BRPI0711302A2 - método para o suprimento de uma vacina de gonadotropina coriÈnica humana (hcg) para a produção de anticorpo de longa atuação - Google Patents

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Abstract

MéTODO PARA O SUPRIMENTO DE UMA VACINA DE GONADOTROPINA CORIÈNICA HUMANA (hCG) PARA A PRODUçãO DE ANTICORPO DE LONGA ATUAçãO. Esta invenção compreende um método para imunização no qual um antígeno de uma vacina de gonadotropina coriónica humana (hCG) é incorporada dentro de um complexo de sal inorgânico! biopolímero com a utilização de um processo simples de fabricação. A matriz sólida resultante é administrada a sujeitos humanos na forma de micro partículas. O método compreende suspender as micro partículas em uma emulsão de um óleo natural e água contendo um composto adjuvante aceitável para uso humano e injetando uma dose farmacêutica da suspensão por via intramuscular. Os antígenos da vacina são conjugados de fragmentos de peptídio da subunidade beta da hCG com uma proteína transportadora. Os antígenos da vacina supridos nessa formulação são efetivos para provocar o aparecimento de anticorpos nos recebedores para o tratamento de câncer ou doenças relacionadas com hormónios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA O SUPRIMENTO DE UMA VACINA DE GONADOTROPINA CORI- ÔNICA HUMANA (hCG) PARA A PRODUÇÃO DE ANTICORPO DE LON- GA ATUAÇÃO".
Antecedentes da Invenção
A aplicação de muitas vacinas de descoberta recente tem sido prejudicada pela falta de um adjuvante/ sistema de liberação para tornar as mesmas eficientes e seguras para o uso médico. Numerosas novas vacinas têm sido desenvolvidas com a utilização de fragmentos ou subunidades de moléculas de antígeno, preparadas através de tecnologia de DNA recombi- nante ou a síntese de peptídios, que tem mostrado serem eficazes quando as respostas de imunização aos mesmos são adequadas.
Em muitas situações, as exigências para provocas a resposta de imunização adequada (anticorpos ou ativação células) envolve o uso de ad- juvantes ou veículos que produzem reações inflamatórias locais não aceitá- veis no local da injeção ou outros efeitos colaterais indesejáveis. Os únicos adjuvantes aprovados para serem usados em vacinas humanas são os sais albumina os quais quando absorvidos ao antígeno, aumentam a resposta de imunização com relação ao antígeno. Infelizmente, esses adjuvantes são efetivos suficientemente somente com relação somente a um número limita- do de antígenos e são raramente úteis para novas vacinas que empregam antígenos de peptídio ou de sub unidades de peptídio. Em geral, essas vaci- nas são fracamente imunogênicas e requerem um efeito de adjuvante mais potente do que o provido pelos sais de albumina. Quando outros adjuvantes comumente disponíveis são usados, tais como emulsões de óleo mine- ral/água, a eficácia pode ser demonstrada, porem os efeitos colaterais, tais como dor e inflamação do tecido no local da injeção, quase sempre impe- dem o uso geral das mesmas em seres humanos.
A produção de uma resposta de imunização com relação a um determinado antígeno depende de uma serie de eventos biológicos, que in- cluem: o suprimento do antígeno a um local acessível às células linfóides; atração dessas células para o micro ambiente nos quais o reconhecimento do antígeno como estranho pelos linfócitos T (células T) ocorre; ligação dos epítopos de dum antígeno aos receptores linfócitos; e a produção das citosi- nas apropriadas pelas células que apresentam o antígeno (as APC), células T e linfócitos B (células B) que são necessárias para a expansão clônica das células que estão produzindo o anticorpo e/ou citotóxicas. Existem numero- sas moléculas naturais e sintéticas que podem atrair e estimular essas célu- las linfóides, Alem disso, a imunização humoral continuada requer a exposi- ção persistente das células B a um antígeno, tanto através da retenção de seqüência de epítopos não degradadas ligadas as células dendríticas folicu- lares, como pela liberação continua do antígeno a partir dos depósitos ou das micro partículas. Essa persistência do antígeno é essencial para a ma- nutenção de um nível elevado de produção de anticorpos sem ter que utilizar imunizações freqüentes de reforço.
A terminologia usada para a definição dos diversos métodos de estimulo da imunização são algumas vezes enganosos e quase sempre con- fusos. Historicamente, o termo "adjuvante" tem sido atribuído a qualquer substância que quando administrada com um antígeno, seja capaz de esti- mular uma resposta de imunização maior do que aquela daquele antígeno se o antígeno for administrado de forma isolada. Essa resposta aumentada é usualmente efetuada pelo estimulo não específico das células linfóides atra- vés do adjuvante. Muitos adjuvantes, tais como um aceitável para uso hu- mano Freund1S Complete Adjuvant (FCA),, pode estimular muitos dos even- tos biológicos referidos anteriormente, enquanto que outros exibem somente algumas dessas atividades. Desse modo, como têm progredido as pesqui- sas para a identificação de melhores potenciadores de imunização, se tor- nou necessária a definição das propriedades dos compostos de forma mais precisa, por exemplo, como ao atraentes celulares, ativadores de macrófa- gos (APC), mitógenos de células T, mitógenos de células B ou sistemas de suprimento de antígenos. Muitas dessas substâncias têm sido definidas em termos da sua atividade principal mesmo embora elas possam produzir mais do que um efeito biológico. Muitas preparações e procedimentos de imuni- zação exibem uma combinação de atividades. A presente invenção é focali- zada sobre um método de formulação de vacina projetado para induzir níveis elevados de anticorpos e para asseguras um suprimento persistente do antí- geno com a utilização de um novo agente de suprimento e dessa forma uma produção contínua de anticorpos durante u7m período de tempo estendido com efeitos colaterais mínimos.
Como exemplos, várias das novas vacinas recentemente desen- volvidas são projetadas para o tratamento quase sempre de outras de condi- ções médicas que não as doenças infecciosas. Pelo menos duas vacinas HCG foram desenvolvidas com a finalidade da concentração ou do tratamen- to do câncer. Os testes clínicos foram realizados com essas vacinas e os resultados foram divulgados (Talwar GP, Singh O, Pal R, Chatterjee N, Jallai P, Dahil K, Kaus J, Das Sci, Suri S, Buchshee, Saraya T, Saxena BN. A vac- cine that prevents pregnancy in women. Proc Natl Acad Sd (USA) 91: 8532 - 6, 1994) e (Moulton HM, Yoshihara, PH1 Mason DH, Iversen PL, Trozzi PL. Active Specific Immunotherapy with β-Human Chorionic Gonadotropin Pepti- de Vaccine in Patients with Metastatic Colorectal Câncer: Antibody Respon- se is Associated with Improved Survival, Clinicai Câncer Research 8: 2044 - 2051,2002). Embora algumas dessas vacinas tenham exibidos promessas com relação ao uso humano, aquelas que demonstraram utilidade quase sempre registraram uma alta incidência de dor e/ou inchaço no local da inje- ção ou necessitaram de múltiplas imunizações. Esses efeitos colaterais são algumas vezes intoleráveis com relação a alguns pacientes.
Um uso principal das formulações da vacina hCG descrito aqui, neste pedido de patente é para o tratamento do câncer. A hCG é classificada como um antígeno oncofetal, um antígeno altamente expresso durante a enbriogênese, porem em quantidades desprezíveis por tecidos adultos nor- mais. A HCG e expressa em excesso em tecidos neoplásicos. Embora so- mente fragmentos possam ser expressos, não existe evidencia no presente de que a hCG expressa por células neoplásicas seja mudada. A produção de hCG por tumores que aparecem a partir de células trofoblásticas/germe, incluindo coriocarcinoma, verruga hidratiforme e carcinoma embrionário dos testículos, é um marcador essencial da atividade dessas doenças, e a medi- ção da mesma tem um papel central no gerenciamento clinico das mesmas modo o espectro da expressão de HCG por ambos os cânceres trofoblasti- cos e não trofoblásticos rep. Também está bastante reconhecido que uma ampla variedade de tumores de origem não trofoblástica também expressam o hCG. Desse modo o espectro de expressão da hCG por ambos os cânce- res trofoblásticos e não trofoblásticos representa um grupo de objetivos pro- váveis para a terapia com vacina.
Brausnstein (Braunstein GD: Placental proteins as tumor mar- kers. In: Immunodiagnosis of Câncer. Herberman RB and Mercer DW (eds) Marcel Dekker1 Inc., New York, pp 673-701, 1990) revisaram a expressão do hCG pelas células de câncer em 1990 e presumiram que a hCG imuno reati- va poderia ser demonstrada nos soros de aproximadamente 18% de pacien- tes com malignidade não trofoblástica. O hCG foi detectado mais comumen- te nos soros de pacientes com cânceres cervicais uterinos (34%), ovariano (29%), pancreático (27%), da bexiga urinária (23%) hepático (22%) e gástri- co (21%). A maioria dos estudos revisados, no entanto, foram baseados no reconhecimento do hCG e do material do tipo do hCG, ou sub unidades de hCG livres tanto por anticorpos policlônicos como por monoclônicos que não eram totalmente específicos ou de alta afinidade. Recentemente ensaios com base em monoclônicos altamente específicos com relação ao hCG in- tacto, a-hCG, β-hCG, o peptídio terminal de carbóxi da sub unidade beta (CTP) e o fragmento do núcleo do β possibilitaram aos investigadores reava- liar a produção de hCG pelos tumores. Por exemplo, o hCG elevado no soro de 72% dos pacientes com câncer pancreático e em 9% daqueles com do- enças não malignas foram encontrados com a utilização de um ensaio imuno fluorométrico altamente sensível resolvido com o tempo; Os níveis baixos de hCG e da sub unidade α-hCG livre, como medidos através de uma analise imuno radiométrica, foram reportados como sendo comuns no soro de indi- víduos normais. O β-hCG, livre (£ 100 pg/ml), no entanto, foi mais específico para tumor, e foi detectado9 nos soros de 47% de pacientes com câncer da bexiga urinária, 32% de pancreático, e 30% de cervical, alem de uma maio- ria de pacientes com tumores de células germe. Os indivíduos normais têm os níveis de β-hCG no soro de menos do que 100 pg/ml.
O hCG associado à membrana e/ou as sub unidades são uma característica comum de linhas de células de câncer cultivadas. O hCG as- sociado à membrana também é detectado freqüentemente em estudos imu- nohistoquímicos de espécimes clínicos de tumores. No resumo de Brausns- tein a detecção de hCG em tecido de tumor foi mais freqüente em cânceres colorrertais (52%), pulmão (35%), pancreático (31%), esofágico (28%), ma- ma (24%) e bexiga urinária (21%) A detecção imunohistoquímica também foi registrada em aproximadamente de 8 a 19% dos cânceres gástricos, da próstata, ovário, cervicais uterinos e do endométrio. De novo a expressão registrada de hCG associada à membrana variou dependendo das técnicas e da população de pacientes estudadas. A taxa de expressão em cânceres tais como gástrico e da próstata podem ser mais altas do que considerado inicialmente, isto é, maior do que 50%. Em outros estudos a expressão da CTP de β-hCG por espécimes de câncer colorretal humano como determi- nado de forma imunohistoquímica com um anticorpo monoclônico específico, foi de 85%. Outros investigadores reportaram a detecção de hCG em mem- branas de virtualmente todas as linhas de células de câncer (Acevedo HF, Krichevsky A, Campbell Acevedo EA, Galyon FC, Buffo MJ, Hartsock RJ. Expression of membrane-associated human chorionic gonadotropin, its su- bunits and fragments by cultured human câncer cells. Câncer 69:1829-42, 1992).
O uso do hormônio hCG total como um antígeno de vacina não é adequado devido a que os anticorpos levantados contra o mesmo irão reagir com outros hormônios, Por conseqüência, as sub unidades ou os fragmen- tos específicos apara o hCG tem sido empregados como antígenos. As vaci- nas que usam esses antígenos foram testadas em seres humanos pára am- bas as "prevenções da gravidez " (?) (Talwar GP, Singh O, Pal R, Chatterjee N, Jallai P, Dahil Κ, A vaccine that prevents pregnancy in women. Proc Natl Acad Sci (USA) 91:8532-6, 1994) and (Jones INR, Judd SJ Ing RMY, Powell J, Bradley J, Denholm EA, Mueller UW, Griffin PD, Stevens VC. Phase I cli- nicai trial of a World Health Organization birth control vaccine. Lancet. 11: 1295-8, 1988) and for câncer therapy (Moulton HM, Yoshihara, PH, Mason DH, Iversen PL, Trozzi PL. Active Specific Immunotherapy with β-Human Chorionic Gonadotropin Peptide Vaeeine in Patients with Metastatie Colorec- tal Câncer: Antibody Response is Associated with Improved Survival, Clinicai Câncer Research 8:2044-2051, 2002) and (Triozii PL, Gochnour D, Martin EW, Aldrich W, Powell J, Kim JA, Young DC, Lombardi J. Clinicai and Immu- nologic effects of a synthetic β-human chorionic gonadotropin vaccine. Int J Oncol 5: 1447-53, 1994).O sais de alumínio e as emulsões de água em óleo exigindo múltiplas injeções foram usados nesses testes. As vacinas que usa- ram o adjuvante alum exigiram administrações freqüentes para manter um nível efetivo de anticorpos, o que tornou a mesma impraticável de ser usada. Da mesma forma, as injeções múltiplas de vacinas com base em emulsão, embora mais efetivas, ocasionaram algumas vezes um nível indesejável de dor e de inchaço no local da injeção. As aplicações muito difundidas de qualquer uma dessas vacinas de hCG, é mais provável de ocorre se elas fossem reformuladas para a utilização de um adjuvante/ sistema de supri- mento mais adequado que tornasse as mesmas mais efetivas, e ainda me- nos irritantes.
Uma vacina especifica de hCG descrita aqui, neste pedido de patente utiliza um conjugado de dois segmentos de peptídios de (β-hCG, conjugada com o toxóide de difteria: a parte CTP (resíduos 109 a145) e um segundo peptídio que representa o amino a região 38-57 do amino ácido. Nessa modalidade da invenção, um análogo da seqüência do peptídio 38- 57, no ligas da seqüência natural é usada. O imunógeno combinado resul- tante é mais potente para a indução dos anticorpos reativos hCG, porem de modo mais importante, esses anticorpos são muito mais efetivos na bio neu- tralização do hCG in vitro e in Vico, o que pode ser de valor em algumas a- plicações.
A imunização com vacinas contendo os conjugados descritos acima resultou em termos de sobrevivência aumentada dos pacientes com câncer colorretal em metástase, porem não resolveu os problemas de dor e de inchaço no local da injeção. Ela também não resolveu o fato de que mui- tas formulações de vacina exigem múltiplas injeções para alcançar respostas altas e duráveis de anticorpos (Moulton HM1 Yoshihara1 PH1 Mason DH, I- versen PL, Trozzi PL. Active Specific Immunotherapy with β-Human Chorio- nic Gonadotropin Peptide Vaccine in Patients with Metastatic Coloreetal Câncer: Antibody Response is Associated with Improved Survival, Clinicai Câncer Research 8:2044-2051, 2002).
Pesquisas extensas foram realizadas durante as ultimas duas décadas com relação à identificação de sistemas mais adequados para o suprimento de vacinas. Muitos aperfeiçoamentos foram feitos com o uso de lipossomas, micro esferas de polímeros biodegradáveis e formulação para imunizações de mucosas. Alguns desses sistemas estão em testes clínicos e pode provar serem úteis com relação a futuras vacinas. Outro sistema úni- co foi recentemente desenvolvido com relação ao suprimento de fármacos, incluindo o suprimento de vacinas, que oferecem vantagens significativas com relação aos outros sistemas sob desenvolvimento mencionados acima. Quando usados para o suprimento de vacinas, o antígeno de vacina é encer- rado em uma matriz de sal inorgânico/ bipolímero e a matriz sólida é tritura- da em partículas muito finas para uso. As micro partículas são suspensas em um veiculo de emulsão para a administração ao recebedor da vacina. Este método mostra ser útil no suprimento de uma formulação de vacina hCG que provoque uma resposta de imunização altamente efetiva com efei- tos colaterais mínimos, compreende esta invenção.
Resumo da Invenção
Esta invenção descreve um novo método para a formulação de vacinas com base em HCG que compreende a retenção de um ou mais con- jugados de peptídio de hCG/toxóide de difteria (DT) ou toxóide de tétano (TT) em uma matriz sal inorgânico/ biopolímero e administrando os mesmos a seres humanos em uma emulsão com base de água em óleo que conte- nha um adjuvante sintético. Os peptídios de hCG conjugados ao toxóide in- cluem aqueles que representam as seqüências de sub unidades beta 109 a 145 e 38 a 57 e análogos das seqüências. A matriz cima mencionada é composta por hemi-hidrato de sulfato de cálcio e sulfato de dextrano. A ma- triz sólida é triturada em um pó fino antes da mesma ser suspensa dentro da emulsão para o suprimento. As partículas de tamanho exigido são obtidas através de peneiramento em seqüência através de telas de malha padrão. Uma forma da emulsão de suspensão pode ser composta de esqualeno, monooleato de manida (MM) e solução salina tamponada com fosfato. Um composto adjuvante sintético, tal como o nor-MDP, pode ser incorporado dentro da parte aquosa da emulsão antes da emulsificação. As doses da vacina são administradas aos recebedores por via intramuscular. Os exem- plos de tais formulações e variações das mesmas tem demonstrado em mo- delos animais provocar altos níveis de anticorpos reativos com hCG durante períodos de tempo que excedem a seis meses a partir de uma única inocu- lação sem a produção de reações inaceitáveis locais no tecido no local da injeção. Os anticorpos produzidos através de tais formulações são úteis para o tratamento de paciente com câncer e para impedir a gravidez. Descrição Detalhada da Invenção
A incorporação de peptídios de antígeno de hCG dentro da ma- triz de sal inorgânico/ biopolímero é conseguida através dos métodos descri- tos por Royer (Patentes U.S. 6.391.336, 6.497.901 e 6.630.486, incorpora- das aqui, neste pedido de patente, em sua totalidade por referência). O sal inorgânico empregado para ser usado na presente invenção é o hemi-ídrato de sulfato de cálcio e o biopolímero usado é o sulfato de dextrano, a forma de preferência tendo um peso molecular médio de 8000 daltons. Dois dos antígenos de peptídios de hCG retidos representam tanto as seqüências de 109 a 145 e 38 a 57 da subunidade beta do hCG, ou análogos desses peptí- dios conjugados ao DT em uma proporção especificada de peptídio para DT ou combinações desses conjugados. O TT pode ser substituído por DT. Ca- da antígeno conjugado, de preferência em um estado seco é misturado de forma separada com o hemi-ídrato de sulfato de cálcio em uma proporção em peso de 1 a 10 partes do sal para 1 parte do antígeno com a proporção e preferência sendo de 4:1. Depois de uma misturação completa dos compo- nentes secos, um volume de 10 por cento de sulfato de dextrano aquoso (peso/volume) é adicionado ao peso apropriado da pré mistura de conjugado seco/ sal com uma agitação continua para a formação de uma suspensão semi fluida com uma dispersão uniforme do conjugado dentro da mesma. O peso da mistura no estado molhado é registrado. A mistura é deixada secar em temperatura ambiente, com ventilação, durante de dois a três dias até que não seja observada nenhuma mudança no peso da mistura. Um peso final é registrado antes da matriz sólida ser triturada em um pó fino com a utilização de um almofariz e mão de gral, ou em um triturador mecânico, e o conteúdo de água do pó é determinado. O conteúdo de água mais a perda de água na secagem são usados para o calculo da concentração do antíge- no na matriz sólida (equilíbrio de peso). Os tamanhos desejados para as mi- cro partículas para uso são obtidos por penetração através de uma serie de peneiras de malhas padronizadas. As partículas usadas para a formulação da vacina variam a partir de 10 a 800 micrômetros com um tamanho de pre- ferência variando de 45 a 150 micrômetros.
As partículas secas que contem o antígeno são tipicamente es- táveis durante a armazenagem em longo prazo em temperatura ambiente, porem podem ser armazenadas sob refrigeração se desejado ou necessita- do com relação às propriedades do antígeno especifico.
Para a formulação de uma vacina, as partículas de matriz que contem o antígeno são suspensas em um meio liquido com viscosidade sufi- ciente para a manutenção de uma distribuição uniforme de partículas através de toda a suspensão. Alternativamente um meio liquido menos viscoso pode ser usado, contanto que as partículas possam ser re-suspensas com facili- dade antes da injeção. Diversos veículos líquidos podem ser usados, tais como emulsões de água em óleo, emulsões de óleo em água, carboximetil celulose a 0,1 a 2,0 por cento, soluções de ácido hialurônico, soluções de Iecitina ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis. Um veiculo de pre- ferência para os antígenos do conjugado hCG é uma solução de água em óleo de esqualeno e solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma proporção de 3 partes da fase de óleo para duas partes de PBS (v/v). Um óleo aceitável é proporcionado por uma mistura de 4 partes de esqualeno para uma parte de MM, que atua como um emulsificador e estabiliza a emul- são. A emulsão é preparada com a utilização de um misturador mecânico ou de modo manual com a utilização de seringas hipodérmicas conectadas a- través de uma torneira de três ramos. Outras proporções de fase de óleo vs. PBS são úteis com relação a outros antígenos dependendo da solubilidade dos mesmos e/ou da dose exigida em uma vacina. Outros óleos, tais como o esqualeno, também podem ser usados.
Os antígenos mais fracos, incluindo os conjugados de hCG usa- dos na presente invenção, exigem que um composto adjuvante seja adminis- trado junto com o antígeno para estimular a resposta de imunização deseja- da. Esses compostos podem ser adicionados à matriz e misturados com o antígeno na ocasião em que a matriz é preparada ou adicionados a fase a- quosa da emulsão antes da emulsão ser formada, Os compostos de adju- vantes que têm mostrado serem efetivos para essa finalidade incluem as micro bactérias, fragmentos sintéticos de membranas de bactérias ou análo- gos sintéticos dos mesmos, sais de alumínio, sais de magnésio, lipídios e numerosos outros compostos(Adams A. Synthetic Adjuvants. New York: John Wiley & Sons, 1985). Um adjuvante de preferência para a invenção descrita aqui, neste pedido de patente é um análogo sintético de uma mem- brana de bactéria, nor Muranil Dipeptidio (nor MDP), que é definido quimi- camente como o sal de sódio de N-acetil-D-Glucosamina-3-i-Ala-DE-isoGln. Este composto é altamente solúvel em água e é adicionado a fase aquosa da emulsão de esqualeno/ PBS em concentrações tais que a emulsão final tenha uma concentração de 5 a100 microgramas por mililitro.
Para a formulação final de uma vacina, é formada em primeiro lugar uma emulsão de PBS e de óleo em um sistema de seringas duplas, através de forçar a mistura óleo/aquosa para frente e para trás entre as se- ringas ate que seja conseguida uma emulsão Ieitosa lisa. Em seguida a se- ringa que contem a emulsão é separada e religada a uma nova seringa que contem as partículas secas do antígeno. A dose selecionada das partículas de matriz (determinada através da concentração da matriz e do peso do an- tígeno necessário) é em seguida suspensa no veiculo de suprimento através de mistura para frente e para trás até que seja conseguida uma suspensão uniforme de partículas no veiculo. As partículas secas da matriz podem ser misturadas com o veiculo na ocasião da imunização ou através de mistura de batelada das partículas com veiculo em volumes em massa para dispen- sar as unidades de doses dentro de frascos pequenos, ampolas, seringas estéreis e outros meios de suprimento adequados. As vacinas formuladas na emulsão são de preferência armazenadas em temperatura de 2 a 8 graus C.
As concentrações do antígeno na matriz podem variar a partir de 12 a 24 por cento em peso com uma concentração de preferência de 16 a 18 por cento. As doses do conjugado de hCG para imunização humana podem variar a partir de 10 a 500 microgramas e podem ser administradas em 0,1 a 1,5 mililitros. As doses do antígeno selecionado e do adjuvante, no volume apropriado são injetadas por via intramuscular aos recebedores em um local medicamente aceitável. Em seres humanos, isso normalmente é na parte superior do braço, coxa ou nádegas.
A liberação dos antígenos retidos é muito mais lenta quando as partículas estão suspensas na emulsão do que quando estão suspensas em um veiculo aquoso.
Descrição das Figuras
A figura 1 ilustra a comparação das taxas de liberação in vitro do conjugado DT/ subunidade beta do peptídio 109 a 145 (CTP/DT) retido na matriz inorgânico/biopolímero, tanto suspenso diretamente em meio de ex- tração (PBS) como depois de primeiro emulsificando com uma emulsão de esqualeno/monooleato de manida/PBS. As partículas ou as partículas emul- sificadas foram colocadas em tubos descartáveis de 13 χ 100 mm com alí- quotas de 1,0 ml, PBS misturado por vortex e girado em um incubador a 37 graus C. Nos tempos indicados os tubos foram centrifugados em baixa velo- cidade (900 χ g) durante de 5 a 7 minutos para assentar as partículas ou partições da emulsão/óleo/PBS. O sobrenadante de PBS foi removido com uma micro pipeta e testado com relação á presença de conjugado extraído através de um procedimento de analise de proteína de Lowry. Outro 1,0 ml de PBS foi adicionado de volta a cada tubo, e as amostras foram misturadas por vortex e em seguida giradas a 37 graus C como anteriormente. As cur- vas indicam a quantidade total de conjugado extraído a partir das partículas suspensas diretamente em PBS (diamantes) e as partículas suspensas em emulsão e em seguida misturadas com PBD (quadrados).
A figura 2 ilustra os níveis médios de anticorpos obtidos em qua- tro coelhos em seguida a uma única injeção de partículas da matriz que con- tinham 1,0 ng do conjugado DT/ subunidade beta do peptídio 109 a 145 (CTP/DT) em 1,0 ml de emulsão de esqualeno/PBS que continha 0,025 mg de adjuvante nor-MDP.
A figura 3 ilustra os níveis médios de anticorpos obtidos em qua- tro coelhos em seguida a uma única injeção de partículas da matriz que con- tinham 1,0 ng do conjugado DT/ análogos da subunidade beta do peptídio 38 a 57 (Alça/DT) em 1,0o ml de emulsão de esqualeno/PBS que continha 0,025 mg de adjuvante nor-MDP.
A figura 4 ilustra os níveis médios de anticorpos obtidos em dois grupos de coelhos (4 a 8 coelhos por grupo) em seguida a injeções tanto de (a) três inoculações de vacina sem o conjugado estando retido em partículas da matriz (diamantes), como (b) uma única inoculação de vacina com o con- jugado retido dentro pás partículas da matriz (quadrados), em que cada for- mulação contem quantidades iguais do conjugado DT/ sub unidade beta do peptídio 109 a 145 (CTP/DT e análogos de 38 a 57 (Alça/DT). Todas as do- ses foram dadas em emulsão de esqualeno/PBS que continha 0,025 mg do adjuvante nor-MPD. Cada uma das inoculações envolveu 0,05 mg de conju- gados e foi administrada aos coelhos. Para o grupo que recebeu a vacina que continha a matriz, a única dose da vacina em 0,5 ml de emulsão foi ad- ministrada no dia um (seta á esquerda) e nenhumas outras injeções foram dadas. Para o grupo que recebeu a vacina sem as partículas da matriz, fo- ram dadas doses em 1,0 ml ou emulsão no dia 1 (seta à esquerda) e de no- vo nas semanas 3 e 6 (setas do meio e à direita).
A Figura 5 ilustra os níveis médios de anticorpos em três grupos de coelhos (4 a 8 coelhos por grupo) em seguida a injeções de partículas de matriz contendo quantidades iguais do conjugado DT/ subunidade beta do peptídio 109 a 145 (CTP/DT) e análogos de 38 a 57 (Alça/DT) com a utiliza- ção de doses combinadas de 0,045, 0,090 ou 0,135 mg administradas a ca- da coelho no dia 1 e em 24 semanas. Todas as doses foram dadas em 0,5 ml de emulsão de esqualeno/PBS que continham 0,025 mg do adjuvante nor-MPD.
Exemplo 1
Com a finalidade de investigar a liberação do imunógeno a partir da matriz inorgânico/biopolímero foi desenvolvido um método in vitro para a determinação da taxa de liberação. O conjugado DT/subunidade beta do peptídio 109 a 145 (CTP/DT) foi retido na matriz de inorgânico/biopolímero, e sem seguida tanto suspenso diretamente em meio de extração (PBS) como suspenso em PBS depois de primeiro suspender as partículas em uma e- mulsão pré formada de esqualeno/MM/PBS. As partículas ou as partículas emulsificadas foram em seguida colocadas em tubos descartáveis de 13 χ 100 mm com alíquotas de 1,0 ml de PBS, misturadas com vortex e em se- guida giradas em um Nos tempos indicados os tubos foram centrifugados em baixa velocidade (900 χ g) durante de 5 a 7 minutos para assentar as partículas ou partições da emulsão/óleo/PBS. O sobrenadante de PBS foi removido com uma micro pipeta e testado com relação á presença de conju- gado extraído através de um procedimento de analise de proteína de Lowry. Outro 1,0 ml de PBS foi adicionado de volta a cada tubo, e as amostras fo- ram misturadas por vortex e em seguida giradas a 37 graus C como anteri- ormente.
As curvas de extração obtidas estão mostradas na Fig. 1. Em ambos os casos a matriz de inorgânico/ biopolímero reteve quantidades sig- nificativas do conjugado e liberou o mesmo durante um numero de dias. NO entanto, o conjugado se extraiu muito mais rapidamente a partir das partícu- las suspensas diretamente em PBS (diamantes) do que a partir das partícu- las suspensas em uma emulsão e em seguida misturadas com PBS (qua- drados). Essas taxas de liberação mais lenta do conjugado são prováveis de serem responsáveis pela s altas titulações e pela longa duração das titula- ções observadas em estudos de imunização (Exemplos Il e III, abaixo), de- vido a que liberação lenta a partir do local da injeção é conhecida como au- mentando as respostas de imunização das vacinas. Com base na retenção superior do conjugado pelas partículas emulsificadas, outros estudos foram focalizados sobre essa formulação de conjugado.
Exemplo II
Um teste de geração de imunização do antígeno do peptídio be- ta hCG 109 a 145 conjugado com DT (CTP/DT) incorporado na matriz sal inorgânico/biopolímero foi realizado com a utilização de coelhos como os recebedores da vacina. Quatro coelhos foram injetados com uma formulação que continha 1,0 mg do conjugado em 1.0 ml de emulsão de esqualeno/PBS (60%/40%) que continha 0,025 mg de MDP. Os níveis de anticorpos foram medidos semanalmente com a utilização de uma analise de radio imuniza- ção e expressos como uma capacidade de ligação nM/L. Uma única injeção intramuscular resultou na produção de anticorpos elevada durante duas se- manas depois da injeção. Os níveis de pico dos anticorpos de acima de 1.500 nM/L foram atingidos em 7 semanas e foram continuados em níveis acima de 100 nM/L durante vários meses. Esses níveis dão de 40 a 100 ve- zes mais altos do que os requeridos em pacientes de câncer do cólon para prover os benefícios a partir da terapia (Figura 2).
Este estudo mostrou que a formulação foi altamente efetiva. Comparado aos resultados previamente obtidos em inoculações com quanti- dadés idênticas de conjugado porém nas quais o conjugado não estava reti- do em partículas de matriz, os dados indicaram que uma dose mais baixa de antígeno retido na matriz poderia ser usada para ser obtido o nível necessá- rio de anticorpos para a terapia, do que com a formulação não retida na ma- triz.
Exemplo III
Outro teste foi executado utilizando condições idênticas como as do Exemplo I, exceto em que um análogo do peptídio 38 a 57 de hCG conju- gado ao DT (Alça/DT) foi usado como o antígeno. Resultados bastante simi- lares foram obtidos (Figura 3). Comparados aos resultados obtidos previa- mente em inoculações com quantidades idênticas de conjugado, porém nas quais o conjugado não estava retido em partículas de matriz, os dados indi- caram que doses mais baixas do antígeno retido na matriz foram mais efeti- vas para uso em uma vacina do que a formulação não retida na matriz.
Exemplo IV
Uma comparação da eficácia de vacinas idênticas exceto com relação à presença ou a ausência da matriz sal inorgânico/biopolímero foi realizada com a utilização de coelhos como os recebedores da vacina.
Quatro coelhos foram, cada um, injetado por via intramuscular com uma formulação que continha 0,5 mg de cada um dos dois conjugados (CTP/DT e Alça?DT como nos exemplos Il e Ill acima) em 0,5 ml de uma emulsão de esqualeno/ PBS (60%/ 40%) que continha 0,025 mg de nor MDP. Os níveis de anticorpos foram medidos a cada semana com a utiliza- ção de uma analise de radio imunização e expressos como a capacidade de ligação nM/L. Uma única injeção intramuscular de vacina que continha a ma- triz sal inorgânico/biopolímero foi comparada com três injeções de vacina que não tinha a matriz sal inorgânico/biopolímero, com a finalidade de alcan- çar uma paridade aproximada de efeitos. A figura 4 mostra que ambos os regimes de vacina resultaram na produção de anticorpos elevados durante duas semanas depois da injeção. No entanto, as titulações obtidas a partir das injeções da vacina que continha a matriz sal inorgânico/biopolímero al- cançaram níveis significativamente mais altos e que permaneceram mais altos do que aqueles a partir da vacina que não tinha a matriz sal inorgâni- co/biopolímero, não obstante esta ultima ter sido injetada três vezes vs. uma vez para a vacina que co9ntinha a matriz sal inorgânico/biopolímero.
A Tabela 1 compara as reações de tecido obtidas a partir das imunizações. Para a vacina não retida Ana matriz sal inorgânico/biopolímero, a reações do tecido nos locais da injeção, medidas como no Exemplo IV fo- ram de mínimas a moderadas em todos os animais, porem a reação media (classificação da lesão) foi 1,4, substancialmente acima do nível clinicamen- te aceitável de 1,0. Em contraste, as reações do tecido foram insignificantes com relação às vacinas que continham a matriz sal inorgânico/biopolímero, e bem dentro dos limites clinicamente aceitáveis. Tabela 1. Reações no tecido nos locais de injeção
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* Medida como descrita no exemplo VI. Exemplo V.
Uma serie de testes com a utilização de conjugados individuais indicou que as doses seguras e efetivas de cada conjugado de HCG incor- porado dentro da matriz foi de entre 0,010 e 0,10 mg. Foi em seguida inicia- do um estudo no qual uma resposta a dose foi obtida com relação a uma combinação ambos os antígenos CTP/DT e Alça/DT em proporções iguais. Doses que continham um total de 0,045 a 0,135 mg dos conjugados combi- nados (proporção de 50/50 em peso) foram testadas com relação à capaci- dade das mesmas de induzir a produção de anticorpos específicos para hCG em coelhos.Os perfis dos anticorpos a partir deste estudo estão mostrados na Figura 5. Os níveis de anticorpos mesmo na dose mais baixa estudada foram mais do que adequados para uso clinico.
As reações do tecido medidas como no Exemplo IV foram míni- mas nas doses mais baixas e moderadas, porem aceitáveis na dose mais alta usada.
Exemplo Vl
Avaliação Macroscópica de Reações do Tecido no Local da Injeção.
Com a finalidade de avaliar a aparência de modo geral do mús- culo da coxa depois da injeção dos materiais em teste, a pele dos animais submetidos à eutanásia foi retirada da coxa examinada fazendo uma incisão transversa e longitudinal e em seguida esfolando a pele. Foi tomado cuidado para fazer uma separação limpa do tecido do músculo sem danificar este ultimo. Incisões adicionais foram feitas se necessário para assegurar a ob- servação completa e a avaliação da patologia. Os espécimes de biopsia fo- ram preservados em formalina tamponada a 10%. Escala para a Avaliação da Aparência Geral. 0: Tecido normal.
Nenhuma patologia visível. Em ocasiões tecido gorduroso fibroso apareceu depois da resolução completa da inflamação no tecido do músculo. Essa mudança não foi classificada como patológica.
1: Patologia Mínima
Uma aparência típica incluiu pequenos nódulos duros (< 3mm de diâmetro) representando abscessos encapsulados e envolvendo abscessos estéreis ou locais de inflamação. O volume combinado de tais lesões foi exi- gido para ser de menos do que 5% do total do volume do músculo da coxa.
2: Patologia Moderada
Os nódulos foram maiores (de 3 a 10 mm de diâmetro) e incluí- ram lesões encapsuladas duros ao toque (fibrose antiga) ou moles (mais recentemente encapsulados). Ao apertar essas lesões, pus ou material da injeção foi algumas vezes expresso, material livre (não encapsulado) foi o- casionalmente observado. Nesse caso, o diâmetro longitudinal da lesão foi exigido de ser maior do que 10 mm. O volume combinado das lesões foi exi- gido ser entre 5 a 10% do volume total do músculo da coxa.
3. Patologia Grave.
Lesões grandes, encapsuladas ou não encapsuladas, maiores do que 10 mm em diâmetro longitudinal. Tipicamente as lesões continham pus (abscessos estéreis) ou material da injeção (emulsão). O volume total das lesões foi > 10% do volume total da coxa.
Classificações Intermediárias.
Quando as lesões não caíam de forma inequívoca dentro da de- finição de um determinado grau, os graus intermediários foram atribuídos como 0-1, 1-2 ou 2-3. Para o calculo das médias dos grupos, foram atribuí- dos graus intermediários de meio valor (por exemplo, para 0-1 foi atribuído um valor de 0,5).

Claims (98)

1. Um método para o suprimento de um antígeno efetivo para provocar o aparecimento de um anticorpo contra a Gonadotropina Coriônica Humana (hCG), que compreende: incorporar o antígeno dentro de uma matriz sal inorgâni- co/biopolímero, suspender a matriz com o antígeno incorporado em uma emul- são de água em óleo contendo um adjuvante, e injetar em seres humanos a emulsão contendo a matriz com o antígeno incorporado para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer.
2. O método de acordo com a reivindicação 1, no qual o antíge- no é um conjugado de uma proteína transportadora tal como o toxóide da difteria e u m peptídio da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG, ou um peptídio análogo da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG.
3. O método de acordo com a reivindicação 1, no qual o antíge- no é um conjugado de uma proteína transportadora tal como o toxóide da difteria e um peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG, ou um peptídio análogo da seqüência dé 38 a 57 da subunidade beta do hCG.
4. O método de acordo com a reivindicação 1, no qual o antíge- no é qualquer conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG, ou um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da subunidade beta do hCG.
5. O método de acordo com a reivindicação 1, no qual a matriz sal inorgânico/biopolímero compreende uma matriz de hemi-ídrato de sulfato de cálcio/sulfato de dextrano ou uma matriz de fosfato de cálcio/sulfato de dextrano.
6. O método de acordo com a reivindicação 1, no qual a emulsão de água em óleo compreende esqualeno e solução salina tamponada com fosfato (PBS).
7. O método de acordo com a reivindicação 6, no qual a emulsão compreende também um emulsificante.
8. O método de acordo com a reivindicação 7, no qual o emulsi- ficante é o monooleato de manida.
9. O método de acordo com a reivindicação 8, no qual o esqua- leno e o monooleato de manida são misturados em uma proporção de 4:1.
10. O método de acordo com a reivindicação 9, no qual a mistu- ra de esqualeno e monooleato de manida serve como uma fase de óleo da emulsão.
11. O método de acordo com a reivindicação 10, no qual a fase de óleo da emulsão é 60 por cento em volume da emulsão e o PBS é 40 por cento.
12. O método de acordo com a reivindicação 1, no qual o adju- vante é o Sal de Sódio de N-acetil-D-Glucosamina-3-i-Ala-DE-isoGln (nor MDP).
13. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do cólon.
14. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do pancreático.
15. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da bexiga urinária.
16. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da próstata.
17. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do ovário.
18. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do pulmão.
19. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer cervical.
20. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da mama.
21. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do rim.
22. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer hepático.
23. O método de acordo com a reivindicação 1, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer melanoma.
24. Um método para o suprimento de um antígeno efetivo para provocar um anticorpo contra a Gonadotropina Coriônica Humana (hCG), que compreende: incorporar o antígeno em uma matriz sal inorgânico/ biopolímero, suspender a matriz com o antígeno incorporado em uma emul- são de água em óleo que contenha um adjuvante, e injetar em seres humanos a emulsão contendo a matriz com o antígeno incorporado, para o tratamento de pacientes sofrendo de uma do- ença relacionada com hormônio ou prevenindo uma condição relacionada com hormônio, em que a doença relacionada com hormônio é selecionada a partir de um grupo que consiste de verruga hidatidiforme, gravidez ectópica, e câncer.
25. O método de acordo com a reivindicação 24, no qual o antí- geno é um conjugado de uma proteína transportadora tal como o toxóide da difteria e um peptídio da sub unidade beta da seqüência de 109 a 145 da hCG ou um análogo do peptídio da seqüência de 109 a 145 da subunidade beta do hCG.
26. O método de acordo com a reivindicação 24, no qual o antí- geno é um conjugado de uma proteína transportadora tal como o toxóide da difteria e um peptídio da sub unidade beta da seqüência de 38 a 57 da hCG ou um análogo do peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG.
27. O método de acordo com a reivindicação 24, no qual o antí- geno é qualquer combinação de um conjugado de uma proteína transporta- dora e um peptídio da sub unidade beta da seqüência de 109 a 145 da hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da sub unidade beta da seqüência de 109 a 145 da hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da sub unidade beta da seqüência de 38 a 57 da hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da sub unidade beta da seqüência de 38 a 57 da hCG, ou um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da sub unidade beta da hCG.
28. O método de acordo com a reivindicação 24, no qual a con- dição relacionada com hormônio que está sendo prevenida é a gravidez.
29. O método de acordo com a reivindicação 24, no qual a ma- triz sal inorgânico/biopolímero compreende uma matriz de hemi-ídrato de sulfato de cálcio/sulfato de dextrano ou uma matriz de fosfato de cál- cio/sulfato de dextrano.
30. O método de acordo com a reivindicação 24, no qual a emul- são de água em óleo compreende esqualeno e solução salina tamponada com fosfato (PBS).
31. O método de acordo com a reivindicação 24, no qual a emul- são compreende também um emulsificante.
32. O método de acordo com a reivindicação 31, no qual o emul- sificante é o monooleato de manida.
33. O método de acordo com a reivindicação 32, no qual o es- qualeno e o monooleato de manida são misturados em uma proporção de 4:1.
34. O método de acordo com a reivindicação 33, no qual a mis- tura de esqualeno e monooleato de manida serve como uma fase de óleo da emulsão.
35. O método de acordo com a reivindicação 34, no qual a fase de óleo da emulsão é 60 por cento em volume da emulsão e o PBS é 40 por cento.
36. O método de acordo com a reivindicação 24, no qual o adju- vante é o Sal de Sódio de N-acetil-D-Glucosamina-3-i-Ala-DE-isoGln (nor MDP).
37. Um método para o suprimento de um antígeno efetivo para provocar o aparecimento de um anticorpo contra a Gonadotropina Coriônica Humana (hCG), que compreende: incorporar o antígeno dentro de uma matriz sal inorgâni- co/biopolímero, suspender a matriz com o antígeno incorporado em uma emul- são de água em óleo contendo um adjuvante, e injetar em seres humanos a emulsão contendo a matriz com o antígeno incorporado para o tratamento de pacientes sofrendo de uma do- ença relacionada com a hCG ou prevenindo uma condição relacionada com ahCG.
38. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual a ma- triz sal inorgânico/biopolímero compreende uma matriz de hemi-ídrato de sulfato de cálcio/sulfato de dextrano.
39. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual o sal inorgânico é selecionado a partir do grupo que consiste de hemi-ídrato de sulfato de cálcio, sulfato de cálcio e fosfato de cálcio, e o biopolímero é sele- cionado a partir do grupo que consiste de ácido hialurônico, sulfato de con- droitina, proteína, glicosaminoglicano, dextrano, sulfato de dextrano, amido goma xântano, quitosana, celulose e derivados da celulose.
40. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual o antí- geno é conjugado a uma proteína transportadora tal como o toxóide da difte- ria e um peptídio da sub unidade beta da seqüência de 109 a 145 da hCG ou um análogo do peptídio da seqüência de 109 a 145 da subunidade beta do hCG.
41. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual o antí- geno é um conjugado de uma proteína transportadora tal como o toxóide da difteria e um peptídio da sub unidade beta da seqüência de 38 a 57 da hCG ou um análogo do peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG.
42. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual o antí- geno é qualquer combinação de um conjugado de uma proteína transporta- dora e um peptídio da sub unidade beta da seqüência de 109 a 145 da hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da sub unidade beta da seqüência de 109 a 145 da hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da sub unidade beta da seqüência de 38 a 57 da hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da sub unidade beta da seqüência de 38 a 57 da hCG, ou um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da sub unidade beta da hCG.
43. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual a con- dição relacionada com o hormônio que está sendo prevenida é a gravidez.
44. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual a ma- triz sal inorgânico/biopolímero compreende uma matriz de hemi-ídrato de sulfato de cálcio/sulfato de dextrano ou uma matriz de fosfato de cál- cio/sulfato de dextrano.
45. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual a emul- são de água em óleo compreende esqualeno e solução salina tamponada com fosfato (PBS).
46. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual a emul- são compreende também um emulsificante.
47. O método de acordo com a reivindicação 46, no qual o emul- sificante é o monooleato de manida.
48. O método de acordo com a reivindicação 47, no qual o es- qualeno e o monooleato de manida são misturados em uma proporção de -4:1.
49. O método de acordo com a reivindicação 48, no qual a mis- tura de esqualeno e monooleato de manida serve como uma fase de óleo da emulsão.
50. O método de acordo com a reivindicação 49, no qual a fase de óleo da emulsão é 60 por cento em volume da emulsão e o PBS é 40 por cento.
51. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual o adju- vante é o Sal de Sódio de N-acetil-D-Glucosamina-3-i-Ala-DE-isoGln (nor MDP).
52. O método de acordo com a reivindicação 37, por mio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de um paciente sofrendo de cân- cer do cólon.
53. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do pancreático.
54. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da bexiga urinária.
55. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da próstata.
56. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do ovário.
57. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do pulmão.
58. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer cervical.
59. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da mama.
60. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do rim.
61. O método de acordo com a reivindicação 37, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer hepático.
62. O método de acordo com a reivindicação 33, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer melanoma.
63. O método de acordo com a reivindicação 37, no qual a do- ença relacionada à hCG é selecionada a partir de um grupo que consiste de verruga hidatidiforme, gravidez ectópica, e câncer.
64. Um método para o suprimento de um antígeno efetivo para provocar o aparecimento de um anticorpo contra a Gonadotropina Coriônica Humana (hCG), que compreende: conjugando um antígeno de peptídio a um veiculo para a forma- ção do antígeno conjugado, incorporando o antígeno conjugado dentro de uma matriz sal inorgânico/biopolímero, na qual o antígeno conjugado é misturado com o hemi-ídrato de sulfato de cálcio e sulfato de dextrano, ficando dessa forma retido em uma matriz de hemi-ídrato de sulfato de cálcio e sulfato de dextra- no, secando a matriz que está retendo o antígeno conjugado, suspendendo a matriz seca em uma emulsão de água em óleo contendo um adjuvante, e injetando em seres humanos a emulsão contendo a matriz que retém o antígeno conjugado para o tratamento de pacientes sofrendo de uma doença relacionada com a hCG ou prevenindo uma condição relacio- nada coma hCG.
65. O método da reivindicação 64, no qual a doença relacionada à hCG é selecionada a partir de um grupo que consiste de verruga hidatidi- forme, gravidez ectópica, e câncer.
66. O método de acordo com a reivindicação 64, no qual o antí- geno é um conjugado de uma proteína transportadora tal como o toxóide da difteria e u m peptídio da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG, ou um peptídio análogo da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG.
67. O método de acordo com a reivindicação 64, no qual o antí- geno é um conjugado de uma proteína transportadora tal como o toxóide da difteria e um peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG, ou um peptídio análogo da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG.
68. O método de acordo com a reivindicação 64, no qual o antí- geno é qualquer combinação de: um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG, ou um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da subunidade beta do hCG.
69. O método de acordo com a reivindicação 64 no qual a condi- ção que esta sendo prevenida é a gravidez.
70. O método de acordo com a reivindicação 64, no qual a ma- triz sal inorgânico/biopolímero compreende uma matriz de hemi-hidrato de sulfato de cálcio, ou uma matriz de fosfato de cálcio/sulfato de dextrano. -70. O método de acordo com a reivindicação 64, no qual a emul- são de água em óleo compreende esqualeno e solução salina tamponada com fosfato (PBS).
71. O método de acordo com a reivindicação 64, no qual a emul- são de água em óleo compreende esqualeno e uma solução salina tampo- nada com fosfato (PBS)
72. O método de acordo com a reivindicação 71, no qual a no qual a emulsão compreende também um emulsificante.
73. O método de acordo com a reivindicação 72, no qual o emul- sificante é o monooleato de manida.
74. O método de acordo com a reivindicação 73, no qual o es- qualeno e o monooleato de manida são misturados em uma proporção de -4:1.
75. O método de acordo com a reivindicação 74, no qual a mis- tura de esqualeno e monooleato de manida serve como uma fase de óleo da emulsão.
76. O método de acordo com a reivindicação 75, no qual a fase de óleo da emulsão é 60 por cento em volume da emulsão e o PBS é 40 por cento.
77. O método de acordo com a reivindicação 64, no qual o adju- vante é o Sal de Sódio de N-acetil-D-Glucosamina-3-i-Ala-DE-isoGln (nor MDP).
78. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do cólon.
79. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do pancreático.
80. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da bexiga urinária.
81. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da próstata.
82. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do ovário.
83. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do pulmão.
84. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer cervical.
85. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer da mama.
86. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer do rim.
87. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer hepático.
88. O método de acordo com a reivindicação 64, por meio do qual é formulada uma vacina para o tratamento de pacientes sofrendo de câncer melanoma.
89. Uma composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina compreendendo: (a) um fragmento de uma subunidade de hCG, (b) um sal de cálcio, e (c) um polímero de matriz em que o fragmento está substancialmente retido na matriz sal inorgânico/biopolímero formada pelo sal de cálcio e o polímero da matriz.
90. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual o antígeno é qualquer combina- ção um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da se- qüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da seqüência de 109 a 154 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG, um conjugado de uma proteína transportadora e um análogo do peptídio da seqüência de 38 a 57 da subunidade beta do hCG, ou um conjugado de uma proteína transportadora e um peptídio da subunidade beta do hCG.
91. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual o sal de cálcio é selecionado a partir do grupo que consiste de hemi-ídrato de sulfato de cálcio, silicatos de cálcio, aluminatos, hidróxidos, fosfatos e fosfato de cálcio.
92. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual o polímero da matriz é seleciona- do a partir do grupo que consiste de dextrano, sulfato de dextrano, ácido hia- lurônico, sulfato de condroitina, proteína, glicosaminoglicano, quitosana, a- mido, goma xântano, celulose, derivados de celulose, colágeno, fibrinogênio, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, polinucleotídios, polipeptídios catiô- nicos e albumina desengordurada.
93. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual o sal de cálcio é o hemi-ídrato do sulfato de cálcio.
94. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual o sal de cálcio é o sulfato de cál- cio.
95. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual o sal de cálcio é o fosfato de cál- cio.
96. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual o polímero da matriz é o dextra- no.
97. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual o polímero da matriz é o sulfato de dextrano.
98. A composição de matriz sal inorgânico/biopolímero de vacina de acordo com a reivindicação 89, na qual a matriz sal inorgâni- co/biopolímero é uma matriz de hemi-ídrato de sulfato de cálcio/dextrano, ou uma matriz de fosfato de cálcio/sulfato de dextrano.
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