BRPI0711607A2 - molécula multimérica para modulação da atividade do sistema imunológico humano ou animal, agente de combinação, kit, agente farmacêutico, molécula e uso da mesma - Google Patents

Abstract

MOLéCULA MULTIMéRICA PARA MODULAçãO DA ATIVIDADE DO SISTEMA IMUNOLóGICO HUMANO OU ANIMAL, AGENTE DE COMBINAçãO, KIT, AGENTE FARMACêUTICO, MOLéCULA E USO DA MESMA. A presente invenção refere-se a uma molécula multimérica de ácido nucléico não codificada para modular a atividade do sistema imune animal ou humano, e para um processo de preparação do mesmo, e uma vacina que compreende a molécula multimérica de ácido nucléico não codificada.

Description

MOLÉCULA MULTIMÉRICA PAEA MODULAÇÃO DA ATIVIDADE DO SISTEMA IMUNOLÓGICO HUMANO OU ANIMAL, AGENTE DE COMBINAÇÃO, KIT, AGENTE FARMACÊUTICO, MOLÉCULA E USO DA MESMA DESCRIÇÃO

A invenção refere-se a uma molécula multimérica de ácido nucléico não-codificante para modular a atividade do sistema imunológico humano ou animal, um método para prepará-la e a vacina que contenha a molécula multimérica de ácido nucléico não-codificante.

Embora a resposta imune adaptativa após a seleção de linfócitos específicos ao respectivo patógeno e a expansão clonal e a diferenciação dos mesmos em células efetoras só ocorra de modo retardado (3-5 dias), porém oferencendo uma proteção duradoura contra o respectivo patógeno pela formação de uma "memória imunológica", as células do sistema imunoló- gico inato reconhecem patógenos com base em padrões molecula- res preservados associados a patógenos (PAMPs) dotados de re- ceptores de germes com célula codificada e respondem imedia- tamente. Dentre as reações que sejam diferentes para tipos distintos de células estão a secreção de citoquinas (por e- xemplo, IL-1, IL-6, TNF-α) e quimiocinas (por exemplo, IL-8/CXCL8, MIP-Ια/β, MCP-1) , ativação de mecanismos efetores (fagocitose, descarga respiratória, liberação de substâncias bactericidas ou grânulos líticos), expressão de moléculas co- estimulatórias (CD80, CD86) , bem como maior expressão de mo- léculas de MHC. Por um lado, isto recruta e ativa células e- fetoras capazes de eliminar o patógeno invadido e, por outro, as células do sistema imunológico adaptivo recebem sinais ne- cessários para a sua ativação. Para produzir uma resposta imune mais aprimorada, foram utilizados oligonucleotí deos CpG (CpG ODN) como uma nova classe de moléculas imunomodulatórias. Tais motivos não- metilados de CG ocorrem no DNA bacteriano e representam um "sinal de perigo" ao sistema imunológico. Por serem "padrões moleculares associados a patógenos" (PAMPs), causam princi- palmente a ativação não-especifica do sistema imunológico i- nato (Krieg, Nat. Med 2003, 9: 831-835).

Os ODNs CpG induzem uma resposta imune acentuada por Th1 por meio das citoquinas interleucina-12, interferon-γ e fator- de necrose tumoral α.

As seqüências de ácido nucléico imunoestimulatório (ISS) contendo os supracitados ODNs CpG têm apenas algumas bases de comprimento e não funcionam através da expressão de proteínas codificadas nos mesmos.

As ISS são moléculas de ácido nucléico fechadas covalen- temente. Consistem de oligonucleotídeos, cujas bases podem sofrer emparelhamento parcial com elas mesmas, e uma ou duas voltas que compreendem 30 bases e diversos motivos CG, sendo doravante denominadas moléculas transportadoras.

A forte estimulação da resposta imune celular permite que se exerça influência sobre os ciclos reguladores que, sem intervenção, resultariam em uma atividade imune insatisfató- ria ao paciente.

A modificação de ODNs CpG com espinha dorsal de fosforo- tioato, conforme utilizada na estabilização de "CpG DNA", possui uma série de revezes graves como, em particular, o fa- to de se observar toxicidade [Heikenwalder 2004, Levin 1999], bem como a ligação não-especifica a proteínas [Brown 1994].

Por este motivo, foi desenvolvida uma nova classe de DNA imunoestimulante fechado covalentemente (EP 1196178). Essas moléculas de DNA consistem de duas moléculas de DNA sinteti- zadas quimicamente com uma região autocomplementar nas extre- midades 5' e 3' com superposições palindrômicas, de modo que a ligação das duas moléculas de DNA produz uma molécula fe- chada covalentemente. Estas moléculas de DNA com motivos CG na região não-complementar mostram atividade similar à da CpG ODN (maior expressão da moléculas de superfície CD80, CD40, MHC em células B e secreção de IL-6, IFN-γ, IFN-α, IL-12, TNF-α por PBMC) , porém, comparadas com CpG ODN com espinha dorsal de fosforotioato, possuem uma padrão de expressão re- lativamente distinto e toxicidade significativamente menor em camundongos. No entanto, este DNA imunoestimulador da estado da técnica possui uma série de desvantagens quanto à modula- ção da atividade do sistema imunológico humano ou animal. Nem sempre é possível modular, especialmente disparar, a ativida- de do sistema imunológico humano ou animal ao nível desejado.

Devido ao estado da técnica acima, o objeto da presente invenção é fornecer moléculas de DNA imunoestimuladoras ade- quadas capazes de disparar uma resposta imune mais aprimora- da, um método para a produção da mesma, bem como vacinas con- tendo as referidas moléculas de DNA imunoestimuladoras.

No contexto da presente invenção, imunoestimulação sig- nifica que o mediador e as células efetoras do sistema imuno- lógico, isto é, especialmente os atualmente conhecidos timó- citos com função auxiliar e timócitos citotóxicos, Células B e as chamdaas células NK (natural killer, ou exterminadoras naturais), macrófagos e monócitos, bem como células dendríti- cas e precursores das mesmas, bem como populações de células assumindo funções no sistema imunológico, funções estas que ainda não foram esclarecidas, são estimuladis para mostrar proliferação, migração, diferenciação ou atividade pelo uso de moléculas de ácido nucléico. Imunomodulação significa que, além da estimulação geral no sentido definido acima, há tam- bém uma influência sobre o tipo ou caráter de uma reação imu- ne, seja por envolvimento de uma reação imune no processo de sua origem ou maturação, seja por mudança de uma reação ante- riormente estabelecida em sua natureza.

A presente invenção resolve o objeto ao fornecer uma mo- lécula multimérica de ácido nucléico não-codificante. A molé- cula multimérica pode ser produzida por meio de um sistema que compreende as seguintes etapas:

- fornecimento da seqüência de ácido oligodesoxirri- bonucléico 5'-fosforilado em água,

liofilização até se obter um resíduo seco, seguida de ressuspensão em solução tampão,

adição de ligase DNA T4, formando assim uma mistura de reação, e

incubação da mistura de reação a 37°C por pelo me- nos 30 minutos.

Mais supreendente, a ordem das supramencionadas etapas resulta em uma molécula multimérica mais apropriada para uso na modulação da atividade do sistema imunológico humano ou animal do que as moléculas do estado da técnica. A molécula multimérica no sentido da invenção é essencialmente uma molé- cula de ácido desoxirribonucléico, tendo esta molécula prefe- rencialmente comprimento de pelo menos 100 nucleotideos, mais preferencialmente 200, com especial preferência mais de 300. Embora a patente EP 1 196 178 divulge moléculas que, em vista de sua estrutura do tipo tronco-loop, podendo ser chamadas de monômeros, o método segundo a invenção fornece moléculas onde uma série dessas estruturas monoméricas em tronco-loop se re- únem em multiméricas ou oligoméricas estruturas. Surpreenden- temente, os aglomerados resultantes são eficazes na modulação do sistema imunológico. Supreendeu o fato de que as etapas de processo simples per se e típicas de laboratório mencionadas acima resultaram na formação de estruturas eficazes. Compara- das às estruturas segundo a EP 1 196 178, as moléculas multi- méricas segundo a invenção representam complexos moleculares maiores.

Em uma modalidade preferida da invenção, o aglomerado oligomérico ou multimérico, isto é, a molécula segundo a in- venção, é caracterizado pelo fato de que a seqüência de ácido oligodesoxirribonucléico compreende as seqüências abaixo:

a) GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC ou

b) ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA, ou

c) compreende uma seqüência de ácido oligodesoxirribo- nucléico com a seqüência de base AACG TTCTTCGGGG CGTT,

d) a referida seqüência de ácido oligodesoxirribonu- cléico com comprimento de 40 a 1.600 nucleotideos.

Os aglomerados multiméricos no sentido da invenção, que incluem as seqüências preferidas, são particularmente apro- priados para estimular a atividade do sistema imunológico em animais domésticos e seres humanos.

Em uma modalidade preferida, a seqüência de base segundo a característica c) está inclusa na seqüência CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC. Surpreendentemente, a presença da seqüência acima resulta em um efeito particularmente alto da molécula, o qual, no sentido da invenção, é entendido como a ativação do sistema imunológico.

Outra modalidade preferida da invenção tem por objetivo o fato de a molécula compreender uma cadeia parcialmente uni- filamentar e fechada covalentemente de resíduos de desoxirri- bonucleosídeos. Ela é a cadeia de resíduos de desoxirribonu- cleosídeos parcialmente monofilamentar, fechada covalentemen- te dentro da estrutura oligomérica ou polimérica montada da molécula que é responsável pela atividade eficaz prolongada da molécula em um organismo-alvo onde for incorporada.

Outra modalidade preferida da invenção tem por objeto o fato de a molécula compreender a seqüência de base N1 N2 CGN3 N4 onde N1N2 é um elemento do grupo de GT, GG, GA, AT ou AA, N3N4 é um elemento do grupo de CT ou TT, e C é desoxicitosi- na, G é desoxiguanosina, Δ é desoxiadenosina, e T é desoxiti- midina.

Uma modalidade particularmente preferida tem por objeti- vo o fato de a seqüência de base N1N2CGN3N4 estar situada na região unifilamentar da cadeia fechada de resíduos de deso- xirribonucleosídeos. São especialmente essas moléculas prefe- ridas que mostram atividade altamente eficaz na estimulação do sistema imunológico.

A invenção também se refere à inventive molécula ligada covalentemente a uma série de substituintes, sendo estes pre- ferencialmente peptídeos, proteínas, sacarídeos, estruturas antigênicas, moléculas de DNA e/ou RNA.

A invenção refere-se também a um agente de combinação compreendendo pelo menos uma molécula segundo a invenção e um agente quimioterapêutico. Surpreendentemente, a estimulação muito elevada do sistema imunológico pela molécula da inven- ção pode melhorar ainda mais quando o agente da invenção é combinado com um agente quimioterapêutico bastante conhecido e o agente de combinação é empregado contra tumores. O agente de combinação no sentido da invenção também pode ser forneci- do sob a forma de um kit onde o agente da invenção e o agente quimioterapêutico do estado da técnica estão presentes sepa- radamente. Portanto, em modalidades preferidas os pelo menos dois componentes do kit podem ser aplicados ao mesmo tempo ou ou a intervalos determinados. Por exemplo, a administração do agente de combinação segundo a invenção pode ativar o sistema imunológico de tal maneira que um agente quimioterapêutico aplicado posteriormente pode desenvolver a sua atividade de maneira especialmente eficaz. Naturalmente, também é possível aplicar o agente quimioterapêutico primeiro e depois adminis- trar a molécula da invenção ao organismo humano ou animal ou a intervalos determinados. Para determinados tumores, dá-se preferência à administração simultânea da molécula segundo a invenção e do agente quimioterapêutico.

Em uma modalidade preferida da invenção, o agente quimi- oterapêutico é selecionado do grupo que compreende anticor- pos, agentes alquilantes, análogos de platina, agentes inter- caladores, antibióticos, inibidores de mitose, taxanos, ini- bidores de topoisomerase, antimetabólitos e/ou L- asparaginase, hidroxicarbamida, mitotano e/ou amanitins.

Em uma modalidade preferida da invenção, os agentes al- quilantes são selecionados do grupo que compreende

- derivados mostarda de nitrogênio, especialmente ciclofosfamida,

- ifosfamida,

- trofosfamida,

- melfalan e/ou

- clorambucil

- alquilsulfonatos, especialmente

- busulfan e/ou

- treosulfan nitrosouréias, especialmente carmustina, lomustina, nimustina, estramustina e/ou estreptozotocina procarbazina e dacarbazina, temozolomida e/ou tiotepa.

Os agentes alquilantes possuem um efeito especialmente elevado sobre tumores, inibindo o seu crescimento.

Em uma modalidade preferida da invenção, os análogos de platina são selecionados do grupo que compreende:

- cisplatina, - carboplatina e/ou - oxaliplatina.

Outra modalidade preferida da invenção tem por objetivo o fato de os agentes intercaladores serem selecionados do grupo que compreende:

- antraciclinas, especialmente - doxorrubicina (adriamicina), - daunorrubicina, - epirrubicina e/ou - idarrubicina, - mitoxantrona, - amsacrina e/ou - doxifluridina.

Outra modalidade preferida da invenção tem por objetivo o fato de os antibióticos serem selecionados do grupo que compreende:

- bleomicina, - actinomicina D (dactinomicina) e/ou - mitomicina.

Em outra modalidade preferida da invenção, mostra-se vantajoso selecinar os inibidores de mitose do grupo que com- preende : alcalóides de Vinca rosea, especialmente vinorrelbina, vincristina (oncovina), vinblastina e/ou - vindesina.

Em outra modalidade particularmente preferida da inven- ção, os taxanos são selecionados do grupo que compreende: paclitaxel e/ou docetaxel.

Além disso, pode-se preferir selecionar os inibidores de

topoisomerase do grupo que compreende:

inibidores de topoisomerase I, especialmente camptotecina, topotecano e/ou - irinotecano e/ou

inibidores de topoisomerase II, especialmente

etoposida

teniposida.

Conta com igual preferência o fato de os antimetabólitos 20 em uma configuração especial da invenção serem selecionados do grupo que compreende:

antagonista de ácido fólicos, especialmente metotrexato,

análogos de pirimidina, especialmente - 5-fluorouracil,

capecitabina,

citosina arabinosida (citarabina) e/ou - gemcitabine,

análogos de purina, especialmente - 6-tioguanina,

pentostatina, azatioprina,6-mercaptopurina, fludarabina e/ou - cladribina.

A invenção refere-se também a um kit compreendendo a mo- lécula da invenção e o agente quimioterapêutico, opcionalmen- te em conjunto com informações relativas à combinação dos conteúdos do kit. Conforme abordado acima, a invenção refere- se também a um agente farmacêutico compreendendo a molécula da invenção ou o agente de combinação, opcionalmente em con- junto com um veiculo tolerável farmaceuticamente.

Além disso, a invenção refere-se ao uso da molécula, do agente de combinação ou do agente farmacêutico referidos para a produção de um agente para modular o sistema imunológico de seres humanos ou animais ou a atividade deste sistema imuno- lógico. Entende-se por modulação do sistema imunológico huma- no ou animal qualquer influência sobre o sistema imunológico que resulte em um efeito inibidor do sistema imunológico em tumores ou cânceres. A modulação da atividade do sistema imu- nológico pode ser entendida de maneira sinônima ou descreve atividades do sistema imunológico bem conhecidas aos versados na técnica, que são dirigidas contra tumores e, surpreenden- temente, com maior potência pelos agentes segundo a invenção. Mais especificamente, a modulação vem a ser a estimulação ou um aumento dos efeitos do sistema imunológico ou do próprio sistema imunológico. Portanto, em uma modalidade preferida, os agentes segundo a invenção podem ser utilizados para esti- mular a resposta imune mediada por célula T, mas também a resposta imune independente de célula T. Em uma modalidade preferida da invenção, este processo pode compreender a pro- liferação de células B ou a ativação de células B.

Em uma modalidade particularmente preferida, modular a atividade do sistema imunológico gera uma estimulação de tal maneira que se secretam citoquinas, ou as mesmas são secreta- das a niveis mais elevados. Pode ser particularmente preferí- vel utilizar a molécula da invenção ou o agente de combinação segundo a invenção como adjuvante na vacinação terapêutica ou profilática. De maneira particularmente eficaz, os agentes da invenção podem ser utilizados no tratamento de transtornos de crescimento celular, e em uma modalidade preferida, o trans- torno do crescimento celular vem a ser um tumor. Em uma moda- lidade preferida, o tumor é uma doença selecionada do grupo que compreende tumores da região otorrinolaringológica, den- tre os quais tumores' do nariz interno, seio nasal, nasofarin- ge, lábios, cavidade oral, orofaringe, laringe, hipofaringe, ouvido, glândulas salivares, e paragangliomas, tumores dos pulmões compreendendo carcinomas não-parvicelulares, carcino- mas brônquicos parvicelulares, tumores de mediastino, tumores do trato gastrointestinal, compreendendo tumores do esôfago, estômago, pâncreas, fígado, vesícula biliar e trato biliar, intestino delgado, cólon e carcinomas retais e carcinomas a- nais, tumores urogenitais compreendendo tumores dos rins, u- reter, bexiga, próstata, uretra, pênis e testículos, tumores ginecológicos compreendendo tumores do colo do útero, vagina, vulva, câncer uterino, doença trofoblástica maligna, carcino- ma ovariano, tumores do tubo uterino (Tuba Faloppii), tumores da cavidade abdominal, carcinomas mamários, tumores dos ór- gãos endócrinos, compreendendo tumores of the tireóide, para- tireóide, córtex adrenal, tumores endócrinos do pâncreas , tumores carcinóides e síndrome carcinóide, neoplasias endó- crinas múltiplas, sarcomas ósseos e de tecidos moles, mesote- liomas, tumores de pele, melanomas dentre os quais melanomas cutâneos e intraoculares, tumores do sistema nervoso central, tumores durante a infância, dentre os quais retinoblastoma, Tumor de Wilms, neurofibromatose, neuroblastoma, Família de tumores do sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, linfomas den- tre os quais linfomas não-Hodgkin, linfomas cutâneos de célu- la T, linfomas primários do sistema nervoso central, Doença de Hodgkin, leucemias dentre as quais leucemias agudas, Ieu- cemidas mielóides e linfáticas crônicas, neoplasmas de célula do plasma, síndromes de mielodisplasia, síndromes paraneo- plásticas, metástases com tumor primário desconhecido (Sín- drome de CUP), carcinomatose peritoneal, males relacionados à imunossupressão dentre os quais Os ligados à AIDS, como Sar- coma de Kaposi, linfomas associados à AIDS, linfomas do sis- tema nervoso central associados à AIDS, doença de Hodgkin as- sociada à AIDS, e tumores anogenitais associados à AIDS, ma- les relacionados a transplantes, tumores em metástase dentre os quais metástases cerebrais, metástases pulmonares, metás- tases hepáticas-, metástases ósseas, metástases pleurais e pe- ricárdicas, e ascites malignas.

Sem pretender ser restritiva, a invenção será explicada com mais detalhes abaixo, com referência aos exemplos.

Os equipamentos, materiais e soluções necessários para os métodos individuais são representados sob o método respec- tivo. A tabela a seguir inclui uma relação dos equipamentos e materiais que foram utilizados e não pretencem a um método especifico, bem como produtos químicos e soluções exigidos para a preparação das soluções:

Tabela: Equipamentos, materiais, produtos químicos e so- luções empregados

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ODNs e dSLIMs utilizados, seleção de seqüência utilizan- do mfold

Muitas das seqüências utilizadas para produzir molécu- las-modelo para uma investigação da estrutura de dSLIM foram construídas utilizando-se o software "mfold", encontrado na página http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold. Trata- se de um programa usado para prever a estrutura secundária de ácido nucléicos com base em dados termodinâmicos [Zuker, 2003]. As seqüências do DNA de 58 nucleotídeos de comprimen- to, doravante denominada 0DN, utilizadas para sintetizar dS- LIM foram introduzidas como DNA linear em "DNA mfold", utili- zando-se ajustes padrão e os seguintes parâmetros: temperatu- ra de 37°C; concentração iônica de 150 mM Na+ e 0, 5 mM Mg2 + , correção oligomérica.

A seqüência de dSLIM-30Ll foi utilizada como base para as moléculas-modelo a fim de investigar a formação de estru- turas G. Inicialmente, as últimas foram modificadas de tal maneira que consecutivos resíduos de guanina não mais foram encontrados, embora retendo a proportion de GC da região com- plementar (doravante denominada de "tronco") . A seqüência da região não-complementar (doravante denominada "loop") foi mo- dificada de tal maneira que o emparelhamento da base Watson- Crick, preferencialmente, não seria possível e nenhum resíduo consecutivo de guanina estaria presente. Como resultado da modificação do loop, os motivos CG situados nesta região fo- ram modificados em comparação com 30L1. O ODN modelo constru- ído desta forma será doravante denominado- KG. 0 GL ODN cor- responde ao KG com a seqüência poli (G) no loop, a qual, em contraste àquela a ocorrer em 30L1, não está situada nos mo- tivos CG. 0 MS ODN corresponde à molécula 30L1 inicial, porém contendo resíduos adicionais de guanina no tronco. 0 GS, GLS e ML ODNs incluem combinações de tronco e loop dos ODNs su- pracitados .

As moléculas no30Ll e noGL, cada uma com CG substituída

por TG, foram utilizadas como moléculas de controle para a dependênciado efeito dos motivos CG observados.

A molécula dSLIM-60Ll foi utilizada como molécula-modelo de um dSLIM-30Ll "dimérico", tal como é possível ser formada por concatemerização. Isto consiste de duas ODNs parcialmente complementares, ainda que não-autocomplementares (60Llforw e 60Llrev), que, após a hibridização, possuem 5' de projeção em relação à outra ODN (30L1-AGGG) com a correspondente projeção de 3' e as regiões 5' e 3' autocomplementares podem ser Iiga- dos. As seqüências das voltas dos 3 ODNs acima correspondem às do 30L1.

Frações de dSLIM-30Ll obtidadas ao se separar uma grande quantidade de dSLIM-30Ll mediante separação por gradiente contínuo de NaCl em HPLC foram fornecidas por Melanie Rothe (Mologen AG).

Os ODNs utilizados neste trabalho foram adquiridos da TIB Molbiol (Berlin) com 5' de fosforilação (exceções: M362,2006) , dissolvidos em H2O a uma concentração de 3 g/l após Purificação de HLC: Tabela: ODNs utilizados (fosforotionato: letras miúdas)

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Devido à orientação dos seus quatro locais ligados em ponte de H, a guanina é capaz de formar um quarteto de base cíclica com 8 pontes de H (quarteto G) via emparelhamento das bases guanina-guanina. A seqüência de DNA que contém uma sé- rie de nucleotídeos guanina consecutivas é, portanto, capaz de formar uma estrutura helicoidal tetramérica em que as ba- ses guanina mostram um alto nível de planaridade com especí- fica interação de empilhamento. Dependendo da posição, do nú- mero e da distribuição de nucleotídeos de guanina na seqüên- cia, é possível a formação de diversas estruturas G, as quais se podem dividir em três grupos: DNA G2' (tetraplexes bimo- leculares paralelos ou antiparalelos), DNA G4' (tetraplexes antiparalelos unimoleculares) ou DNA G4 (tetraplexes antipa- ralelos tetramoleculares). O DNA G4 é capaz de formar nanoes- truturas automontáveis, os chamados fios G. Além do número disponível de resíduos de guanina e a sua disposição e em torno do emparelhamento da base de Watson-Crick, a formação e a estabilidade das estruturas G, esta última sendo por vezes muito elevada, dependem da temperatura, da concentração de DNA e da presença de diversos cátions (ex., Na+, K+, Mg2+, Ca2+). Por exemplo, foram identificadas estruturas G4 nas se- qüências de telômero, regiões de troca de imunoglobulina e DNA de HIV [Sen 1992, Marsh 1994, 1995].

Em seguida, várias moléculas monoméricas e multiméricas dotadas de combinações de várias seqüências de Ioop e tronco foram produzidas. Três seqüências de Ioop e três seqüências de tronco incluindo motivos poli (G) longos, curtos ou nenhum motivo foram utilizadas de cada vez, influenciando assim a capacidade de formar estruturas G. Estruturas G estáveis po- dem ser formadas, nas condições adequadas, em ODNs curtos (12mer) com apenas quatro bases de guanina consecutivas. Em ODNs mais longos são necessários motivos mais longos, uma vez que a probabilidade de formação de estruturas G estáveis cer- tamente se correlaciona com a proporção das bases de guanina que contribuem para a seqüência global [Sen, 1992]. Moléculas adicionais contendo longos motivos poli (G) mostram maior formação de moléculas multiméricas. Além disso, os perfis de eluição destas moléculas diferem daquelas que não contêm motivos poli (G) longos no fato de que surgem dois picos, sendo que o pico de eluição em maior volume correspon- de à distribuição de DNA encontradas na região superior dos géis de agarose. A mudança mais notável foi observada para o GL, a molécula cujos motivos poli (G) estão localizados no Io- op. Aqui, dois picos nitidamente separados poderiam ser dis- tinguidos no perfil de eluição, onde o pico em maior volume de eluição apresentou maior intensidade do que em menor volu- me de eluição. Para GL, a quantidade de DNA difusamente dis- persa no gel acima da faixa monomérica foi relativamente ele- vada, estendendo-se em sua distribuição para a bolsa do gel. Estas observações permitem concluir que uma quantidade rela- tivamente elevada de DNA está presente em complexos multimé- ricos. A distribuição dos picos no perfil de eluição de HPLC e a distribuição do DNA após a eletroforese em gel de agarose foram semelhantes aos constructos contendo motivos poli (G) no tronco (GS, MS). Eles apresentaram um segundo pico pequeno em volumes mais elevados no perfil de eluição e uma distribuição de DNA indiscreta de fraca visibilidade acima da faixa mono- mérica do gel de agarose. Com relação ao padrão de pico (HPLC) e à distribuição de DNA (gel de agarose) , o comporta- mento de migração em HPLC e em gel de agarose observado para moléculas com motivos poli (G) em Ioop e troncos (GLS) foi en- tre GL e GS e MS. Dois picos distintos de mesma altura foram observados no perfil de eluição, e a quantidade de DNA dis- tribuída na região superior do gel foi ligeiramente superior ao de moléculas com motivos poli (G) no tronco (GS e MS), mas inferior para GL. Assim sendo, a formação de moléculas multi- méricas deveria ser favorecida especialmente quando os moti- vos poli (G) estão situados no loop, como é o caso do GL. A razão para isso é a falta de competição entre a formação de pares de base Watson-Crick e a formação de estruturas G em um loop monofilamentar. Esta pré-condição é também indicada na molécula GLS. Neste caso, porém, os motivos poli (G) como pos- síveis parceiros de interação estão presentes tanto no tronco quanto no loop. Daí é possível haver a formação de estruturas G2 intramoleculares, isto é, procedendo em grande parte de maneira independente da concentração. Como resultado, eles representam uma competição à formação de estruturas G inter- moleculares, de modo que a formação de complexos de alto peso molecular é reduzida quando comparada com GL. A menor tendên- cia de formação de complexos de alto peso molecular foi ob- servada em moléculas com motivos poli (G) no tronco, embora os motivos poli (G), neste caso, eram mais do que aqueles em GL.

Dadas quantidades iguais de matéria-prima, as caracte- rísticas acima descritas não foram observadas na molécula mo- nomérica 30L1, que, tal como GLS, possui motivos poli (G) no tronco e no loop. A razão para isso poderia ser que, por um lado, os motivos poli (G) nesta molécula são mais curtos do que os das moléculas multiméricas. Por outro lado, a previsão de estrutura de "DNA mfold" indica uma tendência maior de formar pares de base Watson-Crick no loop de modo que a pro- babilidade de formação da estrutura G de deve ser ainda mais reduzida. No entanto, como as moléculas multiméricas longas com motivos poli (G) , a fração F4 obtida a partir de uma gran- de quantidade de 30L1, através da separação por HPLC mostra também a supracitada distribuição difusa de DNA na região su- perior do gel e no restante do DNA nos bolsos de gel em ele- troforese de gel de poliacrilamida (vide fig. 3.1.9). Obvia- mente, a proporção de complexos de alto peso molecular das estruturas G é tão baixa para 30L1 que a detecção destes só é possível quando se utilizam maiores quantidades de matéria- prima.

Em contraste, as parcelas de DNA no bolso não desapare- cem completamente para GL e GLS, que têm motivos poli (G) no loop, sendo possível reconhecer um padrão de faixa regular adicional. Isto provavelmente se deve a dímeros ou tetrâmeros ou ODNs não-degradados que permaneceram nos agregados que fo- ram dissolvidos dos mesmos por desnaturação e continuam Iiga- dos entre si através da interação guanina-guanina.

As unidades experimentais demonstram que as moléculas multiméricas com longos motivos poli (G) são de fato formadas por estruturas G. Além da aparência de uma distribuição in- discreta de DNA na região superior do gel, essas propriedades incluem o surgimento de faixas regulares após a desnaturação, conforme se observa para GL e GLS em um gel de poliacrilami- da.

Em contraste com a faixa no terço superior do gel, que foi isolado a partir de 30L1, as faixas observadas para KG e ML já não eram reconhecíveis após a desnaturação (vide fig.3.1.6). Estas faixas são, portanto, dímeros que são formados através de interações de pares de base entre duas moléculas monoméricas e, como conseqüência, podem ser facilmente sepa- rados por meio de desnaturação térmica. A aparência preferida dos mesmos em KG ML pode ser devida à sua seqüência de loop comum, o que favorece a interação de duas moléculas.

O fraccionamento por HPLC de uma grande quantidade de molécula 30L1 rendeu 4 frações que apresentaram comportamento de migração bastante diferente no gel. Concentrar as únicas frações permitiu que as mesmas se dissolvessem separadamente, de forma que uma série de faixas anteriormente irreconhecí- veis se tornou visível no gel. O comportamento de migração da primeira fração correspondeu às duas conformações monoméricas observadas, sendo que a da segunda fração correspondia a uma mistura contínua de ambas as conformações, onde a conformação aberta prevaleceu após a desnaturação dessa fração, e a da terceira fração correspondia principalmente a uma molécula dimérica conforme descrita acima. Tendo frações de DNA clara- mente visíveis que permaneceram no bolso de gel, a quarta fração foi similar a MS no seu comportamento de migração.

A passagem da faixa correspondente a um dímero de 30L1 e da fração 3 de 30L1 no meio de cultura celular, em comparação com a sua distância de migração em gel observadas na água, foi notável. Uma comparação com gel corado com Coomassie mos- tra que a faixa correspondente em meio é executada ao mesmo nível com a faixa de proteína inferior. Portanto, pode-se presumir que a passagem da faixa é causada pela ligação da molécula dimérica com a proteína.

O comportamento de migração das faixas correspondentes às conformações monoméricas sequer mudou pela adição do meio, foi apenas com a GL que se observou um aumento da faixa cor- respondente à conformação aberta. Após a incubação a 370C por cinco horas, uma distribuição difusa do DNA entre as duas faixas foi vista anteriormente foi observada em KG e 30L1, onde a intensidade da faixa correspondente à conformação a- berta diminiuiu para KG. Sob as condições selecionadas, a conformação aberta é ligeiramente favorecida em comparação com a solução aquosa. Após 27 h de incubação em meio, as in- tensidades de DNA observadas para ML e GL caíram significati- vamente, e mesmo com KG foi apenas a faixa menor que era vi- sível com intensidade reduzida, embora se tenha observado a menor queda de intensidade com 30L1. Uma possível explicação seria que as conformações abertas se degradam mais facilmente do que as conformações de dois filamentos.

O efeito imunoestimulatório de várias moléculas monomé- ricas e multiméricas estava para ser investigado pela deter- minação das concentrações de IFN-γ, IFN-α e IL-6 nos sobrena- dantes de PBMC de doações de sangue humano após estimulação com estas moléculas.

O sistema de ensaio utilizado para determinar a ativida- de das moléculas de PBMC usando doações de sangue humano é um sistema altamente complexo em que as diferentes células podem influenciar-se mutuamente através da interação e/ou secreção de citoquina de modo que a atribuição de uma resposta obser- vada ao tipo de célula ou um caminho de reação especifico é quase impossível. Além disso, existem grandes variações entre os resultados de cada um dos doadores, para que um maior nú- mero de testes independentes são obrigatórios. A vantagem deste sistema é que ele teste mais se aproxima da situação in vivo entre todos os possíveis bem estabelecidos sistemas in vitro.

Os testes mostraram que a detecção de ativação de célu- las a ser utilizado está sujeita a uma forte influência por parte do cultura de células IL-8/CXCL8 condições, porque tam- bém é secretada em resposta ao estresse celular fatores de indução. Em particular, isto se torna evidente, tendo em con- ta os resultados obtidos com células cujo meio não foi alte- rado antes de estimulação (vide fig. 3.3.1) e onde uma eleva- da concentração de IL-8/CXCL8 foi detectada ainda em células não estimuladas. A proporção determinada da concentração de quimiocina medida em células não estimuladas e a concentração de quimiocina detectada em células estimuladas foi 1,3 e, portanto, muito baixa em comparação com células onde o meio havia sido mudado. Este último tinha uma proporção de 2,3. Portanto, para obter resultados tão informativos quanto pos- sível, a cultura de células sob condições amplamente livres de estresse celular é particularmente importante neste teste. Presumivelmente, o estresse celular é a razão pela qual os resultados obtidos com células estimuladas 24 h após a semea- dura não foram tão claros como os obtidos com células culti- vadas de confluência. A passagem de células e técnicas de cultura celular associadas geram estresse celular elevado.

Tal como observado nos testes relativos a dependência em relação ao tempo de estimulação (vide Fig. 3.3.2), uma dife- rença na quantidade de quimiocinas secretada entre células estimuladas e não estimuladas poderiam ser detectadas somente após 6 horas. A quantidade de IL 8/CXCL8 aumento entre 6 ho- ras e às 24 h, enquanto o aumento observado a partir de 24 h às 48 h foi pequeno.

As atividades das moléculas no sistema de teste foram investigadas nos dois testes onde se observaram diferenças entre as moléculas individuais empregadas (vide Fig. 3.3.3).

A secreção de IL-8/CXCL8 mais alta nos testes foi indu- zida pela estimulação com GL, que foi um pouco maior do que aquela induzida por ODN 2006. Os montantes de IL-8/CXCL8 me- didos após a estimulação com KG e 30L1 foram um pouco mais reduzidos, onde KG mostrou uma atividade um pouco maior se comparada com 30L1. As diferenças observadas na atividade destas moléculas monoméricas e multiméricas diferentes podem dever-se a diferenças estruturais observadas. Assim, é possí- vel demonstrar que o KG e GL, em comparação com 30L1, tendem a possuir uma conformação aberta da região de Ioop com moti- vos CG, de modo que a sua forma de filamento único seja pre- ferida. Como demonstrado por Rutz e outros por meio de resso- nância superficial com plasmon, DNA de filamento único liga- se a TLR9 com maior afinidade do que DNA com dois filamentos [Rutz, 2004], o que poderia ser a razão para atividade rela- tivamente maior do KG e GL, em comparação com 30L1. No entan- to, os motivos CG são diferentes e até mesmo em 30L1 KG/GL, de modo que a atividade distinta também poderia ser devida à afinidade diferente dos diferentes motivos CG para o recep- tor .

GL, a molécula com a maior potência de formar agregados, apresentou a maior atividade entre as moléculas de teste em ambos os ensaios, o que é, possivelmente devido a um cruza- mento mais forte dos receptores pelos complexos de alto peso molecular. No entanto, o reforço da atividade de GL nos tes- tes realizados com PBMC não foi observado. Por outro lado, talvez seja possível que outros receptores de reconhecimento de padrão presentes no sistema mais complexo de PBMC estejam envolvidos na atividade imunomoduladora de moléculas monomé- ricas e multiméricas que seja observado nele, que reconhece outras características estruturais das moléculas. Assim, por exemplo, é possível que o reconhecimento também se dê através de outros receptores de ácido nucléico específicos, tais como TLR8 ou TLR7, produzindo assim um efeito modulador ou coope- rativo.

Em conclusão, pode-se afirmar especificamente que a pre- sença de motivos poli(G) no Ioop de moléculas monoméricas fa- vorece a formação de complexos multiméricos. Além disso, es- tes complexos possuem alta estabilidade à desnaturação térmi- ca.

Para identificar as diferenças dos efeitos imunomodula- dores de diferentes constructos, estes últimos foram emprega- dos em experimentos com estimulação PBMC.

Os resultados mostram que as moléculas multiméricas têm atividade particularmente elevada.

Determinação da concentração de DNA

A concentração dos ODNs e moléculas monoméricas de DNA foi determinada pela medição da absorção a 260°nm (A260). São os anéis aromáticos das bases de ácido nucléico os responsá- veis pela absorção a 260°nm, tendo as bases individuais coe- ficientes distintos de absorção molar ε (A> G> T> C). Como resultado de interações cromóforo-cromóforo, ácidos nucléicos de dois filamentos têm menor absorção do que ácidos nucléicos de filamento único (efeito hipocrômico).

Para determinar a concentração, o volume correspondente de solução de DNA a ser determinado foi inicialmente diluído em um recipiente Eppendorf com tampão TE em um volume final de 300° μl (ODN 1:200, dSLIM 1:100). A solução de DNA foi pos- teriormente transferida para uma cubeta de quartzo, sendo a absorção a 260°nm medida em um fotômetro em contraste com o tampão TE. A concentração foi calculada a partir da absorção medido de acordo com a equação:

c (μg/ml) = A260 x fator de diluição x fator de conver- são

O fator de conversão é um valor aproximado e estimado em 50 μg°/ml de DNA de filamento duplo e 33°μg/ml para DNA de fi- lamento único. Devido à quota de regiões de filamento duplo no ODN e moléculas monoméricas de DNA, utiliza-se um fator de conversão padronizado de 50°pg/ml. Determinações duplas dilu- ições separadas foram realizadas de cada vez, cujo valor mé- dio foi calculado.

Preparação das moléculas de DNA monoméricas

Para o preparo de moléculas monoméricas de DNA, materi- ais estéreis (descartáveis) e tampões frescos ou esteriliza- dos-filtrados estocados a -20°C foram utilizados de forma a evitar a contaminação por bactérias, uma vez que os resulta- dos da estimulação podem ser falsificados, mesmo por pequenas quantidades de endotoxinas.

O primeiro passo na produção de moléculas de DNA é a li- gação de dois ODNs utilizando-se ligase T4 DNA. A T4 DNA Ii- gase catalisa a formação de uma ligação de fosfodiéster entre terminações 5'-fosfato e 3'-OH em DNA de filamento duplo ou RNA com extremidades cegas ou coesivas. Além disso, é capaz de consertar quebras de filamento único em DNA de filamento duplo, RNA ou híbridos de DNA-RNA.

A ligação dos dois ODNs se dá entre a projeção de 5'- fosfato de um ODN e a extremidade 3' do outro ODN, formando assim uma molécula circular. A reação também produz as molé- culas de DNA multiméricas de acordo com a invenção. A quantidade de ODN inicial para a preparação das moléculas foi de 500 a 1000 μg. Para a ligação, os ODNs foram emprega- dos em uma concentração de 0,55 g/l em 1 χ tampão de ligase. Para este fim, eles foram diluídos com Aqua rinse e a quanti- dade correspondente de 10 χ tampão de ligase foi adicionada. Após uma mistura completa, T4 DNA ligase foi adicionado em uma quantidade tal que uma proporção de 0,01 U /pg de DNA es- tava presente. A lote da ligação foi incubado em banho-maria a 37 °C por 15 a 24 h.

Digestão de T7 foi utilizada para degradar ODNs não- ligados. T7 DNA polimerase é uma DNA polimerase dependente de modelo que catalisa a síntese de DNA na direção 5'-3', assim como possui atividade de exonuclease 3'-5' em DNA de filamen- to único e duplo, sendo assim adequadas para a degradação de ODNs não-ligados. O sucesso da ligação foi analisado antes de se efetuar a digestão de T7. Para este fim, 0,3 yg de ODNs, lote de de li- gação e uma digestão de teste de T7 por vez foram separados em um gel agarose a 3% (vide 2.4.1). Para a digestão de teste de T7, um excedente de DNA polimerase T7 na proporção de 10 U/1.1 pg de DNA foi empregado em um volume de 21 μΐ. A reação ocorreu por lha 37°C e foi encerrada por aquecimento a 70°C durante 10 minutos.

Para a digestão de T7, o lote foi diluído com Aqua rinse e uma quantidade correspondente a 10 χ tampão de ligase, a fim de que o DNA estivesse presente numa concentração de 0,3 g/l em 1 χ tampão de ligase. A quantidade de DNA polimerase T7 necessária para obter uma proporção de 0,03 U/yg de DNA foi adicionada. O lote foi incubado em banho-maria a 370C por 15 a 24 h. O sucesso da reação foi analisado por separação de 0,3 pg de lote de ligação juntamente com 0,3 pg e 0,9 pg do lote de digestão de T7 em um gel de agarose a 3%.

Purificação das moléculas de acordo com a invenção A purificação foi efetuada utilizando cromatografia de troca aniônica. O princípio deste método é baseado na presen- ça de grupos carregados positivamente em uma matriz porosa (fase estacionária), que interage com grupos fosfato de áci- dos nucléicos carregados negativamente com mais de pH 2, de modo que estes últimos estão vinculados à fase estacionária. A força da interação depende do valor do pH, a força iônica da fase móvel e as cargas negativas presentes na molécula. Moléculas sem carga produzem uma interação nula ou apenas fraca com a fase estacionária, sendo rapidamente eluídas com uma fase móvel de baixa força iônica. Ao aumentar a força iô- nica da fase móvel, as moléculas vinculadas à fase estacioná- ria são deslocadas a partir da coluna. Como resultado de uma maior interação com a fase estacionária, ácidos nucléicos maiores são eluídos mais tarde do que os menores [Lottspeich,1998; Mülhardt, 2003]. Fractogel-DMAE, uma resina polimérica com grupos dimeti- laminoetila, foi utilizada como fase estacionária na purifi- cação. Para a separação, utilizou-se um gradiente progressivo de NaCl (0%, 50%, 100% 1 M NaCl).

Antes de iniciada a purificação, todas as saídas e en- tradas do aparelho HPLC, preenchidos com 20% de etanol quando fora de operação, inicialmente são lavadas com Aqua rinse, sendo a coluna embalada. Para este fim, 1,6 a 1,8 ml de DMAE foi colocado na coluna, cheio com água até a borda, e a colu- na foi agitada para garantir a uniformidade de distribuição. Posteriormente, a coluna foi conectada ao aparelho HPLC à ma- neira de uma bolha de ar livre. A coluna foi lavada com uma vazão de 1 ml/min até que o material nela contido estivesse completamente decantado. A parte superior do pistão foi para- fusada sobre a matriz à maneira de uma bolha de ar livre, e o excesso de água foi removido da coluna. A coluna foi ligada ao aparelho HPLC e lavada com uma vazão de 1 ml/min, e os es- paços mortos eventualmente ocorridos entre a matriz e os pis- tões foram eliminados repetindo-se o último passo. A coluna assim acondicionada, assim como todo o aparelho HPLC, foram posteriormente equilibrados com tampão T20 com uma vazão de 1 ml/min. O equilíbrio da coluna foi efetuado utilizando-se um volume de aproximadamente 10 vezes o volume da matriz da co- luna e verificada utilizando-se uma tira indicadora de pH. Com uma seringa Hamilton, os lotes foram injetados no apare- lho HPLC por meio de um 2 ml de amostra através de um circui- to fechado. O aparelho HPLC foi controlado por meio de um protocolo de software projetado para efetuar um fracionamento automático. Em alguns casos, no entanto, picos laterais ocor- ridos foram fracionados manualmente. Antes da aplicação da amostra, a coluna foi equilibrada com o dobro do volume da coluna (CV) e, em seguida, eluição das moléculas não ligadas (proteínas, nucleotídeos) foi realizada com 5 CV de tampão T20, seguida pela eluição das moléculas fracamente ligadas (ATP, ODN) com 7 CV de 50% de tampão T20N1000 e eluição de dSLIM com 7 CV de 100% de tampão T20N1000. A vazão foi de 1 ml/min. Posteriormente, a coluna foi reequilibrada com 10 CV de tampão T20 para a próxima aplicação de amostra, e as en- tradas e saídas do aparelho HPLC foram lavadas manualmente com tampão T20.

As moléculas de HPLC purificadas foram concentradas uti- lizando-se precipitação por etanol e dessalinizadas. Na pre- sença de cátions monovalentes, ácidos nucléicos em álcool formam um precipitado insolúvel que pode ser isolado por cen- trifugação. O sal co-precipitado pode ser removido por lava- gem em grande parte em etanol a 70% porque, ao contrário dos ácidos nucléicos, o mesmo é solúvel em etanol. Para aumentar o rendimento em caso de menores quantidades de ácidos nucléi- cos menos propensos a precipitação, é possível realizar a precipitação a baixas temperaturas e/ou adicionar íons Mg2+. Se não interferir em utilizações subsequentes, tais como ma- teriais transportadores como o tRNA ou glicogênio, também po- de ser adicionado, o que aumenta a concentração efetiva de ácidos nucléicos [Lottspeich, 1998; Mülhardt, 2003] .

Para precipitação, as respectivas frações da purificação por HPLC foram transferidas para uma centrífuga de vidro Co- rex e adicionadas com 1/100 do volume 1 M de MgCl2, 1/10 do volume de 3 M de solução de acetato de sódio e 2,5 volumes de etanol a 96%. Os lotes foram misturados e precipitados a 20°C, por 2 a 24 h. Os lotes foram posteriormente centrifuga- dos a 10.000 rpm (11.000 g) e a 4°C por 30 min, o sobrenadan- te foi retirado, lavado com 5 ml de etanol a 70% e centrifu- gado por mais 10 - 30 min a 10.000 rpm (11.000 g) e 4°C. O sobrenadante foi retirado a pelota de DNA foi seca no ar até que o odor de álcool tivesse desaparecido. O DNA foi retomado em 100 - 350 μΐ de Aqua rinse e transferido para recipientes de reação estéreis de 1,5 ml. O volume de ressuspensão foi estimado com referência à quantidade de DNA empregada na pre- paração para que uma concentração de 1 g/l, com rendimento de 50%, fosse obtida.

Eletrofores em gel de agarose

Para a separação e caracterização de ácidos nucléicos, a eletroforese em gel é um meio adequado. Os ácidos nucléicos, sendo carregados negativamente sobre uma ampla faixa de pH, são expostos a um campo elétrico em uma matriz de agarose ou de poliacrilamida e migram para o anodo. Sua taxa de migração varia em função da sua dimensão. O comportamento dos ácidos nucléicos (até cerca de 10 kb) durante a eletroforese em gel pode ser descrito utilizando-se uma combinação das duas teo- rias. O efeito do rastreio Ogstron é baseado na premissa de que os ácidos nucléicos assumem uma forma globular e colidem com a matriz de gel mais freqüentemente quanto maior a cir- cunferência da partícula, de modo que moléculas mairoes são desaceleradas mais fortemente do que as pequenas. Segundo es- ta teoria, moléculas cujo diâmetro é maior que o diâmetro dos poros do gel não devem migrar através do gel. A teoria da reptação supõe que os ácidos nucléicos perdem a sua forma globular em gel e se movem através do gel como uma serpente, com uma extremidade à frente, um movimento que exige mais tempo para moléculas mais longas do que para as curtas. Devi- do à influência do tamanho sobre a taxa de migração dos áci- dos nucléicos, a formação de estruturas secundárias tem um efeito sobre o comportamento da migração no gel. Assim, por exemplo, o comportamento de migração de DNA plasmidial varia de acordo com a sua conformação. A taxa de migração aumenta de aberta (forma I), passando por linear (forma III), supere- lical (forma II), chegando a DNA plasmídico desnaturado (en- rolado). Para DNA linear de duplo filamento (forma III), uma correlação entre Iogi0, comprimento (em bp) e a distância de migração relativa em gel existe em uma vasta gama, de modo que é possível realizar uma determinação de tamanho relativa- mente precisa com base em normas de comprimento.

A detecção de ácidos nucléicos em géis pode ser efetuada usando-se brometo de etídio, que, devido à sua estrutura pla- na, é intercalado no DNA, de modo que a excitação por fluo- rescência com luz na região UV (254 - 366 nm) é possível, cu- ja emissão é observada na região laranja-avermelhada (590 nm) [Lottspeich, 1998]. A agarose é um polissacarídeo recuperado a partir de al- gas marinhas e forma géis com poros relativamente grandes em solução aquosa após arrefecimento (1% (peso/volume), cerca de 150 nm) . O tamanho dos poros é inversamente proporcional à concentração de agarose. Géis de agarose são adequados para a separação de ácidos nucléicos de 0,1 a 25 kb de comprimento. A vantagem dos géis de agarose reside na sua faixa de separa- ção relativamente grande e no fácil manuseio. No entanto, a resolução de pequenos fragmentos de DNA é muito baixa. Ade- quado para a separação dos pequenos fragmentos de DNA é Sieve Agarose, uma forma de agarose derivatizada [Lottspeich, 1998; Mühlhardt, 2003] .

Para separar os ODNs e moléculas de acordo com a inven- ção, foram utilizados 3% de gel de agarose em 1 x tampão TAE com 0,125 yg/ml de brometo de etidio. Utilizando o sistema BioRad, géis horizontal foram expressos (40 ml para pequenos géis com 8 bolsos, 100 ml para grandes géis com 20 bolsos) . As amostras a serem analisadas foram aplicadas em 1 x tampão de teste segundo as normas de comprimento adequadas (vide 2.4.3). A eletroforese foi realizada em 1 x tampão de TAE a 120 V por 30 min. Os géis foram fotografados usando equipa- mento de documentação de gel.

Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa (PAGE)

Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização livre de radicais de monômeros de acrilamida utilizando-se o reticulador Ν,N1-metilenobisacrilamida. O tamanho dos poros do gel varia entre cerca de 3 - 6 nm e depende da concentra- ção total de acrilamida (%T = Macrilamide + mbisacrilamida (Pe- so/volume) ) , e o grau de reticulação (% C = mbiSacrilami- da/Macrilamida + mbisacrilamida) . Ela diminui com o aumento da T em C constante e tem um mínimo a 5% de C em T constante. Géis de poliacrilamida têm muito bom poder de resolução especialmente para pequenos fragmentos de DNA (<1 kb). No entanto, a faixa de separação é substancialmente mais reduzida comparativamen- te aos géis de agarose. A faixa de separação pode ser amplia- da com o uso de géis de gradiente. O maior poder de resolução dos géis de poliacrilamida permite a diferenciação de confor- mações diferentes de DNA que, devido às suas diferentes for- mas, possuem comportamento migratório distinto, o qual pode ser influenciado pela temperatura e pela concentração de í- ons.

Descobriu-se que os géis com 8% de T, 2,6% de C são ide- ais para a separação das moléculas e os géis com 12% de T, 5% de C em 1 χ TBE para a separação de ODNs. Os géis horizontais foram lançados no dia antes da eletroforese (15 ml/gelpequeno, 25 ml/gelgrande) e armazenado em geladeira de um dia para o ou- tro. Antes de aplicada a amostra, os géis foram submetidos a pré-eletroforese a 70 V (170 Vgrande) até não mais se observa- rem alterações no atual força (10 - 11 mA). As amostras foram aplicadas em 1 χ tampão de teste junto com normas de compri- mento adequadas (vide 2.4.3), sem adição de corantes. Para acompanhar os avanços da eletroforese, 1 χ corante de carga foi aplicado em uma pista separada. A eletroforese foi reali- zada em 1 χ TBE a uma tensão constante de 70 V (170 Vgrande) 9 V/cm) e à temperatura ambiente, e foi encerrada logo que o azul de bromofenol havia alcançado a extremidade inferior do gel (cerca de 2 h). Após a eletroforese, os géis foram tingi- dos em solução de brometo de etidio por 10 - 15 min e foto- grafados usando o equipamento de documentação de gel. Em caso de excesso de coloração de fundo, os géis foram lavados em água desmineralizada por 10 - 30 min.

Desnaturação térmica e renaturação para para atribuição de banda

Uma vez que as moléculas monoméricas de DNA são molécu- las circulares de DNA que, a exemplo do DNA plasmidial, reve- lam um complexo comportamento de migração em gel, a atribui- ção de bandas observada no gel a uma conformação ou tamanho em particular não é uma questão simples. O fato de diferentes conformações, em contraste com moléculas de diferentes tama- nhos, poderem ser interconvertidas de maneira reversível sob condições adequadas pode ser empregado na diferenciação.

Conformações diferentes possuem um grau diferente de compactação e, portanto, deveriam ser discerníveis no gel pe- lo seu comportamento de migração distinto, com formas compac- tas de DNA freqüentemente com maior mobilidade no gel em com- paração com formas mais volumosas e abertas de DNA. As formas compactas devem ser conversíveis nas formas abertas ao se destruírem as pontes de hidrogênio.

Para efetuar uma atribuição das bandas observadas no gel de poliacrilamida, as moléculas foram desnaturadas termica- mente por aquecimento a 950C durante 10 minutos. As amostras desnaturadas foram imediatamente colocadas em gelo para evi- tar a renaturação. Para este fim, foi produzido um mastermix que incluía a respectiva molécula dSLIM na concentração de 0,05 g/l em 1 x tampão TE. O lote foi dividido ao meio, tendo 1 lote sido aquecido e outro mantido à temperatura ambiente. As amostras a serem aplicadas em gel foram retiradas dos lo- tes, somadas com a quantidade correspondente de 5 χ tampão de amostra e separadas em um gel poliacrilamida nativo a 8%. Pa- ra observar a renaturação, o lote desnaturado restante foi dividido mais uma vez e, posteriormente, incubado por 3 dias a 4°C e 37°C, respectivamente. O lote restante não desnatura- do foi armazenado a 4°C e dividido igualmente após 3 dias, tendo uma parte sido desnaturada como descrito acima e outra mantida à temperatura ambiente. Os lotes foram adicionados com a quantidade correspondente de 5 χ tampão de amostra e separados em um gel de poliacrilamida nativo a 8%.

Incubação em meio de cultura celular

A atividade das moléculas foi testada in vitro usando células PBMC e HEK293. As moléculas foram dissolvidas em meio de cultura celular contendo proteínas em vez de tampão e in- cubadas a uma temperatura de 37°C. A intenção, portanto, foi investigar a influência destes parâmetros modificados sobre a estrutura e a estabilidade das moléculas e ODNs.

Um fator importante que pode influenciar a atividade das moléculas de DNA de diversas maneiras é a ligação não- específica a proteínas. A ligação a a proteínas muda o com- portamento de migração do DNA em uma país não electroforese em gel poliacrilamida desnaturante (native PAGE), de modo que uma mudança do tronco de DNA na presença da proteína pode ser reconhecido. Na maioria dos casos, a mobilidade eletroforéti- ca de um complexo de proteína de DNA é menor do que a do DNA; para minicírculos de DNA, a mobilidade eletroforética, também pode ser aumentado se o grau de compactação é aumentada pela ligação protéica [Toulmé, 1995].

Para investigar as moléculas e ODNs empregados nos tes- tes de estimulação em termos do seu comportamento nas condi- ções encontradas nos testes de estimulação, o ODN e soluções moleculares foram diluídos a uma concentração de 1 μΜ em meio e incubados por 5 h ou 24 h a 370C em uma "hotstage" ou, após a adição de uma quantidade adequada 5 χ tampão de teste, di- retamente separados em gel de poliacrilamida. ODN e soluções moleculares correlativamente diluídos em H2O foram aplicados para comparação. A fim de verificar se as mudanças observadas foram causadas pela presença de proteínas, lotes incluindo ODN e moléculas da invenção foram diluídos a uma concentração de 1 μΜ em meio aos quais não se adicionou FCS. Para comparar as distâncias de migração de DNA e as faixas de proteína no gel, permitindo assim conclusões quanto à possível ligação das proteínas, o DNA, bem como as proteínas, foram detectados em gel.

A detecção adicional de proteínas foi realizada após a detecção de ácidos nucléicos. Os géis foram fixados por 30 minutos em solução fixante e posteriormente tingidos por 30- 60 min em solução Coomassie. 0 corante excedente foi removido por incubação em solução de um dia para o outro e os géis fo- ram fotografados usando o equipamento documentação em gel.

Padrões de comprimento de DNA utilizados:

Quanto às normas de comprimento, a largura de poço de quantidade/mm recomendada pelo fornecedor foi aplicada em 1 x tampão de amostra por vez. Foram utilizadas as seguintes nor- mas:

GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas)

GeneRuler 50 bp DNA Ladder (MBI Fermentas)

10 bp DNA Ladder (Invitrogen)

25 bp DNA Ladder (Invitrogen) Cultura celular

Todas as operações de cultura celular foram realizadas em condições estéreis utilizando materiais descartáveis·este- rilizados.

As condições na incubadora foram 37°C, 5% de C02, 90% de umidade.

Investigação do efeito imunomodulador das moléculas em PBMC

Para investigar o efeito imunomodulador das moléculas multiméricas, a secreção de citoquinas de linfócitos e monó- citos recuperados a partir de doações de sangue humano foi medida pelo método Elisa.

A matéria-prima para o isolamento de linfócitos e monó- citos, também designada por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) = fração de célula mononuclear do sangue periférico, foi um concentrado de leucócitos, também designa- do de "buffy coat", obtido por centrifugação de sangue inte- gral e adquirido da empresa DRK Blutspendedienst Berlim- Wannsee. Utilizando-se a centrifugação de gradiente de densi- dade Ficoll-Hypaque, as PBMC podem ser separadas dos demais componentes do concentrado de leucócitos (plasma, trombóci- tos, eritrócitos, granulócitos). 0 meio de separação Ficoll- Hypaque é uma solução que inclui uma mistura de Ficoll 400, um polímero fortemente ramificado de monômeros de sacarose reticulados via epicloridrina e diatrizoato de sódio (Hypa- que) com densidade de 1,077 g/ml. Usando a centrifugação iso- pícnica do meio de separação com uma camada de concentrado de leucócitos diluída no topo, é possível separar os diversos componentes, de acordo com as diferentes densidades, obtendo, assim, as frações representadas na figura 2.5.1 [Luttmann, 2004].

Para isolar as PBMC, cada concentrado de leucócitos foi transferido para um frasco de 250 ml estéril e diluído a 1:2 com PBS. Por vez, 15 ml de solução Ficoll-Hypaque foram colo- 35 cados em quatro tubos de centrifugação de 50 ml, cuidadosa- mente cobertos com cerca de 30 ml de mistura de PBS de sangue usando uma pipeta de 10 ml e centrifugados a 800 g durante 20 minutos com o freio desligado (tempo total de aproximadamente 50 minutos). Ά interfase contendo PBMC foi sugada cuidadosa- mente com uma pipeta de 5 ml e transferida para tubos de cen- trifugação de 50 ml com 20 ml de PBS frio. Para remover con- taminações de eritrócitos, Ficoll/Hypaque e trombócitos, as células foram posteriormente submetidas a uma série de etapas de lavagem. Enquanto que todas as etapas até ao isolamento das PBMC foram realizadas à temperatura ambiente a fim de e- vitar a agregação dos trombócitos, as etapas de lavagem foram realizadas a 4ºC para evitar a aderência dos monócitos nos materiais plásticos empregados e, portanto, a perda dos mes- mos. Na primeira etapa de lavagem, as células foram centrifu- gadas a 400 g por 8 min a 4°C. O sobrenadante foi sugado e a pelota celular foi ressuspensa em 5 ml de PBS frio e cheios até 45 ml com PBS frio. As etapas de lavagem seguintes foram realizadas de forma idêntica, mas a centrifugação se deu a 300 g durante 5 min. As etapas de lavagem foram repetidas até que o sobrenadante ficasse transparente e a pelota apresen- tasse uma coloração amarelada (cerca de 5-6 vezes) . As célu- las foram posteriormente ressuspensas em 5 ml de meio frio por vez e combinadas, tendo o volume sido preenchido com meio frio para perfazer 30 ml. O número de células foi determinado por meio de um contador celular automático em um tamanho de exclusão de 8 μm e ajustado a uma concentração de 4 x 10^6 cé- lulas/ml utilizando meio frio.

600 μl de PBMC anteriormente isoladas a uma concentração de 4 x 10^6 células/ml foram colocados em cada poço de placas de cultura celular contendo 24 poços. Em seguida, o volume correspondente de moléculas a ser testado foi acrescentado, de modo que a concentração do lote foi 1 μΜ. As células foram incubadas por 2 dias (42 - 48 h) em uma incubadora. A suspen- são celular foi transferida para um recipiente de reação Ep- pendorf em centrifugada em um Biofuge a 3000 rpm por 4 min. Os sobrenadantes livres de células assim obtidos foram trans- feridos para um novo recipiente de reação e utilizados ou di- retamente para determinar a concentração de citoquina por meio de ELISA ou armazenadas a -70°C.

Cultura de células HEK293

As células foram cultivadas em frascos de cultura celu- lar de 162 cm2, tendo sido semeadas a uma densidade de 1,3 -1,9 χ 1Oˇ5 células/cm2. Após incubação em incubadora de 2 a 3 dias, as células foram divididas em 1:3. Para esse efeito, o meio foi sugado, as células foram lavadas com 10 ml de PBS e posteriormente incubadas à temperatura ambiente por 3-5 min, seguido pelo descolamento com 5 ml de tripsina/solução de EDTA. A reação foi encerrada com a adição de 5 ml de meio. As células foram ressuspensas e mais 5 ml de meio de foram adi- cionados. 5 ml de suspensão celular por vez foram mantidos no frasco de cultura celular ou transferidos para uma nova e a- crescentados com 45 ml de meio. Ocasionalmente, algumas célu- las destacadas do fundo do recipiente antes de o meio foram sugadas. Neste caso, as células foram transferidas para um tubo estéril de centrifugação e centrifugadas a 300 g por 4 min. Posteriormente, o meio foi sugado e as células foram ressuspensas em 5 ml de tripsina/solução de EDTA, adicionadas com 10 ml de meio e transferidas para um novo recipiente de cultura celular, conforme descrito acima.

Estimulação das células HEK293

Para estabelecer o teste, células nulas HEK2 93-TLR9 e HEK293 a uma concentração de 0,6 - 1 χ IO6 células/ml foram semeadas por vez em um volume de 400 μΐ χ placas de cultura delular de 24 poços por 1-5 dias. O número de células foi de- terminado através do contador celular em uma exclusão de ta- manho de 8 μκι, tendo-se ajustado a concentração adequada. Pa- ra culturas de longo prazo, o meio foi trocado após 48 h. Pa- ra esse efeito, o meio foi cuidadosamente sugado e 400 μΐ de meio fresco por vez foram cuidadosamente adicionados às célu- las. Além disso, em alguns lotes o meio foi trocado imediata- mente antes da adição de estimulantes. A estimulação foi rea- lizada através da adição de um volume adequado de ODNs/moléculas, de modo a atingir uma concentração final de 2,5 μΜ e 1 μΜ, respectivamente. LPS foi empregado numa con- centração de 0,5 yg/ml. Posteriormente, as células foram in- cubadas em uma incubadora por diversos períodos de tempo (6- 48 h). Por fim, o meio foi transferido para recipientes de reação de 1,5 ml, centrifugados na Biofuge a 1400 rpm para peletizar as células possivelmente incluídas e os sobrenadan- tes foram usados para determinar a concentração IL-8 por meio de ELISA.

Detecção de citoquina/quimiocina detecção pelo método Elisa

A fim de investigar o efeito imunomodulador de dSLIM so- bre as PBMC, foi medida a indução de IL-6, IFN-α e IFN-γ.

IL-6 é uma citoquina multifuncional, secretada por uma série de linfócitos e monócitos ativados, além de induzir proteínas de fase aguda em hepatócitos, possui um efeito pro- motor sobre o crescimento, a diferenciação e a fagocitose de linfócitos [Kirchner, 1994].

IFN-α, que possui vários subtipos, pertence à família das interferonas tipo I, tendo principalmente um efeito anti- viral. Grandes quantidades de IFN são secretadas pela ativa- ção do ρDC seguem TLR7, 8 ou 9 [Perry, 2005], vide também a seção 1.3.2.

IFN-γ é secretada predominantemente por células NK e T, mas também por monócitos, células dendríticas e células Β. E a única interferona tipo II e, ao contrário das interferonas do tipo I, possui mais um efeito imunomodulador do que anti- viral. Além do seu papel na diferenciação, a IFN-γ é a cito- quinas efetora mais importante de uma resposta imune dirigida por Th1.

A secreção de IL8/CXCL8 foi utilizada para detectar a ativação de TLR9 em células HEK293 transformadas. IL-8 é uma quimiocina CXC secretada por leucócitos, mas também por fi- broblastos, células epiteliais e endoteliais. A indução de IL8/CXCL8 se dá, por exemplo, através de IL-I e TNF-γ, mas também através da PRR e fatores ambientais, tais como hipó- xia. A expressão de IL8/CXCL8 é regulada pela regulamentação de transcrição por meio de ativação cooperativa da NF-α e AP- 1 e sobre o nível de estabilidade de mRNA. Não obstante o seu efeito como ativador de neutrófilos, IL8/CXCL8 possui um e- feito quimiotático sobre diversos leucócitos e está envolvida no processo de transmigração de η m leucócitos em tecidos [Mukaida, 2003].

Para detectar as citoquinas nos sobrenadfantes de cultu- ra celular de PBMC e HEK293 células, foi utilizado o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) sob a forma de um "sanduíche ELISA". Trata-se de um imunoensaio quantitativo onde anticorpos específicos para a proteína a ser detectada são imobilizados na superfície de uma placa de microtitulação por adsorção. A ligação do antígeno ao respectivo anticorpo imobilizou igualmente o primeiro, sendo que outros componen- tes podem ser removidos por lavagem. A ligação do antigênio e do anticorpo é uma reação de equilíbrio, de modo que a quan- tidade de antígeno ligado depende da concentração. A deteção do antígeno é efetuada utilizando um segundo anticorpo espe- cífico e biotinilado, que por sua vez liga-se à enzima conju- gada com estreptavidina empregada na detecção. No ensaio rea- lizado aqui foi a enzima peroxidase (HRP). A quantidade real medida é a quantidade (concentração) de um substrato cromogê- nico reagido pela enzima dentro de um período definido de tempo. 0 substrato utilizado aqui foi TMB (3,3',5,5'- tetrametilbenzidina), que se oxida na presença de H2O2 para absorver a luz de um comprimento de onda de 370 nm (azul). A reação é encerrada pela adição de H2SO4, mudando assim o com- primento de onda de absorção para 450 nm (amarelo) [Luttmann, 2004] . Usando uma série de diluições padrão de concentração de citoquina conhecida a ser determinada, é possível assim determinar as concentrações desconhecidas de citoquina nos sobrenadantes de cultura celular.

Os pares de anticorpos exigidos, a norma, a enzima e as soluções de substrato foram comprados da empresa R&D Systems sob a forma de kits. Os equipamentos e materiais para a exe- cução estão apresentados na tabela abaixo. IL-6 e IFN-γ

A deteção de IL-6 e IFN-γ nos sobrenadantes de cultura celular de PBMC foi realizada utilizando o teste ELISA os Kits DuoSet de Desenvolvimento do Sistema ELISA da R&D Sys- tems, de acordo com as instruções anexas. Para esse efeito, o "anticorpo de captura" foi diluído com PBS a uma concentração de 4 pg/ml (IFN-γ) e 2 pg/ml (IL-6), respectivamente, e 100 μl por vez foram colocados nos poços de uma placa de microti- tulação. A placa foi incubada à temperatura ambiente de um dia para o outro, posteriormente lavada 3 vezes com tampão de lavagem e incubada com 300 μΐ de tampão de bloqueio por poço por 1 - 2 h para saturar os pontos de ligação livres. A placa foi lavada 3 vezes com tampão de lavagem, e 100 μΐ de amos- tras e normas por vez foram posteriormente colocados na pla- ca. Os sobrenadantes foram utilizados em uma diluição de 1:2 em tampão reagente para a detecção de IL-6 e, não diluídos, para a detecção de IFN-γ. As séries de diluição padrão para IL-6 compreendiam as seguintes concentrações: 12,5, 25, 50,100, 200, 350, 700 pg/ml. As séries de diluições do padrão de IFN-γ compreendiam as seguintes concentrações: 12,5, 25, 50,100, 250, 500, 1000 pg/ml. Determinações duplas foram reali- zadas em cada caso. 0 tempo de incubação foi de 2 h. Depois de lavar 3 vezes com tampão de lavagem, 100 μΐ de "anticorpo de detecção", a uma concentração de 100 ng/ml (IL-6) e 200 ng/ml (IFN-γ), respectivamente, em tampão reagente foram co- locados sobre a placa por vez. Depois de um tempo de incuba- ção de 2 h, a placa foi lavada 3 vezes com tampão de lavagem, e 100 μl de estreptavidina-HRP diluída a 1:200 em tampão rea- gente foram colocados em cada poço. O tempo de incubação foi de 20 min. Após uma etapa final de tríplice lavagem, 100 μΐ de solução de substrato ("reagente cor" A e B na proporção de 1:1) por vez foram adicionados por vez às placas e incubados por 20 minutos no escuro. A reação foi encerrada adicionando- se 50 μl de H2SO4 e a absorção em cada poço individual foi medida a 450 nm em um leitor de microplacas. A avaliação foi realizada utilizando-se o software SoftMax Pro 2.6. A curva padrão foi calculada com um ajuste de parâmetro 4.

IFN-α

A deteção de IFN-α nos sobrenadantes de cultura celular de PBMC foi realizada utilizando o Kit ELISA de Interferona-a Humana da empresa Biosource, segundo as instruções anexas. 100 μl de padrões e amostras por poço foram adicionados às tiras de microtitulação incluídas no kit, já fornecidas com anticorpos e bloqueadas, e incubados por 1 h à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram utilizados diluídos a 1:2 com tampão de diluição e as séries de diluição padrão incluí- am as seguintes concentrações: 156, 312, 625, 1250, 2500, 5000 pg/ml. Após uma etapa de lavagem, 100 μl de Concentrado D de Anticorpos em Tampão de diluição C foram adicionados a cada poço e incubados por 1 h à temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes e 100 μl de HRP em Diluente de HRP foram adicionados com Diluente para cada placa e incubados por 1 h. A solução foi removida por lavagem 4 vezes e 100 μl de Solu- ção de Substrato G foram pipetados em cada poço. Isto foi in- cubado no escuro durante 20 minutos, sendo a reação encerrada pela adição de 100 μl de Solução de Parada Η. A absorção a 450 nm foi medida no leitor de microplacas. A avaliação foi realizada utilizando-se o software SoftMax Pro 2.6. A curva padrão foi calculado com um ajuste ponto a ponto.

IL-8/CXCL8

A deteção de IL-8/CXCL8 nos sobrenadantes de cultura ce- lular de células HEK293 foi realizada utilizando o teste Kit de Sistema de Desenvolvimento ELISA DuoSet da empresa R&D Systems, de acordo com as instruções anexas, e era idêntico ao descrito para a IL-6 e IFN-γ. As séries de diluição padrão incluíam as seguintes concentrações: 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1000, 2000 pg/ml. Os sobrenadantes foram empregados na forma não diluída. As concentrações de anticorpo utilizadas foram: anticorpo de captura 4 μg/ml, anticorpo de detecção 20 ng/ml.

Preparação e descrição de moléculas de DNA multiméricas

Para investigar a influência das características estru- turais, particu]larmente aquelas que favorecem a capacidade de formação de estruturas G, foram produzidas combinações de moléculas de DNA monoméricas com motivos poli (G) em diversas regiões usando o método de acordo com a invenção que, não obstante a Iiofilização, está em conformidade com o de prepa- ração de monômeros. Para estsa finalidade, três diferentes seqüências de tronco (S) e Ioop (L) por vez foram combinadas, o que, por um lado, diferiu em número e localização das bases guanina, mas também na estrutura do de Ioop secundária pre- vista pelo programa "DNA mfold". As seqüências individuais e suas características estruturais estão representadas na tabe- la a seguir:

Tabela 3.1: Características estruturais e seqüências Ll- L3, S1-S3 (vermelha: poli(G))

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O diagrama a seguir fornece uma visão geral das combina- ções utilizadas e sua nomenclatura empregada abaixo: Tabela 3.2: Nomenclatura de moléculas com diferentes combinações de loop/tronco

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Como demonstrado acima, as moléculas poliméricas dSLIM que, na acepção da invenção, também podem ser referidas como moléculas multiméricas ou oligoméricas, são muito bem adapta- das para induzir uma resposta imune reforçada em um organis- mo. A resposta imune reforçada permitiu o uso vantajoso dos agentes em conexão com agentes quimioterápicos. Comparado com o efeito cumulativo dos dois agentes, a combinação de agentes quimioterápicos e agentes de acordo com a invenção resulta em um efeito sinergético no tratamento de tumores. Devido à com- binação com o agente de acordo com a invenção, que pode ser obtido por meio das etapas de processo supramencionadas (vide reivindicação principal), todos os efeitos dos agentes quimi- oterápicos ou citostáticos empregados adicionalmente são re- forçados. Muito embora as formas monoméricas de moléculas dS- LIM já tenham sido combinadas com agentes quimioterápicos ou citostáticos, o efeito alcançado pela combinação da forma multimérica ou polimérica de dSLIM com agentes citostáticos se mostrou uma completa surpresa. No uso prático de um agente de combinação compreendendo a forma monomérica das dSLIM e os agentes citostáticos, verificou-se que apenas determinadas propriedades dos agentes citostáticos poderiam ser melhora- das, mas não - conforme se dá com a forma polimérica - as su- as propriedades gerais. Além disso, a ativação do sistema i- mune pela forma polimérica/multimérica das dSLIM foi surpre- endentemente mais elevada, de modo que um resultado geral no tratamento de tumores poderia ser alcançado, que foi surpre- endentemente aprimorado em comparação com o uso da forma mo- nomérica de agentes citostáticos. Assim, em especial, a for- mação de metástases foi evitada através da utilização de mo- léculas dSLIM multiméricas em um organismo quando se adminis- tra agentes citostáticos/quimioterápicos em conjunto com es- tes agentes. Combinação, no sentido da invenção, significa a administração simultânea e periódica dos dois agentes.

A Figura 3.1.1 exemplifica as duas estruturas secundá- rias diferentes das moléculas dSLIM 30L1 (como MS) e KG (como ML, GS, GL, GLS) para as três seqüências de loop, calculadas pelo "DNA mfold". Em contraste com 30L1, não foram previstos pares de bases para KG nas condições selecionadas.

Preparação de várias moléculas monoméricas e multiméri- cas

A figura 3.1.2 mostra o resultado da separação de 0,3 yg de lotes de ligação e a digestão de T7 de ensaio das diferen- tes moléculas dSLIM, juntamente com o ODN 30L1 em gel de aga- rose a 3%. Em todas as tiras em que as diferentes moléculas foram separadas, uma faixa pode ser vista a uma curta distân- cia abaixo do nivel máximo para o qual migrou o fragmento de 100 bp do marcador, faixa esta que corresponde à molécula mo- nomérica. Na tira contendo os ODN 30L1, uma faixa abaixo da- quela das moléculas monoméricas é visível. Para moléculas contendo L3 (GL, GLS), uma distribuição desfocada de DNA pode ser vista na região superior do gel até os bolsos, que é ni- tidamente mais forte para GL e mais fraco para GLS no lote de digestão T7 , em comparação com o lote de ligação. Para molé- culas contendo longos motivos poli (G) (GL, GS GLS MS), as faixas no gel são relativamente desfocadas, em comparação com as demais moléculas (30L1, KG, ML). Nas faixas onde os lotes de digestão T7 foram aplicados, as intensidades de fluores- cência, especialmente na região superior do gel, são mais baixas se comparadas com as faixas que possuíam lotes de li- gação aplicados nela.

A figura 3.1.3 mostra os cromatogramas de uma posterior purificação por HPLC das diferentes moléculas. Cada uma de- marca a absorção em 2 60 nm (linha azul) em comparação com o volume escoado através da coluna após a injeção da amostra a ser separada (linha rosa quebrada). A linha verde representa o gradiente de tampão de NaCl de 0%, 50% e 100% do tampão de NaCl de 1 M (T20N1000) . O primeiro pico com o seu máximo em 2,5 ml e 0% de T20N1000 (F2) corresponde às moléculas não li- gadas, o segundo pico com o seu máximo em 8 ml e 50% de T20N1000 (F3) corresponde às moléculas com baixa afinidade à fase estacionária (não obstante a aplicação da quantidade de 12 vezes comparada com a fração F4, não foi detectado DNA no gel de agarose para nenhuma das frações) . O terceiro pico, com o seu máximo em 14 ml e 100% de T20N1000 (F4), correspon- de às moléculas monoméricas.

Figura 3.1.3: Cromatogramas de purificação por HPLC de diferentes moléculas monoméricas e multiméricas.

a) 30L1, b) ML, c) KG, d) MS, e) GS, f) GLS, g) GL, co- luna: 1 ml de DMAE; quantidade aplicada: 700 μg; vazão: 1 ml/min; tampão A: 20 mM Tris, pH 7; tampão B: 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH7; gradiente: 0%, 50%, 100% tampão B.

Ao comparar os cromatogramas das diferentes moléculas, percebe-se claramente que F4 é um pico único de moléculas sem quaisquer motivos poli (G) , ou seja, nem S3 nem L3 (30L1, ML, KG). Em contraste, um ombro é observado em F4 para as molécu- las que contêm S3. Para aquelas que possuem L3 (GL, GLS), o máximo possui dois picos, com diferente distribuição de in- tensidade entre GL e GLS. Para GLS, tanto o máximo parcial têm aproximadamente a mesma intensidade, enquanto que para GL o máximo parcial observado em um volume maior possui maior intensidade do que em um volume mais baixo. Os máximos late- rais surgidos, ou ombros, foram fracionadas em separado pela operação manual. As frações foram designadas como F1 e F2 de acordo com a ordem cronológica da sua eluição.

As supramencionadas frações de dSLIM da separação de HPLC após precipitação com etanol, ou seja, os produtos fi- nais, são aplicadas sobre o gel de agarose representado na figura 3.1.4. Em todas as faixas, a banda correspondente às moléculas monoméricas pode ser vista a uma curta distância abaixo da distância de migração do fragmento de marcador de 100 pb. Para ML e KG, uma segunda banda mais fraca pode ser reconhecida uma curta distância acima desta banda, que apre- senta maior intensidade para a ML. GL, MS e GLS exibem uma mobilidade um pouco maior no gel do que as demais moléculas. Para as moléculas que não contêm longos motivos poli (G) (30L1, KG, MS), uma distribuição de intensidade não-discreta até ao nivel de aproximadamente 200 pb pode ser reconhecida acima da banda dSLIM. Além disso, uma banda fraca ao nivel do fragmento marcador de 200 pb pode ser reconhecida para KG e ML.

Figura 3.1.4: Várias moléculas monoméricas e multiméri- cas depois de precipitação por etanol.

Gel de agarose a 3%, quantidade aplicada 0,3 * g, marca- dor 100 bp 0,5 * g (100 pb, 30L1, 30L1, KG, ML, GL e Fl, F2- GL, -Fl MS, MS-F2, GS-F1, GS F2-GLS-F1, F2-GLS, 100 pb).

Para moléculas onde se observou uma distribuição de pi- cos múltiplos e os máximos foram fracionados em purificação por HPLC, cada fração 1 corresponde principalmente à banda monomérica, enquanto que as faixas que tinham as frações 2 aplicadas sobre as mesmas mostram principalmente uma distri- buição de intensidade ao longo de uma vasta extensão acima da banda monomérica. Aqui, MS e GS possuem distribuições de in- tensidade semelhantes que, começando aproximadamente a partir da banda monomérica, passam para um nivel de migração corres- pondente a 500 pb. Para GL, por outro lado, ele começa acima de 200 pb, estendendo-se até o bolso do gel. Para GLS, no en- tanto, a distribuição do DNA em toda a faixa pode ser obser- vada, a partir da banda monomérica.

Figura 3.1.6: Desnaturação térmica de várias moléculas monoméricas e multiméricas.

PAGE nativo, gel a 8% (2,6% C), quantidade aplicada 0,25 μg, marcador 25 pb 0,3 μς (25 pb, não tratada, desnaturação 95 0C por 10 min: 30L1, MS, ML, KG, GS, GL-F2, GLS e F2) .

O gel na figura 3.1.6 mostra o efeito da desnaturação térmica das diferentes moléculas sobre o seu comportamento migratório no gel. Para este efeito, os lotes foram divididos e uma parte foi aquecida a 95°C durante 10 minutos, imediata- mente resfriada em gelo e aplicada. As bandas observadas cor- respondem àquelas no gel descritas no item 3.1.5, mas, neste caso, DNA não separado é visível no bolso do gel para MS e GS, e uma segunda banda é vista por MS, que é executada no mesmo nível que a segunda banda de 30L1. GS e MS envolvem um lote de fabricação diferente do gel apresentado na Figura 3.1.5, onde os máximos laterais no fracionamento de HPLC não foram recolhidos separadamente. A comparação das bandas em gel com dSLIM desnaturado e não desnaturado mostra que a in- tensidade da Ia banda diminui e da 2a banda aumenta em todas as moléculas após o aquecimento. A banda nas faixas de ML e KG surgidas no terço superior do gel não é mais visível após a desnaturação. Além disso, o DNA nos bolsos das faixas onde foram aplicados MS e GS já não pode ser reconhecido após a desnaturação. Nas faixas GL-F2 e GLS-F2, a quantidade de DNA no bolso também é reduzida, mas, por outro lado, um grande número de bandas organizadas de regularmente é visível sobre- tudo na 2a banda.

A fim de analisar se as mudanças causadas pela desnatu- ração são reversíveis, as amostras desnaturadas foram dividi- das e incubadas por 3 dias a 4°C e 37°C, respectivamente. Os lotes de dSLIM não tratados foram armazenados a 4 °C, igual- mente divididos após 3 dias, e uma alíquota de cada vez foi aquecida a 95 0C durante 10 minutos e imediatamente colocada em gelo. Os resultados de um PAGE nativo utilizado para sepa- rar os lotes estão representados nas figuras 3.1.7 e 3.1.8. As amostras não tratadas e desnaturadas mostram o mesmo com- portamento de migração no gel, como descrito para o gel re- presentado na figura 3.1.6. No seu comportamento de migração, as amostras desnaturadas incubadas a 4 0C correspondem às a- mostras desnaturadas imediatamente antes da aplicação. As a- mostras incubadas a 37 0C mostram um comportamento de migração no gel, o que corresponde a que grande parte das amostras não tratadas. No entanto, a intensidade da segunda banda para 30L1, MS e GS é superior à anterior. Outra diferença em GS e MS é vista na quantidade de DNA que permaneceu no bolso do gel, o que é muito baixo em comparação com a amostra não tra- tada.

Molécula dimérica e frações monoméricas de 3OLl

Para analisar se a banda reconhecida no terço superior é uma banda correspondente a um dimero, uma fração (F3) obtida a partir de uma grande quantidade de moléculas monoméricas por meio da separação por HPLC e, representando esta banda, foi aplicada em um PAGE nativo juntamente com a molécula di- mérica 60L1.

Figura 3.1.9: Comparação da fração 3 com a molécula di- mérica 60L1.

PAGE nativo, gel a 8% (5% C) , quantidade aplicada 0,25 µg, marcador 25 pb 0,3 μg (25 pb, F3, F3 95°C, 60L1, 60L1 95 °C, fração 1 (Fl), fração 2 (F2), fração 3 (F3), fração 4 (F4) de purificação por HPLC de dSLIM 30L1, 60L1).

As bandas observadas correm no mesmo nivel. Ao aplicar as amostras na forma desnaturada em um gel, as bandas são en- contradas em um nivel superior no gel em comparação com uma faixa com amostras não tratadas aplicados na mesma. As faixas correspondentes do PAGE nativo estão representadas na figura 3.1.9 juntamente com o resultado da separação das quatro di- ferentes frações de monômero 30L1 obtidas por meio de fracio- namento por CLAE.

Meio de incubação, ligação de proteínas

Para investigar o efeito das condições existentes na cultura celular, especialmente a presença de proteínas, sobre as moléculas utilizadas para a estimulação, as últimas foram incubadas em meio de cultura celular por 0,5 e 27 h a 37°C e separadas juntamente com as moléculas dissolvidas em água u- tilizando PAGE nativo. Após o tingimento do DNA, as proteínas presentes no meio foram detectados no gel através do corante Coomassie. Os resultados estão representados nas figuras 3.1.10. e 3.1.11.

Figura 3.1.10: Incubação de moléculas monoméricas em meio

PAGE nativo, gel a 8% (5% C) , quantidade aplicada 0,25 μg, marcador 25 pb 0,3 μg, marcador 50 pb 0,3 μg (50 pb, 27 h médio, 5 h de meio, 0 h de meio, H2O: 30L1 , ML, F3, KG, 25 pb).

PAGE nativo, gel a 8% (2,6% C), quantidade aplicada 0,25 μg, 25 pb 0,35 μg (27 h de meio, 5 h de meio, 0 h de meio, H2O: GL, 25 pb).

Seção de corante Coomassie, PAGE nativo a 8% (5% C) , da figura 3.1.11 a) (27 h de meio, 5 h de meio, 0 h de meio, H2O: ML).

As figuras 3.1.10 a) e 3.1.10 b) mostram o PAGE tingido com brometo de etidio com moléculas aplicados sobre o mesmo. A Figura 3.1.10 c) fornece uma representação exemplar de uma seção do gel tingido com Coomassie utilizado para comparar as distâncias de migração. A comparação das faixas, incluindo os vários lotes, mostra que uma banda aparece no bolso de gel para todas as moléculas no meio, o que está ausente nas fai- xas de H2O (com exceção do GL). A banda que aparece na região superior do gel em H2O para 30L1 e fração 3 mostra uma dis- tância de migração mais curta em meio, que se encontra no ní- vel da banda de proteína inferior. A intensidade tanto do DNA quanto das bandas de proteína diminui com o aumento do tempo de incubação. Para GL, a intensidade da 2a banda aumenta no meio, em comparação com H2O.

Figura 3.1.11: Incubação de ODN M362 em meio

PAGE nativo, gel a 12% (5% C) , quantidade aplicada 0,25 μg, marcador 25 pb 0,3 g (25 pb, H2O, 0 h em meio, 5 h em meio, 27 h em meio).

Seção de corante Coomassie, PAGE nativo, gel a 12% (5% C), de uma figura 3.1.12) (H2O, 0 h em meio, 5 h em meio, 27 h em meio).

A figura 3.1.11 mostra o PAGE nativo onde a molécula de controle protegida por fosforotioato M362 foi aplicada. Como visto claramente, a banda de DNA visível em H2O na extremida- de inferior do gel desapareceu no meio. Em vez disso, uma banda na borda superior do gel, correspondendo, na sua dis- tância de migração, à banda menor de proteína (Figura 3.1.11 b), sendo possível observar uma banda no bolso de -gel. Uma diminuição na intensidade das bandas de DNA com o aumento do tempo de incubação também pode ser observada neste caso.

Para verificar se as mudanças observadas foram causadas pela presença de proteínas e não de outros componentes do meio, as moléculas também foram diluídas em meio sem adição de FCS para fins de comparação. Na Figura 3.1.12 as faixas correspondentes dos géis são exemplificadas por dSLIM (KG) e M362. As faixas onde os ODNs e as moléculas foram separados em meio sem FCS correspondem, na sua distribuição de intensi- dade, àquelas onde ODNs e dSLIMs foram aplicados como uma so- lução em água. Em contrapartida, os ODNs dissolvidos em meio com FCS e as moléculas mostram um comportamento de migração no PAGE nativo que corresponde ao descrito nas figuras 3.1.10 e 3.1.11 para as faixas onde moléculas monoméricas e ODNs di- luídos em meio foram aplicados.

Efeito imunoestimulatório: estimulação de PBMC

0 efeito imunomodulador das diferentes moléculas foi in- vestigado em PBMC isoladas de doações de sangue humano. Para este fim, as PBMC foram incubadas com a respectiva molécula ou molécula de controle M362 em uma concentração final de 1 μΜ por 48 h, sendo a quantidade de IL-6, IFN-α e IFN-γ nos sobrenadantes de cultura celular medida pelo método ELISA. Células incubadas sem qualquer aditivo foram utilizadas como controle.

Os resultados de ELISA de sobrenadantes de PBMC isolados de 4 doações de sangue (doadores A-D) estão representados no diagramas na Figura 3.2.1 a-c) . Os respectivos valores cor- respondem aos valores médios das determinações dupla, e as barras de erro representam o desvio padrão duplo determinado a partir dos mesmos. Para valores marcados com *, foram rea- lizadas determinações duplas adicionais para estimulação de PBMC e os valores indicados correspondem aos valores médios dos quatro resultados ELISA obtidos. As barras de erro cor- respondem ao desvio padrão duplo destes quatro valores.

Figura 3.2.1 ac): Resultados ELISA IFN-γ (a), IFN-α (b), IL-6 (c) PBMC

Sobrenadantes de PBMC (2,4 χ 1O^6 células por lote de 600 5 μΐ) de diferentes doadores A-D, estimulação por 48 h com 1 μΜ de dSLIM/ODN M362, intervalo de medição padrão ---, * deter- minação dupla de cultura celular, barras de erro: 2 x desvio padrão da determinação dupla ELISA (* determinação dupla de cultura celular + determinação dupla ELISA = 4 valores). Referindo-se aos diagramas, uma característica imediata- mente marcante é a de que as concentrações de citoquina nos sobrenadantes dos diferentes doadores mostram fortes varia- ções, o que dificulta a comparação dos dados. Os desvios pa- drão dos valores determinados adicionalmente na cultura celu- lar como determinações duplas são comparáveis aos desvios pa- drão determinados apenas a partir da determinações duplas no ELISA, indicando que as diferenças se devem a diferenças nas PBMC. Nos lotes não estimulados, concentrações nulas ou muito reduzidas der citoquinas foram detectadas concentrações para todos os doadores. Na determinação das concentrações de IL-6 e IFN-γ, alguns dos valores determinados estão no limite su- perior ou fora do intervalo padrão de medição, que é de até 10.000 µg/ml para IFN-γ, até 3500 µg/ml de IL-6 para dSLIM e 7000 µg/ml para M362. Para permitir uma melhor comparação dos dados das dife- rentes valores de citoquina, os valores resultantes foram normalizados. Para esse efeito, o percentual determinado das concentrações de citoquina no valor determinado para M362 foi calculado para cada um dos doadores. Os valores médios dos dados assim normalizados a partir de quatro doadores es- tão representados nos esquemas do ac Figura 3.2.2). Cada bar- ra de erro corresponde ao desvio do valor médio. Devido às grandes diferenças observadas entre os doadores individuais, as barras de erro são muito grandes. Pelo menos, no entanto, é possível estimar a tendência para as moléculas individuais, através dos diagramas. Figura 3.2.2 ac) : Valores médios normalizados dos resul- tados de ELISA para IFN-γ (a), IFN-α (b), IL-6 (c).

Resultados de ELISA, vide fig. 3.2.1 normalizado: quan- tidade de citoquinas em % de M362 por doador, valores médios de 4 doadores, barras de erro: desvio do valor médio.

Para IFN-γ, os valores calculados para as moléculas tes- tadas ficaram entre 40% e 80%, em relação aos valores de M362, e os valores de KG, ML e GLS-F2 ficaram bastante na re- gião inferior e, para GL-F2, na região superior.

A porcentagem média de valores dos diferentes construc- tos de IFN-α correspondiam aproximadamente aos do M362, à ex- ceção dos valores calculados para GL-F1, GLS-F1 e GL-F2, que foram apenas cerca de 50% dos valores M362.

Os valores médios das percentagens de M362 para IL-6 fo- ram abaixo de 50% para 30L1, MS, GS, GL-F2 e GLS-F2 e MS-F2 e GLS - os constructos com a menor concentração de endotoxina também apresentou os valores mais baixos. Os valores de GL-F1 e GL-F2, onde não há valores de endotoxina disponíveis, fica- ram ligeiramente acima de 50% em relação a M362. Os valores mais elevados de IL-6, que correspondem aos do M362 ou estão acima de 100%, foram encontrados em células estimuladas com KG e ML. Também, a mais alta concentração de endotoxina foi medida para os dois constructos.

Figura 3.3.2: Resultados do tempo de estimulação de ELISA IL-8 HEK293-TLR9

Sobrenadantes HEK2 93-TLR9: 400 μL/lote (5 x 1Oº célu- las/ml); estimulação por 6 h, 24 h, 48 h com 2,5 μΜ de ODN 2006; 0,5 μg/ml LPS; estimulação por 3 dias após semeadura celular (meio trocado depois de 48 horas e antes da estimula- ção); barras de erro: 2 x desvio padrão de determinação dupla ELISA.

Proporções de quantidades de quimiocina em lotes estimu- lados/não estimulados a partir de a); barras de erro: soma dos erros relativos da determinação dupla de ELISA.

As concentrações de quimiocina medidas são relativamente baixas. No entanto, um aumento da quantidade de IL-8/CXCL8 com maior tempo de incubação pode ser observado em todos os lotes, que, no entanto, torna-se muito baixo de 24 h a 48 h. Aqui também os valores respectivos para células estimuladas por LPS e não estimuladas são aproximadamente iguais em mag- nitude, e aqueles para as células estimuladas com ODN 2006 são aumentados em um fator de 1,5 comparativamente a células não estimuladas. Não se percebe qualquer diferença nas pro- porções das quantidades de IL-8/CXCL8 de lotes estimula- dos/não estimulados em diferentes intervalos, razão pela qual ainda mais estímulos foram realizados durante 24 h.

Figura 3.3.4: Resultados ELISA IL-8 HEK293 nulo de vá- rias moléculas monoméricas.

Sobrenadantes HEK293 nulos: 400 μl/lote (1 χ IO6 célu- las/ml); estimulação por 24 h com 2 μΜ de ODN 2006/dSLIM; 0,5 μg/ml LPS; estimulação celular por 4 dias após semeadura (meio trocado depois de 48 h e antes da estimulação); barras de erro: 2 χ desvio padrão da determinação dupla de ELISA .

Proporções de quantidades de quimiocina em lotes estimu- lados/não estimulados a partir de a); barras de erro: soma dos erros relativos à determinação dupla de ELISA.

Não houve diferença significativa na secreção de IL- 8/CXCL8 em comparação com um lote não estimulado observada em qualquer dos lotes incubados com os estimulantes diferentes citados.

Claims (30)

1. Molécula multimérica para modulação da atividade do sistema imunológico humano ou animal, caracterizada pelo fato de poder ser produzida por um sistema que compreende as seguintes etapas: fornecimento de uma seqüência de ácido oligodesoxirribonucléico 5'-fosforilado em água, liofilização até se obter um resíduo seco, seguida por ressuspensão em solução tampão, - adição de uma ligase T4 DNA, formando assim uma mistura de reação, e incubação da mistura de reação a 37°C por pelo menos 30 minutos.

2. Molécula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a seqüência oligodesoxirribonucleotídeo compreende as seqüências abaixo: a) GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC ou b) ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA, ou c) compreende uma seqüência de ácido oligodesoxirribonucléico com a seqüência de base AACG TTCTTCGGGG CGTT, d) a referida seqüência de ácido oligodesoxirribonucléico com comprimento de 40 a 1.600 nucleotideos.

3. Molécula, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizada pelo fato de que a seqüência de base segundo a característica c) está inclusa na seqüência CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC.

4. Molécula, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender uma cadeia parcialmente unifilamentar e fechada covalentemente de resíduos de desoxirribonucleosídeos.

5. Molécula, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender a seqüência de base N1N2CGN3N4, onde N1N2 é um elemento do grupo GT, GG, GA, AT ou AA, N3N4 é um elemento do grupo CT ou TT, e C é desoxicitosina, G é desoxiguanosina, A é desoxiadenosina, e T é desoxitimidina.

6. Molécula, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a seqüência de base N1N2CGN3N4 está situada na região unifilamentar da cadeia fechada de resíduos de desoxirribonucleosídeos.

7. Molécula, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que um ou mais substituintes estão ligados à molécula por meio de ligações covalentes.

8. Molécula, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de o substituto ser selecionado de um dos grupos formados por peptídeos, proteínas, sacarídeos, estruturas antigênicas, DNA e/ou RNA.

9. Agente de combinação, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um agente quimioterapêutico.

10. Agente de combinação, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterapêutico é selecionado do grupo que compreende anticorpos, agentes alquilantes, análogos de platina, agentes intercaladores, antibióticos, inibidores de mitose, taxanos, inibidores de topoisomerase, antimetabólitos e/ou L- asparaginase, hidroxicarbamida, mitotano e/ou amanitins.

11. Agente de combinação, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os agentes alquilantes são selecionados do grupo que compreende: - derivados mostarda de nitrogênio, especialmente - ciclofosfamida, - ifosfamida, - trofosfamida, melfalan e/ou clorambucil, alquilsulfonatos, especialmente busulfan e/ou - treosulfan, nitrosouréias, especialmente carmustina, lomustina, nimustina, - estramustina e/ou estreptozotocina, procarbazina e dacarbazina, temozolomida e/ou tiotepa.

12. Agente de combinação, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os análogos de platina são selecionados do grupo que compreende: cisplatina, carboplatina e/ou - oxaliplatina.

13. Agente de combinação, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os agentes intercaladores são selecionados do grupo que compreende: - antraciclinas, especialmente doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, epirrubicina e/ou idarrubicina, - mitoxantrona, amsacrina e/ou doxifluridina.

14. Agente de combinação, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o agente antibiótico é selecionado do grupo que compreende: - bleomicina, - actinomicina D (dactinomicina) e/ou - mitomicina.

15. Agente de combinação, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de mitose é selecionado do grupo que compreende: - alcalóides de Vinca rosea, especialmente - vinorrelbina, - vincristina (oncovina), - vinblastina e/ou - vindesina.

16. Agente de combinação, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os taxanos são selecionados do grupo que compreende: - paclitaxel e/ou - docetaxel.

17. Agente de combinação, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os inibidores de topoisomerase são selecionados do grupo que compreende: - inibidores de topoisomerase I, especialmente - camptotecina, - topotecano e/ou - irinotecano e/ou - inibidores de topoisomerase II, especialmente - etoposideo - teniposideo.

18. Agente de combinação, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os antimetabólitos são selecionados do grupo que compreende: - antagonista de ácido fólico, especialmente - metotrexato, - análogos de pirimidina, especialmente - 5-fluorouracil, - capecitabina, - citosina arabinosideo (citarabina) e/ou - gemcitabina, - análogos de purina, especialmente - 6-tioguanina, - pentostatina, - azatioprina, - 6-mercaptopurina, - fludarabina e/ou - cladribina.

19. Kit, caracterizado por compreender molécula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e/ou agente de combinação, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18 e, opcionalmente, informações relativas à combinação dos conteúdos do kit.

20. Molécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e agente de combinação, como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 18, caracterizada para uso como droga.

21. Agente farmacêutico, caracterizado por compreender uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e/ou um agente de combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17, opcionalmente em conjunto com um veiculo tolerável farmaceuticamente.

22. Uso de uma molécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, de um agente de combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17, de um agente farmacêutico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por destinar-se à produção de um agente para modular o sistema imunológico de seres humanos ou animais ou modular a atividade deste sistema imunológico.

23. Uso, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a referida modulação estimula ou aumenta a atividade do sistema imunológico.

24. Uso, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a estimulação compreende uma reposta imune mediada por célula T ou independente de célula T.

25. Uso, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a resposta imune compreende a proliferação de células B e/ou a ativação de células B.

26. Uso, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a estimulação do sistema imunológico compreende a secreção de citocinas.

27. Uso, de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e/ou o agente de combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17 serem utilizados como adjuvantes na vacinação terapêutica ou profilática.

28. Uso de uma molécula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, de um agente de combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17 e/ou de um agente farmacêutico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por ser na produção de um agente para o tratamento de um transtorno de crescimento celular.

29. Uso, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de o transtorno do crescimento celular ser um tumor.

30. Uso, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o tumor é selecionado do grupo que compreende os da região otorrinolaringológica, abrangendo os tumores do nariz interno, seio nasal, nasofaringe, lábios, cavidade oral, orofaringe, laringe, hipofaringe, ouvido, glândulas salivares, e paragangliomas, tumores dos pulmões dentre os quais carcinomas não-parvicelulares, carcinomas brônquicos parvicelulares, tumores de mediastino, tumores do trato gastrointestinal, dentre os quais tumores do esôfago, estômago, pâncreas, fígado, vesícula biliar e trato biliar, intestino delgado, cólon e carcinomas retais e carcinomas anais, tumores urogenitais dentre os quais os dos rins, ureter, bexiga, próstata, uretra, pênis e testículos, tumores ginecológicos tais como os de colo do útero, vagina, vulva, câncer uterino, doença trofoblástica maligna, carcinoma ovariano, tumores do tubo uterino (Tuba Faloppii), tumores da cavidade abdominal, carcinomas mamários, tumores dos órgãos endócrinos, dentre os quais os de tireóide, paratireóide, córtex adrenal, tumores endócrinos do pâncreas ·, tumores carcinóides e síndrome carcinóide, neoplasias endócrinas múltiplas, sarcomas ósseos e de tecidos moles, mesoteliomas, tumores de pele, melanomas dentre os quais melanomas cutâneos e intraoculares, tumores do sistema nervoso central, tumores durante a infância, dentre os quais retinoblastoma, Tumor de Wilms, neurofibromatose, neuroblastoma, Família de tumores do sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma, linfomas dentre os quais linfomas não-Hodgkin, linfomas cutâneos de célula T, linfomas primários do sistema nervoso central, Doença de Hodgkin, leucemias dentre as quais leucemias agudas, leucemidas mielóides e linfáticas crônicas, neoplasmas de célula do plasma, síndromes de mielodisplasia, síndromes paraneoplásticas, metástases com tumor primário desconhecido (Síndrome de CUP), carcinomatose peritoneal, males relacionados à imunossupressão dentre os quais Os ligados à AIDS, como Sarcoma de Kaposi, linfomas associados à AIDS, linfomas do sistema nervoso central associados à AIDS, doença de Hodgkin associada à AIDS, e tumores anogenitais associados à AIDS, males relacionados a transplantes, tumores em metástase dentre os quais metástases cerebrais, metástases pulmonares, metástases hepáticas, metástases ósseas, metástases pleurais e pericárdicas e ascites malignas.