BRPI0712008A2

BRPI0712008A2 - derivados e análogos de fix prolongados

Info

Publication number: BRPI0712008A2
Application number: BRPI0712008-7A
Authority: BR
Inventors: Henrik Ostergaard; Ole Hvilsted Olsen; Henning Ralf Stennicke; Thomas Dock Steenstrup
Original assignee: Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date: 2006-05-24
Filing date: 2007-05-24
Publication date: 2012-01-10
Also published as: WO2007135182A3; US20090252720A1; EP2029738A2; CN104593348A; MX2008014685A; CA2653154A1; KR20090013816A; WO2007135182A2; AU2007253264A1; JP2014129354A; CN101484576A; EP2213733A2; EP2213733A3; RU2008145084A; JP2009537609A

Abstract

DERIVADOS E ANáLOGOS DE FIX PROLONGADOS. A presente invenção refere-se a análogos de FIX que têm um tempo de circulação aumentado na corrente sanguínea antes da ativação em comparação com aquele de FIX nativo (e uma semana depois da injeção para um paciente retém pelo menos cerca de 5% da atividade de FIX em comparação com o valor de pico de atividade inicial alcançado depois da injeção). Os análogos de FIX reivindicados compreendem um resíduo de cisteina inserido que foi ulteriormente modificado por conjugação com um grupo químico que aumenta o peso molecular do análogo de FIX.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DERIVADOS E ANÁLOGOS DE FIX PROLONGADOS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a certos derivados e análogos de FIX de coagulação de sangue com um tempo de circulação prolongado na corrente sangüínea comparado com FIX nativo. Fundamentos da Invenção

Fator IXa (FIXa) é uma protease de serina de tipo tripsina que serve como um papel chave na hemostasia por geração, como parte do complexo de Xase1 maior parte do fator Xa exigido para suportar formação de trombina adequada durante a coagulação (reveista em (Hoffman e Mon- roe, Ill 2001)). Deficiência congênita de atividade de fator IXa é a causa da desordem de sangramento ligado a X hemofilia B que afeta cerca de 1:100.000 maços. Esses pacientes com hemofilia são atualmente tratados por terapia de substituição ou com FIX de coagulação derivado de plasma ou de recombinante. No entanto, recomendações agora estão se movendo a partir do tratamento conforme a necessidade tradicional em relação a profi- laxia. Terapia de profilaxia atual necessita múltiplas administração dosada por semana, mas para ótimos níveis e eficácia no plasma, injeções uma vez diariamente seriam superiores. Devido às limitações práticas e econômicas associadas a administrações diárias, isso não é atualmente uma opção para os pacientes. Assim, há uma necessidade clara de um produto de fator IX recombinante de ação prolongada.

A WO 2006005058 refere-se a conjugados de uma porção de fator IX e um ou mais polímeros solúveis em água com um tamanho de 5- 150 kDa. WO 2006018204 refere-se a polipeptídeos dependentes de vitami- na K modificados compreendendo um peptídeo de ativação modificado. WO 2004101740 refere-se a uma proteína quimérica compreendendo pelo me- nos um fator de coagulação e pelo menos uma porção de uma região cons- tante de imunoglobulina. WO 2005001025 refere-se a uma proteína híbrida de monômero-dímero quimérica em que a dita proteína compreende uma primeira cadeia polipeptídeo compreendendo uma porção de uma região constante de imunoglobulina e uma molécula biologicamente ativa e uma segunda cadeia polipeptídeo compreendendo uma porção de uma região constante de imunoglobulina sem a molécula biologicamente ativa. US 2006040856 refere-se a conjugados entre fator IX e porções de PEG ligados via um grupo de ligação de glicosila intacto interposto entre e covalentemen- te ligado ao peptídeo e o grupo de modificação.

SE 9501285A revela um processo para a produção in vitro de cerca de proteínas reticuladas por dissulfeto biologicamente ativo, dobradas usando-se uma mistura de uma oxirredutase de dissulfeto de proteína (por exemplo, isomerase de dissulfeto de proteína (PDI)), uma glutaredoxina e um tampão de redox. A referência é focalizada em cisteínas envolvidas nas ligações de dissulfeto intramoleculares.

WO 2006/134173 refere-se um método para derivatização e re- dução seletiva de proteínas engenheiradas recombinantemente preparadas compreendendo pelo menos uma cisteína não nativa incluindo polipeptídeos de fator IX.

É um objetivo da invenção prover derivados ou análogos de FIX modificados com um tempo de circulação prolongado na corrente sangüínea em comparação com FIX nativo enquanto retendo atividade biológica sufici- ente para suportar coagulação de sangue. Sumário da invenção

Em um aspecto a presente invenção refere-se a um análogo de FIX com uma semi-vida circulatório prolongada, em que pelo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415 é usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

Em uma concretização preferida o análogo de FIX tem pelo me- nos um dos resíduos de amino naturais na posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80 ou 84 é usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

Em uma outra concretização preferida o análogo de FIX tem pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141 ou 142, é usado como substituto de um resíduo de ami- noácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

Em uma outra concretização preferida o análogo de FIX tem pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415, é usado como substituto de um resíduo de aminoáci- do de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso mole- cular do polipeptídeo de FIX

Em uma outra concretização preferida o análogo de FIX tem pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 146-180, usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

Deve ser entendido que uma vez que a posição 146-180 corres- ponde ao peptídeo de ativação de FIX, que é removido na ativação, um aná- logo de FIX, em que pelo menos um dos resíduos de amino naturais é usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína em uma posição selecionada de 146-180, que cisteína is conjugada com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX, esse grupo químico não estará presente no análogo após a ativação.

Em uma outra concretização preferida o análogo de FIX tem pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais selecionado das posições 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176 1 77, é usado como substituto de um resíduo de aminoá- cido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso mo- lecular do polipeptídeo de FIX.

Em uma outra concretização preferida o análogo de FIX tem pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais selecionado das posições 160, 161, 162, 163, 164, 165 e 166, é usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

Em uma outra concretização preferida o análogo de FIX tem re- síduo de aminoácido E162 usado como substituto de um resíduo de aminoá- cido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso mo- lecular do polipeptídeo de FIX.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um análogo de FIX com uma semi-vida circulatória prolongada, que tem pelo menos um resíduo de cisteína anexada ao T415 C-terminal, a dita cisteína sendo con- jugada com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptí- deo de FIX.

Em concretizações preferidas da presente invenção, o grupo químico conjugado aos polietileno glicóis de resíduo de cisteína não nativa (PEG). Em uma outra concretização preferida o polietilenoglicol tem um peso molecular médio na faixa de 500-100.000, tais como de 1000-75.000, ou de 2.000-60.000.

Em análogos de FIX preferidos tem uma semi-vida circulatória de pelo menos 1,5 vezes que de FIX de tipo selvagem.

Em análogos de FIX preferidos da presente invenção o análogo, quando medido em um ensaio de coagulação, tem uma atividade biológica de pelo menos 20% de FIX de tipo selvagem.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para a preparação de um análogo de FIX, compreendendo as etapas de a) redução seletiva de um polipeptídeo de FIX engenheirado compreendendo pelo menos uma cisteína não nativa em uma posição selecionada do grupo da posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415, conjugada através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-CYS), por permissão de que o FIX conjugado com tiol de bai- xo peso molecular reaja com uma mistura compreendendo um tampão de redox e b) uma etapa simultânea ou subseqüente de conjugação de pelo menos um das porções de cisteína seletivamente reduzidas (HS-Cys) com um grupo químico.

Em uma concretização preferida o método compreende um tam- pão de redox compreendendo uma mistura compreendendo glutationa redu- zida ou oxidada. Em uma outra concretização preferida o tampão de redox ulteriormente compreende uma glutaredoxina.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para preparação de um análogo de FIX, compreendendo as etapas de a) redução seletiva um polipeptídeo de FIX engenheirado compreendendo pelo menos uma cisteína não nativa em uma posição selecionada do grupo da posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415, conjugada através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-CYS), por permissão de que o FIX conjugado com tiol de bai- xo peso molecular reaja com uma mistura compreendendo um composto de ácido triarilfosfina-3,3',3"-trissulfônico e b) uma etapa simultânea ou subse- qüente de conjugação de pelo menos uma das porções de cisteína seletiva- mente reduzidas (HS-Cys) com um grupo químico.

Em concretizações preferidas do método da presente invenção o grupo químico é selecionado polietileno glicóis (PEG), em particular um ten- do um peso molecular médio de na faixa de 500-100.000, tais como 1000- 75.000, ou de 2.000-60.000. Um outro aspecto da invenção refere-se a uma formulação farmacêutica pa- ra o tratamento de um paciente com hemofilia compreendendo uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de um análogo de FIX de acordo com a inven- ção juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de tratamento de um paciente com hemofilia compreendendo administração ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo de FIX de acordo com a invenção juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma concretização preferida o método conseqüentemente compreende pelo menos um tratamento uma vez por semana. Em uma outra concretização preferida o tratamento compreende apenas tratamento uma vez por semana.

Descrição Detalhada da Invenção

FIX é um fator de coagulação dependente de vitamina K com similaridades estruturais ao fator VII, protrombina, fator X, e proteína C. A forma de zimogênio circulante, que tem tem uma semi-vida no plasma de cerca de 18-30 horas, consiste de 415 aminoácidos divididos em quatro do- mínios distintos compreendendo um domínio rico de ácido γ- carboxiglutâmico N-terminal (Gla), dois domínios de EGF1 e um domínio de protease de serina de tipo tripsina C-terminal. Ativação de FIX ocorre por proteólese limitada a liberação de Arg145-Ala146 e Arg180-Val181 de um frag- meno de 35-aa, o assim chamado peptídeo de ativação (Schmidt e Bajaj 2003). O peptídeo de ativação é fortemente glicosiladdo contendo dois glica- nos N-Iigados e até quanto O-ligados.

Modificação covalente, por exemplo, por PEGilação ou ligação de peptídeo, foi aplicada com sucesso em vários produtos farmacêuticos à base de proteína para aperfeiçoar seus perfis farmacocinético ou farmacodi- nâmico. Conjugação via cisteínas nativas ou engenheiradas provê um meio atraente de modificação específica de sítio devido à raridade desse aminoá- cido sobre a superfície de proteínas bem como a alta seletividade fornecida pela química de acoplamento de tiol. Na prática, no entanto, essa aborda- gem é freqüentemente complicada pelo fato de que as cisteínas introduzidas são encontradas como dissulfetos mistos com tióis de baixo peso molecular (LMW) tais como cisteína e glutationa que previnem modificação subseqüente.

Assim, há uma necessidade de métodos em que dissulfetos mis- tos de tais cisteínas e tióis de baixo peso molecular podem ser quimicamen- te reduzidos com a prevenção das ligações de dissulfeto nativo.

O gene de fator IX humano foi isolado e foi expresso em células de mamífero (K. Kurachi e E. W. Davie). Isolamento e caracterização de um cDNA que codifica fator IX humano. PNAS. 79 (21 l):6461-6464, 1982; Κ. H. Coo, K. G. Gould1 D. J. Rees1 e G. G. Brownlee. Clonagem molecular do ge- ne para fator IX de anti-hemofílico humano. Nature 299 (5879): 178-180, 1982; R. J. Kaufman1 L. C. Wasley1 B. C. Furie1 B. Furie1 e C. B. Shoemaker. Expressão, purificação e caracterização de fator IX gama-carboxilado re- combinante sintetizado em células de ovário chinês. J.Biol.Chem. 261 (21):9622-9628, 1986.) e a seqüência aminoácidos foi deduzida de cDNA.

O presente tratamento de hemofilia B com FIX normalmente in- clui por volta de duas injeções semanalmente suplementadas com injeções em uma base necessária, por exemplo, antes da extrações de dentes ou cirurgia. FIX circula uma proforma inativa e é apenas convertida da forma ativa FIXa quando um sangramento deve ser interrompido. Assim um meio de realizar um tratamento com FIX profilático com base em, por exemplo, uma injeção semanal deve aumentar o tempo de circulação de FIX na cor- rente sangüínea do paciente. Desse modo sempre terá um cero nível de FIX de zimogênio pronto para ser ativado para assegurar condições de coagula- ção de sangue normais no paciente em qualquer tempo.

Os análogos de FIX de acordo com a presente invenção são modificados por substituição de um ou mais do resíduo natural de aminoáci- dos em FIX com um resíduo de Cys.

Identificação de posições em FIX adequada para a introdução de resíduos de cisteína:

As posições de aminoácido sendo modificadas de preferência serão tomadas da combinação de resíduos tendo uma acessabilidade de superfície de cadeia lateral realtiva >50%. Acessabilidade de superfície para a cadeia pesada e domínio de EGF2 foram calculadas a partir de dados cri- talográficos publicados (1RFN, Hopfner e outros, 1999), enquanto cálculos do domínio de EGF1 eram baseados em uma construção de modelo de ho- mologia a partir da estrutura de cristal de FIXa de suíno (1PFX, Brandstetter e outros, 1995). Além disso, resíduos selecionados (resíduos 155-177) no peptídeo de ativação, para o qual nenhuma informação estrutural está dis- ponível, foram considerados importantes. Em uma publicação recente foi mostrado que esse segmento do peptídeo de ativação pode ser deletado sem comprometer a atividade biológica de FIX (Begbie e outros. 2005). To- das as posições relevantes em FIX humano são listadas na Tabela 1.

Tabela 1. Posições relevantes para modificação específica de sítio de FIX. 'ASA1' é a acessabilidade (em Á2) do resíduo de aminoácido total, 'ASA2' é a acessabilidade (em Á2) da cadeia lateral, e 'Rei. ASA' é a acessabilidade da cadeia lateral fracional. A numeração de seqüência segue quimiotripsina e é idêntica à numeração na estrutura de cristal de FIXa de suíno (IPFX.pdb). Cadeias laterais marcadas com asterisco (*) ou um me- nos (-) levanta-se a hipótese de que seja important para a ligação ao com- plexo de FVIIa/TF (Chen, C.W. e outros, Thromb Haemost. 2002; 88:74-82.) ou to FVIIIa (Autin, L. e outros, J. Thromb. Haem. 2005, 3: 2044-56), respec- tivamente.

<table>table see original document page 9</column></row><table> <table>table see original document page 10</column></row><table> EGF2 de FIX <table>table see original document page 10</column></row><table> <table>table see original document page 11</column></row><table>

<table>table see original document page 11</column></row><table> <table>table see original document page 12</column></row><table> <table>table see original document page 13</column></row><table> <table>table see original document page 14</column></row><table>

Os análogos de FIX da presente invenção têm uma semi-vida circulatória prolongada quando em comparação com FIX de tipo selvagem. A semi-vida circulatória pode ser medida por métodos métodos conhecidos pela pessoa versada, tal como, por exemplo, descritos em McCarthy e ou- tros Thromb Haemost. 2002 May;87(5):824-30.

Em concretizações preferidas a semi-vida circulatória dos análo- gos de FIX da presente invenção é pelo menos 1,5 vezes do que o FIX de tipo selvagem, tais como pelo menos 1,6, por exemplo, pelo menos 1,7, tais como pelo menos 1,8, por exemplo, pelo menos 1,9, tais como pelo menos 2,0, por exemplo, pelo menos 2,2, tais como pelo menos 2,4 vezes do que oe FIX de tipo selvagem quando medida no mesmo ensaio ou modelo.

Os análogos de FIX da presente invenção, além do mais, retêm atividade biológica suficiente para suportar a formação de coagulo in vivo. A atividade biológica pode ser medida por métodos conhecidos pela pessoa versada tal como, por exemplo, descritos em McCarthy e outros Thromb Ha- emost. em maio de 2002; 87(5):824-30.

Em concretizações preferidas a atividade de coagulação dos análogos de FIX da presente invenção é pelo menos 15%, tais como pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 25%, tais como pelo menos 30%, por exemplo, pelo menos 35%, tais como pelo menos 40%, por exemplo, pelo menos 50%, tais como pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70% da atividade de coagulação de FIX de tipo selvagem quando medida no mesmo ensaio.

Mutação, expresseção & purificação

Os análogos de FIX podem ser produzidos por meio de técnicas de ácido nucléico recombinantes. Em general, uma seqüência de ácidos nu- cléicos humana clonada é modificada para codificar o análogo de FIX dese- jado e é então inserida para dentro de um vetor de expressão, que é por sua vez transformado ou transfectado para dentro de células hospedeiras. Célu- las eucarióticas superiores, em particular células mamíferos cultivadas, são preferidas as células hospedeiras.

As alterações de seqüência de aminoácidos podem ser realiza- das por uma variedade de técnicas. Modificação da seqüência de ácidos nucléicos pode ser por mutagênes específica de sítio. Técnicas para muta- gênes específica de sítio são bem conhecidas na técnica e são descritas em, por exemplo, Zoller e Smith (DNA 3:479-488, 1984) ou "Splicing by extensi- on overlap", Horton e outros., Gene 77, 1989, pp. 61-68. Assim, usando-se as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de FIX, pode-se introduzir a(s) alteração(ões) de escolha. Do mesmo modo, procedimentos para a pre- paração de um construto de DNA usando-se reação de cadeia de políme- roase usando-se iniciadores específicos são bem conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica (cf. PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, Califórnia, USA).

O contruto de ácido nucléico que codifica o análogo de FIX da invenção pode ser de origem de origem genômica ou cDNA, por exemplo, obtido pela preparação de uma biblioteca genômica ou de cDNA e triagem quanto a seqüências de DNA que codificam a totalidade ou parte de FIX por hibridização usando-se sondas de oligonucleotídeo sintéticas de acordo com técnicas padrão (cf. Sambrook e outros., Clonagem molecular: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Labora-tory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

O construto de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de análogo de FIX pode também ser preparado sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, por exemplo, o método de fosfoamidita descrito por Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869, ou o método described by Matthes e outros., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. De acordo com o método de fosfoamidita, oligonucleotídeos são sintetiza- dos, por exemplo, em uma sintetizador de DNA automático, são purificados, são anelados, são ligados e são clonados em vetores adequados. As se- qüências de DNA que codificam os polipeptídeos de FIX de ser humano po- dem também ser preparados por reação de cadeia de polímeroase usando- se iniciadores específicos, por exemplo, como descritos na patente U.S. no. 4.683.202, Saiki e outros., Science 239 (1988), 487 - 491, ou Sambrook e outros., supra.

Além do mais, o construto de ácido nucléico pode ser de origem genômica e sintética mista e cDNA ou de cDNA e genômica mista preparado por ligação de fragmentos de origem sintética, genômica ou de cDNA (quan- do apropriado), os fragmentos que correspodem a várias partes do construto de ácido nucléico inteiro, de acordo com técnicas padrão.

As seqüências de DNA que codificam os polipeptídeos de FIX são usualmente inseridos para dentro de um vetor recombinante que pode ser qualquer vetor, que pode convenientemente ser submetidos a procedi- mentos de DNA recombinantes, e a escolha do vetor freqüentemente de- penderá da célula hospedeira em que ela deva ser introduzida. Assim, o ve- tor pode ser um vetor de replicação autonômo, isto é, um vetor, que existe como uma entidade extracromossomal, cuja replicação é independente de replicação cromossomal, por exemplo, uma plasmídio. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido para dentro de uma célula hos- pedeira, é integrado para dentro do genoma da célula hospedeira e replicado juntamente com o cromossoma(s) para dentro do qual ele foi integrado.

O vetor é de preferência um vetor de expressão em que a se- qüência de DNA que codifica o análogo de FIX é operavelmente ligado a segmentos adicionais exigidos para a transcrição do DNA. Em general, o vetor de expressão é derivado de DNA viral ou plasmídio, ou pode conter elementos de ambos. O termo, "operavelmente ligado" indica que os seg- mentos são dispostos de modo que eles funcionem de comum acordo para as suas finalidades pretendidas, por exemplo, transcrição inicia em um pro- motor e prossegue através da seqüência de DNA que codifica o polipeptí- deo.

Vetores de expressão para o uso na expressão de análogos de FIX compreenderão um promotor capaz de dirigir transcrição de um cDNA ou de gene clonado. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA, que mostra atividade transcritiva na célula hospedeira de escolha e pode ser de- rivado de genes que codificam proteínas ou homólogas ou heterólogas à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para a direção da transcri- ção do DNA que codifica os análogos de FIX em células de mamífero são o promotor de SV40 (Subramani e outros., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 -864), o promotor de MT-1 (gene de metalotioneína) (Palmiter e outros., Science 222 (1983), 809 - 814), o promotor de CMV (Boshart e outros., Cell 41:521- 530, 1985) ou o promotor tardio principal de adenovírus 2 (Kaufman e Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982).

As seqüências de DNA que codificam o análogo de FIX podem também, se necessário, serem operavelmente ligadas a um terminador ade- quado, tal como o terminador de hormônio de crescimento humano (Palmiter e outros., Science 222, 1983, pp. 809-814) ou os terminadores de TPI1 (Al- ber e Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pp. 419-434) ou de ADH3 (McK- night e outros., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099). Vetores de expressão podem também conter um conjunto de sítios de união localizados a jusante do promotor e a motante do sítio de inserção para a própria seqüência de FIX. Sítios de união de RNA preferidos podem ser obtidos a partir de adeno- vírus e/ou genes de imunoglobulina. Também contida nos vetores de ex- pressão é um sinal de poliadenilação localizado a jusante do sítio de inser- ção. Sinais de poliadenilação particularmente preferidos incluem o sinal de poliadenilação precoce ou tardio oriundo de SV40 (Kaufman e Sharp1 ibid.), o sinal de poliadenilação oriundo da região Elb do adenovírus 5, o termina- dor de gene de hormônio de crescimento humano (DeNoto e outros. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) ou o sinal de poliadenilação oriundo do gene de FIX humano. Os vetores de expressão podem também incluir uma se- qüência líder viral de não codificação, tal como o líder tripartido de adenovi- rus 2, localizado entre o promotor e os sítios de união de RNA; e seqüências aumentadoras, tal como o aumentador de SV40.

Para dirigir o análogo de FIX da presente invenção na trajetória secretória das células hospedeiras, uma seqüência de sinal secretória (tam- bém conhecida como uma seqüência líder, pré-pró-seqüência ou pré- seqüência) pode ser provida no vetor recombinante. A seqüência de sinal secretória é unida às seqüências de DNA que codificam os análogos de FIX no quadro de leitura correto. Seqüência de sinal secretória estão comumente posicionadas 5' em relação a seqüência de DNA que codifica o peptídeo. A seqüência de sinal secretória pode ser aquela, normalmente associada à proteína ou pode ser oriunda de um gene que codifica uma outra proteína secretada.

Os procedimentos usados para ligar as seqüências de DNA que codificam os análogos de FIX, o promotor e opcionalmente o terminador e/ou seqüência de sinal secretória, respectivamente, e para inseri-los para dentro dos vetores adequados contendo a informação necessária para a replicação, são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica (cf., por exemplo,, Sambrook e outros., Clonagem molecular: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Métodos de transfecção de células de mamífero e expressão de seqüências de DNA introduzidas nas células são descritos em, por exemplo, Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern e Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler e outros., Cell 14 (1978), 725; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham e van der Eb, Viro- logy 52 (1973), 456; e Neumann e outros., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845.

Seqüências de DNA clonados são introduzidos para dentro de células de mamífero cultivadas por, por exemplo, transfecção mediada por fosfato (Wigler e outros., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham e Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) ou eletroporação (Neumann e outros., EMBO J. 1:841-845, 1982). Pa- ra identificar e selecionar células que expressam o DNA exógeno, um gene que confere um fenótipo selecionável (um marcador selecionável) é em geral introduzido para dentro das células juntamente com o gene ou cDNA de inte- resse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem genes que conferem 1,5 resistência a fármacos tais como neomicina, higromicina e metotrexato. O marcador selecionável pode ser um marcador selecionável ampliável. Um marcador selecionável ampliável preferido é uma seqüência de redutase de diidrofolato (DHFR). Marcadores selecionáveis são revistos por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, incor- porados aqui por referência). A pessoa versada na técnica facilmente será capaz de escolher The person skilled in the art will easily be able to coose marcadores selecionáveis adequados.

Marcadores selecionáveis podem ser introduzidos para dentro da célula em um plasmídio separado ao mesmo tempo que o gene de inte- resse, ou eles podem ser introduzidos no mesmo plasmídio. Construtos des- se tipo são conhecidos na técnica (por exemplo, Levinson e Simonsen, a patente U.S. no. 4.713.339). Pode também ser vantajoso adicionar DNA adi- cional, conhecido como "DNA de veículo" à mistura que é introduzida para dentro das células.

Depois que as células foram colocadas no DNA, elas são de- senvolvidas em um meio de crescimento apropriado, tipicamente 1-2 dias, para começar a expressão do gene de interesse. Como usado aqui o termo "meio de crescimento apropriado" significa um meio contendo nutrientes e outros componentes exigidos para o crescimento de células e a expressão dos análogos de FIX. Meios em geral incluem uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos essenciais, açúcares essenciais, vitaminas, sais, fosfolipídios, proteína e fatores de crescimento. Seleção de fármaco é então aplicada para selecionar para o crescimento das células que estão exprimindo o marcador selecionável em uma forma adequada. Para as célu- las que foram transfectadas com um marcador selecionável ampliável a con- centração de fármaco pode ser aumentada para selecionar para um número de cópias aumentado das seqüências clonadas, desse modo, aumentando níveis de expressão. Clones de células transfectadas estáveis são então triadas quanto a expressão do análogo de FIX.

Exemplos de linhas de células de mamífero para o uso na pre- sente invenção são linhas de célula de COS-1 (ATCC CRL 1650), de rim de hamster bebê (BHK) e de 293 (ATCC CRL 1573; Graham e outros., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Uma linha de célula de BHK preferida é a linha de célula de tk- ts13 BHK (Waechter e Baserga, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:1106-1110, 1982, incoporadas aqui por referência), aqui em seguida chamadas de células de BHK 570. A linha de célula de BHK 570 foi deposi- tada com a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockvil- le, Md. 20852, sob o número de acesso ATCC CRL 10314. Uma linha de célula de tk- ts13 BHK está também disponível do ATCC sob o número de acesso CRL 1632. Além disso, numerosas outras linhas de célula podem ser usadas dentro da presente invenção, incluindo células de Hep I de rato (he- patoma de Rato; ATCC CRL 1600), de Hep Il rato (hepatoma de rato; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmão humano (ATCC HB 8065), de NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), de CO (ATCC CCL 61) e de CO-DUKX (Ur- laub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, 1980).

Análogos de FIX da invenção são recuperados a partir do meio de cultura e podem então ser purificados por uma variedade de procedimen- tos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização e exclu- são por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa (IEF), solubilidade diferencial (por exemplo, precipita- ção de sulfato de amônio), ou extração (vide, por exemplo, Protein Purificati- on, J.-C. Janson e Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

De preferência, eles podem ser purificados por cromatografia por afinidade sobre uma coluna de anticorpo de anti-FIX. Purificação adicional pode ser alcançada por meio de purificação química convencional, tal como cromato- grafia líquida de alto desempenho. Outros métodos de purificação são co- nhecidos na técnica, e podem ser aplicados à purificação dos novos polipep- tídeos de FIX descritos aqui (vide, por exemplo, Scopes, R., Protein Purifica- tion, Springer-Verlag, N.Y., 1982).

Para finalidades terapêuticas é preferido que o análogo de FIX seja purificado para pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade, de preferência para pelo menos cerca de 98% de homogeneidade. Pureza pode ser avaliada por, por exemplo, eletroforese de gel e seqüenciação de amino- ácido amino-terminal.

Redução seletiva

Em virtude dos obstáculos acima mencionados com relação a conjugação química via grupos tiol de cisteínas não envolvidas em ligações de dissulfeto intramoleculares de proteínas preparadas por técnicas recom- binantes, a presente invenção provê o uso de uma mistura de tampão de redox definida (por exemplo, em combinação com um catalisador de redoz de tiol-dissulfeto) ou uma triarilfosfina para seletivamente reduzir a ligação de dissulfeto mista entre tióis de baixo peso molecular e uma proteína enge- nheirada compreendendo pelo menos uma cisteína não nativa, por exemplo, um fator de coagulação ou uma proteína da família de tripsina de proteases de serina, com tais cisteínas engenheiradas ou nativas. A seguir redução seletiva do dissulfeto misto, a cisteína livre pode então ser modificada por conjugação usando-se a química de acoplamento de tiol na proteína como conhecida por pessoas versadas na técnica.

Conjugação química via cisteínas engenheiradas ou nativas ofe- rece a escolha de modificação direcionada de proteínas que fornece um úni- co produto homogêneo. No entanto, em casos onde a cisteína é conjugada a um tiol de baixo peso molecular e a proteína contém ligações de dissulfeto intramoleculares instáveis essa estratégia não é viável. A presente invenção permite remoção seletiva de preparação da porção de tiol de baixo peso mo- lecular da cisteína liberada para modificação química subseqüente.

Portanto, um aspecto da presente invenção refere-se a um mé- todo para redução seletiva de um FIX engenheirado, isto é, compreendendo pelo menos uma cisteína não nativa, o dito FIX compreendendo um ou mais porções de cisteína conjugadas através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-Cys), a(s) dita(s) porção/porções não estando envolvida(s) nas pontes S-S intramoleculares (Cys-S-S-Cys) quando a prote- ína está em sua forma nativa, o método compreendendo a etapa de permitir que a proteína conjugada com tiol de baixo peso molecular reaja com uma mistura compreendendo um tampão de redox.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para redução seletiva de um FIX engenheirado, isto é, compreendendo pelo menos uma cisteína não nativa, a dita proteína compreendendo uma ou mais porções de cisteína conjugadas através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-Cys), a(s) dita(s) porção/porções não estando envolvida(s) nas pontes S-S intramoleculares (Cys-S-S-Cys) quan- do a proteína está em sua forma ativa, o método compreendendo a etapa de perimitir que a proteína conjugada com tiol de baixo peso molecular reaja com uma mistura compreendendo um agente de redução de triarilfosfina.

O termo "seletivamente reduzido" refere-se ao fato de que uma porção predominante, por exemplo, uma fração de 60% ou mais, ou 80% ou mais, tais como 90% ou mais, das porções de cisteína conjugada através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular são reduzidas para liberar uma porção de cisteína com um grupo tiol que está pronta para a conjugação com outros grupos, enquanto que porção predominante, por exemplo, 60% ou mais, ou 80% ou mais, such as 90% ou mais, de outras ligações de dissulfeto (tipicamente ligações de dissulfeto intramoleculares) são preservadas de modo que a atividade biológica da proteína engenheira- da seja substancialmente preservada. (A) Tampão de redox

Como mencionado acima, a presente invenção i.a. provê um método para redução seletiva de uma proteína engenheirada compreenden- do pelo menos uma cisteína não nativa, por exemplo, um fator de coagula- ção ou uma proteína da família de tripsina de proteases de serina. A proteí- na em questão compreende um ou mais porções de cisteína conjugada atra- vés de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-Cys), a(s) dita(s) porção/porções não estando envolvidas nas pontes S-S intramo- leculares (Cys-S-S-Cys) quando a proteína está em sua forma ativa, o méto- do compreendendo a etapa de permitir que a proteína conjugado com tiol de baixo peso molecular reaja com uma mistura compreendendo um tampão de redox.

Quando usado aqui, o termo "tampão de redox" destina-se a significar um par de redox de dissulfeto/tiol em uma razão que que seja re- dução suficiente para romper um dissulfeto(s) mistos de tiol de proteína de baixo peso molecular (RS-Cys) e ao mesmo tempo oxidação suficiente para preservar a integridade das ligações de dissulfeto nativo na proteína.

De preferência, o tampão de redox compreende um par de redox de dissulfeto/tio de baixo peso molecular. Pelo termo "baixo peso molecular" quer se dizer que a forma de tiol do par de redox tem um peso molecular de no máximo 500 g/mol. Exemplos ilustrativos de tais pares de redox são a- queles selecionados da (i) glutationa reduzida ou oxidada e (ii) γ- glutamilcisteína reduzida e oxidada, (iii) cistenilglicina reduzida ou oxidada, (iv) cisteína reduzida e oxidada, (v) N-acetilcisteína reduzida e oxidada, (vi) cisteamina, é (vii) diidrolipoamida/lipoamida, de preferência de (i) glutationa reduzida ou oxidada.

As ótimas condições de redox podem ser determinadas por rea- lização de uma titulação de redox da proteína como conhecida pela pessoa versada na técnica. Vide Gilbert (1995).

Em uma concretização, o tampão de redox é um par de redox de glutationa reduzida ou oxidada, e a concentração da glutationa reduzida está na faixa de 0-100 mM, e a razão entre glutationa reduzida e glutationa oxi- dada está na faixa de 2-200.

Em uma outra concretização, o tampão de redox é um par de redox de glutationa reduzida ou oxidada, e a concentração da glutationa re- duzida está na faixa de 0-100 mM, por exemplo, de 0,01-50 mM, e a concen- tração da glutationa oxidada está na faixa de 0-5 mM, por exemplo, de 0,001-5 mM. Para polipeptídeos de fator IX, a concentração da glutationa reduzida está de preferência na faixa de 0-5 mM, por exemplo, de 0,01-2 mM, e a concentração da glutationa oxidada está na faixa de 0,001-2 mM, por exemplo, de 0,001 -0,200 mM.

Uma vez que a glutationa e outros tióis de baixo peso molecular são em geral redutores/oxidantes pobres em termos de cinética de reação, um catalisador de redox de dissulfeto/tiol é mais de preferência incluído na mistura em combinação com tampão de redox a fim de aumentar a taxa da reação.

Catalisadores de redox de dissulfeto/tiol adequados a serem in- cluídos na mistura incluem glutaredoxinas de tipo ditiol e de tipo monotiol. Glutaredoxinas e suas funções são em geral descritas em Fernandes e ou- tros. (2004). Exemplos de glutaredoxinas úteis são aquelas selecionadas de Grx1, Grx2 ou Grx3 de Escherichia coli (Holmgren e outros., 1995), Grxlp, Grx2p, Grx3p, Grx4p, e Grx5p de Saccharomyces cerevisiae (Luikenhuis e outros. 1998; Rodriguez-Manzaneque e outros., 1999; Grant, 2001), Grxl e Grx2 de Homo sapiens (Padilla e outros. 1995; Lundberg e outros., 2001), e suas variantes. Variantes incluem, mas não é restrista a, glutaredoxinas de tipo ditiol em que a cisteína C-terminal no pedaço de CXXC foi substituída por um outro aminoácido tipicamente serina (vide Yang e outros., 1998).

O catalisador de redox (em particular uma glutaredoxina) é de preferência usado em uma concentração de 0,001-20 μΜ.

É preferido que a mistura não compreenda uma isomerase de dissulfeto de proteína (PDI).

O tampão de redox pode ulteriormente compreender outros componentes tais como sais, tampões de pH, etc., e o método da invenção pode ser conduzido em qualquer temperatura que seja adequada para a pro- teína em questão, por exemplo, uma temperatura na faixa de de -5°C a 50°C, tal como na faixa de de O°C a 37°C, naturalmente dependendo da es- tabilidade da proteína sob as dadas condições.

(B) Agente de redução de triarilfosfina

Como mencionado acima, a presente invenção também provê um método para redução seletiva de uma proteína engenheirada compreen- dendo pelo menos uma cisteína não nativa, por exemplo, um fator de coagu- lação ou uma proteína da família de tripsina de proteases de serina. A prote- ína em questão compreende uma ou mais porções de cisteína conjugada através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS- Cys), a(s) dita(s) porção/porções não estando envolvidas nas pontes S-S intramoleculares (Cys-S-S-Cys) quando a proteína está em sua forma ativa, o método compreendendo a etapa de permitir que a proteína conjugada com tiol de reaja com um agente de redução de triarilfosfina.

O termo "agente de redução de triarilfosfina" destina-se a signifi- car uma triarilfosfina opcionalmente substituída com um ou mais substituin- tes.

Os grupos arila do agente de redução de triarilfosfina são de pre- ferência selecionados de fenila, naftila, 1,2,3,4-tetraidronaftila, antracila, fe- nantracila, pirenila, benzopirenila, fluorenila e xantenila, em particular fenila, e em concretizações atualmente selecionadas, os grupos arila são de prefe- rência idênticos. Na concretização atualmente mais interessante, todos os três grupos arila são fenila. Exemplos de substituintes, que podem estar pre- sentes nos grupos arila, em particular grupos fenila, são tipicamente aqueles selecionados de ácido sulfônico, ácido carboxílico, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, e C1-6 alcóxi-C1-6 alquila, ou C3-6 alquileno (representando um anel com dois átomos de carbono de arila vizinhos) ou C2-6 alquilenoóxi (representando um anel com dois átomos de carbono de arila vizinhos) ou C1-4alquileno-óxi-C1-4 alquileno (representando um anel com dois átomos de carbono de arila vizi- nhos).

Nas concretizações atualmente de modo mais interessante, pelo menos uma arila (por exemplo, fenila) tem pelo menos um substituinte sele- cionado de ácido sulfônico e ácido carboxílico, em particular ácido sulfônico; tal substituinte de preferência sendo disposto na posição meta em realção à ligação átomo de fósforo.

De preferência, todos os três grupos arila têm um substituinte de ácido sulfônico, por exemplo, todos os três grupos arila têm um substituinte de ácido sulfônico e pelo menos um outro subbstituinte, em particular pelo menos um substituinte na posição para em realção à ligação átomo de fósfo- ro, em particular um substituinte de oxigênio nessa posição para.

Acredita-se atualmente que os grupos arila de agentes de redu- ção preferidos não tenham quaisquer substituintes na posição orto em real- ção à ligação átomo de fósforo.

O termo "C1-6 alquila" destina-se a incluir resíduos de hidrocar- bonetos saturados ramificados ou lineares que têm de 1-6 átomos de carbo- no. Exemplos particulares são metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, iso- butila, sec-butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, n-hexila, etc. Similarmente, o termo "C1-4 alquila" inclui resíduos de hidrocarbonetos saturados ramifica- dos ou lineares que têm 1-4 átomos de carbono. O termos "C1-6-alquileno", "C2-6-alquileno", etc. representam as birradicais que correspondem a "C1-6 alquila", "C2-6 alquila", respectivamente.

Agentes de redução de triarilfosfina adequados são aqueles ten- do um equilíbrio útil entre potencial de redução e impedimento estérico. A natureza química do agente de redução de triarilfosfina é ditada por sua ca- pacidade de clivar um dissulfeto misto de tiol de proteína de baixo peso mo- lecular (RS-Cys) enquanto preservação da integridade das ligações de dis- sulfeto nativo na proteína. Atualmente compostos muito interessantes são ácidos triarilfosfina trissulfônico, tal como ácido trifenilfosfina-3,3',3"- trissulfônico e seus análogos. Seus exemplos ilustrativos são agentes de redução de triarilfosfina selecionados de ácido trifenilfosfina-3,3',3"- trissulfônico e seus análogos, por exemplo, um daqueles selecionados dos compostos de 9-11 abaixo: <formula>formula see original document page 27</formula>

O agente de redução de triarilfosfina é de preferência usado em uma concentração de 0,001-100 mM, tais como de 0,01-50 mM ou de 0,1-25 mM.

Em uma concretização interessante, o agente de redução de triarilfosfina é imobilizado para dar um suporte sólido. Isso facilitará a sepa- ração fácil do agente de redução da proteína. Em geral, agente de redução de triarilfosfina, tais como compostos de 9-11, podem ser imobilizados por meios conhecidos pela pessoa versada na técnica, por exemplo, por introdu- ção de um grupo Iigador em um dos grupos arila. O reagente de triarilfosfina 12 é um exemplo de umuma variantee ligável de 1.

<formula>formula see original document page 27</formula>

A reação é tipicamente conduzida a uma temperatura na faixa de 0-40°C, tal como a temperatura ambiente, por um período de desde 5 segundos a vários dias, como o caso pode ser. A reação pode ser seguida por HPLC a fim de confirmar a conversão. O solvente é de preferência um tampão aquoso, opcionalmente incluindo co-solventes tal como DMSO ou DMF. O solvente pode também compreender sais, por exemplo, sais de cál- cio.

Conjugação

Uma finalidade importante dos métodos de redução seletiva descritos acima é para liberar um grupo cisteína que pode ser usados para a ligação (conjugação) de um grupo químico, por exemplo, uma porção de não polipeptídeo.

Portanto, em uma concretização importante, o método ulterior- mente compreende a etapa simultânea e/ou subseqüente da conjugação de pelo menos uma da(s) porção/porções de cisteína seletivamente reduzida (HS-Cys) com um grupo químico.

Seria entendido que a conjugação das pelo menos uma das por- ções de cisteína seletivamente reduzidoas com um grupo químico pode ser conduzida simultaneamente, isto é, por adição de um ou mais reagentes que levam à conjugação à mistura compreendendo o tampão de redox, ou em uma etapa subseqüente, por exemplo, depois da purificação e/ou isolamento da proteína seletivamente reduzida.

Em uma concretização, o grupo químico é um grupo prolonga- dor, isto é, um grupo que na conjugação à proteína (por exemplo, polipeptí- deo de Fator IX) aumenta a semi-vida de circulação da(o) dita(o) proteína ou polipeptídeo, quando em comparação com o polipeptídeo ou proteína não modificada. O princípio específico atrás do efeito prolongador pode ser cau- sado por tamanho aumentado, união de seqüências de peptídeos que po- dem ser reconhecidas por peptidases ou anticorpos, ou marcaramento de glicanos de tal modo que eles não reconheçam por receptores específicos de glicano presentes, por exemplo, no fígado ou nos macrófagos, prevenção ou diminuição de depuração. O efeito do grupo prolongador pode, por exem- pio, também ser levado por ligação a componentes de sangue tal como al- bumina ou adesão não específica a tecido vascular. A glicoproteína conju- gada substancialmente preservaria sua atividade biológica.

Em uma concretização da invenção o grupo prolongador é sele- cionado do grupo que consiste de:

(a) Um radical carregado orgânico de baixo peso molecular(15- 1.000 Da), que pode conter um ou mais ácidos carboxílicos, ácidos aminas sulfônicos, ácidos fosfônicos, ou sua combinação.

(b) Uma molécula hidrofílica neutra de baixo peso molecular (15- 1.000 Da), tal como ciclodextrina, ou uma cadeia de polietileno que pode opcionalmente ser ramificada.

(c) Uma molécula hidrofílica de baixo peso molecular (15-1.000 Da) tal como um ácido graxo ou ácido cólico ou seus derivados. (d) Polietilenoglicol com um peso molecular médio de 2.000- 60,000 Da.

(e) Um polímero de precisão bem definido tal como um dendrí- mero com uma massa molecular exata que varia de 700 a 20.000 Da1 ou mais de preferência entre 700-10.000 Da.

(f) Um polipeptídeo substancialmente não imunogênico tal como albumina ou um anticorpo ou parte de um anticorpo opcionalmente contendo um domínio de Fc.

(g) Um polímero orgânico de alto peso molecular tal como dex- trano.

Em uma outra concretização da invenção o grupo prolongador é selecionado do grupo que consiste de dendrímeros, oxido de polialquileno (PAO), incluindo polialquileno glicol (PAG), tais como polietileno glicol (PEG) e polipropileno glicol (PPG), PEGs ramificados, álcool polivinílico (PVA), po- licarboxilato, poli-vinilpirolidona, anidrido de ácido polietileno-co-maléico, a- nidrido de ácido poliestireno-co-maléico, e dextrano, incluindo carboximetil- dextrano. Em uma concretização da invenção particularmente interessante, o grupo prolongador é um grupo PEG.

O termo "polímero ramificado", ou intercambeavelmente "políme- ro dendrítico", "dendrímero" ou "estrutura dendrítica" significa um polímero orgânico montado a partir de uma seleção de blocos de construção de mo- nômero dos quais, alguns contêm ramificações.

Em uma concretização da invenção o grupo prolongador é um selecionado do grupo que consiste de ligantes de ligação de proteína de so- ro, tais como compostos que se ligam a albumina, como ácidos graxos, áci- do C5-C24 graxo, diácido alifático (por exemplo, C5-C24). Outros exemplos de grupos prolongadores incluem moléculas orgânicas pequenas contendo porções que sob condições fisiológicas alteram as propriedades de carga, tais como ácidos carboxílicos ou aminas, ou substituintes neutros que previ- nem reconhecimento específico de glicano tais como substituintes de alquila menores (por exemplo, C1-C5 alquila). Em uma concretização da invenção o grupo prolongador é uma albumina. Em uma concretização, o grupo químico é um não polipeptídeo.

Em uma concretização interessante, o grupo químico é um polie- tilenoglicol (PEG), em particular um tendo um peso molecular médio de na faixa de 500-100,000, tais como de 1.000-75.000, ou de 2.000-60.000.

Conjugação pode ser conduzida como revelada na WO 02/077218 A1 e na WO 01/58935 A2.

Particularmente interessante é o uso de PEG como um grupo químico para á conjugação com a proteína. O termo "polietileno glicol" ou "PEG" significa um composto de polietileno glicol ou um seu derivado, com ou sem agentes de acoplamento, porções de acoplamento ou de ativação (por exemplo, com tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirana, piridilditio, vinil sul- fona, ou de preferência com um porção de maleimida). Compostos tal como maleimido monometóxi PEG são exemplares de compostos de PEG ativa- dos da invenção.

PEG é um molécula de polímero adequada, uma vez que ela tem apenas poucos grupos reativos capazes de reticular em comparação com polissacarídeos tal como dextrano. Em particular, PEG monofuncional, por exemplo, metoxipolietileno glicol (mPEG), é de interesse uma vez que sua química de acoplamento é relativamente simples (apenas um grupo rea- tivo está disponível para a conjugação dos grupos de ligação no polipeptí- deo). Conseqüentemente, o risco de reticulação é eliminado, os conjugados de polipeptídeo resultantes são mais homogêneos e a reação das moléculas de polímero com o polipeptídeo é mais fácil de se controlar.

Para efetuar a ligação covalente das molécula(s) de polímero ao polipeptídeo, os grupos finais de hidroxila da molécula de polímero são pro- vidos em forma ativada, isto é, com grupos funcionais reativos. Moléculas de polímero ativadas adequadas estão comercialmente disponíveis, por exem- plo, da Shearwater Corp., Huntsville, Ala., USA, ou da PoIiMASC Pharma- ceuticals plc, UK. Alternativamente, as moléculas de polímero podem ser ativadas por métodos convencionais conhecidos na técnica, por exemplo, como revelados na WO 90/13540. Exemplos específicos de moléculas de polímero ramificadas ou lineares ativadas para o uso na presente invenção são descritas no Shearwater Corp. 1997 e catálogos 2000 (Polímeros bio- compatíveis funcionalizados para pesquisa e produtos farmacêuticos, Polieti- Ieno Glicol e derivados, incorporados aqui por referência). Exemplos especí- ficos de polímeros de PEG ativados incluem a seguir PEGs lineares: NHS- PEG (por exemplo, SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, e SCM-PEG), e NOR-PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO- PEG, e MAL-PEG, e PEGs ramificados tais como PEG2-NHS e aqueles re- velados na patente U.S. no. 5.932.462 e na patente U.S. no. 5.643.575, am- bas as quais são incorporadas aqui por referência. Além do mais, a seguir publicações, incorporadas aqui por referência, revelam moléculas de políme- ro úteis e/ou química de PEGilação chemistries: a patente U.S. no. 5.824.778, a patente U.S. no. 5.476.653, WO 97/32607, EP 229.108, EP 402.378, a patente U.S. no. 4,902.502, a patente U.S. no. 5.281.698, a pa- tente U.S. no. 5.122.614, a patente U.S. no. 5.219.564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, a patente U.S. no. 5.736.625, WO 98/05363, EP 809 996, a patente U.S. no. 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, a patente U.S. no. 5.473.034, a patente U.S. no. 5.516.673, EP 605 963, a patente U.S. no. 5.382.657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 e EP 154 316.

A conjugação do polipeptídeo e das moléculas de polímero ati- vadas é conduzida pelo uso de qualquer método convencional, por exemplo, as described in the a seguir referências (que também descrevem métodos adequados para a ativação de moléculas de polímero): R. F. Tailor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental e applications", Mareei Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugação e Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson e outros., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Técnicas", Academic Press, N.Y.). A pesssoa versada estará ciente que o método de ativação e/ou química de conjugação a serem usados de- penden do(s) grupos de ligação do polipeptídeo (cujos exemplos são dados ulteriormente acima), bem como os grupos funcionais do polímero (por e- xemplo, sendo amina, hidroxila, carboxila, aldeído, sulfidrila, succinimidila, maleimida, vinilsulfona ou haloacetato). A PEGilação pode dizer respeito a conjugação a todos os grupos de ligação disponíveis no polipeptídeo (isto é, tais grupos de ligação que são expostos na superfície do polipeptídeo) ou pode dizer respeito em relação a um ou mais grupos de ligação específicos, por exemplo, o grupo amino N-terminal (a patente U.S. no. 5.985.265). Além do mais, a conjugação pode ser alcançada em uma etapa ou de um modo por etapas (por exemplo, como descrita na WO 99/55377).

Será entendido que a PEGilação é projetada de modo a produzir a ótima molécula com relação ao número de moléculas de PEG ligadas, o tamanho e a forma de tais moléculas (por exemplo, se elas são lineares ou ramificadas), e onde no polipeptídeo tais moléculas estão ligadas. O peso molecular do polímero a ser usado será escolhido levando em consideração o efeito desejado a ser alcançado. Por exemplo, se a finalidade primária da conjugação é alcançar um conjugado tendo um alto peso molecular e tama- nho maior (por exemplo, para reduzir a depuração renal), pode-se escolher para conjugar ou uma ou algumas moléculas de polímero de alto peso mole- cular ou numerosas moléculas de polímero com um peso molecular mais baixo para se obter o efeito desejado. Em uma concretização, várias molécu- las de polímero com um peso molecular mais baixo são usadas. Esse é também o caso se um grau mais alto de união de epítopo for desejado. Em tais casos, de 2-8 polímeros com um peso molecular de, por exemplo, cerca de 5.000 Da, tais como de 3-6 tais polímeros, podem, por exemplo, ser usa- dos. Uma vez que os exemplos abaixo ilustram, pode ser vantajoso ter um número maior de moléculas de polímero com um peso molecular mais baixo (por exemplo, de 4-6 com um Mw de 5,000) em comparação com um núme- ro menor de moléculas de polímero com um peso molecular mais alto (por exemplo, de 1-3 com um MW de 12.000-20.000) em termos de aperfeiçoa- mento da semi-vida funcional in vivo do conjugado de polipeptídeo, even onde o pelo molecular total das moléculas de polímero ligadas nos dois ca- sos é igual ou similar. Acredita-se que a presença de número maior de mo- léculas de polímero menores provê o polipeptídeo com um diâmetro maior ou um tamanho evidente maior do que, por exemplo, uma única molécula de polímero ainda maior, pelo menos quando as moléculas de polímero são relativamente uniformemente distribuídas na superfície de polipeptídeo.

Verificou-se que ulteriormente resultados vantajosos são obtidos quando o tamanho evidente (também chamado do "peso molecular aparen- te" ou "massa aparente") de pelo menos uma porção principal do conjunga- do da invenção é pelo menos cerca de 50 kDa, tais como pelo menos cerca de 55 kDa, tais como pelo menos cerca de 60 kDa, por exemplo, pelo menos cerca de 66 kDa. Acredita-se que sejadevido ao fato de que a depuração renal clearance seja substancialmente eliminada para os conjugados tendo um tamanho aparente suficiente grande. No presente contexto, o "tamanho aparente" de um conjugado de proteína ou polipeptídeo de Fator IX é deter- minado pelo método de SDS-PAGE.

Além do mais, foi relatado que conjugação de polímero excessi- va pode levar a uma perda de atividade da proteína (por exemplo, polipeptí- deo de Fator IX) a qual o grupo químico (por exemplo, uma porção de não polipeptídeo) é conjugada (vide naus abaixo). Esse problema pode ser elimi- nado, por exemplo, por remoção dos grupos de ligação localizado no sítio funcional ou por bloqueamento do sítio funcional ante da conjugação de mo- do que o sítio funcional da proteína seja bloqueada durante conjugação. Es- pecificamente, a conjugação entre a proteína e o grupo químico (por exem- pio, porção de não polipeptídeo) pode ser conduzida sob condições onde o sítio funcional da proteína é bloqueado por uma molécula auxiliar, por exem- plo, um inibidor de protease de serina. De preferência, a molécula auxiliar é uma, que especificamente reconhece um sítio funcional da proteína, tal co- mo um receptor ou um inibidor de sítio ativo que se liga e assim protegendo a área em volta da tríade catalítica (de preferência definida como resíduo de aminoácidos dentro de 10 Á de qualquer átomo na tríade catalítica).

Alternativamente, a molécula auxiliar pode ser um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal que reconhece a proteína (por exemplo, polipeptídeo de Fator IX). Em particular, a molécula auxiliar pode ser um an- ticorpo monoclonal neutralizante.

A proteína é de preferência para interagir com a molécula auxili- ar antes de afetar a conjugação. (Freqüentemente é vantajoso usar a mes- ma molécula auxiliar (por exemplo, um inibidor) como aquela usada nas eta- pas onde dissulfetos mistos são reduzidos.) Isso assegura que o sítio fun- cional da proteína (por exemplo, polipeptídeo de Fator IX) é unido ou é pro- tegido e conseqüentemente não disponível para derivatização pelo grupo químico (por exemplo, porção de não polipeptídeo) tal como um polímero. A seguir sua eluição a partir da molécula auxiliar, o conjugado do grupo quí- mico e da proteína podem ser recuperados com pelo menos um sítio funcio- nal parcialmente preservado.

Formulações e adminsitração

Em um outro aspecto a presente invenção refere-se a uma for- mulação farmacêutica compreendendo um análogo de FIX em uma forma seca, para onde o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso. Por "forma seca" destina-se a composição ou formulação far- macêutica líquida é seca por congelamento (isto é, liofilização; vide, por e- xemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sei. Technol. 38:48-59), seca- gem por spray (vide Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific e Technical, Essez, U.K.), págs. 491-676; Broadhead e outros. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18:1169-1206; e Mumenthaler e ou- tros. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), ou secagem ao ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4:47-53).

Em um outro aspecto a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica compreendendo uma solução aquosa de um análogo de FIX e um tampão, em que o análogo de FIX está presente em uma concentração de 0,01 mg/ml ou acima, e em que a dita formulação tem um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.

Em uma outra concretização da invenção o tampão é seleciona- do do grupo que consiste de acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, diidrogênio phosphato de sódio, fosfato de hidrogênio de dissódio, fosfato de sódio e tris(hidroximetil)- aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou suas misturas. Cada um desse tampões específicos constitui uma concretização alternativa da invenção.

Em uma outra concretização da invenção a formulação ulterior- mente compreende um preservativo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra concretização da invenção o preservativo é selecionado do grupo que consiste de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, 2-fenoxietanol, butil p-hidroxibenzoato, 2-fenilethanol, álcool benzílico, clorobutanol, e tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imidu- réia, cloroexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, etil p- hidroxibenzoato, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano- 1,2-diol) ou suas misturas. Em uma outra concretização da invenção o pre- servativo está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma outra concretização da invenção o preservativo está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma outra concretização da in- venção o preservativo está presente em uma concentração de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma outra concretização da invenção o preservativo está presen- te em uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um desses preser- vativos específicos constitui uma concretização alternativa da invenção. O uso do preservativo em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa versada. Para a referência de conveniência is made to Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

Em uma outra concretização da invenção a formulação ulterior- mente compreende um agente isotônico. Em uma outra concretização da invenção o agente isotônico é selecionado do grupo que consiste de um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de acuar, um aminoáci- do (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lusina, isoleucina, ácido as- pártico, triptofano, treonina), umn alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propileneglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietile- noglicol (por exemplo, PEG400), ou suas misturas. Qualquer açúcar tais co- mo mono-, di-ou polissacarídeos, ou glucanos solúveis em água, incluindo por exemplo frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sa- carose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietila e carboximetilcelulose-Na podem ser usados. Em uma concretização o aditivo de açúcar é sacarose. Álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto de C4-C8 tendo pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Em uma concretização o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não há limite fixo para a quantidade usada, contanto que o açúcar ou álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não adversamente afeta os efeitos de solubilização alcançados usando-se os métodos da invenção. Em uma concretização, a concentração de açúcar ou álcool de açúcar está entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma outra concretização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 50 mg/ml. Em uma outra concretização da in- venção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma outra concretização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 8 mg/ml a 24 mg/ml. Em uma outra con- cretização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentra- ção de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um desses agentes isotônicos específi- cos constitui uma concretização alternativa da invenção. O uso de um agen- te isotônico em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa versada. Para a referência de conveniência é produzida por Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

Em uma outra concretização da invenção a formulação ulterior- mente compreende um agente de quelação. Em uma outra concretização da invenção o agente de quelação é selecionado de sais de ácido etilenodiami- natetraacético (EDTA), ácido cítrico, e ácido aspártico, e suas misturas. Em uma outra concretização da invenção o agente de quelação está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma outra concretização da invenção o agente de quelação está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 2mg/ml. Em uma outra concretização da invenção o agente de quelação está presente em uma concentração de 2 mg/ml a 5mg/ml. Cada um desses agentes de quelação específicos constitui uma concretização alternativa da invenção. O uso de um agente de quelação em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa versada. Para a referência de conveniência é produzida por Remington: The Science e Practice of Phar- macy, 19th edition, 1995.

Em uma outra concretização da invenção a formulação further compreende um estabilizador. O uso de um estabilizador em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa versada. Para a referência de conveniência é produzida por Remington: The Science e Practice of Phar- macy, 19th edition, 1995.

As composições farmacêuticas da invenção podem ulteriormente compreender uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir formação de agregrado pelo polipeptídeo durante a armazenagem da composição. Por "base de aminoácido" destina-se a um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer dado aminoácido está pre- sente ou em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Onde uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidos podem estar presentes em suas formas de base livre, todos podem estar presentes em suas formas de sal, ou alguns podem estar presentes em suas formas de base livre enquanto outros estão presentes em suas formas de sal. Em uma concretização, aminoácidos para usar na preparação das composições da invenção são aqueles que portam uma cadeia lateral carregada, tais como arginina, lisina, ácido aspártico, e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (isto é, isômero de L, D, ou DL) de um aminoácido particular (por exemplo, glicina, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspár- tico, triptofano, treonina e suas misturas) ou combinações desses estereoi- sômeros, podem estar presentes nas composições farmacêuticas da inven- ção contanto que o aminoácido particular esteja presente ou em sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma concretização o L- estereoisômero é usado. Composições da invenção podem também ser for- mulados com análogos desses aminoácidos. Por "análogo de aminoácido " destina-se a um derivado do aminoácido de ocorrência natural que traz cer- ca do efeito desejado de formação de agregado decrescente pelo polipeptí- deo durante a armazenagem das composições farmacêuticas líquidas da invenção. Análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, amino- guanidina, ornitina e N-monoetil L-arginina, análogos de metionina adequa- dos incluem etionina e butionina e análogos de cisteína adequados incluem S-metil-L cisteína. Como com os outros aminoácidos, os análogos de ami- noácido são incorporados nas composições ou em sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma outra concretização da invenção os aminoáci- dos ou análogos de aminoácido são usados em uma concentração, que é suficiente para prevenir ou retardar a agregação da proteína.

Em uma outra concretização da invenção metionina (ou outros análogos de aminoácido ou aminoácidos sulfúricos) pode ser adicionada para inibir oxidação de resíduos de metionina em sulfóxido de metionina quando o polipeptídeo que age como o agente terapêutico é um polipeptídeo compreendendo pelo menos um resíduo de metionina suscetível a tal oxida- ção. Por "inibir" destina-se um acúmulo mtnlmo~de~espécie oxidada por me- tionina durante um tempo. Inibição de oxidação de metionina resulta em re- tenção maior do polipeptídeo em sua forma molecular adequada. Qualquer estereoisômero de metionina (isômero L, D, ou DL) ou suas combinações podem ser usadas. A quantidade a ser adicionada seria uma quantidade su- ficiente para inibir oxidação dos resíduos de metionina tal que a quantidade de sulfóxido de metionina é aceitável para agências reguladoras. Tipicamen- te, isso significa que a composição contém não mais do que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Em geral, isso pode ser alcançado por adição de metionina tal que a razão de metionina adicionada para resí- duos de metionina varia de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, tais como 10:1 a cerca de 100:1.

Em uma outra concretização da invenção a formulação ulterior- mente compreende um estabilizador selecionado do grupo de polímeros de alto peso molecular ou compostos de baixo peso molecular. Em uma outra concretização da invenção o estabilizador é selecionado de polietileno glicol (por exemplo, PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, car- bóxi-/hidroxicelulose ou seus derivados (por exemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias contendo enxofre como monotioglice- rol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol, e sais diferentes (por exemplo, clore- to de sódio). Cada um desses estabilizadores específicos constitui uma con- cretização alternativa da invenção.

As composições farmacêuticas podem também compreender agentes de estabilização adicionais, que ulteriormente aumentam estabilida- de de um polipeptídeo terapeuticamente ativo ali. Agentes de estabilização de interesse particular para a presente invenção incluem, mas não são limi- tados a, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra oxidação de metionina, e um tensoativo não iônico, que protege o polipeptídeo contra agregação associada a descongelamento na geladeira ou cisalhamento me- cânico.

Em uma outra concretização da invenção a formulação compre- ende um tensoativo. O tensoativo pode ser um detergente, óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicolisados, monoglicerídeos acetilados, ésteres de ácido graxo de sorbitano, polímeros por blocos de polioxipropileno- polioxietileno (por exemplo, poloxâmeros tal como Pluronic® F68, poloxâme- ro 188 e 407, Triton X-100 ), ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbi- tan, derivados de polioxietileno e de polietileno tais como derivados alquila- dos e alcoxilados (tweens, por exemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij-35), monoglicerídeos ou seus derivados etoxilados, diglicerídeos ou seus derivados de polioxietileno, álcoois, glicerol, Iectinas e fosfolipídios (eg. fos- fatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol, difosfa- tidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipídios (por exemplo, ácido dipalmitoil fofatídico) e lisofosfolipídios (por exemplo, palmitoil lisofosfatidil-L- serina e ésteres de 1 -acil -sn-glicero-3-fosfato de ethanolamina, colina, serina ou treonina) e alquila, alcoxila (éster de alquila), alcóxi (éter de alquila)- deri- vados de Iisofosfatidila e fosfatidilcolinas, por exemplo, derivados de lauroíla e miristoíla de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo de topo polar, isto é, colinas, etanolaminas, ácido fofatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, e o DODAC positivamente carregado, DOTMA, DCP, BISHOP, Iisofosfatidilserina e lisofosfatidilthreonina, e glicerofosfolipí- dios (por exemplo, cefalinas), gliceroglicolipídios (por exemplo, galactopiran- sóide), esfingoglicolipídios (por exemplo, ceramidas, gangliosódeos), dode- cilfosfocolina, Iisolecitina de ovo de galinha, derivados de ácido fusídico- (por exemplo, tauro-diidrofusidato de sódio etc.), ácidos graxos de cadeia longa e seus sais de C6-C12 (por exemplo, ácido oléico e ácido caprílico), acilcarni- tinas e derivados, derivados de Iisina ND-acilados, arginina ou histidina, ou derivados acilados de cadeia lateral de Iisina ou arginina, derivados de di- peptídeos ND-acilados compreendendo qualquer combinação de lisina, argi- nina ou histidina e um aminoácido ácido ou neutro, derivado de ND-acilado de um tripeptídeo compreendendo qualquer combinação de um aminoácido neutro e dois aminoácido carregados, DSS (docusato sódico, CAS registro no [577-11-7]), docusato cálcico, CAS registro no [128-49-4]), docusato po- tássico, CAS registro no [7491-09-0]), SDS (sulfato de dodecila de sódio ou sulfato de Iaurila de sódio, caprilato de sódio, ácido cólico ou seus derivados, ácidos biliares e seus sais e conjugados de taurina e glicina, ácido ursode- soxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, gli- cocolato de sódio, N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato, tensoativos monovalentes (alquil-aril-sulfonatos) aniônicos, tensoativos zwi- teriônicos (por exemplo, N-alquila-N,N-dimetilamônio-1-propanossulfonatos, 3-colamido-1 -propildimetilamônio-1 -propanossulfonato, tensoativos catiôni- cos (bases de amônio quaternário) (por exemplo, brometo de cetil- trimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio), tensoativos não tônicos (por exem- plo, Dodecil beta-D-glucopironosídeo), poloxaminas (por exemplo, Tetro- nic's), que são copolímeros por blocos tetrafuncionais derivados da adição seqüencial de óxido de propileno e óxido de etileno a etilenodiamina, ou o tensoativo pode ser selecionado do grupo de derivados de imidazolina, ou suas misturas. Cada um desses tensoativos específicos constitui uma con- cretização alternativa da invenção.

O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa versada. Para a referência de conveniência is made to Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995. É possível que outros ingredientes podem estar presentes na formulação farmacêutica da presente invenção. Tais ingredientes adicionais incluem a- gentes de umectação, emulsificadores, antioxidantes, agentes de aumento de volume, modificadores de tonicidade, agentes de quelação, íons de me- tal, veículo oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina de soro de ser humano, gelatina ou proteínas) e um zwiterion (por exemplo, um aminoácido tais como betaína, taurina, arginina, glicina, Iisina e histidina). Tais ingredien- tes adicionais, naturalmente, não deveriam adversamente afetar a estabili- dade global da formulação farmacêutica da presente invenção.

Administração parenteral pode ser realizada por injeção subcu- tânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma serin- ga, opcionalmente sering de tipo caneta. Alternativamente, administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma outra opção é uma composição que pode ser uma solução ou uma suspensão pa- ra a administração do composto de FIX na forma de um spray nasal ou pul- monar. Como ainda outra opção, as composições farmacêuticas contendo o composto de FIX da invenção podem ser adaptadas para a administração transdérmicas, por exemplo, por injeção livre de agulha ou de um adminis- tração de emplastro, opcionalmente implastro iontoforético, ou transmucosal, por exemplo, buccal. Definições

"Fator IX" ou "FIX" como usado aqui refere-se a uma glicoproteí- na de Fator IX no plasma de ser humano que é um membro da trajetória de coagulação intrínsica e é essencial para a coagulação de sangue. Deve ser entendido que essa definição inclui formas nativas bem como recombinantes dessa glicoproteínas de Fator IX no plasma de ser humano. A não ser que de outra maneira especificada ou indicada, como usado aqui fator IX signifi- ca qualquer molécula de proteína de fator IX de ser humano funcional em seu papel normal na coagulação, incluindo qualquer fragmento, análogo e seu derivados. "FIX Nativo" é a molécula de FIX humano de comprimento total como mostrada em SEQ ID NO:1. A numeração da posição de resíduo de aminoácido está de acordo com SEQ ID NO: 1 onde o primeiro resíduo de aminoácido N-terminal é número 1 e assim por diante.

Os termos "análogo" ou "análogos", como usados aqui, destina- se à designar Fator FIX tendo a seqüência de SEQ ID NO: 1, em que um ou mais aminoácidos da proteína de origem foram substituídos por um outro aminoácido e/ou em que um ou mais aminoácidos da proteína de origem foram deletados e/ou em que um ou mais aminoácidos foram inseridos na proteína e/ou em que um ou mais aminoácidos foram adicionados à proteína de origem. Tal adição pode ocorrer ou na extremidade N-terminal ou na ex- tremidade C-terminal da proteína de origem ou ambas. O "análogo" ou "aná- logos" dentro dessa definição ainda têm aditividade de FIX em sua forma ativada. Em uma concretização uma variante é 70% idêntica com a seqüên- cia de SEQ ID NO: 1. Em uma concretização uma variante é 80% idêntica com a seqüência de of SEQ ID NO: 1. Em uma outra concretização uma va- riante é 90% idêntica com a seqüência de SEQ ID NO: 1. Em uma outra concretização uma variante é 95% idêntica com a seqüência de SEQ ID NO: 1. Como usado aqui qualquer referência a posições específicas refere-se à posição correspondente na SEQ ID NO: 1.

A não ser que de outra maneira especificada, domínio de fator IX incluem a seguir resíduo de aminoácidos: domínio de Gla estando a região de resíduo Tyrl para resíduo Lys43; EGF1 estando a região de resíduo Gln44 a resíduo Leu84; EGF2 estando a região de resíduo Asp85 para resí- duo Arg145; o peptídeo de ativação estando a região de resíduo Ala146 para resíduo Arg180; e o domínio de protease estando a região de resíduo Val181 para Thr414. A cadeia leve refere-se à região que inclui o domínio de Gla, EGF1 e EGF2, enquanto a cadeia pesada refere-se ao domínio de pro- tease.

"Semi-vida de FIX" refere-se à semi-vida de fator IX na circula- ção sangüínea, como determinada em animais tais como camundongos ou em ser humano, como determinada por farmacocinética por procedimentos padrão conhecidos por pessoas versadas na técnica.

"Atividade de FIX" ou "atividade biológica de FIX" é definida co- mo a capacidade de funcionar nas cascata de coagulação, induz a formação de FXa via interação com FVIIIa em uma plaqueta ativada, e suporta a for- mação de um coágulo de sangue. A atividade pode ser avaliada in vitro por técnicas tal como análise de coágulo, como descrito, por exemplo, no Mc- Carthi e outros Thromb Haemost. maio de 2002; 87(5):824-30, e outras téc- nicas conhecidas por pessoas versadas na técnica.

"FIX prolongado" significa um composto de FIX que circula em um paciente por um período de tempo prolongado a seguir administração quando em comparação com o FIX humano nativo.

O termo "resíduo de amino inserido" destina-se à incluir tanto uma substituição de um resíduo de aminoácido natural com um outro resí- duo de aminoácido, que não é normalmente encontrado naquela posição da molécula nativa de fIX, quanto uma adição de um resíduo de aminoácido à molécula de FIX humana nativa. A adição de um resíduo de aminoácido po- de ser ou entre dois resíduos de aminoácidos existentes ou na extremidade N- ou C-terminal da molécula de fiX nativa.

O termo "FIX PEGilado" significa FIX tendo uma molécula de PEG conjugada à molécula de FIX. O termo "FIX cisteína-PEGilada" significa FIX tendo uma molécula de PEG conjugada a um grupo sulfidrila de uma cisteína introduzida na molécula de FIX.

A terminologia para as substituições de aminoácido usadas é como se segue. A primeira letra representa o resíduo de aminoácido natu- ralmente presente em uma posição de FVIII de ser humano. A seguir o nú- mero representa a posição em FIX de ser humano. A segunda letra repre- senta o aminoácido diferente que usa como substituição do (resposição) a- minoácido natural. Um exemplo é E162C, onde uma Iisina na posição 162 de FIX de ser humano é substituída por uma cisteína.

No presente contexto as indicações de três letras ou de uma le- tra dos aminoácidos foram usadas em seu mio convencional como indicado na tabela 2. A não ser que expliciddamente indicado, os aminoácidos men- cionados aqui são L-aminoácidos. Além disso, as extremidade a esquerda e a direita de uma seqüência de aminoácidos de um peptídeo are, respectiva- mente, os N- e C-terminais de outra maneira especificados.

Tabela 2: Abreviações para aminoácidos:

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O termo "forma conjugada por tiol de baixo peso molecular (RS- Cys)" e termos similares destinam-se a significar que um grupo tiol de uma cisteína da proteína em questão é conjugada com um composto tendo um grupo tiol, em que o dito composto tem um peso molecular de menos do que 500 Da. Exemplos de tais compostos são glutationa, gama-glutamilcisteína, cisteinilglicina, cisteína, N-acetilcisteína, ciesteamina, etc.

O termo "forma ativa" refere-se à forma (ou formas) de uma pro- teína em que é capaz de realizar uma ação desejada, por exemplo, como um catalisador (enzima), zimogênio, ou como um co-fator, etc. A "forma ati- va" é algumas vezes chamada da "forma corretamente dobrada".

A proteína é em geral um polipeptídeo "engenheirado" que em comparação com uma proteína nativa inclui pelo menos uma cisteína não nativa. Tais polipeptídeos "engenheiradas" são de preferência preparados por técnicas recombinantes como estarão evidentes por técnicas recombi- nantes para a pessoa versada na técnica; vide também WO 02/077218 A1 e Jl 5 WO 01/58935 A2.

Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de paten- tes, e patentes são aqui incorporados por referência em sua totalidade e na medida que se cada referência seja individualmente e especificamente indi- cada ser incorporada por referência e fosse indicada em sua totalidade aqui (na medida máxima permitida pela lei).

Todos os títulos e sub-títulos são usados aqui para conveniência apenas e não seriam interpretados como Iimitantes da invenção de maneira alguma.

O uso de quaisquer e todos os exemplo, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tais como") provido aqui, destina-se à meramente melhor ilu- minar a invenção e não possui uma limitação no escopo da invenção a não ser que de outra maneira reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório se- ria interpretado como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção.

Para citação e incorporação dos documentos de patente aqui são feitos para conveniência apenas e não refletem qualquer ponto de vista da validade, patentabilidade e/ou executabilidade de tais documentos de patente.

Essa invenção inclui todas as modificações e equivalentes do objeto relatado nas reivindicações anexas à mesma uma vez que permitida pela lei aplicável.

Concretizações da invenção:

1. Análogo de FIX com uma semi-vida circulatória prolongada, em que pelo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415 é usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

2. Análogo de FIX de acordo com a concretização 1, em que pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80 ou 84 é usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

3. Análogo de FIX de acordo com a concretização 1, em que pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141 ou 142, é usado como substituto de um resíduo de ami- noácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

4. Análogo de FIX de acordo com a concretização 1, em que pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415, é usado como substituto de um resíduo de aminoáci- do de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso mole- cular do polipeptídeo de FIX 5. Análogo de FIX de acordo com a concretização 1, em que pelo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 146-180, é usado como substitu- to de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo quími- co que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

6. Análogo de FIX de acordo com a concretização 1, em que pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais selecionado das posições 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 167, 168,169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176 177, é usado como substituto de um resíduo de aminoá- cido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso mo- Iecular do polipeptídeo de FIX.

7. Análogo de FIX de acordo com a concretização 1, em que pe- lo menos um dos resíduos de amino naturais selecionados de positions 160, 161, 162, 163, 164, 165 e 166, é usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

8. Análogo de FIX de acordo com a concretização 7, em que re- síduo de aminoácido E162 é usado como substituto de um resíduo de ami- noácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

9. Análogo de FIX com uma semi-vida circulatória prolongada, em que pelo menos um resíduo de cisteína está anexado ao C-terminal T415, a dita cisteína sendo conjugada com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

10. Análogo de FIX de acordo com qualquer uma das concreti- zações anteriores, em que o grupo químico é selecionado de polietileno gli- cóis (PEG).

11. Análogo de FIX de acordo com a concretização 10, em que o polietilenoglicol tem um peso molecular médio de na faixa de 500-100.000, tais como 1000-75.000, ou 2.000-60.000.

12. Análogo de FIX de acordo com qualquer uma das concreti- zações anteriores, em que o análogo tem uma semi-vida circulatória de pelo menos 1,5 vezes que de FIX de tipo selvagem. 13. Análogo de FIX de acordo com qualquer uma das concreti- zações anteriores, em que o análogo, quando medido em um ensaio de co- agulação, tem uma atividade biológica de pelo menos 20% de FIX de tipo selvagem.

14. Um método para preparação de um análogo de FIX de acor- do com qualquer uma das concretizações anteriores, compreendendo as etapas de a) redução seletiva de um polipeptídeo de FIX engenheirado com- preendendo pelo menos uma cisteína não nativa em uma posição selecio- nada do grupo da posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415, conjugada através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-CYS), por permissão de que o FIX conju- gado com tiol de baixo peso molecular reaja com uma mistura compreen- dendo um tampão de redox e b) uma etapa simultânea ou subseqüente de conjugação de pelo menos uma das porções de cisteína seletivamente redu- zidas (HS-Cys) com um grupo químico.

15 . Um método de acordo com a concretização 14, em que o tampão de redox compreende a uma mistura compreendendo glutationa re- duzida ou oxidada e a glutaredoxina.

16. Um método para preparação de um análogo de FIX de acor- do com qualquer uma das concretizações de 1-13, compreendendo as eta- pas de a) redução seletiva de um polipeptídeo de FIX engenheirado com- preendendo pelo menos uma cisteína não nativa em uma posição selecio- nada do grupo da posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415, conjugada através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-CYS), por permissão de que o FIX conju- gado com tiol de baixo peso molecular reaja com uma mistura compreen- dendo um composto de ácido triarilfosfina-3,3',3"-trissulfônico e b) uma eta- pa simultânea ou subseqüente de conjugação de pelo menos uma das por- ções de cisteína seletivamente reduzidas (HS-Cys) com um grupo químico.

17. Um método de acordo com as concretizações de 14-16, em que o grupo químico é selecionado de polietileno glicóis (PEG).

18. O método de acordo com a concretização 17, em que o gru- po químico é um polietilenoglicol, em particular um tendo um peso molecular médio de na faixa de 500-100.000, tais como 1000-75.000, ou 2,000-60.000.

19. Uma formulação farmacêutica para o tratamento de um paci- ente com hemofilia compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo de FIX de acordo com as concretizações de 1-13, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

20. Um método de tratamento de um paciente com hemofilia compreendendo administração ao paciente uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de um análogo de FIX de acordo com qualquer uma das concreti- zações de 1-13, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Um método de acordo com a concretização 20, em que o tratamento compreende pelo menos um tratamento uma vez por semana.

22. Um método de acordo com a concretização 21, em que o tratamento compreende apenas o tratamento uma vez por semana.

Exemplos

A terminologia para as sustituições de aminoácido usadas nos seguintes exemplos é como se segue. A primeira letra representa o aminoá- cido naturalmente presente em uma posição de SEQ ID NO: 1. A seguir o número representa a posição em SEQ ID NO: 1. A segunda letra representa o aminoácido diferente usando como substituto do aminoácido natural. Um exemplo é o fator IX E162C, onde um ácido glutâmico na posição 162 de SEQ ID No: 1 é substituído por uma cisteína.

Materiais -GIutationa reduzida ou oxidada (GSH e GSSG, res- pectivamente) foram adquiridas da Sigma. PEG5k-maleimida (2E2M0H01), PEG20k-maleimida (2E2M0P01), PEG40k-maleimida (2D3Y0T01) foram adquiridas da Nektar Therapeutics (Huntsville, AL). Todos os outros produtos químicas eram de grau analítico ou melhor.

Determinação de concentração - A concentração de GSSG na solução de estoque foi determinada a partir de sua absorção a 248 nm u- sando-se um coeficiente de extinção de 381 M"1cm"1 (Chau e Nelson, 1991).

A concentração de GSH foi determinada usando-se i reagente de Ellman's (5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico)) e 14150 M"1cm"1 como o coeficiente de extinção molar de ácido 2-nitro-5-tiobenzóico a 412 nm (Riddles e outros., 1979).

Clonagem e expressão de glutaredoxinas - A seqüência de codi- ficação de DNA para glutaredoxina 2 de Escherichia coli (Grx2) foi ampliada por PCR usando-se sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche Diagnos- tics Corporation, Indianapolis, IN) de acordo com as recomendações do fa- bricante e introdução de par iniciador oHOJ98-f/oHOJ98 que flanqueia sítios de restrição de Ndel e Xhol (seqüências iniciadoras são listadas na Tabela 1). DNA de modelo genômico para a reação de PCR foi preparado a partir de E. coli de acordo com o procedimento publicado (Grimberg e outros., 1989). O produto de PCR purificado foi cortado com Ndel e Xhol e então foi ligado nos sítios correspondentes de pET-24a(+) (Novagen) para dar pHOJ294. Uma vez que um códon de parada foi provida pelo vetor, o gene foi equipado com uma extensão derivada de vetor 3' que codifica uma eti- queta de afinidade de LEHHHHHH C-terminal. A identidade correta da se- qüência clonada foi verificada por seqüenciação de DNA.

Para a expressão, o plasmídio 294 foi introduzido para dentro das células de BL21(DE3) competentes (Stratagene, La Jolla, CA). Trans- formantes de um dia para o outro frescos foram inoculados em 50 ml de cal- do terrífico ((Sambrook e outros., 1989)) e 30 pg/ml de canamicina em um OD6OO inicial de 0,02. Culturas foram desenvolvidas a 37°C em frascos pro- vidos de defletor a 230 rpm para a fase logarítma do meio (OD6OO 3-4) tem- po esse em que a temperatura foi diminuída para 25°C e expressão de pro- teína induzida por isopropil-p-D-tiogalactopironosídeo a 0,1 mM (ITPG). De- pois da expressão de um dia para o outro, células foram coletadas por cen- trifugação, foram ressuspensas e 50 ml de tampão de Iise (fosfato de potás- sio a 50 mM, NaCI a 300 mM, pH 8,0), e foram Iisadas por três ciclos de congelamento-descongelamento. O Iisado clareado foi carregado sobre uma coluna de 20 ml de Ni-NTA Superflow (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) foi equilibrado com tampão de Iise a uma taxa de fluxo de 5 ml/min. Depois da lavagem com tampão lise, proteína ligada foi eluída com um gradiente de linear de imidazol a 0-200 mM no tampão de lise. Frações de pico foram combinadas, foram tratadas com ditiotreitol a 20mM por 20 min antes da dia- lise extensiva contra Tris-HCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, pH 8,0. A proteína foi armazenada a -80°C e foi avaliada ter >90% de pureza por SDS-PAGE. Concentração foi estimada por absorbância a 280 nm usando-se coeficien- tes de extinção de 21740 M"1cm"1.

Construção de DNA que codifica de fator IX e mutantes de fator IX E162C e J5 fator IX416C-

Plasmídios pHOJ338 e pHOJ358 que codificam fator IX E162C e fator IX 416C, respectivamente, foram construídos por mutagênese de sítio- dirigido QuickChange® usando-se pares de iniciador de oHOJ137- f/oHOJ137-r e oHOJ155-f/oHOJ155-r (vide Tabela 1) como modelo de acor- 20 do com as instruções do fabricante (Stratagene, La Jolla, CA). A identidade correta de todas as seqüências clonadas foi verificada por seqüenciação de DNA.

Purificação de fator IX e variantes - Fator IX e variantes são pu- rificados como descritos emn Arruda e outros. (2001) Blood, 97, 130-138, 25 com a exceção de que frações contendo fator IX (Cys variantes) são combi- nados, são dialisados contra HEPES a 50 mM, NaCI a 100 mM, CaCI2 a 10 mM, pH 7,0 e são armazenados a -80°C.

Modificação de variantes de FIX Cys com PEG-maleimida - Re- dução seletiva é realizada por incubação de 4,8 mg de variante de FIX Cys a 30 30°C por 5 horas em um volume total de 4,4 ml de HEPES a 50 mM, NaCI a 100 mM, CaCI2 a 10 mM, pH 7,0 tampão contendo GSH a 0,5 mM, GSSG a 20 μΜ, e Grx2 a 10 μΜ. Subseqüentemente, geraram tióis livres são seleti- vãmente modificados por adição de PEG5k-maleimida, PEG20k-maleimida, ou PEG40k-maleimida (dissolvidos em água) para dar uma concentração final de 0,8 mM. Alquilação de tiol é deixado que prossiga por 15 min a tem- peratura ambiente no resfiamento brusco com cisteína a 0,5 mM. EDTA é adicionado em excesso de cálcio (concentração final de 20 mM) e o conteú- do total carregado sobre uma coluna de 1 ml de HiTrap Q FF (Amersham Biosciences, GE Healthcare) equilibrado com tampão A (HEPES a 50 mM, NaCl a 100 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,0) para capturar variante de FIX Cys. Depois da lavagem com tampão A, eluição de uma etapa da proteína ligada é realizada com tampão B (GIyGIy a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCI2 a 10 mM, 0,01% de Tween 80, pH 7,0) diretamente sobre uma coluna de HiLoad Superdex 200 16/60 pg (Amersham Biosciences) montada em frente da co- luna de HiTrap. Espécies PEGiIadas e não PEGiIadas são separadas a uma taxa de fluxo de 1 ml/min e são detectadas por absorção a 280 nm. O pico contendo variante de FIX Cys PEGiIado é coletado e é armazenado a -80°C.

Tabela 1

Oligos de DNA usados para a construção de plasmídios.

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Referências

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<110> NOVO NORDISK A/S

<120> PROLONGED FACTOR IX ANALOGUES AND DERIVATIVES <130> 7387.204-W0

<160> 1

<170> PATENTIN VERSION 3.3

<210> 1

<211> 415

<212> PRT

<213> HOMO SAPIENS <220>

<221> THE THREE-LETTER INDICATION "XAA" MEANS 4-CARBOXYGLUTAMIC ACID

(GAMMA-CARBOXYGLUTAMATE)

<222> (1)..(415)

<400> 1

TYR ASN SER GLY LYS LEU XAA XAA PHE VAL GLN GLY ASN LEU XAA ARG 1 5 10 15

XAA CYS MET XAA XAA LYS CYS SER PHE XAA XAA ALA ARG XAA VAL PHE 20 25 30

XAA ASN THR XAA ARG THR THR XAA PHE TRP LYS GLN TYR VAL ASP GLY 35 40 45

ASP GLN CYS GLU SER ASN PRO CYS LEU ASN GLY GLY SER CYS LYS ASP

50 55 60

ASP ILE ASN SER TYR GLU CYS TRP CYS PRO PHE GLY PHE GLU GLY LYS

65 70 75 80

ASN CYS GLU LEU ASP VAL THR CYS ASN ILE LYS ASN GLY ARG CYS GLU

85 90 95

GLN PHE CYS LYS ASN SER ALA ASP ASN LYS VAL VAL CYS SER CYS THR

100 105 110

GLU GLY TYR ARG LEU ALA GLU ASN GLN LYS SER CYS GLU PRO ALA VAL

115 120 125 PRO PHE PRO CYS GLY ARG VAL SER VAL SER GLN THR SER LYS LEU THR 130 135 140

ARG ALA GLU THR VAL PHE PRO ASP VAL ASP TYR VAL ASN SER THR GLU 145 150 155 160

ALA GLU THR ILE LEU ASP ASN ILE THR GLN SER THR GLN SER PHE ASN

165 170 175

ASP PHE THR ARG VAL VAL GLY GLY GLU ASP ALA LYS PRO GLY GLN PHE

180 185 190

PRO TRP GLN VAL VAL LEU ASN GLY LYS VAL ASP ALA PHE CYS GLY GLY

195 200 205

SER ILE VAL ASN GLU LYS TRP ILE VAL THR ALA ALA HIS CYS VAL GLU

210 215 220

THR GLY VAL LYS ILE THR VAL VAL ALA GLY GLU HIS ASN ILE GLU GLU 225 230 235 240

THR GLU HIS THR GLU GLN LYS ARG ASN VAL ILE ARG ILE ILE PRO HIS

245 250 255

HIS ASN TYR ASN ALA ALA ILE ASN LYS TYR ASN HIS ASP ILE ALA LEU

260 265 270

LEU GLU LEU ASP GLU PRO LEU VAL LEU ASN SER TYR VAL THR PRO ILE

275 280 285

CYS ILE ALA ASP LYS GLU TYR THR ASN ILE PHE LEU LYS PHE GLY SER

290 295 300

GLY TYR VAL SER GLY TRP GLY ARG VAL PHE HIS LYS GLY ARG SER ALA 305 310 315 320

LEU VAL LEU GLN TYR LEU ARG VAL PRO LEU VAL ASP ARG ALA THR CYS

325 330 335

LEU ARG SER THR LYS PHE THR ILE TYR ASN ASN MET PHE CYS ALA GLY

340 345 350

PHE HIS GLU GLY GLY ARG ASP SER CYS GLN GLY ASP SER GLY GLY PRO

355 360 365

HIS VAL THR GLU VAL GLU GLY THR SER PHE LEU THR GLY ILE ILE SER

370 375 380

TRP GLY GLU GLU CYS ALA MET LYS GLY LYS TYR GLY ILE TYR THR LYS 385 390 395 400

VAL SER ARG TYR VAL ASN TRP ILE LYS GLU LYS THR LYS LEU THR 405 410 415

Claims

1. Análogo de FIX com uma semi-vida circulatória prolongada, em que pelo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 44, 46, -47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, 91, 94, 100, 101, -102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, 125, 129, 138, -140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, 224, 225, 228, -239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, 265, 277, 280, -314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 ou 415 é usado como substituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

2. Análogo de FIX de acordo com claim 1, em que pelo menos um dos resíduos de amino naturais na posição 146-180, é usado como subs- tituto de um resíduo de aminoácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

3. Análogo de FIX de acordo com a reivindicação 2, em que re- síduo de aminoácido E162 é usado como substituto de um resíduo de ami- noácido de cisteína conjugado com um grupo químico que aumenta o peso molecular do polipeptídeo de FIX.

4. Análogo de FIX de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que 0 grupo químico é selecionado de polietileno glicóis (PEG).

5. Análogo de FIX de acordo com a reivindicação 4, em que o polietilenoglicol tem um peso molecular médio de na faixa de 500-100,000, tais como 1000-75,000, ou 2,000-60,000.

6. Análogo de FIX de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que o análogo tem uma semi-vida circulatória de pelo menos 1,5 vezes que de FIX de tipo selvagem.

7. Análogo de FIX de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que o análogo, quando medido em um ensaio de coagu- lação, tem uma atividade biológica de pelo menos 20% de FIX de tipo selva- gem.

8. Um método para preparação de um análogo de FIX de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo as etapas de a) redução seletiva an polipeptídeo de FIX engenheirado compreendendo pelo menos uma cisteína não nativa em uma posição selecionada do grupo da posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, 89, 90, -91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, 121, 123, -125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, 202, 203, -224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, 262, 263, -265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, 410, 413 OU -415, conjugada através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-CYS), por permissão de que o FIX conjugado com tiol de bai- xo peso molecular reaja com uma mistura compreendendo um tampão de redox e b) uma etapa simultânea ou subseqüente de conjugação de pelo menos uma das porções de cisteína seletivamente reduzidas (HS-Cys) com um grupo químico.

9. Um método para preparação de um análogo de FIX de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-7, compreendendo as etapas de a) redução seletiva de um polipeptídeo de FIX engenheirado compreenden- do pelo menos uma cisteína não nativa em uma posição selecionada do grupo da posição 44, 46, 47, 50, 53, 57, 66, 67, 68, 70, 72, 74, 80, 84, 87, -89, 90, 91, 94, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 113, 116, 119, 120, -121, 123, 125, 129, 138, 140, 141, 142, 146-180, 185, 186, 188, 189, 201, -202, 203, 224, 225, 228, 239, 240, 241, 243, 247, 249, 252, 257, 260, 261, -262, 263, 265, 277, 280, 314, 316, 318, 321, 341, 372, 374, 391, 392, 406, -410, 413 ou 415, conjugada através de uma ponte de dissulfeto a um tiol de baixo peso molecular (RS-CYS), por permissão de que o FIX conjugado com tiol de baixo peso molecular reaja com uma mistura compreendendo um composto de ácido triarilfosfina-3,3',3"-trissulfônico e b) uma etapa simultâ- nea ou subseqüente de conjugação de pelo menos uma das porções de cis- teína seletivamente reduzidas (HS-Cys) com um grupo químico.

10. Um método de acordo com a reivindicaçãos 8-9, em que o grupo químico é selecionado de polietileno glicóis (PEG).

11.O método de acordo com a reivindicação 10, em que o grupo químico é um polietilenoglicol, em particular um tendo um peso molecular médio of na faixa de 500-100.000, tais como 1000-75.000, ou 2.000-60.000.

12. Uma formulação farmacêutica para o tratamento de um paci- ente com hemofilia compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogo de FIX de acordo com a reivindicação 1-7, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Um método de tratamento de um paciente com hemofilia compreendendo administração ao paciente uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de um análogo de FIX de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 -7, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Um método de acordo com a reivindicação 13, em que o tra- tamento compreende pelo menos um tratamento uma vez por semana.

15. Um método de acordo com a reivindicação 14, em que o tra- tamento compreende apenas o tratamento uma vez por semana.