BRPI0711634A2 - métodos e composições para obter plantas transgênicas isentas de marcador - Google Patents

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Michael W Petersen
Shihshieh Huang
Paul S Chomet
David Walters
Susan Johnson
Larry Gilbertson
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Abstract

MéTODOS E COMPOSIçõES PARA OBTER PLANTAS TRANSGêNICAS ISENTAS DE MARCADOR. Trata-se de métodos e composições para a identificação de semente transgênica que contêm um transgene de interesse, porém desprovida de um gene marcador. O uso de uma seqüência de identificação que resulta em um fenótipo detectável aumenta a eficiência de triagem da semente e plantas em que as seqüências de transgene não ligadas a um gene de interesse se segregaram da seqüência que codifica um gene de interesse.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA OBTER PLANTAS TRANSGÊNICAS ISENTAS DE MARCADOR".
Antecedentes da Invenção
Esse pedido reivindica a prioridade de Pedido Provisório norte- americano nQ de série 60/799.875, depositado em 12 de maio de 2006, cuja descrição total está incorporada aqui à título de referência.
1. CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção geralmente refere-se a plantas transgênicas. Mais especificamente, a invenção se refere à identificação e remoção de DNA indesejado ou desnecessário em plantas transformadas.
2. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
A identificação de DNA transgênico desnecessário ou indeseja- do em plantas transformadas vem sendo o assunto de inúmeras investiga- ções e diversos métodos diferentes foram examinados em tentativas para eliminar essas seqüências transgênicas de tais plantas (por exemplo, Han- son etal., 1999; Dale et al., 1991; Ebinuma et al., 1997; Yoder et al., 1994; Kononov et. al., 1997; Hare and Chua, 2002; Scutt et al., 2002; Puchta, 2003; de Vetten et al., 2003; Halpin, 2005; Pedido U.S. Publicado 20030110532; Pedido U.S. Publicado 20040237142; Patente U.S. 6.458.594). Em geral, é vantajoso identificar plantas que não incluem DNA transgênico que não contribuem para uma característica agronomicamente útil da planta transgênica.
Muitos métodos para a introdução de transgenes em plantas por transformação mediada por Agrobacterium utilizam um T-DNA (DNA transfe- rido) que incorpora um transgene e elementos genéticos associados, e transfere esses no genoma de uma planta. Geralmente, o(s) transgene(s) é/são cercado(s) por uma molécula de DNA de margem direita (RB) e uma molécula de DNA de margem esquerda (LB), e é/são transferidos no geno- ma da planta, integrando-se em um ou mais locais. Foi observado que quando uma construção de DNA contiver mais de um T-DNA, esses T-DNAs e os transgenes contidos dentro dessa podem ser integrados no genoma da planta em locais separados (Framond et ai, 1986). Isso é referido como co- transformação.
O processo de co-transformação pode ser realizado pela entrega dos T-DNAs com uma mistura de cepas de Agrobacterium transformadas com plasmídeos que conduzem os T-DNAs separados. A co-transformação também pode ser realizada ao transformar uma cepa de Agrobacterium com duas ou mais construções de DNA1 cada uma contendo um T-DNA. Um mé- todo adicional emprega dois T-DNAs sobre um único vetor de DNA e identifi- car células ou plantas transgênicas que integraram os T-DNAs em locais diferentes. Em um sistema de transformação não-mediado por Agrobacteri- um, tal como, um método físico para introduzir o DNA que inclui bombarde- amento com microprojéteis, duas moléculas de DNA poderiam ser indepen- dentemente integradas no genoma alvo, e então se separam independente- mente em uma geração subseqüente. O uso de 2 construções de T-DNA que permitem a inserção independente de seqüências e sua segregação genética, também foi descrito (por exemplo, Patente U.S. 5.731.179; Zhou et ai, 2003; Breitler etal., 2004; Sato etal., 2004). Embora a descrição anterior facilite o entendimento da técnica, ainda há necessidade de métodos e com- posições aprimoradas para obter plantas isentas de marcador para produzir um desenvolvimento de produto mais eficaz. Os processos de triagem ante- riormente descritos exigem muita mão-de-obra, por exemplo, requerem Sou- thern blot ou análise de PCR™ após o crescimento de material vegetal RO e/ou R1.
A Publicação U.S. 20060041956 descreve o uso de um gene marcador visual em conjunto com a transformação mediada por Agrobaeteri- um. Entretanto, a publicação não descreve qualquer método em que tais marcadores estão ligados a um gene marcador selecionável ou verificável e não-ligado a um gene de interesse. Assim, ainda há uma grande necessida- de na técnica de métodos e composições que poderiam aprimorar a facilida- de e eficiência com tais plantas desprovidas de seqüências e marcadoras e/ou outro DNA transgênico que não é agronomicamente útil pode ser identi- ficado e abortado. Sumário da Invenção
Em um aspecto, a invenção proporciona um método para prepa- rar sementes isentas de marcador de uma planta transgênica que compre- ende as etapas de: a) obter sementes de uma planta transgênica transfor- mada com um primeiro segmento de DNA que compreende um ácido nucléi- co de interesse e um segundo segmento de DNA que compreende um mar- cador vegetal física e/ou geneticamente ligado a um cassete de DNA que é ligado de modo operacional a um promotor funcional na semente, sendo que o cassete de DNA confere um fenótipo detectável às sementes que compre- endem o cassete de DNA; b) classificar as sementes pela ausência de fenó- tipo detectável; e c) selecionar pelo menos uma primeira semente que é desprovida do fenótipo detectável para obter uma semente que é isenta do gene marcador. Em uma modalidade, a etapa c) compreende ainda avaliar a semente pela presença do ácido nucléico de interesse e selecionar uma se- mente que compreende o ácido nucléico de interesse e é desprovida do ge- ne marcador selecionável. Em algumas modalidades, o gene marcador é um gene marcador selecionável ou verificável.
Em algumas modalidades, o cassete de DNA pode ser fundido de maneira traducional ou transcricional com o gene marcador selecionável; ou seja, esse pode codificar um RNA que é fundido de maneira traducional ou transcricional com o gene marcador selecionável. Em uma modalidade adicional, o cassete de DNA compreende um fragmento de DNA anti-senso ou senso com pelo menos 19 ou 21 bp de homologia a um gene endógeno, por exemplo, em que o fragmento de DNA anti-senso ou senso é ligado de modo operacional a um promotor funcional em uma semente. Ainda em ou- tra modalidade, o cassete de DNA compreende um par de repetições inverti- das de um fragmento de DNA, em que cada fragmento possui um tamanho de pelo menos 19 ou 21 bp, e em que o fragmento de DNA é homólogo a um gene endógeno, ligado de modo operacional a um promotor funcional na semente. A repetição invertida de um fragmento de DNA homólogo a um gene endógeno também pode ser integrada em um íntron dentro do gene marcador selecionável. Em algumas modalidades, o cassete de DNA codifi- ca um RNA senso ou anti-senso que compreende pelo menos 19 ou 21 nu- cleotídeos em que o fragmento de DNA é homólogo a um gene endógeno.
Em um método para preparar sementes isentas de marcador de acordo com a invenção, a semente selecionada pode ser desprovida de um gene verificável ou selecionável e cassete de DNA. A obtenção de sementes de uma planta transgênica pode compreender transformar ou co-transformar a planta transgênica ou um progenitor da mesma de qualquer geração ante- rior com primeiro e segundo segmentos de DNA em construções de DNA separadas. A obtenção de sementes de uma planta transgênica também pode compreender transformar a planta transgênica ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com uma única construção de DNA que compreende o primeiro e o segundo segmentos de DNA. O primeiro e o segundo segmentos de DNA podem ser ligados por seqüências de margem de T-DNA diferentes. Em um método da invenção, uma planta transgênica pode ser produzida ao transformar a planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com uma construção de DNA que compreende (i) o primeiro segmento de DNA flanqueado por margens de T-DNA esquerda e direita, e (ii) o segundo segmento de DNA flanqueado por um segundo con- junto de margens de T-DNA esquerda e direita, em que o segundo segmento de DNA compreende, ainda, um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional na planta transgênica. O primeiro e o segundo segmentos de DNA podem ou não ser geneticamente ligados na planta transgênica.
As plantas transgênicas usadas de acordo com a invenção po- dem ser produzidas ao introduzir o primeiro e o segundo segmentos de DNA na planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior por meio da transformação mediada por uma cepa bacteriana selecionada do gênero Agrobacterium, fíhizobium, Mesorhizobium ou Sinorhizobium. As plantas transgênicas também podem ser produzidas, por exemplo, por bombardea- mento com microprojéteis.
Um marcador selecionável usado com a invenção pode codificar um produto selecionado do grupo que consiste em CP4 EPSPS, bar, DMO, NptlI, glifosato acetil transferase, acetolactato sintase mutante, DHFR resis- tente a metotrexato, dalapon desalogenase, PMI, Protox, higromicina fosfo- transferase e antranilato sintase resistente a 5-metil triptofano. Uma seqüên- cia de cassete de DNA para uso com a invenção pode ser selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste em crtB, gus, gfp, sacB, lux, um ge- ne da síntese de antocianina, fator de transcrição DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, AFR2, ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, splA, repetições invertidas de zeína, B-peru, e levedura ATP-PFK. O cassete pode ser ligado de modo operacional a um promotor funcional em um tecido selecionado de um embrião, endosperma da semente, cotilédone, aleurona e tegumento. O promotor pode ser, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em um promotor de napina, um promotor de beta-faseolina, um promotor de subuni- dade beta-conglicinina, um promotor de zeína, um promotor de OsgM, um promotor de oleosina, um promotor de sintase de amido, um promotor de globulina 1, um promotor de cevada LTP2, um promotor alfa-amilase, um promotor quitinase, um promotor beta-glucanase, um promotor cisteína pro- teinase, um promotor glutaredoxina, um promotor de HVA1, um promotor serina carboxipeptidase II, um promotor catalase, um promotor alfa- glucosidase, um promotor beta-amilase, um promotor VP1, um promotor USP, promotor USP88, promotor USP99, Lectina, e um promotor bronze2. O fenótipo detectável pode ser avaliado pela detecção de uma atividade catalí- tica. O fenótipo detectável pode ser selecionado a partir do grupo que con- siste em cor de semente, opacidade de semente, germinabilidade de semen- te, tamanho de semente, viabilidade de semente, formato de semente, textu- ra de semente, e uma semente defeituosa ou abortada. A triagem de semen- tes pode ser feita por uma máquina de seleção de semente automática.
Em outro aspecto, a invenção proporciona uma construção de DNA que compreende (a) um primeiro segmento de DNA que compreende margens de T-DNA esquerda e direita que flanqueiam um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas, e (b) um segundo segmento de DNA que compreende um segundo conjunto de mar- gens de T-DNA esquerda e direita que flanqueia um promotor funcional em uma semente ligada de modo operacional a um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável em sementes que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas. O gene de interesse pode conferir uma característica selecionada do grupo que consiste em tolerância a herbicida, resistência a inseto ou praga, resistência à doenças, biomassa aumentada, metabolismo de ácido graxo modificado, metabolismo de carboidrato modificado, e quali- dade nutricional modificada. Na construção, o cassete de DNA e gene mar- cador selecionável podem ser ligados de modo operacional ao mesmo pro- motor. Em uma modalidade, o cassete de DNA e o gene marcador selecio- nável são ligados de modo operacional a diferentes promotores. Em modali- dades específicas, o gene marcador selecionável codifica um produto sele- cionado do grupo que consiste em CP4 EPSPS, fosfinotricina acetiltransfe- rase, DMO, Nptll, glifosato acetil transferase, acetolactato sintase mutante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon desalogenase, PMI, Protox, higro- micina fosfotransferase e antranilato sintase resistente a 5-metil triptofano. Em outras modalidades, o cassete de DNA é selecionado do grupo que con- siste em fator de transcrição crtB, gus, gfp, sacB, lux, um gene de síntese de antocianina, DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, AFR2, ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, splA, repetições invertidas de zeína, B-peru, e levedura ATP- PFK. O cassete de DNA pode ser ligado de modo operacional a um promo- tor funcional em um tecido selecionado do grupo que consiste em um embri- ão, endosperma de semente, cotilédone, aleurona e tegumento. Em uma modalidade, o cassete de DNA é ligado de modo operacional a um promotor selecionado do grupo que consiste em um promotor de napina, um promotor de beta-faseolina, um promotor de subunidade beta-conglicinina, um promo- tor de zeína, um promotor de Osgt-1, um promotor de oleosina, um promotor de sintase de amido, um promotor de globulina 1, um promotor de cevada LTP2, um promotor alfa-amilase, um promotor quitinase, um promotor beta- glucanase, um promotor cisteína proteinase, um promotor glutaredoxina, um promotor de HVA1, um promotor serina carboxipeptidase II, um promotor catalase, um promotor alfa-glucosidase, um promotor beta-amilase, um pro- motor VP1, um promotor USP88 ou USP99, e um promotor bronze2.
Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona células e plan- tas transgênicas transformadas com uma construção proporcionada aqui. Em uma modalidade, uma planta transgênica que é proporcionada é co- transformada com uma construção de DNA que contém um primeiro seg- mento de DNA compreendendo margens de T-DNA esquerda e direita que flanqueiam um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas e uma segunda construção de DNA que contém um segundo segmento de DNA compreendendo um segundo conjunto de mar- gens de T-DNA esquerda e direita que flanqueiam um promotor funcional em uma semente ligada de modo operacional a um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável em sementes que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas. As células de tal planta também são proporcionadas.
Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona uma construção de DNA que compreende margens de T-DNA esquerda e direita, em que um primeiro segmento de DNAque compreende um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem direita e um segundo segmento de DNA que compreende um cas- sete de DNA que confere um fenótipo detectável às sementes de plantas que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador, tal como, um gene marcador selecionável, ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem esquerda.
Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona uma construção de DNA que compreende margens de T-DNA esquerda e direita, em que um primeiro segmento de DNA que compreende um cassete de DNA que confe- re um fenótipo detectável às sementes de plantas que compreendem o cas- sete de DNA e um gene marcador selecionável ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem direita e um segundo segmento de DNA que compreende um gene de interesse liga- do de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem esquerda. Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona uma construção de DNA que contém duas margens de T-DNA direitas, em que um primeiro segmento de DNA que compreende um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após uma margem direita e um segundo segmento de DNA que compreende um cas- sete de DNA que confere um fenótipo detectável às sementes de plantas que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador selecionável li- gado de modo operacional a um promotor funcional em plantas localizado após a outra margem direita.
Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona uma seqüência de ácido nucléico isolada que compreende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou uma seqüência com pelo menos 70%, 75%, 85% ou 95% identidade com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, e que codifica um polipeptídeo com atividade de fitoeno sintase. Em uma modalidade, a invenção também proporciona uma construção de DNA recombinante que compreende uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, ou uma construção de DNA recombinante que compreende uma seqüência com pelo menos 71%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, e codifica um polipeptídeo com atividade de fitoeno sintase, ligado de modo operacional a um promotor funcional heterólogo em uma planta. Uma célula hospedeira que compreende tal seqüência, sendo que a célula é uma célula bacteriana ou uma célula vegetal é outra modalidade da invenção. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma planta ou semente transgê- nica que compreende a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou uma seqüência com pelo menos 71%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, e codifica um poli- peptídeo com atividade de fitoeno sintase.
Breve Descrição dos Desenhos
Os seguintes desenhos fazem parte do presente relatório descri- tivo e estão incluídos para mostrar adicionalmente certos aspectos da pre- sente invenção. A invenção pode ser melhor entendida a título de referência aos desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentadas aqui.
FIGURA 1. Diagramas Esquemáticos de: (A) pMON10338; (B) pMON10339; e (C) pMON67465.
FIGURA 2. Expressão de CrtB em tecidos de soja transformados com pMON67465.
FIGURA 3. Expressão de CrtB em semente do evento A33908.
FIGURA 4. Expressão de crtB, gus, and CP4/EPSPS em semen- te R1 imaturas.
FIGURA 5. Expressão de crtBem semente R1 madura. FIGURA 6. Coloração com GUS de semente pMON67465.
FIGURA 7. PCR de CP4 & CrtB sobre sementes positivas GUS.
FIGURA 8. Comparação de abordagens de ligação-Southern e marcador verificável para triagem de eventos transgênicos.
FIGURA 9. Sumário Esquemático de seqüências de DNA trans- feridas pelo uso de construção que compreende um gene verificável ligado aos genes marcadores CP4 selecionáveis de sementes isentas de marca- dor. A) GOI localizado em um T-DNA flanqueado com um RB e LB e fisica- mente ligado a um segundo T-DNA que contém um gene verificável ligado a um gene marcador selecionável CP4 em uma construção usada para a transformação mediada por Agrobacteriurrr, B) Um vetor que contém duas margens, o GOI é colocado após uma RB enquanto os genes marcadores examináveis e selecionáveis são colocados após a segunda RB ou após uma LB juntamente com a cadeia principal; C) O GOI e os genes examiná- veis-DNAs são separados em dois vetores e transformados tanto em uma célula Agrobacterium como em células de Agrobacterium separadas; D) Possível ligação de dois segmentos de DNA do GOI e genes marcadores examináveis e selecionáveis. Apenas o GOI separado irá mostrar aparência de semente normal, enquanto as células que contêm o gene verificável mos- tram um fenótipo visível; E) Dois segmentos de DNA separados contêm tan- to o GOI como os genes marcadores examináveis e selecionáveis usados para a transformação mediada não-bacteriana.
FIGURA 10. pMON6742Q representa uma construção de GOI para co-transformação.
FIGURA 11. Plasmídeo pMON99575 contendo fosfofrutoquinase dependente de ATP Schizosaccharomyces pombe conduzida pelo promotor de zeína específico de semente.
FIGURA 12. Espiga de milho que expressa a fosfofrutoquinase dependente de ATP de levedura específica de semente eliminou o desen- volvimento de grão normal.
FIGURA 13. Diagrama esquemático de construções codificado- ras de dsRNA usadas para demonstrar que as repetições invertidas coloca- das dentro de um íntron de um gene marcador resultam em um fenótipo visí- vel.
FIGURA 14. Repetições invertidas incluídas em um íntron origi- nam um fenótipo visível.
FIGURA 15. Silenciamento de α-zeínas em grãos de milho resul- ta em um fenótipo visível.
FIGURA 16. Diagrama esquemático de pMON83530 contendo KAS4.
FIGURA 17. Progênie de sementes de soja transformadas com pMON83530. As sementes à esquerda são encolhidas devido à expressão de KAS4 e indicam a presença de marcador selecionável, enquanto as se- mentes à direita são normais e isentas de marcador.
FIGURA 18. Diagrama esquemático de pMON107314 contendo KAS4 útil como uma seqüência de identificação em uma construção de DNA 2T.
FIGURA 19. Diagrama esquemático de pMON68581 contendo um gene splA útil como um gene de identificação.
FIGURA 20. Progênie de sementes de soja transformadas com pMON68581. As sementes à direita são encolhidas devido à expressão de splA e indicam a presença do marcador verificável ou selecionável, enquanto as sementes à esquerda são normais e isentas de marcador.
FIGURA 21. Diagrama esquemático de formatos de vetor de DNA 2T. Descrição Detalhada da Invenção
A seguir está uma descrição detalhada da invenção proporcio- nada para auxiliar os elementos versados na técnica na prática da presente invenção. Os elementos versados na técnica podem fazer modificações e variações nas modalidades descritas aqui sem que se abandone o espírito ou escopo da presente invenção.
A invenção supera as deficiências na técnica anterior ao propor- cionar construções e métodos que permitem distinguir de maneira eficaz as sementes desprovidas de uma seqüência de identificação e seqüência de gene marcador, porém incluindo um gene ou genes de interesse (GOI), de sementes que contêm uma seqüência de gene de identificação e seqüência de gene marcador, com base em um fenótipo conferido por um gene de i- dentificação expresso por semente, seqüência, ou cassete. Em particular, a presente invenção proporciona, em uma modalidade, construções e métodos de transformação para a transformação de células vegetais que incluem: (i) um gene de interesse; e (ii) uma seqüência de identificação expressa em semente e fisicamente ligada a um gene marcador selecionável ou verificá- vel que pode ser expresso em vários tecidos vegetais, em que o método de construção e/ou transformação é projetado de modo que os elementos gené- ticos de (i) e (ii) possam se integrar independentemente no genoma da plan- ta, e assim, se segregarem geneticamente uns dos outros.
A expressão ou ausência da mesma da seqüência de identifica- ção em tecidos de semente permite a identificação direta de sementes e plantas que são desprovidas da seqüência de identificação expressa por semente e o gene marcador selecionável ou verificável fisicamente ligado, enquanto permite a seleção de semente e plantas que ainda contêm o transgene de interesse. A seleção de semente inclusive o gene de interesse e de seqüências desprovidas de gene marcador no nível de semente repre- senta um avanço significativo, pois evita a necessidade de métodos de tria- gem anteriormente utilizados que são comparativamente dispendiosos e re- querem muita mão-de-obra. Adicionalmente, pode-se economizar tempo vis- to que a triagem pode ser feita antes ou durante a germinação sem requerer crescimento da próxima geração de plantas até um tamanho que permite a colheita de tecido, como necessário para análise de ligação Southern, por exemplo.
Em uma modalidade, a transformação de tecido vegetal é reali- zada por um Agrobacterium ou outro método mediado por Rhizobia (Veja, por exemplo, Pedido de Patente Provisório n° de série U.S. 60/800.872, de- positado em 16 de maio de 2006, intitulado "Use of Non-Agrobacterium Bac- terial Species for Plant Transformation" e protocolo do procurador assinado No. MONS:100USP1, cuja descrição total está especificamente incorporada aqui a título de referência), e as seqüências de DNA inclusive a seqüência de identificação expressa na semente e o gene marcador selecionável ou verificável fisicamente ligado estão presentes juntamente em um T-DNA ou outra seqüência (por exemplo, cadeia principal de vetor) que é transferida em uma célula vegetal (por exemplo, flanqueada por seqüências de RB e/ou LB de T-DNA ou sem uma seqüência de margem). A seqüência de identifi- cação e gene marcador podem ser transferidos para a planta fisicamente ligada, enquanto o gene de interesse está presente em um T-DNA separado flanqueado por suas próprias seqüências de RB e LB, ou outra seqüência transferida em uma célula vegetal, pode ser integrado em um local indepen- dente (por exemplo, FIGURA 21). O marcador selecionável e/ou verificável permite a identificação de tecidos vegetais transformados. As plantas férteis podem ser obtidas e autofecundadas ou cruzadas em um esquema de culti- vo para acompanhar a segregação de fenótipos na próxima geração. As es- tratégias para realizar tal cultivo são bem conhecidas na técnica, e podem variar em detalhes entre plantas diferentes. A expressão de semente, ou ausência de expressão, da seqüência de identificação permite uma rápida identificação de semente com relação à presença de seqüências marcado- ras e de identificação. O gene de interesse, por exemplo, pode conter pelo menos um cassete de expressão de planta que codifica uma característica selecionada do grupo que consiste em tolerância a herbicida, resistência a antibiótico, resistência a inseto, resistência a doenças, resistência a proble- mas (por exemplo, estiagem e frio), eficiência de uso de nutriente aumenta- da, teor nutritivo aumentado (por exemplo, aminoácido, proteína, açúcares, carboidratos, ácidos graxos, e/ou óleo), sistemas de esterilidade, enzimas industriais (por exemplo, produtos farmacêuticos e enzimas de processa- mento de biocombustíveis) e rendimento aumentado.
As seqüências que podem ser transferidas em uma célula vege- tal (por exemplo, T-DNAs) podem estar presentes sobre um vetor de trans- formação em uma cepa bacteriana que é utilizada para transformação. Em outra modalidade, as seqüências inclusive a seqüência de identificação e marcador selecionável de planta, e a(s) seqüência(s) que compreende(m) o(s) gene(s) de interesse pode(m) estar presente(s) em vetores de transfor- mação separados na cepa bacteriana. Ainda em outra modalidade, o T-DNA que inclui a seqüência de identificação e marcador selecionável da planta e o T-DNA que compreende o gene de interesse podem ser encontrados em ou cepas células bacterianas separadas usadas juntamente para a transfor- mação.
Ainda em outra modalidade, as seqüências de DNA que incluem o (i) gene de interesse; e (ii) a seqüência de identificação expressa em se- mente e fisicamente ligada a um gene marcador selecionável ou verificável pode ser introduzida em uma célula vegetal por um método físico, tal como, bombardeamento com microprojéteis. Em tal modalidade, as seqüências de DNA de (i) e (ii) podem estar localizadas em fragmentos de DNA separados que podem ser misturados uns com os outros antes ou durante o revesti- mento de microprojéteis com DNA. As seqüências de DNA podem estar pre- sentes sobre um único microprojétil ou essas podem estar presentes em mi- croprojéteis separados que são misturados antes do bombardeamento.
O fenótipo transportado pela seqüência de identificação pode ser obtido por superexpressão ectópica de um gene heterogênico ou endógeno ligado a um promotor constitutivo ou específico de semente, ou por infra- regulação de um gene endógeno que utiliza RNA anti-senso, interferência de RNA ou tecnologia de supressão. Exemplos do gene endógeno podem inclu- ir, porém sem caráter limitativo, genes envolvidos em metabolismo de açú- car/amido, metabolismo de proteína e metabolismo de ácido graxo. Em uma modalidade, a expressão de semente da seqüência de identificação resulta em um fenótipo detectável na semente de uma planta transgênica que contém uma seqüência de identificação. Em algumas moda- lidades, o fenótipo pode ser detectado por inspeção visual, e pode incluir uma alteração na cor da semente, opacidade (ou translucidez), fluorescên- cia, textura, tamanho, formato, capacidade de germinação, viabilidade, ou geralmente qualquer componente ou característica que é física ou bioquimi- camente avaliável e diferente daquele encontrado no genótipo de receptor não-transgênico. Em certas modalidades, a seqüência de identificação inclui gusA, gfp (Pang et ai, 1996), fitoeno sintase, ou gene codificador de fitoeno desaturase, ou um gene de antocianina (PI, Lc, B-Peru1 C1, R, Rc, mybA ou mybl (por exemplo, Selinger et ai, 1998; Ludwig et ai, 1989; Himi et ai, 2005; Kobayashi et ai, 2002)). Em uma modalidade particular, o gene de identificação compreende um gene crtB que codifica uma fitoeno sintase (Patente N2s U.S. 5.429.939; US 6.429.356; Patente U.S. 5.545.816), inclusi- ve um gene que compreende uma seqüência crtB otimizada por códon para expressão em uma planta monocotiledônea, tal como, planta de milho. Outro exemplo de gene que poderia ser usado nesse aspecto é um gene envolvido na produção de pigmento de semente.
Em outras modalidades, o fenótipo é avaliável pela detecção de uma atividade catalítica. Ainda em outras modalidades, o fenótipo é um fenó- tipo de ablação de tecidos, por exemplo, um bloqueio na formação de pólen, óvulo ou tecido de semente. As composições e métodos que silenciam os genes requeridos para a produção ou viabilidade de gametas, reduzindo ou impedindo as fertilizações que incluem o gene marcador, também são pre- vistos. Por exemplo, as seqüências que poderiam ser usadas resultam no silenciamento de genes requeridos para o desenvolvimento e viabilidade de pólen. O pólen que é proveniente de segregantes meióticos que transportam o gene marcador poderia não se desenvolver ou poderia ser inviável impe- dindo, assim, a transmissão do gene marcador à progênie através do pólen.
Em polinizações cruzadas, toda a progênie poderia ser isenta de marcador. O uso de seqüências que resultam em silenciamento de outros genes endó- genos (por exemplo, tecnologias de RNAi inclusive miRNA) para resultar em um fenótipo de semente também é previsto. Tais genes incluem, porém sem caráter limitativo: genes que codificam ou modificam a expressão de proteí- nas de armazenamento de semente tais como, zeínas, Opaque2, Waxy1 e outros genes que codificam as proteínas envolvidas em acúmulo de carboi- drato, proteína e/ou lipídeo em sementes.
A expressão de uma seqüência de identificação que confere um fenótipo de pólen não-viável também é desejado, pois apenas os grãos de pólen sem a seqüência de identificação serão capazes de fecundar os óvu- los aumentando, assim, a produção de sementes isentas da seqüência de identificação e a seqüência marcadora quando a linhagem transgênica que transporta a seqüência de identificação sob o controle de um promotor espe- cífico de pólen for usada como um polinizador macho. A seqüência de identi- ficação pode produzir uma proteína que é letal ao pólen ou inibitória da ger- minação de pólen. Alternativamente, a expressão de um par de repetições invertidas homólogas a um gene de pólen endógeno essencial pode ser u- sada para silenciar o gene que torna o pólen não-viável. Exemplos de genes e promotores específicos de pólen são conhecidos pelos versados na técni- ca e incluem, por exemplo, genes LAT52 e LAT59 e promotores de tomate, como descrito (Eyal et al, 1995).
Em outra modalidade, a seqüência de identificação pode ser ex- pressa tanto na semente como no pólen para aumentar, adicionalmente, a seleção de sementes com o gene de interesse como para eliminar as se- mentes com a seqüência de identificação e o gene marcador. Isso pode ser realizado utilizando-se uma seqüência de identificação compreendida de dois transgenes; sendo que um desses é expresso na semente e o outro é expresso no pólen. Alternativamente, um promotor que pode expressar a mesma seqüência de identificação no pólen e na semente também pode re- sultar em um fenótipo detectável tanto no pólen como na semente. Exemplos de promotores que são expressos no pólen e na semente são os promotores do gene Waxy de milho (zmGBS; Shure et al., 1983), e o gene ADP-glicose pirofosforilase de pequena subunidade de arroz (osAGP; Anderson et al., 1991). Os padrões de expressão de pólen e semente também estão descri- tos em Russell and Fromm1 1997.
A seqüência de identificação pode alterar alternativamente o me- tabolismo de carboidrato, proteína, lipídeo, ou outros produtos de célula ou semente para produzir um fenótipo detectável. Em uma modalidade, a se- qüência de identificação permite a expressão específica de endosperma de um gene sacB que codifica uma Ievansucrase ou uma fosfofrutoquinase de- pendente de ATP de levedura (ATP-PFK) que elimina o acúmulo de amido em sementes que contêm a seqüência de identificação e o gene marcador (Caimi et ai, 1996; FIGURA 12). A seqüência de identificação pode ser um gene. A seqüência de identificação pode, ainda, codificar uma fusão trans- cricional ou traducional (por exemplo, Publicação de Patente U.S. 6.307.123; U.S. 20060064772).
A Patente U.S. 6.307.123 se refere à construção de uma fusão traducional entre um gene marcador selecionável (npfll) e um gene marca- dor verificável (gfp). O método pode ser aplicado para produzir uma fusão entre uma seqüência de identificação descrita aqui e um marcador selecio- nável ou verificável descrito aqui.
Outro método que pode ser usado para produzir uma fusão de polipeptídeo se baseia na rota de processamento de Ubiquitina (Ub). Esse método pode ser usado para clivar um polipeptídeo longo que compreende dois domínios de proteína em duas proteínas ativas separadas. Nesse mé- todo, um único cassete de gene pode codificar dois ORFs, onde os dois ORFs, por exemplo, para crtB e EPSPS-CP4 são separados pelos 14 ami- noácidos C-terminal de Ub, seguidos por uma seqüência completa de Ub. Após a tradução in vivo, as enzimas endógenas desubiquitinantes (DUBs) clivam a poliproteína em três unidades separadas: 1) a proteína N-terminal, que compreende a seqüência de identificação crtB que termina nos 14 ami- noácidos C-terminal de Ub; 2) um monômero de Ub; e 3) o polipeptídeo C- terminal, que codifica um marcador selecionável EPSPS-CP4. Tais métodos são conhecidos pelos elementos versados na técnica (por exemplo, Walker etal, 2007). Uma fusão transcricional entre uma seqüência de identificação e um marcador selecionável ou verificável pode ser realizada utilizando-se sí- tios internos de entrada do ribossomo (IRES). Por exemplo, poderia ser rea- lizada uma transcrição que codifica o ORF de crtB seguido pelo ORF de ESPSP-CP4 com um elemento IRES funcional posicionado entre esses. Di- versos IRES são conhecidos pelos versados na técnica (veja, por exemplo, Dinkova et al. 2005 e referências a essa; e Patente U.S. 7.119.187, incorpo- rada aqui a título de referência).
O fenótipo da seqüência de identificação no tecido da semente também pode ser detectado por métodos que incluem métodos visuais, bio- químicos, imunológicos e à base de ácido nucléico (por exemplo, baseados em PCR), entre outros. A seqüência de identificação pode conferir um fenó- tipo detectável no tecido da semente que pode ser distinguido do fenótipo do gene marcador. O fenótipo conferido pela seqüência de identificação pode incluir germinação de semente alterada. A seqüência de identificação pode ser expressa em uma ou mais partes de uma semente (núcleo), inclusive o embrião, endosperma, cotilédone(s), e tegumento (casca), de modo que um fenótipo possa ser reconhecido.
A seqüência de identificação também pode originar um fenótipo sem semente. Para realizar a ablação do tecido, em uma modalidade, a se- qüência de identificação dirige a expressão específica do óvulo de defH9- iaaM ou rolBem plantas (por exemplo, Rotino et ai 1997, Carmi et ai 2003, GenBank ΑΜ422760, X64255, AE009418), que elimina o desenvolvimento do óvulo e resulta em um fenótipo sem semente no marcador e seqüência de identificação contendo ovários. Ainda em outra modalidade, a seqüência de identificação dirige a expressão de OsCDPK2 em cereais que atrapalham o desenvolvimento de semente (Morello et ai 2000; e.g., GenBank Y13658).
Os elementos genéticos também podem ser projetados para su- primir a expressão de um gene endógeno, resultando na produção de um fenótipo de semente que permite a distinção de sementes que contêm o ge- ne marcador daqueles que não contêm. Os elementos genéticos dessa se- qüência de identificação são fisicamente ligados ao gene marcador, por e- xemplo, inseridos no cassete de DNA marcador, de modo que o fenótipo da semente seja ligado mediante a presença do marcador, permitindo a rápida identificação de sementes que contêm marcador.
O RNAi pode ser usado para silenciar um ou mais genes resul- tando em um fenótipo de semente facilmente classificado, de preferência, visível. As seqüências de DNA requeridas por um fenótipo de semente me- diado por RNAi estão posicionadas no mesmo T-DNA que o gene marcador. Qualquer progênie de semente que contém o gene marcador também pode- ria apresentar um fenótipo de semente e poderia ser facilmente identificada.
Pode não ser necessário que tais se desenvolvam e sejam verificadas quan- to à presença do gene marcador. Assim, apenas as sementes sem o fenóti- po conferido pela seqüência de identificação se desenvolvem e/ou são avali- adas quanto à presença do GOI. Dependendo se as sementes forem autofe- cundadas ou cruzadas, esse método reduz pelo menos 3X o número de se- mentes necessário para serem plantadas e verificadas para espécies de plantas autofecundadas ou 1X para espécies de plantas cruzadas.
Uma ampla gama de composições é conhecida pelos versados na técnica, essas podem ser usadas para silenciar um gene alvo utilizando rotas relacionadas com RNAi. Uma modalidade consiste em montar um cas- sete de DNA que irá transcrever uma repetição invertida de seqüências, de modo a produzir um RNA de cadeia dupla (dsRNA), tipicamente, com pelo menos cerca de 19 a 21 bp de comprimento e é correspondente a uma parte de um ou mais genes almejados para silenciamento. O dsRNA pode ter cer- ca de 19 a 21 bp de comprimento e é correspondente a uma parte de um ou mais genes almejados para silenciamento. Esse cassete de DNA que inclui uma seqüência de identificação fica posicionado dentro do mesmo T-DNA que o gene marcador selecionável. Outros métodos para silenciar um gene conhecidos pelos versados na técnica incluem, porém sem caráter limitativo: co-supressão, anti-senso, expressão de miRNAs (naturais ou engenheira- dos), expressão de siRNAs trans-atuantes, e expressão de ribozimas. Qual- quer um desses métodos pode ser usado se as seqüências requeridas para efetuar o silenciamento de gene estiverem posicionadas no mesmo T-DNA que o gene marcador.
A seqüência de identificação pode aumentar ou diminuir o tama- nho da semente. Em uma modalidade, a seqüência de identificação confere a infra-regulação de gene AP2 (por exemplo, GenBank U12546) por interfe- rência de RNA anti-senso ou RNA ou tecnologia de co-supressão (Jofuku et ai, 2005), que resulta em sementes maiores que contêm a seqüência de identificação e os genes marcadores selecionáveis. Um tamanho de semen- te maior também pode ser obtido por expressão ectópica de um gene AFR2 (Schruff et al, 2006; e.g., GenBank Accessions NM_203251; NM_180913), ou fator de transcrição ANT (Mizukami and Fisher, 2000; e.g., GenBank NM_202701, NM_119937, NM_180024, NM_101474, NM_202110). Em ou- tra modalidade, a seqüência de identificação conduz a infra-regulação de um gene LEC2 (por exemplo, GenBank AF400123) ou Snf-1 (GenBank AB101657, AB101656, AB101655) por RNA anti-senso ou RNAi ou tecnolo- gia de co-supressão, que resulta em tamanho de semente reduzido (Mendo- za et al, 2005; Radchuk etal., 2006). O tamanho de semente alterado pode ser facilmente classificado por peso, formato ou peneiragem por meios ma- nuais e/ou mecânicos.
Considera-se especificamente, que as técnicas de triagem au- tomáticas podem ser implementadas com a presente invenção para a identi- ficação de sementes que possuem um fenótipo detectável particular. Dessa maneira, grandes quantidades de sementes podem ser verificadas de ma- neira eficaz e as sementes desprovidas de uma seqüência de identificação podem ser coletadas. As técnicas automáticas podem ser mais rápidas, me- nos dispendiosas e mais precisas do que a confiança em especialistas hu- manos. Tais máquinas de classificação de semente que poderiam ser usa- das dessa maneira foram descritas. Por exemplo, a Patente No. U.S. 4.946.046 descreve um aparelho para classificação de sementes de acordo com a cor. Nessa máquina, as sementes são classificadas de acordo com a cor ao colocar as sementes em fileiras uniformes de indentações em um tambor giratório e passar as sementes sob uma câmera de formação de i- magens digital e uma fonte de luz. As imagens são lidas pela câmera e são passadas para um computador, que também recebe informações de um sensor de velocidade de tambor. O computador gera um sinal que gera um sopro de ar que passa através de uma abertura no fundo de uma endenta- ção que contêm uma semente colorida para coletar tal semente. As semen- tes coletadas são alimentadas em uma tremonha de coleta, e as sementes não-coloridas em uma tremonha separada.
Variando-se o comprimento de onda da fonte de luz usada para a detecção de sementes coloridas, bem como, filtros de barreira colocados entre a semente colorida e a câmera de detecção, potencialmente qualquer marcador de identificação poderia ser detectado com essa técnica. Por e- xemplo, para detectar as sementes que expressam GFP, o comprimento de onda de excitação está no espectro UV de luz azul, tipicamente em cerca de 395 nm. As fontes de luz adequadas para emissão de UV são bem conheci- das pelos versados na técnica, e incluem lâmpadas de xênon ou mercúrio.
Os conjuntos de filtro adequados também são conhecidos pelos versados na técnica, e incluem, por exemplo, um filtro excitador BP450-490, um divisor óptico cromático FT510, e um filtro de barreira BP515-565 (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY). Tais conjuntos de filtros e comprimentos de onda de emis- são são discutidos em mais detalhes em Heim and Tsien, 1996, cuja descri- ção está especificamente incorporada aqui a título de referência em sua tota- lidade.
Mediante o uso de construções inclusive uma ou mais seqüên- cias de identificação, o pó seletivo pode ser estendido a múltiplos genes se- lecionáveis e/ou verificáveis e genes de interesse. Portanto, grandes núme- ros de sementes transgênicas, que representam uma variedade de eventos de transformação diferentes, podem ser verificados de maneira eficaz e a- penas aquelas sementes que possuem {ou não possuem) um conjunto de seqüências de identificação podem ser selecionadas.
Um vetor de DNA recombinante pode ser, por exemplo, um segmento de DNA linear ou um plasmídeo circular fechado. O sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contêm juntamente o DNA total que será introduzido no ge- noma da planta. As moléculas de ácido nucléico como apresentado aqui po- dem ser, por exemplo, adequadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em uma célula vegetal para condu- zir a expressão de uma seqüência de codificação ligada ou outra seqüência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para essa finalidade, e a seleção do vetor apropriado irá depender principalmente do tamanho do ácido nu- cléico que será inserido no vetor e a célula hospedeira particular que será transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes depen- dendo de sua função e do vetor e célula vegetal particular com os quais será usado ou é compatível.
Inúmeros vetores adequados para transformação estável de cé- lulas vegetais ou para o estabelecimento de plantas transgênicas são bem conhecidos, por exemplo, Gelvin et al. (1990). Tipicamente, os vetores de expressão de plantas incluem, porém sem caráter limitativo, um ou mais ge- nes de interesse unidades de transcrição, sendo que cada um inclui: uma região 5' não-traduzida, que inclui seqüências que controlam a transcrição (por exemplo, seqüências promotoras cis-atuantes, tais como, intensificado- res, o sítio de iniciação de transcrição, etc.) e tradução (por exemplo, um sítio de ligação de ribossomo) de uma seqüência de codificação de proteína ligada de modo operacional ("quadro de leitura aberta", ORF); uma região 3' não-traduzida que inclui regiões reguladoras adicionais da extremidade 3' de genes de plantas (Thornburg et al., 1987); An et al., 1989), por exemplo, uma região 3' terminadora para aumentar a estabilidade de mRNA. Alterna- tivamente, um vetor de expressão de plantas pode ser designado para a ex- pressão de uma molécula de mRNA que pode, por exemplo, alterar a ex- pressão genética da planta por um abordagem mediada por RNAi. Ademais, tais construções incluem comumente uma unidade de transcrição de marca- dor selecionável e/ou verificável e, opcionalmente, a origem de replicação ou outras seqüências requeridas para a replicação do vetor em uma células hospedeira bacteriana.
As construções também podem conter os segmentos de DNA de cadeia principal de plasmídeo que proporcionam função de replicação e se- leção de antibióticos em células bacterianas, por exemplo, uma de origem Escherichia colide replicação, tal como, orí322, uma origem com ampla faixa de hospedeiros de replicação, tal como, orN ou oriRi, e uma região de codi- ficação de um marcador selecionável, tal como, Spec/Strp que codifica Tn7 aminoglicosídeo adeniltransferase (aadA) que confere resistência à especti- nomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável, gentamicina (Gm, Gent). Para a transformação de plantas, a cepa bacteriana hospedeira é geralmente Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, LBA4404, EHA101, ou EHA105 que conduz um plasmídeo que possui uma função de transferência da unidade de expressão. Outras cepas conhecidas pelos versados na téc- nica de transformação de plantas podem funcionar na presente invenção.
Os vetores de expressão de plantas incluem opcionalmente si- nais de processamento de RNA, por exemplo, íntrons, que podem ser posi- cionados a montante ou a jusante de uma seqüência de codificação de poli- peptídeo no transgene. Ademais, os vetores de expressão também podem incluir seqüências reguladoras adicionais da região 3' não-traduzida de ge- nes de plantas. Essas regiões 3' não-traduzidas contêm sinais de termina- ção de transcrição de mRNA. Outros elementos móveis contidos em vetores de expressão de plantas podem incluir seqüências líder 5', seqüências de sinal de trânsito, e seqüências de codificação.
Os vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também referidos como um marcador selecionável de plantas. Esse gene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de célula vegetais transformadas desenvolvidas em um regime de cultura seletivo.
Os genes de seleção típicos codificam as proteínas que conferem resistência a agentes seletivos, tais como, antibióticos inclusive herbicidas, ou outras toxi- nas, por exemplo, neomicina, metotrexato, dicamba, glufosinato, ou glifosato. Aquelas células que são corretamente transformadas com uma proteína hete- róloga ou fragmento dessa produzem uma proteína que confere, por exemplo, resistência a fármaco e, assim, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de vários marcadores selecionáveis/verificáveis/classificáveis e genes que codificam os mesmos estão descritos em Miki and McHugh, 2004. Um vetor de expressão para produzir um mRNA também pode conter um promotor induzível ou específico de tecido que é reconhecido na célula hospedeira vegetal e é ligado de modo operacional ao ácido nucléico que codifica a molécula de ácido nucléico, ou fragmento dessa, de interesse.
Os promotores de plantas são discutidos abaixo.
Em uma modalidade, o vetor de transformação de plantas que é utilizado inclui uma molécula de DNA isolada e purificada que inclui um pro- motor heterólogo específico de semente ligado de modo operacional a uma ou mais seqüências de nucleotídeo da presente invenção. Em outra modali- dade, o promotor é expresso por semente, porém não específico de semen- te. Um vetor de transformação de plantas pode conter seqüências de um ou mais genes permitindo, assim, a produção de mais de um mRNA em uma célula vegetal. Um versado na técnica irá avaliar facilmente que os segmen- tos de DNA podem ser combinados em um único segmento de DNA de compósito para a expressão em uma planta transgênica.
Acredita-se que os métodos adequados para a transformação de células hospedeiras para uso com a invenção incluem virtualmente qualquer método por meio do qual o DNA pode ser introduzido em uma célula (veja, por exemplo, Miki et ai, 1993), tal como, por transformação de protoplastos (Patente n2 U.S. 5.508.184; Omirulleh et ai, 1993), por absorção de DNA mediada por dessecação/inibição (Potrykus et a/., 1985), por eletroporação (Patente n- U.S. 5.384.253), por agitação com fibras de carbureto de silício (Kaeppler et a!., 1990; Patente n2 U.S. 5.302.523; e Patente n2 U.S. 5.464.765), por transformação mediada por Agrobacterium (Patente n— 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; 6.384.301) e por aceleração de partículas cobertas com DNA (Patente n— U.S. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; 6.403.865; Padgette et al. 1995), etc. Mediante a aplicação de técnicas, tais como essas, as células virtualmente de qualquer espécie podem ser transformadas de maneira es- tável. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em organismos transgênicos.
O método mais amplamente utilizado para introdução de um ve- tor de expressão nas plantas se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacterium (por exemplo, Horsch et ai, 1985) Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens and A. rhizogenes, respectivamente, conduzem genes responsáveis pela transformação genética da planta. As descrições de sis- temas e métodos de vetor de Agrobacterium para transferência de gene me- diada por Agrobacterium são proporcionadas por inúmeras referências, in- clusive Gruber et aí., 1993; Miki et ai., 1993, Moloney et al., 1989, e Patente n- U.S. 4.940.838 e 5.464.763. Outras bactérias, tais como, Sinorhizobium, Rhizobium, e Mesorhizobium que interagem com plantas podem ser natu- ralmente modificadas para mediar a transferência genética a inúmeras plan- tas diferentes (Broothaerts et ai, 2005). Essas bactérias simbióticas associ- adas às plantas podem se tornar competentes para transferência genética por aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado como de um vetor biná- rio adequado. As seqüências que serão transferidas por meio de um método de transformação mediado por Agrobacterium incluem uma ou mais seqüên- cias de "margem", tais como, seqüências de margem direita (RB) e margem esquerda (LB) que geralmente definem a extensão do DNA transferido (T- DNA) que contém um ou mais genes que serão expressos em uma célula vegetal, e podem incluir adicionalmente uma seqüência de intensificador, tal como, uma seqüência de superestímulo (overdrive) (Toro et ai, 1989) ou uma pluralidade de seqüências de superestímulo, como descrito no Pedido de Patente Provisório n2 U.S. 60/831.814, incorporado aqui a título de refe- rência.
As técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de algodão estão descritas na Patente n— U.S. 5.846.797, 5.159.135, 5.004.863, e 6.624.344. As técnicas para transformação de plan- tas Brassica, em particular, estão descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5.750.871; e as técnicas para transformação de soja estão descritas, por exemplo, em Zhang et ai, 1999, Patente US 6.384.301, e US 7.002.058. As técnicas para transformar milho estão descritos no documento. Alguns e- xemplos não-limitadores de plantas que podem encontrar uso com a inven- ção incluem alfalfa, cevada, feijões, beterraba, brócolis, repolho, cenoura, canola, couve-flor, aipo, repolho chinês, milho, algodão, pepino, feijoeiro, beringela, erva-doce, feijões cultivados, abóbora, alho-poró, alface, melão, aveia, quiabo, cebola, ervilha, pimenta, abobrinha, amendoim, batata, raba- nete, arroz, sorgo, soja, espinafre, milho verde, beterraba sacarina, girassol, tomate, melancia, e trigo.
Um vetor ou construção também pode incluir vários elementos reguladores. A seqüência líder 5' não-traduzida pode ser proveniente do promotor selecionado para expressar a seqüência de gene heterólogo da molécula de DNA da presente invenção, e pode ser especificamente modifi- cada se desejado para aumentar a tradução de mRNA. As regiões 5' não- traduzidas também podem ser obtidas a partir de RNAs virais de plantas (por exmeplo, vírus do mosaico do tabaco, vírus etch do tabaco, vírus do mosaico do milho, vírus do mosaico da alfalfa) de genes eucarióticos adequados, ge- nes de plantas (líder de gene de proteína de ligação a/b clorofila de trigo e milho), ou de uma seqüência genética sintética. A seqüência líder também poderia ser proveniente de um promotor não-relacionado ou seqüência de codificação. As seqüências líder úteis no contexto da presente invenção in- cluem o líder Hsp70 de milho (Patente n2 U.S. 5.362.865 e Patente n2 U.S. 5.859.347, incorporadas aqui a título de referência em sua totalidade), e o elemento omega TMV (Gallie et ai, 1989). Exemplos de seqüências líder de tradução incluem líderes de proteína de choque térmico de milho e petúnia (Patente n2 U.S. 5.362.865), líderes de proteína capsidial do vírus da planta, líderes de ribulose-bisfosfato carboxilase oxigenase (rubisco) da planta, GmHsp (Patente U.S. 5.659.122), PhDnaK (Patente U.S. 5.362.865), AtAntI, TEV (Carrington and Freed, 1990), AGRtunos (GenBank Accession V00087; Bevan et al., 1983), OsActI (patente U.S. 5641876), OsTPI (Patente n2 US 7.132.528), e OsActI5 (Publicação n2 US 20060162010), entre outros.
As seqüências íntron são conhecidas na técnica para ajudar na expressão de transgenes em células vegetais de monocotiledôneas. Exem- plos de íntrons incluem íntron da actina de milho (Patente US 5.641.876), o íntron HSP70 de milho (ZmHSP70; Patente US 5.859.347; Patente US 5.424.412), e íntron TPI de arroz (OsTPI; Patente n2 US 7.132.528), e são úteis na prática dessa invenção.
Um vetor também pode incluir uma seqüência de ácido nucléico de peptídeo de trânsito. Muitas proteínas localizadas no cloroplasto, inclusi- ve aquelas envolvidas na síntese de carotenóide, são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são direcionadas ao cloroplasto por um peptídeo de trânsito cloroplástico (CTP) que é removido após as etapas de importação. Exemplos de outras tais proteínas do cloroplasto incluem a pe- quena subunidade (SSU) de Ribulose-1,5,-bisfosfato carboxilase, e comple- xos de proteína I e proteína Il captadores de luz. Foi mostrado in vivo e in vitro que as proteínas de não-cloroplasto podem ser direcionadas ao cloro- plasto pelo uso de fusões de proteínas com CTP e essa seqüência CTP é suficiente para direcionar uma proteína ao cloroplasto. A incorporação de um peptídeo de trânsito cloroplástico adequado, tal como, Arabidopsis thaliana (At) EPSPS CTP (Klee et ai., 1987) e Petunia hybrida (Ph.) EPSPS CTP (della-Cioppa et ai, 1986) mostrou direcionar as seqüências de proteína he- teróloga aos cloroplastos em plantas transgênicas. Os versados na técnica irão reconhecer que várias construções quiméricas podem ser feitas, se ne- cessário, para que utilizem a funcionalidade de uma CTP particular para im- portar um determinado produto genético em um cloroplasto. Outras CTPs que podem ser úteis na prática da presente invenção incluem CTPs deriva- das de PsRbcS (Pisum sativum Rubisco small subunit CTP; Coruzzi et ai., 1984); AtRbcS CTP (Arabidopsis thaliana Rubisco small subunit 1A CTP; CTP1; Patente U.S. 5,728,925); AtShkG CTP (CTP2; Klee et ai, 1987); At- ShkGZm CTP (CTP2synthetic; codon optimized for monocot expression; SEQ ID N0:14 of W004009761); PhShkG CTP (Petunia hybrida EPSPS; CTP4; codon optimized for monocot expression; Gasser et al., 1988); Ta- Waxy CTP (Triticum aestivum granule-bound starch synthase CTPsynthetic, codon optimized for corn expression: Clark et al., 1991): OsWaxy CTP (Ory- za sativa starch synthase CTP; Okagaki, 1992); NtRbcS CTP (Nicotiana ta- bacum ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit chloroplast tran- sit peptide; Mazur, et al., 1985); ZmAS CTP (Zea mays anthranilate synthase alpha 2 subunit gene CTP; Gardiner et al., 2004); e RgAS CTP (Ruta graveo- lens anthranilate synthase CTP; Bohlmann, et ai, 1995).
Outros peptídeos de trânsito que podem ser úteis incluem a se- qüência de sinal cab-m7 de milho (PCT WO 97/41228) e a seqüência de si- nal glutationa reductase (Pisum sativum) da ervilha (PCT WO 97/41228).
O término da transcrição pode ser realizado por uma seqüência de DNA 3' não-traduzida ligada de modo operacional a um transgene re- combinante (por exemplo, o gene de interesse, a seqüência de identificação que inclui um gene verificável, ou o gene marcador selecionável da planta).
A região 3' não-traduzida de uma molécula de DNA recombinante contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para induzir a adição de nucleotídeos de adenilato à extremidade 3' do RNA.A região 3' não-traduzida pode ser obtida a partir de vários genes que são expressos em células vege- tais. A região 3' da nopalina sintase não-traduzida (Fraley et ai, 1983), é comumente usada nessa capacidade. As moléculas de poliadenilação de um gene RbcS2 Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et ai, 1984), AGRtu.nos (Genbank Accession E01312), E6 (Accession # U30508), glutelina do arroz (Okita et ai, 1989), e TaHspI 7 (gene da proteína de choque térmico de bai- xo peso molecular de trigo; Accession # X13431) em particular, podem ser úteis para uso com a invenção.
Para as modalidades da invenção onde o uso de um promotor constitutivo é desejado, qualquer promotor de plantas constitutivo bem co- nhecido pode ser usado. Os promotores de plantas constitutivos incluem, por exemplo, o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), que confere expressão constitutiva de alto nível na maior parte dos tecidos vege- tais (veja, por exemplo, Odell et ai, 1985), inclusive monocotiledôneas (veja, por exemplo, Dekeyser et ai, 1990); Terada et ai, 1990); o promotor da no- palina sintase (An et ai, 1988), o promotor da octopina sintase (Fromm et ai, 1989), promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor, promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária, promotor 1 da actina do arroz, promotor<Ja manopina sintase, e um promotor de histona.
Para outras modalidades da invenção, os promotores de gene de planta bem conhecidos que são regulados em resposta aos sinais ambi- entais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento podem ser usados, inclusive promotores regulados por (1) calor (Callis et ai, 1988), (2) luz (por exemplo, promotor rbcS-3A da ervilha, Kuhlemeier et al., 1989; promotor rbcS do milho, Schaffner and Sheen, 1991; ou promotor da proteína de Iiga- ção de clorofila a/b, Simpson et al., 1985), (3) hormônios, tal como, ácido abscísico (Marcotte et al., 1989), (4) cura (por exemplo, wunl, Siebertz et al., 1989); ou (5) produtos químicos, tais como, jasmonato de metila, ácido sali- cílico, etc. Também pode ser vantajoso empregar (6) promotores específicos de órgão (por exemplo, Roshal et al., 1987; Schernthaner et al., 1988; Bus- tos et al., 1989).
Há uma grande variedade de seqüências promotoras de plantas que pode ser usada para conduzir a expressão específica de tecido de poli- nucleotídeos em plantas transgênicas. De fato, em modalidades particulares da invenção, o promotor usado é um promotor específico de semente. O promotor de β-conglicinina (Chen et al., 1989) ou outros promotores especí- ficos de semente, tal como, o promotor de napina, que são regulados duran- te o amadurecimento da semente da planta (Kridl et ai., 1991; Kohno-Murase et al., 1994), cevada Hv.Perl (Stacey et al., 1996), faseolina (Bustos et al., 1989), inibidor de tripsina de soja (Riggs et al., 1989), ACP (Baerson et al., 1993), estearoil-ACP desaturase (Slocombe et al., 1994), subunidade a' de soja de β-conglicinina (P-Gm7S, veja, por exemplo, Chen et al., 1986), Vicia faba USP (P-Vf.Usp, veja, por exemplo, SEQ ID NO: 1, 2, e 3, Publicação de Pedido U.S. 20030229918), o promotor de globulina (veja, por exemplo, Be- Ianger and Kriz, 1991), subunidade alfa de soja de β-conglicinina (7S alfa; Patente U.S. 6.825.398, incorporado a título de referência) e promotor de oleosina L3 Zea mays (P-Zm.L3, veja, por exemplo, Hong et al., 1997; veja, também, Patente n2 U.S. 6.433.252, cuja descrição está especificamente incorporada aqui a título de referência).
As zeínas consistem em um grupo de proteínas de armazena- mento encontrado em endosperma de Zea mays. Os clones genômicos de genes de zeína foram isolados (Pedersen et al., 1982; Patente U.S. 6.326.527), e os promotores desses clones, inclusive 15 kDa, 16 kDa, 19 kDa, 22 kD, 27 kDa, e genes gamma, também poderiam ser usados. Outros promotores conhecidos para funcionar, por exemplo, em Zea mays incluem os promotores dos seguintes genes: waxy (Russell and Fromm, 1997; Shure et ai, 1983), Brittle (Giroux etal., 1994), Shrunken 2, enzimas de ramificação I e II, amido sintases, enzimas de desramificação, oleosinas, glutelinas, e sucrose sintases. Outro promotor de expressão de endosperma de Zea é o promotor do gene glutelina do arroz, mais particularmente, o promotor Osgt- 1 (Zheng et ai, 1993). Exemplos de tais promotores em arroz incluem aque- les promotores das unidades ADPGPP, o grânulo ligado e outra amido sinta- se, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, sucrose sin- tases (Yang et al., 1990), e BetH (camada de transferência de endosperma basal) e globulina 1.
Exemplos de outros promotores que podem ser úteis com a pre- sente invenção estão descritos na Patente U.S. 6.437.217 (promotor RS81 de milho), Patente U.S. 5.641.876 (promotor de actina do arroz; OsActI), Patente U.S. 6.426.446 (promotor RS324 de milho), Patente U.S. 6.429.362 (promotor PR-1 de milho), Patente U.S. 6.232.526 (promotor A3 de milho), Patente U.S. 6.177.611 (promotores de milho constitutivos), Patentes U.S. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), Patente U.S. 6.433.252 (promotor de oleosina L3 de milho), Patente U.S. 6.429.357 (pro- motor da actina 2 do arroz bem como um íntron de actina 2 do arroz), Paten- te U.S. 5.837.848 (promotor específico de raiz), Patente U.S. 6.294.714 (promotores induzíveis por luz), Patente U.S. 6.140.078 (promotores induzí- veis por sal), Patente U.S. 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno), Patente U.S. 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo), Patente U.S. 6.635.806 (promotor gamma-coixina), e Patente U.S. 7.151.204 (promotor de cloroplasto aldolase de milho). Os promotores adicionais que podem encontrar uso são promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., 1987), o promotor de octopina sintase (OCS) (que é conduzido sobre plas- mídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovírus, tal como, o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., 1987), o promotor 35S de CaMV (Odell et al., 1985), o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et ai, 1987), o promotor de sucrose sintase (Yang et ai, 1990), o promotor de complexo de gene (Chandler et al., 1989), e o promotor de gene de proteína de ligação a/b, etc. Na presente invenção, CaMV35S com seqüências de intensificador (e35S; Patente n^ U.S. 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142; e 5.530.196), FMV35S (Patentes U.S. 6.051.753; 5.378.619), caulimovírus das estrias clo- róticas no amendoim (PCISV; Patente US 5.850.019), At.Act 7 (Accession # U27811), At.ANTI (Publicação de Pedido de Patente US 20060236420), FMV.35S-EF1a (Publicação de Pedido de Patente U.S. 20050022261), elF4A10 (Accession # X79008) e AGRtu.nos (GenBank Accession V00087; Depicker et al, 1982; Bevan et al., 1983), triose fosfato isomerase citosólica do arroz (OsTPI; Patente No. US 7.132.528), e gene da actina 15 do arroz (OsAct15; Publicação de Pedido de Patente U.S. 20060162010) os promoto- res podem ser de vantagem particular. Em alguns casos, por exemplo, OsT- Pl e OsAct 15, um promotor pode incluir um 5'UTR e/ou um primeiro íntron. Outros promotores úteis na prática da invenção que são conhecidos por um versado na técnica também são contemplados pela invenção.
Um vetor de expressão de plantas também pode incluir um cas- sete de gene marcador verificável ou classificável que pode ser usado na presente invenção para monitorar a segregação de células ou a progênie de (perda de) de expressão. Os marcadores exemplificativos são conhecidos e incluem β-glucuronidase (GUS) que codifica uma enzima de vários substra- tos cromogênicos (Jefferson et ai, 1987a; Jefferson et ai, 1987b); e gene de local R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos anto- cianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et ai, 1988); um gene da β-lactamase (Sutcliffe et ai, 1978); um gene que codifica uma enzima daqueles vários substratos cromogênicos é conhecido (por exemplo, PA- DAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da Iuciferase (Ow et ai, 1986); um gene xy1E (Zukowsky et ai, 1983) que codifica uma catecol dio- xigenase que pode converter os catecóis cromogênicos; um gene da a- amilase (Ikatu et ai, 1990); um gene da tirosinase (Katz et ai, 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona que, sucessivamente, se condensa em melanina; proteína verde fluorescen- te (Elliot et ai, 1999) e uma α-galactosidase. Um gene marcador verificável ou classificável pode codificar o mesmo produto de gene que uma seqüência de identificação que inclui um gene verificável ou classificável ou um produto de gene diferente. Entretanto, a seqüência de identificação é expressa em óvulo, pólen ou tecidos de sementes, enquanto o gene marcador verificável ou classificável é expresso durante o processo de identificação de células vegetais transformadas. A seqüência de identificação também pode ser ex- pressa de maneira constitutiva, porém apenas conduz um fenótipo em óvulo, pólen ou tecidos de sementes.
As plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir de uma célula vegetal transformada por métodos bem conhecidos no campo de cul- tura de célula vegetal. Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transformação de Agrobacterium contém tipicamente uma única seqüên- cia de DNA recombinante simples inserida em um cromossoma e é referida como um evento transgênico. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como heterozigóticas da seqüência exógena inserida. Uma planta transgêni- ca homozigótica com relação a um transgene pode ser obtida ao acasalar sexualmente (autofecundar) uma planta transgênica segregante independen- te que contém uma única seqüência genética exógena na mesma, por e- xemplo, uma planta FO, para produzir a semente F1. Um quarto da semente F1 produzido será homozigótico com relação ao transgene. A germinação de semente F1 resulta em plantas que podem ser testadas para zigosidade, utilizando tipicamente uma análise SNP ou uma análise de amplificação tér- mica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (ou seja, uma análise de zigosidade).
Inúmeras seqüências de identificação podem ser usadas, por exemplo, os genes cuja expressão pode resultar em um fenótipo visível, in- clusive o uso de gus, gfp, e Iuc (veja, por exemplo, Ow et ai, 1986; WO 97/41228 e Patente U.S. 6.583.338; por exemplo, M26194; M15077). Um gene da levansucrase, sacB (Caimi et ai, 1996; por exemplo, X02730) que resulta em um fenótipo de semente "contraído", ou um gene da pirofosfatase (Hajirezaei et ai, 1999) que resulta em inibição de germinação, também po- de ser empregado. Os genes que codificam a fitoeno sintase (crtB) são co- nhecidos na técnica, inclusive aqueles de Erwinia uredovora (por exemplo, Misawa etal., 1990; Sandmann and Misawa, 1992; Patentes U.S. 5.429.939;
6.429.356), e Pantoea/Enterobacter agglomerans (por exemplo, GenBank M38423; M87280), entre outros. A expressão específica de semente de crtB que resulta em coloração laranja foi descrita (Shewmaker etal., 1999; Paten- te U.S. 6,429,356).
A maior parte dos transgenes que produzem fenótipos de se- mente pleiotrópicos pode ser usada como um gene marcador visível ligado a um marcador selecionável para identificar o gene isento de marcador de in- teresse de sementes positivas. O fenótipo visível pode ser produzido por superexpressão ectópicâ de um transgene ou resultar de infra-regulação de genes endógenos de rota metabólica por RNA anti-senso, interferência de RNA ou tecnologia de co-supressão.
As seguintes definições e métodos são proporcionados para de- finir melhor a presente invenção e guiar os versados na técnica na prática da presente invenção. Exceto onde especificamente observado, os termos de- vem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos versados na técnica relativa. As definições de termos comuns em biologia molecular tam- bém podem ser encontradas em Rieger et ai (1991); e Lewin (1994). Utiliza- se a nomenclatura de bases de DNA como apresentado em 37 CFR § 1.822.
"CP4", "aroACP4", "AGRTU.aroACP4", "CP4 EPSPS" e "EPSPS CP4" s referem ao gene da EPSP sintase ou proteína purificada a partir da cepa de Agrobacterium tumefaciens (AGRTU) CP4 que quando ex- pressa em plantas confere tolerância a formulações herbicidas contendo gli- fosato e glifosato (Patente N2 U.S. 5.633.435, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade). A seqüência genética pode ser nativa ou mo- dificada para expressão aumentada em plantas.
Um "segmento" de DNA se refere a uma região de seqüência de DNA de uma construção de DNA. Um segmento de DNA pode -estar dentro, entre, ou flanqueando as moléculas de T-DNA encontradas em uma cons- trução usada para a transformação de célula vegetal mediada por Agrobac- terium. Por exemplo, um segmento de DNA pode conter elementos genéti- cos para a replicação de plasmídeos em bactérias ou outros vários elemen- tos e cassetes de expressão da construção de DNA designada para uso na transformação de célula vegetal. Assim, um "cassete de DNA" pode com- preender um segmento de DNA, inclusive elemento(s) para a expressão da seqüência de DNA em uma célula.
Uma "proteína de fusão" se refere a uma fusão tradicional ex- pressa como uma única unidade, produzindo ainda um produto genético que confere os fenótipos da proteína codificada pelas seqüências genéticas de partida não-fundidas.
Um ácido nucléico "isolado" é substancialmente purificado ou separado de outras seqüências de ácido nucléico na célula do organismo onde o ácido nucléico ocorre naturalmente, ou seja, outro DNA e RNA cro- mossomal e extracromossomal, por métodos de purificação de ácido nucléi- co convencionais. O termo também inclui ácidos nucléicos recombinantes e ácido nucléicos quimicamente sintetizados.
O termo "gene de resistência a glifosato" se refere a qualquer gene que, quando expresso como um transgene em uma planta, confere a capacidade de tolerar níveis do herbicida glifosato que poderiam de outro modo danificar ou matar a planta. Qualquer gene com tolerância a glifosato conhecido pelo versado na técnica é adequado para uso na prática da pre- sente invenção. O glifosato (inclusive qualquer forma herbicidamente ativa de N-fosfonometilglicina e qualquer sal dessa) inibe a enzima 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS). Uma variedade de enzimas EPSPS nativas e variantes foi expressa em plantas transgênicas para confe- rir tolerância a glifosato, sendo que qualquer uma dessas pode ser usada na invenção. Exemplos de algumas dessas EPSPSs incluem aquelas descritas e/ou isoladas de acordo com a Patente n2 U.S. 4.940.835, Patente n2 U.S. 4.971.908, Patente n2 U.S. 5.145.783, Patente n2 U.S. 5.188.642, Patente n2 U.S. 5.310.667, e Patente n2 U.S. 6.803.501. Essas também podem ser de- rivadas de uma classe estruturalmente distinta de genes EPSPS não- homólogos, tais como, os genes EPSPS da classe II isolados da cepa de Agrobacterium sp. CP4 (AGRTU.aroACP4). O termo "seqüência de identifi- cação" se refere a um ácido nucléico que codifica um produto que confere um fenótipo detectável, tal como, alteração em semente ou cor de gameta, opacidade ou translucidez, fluorescência, textura, tamanho, formato, capaci- dade de germinação, ou viabilidade ou outro produto de metabolismo de cé- lula ou semente. A seqüência de identificação pode incluir uma seqüência de nucleotídeo (por exemplo, um fragmento de gene) que pode conferir um fe- nótipo através da infra-regulação da expressão de outro gene, tal como, a- través de um processo mediado por RNAi. Em algumas modalidades, a se- qüência de identificação inclui um gene verificável, tal como, gene gusA, gfp, ou crtB. Em uma modalidade particular, a seqüência de identificação inclui um gene crtB que codifica uma fitoeno sintase de Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans-, GenBank M38423, incorporada aqui a título de referência; e a Patente n22 U.S. 5.429.939, 6.429.356). A seqüência de identificação é fisi- camente ligada a um gene marcador selecionável, verificável e/ou classificá- vel da planta, tal como, um que codifica a resistência a antibiótico ou tole- rância à herbicida. A seqüência de identificação pode conferir um fenótipo detectável (por exmeplo, verificável ou selecionável) em semente.
Uma primeira seqüência de ácido nucléico é conectada ou ligada "de modo operacional" a uma segunda seqüência de ácido nucléico quando a primeira seqüência de ácido nucléico for colocada em uma relação funcio- nal com a segunda seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor é ligado de modo operacional a uma seqüência de codificação de proteína se o promotor afetar a transcrição ou expressão da seqüência de codifica- ção. Geralmente, as seqüências de DNA ligadas de modo operacional são contíguas e, quando necessário unem duas regiões de codificação de prote- ína, e estão no mesmo quadro de leitura.
O termo "planta" inclui qualquer planta superior e progênie da mesma, inclusive monocotiledôneas (por exemplo, lírio, milho, arroz, trigo, cevada, etc.), dicotiledôneas (por exemplo, soja, algodão, tomate, canola, batata, Arabidopsis, tabaco, etc.), gimnospermas (pinhos, abetos, cedros, etc.) e inclui partes de plantas, inclusive unidades reprodutivas de uma plan- ta (por exemplo, sementes, bulbos, tubérculos, ou outras partes ou tecidos daquela planta podem ser reproduzidas), fruto, flores, etc.
Um ácido nucléico "recombinante" é feito por uma combinação artificial de dois segmentos, de outra forma, separados de seqüência, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucléicos por técnicas de engenharia genética.
Os termos "construção de DNA" ou "vetor de DNA" se refere a qualquer plasmídeo, cosmídeo, vírus, que replica livremente a seqüência, fago, ou outro DNA ou RNA de cadeia simples ou de cadeia ramificada circu- lar derivado de qualquer fonte que inclui uma ou mais seqüências de DNA, tais como, promotores, seqüências de codificação de proteínas, regiões 3' não-traduzidas, etc., que foram ligados de maneira funcionalmente operativa por técnicas de DNA recombinantes. Os vetores de DNA recombinante para a transformação de plantas são comumente plasmídeos circulares de cadeia dupla capazes de replicação em uma célula bacteriana. As composições e métodos convencionais para produzir e utilizar construções de ácido nucléi- co recombinantes são bem conhecidos, por exemplo, Sambrook et al, 1989; e Ausubel et ai, 1992 (com atualizações periódicas), e Clark et al. (1997), entre outros.
O termo "promotor" ou "região de promotor" se refere a uma se- qüência de ácido nucléico, geralmente encontrada a montante (5') de uma seqüência de codificação que controla a expressão da seqüência de codifi- cação ao controlar a produção de RNA mensageiro (mRNA) ao proporcionar o sítio de reconhecimento para a RNA polimerase e/ou outros fatores neces- sários para o início da transcrição no sítio correto. Como contemplado aqui, um promotor ou região promotora inclui variações de promotores derivados por meio de ligação a várias seqüências reguladoras, mutagênese aleatória ou controlada, e adição ou duplicação de seqüências de intensificador. Uma região promotora é responsável pela condução da transcrição de seqüências de codificação sob seu controle quando introduzidas em um hospedeiro co- mo parte de um vetor recombinante adequado, como mostrado por sua ca- pacidade de produzir mRNA.
"Regeneração" se refere ao processo de desenvolvimento de uma planta de uma célula vegetal (por exemplo, protoplasto ou explante da planta).
"Marcador selecionável" se refere a uma seqüência de ácido nu- cléico cuja expressão confere um fenótipo que facilita a identificação de célu- las que contêm a seqüência de ácido nucléico. Os marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a produtos químicos tóxicos (por exemplo, resistência a antibiótico), ou conferem uma característica visual- mente diferenciada (por exemplo, alterações de cor ou f luorescência).
Os genes marcadores selecionáveis da planta dominante inclu- em genes que codificam genes de resistência a antibiótico (por exemplo, resistência à higromicina, imidazolinona, canamicina, bleomicina, G418, es- treptomicina ou espectinomicina); e genes de resistência à herbicida (por exemplo, fosfinotricina acetiltransferase, ALS modificado, BAR, EPSPSs de classe I modificadas, EPSPSs de classe II, DMOs), entre outros.
Os genes que codificam um marcador secretável cuja secreção pode ser detectada como um meio para identificar ou selecionar as células transformadas estão incluídos dentro dos termos "genes marcadores classi- ficáveis" ou "genes marcadores verificáveis". Exemplos desses incluem mar- cadores que codificam um antígeno secretável que pode ser identificado por interação de anticorpo, ou ainda enzimas secretáveis que podem ser detec- tadas de forma catalítica. As proteínas secretáveis podem ser divididas em inúmeras classes, inclusive pequenas proteínas difusíveis que são detectá- veis, (por exemplo, por ELISA), pequenas enzimas ativas que são detectá- veis em uma solução extracelular (por exemplo, a-amilase, β-lactamase, fos- finotricina acetiltransferase), ou proteínas que são inseridas ou aprisionadas na parede celular (tais como, proteínas que incluem uma seqüência líder tal como aquela encontrada na unidade de expressão de extensão ou tabaco 30 PR-S). Outros genes marcadores selecionáveis e/ou verificáveis possíveis tornar-se-ão óbvios pelos versados na técnica.
"T-DNA" se refere a uma molécula de DNA que se integra no genoma de uma planta através de Agrobacterium ou outro método de trans- formação mediada por Rhizobia. Pelo menos uma extremidade da molécula de T-DNA é flanqueada por pelo menos uma região de margem do T-DNA de um plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacterium. Essas de regiões de margem são geralmente referidas como as regiões de margem direita (RB) e margem esquerda (LB) e se apresentam como variações em seqüência de nucleotí- deo e comprimento dependendo de sua fonte (por exemplo, cepas produto- ras de nopalina ou octopina de Agrobacterium). As regiões de margem co- mumente usadas em construções de DNA designadas para transferir trans- genes em plantas possuem, geralmente, centenas de polinucleotídeos de comprimento e incluem um sítio de corte onde a virD2 endonuclease deriva- da de plasmídeo auxiliar Ti ou Ri digere o DNA e se liga de maneira covalen- te à extremidade 5' após a formação de T-filamento para guiar a integração de T-filamento no genoma de uma planta. A(s) molécula(s) de T-DNA geral- mente contêm um ou mais cassetes de expressão de plantas.
O termo "transgene" se refere a qualquer seqüência de ácido nucléico não-nativa a uma célula ou organismo transformada na dita célula ou organismo. "Transgene" também pode se referir a qualquer seqüência endógena que é ectopicamente expressa ao modificar a seqüência de codifi- cação ou seqüências reguladoras. "Transgene" também inclui as partes de componente de um gene de planta nativo modificado pela inserção de uma seqüência de ácido nucléico não-nativa ou nativa por recombinação direta.
EXEMPLOS
Os versados na técnica irão avaliar as diversas vantagens dos métodos e composições proporcionadas pela presente invenção. Os seguin- tes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser observado pelos versados na técnica que os procedi- mentos descritos nos exemplos a seguir representam procedimentos desco- bertos pelos inventores que funcionam bem na prática da invenção, e assim podem ser considerados para constituir os modos preferidos para sua práti- ca. Entretanto, os versados na técnica elevem avaliar, considerando a pre- sente descrição, que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas descritas e ainda assim obter um resultado parecido ou similar sem que se abandone o espírito e escopo da invenção. Todas as referências citadas aqui estão incorporadas aqui a título de referência na medida em que essas suplementam, explicam, proporcionam um perfil ou ensinam a meto- dologia, técnicas ou composições empregadas aqui.
EXEMPLO 1
Preparação de Vetores de 2T-DNA com uma Seqüência de Identificação e Gene Marcador, e um Gene de Interesse
Dois vetores de expressão de plantas de T-DNA, pMON67465, pMON1C)1338 e pMON101339 (FIGURA 1), foram construídos de acordo com o procedimento de clonagem molecular padrão (Sambrook et al., 1989). Um T-DNA inclui um promotor 35S de CaMV ligado de modo operacional a um gene npüI que codifica a resistência à canamicina e um promotor 35S de CaMV ligado de modo operacional a um gene repórter de GUS. O outro T- DNA compreende um cassete de napina:ctp-crtB: napin 3' e um cassete de EPSPS 35S:ctp:CP4, que confere resistência a glifosato. O crtB em pMON67465 com origem de replicação oriV foi conduzido por um promotor de napina específico de semente de 1,8 kb - e um terminador de napina de 1 kb de Brassica napus. O crtB em pMON101338 com replicon oriV em pMON101339 com origem de replicação de pRi foi conduzido por uma ver- são mais curta de promotor de napina (1 kb) e terminador (0,3 kb). O gene crtB, que codifica uma fitoeno sintase de Erwinia sp. confere cor laranja à semente de soja sem afetar a freqüência de transformação (FIGURA 3).
EXEMPLO 2
Transformação e Regeneração de Explantes de Soja com pMON67465
Os tecidos de soja (cv. A3244) foram transformados com pMON67465 (FIGURA 1) através de um método mediado por Agrobacteri- um, essencialmente como descrito antes (Patente U.S. 6.384.301, incorpo- rada aqui a título de referência). Resumidamente, os explantes de meristema de soja cortados manualmente foram co-cultivados com Agrobacterium du- rante 2 a 4 dias a 23°C, transferidos sobre o meio sólido de WPM com 75 μΜ de seleção de glifosato em um PLANTCON e cultivados a 28°C sob um período claro/escuro 16/8. Após duas semanas, os explantes foram transfe- ridos para meio de WPM fresco e cultivados até a colheita do broto. Após 2 meses, os brotos com true trifolia foram cortados e cultivados em meio BRM de enraizamento durante 2 a 4 semanas. As mudas enraizadas se desenvol- veram em estufa para amadurecimento da semente. Entre 40 eventos anali- sados, 72,5% apresentaram co-transformação com ambos os T-DNAs. 45% dos 40 eventos continham tanto genes nptll como gus. O evento A33908, que contém T-DNAs de pMON67465, foi adicionalmente analisado.
Os eventos adicionais com plasmídeo pMON67465 foram obti- dos por re-transformação do plasmídeo na mesma cultivar A3244 e 13 linha- gens transgênicas foram obtidas com freqüência de transformação de 0,22%. Sete dentre 13 linhagens são isentas de marcador e positivas de ge- ne de interesse após analisar as sementes com aparência normal através de PCR em termos de presença ou ausência de um gene marcador gus ou CP4 (FIGURA 6). As sementes laranja de plantas RO também foram analisadas por PCR em termos de presença do gene crtB e gene marcador CP4. Todas as sementes laranja, porém três foram consideradas positivas tanto por crtB como CP4 (FIGURA 7), apesar de nenhuma semente de aparência normal (FIGURA 7, células brancas) continham genes CP4 ou crtB, que indicam que o fenótipo de crtB está estreitamente ligado ao gene marcador CP4 selecio- nável.
Assim, o uso de uma construção de 2T-DNA com uma seqüên- cia de identificação inclusive um gene verificável ligado a um gene marcador selecionável permite uma triagem e seleção mais eficaz de eventos transgê- nicos que contêm um gene de interesse, embora desprovidos de seqüências que codificam um marcador selecionável. Uma comparação exemplificativa entre uma abordagem baseada em ligação-Southern ("Padrão 2T") e uma classificação baseada em marcador (ou seja, baseada em seqüência de i- dentificação) para a identificação da progênie da semente em que um gene de interesse e um marcador selecionável foram independentemente segre- gados é encontrada na FIGURA 8. O uso da abordagem de seqüência de identificação permite a triagem de naus eventos transgênicos e mais progê- nie de cada evento para identificar a progênie útil para análise adicional.
EXEMPLO 3
Expressão de CrtB/GUS/CP4 em Evento de Soja A33908 e Progênie R1 de Semente
A inspeção visual de tecidos de evento A33908 (FIGURA 2) indi- cou que os caules e folhas expandidas jovens apresentaram um molde la- ranja. O tecido da folha e da raiz era de outro modo fenotipicamente normal em plantas que expressam CrtB. Os tegumentos da semente da planta RO (ou seja, a geração de R1) apresentaram leve expressão de CrtB, enquanto os cotilédones de semente derivada de A33908 apresentaram uma cor la- ranja diferente e alguns com um fenótipo rugoso (FIGURA 3).
Doze sementes R1 imaturas do evento A33908 foram disseca- das do tegumento e submetidas a ELISA CP4-EPSPS, e análises de CrtB e visuais de GUS (FIGURA 4). A segregação dos fenótipos EPSPS de CrtB1 GUS, e CP4 foi evidente. 9/12 da semente foram positivos em todas as três análises. 1/12 da semente era EPSPS CrtB e CP4 positivo, porém GUS ne- gativo, mostrando a segregação de dois T-DNAs de pMON67465, com perda do gene gus. 2/12 da semente foram ELISA CP4-EPSPS negativas. Tanto a semente foi CrtB negativo como GUS positivo, mostrando assim a ligação entre a seqüência de identificação (crtB) e o gene marcador CP4-EPSPS selecionável, e a segregação desses locais transgênicos do local gus. A ra- zão fenotípica na segregação da semente foi compatível com a segregação de mendeliana de dois locais dominantes.
EXEMPLO 4
Análise Visual de Semente R1
As sementes maduras de A33908 foram visualmente analisadas em termos de cor, tamanho e formato (FIGURA 5). Uma mistura de (i) se- mente normal isenta de marcador (por exemplo, amarela e lisa); (ii) laranja e lisa; e (iii) laranja e rugosa foi observada.
EXEMPLO 5
Análise de PCR sobre a Semente GUS Positivo
INVADER PCR (por exemplo, Mein et ai, 2000) foi usado para acompanhar a segregação dos genes CP4-EPSPS, crtB, e gus distribuídos por pMON67465 em semente de plantas transgênicas de soja. O evento A33908 foi determinado por conter uma única cópia do gene marcador CP4- EPSPS e uma única cópia do gene NPTII. A segregação de semente Iaran- ja:normal seguiu uma razão esperada 3:1 no evento A33908 (Tabela 1).
Tabela 1: Fenótipo e genótipo de progênie de plantas transgênicas
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EXEMPLO 6
Uso de ATP PFK como uma Seqüência de Identificação
Para grãos ricos em amido inclusive milho, a manipulação de metabolismo de açúcar/amido que resulta em um fenótipo de desenvolvi- mento de semente rugosa ou abortada pode ser utilizada. A expressão es- pecífica de semente de sacB (Caimi et al. 1996), ou expressão específica de semente de fosfofrutoquinase dependente de ATP de levedura (ATP PFK; por exemplo, Número de acesso no GenBank NC_003423, bases 2297466..2300294) em espigas de milho resulta em desenvolvimento de grão abortado (FIGURA 12). A construção pMON99575 que contém o mar- cador CP4 selecionável e ATP-PFK pode ser diretamente usada para a co- transformação com uma construção de T-DNA que contém um gene de inte- resse ao misturar as células de duas cepas de Agrobacterium, cada uma incluindo uma dessas construções e transformar uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada. Alternativamente, o cassete ATP-PFK de ex- pressão específica de semente pode ser subclonado em uma construção de 2T-DNA como uma seqüência de identificação, para identificação eficaz de sementes isentas de marcador. Os grãos que contêm esse gene são extre- mamente rugosos e não germinam. Apenas os grãos isentos de seqüência de identificação e isentos de gene marcador mostram aparência normal. EXEMPLO 7
Uso de Genes Envolvidos em Síntese de Porfirina como Seqüências de i- dentificação
As uroporfirinogênio Ill (uro'gen) metil transferases (SUMT) de- pendente de S-adenosil-L-metionina produzem compostos porfirinóides fluo- rescentes vermelho claro quando superexpressas em E. coli, levedura, e células de CHO. Essa propriedade permitiu a seleção visual de colônias de E. coli transformadas (Rossner & Scott 1995) e a classificação automática de levedura transformada e células CHO (Wildt & Deuschle 1999). Essa fluo- rescência é o resultado de acúmulo intracelular de uro'gen di e tri-metilado (diidrosiroidroclorina e trimetilpirorocorfina), ambos são compostos encontra- dos em rotas de síntese de porfirina (ou seja, clorofila e cobalamina).
As células transformadas com cobA que codifica SUMT a partir de Propionibacterium freudenreichii (GenBank accession U13043; incorpo- rado aqui a título de referência) produzem um sinal fluorescente com picos de absorção em 384 nm e 500 nm juntamente com uma faixa de emissão em 605 nm. Os porfirinóides fluorescentes gerados pela metil transferase de cobA uro'gen possuem uma boa assinatura espectral para produzir o materi- al vegetal. A excitação tanto de 384 como 500 nm evita uma forte absorção de clorofila e a emissão vermelha resultante é facilmente detectada como possuindo um deslocamento de Stokes substancial (da origem de absorção de 500), porém não se sobrepõe com a autofluorescencia da clorofila na vermelha extrema (Haseloff, 1999).
A terminação carbóxi de proteínas SUMT de milho (GenBank D83391), Arabidopsis Upml (GenBank L47479), e E. coli CysG (OenBank X14202) são significativamente similares às proteínas codificadas por genes de Ρ. freudenreichii (cobA), Pseudomonas denitrificans (cobA, GenBank M59236), e de Synechocystis sp. (anteriormente Anaeystis nidulans; Gen- Bank X70966), cada uma incorporada aqui a título de referência (Sakakibara et ai 1996), e podem ser usadas de maneira similar.
Uma construção inclusive um promotor com expressão de b nú- cleo e um gene que codifica CobA, ou uma proteína similar com atividade de SUMT1 permite o uso de tal gene como uma seqüência de identificação ao verificar (a ausência de) de fluorescência vermelha visível em semente de milho, por exemplo. As siroheme sintases de plantas foram relatadas como localizadas no cloroplasto (Leustek et al., 1997). Assim, o uso de um gene de biossíntese de porfirina como uma seqüência de identificação pode incluir o uso de um peptídeo de trânsito cloroplástico para dirigir o produto genético ao cloroplasto. A construção pode ser diretamente usada como uma se- qüência de identificação, e um T-DNA que compreende tal seqüência de i- dentificação e um marcador selecionável podem ser, por exemplo, co- transformados com uma segunda construção que compreende um T-DNA que contém um gene de interesse ao misturar duas cepas de Agrobaeterium, sendo que cada uma contém uma dessas construções, e transforma uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada. Um cassete de expressão de SUMT também pode ser rapidamente subclonado em outros vetores de 2 T-DNA, ou em um vetor designado para uso em transformação mediada por microprojétil, e usado como uma seqüência de identificação por um versado na técnica.
EXEMPLO 8
Uso de Silenciamento de Gene para Produzir um Fenótipo de Semente De- tectável
Uma repetição invertida posicionada dentro de um íntron do cas- sete de gene marcador pode resultar em silenciamento eficaz de gene em células vegetais. Isso é descrito em detalhe na Publicação de Pedido n- U.S. 2006/0200878 (por exemplo, Figuras 7, 8, 9, incorporada aqui a título de re- ferência). Para testar se um dsRNA codificado por repetições invertidas co- locado dentro de um íntron é capaz de obter o silenciamento do gene, as repetições invertidas de um segmento de -400 bp do gene da luciferase (SEQ ID NO:1) foram colocadas no íntron do promotor de actinal do arroz em um cassete de gene EPSPS-CP4 (pMON73874) e a capacidade de a construção suprimir o gene da luciferase em uma transformação temporária de protoplastos de folha de milho foi testada. Como um controle, um plasmí- deo similar foi testado, exceto pelo fato que o controle de plasmídeo possuía repetições invertidas de um segmento do gene GUS em vez do gene da luci- ferase (pMON73875). Por fim, como um controle adicional, pMON25492, que é idêntico exceto pelo fato de não possuir repetições invertidas, também foi empregado (FIGURA 13).
Quando esses três plasmídeos foram testados em um sistema de silenciamento de gene temporário de protoplasto de folha de milho para a supressão de Iuciferase de vaga-lume e normalização da expressão de um controle interno de RENILLA Iuciferase (Promega Corp., Madison, WI), foi observado que o plasmídeo com dsRNA que codifica repetições invertidas dentro do íntron (pMON73874) foi capaz de suprimir a Iuciferase relativa aos controles pMON73875 e pMON25492 (FIGURA 14). O experimento foi repe- tido pela segunda vez com resultados similares.
Para testar se um fenótipo de grão de milho pode ser gerado através de uma abordagem de silenciamento de gene, foram feitas constru- ções designadas para suprimir o gene Waxy. pMON81990 contém repeti- ções invertidas de parte do gene Waxy. As plantas de milho transgênicas que contêm pMON81990 apresentaram silenciamento do gene Waxy em pelo menos 65% das plantas RO independentes, como determinado ao colo- rir o pólen e grãos com iodo para produção de amido. Em comparação, as plantas que contêm pMON81993, que expressa um fragmento senso de Waxy, não apresentam silenciamento eficaz do gene Waxy.
O silenciamento de genes que codificam zeínas (proteínas de armazenamento de semente), que resulta em um fenótipo visível também pode mostrado. pMON73567 contém repetições invertidas de seqüências de genes que codificam α-zeínas em grãos de milho. A transcrição das repeti- ções invertidas resulta em silenciamento desses genes, reduzindo os níveis das α-zeínas de 19kD e 22kD em 26 dentre 29 plantas RO testadas. A FI- GURA 15 demonstra que os grãos que resultam de células transformadas com essa seqüência de codificação de dsRNA possuem um fenótipo visual óbvio, em que os grãos com zeínas reduzidas são menos transparentes do que os grãos tipo selvagem.
Assim, uma seqüência de codificação de dsRNA no íntron de um gene marcador pode ser usado como uma seqüência de identificação de acordo com a presente invenção. As construções que contém, por exemplo, um gene de resistência a glifosato, tal como, CP4 EPSPS como um marca- dor selecionável e tal seqüência de codificação de dsRNA em um íntron do gene marcador selecionável pode ser diretamente usada para co- transformção com uma construção de T-DNA que contém um gene de inte- resse ao misturar as células de duas cepas de Agrobacterium, sendo que cada uma compreende uma dessas construções e transforma uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada. Alternativamente, o cassete de codificação de dsRNA pode ser subclonado em uma construção de 2T-DNA como uma seqüência de identificação, para a identificação eficaz de semen- tes isentas de marcador. Um versado na técnica também poderia projetar construções análogas para uso em transformação de célula vegetal mediada por bombardeamento de microprojéteis.
EXEMPLO 9
Uso de KAS4 como uma Seqüência de identificação
O vetor binário pMON83530 (FIGURA 16) contém um KAS4 (a- ceto-acetil-ACT sintase; GenBank accession AF060518) conduzido por um promotor USP88 de soja (por exemplo, Patente U.S. 7.078.588) com um cassete expressável de planta CP4 como um marcador selecionável sobre o mesmo T-DNA. A expressão específica de semente do gene KAS4 resulta em sementes rugosas que são facilmente distinguíveis das sementes nor- mais que não contêm o gene (FIGURA 17). A construção pode ser direta- mente usada como uma seqüência de identificação, e um T-DNA que com- preende tal seqüência de identificação e um marcador selecionável pode ser co-transformado com uma segunda construção que compreende um T-DNA contendo um gene de interesse ao misturar duas cepas de Agrobacterium, sendo que cada uma contém uma dessas construções e transforma uma célula vegetal com a cultura bacteriana misturada.
O cassete de expressão KAS4 também está presente em um plasmídeo de 2 T-DNA como mostrado em pMON107314 (FIGURA 18) onde um T-DNA compreende um gene splA (Sucrose fosforilase de Agrobacterium tumefaciens; GenBank Accession AE009432) como uma seqüência de iden- tificação e um gene marcador e o outro T-DNA pode compreender um gene de interesse como construído por métodos de clonagem rotineiros conheci- dos pelo versado na técnica. O plasmídeo de 2 Τ-ΌΝΑ pode ser então usa- do, por exemplo, para transformação de soja. O gene de identificação é usa- do para selecionar sementes sem o gene marcador baseado no fenótipo proporcionado pelo gene de identificação.
EXEMPLO 10
Uso de um gene splA como uma Seqüência de Identificação
O vetor binário pMON68581 (FIGURA 19) contém a splA (Su- crose fosforilase de Agrobacterium tumefaciens; GenBank Accession A- E009432) conduzida por um 7S alfa promotor de soja (por exemplo, Gen- Bank M13759; Doyle et ai, 1986) com um cassete expressável de planta CP4 como um marcador selecionável sobre o mesmo T-DNA. A expressão específica de semente do gene splA resulta em sementes rugosas que são facilmente distinguíveis das sementes normais que não contêm o gene (FI- GURA 20). A construção pode ser diretamente usada como uma seqüência de identificação, e um T-DNA que compreende tal seqüência de identificação e um marcador selecionável podem ser co-transformados com uma segunda construção que compreende um T-DNA contendo um gene de interesse ao misturar duas cepas de Agrobacterium, sendo que cada uma contém uma dessas construções e transforma uma célula vegetal com a cultura bacteria- na misturada. O cassete de expressão de splA também pode ser facilmente subclonado em vetores de 2 T-DNA onde um T-DNA compreende gene de splA como uma seqüência de identificação e um gene marcador e o outro T- DNA compreende um gene de interesse por métodos de clonagem rotineiros conhecidos pelo versado na técnica. O plasmídeo de 2 T-DNA pode ser en- tão usado, por exemplo, para transformação de soja. A seqüência de identi- ficação é usada para selecionar sementes sem um gene marcador selecio- nável ou verificável baseado no fenótipo proporcionado pela seqüência de identificação.
EXEMPLO 11
Uso de Diversas Seqüências de identificação na Produção de Semente de Milho Isenta de Marcador
Múltiplos vetores de expressão de plantas de 2 T-DNA foram construídos. Em cada construção, o primeiro segmento de T-DNA compre- endido de um transgene uidA expressável por planta como um exemplo de um ácido nucléico de interesse e o segundo segmento de T-DNA compreen- dido de um transgene CP4 EPSPS expressável por planta como um marca- dor selecionável e uma seqüência de identificação como mostrado na tabela abaixo. As seqüências de crtB designadas para expressão em monocotile- dôneas foram preparadas por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, por otimização de códon como encontrado em SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3). pMON68412 compreende a SEQ ID NO:3. O primeiro T-DNA é flanqueado por margens direita e esquerda, enquanto o segundo T-DNA fica localizado na cadeia principal do vetor, um formato de 2 T-DNA comumente conhecido como formato em conjunto (Huang et al., 2005). Os tecidos de milho foram transformados separadamente com cada construção por métodos conheci- dos na técnica. O fenótipo esperado com cada gene de identificação é indi- cado na Tabela 2 abaixo. Os promotores alternativos para a expressão das seqüências de identificação em endosperma incluem promotor de glutelina 1 de arroz, o promotor waxy de milho, e o promotor sensível 2 de milho.
Tabela 2: Fenótipos exemplificativos esperados com determinadas seqüên- cias de identificação. <table>table see original document page 49</column></row><table>
Todas as composições e métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida considerando a presente descrição. Embora as composições e métodos dessa invenção sejam descritos em termos das modalidades e exemplos ilustrativos anterio- res, tornar-se-á óbvio para o versado na técnica que variações, alterações e modificações podem ser aplicadas à composição, métodos, e nas etapas ou na seqüência de etapas dos métodos descritos aqui, sem que se abandone o conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, tornar-se-á óbvio que certos agentes que são tanto química como fisiologicamente rela- cionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, embora re- sultados iguais ou similares possam ser obtidos. Todos tais substitutos e modificações similares evidentes para o versado na técnica estão conside- rados dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações em anexo.
Referências
As seguintes referências, à medida que proporcionam detalhes procedurais exemplificativos ou outros suplementares àqueles apresentados aqui, estão especificamente incorporadas no presente documento a título de referência.
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<110> YE, XUDONG
PETERSEN, MICHAEL W. HUANG, SHIHSHIEH CHOMET, PAUL S. WALTERS, DAVID JOHNSON, SUSAN GILBERTSON, LARRY
<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA OBTER PLANTAS TRANSGÊNICAS ISENTAS
DE MARCADOR
<130> MONS:103US
<140> DESCONHECIDO
<141> 2007-05-11
<150> 60/799,875
<151> 2006-05-12
<160> 3
<170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1048 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial Primer Artificial <400> 1
ccacaccctt aggtaaccca gtagatccag aggaattcat tatcagtgca attgttttgt 60 cacgatcaaa ggactctggt acaaaatcgt attcattaaa accgggaggt agatgagatg 120 tgacgaacgt gtacatcgac tgaaatccct ggtaatccgt tttagaatcc atgataataa 180 ttttctggat tattggtaat tttttttgca cgttcaaaat tttttgcaac ccctttttgg 240 aaacaaacac tacggtaggc tgcgaaatgt tcatactgtt gagcaattca cgttcattat 300 aaatgtcgtt cgcgggcgca actgcaactc cgataaataa cgcgcccaac accggcataa 360 agaattgaag agagttttca ctgcatacga cgattctgtg atttgtattc agcccatatc 420 gacgcgtgaa gacgccaaaa acataaagaa aggcccggcg ccattctatc ctctagagga 48Ό tggaaccgct ggagagcaac tgcataaggc tatgaagaga tacgccctgg ttcctggaac 540 aattgctttt acagatgcac atatcgaggt gaacatcacg tacgcggaat acttcgaaat 600 gtccgttcgg ttggcagaag ctatgaaacg atatgggctg aatacaaatc acagaatcgt 660 cgtatgcagt gaaaactctc ttcaattctt tatgccggtg ttgggcgcgt tatttatcgg 720 agttgcagtt gcgcccgcga acgacattta taatgaacgt gaattgctca acagtatgaa 780 catttcgcag cctaccgtag tgtttgtttc caaaaagggg ttgcaaaaaa ttttgaacgt 840 gcaaaaaaaa ttaccaataa tccagaaaat tattatcatg gattctaaaa cggattacca 900 gggatttcag tcgatgtaca cgttcgtcac atctcatcta cctcccggtt ttaatgaata 960 cgattttgta ccagagtcct ttgatcgtga caaaacaatt gcactgataa tgaattcctc 1020 tggatctact gggttaccta agggtgtg 1048
<210> 2 <211> 930 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial : Primer Artificial <400> 2
atgtcccagc ctcctctcct ggatcatgct acccaaacta tggctaacgg tagcaagtcc 60 ttcgctaccg ccgctaagct cttcgatcct gctactaggc gttccgtcct catgctgtac 120 acctggtgta ggcattgcga cgatgtgatc gacgatcaaa cccacggttt cgcgtccgag 180 gctgcggccg aggaagaggc gacccaaagg ctcgctcgcc tccgtaccct caccctcgcc 240 gctttcgagg gcgctgagat gcaagatcct gcgttcgccg ctttccaaga ggtcgccctc 300 acccacggca tcactccaag gatggccctg gaccacctgg acggtttcgc tatggacgtc 360 gcccaaactc gctacgtgac tttcgaggac actctccggt actgctacca tgtcgccggt 420 gttgtcggcc tcatgatggc gcgcgtcatg ggtgtccgcg acgagcgcgt cctcgacagg 480 gcttgcgacc tcggcctcgc gtttcagctt accaacattg ctagggacat catcgacgac 540 gctgcgatag ataggtgtta cctgcctgct gagtggcttc aggacgctgg tcttacgccc 600 gagaactacg ctgccaggga gaacagggct gcccttgcta gagtcgctga gcgtttgatc 660 gacgcggctg aaccctatta cattagctcg caagcgggtt tgcatgactt gcctccacgt 720 tgtgcgtggg ccattgcgac ggcgcgtagt gtttatcgtg aaattgggat caaggttaag 780 gccgctggag gatcagcatg ggaccggaga cagcatacgt ctaagggaga gaagatcgca 840 atgctaatgg cagctcccgg ccaagtcatc cgcgcaaaga caacgcgggt tacacccaga 900 ccagcgggct tatggcagcg accagtatga 930 <210> 3 <211> 930 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência Artificial : Primer Artificial <400> 3
atgtcccagc ctcctctcct ggatcatgct acccaaacta tggctaacgg tagcaagtcc 60
ttcgctaccg ccgctaagct cttcgatcct gctactaggc gttccgtcct catgctgtac 120
acctggtgta ggcattgcga cgatgtgatc gacgatcaaa cccacggttt cgcgtccgag 180
gctgcggccg aggaagaggc gacccaaagg ctcgctcgcc tccgtaccct caccctcgcc 240
gctttcgagg gcgctgagat gcaagatcct gcgttcgccg ctttccaaga ggtcgccctc 300
acccacggca tcactccaag gatggccctg gaccacctgg acggtttcgc tatggacgtc 360
gcccaaactc gctacgtgac tttcgaggac actctccggt actgctacca tgtcgccggt 420
gttgtcggcc tcatgatggc gcgcgtcatg ggtgtccgcg acgagcgcgt cctcgacagg 480
gcttgcgacc tcggcctcgc gtttcagctt accaacattg ctagggacat catcgacgac 540
gctgcgatag ataggtgtta cctgcctgct gagtggcttc aggacgctgg tcttacgccc 600
gagaactacg ctgccaggga gaacagggcc gcccttgcta gagtcgctga gcgtttgatc 660
gacgcggctg aaccctatta cattagctcg caagcgggtt tgcatgactt gcctccacgt 72 0
tgtgcgtggg ccattgcgac ggcgcgtagt gtttatcgtg aaattgggat caaggttaag 780
gccgctggag gatcagcatg ggaccggaga cagcatacgt ctaagggaga gaagatcgca 840
atgctaatgg cagctcccgg ccaagtcatc cgcgcaaaga caacgcgggt tacacccaga 900
ccagcgggct tatggcagcg accagtatga 93 0

Claims (48)

1. Método para a preparação de sementes isentas de marcador de uma planta transgênica que compreende as etapas de: a) obter sementes de uma planta transgênica que compreende um primeiro segmento de DNA compreendendo um ácido nucléico de inte- resse e um segundo segmento de DNA compreendendo um gene marcador fisicamente ligado a um cassete de DNA que é ligado de modo operacional a um promotor funcional na dita semente, sendo que o cassete de DNA confe- re um fenótipo detectável; b) classificar as sementes pela ausência do fenótipo detectável; e c) selecionar pelo menos uma primeira semente que é desprovi- da do fenótipo detectável para obter uma semente isenta do gene marcador.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a etapa c) compreende adicionalmente avaliar a semente pela presença do ácido nucléico de interesse e selecionar uma semente que compreende o ácido nucléico de interesse.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o gene marcador é um gene marcador selecionável.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o gene marcador é um gene marcador verificável.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, sendo que o casse- te de DNA codifica um RNA que é fundido de maneira traducional ou trans- cricional com o gene marcador selecionável.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o casse- te de DNA compreende o DNA que codifica um RNA anti-senso ou senso que silencia um gene endógeno para resultar no fenótipo detectável.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, sendo que o casse- te de DNA compreende um par de repetições invertidas de um fragmento de DNA homólogo ao gene endógeno.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, sendo que a repeti- ção invertida de fragmento de DNA é inserida em um íntron dentro do gene marcador.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o primei- ro segmento de DNA e segundo segmento de DNA se sobrepõem.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a se- mente selecionada na etapa c) é desprovida do gene marcador e cassete de DNA.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a plan- ta transgênica ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior foi co-transformada com o primeiro e segundo segmentos de DNA em constru- ções de DNA separadas.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o pri- meiro e segundo segmentos de DNA são ligados por seqüências de margem de T-DNA diferentes.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, sendo que a eta- pa a) compreende transformar a planta transgênica ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com uma única construção de DNA que compreende o primeiro e segundo segmentos de DNA.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a plan- ta transgênica foi produzida ao transformar a planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração anterior com uma construção de DNA que compreende (i) o primeiro segmento de DNA flanqueado por margens es- querda e direita de T-DNA que compreendem um ácido nucléico de interes- se, e (ii) o segundo segmento de DNA flanqueado por um segundo conjunto de margens esquerda e direita de T-DNA, em que o segundo segmento de DNA compreende ainda um gene marcador ligado de modo operacional a um promotor funcional na planta transgênica.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o pri- meiro e segundo segmentos de DNA não são geneticamente ligados na dita planta transgênica.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o pri- meiro e segundo segmentos de DNA são geneticamente ligados na dita planta transgênica.
17. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a plan- ta transgênica foi produzida ao introduzir o primeiro e segundo segmentos de DNA na dita planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração an- terior por transformação mediada por uma cepa bacteriana selecionada do gênero Agrobacterium, fíhizobium, Mesorhizobium, ou Sinorhizobium.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a plan- ta transgênica foi produzida ao introduzir o primeiro e segundo segmentos de DNA na dita planta ou um progenitor da mesma de qualquer geração an- terior por bombardeamento de microprojéteis.
19. Método, de acordo com a reivindicação 3, sendo que o gene marcador selecionável codifica um produto selecionado do grupo que consis- te em CP4EPSPS, fosfinotricina acetiltransferase, DMO, Nptll, glifosato ace- til transferase, acetolactato sintase mutante, DHFR resistente a metotrexato, dalapon desalogenase, PMI, Protox, higromicina fosfotransferase e antranila- to sintase resistente a 5-metil triptofano.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a se- qüência de cassete de DNA é selecionada do grupo que consiste em crtB, gus, gfp, sacB, lux, um gene de síntese de antocianina, fator de transcrição DefH9-iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, AFR2, ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, splA, repetições invertidas de zeína, B-peru, e ATP-PFKde levedura.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o cas- sete de DNA é ligado de modo operacional a um promotor funcional em um tecido selecionado entre um embrião, endosperma de semente, cotilédone, aleurona e tegumento.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o cas- sete de DNA compreende uma seqüência de ácido nucléico ligada de modo operacional a um promotor selecionado do grupo que consiste em um pro- motor de napina, um promotor de beta-faseolina, um promotor de subunida- de de beta-conglicinina, um promotor de zeína, um promotor de Osgt-1, um promotor de oleosina, um promotor de amido sintase, um promotor de globu- lina 1, promotor de LTP2 de cevada, um promotor de alfa-amilase, um pro- motor de quitinase, um promotor de beta-glucanase, um promotor de cisteí- na, um promotor de glutaredoxina, um promotor de HVA1, um promotor de serina carboxipeptidase II, um promotor de catalase, um promotor de alfa- glucosidase, um promotor de beta-amilase, um promotor de VP1, USP, USP88, USP99, Lectina, um promotor de bronze2.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o fenó- tipo detectável é selecionado do grupo que consiste em cor de semente, o- pacidade de semente, capacidade de germinação de semente, tamanho de semente, viabilidade de semente, formato de semente e textura de semente.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o fenó- tipo detectável é avaliado pela detecção de uma atividade cataiítica.
25. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o fenó- tipo detectável é um fenótipo de ablação de tecido.
26. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que o fenó- tipo detectável resulta em uma semente defeituosa ou abortada.
27. Método, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a etapa c) é realizada por uma máquina de classificação de semente automática.
28. Uma construção de DNA que compreende (a) um primeiro segmento de DNA que compreende margens esquerda e direita de T-DNA que flanqueiam um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas, e (b) um segundo segmento de DNA que compreende um segundo conjunto de margens esquerda e direita de T-DNA que flanqueiam um promotor funcional em uma semente ligada de modo o- peracional a um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável em sementes que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas.
29. Construção de DNA, de acordo com a reivindicação 28, sen- do que o gene marcador é um gene marcador selecionável.
30. Construção, de acordo com a reivindicação 28, sendo que o gene de interesse confere uma característica selecionada do grupo que con- siste em tolerância à herbicida, resistência a inseto ou praga, resistência a doenças, biomassa aumentada, metabolismo de ácido graxo modificado, metabolismo de carboidrato modificado, e qualidade nutricional modificada.
31. Construção, de acordo com a reivindicação 28, sendo que o cassete de DNA e gene marcador selecionável são ligados de modo opera- cional ao mesmo promotor.
32. Construção, de acordo com a reivindicação 28, sendo que o cassete de DNA e o gene marcador selecionável são ligado de modo opera- cional a promotores diferentes.
33. Construção, de acordo com a reivindicação 28, sendo que o gene marcador selecionável codifica um produto selecionado do grupo que consiste em CP4 EPSPS, fosfinotricina acetiltransferase, DMO, NptII, glifo- sato acetil transferase, acetolactato sintase mutante, DHFR resistente a me- totrexato, dalapon desalogenase, PMI, Protox, higromicina fosfotransferase e antranilato sintase resistente a 5-metil triptofano.
34. Construção, de acordo com a reivindicação 28, sendo que o cassete de DNA é selecionado do grupo que consiste em crtB, gus, gfp, sacB, lux, um gene da síntese de antocianina, fator de transcrição DefH9- iaaM, rolB, OsCDPK2, AP2, AFR2, ANT, LEC2, Snf-1, cobA, KAS4, splA, repetições invertidas de zeína, B-peru, e ATP-PFKde levedura.
35. Construção, de acordo com a reivindicação 28, sendo que o cassete de DNA é ligado de modo operacional a um promotor funcional em um tecido selecionado do grupo que consiste em um embrião, endosperma de semente, cotilédone, aleurona e tegumento.
36. Construção, de acordo com a reivindicação 22, sendo que o cassete de DNA é ligado de modo operacional a um promotor selecionado do grupo que consiste em um promotor de napina, um promotor de beta- faseolina, um promotor de subunidade beta-conglicinina, um promotor de zeína, um promotor de Osgt-1, um promotor de oleosina, um promotor de amido sintase, um promotor de globulina 1, um promotor de LTP2 de ceva- da, um promotor de alfa-amilase, um promotor de quitinase, um promotor de beta-glucanase, um promotor de cisteína proteinase, um promotor de gluta- redoxina, um promotor de HVA1, um promotor de serina carboxipeptidase II, um promotor de catalase, um promotor de alfa-glucosidase, um promotor de beta-amilase, um promotor de VP1, um promotor de USP, USP88 ou USP99, e um promotor de bronze2.
37. Célula transgênica transformada com a construção, de acor- do com a reivindicação 28.
38. Planta transgênica transformada com a construção, de acor- do com a reivindicação 28.
39. Planta transgênica co-transformada com uma construção de DNA que compreende um primeiro segmento de DNA compreendendo mar- gens esquerda e direita de T-DNA que flanqueiam um gene de interesse li- gado de modo operacional a um promotor funcional em plantas e uma se- gunda construção de DNA que contém um segundo segmento de DNA com- preendendo um segundo conjunto de margens esquerda e direita de T-DNA que flanqueiam um promotor funcional em uma semente ligada de modo o- peracional a um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável em sementes que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas.
40. Célula da planta, de acordo com a reivindicação 39.
41. Construção de DNA que compreende margens direita e es- querda de T-DNA, sendo que um primeiro segmento de DNA que compre- ende um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor fun- cional em plantas fica localizado após a margem esquerda e um segundo segmento de DNA que compreende um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável às sementes das plantas que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas está localizado após a margem direita.
42. Construção de DNA que compreende margens direita e es- querda de T-DNA, sendo que o primeiro segmento de DNA compreende um cassete de DNA que confere um fenótipo detectável às sementes das plan- tas que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas está localizado após a margem direita, e um segundo segmento de DNA que compreende um gene de interesse ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas fica localizado após a margem esquerda.
43. Construção de DNA que compreende primeira e segunda margens direitas de T-DNA1 sendo que um primeiro segmento de DNA que compreende um gene de interesse ligado de modo operacional a um promo- tor funcional em plantas fica localizado após a primeira margem direita e um segundo segmento de DNA que compreende um cassete de DNA que confe- re um fenótipo detectável às sementes das plantas que compreendem o cassete de DNA e um gene marcador ligado de modo operacional a um promotor funcional em plantas localizadas após a segunda margem direita.
44. Seqüência de ácido nucléico isolado que compreende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou uma seqüência com pelo menos 71% de identi- dade com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, e que codifica um polipeptídeo com atividade de fitoeno sintase.
45. Construção de DNA recombinante que compreende a se- qüência de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 44, ligada de mo- do operacional a um promotor funcional heterólogo em uma planta.
46. Célula hospedeira, que compreende a seqüência de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 44.
47. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 46, sendo que a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula vegetal.
48. Planta transgênica ou semente que compreende a seqüência de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 44.
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