, a separação e/ou enriquecimento de proteínas deprion PrPsc a partir de proteínas PrPc e a remoção de proteínas de prionPrPsc e PrPc é o assunto em questão do pedido de patente internacional co-pendente ainda não publicado dos Requerentes EP/2005/011565, deposita-do em 28/10/2005.

A seguir, o assunto em questão da invenção será descrito emmaiores detalhes em exemplos/modalidades com referência às figuras. Ne-nhum desses deve ser considerado como limitando o escopo da invenção,conforme eia é apresentada na descrição e nas reivindicações em anexo.

Figuras

A figura 1 mostra uma Western blot de proteína de prion PrPcapós enriquecimento a partir de 10 ml de leite de vaca, ovelha, cabra e serhumano não infectado usando a matriz PrioTrap® de acordo com o exemplo 1.

A figura 2 mostra uma Western blot demonstrando a ligação es-pecífica de vários anticorpos monoclonais anti-PrP à PrPc do leite de acordocom o exemplo 2.

A figura 3 mostra uma Western blot demonstrando o efeito detratamento com PNGase (N-glicosidase F) sobre a PrPc no leite e cérebrode acordo com o exemplo 3.

A figura 4 mostra uma Western blot demonstrando a remoçãoaltamente seletiva de PrPc do leite e um gel corado com prata das mesmasamostras tratadas e não tratadas, não demonstrando efeito do tratamento deremoção sobre as proteínas do leite restantes de acordo com o exemplo 4.

A figura 5 mostra uma Western blot demonstrando a capacidadede ligação de PrioTrap® à PrPc após reforço do leite com homogenato decérebro de acordo com o exemplo 5.

Exemplos

Exemplo 1: Detecção de PrPc nativa no leite de seres humanos e animais

Um volume de 10 ml de leite (fresco ou UHT (tratamento emtemperatura ultra-elevada padrão) ou pasteurizado) foi centrifugado a 3000 gdurante 10 min para assegurar a remoção completa de células. O sobrena-dante de leite pobre em gordura e isento de células foi incubado com 800 mlde solução de EDTA a 500 mM, pH de 7,4 e agitado durante 30 min na pre-sença de 50 Dl de matriz PrioTrap® (Ni Sepharose® High Performance (nú-mero de código 17-5268-01, 25 ml, 17-5268-02, 100 ml) da Ge Healthcare(Amersham Biosciences Europe GmbH, Industrienstrasse 30, CH-8112 Otel-fingen). A matriz foi lavada quatro vezes em RT com 10 ml de solução delavagem contendo tampão de fosfato de sódio a 100 mM, Tris a 20 mM, imi-dazol a 10 mM, pH de 8. Para eluir as proteínas da matriz, 15 Dl de tampãode amostra (tampão de amostra XT1 Biorad1 Biorad Laboratoires Nenzlin=gerweg 2, 4153 Reinach, CH) foram adicionados e aquecidos durante 10 mina 70°C. Φ tampão de amostra contendo matriz foi carregado sobre um gelCriterion XT 12 % Precast (Biorad). Após eletroforese, as proteínas foramtransferidas para uma modalidade de PVDF (Hybond-P, Amersham Biosci-ences) através de uma transferência semi-seca, usando um sistema comtrês tampões (anodo 1: Tris a 300 mM, metanol a 20%, pH de 10,4; anodo 2:Tris a 25 mM, metanol a 20%, pH de 10,4; catodo: Tris a 25 mM, ácido ami-nohexanóico a 40 mM, SDS a 0,05%, pH de 9,4). As proteínas de prion fo-ram detectadas através de Western blotting usando o anticorpo monoclonalPrP-mab 8B4 (Alicon AG; número de Produto A0001; Schlieren, Suíça; Li eoutros, J. Mol. Biol. 301, 567-573, 2000)) em combinação com o ECL Ad-vance Western Blotting Detection Kit, Amersham Biosciences. Os marcado-res de peso molecular são indicados do lado esquerdo. PrP bovina recombi-nante (aa 25-241) foi usada como um padrão. Os resultados são mostradosna figura 1, uma Western blot de PrPc após enriquecimento a partir de 10 mlde leite de vaca, ovelha, cabra e sèr humano não infectado usando a matrizPrio Trap® (veja acima). Em leite de vaca, três isoformas de PrPc são obser-vadas, com uma massa molecular evidente de cerca de 34 kD, 30 kD e 27kD, correspondendo à PrPc diglicosilada, monoglicosilada e não glicosilada,respectivamente. Além disso, em alguns preparados, PrP^c monoglicosiladaaparece como uma banda dupla, indicando que os dois sítios de glicosilaçãopodem estar ligados a diferentes carboidratos. A massa molecular evidenteda PrP^c não glicosilada é ligeiramente maior quando comparado com umpadrão de PrP bovina recombinante (25-241) a 26 kD, indicando que a PrP^cnativa no leite contém uma âncora de glicosil fosfatidil inositol (Stahl e ou-tros, Cell, 51, 229-240, 1987; Stahl e outros, Biochemistry 29, 8879-8884,1990). Cerca da mesma distribuição de isoformas de PrP^c é observada emleite de ovelha, cabra e humano, embora a quantidade total de PrPc nativavenha a diferir significativamente entre as espécies. A proporção relativa dePrPc em ovelha/vaca/cabra/ser humano é estimada a 100/20/4/1.

A partir dos experimentos realizados quando de incubações se-qüenciais com PrioTrap®, a concentração total de PrPc no leite de vaca fres-co pode ser estimada como sendo de cerca de 200 pg/ml. Levando-se em1 conta as proporções relativas de PrPc no leite de diferentes espécies, leitede ovelha fresco e leite de cabra contêm cerca de 1 ng/ml e 40 pg/ml de PrP,respectivamente. Leite humano contém menos de 10 pg/ml de PrPc. A con-centração de PrPc em leite de Swiss em circulação é reduzida quando com-parado com leite fresco, mas pode ser claramente detectada (Figura 1). Cer-ca da mesma concentração de PrPc foi medida para leite de fazenda orgâni-co e leite de fazenda não orgânico, bem como para leite pasteurizado e tra-tado em temperatura ultra-elevada (UHT) quando comparados, do mesmofornecedor (dados não mostrados).

Exemplo 2: Ligação específica de anticorpos monoclonais anti-PrP à PrPcdo leite

Para confirmar a especificidade da detecção imunoquímica dePrPc em leite, diferentes anticorpos monoclonais anti-PrP foram compara-dos, os quais são dirigidos contra epítopos não em sobreposição (Figura 2).

Amostras de leite de vaca fiasco foram tratadas conforme des-crito; no exemplo 1, exceto que vários primeiros anticorpos foram usados pa-ra a detecção de PrPc em leite de vaca fresco: PrP-mab 8B4 (Alicon AG,veja acima), mAB 6H4 (Prionics AG, Suíça; Korth e outros, Nature, 390, 74-77, 1997) e PrP-mab 8H4 (Alicon AG, Número de Produto A0002; Schlieren,Suíça; Zanusso e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 8812-8816, 1998).Um anticorpo monoclonal específico para a proteína tau-1 (Chemicon Inter-national, Inc., Califórnia, EUA) foi usado como um controle negativo. PrP-mab 8B4 se liga aos resíduos 37-44 dentro do domínio amino-terminal f Iexi-velmente desordenado de PrP de camundongo; mAB 6H4 objetiva os resí-duos 144-152 dentro da hélice 1 do domínio carbóxi-terminal globular; e PrP-mab 8H4 se liga aos resíduos 175-185 da hélice 2 dentro do domínio globu-lar. Os três anticorpos reconhecem as mesmas proteínas e, assim, confir-mam a presença de PrPc no leite. Em experimentos de controle, com umanticorpo não-PrP, por exemplo, anticorpo monoclonal antiproteína Tau (Fi-gura 2) e anticorpo monoclonal anti-AD (Calbiochem, Alemanha; dados nãoδ mostrados), nenhuma das isoformas de PrPc foi detectada, assim, confir-mando a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais anti-PrP.Uma observação interessante com relação ao anticorpo 8B4 é seu perfil dedetecção "claro" quando comparado com os anticorpos 6H4 e 8B4. Pode-seconcluir que o 8B4 não reconhece uma variedade de fragmentos carbóxi-terminais da PrPc do leite, a qual aparece como uma mancha na Westernblot.

Exemplo 3: Identificação de glicoformas de PrP através de tratamento comPNGase de PrPc de leite e cérebro

A identificação de glicoformas de PrP foi realizada com PNGase(Figura 3), uma enzima que corta oligossacarídeos de glicoproteínas N-ligadas, por exemplo, os dois açúcares N-Iigados de PrPc (Haraguchi e ou-tros, Arch. Biochem. Biophys. 274, 1-13, 1989).

Para tratamento com PNGase, proteína de prion extraída de 10ml de leite de vaca fresco conforme descrito no exemplo 1 ou 10 ml de ho-mogenato de cérebro de vaca a 1% (peso/v) foram incubados sob agitaçãodurante 12 h a 37°C em tampão contendo fosfato de sódio a 100 mM, Tris a10 mM, imidazol a 20 mM, NP-40 a 1%, MEGA-8 a 1%, pH de 8 e 1,5 unida-des de N-Glicosidase F (Roche, Mannheim, Alemanha). Sob as condiçõesde clivagem mais estringentes, as proteínas foram desnaturadas através deaquecimento durante 10 minutos a 100°C na presença de SDS a 0,5% antesde tratamento com 4 unidades de N-glicosidase. As proteínas foram analisa-das através de eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS e Western blottingusando o anticorpo PrP-mab 8B4 conforme descrito no exemplo 1. Após cli-vagem parcial com PNGase, a isoforma de PrP superior na Western blot re-presentando PrPc diglicosilada (34 kD) desaparece em favor de PrPc mono-glicosilada (30 kD) e não glicosilada (27 kD). Em paralelo, parece haver umpequeno desvio da forma monoglicosilada com peso molecular superior paraa forma com peso molecular menor. Um ligeiro desvio da PrP^c monoglicosi-Iada também é observado para o homogenato de cérebro após tratamentocom PNGase (Figura 3). As isoformas de PrP^c diglicosiladas diferem ligei-ramente quanto à massa molecular, indicando que a estrutura de carboidratoda PrP^c no leite e cérebro pode não ser idêntica. Condições de reação maisestringentes resultam em truncamento completo de carboidratos da PrP^c. Demodo mais importante, as massas moleculares evidentes de PrP^c não glico-silada no leite são exatamente equivalentes àquelas da PrP^c correspondenteem homogenato de cérebro.

Exemplo 4: Remoção de PrP^c do leite

PrioTrap® pode também ser aplicada para remoção de PrP^c doleite. PrP^c foi detectada em 10 ml de leite de vaca fresco, conforme descritoacima no exemplo 1. Entre as etapas de detecção, o leite foi incubado com500 □l de PrioTrap® (Ni-Sepharose® High Performance GeHeaIthcare, A-mersham Biosciences) durante 30 min para remover a PrP^c. Os sobrena-dantes, antes e após as etapas de remoção, foram analisados através deWestern blotting conforme descrito no exemplo 1 e as proteínas totais noleite foram detectadas através de coloração com prata (SilverSNAP Stain KitII, Pierce, Perbioscience, Lausanne, Suíça).

Conforme mostrado na Figura 4, após o primeiro tratamento de,10 ml de leite com matriz, mais dé 95% da PrP^c endógena já tinham sido-removidos e, após o segundo tratamento, PrPc foi completamente removidadentro do limite de detecção de 1 pg. Contudo, a concentração global deproteína (medida através do ensaio com ácido biçinconínico, Perbioscience,Suíça) era constante, com cerca de 40 mg/ml antes e após eliminação dePrP^c. A composição de proteína do leite, conforme analisado através deSDS PAGE (Figura 4B) não foi afetada. A proteína de prion também foicompletamente removida quando o leite foi reforçado com PrP^sc de homo-genato de cérebro de camundongo Rocky Mountain Laboratory (RML) (da-dos não mostrados). Assim, PrioTrap® pode ser usada para enriquecimentoe identificação de proteínas de prion em leite e também para sua remoçãocompleta.Exemplo 5: Detecção de PrPsc no leite

PrioTrafP® pode também ser aplicada para a detecção de PrPscno leite. 10 ml de leite de ovelha pasteurizado foram reforçados com 10 □lde homogenato de cérebro de camundongo a 1% (peso/v) Rocky MountainLaboratory (RML) contendo cerca de 1 ng de PrPc. Após agitação durante30 min, o leite foi centrifugado a 3000 g durante 10 min. A fração de péletefoi dissolvida em 10 ml de tampão de fosfato de sódio a 100 mM, Tris a 20mM, imidazol a 10 mM, pH de 8 contendo Triton X-100 a 1% e subseqüen-temente incubado sob agitação durante 30 min na presença de 50 □l de Pri-oTrap®. Subseqüentemente, a matriz foi lavada quatro vezes com 10 ml desolução de lavagem contendo tampão de fosfato de sódio a 100 mM, Tris a20 mM, imidazol a 10 mM, pH de 8. Proteínas ligadas à matriz foram trata-das com 0,88 U de proteinase K (PK) (Roche, Suíça) durante 60 min a 37°C.A reação foi cessada através da adição de PMSF em uma concentração finalde 3 mM. As proteínas foram analisadas através de Western blotting, con-forme descrito no exemplo 1, com anticorpo 8H4.

As três bandas desviadas detectadas após tratamento com PKno leite reforçado com homogenato de cérebro representam claramentePrPsc após enriquecimento com PrioTrap® (veja figura 5). A intensidade dossinais de PrPsc indica que o enriquecimento é quantitativo. O experimento decontrole na ausência de PrPsc nãó mostra sinal após tratamento com PK,indicando que a detecção de sinal resulta de reforço do leite com homogena-to de cérebro contendo PrPsc.

Claims (34)

1. Uso de leite ou um derivado do mesmo para a identificação deproteínas de prion em um mamífero.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1 em que as proteínas deprion são proteínas de prion PrPsc.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o mamífe--1 ro é selecionado do grupo consistindo em um ser humano, bovino, ovino,camundongo, hâmster, cervo, cabra ou rato.

4. Método para identificação de proteínas de prion em mamífe-ros compreendendo a etapa de:contato do leite ou um derivado do mesmo com um agente tendoafinidade e seletividade elevadas por proteínas de prion.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que as proteínasde prion são proteínas de prion PrPsc e o agente tem elevada afinidade eseletividade por proteínas de prion PrPsp.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o ma-mífero é selecionado do grupo consistindo em um ser humano, bovino, ovi-no, camundongo, hâmster, cervo, cabra ou rato.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a-6, em que o agente tendo alta afinidade e seletividade por proteínas de prionPrPsc e/ou PrPc é selecionado do grupo consistindo em anticorpos policlo-naisjou monoclonais ou derivados dos mesmos e/ou proteínas de ligação dedomínios de não-imunoglobulina.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a-7, compreendendo as etapas de:(i) concentração e/ou purificação de proteínas de prion PrPc e/ou proteí-nas de prion PrPsc do leite ou um derivado do mesmo,(ii) contato do leite ou um derivado do mesmo com um agente tendo altaafinidade e seletividade por proteínas de prion PrPsc e/ou proteínas deprion PrPc.

9. Método de acordo com a reivindicação 8 em que a etapa (i)ainda compreende as seguintes etapas:a) contato das proteínas de prion PrPc e/ou proteínas de prion PrPsc doleite ou um derivado do mesmo com sepharose sob condições quepermitem a ligação da referida sepharose à& referidas proteínas de pri-on PrPsc e/ou proteínas de prion PrPc, b) remoção das proteínas de não-prion não ligadas da referida sepharose.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a sepharo- se é selecionada de sepharoses não ligadas, de preferência selecionadas dogrupo consistindo em Sepharose 2B®, 4B®, 6B®, Sepharose CL-4B®, Sepha-rose-6B®, Superdex 75®, Sephacryl 100HR® e Sephadex G10®.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a10 em que a sepharose é selecionada de sepharoses ligante-modificadas,de preferência selecionadas do grupo consistindo em sepharoses de quela-ção de metal, agaroses de lectina, sepharose iminodiacética, agarose deproteína A, sepharose de estreptavidina, sepharose de sulfopropila e sepha- rose de carboximetila.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a-11, compreendendo adicionalmente a etapa de separação e/ou enriqueci-mento de proteínas de prion PrPsc a partir de proteínas PrPc.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, compreendendo as seguintes etapas adicionais:a) coníanto de proteínas de prion PrPsc e proteínas PrPc de leite ou um derivado funcional do mesmo com sepharose ligante-modificada sobcondições que permitem:(i) a ligação da referida parte de sepharose às referidas proteínas de prion PrPsc e(ii) a ligação da referida parte de Iigante da sepharose a proteínasPrPc,b) opcionalmente, remoção do material não ligado da referida sepharoseligante-modificada, c) opcionalmente, aguardar um período de tempo suficiente para que al-gumas ou a maioria das proteínas PrPc ligante-ligadas e/ou derivadosfuncionais das mesmas se convertam em proteínas de prion PrPsc e/ouderivados funcionais em proximidade íntima com as proteínas de prionPrPsc e/ou derivados funcionais das mesmas,d) adição de uma agente de liberação seletivo às proteínas sepharose-ligadas e/ou derivados funcionais das mesmas da etapa a), b) ou c)sob condições que permitem a liberação de proteínas PrPc e opcional-mente proteínas de não-prion da parte do Iigante da sepharose, masnão a liberação das proteínas de prion PrPsc e/ou derivados funcionaisdas mesmas da parte de sepharose ee) remoção de PrPc e opcionalmente proteínas de não-prion da sepharo-se.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, ainda compreen-dendo a etapa de:f) liberação de proteínas de prion PrPsc e/ou derivados das mesmas dasepharose.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a libera-ção de proteínas de prion PrPsc e/ou derivados das mesmas è realizada a-través da adição de agentes caotrópicos e/ou detergentes, de preferênciauréia e/ou cloreto de guanidínio e/ou SDS, mais preferivelmente adição deuréia e/ou SDS, ainda mais preferivelmente adição de um tampão de carre-gamento de gel compreendendo uréia a 8 M e SDS a 5% e aplicação de umcampo elétrico.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11-15, em que a sepharose ligante-modificada é uma sepharose de quelaçãode metal compreendendo íons de metal imobilizados divalentes.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que os íonsde metal são selecionados do grupo consistindo em Ni2+, Co2+, Zn2+, Mg2+,Ca2+e Mn2+.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que os íonsde metal são selecionados do grupo consistindo em Ni2+, Co2+, Zn2+ e Mn2+,de preferência Ni2+ e Zn2+.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a sepha-rose ligante-modificada é Ni Sepharose® High Performance da GeHeaIthca-re, Amersham.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13a 19, em que a sepharose ligante-modificada é ucna sepharose de quelaçãode metal de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19 e o agentede liberação seletivo é um agente de quelação de metal, de preferência umagente selecionado de EDTA e/ou EGTA.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o agentede quelação de metal é EDTA.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a sepha-rose de quelação de metal compreende Zn2+ e o agente de quelação de me-tal é EDTA.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13a 22, em que as condições na etapa d) da reivindicação 13 que permitem aliberação de proteínas de não-prion e PrPc dos íons de metal sepharose-n15 imobilizados compreendem a presença de um agente de quelação de metalem uma concentração de 10 a 100 mM, mais preferivelmente 20 a 80 mM,ainda mais preferivelmente EDTA em uma concentração de 40 a 80 mM.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-23, em que pelo menos um ligante adicional para ligação de proteínas deprion PrPsc e/ou PrPc é ligado direta ou indiretamente à sepharose.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o liganteadicional é selecionado do grupo consistindo em proteínas de prion, deriva-dos funcionais de proteínas de prion, proteínas de prion His-marcado, prote-ínas de ligação a proteínas de prion, anticorpos de ligação a proteínas deprion e ligantes específicos à proteínas de prion.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o liganteadicional é uma proteína de prion e/ou um derivado funcional da mesma.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 19, em que o ligante adicional é ligado à sepharose direta ou indiretamen-te, de preferência através de uma porção espaçadora.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-27, em que as condições para ligação de sepharose a proteínas de prionPrPSc são condições fisiológicas, de preferência em um pH de 5 a 8 e 2 a-39°C, mais preferivelmente um pH de cerca de 7 e cerca de 2 a 8°C.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que as condi-ções compreendem a presença de pelo menos um detergente e/ou um tam-pão de íise de célula.

30. Método para remoção de proteínas de prion PrPsc e/ou PrPcdo leite ou um derivado de leite compreendendo as etapas de:(a) contato do leite ou um derivado do mesmo com sepharose sob condi-ções que permitem a ligação da referida sepharose às referidas proteí-nas de prion,(b) remoção do leite ou derivado do leite da referida sepharose.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que a referidasepharose é uma sepharose de quelação de metal compreendendo íons demetal divalente imobilizados.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que os íonsde metal são selecionados do grupo consistindo em Ni2+, Co2+, Zn2+, Mg2+,Ca2+e Mn2+, de preferência do grupo consistindo em Ni2+, Co2+, Zn2+ e Mn2+,mais preferivelmente em que os íons de metal são Zn2+.

33. Método de acordo com as reivindicações 30 a 32, em que asepharose de quelação de metal é Ni Sepharose® High Performance da Ge-HeaIthcarerAmersham.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30a 33, em que cerca de 800 Dl de EDTA a 500 mM são adicionados a 10 mlde leite ou um derivado do mesmo antes da etapa (a).