BRPI0711589A2

BRPI0711589A2 - antagonistas de alta afinidade de quimiocinas elr-cxc

Info

Publication number: BRPI0711589A2
Application number: BRPI0711589-0A
Authority: BR
Inventors: John R Gordon
Original assignee: Univ Saskatchewan
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2011-11-16
Also published as: CL2007001402A1; JP2009542192A; EP2021475A1; ATE530650T1; CA2652094A1; US8039429B2; EP2021475A4; TW200813084A; CN101484579A; WO2007131352A1; EP2021475B1; NZ573657A; JP5462623B2; MX2008014656A; AR060960A1; IL195309A0; US20090270318A1; CN101484579B; AU2007250429A1

Abstract

ANTAGONISTAS DE ALTA AFINIDADE DE QUIMIOCINAS ELR-CXC. A presente invenção fornece novas seqüências de polipeptídeo, métodos para sua produção e seu uso para novos agonistas e antagonistas do receptor de quimiocina ELR-CXC.

Description

"ANTAGONISTAS DE ALTA AFINIDADE DE QUIMIOCINAS ELR-CXC" Campo da Invenção

A presente invenção está relacionada ao campo dos antagonistas do receptor de quimiocina CXC.

Fundamentos da Invenção

As quimiocinas CXC que possuem o motivo (ELR) receptor-sinalizador ácido glutâ- mico-leucina-arginina (por exemplo, CXCL1/GROa, CXCL8/IL-8; Baggiolini1 M. 1998. Nature. 392:565-568) são importante para o influxo das células inflamatórias que mediam muitas das patologias nos múltiplos cenários, incluindo dano por isquemia-reperfusão (Sekido, N. et al. 1993. Nature. 365:654-657; Villard, J. et al. 1995. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: 1549-1554), síndrome de sofrimento respiratório agudo induzido por endotoxemia (ARDS; Mukaida, N. et al. 1998. Inflamm. Res. 47 suppl. 3):S151-157), artrite, e gIomeruIonefrite do tipo imuno complexo (Harada, A. et al. 1996. Inflamm. Res. 2:482-489). Por exemplo, enzi- mas hidrolíticas inapropriadamente liberadas e espécies oxigênio reativas provenientes de neutrófilos ativados iniciam e/ou perpetuam os processos patológicos. Por outro lado, duran- te a maioria das infecções bacterianas essa resposta quimiocina representa uma primeira linha crítica de defesa. Mas ainda aqui, as respostas das quimiocinas ELR+ CXC, por meio de suas capacidades para ativar células inflamatórias que revelam os receptores CXCR1 e CXCR2, exacerbam a patologia. Por exemplo, durante a sepse de "punção cecal e ligadura", a neutralização de MIP-2 reduzem a mortalidade em ratos de 85 para 38% (Walley, K. R. et al. 1997. Infect. Immun. 65:3847-3851). E tratamentos experimentais que eliminam a circu- lação de neutrófilos melhoram a patologia de maneimiose pneumônica (Slocombe, R. et al. 1985. Am. J. Vet. Res. 46:2253), em que a expressão da CXCL8 nas vias respiratórias influ- encia de forma variada a quimioatração neutrofílica. Caswell, J. L. et al. 1997. Vet. Pathol. 35: 124-131 ; Caswell, J. L. et al. 2001. Canad. J. Vet. Res. 65:229-232). A despeito da im- portância crítica dessas respostas quimiocinas em muitos cenários, as respostas descontro- ladas das células inflamatórias são suficientemente prejudiciais ao ponto de que o desenvol- vimento de ferramentas terapêuticas com as quais se possa bloquear as quimiocinas ELR+ tem se tornado uma prioridade nas pesquisas (Baggiolini, M., and B. Moser. 1997. J. Exp. Med. 186: 1189-1191).

As quimiocinas ELR+ quimioatraem e ativam as células inflamatórias por meio de seus receptores CXCR1 e CXCR2 (Baggiolini, 1998; Ahuja, S. K., and Ρ. M. Murphy. 1996. J. Biol. Chem. 271 :20545-20550). A maioria dos mamíferos expressam ortólogos (genes em diferentes espécies que evoluíram a partir de um gene ancestral comum por evolução gra- dual) dos receptores CXCR1 e CXCR2 e das quimiocinas 'ELR'. A similaridade das seqüên- cias entre esse genes homólogos (geneticamente ou funcionalmente relacionados) é alta; mais alta ainda quando são consideradas substituições aminoácidos conservados. Ratos e camundongos são exceções onde essas espécies não possuem genes CXCR1 e o equiva- lente CXCL8 deles é altamente divergente daquele de outros mamíferos. A Interleucina 8 (CXCL8) não é espécie específica, pelo fato de que a proteína CXCL8 proveniente de uma espécie pode ser funcional numa outra espécie (Rot, 1991, Cytokine 3: 21-27).

A CXCR1 é específica para CXCL8 e proteína-2 CXCL6/granulócito quimiotática (GCP-2), enquanto que a CXCR2 se liga a CXCL8 com alta afinidade, mas também a prote- ína-2 macrófago inflamatória (MIP-2), CXCL1, CXCL5/ENA-78, e CXCL6 com afinidades um tanto mais baixas (ver, por exemplo, Baggiolini and Moser, 1997). A sinalização de CXCL8 em linhagens de células transfectadas com o CXCR1 ou CXCR2 humano induz respostas quimiotáticas equipotentes (Wuyts, A. et al. 1998. Eur. J. Biochem. 255:67-73; Richardson, R. et al. 1998. J. Biol. Chem. 273:23830 - 23836), e embora as alterações do neutrófilo cito- sólico livre de Ca++ e a desgranulação celular em resposta a CXCL8 sejam também media- das por ambos os receptores, a explosão respiratória e a ativação da fosfolipase D de acor- do com o reportado dependem exclusivamente do CXCR1 (Jones, S. A. et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S A. 93:6682-6686.). Por outro lado, foi reportado que um antagonista não peptídeo do CXCR2, mas não do CXCR1, antagoniza a quimiotaxia neutrofílica mediada por CXCL8, mas não a ativação celular (White, J. R. et al. 1998. J. Biol. Chem. 273: 10095- 10098.). Finalmente, existe uma evidência abundante de que as quimiocinas são muito fre- qüentemente expressas de modo redundante durante as respostas inflamatórias (ver, por exemplo, Caswell et al., 1997). Porem, a despeito da intensa pesquisa no campo, não são conhecidos antagonistas da quimiocina CXC na arte já existente que sejam eficazes em suprimir a atividade adversa das células inflamatórias induzida por um ou outro receptor de quimiocina ELR-CXC.

Sumário da Invenção

As composições da presente invenção incluem novos agonistas e antagonistas do receptor de quimiocina ELR-CXC que são capazes de se ligarem aos receptores de CXCR1 ou CXCR2 em células de mamíferos. Estes incluem agonistas e antagonistas capazes de ligações de alta afinidade, onde "alta afinidade" se refere a afinidade do agonista ou do an- tagonista quanto ao receptor que seja suficiente tal que ele seja capaz de bloquear agonista quimiocina em sua forma natural sob concentrações fisiologicamente relevantes. As novas proteínas antagonistas também incluem aquelas que sejam substancialmente equivalentes (isto é, aquelas que contenham substituições, adições e deletações que não deletam as fun- ções ligantes a CXCR1 e CXCR2) a uma proteína CXCL8 naturalmente ocorrente em bovi- nos e/ou humanos (ilustrado aqui como as seqüências aminoácidos de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) e também abrigam resíduos aminoácidos amino-terminais modificados juntamente com substituições de Lysl 1 com Arg e Gly31 com Pro (SEQ ID No. 6). Análogos desse CXCL8(3-74)K11R/G31P bovinos são também incluídos, ou seja CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G (SEQ ID No. 7) e

CXCL8(3-74)K11R/T12S/H13F/G3IP (SEQ ID No.8).

Outras composições da invenção são os novos polinucleotídeos and polipeptídeos relacionados a estas proteínas. Em outras modalidades, são providas seqüências de nucleo- tídeos derivadas das seqüências aminoácidos. Também, a invenção inclui vetores que com- preendem os novos polinucleotídeos, e vetores de expressão compreendendo os novos po- linucleotídeos operativamente associados com seqüências regulatórias que controlam a ex- pressão dos polinucleotídeos. De modo similar, fusões de genes que compreendam lidar com a afinidade e os novos polinucleotídeos estão inclusos na invenção, como são os veto- res resultantes e vetores de expressão contendo tais fusões de genes.

A invenção também inclui hospedeiros produzidos por engenharia genética para conter os novos polinucleotídeos bem como hospedeiros produzidos por engenharia genéti- ca para conter os novos polinucleotídeos operativamente associados com seqüências regu- latórias, isto é, associados com seqüências regulatórias em um modo tal que as seqüências regulatórias controlem a expressão dos novos polinucleotídeos.

Também inclusos estão hospedeiros contendo fusões de genes, sejam associados com seqüências regulatórias em um modo tal que as seqüências regulatórias controlem a expressão das fusões de genes, ou na ausência de tais seqüências regulatórias. Estes hos- pedeiros podem ser vírus ou células, onde as últimas mencionadas incluem, sem limitação, levedura, protozoa, fungos, algas, células de vegetais, e células animais e organismos supe- riores derivados destes mencionados.

A invenção adicionalmente compreende usos dos novos polipeptídios no tratamento de patologias mediadas pela quimiocina CXC envolvendo os receptores de CXCR1 ou CXCR2 em mamíferos. Do mesmo modo, a invenção inclui métodos de tratar patologias mediadas pela quimiocina ELR-CXC envolvendo os receptores de CXCR1 ou CXCR2, que compreende administrar ao mamífero afligido uma quantidade eficaz de um dos novos poli- peptídeos. Composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade biologicamente ativa de um dos novos polipeptídios são também incluídas na invenção.

Métodos de produzir e de purificar os novos são também incluídos na invenção.

Em um aspecto da invenção, é provido um polipeptídio purificado ou isolado possu- indo ou compreendendo uma seqüência aminoácido de:

XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX XX (SEQ ID NO. 3), em que X é qualquer aminoá- cido.

Em uma outra modalidade da invenção, é provido um polipeptídio isolado ou purifi- cado compreendendo uma seqüência aminoácido de:

XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEHVK LXXGXEXCLX de ligação, como notado em Li and Gordon (2001, supra).

Ensaios Iigantes de análogo CXCL8(3.74)K11R . Células (85-93% neutrófilos) foram purificadas a partir do sangue de gado de acordo com o método Caswell method (Caswell, J. L. et al. 1998. Vet. Immunol. Immunopath. 67:327-340). Nos experimentos preliminares, foi determinado que nenhum dos análogos influenciou a viabilidade dos neutrófilos, como determinado por exclusão de corante trypan blue. Para as pesquisas amplas do análogo, neutrófilos em HBSS/0.5% BSA foram incubados por 2 h a 4°C com o análogo, lavado em DMEM frio, e em seguida incubado por outras 2 h a 4°C com blotCXCL8 (1000 µg/mL). A biotina associada com a célula foi detectada mediante incubar as células lavadas com fosfa- tase alcalina conjugada com estrepavidina (diluição 1:700) e em seguida com substrato en- zima ABTS. O OD40S das amostras foi determinado usando um leitor de placa ELISA. Os neutrófilos tratados no meio rotineiramente ligam suficiente .sup.biotCXCL8 para gerar um OD405 de 0,5-0,6.

Para estudos aprofundados com CXCL8(3.74)K11R/G31P, foi usado 125I-CXCL8 nos ensaios de inibição com CXCL8 ou CXCL8(3.74)K11R/G31P não marcados. Em experimentos preliminares foi determinado que o tempo de equilíbrio de ligação de neutrófilos para 125I- CXCL8 foi de 45 min e que 20 pM 125I-CXCL8 20 pM logo saturou os receptores de alta afi- nidade das células. Desse modo, nos ensaios realizados, 106 neutrófilos purificados foram incubados por 45 minutos sobre gelo com 125I- CXCL8 20 pM e concentrações variadas de ligando competidor não marcado. As células foram em seguida sedimentadas através de óleo mineral 6% em óleo siliconado e os níveis de rádio-ligantes associados com a célula determinado usando um contador. A ligação não específica de 125ICXCL8 para as células foi avaliada em cada ensaio mediante incluir um excesso molar de 200 vezes de ligando não marcado em um conjunto de amostras. Esse valor foi usado para calcular o percentual de ligação específica (Coligan, J., A. Kruisbeek, D. Margulies, E. Shevach, and W. Strober. 1994. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, New York).

Ensaio de liberação neutrófilo-glicuronidase. O ensaio neutrófilo-glicuronidase foi reportado em detalhes (Li and Gordon 2001, supra). Em resumo, neutrófilos tratados com cytochalasin B foram incubados por 30 minutos com os análogos de CXCL8, em seguida seus produtos de segregação ensaiados calorimetricamente quanto a enzima. A liberação glicuronidase foi expressa como o percentual do conteúdo celular total, determinado medi- ante Iisar as células tratadas no meio com 0,2% (v/v) Triton X-100. A provocação neutrofílica com o estímulo de controle positivo PMA (50 µg/mL) e A23187 (1 µg/mL) induziu liberação de 42+/-6% do total de armazenados glicuronidase celular. Amostras provenientes de lesões inflamatórias. Foram obtidos fluidos de lavagem

bronquialveolar (BALF) provenientes de pulmões de gado (n=4) com diagnóstico clínico de maneimiose pneumônica purulenta (Caswell et al., 1997), bem como fluidos das cavidades De acordo com um outro aspecto da invenção, é provido um peptídeo isolado con- sistindo essencialmente de uma seqüência aminoácido como apresentado em qualquer um dos seguintes:

GSTELRCQC IRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCEN

EIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR

WEKFLKRAENS (bhG31P - SEQ ID No. 10);

KELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIE

PPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRW EKFLKRAENS (hG31P (0) - SEQ ID No. 11);

ELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIES

PHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRWE

KFLKRAENS (hG31 P (-1) - SEQ ID No. 12); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRV ESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (hG31P (+2) - SEQ ID No. 13);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hG31P (+6) - SEQ ID No. 14);

GSTELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWV

QR

WEKFLKRAENS (hG31 P K3T - SEQ ID No. 15);

GSKELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENW

VQR WEKFLKRAENS (hG31 P Υ13H - SEQ ID No. 16);

GSKELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWV

QR

WEKFLKRAENS (hG31 P K15T (0) - SEQ ID No. 17);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLSDGRELCLDPKENWV

QR

WEKFLKRAENS (hG31P A35E(0) - SEQ ID No. 18); GSKELRCQC

IRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (hG31P T37S (0) - SEQ ID No. 19); GSKELRCQC

IRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (hG31P S44T (0) - SEQ ID No. 20);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGDELCLDPKENWV QR

WEKFLKRAENS (hG31P R47D (0) - SEQ ID No. 21); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKEKWV

QR

WEKFLKRAENS (hG31P N56K(0) - SEQ ID No. 22); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQK WEKFLKRAENS (hG31 P R60K (0) - SEQ ID No. 23);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWV

QR

WEVFLKRAENS (hG31P K64V (0) - SEQ ID No. 24);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGREVCLDPKENW 10 VQR WEKFLKRAENS (hG31 P L49V - SEQ ID No. 25);

GSKELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWV

QR

WEKFLKRAENS (bhG31P T3K- SEQ ID No. 26);

GSTELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWV QR

WEKFLKRAENS (bhG31P H13Y - SEQ ID No. 27); GSTELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (bhG31 P Τ15K - SEQ ID No. 28);

GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLTDGRELCLDPKENWV QR

WEKFLKRAENS (bhG31P E35A - SEQ ID No. 29);

GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLTDGRELCLDPKENWV QR WEKFLKRAENS (bhG31 P S37T - SEQ ID No. 30);

GSMGGSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPK EN

WVQRWEKFLKRAENS (bhG31 P (+6) - SEQ ID No. 31);

GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWV

QR

WEKFLKRAENS (bhG31P (+2) - SEQ ID No. 32); 30 TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQRW EKFLKRAENS (bhG31P (+0) - SEQ ID No. 33);

ELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR

WE

KFLKRAENS (bhG31P (-1) - SEQ ID No. 34);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDP

KEN

WVQRWEKFLKRAENS (hK11R (+6) - SEQ ID No. 35); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIK LRVIESPPHCENTEIIVKLSDGRELCLDPKEN

WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P A35E(+6) - SEQ ID No. 36); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLSDGRELCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P T37S (+6) - SEQ ID No. 37); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLTDGRELCLDPK EN

WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P S44T (+6) - SEQ ID No. 38);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGDELCLDP KEN WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P R47D (+6) - SEQ ID No. 39);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGREVCLDP KEN

WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P L49V - SEQ ID No. 40);

GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWV QK

WQVFVKRAEKQDP (Bovino 3-74 K11RG31P (+2)- SEQ ID No. 41).

De acordo com um aspecto adicional, é provida uma seqüência polinucleotídeo iso- lada compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência aminoáci- do de:

X1ELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX

PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4 onde X1, X2, X3 e X4 são independentemente resíduos de aminoácidos 0 -10 e X é qualquer aminoácido.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provida uma seqüência polinu- cleotídeo isolada que codifica uma seqüência aminoácido de:

X1ELRCX6CIRX1O X11SX13PFX16PKX19I X2IEX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX5OPX52X53X54WVQX58X59V

X61X62FX64KX66X67EX69X7OX71X72 (SEQ ID NO. 4) onde

X1 é aminoácidos 0-10; X 6 é Q1 E ou L;

X10 é T ou I;

X11 é H ou Y;

X13 é T ou K;

X16 é H ou N;

X19 é F ou Y ou L;

X21 é K ou R;

X24 é R ou T; X25 é Vou A; X27 é D ou E; X33 é V ou A ou E; X35 é Tou S; X42 é S ou V ou T ou F; X43 é D ou N; X45 é R ou A ou N ou K ou D; X47 é Lou V; X52 é Kou H; X53 é E ou Q ou T; X54 é P ou N ou K; X58 é R ou K ou I; Χβ2 é K ou I ou V ou A; Χβ4 é Lou V; Χβ6 é Rou K; Χβ7 é A ou T; G; Χ70 é Q ou S ou K ou deletado;

Xn é N ou D ou deletado; e X72 é P ou A ou S ou deletado.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido um polinucleotídeo iso- lado consistindo essencialmente de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma se- qüência aminoácido como apresentada em qualquer uma de SEQ ID No. 10-41.

Em um outro aspecto da invenção, é provida uma célula transgênica compreenden- do um polinucleotídeo como descrito acima. O polinucleotídeo pode ser não natural.

Em um outro aspecto da invenção, é provido um hospedeiro viral produzido por en- genharia genética para compreender um polinucleotídeo como descrito acima.

Em um aspecto adicional da invenção, é provido um vetor de expressão que com- preende o polinucleotídeo como descrito acima operativamente ligado a uma seqüência re- gulatória que controla a expressão do referido polinucleotídeo em um hospedeiro adequado.

Em ainda um aspecto adicional da invenção, é provida uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão descrito acima.

Em um outro aspecto da invenção, é provido o uso do peptídeo como descrito aci- ma na fabricação de um medicamento para tratar uma patologia mediada pela quimiocina CXC.

Em um outro aspecto da invenção, é provido um método de tratar uma patologia mediada pela quimiocina CXC compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um peptídeo como descrito acima. Breve Descrição das Figuras

Figura 1. o análogo G31 P de CXCL8(3.74)K11R é um potente inibidor da ligação de CXCL8 aos neutrófilos do sangue periférico. Neutrófilos do sangue periférico bovino (pureza 87-93%) foram (anel superior) expostos a 4 0C por 2 h a análogos de CXCL8(3.74)K11R (10 ng/mL) ou meio (med) sozinho, então lavado e similarmente incubados com CXCL8 biotini- lados (blotCXCL8; 1000 ng/mL ou 129 nM). Esses níveis de CXCL8 aproximados daqueles encontrados nos tecidos pulmonares de animais com pasteurelose pneumônica (ref. 8, 9).

Os níveis de blotCXCL8 Iigantes às células foram determinados usando tecnologia ELISA. Tais substituições aminoácidos descritas contidas em CXCL8(3.74)K11R incluiu: G31P; P32G; T12S/H13P/G31P; and T12S/H13P/G31P/P32G. O análogo G31P, mas não o análogo P32G foi um antagonista altamente eficaz de CXCL8 Iigante às células. Com ambos os aná- logos G31P e P32G, as substituições adicionais de T12S e H13F reduziram suas atividades antagonistas a CXCL8 (painel inferior). Os neutrófilos foram expostos simultaneamente por 45 minutos a 4 0C a concentrações variadas de CXCL8(3_74)K11R/G31P ou não marcado CXCL8 e 20 pM 125ICXCL8. Esse nível de 125I-CXCL8 foi escolhido como próximo da satura- ção quanto aos receptores CXCL8 de alta afinidade das células (dados não mostrados). Os níveis de 125I-CXCL8 associados a célula foram avaliados usando um contador. Os dados indicam claramente que CXCL8(3.74)K11R/G31P tiveram uma afinidade substancialmente maior para os neutrófilos que CXCL8.

FIG. 2. CXCL8(3.74)K11R/G31P não é um agonista das respostas da quimioatração neutrofílica ou liberações glicuronidase. CXCL8 e os análogos G31P, P32G, ou análogos combinados G31P/P32G de CXCL8(3.74)K11R foram testados quanto às suas atividades a- gonistas neutrofílicas, utilizando nentrófilos do sangue periférico bovino recém purificados (painel superior) as respostas quimiotáticas para cada proteína foram testadas em ensaios de microquimiotaxia por 30 minutos e os resultados expressos como o número médio (+/-) SEM de células/campo microscópico com objetiva 40x, como delineado na seção métodos. Ambos os análogos G31P e G31P/P32G apresentaram pouca atividade quimiotática dissi- mulada, enquanto que o análogo P32G estimulou respostas substanciais a 100 ng/mL. (pai- nel inferior). Os neutrófilos foram expostos a doses variadas de cada análogo por 30 minu- tos, e em seguida os produtos de secreção foram ensaiados quanto a glicuronidase usando o substrato quimiogênico p-nitrofenil-D-glicuronida, como apresentado na seção de méto- dos. Os armazenados celulares totais glicuronidase foram determinados a partir de alíquotas de células Iisadas com Triton-X-100. A liberação enzimática com cada tratamento é expres- sa como o percentual dos armazenados celulares totais. Nenhum dos análogos tiveram substancial atividade agonista, embora a CXCL8 propriamente não induzisse significativa liberação enzimática. O controle positivo do tratamento com phorbol-12,13-miristato acetato e ionóforo de cálcio A23187 induziu liberação enzimática de 42 +/- 6%. FIG. 3. CXCL8(3-74)K11R-G31P é um altamente eficaz antagonista da quimioatração neutrofílica mediada por quimiocina ELR-CXC. A capacidade de CXCL8(3.74)K11R/G31P pa- ra bloquear respostas quimiotáticas de neutrófilos bovinos para diversas quimiocinas ELR- CXC foi medida usando ensaios de microquimiotaxia de 20 minutos, (painel esquerdo). As células foram simultaneamente expostas a CXCL8 (1 ug/mL) e variadas concentrações do análogo. O número de células que responderam a CXCL8foi avaliado mediante contagem direta das membranas do ensaio de quimiotaxia, como na Figura 2. CXCL8(3-74)K11R/G31P foi um inibidor competitivo altamente eficaz das respostas das células a CXCL8. (painel in- termediário) curvas dose-resposta para a quimioatração de neutrófilos bovinos por CXCL1, CXCL5, ou CXCL8 humanos. Cada quimiocina apresentou um padrão bifásico de atividade, com máxima a 1-10 ng/mL e a 1 ug/mL. (painel direito). A capacidade de CXCL8(3. 74)K11R/G31P para bloquear as respostas celulares a 1 ng/mL de CXCL5 ou CXCL, huma- no ou 10 ng/mL de CXCL8 humano foi avaliada como acima. CXCL8(3.74)K11R/G31P anta- gonizou eficazmente cada quimiocina ELR-CXC, com a completa inibição sendo conseguida de 3-20 nM CXCL8(3.74)K11R/G31P.

FIG. 4. CXCL8(3-74)K11R-G31P bloqueia as atividades de quimioatraentes CXCL8 e não-CXCL8 expressas dentro das vias respiratórias pneumônicas ou em mastite induzida por endotoxina. Os efeitos do anticorpo monoclonal anti-IL8 8B6 ou CXCL8(3-74)K11R-G31P sobre as respostas neutrofílicas aos quimioatraentes expressos dentro das vias respiratórias dos animais com pasteurelose pneumônica ou em cavidade mamária de gado com mastite induzida por endotoxina foram avaliados como na Figura (3). (A) fluidos de lavagem bron- quialveolar diluídos (1:10) (BALF) provenientes de lóbulos Iesionais pulmonares de gado pneumônico (PNEUMONIA) ou lavagem da cavidade dos mamilos de gado com mastite (MASTITE) foram testadas como apresentadas (nenhum) ou após tratamento com um ou outro de anti-CXCL8 MAb 8B6 (5 ug/mL) ou CXCL8(3-74)K11R/G31P (G31P; 1 ou 10 ng/mL) quanto suas atividades quimiotáticas comparado ao meio sozinho. Com ambas as amostras, os anticorpos Mab 8B6 por si só neutralizaram 74% das atividades quimiotáticas nas amos- tras, enquanto que CXCL8(3-74)K11R/G31P reduziram as respostas em 93-97%. (B) Afim de confirmar esses resultados usando uma estratégia alternativa, fluidos Iesionais BAL foram absorvidos com matrizes de imunoafinidade com anticorpo monoclonal 8B6, removendo >99% de seu conteúdo de CXCL8, em seguida testadas ambas suas atividades quimiotáti- cas residuais e uma capacidade de CXCL8(3-74)K11R/G31P para antagonizar essas ativida- des quimiotáticas não-CXLC8 residuais. Houve uma inibição dose-dependente doas ativida- des quimiotáticas total e residual nas amostras, indicando que ambos os quimioatraentes CXCL8 e não-CXCL8 são expressos nessas lesões.

Figura 5. CXCL8(3-74)K11R-G31P pode extirpar respostas inflamatórias endotoxina- induzidas in vivo. Bezerros Holstein de duas semanas de idade foram testados quanto às suas respostas inflamatórias neutrofílicas à provocação de endotoxina intradérmica (1 μ- g/local) antes e em diversos momentos após a injeção intravenosa (i.v.), subcutânea (subcu- tan.), ou intramuscular (i.m.) de CXCL8(3.74)K11R-G31P (75 //g/kg). Biópsias dos locais de reação endotoxina com quinze horas foram obtidas a 0, 16, 48 e 72 h pós-tratamento e pro- cessadas quanto a avaliação histopatológica da resposta neutrofílica, como determinado pela contagem dos número de neutrófilos em nove campos microscópico com objetiva 40x por seção (painel esquerdo). Fotomicrografias das respostas teciduais da provocação por endotoxina nas proximidades de vasos sangüíneos contidos no reticular dérmico antes de ((0 h) e 48 h pós tratamento. Grande quantidade de neutrófilos se acumulou em torno da vasculatura dentro da derme reticular nos tecidos pré-, porém não pós-tratamento. (B) Apre- sentação gráfica das respostas neutrofílicas à provocação endotoxina ou antes (0 h) ou a- pós (16, 48, 72 h) a aplicação de CXCL8(3.74)K11R-G31P por meio de cada rota. ** ou ***=p 0,01 ou 0,001, respectivamente, relativamente às respostas do pré-tratamento do controle interno.

Figura 6. Eosinófilos purificados provenientes do sangue de doadores atópicos as- máticos e atópicos não asmáticos (painéis esquerdos) ou um indivíduo com hipereosinofilia (painel direito) foram avaliados quanto as suas respostas ao recombinante humano CXCL8, CXCL5, ou CCL11, em presença ou ausência das doses indicadas de CXCL8(3. 74)K11R/G31P (G31P) recombinante bovino. Baixas doses de G31P foram capazes de blo- quear as respostas dessas células a cada um dos Iigandos CXCR1 e CXCR2, mas não teve efeito sobre as respostas dos eosinófilos relativamente ao ligando CCR3 não correlato CCL11/eotaxina.

Figura 7. Neutrófilos provenientes do sangue periférico de um doador saudável fo- ram testados quanto às suas respostas ao CXCL8 ou CXCL5 recombinante humano em presença ou ausência de CXCL8(3.74)K11R/G31P (G31P; 10 ng/mL) bovino. O G31P bloque- ou as respostas neutrofílicas a ambos os ligandos.

Figura 8. Caracterização física de isoformas de hbG31P.

Figura 9. Comparação de bG31P e hbG31P (antagonismo CXCL8).

Figura 10A. Análogos hbG31P não são agonistas neutrofílicos.

Figura 10B. Atividade do antagonista hbG31P.

Figura 11. Efeito da seqüência carbóxi-terminal de hbG31P sobre suas atividades antagonistas.

Figura 12. Agonista e análogos CXCL8 - atividades dos construtos.

Figura 13. Comparação das atividades antagonistas de bG31P e hG31P+6

Figura 14. hG31P antagoniza ENA78, um ligando CXCR2-específico.

Figura 15. hG31P antagoniza liberação de ROI CXCL8-induzida.

Figura 16. hG31P antagoniza atividades quimiotáticas neutrofílicas no esputo de pacientes com bronquiectasia e fibrose cística.

Figura 17. hG31P reduz inflamação pulmonar em ratos endotoxêmicos.

Figura 18. Efeito de hG31P na endotoxemia mórbida das vias respiratórias em por- cos da índia.

Figura 19. Efeito de diversas isoformas de hG31P (e hbG31P) sobre patologia da endotoxemia das vias respiratórias em porcos da índia.

Figura 20. Efeito das diversas isoformas hG31P (e hbG31P) sobre a patologia da endotoxemia das vias respiratórias em porcos da índia.

Figura 21. Efeitos dos mutantes hbG31P sobre a resposta do influxo neutrofílico Ca intracelular (PMN) ao IL-8 humano e GROa. A atividade de hbG31P e sua atividade mutante sobre o bloqueio da liberação de Ca intracelular PMN intracelular [Ca], estimulada por IL-8 humano e GROa foram avaliadas. 100 ng/mL de mutantes de bG31P, hbG31P, e hbG31P foram incubados com 2 //M Fluo- 4 AM manchado com 2 χ 105 PMNs por 15 mins, em se- guida estimulado por 100 ng/mL IL-8 ou GROa. Em seguida a leitura da fluorescência das amostras com fluorímetro. Os dados foram expressos como a área das medições [Ca],. Ge- ralmente, mutantes hbG31P bem como hbG31P, bG31P apresentaram atividade agonista eficaz em PMN [Ca]i estimulado por IL-8 e GROa.

Figura 22. mutantes hbG31P apresentaram diferentes efeitos sobre o bloqueio da migração de PMN ao sítio de inflamação nos testes de pele estimulados por LPS. hbG31P e sua atividade antagonista mutante em bloquear a infiltração de PMS no sítio de inflamação estimulado por LPS foram avaliados. Os dados foram expressos como a porcentagem do número bloqueado de PMN em campo 40x de microscópio de tecido subcutâneo e intradér- mico tratados por 0,5 //g LPS e 250 //g/mL bG31P, hbG31P ou seus mutantes no número de PMN no sítio de inflamação tratado apenas com LPS. Os dados mostraram claramente que hbG31P possui atividade bloqueadora igual com bG31P. H13Y mostrou atividade antagonis- ta muito melhor que T3K, E35A. T15K apresentou ligeiro efeito sobre o bloqueio. Ao mesmo tempo, S37T não apresenta qualquer atividade antagonista.

Descrição Detalhada da Invenção

(As abreviações apresentadas a seguir são usadas no transcurso desta revelação: ARDS, síndrome de sofrimento respiratório agudo; BALF, fluido da lavagem bronquialveolar; BHR1 Reagente de Bolton-Hunter; receptores de CXCR1, CXCR2, CXCL8 A, B, respectiva- mente; motivo ácido glutâmico-lisina-arginina, ELR; CXCL1, oncogene-alfa relacionado com o crescimento; CXCL4, fator plaquetário-4; CXCL5, ativador-78 neutrofílico derivado epiteli- al; CXCL6, proteína-2 quimiotática granulócita; CXCL8, interleucina-8; fMLP, tripeptídeo bac- teriano formil metionil-leucilprolina; IPTG1 isopropil-tio-D-galactopiranosida; MIP-2, proteína- 2 macrófago inflamatória; PMSF, fluoreto de fenilmetilsulfonila; TMB, tetrametilbenzidina).

Como usado aqui, 'um agonista' se refere a um agente que induza a célula a se tornar ativada.

Como usado aqui, 'um antagonista' se refere a um agente que impede a célula de ser ativada em presença ou ausência do agonista.

Como usado aqui, 'purificado' não exige pureza absoluta mas em lugar disso é pre- tendido como uma definição relativa. Por exemplo, a purificação do material de partida ou do material natural a pelo menos uma ordem de magnitude, preferivelmente duas ou três or- dens de magnitude é expressamente contemplado como se inserindo na definição de 'purifi- cado'.

Como usado aqui, o termo 'isolado' requer que o material seja removido de seu ambiente original.

Como usado aqui, o termo 'tratamento' em suas diversas formas gramaticais se re- fere a prevenir, curar, reverter, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir ou parar os efeitos preju- diciais de um estado de doença, de progressão da doença, ou de uma condição anormal outra provocada pelo agente causai da doença.

Como usado aqui, uma 'quantidade eficaz' é uma quantidade que é suficiente para conseguir o resultado desejado. Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, uma tal quantidade irá, naturalmente, depender da idade, peso e das condições do paciente individual que está sendo tratado.

Quando truncagem amino terminal de CXCL8 bovino é combinada com uma lisina para substituição arginina no aminoácido 11 (isto é, CXCL8(3-74)K11R), são evidentes au- mentos importantes na afinidade do receptor de CXCR1 e CXCR2, tal que CXCL8(3-74)K11R inibe competitivamente a ligação de múltiplos Iigandos a ambos os receptores (Li, F., and J. R. Gordon. 2001. Biochem. Biophys. Res. Comm. 286:595-600., aqui incorporados por refe- rência). A truncagem adicional no motivo receptor-sinalizador ELR (por exemplo, aminoáci- dos 4-6 de CXCL8 humano) de algumas quimiocinas CXC pode transforma-los em antago- nistas de receptor brando (CXCL8(6.72)) a moderado (CXCL1(8-73)) (McColl and Clark Lewis 1999; Moser, B. et al. 1993. J. Biol. Chem. 268:7125- 7128). Como revelado aqui, ao intro- dução no CXCL8(3-74)K11R de uma segunda substituição aminoácido, glicina 31 a um resí- duo prolina (isto e, CXCL8(3-74)K11R/G31P), torna esse análogo CXCL8 um antagonista de afinidade muito alta das respostas quimiocinas ELR-CXC bovina e humana. Ele antagoniza o arranjo completo de quimiocinas ELR-CXC expressos no foco inflamatório endotoxina in- duzido e bloqueia a inflamação induzida por endotoxina in vivo.

Embora algumas das discussões apresentadas a seguir tratem primeiramente com neutrófilos bovinos, células inflamatórias de outros mamíferos (incluindo humanos) também apresentam receptores de CXCR1 e CXCR2 (ver, por exemplo, Benson, M. et al. 1999. Pe- diatr. Allergy Immunol. 10:178-185) e são também vulneráveis a inibição por meio de CXCL8(3-74)K11R/G31P. Conseqüentemente, a presente invenção tem uma ampla aplicabili- dade para as patologias mediadas pela quimiocina ELR-CXC em mamíferos.

Como será entendido por aqueles usualmente versados na técnica, na nomenclatu- ra usada aqui, '3-74' se refere ao fato de que o peptídeo CXCL8 natural tem comprimento de 74 aminoácidos ('74') e os dois primeiros aminoácidos foram clivados, significando que a seqüência de peptídeo 'começa' no aminoácido #3 da seqüência natural. Para consistência de nomenclatura, os aminoácidos são referidos pelo número com base na seqüência do tipo naturalmente encontrado e como tal 'G31P' se refere à substituição de glicina no aminoácido #31 da seqüência naturalmente encontrada com prolina. Como será notado por aqueles u- sualmente versados na técnica, com referência à SEQ ID No. 1, prolina está de fato no 29° aminoácido em vista da deleção dos dois primeiros aminoácidos.

Em outras modalidades da invenção, são providas proteínas antagonistas da qui- miocina ELR-CXC que são capazes de se ligarem aos receptores de CXCR1 ou CXCR2 em células inflamatórias de mamíferos. Numa modalidade preferida, esses peptídeos são subs- tancialmente equivalentes a um peptídeo que possui uma seqüência de SEQ ID No. 1, em que, como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, substancialmente e- quivalente significa que os peptídeos possuem uma seqüência aminoácido que é pelo me- nos 60% idêntica, ou pelo menos 65% idêntica, ou pelo menos 70% idêntica, ou pelo menos 71%, ou pelo menos 72% idêntica, ou pelo menos 73% idêntica, ou pelo menos 74% idênti- ca, ou pelo menos 75% idêntica, ou pelo menos 76% idêntica, ou pelo menos 77% idêntica, ou pelo menos 78% idêntica, ou pelo menos 79% idêntica, ou pelo menos 80% idêntica, ou pelo menos 81% idêntica, ou pelo menos 82% idêntica, ou pelo menos 83% idêntica, ou pelo menos 84% idêntica ou pelo menos 85% idêntica, ou pelo menos 86% idêntica, ou pelo menos 87% idêntica ou pelo menos 88% idêntica ou pelo menos 89% idêntica ou pelo me- nos 90% idêntica ou pelo menos 91% idêntica ou pelo menos 92% idêntica ou pelo menos 93% idêntica ou pelo menos 94% idêntica ou pelo menos 95% idêntica a uma proteína CXCL8 naturalmente encontrada (ilustrado aqui como a seqüência aminoácido de SEQ ID NO:2) e também possui uma truncagem dos primeiros dois resíduos aminoácidos juntamen- te com substituições de Lysl 1 com Arg e Gly31 com Pro. Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, em muitas modalidades, esses peptídeos terão compri- mentos de aproximadamente 69, 70 ou 72 aminoácidos, como discutido adiante. Todavia, em outras modalidades, os peptídeos como descrito acima podem incluir deleções e/ou in- serções de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais aminoácidos. Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, regiões de um peptídeo que podem tolerar uma inserção ou deleção podem ser previstas a partir da estrutura tridimensional de um peptídeo ou por meio de comparação das seqüências provenientes dos organismos correlatos.

Por exemplo, com referência a Tabela 1 que mostra o alinhamento de peptídeos das seqüências de CXCL8 naturalmente encontradas a partir de um número de espécies, incluindo bovino, humano, macaco rhesus, ovelhas, cães, e porcos, uma das seqüências de porcos inclui um aminoácido adicional inserido entre o que corresponde as aminoácidos 60 e 61 da seqüência bovina naturalmente encontrada, indicando que este é um sítio que é possível de tolerar inserções de um ou mais aminoácidos em outras espécies. De modo si- milar, as seqüências humana e de porco, 2 e 3 aminoácidos respectivamente são deletados no C-terminal relativamente à seqüência bovina, sugerindo que a deleção de pelo menos 2- 3 aminoácidos do C-terminal é possível de ser tolerada em outras espécies também. Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, isto também indica que a adição ou a substituição de aminoácidos na extremidade C-terminal desses peptídeos é possível de ser tolerada, isto é, não teria um efeito significativamente negativo sobre a atividade biológi- ca desejada do peptídeo.

É de notar que é bem conhecido na arte que algumas modificações e alterações podem ser feitas na estrutura de um peptídeo sem alterar substancialmente a função bioló- gica daquele peptídeo, para obter um peptídeo biologicamente equivalente. Em um aspecto da invenção, os peptídeos acima mencionados podem incluir peptídeos que diferem pelas substituições aminoácidos conservativas. Os peptídeos da presente invenção também se estendem aos peptídeos biologicamente equivalentes que diferem pelas substituições ami- noácidos conservativas. Como usado aqui, o termo "substituições aminoácidos conservati- vas" se refere a substituição de um aminoácido por um outro numa dada posição no peptí- deo, onde a substituição pode ser feita sem substancial perda da função pertinente, nesse caso, a multiplicação do epítopo. Na produção de tais alterações , as substituições de resí- duos iguais de aminoácidos pode ser feita com base na similaridade relativa de substituintes de cadeia lateral, por exemplo, seu tamanho, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e seme- lhantes, e tais substituições podem ser ensaiadas quanto ao seu efeito acerca da função do peptídeo através de testagem de rotina. Nessas modalidades, função se refere a atividade antagonista da quimiocina CXCL8.

Em algumas modalidades, substituições aminoácidos conservativa podem ser feitas onde um resíduo aminoácido é substituído por um outro possuindo um valor similar de hidro- filicidade (por exemplo, dentro de um valor de mais ou menos 2,0), onde o seguinte pode ser um aminoácido possuindo um índice hidropático de cerca de 1,6 tal como Tyr (-1,3) ou Pro (- 1,6) são consignados a resíduos aminoácidos (como detalhado na Patente U.S. No. 4.554.101, incorporada aqui por referência): Arg (+3,0); Lys (+3,0); Asp (+3,0); Glu (+3,0); Ser (+0,3); Asn (+0,2); Gln (+0,2); Gly (0); Pro (-0,5); Thr (-0,4); Ala (-0,5); His (-0,5); Cys (- 1,0); Met (-1,3); Val (-1,5); Leu (-1,8); He (-1,8); Tyr (- 2,3); Phe (-2,5); and Trp (-3,4).

Em modalidades alternativas, as substituições aminoácidos conservativas podem ser feitas onde um resíduo aminoácido está substituído por um outro possuindo um índice hidropático (por exemplo, contido em um valor de mais ou menos 2,0). Em tais modalidades, cada resíduo aminoácido pode estar consignado a um índice hidropático com base em suas características de hidrofobicidade e carga, como a seguir: He (+4,5); Val (+4,2); Len (+3,8); Phe (+2,8); Cys (+2,5); Met (+1,9); Ala (+1,8); Gly (-0,4); Thr (-0,7); Ser (-0,8); Trp (-0,9); Tyr (-1,3); Pro (-1,6); His (-3,2); Glu (-3,5); Gln (-3,5); Asp (- 3,5); Asn (-3,5); Lys (-3,9); and Arg (-4,5).

Em modalidades alternativas, substituições aminoácidos conservativas podem ser feitas onde um resíduo aminoácido está substituído por um outro na mesma classe, onde os aminoácidos são divididos na forma de não polar, ácidos, básicos e neutros, como a seguir: não polar: Ala, Val, Leu, He, Phe, Trp, Pro, Met; ácido: Asp, Glu; básico: Lys, Arg, His; neu- tro: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.

Em ainda outras modalidades, as substituições podem ser feitas onde qualquer a- minoácido conhecido está substituído numa dada posição. Em algumas modalidades, ami- noácidos evolutivamente não conservados ou fracamente conservados podem estar substi- tuídos com qualquer, por exemplo, aminoácidos de tamanhos similares mas de diferentes hidrofobicidade, carga similar mas diferentes tamanhos ou outros tios de substituições que serão entendidas por aqueles usualmente versados na técnica.

Desse modo, análogos de CXCL8(3-74)K11RG31P podem ser construídos onde a função biológica desejada é mantida por inserção, deleção e substituição da seqüência a- presentada na SEQ ID No. 6, como discutido aqui. É também notado que análogos repre- sentativos são mostrados nas SEQ ID Nos. 7-41.

Numa modalidade preferida, análogos substancialmente equivalentes de CXCL8(3- 74)G31P são preparados usando comparações das seqüências correlatas provenientes de diversas espécies, por exemplo, como mostrado na Tabela 1. Como será notado por aque- les usualmente versados na técnica, a substituição em locações altamente variáveis do ami- noácido é mais possível de ser tolerada que a substituição em aminoácidos altamente con- servados.

Por exemplo, a comparação das seqüências apresentadas na Tabela 1, seguida pela deleção dos dois aminoácidos N-terminais e a substituição de glicina 31 com prolina e lisina 11 com arginina proporciona uma seqüência de: XELRCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX XX (SEQ ID NO. 3) onde X é qualquer aminoácidos. Em algumas modalidades, X é um aminoácido natu- ral.

Em uma outra modalidade da invenção, é provido um polipeptídeo isolado ou purifi- cado compreendendo uma seqüência aminoácido de: X1ElrCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4 (SEQ ID NO. 42) onde aqui X1l X2, X3 e X4 são independentemente resíduos de aminoácidos 0 -10 e X é qualquer aminoácido. Isto é, X1 pode ser, por exemplo, 6 aminoácidos longos aleatórios enquanto que X2, X3 e X4 podem ser todos 0 aminoácidos longos, tal que ele possa ser dele- tado. Em outras modalidades, X1 pode ser 2 aminoácidos não naturais, isto é não MS (bovi- no) ou SA (humano) mas qualquer outros 2 aminoácidos, X2 pode ser S ou Q e X3 e X4 po- dem ser deletados.

De modo alternativo, Xi pode ser aminoácidos 0-9 , aminoácidos 0-8, aminoácidos 0-7 ou aminoácidos 0 - 6 ou 0-5 aminoácidos, ou aminoácidos 0 - 4, ou aminoácidos 0-3 , ou aminoácidos 0-2 , ou X, pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de GSK, GST, S, A, Τ, K, GSMGGSK, e GSMGGST ou X1 pode ser deletado.

É de notar que em algumas modalidades é provida a condição de que o peptídeo não possui seqüência aminoácido SEQ ID No. 6, 7, 8 ou 9.

Em uma outra modalidade da invenção, é provido um polipeptídeo isolado ou purifi- cado compreendendo uma seqüência aminoácido de:

X1ELRCX6CIRX1O XIIXI3PFX16PKX19I X2-IEX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX5O PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69X7OX71X72 (SEQ ID NO. 43)

onde:

X1, X70, X71 e X72 são independentemente aminoácidos 0 -10; e X6, X10 X11, X13 X16 X19 X21 X23 X24 X25 X27 X33 X35 X42 X43 X45 X47 X50 X52 X53 X54 X58 X59 X61 X62 X64 X66 X67 X69 são cada um independentemente selecionado a partir do grupo que consiste de: A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V e Y.

De modo alternativo, X1, X70, X71 e X72 independentemente pode ser aminoácidos 0- 9 , aminoácidos 0-8, aminoácidos 0-7 ou aminoácidos 0 - 6 ou aminoácidos 0-5 , ou ami- noácidos 0 - 4, ou aminoácidos 0-3 , ou aminoácidos 0-2 , ou X1 pode ser selecionado a par- tir do grupo que consiste de GSK, GST, S, A,

Τ, K, GSMGGSK, e GSMGGST ou X, pode ser deletado.

Em outras modalidades, X1 pode ser 2 aminoácidos não naturais, isto é, não t MS (bovino) ou SA (humano) mas quaisquer outros 2 aminoácidos, X70 pode ser S ou Q e X71 e X72 podem ser deletados. É de notar que em algumas modalidades é provida a condição de que o peptídeo não possui a seqüência aminoácido de SEQ ID No. 6, 7, 8 ou 9.

Em uma outra modalidade da invenção, é provido um polipeptídeo isolado ou purifi- cado compreendendo uma seqüência aminoácido de: X1ELRCIRX6CIRX10X11SX13PFX16PKX19I X21EX23X24X25IX27SPP

HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX5OPX52X53X54WVQX58X59V X6IX62FX64KX66X67EX69X7OX71X72 (SEQ ID NO. 4)

onde

X1 é aminoácidos 0-10;

X6 é Q, E ou L; X10 é T ou I;

X11 é H ou Υ;

X13 é T ou Κ;

X16 é H ou Ν;

X19 é F ou Y ou L;

Χ21 é K ou R;

X23 é L ou M;

X24 é R ou T;

X25 é V ou A;

X27 é D ou E;

X33 é V ou A ou E;

X35 é T ou S;

X42 é S ou V ou T ou F;

X45 é R ou A ou N ou K ou D;

X47 é L ou V;

X50 é D ou N;

X52 é K ou H;

X53 é E ou Q ou T;

X54 é P ou N ou K;

X58 é R ou K ou I;

X59 é Vou I;

X61 é E ou Q;

X64 é L ou V;

X66 é R ou K;

X67 é A ou T;

X69 é S ou N ou K ou G;

X70 é Q ou S ou K ou deletado;

X71 é N ou D ou deletado; and

X72 é P ou A ou S ou deletado.

Alternativamente, X1 pode ser aminoácidos 0-9 , aminoácidos O - 8, aminoácidos O- 7 ou aminoácidos O - 6 ou aminoácidos 0-5 , ou aminoácidos O - 4, ou aminoácidos 0-3 , ou aminoácidos 0-2 , ou

X1 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de GSK1 GST1 S1 A1 T, K1 GSMGGSK, e

GSMGGST ou X1 pode ser deletado.

É de notar que em algumas modalidades é provida a condição de que o peptídeo não possui a seqüência aminoácido SEQ ID No. 6, 7, 8 ou 9. Em uma outra modalidade da invenção, é provido um polipeptídeo isolado ou purificado compreendendo uma seqüência aminoácido de:

X1Elrcqcirt X11Sx13PfhPkfi kelrviespp hcx33nx35elivk lx42x43gx45ex47clx5O pkex54wvqx58w X61X62Fx64KRAEX69X7OX7IX72 (seq id no. 4)

onde

XI é GSK1 GST, S1 A1 T1 K1 GSMGGSK, GSMGGST ou deletado;

XII é H ou Y; X13 é T ou K;

X33 é A ou E;

X35 é T ou S; X42 é S ou T; X43 é D ou N; X45 é R ou N ou D; X47 é L ou V; X50 é D ou N; X54 é N ou K; X5s é R ou K; X6l é E ou Q; X64 é L ou V; X69 é N ou K; X70 é Q ou S ou deletado; X71 é D ou deletado; e X72 é P ou deletado.

É de notar que em algumas modalidades é provida a condição de que o peptídeo não possui a seqüência aminoácido SEQ ID No. 6, 7, 8 ou 9.

Em outras modalidades, é provido um polipeptídeo isolado ou purificado que possui ou compreende ou consiste essencialmente ou consiste de uma seqüência aminoácido co- mo apresentado em qualquer uma das SEQ ID No. 6-41 ou SEQ ID No. 10-41. Por referên- cia, essas seqüências aminoácidos são como a seguir: TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIE PPHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKW

QVFVKRAEKQDP (Bovino 3-74 K11RG31P - SEQ ID No. 6) TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESGGHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKV VQVFVKRAEKQDP (bovino 3-74 K11R P32G - SEQ ID No. 7) TELRCQC IRSPSTPFHPKFIKELRVIESPPHCEN EIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKW QVFVKRAEKQDP (bovino - 3-74 T12SH13PG31P - SEQ ID No. 8) TELRCQCIRSPSTPFHPKFIKELRVIE PGHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQKW QVFVKRAEKQDP (bovino - 3-74 T12SH13PG31PP32G - SEQ ID No. 9) GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRV ESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (bhG31P - SEQ ID No. 10);

KELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIE PPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRW EKFLKRAENS (hG31 P (0) - SEQ ID No. 11); ELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIES PHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRWE

KFLKRAENS (hG31P (-1) - SEQ ID No. 12); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRV ESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (hG31P (+2) - SEQ ID No. 13);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIK LRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hG31P (+6) - SEQ ID No. 14);

GSTELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRV ESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (hG31P K3T - SEQ ID No. 15); GSKELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (hG31P Y13H - SEQ ID No. 16);

GSKELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRV ESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (hG31P K15T (0) - SEQ ID No. 17);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLSDGRELCLDPKENWV QR WEKFLKRAENS (hG31 P A35E(0) - SEQ ID No. 18);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLSDGRELCLDPKENW VQR WEKFLKRAENS (hG31P T37S (0) - SEQ ID No. 19);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLTDGRELCLDPKENWV QR VVEKFLKRAENS (hG31P S44T (0) - SEQ ID No. 20);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGDELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (hG31P R47D (0) - SEQ ID No. 21); GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRV ESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKEKWVQR

WEKFLKRAENS (hG31P N56K(0) - SEQ ID No. 22);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRV ESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQK WEKFLKRAENS (hG31P R60K (0) - SEQ ID No. 23);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRV ESPPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQR

WEVFLKRAENS (hG31P K64V (0) - SEQ ID No. 24);

GSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRV

ESPPHCANTEIIVKLSDGREVCLDPKENWVQR

WEKFLKRAENS (hG31P L49V - SEQ ID No. 25); GSKELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR

WEKFLKRAENS (bhG31P T3K- SEQ ID No. 26);

GSTELRCQCIRTYSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWV QR

WEKFLKRAENS (bhG31P Hl 3 Y - SEQ ID No. 27);

GSTELRCQCIRTHSKPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWV QR

WEKFLKRAENS (bhG31 P Τ15K - SEQ ID No. 28); GSTELRCQC

IRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCANSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR

WEKFLKRAENS (bhG31P E35A - SEQ ID No. 29);

GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENTEIIVKLTDGRELCLDPKENWV QR

WEKFLKRAENS (bhG31 P S37T - SEQ ID No. 30);

GSMGGSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPK EN

WVQRWEKFLKRAENS (bhG31P (+6) - SEQ ID No. 31); GSTELRCQC

IRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR WEKFLKRAENS (bhG31P (+2) - SEQ ID No. 32);

TELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR W

EKFLKRAENS (bhG31P (+0) - SEQ ID No. 33);

ELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRVIESPPHCENSEIIVKLTDGRELCLDPKENWVQR WE

KFLKRAENS (bhG31P (-1) - SEQ ID No. 34); GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hK11R (+6) - SEQ ID No. 35);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIK LRVIESPPHCENTEIIVKLSDGRELCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P A35E(+6) - SEQ ID No. 36);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIK LRVIESPPHCANSEIIVKLSDGRELCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P T37S (+6) - SEQ ID No. 37);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIK LRVIESPPHCANTEIIVKLTDGRELCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P S44T (+6) - SEQ ID No. 38);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIK LRVIESPPHCANTEIIVKLSDGDELCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P R47D (+6) - SEQ ID No. 39);

GSMGGSKELRCQCIRTYSKPFHPKFIKELRVIESPPHCANTEIIVKLSDGREVCLDPKEN WVQRWEKFLKRAENS (hK11RG31P L49V - SEQ ID No. 40); e

GSTELRCQCIRTHSTPFHPKFIKELRV ESPPHCENSEIIVKLTNGNEVCLNPKEKWVQK WQVFVKRAEKQDP (Bovino 3-74 K11RG31P (+2)- SEQ ID No. 41).

Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, 'consistindo es- sencialmente de' como usado com respeito aos peptídeos definidos acima se refere ao fato de que os peptídeos podem incluir, por exemplo, deleções N-terminais e/ou C-terminais que não influenciam materialmente a atividade, isto é, a atividade antagonista ou agonista da quimiocina ELR-CXC do peptídeo em questão.

Numa modalidade preferida, o peptídeo isolado ou purificado é como apresentado na SEQ ID No. 13 (hG31P+2) ou SEQ ID No. 14 (hG31P+6). Como pode ser visto pela refe- rência às Figuras 12, 19 e 20 e como discutido adiante, esses peptídeos aparentam mostrar uma atividade relativamente maior comparada a hG31P+0 e hG31P-l.

Como discutido aqui, polinucleotídeos que codificam os peptídeos descritos acima estão inseridos no escopo da invenção e podem ser construídos usando meios bem conhe- cidos na arte. Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, células transgênicas ou linhagens de células que compreendem ou que tenham sido transformadas ou transfectadas com tais polinucleotídeos estão também inseridas no escopo da invenção como discutido acima.

Por exemplo, um hospedeiro viral pode ser produzido por engenharia genética para compreender o polinucleotídeo ou um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo como descrito acima e estando operativamente ligado a uma seqüência regulatória que con- trola a expressão do referido polinucleotídeo pode ser construído usando meios conhecidos na arte.

Além disso, os peptídeos como descrito acima pode ser usado na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma patologia mediada pela quimiocina CXC. Em algu- mas modalidades, o medicamento é para o tratamento de uma patologia mediada pela qui- miocina ELR-CXC. A patologia mediada pela quimiocina CXC pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de: dano por isquemia-reperfusão, síndrome de sofrimento respirató- rio agudo induzido por endotoxemia, glomerulonefrite do tipo imuno complexo, pneumonia bacteriana e mastite.

Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, tais medicamentos compreendendo uma quantidade eficaz de qualquer um dos peptídeos descritos acima po- dem ser administrados a um indivíduo com necessidade de tal tratamento.

Numa modalidade alternativa da invenção, é vislumbrado que compostos possuindo a mesma estrutura tridimensional no sítio de ligação pode sr usada como antagonistas. A análise tridimencional da estrutura química é usada para determinar a estrutura dos sítios ativos, incluindo sítios Iigantes para as quimiocinas. Condutores químicos com alta vazão de classificação têm sido usados para gerar e otimizar quimicamente um antagonista seletivo do CXCR2 (J Biol Chem, 1998, 273: 10095, aqui incorporado por referência). Uma aborda- gem similar foi também usado para gerar um antagonista de CCR3 (J Biol Chem, 2000, 275:36626, aqui incorporado por referência).

Wells et al (J Leuk Biol, 1996, 59:53, aqui incorporado por referência), empregaram uma espectroscopia por ressonância magnética nuclear (RMN) para detalhar a estrutura tridimensional dos ligandos para CXCR, incluindo ambas as quimiocinas CXC ELR e não- ELR. Com suas informações de RMN, Wells et al geraram múltiplas substituições dentro dos sítios Iigantes do receptor de múltiplas quimiocinas, tal que elas, puderam alterar substanci- almente as especificidades dos ligandos.

Materiais e Métodos

Reagentes e suprimentos. Os reagentes a seguir foram adquiridos comercialmente: reagents were purchased commercially: glutathione-Sepharose, o vetor de expressão pGEX- 2T, Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia-Biotech, Baie d'Urf, PQ), Bolton-Hunter reagent, um kit de biotinilação de proteína (Pierce Scientific, Rockford, 111.), o vetor de seqüenciamento pBluescript Il KS, Pfu Turbo.TM. DNA polymerase (Stratagene, La Jolla, Calif), um kit de mutagênese sítio-direcionado (QuickChange.TM.; Boerhinger-Mannheim Canada, Lavai, PQ), aprotinina, benzeno, ionóforo de cálcio A23187, chloramine T, cytochalasin B, dimethylformamide, endotoxina (Escherichia coli lipopolissacarídeo, serotipo 0127B8), isopropil-tio-D-galactopiranosida (IPTG), leupeptina, p-nitrofenil-D-glicuronida, óleo mineral, óleo de silício, tetrametilbenzidina (TMB), fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), phorbol-12,13-miristato acetato (PMA)1 e Triton X- 100 (Sigma Chemical Co, Mississauga, ON), um kit de manchamento Diff-Quick (American Scientific Products, McGaw Pk1 111.). humano CXCL1, CXCL5, e CXCL8 (R & D Systems Inc,

Minneapolis, Minn.), horse radish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit Ig (Zymed, South San Francisco, Calif), DMEM, HBSS (Gibco, Grand Island, N.Y.), HRP- streptavidin (Vetor Labs, Burlingame, Calif), ABTS enzyme substrate (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, Md.), soro de albumina bovino (BSA), and Lymphocyte Separation Médium (ICN Pharmaceuticals, Aurora, 111.).

Geração de análogos de CXCL8.sub.(3.74)K11R. O ligando CXCL8.sub.(3.74)K11R de alta afinidade a CXCR1/CXCR2, e seu análogo T12S/H13F foram gerados de acordo com os métodos descritos em Li and Gordon (2001, supra). Os análogos Gly31Pro(G31P), Pro32Gly (P32G), e G31P/P32G dessas proteínas foram geradas de modo similar através de mutagênese sítio-direcionada usando PCR com os apropriados iniciadores oligonucleotí- deos para frente e reverso (Tabela 1). Os produtos provenientes de cada reação foram dige- ridos com Dpnl, ligados ao vetor pGEX-2T, transfectados para células HB101, e suas se- qüências verificadas comercialmente (Plant Biotechnology lnstitute, Saskatoon). Em resumo, as bactérias recombinantes foram Iisadas em presença de um coquetel inibidor de protease (2 mM PMSF, 2 μg/mL aprotinina, e 2 μg/mL leupeptina) e as proteínas recombinantes de fusão nos sobrenadantes purificadas por cromatografia de afinidade, usando microesferas de glutathione-Sepharose de acordo com os métodos de Caswell et al. (Caswell, J. L., D. M. Middleton, and J. R. Gordon. 1998. Vet. Immunol. Immunopath. 67:327-340.). Os análogos CXCL8(3.74)K11R foram clivados a partir das proteínas de fusão GST através da digestão trombina, dialisado contra salino tamponado em fosfato (PBS), corrida através de colunas comerciais de remoção de endotoxina, e em seguida caracterizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e Western blotting com um anticorpo goat anti-CXCL8 bovino (provido por Dr. M. Morsey). Cada análogo purificado tinha uma massa molecular de 8 kDa, foi especificamente identificado pelo anticorpo anti-CXCL8 no Western blotting, e tinha uma pureza relativa de 96%, como dimensionado por análise desintométrica dos géis PAGE.

Marcação das proteínas recombinantes. Foi usado blotCXCL8 para a pesquisa inicial da ligação do análogo aos neutrófilos e 125I-CXCL8 para os ensaios do estágio posterior da afinidade relativa do receptor. CXCL8 foi biotinilado e os níveis da substituição biotina de- terminados usando um kit comercial, como indicado por Li and Gordon (2001, supra). O blotCXCL8 foi substituído com 2,15 moles de biotina por mol de CXCL8. CXCL8 foi rádio- marcado com 125I usando o método do reagente de Bolton-Hunter (BHR), como apresentado em detalhes em (Li and Gordon 2001, supra). A proteína marcada foi separada do 125I-BHR não incorporada por cromatografia em Sephadex G50, e o CXCL8 marcado caracterizado quanto a sua afinidade relativa a neutrófilos e o tempo requerido para conseguir o equilíbrio de ligação, como notado em Li and Gordon (2001, supra).

Ensaios Iigantes de análogo CXCL8(3.74)K11R . Células (85-93% neutrófilos) foram purificadas a partir do sangue de gado de acordo com o método Caswell method (Caswell, J. L. et al. 1998. Vet. Immunol. Immunopath. 67:327-340). Nos experimentos preliminares, foi determinado que nenhum dos análogos influenciou a viabilidade dos neutrófilos, como determinado por exclusão de corante trypan blue. Para as pesquisas amplas do análogo, neutrófilos em HBSS/0.5% BSA foram incubados por 2 h a 4°C com o análogo, lavado em DMEM frio, e em seguida incubado por outras 2 h a 4 0C com blotCXCL8 (1000 ng/mL). A biotina associada com a célula foi detectada mediante incubar as células lavadas com fosfa- tase alcalina conjugada com estrepavidina (diluição 1:700) e em seguida com substrato en- zima ABTS. O OD40S das amostras foi determinado usando um leitor de placa ELISA. Os neutrófilos tratados no meio rotineiramente ligam suficiente .sup.biotCXCL8 para gerar um OD405 de 0,5-0,6.

Ensaio de liberação neutrófilo-glicuronidase. O ensaio neutrófilo-glicuronidase foi reportado em detalhes (Li and Gordon 2001, supra). Em resumo, neutrófilos tratados com cytochalasin B foram incubados por 30 minutos com os análogos de CXCL8, em seguida seus produtos de segregação ensaiados calorimetricamente quanto a enzima. A liberação glicuronidase foi expressa como o percentual do conteúdo celular total, determinado medi- ante Iisar as células tratadas no meio com 0,2% (v/v) Triton X-100. A provocação neutrofílica com o estímulo de controle positivo PMA (50 ng/mL) e A23187 (1 /yg/mL) induziu liberação de 42+/-6% do total de armazenados glicuronidase celular.

Amostras provenientes de lesões inflamatórias. Foram obtidos fluidos de lavagem bronquialveolar (BALF) provenientes de pulmões de gado (n=4) com diagnóstico clínico de maneimiose pneumônica purulenta (Caswell et al., 1997), bem como fluidos das cavidades de mamilos provenientes de gado (n=4) com mastite experimental induzida por endotoxina (Waller, Κ. P. 1997. Vet. Immunol. Immunopathol. 57:239-251). Em experimentos dose- resposta preliminares foi determinado que 5 yug de endotoxina induziu uma forte (70-80% máximo) de resposta neutrofílica mamária. Desse modo, nos experimentos reportado a mas- tite foi induzida através da infusão de 5 //g de endotoxina ou meio veículo sozinho (salino; 3 mL volumes) dentro das cavidades mamilares vacas leiteiras Holstein não lactantes, e 15 h mais tarde os infiltrados foram recuperados das cavidades por lavagem com 30 mL HBSS. As células provenientes da BALF e os fluidos de lavagem da cavidade mamilar foram sedi- mentados por centrifugação e as contagens diferenciais foram realizadas. Fluidos de Iava- gem não tratados e esgotados de CXCL8 (abaixo) foram avaliados quanto aos seus teores de quimiocina através de ELISA (CXCL8 somente) e ensaios de quimiotaxia.

Ensaios de quimiotaxia neutrofílica. Os ensaios de microquimiotaxia foram transcor- ridos em câmaras de microquimiotaxia de Boyden modificadas usando filtros de policarbona- to com tamanho de poro de 5 μητι livres de polivinilpirrolidona, de acordo com métodos co- nhecidos (Caswell et al.,1998; Cairns, C. M. et al. 2001. J. Immunol. 167:57-65). Para cada amostra, os números de células que haviam migrado para o interior das membranas durante 20-30 min foram enumerados através de contagem direta de pelo menos 40 vezes. Os cam- pos das objetivas, e os resultados expressaram o número médio de células/campo 40x (+/- SEM). Os quimioatraentes incluíam d CXCL8 bovino ou humano, CXCL5 e CXCL1 huma- nos, maneimiose pneumônica de BALF e fluidos de lavagem de mastite (diluído 1:10-1:80 em HBSS), enquanto que os antagonistas compreenderam anticorpo 8M6 de mouse anti- ovine CXCL8 (fornecido generosamente por Dr. P. Wood, CSIRO, Austrália) ou os análogos CXCL8(3_74)K11R. Em alguns ensaios as amostras foram pré-incubadas com os anticorpos (5 //g/mL) por 60 min sobre gelo (Gordon, J. R. 2000. Cell Immunol. 201 :42-49). Em outros, foram geradas matrizes de imunoafinidade CXCL8-específicas com os anticorpos 8M6 e microesferas de proteína-A-Sepharose e usado esse excesso para absorver as amostras (Caswell et al.,1997; Gordon, J. R., and S. J. Galli. 1994. J. Exp. Med. 180:2027- 2037); o nível de depleção de CXCL8 foi confirmado por ELISA das amostras tratadas. Para ensaios com os antagonistas recombinantes, os inibidores foram misturados diretamente com as amostras imediatamente antes da realização dos testes.

ELISA de CXCL8. Para os testes ELISA, MAb 8M6 foi usado como o anticorpo de captura, rabbit antiovine CXCL8 antiserum (também de P. Wood, CSIRO) como o anticorpo secundário, e HRP-conjugado anti-rabbit lg, e TMB como o sistema de detecção, como no- tado em Caswell et al. (1997). Diluições seriais de cada amostra foram analisadas em tripli- cada, e cada ensaio incluiu uma curva padrão do CXCL8 bovino recombinante.

Bloqueio CXCL8(3.74)K11R/G31P das respostas endotoxina in vivo. Foram usadas series seqüenciais de testes cutâneos de 15 h para testar a capacidade de CXCL8(3. 74)K11R/G31P para bloquear respostas inflamatórias induzidas por endotoxina in vivo. Para cada teste, foram provocadas duas vacas Holstein de 2 semanas de idade de modo intra- dérmico com 1 /yg endotoxina em 100 μΙ_ de salino, após 15 h mais tarde tomadas biópsias por punção 6 mm sob anestesia local (lidocaína) e processadas estas quanto a histopatolo- gia (Gordon and Galli1 1994). Em seguida ao primeiro teste (controle interno positivo), foi injetado em cada animal de modo subcutâneo, intramuscular, ou intravenoso CXCL8(3_ 74)K11R/G31P (75 //g/kg) em salino, em seguida provocados novamente com endotoxina, como acima. Os animais foram provocados um total de 4 vezes com endotoxina, tal que biópsias do sítio de reação com 15 h foram obtidas a 0, 16, 48, e 72 h pós-tratamento. As biópsias foram processadas através de métodos de rotina em seções de parafinas .mu.m, manchadas com solução Giemsa1 e examinadas em modo cego numa ampliação de 400x (Gordon and Galli, 1994; Gordon1 J. R. 2000. J. Allergy Clin. Immunol. 106:110-116). Os números médios de neutrófilos por campo microscópico de objetiva 40x foram determinados em três diferentes profundidades de pele, a derme papilar (superficial), intermediária, e reti- cular (profunda).

Análise estatística. Dados multigrupos foram analisados por ANOVA e testagem post-hoc Fisher protected Least Significant Difference (PLSD), enquanto comparações em dois grupos foram feitas usando o teste-t de Student (bi-caudal). Os resultados são expres- sos como a média +/- SEM.

Results

1. G31P Bovino

CXCL8(3.74)K11R/G31P inibe competitivamente a ligação CXCL8 a neutrófilos. Foi pesquisada a capacidade de cada análogo CXCL8(3_74)K11R em se ligar aos receptores de CXCL8 em neutrófilos, e desse modo competir com CXCL8 como um ligando. Nas pesqui- sas iniciais, foram empregados ensaios de inibição da ligação blotCXCL8, incubação das cé- lulas com os análogos (10 ng/mL) por 2 h a 4 0C antes da exposição a blotCXCL8 (1 yyg/mL). Esse nível de CXCL8 se aproxima daquele encontrado nos tecidos pulmonares de carneiros com maneimiose pneumônica experimental (Caswell, J. L. 1998. The role of interleukin-8 as a neutrophil chemoattractant in bovino bronchopneumonia. Ph.D. thesis, Department of Vet- erinary Pathology, University of Saskatchewan). Foi descoberto que CXCL8(3.74)K11R/G31P foi um potente antagonista da ligação CXCL8 nesse ensaio (Figura 1), tal que 10 ng/mL de CXCL8(3-74)K11R/G31 P bloqueou 95% das ligações blotCXCL8 subseqüentes para as células. Quando testado nessa dose, o CXCL8(3.74)K11R/P32G bloqueou apenas 48% das ligações CXCL8, enquanto que CXCL8 não marcado propriamente inibiu competitivamente 30% das ligações bl0,CXCL8. A itcç em CXCL8(3_74)K11R/G31P ou CXCL8(3.74)K11R/P32G de substitui- ções aminoácidos adicionais em Thrl2 e Hisl3 reduziu substancialmente as atividades dos análogos (FIG. 1). Estes dados sugerem claramente que a pré-incubação de neutrófilos com CXCL8(3-74)K11R/G31P controla fortemente para baixo a subseqüente ligação de CXCL8.

A fim de mapear de modo mais refinado a capacidade de CXCL8(3.74)K11R/G31 pa- ra inibir a ligação de CXCL8, no próximo conjunto de experimentos as células foram expos- tas simultaneamente a 125ICXCL8 e doses variadas de CXCL8(3.74)K11R/G31P ou CXCL8 não marcadas. Foi descoberto que CXCL8(3.74)K11R/G31P foi cerca de duas ordens de magnitude mais eficaz que o CXCL8 naturalmente encontrado em inibir a ligação de 20 pM 125I-CXCL8 às células (Figura 1). A concentração de inibição de 50% da ligação do ligando marcado (IC50) foi de 120 pM para CXCL8 não marcado, e de 4 pM para CXCL8(3. 74)K11RA331P. Esses dado sugerem que CXCL8(3.74)K11R/G31P é um inibidor competitivo muito potente da ligação CXCL8 aos neutrófilos.

CXCL8(3_74)K11R/G31P não apresenta atividades agonistas neutrofílicas. Embora CXCL8(3.74)K11R/G31P fosse certamente um ligando de alta afinidade para os receptores CXCL8 neutrofílicos, seria igualmente bom realizar o mesmo como um agonista ou um an- tagonista. Desse modo os experimentos seguintes se voltaram para as atividades agonistas potenciais dos análogos CXCL8(3.74)K11R que foram gerados, como medidos por suas capa- cidades para quimioatrair essas células ou induzir a liberação a enzima hidrolítica granular neutrofílica-glicuronidase in vitro (Figura 2). Foi descoberto que mesmo a 100 ng/mL, CXCL8(3_74)K11R/G31P foi um fraco quimioatraente, induzindo 13,9 +/- 4% ou 5,4 +/- 2% das respostas induzidas por 1 ou 100 ng/mL CXCL8 (p,0,001), respectivamente. A 100 ng/mL, o análogo CXCL8(3.74)K11R/P32G induziu uma resposta que foi claramente substancial (38,3 +/- 2% da resposta de CXCL8), enquanto que o análogo combinado XCL8(3. 74)K11R/G31P/P32G também não foi um quimioatraente eficaz. Quando foi avaliada suas capacidades de induzir a liberação da glicuronidase, foi descoberto que nenhum dos análo- gos CXCL8(3.74)K11R foi tão eficaz quanto CXCL8 em induzir liberação do mediador. Em realidade, foi descoberto apenas liberação de base com qualquer deles a 10 ng/mL, e a 100 ng/mL e apenas CXCL8(3.74)K11R/G31P/P32G induziu significativas respostas neutrofílicas (Figura 2). Dada a combinada inibição competitiva de CXCL8 e os dados do agonista neu- trofílico, a partir desse momento as atenções foram voltadas para CXCL8(3.74)K11R/G31P.

CXCL8(3-74)K11R/G31 P bloqueia as respostas quimiotáticas neutrofílicas a ambos os Iigandos CXCR1 e CXCR2. O efeito mais patogênico da inapropriada expressão quimio- cina ELR+ é a atração de células inflamatórias ao interior dos tecidos. Desse modo, foi avali- ado em seguida o impacto de CXCL8(3.74)K11R/G31P sobre as respostas quimiotáticas de neutrófilos a altas doses de CXCL8 (Figura 3). Como previsto a partir das observações in vivo em ovelhas e gado (33), 1 //g/mL (129 nM) CXCL8 foi muito fortemente quimioatrativo, ção de 12,9 pM CXCL8(3.74)K11R/G31P reduziu a resposta quimiotática das células em 33%. A IC50 para CXCL8(3.74)K11R/G31P sob essas condições foi de 0,11 nM, enquanto que o bloqueio completo dessa resposta CXCL8 foi conseguido com 10 nM CXCL8(3. 74)K11R/G31P.

Quando da realização dos testes de eficácia de CXCL8(3.74)K11R/G31P em bloque- ar respostas para provocações mais sutis de CXCL8, os estudos foram também estendidos para avaliar a capacidade de CXCL8(3.74)K11R/G31P para bloquear respostas neutrofílicas ao CXCL8 humano bem como aos ligandos CXCR2 humano-específicos CXCL1 e CXCL5. Cada um desses é expressado nos tecidos de pacientes afetados de pancreatite (Hochrei- ter, W. W. et al. 2000. Urology. 56: 1025-1029) ou ARDS (Villard et al., 1995) a 1-10 ng/mL. Foi descoberto que neutrófilos bovinos foram responsivos a 1 ng/mL hCXCLI ou hCXCLõ, e similarmente responsivos a 10 ng/mL hCXCL8 (FIG. 3), de modo que essas doses foram empregadas para testar os efeitos de CXCL8(3.74)K11R/G31P nas respostas neutrofílicas desses ligandos. As respostas neutrofílicas a hCXCLI and hCXCLõ foram reduzidas a 50% por meio de 0,26 e 0,06 nM de CXCL8(3.74)K11R/G31P, respectivamente, enquanto suas respostas a hCXCL8 foram reduzidas em 50% por meio de 0,04 nM CXCL8(3.74)K11R/G31P (Figura 3). Esses dados indicam que CXCL8(3.74)K11R/G31P pode antagonizar as ações de múltiplos componentes da sub-família de quimiocinas ELR-CXC.

CXCL8(3.74)K11R/G31P é um efetivo antagonista in vitro das quimiocinas neutrofíli- cas expressas em pneumonia bacteriana ou lesões por mastite. Foi estado o nível até o qual o presente antagonista poderia bloquear a disposição de quimioatraentes neutrofílicos ex- pressos dentro dos complexos ambientes inflamatórios in vivo. Desse modo, foram escolhi- das duas doenças nas quais a ativação neutrofílica acionada por quimiocina contribui de modo importante para a progressão da patologia, mastite, e maneimiose pneumônica. Foi utilizada um modelo endotoxina de mastite (Persson, K. et al., 1993. Vet. Immunol. Immuno- pathol. 37:99-112), no qual foi infundido 5 μg de endotoxina/cavidade mamilar e 15 h mais tarde foi lavada cada cavidade. Os neutrófilos compreenderam 82 e 6%, respectivamente, das células provenientes das cavidades controladas por endotoxina e salino, com a massa maior das células restantes compreendendo macrófagos. Os fluidos de lavagem diluídos (1:10) induziram fortes respostas quimiotáticas neutrofílicas in vivo, e a adição de anticorpos anti-CXCL8 às amostras reduziu maximalmente estas em 73 +/- 8% (Figura 4A), relativa- mente ao meio de controle. Por outro lado, a adição de 1 ng/mL de CXCL8(3.74)K11R/G31P às amostras reduziu suas atividades quimiotáticas em 97% +/- 3%.

Neutrófilos também compreenderam 93 +/- 12% das células recuperadas de BALF de gado com avançada maneimiose pneumônica. Quando testadas in vitro, essas amostras também foram fortemente quimiotática para neutrófilos, e a adição de anticorpos anti-CXCL8 reduziu maximalmente suas atividades quimiotáticas neutrofílicas em 73 +/- 5% (Figura 4A). O tratamento dessas amostras BALF com 1 ou 10 ng/mL de CXCL8(3.74)K11R/G31P reduziu as respostas neutrofílicas em 75 +/- 9 ou 93 +/- 9%, respectivamente, relativamente aos meios de controle. Esses dados sugerem que CXCL8(3.74)K11R/G31P bloqueia as ações de quimioatraentes CXCL8 e não-CXCL8 nessas amostras.

A fim de confirmar essas observações usando uma estratégia alternativa, foi em seguida depletada amostras de pneumonia bacteriana BALF de CXCL8 usando matrizes de imunoafinidade, em seguida avaliada a eficácia de CXCL8(3.74)K11R/G31P em bloquear as atividades quimiotáticas neutrofílicas residuais nas amostras (Figura 4B). As amostras Iesio- nais de BALF não tratadas continham 3.215 +/- 275 pg/mL CXCL8, enquanto que a imunoa- finidade-absorvida BALF continha 24 +/-17 pg/mL CXCL8. Nessas series de experimentos a resposta neutrofílica para as amostras BALF depletadas-CXCL8 foi de 65,4 +/- 4% de suas respostas em relação as amostras não absorvidas. É sabido que CXCL8 pode contribuir tão pouco quanto 15% das atividades quimiotáticas neutrofílicas na maneimiose pneumônica BALF obtida a partir de uma disposição de casos clínicos (Caswell et al., 2001). Enquanto os tratamentos de depleção de CXCL8 foram eficazes em 99% em remover CXCL8, resta- ram nessas amostras quantidades substanciais das atividades quimiotáticas neutrofílicas, e a adição de 1 ng/mL CXCL8(3.74)K11R/G31P anulou completamente seus efeitos cumulativos (Figura 4B). Esses dados confirmaram inequivocamente que CXCL8(3.74)K11R/G31P tam- bém antagoniza o espectro de quimioatraentes não-IL-8 expressos nessas amostras.

CXCL8(3.74)K11R/G31P é altamente eficaz em bloquear a inflamação neutrofílica endotoxina-induzida in vivo. Nos últimos experimentos, foi avaliada a capacidade de CXCL8(3-74)K11R/G31P para bloquear respostas inflamatórias endotoxina-induzidas na pele de gado, bem como os quadros de tempo durante os quais ela foi eficaz. Os animais foram provocados de modo intradérmico com 1 μg endotoxina bacteriana 15 h antes (resposta controle positivo interno), ou em três diferentes momentos após, injeção intravenosa, subcu- tânea ou intramuscular de CXCL8(3.74)K11R/G31P (75 //g/kg). Desse modo biópsias de pun- ção de sítios de reação endotoxina com 15 horas foram tomadas 15 minutos antes do trata- mento e a 16, 48 e 72 h após a injeção do antagonista em cada animal, e os números de neutrófilos infiltrantes foram determinados em um modo cego quanto a derme papilar (super- ficial), intermediária e reticular de cada biópsia. Antes dos tratamentos antagonistas, fortes respostas inflamatórias neutrofílicas eram evidentes nos sítios de provocação endotoxina em cada animal (Figura 5). Dentro das biópsias, as respostas na derme papilar foram bran- das em todos os animais (dados não mostrados) e se tornam progressivamente mais evi- denciadas com o aumento da profundidade da pele, tal que inflamação maximal (infiltração neutrofílica) foi observada em torno dos vasos sangüíneos na derme reticular (Figura 5A).

Em seguida aos tratamentos CXCL8(3-74)K11R/G31P, as respostas inflamatórias observadas no intervalo de 16 h das biópsias foram suprimidos em 88-93%, enquanto que aqueles nas biópsias de 48 h foram suprimidos em 57% (intravenosa) a 97% (intradérmica), relativamen- te às suas respectivas respostas de pré-tratamento. Por volta das 72 h pós-tratamento os efeitos do antagonista administrado de modo intravenoso teve tinha se desgastado, enquan- to que as respostas endotoxina no gado tratado de modo intradérmico e subcutâneo foram ainda suprimidos em 60%. Esses dados indicam claramente que CXCL8(3.74)K11R/G31P é um antagonista altamente eficaz das respostas inflamatórias endotoxina-induzidas in vivo, que esses efeitos podem durar por 2-3 dias, e que a rota das aplicações influenciam nota- damente a farmacocinética desse novo antagonista.

Foi descoberto que G31P antagoniza também os efeitos quimiotáticos ELR-CXC humanas CXCL8/IL-8 e CXCL5/ENA-78 nos neutrofilos humanos. Desse modo as atividades quimiotáticas de 0,1 a 500 ng/ml_ de um ou outro de CXCL8 (Figura 6, painel esquerdo) ou CXCL5/ENA-78 (Figura 6, painel direito) foram essencialmente completamente bloqueadas pela adição de 10 ng/mL do antagonista da presente invenção quanto aos ensaios de quimi- otaxia. De modo similar, G31P bloqueou os efeitos quimiotáticos de CXCL8 quanto a eosi- nófilos CXCR1/CXCR2-positivos. Foi descoberto também que eosinófilos provenientes de indivíduos atópicos ou asmáticos expressam ambos os receptores de quimiocina ELR-CXC, e são responsivos a CXCL8 (Figura 7, painel esquerdo). Os efeitos quimiotáticos de 100 ng/mL CXCL8,mas não do ligando CCR3 CCL11/eotaxina, sobre eosinófilos do sangue peri- férico purificado de um doador levemente atópico, não asmático (pureza 99%) foram com- pletamente anulados pela adição de 10 ng/mL G31P aos ensaios de quimiotaxia (Figura 7, painel intermediário). Quando testados contra eosinófilos purificados provenientes de um paciente hipereosinofílico (Figura 7, painel direito), G31P neutralizou as respostas dessas células a um ou outro de CXCL8/IL-8 ou CXCL5/ENA-78.

Esses dados indicam claramente que G31P bovino é um antagonista eficaz das quimiocinas ELR-CXC bovinas expressas in vivo em resposta a provocação endotoxina, mas também antagoniza completamente as respostas do receptor qui8miocina ELR-CXC neutrofílico e eosinofílico a CXCL8 e CXCL5, Iigandos conhecidos para ambos o CXCR1 e CXCR2.

. G31P bovino humanizado.

Foi gerada uma proteína quimérica bovino-humano, compreendendo a metade a- mino-terminal de G31P bovino e a metade carbóxi-terminal de CXCL8 humano (bhG31P) (SEQ ID No. 10), e descoberto que ela tem forte atividade antagonista neutrofílica in vitro e in vivo; em realidade, bhG31P pode ter atividade maior que bG31P, ou das formas humanas de G31P. Foram também geradas e caracterizadas 5 formas alternativas de bhG31P (SEQ ID No. 26-30) em que aminoácidos humanos foram substituídos para os remanescentes aminoácidos bovinos - nenhum destes aumentou a atividade antagonista dos análogos, e algumas evidências sugerem que eles podem reduzir a atividade antagonista.

Como uma abordagem em gerar um fármaco humano, foi empreendida a humani- zação de bG31P. Além disso, uma vez que a 'metade' amino terminal de CXCL8 é mais im- portante para a atividade biológica de CXCL8 que a terminação carbóxi, e devido a 'metade' carbóxi-terminal de CXCL8 conter 10 dos 15 aminoácidos discrepantes bovino-humano da molécula, foi primeiramente avaliado se a totalidade do conjunto de ligação da terminação carbóxi de hCXCL8 (isto é, que codifica aminoácidos 45-72) por sobre a metade amino de bG31P (isto é, que codifica aminoácidos 3-44) poderia influenciar sua atividade. Especifica- mente, a metade amino de CXCL8 é conhecida portar os motivos de reconhecimento e de sinalização do receptor crítico e de suas estruturas andaimes associadas.

Foi gerada a proteína quimérica G31P bovino-humano, bCXCL8(3-44)K11R/G31P- hCXCL8(45-72)(bhG31P) (SEQ ID No. 10), em seguida usado o cDNA para essa proteína co- mo um gabarito para a substituição dos restantes resíduos aminoácidos bovino-humano discrepantes um a um, como discutido acima.

Foi expresso e purificado cada construto usando SOP para a clivagem enteroquina- se (bhG31P+0 & bhG31P isoformas apenas) ou trombina (todos os outros análogos), e a caracterização delas por SDS-PAGE e Western blotting (Fig 8). Cada isoforma tinha 8 kD de tamanho, embora as soluções de isoformas bhG31P/T15K (SEQ ID No. 28) e bhG31P/S37T (SEQ ID No. 30) aparentassem conter o que poderia ser interpretado como baixos níveis de dímeros, formados talvez como um resultado das altas concentrações de proteína nas a- mostras ou alternativamente talvez relacionadas com a perturbação dessas partes dos aná- logos G31P associadas com a dimerização. Diversos aminoácidos nessa região têm sido reportados anteriormente influenciar significativamente a dimerização de CXCL8 humano.

Foi descoberto que bhG31P (isto é, bCXCL8(3-44)K11R/G31 P-hCXCL8(45-72)) manteve a atividade antagonista da quimiocina ELR-CXC de bG31P, tal que ela bloqueou as respostas do intermediário oxigênio reativo ou quimiotático (ROI) de neutrófilos humanos para CXCL8 humano (Figura 9).

Quando se humanizou ainda mais essa proteína quimérica bovino-humano median- te introdução de adicionais aminoácidos humano-equivalentes em lugar dos resíduos dis- crepantes (isto é, T3K (SEQ ID No. 26), H13Y (SEQ ID No. 27), T15K (SEQ ID No. 28), E35A (SEQ ID No. 29), e S37T (SEQ ID No. 30)), foi descoberto que essas provocações na realidade não tinham efeito significativo sobre a atividade a quimera 50:50 bh, nem tornando qualquer dos análogos agonísticos quanto a neutrófilos como avaliado nos ensaios de qui- miotaxia (Figura 10A) ou em termos de reduzir significativamente a atividade antagonística como avaliado pela inibição da quimiotaxia ou pela inibição da liberação de intermediário oxigênio reativo (Figura 10B).

Como notado, foi avaliado o impacto sobre a atividade de bhG31 P da variação da seqüência amino-terminal (isto é, hG31P+6, bhG31P+2, bhG31P+°, bhG31P-1) (SEQ ID Nos. 14, 13, 11 e 12, respectivamente), medindo a atividade de cada um nos ensaios de inibição da quimiotaxia e de inibição do intermediário oxigênio reativo (Figura 11). Embora tenha sido descoberto que a eliminação de Lys3 tende a reduzir a atividade de bhG31 P, as atividades antagonistas dos outros análogos foram a grosso modo equivalentes (Fig. 11). Como será notado por aqueles usualmente versados na técnica, esses dados indicam que adições N- terminais de variados comprimentos e variadas composições aminoácidos seriam toleradas sem significativa ruptura da atividade de G31P. Conseqüentemente, adições N-terminais de aminoácidos aleatórios 0-10 ou aminoácidos aleatórios 0-9 ou aminoácidos aleatórios 0-8 ou aminoácidos aleatórios 0-7 ou aminoácidos aleatórios 0-6 ou aminoácidos aleatórios 0-5 ou aminoácidos aleatórios 0-4 ou aminoácidos aleatórios 0-3 ou aminoácidos aleatórios 0-2 .

Tomados em conjunto, esses dados sugerem que múltiplas formas quiméricas bo- vino-humanas of G31P são úteis antagonistas neutrofílicos. Deve ser notado, todavia, que ao tempo em que estavam sendo completadas a caracterização dessas quimeras, foi de- terminado que as formas humanas de CXCL8(3.72)K11R/G31P foram tão eficazes quanto bG31P em bloquear respostas neutrofílicas conduzidas por CXCL8, e que hG31P foi tam- bém um antagonista altamente eficaz da inflamação neutrofílica conduzida por endotoxina bacteriana e patologia in vivo. Desse modo, nesse momento foram envidados a maior parte dos esforços para caracterizar de modo mais completo os construtos hG31P.

3. G31P humano (hG31P).

Foi feito contrato com Takara Biotechnology Co., Dalian, PRC para sintetizar um cDNA de CXCL8 humano de comprimento completo, o qual foi clonado dentro de pGEX-2T utilizando terminações 5' (BamHI) e 3' (EcoRI) compatíveis. Esse cDNA pGEX-hCXCL8 foi usado como um gabarito para a mutagênese sítio-direcionada para gerar pGEX-hCXCL8(3. 72)K11R (hK11R) e pGEX-hCXCL8(3.72)K11R/G31P (hG31 P), os quais foram expressos como proteínas de fusão GST e purificados por clivagem trombina usando procedimentos opera- cionais padrões. Como com bhG31P (acima), foram geradas duas famílias de moléculas recombinantes G31P-relacionadas que foram precedidas por um outro de seis (Gly-Ser-Met- Gly-Gly-Ser) ou dois (GIy-Ser) aminoácidos estranhos, referidos como hG31P+6 (SEQ ID No. 14) ou hG31P+2 (SEQ ID No. 13), mas também famílias de construtos adicionais sem ami- noácidos exógenos (G31P+0) (SEQ ID No. 11) ou que foram também amino terminal- deletado (isto é, G31P"1, G31P"3, ou G31P"5). Foram também introduzidos no hG31P+6 os aminoácidos bovinos equivalentes nas posições aminoácidos 35 (SEQ ID No. 36), 37 (SEQ ID No. 37), 44 (SEQ ID No. 38), 47 (SEQ ID No. 39) e 49 (SEQ ID No. 40). Cada proteína foi expressada, purificada e caracterizada por meio de SDS-PAGE e Western blotting. Como previsto, cada uma compreendia fita única de ~8kD que foi reativa com anticorpos anti- CXCL8.

Caracterização biológica do análogo CXCL8s. Foram usados os ensaios de quimio- taxia com neutrófilos humanos purificados para avaliar as atividades agonista e antagonista CXCL8 de cada construto (Figura 12). hCXCL8(3-72)K11 R(hK11 R)-hK11R teve atividade específica significativamente maior (ensaio de quimiotaxia neutrofílica) que o CXCL8 humano, tal que ele representa um agonis- ta neutrofílico muito mais forte que a quimiocina humana naturalmente encontrada. Desse modo o hK11R pode ser usado em situações clínicas que demandem por aumentado recru- tamento/ativação neutrofílica.

Substituições hCXCL8(3.72)KI 1R/G31P (hG31P)-G31P dentro de hK11R+6 eliminou essencialmente a atividade agonista dessa molécula, tal que hG31P+6 foi pelo menos tão eficaz quanto um antagonista de quimiotaxia induzida por CXCL8 como bG31P+6.

As diversas estruturas N-terminais de hG31P influenciaram a atividade biológica dos análogos, tal que hG31P+6 e hG31P+2 aparentaram serem antagonistas superiores de quimiotaxia de CXCL8, enquanto que hG31P+0 e hG31P+2 possuíram atividade antagonista de quimiotaxia menos significativa relativamente ao bG31P+6. De modo interessante, quando comparado quanto às suas capacidades para inibir a liberação FOI CXCL8-induzida a partir de neutrófilos humanos, as diversas seqüências N-terminais tiveram muito menos efeitos sobre as atividades antagonistas dos análogos, com cada análogo exibindo atividade anta- gonista de liberação ROI altamente significativa. A liberação de ROI é dependente da ativi- dade da NADPH oxidase em neutrófilos, e foi reportado que a NADPH oxidase está sob o controle de CXCR2, mas não de CXCR1 .

O argumento para os diferentes graus de eficácia desses diversos análogos de substituição N-terminal pode ser que os dois ou seis resíduos extras em hG31P+2 ou hG31P+6 podem reduzir ainda mais o potencial da interação do motivo ELR (isto é no G31P), talvez por impedimento estérico.

A fim de documentar ainda mais as capacidades de hG31P para antagonizar as funções de CXCR2, foi avaliada sua capacidade para inibir a quimiotaxia neutrofílica CXCL5 (ENA-78)-dependente; CXCL5 é um Iigante CXCR2-específico, mas não um Iigante CXCR1- específico. hG31P+6 antagonizou sua atividade quimiotática num modo dose-dependente (Figura 14).

Foi também avaliado se os diversos análogos N-terminais de hG31P possuíam ati- vidade agonista significativa, relativamente ao PBS sozinho ou em um ensaio de quimiotaxia neutrofílica. Não foram descobertas respostas significativas da parte de neutrófilos relativa- mente a qualquer dos análogos N-terminais alternativos.

Foi em seguida avaliada se as substituições adicionais dentro de hG31P+6 dos ami- noácidos discrepantes humano-bovinos poderiam aumentar essa atividade antagonista do hG31P. Foram gerados e testados hG31P/A35E, hG31P/L49V, hG31P/R47D, hG31P/S44T e hG31P/T37S e descoberto que todos foram agonistas ineficazes. A introdução de aminoá- cidos bovino-equivalentes nas posições 35, 37, 44, 47 ou 49 reduziu diferencialmente a ati- vidade antagonista desses análogos, tal que os análogos R47D e S44T pareceram aumen- tar a atividade de CXCL8, preferivelmente que inibi-la, enquanto que os análogos A35E, L49V e T37S não apresentaram significativa atividade de inibição da quimiotaxia.

Foi previamente documentado que bG31P pode antagonizar as atividades quimiotá- ticas neutrofílicas presentes no esputo proveniente de pacientes com fibrose cística (CF) que experimentam exacerbações bacterianas de pneumonia. Desse modo, foi testada a ca- pacidade de hG31P para bloquear as atividades quimiotáticas neutrofílicas presentes no esputo proveniente de pacientes com CF branda (n=l), moderada (n=2), severa (n=2), ou avançada (n=2), mas também proveniente de pacientes com bronquiectasia não classificada (n=2; bact), moderada (n=2), ou severa (n=2). Esputos provenientes de pacientes diagnosti- cados com asma, DPOC, ou sinusite/bronquite geral foram também testados com ou sem hG31P+. Com a exceção do paciente de asma com um controle, todos os outros foram cultu- ra-positivos para as diversas espécies bacterianas (por exemplo, Haemophilus, Pseudomo- nas, Staphylococcus). Cada amostra foi titulada em experimentos preliminares para deter- minar a diluição ótima para uso no ensaio de quimiotaxia. G31P foi eficaz para bloquear de modo marcante as atividades quimiotáticas neutrofílicas presentes em todas as amostras, exceto aquelas provenientes de pacientes de CF avançada. Isso sugere que uma etiologia pode existir para a patologia observada em pacientes com CF avançada.

hG31 P antagoniza a inflamação neutrofílica in vivo

Foi previamente documentada a capacidade de bG31P para bloquear inflamação neutrofílica dérmica induzida por endotoxina e patologia de endotoxemia das vias respirató- rias. Desse modo foi em seguida avaliada a atividade de hG31 P em modelos de endotoxe- mia das vias respiratórias.

Modelo rato da endotoxemia das vias respiratórias

Na medida em que ratos são animais pequenos e isso iria requerer substancialmen- te menos G31P que em porcos da índia (o modelo padrão), foram primeiramente testados os efeitos protetores de hG31P+6 sobre a inflamação neutrofílica em ratos. Nos testes preli- minares foi determinado que a dose LPS de 1,5 mg/kg proporcionou uma apropriada dose de provocação para ratos BALB/c; isto está em absoluto contraste aos porcos da índia, onde 5 µg/kg de LPS induz uma forte neutrofilia, pirexia das vias respiratórias, e uma resposta hemorrágica pleural pulmonar. Num experimento em um único rato (n=5/grupo, aos ratos foram dados salino ou 100, 250, ou 500 µg/kg de hG31P+6 s.c, em seguida uma hora mais tarde eles foram provocados de modo intranasal, sob anestesia leve por gás isofluorano, com LPS (1/5 mg/kg). Após 16 horas, os animais foram eutanasiados usando CO2, em se- guida o sangue, fluido de lavagem alveolar bronquial (BAL), e tecidos pulmonares foram tomados para a analise. Embora um ensaio piloto anterior tenha mostrado que 150 /yg/kg de bG31P teve pouco efeito em um modelo peritonite LPS a hG31P+6 foi altamente eficaz em reduzir as células brancas totais do sangue das vias respiratórias e a infiltração neutrofílica, neutrofilia parenquimal pulmonar, e, a um nível mais baixo e variável, também a aparência das células vermelhas do sangue nas vias respiratórias (Figura 17).

Modelo porco da índia de endotoxemia das vias respiratórias

Foi também empregado um modelo porco da índia da endotoxemia das vias respi- ratórias em três experimentos. Em um, aos animais foram dadas uma dose supra-ótima de endotoxina (50 µg/kg), enquanto que no segundo e terceiro eles foram provocados com a dose LPS padrão de 5 µg/kg, mas com G31P aplicado em níveis variados. Em cada experi- mento, os animais foram provocados de modo intranasal com LPS e tratados s.c. ao mesmo tempo com G31P. Quinze horas mais tarde, os animais foram sacrificados e o sangue peri- férico deles (diferenciais WBC) e respostas pulmonares (números WBS BAL, diferenciais, e níveis de produto de desgranulação neutrofílica, e neutrofilia tecidual) foram avaliados como acima.

Experimento de provocação LPS com alta dose (mórbida)

Em doses de > 50 //g/kg, LPS induz graves danos pulmonares em porcos da índia, incluindo grave hemorragia para dentro das vias respiratórias, embora nessas doses a infil- tração neutrofílica dos pulmões é embotada, relativamente àquela observada com +/- 5 µg/kg LPS. Foi descoberto ainda com provocação de 50 µg/kg LPS, hG31P+6 foi muito eficaz em reduzir a aparência das células vermelhas do sangue (RBC) nas vias respiratórias (Figu- ra 18). O tratamento por G31P também reduziu os números médios de neutrófilos no BAL.

Eficácia de hG3IP e hbG31P na patologia da endotoxemia das vias respiratórias Foi comparada a eficácia terapêutica de hG31P+0, hG31P"1, hG31P+2, e hG31P+6, bem como a quimera bovino-humano bhG31P+6, que aparentou ser altamente eficaz in vitro contra o recrutamento neutrofílico dependente de CXCL8 humano. Novamente, foram apli- cados 250 µg/kg de cada isoforma G31P a grupos de porcos da índia (s.c; n=5), e a provo- cação deles por meio das vias respiratórias com 5 µg/kg E. coli LPS, em seguida 15 h mais tarde os animais foram sacrificados e avaliada a neutrofilia do sangue periférico deles, e a neutrofilia das vias respiratórias, e os níveis de células vermelhas no sangue, bem como os níveis de dois marcadores neutrofílicos granulares, Iactoferrin (um primeiro marcador espe- cífico granular de neutrófilo) e mieloperoxidase (um segundo marcador específico granular de neutrófilo). Nessa dose de 250 µg/kg, cada uma das isoformas de G31P estadas essen- cialmente removeram essencialmente a infiltração de neutrófilos para dentro das vias respi- ratórias (neutrófilos BAL), e reduziram significativamente a aparência de RBC, Iactoferrin e mieloperoxidase no BAL (Figura 19). Dá a impressão de como se hG31P+2 pode ter dada proteção maior que os outros, mas não significativamente senão quando todos os parâme- tros são levados em conta. A quimera bhG31P foi também altamente eficaz nesse sistema em termos de cada um dos parâmetros avaliados.

Testes toxicológicos. A realização de testes preliminares da toxicidade de bG31P foi realizada. A aplica- ção de bG31P (250 //g/kg) a três porcos da índia numa janela de tempo designada para oti- mizar a sensibilização imune (isto é, se as moléculas fossem um imunogênico) não induz quaisquer flutuações observáveis do normal nos níveis séricos do painel de enzimas hepáti- cas e renais. Não foram observadas alterações no comportamento do animal ou quanto ao seu estado de saúde. Além disso, avaliações histológicas preliminares do coração, rim, pul- mão, fígado, intestinos, e desses animais não revelaram evidências de infiltrados inflamató- rios, ou apoptose ou proliferação celular local, ou anormalidades histopatológicas. Foram feitos arranjos quanto a um patologista anatômico para avaliar de forma independente os tecidos. Não se foi capaz de detectar níveis discerníveis de reatividade do anticorpo anti- bG31P no soro desses animais, embora os ensaios empregados não sejam particularmente sensíveis.

De importância para a geração de hG31P ou bG31P que utiliza um sistema de ex- pressão procariótico (isto é, bacteriano), foi descoberto que as preparações são significati- vãmente contaminadas com endotoxina bacteriana. Quando passado sobre colunas comer- ciais de remoção de endotoxina para reduzir a carga de endotoxina do fármaco, foi desco- berto que o uso de colunas de remoção de endotoxina resultou em perdas inaceitavelmente altas de G31P. O tratamento in vivo de porcos da índia com os níveis de endotoxina encon- trados em doses terapêuticas de G31P não imita a atividade terapêutica de G31P.

Estudos de eficácia

Em um experimento foi empregado hG31P+6 a 50 μg/kg (isto é, 20% da dose ótima para bG31P). Porcos da índia foram provocados com 5 μg/kg of LPS e tratados com essa baixa dose de hG31P. Foi descoberto que hG31P+2 e hG31P+6 mantiveram apenas mo- desta eficácia em termos de reduzir a infiltração neutrofílica, mas foi ainda eficaz em reduzir a migração das células vermelhas do sangue para dentro das vias respiratórias (o significa- do dessa descoberta não está inteiramente claro, mas ela sugere o potencial para um outro grau de complexidade nos mecanismos por meio dos quais o fármaco atua).

Em uma outra abordagem in vivo usando o modelo de endotoxemia das vias respi- ratórias, porcos da índia foram provocados com uma dose de LPS conhecida induzir graves hemorragias pulmonares, e tratados com 250 μg/kg hG31P (ver Figura 18). Sabe-se a partir de estudos anteriores que nessa elevada dose de LPS os neutrófilos são apenas fracamen- te alcançados a partir da vasculatura ao interior das vias respiratórias.

Em um experimento foi empregado hG31P+6 a 50 μg/kg (isto é, 20% da dose ótima para bG31 P). Porcos da índia foram provocados com 5 μg/kg of LPS e tratados com essa baixa dose de hG31P. Foi descoberto que hG31P e hG31P mantiveram apenas modesta eficácia em termos de reduzir a infiltração neutrofílica, mas foi ainda eficaz em reduzir a mi- gração das células vermelhas do sangue para dentro das vias respiratórias (o significado dessa descoberta não está inteiramente claro, mas ela sugere o potencial para um outro grau de complexidade nos mecanismos por meio dos quais o fármaco atua).

Em uma outra abordagem in vivo usando o modelo de endotoxemia das vias respi- ratórias, porcos da índia foram provocados com 50 mg/kg de LPS, uma dose conhecida in- duzir graves hemorragias pulmonares, e tratados com 250 /vg/kg hG31P (ver Figura 18).

Sabe-se a partir de estudos anteriores que nessa elevada dose de LPS os neutrófilos são apenas fracamente alcançados a partir da vasculatura ao interior das vias respiratórias. Não obstante, hG31P teve efeitos significativos na redução do alto nível de extravasamento de RBC para dentro das vias respiratórias observados em animais provocados com altas doses de LPS, tratados com salino (Figura 18) e tendeu a reduzir a resposta neutrofílica das vias respiratórias e a mobilização neutrofílica do sangue periférico associada com essa provoca- ção (Fig. 18).

Discussão

Foi demonstrado aqui que CXCL8(3-74)K11R/G31P é um antagonista de alta afinida- de de múltiplas quimiocinas ELR-CXC. In vitro, esse antagonista efetivamente bloqueou a totalidade das atividades quimiotáticas neutrofílicas expressadas em lesões inflamatórias de brandas a intensas dentro de dois compartimentos mucosais (pulmões, e glândulas mamari- as), e bloqueou até 97% das respostas inflamatórias endotoxina-induzidas in vivo. CXCL8 foi identificado o como um mais importante quimioatraente nas amostras de pneumonia e mastite, mas também demonstrou que 35% da atividade nas amostras de pneumonia bacte- riana foi devido aos quimioatraentes não-CXCL8 que foram também eficazmente antagoni- zados por CXCL8(3.74)K11R/G31P. Com base nos estudos das respostas inflamatórias em roedores (Tateda et al., 2001 ; Tsai et al., 2000), gado (Caswell et al., 1997), e humanos (Villard et al., 1995), é claro que essas amostras podem conter numerosas quimiocinas ELR+ CXC (por exemplo, CXCL5, e CXCL8) para as quais CXCL8(3.74)K11R/G31P possui um efei- to antagonístico.

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Tabela 1

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Alinhamento de CXCL8 de mamíferos selecionados e % de identidade com CXCL8 humano

Tabela 2

Resultados da atividade da proteína quimérica (% supressão) <table>table see original document page 45</column></row><table>

Claims

1. Um peptídeo purificado ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoáci- do de: X1ElrCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4 CARACTERIZADO pelo fato de X1l X2, X3 e X4 serem independentemente resíduos de aminoácidos O-IOeX ser qualquer aminoácido.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de X1 ser aminoácidos 0-8.

3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de cada X1 ser aminoácidos 0-6.

4. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de X1 ser selecionado do grupo que consiste de GSK, GST, S, A, T1 K, GSMGGSK, e GSMGGST.

5. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de X1 ser aminoácidos 0.

6. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da con- dição de que a seqüência de aminoácido não ser conforme disposto em qualquer uma da SEQ ID No. 6-9.

7. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma seqüência de aminoácido conforme disposto na SEQ ID No. 13.

8. Um peptídeo purificado ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoáci- do de: X1ElRCX6CIRX1O X11SX13PFX16PKX19I X21EX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX5O PX52X53X54WVQX5BX59V X6iX62FX64KX66X67EX69X70X71X72 (SEQ ID No. 43) CARACTERIZADO pelo fato de X1, X7o, X71 e X72 serem independentemente amino- ácidos 0 — 10; e X6, X1O, Xn,X-i3, X16. X19, X21. X23. X24, X25. X27. X33lX35. Χί2. X43, X45. X47. X5o, X52. X53. X54, X58, X5g, X6I1X62, X64, X66, X67 e X69Serem cada um independentemente selecio- nados do grupo que consiste de: A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R1 S, Τ, V e Y.

9. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de X1 ser aminoácidos 0-8.

10. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de ca- da X1 ser aminoácidos 0-6.

11. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de X1 ser selecionado do grupo que consiste de GSK, GST, S, A, Τ, K, GSMGGSK, e GSMGGST.

12. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de X1 ser aminoácidos 0.

13. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato da condição de que a seqüência de aminoácido não ser conforme disposto em qualquer uma da SEQ ID No. 6-9.

14. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma seqüência de aminoácido conforme disposto na SEQ ID No. 13.

15. Um peptídeo purificado ou isolado compreendendo uma seqüência de aminoá- cido de: X1ElRCX6CIRX1O X11SX13PFX16PKX19I X21EX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX5O PX52X53X54WVQX56X59V X61X62 FX64ΚΧεβΧε?EX69X70X71X72 (SEQ ID No. 4) CARACTERIZADO pelo fato de Xi ser independentemente aminoácidos 0 - 10; X6 ser Q1 E ou L; X10 ser T ou I; X11 ser H ou Y; X13 ser T ou K; X16 ser H ou N; X19 ser F ou Y ou L; X21 ser K ou R; X23 ser L ou M; X24 ser R ou T; X25 ser V ou A; X27 ser D ou E; X33 ser V ou A ou E; X35 ser T ou S; X42 ser S ou V ou T ou F; X43 ser D ou N; X45 ser R ou A ou N ou K ou D; X47 ser L ou V; X50 ser D ou N; X52 ser K ou H; X53 ser E ou Q ou T; X54 ser P ou N ou Q; X58 ser R ou K ou I; X59 ser V ou I; X61 ser E ou Q; X62 ser K ou I ou V ou A; X64 ser L ou V; X66 ser R ou K; X67 ser A ou T; X69 ser S ou N ou K ou G; X70 ser Q ou S ou K ou dele- tado; X71 ser N ou D ou deletado; X72 ser P ou A ou S ou deletado.

16. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de X1 ser aminoácidos 0-8.

17. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de cada X1 ser aminoácidos 0-6.

18. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de X1 ser selecionado do grupo que consiste de: S, A, Τ, K, GSK, GST, GSMGGSK, GSMGGST ou deletado.

19. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato da condição de que a seqüência de aminoácido não ser conforme disposto em qualquer uma da SEQ ID No. 6-9.

20. Peptídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de consistir essencialmente de uma seqüência de aminoácido conforme disposto em qualquer uma da SEQ ID No. 10-41.

21. Uma seqüência isolada de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido de: X1ElrCXCIRX XSXPFXPKXI XEXXXIXSPP HCXNXEIIVK LXXGXEXCLX PXXXWVQXXV XXFXKXXEXX2X3X4 CARACTERIZADA pelo fato de X1, X2, X3 e X4 serem independentemente resíduos de ami- noácidos O-IOeX ser qualquer aminoácido.

22. Seqüência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de X1 ser aminoácidos 0-8.

23. Seqüência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de cada X1 ser aminoácidos 0-6.

24. Seqüência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de X1 ser selecionado do grupo que consiste de GSK, GST, S1 A, Τ, K, GSMGGSK, e GSMGGST.

25. Seqüência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de X1 ser aminoácidos 0.

26. Seqüência de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato da condição de que a seqüência de aminoácido não ser con- forme disposto em qualquer uma da SEQ ID No. 6-9.

27. Seqüência isolada de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nu- cleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido de: X1ElrcX6CIRXio X^SX^PFX-iePKX^I X21EX23X24X25IX27SPP HCX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX50 PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69X7OX71X72 (SEQ ID NO. 43) CARACTERIZADA pelo fato de X1, X70, X71 e X72 serem independentemente aminoácidos 0 — 10; e X6, X1O, X11lX1S. X16. X19, Χ2ι. X23. X24,X25. X27. X33, X35. X42. X43lX45. X47. X50,X52. X53. X54, X58. X59, X61lX62, X<54, X66lX67 e X69Serem cada um independentemente selecionados do grupo que consiste de: A, D, E, F1 G1 Η, I, K, L, Μ, Ν, P, Q, R, S, Τ, V e Y.

28. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fa- to de X1 ser aminoácidos 0-8.

29. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fa- to de cada X1 ser aminoácidos 0-6.

30. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fa- to de X1 ser selecionado do grupo que consiste de GSK, GST, S1 A, Τ, K, GSMGGSK, e GSMGGST.

31. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fa- to de X1 ser aminoácidos 0.

32. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fa- to da condição de que a seqüência de aminoácido não ser conforme disposto em qualquer uma da SEQ ID No. 6-9.

33. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fa- to de codificar uma seqüência de aminoácido conforme disposto na SEQ ID No. 13.

34. Uma seqüência isolada de polinucleotídeo que codifica uma seqüência de ami- noácido de: X1ElRCX6CIRX1O X11SX13PFX16PKX19I X21EX23X24X25IX27SPP HcX33NX35EIIVK LX42X43GX45EX47CLX5O PX52X53X54WVQX58X59V X61X62FX64KX66X67EX69X7OX7IX72 (SEQ ID No. 4) CARACTERIZADA pelo fato de X1 ser independentemente aminoácidos 0 - 10; X6 ser Q, E ou L; X10 ser T ou I; X11 ser H ou Y; X13 ser T ou K; X16 ser H ou N; X19 ser F ou Y ou L; X21 ser K ou R; X23 ser L ou M; X24Ser R ou T; X25 ser V ou A; X27 ser D ou E; X33Ser V ou A ou E; X35 ser T ou S; X42 ser S ou V ou T ou F; X43 ser D ou N; X45 ser R ou A ou N ou K ou D; X47 ser L ou V; X50 ser D ou N; X52 ser K ou H; X53 ser E ou Q ou T; X54Ser P ou N ou Q; X58 ser R ou K ou I; X59 ser V ou I; X61 ser E ou Q; X62 ser K ou I ou V ou A; X64 ser L ou V; X66 ser R ou K; X67 ser A ou T; X69 ser S ou N ou K ou G; X70 ser Q ou S ou K ou dele- tado; X71 ser N ou D ou deletado; X72 ser P ou A ou S ou deletado.

35. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fa- to de Xi ser aminoácidos 0-8.

36. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fa- to de cada X1 ser aminoácidos 0-6.

37. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fa- to de X1 ser selecionado do grupo que consiste de: S, A, Τ, K, GSK, GST, GSMGGSK, GSMGGST ou deletado.

38. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fa- to da condição de que a seqüência de aminoácido não ser conforme disposto em qualquer uma da SEQ ID No. 6 - 9.

39. Um polinucleotídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de consistir essenci- almente de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoácido con- forme disposto na SEQ ID No. 10-41.

40. Uma célula transgênica CARACTERIZADA pelo fato de compreender o polinu- cleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 - 39.

41. Um hospedeiro viral geneticamente engenheirado CARACTERIZADO pelo fato de compreender o polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 - -39.

42. Um vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de compreender o polinu- cleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 - 39, operacionalmente ligado a uma seqüência regulatória que controla a expressão do citado polinucleotídeo em um hospedeiro adequado.

43. Uma célula de hospedeiro CARACTERIZADA pelo fato de compreender o vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 42.

44. Uso do peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 - 20 na fabricação de um medicamento, CARACTERIZADO pelo fato de ser para o tratamento de uma patologia mediada pela quimiocina CXC.

45. Uso, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato do medi- camento ser para o tratamento de uma patologia mediada pela quimiocina ELR-CXC.

46. Uso, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato do medi- camento ser formulado para liberação intravenosa, liberação intradérmica ou liberação sub- cutânea.

47. Uso, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato da patolo- gia mediada pela quimiocina CXC ser selecionada do grupo que consiste de: dano por is- quemia-reperfusão, síndrome de sofrimento respiratório agudo induzido por endotoxemia, glomerulonefrite do tipo imuno complexo, pneumonia bacteriana e mastite.

48. Um método de tratamento de uma patologia mediada pela quimiocina CXC1 CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração a um indivíduo com necessi- dade de tal tratamento de uma quantidade efetiva de um peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 - 20.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato da pa- tologia mediada pela quimiocina CXC ser uma patologia mediada pela quimiocina ELR- CXC.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato da pa- tologia mediada pela quimiocina CXC ser selecionada do grupo que consiste de: dano por isquemia-reperfusão, síndrome de sofrimento respiratório agudo induzido por endotoxemia, glomerulonefrite do tipo imuno complexo, pneumonia bacteriana e mastite.