BRPI0712222A2 - proteìnas de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatótico humano (hgf), ácido nucléico isolado, vetor de expressão, célula hospedeira e método de produzir uma proteìna de ligação - Google Patents

Abstract

PROTEìNA DE LIGAçãO ISOLADA QUE SE LIGA AO FATOR DE CRESCIMENTO DE HEPATOCITO HUMANO (HGF), áCI- DO NUCLéICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA E MéTODO DE PRODUZIR UMA PROTEìNA DE LIGAçãO. A presente invenção refere-se uma família de proteínas de ligação que se ligam e neutralizam a atividade do fator de crescimento de hepa- tócito (HGF), em particular, HGF humano. As proteínas de ligação podem ser usadas como agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Com relação a sua atividade terapêutica, as proteínas de ligação podem ser usadas para tratar certas desordens responsivas a HGF, por exemplo, certos tumores respon- sivos a HGF.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA DE LIGAÇÃO ISOLADA QUE SE LIGA AO FATOR DE CRESCIMENTO DE HEPATÓCITO HUMANO (HGF), ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA E MÉTODO DE PRODUZIR UMA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO".

PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido reivindica o benefício e prioridade dos Pedidos Pro- visórios U.S. Ngs 60/810.714, depositado em 2 de junho de 2006 e 60/860.509, depositado em 21 de novembro de 2006, cujas descrições estão incorporadas aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

O campo da invenção é de biologia molecular, imunologia e on- cologia. Mais particularmente, o campo é de proteínas Iigantes baseadas em anticorpo que se ligam ao fator de crescimento do hepatócito humano (HGF).

ANTECEDENTES

O Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF), também conheci- do como Fator de Dispersão (SF), é uma proteína heterodimérica multifun- cional produzida predominantemente por células mesenquimais e é um efe- tor de células que expressam o receptor Met de tirosina quinase (Bottaro et al. (1991) Science 251: 802-804, Rubin et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1155: 357-371). O receptor Met humano também é conhecido como "c-Met". HGF maduro contém duas cadeias de polipeptídeos, a cadeia α e a cadeia β. Estudos publicados sugerem que é a cadeia α que contem o domínio de ligação do receptor c-Met de HGF.

Quando se liga ao seu receptor cognato, HGF medeia várias atividades celulares. A via de sinalização HGF-Met desempenha um papel ga regeneração hepática, cicatrização de lesão, regeneração neural, angio- gênese e malignidades. Veja, por exemplo, Cao et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7443-7448, Burgess et al. (2006) Câncer Res. 66: 1721- 1729, e Patentes U.S. Nes 5.997.868 e 5.707.624. Pesquisadores têm de- senvolvo vários moduladores de HGF, incluindo anticorpos para tratar vá- rias desordens que envolvem atividade de HGF, por exemplo, certos cânce- res responsivos a HGF. Veja, por exemplo, Publicação de Pedido Interna- cional Nq WO 2005/017107.

A estrutura básica comum para todos os anticorpos é mostrada esquematicamente na Figura 1. Anticorpos são proteínas multiméricas que contêm quatro cadeias de polipeptídeos. Duas das cadeias de polipeptídeo são chamadas de cadeias pesadas ou H e duas das cadeias de polipeptí- deos são chamadas de cadeias leves ou L. As cadeias pesada e leve de imunoglobulina são conectadas por uma ligação de dissulfeto entre as ca- deias. As cadeias pesadas de imunoglobulina são conectadas por várias pontes de dissulfeto entre as cadeias. Uma cadeia leve é composta de uma região variável (VL na Figura 1) e uma região constante (Cl na Figura 1), en- quanto que a cadeia pesada é composta de uma região variável (Vh na Figu- ra 1) e pelo menos três regiões constantes (CHi, CH2 e CH3 na Figura 1). As regiões variáveis determinam a especificidade do anticorpo e as regiões constantes têm outras funções.

A informação estrutural e dos aminoácidos indica que cada regi- ão variável compreende três regiões hipervariáveis (também conhecidas como regiões de determinação de complementaridade ou CDRs) flanquea- das por quatro regiões de arcabouço relativamente conservadas ou FRs. As três CDRs, referidas como CDRi, CDR2, e CDR3, são responsáveis pela es- pecificidade de ligação de anticorpos individuais. Quando os anticorpos são para serem usados como agentes de diagnóstico e terapêuticos, tipicamente é desejável criar anticorpos que tem a maior especificidade de ligação e afi- nidade com a molécula alvo. Acredita-se que diferenças nas regiões variá- veis possam ter efeitos profundos sobre a especificidade e a afinidade do anticorpo.

Patente U.S. Nq 5.707.624 descreve o uso de anticorpos anti- HGF no tratamento do sarcoma de Kaposi. Similarmente, a Patente U.S. N- 5.997.868 descreve o tratamento de um tumor pela administração de um anticorpo anti-HGF ao paciente a ser tratado a fim de bloquear a habilidade de HGF endógeno de promover angiogênese no tumor. Mais recentemente, pesquisadores propuseram que anticorpos que se ligam a cadeia β de HGF podem ter potencial como agentes terapêuticos em pacientes com tumores dependentes de HGF (Burgess (2006) supra).

Apesar disso, ainda há uma necessidade de moduladores adi- cionais de HGF que possam ser usados como agente terapêutico e diagnós- tico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção é baseada, em parte, na descoberta de uma família de proteínas de ligação que se ligam especificamente a HGF, em particular, a HGF humano. As proteínas de ligação são baseadas em anticorpo à medi- da que elas contêm sítios de ligação de antígeno (isto é, HGF) baseados nas CDRs de uma família de anticorpos que se ligam especificamente a HGF. As proteínas de ligação podem ser usadas como agentes de diagnóstico e tera- pêuticos. Quando usadas como agente terapêutico, as proteínas de ligação são manipuladas (por exemplo, humanizadas) a fim de reduzir ou eliminar o risco de indução de resposta imune contra a proteína de ligação quando administrada ao receptor (por exemplo, um ser humano).

As proteínas de ligação neutralizam a atividade de HGF e, por- tanto, podem ser usadas como um agente terapêutico. Em certas modalida- des, as proteínas de ligação impedem que HGF se ligue ao seu receptor cognato, c-Met, neutralizando dessa forma a atividade de HGF. Em outras modalidades, as proteínas de ligação se ligam a HGF e neutralizam sua ati- vidade biológica, mas sem evitar que HGF se ligue ao receptor c-Met. Como HGF tem sido implicado no crescimento e proliferação de células cancero- sas, as proteínas de ligação podem ser usadas para inibir a proliferação de células cancerosas. Além disso, quando administradas a um mamífero, as proteínas de ligação podem inibir ou reduzir o crescimento do tumor no ma- mífero.

Esses e outros aspectos e vantagens da invenção se tornarão claros após a consideração das seguintes figuras, descrição detalhada e reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção pode ser mais completamente compreendida com referência as seguintes figuras.

Figura 1 é uma representação esquemática de um anticorpo típi- co.

Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando a seqüência de aminoácidos que define a região variável da cadeia pesada da imunoglobuli- na completa dos anticorpos indicados como 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 e 3D11. As seqüências de aminoácidos de cada anticorpo estão alinha- das uma contra outra e as regiões que definem o peptídeo de sinal, CDRi, CDR2, e CDR3 estão identificadas em retângulos. As seqüências fora dos retângulos representam seqüências de FR.

Figura 3 é um diagrama esquemático que mostra as seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cada uma das seqüências da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina apresentadas na Figura 2.

Figura 4 é um diagrama esquemático que mostra a seqüência de aminoácidos que define a região variável da cadeia leve de imunoglobulina completa dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11. As seqüências de aminoácidos de cada anticorpo estão alinhadas uma contra outra e as regiões que definem o peptídeo de sinal, CDR1, CDR2, e CDR3 estão identificadas em retângulos. As seqüências fora dos retângulos repre- sentam seqüências FR.

Figura 5 é um diagrama esquemático que mostra as seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cada uma das seqüências da região variável da cadeia leve de imunoglobulina apresentadas na Figura 4.

Figura 6 é um gráfico que resume os resultados de um experi- mento para medir a atividade inibitória de tumor de anticorpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 e 2B8 em um modelo de xenoenxerto de U87MG. Losangos cor- respondem a PBS; triângulos correspondem ao anticorpo 1A3 anti-HGF; X corresponde ao anticorpo 1D3 anti-HGF; quadrados correspondem ao anti- corpo 1F3 anti-HGF e círculos correspondem ao anticorpo 2B8 anti-HGF.

Figura 7 é um gráfico que resume os resultados de um experi- mento para medir a atividade inibitória de tumor de anticorpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1Α3 e 2Β8 em um modelo de xenoenxerto de U118. Losangos corres- pondem a IgG; quadrados correspondem ao anticorpo 1F3 anti-HGF, triân- gulos ao anticorpo 1D3 anti-HGF; X corresponde ao anticorpo 1A3 anti-HGF; e círculos correspondem ao anticorpo 2B8 anti-HGF.

Figura 8 é uma tabela que resume os dados de ressonância de plásmon de superfície sobre a afinidade de ligação ao antígeno e a cinética de interação entre HGF humano e anticorpos 2B8 quimérico, quiméri- co/humanizado ou humanizado. A tabela lista os pares de cadeia leve Capa e cadeia pesada de IgGI testados. Aqueles anticorpos com desvios-padrão (STDEV) listados foram analisados em três experimentos independentes.

Figura 9 é um gráfico de barras que resume dados experimen- tais que indicam que Hu2B8 se liga a um epítopo mutuamente exclusivo pa- ra o anticorpo monoclonal 2B8 de murino. 2B8 humanizado ou quimérico foi capturado sobre um chip de Fc anti-humano. Então, HGF estava ligado a 2B8 quimérico ou humanizado. A habilidade de 2B8 de camundongo ou do anticorpo de controle (anticorpo policlonal anti-HGF de cabra) se ligar a HGF capturado foi medida. Ambos os anticorpos 2B8 humanizado e 2B8 quiméri- co impedem que 2B8 de murino se ligue a HGF. As barras brancas corres- pondem ao anticorpo 2B8 quimérico; as barras cinzas correspondem ao an- ticorpo Hu2B8 humanizado (região variável capa Kv 1-39.1 e região variável de cadeia pesada Hv5-51.1); as barras pretas correspondem ao anticorpo Hu2B8 humanizado (região variável capa Kv 3-15.1 e região variável de ca- deia pesada Hv5-51.1).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção é baseada, em parte, na descoberta de uma família de proteínas de ligação que se ligam especificamente e neutralizam a ativi- dade de HGF, em particular, HGF humano. As proteínas de ligação podem ser usadas em uma variedade de aplicações de diagnóstico e terapêuticas. As proteínas de ligação são baseadas nos sítios de ligação a antígeno de certos anticorpos monoclonais que foram selecionados por sua habilidade de se ligar e neutralizar a atividade de HGF. Em particular, as proteínas de liga- ção contêm seqüências de região variável de CDR de imunoglobulina que juntas definem um sítio de ligação para HGF.

Em vista da atividade neutralizante desses anticorpos, eles são particularmente úteis em modular o crescimento e/ou proliferação de células responsivas a HGF, por exemplo, células cancerosas. Quando usadas como um agente terapêutico, as proteínas de ligação podem ser manipuladas a fim de minimizar ou eliminar o risco de indução de resposta imune contra a pro- teína de ligação quando administrada ao receptor. Além disso, dependendo da aplicação particular, considera-se que as proteínas de ligação podem ser conjugadas com outras porções, por exemplo, marcadores detectáveis, por exemplo, radiomarcadores e moléculas efetoras, por exemplo, outra proteína e terapêuticos baseados em moléculas pequenas. Cada uma dessas carac- terísticas e aspectos da invenção é discutida em mais detalhes abaixo.

I - Proteínas de Ligação que se Ligam a HGF

Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDR u-CDR L2-CDR L3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de com- plementaridade (CDRs), em que a região variável de cadeia leve de imuno- globulina e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina juntas de- finem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. CDRu com- preende a seqüência de aminoácidos Xi X2 Ser X4 X5 X6 X7 Xe X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, em que o aminoácido Xi é Arg1 Lys, ou Ser, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu, Gln, ou Ser, X5 é Asn, Asp, ou Ser, X6 é Ile ou Vai, X7 é Asp, Lys, Ser, Vai, ou Tyr, X8 é uma ligação peptídica ou Tyr, X9 é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, X11 é uma ligação peptídica ou Asn, X12 é uma ligação peptídica, lie, ou Ser, X13 é Asn ou Tyr, Xi4 é lie, Leu, Met, ou Vai, X15 é Ala, Asn, His, ou Ser. CDRl2 compreende a seqüência de ami- noácidos Xi6 X17 X18 X19 X20 X21 X22, em que o aminoácido X16 é Ala, Asp, Arg, Gly, ou Vai, X17 é Ala, Thr, ou Vai, X18 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, Lys, ou He, X20 é Leu ou Arg, X21 é Ala, Asn, Glu, Vai, ou Pro, X22 é Asp, Ser, ou Thr. CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 Χ25 Χ26 Χ27 Χ28 Pro X3O Thr, em que o aminoácido X23 é Leu, Gly1 ou Gln1 X24 é His ou Gln1 X25 é Phe1 Ser, Trp, ou Tyr, X26 é Asp, lie, Ser, Trp1 ou Tyr, X27 é Gly, Glu, Asn, ou Ser, X28 é Asp, Asn, Phe, Thr, ou Tyr, X30 é Leu, Phe, Pro, ou Tyr.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano que compreende (i) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDR hi~ CDR H2-CDR H3 e (ii) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade (C- DRs), em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e a re- gião variável de cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. CDRHi compreende a se- qüência de aminoácidos Xi Tyr X3 X4 X5 em que o aminoácido Xi é Asp, Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe, Ser, Trp, ou Tyr, X4 é lie, Leu, ou Met, X5 é Asn, His, ou Ser. CDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos X6 Ile X8 Xg Χίο X11 Gly Xi3 X14 X-15 Tyr X17 Xi8 X19 X20 X21 X22, em que o aminoácido X6 é Lys, Gln, Glu, Vai, ou Tyr, X8 é Asn, Gly, Ser, Trp, ou Tyr, X9 é Ala, Pro ou Ser, X10 é Gly ou Thr, X11 é uma ligação peptídica, Asp, Asn, Gly, ou Ser, X13 é Asp, Asn, His, ou Ser, X14 é Ser ou Thr, X15 é Asn ou Tyr, X17 é Asn ou Pro, Xi8 é Ala, Asp, Gly, Gln, Glu, Pro, ou Ser, X19 é Asn, Lys, Met, ou Ser, X20 é Leu, Phe ou Vai, X21 é Lys, Met, ou Gln, X22 is Asp, Gly ou Ser. CDRh3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg, Asn, Gln, ou Glu, X24 é Gly, Leu, Arg, ou Tyr, X25 é uma ligação peptídica, Asp, ou Gly, X26 é uma ligação peptídica ou Gly, X27 é uma ligação peptídica ou Tyr, X28 é uma ligação pep- tídica, Leu, ou Tyr, X29 é uma ligação peptídica, Gly, Leu, Arg, ou Vai, X30 é uma ligação peptídica, Asp, Gly, ou Glu, X31 é uma ligação peptídica, Asn, Arg, Ser, ou Tyr, X32 é uma ligação peptídica, Ala, Gly, lie, ou Tyr, X33 is Met ou Phe, X34 é Ala ou Asp.

Compreende-se que a proteína de ligação pode compreender tanto a seqüências da cadeia leve de imunoglobulina quanto a cadeia pesa- da da imunoglobulina ou fragmentos destas, registrados acima. Além disso, compreende-se que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto ou um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossin- tético.

Em certas modalidades, as seqüências de CDR da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina são interpostas com regiões de arcabouço (FR).

Em certas outras modalidades, as seqüências de CDR da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina são interpos- tas entre regiões de arcabouço humanas ou humanizadas.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga especificamente a HGF humano. A proteína de ligação compreende: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRu-CDRl2-CDRl3 e (b) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. A CDRli compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 8 (1A3), SEQ ID NO. 18 (2B8), SEQ ID NO. 28 (2F8), SEQ ID NO. 38 (3B6), SEQ ID NO. 48 (3D11), SEQ ID NO. 58 (1D3), SEQ ID NO. 68 (1F3), e SEQ ID NO. 78 (3A12). A CDRl2 compreende uma seqüência sele- cionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 9 (1A3), SEQ ID NO. 19 (2B8), SEQ ID NO. 29 (2F8), SEQ ID NO. 39 (3B6), SEQ ID NO. 49 (3D11), SEQ ID NO. 59 (1D3), SEQ ID NO. 69 (1F3), SEQ ID NO. 79 (3A12) e SEQ ID NO. 206 (LRMR2B8LC). A CDRu3 compreende uma seqüência selecio- nada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 10 (1A3), SEQ ID NO. 20 (2B8), SEQ ID NO. 30 (2F8), SEQ ID NO. 40 (3B6), SEQ ID NO. 50 (3D11), SEQ ID NO. 60 (1D3), SEQ ID NO. 70 (1F3), e SEQ ID NO. 80 (3A12). Ao longo do pedido e das reivindicações, as seqüências caracterizadas por uma SEQ ID NO. particular, são acompanhadas em parênteses pelo anticorpo que foi a origem da seqüência particular. Como exemplo, SEQ ID NO. 8 (1A3) indica que a SEQ ID NO: 8 é baseada na seqüência presente no anti- corpo 1A3. Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C- DRu que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 8 (1A3), uma CDFta que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 9 (1A3) e uma CDFta que com- preende a seqüência de SEQ ID NO. 10 (1A3).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C- DRu que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 18 (2B8), uma CDR|_2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 19 (2B8) ou SEQ ID NO. 206 (LRMR2B8LC) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 20 (2B8).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C- DRu que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 28 (2F8), uma CDR|_2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 29 (2F8) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 30 (2F8).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C- DRu que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 38 (3B6), uma CDRl2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 39 (3B6) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 40 (3B6).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C- DRLi que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 48 (3D11), uma CDRl2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 49 (3D11) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 50 (3D11).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C- DRu que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 58 (1D3), uma CDR|_2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 59 (1D3) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 60 (1D3).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C- DRu que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 68 (1F3), uma CDFta que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 69 (1F3) e uma CDRu3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 70 (1F3).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C- DRu que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 78 (3A12), uma CDRl2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 79 (3A12) e uma CDRl3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 80 (3A12).

Em cada uma das modalidades anteriores, as seqüências de CDRu, CDR|_2, e CDRu3 preferivelmente são interpostas entre FRs de imu- noglobulina humanas ou humanizadas. É compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento deste que se liga a an- tígeno ou um sítio de anticorpo biossintético.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRHi-CDRH2-CDRH3e (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobuli- na e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. A CDRm compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 5 (1A3), SEQ ID NO. 15 (2B8), SEQ ID NO. 25 (2F8), SEQ ID NO. 35 (3B6), SEQ ID NO. 45 (3D11), SEQ ID NO. 55 (1D3), SEQ ID NO. 65 (1F3), e SEQ ID NO. 75 (3A12); a CDRH2 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 6 (1A3), SEQ ID NO. 16 (2B8), SEQ ID NO. 26 (2F8), SEQ ID NO. 36 (3B6), SEQ ID NO. 46 (3D11), SEQ ID NO. 56 (1D3), SEQ ID NO. 66 (1F3), SEQ ID NO. 76 (3A12), SEQ ID NO. 202 (Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID NO. 203 (Hu2B8 Hv5a.1 ou Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID NO. 204 (LR2B8HC) e SEQ ID NO. 205 (LRMR2B8HC); a CDRh3 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 7 (1A3), SEQ ID NO. 17 (2B8), SEQ ID NO. 27 (2F8), SEQ ID NO. 37 (3B6), SEQ ID NO. 47 (3D11), SEQ ID NO. 57 (1D3), SEQ ID NO. 67 (1F3), e SEQ ID NO. 77 (3A12).

Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 5 (1A3); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 6 (1A3); e uma CDRH3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 7 (1A3).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID NO.15 (2B8); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 16 (2B8), SEQ ID NO. 202 (Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID NO. 203 (Hu2B8 Hv5a.1 ou Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID NO. 204 (LR2B8HC) ou SEQ ID NO. 205 (LRMR2B8HC); e uma CDRH3que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 17 (2B8).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID N0.25 (2F8); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 26 (2B8), e uma CDRH3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 27 (2F8).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRhi que compreende a seqüência de SEQ ID N0.35 (3B6); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 36 (3B6), e uma CDRH3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 37 (3B6).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRhi que compreende a seqüência de SEQ ID N0.45 (3D11); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 46 (3D11), e uma CDR^que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 47 (3D11).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID NO.55 (1D3); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 56 (1D3), e uma CDRH3que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 57 (1D3).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRhi que compreende a seqüência de SEQ ID NO.65 (1F3); uma CDRh2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 66 (1F3), e uma CDRh3 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 67 (1F3).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID NO.75 (3A12); uma CDRh2 que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 76 (3A12), e uma CDR^que compreende a seqüência de SEQ ID NO. 77 (3A12).

Em cada uma das modalidades anteriores, as seqüências de CDRh-I, CDRh2, e CDRh3 preferivelmente são interpostas entre FRs de imu- noglobulina humanas ou humanizadas. É compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nos resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 2 (1A3), resíduos 20-137 de SEQ ID NO. 12 (2B8), resíduos 20-137 de SEQ ID NO. 22 (2F8), resíduos 20-139 de SEQ ID NO. 32 (3B6), resíduos 20-132 de SEQ ID NO. 42 (3D11), resíduos 20- 141 de SEQ ID NO. 52 (1D3), resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 62 (1F3), e resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 72 (3A12) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste nos resíduos 21- 127 de SEQ ID NO. 4 (1A3), resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 14 (2B8), resí- duos 20-131 de SEQ ID NO. 24 (2F8), resíduos 23-129 de SEQ ID NO. 34 (3B6), resíduos 23-128 de SEQ ID NO. 44 (3D11), resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 54 (1D3), resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 64 (1F3), e resíduos 21- 127 de SEQ ID NO. 74 (3A12).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 2 (1A3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4 (1A3).

Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 20-137 de SEQ ID NO: 12 (2B8) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4 (2B8).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 20-137 de SEQ ID NO: 22 (2F8) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-131 de SEQ ID NO: 24 (2F8).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 20-139 de SEQ ID NO: 32 (3B6) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 23-129 de SEQ ID NO: 34 (3B6).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 20-132 de SEQ ID NO: 42 (3D11) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 23-128 de SEQ ID NO: 44 (3D11).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 52 (1D3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 54 (1D3).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 62 (1F3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 64 (1F3).

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- quência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 72 (3A12) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 74 (3A12).

Em qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína de li- gação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento deste que se liga a antí- geno ou um sítio de anticorpo biossintético.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 173 (região variável da cadeia leve de Hu2B8 Kv1 -39.1), SEQ ID NO. 179 (região variável da cadeia leve de Hu2B8 Kv3-15.1), SEQ ID NO. 193 (região variável da cadeia leve de LR2B8LC), e SEQ ID NO. 199 (região variável da cadeia leve de LR- MR2B8LC); e (ii) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 159 (região variá- vel da cadeia pesada de Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID NO. 165 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv5a.1), SEQ ID NO. 169 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID NO. 183 (região variável da cadeia pesada de LR2B8HC), e SEQ ID NO. 189 (região variável da ca- deia pesada de LRMR2B8LC). A proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + constante capa (alótipo Km(3) (alelo 2)), SEQ ID NO. 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 2)), SEQ ID NO. 197 (LR2B8LC + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)), e SEQ ID NO. 201 (LRMR2B8LC + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)); e (ii) uma imunoglobulina da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 163 (Hu2B8 Hv1f.1 + constante de IgGI (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID NO. 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + constante de IgGI (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID NO. 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + Cons- tante de IgGI (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID NO. 187 (LR2B8HC + cons- tante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 1)), e SEQ ID NO. 191 (LRMR2B8HC + constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 1)). A proteína de ligação po- de ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano reduzido. A proteína de ligação compre- ende (i) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compre- ende três CDRs e (ii) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobu- Iina que compreende três CDRs. As CDRs estão tipicamente interpostas en- tre FRs. As CDRs da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação que se liga a HGF huma- no reduzido, por exemplo, a cadeia α de HGF reduzido. HGF reduzido refe- re-se a HGF tratado com uma quantidade de agente redutor, por exemplo, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol ou glutationa suficiente para reduzir a ligação dissulfeto entre a cadeia α e a cadeia β. Concentrações exemplares incluem, por exemplo, DTT 100 mM e 2-mercaptoetanol 5%.

Em certas modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende pelo me- nos uma CDR selecionada do grupo que consiste em CDRu, CDRl2 e C- DRl3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende duas CDRs, por exemplo, CDRu e CDRl2, ou CDRu e CDRl3, ou CDRu e CDRl3. Opcio- nalmente, a proteína de ligação compreende todas as três CDRs, isto é, CDRui CDRl2 e CDRl3. CDRli compreende a seqüência de aminoácidos Xi X2 Ser X4 X5 Χβ X7 Xe X9 Xio Xn X12 Xi3 X14 X-i5> em que o aminoácido Xi é Arg ou Lys, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu ou Gln, X5 é Asn, Ser, ou Asp, X6 é Ile ou Vai, X7 é Tyr, Asp, ou Lys, Xe é uma ligação peptídica ou Tyr, X9 é uma ligação peptídica ou Asp, X-ιο é uma ligação peptídica ou Gly, Xn é uma liga- ção peptídica ou Asn, Xi2 é uma ligação peptídica ou Ser, Xi3 é Asn ou Tyr1 X14 é Ile ou Leu, X15 é Ala, Asn, ou Ser. CDRl2 compreende a seqüência de aminoácidos Xi6 X17 Χιβ X19 Leu X21 X22, em que o aminoácido X16 é Ala, Asp, Vai, ou Arg, X17 é Ala ou Vai, Xi8 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, ou He, X21 é Ala, Glu1 Vai, ou Pro, X22 é Asp ou Ser. CDR|_3 compreende a se- qüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X3o Thr, em que o ami- noácido X23 é Leu ou Gln, X24 é H ou Gln, X25 é Phe, Ser, ou Tyr, X26 é Asp, lie, ou Trp, X27 é Gly ou Glu, X28 é Asp, Phe, ou Thr, X30 é Phe, Pro, ou Tyr.

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende pelo me- nos uma CDR selecionada do grupo que consiste em CDRh1i CDRh2, e CD- Rh3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende duas CDRs, por e- xemplo, CDRhi e CDRH2, ou CDRhi e CDRh3, ou CDRm e CDRh3. Opcio- nalmente, a proteína de ligação compreende todas as três CDRs, isto é, CDRh1i CDRh2 e CDRh3. CDRhi compreende a seqüência de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5, em que o aminoácido X1 é Asp, Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe, Trp, ou Tyr, X4 é Ile ou Met, X5 é Asn, Hé, ou Ser. CDRh2 compreende a seqüência de aminoácidos X6 Ile X8 X9 Gly X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X18 X19 X20 Lys X22, em que o aminoácido X6 é Lys, Gln, ou Tyr, X8 é Gly, Ser, ou Tyr, X9 é Pro ou Ser, X11 é Asp, Gly, ou Ser, X13 é Asp ou Ser, X14 é Ser ou Thr, X15 é Asn ou Tyr, X17 é Asn ou Pro, X18 é Ala, Asp, Gly, ou Glu, X19 é Asn, Met, ou Ser, X2o é Phe ou Vai, X22 é Asp ou Gly. CDRh3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 Asp Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg ou Gln, X24 é Gly ou Leu, X25 é Asp, Gly, ou uma ligação peptídica, X26 é Gly ou uma ligação peptídica, X27 é uma li- gação peptídica ou Tyr, X28 é Leu, uma ligação peptídica ou Tyr, X29 é a Gly, Arg ou Leu, X30 é Asp, Gly ou Glu, X31 é a Tyr, Arg ou Asn, X32 é Ala, Gly ou Tyr, X33 é Met ou Phe.

Compreende-se que a proteína de ligação pode compreender ambas as seqüências de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada de imunoglobulina ou fragmentos dessas, registrados acima. Além disso, é compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto ou um fragmento deste que se liga a antígeno ou um sítio de anticorpo biossin- tético.

Em certas modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende (i) uma CDRu que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 8 (1A3), SEQ ID NO. 28 (2F8), SEQ ID NO. 38 (3B6), SEQ ID NO. 58 (1D3), e SEQ ID NO. 68 (1F3), (ii) uma CDRl2 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 9 (1A3), SEQ ID NO. 29 (2F8), SEQ ID NO. 39 (3B6), SEQ ID NO. 59 (1D3), e SEQ ID NO. 69 (1F3), e (iii) uma CDRu3 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consis- te em SEQ ID NO. 10 (1A3), SEQ ID NO. 30 (2F8), SEQ ID NO. 40 (3B6), SEQ ID NO. 60 (1D3), e SEQ ID NO. 70 (1F3). As seqüências de CDR po- dem ser interpostas entre FRs humanas ou humanizadas.

Em outras modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma se- qüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos resíduos 21- 127 de SEQ ID NO. 4 (1A3), resíduos 20-131 de SEQ ID NO. 24 (2F8), resí- duos 23-129 de SEQ ID NO. 34 (3B6), resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 54 (1D3), e resíduos 21 -127 de SEQ ID NO. 64 (1F3).

Em certas outras modalidades, a proteína de ligação compreen- de uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreen- de (i) uma CDRm que tem uma seqüência selecionada do grupo que consis- te em SEQ ID NO. 5 (1A3), SEQ ID NO. 25 (2F8), SEQ ID NO. 35 (3B6), SEQ ID NO. 55 (1D3), e SEQ ID NO. 65 (1F3), (ii) uma CDRh2 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 6 (1A3), SEQ ID NO. 26 (2F8), SEQ ID NO. 36 (3B6), SEQ ID NO. 56 (1D3), e SEQ ID NO. 66 (1F3),e (iii) uma CDRh3 que tem uma seqüência selecionada do gru- po que consiste em SEQ ID NO. 7 (1A3), SEQ ID NO. 27 (2F8), SEQ ID NO. 37 (3B6), SEQ ID NO. 57 (1D3), e SEQ ID NO. 67 (1F3). As seqüências de CDR podem ser interpostas entre FRs humanas ou humanizadas.

Em outra modalidade, a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 2 (1A3), resíduos 20-137 de SEQ ID NO. 22 (2F8), resíduos 20-139 de SEQ ID NO. 32 (3B6), resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 52 (1D3), e resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 62 (1F3).

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano e compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina. A proteína de ligação isolada compete pela ligação a HGF com pelo menos um anticorpo de referência selecionado do grupo que con- siste em (i) um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve de i- munoglobulina com resíduos 20-131 de SEQ ID NO. 24 (2F8) e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20-137 de SEQ ID NO. 22 (2F8), (ii) um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com resíduos 23-129 de SEQ ID NO. 34 (3B6), e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20- 139 de SEQ ID NO. 32 (3B6) e (iii) um anticorpo que tem uma região variá- vel de cadeia leve de imunoglobulina com resíduos 23-128 de SEQ ID NO. 44 (3D11) e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20-132 de SEQ ID NO. 42 (3D11). Sob certas circunstancias, a pro- teína de ligação se liga ao mesmo epítopo de HGF como um dos anticorpos de referência.

É compreendido que cada uma das proteínas de ligação discuti- das acima pode ser um anticorpo intacto, por exemplo, um anticorpo mono- clonal. Alternativamente, a proteína de ligação pode ser um fragmento de um anticorpo que se liga a antígeno ou pode ser um sítio de ligação de anticorpo biossintético. Fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', (Fab')2 ou Fv. Técnicas para fazer tais fragmentos de anticorpo são conhecidas por aqueles versados na técnica. Vários sítios de ligação de anticorpo biossinté- tico são conhecidos na técnica, por exemplo, moléculas de Fv único ou sFv, descritas, por exemplo, na Patente U.S. Nq 5.476.786. Outros sítios de liga- ção de anticorpo biossintético incluem proteínas de ligação biespecíficas ou bifuncionais que são anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam a pelo menos dois antígenos diferentes. Por exemplo, proteínas de ligação biespecíficas podem se ligar a HGF, por exemplo, HGF humano e outro an- tígeno de interesse. Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhe- cidos na técnica e incluem, por exemplo, a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-325; Kostelny etal. (1992) J. Immunol. 148: 1547-1553.

As proteínas de ligação da invenção podem se ligar a hHGF que contém uma substituição de cisteína por arginina na posição 561 ou uma substituição de glicina por glutamato na posição 555.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano com uma kd de 4,0 χ 10'5 s"1 ou menor, 3,0 χ 10~5 s"1 ou menor, ou 2,0 χ 10'5 s"1 ou menor. As proteínas de ligação isoladas podem se ligar a HGF humano com kd de 5,0 χ 10"5 s'1 a 0,5 χ 10"5s"1, ou de 4,0 χ 10'5 s"1 a 1,0 χ 10"5s"1, ou de 3,0 χ 10"5 s"1 a 1,5 χ 10"5 s"1. Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano com Kd de 100 pM ou menor, ou 20 pM ou menor, ou 10 pM ou menor ou 5 pM ou menor. As proteínas de ligação isoladas podem se ligar a HGF humano com K0 de 100 pM a 5 pM, ou de 20 pM a 5 pM, ou de 15 pM a 10 pM, ou de 20 pM a 10 pM, ou de 15 pM a 5 pM. A menos que especificado de outra maneira, valores de Kd são determinados pelos méto- dos e sob as condições descritas no Exemplo 6.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano, em que o anticorpo se liga a HGF huma- no com Kd menor a 379C do que a 259C. A proteína de ligação opcionalmen- te se liga a HGF humano com Kd menor do que 5 pM a 37°C.

Em outros aspectos e modalidades, as proteínas de ligação po- dem inibir a ligação de hHGF a c-Met. Por exemplo, as proteínas de ligação podem ter uma IC5o (concentração a 50% da inibição máxima) de pelo me- nos cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, e 7,0 nM quando testadas usando o protocolo descrito no Exemplo 7(a). Em certas outras modalidades, as prote- ínas de ligação podem neutralizar a incorporação de BrdU mediada por HGF em células 4 MBr-5 (ATCC, N9 de catálogo CCL208) usando o método des- crito no Exemplo 7(b).

As proteínas de ligação podem ter uma IC50 de 50 nM ou menor, preferivelmente 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0.5 nM ou menor, quando ensaiadas usando o protocolo descrito no Exemplo 7(b). Em certas outras modalidades, as proteínas de ligação podem ser usadas para inibir a fosfori- lação de c-Met estimulada por HGF em células PC-3 (ATCC, Manassus, VA Nq de catálogo. CRL-1435) usando o ensaio descrito no Exemplo 9.

II - Produção de Proteínas de Ligação

Proteínas de ligação da invenção podem ser produzidas de vá- rias maneiras usando abordagens conhecidas na técnica. Por exemplo, mo- léculas de DNA que codificam regiões variáveis de cadeia leve e regiões variáveis de cadeia pesada podem ser sintetizadas quimicamente, usando um sintetizador comercial e a informação de seqüência fornecida nesse. Tais moléculas sintéticas de DNA podem ser ligadas a outras seqüências de nu- cleotídeo apropriadas, incluindo, por exemplo, seqüências que codificam região constante e seqüências de controle da expressão, para produzir cons- trutos de expressão de gene convencionais que codificam as proteínas de ligação desejadas. A produção de construtos de genes definidos está dentro da técnica de rotina. Alternativamente, as seqüências fornecidas aqui podem ser clonadas de hibridomas por técnicas de hibridização convencionais ou técnicas de PCR, usando sondas de ácido nucléico sintético cujas seqüên- cias são baseadas na informação de seqüência fornecida aqui ou na infor- mação de seqüência da técnica anterior com relação a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino em células de hibrido- ma. A produção e uso de tais sondas está dentro da técnica ordinária.

Os ácidos nucléicos que codificam as proteínas de ligação dese- jadas podem ser introduzidos (ligados) em vetores de expressão, que podem ser introduzidos em uma célula hospedeira através de técnicas usuais de transfecção ou de transformação conhecidas na técnica. Células hospedei- ras exemplares incluem, por exemplo, células de E. coli, células de ovário de hamster chinês (CHO)1 células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e células de mieloma que não produzem proteína imuno- globulina de outra maneira. Células hospedeiras transfectadas podem ser cultivadas sob condições que permitem as células hospedeiras expressar os genes de interesse, por exemplo, os genes que codificam as regiões variá- veis de cadeia leve e pesada de imunoglobulina. Os produtos de expressão resultantes podem ser coletados usando técnicas conhecidas.

As condições de expressão e purificação particulares variarão dependendo de qual sistema de expressão é empregado. Por exemplo, se o gene for expresso em E. coli, ele é clonado primeiro em um vetor de expres- são. Isso é obtido pelo posicionamento do gene manipulado a jusante do promotor bacteriano adequado, por exemplo, TrP ou Tac, e uma seqüência de sinal, por exemplo, uma seqüência que codifica um fragmento B da prote- ína A (FB). A proteína de fusão expressa resultante se acumula tipicamente em corpos refrativos ou de inclusão no citoplasma das células e podem ser coletadas após a ruptura das células por prensa francesa ou sonicação. Os corpos refrativos são então solubilizados e as proteínas expressas reenove- Iadas e clivadas por métodos já estabelecidos para muitas outras proteínas recombinantes.

Se o gene manipulado for expresso em células hospedeiras eu- carióticas, por exemplo, células de mieloma ou células CHO, ele é inserido primeiro em um vetor de expressão que contem um promotor eucariótico adequado, um sinal de secreção, intensificadores de imunoglobulina e vários íntrons. Esse vetor de expressão pode conter opcionalmente seqüências que codificam toda ou uma parte de uma região constante, possibilitando que uma cadeia pesada ou leve inteira ou uma parte seja expressa. O construto de gene pode ser transfectado em células de mieloma ou células CHO u- sando protocolos de transfecção estabelecidos. Tais células transfectadas podem expressar fragmentos de Vl ou Vh, heterodímeros de Vl-Vh, polipep- tídeos de cadeia simples de Vh-Vl ou Vl-Vh, cadeias pesadas ou leves com- pletas de imunoglobulina ou porções desses, cada um dos quais podendo ser acoplados a um domínio de proteína que tem outra função (por exemplo, citotoxicidade).

III - Modificações das Proteínas de Ligação

É compreendido que as proteínas de ligação podem ser modifi- cadas para otimizar o desempenho dependendo do uso pretendido das pro- teínas de ligação. Por exemplo, a proteína de ligação está sendo usada co- mo um agente terapêutico, a proteína de ligação pode ser modificada para reduzir sua imunogenicidade no receptor pretendido. Alternativamente ou, adicionalmente, a proteína de ligação pode ser fundida ou acoplada à outra proteína ou peptídeo, por exemplo, um fator de crescimento, citocina ou cito- toxina. Tais modificações podem ser obtidas usando técnicas de manipula- ção de gene de rotina conhecidas na técnica.

Várias técnicas para reduzir a antigenicidade de anticorpos ou fragmentos de anticorpo são conhecidas na técnica. Essas técnicas podem ser usadas para reduzir ou eliminar a antigenicidade das proteínas de Iiga- ção da invenção. Por exemplo, quando as proteínas de ligação são para ser administradas a um ser humano, as proteínas de ligação são preferivelmente manipuladas para reduzir sua antigenicidade em seres humanos. Esse pro- cesso é geralmente referido como humanização. Preferivelmente, as proteí- nas de ligação humanizadas têm a mesma ou substancialmente a mesma afinidade pelo antígeno que a proteína de ligação não humanizada original da qual ela é derivada.

Em uma abordagem de humanização bem conhecida, proteínas quiméricas são criadas nas quais as regiões constantes de imunoglobulina de anticorpos de uma espécie, por exemplo, camundongo, são substituídas por regiões constantes de imunoglobulina de uma segunda espécie diferen- te, por exemplo, um humano. Nesse exemplo, o anticorpo resultante é uma quimera de camundongo-humano, onde as seqüências da região constante humana, em princípio, são menos imunogênicas do que as seqüências de murino correspondentes. Esse tipo de manipulação de anticorpo é descrito, por exemplo, em Morrison, et al. (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851- 6855, Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608; Patente U.S. Nss. 6.893.625 (Robinson); 5.500.362 (Robinson); e 4.816.567 (Cabilly). Em outra abordagem, conhecida como enxerto de CDR, as C- DRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo de inte- resse são enxertadas em regiões de arcabouço (FRs) de outra espécie. Por exemplo, CDRs de murino podem ser enxertadas em seqüências de FR hu- manas. Em algumas modalidades, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo anti-HGF são enxertadas em FRs humanas ou FRs humanas de consenso. A fim de criar FRs humanas de consenso, FRs de várias seqüências de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve humanas são alinhadas para identificar a seqüência de aminoácidos de con- senso. O enxerto de CDR está descrito, por exemplo, em Patente U.S. Ngs 7.022.500 (Queen); 6.982.321 (Winter); 6.180.370 (Queen); 6.054.297 (Car- ter); 5.693.762 (Queen); 5.859.205 (Adair); 5.693.761 (Queen); 5.565.332 (Hoogenboom); 5.585.089 (Queen); 5.530.101 (Queen); Jones et ai (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et ai (1988) Nature 332: 323-327; Ver- hoeyen et ai (1988) Science 239: 1534-1536; e Winter (1998) FEBS Lett 430: 92-94.

Em uma abordagem chamada "super-humanização", anticorpos nos quais a imunogenicidade humana está reduzida ou eliminada são cria- dos por uma forma alternativa de enxerto. Na super-humanização, sequên- cias de FR são escolhidas de um grupo de genes de linhagem germinativa humana com base na similaridade estrutural das CDRs humanas com aque- las do anticorpo de camundongo a ser humanizado. Essa abordagem é des- crita, por exemplo, na Patente U.S. Nq 6.881.557 (Foote) e em Tan et ai (2002) J. IMMUNOL 169:1119-1125.

Outras abordagens para reduzir a imunogenicidade incluem téc- nicas que são conhecidas como "transformação", "hiperquimerização" ou "recapeamento/revestimento" para produzir anticorpos humanizados. Veja, por exemplo, Vaswami et ai (1998) Annals of Allergy, Asthma, & Immunol. 81: 105; Roguska et al. (1996) Prot. Engineer 9: 895-904; e Patente U.S. Ng 6.072.035 (Hardman). Na abordagem de recapeamento/revestimento, os resíduos de aminoácidos de superfície acessível no anticorpo de murino são substituídos por resíduos de aminoácidos mais freqüentemente encontrados nas mesmas posições em um anticorpo humano. Esse tipo de revestimento de anticorpo está descrito, por exemplo, na Patente U.S. Nq 5.639.641 (Pe- dersen).

Uma abordagem exemplar para conversão de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso médico em seres humanos é conhecida como tecnologia ACTIVMAB® (Vaccinex, Inc., Rochester, NY), que envolve um vetor baseado no vírus da vacínia para expressar anticorpos em células de mamífero. Altos níveis de diversidade combinatória das cadei- as pesadas e leves de imunoglobulina são ditos serem produzidos. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nes 6.706.477 (Zauderer); 6.800.442 (Zauderer); e 6.872.518 (Zauderer).

Outra abordagem exemplar para conversão de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso em seres humanos é a tec- nologia praticada comercialmente por KaIoBios Pharmaceuticals, Inc. (Paio Alto, CA). Essa tecnologia envolve o uso de uma biblioteca "aceptora" de propriedade humana para produzir uma biblioteca "focalizada no epítopo" para seleção de anticorpo.

Outra abordagem exemplar para modificação de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso médico em humanos é a tecnologia HUMAN ENGINEERING® (HE®), que é praticada comercialmente por XOMA (US) LLC. Veja, por exemplo, Pedido de Publicação Internacional N9 WO 93/11794 e Patente U.S. Nqs 5.766.886; 5.770.196; 5.821.123; e 5.869.619.

Qualquer abordagem adequada, incluindo qualquer uma das abordagens acima, pode ser utilizada para reduzir ou eliminar a imunogeni- cidade humana de uma proteína de ligação de interesse.

Além disso, é possível criar anticorpos totalmente humanos em camundongos. Nessa abordagem, anticorpos humanos são preparados u- sando um camundongo transgênico no qual os genes que produzem anti- corpo de camundongo foram substituídos por uma porção substancial de genes que produzem anticorpo humano. Tais camundongos produzem imu- noglobulina humana ao invés de moléculas de imunoglobulina de murino. Veja, por exemplo, WO 98/24893 (Jacobovitz et al.) e Mendez et ai. (1997) Nature Genetics 15: 146-156. Anticorpos monoclonais anti-HGF totalmente humanos podem ser produzidos usando a seguinte abordagem. Camundon- gos transgênicos que contêm genes de imunoglobulina humana são imuni- zados com o antígeno de interesse, por exemplo, HGF. Células linfáticas dos camundongos são então obtidas dos camundongos, que são então fundidas com uma linhagem celular de tipo mielóide para preparar linhagens celulares de hibridoma imortalizado. As linhagens celulares de hibridoma são rastrea- das e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para HGF.

Proteínas de ligação da invenção podem ser conjugadas com outras moléculas, dependendo do uso pretendido. Por exemplo, se a proteí- na de ligação for usada como um terapêutico, então a proteína de ligação pode ser conjugada com outro agente, por exemplo, uma molécula efetora que modula ou, promove a terapia de outra forma. À medida que o efetor é um agente baseado em uma não proteína, por exemplo, um fármaco de mo- lécula pequena, um radiomarcador ou toxina, então o agente pode ser qui- micamente acoplado usando químicas de acoplamento in vitro padronizadas. Se, por outro lado, a molécula efetora é uma proteína ou peptídeo, por e- xemplo, uma enzima, receptor, toxina, fator de crescimento, citocina ou outro imunomodulador, então a proteína de ligação pode ser quimicamente aco- plada ao efetor usando químicas de acoplamento in vitro ou podem ser aco- pladas ao efetor como uma proteína de fusão. Proteínas de fusão podem ser construídas e expressas usando técnicas similares àquelas discutidas na seção II.

IV - Uso de Proteínas de Ligação

As proteínas de ligação descritas aqui podem ser usadas como um agente de diagnóstico ou um agente terapêutico.

(1) Aplicações Terapêuticas

Como as proteínas de ligação da invenção neutralizam a ativi- dade de HGF, elas podem ser usadas em várias aplicações terapêuticas. Por exemplo, certas proteínas de ligação da invenção são úteis na preven- ção ou tratamento de doenças ou desordens hiperproliferativas, por exem- plo, várias formas de câncer.

As proteínas de ligação podem ser usadas para inibir ou reduzir a proliferação de células tumorais. Em tal abordagem, as células tumorais são expostas a uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de liga- ção a fim de inibir ou reduzir a proliferação da célula tumoral. Em certas mo- dalidades, as proteínas de ligação inibem a proliferação de célula tumoral em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%.

Em certas modalidades, a proteína de ligação é usada para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula de tumor, na qual a proteína de liga- ção reduz a habilidade de hHGF de se ligar a c-Met. Em outras modalidades, a proteína de ligação é usada para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula de tumor mesmo quando a proteína de ligação se liga a hHGF mas não inibe substancialmente a ligação de hHGF a c-Met, como demonstrado pelo anticorpo 3B6 nas Tabelas 5 e 6.

Além disso, a proteína de ligação pode ser usada para inibir ou reduzir o crescimento ou desenvolvimento do tumor em um mamífero. Em tal método, uma quantidade eficaz de proteína de ligação é administrada ao mamífero a fim de inibir ou reduzir o crescimento do tumor em um mamífero.

Consequentemente, as proteínas de ligação podem ser usadas para tratar tumores, por exemplo, em um mamífero. O método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação. A proteína de ligação pode ser administrada sozinha ou em combinação com outra mo- lécula farmaceuticamente ativa a fim de tratar o tumor.

Considera-se que as proteínas de ligação da invenção podem ser usadas no tratamento de uma variedade de distúrbios responsivas a HGF, incluindo, por exemplo, células tumorais responsivas a HGF no câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de colo, câncer de próstata, câncer o- variano, câncer de cabeça e pescoço, câncer ovariano, mieloma múltiplo, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de rim, câncer de nasofaringe, câncer pancreático, mesotelioma, melanoma e glioblastoma.

Conforme usado aqui "tratar", "tratando" e "tratamento" referem- se ao tratamento de um estado de doença em um mamífero, particularmente em um ser humano, e incluem: (a) impedir que o estado de doença ocorra em um mamífero, em particular quando tal mamífero está predisposto ao estado de doença, mas ainda não foi diagnosticado como o tendo; (b) inibir o estado de doença, isto é, parar seu desenvolvimento; e/ou (c) aliviar o esta- do de doença, isto é, causar a regressão do estado de doença.

Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz do com- ponente ativo estará na faixa entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/ kg, opcionalmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, opcionálmen- te de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. A quantidade administrada de- penderá de variáveis tais como o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, do estado de saúde do paciente em particular, da eficácia bioló- gica relativa da proteína de ligação liberada, da formulação da proteína de ligação, da presença e dos tipos de excipientes na formulação e da via de administração. A dosagem inicial administrada pode ser aumentada além do nível superior a fim de se obter rapidamente o nível sangüíneo ou nível teci- dual desejados ou a dosagem inicial pode ser menor do que o ótimo e a do- sagem diária pode ser progressivamente aumentada durante o curso do tra- tamento dependendo da situação particular. A dosagem humana pode ser otimizada, por exemplo, em um estudo de intensificação de dosagem con- vencional de Fase I planejado para correr entre 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. A fre- qüência de dosagem pode variar, dependendo de fatores tais como a via de administração, quantidade dosada e a condição da doença a ser tratada. Freqüências de dosagem exemplares são uma vez por dia, uma vez por se- mana e uma vez a cada duas semanas. A via de administração preferida é parenteral, por exemplo, infusão intravenosa. A formulação de fármacos ba- seados em anticorpos monoclonais está dentro da técnica comum. Em al- gumas modalidades da invenção, a proteína de ligação, por exemplo, um anticorpo monoclonal, é liofilizada e reconstituída em salina tamponada no momento da administração.

As proteínas de ligação podem ser administradas tanto sozinhas quanto em combinação com outros ingredientes farmaceuticamente ativos. Os outros ingredientes ativos, por exemplo, imunomoduladores, podem ser administrados junto com a proteína de ligação ou podem ser administrados antes ou depois da proteína de ligação.

Formulações contendo as proteínas de ligação para uso tera- pêutico, incluem tipicamente as proteínas de ligação combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme usado aqui, "veículo farma- ceuticamente aceitável" significa tampões, veículos e excipientes que são, dentro do escopo do julgamento clínico, adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irrita- ção, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, correspondente a uma proporção benefício/risco razoável. O(s) veículo(s) deve(m) ser "aceitá- vel(eis)" no sentido de serem compatíveis com outros ingredientes das for- mulações e não deletérios para o receptor. Veículos farmaceuticamente a- ceitáveis, nesse aspecto, pretendem incluir qualquer um e todos os tampões, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes isotônicos e prolon- gadores da absorção e semelhantes, compatíveis com administração farma- cêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas em uma forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer méto- do adequado, incluindo quaisquer métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Uma composição farmacêutica da invenção deve ser formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração parenteral ou administração não parenteral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, inalação, transdér- mica (tópica), transmucosa e administração retal. Soluções úteis para admi- nistração oral ou parenteral podem ser preparadas por qualquer um dos mé- todos bem conhecidos na técnica farmacêutica, descritos, por exemplo, em Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18ã d. (Mack Publishing Company, 1990).

Formulações adequadas para administração oral podem estar na forma de: unidades individuais tais como injeções, cápsulas, cápsulas gelatinosas, sachês, comprimidos, pastilhas ou drágeas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada da proteína de ligação; uma composição em pó ou granulada; uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou uma emulsão de óleo em água ou uma emul- são de água em óleo.

Formulações adequadas para administração parenteral incluem, por exemplo, os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propile- no glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfeto de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminote- traacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A pre- paração parenteral pode ser acondicionada em ampolas, seringas descartá- veis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.

Em geral, composições adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas (quando solúveis em água) ou dispersões e pós para pre- paração extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou salina tamponada com fosfato (PBS). Ela deve ser estável sob as condições de produção e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contami- nante de microorganismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contém, por exemplo, água, eta- nol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido) e misturas adequadas desses.

As formulações farmacêuticas preferivelmente são estéreis, A esterilização pode ser obtida, por exemplo, por filtração através de membra- nas de filtração estéreis. Onde as composições são liofilizadas, a esteriliza- ção usando esse método pode ser conduzida antes ou após a liofilização e reconstituição. Uma vez que a composição farmacêutica tenha sido formula- da, ela pode ser armazenada, por exemplo, em frascos como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado. (2) Aplicações Diagnosticas

Sempre que as proteínas de ligação forem usadas com propósi- tos de diagnóstico, tanto in vitro quanto in vivo, as proteínas de ligação são marcadas tanto diretamente quanto indiretamente com uma porção detectá- vel. A porção detectável pode ser qualquer porção que á capaz de produzir, tanto diretamente quanto indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3Hidrogênio (3H), 14Carbono (14C), 32Fosforo (32P), 35Enxofre (35S), ou 125Iodo (125I); um com- posto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluores- ceína, rodamina ou luciferina; uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta- galactosidase ou peroxidase de rábano silvestre; uma sonda paramagnética, tal como um marcador de spin; ou uma partícula colorida, por exemplo, uma partícula de látex ou ouro. É compreendido que a proteína de ligação pode ser conjugada com a porção detectável usando várias abordagens conheci- das na técnica, por exemplo, como descrito em Hunter et ai. (1962) Nature 144: 945; David et ai. (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain et ai. (1981) J. Immunol. Meth. 40: 219; and Nygren (1982) J. Histochem. and Cytochem. 30: 407. Os marcadores podem ser detectados, por exemplo, visualmente ou com a ajuda de um espectrofotômetro ou outro detector.

As proteínas de ligação podem ser empregadas em uma ampla faixa de técnicas de imunoensaio disponíveis na técnica. Imunoensaios e- xemplares incluem, por exemplo, imunoensaios sanduíche, imunoensaios competitivos e procedimentos imuno-histoquímicos.

Em um imunoensaio intercalado, dois anticorpos que se ligam a um analito ou antígeno de interesse são usados, por exemplo, um imobiliza- do sobre um suporte sólido e um livre em solução e marcado com uma por- ção detectável. Quando uma amostra que contém o antígeno é introduzida nesse sistema, o antígeno se liga ao anticorpo imobilizado e ao anticorpo marcado, para formar uma "intercalação" de complexo imune sobre a super- fície do suporte. A proteína complexada é detectada pela lavagem dos com- ponentes não ligados da amostra e do excesso de anticorpo marcado e pela medida de anticorpo marcado complexado à proteína sobre a superfície do suporte. Alternativamente, o anticorpo livre em solução pode ser detectado por um terceiro anticorpo marcado com uma porção detectável que se liga ao anticorpo livre. Uma revisão detalhada do planejamento de ensaio imuno- lógico, teoria e protocolos podem ser encontrados em vários textos, incluindo Butt, ed., (1984) Practical Immunology, Mareei Dekker, New York; Harlow et al. eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory; and Diamandis et al., eds. (1996) Immunoassay, Academic Press, Boston.

É considerado que as proteínas de ligação marcadas são úteis como agentes de imagem in vivo, através do que as proteínas de ligação podem direcionar os agentes de imagem para os tecidos particulares de inte- resse do receptor. Uma porção remotamente detectável preferida para ima- gem in vivo inclui o átomo radioativo Tecnécio99"1 (99mTc), um emissor gama com uma meia-vida de cerca de seis horas. Porções não radioativas também úteis em imagem in vivo incluem marcadores de spin de nitróxido assim co- mo lantanídeo e íons de metal de transição, todos os quais induzem atenua- ção de próton in situ. Além de imunoimagem, as porções radioativas com- plexadas podem ser usadas em protocolos padronizados de rádio-imuno- terapia para destruir as células-alvo. Nucleotídeos preferidos para radioimu- noterapia em altas doses incluem os átomos radioativos 90Itrio (90Yt), 131Iodo (131I) e 111Indio (111In). A proteína de ligação pode ser marcada com 1311,111In e 99mTc usando técnicas de acoplamento conhecidas nas técnicas de ima- gem. Similarmente, procedimentos para preparar e administrar o agente de imagem assim como capturar e processar imagens são bem conhecidas na técnica de imagem e, portanto não são discutidos em detalhes nesse. Simi- larmente, métodos para realizar imunoterapias baseadas em anticorpo são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nq 5.543.254.

Ao longo de toda a descrição, onde as composições são descri- tas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, é contemplado que as composições também consistem essencialmente, ou consistem nos componentes listados. Similarmente, onde os processos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas do processo, os processos também consistem essencialmente ou consistem nas etapas de processamento listadas. Exceto onde indicado de outra ma- neira, a ordem das etapas ou ordem de realização de certas ações são irre- levantes com a condição de que a invenção permaneça operativa. Além dis- so, a menos que observado de outra maneira, duas ou mais etapas ou a - ções podem ser conduzidas simultaneamente.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos discutem a produção e caracterização e vários anticorpos monoclonais anti-hHGF.

Exemplo 1 - Produção de Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF

Este Exemplo descreve a produção de vários anticorpos mono- clonais anti-hHGF.

As imunizações, fusões e rastreamentos primários foram condu- zidos em MBS Inc. (Portland, ME), após o protocolo de Múltiplos Locais de Imunização Repetitiva (Repetitive Immunization Multiple Sites (RIMMS)). Cinco camundongos AJ e cinco camundongos Balb/c foram imunizados com HGF humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN; N9 de catálo- go 294-HGN-025). Dois camundongos com soros apresentando as maiores atividades anti-HGF por Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA) foram escolhidos para fusão subsequente. Os baços e nodos linfáticos dos camundongos apropriados foram coletados. As células B foram então colhi- das e fundidas com uma linhagem de mieloma. Os produtos de fusão foram diluídos seriadamente em uma ou mais placas até próximo da clonalidade.

Os sobrenadantes das fusões resultantes foram examinados quanto a sua ligação a hHGF por ELISA. Os sobrenadantes identificados como contendo anticorpos para HGF foram caracterizados posteriormente por um teste fun- cional in vitro discutido nos exemplos seguintes. Um painel de hibridomas foi selecionado e os hibridomas foram subclonados e expandidos. Os anticor- pos monoclonais foram então purificados por cromatografia de afinidade so- bre resina de Proteína A/G sob condições usuais.

Exemplo 2 - Análise de Seqüência de Anticorpos Monoclonais anti-hHGF Este exemplo descreve as análises de isótipo e seqüência dos anticorpos monoclonais anti-hHGF produzidos no Exemplo 1.

a. Determinação dos Isótipos dos Anticorpos Monoclonais Murinos de HGF

O tipo de cadeia leve e o isótipo de cadeia pesada de cada anti- corpo monoclonal foram determinados usando o kit IsoStrip Mouse Mono- clonal Antibody Isotyping de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science).

Foi determinado que todos os anticorpos continham uma cadeia leve capa de imunoglobulina e uma cadeia pesada de imunoglobulina de IgGI.

b. Determinação das Seqüências de Nucleotídeo que Codificam as Regiões Variáveis de Cadeia Pesada e Leve

O RNA total foi extraído de cada linhagem celular de hibridoma monoclonal usando o kit RNeasy Miniprep de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen Venlo, Holanda). A primeira fita de cDNA de extensão completa foi gerada usando o kit de amplificação de cDNA BD SMART® RACE de acordo com as instruções do fabricante (CIontech) usando os inici- adores de oligonucleotídeo BD SMART Il A (5' aagcagtggtatcaacgcagag- tacgcggg 3') (SEQ ID NO. 85) e o iniciador 5'-RACE CDS (5' ttttttttttttttttttt ttttttvn 3', onde ν = a, g, ou c e η = a, g, c, ou t) (SEQ ID NO. 86) com a fina- lidade de 5' RACE (Rápida Amplificação das Extremidades do cDNA).

As regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina Pesada (IgGI) e Capa foram amplificadas por PCR (Reação em Cadeia da Polime- rase) usando o Sistema Expand High-Fidelity PCR System (Roche Applied Science) de acordo com as instruções do fabricante. As regiões variáveis de cadeia pesada foram amplificadas com a mistura de iniciadores de oligonu- cleotídeo 5' Universal Primer Mix A (mistura de 5' ctaatacgactcactatagggca agcagtggtatcaacgcagagt 3' (SEQ ID NO. 87) e 5' ctaatacgactcactatagggc 3'(SEQ ID NO. 88)) e um 3' iniciador específico para a região constante de IgGI1 ou 5' tatgcaaggcttacaaccaca 3' (SEQ ID NO. 89) ou 5' gccagtggataga cagatgggggtgtcg 3' (SEQ ID NO. 90). As regiões variáveis de cadeia Capa foram amplificadas com a mistura de iniciador de oligonucleotídeo 5' Univer- sal Primer Mix A e um iniciador específico para a Região Constante Capa 3', ou 5' ctcattcctgttgaagctcttgacaat 3' (SEQ ID NO. 91) ou 5' cgactgaggcacctc- cagatgtt 3' (SEQ ID NO. 92).

Os produtos de PCR individuais foram fracionados por eletrofo- rese em gel de agarose e purificados usando o kit Qiaquick Gel Purification de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). Os produtos de PCR foram subseqüentemente clonados no plasmídeo pCR2.1 TOPO usando o kit de clonagem baseado em topoisomerase TOPO TA Cloning® Kit (com o vetor pCR®2.1-T0P0®) de acordo com as instruções do fabricante (Invitro- gen, Carlsbad, CA) e transformados em bactérias DH5 usando técnicas de transformação usuais. O DNA de plasmídeo isolado dos clones bacterianos transformados foi sequenciado usando os iniciadores de T7 (5' TAATACG ACTCACTATAGGG 3') (SEQ ID NO. 93), de M13 de sentido direto (5' GTA AAACGACGGCCAGT 3') (SEQ ID NO. 94), e de M13 de sentido reverso (5' CAGGAAACAGCTATGACC 3') (SEQ ID NO. 95) por Agencourt Bioscience usando métodos de sequenciamento de didesoxi DNA usuais para identificar a seqüência das seqüências da região variável. As seqüências foram anali- sadas usando o programa Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o servidor da internet IMGT/V-Quest (http://imgt.cines.fr/textes/vquest) para identificar e confirmar as seqüências da região variável.

c. Determinação das seqüências de nucleotídeo que codificam as seqüên- cias da região constante da cadeia pesada e leve de imunoglobulina para as cadeias capa e de IqGI de 1A3, 1D3. 1F3, e 2B8

cDNAs de extensão completa para as cadeias de IgGI de 1A3, 1D3, e 1F3 foram amplificados por PCR a partir do cDNA criado acima u- sando o seguinte iniciador de sentido direto 5' ggggacaagtttgtacaaaaaag caggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3' (códon de início sublinhado) (SEQ ID NO. 96) e o iniciador de sentido reverso 5' ggggaccactttgtacaagaa agctgggttçatttaccaggagagtgggagagg 3' (códon de parada sublinhado) (SEQ ID NO. 97). cDNA de extensão completa para a cadeia de IgGI de 2B8 foi amplificada a partir do cDNA criado acima usando o seguinte iniciador de sentido direto 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatc atcctcttt 3' (códon de início sublinhado) (SEQ ID NO. 98) e iniciador de senti- do reverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttçatttaccaggagagtgggagag 3' (códon de parada sublinhado) (SEQ ID NO. 99).

cDNA de extensão completa para a cadeia Capa de 2B8 foi am- plificado usando o seguinte iniciador de sentido direto 5' ggggacaagtttgtaca aaaaagcaggctgccaccatggaatcacagactctggtcttcata 3' (códon de início subli- nhado) (SEQ ID NO. 100) e o iniciador de sentido reverso 5' ggggaccactttg tacaagaaagctgggtçtaacactcattcctgttgaagctc 3' (códon de parada sublinhado) (SEQ ID NO. 101). Os fragmentos de PCR foram subclonados em pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por reação de recombinação Gateway BP (Invitrogen, Carlsbad, CA) e sequenciados por Agencourt Bioscience u- sando métodos de sequenciamento de didesoxi DNA usuais para identificar a seqüência da região constante e confirmar adicionalmente as seqüências da região variável.

d. Análise de seqüência

As regiões variáveis (texto normal) foram identificadas usando o servidor da internet IMGT/V-QUEST (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/). As seqüências de Peptídeo de Sinal foram previstas com base na identificação do códon de início in frame (ATG) que estava à montante da Região Variável identificada. As seqüências de peptídeo de sinal foram identificadas e estão sublinhadas abaixo.

O último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variável/constante. Este nu- cleotídeo está incluído na região variável porque ele é parte deste éxon. As seqüências de aminoácido das regiões constantes listadas abaixo incluem a tradução deste códon de junção.

A fim de criar as seqüências do anticorpo da cadeia pesada ou capa completas, as seqüências da região variável observadas abaixo são combinadas com suas respectivas seqüências da região constante (as se- quências de sinal estão sublinhadas).

(1) Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 (SEQ ID NO. 1)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtqtqaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc

121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca

241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat

361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc

421 tcag

(2) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 1A3 (SEQ ID NO. 3)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt

61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc

121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag

181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca

241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct

301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg

361 gggaccaagc tggaaataaa ac

(3) Região Variável da Cadeia Pesada de 2B8 (SEQ ID NO. 11)

1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag

61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc

121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct

181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg

301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag

(4) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 2B8 (SEQ ID NO. 13)

1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg

61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc

121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca

181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat

241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct

301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg

361 gggaccaggc tggaaataaa ac

(5) Região Variável da Cadeia Pesada de 2F8 (SEQ ID NO. 21) 1 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag

61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc

121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct

181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat

241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg

301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg

361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag

(6) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 2F8 (SEQ ID NO. 23)

1 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt

61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc

121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac

181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct

241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat

301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc

361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac

(7) Região Variável da Cadeia Pesada de 3B6 (SEQ ID NO. 31)

1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag

61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc

121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct

181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat

241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg

301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg

361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag

(8) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 3B6 (2 possíveis códons de início ATG (letras maiúsculas)) (SEQ ID NO. 33)

1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc

61 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga

121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag

181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc

241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg

301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc

361 ggagggggga ccaagctgga aataaagc (9) 3D11 Região Variável da Cadeia Pesada (SEQ ID NO. 41)

1 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag

61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact

121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca

181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg

241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa

301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct

3-61 tac-tggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag

(10) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 3D11 (SEQ ID

NO. 43)

1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaac

(11) Região Variável da Cadeia Pesada de 1D3 (SEQ ID NO. 51)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc

121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca

241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat

361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc

421 tcag

(12) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 1D3 (SEQ ID NO.

53)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt

61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc

121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag

181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct

301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg

361 gggaccaaac tggaaataaa ac

(13) Região Variável da Cadeia Pesada de 1F3 (SEQ ID NO. 61)

51 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc

121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca

181 -gagaagaggc. tggagtgggt cgcatatatt .agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca

241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat

3 61 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc

421 tcag

(14) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 1F3 (SEQ ID NO.

63)

151 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt

61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc

121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag

181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca

241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct

301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg

361 gggaccagac tggaaattaa ac

(15) Região Variável da Cadeia Pesada de 3A12 (SEQ ID NO.

71)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc

121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca

241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat

361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc

421 tcag

(16) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 3A12 (seo id NO. 73) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa ac

(17) Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI de Camun- donoo de Referência (J00453) (SEQ ID NO. 81)

1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg

61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc

121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc

181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagccc

241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga

301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt

361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc

421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg

481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa

541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa

601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc

661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca

721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat

781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat

841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg

901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac

961 ctcctggtaa atga

(18) Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI de Camun- dongo Determinada para 1A3. 1D3, 1F3, e 2B8 (derivada de camundonoo da cepa AJ) (SEQ ID NO. 82)

1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct

atctgctgcc tgagccagtg agctgtcctg tcggcccagc caagaaaatt atcatctgtc taaggtcacg gtttgtagat cagcactttc ggagttcaaa caaaaccaaa gatggccaag tactgtggag catgaacacg ggaggcagga tgagaagagc

caaactaact acagtgacct gagtctgacc gagaccgtca gtgcccaggg ttcatcttcc tgtgttgtgg gatgtggagg cgctcagtca tgcagggtca ggcagaccga gataaagtca tggcagtgga aatggctctt aatactttca ctctcccact 121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc 181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga

(19) Região Constante da Cadeia Leve Capa de Camundonqo de Referência (V00807) e Região Constante da Cadeia Leve Capa de Ca- mundonqo Determinada para 1D3. 1F3. e 2B8 (derivada de camundongo da cepa AJ) (SEQ ID NO. 83)

1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag

(20) Região Constante da Cadeia Leve Capa de Camundongo Determinada para 1A3 contendo um nucleotídeo alterado em comparação com 1D3. 1F3. e 2B8 (sublinhados) (SEQ ID NO. 84)

1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag

Cada uma das seqüências de aminoácido que define as regiões variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina para os anticorpos produzidos no Exemplo 1 é descrita na Figura 2. Cada uma das seqüências é alinhada com as outras e as seqüências que definem o peptídeo de sinal, CDR1, C- DR2 e CDR3 são identificadas por quadrados. A Figura 3 mostra um alinha- mento das seqüências de CDRi, CDR2 e CDR3 separadas para cada um dos anticorpos.

Cada uma das seqüências de aminoácido que define as regiões variáveis da cadeia leve de imunoglobulina para cada um dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 é descrita na Figura 4. Cada uma das seqüências é alinhada com as outras e as seqüências que definem o peptídeo de sinal, CDR1, CDR2 e CDR3 são identificadas por quadrados. A Figura 5 mostra um alinhamento das seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 separadas para cada um dos anticorpos.

Por conveniência, a Tabela 1 fornece um quadro de concordân- cia que mostra a correspondência entre as seqüências de anticorpo discuti- das neste Exemplo com aquelas apresentadas na Listagem de Seqüência.

TABELA 1

<table>table see original document page 43</column></row><table> SEQ. ID NO. Proteína ou Acido Nucléico 19 CDR2da Cadeia Leve (capa) de 2B8 20 CDR3 da Cadeia Leve (capa) de 2B8 21 Região Variável da Cadeia Pesada de 2F8 - ácido nucléico 22 Região Variável da Cadeia Pesada de 2F8 - proteína 23 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 2F8 - ácido nucléico 24 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 2F8 - proteína 25 CDRi da Cadeia Pesada de 2F8 26 CDR2 da Cadeia Pesada de 2F8 27 CDR3 da Cadeia Pesada de 2F8 28 CDR1 da Cadeia Leve (capa) de 2F8 29 CDR2 da Cadeia Leve (capa) de 2F8 30 CDR3 da Cadeia Leve (capa) de 2F8 31 Região Variável da Cadeia Pesada de 3B6 - ácido nucléico 32 Região Variável da Cadeia Pesada de 3B6 - proteína 33 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 3B6 - ácido nucléico 34 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 3B6 - proteína 35 CDR1 da Cadeia Pesada de 3B6 36 CDR2 da Cadeia Pesada de 3B6 37 CDR3 da Cadeia Pesada de 3B6 38 CDR1 da Cadeia Leve (capa) de 3B6 39 CDR2 da Cadeia Leve (capa) de 3B6 40 CDR3 da Cadeia Leve (capa) de 3B6 41 Região Variável da Cadeia Pesada de 3D11 - ácido nucléico 42 Região Variável da Cadeia Pesada de 3D11 - proteína 43 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 3D11 - ácido nucléico 44 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 3D11 - proteína 45 CDR1 da Cadeia Pesada de 3D11 46 CDR2 da Cadeia Pesada de 3D11 47 CDR3 da Cadeia Pesada de 3D11 48 CDR1 da Cadeia Leve (capa) de 3D11 49 CDR2 da Cadeia Leve (capa) de 3D11 50 CDR3 da Cadeia Leve (capa) de 3D11 51 Região Variável da Cadeia Pesada de 1D3 - ácido nucléico 52 Região Variável da Cadeia Pesada de 1D3 - proteína 53 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 1D3 - ácido nucléico 54 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 1D3 - proteína 55 CDR1 da Cadeia Pesada de 1D3 56 CDR2 da Cadeia Pesada de 1D3 57 CDR3 da Cadeia Pesada de 1D3 58 CDR1 da Cadeia Leve (capa) de 1D3 59 CDR2 da Cadeia Leve (capa) de 1D3 60 CDR3 da Cadeia Leve (capa) de 1D3 61 Região Variável da Cadeia Pesada de 1F3 - ácido nucléico 62 Região Variável da Cadeia Pesada de 1F3 - proteína 63 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 1F3 - ácido nucléico 64 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 1F3 - proteína 65 CDR1 da Cadeia Pesada de 1F3 66 CDR2 da Cadeia Pesada de 1F3 67 CDR3 da Cadeia Pesada de 1F3 SEQ. ID NO. Proteína ou Acido Nucléico 68 CDR1 da Cadeia Leve (capa) de 1F3 69 CDR2 da Cadeia Leve (capa) de 1F3 70 CDR3 da Cadeia Leve (capa) de 1F3 71 Região Variável da Cadeia Pesada de 3A12 - ácido nucléico 72 Região Variável da Cadeia Pesada de 3A12 - proteína 73 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 3A12 - ácido nucléico 74 Região Variável da Cadeia Leve (capa) de 3A12 - proteína 75 CDR1 da Cadeia Pesada de 3A12 76 CDR2 da Cadeia Pesada de 3A12 77 CDR3 da Cadeia Pesada de 3A12 78 CDR1 da Cadeia Leve (capa) de 3A12 79 CDR2 da Cadeia Leve (capa) de 3A12 80 CDR3 da Cadeia Leve (capa) de 3A12

Também, por conveniência, as seguintes seqüências represen- tam as seqüências de cadeia pesada e leve de extensão completa reais ou contempladas (isto é, contendo ambas as seqüências da região variável e constante) para cada um dos anticorpos descritos neste Exemplo. Observa- se que as regiões constantes dos anticorpos murinos 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11 não foram sequenciadas, mas supõe-se que tenham as mesmas se- qüências de região constante que os anticorpos 1D3, 1F3, e 2B8, os quais foram sequenciados, já que eles todos foram derivados do camundongo da cepa AJ. É observado, entretanto, que as seqüências da região variável descritas aqui podem ser ligadas a cada uma de várias seqüências de região constante conhecidas daqueles versados na técnica para produzir cadeias pesadas e leves ativas de imunoglobulina de extensão completa.

(1) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 e Região Constante de IqGD (seqüência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 122)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc

121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca

241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat

361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga

(2) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 e Região Constante de IqGD (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 123)

1 evqlvesggg lvqpggslkl scaaseftfs nyymswvrqt pekrlqwvay ispgggssyy 61 pasvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycarqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc wvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvrisaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk

(3) Seguência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seguência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável Capa e Região Constante de 1A3) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 124) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcatg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag

(4) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável Capa e Região Cons- tante) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 125)

1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvya atnladgvps

61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgtyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp

121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlm

181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(5) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 2B8) (seguência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 126)

1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag

61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc

121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct

181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg

301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg

421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg

481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt

1381 aaatga

(6) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 2B8) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 127)

1 qvqlqqpgae lvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp 241 kpkdvltitl tpkvtcvwd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk

(7) Seqüência de Ácido Nucléico caie Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 (Re- gião Variável Capa e Região Constante de 2B8) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 128)

1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (8) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 ÍReaião Variável Caoa e Reaião Cons- tante de 2B8) (sem seauência de sinal) ÍSEQ ID NO. 129) 1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenw syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (9) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2F8 (Reqião Variável da Cadeia Pesada e Reqião Constante de IaG 1 de 2F8) (seqüência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 130) 1 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct

541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1381 aaatga

(10) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 2F8) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 131)

1 qvqlkqsgae lvrpgtsvkm sckasgytft tyyihwvnqr pgqglewigk igpgsgstyy 61 nemfkdkatl tvdtssstay mqlssltsdd savyfcarrg lgrgfdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp 241 kpkdvltitl tpkvtcvwd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk

(11) Seguência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seqüência da

Cadeia Leve de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável Capa e Região Constante de 2F8) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 132)

1 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct

241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat

301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc

361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc

421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg

481 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa

541 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc

601 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc

661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag

(12) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável Capa e Região Cons- tante de 2F8) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 133)

1 divltqspas lavslgqrat isckasqsvd ydgnsyinwy qqkpgqppkv liyvasnles

61 giparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqqsiedpp tfgagtklel kradaaptvs

121 ifppsseqlt sggaswcfl nnfypkdinv kwkidgserq ngvlnswtdq dskdstysms

181 stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec

(13) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 3B6) (seguência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 134)

1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag

61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc

121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct

181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat

241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg

301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg

361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc

421 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc

481 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg

541 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc

601 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc

661 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 721 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 781 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 841 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 901 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 961 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1021 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1081 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1141 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1201 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1261 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1321 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1381 cctggtaaat ga

(14) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 3B6) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 135)

1 qvqlqqsgae lvrpgssvki sckasgyvfs sywmnwvkqr pgqglewigq iypgdgdsny 61 ngnfkgkatl tadkssstay mqlssltsed savyfcasql glrenyfdyw gqgttltvss 121 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd 181 lytlsssvtv psstwpsetv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif 241 ppkpkdvlti tltpkvtcw vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv 301 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv 361 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf 421 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk

(15) Seguência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seguência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável Capa e Região Constante de 3B6) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 136)

1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 61 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc

361 ggagggggga ccaagctgga aataaagcgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc

421 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac

481 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc

541 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc

601 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac

661 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta g

(16) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável Capa e Região Cons- tante de 3B6) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 137)

1 dikmtqspss myaslgervt itckasqdik sylswfqqkp gkspktliyr vnrlvdgvps 61 rfsgsgsgqd ssltitslen edmgiyyclq ydefpftfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(17) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 3D11) (seqüência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 138)

1 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc 421 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg 481 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc 541 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg 601 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc 661 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata 721 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc 781 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc 841 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc 901 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag 961 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc 1021 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt 1081 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac 1141 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac 1201 aagaacactc agcccatcat ggacacagat ggctcttact tcgtctacag caagctcaat 1261 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc 1321 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc tcccactctc ctggtaaatg a

(18) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 3D11) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 139)

1 qvqlkesgpg lvapsqslsi tctvsgfslt syslhwvrqp pgkglewlgv iwaggntnyn 61 sslmsrltir kdnsksqvfl kmnslqtddt amyycarerf aywgqgtlvt vsaakttpps 121 vyplapgsaa qtnsmvtlgc lvkgyfpepv tvtwnsgsls sgvhtfpavl qsdlytlsss 181 vtvpsstwps etvtcnvahp asstkvdkki vprdcgckpc ictvpevssv fifppkpkdv 241 ltitltpkvt cvwdiskdd pevqfswfvd dvevhtaqtq preeqfnstf rsvselpimh 301 qdwlngkefk crvnsaafpa piektisktk grpkapqvyt ipppkeqmak dkvsltcmit 361 dffpeditve wqwngqpaen ykntqpimdt dgsyfvyskl nvqksnweag ntftcsvlhe 421 glhnhhteks lshspgk

(19) Seguência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seguência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável Capa e Regi- ão Constante de 3D11) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 140)

1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 421 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 481 taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc

541 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc

601 acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag

661 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag

(20) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável Capa e Região Cons- tante de 3D11) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 141)

1 givltqspai msaypgekvt mtcsasssvs ymhwyqqksg tspkrwiydt sklasgvpar 61 fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpltfgag tklelkrada aptvsifpps 121 seqltsggas wcflnnfyp kdinvkwkid gserqngvln swtdqdskds tysmsstltl 181 tkdeyerhns ytceathkts tspivksfnr nec

(21) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 1D3) (seqüência de sinal sublinha-

da) (SEQ 1 ID NO. 142) atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga

(22) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 1D3) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 143)

1 evqlvesggg lvqpggslkl scaasgftfs dyymswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmsslksed taiyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsviv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vwdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk

(23) Seguência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seguência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável Capa e Região Constante de 1D3) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 144)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag

(24) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável Capa e Região Cons- tante de 1D3) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 145)

1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcrtseniy snlawyqqkq gkspqlliya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslrinslqs edfgryycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(25) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 1F3) (seqüência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 146)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag

1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc

1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact

1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc

1381 cactctcctg gtaaatga

(26) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqG1 de 1F3) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 147)

1 evqlvesggg lvqsggslkl scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy

61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv

121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq

181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf

241 ifppkpkdvl titltpkvtc vwdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr

301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd

361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn

421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk

(27) Seguência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seguência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável Capa e Região Constante de 1F3) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 148)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (28) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável Capa e Região Cons- tante de 1F3) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 149)

1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvyd athlpdgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

(29) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 3A12) (seqüência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 150)

1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa

61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc

121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca

181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca

241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg

301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat

3 61 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc

421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact

481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg

541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct

601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc

661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc

721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc

781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt

841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg

901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca

961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg

1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga

1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa

1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag

1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 12 61 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga

(30) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável da Cadeia Pesada

e Região Constante de IqGI de 3A12) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 151)

1 evqlvesggg lvqpggslki scaasgftfs nyfmswvrqt_pekrlewvay issgggstyy

61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmnslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv

121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq

181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf

241 ifppkpkdvl titltpkvtc vwdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr

301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd

361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk

(31) Seguência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável Capa e Regi- ão Constante de 3A12) (seouência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 152)

1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag

(32) Seguência de Proteína gue Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável Capa e Região Cons- tante de 3A12) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 153)

1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy inlawyqqkq gkspqllvha atkladgvps

61 rfsgsgsgtq yslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp

121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt

181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

Por conveniência, a Tabela 2 fornece um quadro de concordân- cia que mostra a correspondência entre as seqüências de extensão comple- ta dos anticorpos_discutidos_neste Exemplo com aqueles, apresentados na Listagem de Seqüência.

TABELA 2

<table>table see original document page 61</column></row><table> Exemplo 3 - Produção de Várias Proteínas hHGF Recombinantes

Este Exemplo descreve a clonagem e expressão de várias prote- ínas recombinantes usadas para caracterizar os anticorpos criados no E- xemplo 1 e no Exemplo 14. Em particular, este Exemplo descreve a clona- gem e expressão da proteína hHGF recombinante, uma proteína hHGF re- combinante que contém uma substituição de glicina para glutamato na posi- ção 555 (G555E), uma proteína hHGF recombinante que contém uma subs- tituição de cisteína para arginina na posição 561 (C561R), uma proteína HGF quimérica camundongo-humano-camundongo (mhm) recombinante contendo a seqüência de HGF V495-L585 humana disposta dentro da se- qüência de HGF de camundongo, uma proteína de HGF quimérica mhm re- combinante contendo a seqüência de HGF I499-R566 humana disposta den- tro da seqüência de HGF de camundongo, e uma proteína de HGF quiméri- ca mhm recombinante contendo a seqüência de HGF W507-L585 humana disposta dentro da seqüência de HGF de camundongo.

Os seguintes construtos de expressão foram gerados usando técnicas moleculares usuais e as seqüências de cDNA resultantes foram confirmadas por sequenciamento de DNA:

a. hHGF-Fc

Em um primeiro ciclo de PCR, dois fragmentos de PCR sobre- poníveis foram gerados introduzindo um sítio de Not I e codificando um sina- Iizador 6xHis entre hHGF e hlgFc. Os fragmentos de PCR sobreponíveis serviram como molde em um segundo ciclo para amplificar hHGF-his-lgFc. O fragmento resultante foi digerido por Nhel e BamHI e clonado em pcD- NA5/FRT (Invitrogen, #35-3014). Então, hHGF foi amplificado a partir do clo- ne ID: IOH29794 (cDNA de HGF humano) da Invitrogen. A seqüência cor- respondeu à seqüência depositada no NCBI sob o número de acesso NM_000601.4.

(1) Iniciador de Nhel de hHGF5'

ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT (SEQ ID NO. 102)

(2) IniciadordeHisTag de Notl hHGF 3'

GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTATATG (SEQ ID NO. 103)

(3) Iniciador de HisIgFc 5'

ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO. 104)

(4) Iniciador de BamHI de IaFc 3'

ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG (SEQ ID NO. 105)

b. G555E de hHGF-Fc e C561R de hHGF-Fc

Os mutantes de hHGF-Fc, G555E e C561R, foram gerados por mutagênese sítio-dirigida usando o kit de mutagênese sítio-dirigida Quik- Change II XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. (1) Iniciador senso de hHGF-Fc (G555E)

CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG (SEQ ID NO. 106)

(2) Iniciador anti-senso de hHGF-Fc (G555E)

CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG (SEQ ID NO. 107)

(3) Iniciadorsensode hHGF-Fc (C561R)

GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG (SEQ ID NO. 108)

(4) Iniciador anti-senso de hHGF-Fc (C561R)

CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC (SEQ ID NO. 109)

c. Fc quimérico camundogno-humano-camundonqo

O construto de IgFc quimérico camundongo-humano-camun- dongo contém uma cadeia-alfa de mHGF, aminoácidos da cadeia β Val 495- Leu 585 de HGF humano, e a cadeia beta C-terminal de mHGF seguido por sinalizador 6xHis e IgG-Fc.

cDNA de HGF humano que codifica os aminoácidos V495-L585 foi amplificado a partir do clone ID: IOH29794 (cDNA de HGF humano) da Invitrogen. A seqüência corresponde à seqüência depositada no NCBI sob o número de acesso NM_000601.4. Seqüências de HGF de camundongo fo- ram amplificadas por RT-PCR a partir de RNA total de fígado de camundon- go (Clontech, # 636603) usando o kit de RT-PCR Super Script One Step da Invitrogen (#10928-034) de acordo com as instruções do fabricante. A se- quência de cDNA de mHGF corresponde à seqüência depositada no NCBI sob o número de acesso D10213.1.

Três fragmentos, referidos como 1, 2 e 3 foram gerados usando iniciadores de PCR sobreponíveis e anelados em ciclos consecutivos de amplificação por PCR. O produto final foi clivado com Nhel e Notl e clonado em pcDNA5/FRT IgGFc.

(1) Iniciadores do fragmento 1 para Nhel 5' da cadeia alfa de mHGF 5'ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC (SEQ ID NO. 110)

3' GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG (SEQ ID NO. 111)

(2) Iniciadores do fragmento 2 para aa V495-L585 da cadeia alfa de hHGF 5'JCCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC (SEQ ID NO. 112) 3' CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT (SEQ ID NO. 113)

(3) Iniciadores do fragmento 3 para Notl3' C-terminal da cadeia beta de mHGF

5' AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG (SEQ ID NO. 114)

3' GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO. 115)

d. Construção de quimeras de hHGF e mhm

Os vetores que codificam as quimeras de hHGF e mhm (V495- L585), pcDNA5/FRT hHGF e quimera pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585), sem Fc-tag foram gerados por mutagênese sítio-dirigida. Um códon de parada foi introduzido a 3' de 6xHis usando o kit de mutagênese sítio-dirigida Quik- Change Il XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores da mutagênese incluíram o iniciador 1:

CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCTGGTGCCACG (SEQ ID NO. 116), e o Iniciador 2:

CGTGGCACCAGACCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATG (SEQ ID NO. 117).

Além disso, duas quimeras de mhm adicionais foram criadas a partir do construto de pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585) por mutagênese sítio- dirigida usando o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange Il XL (Strata- gene) de acordo com as instruções do fabricante. Um construto de mhm continha a região de I499-R556 de hHGF disposta entre as seqüências mu· rinas. O outro construto de mhm continha a região de W507-L585 de hHGF disposta entre as seqüências murinas.

Para a quimera de mhm (I499-R556), as seguintes mutações pontuais foram feitas em ordem no construto molde da quimera pcD- NA5/FRT-mhm (V495-L585): D558E, C561R, V564I, V567I e M583L, usando as seqüências de oligonucleotídeo apropriadas. Para a quimera de mhm (W507-L585), as seguintes mutações pontuais foram introduzidas em uma etapa na quimera molde pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585): Q502R, N504T e I505V, usando as seqüências de oligonucleotídeoapropriadas.

A seqüência de nucleotídeo resultante da proteína hHGF-Fc é descrita como SEQ ID NO. 118, incluindo a seqüência de sinal (nucleotídeos 1-93) e pró-domínio (nucleotídeos 94 a 162). A seqüência de aminoácido da proteína hHGF-Fc é descrita como SEQ ID NO. 119.

A seqüência de nucleotídeo resultante que codifica a proteína mhm (V495-L585)-Fc quimérica é descrita em SEQ ID NO. 120, incluindo a seqüência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97 a 165). A seqüência de aminoácido da proteína quimérica mhm (V495-L585)- Fc é descrita em SEQ ID NO. 121.

A seqüência de nucleotídeo resultante que codifica e a seqüên- cia de proteína que define o construto de mhm (V495-L585) são descritas em SEQ ID NOS. 211 e 212, respectivamente. A seqüência de ácido nucléi- co descrita em SEQ ID NO. 211 inclui a seqüência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97 a 165), e a seqüência de proteína des- crita em SEQ ID NO. 212 inclui a seqüência de proteína ativa (sem a se- qüência de sinal ou o pró-domínio). A seqüência de nucleotídeo resultante que codifica e a seqüência de proteína que define o construto de mhm (I499- R556) são descritas em SEQ ID NOS. 213 e 214, respectivamente. A se- qüência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NO. 213 inclui a seqüência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97-165), e a se- qüência de proteína descrita em SEQ ID NO. 214 inclui a seqüência de pro- teína ativa (sem a seqüência de sinal ou o pró-domínio). A seqüência de nu- cleotídeo resultante que codifica e a seqüência de proteína que define mhm (W507-L585) são descritas em SEQ ID NOS. 215 e 216, respectivamente. A seqüência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NO. 215 inclui a seqüência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97 a 165), e a seqüência de proteína descrita em SEQ ID NO. 216 inclui a seqüência de proteína ativa (sem a seqüência de sinal ou o pró-domínio).

e. Expressão de Proteína

(1) Cultura celular

Células CHO Flpln (Invitrogen, Ne de catálogo R758-07)) foram cultivadas em meio F12K (ATCC, N9 de catálogo 30-2004), 10% de FCS (In- vitrogen, N9 de catálogo 10438026), 1% de Penicilina (10000 unidades/mL)/ estreptomicina (10.000 Dg/mL) (Invitrogen, N9 de catálogo 15140-122) a 37°C, 5% de CO2,100 μg/mL de Zeocina (Invitrogen, N9 de catálogo R250-01).

(2) Geração de Linhagens Celulares CHO estáveis

As células hospedeiras CHO Flpln foram transfectadas com uma proporção 9:1 de DNA de plasmídeo de expressão pOG44:pcDNA5/FRT usando Iipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Invi- trogen, N9 de catálogo 11668-027). Como controles, as células foram trans- fectadas com o vetor vazio pcDNA5/FRT vetor/pOG44 e plasmídeo pOG44 (Invitrogen, N9 de catálogo 35-3018) apenas. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram repicadas, e após quarenta e oito horas 0,5 mg/mL de Higromicina B (Sigma, N9 de catálogo H0654-SPEC) foi adiciona- do às células. A seleção policlonal de células estáveis foi realizada em F12K, 10% de FCS, 1% de Penicilina/Estreptomicina, 0,5 mg/mL de Higromicina B.

(3) Expressão de proteína em linhagens celulares CHO Flpln estáveis

Aproximadamente 2x106 células foram semeadas em placas de 15 cm e cultivadas em F12K (ATCC, N9 de catálogo 30-2004)/DMEM com alto teor de glicose (Invitrogen, N9 de catálogo 11995065) 1:1, 5% de ultra Iow IgG FCS (Invitrogen, #16250-78) a 37°C, 5% de CO2 por 5 a 6 dias. Os sobrenadantes foram colhidos e as proteínas resultantes analisadas por E- LISA e por ressonância de plásmon de superfície.

Exemplo 4 - Características de ligação de Anticorpos Monoclonais Anti- hHGF

Os anticorpos monoclonais produzidos no Exemplo 1 foram ca- racterizados por sua habilidade de se ligar a hHGF, e algumas das proteínas HGF recombinantes produzidas no Exemplo 3.

Os anticorpos foram analisados por ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100 para avaliar sua habilidade de se ligar a HGF e algumas das proteínas de fusão discutidas no Exemplo 3. Cada anticorpo foi imobilizado sobre um chip sensor CM5 de dextrano carboxilado (BIAcore, N- de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de ami- na (BIAcore, N9 de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acopla- mento usual de acordo com as instruções do fabricante.

As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, Ns de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, Ne de ca- tálogo R-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N9 de catálogo 2930) e 10 mg/ml_ de Sal de Sódio CM-Dextran (Fluka, N9 de catálogo 86524) como tampão de corrida. Sobrenadantes contendo diferentes proteínas de fusão de HGF ou sobrenadante de células transfectadas com o vetor vazio foram injetados sobre cada anticorpo em uma taxa de fluxo de 30 μL/min por 3 minutos. A ligação resultante foi determinada como unidades de ressonância (RU) so- bre o basal 30 segundos após o final da injeção. A ligação foi comparada com HGF humano (R&D Systems, N9 de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida. Ligação inespecífica foi monitorada por comparar a liga- ção a uma superfície de controle onde IgG de camundongo (Rockland, N9 de catálogo 010-0102) foi imobilizada usando o mesmo procedimento de acoplamento de amina.

Os resultados estão resumidos na Tabela 3. TABELA 3

<table>table see original document page 68</column></row><table>

Os resultados na Tabela 3 demonstram que cada um dos anti- corpos se liga a rHGF e HGF humano purificado. Além disso, todos os anti- corpos se ligam a hHGF contendo as mutações pontuais G555E e C561R.

Em geral, todos os anticorpos exceto 1F3 e 2F8 não se ligam a murino de- monstrando que os anticorpos 1A3, 1D3, 2B8, 3A12, 3B6, e 3D11 se ligam especificamente a HGF humano. Os anticorpos 1D3, 1F3, e 2B8 se ligam à quimera de camundongo-humano-camundongo, enquanto que os anticorpos restantes não se ligaram. Os resultados sugerem que os anticorpos 1D3 e 2B8 se ligam pelo menos em parte aos resíduos 495 a 585 de HGF humano. Os anticorpos 1A3, 3A12, 3B6, e 3D11 parecem se ligar a porções de hHGF humano com exceção dos resíduos 495 a 585. No momento é não se sabe o motivo de 2F8 não se ligar à quimera de mhm já que ele parece se ligar tan- to a hHGF quanto mHGF.

Exemplo 5 - Habilidade dos Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF se Ligarem a HGF Reduzido e Não-Reduzido

Neste Exemplo, os anticorpos monoclonais anti-hHGF produzi- dos no Exemplo 1 foram analisados quanto a sua habilidade de se ligar a HGF reduzido e não reduzido.

A reatividade dos soros anti-HGF com o hHGF recombinante foi avaliada por immunoblotting. Oito μg de proteína hHGF recombinante em tampão de corrida NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen) com ou sem tampão redutor de amostra NuPAGE (Invitrogen) foram fracionados em um gel de Bis-Tris 4 a 12% com cavidades de 1,Omm X 2D (Invitrogen, Carlsbad1 CA). As proteínas fracionadas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando procedimentos usuais. As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com solução de leite em pó desnatado a 5% em Salina Tamponada com Tris com 0,1% de Tween-20® (TBST), e então colocadas em um equipamento Mini Protean Il Multi-Screen (BioRad) para bloqueio adicional.

As membranas resultantes foram marcadas com os anticorpos purificados em um equipamento Multi-Screen. Os anticorpos purificados fo- ram diluídos para 5 μg/mL. em tampão de bloqueio. A membrana de nitroce- lulose foi então removida do equipamento, e incubada com anticorpos anti- IgG de camundongo marcada com peroxidase de rábano silvestre. Os resul- tados estão resumidos na Tabela 4, onde os números refletem a extensão de ligação com - representando a ligação mínina (pouca ou nenhuma Iiga- ção) e 3+ representando a ligação máxima.

TABELA 4

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Os dados na Tabela 4 demonstram que todos os anticorpos se ligam a rhHGF não-reduzido. Em oposição, os anticorpos monoclonais 1A3, 1D3, 1F3, 2F8, 3B6 se ligaram a rhHGF reduzido mas os anticorpos 2B8, 3A12, e 3D11 não se ligaram a rhHGF.

Exemplo 6 - Afinidades de Ligação

As afinidades de ligação e cinéticas de interação de cada um dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 contra hHGF foram medidas por ressonância de plásmon de superfície.

Imunoglobulinas de coelho anti-camundongo (BIAcore, Nq de catálogo BR-1005-14) foram imobilizadas sobre chips sensores CM5 de dex- tran carboxilado (BIAcore, N9 de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N9 de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo usual de acordo com as instruções do fabricante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N9 de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tenso- ativo P20 (BIAcore, N9 de catálogo BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N9 de catálogo 2930), e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextran (Fluka, N9 de catálogo 86524) como tampão de corrida.

Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo indivi- dual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável pa- ra cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo captu- rado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N9 de catálogo 294- HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado seqüencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a super- fície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dis- sociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentra- ção. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCI, pH 1,7 (BIAcore, N9 de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.

Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BIAevaIutation com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo ka (constante da taxa de associ- ação), kd (constante da taxa de dissociação) e K0 (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 5.

TABELA 5

<table>table see original document page 70</column></row><table>

Os dados na Tabela 5 demonstram que os anticorpos se ligam a hHGF com um Kd de cerca de 100 pM ou menos, cerca de 50 pM ou menos, ou 20 pM ou menos.

Exemplo 7 - Atividade de Neutralização de Anticorpos Anti-hHGF

Neste exemplo, os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram 5 caracterizados quanto a sua habilidade de (a) inibir a ligação de hHGF a c- Met1 e (b) inibir a incorporação de BrdU estimulada por HGF em células 4MBr-5.

a. Ensaio de Inibicão de Ligação de HGF-Met (Ensaio de Neutralização)

Os anticorpos foram testados por ELISA quanto a sua habilidade de inibir a ligação de hHGF a c-Met.

Especificamente, placas de ensaio DELFIA de 96 cavidades Wallac (Wallac Inc., Ns de catálogo AAAND-0001) foram revestidas com 100 μl de HGF a 6,25 μg/mL (R&D Systems, Nq de catálogo 294-HGN-025) em tampão de revestimento de carbonato (15 mM de NaaCO3 e 34 mM de NaHCO3, pH 9,0) por 16 horas a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 200 μί de leite em pó desnatado a 5% em PBS por 1 hora em tempera- tura ambiente. Os anticorpos foram preparados em uma placa separada por adicionar concentrações crescentes dos anticorpos sob investigação (0,033 a 667 nM, diluição seriada de 3 vezes) a 2 nM de c-Met (R&D Systems, N9 de catálogo 358-MT/CF) em leite em pó desnatado a 5% em PBS. 100 μί de amostra por cavidade foram transferidos para a placa de ensaio e incubados durante a noite a 4°C. As placas de ensaio foram então lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubados por 2 horas em temperatura am- biente com 100 μL/cavidade de anticorpo anti-c-Met humano biotinilado a 2 μg/mL (R&D Systems, Nq de catálogo BAF358) preparado em leite em pó desnatado a 5% em PBS.

As placas resultantes foram então lavadas três vezes com PBS- 0,1% de Tween 20, e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com Es- treptavidina marcada com Eu (Wallac, Nq de catálogo 1244-360) diluída 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Wallac, N- de catálogo 4002-0010).

As placas resultantes foram lavadas 3 vezes com solução de lavagem DEL- FIA (Wallac, N9 de catálogo 4010-0010) e incubadas com 100 μL/cavidade de solução de intensificação DELFIA (Wallac #4001-0010) por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação.

As placas foram lidas em um instrumento Victor3V (Perkin Elmer) usando o método de Európio. Os valores de IC50 foram calculados e estão resumidos na Tabela 6.

TABELA 6

<table>table see original document page 72</column></row><table>

Os resultados demonstram que todos os anticorpos (isto é, 1D3, 1A3, 2B8, 3A12, 1F3, 3D11, e 2F8) com exceção de 3B6 neutralizam efi- cazmente a ligação de HGF a c-Met.

b. Neutralização da Incorporação de BrdU Estimulada por HGF em células 4MBr-5

Dez μL de 12,5 nM de hHGF foram dispensados em cavidades individuais de uma placa de microtitulação de cultura de tecido de 96 cavi- dades (Costar, Nq de catálogo 3903). Dez μΙ_ de anticorpos foram diluídos seriadamente em concentrações de 6667; 2222; 740; 247; 82; 27; 9,1; 3,0; 1,0; 0,33 nM foram adicionados a cada cavidade. A mistura de anticorpo de HGF foi então incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Células epiteliais brônquicas de macaco 4MBr-5 (ATCC, CCL208) cultivadas em F- 12K (ATCC, 30-2004), 15% de FBS (Gibco 10438-026), 30 ng/mL de EGF (Sigma E9644), 1% de penicilina/estreptomicina (PS, Gibco N5 de catálogo 15140-122) foram dissociadas com Tripsina (Gibco, N2 de catálogo 25200- 056), ressuspensas em meio de ensaio (F-12K, 2,5% de FBS, 1% de PS) a 75.000 células/mL, e 80 μΙ_ da suspensão celular foi dispensada à mistura de anticorpo de HGF.

As células resultantes foram incubadas a 37°C, 5% de CO2- Quarenta e oito horas depois, 10 μί de BrdU a 100 μΜ (Roche, N9 de catá- logo 1669915) foram adicionados. Setenta e duas horas depois, o meio foi removido, as placas foram secas com secador de cabelo e foram processa- das com ELISA de BrdU de acordo com as instruções do fabricante (Roche N9 de catálogo 1669915).

O sinal Iuminescente foi quantificado por um leitor de placas Sy- nergy HT (Bio-Tek). Os dados foram ajustados para uma dose-resposta sig- moide com inclinação, variável com a equação, y = inferior + .(superior- inferior)/(1+10A(log(EC50-x)*inclinação)) em GraphPad Prism (GraphPad Software). Cada experimento foi repetido pelo menos 3 vezes em duplicatas e os valores de EC50 médios são apresentados na Tabela 7.

TABELA 7

<table>table see original document page 73</column></row><table>

Os resultados na Tabela 7 demonstram que todos os anticorpos 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11 inibem a proliferação induzida por HGF em células 4MBr-5.

Exemplo 8 - Atividade Antidisperão de Anticorpos Anti-hHGF

Este Exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos pro- duzidos no Exemplo 1 quanto a sua habilidade de inibir a atividade de dis- persão induzida por HGF. HGF induz "dispersão" (motilidadê) de aglomera- dos em células MDCK (ATCC, Manassas, VA, N9 de catálogo CCL-34).

Células MDCK foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades Costar (Corning Incorporated, Corning, NY, N9 de catálogo 3595) em uma densidade de 4x103 células por cavidade em 80 μί de MEM (ATCC, Manassas, VA, Ne de catálogo 30-2003) contendo 10% de Soro Fe- tal Bovino (Invitrogen N9 de catálogo 10438026), e 1% de penicilina-estrepto- mcina (Invitrogen, Ne de catálogo 15140122). Cada um dos anticorpos a ser investigado foi diluído para 6.667 nM em MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1 % de penicilina-estreptomicina. Cada uma das diferentes diluições de anticorpo, assim como MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1% de penicilina-estreptomicina sem anticorpo, foi então combinada separadamen- te com um volume igual de MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1% de penicilina-estreptomicina, e 100 ng/ml de HGF (R&D Systems N9 de catá- logo 294-HGN-025). As diluições de anticorpo/HGF foram incubadas por 30 minutos a 25°C. Vinte μΙ_ de cada diluição de anticorpo/HGF foi adicionada separadamente à cavidades individuais, gerando uma concentração final de anticorpo de 666,7 nM, e uma concentração final de HGF de 10 ng/ml. As células MDCK foram então incubadas por 24 horas a 37°C com 5% de CO2.

Após 24 horas de incubação, as células MDCK foram cuidado- samente lavadas uma vez com 100 μL por cavidade de PBS gelado (Invitro- gen Ns de catálogo 14190144), e fixadas com 100 μL por cavidade de meta- nol gelado durante agitação por 10 minutos a 25°C. As placas foram então lavadas cuidadosamente uma vez com água destilada. Um volume de 100 μL de solução de cristal violeta, consistindo em 0,5% de cristal violeta (Sig- ma, St. Louis, MO, Nq de catálogo C3886) e etanol a 50% em água destila- 20 da, foi adicionado a cada cavidade, e as células foram incubadas por 20 mi- nutos a 25°C com agitação.

Após a marcação com solução de cristal violeta, as células fo- ram lavadas cuidadosamente três vezes com água destilada. A seguir, PBS foi adicionado a cada cavidade para evitar o ressecamento das amostras. As células foram visualizadas usando o microscópio Leica DMIRB (Leica Mi- crosystems GmbH, Wetzler, Alemanha), a câmera DC500 (Leica Microsys- tems GmbH, Wetzler, Germany), e o programa MagnaFire 2.1 C (Optronics, Goleta, CA), e as amostras foram quantificadas quanto ao nível de disper- são. Os resultados estão resumidos na Tabela 8. TABELA 8

<table>table see original document page 75</column></row><table>

- Nenhuma inibição

+++ Inibição muito grande, quase completa ++ Inibição forte + Inibição detectável

Os resultados na Tabela 8 demonstram que o anticorpo 2B8 ini- biu a dispersão induzida por HGF mais do que os outros anticorpos. Os anti- corpos 1D3 e 3B6 apresentaram um nível de inibição intermediário; o anti- corpo 1A3 apresentou um nível de inibição baixo a intermediário. Os anticor- pos 1F3 e 2F8 apresentaram um nível de inibição baixo; e os anticorpos 3A12 e 3D11 forneceram pouca ou nenhuma inibição detectável.

Exemplo 9 - Inibição de Fosforilacão de c-Met estimulada por HGF

Este Exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos pro- duzidos no Exemplo 1 quanto a sua habilidade de inibir a fosforilação de c- Met estimulada por HGF em células PC-3. HGF induz a fosforilação de Met em células PC-3 (ATCC No. CRL-1435).

As células PC-3 foram semeadas em cavidades individuais de placas de cultura de tecido de 96 cavidades Costar (Corning N9 de catálogo 3595) em uma densidade de 4,5 χ 10^4 células por cavidade em 100 μL de F- 12K (ATCC, Manassas, VA, N° de catálogo 30-2004) contendo 10% de Soro Fetal Bovino (Invitrogen, N° de catálogo 10438026) e 1% de penicilina- estreptomicina (Invitrogen, N° de catálogo 15140122). Após 24 horas a 37°C com 5% de CO2, o meio foi removido, e as células foram enxaguadas uma vez com F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. As célu- las foram então incubadas por 24 horas em 100 μL de F-12K sem soro con- tendo 1% de penicilina-estreptomicina. As 10 diferentes diluições a seguir de cada um dos anticorpos sendo investigados foram preparadas em F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina: 6667 nM, 2222 nM, 741 nM; 247 nM; 82,3 nM; 27,4 nM; 9,1 nM; 3,0 nM; 1,0 nM; e 0,3 nM. Cada diluição de anticorpo, e F- 12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina sem anticorpo, fo- ram combinadas separadamente com um volume igual de F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina e 500 ng/mL de HGF (R&D Sys- tems N- de catálogo 294-HGN-025). Estas diluições de anticorpo/HGF fo- ram incubadas por 30 minutos a 25°C. Isto resultou em uma concentração final de 1,25 nM de HGF.

As células PC-3 foram lavadas uma vez com F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. A seguir, 70 μL de F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina foi adicionado às células, se- guido por 10 μL de Na3VO4 a 10 mM (Sigma, N9 de catálogo S6508) em F- 12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram então incubadas por 60 minutos a 37°C com 5% de CO2. Após esta incuba- ção, 20 μL de cada diluição de anticorpo/HGF foi adicionada aos separada- mente a cavidades separados, produzindo uma concentração final de HGF de 50 ng/mL, e as seguintes concentrações finais de cada anticorpo 666,7 nM; 222,2 nM; 74,1 nM; 24,7 nM; 8,23 nM; 2,74 nM; 0,91 nM; 0,30 nM; 0,10 nM; 0,03 nM. As células foram então incubadas por 10 minutos a 37°C com 5% de CO2, e após isto, a mistura de meio/anticorpo/HGF foi removida, as placas foram plaqueadas em gelo. As células foram então lavadas uma vez com 100 μL por cavidade de PBS gelado (Invitrogen, N9 de catálogo 14190144) contendo 1 mM de Na3VO4. As células foram então incubadas por 30 minutos a 4°C em 100 μL por cavidade de tampão de Iise gelado con- sistindo em 1% de OmniPur Triton X-100 (MERCK KGaA, Darmstadt, Ale- manha, N9 de catálogo 9410), 50 mM de Tris-HCI pH 8,0, 100 mM de NaCI, 0,3 mM de Na3VO4, coquetel de inibidor de protease a 1x (Sigma, N9 de ca- tálogo P8340), e coquetel de inibidor de protease 2 a 1x (Sigma, N9 de catá- logo 5726).

Anticorpo anti-HGF-R humano biotinilado (c-met) (R&D Systems, N- de catálogo BAF358) foi diluído para uma concentração de 2 μς/ηιί em tampão de ensaio DELFIA Assay Buffer (PerkinElmer, Turku1 Finland, N5 de catálogo 4002-0010) contendo 1% de albumina sérica bovina (Sigma N2 de catálogo A2153), e 50 μΐ_ por cavidade desta diluição foram adicionados de placas de microtitulação de estreptavidina amarela (PerkinElmer, Ns de catá- logo AAAND-0005). As placas foram então incubadas com anticorpo por 30 minutos a 25°C com agitação. Após a incubação, as placas foram lavadas com solução de lavagem DELFIA (PerkinElmer, N9 de catálogo 4010-0010), e 80 μl de cada um dos diferentes Iisados de células PC-3 foram adiciona- dos a cavidades individuais das placas de microtitulação de estreptavidina lavadas.

As placas de microtitulação de estreptavidina contendo lisados de células PC-3 foram incubadas por 60 minutos a 25°C com agitação, e então lavadas com solução de lavagem DELFIA. 100 μl de 600 ng/mL de anticorpo DELFIA Eu-Nl P-Tyr-100 (PerkinElmer, Ns de catálogo AD0159) diluído em DELFIA Assay Buffer contendo 1% de albumina sérica bovina foi adicionada a cada cavidade das placas de microtitulação de estreptavidina lavadas incubadas previamente com Iisados de células PC-3. As placas fo- ram incubadas por 60 minutos a 25°C, com agitação. As placas foram Iava- das mais uma vez com solução de lavagem DELFIA. Então, 200 μί de DEL- FIA Enhancement Solution (PerkinElmer N- de catálogo 4001-0010) foram adicionados a cada cavidade das placas de microtitulação de estreptavina lavadas, e as placas foram incubadas no escuro por 5 minutos e 25°C, com agitação.

O sinal foi então medido usando o protocolo de Európio no leitor Victor3V (PerkinElmer). Os valores de EC50 foram calculados usando Prism 4 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) e a equação do- se-resposta sigmóide.

Os resultados resumidos como EC50s em nM estão tabulados na Tabela 9. TABELA 9

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Os dados na Tabela 9 demonstram que todos os oito anticorpos são potentes inibidores da fosforilação de c-Met induzida por HGF em celilas PC-3.

Exemplo 10 - Inibicão de Tumor em Modelo de Xenoenxerto de U87MG

A habilidade de anticorpos monoclonais murinos da invenção inibirem o crescimento tumoral foi testada em um modelo de xenoenxerto de U87MG. Células U87MG (ATCC) foram expandidas em cultura a 37°C em uma atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% de ar, usando um meio que compreende meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomi- cina. As células foram subcultivadas e mantidas por desprender as células da parede da placa de cultura usando tripsina-EDTA.

Células quase confluentes foram coletadas por tripsinização e então 5 χ 106 células em Matrigel 50% (BD Biosciences; Nq de catálogo 356237) foram injetadas subcutaneamente na área dorsal superior entre a escápula de camundongos ICR SCID fêmeas de 7 semanas de idade (Taco- nic Labs). Os diâmetros (mm) mais longos (L) e mais curtos (W) dos tumores foram medidos com um compasso de calibre. O volume tumoral (vol) foi cal- culado como: (mm3) = L χ W2 / 2. Quando os tumores cresceram para apro- ximadamente 200 mm3, os camundongos que possuíam os tumores foram randomizados em 5 grupos de 10 camundongos cada. Um grupo recebeu PBS. Cada um dos outros 4 grupos recebeu um dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3 ou 2B8. Todos os anticorpos foram administrados em doses de 1 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injeções intraperitoneais de 5 doses. Os volumes tumorais e os pesos corporais dos camundongos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento tumoral foi analisada usando o teste de f-Student. Os resultados estão resumidos na Figura 6 e na Tabela 10.

TABELA 10

<table>table see original document page 79</column></row><table>

Regressão parcial foi obtida no grupo tratado com 2B8 (Figura 6). Inibição estatisticamente significativa do crescimento foi observada nos grupos tratados com 1A3 e nos tratados com 1F3 (Tabela 10). Houve uma inibição de crescimento do tumor de 51% para 1D3 com um valor de ρ de 0,075. Nenhuma perda corporal significativa foi observada.

Exemplo 11 - Inibição de Tumor em Modelo de Xenoenxerto de Ü118

A habilidade dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3 e 2B8 em inibir o crescimento tumoral foi testado em um modelo de xenoenxerto de U118. Células U118 (ATCC) foram expandidas como descrito no Exemplo 10 (aci- ma) com relação às células U87MG.

Tumores subcutâneos foram estabelecidos como descrito no Exemplo 10 acima, exceto que os camundongos usados eram camundongos nude NCr fêmeas de 7 semanas de idade (Taconic), e o tratamento foi inici- ado quando os tumores atingiram aproximadamente 80 mm3. Como no mo- delo de U87MG, todos os anticorpos foram administrados em doses de 1 mg/kg de peso corporal duas vezes por semana por injeções intraperitoneais por 4 doses. Os volumes tumorais o os pesos corporais dos camundongos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento do tu- mor foi analisada usando o teste de f-Student. Os resultados estão resumi- dos na Figura 7 e na Tabela 11.

Tabela 11

<table>table see original document page 79</column></row><table> Inibição do tumor estatisticamente significativa foi observada nos grupos tratados com 2B8 e 1A3 (Figura 7). Houve uma modesta inibição do crescimento do tumor nos grupos de 1F3 e 1D3 com valores de ρ menores do que 0,05, o qual foi definido como significância estatística neste estudo (Tabela 11). Nenhuma perda de peso corporal significativa foi observada. Exemplo 12 - Humanizacão de Anticorpos Monoclonais Murinos

Este Exemplo descreve a humanização do anticorpo murino 2B8, junto com uma caracterização dos anticorpos humanizados resultantes, as regiões Variáveis de Cadeia Pesada e Leve de 2B8 foram "humanizadas" por dois métodos.

A. Procedimento de Humanização 1

No primeiro método, três regiões variáveis de cadeia pesada humanizadas e duas regiões variáveis de cadeia lave capa humanizadas foram desenhadas com base no método de "super-humanização" descrito em Hwang et al. (2005) Methods 36:35-42; Tan et al. (2002) J. Immunol. 169:1119-1125; Patente U.S. N9 6.881,557.

A classe estrutural canônica de Chothia foi determinada para cada CDR de 2B8 de camundongo com base o comprimento e na composi- ção de aminoácidos da CDR. As regiões variáveis de linhagem germinativa humanas que consistem em regiões variáveis leves e pesadas da mesma classe estrutural canônica de Chothia foram identificadas com base em ale- los de referência da região variável de linhagem germinativa humana conhe- cidos descritos no site da internet do International Immunogentics Informati- on System (IMGT) (disponível na rede de alcance mundial em imgt.cines.fr e biochem.unizh.ch/antibody/Sequences/index.html). Estas regiões variáveis de linhagem germinativa humana da mesma classe estrutural foram compa- radas a regiões variáveis de 2B8 de murino por calcular o percentual de i- dentidade ou similaridade entre os resíduos de aminoácido da CDR. As regi- ões variáveis de linhagem germinativa humanas com a maior identidade e/ou similaridade com os resíduos da CDR de 2B8 de camundongo foram preservadas, enquanto que os resíduos da CDR de 2B8 foram usados para substituir os resíduos correspondentes da região variável de linhagem ger- minativa humana que eram diferentes entre as CDRs de linhagem germinati- va humana e CDR de 2B8 de camundongo. A região J humana que era a mais semelhante à região J de camundongo de 2B8 foi então adicionada à terminação carboxila das regiões variáveis "super-humanizadas" e estas se- quências de aminoácido foram convertidas em seqüências de ácido nucléi- co.

A seqüência de ácido nucléico da região variável completa foi construída usando métodos de síntese de gene por PCR (Young et al. (2004) NUCL. ACIDS RES. 32:e59) e clonadas em um vetor de expressão em mamífero (baseado em pcDNA3.2 DEST (Invitrogen)) contendo regiões constantes humanas (a jusante das regiões variáveis) de IgGI (alótipo G1m(17,1)) ou Capa (alótipo Km(3) (alelo 2)) usando técnicas de biologia molecular usuais. Todos os quatro anticorpos de IgGI de cadeia pesada (de 2B8 quimérico a 3 cadeias pesadas humanizadas (Hu2B8 Hv1-f.1, Hu2B8 Hv5-a.1, Hu2B8 Hv5-51.1) foram expressos nas combinações possíveis com todos os 3 anticorpos de cadeia capa (quimera de 2B8 e 2 cadeias leves humanizadas (Hu2B8 Kv1-39.1 e Hu2B8 Kv3-15.1) criando 12 proteínas de anticorpo diferentes. A ligação dos anticorpos quiméricos, quiméricos/hu- manizados e humanizados a HGF humano foi então medida como descrito abaixo e os resultados estão resumidos na Figura 8. Cada uma das possí- veis combinações de cadeia pesada de imunoglobulina e cadeia leve de i- munoglobulina são descritas abaixo na Tabela 12A.

Tabela 12A

<table>table see original document page 81</column></row><table> Cada uma das combinações possíveis das cadeias pesadas de imunoglobulina e cadeias leves de imunoglobulinas é descrita abaixo na Ta- bela 12B.

Tabela 12B

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Dois dos possíveis construtos de anticorpo que contêm as ca- deias pesadas e leves de imunoglobulina de extensão completa contendo as regiões variáveis humanizadas são designados abaixo. sh2B8-9 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgGI (alótipo G1m(17,1)) (SEQ ID NO. 171) mais hu2B8 Kv 1-39.1 (+ região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID NO. 177)

sh2B8-12 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgGI (alótipo G1m(17,1))) (SEQ ID NO. 171) mais hu2B8 Kv 3-15.1 (+ região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID NO. 181).

As seqüências de ácido nucléico codificantes e as seqüências de proteína que definem cada um dos anticorpos humanizados estão resu- midas abaixo. Nesta seção, o último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variável/cons- tante. Este nucleotídeo está incluído na Região Variável porque ele faz parte deste éxon. Seqüências de aminoácido de Regiões Constantes listadas a- baixo incluem a tradução deste códon de junção.

(1) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Cadeia Pesada de 2B8 Quimérico de Extensão Completa (Região Variável de Camundongo

e Região Constante de IgGI humana) (alótipo G1m(17,1)) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 154)

1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(2) Seguência de Proteína gue Define a Cadeia Pesada de 2B8 Quimérico de Extensão Completa (lqG1 de 2B8 Quimérico (alótipo G1m (17.1)) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 155)

1 gvqlqqpgae lvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 ys lsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vf lfppkpkd tlmisrtpev tcvwdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrwsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(3) Seqüência de Acido Nucléico que Codifica a Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 Quimérico (Região Variável de Camundonqo e Região Constante Humana) (Capa de 2B8 Quimérico (Km(3))) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 156)

1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga

(4) Seqüência de Proteína que Define a Cadeia Leve de Exten- são Completa de 2B8 Quimérico (Capa de 2B8 Quimérico (Km(3))) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 157)

1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenw syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

(5) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv1-f.1 Humanizado (seqüência de sinal subli- nhada) (SEQ ID NO. 158)

1 atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgcc- gag

61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag

(6) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Ca- deia Pesada de Hu2B8 Hv1-f.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 159)

1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvss

(7) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Cons- tante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (alótipo G1m(17,1)) (SEQ ID NO. 160)

1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga

(8) Seqüência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (alótipo G1m(17.1)) (SEQ ID NO. 161). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da seqüência da Cadeia Pesada de IgGI.

1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslsswt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvwdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrwsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsrde 241 ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

(9) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv1f.1 Humanizado de Extensão Completa e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI humana (alótipo G1m(17,1)) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 162)

1 atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag 61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(10) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv1f.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGl Humana (alótipo G1m(17.1)) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 163)

1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvwdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrwsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(11) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 164)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa

61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc

121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc

181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag

(12) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 165)

1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqghvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss

(13) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI Humana (alótipo G1m(17.1)) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 166)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa

61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc

121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc

181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg

301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc

421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg

481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca

541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac

601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt

721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc

781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac

901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac

961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag

1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa

1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag

1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag

1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(14) Seqüência de Proteína que Define a Região variável da ca- deia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado e

(G1m(17,1) alótipo) a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 167)

1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqghvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvwdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrwsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(15) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região variável da cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado (seqüência de sinal sub- linhada) (SEQ ID NO. 168)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa

61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc

121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc

181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat

241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg

301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt

361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag

(16) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência Variável de Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 169)

1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss

(17) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região variável da cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (G1m(17,1) alótipo) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 170)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca- gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag. .aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(18) Seqüência de Proteína que Define a Região variável da ca- deia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI Humana (alótipo G1m(17.1)) (sem seguência de sinal) (SEQ ID NO. 171)

1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps

241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvwdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst

301 yrwsvltvl hgdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

421 gnvfscsvmh ealhnhytqk sIslspgk

(19) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Capa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 172). Dois possíveis ATGs de início são mostrados em letras maiúsculas.

1 ATGgacATGa gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga

121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaac

(20) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Capa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 173)

1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasenw syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleik

(21) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Cons- tante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID NO. 174)

1 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tga

(22) Seqüência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID NO. 175). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da Seqüência da Cadeia Leve Capa.

1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtaswclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec

(23) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (se- qüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 176)

1 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 421 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 481 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 541 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 601 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 661 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a

(24) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 177)

1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasenw syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps

61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

(25) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 178)

1 atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc

121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct

181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc

241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct

301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag

361 gggaccaagc tggagatcaa ac

(26) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 179)

1 eivmtqspat lsvspgerat lsckasenw syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleik

(27) Ácido Nucléico oue Codifica a Região Variável de Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 180)

1 atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga

(28) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado e a Região Constante da Ca- deia Capa Humana (Km(3) alótipo) (alelo 2) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 181)

1 eivmtqspat lsvspgerat lsckasenw syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

Para conveniência, a Tabela 13 fornece um quadro de concor- dância mostrando uma correspondência entre as seqüências de extensão completa e os anticorpos discutidos nesta seção com aqueles apresentados na Listagem de Seqüência.

TABELA 13

<table>table see original document page 94</column></row><table>

B. Procedimento de Humanizacão 2

O Segundo método de humanização empregado para reduzir a imunogenicidade do anticorpo 2B8 de camundongo se baseia no método descrito por Studnicka et ai (1994) PROTEIN ENG. 7:805-814. As regiões variáveis de linhagem germinativa pesada e capa humanas mais idênticas (em aminoácidos) àquelas de 2B8 de camundongo foram identificadas. Os resíduos que diferiram entre camundongo e humano foram convertidos na seqüência humana dependendo da probabilidade do risco de que tal altera- ção afetasse a ligação ou imunogenicidade. Resíduos de baixo risco (isto é, resíduos que quando trocados provavelmente não afetariam a ligação de antígeno e também reduziriam potencial imunogenicidade) foram trocados para o aminoácido humano na região variável pesada (criando LR2B8HC) e a região variável capa (criando LR2B8LC). Adicionalmente, os resíduos de baixo risco e médio risco (isto é., resíduos que quando trocados têm alguma probabilidade de ter um efeito sobre a ligação e também reduziriam potencial imunogenicidade) foram trocados para o aminoácido humano na região vari- ável pesada (criando LRMR2B8HC) e a região variável capa (criando LR- MR2B8LC). A região constante de cadeia pesada de IgGI (alótipo G1m(3) (alelo 1)) foi adicionada à terminação carboxila de duas regiões variáveis pesadas manipuladas humanas e a região constante capa humana (alótipo Km(3) (alelo 1)) foi adicionada à terminação carboxila de duas regiões variá- veis leves manipuladas, criando assim quatro cadeias de anticorpo humanas manipuladas. Seqüências de ácido nucléico da região variável foram primei- ro sintetizadas por métodos de síntese gênica e então adicionadas às se- qüências da região constante humana. Estes anticorpos manipulados foram clonados em vetores de expressão de proteína de mamífero, e a proteína foi expressa nas quatro combinações possíveis de cadeia pesada mais cadeia leve. A ligação dos anticorpos quiméricos, quiméricos/humanizados, ou hu- manizados a HGF humano foi medida usando técnicas convencionais, con- forme descrito abaixo.

As seqüências de ácido nucléico codificantes e as seqüências de proteína que definem cada um dos anticorpos humanizados estão resu- midas abaixo. Nesta seção, o último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variá- vel/constante. Este nucleotídeo está incluído na Região Variável porque ele faz parte deste éxon. As seqüências de aminoácido das Regiões Constantes listadas abaixo incluem a tradução deste códon de junção.

(1) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de LR2B8HC Humanizado (seqüência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 182)

1 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa

61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca

121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc

181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat

241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg

301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta

361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc ag

(2) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Ca- deia Pesada de LR2B8HC Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 183)

1 qvqlvqpgae wkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss

(3) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Cons- tante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 184)

1 ccagcacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgtccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga

721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg

781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc

841 tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc

901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc

961 agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga

(4) Seqüência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1 ou 2) (SEQ ID NO. 185). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotí- deo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da seqüência da Cadeia Pesada de IgGI.

1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslsswt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvwdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrwsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

(5) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de de Extensão Completa de LR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IoGI Humana (Alótipo G1m(3)) (a- Ielo 1) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 186)

1 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa 61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc agccagcaca 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga

(6) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Ca- deia Pesada de Extensão Completa de LR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 187)

1 qvqlvqpgae wkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny

61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps

241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvwdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst

301 yrwsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(7) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de LRMR2B8HC Humanizado (seqüência de sinal subli- nhada) (SEQ ID NO. 188)

1 atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag

61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca

121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc

181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc ag

(8) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Ca- deia Pesada de LRMR2B8HC Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 189)

1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss

(9) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de de Extensão Completa de LRMR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgGl Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (seguência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 190)

1 atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag

61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca

121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc agccagcaca 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga

(10) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da

Cadeia Pesada de Extensão Completa de LRMR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (Alótipo G1m(3)) (a- Ielo 1) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 191)

1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny

61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas

121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl

181 yslsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps

241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvwdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst

301 yrwsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt

361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq

-421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

(11) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Leve de LR2B8LC Humanizado (seqüência de sinal sublinha- da) (SEQ ID NO. 192)

1 atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc

61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc

121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc

181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac

241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca

301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa

(12) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de LR2B8LC Humanizado (sem seguência de sinal) (SEQ ID NO. 193)

1 divmtqspds mamsvgervt lnckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd

61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik

(13) Seguência de Ácido Nucléico gue Codifica a Região Cons- tante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 194) 1 gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg

61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt

121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca

181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga

241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga

301 gcttcaacag gggagagtgt tag

(14) Seqüência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 195). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da seqüência da Cadeia Leve Capa.

1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtaswclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec

(15) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Leve de Extensão Completa de LR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 196)

1 atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc 61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa 361 ggaaccaaac tcgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag

(16) Seqüência de Proteína que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 197) 1 divmtqspds mamsvgervt lnckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

(17) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Leve de LRMR2B8LC Humanizado (seqüência de sinal subli- nhada) (SEQ ID NO. 198)

1 atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga

61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca

121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct

181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac

241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc

301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa

361 ggcactaaac ttgaaattaa ac

(18) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de LRMR2B8LC Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 199)

1 divmtqspds lamslgervt lnckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik

(19) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variá- vel da Cadeia Leve de Extensão Completa de LRMR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (se- qüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 200)

1 atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga

61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca

121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct

181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac

241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc

301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa

361 ggcactaaac ttgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca

421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat

481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag

(20) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LRMR2B8LC Humanizado e a Regi- ão Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 201)

1 divmtqspds lamslgervt lnckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd

61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp

121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt

181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

Para conveniência, a Tabela 14 fornece um quadro de concor- dância mostrando a correspondência entre as seqüências de extensão com- pleta e os anticorpos discutidos nesta seção com aqueles apresentados na

Listagem de Seqüência.

TABELA 14

<table>table see original document page 103</column></row><table> <table>table see original document page 104</column></row><table>

A Tabela 15 resume as seqüências de CDR da cadeia pesada (definição de Kabat) dos anticorpos 2B8 humanizados preparados pelo pro- cedimento de humanização 1 e pelo procedimento de humanização 2 descri- tos acima neste Exemplo. Tabela 15

<table>table see original document page 105</column></row><table> TABELA 16

<table>table see original document page 106</column></row><table> C. Afinidade de Ligação de Anticorpos 2B8 Humanizados

A afinidade de ligação ao antígeno e a cinética de interação fo- ram analisadas por tecnologia de ressonância de plásmon de superfície u- sando um instrumento BIAcore T100. Imunoglobulinas anti-humano de ca- mundongo (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) foram imobiliza- das em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, N5 de ca- tálogo BR-1005-34) por acoplamento de amina (BIAcore, N9 de catálogo BR- 1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as re- comendações do fabricante. As análises foram executadas a 25°C usando PBS (GIBCO, Nq de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N2 de catálogo BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N9 de catá- logo 2930) e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextrano (Fluka, N9 de catálogo 86524) como tampão de corrida.

Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo indivi- dual em uma taxa de fluxo de 10 μΙ_/ιηίη. O tempo de injeção foi variável pa- ra cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo captu- rado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N9 de catálogo 294- HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado seqüencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a super- fície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μΙ_/ηιΐη. A fase de dis- sociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentra- ção. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCI, pH 1,7 (BIAcore, Ns de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μΙ-/ιτιΐη antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 1,88; 3,75 e 7,5 nM. A determinação dos parâmetros de cinética foi obtida usando a função de cinética do programa BIAevaIutation com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e Kd (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 8.

Os resultados resumidos na Figura 8 mostram que certas com- binações de cadeias pesadas super-humanizadas (Hu2B8 Hv5a.1, Hu2B8 Hv5-51.1 ou Hu2B8 Hv1-f.1) e cadeias leves (Hu2B8 Kv1-39.1 ou Hu2B8 Kv3-15.1) retêm afinidade de ligação (Kd) a HGF semelhante a 2B8 quiméri- co (regiões variáveis de camundongo com regiões constantes humanas) e 2B8 (Tabela 5).

D. Ensaio de ligação mutuamente exclusiva

A ligação mutuamente exclusiva a HGF foi avaliada por tecnolo- gia de ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAco- re T100. Imunoglobulinas anti-humanas de camundongo (Jackson Immuno- Research Labs, 209-005-098) foram imobilizadas sobre chips sensores CM5 de dextran carboxiladometilado (BIAcore, N° de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo usual de acoplamento de acordo com as recomendações do fabri- cante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N° de ca- tálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, No. BR- 1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de catálogo 2930), e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextrano (Fluka, N° de catálogo 86524) como tampão de corri- da.

Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo indivi- dual em uma taxa de fluxo de 30 □ L/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 150 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. HGF (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN- 025) diluído em tampão de corrida em uma concentração final de 7,5 μg/mL foi injetado por 90 segundos a 30 μL/min sobre os anticorpos humanizados capturados. A ligação de HGF foi monitorada antes da injeção subsequente de anticorpo 2B8 de camundongo ou anticorpo policlonal anti-HGF de cabra (R&D Systems, AF294) por 3 min a 30 μL/min. A superfície foi então rege- nerada com 10 mM de GIicina-HCI pH 2,0 (BIAcore, N° de catálogo BR- 1003-55) injetada por 3 min em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro anticorpo ser testado. Os resultados estão resumidos na Figura 9.

Os resultados resumidos na Figura 9 mostram que tanto os anti- corpos 2B8 humanizados quanto os anticorpos 2B8 quiméricos impedem 2B8 de se ligar a HG F. Estes resultados demonstram que os anticorpos hu- manizados ainda se ligam ao mesmo epítopo de HGF que o anticorpo 2B8 original.

Exemplo 13 - Produção de Variantes Humanizadas de 2B8 a. ANTICORPOS HUMAN ENGINEERED®

Cadeias manipuladas leves (LR2B8LC e LRMR2B8LC, respecti- vãmente) e pesadas (LR2B8HC and LRMR2B8HC, respectivamente) de bai- xo risco e de risco baixo-mais-moderado com otimização de códon e de ex- pressão foram clonadas in phase em vetores de expressão de anticorpo transitório_dfi_XOMA, os quais contêm módulos de regiões constantes hu- manas Capa e Gama-1. As quatro variantes de 2B8 Human Engineered fo- ram produzidas por transfecção transitória em células HEK293E. Os quatro anticorpos a seguir foram produzidos:

HE2B8-1 = LR2B8HC (+ região constante de IgGI (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID NO. 187) mais LR2B8LC (+ região constante Ca- pa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID NO. 197) HE2B8-2 = LR2B8HC (+região constante de IgGI (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID NO. 187) mais LRMR2B8LC (+ Região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID NO. 201) HE2B8-3 = LRMR2B8HC (+ região constante de IgGI (alótipo G1 m(3) (alelo 1)) (SEQ ID NO. 191) mais LR2B8LC (+ Região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID NO. 197) HE2B8-4 = LRMR2B8HC (+ região constante de IgGI (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID NO. 191) mais LRMR2B8LC (+ Região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID NO. 201)

As cadeias leves e pesadas foram co-transfectadas em células HEK293E adaptadas para suspensão de XOMA cultivadas em meio IS293 (Irvine Scientific, Irvine, CA) usando frascos de agitação de 2 litros. Após 24 horas nos frascos de agitação, 200 ml_ das células transfectadas foram cen- trifugadas, ressuspensas em 40 mL de meio fresco e transferidas para fras- cos Integra (Wilson Wolf Manufacturing Inc., MN) para produção. Após a in- cubação por sete dias, as suspensões celulares foram removidas dos fracos Integra, centrifugadas e os sobrenadantes das culturas retidos. Os anticor- pos nos sobrenadantes das culturas foram purificados em colunas de rota- ção (spin) de proteína A (Pro-Chem)1 dialisados contra PBS, concentrados e esterilizados por filtração. b. Anticorpos SUPERHUMANIZED®

cDNA de Hu2B8_Hv5-51.1 de extensão completa + domínio constante de IgGI humana (alótipo G1m(3)) foi clonado em pEE6.4 (Lonza Biologics, Berkshire, UK) usando sítios de restrição de Hindlll e EcoRI. cD- NA da região variável de Hu2B8_Kv1-39.1 de extensão completa + domínio constante Capa humano e cDNA da região variável de Hu2B8_Kv3-15.1 de extensão completa + domínio constante Capa humano foram clonados cada, em pEE14.4 (Lonza Biologics) usando sítios de restrição de Hindlll e EcoRI. cDNA do promotor de hCMV-MIE + Hu2B8_Hv5-51.1 de extensão completa + domínio constante de IgGI humana (alótipo G1m(3)) + fragmento poli A de SV40 (em pEE6.4) foi removido por digestão com Notl/Sall e inserido no ve- tor pEE14.4 da cadeia Capa através dos sítios de Notl/Sall, criando assim 2 diferentes vetores de expressão que expressam cada, simultaneamente, a cadeia pesada e a cadeia leve para fazer os seguintes anticorpos:

sh2B8-9 (G1 m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ Região constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 2)) (SEQ ID NO. 210) mais hu2B8 Kv 1-39.1 (+ Região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID NO: 177) sh2B8-12 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ Região constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 2)) (SEQ ID NO. 210) mais hu2B8 Kv 3-15.1 (+ Região constante Capa (Km(3) alótipo (alelo 2))) (SEQ ID No. 181)

As seqüências de ácido nucléico codificantes e as seqüências de proteína que definem a Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI Humana alótipo G1m(3) (alelo 2) e cada uma das seqüência da cadeia pe- sada de extensão completa são descritas abaixo. As seqüências da cadeia leve foram as mesmas que as descritas no Exemplo 12.

(1) Seqüência de Ácido Codificante da Região Constante da Ca- deia Pesada de IqGI Humana (alótipo G1m(3)) (alelo 2) (SEQ ID NO. 207) 1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaag accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga

(2) Seqüência de Proteína que Define a da Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (alótipo G1m(3)) (alelo 1 ou 2) (SEQ ID NO. 208). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotí- deo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da Seqüência da Cadeira Pesada dé IgGI.

1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslsswt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvwdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrwsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

(3) Seqüência de Ácido Codificante da Cadeia de Extensão Completa que contém a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5- 51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana G1m(3) alótipo (alelo 2) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 209)

1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca

841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac

901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga agaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc

13 81 ctctccctgt ctccgggtaa atga

(4) Seqüência de Proteína que Define a Cadeia de Extensão Completa que contém Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IoGI Humana G1m(3) alótipo (alelo 2) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID NO. 210)

1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqggvti saâksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvwdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrwsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

Cada vetor de expressão duplo foi transfectado em células 293T para expressão transitória usando DMEM com 10% de soro fetal bovino. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lavadas com, e então substituídas por, meio livre de soro, IS GRO® (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo 4mM de L-Glutamina. O sobrenadante foi coletado diari- amente e substituído por meio fresco por 10 dias. Os sobrenadantes da cul- tura foram centrifugados, filtrados (0,45 μm) e concentrados 10 a 100 vezes. Os anticorpos foram purificados em resina ProSep vA (Millipore), dialisados contra PBS, concentrados e esterilizados por filtração.

Exemplo 14 - Características de Ligação de Variantes Humanizadas de 2B8

Os anticorpos humanizados produzidos no Exemplo 13 foram caracterizados quanto a sua habilidade de se ligar a hHGF e às proteínas HGF recombinantes produzidos na Exemplo 13.

Os anticorpos foram analisados por ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100 para avaliar sua habilidade de se ligar a hHGF e às proteínas de fusão discutidas no Exemplo 3. Cada anticorpo foi imobilizado sobre um chip sensor de dextran carboximetilado CM5 (BIAcore, N2 de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIA- core, Ns de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento u- sual de acordo com as instruções do fabricante.

As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N9 de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N9 de ca- tálogo R-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N5 de catálogo 2930) e 10 mg/mL de sal de sódio CM-Dextrano (Fluka, N2 de catálogo 86524) como tampão de corrida. O sobrenadante contendo diferentes proteínas de fusão de HGF ou o sobrenadante de células transfectadas com o vetor vazio foi injetado sobre cada anticorpo em uma taxa de fluxo de 30 μL/min por 3 mi- nutos. A ligação resultante foi determinada como unidades de ressonância (RU) sobre o limite basal 30 segundos após o final da injeção. A ligação foi comparada a HGF humano (R&D Systems, N9 de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida. As ligações inespecíficas foram monitoradas por comparar a ligação a uma superfície de controle. Os resultados estão resumidos na Tabela 17.

TABELA 17

<table>table see original document page 114</column></row><table>

Os resultados na Tabela 17 demonstram que cada um dos anti- corpos humanizados baseados em 2B8 se liga a rhHGF e a todas as três quimeras camundongo-humano-camundongo.

Exemplo 15 - Afinidades de Ligação de Variantes Humanizadas de 2B8

As afinidades de ligação e a cinética de interação dos anticorpos listados na Tabela 15 foram medidas por ressonância de plásmon de super- fície.

Imunoglobulinas anti-humano de camundongo (Jackson Labs, N° de catálogo 209-005) foram imobilizadas em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, N° de catálogo BR-1006-68) por acoplamen- to de amina (BIAcore, N9 de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N° de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-54), e 2 mg/mL de BSA (EMD, N9 de catálogo 2930).

Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo indivi- dual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável pa- ra cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo captu- rado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N9 de catálogo 294- HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado seqüencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a super- fície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μΙ_/ιτιίη. A fase de dis- sociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentra- ção. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCI, pH 1,7 (BIAcore, N9 de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μΙ_Λτιίη antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.

Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BlAevalutation® com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo ka (constante da taxa de associ- ação), kd (constante da taxa de dissociação) e K0 (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 18.

TABELA 18

<table>table see original document page 115</column></row><table>

Estes dados mostram que os anticorpos humanizados têm taxas de associação rápidas (kg), taxas de dissociação muito lentas (kd), e afinida- des muito altas (KD). Em particular, os anticorpos têm afinidades que variam de 2,0 a 12 pM.

Exemplo 16 - Comparação das Afinidades de Ligação a 25°C e 37°C

As afinidades de ligação e a cinética de interação dos anticorpos HE2B8-4, sh2B8-9, sh2B8-12, e 2B8 murino foram medidas por ressonância de plásmon de superfície sob diferentes condições.

Imunoglobulinas anti-humano de camundongo (Jackson Labs, N9 de catálogo 209-005) ou imunoglobulinas anti-camundongo de coelho (BIAcore, N9 de catálogo BR-1005-14) foram imobilizadas em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, N9 de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N9 de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante. No caso de medidas a 25°C para sh2b8-9 e sh2B8-12, um chip sensor CM5 (BIAcore, N9 de catálogo BR-1006-68) foi usado. As análises foram realiza- das a 25°C e 37°C usando PBS (GIBCO, Ne de catálogo 14040-133) con- tendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, Nq de catálogo BR-1000-54), e 2 mg/mL de BSA (EMD, N- de catálogo 2930) como tampão de corrida.

Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo indivi- dual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável pa- ra cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo captu- rado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, Ns de catálogo 294- HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado seqüencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a super- fície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dis- sociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentra- ção. A superfície dos chips sensores de imunoglobulinas de camundongo anti-humano foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCI, pH 2,2 (BIA- core, Ne de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. A superfície dos chips sensores de imunoglobulinas de coelho anti-camundongo foi então regene- rada com 10 mM de Glicina-HCI, pH 1,7 (BIAcore, Nq de catálogo BR-1003- 54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.

Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BIAevaIutation com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo, kg (constante da taxa de associ- ação), kd (constante da taxa de dissociação) e Kd (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 19. TABELA 19

<table>table see original document page 117</column></row><table>

Conforme esperado, as constantes da taxa de associação au- mentaram com um aumento na temperatura. De forma surpreendente, as constantes de dissociação não mudaram significativamente com um aumen- to correspondente na temperatura. Consequentemente, as constantes de dissociação de equilíbrio gerais (K0) foram aproximadamente 1,4 a 3 vezes menores (maior afinidade) em temperatura fisiológica (37°C).

Exemplo 17 - Atividade de Neutralização de Variantes Humanizadas de 2B8

Os anticorpos descritos no Exemplo 14 foram caracterizados quanto a sua habilidade de (a) inibir a ligação de hHGF a c-Met, e (b) inibir a incorporação de BrdU estimulada por HGF em células 4MBr-5.

O Ensaio de Inibição da Ligação HGF-Met (Ensaio de Neutrali- zação) foi realizado como descrito a seguir. Os anticorpos foram testados por ELISA quanto a sua habilidade de inibir a ligação de hHGF a c-Met. Es- pecificamente, placas de ensaio DELFIA de 96 cavidades Wallac (Wallac Inc., Ns de catálogo AAAND-0001) foram revestidas com 100 μl de HGF a 6,25 μg/mL (R&D Systems, Nq de catálogo 294-HGN-025) em tampão de revestimento de carbonato (15 mM de Na2CO3 e 34 mM de NaHCO3, pH 9,0) por 16 horas a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 200 μl de leite em pó desnatado a 5% em PBS por 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos foram preparados em uma placa separada por adicionar concen- trações crescentes dos anticorpos sob investigação (0,033 a 250 nM, dilui- ção seriada de 2 vezes) a 2 nM de c-Met biotinilado em leite em pó desnata- do a 5% em PBS. C-Met (R&D Systems, N5 de catálogo 358-MT/CF) é bioti- nilado de acordo com as instruções do fabricante em uma proporção de bio- tina para c-Met de10:1. 100 μΙ_ de amostra por cavidade foram transferidos para a placa de ensaio e incubados por 2 horas em temperatura ambiente. As placas resultantes foram lavadas três vezes com PBS-O11% de Tween 20, e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com Estreptavidina marcada com Eu (Wallac, N9 de catálogo 1244-360) diluída 1:1000 em tam- pão de ensaio DELFIA (Wallac, N- de catálogo 4002-0010). As placas resul- tantes foram lavadas 3 vezes com solução de lavagem DELFIA (Wallac, Ns de catálogo 4010-0010) e incubadas com 100 μL/cavidade de solução de intensificação DELFIA (Wallac #4001-0010) por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação. As placas foram lidas em um instrumento Victor3V (Perkin Elmer) usando o método de Európio. Os valores de IC5o foram calcu- lados e estão resumidos na Tabela 6.

Os valores de IC5o obtidos são mostrados na Tabela 20.

TABELA 20

<table>table see original document page 118</column></row><table>

Estes resultados da Tabela 20 demonstram que os anticorpos humanizados testados neutralizaram eficazmente a ligação de HGF a c-Met.

Os anticorpos na Tabela 17 também foram testados no ensaio de proliferação celular descrito no Exemplo 7(b). Os resultados estão resu- midos na Tabela 21.

TABELA 21

<table>table see original document page 118</column></row><table> Os resultados da Tabela 21 demonstram que todos os anticor- pos humanizados testados inibiram a proliferação induzida por HGF em célu- las 4MBr-5.

Exemplo 18 - Atividade Anti-Dispersão de Variantes Humanizadas de 2B8

Os anticorpos na Tabela 17 foram testados no ensaio antidisper- são descrito no Exemplo 8. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabe- la 22.

TABELA 22

<table>table see original document page 119</column></row><table>

Nenhuma Inibição

+++ Inibição muito forte, quase completa inhibition

++ Inibição forte

+ Inibição detectável

Os resultados na Tabela 22 demonstram que todos os anticor- pos humanizados testados inibiram a dispersão induzida por HGF na mesma extensão que o anticorpo monoclonal murino 2B8.

Exemplo 19 - Inibição de Fosforilacão de c-Met estimulada por HGF

Os anticorpos na Tabela 17 foram testados no ensaio de fosfori- lação de c-Met descrito no Exemplo 9. Os resultados estão resumidos abai- xo na Tabela 23.

TABELA 23

<table>table see original document page 119</column></row><table> Os resultados na Tabela 23 demonstram que todos os anticor- pos humanizados testados são potentes inibidores da fosforilação de c-Met induzida por HGF em células PC-3.

Exemplo 20 - Inibição tumoral em Modelo de Xenoenxerto de U87MG

A habilidade dos anticorpos monoclonais humanizados da in- venção inibirem o crescimento tumoral foi testada em um modelo de xeno- enxerto de U87MG. Células U87MG (ATCC) foram expandidas em cultura a 37°C em uma atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% de ar, usando um meio que compreende meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL. de estrep- tomicina. As células foram subcultivadas e mantidas por desprender as célu- las da parede da placa de cultura usando tripsina-EDTA.

Células quase confluentes foram coletadas por tripsinização e então 5x10® células em Matrigel 50% (BD Biosciences; Ns de catálogo 356237) foram injetadas subcutaneamente na área dorsal superior entre a escápula de camundongos ICR SCID fêmeas de 7 semanas de idade (Taco- nic Labs). Os diâmetros (mm) mais longos (L) e mais curtos (W) dos tumores foram medidos com um compasso de calibre. O volume tumoral (vol) foi cal- culado como: (mm3) = L χ W2 / 2. Quando os tumores cresceram para apro- ximadamente 200 mm3, os camundongos que possuíam os tumores foram randomizados em 5 grupos de 10 camundongos cada. Um grupo recebeu PBS e um grupo recebeu controle com IgG. Cada um dos outros 4 grupos recebeu um dos anticorpos humanizados (HE2B8-1, HE2B8-2, HE2B8-3, e HE2B8-4). Todos os anticorpos foram administrados em doses de 0,25 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injeções intraperitone- ais de 5 doses. Os volumes tumorais e os pesos corporais dos camundon- gos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento tumoral foi analisada usando o teste de f-Student.

Os anticorpos humanizados testados eram ativos in vivo. Houve uma inibição do crescimento do tumor de 57% tumor para HE2B8-1 com um valor de ρ de 0,02, 61% de inibição do crescimento do tumor para HE2B8-2 com um valor de ρ de 0,02, 85% de inibição do crescimento do tumor para ΗΕ2Β8-3, com um valor de ρ de 0,0004, e 74% de inibição do crescimento do tumor para HE2B8-4 com um valor d ρ de 0,001. Nenhuma perda corpo- ral significativa foi observada.

Um estudo subsequente foi realizado como descrito acima em camundongos nude NCR fêmeas com tumores de U87MG subcutâneos ino- culados no flanco. Cada (10 camundongos cada) recebeu um dos seguintes tratamentos a 0,5 mg/kg: controle com veículo de PBS, controle de hulgG, HE2B8-4, ou sh2B8-9. O tratamento foi dado intra-peritonealmente duas vezes por semana por um mínimo de 5 semanas. Cada grupo de tratamento demonstrou regressão tumoral similar com inibição do crescimento do tumor de 113% para sh2B8-9 e 115% para HE2B8-4, e um retardo mínimo do crescimento do tumor de 30 dias. Ambos os tratamentos foram bem tolera- dos sem perdas corporais significativas.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

A descrição completa de cada um dos documentos de patente e

artigos científicos referidos aqui está incorporada por referência para todos os propósitos.

EQUIVALENTES

A invenção ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou características essenciais desta. As modalidades anteriores são, portanto para serem consideradas, em todos os aspectos, como ilustrativas ao invés de Iimitantes da invenção aqui descrita. O escopo da invenção é indicado assim pelas reivindicações anexas e não pela des- crição anterior, e todas as alterações que se encontram dentro do significado e amplitude de equivalência das reivindicações são pretendidas para serem abrangidas nela. LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Winston, William M.

Wright, Kirk S. Han, May Breault, Lyne Lin, Jie

Etemad-Gilbertson, Bijan Knuehl, Chr i s t ine Gyuris, Jeno

<120> Proteínas de ligação ao fator de crescimento de hepatócito (HGF)

<130> AVO-OOlB

<150> 60/810,714

<151> 2006-06-02

<150> - 60/-860-509

<151> 2006-11-21

<160> 216

<170> Patente em versão 3.3

<210> 1 <211> 424

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 1A3

<400> 1

atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 240 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 360 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcag 424

<210> 2 <211> 141

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 1A3

<400> 2

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15

Val Lys Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Gln Trp Val Ala Tyr Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro 65 70 75 80

Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 3

<211> 382

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223> região região variável cadeia(capa) leve 1A3 <400> 3 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa ac 382 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> região região variável cadeia(capa) leve 1A3 <400> 4 - - Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

15 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp

100 105 110

Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDl 1A3

<400> 5

Asn Tyr Tyr Met Ser 1 5

<210> 6 <211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR2 1A3

<400> 6

Tyr Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Ala Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR3 1A3

<400> 7

Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10

<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDRl 1A3

<400> 8

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 15 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR2 1A3

<400> 9

Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5

<210> 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR3 1A3

<400> 10

Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 11 <211> 412

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 2B8

<400> 11

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 3 60 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag 412

<210> 12 <211> 137

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 2B8

<400> 12

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 15 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 13 <211> 382

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 2B8

<400> 13

atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 60 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 180 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 300 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaggc tggaaataaa ac 382

<210> 14

<211> 127

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 2B8

<400> 14

Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr 15 10 15

Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser

20 25 30

Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn

35 40 45

Val Val Ser Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Arg Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr

100 105 110

Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> > 15 <211> ' 5 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDl 2B8

<400> 15

Thr Tyr Trp Met His 1 5

<210> 16 <211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR2 2B8

<400> 16

Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Ser

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR3 2B8

<400> 17 Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr 1 5

<210> 18 <211> 11 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDRl 2B8

<400> 18

Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr Val Ser 1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR2 2B8

<400> 19

Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr 1 5

<210> 20 <211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR3 2B8

<400> 20

Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 21 <211> 412 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Região variável de cadeia pesada sintética 2F8 <400> 21 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 60 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 180 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 240 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 360 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag 412 <210> 22 <211> 137 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Região variável de cadeia pesada sintética 2F8 <400> 22 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu : Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Cys Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Thr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Thr Tyr Tyr Ile His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Lys Ile Gly Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80

Glu Met Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Leu Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 23

<211> 394

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 2F8

<400> 23

atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 240 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac 394

<210> 24

<211> 131

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 2F8

<400> 24

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Asn Ser Tyr Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Leu Lys 130

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDl 2F8

<400> 25

Thr Tyr Tyr Ile His 1 5

<210> 26 <211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR2 2F8

<400> 26

Lys Ile Gly Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys 15 10 15

Asp

<210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia pesada sintética CDR3 <400> 27 Arg Gly Leu Gly Arg Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética <400> 28 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly , 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética <400> 29 Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética <400> 30 Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Pro Thr 1 5 <210> 31 <211> 418 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

2F8

CDRl 2F8

15

CDR2 2F8

CDR3 2F8

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 3B6

<400> 31

atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 60

gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 120

tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 240

ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 300

tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 360

ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag 418

cagctcagca gcctaacatc ctacgtgaga actactttga

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Met Glu 1

Val His

32

139

PRT

Seqüência

artificial

Região variável de cadeia pesada sintética 3B6 32

Trp Pro Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Glu Gly

5 10 15

Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ser Asn Tyr Asn 65 70 75 80

Gly Asn Phe Lys Gly Lys Alci Thx Leu Thx Ala Asp Lys Seir Ser Sex

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Leu Gly Leu Arg Glu Asn Tyr Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 33

<211> 388

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 3B6

(metiominas iniciam 2 possíveis ATG) <400> 33

atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 60

aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 120 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 180 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 300 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 360 ggagggggga ccaagctgga aataaagc 388

<210> 34

<211> 129

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 3B6

(metiominas iniciam 2 possíveis) <400> 34

Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15

Phe Pro Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ser Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly Val 65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Thr Ser Leu Glu Asn Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln

100 105 110

Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125

Lys

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia pesada sintética CDl 3B6

<400> 35

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR2 3B6

<400> 36

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ser Asn Tyr Asn Gly Asn Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia pesada sintética CDR3 3B6 <400> 37 Gln Leu Gly Leu Arg Glu Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética CDRl <400> 38 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética CDR2 <400> 39 Arg Val Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética CDR3 <400> 40 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 41 <211> 397 <212> DNA <213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 3D11

<400> 41

atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gtacagctga aggagtcagg acctggcctg tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc tactggggcc aagggactct ggtcactgtc <210> 42

<211> 132

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 3D11

<400> 42

gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 60 gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 120 tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 180 tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 240 gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 300 atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 360 tctgcag 397 Met Ala Val Pro Val Leu Phe Leu Cys Leu Val Ala Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

20 25 30

Pro r Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Ser Tyr Ser Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80

Ser Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

115 120 125

Thr Val Ser Ala 130

<210> 43

<211> 385

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 3D11

<400> 43

atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 60

agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 120 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 360 gctgggacca agctggagct gaaac 385

<210> 44

<211> 128 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 3D11

<400> 44

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 15 10 15

Val Lys Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Met Ser Ala Tyr Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

35 40 45

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser

50 55 60

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

100 105 110

Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDl 3D11

<400> 45

Ser Tyr Ser Leu His 1 5 <210> 46

<211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR.2 3D11

<400> 46

Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met Ser 1 5 10 15

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR3 3D11

<400> 47

Glu Arg Phe Ala Tyr

1 5

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDRl 3D11

<400> 48

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR2 3D11

<400> 49

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR3 3D11

<400> 50

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5

<210> 51 <211> 424 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Região variável de cadeia pesada sintética 1D3 <400> 51 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 360 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 420 tcag 424 <210> 52 <211> 141 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 1D3

<400> 52

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15

Val Lys Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser

130 135 140

<210> 53

<211> 382

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 1D3

<400> 53

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tggaaataaa ac 382

<210> 54

<211> 127

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 1D3

<400> 54

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15

Asp Val Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp

100 105 110

Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 55

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDl 1D3 <400> 55 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia pesada sintética CDR2 <400> 56 Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr 1 5 10 Gly <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia pesada sintética CDR3 <400> 57 Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética <400> 58 Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu 1 5 10 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética <400> 59 Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Cadeia (capa) leve sintética <400> 60 Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 61 <211> 424 <212> DNA <213> Seqüência artificial

1D3

1D3

1D3

CDR3 1D3

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 1F3

<400> 61

atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 120

tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 180

gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240

gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300

caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 360 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcag 424

<210> 62 <211> 141

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 1F3

<400> 62

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15

Val Lys Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Ser Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 63

<211> 382

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 1F3

<400> 63

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 360 gggaccagac tggaaattaa ac 382

<210> 64

<211> 127

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 1F3

<400> 64

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val Tyr Asp Ala Thr His Leu Pro Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp

100 105 110

Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia pesada sintética CDl 1F3

<400> 65

Asn Tyr Phe Met Ser

1 5

<210> 66

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR2 1F3

<400> 66

Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

15 10 15

Gly

<210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR3 1F3

<400> 67

Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

15 10

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDRl 1F3

<400> 68

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala

15 10

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR2 1F3

<400> 69

Asp Ala Thr His Leu Pro Asp

1 5

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR3 1F3

<400> 70

Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 71

<211> 424

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 3A12

<400> 71

atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 120 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 360 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcag 424

<210> 72

<211> 141

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada sintética 3A12

<400> 72

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15

Val Lys Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Phe Met Ser Trp Vci 1 Airg Gln Thr- Pro Glu Lys Airg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 73

<211> 382

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 3A12

<400> 73

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tagaaataaa ac 382

<210> 74

<211> 127

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia (capa) leve sintética 3A12

<400> 74

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn

35 40 45

Ile Tyr Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val His Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly

Ser Leu Gln Ser 100

Gly Thr Pro Tyr 115

<210> 75

<211> 5

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDl 3A12

<400> 75

Asn Tyr Phe Met Ser

1 5

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR2 3A12

<400> 76

Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 77

<211> 13

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada sintética CDR3 3A12

<400> 77

Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr

15 10

<210> 78

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDRl 3A12

<400> 78

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ile Asn Leu Ala 15 10

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR2 3A12

<400> 79

Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp 1 5

<210> 80 <211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia (capa) leve sintética CDR3 3A12

<400> 80

Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 81 <211> 974

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile 85 90 95 Glu Asp Phe Gly Ser 105 Tyr Tyr Cys Gln His 110 Phe Thr Phe Gly Gly 120 Gly Thr Lys Leu Glu 125 Ile Lys <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região constante de cadeia pesada de referência IgGl de camun

dongo (J00453) (J00453)

<400> 81

ccaaaacgac acccccatct gtctatccac ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca attgtggttg taagccttgc atatgtacag ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg gtgaacttcc catcatgcac caggactggc acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc gtctgacctg catgataaca gacttcttcc atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca ctcctggtaa atga <210> 82 <211> 974

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Região constante de cadeia pesada de XgGl de camundongo determi

nado para (derivado de AJ cepa de camundongo) 1A3, 1D3, 1F3, 2B8

<400> 82

ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 60

ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 120 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc 180 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca 240 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 300 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 360 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 420 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 480 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 540 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 600 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 660 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 720 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 780 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 840 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 900 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 960 ctcctggtaa atga 974

<210> 83

<211> 323

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Região constante de cadeira capa livre de referência de camun

dongo e região constante de cadeira capa leve de camundongo de terminado para 1D3, 1F3, e 2B8 (derivado de AJ cepa de camundon go)

<400> 83

gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 60

gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 120 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 180

tggcccctgg atctgctgcc gctatttccc tgagccagtg acaccttccc agctgtcctg cctccagccc tcggcccagc ccaaggtgga caagaaaatt tcccagaagt atcatctgtc ctctgactcc taaggtcacg agttcagctg gtttgtagat agcagttcaa cagcactttc tcaatggcaa ggagttcaaa aaaccatctc caaaaccaaa ccaaggagca gatggccaag ctgaagacat tactgtggag ctcagcccat catgaacacg agagcaactg ggaggcagga accaccatac tgagaagagc

caaactaact 60 acagtgacct 120 gagtctgacc 180 gagaccgtca 240 gtgcccaggg 300 ttcatcttcc 360 tgtgttgtgg 420 gatgtggagg 480 cgctcagtca 540 tgcagggtca 600 ggcagaccga 660 gataaagtca 720 tggcagtgga 780 aatggctctt 840 aatactttca 900 ctctcccact 960 974 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac 240 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 300 gcttcaacag gaatgagtgt tag 323

<210> <211> <212> <213> <220> <223>

84

323

DNA

Seqüência artificial

Região constante de cadeia leve capa de camundongo sintético determinado por 1A3 contendo um nucleotídeo alterado como posi- ção comparada a 1D3, 1F3, e 2B8

<400> 84 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 60 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 120 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 180 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac 240 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 300 gcttcaacag gaatgagtgt tag 323 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de oligonecleotídeo sintético de mistura de iniciador universal BD SMART II A <400> 85 aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30

<210> <211> <212> <213> <220> <223>

<220> <221> <222> <223> <400>

tttttttttt tttttttttt tttttvn

86 27 DNA

Seqüência artificial

Iniciador de oligonecleotídeo universal RACE CDS

sintético de mistura de iniciador

misc_feature (27)..(27) η is a, c, g, 86

t OU U

27

<210> <211> <212> <213> <220> <223>

87 45 DNA

Seqüência artificial

Iniciador de oligonecleotídeo sintético de mistura de iniciador Iniciador Universal Mix A

<400> 87

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt

45

<210> <211> <212> <213> <220> <223>

88 22 DNA

Seqüência artificial

Iniciador de oligonecleotídeo sintético de mistura de iniciador Universal Primer Mix A

<400> 88

ctaatacgac tcactatagg gc

22 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador específico de região constante IgGl sintético <400> 89 tatgcaaggc ttacaaccac a 21 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador específico de região constante IgGl sintético <400> 90 gccagtggat agacagatgg gggtgtcg 28 <210> 91 <211> 27 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador sintético oligonucleotídeo <400> 91 ctcattcctg ttgaagctct tgacaat 27 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador sintético oligonucleotídeo <400> 92 cgactgaggc acctccagat gtt 23 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de oligonecleotídeo sintético de mistura de iniciador universalT7 <400> 93 taatacgact cactataggg 20 <210> 94 <211> 17 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador M13 dianteiro sintético de oligonecleotídeo <400> 94 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 95 <211> 18 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador M13 reverso sintético de oligonecleotídeo <400> 95 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 96 <211> 63 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador dianteiro de oligonucleotídeo sintético <400> 96 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccaccatgaa ctttgggctc agattgattt 60 tcc 63 <210> 97 <211> 54 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador reverso de oligonucleotídeo sintético <400> 97 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt catttaccag gagagtggga gagg 54 <210> 98 <211> 62 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador dianteiro de oligonucleotídeo sintético <400> 98 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccaccatggg atggagctat atcatcctct 60 tt 62 <210> 99 <211> 53 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador reverso de oligonucleotídeo sintético <400> 99 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt catttaccag gagagtggga gag 53 <210> 100 <211> 62 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador dianteiro de oligonucleotídeo sintético <400> 100 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccaccatgga atcacagact ctggtcttca 60 ta 62 <210> 101 <211> 54 <212> DNA <213> Seqüência artificial <22 0> <223> Iniciador reverso de oligonucleotídeo sintético <400> 101 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc taacactcat tcctgttgaa gctc 54 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Inieiador hHGF NotI iniciador oligonucleotídeo 5 sintético <400> 102 actggctagc atgtgggtga ccaaactcct 30 <210> 103 <211> 46 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Inieiador hHGF NotI his tag iniciador oligonucleotídeo 3 sinté tico <400> 103 gtgatggtga tggtgatggc ggccgcatga ctgtggtacc ttatat 46 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador His IgFc iniciador oligonucleotídeo 3 sintético <400> 104 actggcggcc gccatcacca tcaccatcac 30 <210> 105 <211> 31 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador IgFc BamHI iniciador oligonucleotídeo 3 sintético <400> 105 actgggatcc tcactattta cccggggaca g 31 <210> 106 <211> 27 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador sentido hHGF-Fc (G555E) sintético <400> 106 catgatgtcc acgaaagagg agatgag 27 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador antissentido hHGF-Fc (G555E) sintético <400> 107 ctcatctcct ctttcgtgga catcatg 27 <210> 108 <211> 37 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador sentido hHGF-Fc (C561R) sintético <400> 108 ggaagaggag atgagaaacg caaacaggtt ctcaatg 37 <210> 109 <211> 37 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador antissentido hHGF-Fc (C561R) sintético <400> 109 cattgagaac ctgtttgcgt ttctcatctc ctcttcc 37 <210> 110 <211> 29 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de fragmento 1 sintético para cadeia 5 alfa mHGF ini ciador NheI <400> 110 atcggctagc atgatgtggg ggaccaaac 29 <210> 111 <211> 36 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de fragmento 1 sintético para cadeia 5 Alfa mHGF ini ciador NheI <400> 111 ggttttgttt tgttgacgcc caacatttac cctaag 36 <210> 112 <211> 36 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de fragmento 2 sintético para cadeia beta hHGF V495 L585 <400> 112 ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattc 36 <210> 113 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de fragmento 2 sintético para beta cadeia hHGF V495 L585 <400> 113 tctagaccaa aattacttcg aacgagctgg acgttaggac 40 <210> 114 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de fragmento 3 sintético para beta cadeia mHGF C término <400> 114 agatctggtt ttaatgaagc ttgctcgacc tgcaatcctg 40 <210> 115 <211> 48 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de fragmento 3 sintético para beta cadeia mHGF C término <400> 115 cactaccact accactaccg ccggcgtgtt gaacatacag ttttaatg 48 <210> 116 <211> 38 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de mutagênese sintético 1 <400> 116 catcaccatc accatcacta agcgggtctg gtgccacg 38 <210> 117 <211> 38 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de mutagênese sintético 2 <400> 117 cgtggcacca gacccgctta gtgatggtga tggtgatg 38 <210> 118 <211> 2922 <212> DNA <220>

<223> Seqüência de nucleotídeo de proteína hHGF-Fc sintético

<400> 118

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660

ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720

caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780

cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840

gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900

gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960

tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020

cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080

gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140

ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200

ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260

gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320

cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380

tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440

gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500

acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560

ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620

ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680

tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740

ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800

aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860

ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920

aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980

gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040

caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100

aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160

ttaacatata aggtaccaca gtcatgcggc cgccatcacc atcaccatca ctccgcgggt 2220

ctggtgccac gcggtagtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 2280

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2340

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2400

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2460

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2520

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2580

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 2640

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 2700

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2760

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 2820

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2880

cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ag 2922 <210> 119 <211> 919 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de aminoácido de proteína hHGF-Fc sintético

(sem seqüência de sinal e pró-domínio)

<400> Pro Ala 1

119

Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys

5 10 15 Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala

20 25 30

Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn

35 40 45

Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu

50 55 60

Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg 65 70 75 80

Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln

85 90 95

Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly

115 120 125

Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr

130 135 140

Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys 145 150 155 160

Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys

165 170 175

Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu

180 185 190

Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn

195 200 205

Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr

210 215 220

Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn 225 230 235 240

Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly

245 250 255

Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys

260 265 270

Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro Glu

275 280 285

Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp

290 295 300

Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val 305 310 315 320

Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln Asp

325 330 335

Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr

340 345 350

Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu

355 360 365

His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn

370 375 380

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 385 390 395 400

Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu

405 410 415

Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser

420 425 430

Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg

435 440 445

Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile

450 455 460

Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln 465 470 475 480

Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile

485 490 495

His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn

500 505 510

Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met 515 520 525 Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp

530 535 540

Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val 545 550 555 560

Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg

565 570 575

Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His

580 585 590

Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu

595 600 605

Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val

610 615 620

Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly 625 630 635 640

Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala

645 650 655

Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro

660 665 670

Gln Ser Cys Gly Arg His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val

675 680 685

Pro Arg Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

690 695 700

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 705 710 715 720

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

725 730 735

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

740 745 750

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

755 760 765

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

770 775 780

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 785 790 795 800

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

805 810 815

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

820 825 830

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

835 840 845

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

850 855 860

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 865 870 875 880

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

885 890 895

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

900 905 910

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

915

<210> <211> <212> <213> <220> <223>

120

2901

DNA

Seqüência artificial

<400>

Seqüência nucleotídeo que codifica proteína quimérica mhm (V495- L585)-Fc 120

atgatgtggg ctcctgcttc catgaattta aaaaccaaaa tttacgttca

ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60

atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120

aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180

aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240

cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300 cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa gaaaacaaag actatattag aaactgcatc gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct aaatgcaagg accttagaga aaattattgc tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg catatcttct gggagccaga tgctagcaaa gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg cctatttccc gttgtgaagg agatactaca atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg ataggatgga tggttagttt gagatacaga aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ctcaatgttt cccagctggt atatggccct gctcgacctg caatcctgga taactttgtc acaatccctg aaaagaccac ttgcagtatt gcggatggtt tattacgagt agctcatctg caccatcaag gcaaggtgac tttgaatgag ggatcaggac catgtgaggg agattatggt agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt atttttgttc gagtagcata ttatgcaaaa ttgtgcggcc gccatcacca tcaccatcac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag aaggtctcca acaaagccct cccagccccc cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct tccctgtccc cgggtaaata g

aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360

attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420

cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480

aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540

gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600

aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660

tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720

tttgatgata attattgccg caatcctgat 780

gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840

gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900

ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960

cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020

cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080

ggctactgct ctcaaattcc caagtgtgac 1140

aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200

tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260

ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320

gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 13 80

cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440

gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac 1500

aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560

tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620

ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt 1680

gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt 1740

agtacaattg atttacctag ttatggttgt 1800

tacggctggg gctacactgg attgatcaac 1860

tatattatgg ggaatgagaa atgcagtcag 1920

tctgagttat gtgctggggc tgaaaagatt 1980

ggcccactca tttgtgaaca acacaaaatg 2040

cgtggatgtg ccatcccaaa tcgtcctggt 2100

tggatacaca aagtaatttt gacatacaag 2160

tccgcgggtc tggtgccacg cggtagtgac 2220

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 2280

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 2340

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 2400

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 2460

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 2520

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 2580

cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 2640

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 2700

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 2760

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 2820

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 2880

2901

<210> 121

<211> 911

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> seqüência de aminiácido de forma ativa mhm-Fc sintético (seqüên- cia de sinal) e pró-domínio removido)

<400> 121

Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys 1 5

Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg 20

Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys

35 40

Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys

50 55

Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg 65 70

Lys Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys

10 15

Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala 25 30

Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn 45

Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu 60

Asn Cys Xle Ile Gly Lys Gly Gly 75 80 Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln

85 90 95

Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp

100 105 110

Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro

115 120 125

Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile

130 135 140

Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr 145 150 155 160

Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp

165 170 175

Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro

180 185 190

Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro

195 200 205

Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys

210 215 220

Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala Val Asn Glu Thr Asp Val Pro 225 230 235 240

Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly

245 250 255

Thr Ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser

260 265 270

Gln Tyr Pro His Lys His Asp Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys

275 280 285

Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu Ser Pro

290 295 300

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln 305 310 315 320

Ile Pro Lys Cys Asp Val Ser Ser Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn

325 330 335

Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ser Gly Leu Thr

340 345 350

Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe

355 360 365

Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

370 375 380

Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile 385 390 395 400

Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro

405 410 415

Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys

420 425 430

Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp

435 440 445

Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu

450 455 460

Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg 465 470 475 480

Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly

485 490 495

Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Va. 1 Leu Asn Vâl Ser Gln Leu Val

500 505 510

Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro

515 520 525

Ala Ile Leu Asp Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Ser Tyr Gly

530 535 540

Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr 545 550 555 560

Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr

565 570 575

Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys Val Thr 580 585 590 Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly

595 600 605

Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys

610 615 620

Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile 625 630 635 640

Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp

645 650 655

Ile His Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu Cys Gly Arg His His His

660 665 670

His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp Lys Thr His

675 680 685

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

690 695 700

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 705 710 715 720

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

725 730 735

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

740 745 750

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

755 760 765

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

770 775 780

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 785 790 795 800

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

805 810 815

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

820 825 830

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

835 840 845

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

850 855 860

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 865 870 875 880

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

885 890 895

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

900 905 910

<210> 122 <211> 1398

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de ácido nucleíco que codifica seqüência de cadeia

pesada 2B8 de comp. total sintético (Região variável de cadeia pesada 2B8 e região constatnte IgGl)

<400> 122

atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca ggttactacg gggactatgc tatggactac tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc acctggaact ctggatccct gtccagcggt gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc

gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60 gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180 agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 240 agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 360 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480 aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540 gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600 gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660 agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720 acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780 attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900

gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960

gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020

gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080

ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140

gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200

tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260

tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320

ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380

cactctcctg gtaaatga 1398

<210> <211> <212> <213> <220> <223>

123 446 PRT

Seqüência artificial

Seqüência de proteína que defininda seqüência de cadeia pesada 1A3 de comprimento total (1A3) região variável de cadeia pesada 1A3 e região constante IggGl)(sem seqüência de sinal)

<400> 123

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 · 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Gln Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Ala Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

115 . . 120 125

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

210 215 220

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

245 250 255

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

275 280 285

Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

290 295 300

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro 340 345 350

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

355 360 365

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

405 410 415

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

420 425 430

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 124

<211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de ácido nucleíco que codifica seqüência de cadeia

pesada 2B8 de comp. total sintético (Região variável de cadeia pesada 2B8 e região constatnte IgGl) <400> 124

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcatg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705

<210> 125

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de proteína que definindo seqüência de cadeia pesada

1A3 de comprimento total (1A3) região variável de cadeia pesada 1A3 e região constante IggGl)(sem seqüência de sinal)

<400> 125

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Met Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210

<210> 126 <211> 1386

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length

2B8 Heavy Chain Sequenee (2B8 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region)

<400>

126

atgggatgga gctatatcat cetetttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240

gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 360

ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 420

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480

accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540

ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600

ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660

gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720

tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780

cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840

agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900

gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960

cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020

gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080

caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140

tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200

ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260

tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320

gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380

aaatga 1386

127 442 PRT

Seqüência artificial

<210> <211> <212> <213> <22 0>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 2B8 Heavy

Chain Sequence (2B8 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) (without signal sequence) <400> 127

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

10

15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20

25

30

Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35

40

45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50

55

60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65

70

75

80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85

90

95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100

105

110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro

210 215 220

Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp

260 265 270

Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320

Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln

340 345 350

Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe

355 360 365

Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu

370 375 380

Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 385 390 395 400

Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn

405 410 415

Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

420 425 430

Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 128 <211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetic Full Length 2B8

Light Chain Sequenee (2B8 Capa Variable Region and Constant Region) <400> 128

atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 60

aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 180 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 300 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaggc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705

<210> 129

<211> 214 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 2Β8 Light

Chain Sequence (2Β8 Capa Variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 129

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Arg Ala 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210

<210> 130

<211> 1386

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 2F8

Heavy Chain Sequence (2F8 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) <400> 130

atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 60

gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 180 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 240 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 360 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 420 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380 aaatga 1386

<210> 131

<211> 442

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 2F8 Heavy

Chain Sequence (2F8 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) (without signal sequence) <400> 131

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Lys Ile Gly Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Leu Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr

180 185 190

Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro

210 215 220

Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp

260 265 270

Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 305 310 315 320

Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

325 330 335

Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln

340 345 350

Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe

355 360 365

Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu

370 375 380

Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe 385 390 395 400

Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 405 410 415

Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

420 425 430

Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 132

<211> 717

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Aeid Sequenee Encoding synthetic Full Length 2F8 Light

Chain Sequence (2F8 Capa Variable Region and Constant Region) <400> 132

atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 240 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717

<210> 133

<211> 218 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 2F8 Light

Chain Sequence (2F8 Capa Variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 133

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asn Ser Tyr Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Val Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile

85 90 95

Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 134

<211> 1392 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequenee Encoding synthetie Full Length 3Β6

Heavy Chain Sequence (3Β6 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) <400> 134

atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 60

gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 120 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 240 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 300 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 360 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 420 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 600 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 660 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 720 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 780 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 840 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 900 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 960 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1020 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1080 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1140 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1200 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1260 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1320 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1380 cctggtaaat ga 1392

<210> 135

<211> 444

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetie Full Length 3B6 Heavy

Chain Sequence (3B6 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant egion) (without signal sequence) <400> 135

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ser Asn Tyr Asn Gly Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Gln Leu Gly Leu Arg Glu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys

210 215 220

Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

290 295 300

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 305 310 315 320

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

325 330 335

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys

340 345 350

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp

355 360 365

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 385 390 395 400

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala

405 410 415

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His

420 425 430

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 136

<211> 711

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Full Length 3B6 Light

Chain Sequenee (3B6 Capa Variable Region and Constant Region) <400> 136

atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt teeaggtate 60

aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 120 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 180 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 300 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 360 ggagggggga ccaagctgga aataaagcgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 480 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 540 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 600 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 660 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta g 711

<210> 137

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3B6 Light

Chain Sequence (3B6 Capa Variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 137

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr 20 25

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly

35 40

Tyr Arg Val Asn Arg Leu Val Asp Gly

50 55

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Ser Ser Leu 65 70

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu 85

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser

115 120

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn

130 135

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser 145 150

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys 165

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu 180 185

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser

195 200

Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210

<210> 138

<211> 1361

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Full Length 3D11

Heavy Chain Sequenee (3D11 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) <400> 138

atggctgtce cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcceag 60

gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 120 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 180 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 240 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 300 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 3 60 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc 42 0 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg 480 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc 540 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg 600 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc 660 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata 720 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc 780 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc 840 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc 900 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag 960 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt 1080 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac 1140 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac 1200 aagaacactc agcccatcat ggacacagat ggctcttact tcgtctacag caagctcaat 1260 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc 1320 ctgcacaacc accatactga tcccactctc ctggtaaatg a 1361

<210> 139

<211> 437

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3D11 Heavy

Chain Sequence (3D11 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant

30

Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 45

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Thr Ile Thr Ser Leu Glu Asn

75 80

Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe 90 95

Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 110

Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 125

Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 140

Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 155 160

Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 170 175

Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 190

Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 205 Region) (without signal sequence)

<400>

139

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Ser Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser

115 120 125

Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser 145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr

165 170 175

Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr

180 185 190

Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val

210 215 220

Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val 225 230 235 240

Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile

245 250 255

Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val

260 265 270

Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

275 280 285

Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu

290 295 300

Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala 305 310 315 320

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro

325 330 335

Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys

340 345 350

Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr

355 360 365

Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr

370 375 380

Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu 385 390 395 400

Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser

405 410 415

Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser

420 425 430

His Ser Pro Gly Lys

435

<210> <211> <212> <213> <22 0> <223>

140 708 DNA

Seqüência artificial

Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 3D11 Light Chain Sequence (3D11 Capa Variable Region and Constant Region) <400> 140

atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 60

agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 120 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 360 gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480 taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600 acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag 708

<210> 141

<211> 213

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3D11 Light

Chain Sequence (3D11 Capa Variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 141

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Tyr Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro

100 105 110

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys 210

<210> 142

<211> 1398

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 1D3 Heavy

Chain Sequence (1D3 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) <400> 142

atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 360 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 420 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380 cactctcctg gtaaatga 1398

<210> 143

<211> 446

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1D3 Heavy

chain sequence (1D3 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) (without signal sequence) <400> 143

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

210 215 220

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

245 250 255

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 275 280 285 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

290 295 300

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

355 360 365

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

405 410 415

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

420 425 430

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 144

<211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequenee Encoding synthetic Full Length 1D3

Light Chain Sequenee (1D3 Capa Variable Region and Constant Region) <400> 144

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705

<210> 145

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1D3 Light

Chain Sequence (1D3 Capa Variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 145

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gl.y Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 164

115

120

125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130

135

140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145

150

155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210

<210> 146

<211> 1398

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Full Length 1F3

Heavy Chain Sequence (1F3 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) <400> 146

atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag 60

gtgeagetgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 360 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380 cactctcctg gtaaatga 1398

<210> 147

<211> 446

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1F3 Heavy

Chain Sequence (1F3 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) (without signal sequence) <400> 147

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20

25

30

Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35

40

45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50

55

60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

210 215 220

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

245 250 255

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

275 280 285

Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

290 295 300

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 . 320

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

355 360 365

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

405 410 415

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

420 425 430

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 148

<211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Aeid Sequence Eneoding synthetic Full Length 1F3 Light

Chain Sequence (1F3 Capa Variable Region and Constant Region) <400> 148

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagectec ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggate aggcacacag ttttccctca agatcaacag ectgcagtet 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta etecgtacac gtttggaggg 360 gggaccagae tggaaattaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tecagtgage agttaaeate tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705

<210> 149

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1F3 Light

Chain Sequence (1F3 Capa Variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 149

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asp Ala Thr His Leu Pro Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210

<210> 150

<211> 1398

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleie Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 3A12

Heavy Chain Sequence (3A12 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) <400> 150

atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 120 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 360 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380 cactctcctg gtaaatga 1398

<210> 151

<211> 446

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3Α12 Heavy

Chain Sequence (3Α12 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) (without signal sequence) <400> 151

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Tliir Leu Tyir 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

210 215 220

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe 225 230 235 240

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

245 250 255

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

275 280 285

Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

290 295 300

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile 355 360 365 Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

405 410 415

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

420 425 430

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 152

<211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 3A12 Light

Chain Sequenee (3A12 Capa Variable Region and Constant Region) <400> 152

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 3 00 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tagaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705

<210> 153

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3A12 Light

Chain Sequence (3A12 Capa Variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 153

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 15 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ile Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

His Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210

<210> 154

<211> 1404

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Full Length Chimeric

2Β8 Heavy Chain (Mouse Variable Region and Human IgGl Constant Region) (allotype Glm(17,l)) <400> 154

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404

<210> 155

<211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Chimeric

2B8 Heavy Chain (Chimeric 2B8 IgGl (Glm(17,l) allotype) (without signal sequence) <400> 155

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 156

<211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Chimeric

2B8 Light Chain (Mouse Variable Region and Human Constant Region) (Chimeric 2B8 Capa (Km(3))) <400> 156

atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 60

aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 180 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 300 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaggc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 705

<210> 157

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Chimeric 2B8 Light Chain (Chimeric 2B8 Capa) (without signal seguence) <400> 157

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Arg Ala 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 158

<211> 412

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetie Humanized Hu2B8

Hvl-f.l Heavy Chain Variable Region <400> 158

atggactgca eetggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggeae ccacgccgag 60

gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 120 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 180 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag 412

<210> 159

<211> 118 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetie Humanized Hu2B8 Hvl-f.l

Heavy Chain Variable Region (without signal sequence) <400> 159

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 160 <211> 992

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequenee Encoding synthetic Human IgGl Heavy

Chain Constant Region (Glm(17,l) allotype) <400> 160

cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60

gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 300 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 720 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgácctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 960 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 992

<210> 161 <211> 330

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Human IgGl Heavy Chain

Constant Region (Glm(17,l) allotype) <400> 161

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 162 <211> 1404

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetic Full Length Heavy

Chain Humanized Hu2B8 Hvlf.l Variable Region and Human IgGl (Glm(17,l) allotype) Heavy Chain Constant Region <400> 162

atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag 60

gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 120 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 180 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404

<210> 163

<211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Heavy Chain

Humanized Hu2B8 Hvlf.l Variable Region and Human IgGl Heavy Chain Constant Region (Glm(17,l) allotype) (without signal sequence) <400> 163

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435

440

445

<210> <211> <212> <213>

164 412 DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Seguence Eneoding synthetic Humanized Hu2B8

Hv5a.1 Heavy Chain Variable Region

<400>

164

atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120

tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180

gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240

ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300

cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag 412

<210> 165

<211> 118 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Hv5a.l

Heavy Chain Variabl <400> 165

Glu Val Gln Leu Val 1 5

Ser Leu Arg Ile Ser 20

Trp Met His Trp Val 35

Gly Glu Ile Asn Pro 50

Gln Gly His Val Thr 65

Leu Gln Trp Ser Ser 85

Ala Arg Asn Tyr Val 100

Leu Val Thr Val Ser 115

<210> 166 <211> 1404

<212> DNA

<213> Sequênc

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized

Hu2B8 Hv5a.1 Heavy Chain Variable Region and Human IgGl (Glm(17,l) allotype) Heavy Chain Constant Region <400> 166

atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 3 00 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 3 60 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 13 80 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404

<210> 167

<211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized

e Region (without signal sequence)

Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

10 15

Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr

25 30

Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

40 45

Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe

55 60

Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 70 75 80

Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

90 95

Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 105 110

Ser

ia artificial Hu2B8 Hv5a.1 Heavy Chain Variable Region and Human IgGl (Glm(17,l) allotype) Heavy Chain Constant Region (without signal sequence) <400> 167

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435

440

445

<210> <211> <212> <213> <220>

168 412 DNA

Seqüência artificial <223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetic Humanized Hu2B8 Ην5-51.1 Heavy Chain Variable Region

<400> 168

atggggteaa ccgecatect cgccctcete gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc ggtagcatct ttgactactg gggccaagga

<210> 169

<211> 118 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Hv5-51.1

Gly Glu 15

Thr Tyr

Trp Met

Ser Phe

Ala Tyr 80 Tyr Cys 95

Gly Thr

<22 0>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized

Hu2B8 Hv5-51.1 Heavy Chain Variable Region and Human IgGl (Glm(17,l) allotype) Heavy Chain Constant Region <400> 170

atggggteaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc

ctggctgttc tccaaggagt aaaaagcccg gggagtctct tactggatgc actgggtgcg aatcctacca acggtcatac gctgacaagt ccatcagcac gccatgtatt actgtgcgag accctggtca ccgtctcctc

ctgtgccgaa 60 gaagatctcc 120 ccagatgccc 180 taactacaat 240 tgcctacctg 300 aaactatgtt 360 ag 412

Heavy Chain Variable Sequence (without signal sequence) <400> 169

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 15 10

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr 65 70 75

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr

85 90

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 170

<211> 1404

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404

<210> 171

<211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized

Hu2B8 Ην5-51.1 Heavy Chain Variable Region and Human IgGl (Glm(17,l) allotype) Heavy Chain Constant Region (without signal sequence) <400> 171

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 172

<211> 388

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Humanized Hu2B8

Kvl-39.1 Capa Chain Variable Region <400> 172

atggacatga gggtececgc tcagcteetg gggcteetge tactetgget ccgaggtgee 60

agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaac 388

<210> 173

<211> 107

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Kvl-39.1

Capa Chain Variable Region (without signal sequence) <400> 173

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 174

<211> 323

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Human Capa Chain

Constant Region (Km(3) allotype) (allele 2) <400> 174

gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60

gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 180 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300 gcttcaacag gggagagtgt tga 323

<210> 175

<211> 107

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Human Capa Chain

Constant Region (Km(3) allotype) (allele 2) <400> 175

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 176

<211> 711

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetic Full Length Humanized

Hu2B8 Kv-39.1 Light Chain Variable Region and Human Capa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 2) <400> 176

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60

agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a 711

<210> 177

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized

Hu2B8 Kvl-39.1 Light Chain Variable Region and Human Capa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 177

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 178

<211> 382

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetie Humanized Hu2B8

Kv3-15.1 Light Chain Variable Region <400> 178

atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 360 gggaccaagc tggagatcaa ac 3 82

<210> 179

<211> 107

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetie Humanized Hu2B8 Kv3-15.1

Light Chain Variable Region (without signal sequence) <400> 179

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 180 <211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Encoding synthetie Full Length Humanized Hu2B8

Kv3-15.1 Light Chain Variable Region and Human Capa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 2) <400> 180

atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 360 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 705

<210> 181 <211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Κν3-15.1

Light Chain Variable Region and Human Capa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 2) (without signal sequence) <400> 181

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 182 <211> 412 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized LR2B8HC Heavy Chain Variable Region <400> 182 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa 60 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 120 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 180 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 240 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 300 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 360 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc ag 412 <210> 183 <211> 118 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized LR2B8HC Heavy

Chain Variable Region (without signal sequence) <400> 183

Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35

40

45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50

55

60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65

80

70 75

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Leu Thr Val Ser Ser 115

184 992 DNA

Seqüência artificial

<210> <211> <212> <213> <220> <223>

Nucleic Acid Sequenee Encoding synthetic Human IgGl Heavy Chain

Constant Region (Glm(3) allotype) (allele 1)

<400>

184

ccagcacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgtccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga 185 330 PRT

Seqüência artificial

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 992

<210> <211> <212> <213> <22 0> <223>

Protein Sequence Defining synthetic Human IgGl Heavy Chain (Glm(3) allotype) (allele 1 or 2)

Constant Region <400> 185

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

10

15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20

25

30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35

40

45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50

55

60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65

70

75

80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 85

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

90

95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100

105

110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115

120

125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130

135

140 Val Val Val Asp Val 145

Tyr Val Asp Gly Val 165

Glu Gln Tyr Asn Ser 180

His Gln Asp Trp Leu 195

Lys Ala Leu Pro Ala 210

Gln Pro Arg Glu Pro 225

Met Thr Lys Asn Gln 245

Pro Ser Asp Ile Ala 260

Asn Tyr Lys Thr Thr 275

Leu Tyr Ser Lys Leu 290

Val Phe Ser Cys Ser 305

Gln Lys Ser Leu Ser 325

<210> 186 <211> 1404

<212> DNA

<213> Sequênc

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Full Length Heavy

Chain Humanized LR2B8HC Heavy Chain Variable Region and Human IgGl Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (allele 1) <400> 186

atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctacegatgt gcactctcaa 60

gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatetgt taaactctca 120 tgcaaagcct caggataeae tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 180 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 240 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 300 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtetaet attgcgccag aaactacgta 360 ggatcaatat tegattaetg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc agccagcaca 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacetetgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgaeggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaate acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgtce accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc eccategaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cecgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat egeegtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tetteetcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ccccgggtaa atga 1404

<210> 187

<211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Heavy Chain

Humanized LR2B8HC Heavy Chain Variable Region and Human IgGl Heavy

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 150 155 160

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

170 175

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

185 190

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

200 205

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

215 220

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 230 235 240

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

250 255

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

265 270

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

280 285

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

295 300

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 310 315 320

Leu Ser Pro Gly Lys 330

ia artificial Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (allele 1) (without signal sequence)

<400> 187

Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Thr 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 188 <211> 412

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetie Humanized LRMR2B8HC

Heavy Chain Variable Region <400> 188

atgggttggt catatattat actetttctc gtagccaceg ccaeegacgt acactctcag 60

gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 120 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 180 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 240 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 300 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 360 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc ag 412

<210> 189

<211> 118 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetie Humanized LRMR2B8HC Heavy

Chain Variable Region (without signal sequence)

<400>

189

Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

10

15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20

25

30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35

40

45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50

55

60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65

70

75

80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85

90

95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 190

<211> 1404

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Aeid Sequence Encoding synthetie Full Length Heavy

Chain Humanized LRMR2B8HC Heavy Chain Variable Region and Human IgGl Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (allele 1) <400> 190

atgggttggt catatattat actetttctc gtagccaceg ccaccgacgt acactctcag 60

gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 12 0 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 180 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 240 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 300 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 360 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc agccagcaca 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ccccgggtaa atga 1404

<210> 191

<211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Heavy Chain

Humanized LRMR2B8HC Heavy Chain Variable Region and Human IgGl Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (allele 1) (without signal sequence) <400> 191

Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420

Leu His Asn His 435

<210> 192

<211> 360

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Humanized LR2B8LC

Light Chain Variable Region <400> 192

atggaaagte agaeeettgt atteatctet attcttettt ggttgtatgg agcagacggc 60

gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 120 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 180 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 240 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 300 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa 360 <210> 193

<211> 107

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized LR2B8LC Light

Chain Variable Region (without signal sequence)

<400> 193 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Met Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr 20 Leu Asn Cys Lys Ala 25 Ser Glu Asn Val Val 30 Ser Tyr Val Ser Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Gln Ser Pro Lys 45 Leu Leu Ile Tyr Gly 50 Ala Ser Asn Arg Asn 55 Thr Gly Val Pro Asp 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp 85 Tyr His Cys Gly Gln 90 Ser Tyr Asn Tyr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Lys <210> 194 <211> 323 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Human Capa Chain

Constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 194

gtacggtggc tgcaccatct gtctteatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgectc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tag <210> 195

<211> 107

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Encoding synthetic Hximan Capa Chain Constant

Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 195

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 445

60 120 180 240 300 323 1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 196

<211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized

LR2B8LC Light Chain Variable Region and the Human Capa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 196

atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc 60

gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 120 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 180 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 240 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 300 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa 360 ggaaccaaac tcgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705

<210> 197

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized

LR2B8LC Light Chain Variable Region and the Human Capa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 197

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Met Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 198

<211> 382

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetic Humanized LRMR2B8LC

Light Chain Variable Region <400> 198

atggaateec aaaeccttgt tttcatetet atcettetct ggetttatgg cgccgacgga 60

gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 120 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 180 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 240 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 300 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 360 ggcactaaac ttgaaattaa ac 382

<210> 199

<211> 107

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized LRMR2B8LC Light

Chain Variable Region (without signal sequence) <400> 199

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 200 <211> 705

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized

LRMR2B8LC Light Chain Variable Region and the Human Capa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 200

ggetttatgg cgccgacgga 60 gcttgggcga acgagtaaca 120 cctggtatca gcaaaaacct 180 gtgaaagtgg cgtcccagac 240 caatttctag cgttcaggcc 300 atccttatac tttcggacaa 360 ctgtcttcat cttcccgcca 420 gcctgctgaa taacttctat 480 tccaatcggg taactcccag 540 gcctcagcag caccctgacg 600 gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705

<210> 201

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized

LRMR2B8LC Light Chain Variable Region and the Human Capa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 201

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 202 <211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Heavy Chain CDR2 sequence (Kabat Definition) of synthetic

humanized Hu2B8 Hvlf.l antibody <400> 202

Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Gln 15 10 15

Gly

<210> 203

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Heavy Chain CDR2 sequence (Kabat Definition) of synthetic

humanized Hu2B8 Hv5a.l antibody <400> 203

Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe Gln 15 10 15

Gly

<210> 204

<211> 17 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Heavy Chain CDR2 sequence (Kabat Definition) Of synthetic humanized LR2B8HC antibody <400> 204

Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 205 <211> 17 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Heavy Chain CDR2 sequence (Kabat Definition) Of synthetic humanized LRMR2B8HC antibody <400> 205 Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 206 <211> 7 <212> PRT <213> . Seqüência artificial <220> <223> Light Chain CDR2 sequence (Kabat Definition) Of synthetic humanized LRMR2B8LC antibody <400> 206 Gly Ala 1 Ser Asn Arg Glu Ser C J. <210> 207 <211> 992 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Hiiman IgGl Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (allele 2) <400> 207 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120

ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180

gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240

acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 300

aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360

cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420

aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480

acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540

gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600

agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaag accatctcca 660

aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 720

tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780

ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840

tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900

agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 960

agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 992 <210> 208 <211> 330 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Sequence Defining synthetic Human IgGl Heavy Chain Cons-

tant Region (Glm(3) allotype) (allele 1 or 2) <400> 208

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 209

<211> 1404

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Nucleic Aeid Sequence Eneoding synthetic Full Length Chain Con-

taining Humanized Hu2B8 Hv5-51.1 Heavy Chain Variable Region and the Human IgGl Heavy Chain Constant Region Glm(3) allotype (allele 2) <400> 209

atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga agaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404

<210> 210 <211> 448

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Protein Seguence Defining synthetic Full Length Heavy Chain Con-

taining Humanized Hu2B8 Ην5-51.1 and the Human IgGl Heavy Chain Constant Region Glm(3) allotype (allele 2) (without signal sequence) <400> 210

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 211 <211> 2209

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Synthetic HGF mhm (V495-L585)

<400> 211

atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60 ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120 catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180 aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240 tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300 cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360 gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420 gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480 cacagctttt tgccttcgag ctatcgcggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 540 cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 600 gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg tgaaagctac 660 agaggtccca tggatcacac agaatcaggc aagacttgtc agcgctggga ccagcagaca 720 ccacaccggc acaagttctt gccagaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 780 tgccgcaatc ctgatggcaa gccgaggcca tggtgctaca ctcttgaccc tgacaccact 840 tgggagtatt gtgcaattaa aacgtgcgct cacagtgctg tgaatgagac tgatgtccct 900 atggaaacaa ctgaatgcat tcaaggccaa ggagaaggtt acaggggaac cagcaatacc 960 atttggaatg gaattccctg tcagcgttgg gattcgcagt accctcacaa gcatgatatc 1020 actcccgaga acttcaaatg caaggacctt agagaaaatt attgccgcaa tccagatggg 1080 gctgaatcac catggtgttt taccactgac ccaaacatcc gagttggcta ctgctctcag 1140 attcccaagt gtgacgtgtc aagtggacaa gattgttatc gtggcaatgg gaaaaattac 1200 atgggcaact tatccaaaac aaggtctgga cttacatgtt ccatgtggga caagaatatg 1260 gaggatttac accgtcatat cttctgggag ccagatgcta gcaaattgaá taagaattac 1320 tgccggaatc ctgatgatga tgcccatgga ccttggtgct acacggggaa tcctcttatt 1380 ccttgggatt attgccctat ttcccgttgt gaaggagata ctacacctac aattgtcaat 1440 ttggaccatc ctgtaatatc ctgtgccaaa acaaaacaac tgcgggttgt aaatgggatt 1500 ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 1560 ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 1620 gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 1680 aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 1740 gttttaatga agcttgctcg acctgcaatc ctggataact ttgtcagtac aattgattta 1800 cctagttatg gttgtacaat ccctgaaaag accacttgca gtatttacgg ctggggctac 1860 actggattga tcaacgcgga tggtttatta cgagtagctc atctgtatat tatggggaat 1920 gagaaatgca gtcagcacca tcaaggcaag gtgactttga atgagtctga gttatgtgct 1980 ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggagatt atggtggccc actcatttgt 2040 gaacaacaca aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatc 2100 ccaaatcgtc ctgttatttt tgttcgagta gcatattatg caaaatggat acacaaagta 2160 attttgacat acaagttgtg cggccgccat caccatcacc atcactaag 2209

<210> 212 <211> 680 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Synthetic HGF mhm495-585 active

<400> 212 Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15

Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala

20 25 30

Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn

35 40 45

Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu

50 55 60

Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80

Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln

85 90 95

Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly

115 120 125

Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr

130 135 140

Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys 145 150 155 160

Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys

165 170 175

Thr Cys Gln Arg Trp Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu

180 185 190

Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn

195 200 205

Pro Asp Gly Lys Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr

210 215 220

Thr Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala Val Asn 225 230 235 240

Glu Thr Asp Val Pro Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly

245 250 255

Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys

260 265 270

Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Lys His Asp Ile Thr Pro Glu

275 280 285

Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp

290 295 300

Gly Ala Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val 305 310 315 320

Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Lys Cys Asp Val Ser Ser Gly Gln Asp

325 330 335

Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr

340 345 350

Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu

355 360 365

His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn

370 375 380

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 385 390 395 400

Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu

405 410 415

Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser

420 425 430

Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg

435 440 445

Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile

450 455 460

Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln 465 470 475 480

Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile

485 490 495

His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn 500 505 510 Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met

515 520 525

Lys Leu Ala Arg Pro Ala Ile Leu Asp Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp

530 535 540

Leu Pro Ser Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile 545 550 555 560

Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg

565 570 575

Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His

580 585 590

Gln Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu

595 600 605

Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile

610 615 620

Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly 625 630 635 640

Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Val Ile Phe Val Arg Val Ala

645 650 655

Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu Cys

660 665 670

Gly Arg His His His His His His

675 680

<210> 213

<211> 2194

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Synthetic HGF mhm (I499-R556)

<400> 213

atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60

ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120

catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180

aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240

tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300

cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360

gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420

gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480

cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540

gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600

cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660

cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720

ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcctgat 780

ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840

attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900

tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960

ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020

aaatgcaagg accttagaga aaattattgc cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080

tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt ggctactgct ctcagattcc caagtgtgac 1140

gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200

aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260

catatcttct gggagccaga tgctagcaaa ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320

gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 1380

cctatttccc gttgtgaagg agatactaca cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440

atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac 1500

ataggatgga tggttagttt gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560

aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620

gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ggaagaggag aggagaaaag aaaacagatt 1680

ctcaatattt cccagctggt atatggccct gaaggatcag atctggtttt actgaagctt 1740

gctcgacctg caatcctgga taactttgtc agtacaattg atttacctag ttatggttgt 1800

acaatccctg aaaagaccac ttgcagtatt tacggctggg gctacactgg attgatcaac 1860

gcggatggtt tattacgagt agctcatctg tatattatgg ggaatgagaa atgcagtcag 1920

caccatcaag gcaaggtgac tttgaatgag tctgagttat gtgctggggc tgaaaagatt 1980

ggatcaggac catgtgaggg agattatggt ggcccactca tttgtgaaca acacaaaatg 2040

agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt cgtggatgtg ccatcccaaa tcgtcctggt 2100 atttttgttc gagtagcata ttatgcaaaa tggatacaca aagtaatttt gacatacaag 2160 ttgtgcggcc gccatcacca tcaccatcac taag 2194

<210> 214

<211> 675

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Synthetic HGF mhm 499-556 active

<400> 214

Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15

Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala

20 25 30

Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn

35 40 45

Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu

50 55 60

Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80

Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln

85 90 95

Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp

100 105 110

Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro

115 120 125

Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile

130 135 140

Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr 145 150 155 160

Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp

165 170 175

Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro

180 185 190

Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro

195 200 205

Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys

210 215 220

Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala Val Asn Glu Thr Asp Val Pro 225 230 235 240

Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly

245 250 255

Thr Ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser

260 265 270

Gln Tyr Pro His Lys His Asp Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys

275 280 285

Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu Ser Pro

290 295 300

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln 305 310 315 320

Ile Pro Lys Cys Asp Val Ser Ser Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn

325 330 335

Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ser Gly Leu Thr

340 345 350

Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe

355 360 365

Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

370 375 380

Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile 385 390 395 400

Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro

405 410 415

Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys

420 425 430

Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp 435 440 445

Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu

450 455 460

Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg 465 470 475 480

Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly

485 490 495

Arg Gly Glu Glu Lys Arg Lys Gln Ile Leu Asn Ile Ser Gln Leu Val

500 505 510

Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Leu Lys Leu Ala Arg Pro

515 520 525

Ala Ile Leu Asp Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Ser Tyr Gly

530 535 540

Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr 545 550 555 560

Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr

565 570 575

Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys Val Thr

580 585 590

Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly

595 600 605

Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys

610 615 620

Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile 625 630 635 640

Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp

645 650 655

Ile His Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu Cys Gly Arg His His His 660 665 670

His His His 675

<210> 215

<211> 2193

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Synthetic HGF mhm (W507-L585)

<400> 215

atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60

ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120

catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180

aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240

tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300

cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360 gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420

gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480

cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540

gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600

cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660

cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720 ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcctgat 780 ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840 attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900

tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960

ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020

aaatgcaagg accttagaga aaattattgc cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080

tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt ggctactgct ctcagattcc caagtgtgac 1140 gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200 aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260 catatcttct gggagccaga tgctagcaaa ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320

gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 1380

cctatttccc gttgtgaagg agatactaca cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440

atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattccaac acaaacaaca 1500

gtaggatgga tggttagttt gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560 aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620 gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt 1680 ctcaatgttt cccagctggt atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt 1740 gctcgacctg caatcctgga taactttgtc agtacaattg atttacctag ttatggttgt 1800 acaatccctg aaaagaccac ttgcagtatt tacggctggg gctacactgg attgatcaac 1860 gcggatggtt tattacgagt agctcatctg tatattatgg ggaatgagaa atgcagtcag 1920 caccatcaag gcaaggtgac tttgaatgag tctgagttat gtgctggggc tgaaaagatt 1980 ggatcaggac catgtgaggg agattatggt ggcccactca tttgtgaaca acacaaaatg 2040 agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt cgtggatgtg ccatcccaaa tcgtcctggt 2100 atttttgttc gagtagcata ttatgcaaaa tggatacaca aagtaatttt gaca:tacaag 2160 ttgtgcggcc gccatcacca tcaccatcac taag 2194

<210> 216 <211> 675

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Synthetic HGF mhm507-585 active

<400> 216

Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys 15 10 15

Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala

20 25 30

Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn

35 40 45

Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu

50. 55 60

Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80

Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln

85 90 95

Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp

100 105 110

Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro

115 120 125

Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile

130 135 140

Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr 145 150 155 160

Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp

165 170 175

Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro

180 185 190

Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro

195 200 205

Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys

210 215 220

Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala Val Asn Glu Thr Asp Val Pro 225 230 235 240

Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly

245 250 255

Thr Ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser

260 265 270

Gln Tyr Pro His Lys His Asp Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys

275 280 285

Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu Ser Pro

290 295 300

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln 305 310 315 320

Ile Pro Lys Cys Asp Val Ser Ser Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn

325 330 335

Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ser Gly Leu Thr

340 345 350

Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe 355 360 365 Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

370 375 380

Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile 385 390 395 400

Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro

405 410 415

Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys

420 425 430

Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Gln Thr Thr Val Gly Trp

435 440 445

Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu

450 455 460

Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg 465 470 475 480

Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly

485 490 495

Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val

500 505 510

Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro

515 520 525

Ala Ile Leu Asp Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Ser Tyr Gly

530 535 540

Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr 545 550 555 560

Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr

565 570 575

Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys Val Thr

580 585 590

Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly

595 600 605

Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys

610 615 620

Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile 625 630 635 640

Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp

645 650 655

Ile His Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu Cys Gly Arg His His His 660 665 670

His His His 675

Claims (23)

1. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimen- to de hepatócito humano (HGF), caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRm-CDR H2~ CDR H3, em que (i) CDRm compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 (2B8) (ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos sele- cionada do grupo que consiste em SEQ ID N0:204 (LR2B8HC) e SEQ ID NO: 205 (LRMR2B8HC) e (iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 17 (2B8); e (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina com- preendendo a estrutura CDRL1-CDR L2-CDR L3, em que (i) CDRu compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 18 (2B8) (ii) CDRl2 compreende uma seqüência de aminoácidos sele- cionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:19 (2B8) e SEQ ID NO: 206 (LRMR2B8LC) e (iii) CDR|_3 compreende uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 20 (2B8), em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para ligação a HGF humano.

2. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 1, caracte- rizada pelo fato de que as CDRs estão interpostas entre regiões de arcabou- ço de imunoglobulina humana ou humanizada.

3. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 2, caracte- rizada pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo ou um fragmen- to de ligação ao antígeno deste.

4. Proteína de ligação isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

5. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina como definida na reivindicação 1.

6. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de que com- preende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina como definida na reivindicação 1.

7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que contém a seqüência de ácido nucléico como definida na reivindicação 5.

8. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreen- de pelo menos um vetor de expressão que codifica uma região variável da cadeia pesada ou leve de imunoglobulina como definida na reivindicação 1.

9. Método de produzir uma proteína de ligação, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 8 sob condições tais que a célula hospedeira expresse uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina; e (ii) coletar a região variável da cadeia leve de imunoglobulina.

10. Proteína de ligação isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação se liga ao fator de cres- cimento de hepatócito humano com um kd de 4,0 χ 10"5 s"1 ou menor.

11. Proteína de ligação isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação se liga ao fator de cres- cimento de hepatócito humano com um Kd de 20 pM ou menor.

12. Método de inibir ou reduzir a proliferação de uma célula tu- moral, caracterizado pelo fato de que compreende expor a célula a uma quantidade eficaz da proteína de ligação como definida na reivindicação 1 para inibir ou reduzir a proliferação da célula tumoral.

13. Método de inibir ou reduzir o crescimento de tumor em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende expor o mamífero a uma quantidade eficaz da proteína de ligação como definida na reivindicação 1 para inibir ou reduzir a proliferação do tumor.

14. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de cresci- mento de hepatócito humano (HGF), caracterizada pelo fato de que compre- ende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina selecionada do grupo que con- siste em: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina com- preendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 193 (região vari- ável da cadeia leve LR2B8LC), e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 183 ( região variável da cadeia pesada LR2B8HC), (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina com- preendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 193 ( região vari- ável da cadeia leve LR2B8LC), e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189 (região variável da cadeia pesada LRMR2B8HC), (c) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina com- preendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 199 (região vari- ável da cadeia leve LRMR2B8LC), e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 183 (região variável da cadeia pesada LR2B8HC); e (d) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina com- preendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 199 (região vari- ável da cadeia leve LRMR2B8LC), e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189 ( região variável da cadeia pesada LRMR2B8HC).

15. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato de que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO 199 (região variá- vel da cadeia leve LRMR2B8LC), e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: -189 (região variável da cadeia pesada LRMR2B8HC).

16. Método de tratar um tumor em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz da proteína de ligação como definida na reivindicação 15.

17. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de cresci- mento de hepatócito humano (HGF), caracterizada pelo fato de que compre- ende uma seqüência da cadeia leve de imunoglobulina e uma seqüência da cadeia pesada de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em: (a) uma seqüência da cadeia leve de imunoglobulina compreen- dendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 197 (LR2B8LC + cons- tante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)), e uma seqüência da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187 (LR2B8HC + Constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 1)); (b) uma seqüência da cadeia leve de imunoglobulina compreen- dendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 197 (LR2B8LC + cons- tante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)), e uma seqüência da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 191 (LRMR2B8HC + Constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 1)); (c) uma seqüência da cadeia leve de imunoglobulina compreen- dendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 201 (LRMR2B8LC + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)), e uma seqüência da cadeia pe- sada de imunoglobulina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187 (LR2B8HC + Constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 1));e (d) uma seqüência da cadeia leve de imunoglobulina compreen- dendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 201 (LRMR2B8LC + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)), e uma seqüência da cadeia pe- sada de imunoglobulina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 191 (LRMR2B8HC + Constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (a- lelo 1)).

18. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 17, carac- terizada pelo fato de que a cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 201 (LRMR2B8LC + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)), e a cadeia pesada de imunoglobulina com- preende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 191 (LRMR2B8HC + Constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 1)).

19. Método de tratar um tumor em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma pro- teína de ligação como definida na reivindicação 18.

20. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que contem a seqüência de ácido nucléico como definida na reivindicação 6.

21. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (iii) ligar covalentemente a região variável da cadeia leve de i- munoglobulina a uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina para que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada se liguem juntas ao HGF humano.

22. Método de produzir uma proteína de ligação, caracterizado _pelo_fato_de que compreende: (i) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 8 sob condições tais que a célula hospedeira expresse uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina; e (ii) coletar a região variável da cadeia pesada de imunoglobuli- na.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe- lo fato de que compreende: (iii) ligar covalentemente a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina a uma região variável da cadeia leve de i- munoglobulina para que as regiões variáveis de cadeia pe- sada e leve se liguem juntas ao HGF humano.