BRPI0712223A2 - proteìnas de ligação ao fator de crescimento de hepatócito (hgf) - Google Patents

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BRPI0712223A2
BRPI0712223A2 BRPI0712223-3A BRPI0712223A BRPI0712223A2 BR PI0712223 A2 BRPI0712223 A2 BR PI0712223A2 BR PI0712223 A BRPI0712223 A BR PI0712223A BR PI0712223 A2 BRPI0712223 A2 BR PI0712223A2
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S Kirk Wright
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Lyne Breault
Jie Lin
Bijan Etemad-Gilbertson
Christine Knuehl
Jeno Gyuris
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Abstract

PROTEìNAS DE LIGAçãO AO FATOR DE CRESCIMENTO DE HEPATóCITO (HGF). A presente invenção refere-se a uma família de proteínas de ligação que se ligam e neutralizam a atividade do fator de crescimento de hepatócito (HGF), em particular, HGF humano. As proteínas de ligação podem ser usadas como agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Com relação a sua atividade terapêutica, as proteínas de ligação podem ser usadas para tratar certas desordens responsivas a HGF, por exemplo, certos tumores responsivos a HGF.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO FATOR DE CRESCIMENTO DE HEPATÓCITO (HGF)".
Pedidos Relacionados
Esse pedido reivindica o benefício e prioridade dos Pedidos Provisórios U.S. Nss 60/810.714, depositado em 2 de junho de 2006 e 60/860.509, depositado em 21 de novembro de 2006, cujas descrições estão incorporadas aqui por referência.
Campo da Invenção
O campo da invenção é de biologia molecular, imunologia e oncologia. Mais particularmente, o campo é de proteínas Iigantes baseadas em anticorpo que se ligam ao fator de crescimento do hepatócito humano (HGF).
Antecedentes
O Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF), também conhecido como Fator de Dispersão (SF), é uma proteína heterodimérica multifuncional produzida predominantemente por células mesenquimais e é um efe-tor de células que expressam o receptor Met de tirosina quinase (Bottaro et al. (1991) Science 251: 802-804, Rubin et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1155: 357-371). O receptor Met humano também é conhecido como "c-Met".HGF maduro contém duas cadeias de polipeptídeos, a cadeia α e a cadeia β. Estudos publicados sugerem que é a cadeia α que contem o domínio de ligação do receptor c-Met de HGF.
Quando se liga ao seu receptor cognato, HGF media várias atividades celulares. A via de sinalização HGF-Met desempenha um papel na 25 regeneração hepática, cicatrização de lesão, regeneração neural, angiogê-nese e malignidades. Veja, por exemplo, Cao et al. (2001) Proc. Natl. A-cad. Sci. USA 98: 7443-7448, Burgess et al. (2006) Câncer Res. 66: 1721-1729, e Patentes U.S. Nqs 5.997.868 e 5.707.624. Pesquisadores têm desenvolvido vários moduladores de HGF, incluindo anticorpos para tratar várias desordens que envolvem atividade de HGF, por exemplo, certos cânce-res responsivos a HGF. Veja, por exemplo, Publicação de Pedido Internacional NsWO 2005/017107. A estrutura básica comum para todos os anticorpos é mostrada esquematicamente na Figura 1. Anticorpos são proteínas multiméricas que contêm quatro cadeias de polipeptídeos. Duas das cadeias de polipeptídeo são chamadas de cadeias pesadas ou H e duas das cadeias de polipeptídeos são chamadas de cadeias leves ou L. As cadeias pesada e leve de imunoglobulina são conectadas por uma ligação de dissulfeto entre as cadeias. As cadeias pesadas de imunoglobulina são conectadas por várias pontes de dissulfeto entre as cadeias. Uma cadeia leve é composta de uma região variável (VL na Figura 1) e uma região constante (Cl na Figura 1), enquanto que a cadeia pesada é composta de uma região variável (VH na Figura 1) e pelo menos três regiões constantes (CH1, CH2 e CH3 na Figura 1). As regiões variáveis determinam a especificidade do anticorpo e as regiões constantes têm outras funções.
A informação estrutural e dos aminoácidos indica que cada região variável compreende três regiões hipervariáveis (também conhecidas como regiões de determinação de complementaridade ou CDRs) flanquea-das por quatro regiões de arcabouço relativamente conservadas ou FRs. As três CDRs, referidas como CDR1, CDR2, e CDR3, são responsáveis pela especificidade de ligação de anticorpos individuais. Quando os anticorpos são para serem usados como agentes de diagnóstico e terapêuticos, tipicamente é desejável criar anticorpos que tem a maior especificidade de ligação e afinidade com a molécula alvo. Acredita-se que diferenças nas regiões variáveis possam ter efeitos profundos sobre a especificidade e a afinidade do anticorpo.
Patente U.S. Ns 5.707.624 descreve o uso de anticorpos anti- HGF no tratamento do sarcoma de Kaposi. Similarmente, a Patente U.S. Ns 5.997.868 descreve o tratamento de um tumor pela administração de um anticorpo anti-HGF ao paciente a ser tratado a fim de bloquear a habilidade de HGF endógeno de promover angiogênese no tumor. Mais recentemente, pesquisadores propuseram que anticorpos que se ligam a cadeia β de HGF podem ter potencial como agentes terapêuticos em pacientes com tumores dependentes de HGF (Burgess (2006) supra). Apesar disso, ainda há uma necessidade de moduladores adicionais de HGF que possam ser usados como agente terapêutico e diagnóstico.
Sumário da Invenção
A invenção é baseada, em parte, na descoberta de uma família de proteínas de ligação que se ligam especificamente a HGF, em particular, a HGF humano. As proteínas de ligação são baseadas em anticorpo à medida que elas contêm sítios de ligação de antígeno (isto é, HGF) baseados nas CDRs de uma família de anticorpos que se ligam especificamente a HGF. As proteínas de ligação podem ser usadas como agentes de diagnóstico e terapêuticos. Quando usadas como agente terapêutico, as proteínas de ligação são manipuladas (por exemplo, humanizadas) a fim de reduzir ou eliminar o risco de indução de resposta imune contra a proteína de ligação quando administrada ao receptor (por exemplo, um humano).
As proteínas de ligação neutralizam a atividade de HGF e, portanto, podem ser usadas como um agente terapêutico. Em certas modalidades, as proteínas de ligação impedem que HGF se ligue ao seu receptor cognato, c-Met, neutralizando dessa forma a atividade de HGF. Em outras modalidades, as proteínas de ligação se ligam a HGF e neutralizam sua atividade biológica, mas sem evitar que HGF se ligue ao receptor c-Met. Como HGF tem sido implicado no crescimento e proliferação de células cancerosas, as proteínas de ligação podem ser usadas para inibir a proliferação de células cancerosas. Além disso, quando administradas a um mamífero, as proteínas de ligação podem inibir ou reduzir o crescimento do tumor no mamífero.
Esses e outros aspectos e vantagens da invenção se tornarão claros após a consideração das seguintes figuras, descrição detalhada e reivindicações. Descrição das Figuras
A invenção pode ser mais completamente compreendida com referência as seguintes figuras.
Figura 1 é uma representação esquemática de um anticorpo típico. Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando a seqüência de aminoácidos que define a região variável da cadeia pesada da imunoglobuli-na completa dos anticorpos indicados como 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 e 3D11. As seqüências de aminoácidos de cada anticorpo estão alinhadas uma contra outra e as regiões que definem o peptídeo de sinal, CDR1, CDR2, e CDR3 estão identificadas em retângulos. As seqüências fora dos retângulos representam seqüências de FR.
Figura 3 é um diagrama esquemático que mostra as seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cada uma das seqüências da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina apresentadas na Figura 2.
Figura 4 é um diagrama esquemático que mostra a seqüência de aminoácidos que define a região variável da cadeia leve de imunoglobulina completa dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11. As seqüências de aminoácidos de cada anticorpo estão alinhadas uma contra outra e as regiões que definem o peptídeo de sinal, CDR1, CDR2, e CDR3 estão identificadas em retângulos. As seqüências fora dos retângulos representam seqüências FR.
Figura 5 é um diagrama esquemático que mostra as seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cada uma das seqüências da região variável da cadeia leve de imunoglobulina apresentadas na Figura 4.
Figura 6 é um gráfico que resume os resultados de um experimento para medir a atividade inibitória de tumor de anticorpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 e 2B8 em um modelo de xenoenxerto de U87MG. Losangos correspondem a PBS; triângulos correspondem ao anticorpo 1A3 anti-HGF; X corresponde ao anticorpo 1D3 anti-HGF; quadrados correspondem ao anticorpo 1F3 anti-HGF e círculos correspondem ao anticorpo 2B8 anti-HGF.
Figura 7 é um gráfico que resume os resultados de um experimento para medir a atividade inibitória de tumor de anticorpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 e 2B8 em um modelo de xenoenxerto de U118. Losangos correspondem a IgG; quadrados correspondem ao anticorpo 1F3 anti-HGF, triângulos ao anticorpo 1D3 anti-HGF; X corresponde ao anticorpo 1A3 anti-HGF; e círculos correspondem ao anticorpo 2B8 anti-HGF. Figura 8 é uma tabela que resume os dados de ressonância de plásmon de superfície sobre a afinidade de ligação ao antígeno e a cinética de interação entre HGF humano e anticorpos 2B8 quimérico, quiméri-co/humanizado ou humanizado. A tabela lista os pares de cadeia leve Kappa e cadeia pesada de IgGI testados. Aqueles anticorpos com desvios-padrão (STDEV) listados foram analisados em três experimentos independentes.
Figura 9 é um gráfico de barras que resume dados experimentais que indicam que Hu2B8 se liga a um epítopo mutuamente exclusivo para o anticorpo monoclonal 2B8 de murino. 2B8 humanizado ou quimérico foi capturado sobre um chip de Fc anti-humano. Então, HGF estava ligado a 2B8 quimérico ou humanizado. A habilidade de 2B8 de camundongo ou do anticorpo de controle (anticorpo policlonal anti-HGF de cabra) se ligar a HGF capturado foi medida. Ambos os anticorpos 2B8 humanizado e 2B8 quimérico impedem que 2B8 de murino se ligue a HGF. As barras brancas correspondem ao anticorpo 2B8 quimérico; as barras cinzas correspondem ao anticorpo Hu2B8 humanizado (região variável kappa Kv 1-39.1 e região variável de cadeia pesada Hv5-51.1); as barras pretas correspondem ao anticorpo Hu2B8 humanizado (região variável kappa Kv 3-15.1 e região variável de cadeia pesada Hv5-51.1).
Descrição Detalhada da Invenção
A invenção é baseada, em parte, na descoberta de uma família de proteínas de ligação que se ligam especificamente e neutralizam a atividade de HGF, em particular, HGF humano. As proteínas de ligação podem ser usadas em uma variedade de aplicações de diagnóstico e terapêuticas.
As proteínas de ligação são baseadas nos sítios de ligação a antígeno de certos anticorpos monoclonais que foram selecionados por sua habilidade de se ligar e neutralizar a atividade de HGF. Em particular, as proteínas de ligação contem seqüências de região variável de CDR de imunoglobulina que juntas definem um sítio de ligação para HGF.
Em vista da atividade neutralizante desses anticorpos, eles são particularmente úteis em modular o crescimento e/ou proliferação de células responsivas a HGF, por exemplo, células cancerosas. Quando usadas como um agente terapêutico, as proteínas de ligação podem ser manipuladas a fim de minimizar ou eliminar o risco de indução de resposta imune contra a proteína de ligação quando administrada ao receptor. Além disso, dependendo da aplicação particular, considera-se que as proteínas de ligação podem ser conjugadas com outras porções, por exemplo, marcadores detectáveis, por exemplo, radiomarcadores e moléculas efetoras, por exemplo, outra proteína e terapêuticos baseados em moléculas pequenas. Cada uma dessas características e aspectos da invenção é discutida em mais detalhes abaixo.
I - Proteínas de Ligação que se Liaam a HGF
Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDR Li-CDR L2-CDR L3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de i-munoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade (CDRs), em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. CDRu compreende a seqüência de aminoácidos X1 X2 Ser X4 X5 Xe X7 Xe Xg X10 Xn X12 X13 X14 X15, em que o aminoácido X1 é Arg, Lys1 ou Ser, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu1 Gln, ou Ser, X5 é Asn1 Asp, ou Ser, X6 é Ile ou Vai, X7 é Asp, Lys, Ser, Val1 ou Tyr, Xe é uma ligação peptídica ou Tyr, Xg é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, X11 é uma ligação peptídica ou Asn, X12 é uma ligação peptídica, lie, ou Ser, X13 é Asn ou Tyr, X14 é lie, Leu, Met, ou Vai, X15 é Ala, Asn, His, ou Ser. CDRl2 compreende a seqüência de aminoácidos X16 X17 Xis X19 X2o X21 X22. em que o aminoácido X16 é Ala, Asp, Arg, Gly, ou Vai, X17 é Ala, Thr, ou Vai, X18 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, Lys, ou He, X2o é Leu ou Arg, X21 é Ala, Asn, Glu, Vai, ou Pro, X22 é Asp, Ser, ou Thr. CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, em que o aminoácido X23 é Leu, Gly, ou Gln, X24 é His ou Gln, X25 é Phe1 Ser, Trp, ou Tyr, X26 é Asp, lie, Ser1 Trp1 ou Tyr, X27 é Gly, Glu, Asn, ou Ser, X2e é Asp, Asn, Phe, Thr1 ou Tyr1 X3o é Leu, Phe1 Pro1 ou Tyr. Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano que compreende (i) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDR Hr CDR H2-CDR H3 β (ü) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina 5 que compreende três regiões de determinação de complementaridade (C-DRs), em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável de cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. CDRm compreende a seqüência de aminoácidos Xi Tyr X3 X4 X5 em que o aminoácido Xi é Asp, Asn1 Ser, ou Thr, X3 é Phe, Ser, Trp, ou Tyr, X4 é lie, Leu, ou Met, X5 é Asn, His1 ou Ser. CDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos X6 Ile X8 Xg X-io X11 Gly Xi3 Xi4 X15 Tyr X17 X18 X19 X20 X21 X22. em que o aminoácido Χβ é Lys, Gln, Glu, Vai, ou Tyr, X8 é Asn, Gly, Ser, Trp, ou Tyr, X9 é Ala, Pro ou Ser, X10 é Gly ou Thr, X11 é uma ligação peptídica, Asp, Asn, Gly, ou Ser, X13 é Asp, Asn, His, ou Ser, X14 é Ser ou Thr, X15 é Asn ou Tyr, X17 é Asn ou Pro, X18 é Ala, Asp, Gly, Gln1 Glu, Pro, ou Ser, X19 é Asn, Lys, Met, ou Ser, X20 é Leu, Phe ou Vai, X21 é Lys, Met, ou Gln, X22 is Asp, Gly ou Ser. CDRH3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg1 Asn, Gln, ou Glu, X24 é Gly, Leu, Arg, ou Tyr, X25 é uma ligação peptídica, Asp, ou Gly, X28 é uma ligação peptídica ou Gly, X27 é uma ligação peptídica ou Tyr, X28 é uma ligação peptídica, Leu, ou Tyr, X29 é uma ligação peptídica, Gly, Leu, Arg, ou Vai, X30 é uma ligação peptídica, Asp, Gly, ou Glu, X31 é uma ligação peptídica, Asn, Arg, Ser, ou Tyr, X32 é uma ligação peptídica, Ala, Gly, lie, ou Tyr, X33 is Met ou Phe, X34 é Ala ou Asp.
Compreende-se que a proteína de ligação pode compreender tanto a seqüências da cadeia leve de imunoglobulina quanto a cadeia pesada da imunoglobulina ou fragmentos destas, registrados acima. Além disso, compreende-se que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto ou um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossin-tético.
Em certas modalidades, as seqüências de CDR da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina são interpostas com regiões de arcabouço (FR).
Em certas outras modalidades, as seqüências de CDR da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina são interpos-tas entre regiões de arcabouço humanas ou humanizadas.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga especificamente a HGF humano. A proteína de ligação compreende: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRL1-CDRL2-CDRl3 e (b) uma região variável da 10 cadeia pesada de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. A CDRu compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 8 (1A3), SEQ ID Ns: 18 (2B8), SEQ ID Ns: 28 (2F8), SEQ ID N2: 38 (3B6), SEQ ID Ne: 48 (3D11), SEQ ID Ne: 58 (1D3), SEQ ID N2: 68 (1F3), e SEQ ID Ns: 78 (3A12). A CDRl2 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 9 (1A3), SEQ ID N2: 19 (2B8), SEQ ID Ns: 29 (2F8), SEQ ID Ns: 39 (3B6), SEQ ID N9: 49 (3D11), SEQ ID Ns: 59 (1D3), SEQ ID N5: 69 (1F3), SEQ ID Ns: 79 (3A12) e SEQ ID Ns: 206 (LR-20 MR2B8LC). A CDRL3 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N2: 10 (1A3), SEQ ID N2: (2B8), SEQ ID Ns: 30 (2F8), SEQ ID Ns: 40 (3B6), SEQ ID Ns: 50 (3D11), SEQ ID Ns: 60 (1D3), SEQ ID Ns: 70 (1F3), e SEQ ID N9: 80 (3A12). Ao longo do pedido e das reivindicações, as seqüências caracterizadas por uma SEQ ID Ns: particular, 25 são acompanhadas em parênteses pelo anticorpo que foi a origem da seqüência particular. Como exemplo, SEQ ID N2: 8 (1A3) indica que a SEQ ID N2: 8 é baseada na seqüência presente no anticorpo 1A3.
Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRu 30 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 8 (1A3), uma CDRl2 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 9 (1A3) e uma CDRu3 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 10 (1A3). Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende umaCDRL1 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 18 (2B8), uma CDRl2 que compreende a seqüência de SEQ ID Ne: 19 (2B8) ou SEQ ID N2: 206 (LR-MR2B8LC) e uma CDRl3 que compreende a seqüência de SEQ ID Ns: 20 (2B8).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C-DRu que compreende a seqüência de SEQ ID N0: 28 (2F8), uma CDRL2 que compreende a seqüência de SEQ ID NQ: 29 (2F8) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID Ne: 30 (2F8).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende umaCDRL1 que compreende a seqüência de SEQ ID Ne: 38 (3B6), uma CDRL2 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 39 (3B6) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID Ns: 40 (3B6).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C-DRu que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 48 (3D11), uma CDRL2 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 49 (3D11) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 50 (3D11).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C-DRu que compreende a seqüência de SEQ ID Ne: 58 (1D3), uma CDRL2 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 59 (1D3) e uma CDRl3 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 60 (1D3).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C-DRu que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 68 (1F3), uma CDRL2 que compreende a seqüência de SEQ ID Ne: 69 (1F3) e uma CDRl3 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 70 (1F3).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma C-DRu que compreende a seqüência de SEQ ID Ne: 78 (3A12), uma CDRl2 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 79 (3A12) e uma CDRL3 que compreende a seqüência de SEQ ID Ns: 80 (3A12).
Em cada uma das modalidades anteriores, as seqüências de CDRu, CDRl2, e CDRL3 preferivelmente são interpostas entre FRs de imunoglobulina humanas ou humanizadas. É compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento deste que se liga a an-tígeno ou um sítio de anticorpo biossintético.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRHi-CDRH2-CDRH3e (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. A CDRHi compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 5 (1A3), SEQ ID Ns: 15 (2B8), SEQ ID N9: 25 (2F8), SEQ ID N9: 35 (3B6), SEQ ID N9: 45 (3D11), SEQ ID N9: 55 (1D3), SEQ ID Ns: 65 (1F3), e SEQ ID Ns: 75 (3A12); a CDRh2 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 6 (1A3), SEQ ID Ns: 16 (2B8), SEQ ID Ns: 26 (2F8), SEQ ID Ns: 36 (3B6), SEQ ID Ns: 46 (3D11), SEQ ID Ns: 56 (1D3), SEQ ID Ns: 66 (1F3), SEQ ID Ns: 76 (3A12), SEQ ID N9: 202 (Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID Ns: 203 (Hu2B8 Hv5a.1 ou Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID N9: 204 (LR2B8HC) e SEQ ID N9: 205 (LRMR2B8HC); a CDRH3 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 7 (1A3), SEQ ID N9: 17 (2B8), SEQ ID N9: 27 (2F8), SEQ ID N9: 37 (3B6), SEQ ID Ns: 47 (3D11), SEQ ID N9: 57 (1D3), SEQ ID N9: 67 (1F3), e SEQ ID N9: 77 (3A12).
Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRhi que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 5 (1A3); uma CDRh2 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 6 (1A3); e uma CDRH3 que compreende a seqüência de SEQ ID Ns: 7 (1A3).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID Ns: (2B8); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 16 (2B8), SEQ ID Ns: 202 (Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID N2: 203 (Hu2B8 Hv5a.1 ou Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID N2: 204 (LR2B8HC) ou SEQ ID N2: 205 (LRMR2B8HC); e uma CDRh3 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 17 (2B8).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID N2:25 (2F8); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 26 (2B8), e uma CDRH3 que compreende a seqüência de SEQ ID Ns: 27 (2F8).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID N2:35 (3B6); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 36 (3B6), e uma CDRH3 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 37 (3B6).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID N2:45 (3D11); uma CDRH2 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 46 (3D11), e uma CDRh3 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 47 (3D11).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a seqüência de SEQ ID N2:55 (1D3); uma CDRh2 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 56 (1D3), e uma CDRh3 que compreende a seqüência de SEQ ID N2: 57 (1D3).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID N2:65 (1F3); uma CDRh2 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 66 (1F3), e uma CDRh3 que compreende a seqüência de SEQ ID N9: 67 (1F3).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRHi que compreende a seqüência de SEQ ID N9:75 (3A12); uma CDRh2 que compreende a seqüência de SEQ ID Ns: 76 (3A12), e uma CDRHaque compreende a seqüência de SEQ ID Ns: 77 (3A12).
Em cada uma das modalidades anteriores, as seqüências de CDRHi, CDRh2i e CDRH3 preferivelmente são interpostas entre FRs de imunoglobulina humanas ou humanizadas. É compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nos resíduos 20-141 de SEQ ID N5: 2 (1A3), resíduos 20-137 de SEQ ID Ns: 12 (2B8), resíduos 20-137 de SEQ ID N5: 22 (2F8), resíduos 20-139 de SEQ ID N5: 32 (3B6), resíduos 20-132 de SEQ ID Ne: 42 (3D11), resíduos 20-141 de SEQ ID Ns: 52 (1D3), resíduos 20-141 de SEQ ID N9: 62 (1F3), e resíduos 20-141 de SEQ ID N9: 72 (3A12) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste nos resíduos 21-127 de SEQ ID N9: 4 (1A3), resíduos 21-127 de SEQ ID N9: 14 (2B8), resíduos 20-131 de SEQ ID N9: 24 (2F8), resíduos 23-129 de SEQ ID N9: 34 (3B6), resíduos 23-128 de SEQ ID N9: 44 (3D11), resíduos 21-127 de SEQ ID N9: 54 (1D3), resíduos 21-127 de SEQ ID N9: 64 (1F3), e resíduos 21-127 de SEQ ID N9: 74 (3A12).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID N9: 2 (1A3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID N9: 4 (1A3).
Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a se- qüência de aminoácidos dos resíduos 20-137 de SEQ ID N0: 12 (2B8) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID Ne: 4 (2B8).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-137 de SEQ ID Ns: 22 (2F8) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-131 de SEQ ID NQ: 24 (2F8).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-139 de SEQ ID Ns: 32 (3B6) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 23-129 de SEQ ID N0: 34 (3B6).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-132 de SEQ ID Ne: 42 (3D11) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 23-128 de SEQ ID Ns: 44 (3D11).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID Na: 52 (1D3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID Ne: 54 (1D3).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID Ns: 62 (1F3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID Ns: 64 (1F3).
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID Ng: 72 (3A12) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID N2: 74 (3A12).
Em qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento deste que se liga a antí-geno ou um sítio de anticorpo biossintético.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N9: 173 (região variável da cadeia leve de Hu2B8 Kv1 -39.1), SEQ ID Ne: 179 (região variável da cadeia leve de Hu2B8 Kv3-15.1), SEQ ID Ns: 193 (região variável da cadeia leve de LR2B8LC), e SEQ ID Ns: 199 (região variável da cadeia leve de LRMR2B8LC); e (ii) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N2: 159 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID Ns: 165 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv5a.1), SEQ ID N2: 169 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID Ns: 183 (região variável da cadeia pesada de LR2B8HC), e SEQ ID Ns: 189 (região variável da cadeia pesada de LR-MR2B8LC). A proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + constante kappa (alótipo Km(3) (alelo 2)), SEQ ID N2: 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 2)), SEQ ID N2: 197 (LR2B8LC + constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 1)), e SEQ ID N2: 201 (LRMR2B8LC + constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 1)); e (ii) uma imunoglobulina da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N2: 163 (Hu2B8 Hv1f.1 + constante de IgGI (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID N2: 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + constante de IgGI (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID N2: 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante de IgGI (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID N2: 187 (LR2B8HC + constante de lgG1 (alótipo G1m(3)) (alelo 1)), e SEQ ID N2: 191 (LRMR2B8HC +cons- tante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 1)). A proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano reduzido. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende três CDRs e (ii) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três CDRs. As CDRs estão tipicamente interpostas entre FRs. As CDRs da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação que se liga a HGF humano reduzido, por exemplo, a cadeia α de HGF reduzido. HGF reduzido refe-re-se a HGF tratado com uma quantidade de agente redutor, por exemplo, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol ou glutationa suficiente para reduzir a ligação dissulfeto entre a cadeia α e a cadeia β. Concentrações exemplares incluem, por exemplo, DTT 100 mM e 2-mercaptoetanol 5%.
Em certas modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende pelo menos uma CDR selecionada do grupo que consiste em CDRu, CDR L2 e C-DRl3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende duas CDRs, por exemplo, CDRu e CDRl2i ou CDRu e CDRl3, ou CDRli e CDRl3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende todas as três CDRs, isto é, CDRL1, CDRl2 e CDRL3. CDRL1 compreende a seqüência de aminoácidos X1 X2 Ser X4 X5 X6 X7 Xe Xg X10 Xn X12 Xi3 Xu X15, em que o aminoácido X1 é Arg ou Lys, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu ou Gln, X5 é Asn, Ser, ou Asp, X6 é Ile ou Vai, X7 é Tyr1 Asp, ou Lys, X3 é uma ligação peptídica ou Tyr, X9 é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, X11 é uma ligação peptídica ou Asn, X12 é uma ligação peptídica ou Ser, Xi3 é Asn ou Tyr, X14 é Ile ou Leu, X15 é Ala, Asn, ou Ser. CDRl2 compreende a seqüência de aminoácidos X16 X17 Xie X19 Leu X21 X22, em que o aminoácido X16 é Ala, Asp, Vai, ou Arg, X17 é Ala ou Vai, X18 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, ou He, X21 é Ala, Glu1 Vai, ou Pro, X22 é Asp ou Ser. CDRl3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X26 Pro X3o Thr, em que o ami- noácido X23 é Leu ou Gln1 X24 é H ou Gln, X25 é Phe1 Ser, ou Tyr1 X26 é Asp1 lie, ou Trp1 X27 é Gly ou Glu1 X28 é Asp, Phe, ou Thr1 X30 é Phe1 Pro1 ou Tyr.
Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende pelo menos uma CDR selecionada do grupo que consiste em CDRhi, CDRH2, e CD-Rh3- Opcionalmente, a proteína de ligação compreende duas CDRs1 por e-xemplo, CDRhi e CDRh2i ou CDRm e CDRh3i ou CDRm e CDRH3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende todas as três CDRs1 isto é, CDRm, CDRh2 e CDRH3. CDRhi compreende a seqüência de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5l em que o aminoácido X1 é Asp1 Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe1 Trp1 ou Tyr1 X4 é Ile ou Met1 X5 é Asn1 Hé, ou Ser. CDRh2 compreende a seqüência de aminoácidos X6 Ile X8 X9 Gly X11 Gly X13 X14 Xi5 Tyr X17 X18 X19 X20 Lys X22, em que o aminoácido X6 é Lys, Gln1 ou Tyr, X8 é Gly, Ser, ou Tyr, X9 é Pro ou Ser, X11 é Asp1 Gly1 ou Ser1 X13 é Asp ou Ser1 X14 é Ser ou Thr1 X15 é Asn ou Tyr1 X17 é Asn ou Pro1 X18 é Ala, Asp, Gly1 ou Glu1 X19 é Asn1 Met1 ou Ser1 X20 é Phe ou Val1 X22 é Asp ou Gly. CDRh3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 Χ3ι X32 X33 Asp Tyr1 em que o aminoácido X23 é Arg ou Gln1 X24 é Gly ou Leu1 X25 é Asp1 Gly1 ou uma ligação peptídica, X26 é Gly ou uma ligação peptídica, X27 é uma ligação peptídica ou Tyr, X28 é Leu, uma ligação peptídica ou Tyr, X29 é a Gly, Arg ou Leu, X30 é Asp1 Gly ou Glu, X31 é a Tyr, Arg ou Asn1 X32 é Ala, Gly ou Tyr, X33 é Met ou Phe.
Compreende-se que a proteína de ligação pode compreender ambas as seqüências de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada de imunoglobulina ou fragmentos dessas, registrados acima. Além disso, é compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto ou um fragmento deste que se liga a antígeno ou um sítio de anticorpo biossin-tético.
Em certas modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende (i) uma CDRli que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 8 (1A3), SEQ ID Ne: 28 (2F8), SEQ ID N9: 38 (3B6), SEQ ID Ns: 58 (1D3), e SEQ ID Ns: 68 (1F3), (ii) uma CDRl2 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 9 (1A3), SEQ ID N8: 29 (2F8), SEQ ID Ns: 39 (3B6), SEQ ID Ns: 59 (1D3), e SEQ ID Ne: 69 (1F3), e (iii) uma CDRL3 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em 5 SEQ ID Ns: 10 (1A3), SEQ ID Ns: 30 (2F8), SEQ ID N2: 40 (3B6), SEQ ID Ns: 60 (1D3), e SEQ ID Ns: 70 (1F3). As seqüências de CDR podem ser interpostas entre FRs humanas ou humanizadas.
Em outras modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos resíduos 21-127 de SEQ ID Ns: 4 (1A3), resíduos 20-131 de SEQ ID Ne: 24 (2F8), resíduos 23-129 de SEQ ID N9: 34 (3B6), resíduos 21-127 de SEQ ID Ns: 54 (1D3), e resíduos 21-127 de SEQ ID Ns: 64 (1F3).
Em certas outras modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende (i) uma CDRhi que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 5 (1A3), SEQ ID N2: 25 (2F8), SEQ ID N3: 35 (3B6), SEQ ID Ns: 55 (1D3), e SEQ ID Ns: 65 (1F3), (ii) uma CDRh2 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 6 (1A3), SEQ ID 20 N9: 26 (2F8), SEQ ID Ns: 36 (3B6), SEQ ID N2: 56 (1D3), e SEQ ID N2: 66 (1F3),e (iii) uma CDRH3 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N2: 7 (1A3), SEQ ID N2: 27 (2F8), SEQ ID N2: 37 (3B6), SEQ ID N2: 57 (1D3), e SEQ ID N2: 67 (1F3). As seqüências de CDR podem ser interpostas entre FRs humanas ou humanizadas.
Em outra modalidade, a região variável da cadeia pesada de i- munoglobulina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos resíduos 20-141 de SEQ ID N2: 2 (1A3), resíduos 20-137 de SEQ ID N2: 22 (2F8), resíduos 20-139 de SEQ ID Ne: 32 (3B6), resíduos 20-141 de SEQ ID Ns: 52 (1D3), e resíduos 20-141 de SEQ ID N2: 30 62 (1F3).
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano e compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina. A proteína de ligação isolada compete pela ligação a HGF com pelo menos um anticorpo de referência selecionado do grupo que consiste em (i) um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com resíduos 20-131 de SEQ ID N9: 24 (2F8) e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20-137 de SEQ ID Ns: 22 (2F8), (ii) um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com resíduos 23-129 de SEQ ID N0: 34 (3B6), e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20-139 de SEQ ID NQ: 32 (3B6) e (iii) um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com resíduos 23-128 de SEQ ID Ns: 44 (3D11) e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20-132 de SEQ ID Ns: 42 (3D11). Sob certas circunstâncias, a proteína de ligação se liga ao mesmo epítopo de HGF como um dos anticorpos de referência.
É compreendido que cada uma das proteínas de ligação discuti- das acima pode ser um anticorpo intacto, por exemplo, um anticorpo mono-clonal. Alternativamente, a proteína de ligação pode ser um fragmento de um anticorpo que se liga a antígeno ou pode ser um sítio de ligação de anticorpo biossintético. Fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', (Fab1)2 ou Fv. Técnicas para fazer tais fragmentos de anticorpo são conhecidas por aqueles versados na técnica. Vários sítios de ligação de anticorpo biossintético são conhecidos na técnica, por exemplo, moléculas de Fv único ou sFv, descritas, por exemplo, na Patente U.S. Ne 5.476.786. Outros sítios de ligação de anticorpo biossintético incluem proteínas de ligação biespecíficas ou bifuncionais que são anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam a pelo menos dois antígenos diferentes. Por exemplo, proteínas de ligação biespecíficas podem se ligar a HGF, por exemplo, HGF humano e outro antígeno de interesse. Métodos para fazer anticorpos bi-específicos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai et ai (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-325; Kostelny et ai (1992) J. Immunol. 148: 1547-1553. As proteínas de ligação da invenção podem se ligar a hHGF que contém uma substituição de cisteína por arginina na posição 561 ou uma substituição de glicina por glutamato na posição 555.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano com uma Ki de 4,0 χ 10"5 s"1 ou menor, 3,0 χ 10"5 s'1 ou menor, ou 2,0 χ 10"5 s"1 ou menor. As proteínas de ligação isoladas podem se ligar a HGF humano com kd de 5,0 χ 10"5 s"1 a 0,5 χ 10"5 s" \ ou de 4,0 χ 10'5 s"1 a 1,0 χ 10'5s"\ ou de 3,0 χ 10"5 s'1 a 1,5 χ 10'5 s'1. Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se 10 liga a HGF humano com Kd de 100 pM ou menor, ou 20 pM ou menor, ou 10 pM ou menor ou 5 pM ou menor. As proteínas de ligação isoladas podem se ligar a HGF humano com K0 de 100 pM a 5 pM, ou de 20 pM a 5 pM, ou de pM a 10 pM, ou de 20 pM a 10 pM, ou de 15 pM a 5 pM. A menos que especificado de outra maneira, valores de Kd são determinados pelos méto-15 dos e sob as condições descritas no Exemplo 6.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano, em que o anticorpo se liga a HGF humano com Kd menor a 37SC do que a 259C. A proteína de ligação opcionalmente se liga a HGF humano com K0 menor do que 5 pM a 37SC. 20
Em outros aspectos e modalidades, as proteínas de ligação po- dem inibir a ligação de hHGF a c-Met. Por exemplo, as proteínas de ligação podem ter uma IC50 (concentração a 50% da inibição máxima) de pelo menos cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, e 7,0 nM quando testadas usando o protocolo descrito no Exemplo 7(a). Em certas outras modalidades, as prote-25 ínas de ligação podem neutralizar a incorporação de BrdU mediada por HGF em células 4 MBr-5 (ATCC, Nq de Catálogo CCL208) usando o método descrito no Exemplo 7(b).
As proteínas de ligação podem ter uma IC50 de 50 nM ou menor, preferivelmente 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0.5 nM ou menor, quando ensaiadas usando o protocolo descrito no Exemplo 7(b). Em certas outras modalidades, as proteínas de ligação podem ser usadas para inibir a fosfori-lação de c-Met estimulada por HGF em células PC-3 (ATCC, Manassus, VA Ns de Catálogo. CRL-1435) usando o ensaio descrito no Exemplo 9. II - Produção de Proteínas de Ligação
Proteínas de ligação da invenção podem ser produzidas de várias maneiras usando abordagens conhecidas na técnica. Por exemplo, mo léculas de DNA que codificam regiões variáveis de cadeia leve e regiões variáveis de cadeia pesada podem ser sintetizadas quimicamente, usando um sintetizador comercial e a informação de seqüência fornecida nesse. Tais moléculas sintéticas de DNA podem ser ligadas a outras seqüências de nu-cleotídeo apropriadas, incluindo, por exemplo, seqüências que codificam região constante e seqüências de controle da expressão, para produzir cons-trutos de expressão de gene convencionais que codificam as proteínas de ligação desejadas. A produção de construtos de genes definidos está dentro da técnica de rotina. Alternativamente, as seqüências fornecidas aqui podem ser clonadas de hibridomas por técnicas de hibridização convencionais ou técnicas de PCR, usando sondas de ácido nucléico sintético cujas seqüências são baseadas na informação de seqüência fornecida aqui ou na informação de seqüência da técnica anterior com relação a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino em células de hibrido-ma. A produção e uso de tais sondas está dentro da técnica ordinária.
Os ácidos nucléicos que codificam as proteínas de ligação dese- jadas podem ser introduzidos (ligados) em vetores de expressão, que podem ser introduzidos em uma célula hospedeira através de técnicas usuais de transfecção ou de transformação conhecidas na técnica. Células hospedeiras exemplares incluem, por exemplo, células de E. coli, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e células de mieloma que não produzem proteína imuno-globulina de outra maneira. Células hospedeiras transfectadas podem ser cultivadas sob condições que permitem as células hospedeiras expressar os 30 genes de interesse, por exemplo, os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de imunoglobulina. Os produtos de expressão resultantes podem ser coletados usando técnicas conhecidas. As condições de expressão e purificação particulares variarão dependendo de qual sistema de expressão é empregado. Por exemplo, se o gene for expresso em E. coli, ele é clonado primeiro em um vetor de expressão. Isso é obtido pelo posicionamento do gene manipulado à jusante do promotor bacteriano adequado, por exemplo, TrP ou Tac1 e uma seqüência de sinal, por exemplo, uma seqüência que codifica um fragmento B da proteína A (FB). A proteína de fusão expressa resultante se acumula tipicamente em corpos refrativos ou de inclusão no citoplasma das células e podem ser coletadas após a ruptura das células por prensa francesa ou sonicação. Os corpos refrativos são então solubilizados e as proteínas expressas re-enoveladas e clivadas por métodos já estabelecidos para muitas outras proteínas recombinantes.
Se o gene manipulado for expresso em células hospedeiras eu-carióticas, por exemplo, células de mieloma ou células CHO, ele é inserido primeiro em um vetor de expressão que contem um promotor eucariótico adequado, um sinal de secreção, intensificadores de imunoglobulina e vários íntrons. Esse vetor de expressão pode conter opcionalmente seqüências que codificam toda ou uma parte de uma região constante, possibilitando que uma cadeia pesada ou leve inteira ou uma parte seja expressa. O construto de gene pode ser transfectado em células de mieloma ou células CHO u-sando protocolos de transfecção estabelecidos. Tais células transfectadas podem expressar fragmentos de Vl ou Vh, heterodímeros de VI-Vh, polipep-tídeos de cadeia simples de Vh-Vl ou Vl-Vh, cadeias pesadas ou leves completas de imunoglobulina ou porções desses, cada um dos quais podendo 25 ser acoplados a um domínio de proteína que tem outra função (por exemplo, citotoxicidade).
III- Modificações das Proteínas de Ligação
É compreendido que as proteínas de ligação podem ser modificadas para otimizar o desempenho dependendo do uso pretendido das proteínas de ligação. Por exemplo, a proteína de ligação está sendo usada como um agente terapêutico, a proteína de ligação pode ser modificada para reduzir sua imunogenicidade no receptor pretendido. Alternativamente ou, adicionalmente, a proteína de ligação pode ser fundida ou acoplada a outra proteína ou peptídeo, por exemplo, um fator de crescimento, citocina ou cito-toxina. Tais modificações podem ser obtidas usando técnicas de manipulação de gene de rotina conhecidas na técnica.
Várias técnicas para reduzir a antigenicidade de anticorpos ou fragmentos de anticorpo são conhecidas na técnica. Essas técnicas podem ser usadas para reduzir ou eliminar a antigenicidade das proteínas de ligação da invenção. Por exemplo, quando as proteínas de ligação são para ser administradas a um humano, as proteínas de ligação são preferivelmente 10 manipuladas para reduzir sua antigenicidade em humanos. Esse processo é geralmente referido como humanização. Preferivelmente, as proteínas de ligação humanizadas têm a mesma ou substancialmente a mesma afinidade pelo antígeno que a proteína de ligação não humanizada original da qual ela é derivada.
Em uma abordagem de humanização bem conhecida, proteínas quiméricas são criadas nas quais as regiões constantes de imunoglobulina de anticorpos de uma espécie, por exemplo, camundongo, são substituídas por regiões constantes de imunoglobulina de uma segunda espécie diferente, por exemplo, um humano. Nesse exemplo, o anticorpo resultante é uma quimera de camundongo-humano, onde as seqüências da região constante humana, em princípio, são menos imunogênicas do que as seqüências de murino correspondentes. Esse tipo de manipulação de anticorpo é descrito, por exemplo, em Morrison, et ai (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851-6855, Neuberger et ai (1984) Nature 312: 604-608; Patente U.S. Nos. 6.893.625 (Robinson); 5.500.362 (Robinson); e 4.816.567 (Cabilly).
Em outra abordagem, conhecida como enxerto de CDR, as C-DRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo de interesse são enxertadas em regiões de arcabouço (FRs) de outra espécie. Por exemplo, CDRs de murino podem ser enxertadas em seqüências de FR humanas. Em algumas modalidades, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo anti-HGF são enxertadas em FRs humanas ou FRs humanas de consenso. A fim de criar FRs humanas de consenso, FRs de várias seqüências de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve humanas são alinhadas para identificar a seqüência de aminoácidos de consenso. O enxerto de CDR está descrito, por exemplo, em Patente U.S. Nos. 7.022.500 (Queen); 6.982.321 (Winter); 6.180.370 (Queen); 6.054.297 (Car-ter); 5.693.762 (Queen); 5.859.205 (Adair); 5.693.761 (Queen); 5.565.332 (Hoogenboom); 5.585.089 (Queen); 5.530.101 (Queen); Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Ve-rhoeyen et ai (1988) Science 239: 1534-1536; e Winter (1998) FEBS Lett 430: 92-94.
Em uma abordagem chamada "super-humanização", anticorpos nos quais a imunogenicidade humana está reduzida ou eliminada são criados por uma forma alternativa de enxerto. Na super-humanização, seqüências de FR são escolhidas de um grupo de genes de linhagem germinativa humana com base na similaridade estrutural das CDRs humanas com aquelas do anticorpo de camundongo a ser humanizado. Essa abordagem é descrita, por exemplo, na Patente U.S. Ne 6.881.557 (Foote) e em Tan et al. (2002) J. IMMUNOL 169:1119-1125.
Outras abordagens para reduzir a imunogenicidade incluem técnicas que são conhecidas como "transformação", "hiperquimerização" ou "recapeamento/revestimento" para produzir anticorpos humanizados. Veja, por exemplo, Vaswami et al. (1998) Annals of Allergy, Asthma, & Immunol. 81: 105; Roguska et al. (1996) Prot. Engineer 9: 895-904; e Patente U.S. N9 6.072.035 (Hardman). Na abordagem de recapeamento/revestimento, os resíduos de aminoácidos de superfície acessível no anticorpo de murino são substituídos por resíduos de aminoácidos mais freqüentemente encontrados nas mesmas posições em um anticorpo humano. Esse tipo de revestimento de anticorpo está descrito, por exemplo, na Patente U.S. Ns 5.639.641 (Pe-dersen).
Uma abordagem exemplar para conversão de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso médico em humanos é conhecida como tecnologia ACTIVMAB™ (Vaccinex, Inc., Rochester, NY), que envolve um vetor baseado no vírus da vacínia para expressar anticorpos em células de mamífero. Altos níveis de diversidade combinatória das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina são ditos serem produzidos. Veja, por exemplo, Patente U.S. Nes 6.706.477 (Zauderer); 6.800.442 (Zauderer); e 6.872.518 (Zauderer).
Outra abordagem exemplar para conversão de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso em humanos é a tecnologia praticada comercialmente por KaIoBios Pharmaceuticals, Inc. (Paio Alto, CA). Essa tecnologia envolve o uso de uma biblioteca "aceptora" de propriedade humana para produzir uma biblioteca "focalizada no epítopo" para se-10 leção de anticorpo.
Outra abordagem exemplar para modificação de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso médico em humanos é a tecnologia HUMAN ENGINEERING® (HE®), que é praticada comercialmente por XOMA (US) LLC. Veja, por exemplo, Pedido de Publicação Internacional Ns WO 93/11794 e Patente U.S. N5* 5.766.886; 5.770.196; 5.821.123; e 5.869.619.
Qualquer abordagem adequada, incluindo qualquer uma das abordagens acima, pode ser utilizada para reduzir ou eliminar a imunogenici-dade humana de uma proteína de ligação de interesse.
Além disso, é possível criar anticorpos totalmente humanos em camundongos. Nessa abordagem, anticorpos humanos são preparados u-sando um camundongo transgênico no qual os genes que produzem anticorpo de camundongo foram substituídos por uma porção substancial de genes que produzem anticorpo humano. Tais camundongos produzem imunoglobulina humana ao invés de moléculas de imunoglobulina de murino. Veja, por exemplo, WO 98/24893 (Jacobovitz et al.) e Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156. Anticorpos monoclonais anti-HGF totalmente humanos podem ser produzidos usando a seguinte abordagem. Camundongos transgênicos que contêm genes de imunoglobulina humana são imunizados com o antígeno de interesse, por exemplo, HGF. Células linfáticas dos camundongos são então obtidas dos camundongos, que são então fundidas com uma linhagem celular de tipo mielóide para preparar linhagens celulares de hibridoma imortalizado. As linhagens celulares de hibridoma são rastrea-das e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para HGF.
Proteínas de ligação da invenção podem ser conjugadas com outras moléculas, dependendo do uso pretendido. Por exemplo, se a proteína de ligação for usada como um terapêutico, então a proteína de ligação pode ser conjugada com outro agente, por exemplo, uma molécula efetora que modula ou, promove a terapia de outra forma. À medida que o efetor é um agente baseado em uma não proteína, por exemplo, um fármaco de molécula pequena, um radiomarcador ou toxina, então o agente pode ser quimicamente acoplado usando químicas de acoplamento in vitro padronizadas. Se, por outro lado, a molécula efetora é uma proteína ou peptídeo, por exemplo, uma enzima, receptor, toxina, fator de crescimento, citocina ou outro imunomodu-lador, então a proteína de ligação pode ser quimicamente acoplada ao efetor usando químicas de acoplamento in vitro ou podem ser acopladas ao efetor como uma proteína de fusão. Proteínas de fusão podem ser construídas e expressas usando técnicas similares àquelas discutidas na seção II. IV - Uso de Proteínas de Ligação
As proteínas de ligação descritas aqui podem ser usadas como 20 um agente de diagnóstico ou um agente terapêutico. (1) Aplicações Terapêuticas
Como as proteínas de ligação da invenção neutralizam a atividade de HGF, elas podem ser usadas em várias aplicações terapêuticas. Por exemplo, certas proteínas de ligação da invenção são úteis na prevenção ou tratamento de doenças ou desordens hiperproliferativas, por exemplo, várias formas de câncer.
As proteínas de ligação podem ser usadas para inibir ou reduzir a proliferação de células tumorais. Em tal abordagem, as células tumorais são expostas a uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a fim de inibir ou reduzir a proliferação da célula tumoral. Em certas modalidades, as proteínas de ligação inibem a proliferação de célula tumoral em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%. Em certas modalidades, a proteína de ligação é usada para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula de tumor, na qual a proteína de ligação reduz a habilidade de hHGF de se ligar a c-Met. Em outras modalidades, a proteína de ligação é usada para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula de tumor mesmo quando a proteína de ligação se liga a hHGF mas não inibe substancialmente a ligação de hHGF a c-Met, como demonstrado pelo anticorpo 3B6 nas Tabelas 5 e 6.
Além disso, a proteína de ligação pode ser usada para inibir ou reduzir o crescimento ou desenvolvimento do tumor em um mamífero. Em tal método, uma quantidade eficaz de proteína de ligação é administrada ao mamífero a fim de inibir ou reduzir o crescimento do tumor em um mamífero. Conseqüentemente, as proteínas de ligação podem ser usadas para tratar tumores, por exemplo, em um mamífero. O método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação. A proteína de ligação pode ser administrada sozinha ou em combinação com outra molécula farmaceuticamente ativa a fim de tratar o tumor.
Considera-se que as proteínas de ligação da invenção podem ser usadas no tratamento de uma variedade de desordens responsivas a HGF, incluindo, por exemplo, células tumorais responsivas a HGF no câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de colo, câncer de próstata, câncer o-variano, câncer de cabeça e pescoço, câncer ovariano, mieloma múltiplo, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de rim, câncer de nasofaringe, câncer pancreático, mesotelioma, melanoma e glioblastoma.
Conforme usado aqui "tratar", "tratando" e "tratamento" referemse ao tratamento de um estado de doença em um mamífero, particularmente em um humano, e incluem: (a) impedir que o estado de doença ocorra em um mamífero, em particular quando tal mamífero está predisposto ao estado de doença, mas ainda não foi diagnosticado como o tendo; (b) inibir o estado de doença, isto é, parar seu desenvolvimento; e/ou (c) aliviar o estado de doença, isto é, causar a regressão do estado de doença.
Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz do componente ativo estará na faixa entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, opcionalmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, opcionalmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. A quantidade administrada dependerá de variáveis tais como o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, do estado de saúde do paciente em particular, da eficácia biológica relativa da proteína de ligação liberada, da formulação da proteína de ligação, da presença e dos tipos de excipientes na formulação e da via de administração. A dosagem inicial administrada pode ser aumentada além do nível superior a fim de se obter rapidamente o nível sangüíneo ou nível teci-dual desejados ou a dosagem inicial pode ser menor do que o ótimo e a dosagem diária pode ser progressivamente aumentada durante o curso do tratamento dependendo da situação particular. A dosagem humana pode ser otimizada, por exemplo, em um estudo de intensificação de dosagem convencional de Fase I planejado para correr entre 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. A freqüência de dosagem pode variar, dependendo de fatores tais como a via de administração, quantidade dosada e a condição da doença a ser tratada. Freqüências de dosagem exemplares são uma vez por dia, uma vez por semana e uma vez a cada duas semanas. A via de administração preferida é parenteral, por exemplo, infusão intravenosa. A formulação de fármacos baseados em anticorpos monoclonais está dentro da técnica comum. Em algumas modalidades da invenção, a proteína de ligação, por exemplo, um anticorpo monoclonal, é Iiofilizada e reconstituída em salina tamponada no momento da administração.
As proteínas de ligação podem ser administradas tanto sozinhas quanto em combinação com outros ingredientes farmaceuticamente ativos.
Os outros ingredientes ativos, por exemplo, imunomoduladores, podem ser administrados junto com a proteína de ligação ou podem ser administrados antes ou depois da proteína de ligação.
Formulações contendo as proteínas de ligação para uso terapêutico, incluem tipicamente as proteínas de ligação combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" significa tampões, veículos e excipientes que são, dentro do escopo do julgamento clínico, adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, correspondente a uma proporção benefício/risco razoável. O(s) veículo(s) deve(m) ser "aceitá-vel(eis)" no sentido de serem compatíveis com outros ingredientes das for-5 mulações e não deletérios para o receptor. Veículos farmaceuticamente a-ceitáveis, nesse aspecto, pretendem incluir qualquer um e todos os tampões, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes isotônicos e prolon-gadores da absorção e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substancias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.
As formulações podem ser convenientemente apresentadas em uma forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer método adequado, incluindo quaisquer métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Uma composição farmacêutica da invenção deve ser formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração parenteral ou administração não parenteral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, inalação, transdérmica (tópica), transmucosa e administração retal. Soluções úteis para administração oral ou parenteral podem ser preparadas por qualquer um dos métodos 20 bem conhecidos na técnica farmacêutica, descritos, por exemplo, em Reming-ton's Pharmaceutical Sciences, 18- d. (Mack Publishing Company, 1990).
Formulações adequadas para administração oral podem estar na forma de: unidades individuais tais como injeções, cápsulas, cápsulas gelatinosas, saches, comprimidos, pastilhas ou drágeas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada da proteína de ligação; uma composição em pó ou granulada; uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou uma emulsão de óleo em água ou uma emul-são de água em óleo.
Formulações adequadas para administração parenteral incluem, por exemplo, os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propile-no glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfeto de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminote-tracético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade tais como ácido hidroclórico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser acondicionada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.
Em geral, composições adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas (quando solúveis em água) ou dispersões e pós para preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou salina tamponada com fosfato (PBS). Ela deve ser estável sob as condições de produção e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contami-nante de microrganismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser 15 um solvente ou um meio de dispersão que contem, por exemplo, água, eta-nol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido) e misturas adequadas desses.
As formulações farmacêuticas preferivelmente são estéreis. A esterilização pode ser obtida, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Onde as composições são liofilizadas, a esterilização usando esse método pode ser conduzida antes ou após a liofilização e reconstituição. Uma vez que a composição farmacêutica tenha sido formulada, ela pode ser armazenada, por exemplo, em frascos como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado.(2) Aplicações
Diagnosticas
Sempre que as proteínas de ligação forem usadas com propósitos de diagnóstico, tanto in vitro quanto in vivo, as proteínas de ligação são marcadas tanto diretamente quanto indiretamente com uma porção detectá-vel. A porção detectável pode ser qualquer porção que á capaz de produzir, tanto diretamente quanto indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3Hidrogênio (3H), 14Carbono (14C), 32Fosforo (32P), 35Enxofre (35S), ou 125Iodo (125I); um com- posto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fIuores-ceína, rodamina ou luciferina; uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano silvestre; uma sonda paramagnética, tal como um marcador de spin; ou uma partícula colorida, por exemplo, uma 5 partícula de látex ou ouro. É compreendido que a proteína de ligação pode ser conjugada com a porção detectável usando várias abordagens conhecidas na técnica, por exemplo, como descrito em Hunter et ai (1962) Nature 144: 945; David et ai (1974) Biochemistry 13: 1014; Pain et al. (1981) J. Immunol. Meth. 40: 219; and Nygren (1982) J. Histochem. and Cytochem. 10 30: 407. Os marcadores podem ser detectados, por exemplo, visualmente ou com a ajuda de um espectrofotômetro ou outro detector.
As proteínas de ligação podem ser empregadas em uma ampla faixa de técnicas de imunoensaio disponíveis na técnica. Imunoensaios e-xemplares incluem, por exemplo, imunoensaios sanduíche, imunoensaios competitivos e procedimentos imuno-histoquímicos.
Em um imunoensaio sanduíche, dois anticorpos que se ligam a um analito ou antígeno de interesse são usados, por exemplo, um imobilizado sobre um suporte sólido e um livre em solução e marcado com uma porção detectável. Quando uma amostra que contem o antígeno é introduzida nesse sistema, o antígeno se liga ao anticorpo imobilizado e ao anticorpo marcado, para formar um "sanduíche" de complexo imune sobre a superfície do suporte. A proteína complexada é detectada pela lavagem dos componentes não ligados da amostra e do excesso de anticorpo marcado e pela medida de anticorpo marcado complexado à proteína sobre a superfície do suporte. Alternativãmente, o anticorpo livre em solução pode ser detectado por um terceiro anticorpo marcado com uma porção detectável que se liga ao anticorpo livre. Uma revisão detalhada do planejamento de ensaio imunológico, teoria e protocolos podem ser encontrados em vários textos, incluindo Butt, ed., (1984) Practical Immunology, Mareei Dekker, New York; Harlow et ai eds. (1988)Antibodies, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory; and Diamandis etal., eds. (1996) Immunoassay, Academic Press, Boston.
É considerado que as proteínas de ligação marcadas são úteis como agentes de imagem in vivo, através do que as proteínas de ligação podem direcionar os agentes de imagem para os tecidos particulares de interesse do receptor. Uma porção remotamente detectável preferida para imagem in vivo inclui o átomo radioativo Tecnécio"171 (99mTc), um emissor gama com uma meia-vida de cerca de seis horas. Porções não radioativas também úteis em imagem in vivo incluem marcadores de spin de nitróxido assim como lantanídeo e íons de metal de transição, todos os quais induzem atenuação de próton in situ. Além de imunoimagem, as porções radioativas com-plexadas podem ser usadas em protocolos padronizados de radioimunotera-10 pia para destruir as células-alvo. Nucleotídeos preferidos para radioimunote-rapia em altas doses incluem os átomos radioativos 90Itrio (90Yt), 131Iodo (131I) e 111Indio (111In). A proteína de ligação pode ser marcada com 131 11 111I e 99mTc usando técnicas de acoplamento conhecidas nas técnicas de imagem. Similarmente, procedimentos para preparar e administrar o agente de ima-15 gem assim como capturar e processar imagens são bem conhecidas na técnica de imagem e, portanto não são discutidos em detalhes nesse. Similarmente, métodos para realizar imunoterapias baseadas em anticorpo são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. N9 5.543.254.
Ao longo de toda a descrição, onde as composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, é contemplado que as composições também consistem essencialmente, ou consistem nos componentes listados. Similarmente, onde os processos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas do processo, os processos também consistem essencialmente ou consistem nas etapas de processamento listadas. Exceto onde indicado de outra maneira, a ordem das etapas ou ordem de realização de certas ações são irrelevantes com a condição de que a invenção permaneça operativa. Além disso, a menos que observado de outra maneira, duas ou mais etapas ou a-ções podem ser conduzidas simultaneamente.
Exemplos
Os seguintes exemplos discutem a produção e caracterização e vários anticorpos monoclonais anti-hHGF. Exemplo 1 - Produção de Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF
Este Exemplo descreve a produção de vários anticorpos mono-clonais anti-hHGF.
As imunizações, fusões e rastreamentos primários foram conduzidos em MBS Inc. (Portland, ME), após o protocolo de Múltiplos Locais de Imunização Repetitiva (Repetitive Immunization Multiple Sites (RIMMS)). Cinco camundongos AJ e cinco camundongos Balb/c foram imunizados com HGF humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN; Ne de Catálogo 294-HGN-025). Dois camundongos com soros apresentando as maiores atividades anti-HGF por Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA) foram escolhidos para fusão subseqüente. Os baços e nodos linfáticos dos camundongos apropriados foram coletados. As células B foram então colhidas e fundidas com uma linhagem de mieloma. Os produtos de fusão foram diluídos seriadamente em uma ou mais placas até próximo da clonalidade. Os sobrenadantes das fusões resultantes foram examinados quanto a sua ligação a hHGF por ELISA. Os sobrenadantes identificados como contendo anticorpos para HGF foram caracterizados posteriormente por um teste funcional in vitro discutido nos exemplos seguintes. Um painel de hibridomas foi selecionado e os hibridomas foram subclonados e expandidos. Os anticorpos monoclonais foram então purificados por cromatografia de afinidade sobre resina de Proteína A/G sob condições usuais.
Exemplo 2 - Análise de Seqüência de Anticorpos Monoclonais anti-hHGF
Este exemplo descreve as análises de isotipo e seqüência dos anticorpos monoclonais anti-hHGF produzidos no Exemplo 1.
a. Determinação dos Isotipos dos Anticorpos Monoclonais Murinos de HGF O tipo de cadeia leve e o isotipo de cadeia pesada de cada anticorpo monoclonal foram determinados usando o kit IsoStrip Mouse Mono-clonal Antibody Isotyping de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science).
Foi determinado que todos os anticorpos continham uma cadeia leve kappa de imunoglobulina e uma cadeia pesada de imunoglobulina de IgGl. b. Determinação das Seqüências de Nucleotídeo que Codificam as Regiões Variáveis de Cadeia Pesada e Leve
O RNA total foi extraído de cada linhagem celular de hibridoma monoclonal usando o kit RNeasy Miniprep de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen Venlo1 Holanda). A primeira fita de cDNA de extensão completa foi gerada usando o kit de amplificação de cDNA BD SMART® RA-CE de acordo com as instruções do fabricante (CIontech) usando os iniciado-res de oligonucleotídeo BD SMART Il A (5' aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3') (SEQ ID N-: 85) e o iniciador 5'-RACE CDS (5' tttttttttttttttttttttttttvn 3', onde ν = a, g, ou c e η = a, g, c, ou t) (SEQ ID Ns: 86) com a finalidade de 5' RACE (Rápida Amplificação das Extremidades do cDNA).
As regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina Pesada (IgGI) e Kappa foram amplificadas por PCR (Reação em Cadeia da Polime-rase) usando o Sistema Expand High-Fidelity PCR System (Roche Applied 15 Science) de acordo com as instruções do fabricante. As regiões variáveis de cadeia pesada foram amplificadas com a mistura de iniciadores de oligonucleotídeo 5' Universal Primer Mix A (mistura de 5' ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt 3' (SEQ ID Ns: 87) e 5' ctaatacgactcactatagggc 3'(SEQ ID NQ: 88)) e um 3' iniciador específico para a região constante de IgGI, ou 5' tatgcaaggcttacaaccaca 3' (SEQ ID NQ: 89) ou 5' gccagtggatagacagatgggggtgtcg 3' (SEQ ID NQ: 90). As regiões variáveis de cadeia Kappa foram amplificadas com a mistura de iniciador de oligonucleotídeo 5' Universal Primer Mix A e um iniciador específico para a Região Constante Kappa 3', ou 5' ctcattcctgttgaagctcttgacaat 3' (SEQ ID N9: 91) ou 5' cgactgaggcacctccagatgtt 3' (SEQ ID Ns: 92).
Os produtos de PCR individuais foram fracionados por eletrofo-rese em gel de agarose e purificados usando o kit Qiaquick Gel Purification de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). Os produtos de PCR foram subseqüentemente clonados no plasmídeo pCR2.1 TOPO usando o 30 kit de clonagem baseado em topoisomerase TOPO TA Cloning® Kit (com o vetor pCR®2.1-T0P0®) de acordo com as instruções do fabricante (Invitro-gen, Carlsbad, CA) e transformados em bactérias DH5 usando técnicas de transformação usuais. O DNA de plasmídeo isolado dos clones bacterianos transformados foi seqüenciado usando os iniciadores de T7 (5' TAATAC-GACTCACTATAGGG 3') (SEQ ID N2: 93), de M13 de sentido direto (5' GTAAAACGACGGCCAGT 3') (SEQ ID N5: 94), e de M13 de sentido reverso (5' CAGGAAACAGCTATGACC 3') (SEQ ID Ns: 95) por Agencourt Bioscien-ce usando métodos de seqüenciamento de didesoxi DNA usuais para identificar a seqüência das seqüências da região variável. As seqüências foram analisadas usando o programa Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o servidor da internet IMGT/V-Quest (http://imgt.cines.fr/textes/vquest) para identificar e confirmar as seqüências da região variável. C1 Determinação das seqüências de nucleotídeo que codificam as seqüências da região constante da cadeia pesada e leve de imunoqlobulina para as cadeias kappa e de lqG1, de 1A3, 1D3. 1F3, e 2B8
cDNAs de extensão completa para as cadeias de IgGI de 1A3, 1D3, e 1F3 foram amplificados por PCR a partir do cDNA criado acima u-sando o seguinte iniciador de sentido direto 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3' (códon de início sublinhado) (SEQ ID N9: 96) e o iniciador de sentido reverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttçatttaccaggagagtgggagagg 3' (códon de parada sublinhado) (SEQ ID Ns: 97). cDNA de extensão completa para a cadeia de IgGI de 2B8 foi amplificada a partir do cDNA criado acima usando o seguinte iniciador de sentido direto 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatcatcctcttt 3' (códon de início sublinhado) (SEQ ID Ns: 98) e iniciador de sentido reverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttçatttaccaggagagtgggagag 3' (códon de parada sublinhado) (SEQ ID N2: 99).
cDNA de extensão completa para a cadeia Kappa de 2B8 foi amplificado usando o seguinte iniciador de sentido direto 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggaatcacagactctggtcttcata 3' (códon de início sublinhado) (SEQ ID N2: 100) e o iniciador de sentido reverso 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtçtaacactcattcctgttgaagctc 3' (códon de parada sublinhado) (SEQ ID N2: 101). Qs fragmentos de PCR foram subclo- nados em pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por reação de recombina-ção Gateway BP (Invitrogen, Carlsbad, CA) e seqüenciados por Agencourt Bioscience usando métodos de seqüenciamento de didesoxi DNA usuais para identificar a seqüência da região constante e confirmar adicionalmente 5 as seqüências da região variável, d. Análise de seqüência
As regiões variáveis (texto normal) foram identificadas usando o servidor da internet IMGT/V-QUEST (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/). As seqüências de Peptídeo de Sinal foram previstas com base na identificação do códon de início in frame (ATG) que estava à montante da Região Variável identificada. As seqüências de peptídeo de sinal foram identificadas e estão sublinhadas abaixo.
O último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variável/constante. Este nucleotídeo está incluído na região variável porque ele é parte deste éxon. As seqüências de aminoácido das regiões constantes listadas abaixo incluem a tradução deste códon de junção.
A fim de criar as seqüências do anticorpo da cadeia pesada ou kappa completas, as seqüências da região variável observadas abaixo são combinadas com suas respectivas seqüências da região constante (as seqüências de sinal estão sublinhadas).
(1) Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 (SEQ ID N2: 1)
1 atqaactttq qqctcaqatt qattttcctt qtccttqttt taaaaqqtqt qaaqtqtqaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 42itcag
(2) Região Variável da Cadeia Leve Kappa de 1A3 (SEQ ID Ns: 3)
1 atqaqtqtqc ccactcaqqt cctqqqqttq ctqctqctqt qqcttacaqa tqccaqatqt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc
121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag
181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca
241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct
301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg
36lgggaccaagc tggaaaíaaa ac
(3) Região Variável da Cadeia Pesada de 2B8 (SEQ ID N5: 11)
1 atqqqatqqa qctatatcat cctctttttq gtaqcaacaa ctacaaatat ccactcccaa 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 36lggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag
(4) Região Variável da Cadeia Leve Kappa de 2B8 (SEQ ID Ns: 13)
1 atqqaatcac aqactctqgt cttcatatcc atactqctct qqttatatqg tqctqatqqq 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361gggaccaggc tggaaataaa ac
(5) Região Variável da Cadeia Pesada de 2F8 (SEQ ID Ne: 21)
1 atqqaatqqa qctqqqtctt tctcttcctc ctqtcaqtaa ctqcaqqtqt ccactqccaq 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 36lggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag
(6) Região Variável da Cadeia Leve Kappa de 2F8 (SEQ ID Ns: 23) 1 atqqagacaq acacaatcct qctatqqqtq ctqctqctct qqqttccaqq ctccactqqt 61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc
121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac
181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct
241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat
301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc
36lacgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac
(7) Região Variável da Cadeia Pesada de 3B6 (SEQ ID Ns: 31)
1 atggaataac cttatatctt tctcttcctc ctqtcaataa ctqaaaatat ccactcccag
61gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc
121tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct
181ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat
241ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg
301cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg
361ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag
(8) Região Variável da Cadeia Leve Kappa de 3B6 (2 possíveis códons de início ATG (letras maiúsculas)) (SEQ ID Ne: 33)
1ATGgacATGa qgacccctgc tcagtttctt ggaatcttqt tactctqqtt tccaqatatc
61aaatqtqaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga
121gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag
181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc
241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg
301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc
361 ggagggggga ccaagctgga aataaagc
(9) 3D11 Região Variável da Cadeia Pesada (SEQ ID Ne: 41)
1 atqqctqtcc cqgtgctqtt cctctqcctq qttqcatttc caaqctqtqt cctctcccaq
61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact
121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca
181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg
241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa
301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct
361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag
(10) Região Variável da Cadeia Leve Kappa de 3D11 (SEQ ID Ne: 43) 1atqqattttc aagtqcaqat tttcaacttc ctactaatca gtacctcaat
61caaaatatcc aqaqqacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt
121ctgcatatcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt
181gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag tcaggcacct cccccaaaag
241 atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct gctcgcttca
301gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag
361 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact
cacgttcggt gctgggacca agctggagct gaaac
(11) Região Variável da Cadeia Pesada de 1D3 (SEQ ID Ns: 51)
1 atqaactttg qqctcaqatt aattttcctt qtccttqttt taaaaaatgt aaaatataaa
61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc
121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca
181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca
241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg
301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat
361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc
421 tcag
(12) Região Variável da Cadeia Leve Kappa de 1D3 (SEQ ID Ns: 53)
1 atqaqtqtqc ccactcaaat cctaaaatta ctactactat aacttacaaa tgtcaaatat
61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc
121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag
181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca
241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct
301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg
361 gggaccaaac tggaaataaa ac
(13) Região Variável da Cadeia Pesada de 1F3 (SEQ ID Ns: 61)
1atqaactttg ggctcaaatt qattttcctt qtccttqttt taaaaaatgt aaaatataaa
61gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc
121tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca
181gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca
241gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg
301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat
361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag
(14) Região Variável da Cadeia Leve Kaooa de 1F3 (SEQ ID Ne: 63)
1 atqaqtqtqc ccactcagqt cctqqqqttq ctqctqctqt qqcttacaaa taccaqatgt
61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc
121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag
181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca
241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct
301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa ac
(15) Região Variável da Cadeia Pesada de 3A12 (SEQ ID N9: 71)
1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaaqtgtqaa
61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc
121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca
181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca
241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg
301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag
(16) Região Variável da Cadeia Leve Kaooa de 3A12 (SEQ ID Ne: 73)
1 atqaqtqtqc ccactcagqt cctqqqqttq ctqctqctqt qqcttacaqa tqccaqatqt
61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc
121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag
181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca
241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg
361 gggaccaaac tagaaataaa ac
(17) Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI de Camundongo de Referência (J00453) (SEQ ID N2: 81)
1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact
61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct
121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gagtctgacc
181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagccc tcggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcc-caggg
301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc
361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg
421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg
481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca
541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca
601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga
661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca
721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga
781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg aatggctctt
841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca
901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact
961 ctcctggtaa atga
(18) Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI de Camundonqo Determinada para 1A3. 1D3, 1F3, e 2B8 (derivada de camundonao da cepa AJ) (SEQ ID Ns: 82)
1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact
61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct
121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc
181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca
241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcc-caggg
301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc
361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg
421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg
481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca
541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca
601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga
661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca
721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga
781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga
(19) Região Constante da Cadeia Leve Kappa de Camundonqo de Referência (V00807) e Região Constante da Cadeia Leve Kappa de Camundonqo
Determinada para 1D3, 1F3, e 2B8 (derivada de camundongo da cepa AJ) (SEQ ID N9: 83)
1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg
61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt
121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca
181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac
241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga
301 gcttcaacag gaatgagtgt tag
(20) Região Constante da Cadeia Leve Kappa de Camundongo Determinada para 1A3 contendo um nucleotídeo alterado em comparação com 1D3, 1F3,
e 2B8 (sublinhados) (SEQ ID N2: 84)
1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg
61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt
121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca
181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac
241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga
301 gcttcaacag gaatgagtgt tag
Cada uma das seqüências de aminoácido que define as regiões variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina para os anticorpos produzidos 25 no Exemplo 1 é descrita na Figura 2. Cada uma das seqüências é alinhada com as outras e as seqüências que definem o peptídeo de sinal, CDRi, C-DR2 e CDR3 são identificadas por quadrados. A Figura 3 mostra um alinhamento das seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3separadas para cada um dos anticorpos.
Cada uma das seqüências de aminoácido que define as regiões variáveis da cadeia leve de imunoglobulina para cada um dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 é descrita na Figura 4. Cada uma das seqüências é alinhada com as outras e as seqüências que definem o peptídeo de sinal, CDRi, CDR2 e CDR3 são identificadas por quadrados. A Figura 5 mostra um alinhamento das seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 separadas para cada um dos anticorpos.
Por conveniência, a Tabela 1 fornece um quadro de concordân- cia que mostra a correspondência entre as seqüências de anticorpo discutidas neste Exemplo com aquelas apresentadas na Listagem de
Seqüência. Tabela 1
<table>table see original document page 43</column></row><table> <table>table see original document page 44</column></row><table> <table>table see original document page 45</column></row><table>
Também, por conveniência, as seguintes seqüências representam as seqüências de cadeia pesada e leve de extensão completa reais ou contempladas (isto é, contendo ambas as seqüências da região variável e constante) para cada um dos anticorpos descritos neste Exemplo. Observa-se que as regiões constantes dos anticorpos murinos 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11 não foram seqüenciadas, mas supõe-se que tenham as mesmas seqüências de região constante que os anticorpos 1D3, 1F3, e 2B8, os quais foram seqüenciados, já que eles todos foram derivados do camundongo da cepa AJ. É observado, entretanto, que as seqüências da região variável descritas aqui podem ser ligadas a cada uma de várias seqüências de região constante conhecidas daqueles versados na técnica para produzir cadeias pesadas e leves ativas de imunoglobulina de extensão completa.
(1) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 e Região Constante de IgGD (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID N9: 122)
1 atqaactttq qqctcaqatt qattttcctt qtccttqttt taaaaqqtqt qaaqtqtqaa
61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc
121 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca
181 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca
241 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg
301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat
361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc
421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact
481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg
541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct
601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc
661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc
721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc
781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt
841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg
901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca
961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg
1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa
1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag
1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc
1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact
1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc
1381 cactctcctg gtaaatga
(2) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 e Região Constante de lqG1) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ne: 123)
1 evqlvesggg Ivqpggslkl scaaseftfs nyymswvrqt pekrlqwvay ispgggssyy
61 pasvkgrfti srdnakntly Iqmsslksed tamyycarqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv
121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq
181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf
241 ifppkpkdvl titltpkvtc wvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr
301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd
361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn
421 tftcsvlheg Ihnhhteksl shspgk
(3) Següência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável Kappa e Região Constante de 1A3) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 124)
1 atqaqtqtqc ccactcaqqt cctqqqqttq ctqctqctqt qqcttacaqa tqccaqatqt
61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc
121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag
181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca
241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct
301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg
361 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca
421 tccagtgagc agttaacalc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac
481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg
541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcatg
601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca
661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (4) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável Kappa e Região Constante) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 125)
1 diqmtqspas Isvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgtyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlm 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec
(5) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 2B8) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 126)
1 atqqqatqqa qctatatcat cctctttttq qtaqcaacaq ctacaqatqt ccactcccaq 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1381 aaatga
(6) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de
Extensão Completa de 2B8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 2B8) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 127) 1 qvqlqqpgae Ivkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny
61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly
181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp
241 kpkdvltitl tpkvtcvwd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 Ipimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk
(7) Següência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável Kappa e Região Constante de 2B8) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ne: 128)
1 atqqaatcac aqactctqqt cttcatatcc atactqctct qqttatatqq tqctqatqqq
61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc
121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca
181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat
241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct
301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg
361 gggaccaggc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca
421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac
481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg
541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg
601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca
661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (8) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável Kappa e Região Constante de 2B8) (sem seoüência de sinal) (SEQ ID Ns: 129)
1 nivmtqspks msmsvgervt Isckasenw syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd
61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrad aaptvsifpp
121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt
181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn mec
(9) Següência de Ácido Nucléico gue Codifica a Següência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 2F8) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 130)
1 atqqaatqqa qctqqqtctt tctcttcctc ctqtcaqtaa ctqcaqqtqt ccactqccaq
61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc
121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct
181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat
241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg
301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg
361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg
421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg
481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct
541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact
601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac
661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt
721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag
781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc
841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca
901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt
961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca
1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca
1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc
1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag
1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1381 aaatga
(10) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 2F8) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 131)
1 qvqlkqsgae Ivrpgtsvkm sckasgytft tyyihwvnqr pgqglewigk igpgsgstyy 61 nemfkdkatl tvdtssstay mqlssltsdd savyfcarrg Igrgfdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp
241 kpkdvltitl tpkvtcwvd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 Ipimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk (11) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável Kappa e Região Constante de 2F8) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID N9: 132)
1 atqqaqacaq acacaatcct qctatqqqtq ctqctqctct qqqttccaqq ctccactqqt
61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc
121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac
181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct
241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat
301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc
361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc
421 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg
481 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa
541 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc
601 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc
661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag (12) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável Kappa e Região Constante de 2F8) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 133)
1 divltqspas Iavslgqrat isckasqsvd ydgnsyinwy qqkpgqppkv Iiyvasnles
61 giparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqqsiedpp tfgagtklel kradaaptvs
121 ifppsseqlt sggasvvcfl nnfypkdinv kwkidgserq ngvlnswtdq dskdstysms
181 stititkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec
(13) Següência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 3B6) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 134)
1 atqqaatqqc cttqtatctt tctcttcctc ctqtcaqtaa ctqaaqqtqt ccactcccag
61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc
121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct
181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat
241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg
301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg
361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc
421 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc
481 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg
541 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 601 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 661 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 721 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 781 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 841 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 901 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 961 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1021 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1081 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1141 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1201 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1261 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1321 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1381 cctggtaaatga
(14) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 3B6) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 135)
1 qvqlqqsgae Ivrpgssvki sckasgyvfs sywmnwvkqr pgqglewigq iypgdgdsny 61 ngnfkgkatl tadkssstay mqlssltsed savyfcasql glrenyfdyw gqgttltvss 121 akttppsvyp Iapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd 181 Iytlsssvtv psstwpsetv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif 241 ppkpkdvlti tltpkvtcw vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv 301 selpimhqdw Ingkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv 361 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf 421 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk
(15) Següência de Ácido Nucléico gue Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável Kappa e Região Constante de 3B6) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID N2: 136)
1 ATGqacATGa qqacccctqc tcaqtttctt qqaatcttqt tqctctqqtt tccaqqtatc 61 aaatqtqaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 361 ggagggggga ccaagctgga aataaagcgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 421 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 481 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 541 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 601 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 661 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta g (16) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável Kappa e Região Constante de 3B6) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 137)
1 dikmtqspss myaslgervt itckasqdik sylswfqqkp gkspktliyr vnrlvdgvps
61 rfsgsgsgqd ssltitslen edmgiyyclq ydefpftfgg gtkleikrad aaptvsifpp
121 sseqltsgga svvcfInnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec
(17) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Següência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável da Cadeia Pesada e
Região Constante de IgGI de 3D11) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 138)
1 atqqctqtcc cqqtqctqtt cctctqcctq qttqcatttc caaqctqtqt cctqtcccag 61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg
241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa
301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct
361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc
421 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg
481 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc
541 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg 601 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc 661 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata 721 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc 781 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc
841 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc 901 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag 961 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc 1021 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt 1081 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac
1141 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac 1201 aagaacactc agcccatcat ggacacagat ggctcttact tcgtctacag caagctcaat 1261 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc 1321 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc tcccactctc ctggtaaatg a
(18) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 3D11) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 139)
1 qvqlkesgpg Ivapsqslsi tctvsgfslt syslhwvrqp pgkglewlgv iwaggntnyn 61 sslmsrltir kdnsksqvfl kmnslqtddt amyycarerf aywgqgtlvt vsaakttpps 121 vyplapgsaa qtnsmvtlgc Ivkgyfpepv tvtwnsgsls sgvhtfpavl qsdlytlsss 181 vtvpsstwps etvtcnvahp asstkvdkki vprdcgckpc ictvpevssv fifppkpkdv 241 Ititltpkvt cvwdiskdd pevqfswfvd dvevhtaqtq preeqfnstf rsvselpimh 301 qdwlngkefk crvnsaafpa piektisktk grpkapqvyt ipppkeqmak dkvsltcmit 361 dffpeditve wqwngqpaen ykntqpimdt dgsyfvyskl nvqksnweag ntftcsvlhe 421 glhnhhteks Ishspgk
(19) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável Kappa e Região Constante de 3D11) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 140)
1 atqqattttc aaqtqcaqat tttcaqcttc ctqctaatca qtqcctcaqt caaaatatcc 61 aqaqqacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 421 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 481 taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 541 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 601 acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 661 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag
(20) Seqüência de Proteína oue Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável Kappa e Região Constante de 3D11) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 141)
1 qivltqspai msaypgekvt mtcsasssvs ymhwyqqksg tspkrwiydt sklasgvpar 61 fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpltfgag tklelkrada aptvsifpps
121 seqltsggas vvcflnnfyp kdinvkwkid gserqngvln swtdqdskds tysmsstltl
181 tkdeyerhns ytceathkts tspivksfnr nec (21) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pe-5 sada de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de lqG1 de 1D3) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ne: 142)
1 atqaactttq qqctcaqatt qattttcctt qtccttqttt taaaaqqtqt qaaqtqtqaa
61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc
121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca
181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca
241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg
301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat
361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc
421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact
481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg
541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct
601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc
661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc
721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc
781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt
841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg
901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca
961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg
1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga
1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa
1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag
1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc
1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact
1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc
1381 cactctcctg gtaaatga (22) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 1D3) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 143)
1 evqlvesggg Ivqpggslkl scaasgftfs dyymswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly Iqmsslksed taiyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsviv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc wvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg Ihnhhteksl shspgk
(23) Seoüência de Ácido Nucléico gue Codifica a Següência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável Kappa e Região Constante de 1D3) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 144)
1 atqaqtqtqc ccactcaqqt cctqqqqttq ctqctqctqt qqcttacaqa tqtcaqatqt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag
(24) Seqüência de Proteína oue Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável Kappa e Região Constante de 1D3) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 145)
1 diqmtqspas Isvsvgetvt itcrtseniy snlawyqqkq gkspqlliya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslrinslqs edfgryycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga swcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (25) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 1F3) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID 5 NQ: 146)
1 atqaactttq ggctcaqatt qattttcctt qtccttqttt taaaaqqtqt qaaqtqtqag 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg
301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct
601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg
901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag
1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (26) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 1F3) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 147)
1 evqlvesggg Ivqsggslkl scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly Iqmsslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssví 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg Ihnhhteksl shspgk
(27) Següência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável Kappa e Região Constante de 1F3) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 148)
1 atqaqtqtqc ccactcaqqt cctqqqqttq ctqctqctqt qqcttacaqa tqccaqatqt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (28) Següência de Proteína oue Define a Següência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável Kappa e Região Constante de 1F3) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 149)
1 diqmtqspas Isvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvyd athlpdgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcfInnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (29) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IqGI de 3A12) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 150)
1 atqaactttq qqctcaqatt qattttcctt qtccttqttt taaaaqqtqt qaaqtqtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (30) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgGI de 3A12) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 151)
1 evqlvesggg Ivqpggslki scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy
61 pdsvkgrfti srdnakntly Iqmnslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv
121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq
181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf
241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr
301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd
361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn
421 ftcsvlheg Ihnhhteksl shspgk
(31) Següência de Ácido Nucléico que Codifica a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável Kappa e Região Constante de 3A12) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 152)
1 atqaqtqtqc ccactcaqqt cctqqqqttq ctqctqctqt gqcttacaaa taccaqatqt
61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc
121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag
181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca
241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct
301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg
361 gggaccaaac tagaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca
661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag
(32) Següência de Proteína gue Define a Seqüência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável Kappa e Região Constante de 3A12) (sem següência de sinal) (SEQ ID Ne: 153)
1 diqmtqspas Isvsvgetvt itcraseniy inlawyqqkq gkspqllvha atkladgvps
61 rfsgsgsgtq yslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp
121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 Itkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec
Por conveniência, a Tabela 2 fornece um quadro de concordância que mostra a correspondência entre as seqüências de extensão completa dos anticorpos discutidos neste Exemplo com aqueles apresentados na
Listagem de Seqüência.
TABELA 2
<table>table see original document page 62</column></row><table> <table>table see original document page 63</column></row><table>
Exemplo 3 - Produção de Várias Proteínas hHGF Recombinantes
Este Exemplo descreve a clonagem e expressão de várias proteínas recombinantes usadas para caracterizar os anticorpos criados no E-xemplo 1 e no Exemplo 14. Em particular, este Exemplo descreve a clonagem e expressão da proteína hHGF recombinante, uma proteína hHGF re-combinante que contém uma substituição de glicina para glutamato na posição 555 (G555E), uma proteína hHGF recombinante que contém uma substituição de cisteína para arginina na posição 561 (C561R), uma proteína HGF quimérica camundongo-humano-camundongo (mhm) recombinante contendo a seqüência de HGF V495-L585 humana disposta dentro da seqüência de HGF de camundongo, uma proteína de HGF quimérica mhm recombinante contendo a seqüência de HGF I499-R566 humana disposta dentro da seqüência de HGF de camundongo, e uma proteína de HGF quimérica mhm recombinante contendo a seqüência de HGF W507-L585 humana disposta dentro da seqüência de HGF de camundongo.
Os seguintes construtos de expressão foram gerados usando técnicas moleculares usuais e as seqüências de cDNA resultantes foram confirmadas por seqüenciamento de DNA: a. hHGF-Fc
Em um primeiro ciclo de PCR, dois fragmentos de PCR sobre- poníveis foram gerados introduzindo um sítio de Not I e codificando um sina-Iizador 6xHis entre hHGF e hlgFc. Os fragmentos de PCR sobreponíveis serviram como molde em um segundo ciclo para amplificar hHGF-his-lgFc. O fragmento resultante foi digerido por Nhel e BamHI e clonado em pcD-NA5/FRT (Invitrogen, #35-3014). Então, hHGF foi amplificado a partir do clo-ne ID: IOH29794 (cDNA de HGF humano) da Invitrogen. A seqüência correspondeu à seqüência depositada no NCBI sob o número de acesso NM_000601.4.
(1) Iniciadorde Nhel de hHGF5'
ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT (SEQ ID N3: 102)
(2) Iniciadorde HisTaa de Notl hHGF 3'
GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTAT ATG (SEQ IDN9: 103)
(3) Iniciador de HisIaFc 5'
ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEQ ID NQ: 104)
(4) Iniciador de BamHI de IaFc 3'
ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG (SEQ ID Ns: 105)
b. G555E de hHGF-Fc e C561R de hHGF-Fc
Os mutantes de hHGF-Fc, G555E e C561R, foram gerados por mutagênese sítio-dirigida usando o kit de mutagênese sítio-dirigida Quik-Change Il XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante.
(1) Iniciador senso de hHGF-Fc (G555E) CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG (SEQ ID NQ: 106)
(2) Iniciador anti-senso de hHGF-Fc (G555E) CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG (SEQ ID Ns: 107) {3} Iniciador senso de hHGF-Fc (C561R)
GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG (SEQ ID N5: 108) (4) Iniciador anti-senso de hHGF-Fc (C561R)
CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC (SEQ ID Ns: 109)
c. Fc quimérico eamundogno-humano-camundongo
O construto de IgFc quimérico camundongo-humano-camundongo contém uma cadeia-alfa de mHGF, aminoácidos da cadeia β Val 495-Leu 585 de HGF humano, e a cadeia beta C-terminal de mHGF seguido por sinalizador 6xHis e IgG-Fc.
cDNA de HGF humano que codifica os aminoácidos V495-L585 foi amplificado a partir do clone ID: IOH29794 (cDNA de HGF humano) da Invitrogen. A seqüência corresponde à seqüência depositada no NCBI sob o número de acesso NM_000601.4. Seqüências de HGF de camundongo foram amplificadas por RT-PCR a partir de RNA total de fígado de camundongo (Clontech, # 636603) usando o kit de RT-PCR Super Script One Step da Invitrogen (#10928-034) de acordo com as instruções do fabricante. A seqüência de cDNA de mHGF corresponde à seqüência depositada no NCBI sob o número de acesso D10213.1.
Três fragmentos, referidos como 1, 2 e 3 foram gerados usando iniciadores de PCR sobreponíveis e anelados em ciclos consecutivos de amplificação por PCR. O produto final foi clivado com Nhel e Notl e clonado em pcDNA5/FRT IgGFc.
(1) Iniciadores do fragmento 1 para Nhel 5' da cadeia alfa de mHGF 5'ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC (SEQ ID Ns: 110) 3' GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG (SEQ ID Ns: 111) í£) Iniciadores do fragmento 2 para aa V495-L585 da cadeia alfa de hHGF 5' CCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC (SEQ ID Ns: 112) 3' CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT (SEQ ID Ns: 113)
(3) Iniciadores do fragmento 3 para Notl3' C-terminal da cadeia beta de mHGF
5' AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG (SEQ ID Ns: 114)
3' GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEQ ID N2: 115)
d. Construção de Quimeras de hHGF e mhm
Os vetores que codificam as quimeras de hHGF e mhm (V495-L585), pcDNA5/FRT hHGF e quimera pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585), sem Fc-tag foram gerados por mutagênese sítio-dirigida. Um códon de parada foi introduzido a 3' de 6xHis usando o kit de mutagênese sítio-dirigida Quik-Change Il XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores da mutagênese incluíram o iniciador 1: CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCTGGTGCCACG (SEQ ID Ns: 116), e o Iniciador 2: CGTGGCACCAGACCCGCTTAGTGATGGT-GATGGTGATG (SEQ ID N9: 117).
Além disso, duas quimeras de mhm adicionais foram criadas a partir do construto de pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585) por mutagênese sítio-dirigida usando o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange II XL (Strata-gene) de acordo com as instruções do fabricante. Um construto de mhm continha a região de I499-R556 de hHGF disposta entre as seqüências mu-rinas. O outro construto de mhm continha a região de W507-L585 de hHGF disposta entre as seqüências murinas.
Para a quimera de mhm (I499-R556), as seguintes mutações pontuais foram feitas em ordem no construto molde da quimera pcD-NA5/FRT-mhm (V495-L585): D558E, C561R, V564I, V567I e M583L, usando as seqüências de oligonucleotídeo apropriadas. Para a quimera de mhm (W507-L585), as seguintes mutações pontuais foram introduzidas em uma etapa na quimera molde pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585): Q502R, N504T e I505V, usando as seqüências de oligonucleotídeo apropriadas.
A seqüência de nucleotídeo resultante da proteína hHGF-Fc é descrita como SEQ ID Ns: 118, incluindo a seqüência de sinal (nucleotídeos 1-93) e pró-domínio (nucleotídeos 94 a 162). A seqüência de aminoácido da proteína hHGF-Fc é descrita como SEQ ID Ns: 119.
A seqüência de nucleotídeo resultante que codifica a proteína mhm (V495-L585)-Fc quimérica é descrita em SEQ ID Ne: 120, incluindo a seqüência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97 a 165). A seqüência de aminoácido da proteína quimérica mhm (V495-L585)-Fc é descrita em SEQ ID Ns: 121.
A seqüência de nucleotídeo resultante que codifica e a seqüência de proteína que define o construto de mhm (V495-L585) são descritas em SEQ ID NOS. 211 e 212, respectivamente. A seqüência de ácido nucléi-co descrita em SEQ ID N5: 211 inclui a seqüência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97 a 165), e a seqüência de proteína descrita em SEQ ID Ns: 212 inclui a seqüência de proteína ativa (sem a seqüên- cia de sinal ou o pró-domínio). A seqüência de nucleotídeo resultante que codifica e a seqüência de proteína que define o construto de mhm (1499-R556) são descritas em SEQ ID NOS. 213 e 214, respectivamente. A seqüência de ácido nucléico descrita em SEQ ID Ns: 213 inclui a seqüência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97-165), e a seqüência de proteína descrita em SEQ ID Ns: 214 inclui a seqüência de proteína ativa (sem a seqüência de sinal ou o pró-domínio). A seqüência de nucleotídeo resultante que codifica e a seqüência de proteína que define mhm (W507-L585) são descritas em SEQ ID NOS. 215 e 216, respectivamente. A seqüência de ácido nucléico descrita em SEQ ID Ns: 215 inclui a seqüência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97 a 165), e a seqüência de proteína descrita em SEQ ID Ns: 216 inclui a seqüência de proteína ativa (sem a seqüência de sinal ou o pró-domínio). e. Expressão de Proteína (1) Cultura celular
Células CHO Flpln (Invitrogen, Ns de Catálogo R758-07)) foram cultivadas em meio F12K (ATCC, Ns de Catálogo 30-2004), 10% de FCS (Invitrogen, Ns de Catálogo 10438026), 1% de Penicilina (10000 unida-des/mL) /estreptomicina (10.000 Dg/mL) (Invitrogen, Ns de Catálogo 15140-20 122) a 37°C, 5% de CO2, 100 DgMiL de Zeocina (Invitrogen, Ns de Catálogo R250-01).
(2) Geração de Linhagens Celulares CHO estáveis
As células hospedeiras CHO Flpln foram transfectadas com uma proporção 9:1 de DNA de plasmídeo de expressão pOG44:pcDNA5/FRT 25 usando Iipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Ns de Catálogo 11668-027). Como controles, as células foram transfectadas com o vetor vazio pcDNA5/FRT vetor/pOG44 e plasmídeo pOG44 (Invitrogen, Ne de Catálogo 35-3018) apenas. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram repicadas, e após quarenta e oito horas 0,5 30 mg/mL de Higromicina B (Sigma, Ns de Catálogo H0654-SPEC) foi adicionado às células. A seleção policlonal de células estáveis foi realizada em F12K, 10% de FCS, 1% de Penicilina/Estreptomicina, 0,5 mg/mL de Higromieina B. (3) Expressão de proteína em linhagens celulares CHO Flpln estáveis
Aproximadamente 2x106 células foram semeadas em placas de 15 cm e cultivadas em F12K (ATCC, N9 de Catálogo 30-2004)/DMEM com alto teor de glicose (Invitrogen, Ns de Catálogo 11995065) 1:1, 5% de ultra 5 Iow IgG FCS (Invitrogen, #16250-78) a 37°C, 5% de CO2 por 5 a 6 dias. Os sobrenadantes foram colhidos e as proteínas resultantes analisadas por E-LISA e por ressonância de plásmon de superfície.
Exemplo 4 - Características de ligação de Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF
Os anticorpos monoclonais produzidos no Exemplo 1 foram ca- racterizados por sua habilidade de se ligar a hHGF, e algumas das proteínas HGF recombinantes produzidas no Exemplo 3.
Os anticorpos foram analisados por ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100 para avaliar sua habilidade 15 de se ligar a HGF e algumas das proteínas de fusão discutidas no Exemplo 3. Cada anticorpo foi imobilizado sobre um chip sensor CM5 de dextran car-boxilado (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, Ne de Catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante.
As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, Ns de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, Ne de Catálogo R-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, Ns de Catálogo 2930) e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextran (Fluka, N2 de Catálogo 86524) como tampão de corrida. Sobrenadantes contendo diferentes proteínas de fusão 25 de HGF ou sobrenadante de células transfectadas com o vetor vazio foram injetados sobre cada anticorpo em uma taxa de fluxo de 30 μl/ηηίη por 3 minutos. A ligação resultante foi determinada como unidades de ressonância (RU) sobre o basal 30 segundos após o final da injeção. A ligação foi comparada com HGF humano (R&D Systems, Ns de Catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida. Ligação inespecífica foi monitorada por comparar a ligação a uma superfície de controle onde IgG de camundongo (Rockland, Ns de Catálogo 010-0102) foi imobilizada usando o mesmo procedimento de acoplamento de amina.
Os resultados estão resumidos na Tabela 3.
TABELA 3
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Os resultados na Tabela 3 demonstram que cada um dos anti- corpos se liga a rHGF e HGF humano purificado. Além disso, todos os anticorpos se ligam a hHGF contendo as mutações pontuais G555E e C561R. Em geral, todos os anticorpos exceto 1F3 e 2F8 não se ligam a murino demonstrando que os anticorpos 1A3, 1D3, 2B8, 3A12, 3B6, e 3D11 se ligam especificamente a HGF humano. Os anticorpos 1D3, 1F3, e 2B8 se ligam à quimera de camundongo-humano-camundongo enquanto que os anticorpos restantes não se ligaram. Os resultados sugerem que os anticorpos 1D3 e 2B8 se ligam pelo menos em parte aos resíduos 495 a 585 de HGF humano. Os anticorpos 1A3, 3A12, 3B6, e 3D11 parecem se ligar a porções de hHGF humano com exceção dos resíduos 495 a 585. No momento é não se sabe o motivo de 2F8 não se ligar à quimera de mhm já que ele parece se ligar tanto a hHGF quanto mHGF.
Exemplo 5 - Habilidade dos Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF se Ligarem a HGF Reduzido e Não-Reduzido
Neste Exemplo, os anticorpos monoclonais anti-hHGF produzidos no Exemplo 1 foram analisados quanto a sua habilidade de se ligar a HGF reduzido e não reduzido.
A reatividade dos soros anti-HGF com o hHGF recombinante foi avaliada por immunoblotting. Oito pg de proteína hHGF recombinante em tampão de corrida NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen) com ou sem tampão redutor de amostra NuPAGE (Invitrogen) foram fracionados em um gel de Bis-Tris 4 a 12% com poços de 1,0mm X 2D (Invitrogen, Carlsbad, CA). As proteínas fracionadas foram então transferidas para uma membrana de ni-trocelulose usando procedimentos usuais. As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com solução de leite em pó desnatado a 5% em Salina Tamponada com Tris com 0,1% de Tween-20® (TBST), e então colocadas em um equipamento Mini Protean II Multi-Screen (BioRad) para bloqueio adicional.
As membranas resultantes foram marcadas com os anticorpos purificados em um equipamento Multi-Screen. Os anticorpos purificados foram diluídos para 5Mg/mL em tampão de bloqueio. A membrana de nitrocelulose foi então removida do equipamento, e incubada com anticorpos anti-lgG de camundongo marcada com peroxidase de rábano silvestre. Os resultados estão resumidos na Tabela 4, onde os números refletem a extensão de ligação com - representando a ligação mínina (pouca ou nenhuma ligação) e 3+ representando a ligação máxima.
TABELA 4
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Os dados na Tabela 4 demonstram que todos os anticorpos se ligam a rhHGF não-reduzido. Em oposição, os anticorpos monoclonais 1A3, 1D3, 1F3, 2F8, 3B6 se ligaram a rhHGF reduzido mas os anticorpos 2B8, 3A12, e 3D11 não se ligaram a rhHGF. Exemplo 6 - Afinidades de Ligação
As afinidades de ligação e cinéticas de interação de cada um dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 contra hHGF foram medidas por ressonância de plásmon de superfície.
Imunoglobulinas de coelho anti-camundongo (BIAcore, Ne de Catálogo BR-1005-14) foram imobilizadas sobre chips sensores CM5 de dextran carboxilado (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N2 de Catálogo BR-1000-50) usando um protocolo usual de acordo com as instruções do fabricante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, Ne de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, Ne de Catálogo 2930), e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextran (Flu-ka, Ns de Catálogo 86524) como tampão de corrida.
Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, Ns de Catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado seqüencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a superfície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dissociação foi monitorada por ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCI, pH 1,7 (BIAcore, N5 de Catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μl/min antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.
Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BIAevaIutation com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo kg (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e Kd (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 5. TABELA 5
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Os dados na Tabela 5 demonstram que os anticorpos se ligam a hHGF com um Kd de cerca de 100 pM ou menos, cerca de 50 pM ou menos, ou pM ou menos.
Exemplo 7 - Atividade de Neutralização de Anticorpos Anti-hHGF
Neste exemplo, os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram caracterizados quanto a sua habilidade de (a) inibir a ligação de hHGF a c-Met, e (b) inibir a incorporação de BrdU estimulada por HGF em células 4MBr-5.
a. Ensaio de Inibicão de Ligação de HGF-Met (Ensaio de Neutralização)
Os anticorpos foram testados por ELISA quanto a sua habilidade de inibir a ligação de hHGF a c-Met.
Especificamente, placas de ensaio DELFIA de 96 poços Wallac (Wallac Inc., Ns de Catálogo AAAND-0001) foram revestidas com 100 μί de HGF a 6,25 μg/mL (R&D Systems, Ns de Catálogo 294-HGN-025) em tampão de revestimento de carbonato (15 mM de Na2CO3 e 34 mM de NaHCO3, pH 9,0) por 16 horas a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 200 μl de leite em pó desnatado a 5% em PBS por 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos foram preparados em uma placa separada por adicionar concentrações crescentes dos anticorpos sob investigação (0,033 a 667 nM, diluição seriada de 3 vezes) a 2 nM de c-Met (R&D Systems, Ns de Catálogo 358-MT/CF) em leite em pó desnatado a 5% em PBS. 100 μί de amostra por poço foram transferidos para a placa de ensaio e incubados durante a noite a 4°C. As placas de ensaio foram então lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubados por duas horas em temperatura ambiente com 100 μL/poco de anticorpo anti-c-Met humano biotinilado a 2 μg/ml. (R&D Systems, Ns de Catálogo BAF358) preparado em leite em pó desnatado a 5% em PBS.
As placas resultantes foram então lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com Es-treptavidina marcada com Eu (Wallac, Ns de Catálogo 1244-360) diluída 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Wallac, Ns de Catálogo 4002-0010). As placas resultantes foram lavadas 3 vezes com solução de lavagem DEL-FIA (Wallac, Ns de Catálogo 4010-0010) e incubadas com 100 μl/poco de solução de intensificação DELFIA (Wallac ns 4001-0010) por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação.
As placas foram lidas em um instrumento Victor3V (Perkin Elmer) usando o método de Európio. Os valores de IC50 foram calculados e estão resumidos na Tabela 6.
<table>table see original document page 73</column></row><table>
Os resultados demonstram que todos os anticorpos (isto é, 1D3, 1A3, 2B8, 3A12, 1F3, 3D11, e 2F8) com exceção de 3B6 neutralizam eficazmente a ligação de HGF a c-Met.
b. Neutralização da Incorporação de BrdU Estimulada por HGF em
células 4MBr-5
Dez μL de 12,5 nM de hHGF foram dispensados em poços individuais de uma placa de microtitulação de cultura de tecido de 96 poços (Costar, N2 de Catálogo 3903). Dez pL de anticorpos foram diluídos seria- damente em concentrações de 6667; 2222; 740; 247; 82; 27; 9,1; 3,0; 1,0; 0,33 nM foram adicionados a cada poço. A mistura de anticorpo de HGF foi então incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Células epiteliais brônquicas de macaco 4MBr-(ATCC, CCL208) cultivadas em F-12K (ATCC, 30-2004), 15% de FBS (Gibco 10438-026), 30 ng/mL de EGF (Sigma E9644), 1% de penicilina/estreptomicina (PS, Gibco N2 de Catálogo 15140-122) foram dissociadas com Tripsina (Gibco, Ns de Catálogo 25200-056), ressuspensas em meio de ensaio (F-12K, 2,5% de FBS, 1% de PS) a 75.000 células/mL, e 80 μL da suspensão celular foi dispensada à mistura de anticorpo de HGF.
As células resultantes foram incubadas a 37SC, 5% de CO2. Quarenta e oito horas depois, 10 pL de BrdU a 100 μM (Roche, Ns de Catálogo 1669915) foram adicionados. Setenta e duas horas depois, o meio foi removido, as placas foram secas com secador de cabelo e foram processadas com ELISA de BrdU de acordo com as instruções do fabricante (Roche N8 de Catálogo 1669915).
O sinal Iuminescente foi quantificado por um leitor de placas Sy-nergy HT (Bio-Tek). Os dados foram ajustados para uma dose-resposta sig-móide com inclinação variável com a equação y = inferior + (superior-inferior)/(1 +10A(log(EC50-x)*inclinação)) em GraphPad Prism (GraphPad Software). Cada experimento foi repetido pelo menos 3 vezes em duplicatas e os valores de EC5O médios são apresentados na
Tabela 7.
TABELA 7
<table>table see original document page 74</column></row><table> Os resultados na Tabela 7 demonstram que todos os anticorpos 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11 inibem a proliferação induzida por HGF em células 4MBr-5.
Exemplo 8 - Atividade Anti-Disperão de Anticorpos Anti-hHGF 5 Este Exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos pro-
duzidos no Exemplo 1 quanto a sua habilidade de inibir a atividade de dispersão induzida por HGF. HGF induz "dispersão" (motilidade) de aglomerados em células MDCK (ATCC, Manassas, VA, N2 de Catálogo CCL-34).
Células MDCK foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 poços Costar (Corning Incorporated1 Corning, NY, Ns de Catálogo 3595) em uma densidade de 4x103 células por poço em 80 pL de MEM (ATCC, Manassas, VA, Ns de Catálogo 30-2003) contendo 10% de Soro Fe-tal Bovino (Invitrogen N2 de Catálogo 10438026), e 1% de penicilina-estreptomcina (Invitrogen, N9 de Catálogo 15140122). Cada um dos anticorpos a ser investigado foi diluído para 6.667 nM em MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Cada uma das diferentes diluições de anticorpo, assim como MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1% de penicilina-estreptomicina sem anticorpo, foi então combinada separadamente com um volume igual de MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1% de penicilina-estreptomicina, e 100 ng/ml de HGF (R&D Systems Ns de Catálogo 294-HGN-025). As diluições de anticorpo/HGF foram incubadas por 30 minutos a 25°C. Vinte pL de cada diluição de anticorpo/HGF foi adicionada separadamente aos poços individuais, gerando uma concentração final de anticorpo de 666,7 nM, e uma concentração final de HGF de 10 ng/ml. As células MDCK foram então incubadas por 24 horas a 37°C com 5% de CO2.
Após 24 horas de incubação, as células MDCK foram cuidadosamente lavadas uma vez com 100 pL por poço de PBS gelado (Invitrogen Ns de Catálogo 14190144), e fixadas com 100 pL por poço de metanol gelado durante agitação por 10 minutos a 25°C. As placas foram então lavadas cuidadosamente uma vez com água destilada. Um volume de 100 pL de solução de cristal violeta, consistindo em 0,5% de cristal violeta (Sigma, St. Louis, MO, Ns de Catálogo C3886) e etanol a 50% em água destilada, foi adicionado a cada poço, e as células foram incubadas por 20 minutos a 25°C com agitação.
Após a marcação com solução de cristal violeta, as células foram lavadas cuidadosamente três vezes com água destilada. A seguir, PBS foi adicionado a cada poço para evitar o ressecamento das amostras. As células foram visualizadas usando o microscópio Leica DMIRB (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Alemanha), a câmera DC500 (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Germany), e o programa MagnaFire 2.1 C (Optronics, Goleta, CA), e as amostras foram quantificadas quanto ao nível de dispersão. Os resultados estão resumidos na Tabela 8.
TABELA 8
<table>table see original document page 76</column></row><table>
- Nenhuma inibição
+++ Inibição muito grande, quase completa ++ Inibição forte + Inibição detectável Os resultados na Tabela 8 demonstram que o anticorpo 2B8 inibiu a dispersão induzida por HGF mais do que os outros anticorpos. Os anticorpos 1D3 e 3B6 apresentaram um nível de inibição intermediário; o anticorpo 1A3 apresentou um nível de inibição baixo a intermediário. Os anticorpos 1F3 e 2F8 apresentaram um nível de inibição baixo; e os anticorpos 3A12 e 3D11 forneceram pouca ou nenhuma inibição detectável. Exemplo 9 - Inibicão de Fosforilacão de c-Met estimulada por HGF
Este Exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 quanto a sua habilidade de inibir a fosforilação de c-Met estimulada por HGF em células PC-3. HGF induz a fosforilação de Met em células PC-3 (ATCC N9 CRL-1435).
As células PC-3 foram semeadas em poços individuais de placas de cultura de tecido de 96 poços Costar (Corning Ns de Catálogo 3595) em uma densidade de 4,5 χ "10"4 células por poço em 100 pL de F-12K (ATCC, Manassas, VA, Ns de Catálogo 30-2004) contendo 10% de Soro Fetal Bovino (Invitrogen, Ns de Catálogo 10438026) e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, N2 de Catálogo 15140122). Após 24 horas a 37eC com 5% de CO2, o meio foi removido, e as células foram enxaguadas uma vez com F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram então incubadas por 24 horas em 100 μL de F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina.
As 10 diferentes diluições a seguir de cada um dos anticorpos sendo investigados foram preparadas em F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina: 6667 nM, 2222 nM, 741 nM; 247 nM; 82,3 nM; 27,4 nM; 9,1 nM; 3,0 nM; 1,0 nM; e 0,3 nM. Cada diluição de anticorpo, e F-20 12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina sem anticorpo, foram combinadas separadamente com um volume igual de F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina e 500 ng/mL de HGF (R&D Systems Nq de Catálogo 294-HGN-025). Estas diluições de anticorpo/HGF foram incubadas por 30 minutos a 25°C. Isto resultou em uma concentração final de 1,25 nM de HGF.
As células PC-3 foram lavadas uma vez com F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. A seguir, 70 μΐ_ de F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina foi adicionado às células, seguido por 10 pl de Na3VO4 a 10 mM (Sigma, Ns de Catálogo S6508) em F-30 12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram então incubadas por 60 minutos a 37°C com 5% de CO2. Após esta incuba-ção, 20 μL de cada diluição de anticorpo/HGF foi adicionada aos separada- mente a poços separados, produzindo uma concentração final de HGF de 50 ng/mL, e as seguintes concentrações finais de cada anticorpo 666,7 nM; 222,2 nM; 74,1 nM; 24,7 nM; 8,23 nM; 2,74 nM; 0,91 nM; 0,30 nM; 0,10 nM; 0,03 nM. As células foram então incubadas por 10 minutos a 37°C com 5% de CO2, e após isto, a mistura de meio/anticorpo/HGF foi removida, as placas foram plaqueadas em gelo. As células foram então lavadas uma vez com 100 μL por poço de PBS gelado (Invitrogen, N9 de Catálogo 14190144) contendo 1 mM de Na3VO4. As células foram então incubadas por 30 minutos a 4°C em 100 μL por poço de tampão de lise gelado consistindo em 1% de OmniPur Triton X-100 (MERCK KGaA, Darmstadt, Alemanha, N2 de Catálogo 9410), 50 mM de Tris-HCI pH 8,0, 100 mM de NaCI, 0,3 mM de Na3VO4, coquetel de inibidor de protease a 1x (Sigma, Na de Catálogo P8340), e coquetel de inibidor de protease 2 a 1x (Sigma, Ns de Catálogo 5726).
Anticorpo anti-HGF-R humano biotinilado (c-met) (R&D Systems, Ns de Catálogo BAF358) foi diluído para uma concentração de 2 pg/mL em tampão de ensaio DELFIA Assay Buffer (PerkinElmer, Turku, Finland, Ns de Catálogo 4002-0010) contendo 1% de albumina sérica bovina (Sigma Ne de Catálogo A2153), e 50 pL por poço desta diluição foram adicionados de placas de microtitulação de estreptavidina amarela (PerkinElmer, Ns de Catálogo AAAND-0005). As placas foram então incubadas com anticorpo por 30 minutos a 25°C com agitação. Após a incubação, as placas foram lavadas com solução de lavagem DELFIA (PerkinElmer, N2 de Catálogo 4010-0010), e 80 pL de cada um dos diferentes Iisados de células PC-3 foram adicionados a poços individuais das placas de microtitulação de estreptavidina lavadas.
As placas de microtitulação de estreptavidina contendo lisados de células PC-3 foram incubadas por 60 minutos a 25°C com agitação, e então lavadas com solução de lavagem DELFIA. 100 pL de 600 ng/mL de anticorpo DELFIA Eu-Nl P-Tyr-100 (PerkinElmer, N2 de Catálogo AD0159) diluído em DELFIA Assay Buffer contendo 1% de albumina sérica bovina foi adicionada a cada poço das placas de microtitulação de estreptavidina lava- das incubadas previamente com Iisados de células PC-3. As placas foram incubadas por 60 minutos a 25°C, com agitação. As placas foram lavadas mais uma vez com solução de lavagem DELFIA. Então, 200 μL de DELFIA Enhancement Solution (PerkinEImer Ns de Catálogo 4001-0010) foram adicionados a cada poço das placas de microtitulação de estreptavina lavadas, e as placas foram incubadas no escuro por 5 minutos e 25°C, com agitação.
O sinal foi então medido usando o protocolo de Európio no leitor Victor3V (PerkinEImer). Os valores de EC5O foram calculados usando Prism 4 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) e a equação doseresposta sigmóide.
Os resultados resumidos como EC50s em nM estão tabulados na Tabela 9.
<table>table see original document page 79</column></row><table>
Os dados na Tabela 9 demonstram que todos os oito anticorpos são potentes inibidores da fosforilação de c-Met induzida por HGF em celilas PC-3.
Exemplo 10 - Inibicão de Tumor em Modelo de Xenoenxerto de U87MG
A habilidade de anticorpos monoclonais murinos da invenção i-nibirem o crescimento tumoral foi testado em um modelo de xenoenxerto de U87MG. Células U87MG (ATCC) foram expandidas em cultura a 37°C em uma atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% de ar, usando um meio que compreende meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomi- cina. As células foram subcultivadas e mantidas por desprender as células da parede da placa de cultura usando tripsina-EDTA.
Células quase confluentes foram coletadas por tripsinização e então 5 χ "10^6 células em Matrigel 50% (BD Biosciences; Ns de Catálogo 356237) foram injetadas subcutaneamente na área dorsal superior entre a escápula de camundongos ICR SCID fêmeas de 7 semanas de idade (Taco-nic Labs). Os diâmetros (mm) mais longos (L) e mais curtos (W) dos tumores foram medidos com um compasso de calibre. O volume tumoral (vol) foi calculado como: (mm3) = L χ W2 / 2. Quando os tumores cresceram para apro-10 ximadamente 200 mm3, os camundongos que possuíam os tumores foram randomizados em 5 grupos de 10 camundongos cada. Um grupo recebeu PBS. Cada um dos outros 4 grupos recebeu um dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3 ou 2B8. Todos os anticorpos foram administrados em doses de 1 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injeções intraperitoneais de 5 15 doses. Os volumes tumorais e os pesos corporais dos camundongos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento tumoral foi analisada usando o teste de f-Student. Os resultados estão resumidos na Figura 6 e na Tabela 10.
TABELA 10
<table>table see original document page 80</column></row><table>
Regressão parcial foi obtida no grupo tratado com 2B8 (Figura
6). Inibição estatisticamente significativa do crescimento foi observada nos grupos tratados com 1A3 e nos tratados com 1F3 (Tabela 10). Houve uma inibição de crescimento do tumor de 51% para 1D3 com um valor de ρ de 0,075. Nenhuma perda corporal significativa foi observada.
Exemplo 11 - Inibição de Tumor em Modelo de Xenoenxerto de U118
A habilidade dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3 e 2B8 em inibir o crescimento tumoral foi testado em um modelo de xenoenxerto de U118. Células U118 (ATCC) foram expandidas como descrito no Exemplo 10 (acima) com relação às células U87MG.
Tumores subcutâneos foram estabelecidos como descrito no Exemplo 10 acima, exceto que os camundongos usados eram camundongos nude NCr fêmeas de 7 semanas de idade (Taconic), e o tratamento foi iniciado quando os tumores atingiram aproximadamente 80 mm3. Como no modelo de U87MG, todos os anticorpos foram administrados em doses de 1 mg/kg de peso corporal duas vezes por semana por injeções intraperitoneais por 4 doses. Os volumes tumorais o os pesos corporais dos camundongos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento do tumor foi analisada usando o teste de f-Student. Os resultados estão resumidos na Figura 7 e na Tabela 11.
Tabela 11
<table>table see original document page 81</column></row><table>
Inibição do tumor estatisticamente significativa foi observada nos 15 grupos tratados com 2B8 e 1A3 (Figura 7). Houve uma modesta inibição do crescimento do tumor nos grupos de 1F3 e 1D3 com valores de ρ menores do que 0,05, o qual foi definido como significância estatística neste estudo (Tabela 11). Nenhuma perda de peso corporal significativa foi observada. Exemplo 12 - Humanizacão de Anticorpos Monoclonais Murinos
Este Exemplo descreve a humanização do anticorpo murino 2B8, junto com uma caracterização dos anticorpos humanizados resultantes, as regiões Variáveis de Cadeia Pesada e Leve de 2B8 foram "humanizadas" por dois métodos.
A. Procedimento de Humanizacão 125 No primeiro método, três regiões variáveis de cadeia pesada humanizadas e duas regiões variáveis de cadeia lave kappa humanizadas foram desenhadas com base no método de "super-humanização" descrito em Hwang et al. (2005) Methods 36:35-42; Tan et al. (2002) J. Immunol. 169:1119-1125; Patente U.S. Ns 6.881,557.
A classe estrutural canônica de Chothia foi determinada para cada CDR de 2B8 de camundongo com base o comprimento e na composicão de aminoácidos da CDR. As regiões variáveis de linhagem germinativa humanas que consistem em regiões variáveis leves e pesadas da mesma classe estrutural canônica de Chothia foram identificadas com base em ale-los de referência da região variável de linhagem germinativa humana conhecidos descritos no site da internet do International Immunogentics Information System (IMGT) (disponível na rede de alcance mundial em imgt.cines.fr e biochem.unizh.ch/antibody/Sequences/index.html). Estas regiões variáveis de linhagem germinativa humana da mesma classe estrutural foram comparadas a regiões variáveis de 2B8 de murino por calcular o percentual de i-dentidade ou similaridade entre os resíduos de aminoácido da CDR. As regiões variáveis de linhagem germinativa humanas com a maior identidade e/ou similaridade com os resíduos da CDR de 2B8 de camundongo foram preservadas enquanto que os resíduos da CDR de 2B8 foram usados para substituir os resíduos correspondentes da região variável de linhagem germinativa humana que eram diferentes entre as CDRs de linhagem germinati-20 va humana e CDR de 2B8 de camundongo. A região J humana que era a mais semelhante à região J de camundongo de 2B8 foi então adicionada à terminação carboxila das regiões variáveis "super-humanizadas" e estas seqüências de aminoácido foram convertidas em seqüências de ácido nucléi-co.
A seqüência de ácido nucléico da região variável completa foi construída usando métodos de síntese de gene por PCR (Young et al. (2004) NUCL. ACIDS RES. 32:e59) e clonadas em um vetor de expressão em mamífero (baseado em pcDNA3.2 DEST (Invitrogen)) contendo regiões constantes humanas (à jusante das regiões variáveis) de IgGI (alótipo G1m(17,1)) ou Kappa (alótipo Km(3) (alelo 2)) usando técnicas de biologia molecular usuais. Todos os quatro anticorpos de IgGI de cadeia pesada (de 2B8 quimérico a 3 cadeias pesadas humanizadas (Hu2B8 Hvl-f.1, Hu2B8 Hv5-a.1, Hu2B8 Hv5-51.1) foram expressos nas combinações possíveis com todos os 3 anticorpos de cadeia kappa (quimera de 2B8 e 2 cadeias leves humanizadas (Hu2B8 Kv1-39.1 e Hu2B8 Kv3-15.1) criando 12 proteínas de anticorpo diferentes. A ligação dos anticorpos quiméricos, quiméri-cos/humanizados e humanizados a HGF humano foi então medida como descrito abaixo e os resultados estão resumidos na Figura 8. Cada uma das possíveis combinações de cadeia pesada de imunoglobulina e cadeia leve de imunoglobulina são descritas abaixo na Tabela 12A.
Tabela 12A
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Cada uma das combinações possíveis das cadeias pesadas de imunoglobulina e cadeias leves de imunoglobulinas é descrita abaixo na Ta- bela 12B.
Tabela 12B
<table>table see original document page 83</column></row><table> <table>table see original document page 84</column></row><table>
Dois dos possíveis construtos de anticorpo que contêm as ca- deias pesadas e leves de imunoglobulína de extensão completa contendo as regiões variáveis humanizadas são designados abaixo. sh2B8-9 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgGI (alótipo G1m(17,1)) (SEQ ID Ne: 171) mais hu2B8 Kv 1-39.1 (+ região constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID Ns: 177)
sh2B8-12 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgGI (alótipo G1m(17,1))) (SEQ ID Ns: 171) mais hu2B8 Kv 3-15.1 (+ região constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID Ns: 181).
As seqüências de ácido nucléico codificantes e as seqüências de proteína que definem cada um dos anticorpos humanizados estão resu- midas abaixo. Nesta seção, o último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variável/constante. Este nucleotídeo está incluído na Região Variável porque ele faz parte deste éxon. Seqüências de aminoácido de Regiões Constantes listadas abaixo incluem a tradução deste códon de junção.
(1) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Cadeia Pesada de 2B8 Quimérico de Extensão Completa (Região Variável de Camundonqo e Região Constante de IqGI humana) (alótipo G1m(17,1)) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 154)
1 atqqqatgga qctatatcat cctctttttq qtaqcaacaq ctacaqatqt ccactcccaa
61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt ga-agctgtcc
121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tca-gaggcct
181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taacta-caat
241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcc-tacatg
301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaac-tatgtt
361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agcctc-cacc
421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggca-cagcg
481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtgga-actca
541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactc-tac
601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac cta-catctgc
661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caa-atcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc
781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggt-
caca
841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac
901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac
961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagta-
caag
1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caa-agccaaa
1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gct-gaccaag
1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag
1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc
1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcag-cagggg
1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaa-
gagc
1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (2) Seqüência de Proteína que Define a Cadeia Pesada de 2B8 Quimérico de Extensão Completa (lqG1 de 2B8 Quimérico (alótipo G1m(17.1)) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 155)
1 qvqlqqpgae Ivkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcwvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk
(3) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 Quimérico (Região Variável de Camundonoo e Região Constante Humana) (Kappa de 2B8 Quimérico (Km(3))) (seoüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ne: 156)
1 atqqaatcac aqactctaat cttcatatcc atactqctct qqttatatqq tqctqatqgq 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga
(4) Següência de Proteína oue Define a Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 Quimérico (Kappa de 2B8 Quimérico (Km(3))) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 157)
1 nivmtqspks msmsvgervt Isckasenw syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhk vyacevthqg Isspvtksfn rgec
(5) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv1-f.1 Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ne: 158)
1 atqqactqca cctqqaoqat cctcctcttq qtqqcaqcaq ctacaqqcac ccacoccaaq 61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag
(6) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv1-f.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 159)
1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvss
(7) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (alótipo G1m(17.1)) (SEQ ID Ns: 160)
1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg
61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt
121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga
(8) Seqüência de Proteína gue Define a Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI Humana (alótipo G1m(17.1)) (SEQ ID Ns: 161). O primeiro ami-noácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da seqüência da Cadeia Pesada de IgGI.
1 astkgpsvfp Iapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvfIfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrwsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka Ipapiektis kakgqprepq vytlppsrde 241 Itknqvsltc Ivkgfypsdi avewesngqp ennykttppv Idsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (9) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv1f.1 Humanizado de Extensão Completa e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI humana (alótipo G1m(17,1)) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 162)
1 atqqactQca cctqqaaaat cctcctcttg qtqqcaqcaq ctacaaacac ccacqccqaa 61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (10) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv1f.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (alótipo G1m(17.1)) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 163)
1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptn- ghtny
61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk
(11) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado (següência de sinal sublinhada)
(SEQ ID Ne: 164)
1 atqqqqtcaa ccqccatcct cqccctcctc ctqqctqttc tccaaqqagt ctqtqccaaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag
(12) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado (sem següência de sinal) (SEQ ID Ns: 165)
1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqghvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss
(13) Següência de Ácido Nucléico gue Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado e a Região
Constante da Cadeia Pesada de IgGI Humana (alótipo G1m(17.1)) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 166) 1 atqqqqtcaa ccqccatcct cqccctcctc ctqqctqttc tccaaqqagt ctqtqccqaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (14) Seqüência de Proteína que Define a Região variável da cadeia Pesada 25 de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado e (G1m(17,1) alótipo) a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 167)
1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptn-ghtny
61 npsfqghvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas
121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl
yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vfIfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk
(15) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região variável da cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQID Ns: 168)
1 atqqqqtcaa ccgccatcct caccctcctc ctaactqttc tccaaaaaqt ctgtaccaaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag
(16) Seqüência de Proteína que Define a Seqüência Variável de Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 169)
1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny
61 npsfqgqvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss
(17) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região variável da cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI Humana (G1m(17.1) alótipo) (se-güência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 170)
1 atqqqqtcaa ccgccatcct cqccctcctc ctqqctqttc tccaaqqaqt ctqtqccqaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc
781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa
1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga
(18) Seqüência de Proteína que Define a Região variável da cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IoG 1 Humana (alótipo G1m(17,1)) (sem seqüên- cia de sinal) (SEQ ID Ns: 171)
1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslsswtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcwvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk
(19) Següência de Ácido Nucléico oue Codifica a Região Variável da Cadeia Kappa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado (següência de sinal sublinhada)
(SEQ ID Ne: 172). Dois possíveis ATGs de início são mostrados em letras maiúsculas. 1 ATGqacATGa qqqtccccac tcaqctcctq qqqctcctac tactctqqct ccqaqqtqcc 61 aqatqtqaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 212 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaac
(20) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Kappa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ne: 173)
1 diqmtqspss Isasvgdrvt itckasenw syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleik
(21) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID N3: 174)
1 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tga
(22) Següência de Proteína oue Define a Região Constante da Cadeia Kap-pa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID Ns: 175). O primeiro aminoáci-do é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da Seqüência da Cadeia Leve Kappa.
1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec
(23) Seqüência de Ácido Nucléico oue Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID N2: 176)
1 atqqacatqa qqqtccccqc tcaqctcctq qqqctcctqc tactctqqct ccqaqqtqcc 61 aqatqtqaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 421 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 481 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 541 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 601 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 661 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a
(24) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID Ns: 177)
1 diqmtqspss Isasvgdrvt itckasenw syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhkvyacevthqg Isspvtksfn rgec
(25) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID N9: 178)
1 atqqaaqccc caqcqcaqct tctcttcctc ctqctactct qqctcccaqa taccactqqa 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gggaccaagc tggagatcaa ac
(26) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 179)
1 eivmtqspat Isvspgerat Isckasenw syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleik
(27) Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável de Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Kaopa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 180)
1 atgqaaaccc caqcqcaqct tctcttcctc ctqctactct qqctcccaqa taccactqqa 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat
481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga
(28) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (Km(3) alótipo) (alelo 2) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 181) 1 eivmtqspat Isvspgerat Isckasenw syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhkvyacevthqg Isspvtksfn rgec
Para conveniência, a Tabela 13 fornece um quadro de concordância mostrando uma correspondência entre as seqüências de extensão completa e os anticorpos discutidos nesta seção com aqueles apresentados na Listagem de Seqüência.
TABELA 13
SEQ. ID Na: Proteína ou Ácido Nucléico 154 IgGI de 2B8 quimérico (G1m(17,1)) - ácido nucléico 155 IgGI de 2B8 quimérico (G1m(17,1)) - proteína 156 Kappa de 2B8 quimérico (Km(3)) - ácido nucléico 157 Kappa de 2B8 quimérico (Km (3)) - proteína <table>table see original document page 97</column></row><table>
Β. Procedimento de Humanizacão 2
O Segundo método de humanização empregado para reduzir a imunogenicidade do anticorpo 2B8 de camundongo se baseia no método descrito por Studnicka et al. (1994) PROTEIN ENG. 7:805-814. As regiões variáveis de linhagem germinativa pesada e kappa humanas mais idênticas (em aminoácidos) àquelas de 2B8 de camundongo foram identificadas. Os resíduos que diferiram entre camundongo e humano foram convertidos na seqüência humana dependendo da probabilidade do risco de que tal alteração afetasse a ligação ou imunogenicidade. Resíduos de baixo risco (isto é, resíduos que quando trocados provavelmente não afetariam a ligação de antígeno e também reduziriam potencial imunogenicidade) foram trocados para o aminoácido humano na região variável pesada (criando LR2B8HC) e a região variável kappa (criando LR2B8LC). Adicionalmente, os resíduos de baixo risco e médio risco (isto é., resíduos que quando trocados têm alguma probabilidade de ter um efeito sobre a ligação e também reduziriam potencial imunogenicidade) foram trocados para o aminoácido humano na região variável pesada (criando LRMR2B8HC) e a região variável kappa (criando LR-MR2B8LC). A região constante de cadeia pesada de IgGI (alótipo G1m(3) (alelo 1)) foi adicionada à terminação carboxila de duas regiões variáveis pesadas manipuladas humanas e a região constante kappa humana (alótipo Km(3) (alelo 1)) foi adicionada à terminação carboxila de duas regiões variáveis leves manipuladas, criando assim quatro cadeias de anticorpo humanas manipuladas. Seqüências de ácido nucléico da região variável foram primeiro sintetizadas por métodos de síntese gênica e então adicionadas às seqüências da região constante humana. Estes anticorpos manipulados foram clonados em vetores de expressão de proteína de mamífero, e a proteína foi expressa nas quatro combinações possíveis de cadeia pesada mais cadeia leve. A ligação dos anticorpos quiméricos, quiméricos/humanizados, ou humanizados a HGF humano foi medida usando técnicas convencionais, conforme descrito abaixo.
As seqüências de ácido nucléico codificantes e as seqüências de proteína que definem cada um dos anticorpos humanizados estão resumidas abaixo. Nesta seção, o último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variável/constante. Este nucleotídeo está incluído na Região Variável porque ele faz parte deste éxon. As seqüências de aminoácido das Regiões Constantes listadas abaixo incluem a tradução deste códon de junção.
(1) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de LR2B8HC Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ IDN2: 182)
1 ataaactaat catatattat tctctttctt attactacca ctaccoatat acactctcaa 61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc ag
(2) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de LR2B8HC Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 183)
1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss
(3) Seqüência de Ácido Nucléico oue Codifica a Região Constante da Cadeia Pesada de lgG1 Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (SEQ ID Ns: 184)
1 ccagcacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgtccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga
(4) Seqüência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1 ou 2) (SEQ ID N2: 185). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da seqüência da Cadeia Pesada de lgG1.
1 astkgpsvfp Iapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcwvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka Ipapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc Ivkgfypsdi avewesngqp ennykttppv Idsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
(5) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de de Extensão Completa de LR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgGI Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (següência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ne: 186)
1 atqqqctqqt catatattat tctctttctt Qttgctaccq ctaccqatqt qcactctcaa 61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc agccagcaca 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga
(6) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de LR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 187)
1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksnwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk
(7) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de LRMR2B8HC Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID N2: 188)
1 atgqqttqqt catatattat actctttctc qtaaccaccq ccaccqacqt acactctcaq 61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc ag (8) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de LR-MR2B8HC Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID N9:189)
1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss
(9) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de de Extensão Completa de LRMR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 190)
1 atqqqttqqt catatattat actctttctc qtaqccaccq ccaccqacqt acactctcag 61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca
121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc agccagcaca 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga (10) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de LRMR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID N9: 191)
1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk
(11) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de LR2B8LC Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID N2: 192)
1 atqqaaaqtc aqacccttqt attcatctct attcttcttt qqttqtatqq aqcaqacqgc 61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa
(12) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de LR2B8LC Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ns: 193)
1 divmtqspds mamsvgervt Inckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik
(13) Seqüência de Ácido Nucléico gue Codifica a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID Ns: 194)
1 gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tao(14^ Seqüência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)^ (alelo 1) (SEQ ID Ns: 195). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da seqüência da Cadeia Leve Kappa.
1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec
(15) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Reaião Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID Ns: 196)
1 ataaaaaatc aqacccttat attcatctct attcttcttt aattatataa aacaaacaac 61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa 361 ggaaccaaac tcgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag
(16) Seqüência de Proteína que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LR2B8LC Humanizado e a Reoião Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID Ns: 197)
1 divmtqspds mamsvgervt Inckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhk vyacevthqg Isspvtksfn rgec (17) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de LRMR2B8LC Humanizado (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 198)
1 atqqaatccc aaacccttqt tttcatctct atccttctct qgctttatqg caccaacqqa 61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 361 ggcactaaac ttgaaattaa ac
(18) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de LRMR2B8LC Humanizado (sem seqüência de sinal) (SEQ ID Ne: 199)
1 divmtqspds Iamsigervt Inckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asn-resgvpd
61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik
(19) Seqüência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LRMR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 200)
1 atqqaatccc aaacccttqt tttcatctct atccttctct qgctttatqg cqccqacqqa 61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 361 ggcactaaac ttgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag (20) Seqüência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LRMR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Kappa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID Ns: 201)
1 divmtqspds Iamslgervt Inckasenw syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta swcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 Iskadyekhk vyacevthqg Isspvtksfn rgec
Para conveniência, a Tabela 14 fornece um quadro de concordância mostrando a correspondência entre as seqüências de extensão com-10 pleta e os anticorpos discutidos nesta seção com aqueles apresentados na Listagem de Seqüência.
TABELA 14
<table>table see original document page 106</column></row><table> <table>table see original document page 107</column></row><table>
A Tabela 15 resume as seqüências de CDR da cadeia pesada (definição de Kabat) dos anticorpos 2B8 humanizados preparados pelo procedimento de humanização 1 e pelo procedimento de humanização 2 descritos acima neste Exemplo.
TABELA 15
<table>table see original document page 107</column></row><table>
A Tabela 16 resume as seqüências de CDR da cadeia leve (definição de Kabat) dos anticorpos 2B8 humanizados preparados pelo proce- dimento de humanização 1 e pelo procedimento de humanização 2 descritos acima neste Exemplo
TABELA 16
<table>table see original document page 108</column></row><table>
C. Afinidade de Ligação de Anticorpos 2B8 Humanizados
A afinidade de ligação ao antígeno e a cinética de interação fo- ram analisadas por tecnologia de ressonância de plásmon de superfície u-sando um instrumento BIAcore T100. Imunoglobulinas anti-humano de ca-mundongo (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) foram imobilizadas em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1005-34) por acoplamento de amina (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as recomendações do fabricante. As análises foram executadas a 25°C usando PBS (GIBCO, Ns de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, Ns de 15 Catálogo 2930) e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextran (Fluka, Ns de Catálogo 86524) como tampão de corrida.
Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 10 □ L/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, Ne de Catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado seqüencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a superfície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 □ L/min. A fase de dissociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7 (BIAcore, Ne de Catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 DUmin antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 1,88; 3,75 e 7,5 nM. A determinação dos parâmetros de cinética foi obtida usando a função de cinética do programa BIAevaIutati-on com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e Kd (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 8.
Os resultados resumidos na Figura 8 mostram que certas com- binações de cadeias pesadas super-humanizadas (Hu2B8 Hv5a.1, Hu2B8 Hv5-51.1 ou Hu2B8 Hv1-f.1) e cadeias leves (Hu2B8 Kv1-39.1 ou Hu2B8 Kv3-15.1) retêm afinidade de ligação (K0) a HGF semelhante a 2B8 quiméri-co (regiões variáveis de camundongo com regiões constantes humanas) e 2B8 (Tabela 5).
D. Ensaio de ligação mutuamente exclusiva
A ligação mutuamente exclusiva a HGF foi avaliada por tecnologia de ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100. Imunoglobulinas anti-humanas de camundongo (Jackson Immuno Research Labs, 209-005-098) foram imobilizadas em foram imobilizadas sobre chips sensores CM5 de dextran carboxiladometilado (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N2 de Catálogo BR-1000-50) usando um protocolo usual de acoplamento de acordo com as recomendações do fabricante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, Ns de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, Ns BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, Ne de Catálogo 2930), e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextran (Fluka, Ne de Catálogo 86524) como tampão de corrida.
Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 30 □ L/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 150 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. HGF (R&D Systems, Ne de Catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida em uma concentração final de 7,5 pg/mL foi injetado por 90 segundos a 30 pL/min sobre os anticorpos humanizados capturados. A ligação de HGF foi monitorada antes da injeção subseqüente de anticorpo 2B8 de camundongo ou anticorpo policlonal anti-HGF de cabra (R&D Systems, AF294) por 3 min a 30 pL/min. A superfície foi então regenerada com 10 mM de GIicina-HCl pH 2,0 (BIAcore, Ns de catálogo BR-1003-55) injetada por 3 min em uma taxa de fluxo de 60 pUmin antes de outro anticorpo ser testado. Os resultados estão resumidos na Figura 9.
Os resultados resumidos na Figura 9 mostram que tanto os anticorpos 2B8 humanizados quanto os anticorpos 2B8 quiméricos impedem 2B8 de se ligar a HGF. Estes resultados demonstram que os anticorpos humanizados ainda se ligam ao mesmo epítopo de HGF que o anticorpo 2B8 original.
Exemplo 13 - Produção de Variantes Humanizadas de 2B8 a. ANTICORPOS HUMAN ENGINEERED™
Cadeias manipuladas leves (LR2B8LC e LRMR2B8LC, respectivamente) e pesadas (LR2B8HC and LRMR2B8HC, respectivamente) de baixo risco e de risco baixo-mais-moderado com otimização de códon e de expressão foram clonadas in phase em vetores de expressão de anticorpo transitório de XOMA, os quais contêm módulos de regiões constantes humanas Kappa e Gama-1. As quatro variantes de 2B8 Human Engineered foram produzidas por transfecção transitória em células HEK293E. Os quatro anticorpos a seguir foram produzidos:
HE2B8-1 = LR2B8HC (+ região constante de IgGI (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID Νδ: 187) mais LR2B8LC (+ região constante Kap-pa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID Ns: 197)
HE2B8-2 = LR2B8HC (+região constante de IgGI (alótipo Glm(3) (alelo 1)) (SEQ ID Ns: 187) mais LRMR2B8LC (+ Região constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID Ns: 201)
HE2B8-3 = LRMR2B8HC (+ região constante de lgG1 (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID Ns: 191) mais LR2B8LC (+ Região constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID Ns: 197)
HE2B8-4 = LRMR2B8HC (+ região constante de lgG1 (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID Ns: 191) mais LRMR2B8LC (+ Região constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID Ne: 201)
As cadeias leves e pesadas foram co-transfectadas em células HEK293E adaptadas para suspensão de XOMA cultivadas em meio IS293 (Irvine Scientific, Irvine, CA) usando frascos de agitação de 2 litros. Após 24 horas nos frascos de agitação, 200 ml_ das células transfectadas foram centrifugadas, ressuspensas em 40 mL de meio fresco e transferidas para frascos Integra (Wilson Wolf Manufacturing Inc., MN) para produção. Após a in-cubação por sete dias, as suspensões celulares foram removidas dos fracos Integra, centrifugadas e os sobrenadantes das culturas retidos. Os anticorpos nos sobrenadantes das culturas foram purificados em colunas de rotação (spin) de proteína A (Pro-Chem), dialisados contra PBS, concentrados e esterilizados por filtração. b. Anticorpos SUPERHUMANIZED™
cDNA de Hu2B8_Hv5-51.1 de extensão completa + domínio constante de lgG1 humana (alótipo G1m(3)) foi clonado em pEE6.4 (Lonza Biologics, Berkshire, UK) usando sítios de restrição de Hindlll e EcoRI. cD-NA da região variável de Hu2B8_Kv1-39.1 de extensão completa + domínio constante Kappa humano e cDNA da região variável de Hu2B8_Kv3-15.1 de extensão completa + domínio constante Kappa humano foram clonados cada, em pEE14.4 (Lonza Biologics) usando sítios de restrição de Hindlll e E-coRI. cDNA do promotor de hCMV-MIE + Hu2B8_Hv5-51.1 de extensão completa + domínio constante de IgGI humana (alótipo G1m(3)) + fragmento poli A de SV40 (em pEE6.4) foi removido por digestão com Notl/Sall e inserido no vetor pEE14.4 da cadeia Kappa através dos sítios de Notl/Sall, criando assim 2 diferentes vetores de expressão que expressam cada, si- multaneamente, a cadeia pesada e a cadeia leve para fazer os seguintes anticorpos:
sh2B8-9 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ Região constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 2)) (SEQ ID Ns: 210) mais hu2B8 Kv 1-39.1 (+ Região constante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID Ns: 177) sh2B8-12 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ Região constante de IgGI (alótipo G1m(3)) (alelo 2)) (SEQ ID N9: 210) mais hu2B8 Kv 3-15.1 (+ Região constante Kappa (Km(3) alótipo (alelo 2))) (SEQ ID Ns: 181)
As seqüências de ácido nucléico codificantes e as seqüências de proteína que definem a Região Constante da Cadeia Pesada de lgG1 Humana alótipo G1m(3) (alelo 2) e cada uma das seqüência da cadeia pesada de extensão completa são descritas abaixo. As seqüências da cadeia leve foram as mesmas que as descritas no Exemplo 12. (1) Seqüência de Ácido Codificante da Região Constante da Cadeia Pesada de lqG1 Humana (alótipo G1m(3» (alelo 2) (SEQ ID N2: 207)
1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaag accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga (2) Seqüência de Proteína que Define a da Região Constante da Cadeia Pesada de loG1 Humana (alótipo Glm(3)) (alelo 1 ou 2) (SEQ ID Ns: 208). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da Seqüência da Cadeira Pesada de IgGI.
1 astkgpsvfp Iapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcwvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrwsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka Ipapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc Ivkgtypsdi avewesngqp ennykttppv Idsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk
(3) Seqüência de Ácido Codificante da Cadeia de Extensão Completa que contém a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IqGI Humana G1m(3) alótipo (alelo 2) (seqüência de sinal sublinhada) (SEQ ID Ns: 209)
1 atqqqqtcaa ccgccatcct cqccctcctc ctqqctqttc tccaagqaqt ctqtaccaaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga agaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (4) Seqüência de Proteína que Define a Cadeia de Extensão Completa que contém Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de lqG1 Humana G1m(3) alótipo (alelo 2) (sem seqüência de sinal) (SEQ ID N8: 210)
1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay Iqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcwvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrwsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk Itvdksnvqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk
Cada vetor de expressão duplo foi transfectado em células 293T para expressão transitória usando DMEM com 10% de soro fetal bovino. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lavadas com, e então substituídas por, meio livre de soro, IS GRO™ (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo 4mM de L-Glutamina. O sobrenadante foi coletado diariamente e substituído por meio fresco por 10 dias. Os sobrenadantes da cultura foram centrifugados, filtrados (0,45 μm) e concentrados 10 a 100 vezes. Os anticorpos foram purificados em resina ProSep vA (Millipore), dialisados contra PBS, concentrados e esterilizados por filtração.
Exemplo 14 - Características de Ligação de Variantes Humanizadas de 2B8
Os anticorpos humanizados produzidos no Exemplo 13 foram caracterizados quanto a sua habilidade de se ligar a hHGF e às proteínas HGF recombinantes produzidos na Exemplo 13. Os anticorpos foram analisados por ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100 para avaliar sua habilidade de se ligar a hHGF e às proteínas de fusão discutidas no Exemplo 3. Cada anticorpo foi imobilizado sobre um chip sensor de dextran carboximetilado 5 CM5 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (Bl-Acore, N2 de Catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante.
As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N2 de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N2 de Catálogo R-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, Ns de Catálogo 2930) e 10 mg/mL de sal de sódio CM-Dextran (Fluka, N2 de Catálogo 86524) como tampão de corrida. O sobrenadante contendo diferentes proteínas de fusão de HGF ou o sobrenadante de células transfectadas com o vetor vazio foi injetado sobre cada anticorpo em uma taxa de fluxo de 30 DLVmin por 3 minutos. A ligação resultante foi determinada como unidades de ressonância (RU) sobre o limite basal 30 segundos após o final da injeção. A ligação foi comparada a HGF humano (R&D Systems, N2 de Catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida. As ligações inespecíficas foram monitoradas por comparar a ligação a uma superfície de controle. Os resultados estão 20 resumidos na Tabela 17.
TABELA 17
<table>table see original document page 115</column></row><table> Os resultados na Tabela 17 demonstram que cada um dos anticorpos humanizados baseados em 2B8 se liga a rhHGF e a todas as três quimeras camundongo-humano-camundongo.
Exemplo 15 - Afinidades de Ligação de Variantes Humanizadas de 2B8
As afinidades de ligação e a cinética de interação dos anticorpos listados na Tabela 15 foram medidas por ressonância de plásmon de superfície.
Imunoglobulinas anti-humano de camundongo (Jackson Labs, Nq de Catálogo 209-005) foram imobilizadas em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1006-68) por acoplamen-to de amina (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, Ns de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N2 de Catálogo BR-1000-54), e 15 2 mg/mL de BSA (EMD, Ns de Catálogo 2930).
Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, Ns de Catálogo 294-20 HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado seqüencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a superfície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dissociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μυηιΐη antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.
Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BlAevalutation® com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e Kd (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 18. TABELA 18
<table>table see original document page 117</column></row><table>
Estes dados mostram que os anticorpos humanizados têm taxas de associação rápidas (kg), taxas de dissociação muito lentas (kd), e afinidades muito altas (KD). Em particular, os anticorpos têm afinidades que variam de 2,0 a 12 pM.
Exemplo 16 - Comparação das Afinidades de Ligação a 25°C e 37°C
As afinidades de ligação e a cinética de interação dos anticorpos HE2B8-4, sh2B8-9, sh2B8-12, e 2B8 murino foram medidas por ressonância de plásmon de superfície sob diferentes condições.
Imunoglobulinas anti-humano de camundongo (Jackson Labs, Ns de Catálogo 209-005) ou imunoglobulinas anti-camundongo de coelho (BIAcore, N9 de Catálogo BR-1005-14) foram imobilizadas em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante. No caso de medidas a 25SC para sh2b8-9 e sh2B8-12, um chip sensor CM5 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1006-68) foi usado. As análises foram realizadas a 25°C e 37SC usando PBS (GIBCO, Ns de Catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, Ns de Catálogo BR-1000-54), e 2 mg/mL de BSA (EMD, Nq de Catálogo 2930) como tampão de corrida.
Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, Ns de Catálogo 294- HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado seqüencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a superfície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dissociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície dos chips sensores de imunoglobulinas de camundongo anti-humano foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 2,2 (BIA-core, Nq de Catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. A superfície dos chips sensores de imunoglobulinas de coelho anti-camundongo foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCI, pH 1,7 (BIAcore, N9 de Catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.
Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BIAevaIutation com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo, kg (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e K0 (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 19.
TABELA 19
<table>table see original document page 118</column></row><table>
Conforme esperado, as constantes da taxa de associação au- mentaram com um aumento na temperatura. De forma surpreendente, as constantes de dissociação não mudaram significativamente com um aumento correspondente na temperatura. Conseqüentemente, as constantes de dissociação de equilíbrio gerais (K0) foram aproximadamente 1,4 a 3 vezes menores (maior afinidade) em temperatura fisiológica (37s C).
Exemplo 17 - Atividade de Neutralização de Variantes Humanizadas de 2B8
Os anticorpos descritos no Exemplo 14 foram caracterizados quanto a sua habilidade de (a) inibir a ligação de hHGF a c-Met, e (b) inibir a incorporação de BrdU estimulada por HGF em células 4MBr-5.
O Ensaio de Inibição da Ligação HGF-Met (Ensaio de Neutralização) foi realizado como descrito a seguir. Os anticorpos foram testados por ELISA quanto a sua habilidade de inibir a ligação de hHGF a c-Met. Especificamente, placas de ensaio DELFIA de 96 poços Wallac (Wallac Inc., Ns de Catálogo AAAND-0001) foram revestidas com 100 μl de HGF a 6,25 □g/mL (R&D Systems, Ne de Catálogo 294-HGN-025) em tampão de revestimento de carbonato (15 mM de Na2CO3 e 34 mM de NaHCO3, pH 9,0) por 16 horas a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 200 μl de leite em pó desnatado a 5% em PBS por uma hora em temperatura ambiente. Os anticorpos foram preparados em uma placa separada por adicionar concentrações crescentes dos anticorpos sob investigação (0,033 a 250 nM, diluição seriada de duas vezes) a 2 nM de c-Met biotinilado em leite em pó desnatado a 5% em PBS. C-Met (R&D Systems, Ns de Catálogo 358-MT/CF) é biotinilado de acordo com as instruções do fabricante em uma proporção de biotina para c-Met de10:1. 100 μί de amostra por poço foram transferidos para a placa de ensaio e incubados por duas horas em temperatura ambiente. As placas resultantes foram lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubadas por uma hora em temperatura ambiente com Estreptavidina marcada com Eu (Wallac, N9 de Catálogo 1244-360) diluída 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Wallac, Ne de Catálogo 4002-0010). As placas resultantes foram lavadas 3 vezes com solução de lavagem DELFIA (Wallac, Ns de Catálogo 4010-0010) e incubadas com 100 μL/ροςο de solução de intensificação DELFIA (Wallac #4001-0010) por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação. As placas foram lidas em um instrumento Victor3V (Perkin Elmer) usando o método de Európio. Os valores de IC50 foram calculados e estão resumidos na Tabela 6. Os valores de IC5o obtidos são mostrados na Tabela 20.
TABELA 20
<table>table see original document page 120</column></row><table>
Estes resultados da Tabela 20 demonstram que os anticorpos humanizados testados neutralizaram eficazmente a ligação de HGF a c-Met.
Os anticorpos na Tabela 17 também foram testados no ensaio de proliferação celular descrito no Exemplo 7(b). Os resultados estão resumidos na Tabela 21. TABELA 21
<table>table see original document page 120</column></row><table>
Os resultados da Tabela 21 demonstram que todos os anticorpos humanizados testados inibiram a proliferação induzida por HGF em células 4MBr-5.
Exemplo 18 - Atividade Anti-Dispersão de Variantes Humanizadas de 2B8
Os anticorpos na Tabela 17 foram testados no ensaio anti-dispersão descrito no Exemplo 8. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 22. TABELA 22
<table>table see original document page 121</column></row><table>
- Nenhuma Inibição
+++ Inibição muito forte, quase completa inhibition ++ Inibição forte + Inibição detectável Os resultados na Tabela 22 demonstram que todos os anticorpos humanizados testados inibiram a dispersão induzida por HGF na mesma extensão que o anticorpo monoclonal murino 2B8.
Exemplo 19 - Inibição de Fosforilacão de c-Met estimulada por HGF
Os anticorpos na Tabela 17 foram testados no ensaio de fosforilação de c-Met descrito no Exemplo 9. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 23.
TABELA 23
<table>table see original document page 121</column></row><table>
Os resultados na Tabela 23 demonstram que todos os anticor- pos humanizados testados são potentes inibidores da fosforilação de c-Met induzida por HGF em células PC-3.
Exemplo 20 - Inibicão tumoral em Modelo de Xenoenxerto de U87MG
A habilidade dos anticorpos monoclonais humanizados da invenção inibirem o crescimento tumoral foi testada em um modelo de xeno-enxerto de U87MG. Células U87MG (ATCC) foram expandidas em cultura a 37°C em uma atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% de ar, usando um meio que compreende meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μς/mL de estrep-tomicina. As células foram subcultivadas e mantidas por desprender as células da parede da placa de cultura usando tripsina-EDTA.
Células quase confluentes foram coletadas por tripsinização e então 5 χ 10^6 células em Matrigel 50% (BD Biosciences; Ns de Catálogo 356237) foram injetadas subcutaneamente na área dorsal superior entre a escápula de camundongos ICR SCID fêmeas de 7 semanas de idade (Taco-nic Labs). Os diâmetros (mm) mais longos (L) e mais curtos (W) dos tumores foram medidos com um compasso de calibre. O volume tumoral (vol) foi calculado como: (mm3) = L χ W2 / 2. Quando os tumores cresceram para aproximadamente 200 mm3, os camundongos que possuíam os tumores foram randomizados em 5 grupos de camundongos cada. Um grupo recebeu PBS e um grupo recebeu controle com IgG. Cada um dos outros 4 grupos recebeu um dos anticorpos humanizados (HE2B8-1, HE2B8-2, HE2B8-3, e HE2B8-4). Todos os anticorpos foram administrados em doses de 0,25 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injeções intraperitone-ais de 5 doses. Os volumes tumorais e os pesos corporais dos camundongos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento tumoral foi analisada usando o teste de f-Student.
Os anticorpos humanizados testados eram ativos in vivo. Houve uma inibição do crescimento do tumor de 57% tumor para HE2B8-1 com um valor de ρ de 0,02, 61% de inibição do crescimento do tumor para HE2B8-2 com um valor de ρ de 0,02, 85% de inibição do crescimento do tumor para HE2B8-3, com um valor de ρ de 0,0004, e 74% de inibição do crescimento do tumor para HE2B8-4 com um valor d ρ de 0,001. Nenhuma perda corporal significativa foi observada.
Um estudo subseqüente foi realizado como descrito acima em camundongos nude NCR fêmeas com tumores de U87MG subcutâneos ino-culados no flanco. Cada (10 camundongos cada) recebeu um dos seguintes tratamentos a 0,5 mg/kg: controle com veículo de PBS, controle de hulgG, HE2B8-4, ou sh2B8-9. O tratamento foi dado intra-peritonealmente duas vezes por semana por um mínimo de 5 semanas. Cada grupo de tratamento demonstrou regressão tumoral similar com inibição do crescimento do tumor de 113% para sh2B8-9 e 115% para HE2B8-4, e um retardo mínimo do crescimento do tumor de 30 dias. Ambos os tratamentos foram bem tolerados sem perdas corporais significativas.
Incorporação por Referência
A descrição completa de cada um dos documentos de patente e artigos científicos referidos aqui está incorporada por referência para todos os propósitos.
Equivalentes
A invenção ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou características essenciais desta. As modalidades anteriores são, portanto para serem consideradas, em todos os aspectos, como ilustrativas ao invés de limitantes da invenção aqui descrita. O escopo da invenção é indicado assim pelas reivindicações anexas e não pela descrição anterior, e todas as alterações que se encontram dentro do significado e amplitude de equivalência das reivindicações são pretendidas para serem abrangidas nela. Listagem de Seqüência <110> Han1 May
Wright, Kirk S. winston, william M.
Breault, Lyne
Lin1 Jie
Etemad-Gilbertson, Bijan Knuehl, Christine Gyuris, Jeno
<120> Hepatocyte Growth Factor (HGF) Binding Proteins <130> AVO-OOIA <150> 60/810,714 <151> 2006-06-02 <150> 60/860,461 15 <151> 2006-11-21 <160> 216
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 424 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy chain variable Region 1A3 <400> 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 240 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 360 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcag 424 <210> 2
<211> 141
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 1Α3 <400> 2
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu vai Leu Val Leu Lys Gly 15 10 15
Val Lys Cys Glu Val Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 15 50 55 60
Gln Trp Val Ala Tyr Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro 65 70 75 80
Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr vai Ser Ser 25 130 135 140
<210> 3 <211> 382 <212> DNA
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Light Ckappa) Chain variable Region 1α3 <400> 3 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa ac 382
<210> 4 <211> 127 10 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain variable Region 1α3 <400> 4
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 15 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
25 30
vai Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 20 35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys lie Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 30 115 120 125
<210> 5 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDRl 1α3
<400> 5
Asn Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy chain CDR2 1Α3
<400> 6
Tyr Ile Ser Pro Gly Gly Gly ser Ser Tyr Tyr Pro Ala Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR3 1Α3
<400> 7
Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDRl 1Α3 <400> 8
Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10
<210> 9 5 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR2 1a3 10 <400> 9
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1
<210> 10 <211> 9 15 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR3 1a3 <400> 10
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 11 <211> 412 <212> DNA 25 <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain variable Region 2B8 <400> 11
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag 412
<210> 12 5 <211> 137 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 2Β8 10 <400> 12
Met Gly Trp Ser Tyr He Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 15 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30
15 Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Thr Tyr Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn 20 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp ser Ala Val 100 105 110
25 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 13 30 <211> 382 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) chaiη Variable Region 2β8 <400> 13
atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 60 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 180 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 300 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac Qttcggaggg 360 gggaccaggc tggaaataaa ac 382 <210> 14 <211> 127 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Synthetic Light (kappa) Chain Variable Region 2β8 <400> 14 Met Glu Ser Gln Thr Leu vai Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser 20 25 30 Met ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala ser Glu Asn 35 40 45 Val Val Ser Tyr vai Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly vai Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95 Ser Val Arg Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln ser Tyr 100 105 110 Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 115 120 125
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDRl 2Β8
<400> 15
Thr Tyr Trp Met His
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR2 2Β8 <400> 16
Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Ser
<210> 17 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR3 2Β8
<400> 17
Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr 1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDRl 2b8
<400> 18
Lys Ala ser Glu Asn Val vai Ser Tyr vai ser
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> prt
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR2 2b8
<400> 19
Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR3 2b8
<400> 20
Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 412
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy chain variable Region 2f8
<400> 21
atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 120 ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 180 ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 240 aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 300 gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 360 ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag 412
<210> 22 <211> 137 <212> PRT 10 <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy chain variable Region 2F8 <400> 22
Met Glu Trp Ser Trp vai Phe Leu Phe Leu Leu ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15
vai His Cys Gln vai Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu vai Arg
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45
Thr Thr Tyr Tyr Ile His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Lys lie Gly Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80
Glu Met Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala vai
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Leu Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr vai ser ser 130 135
<210> 23 <211> 394 <212> dna
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain Variable Region 2f8 <400> 23
atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 240 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac 394
<210> 24 15 <211> 131 <212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) chain variable Region 2f8 20 <400> 24
Met Glu Thr Asp Thr lie Leu Leu Trp vai Leu Leu Leu Trp vai Pro 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp lie vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20
25
30
vai Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser
35
40
45
vai Asp Tyr Asp Gly Asn ser Tyr lie Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50
55
60
Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu lie Tyr vai Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65
70
75
80
Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85
90
95 Leu Asn lie His Pro vai Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln ser Ile Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Leu Lys
130 <210> 25 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDRl 2f8 <400> 25
Thr Tyr Tyr Ile His 1 5
<210> 26 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR2 2f8 <400> 26
Lys Ile Gly Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe Lys 10 15
Asp
<210> 27 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR3 2f8 <400> 27 Arg Gly Leu Gly Arg Gly Phe Asp Tyr 1 5
<210> 28 <211> 15 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDRl 2f8 <400> 28
Lys Ala Ser Gln ser Val Asp Tyr Asp Gly Asn Ser Tyr Ile Asn 15 10 15
<210> 29 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR2 2F8 <400> 29
vai Ala Ser Asn Leu Glu ser 1 5
<210> 30 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR3 2f8
<400> 30
Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Pro Thr
1 5
<210> 31
<211> 418
<212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 3B6 <400> 31
atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 120 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 240 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 300 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 360 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag 418
<210> 32 <211> 139 <212> PRT 15 <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 3B6 <400> 32
Met Glu Trp Pro Cys lie Phe Leu Phe Leu Leu ser vai Thr Glu Gly 1 5 10 15
vai His ser Gln vai Gln Leu Gln Gln ser Gly Ala Glu Leu vai Arg
20 25 30
Pro Gly ser Ser vai Lys lie ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr vai Phe 35 40 45
Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp vai Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp ser Asn Tyr Asn 65 70 75 80
Gly Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser ser ser 30 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala vai 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Ser Gln Leu Gly Leu Arg Glu Asn Tyr Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135
<210> 33 <211> 388 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain variable Region 3b6 (2 possible atg start codons) <400> 33
atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 60 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 120 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 180 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 300 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 360 ggagggggga ccaagctgga aataaagc 388
<210> 34 <211> 129 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain variable Region 3b6 (2 possible start Methionines) <400> 34
Met Asp Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly lie Leu Leu Leu Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ile Lys Cys Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Met Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Arg vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35
Gln Asp lie 50
Ser Pro Lys 65
Pro Ser Arg
lie Thr ser
Tyr Asp Glu 115
Lys
<210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDRl 3B6 <400> 35
Ser Tyr Trp Met Asn 1 5
<210> 36 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR2 3b6 <400> 36
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ser Asn Tyr Asn Gly Asn Phe Lys 15 10 15
Gly
<210> 37
40
Lys Ser Tyr Leu Ser Trp 55
Thr Leu lie Tyr Arg vai 70
Phe Ser Gly Ser Gly Ser 85
Leu Glu Asn Glu Asp Met 100 105
Phe Pro Phe Thr Phe Gly 120
45
Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 60
Asn Arg Leu vai Asp Gly vai 75 80
Gly Gln Asp Ser ser Leu Thr 90 95
Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln 110
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 125 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR3 3Β6 <400> 37
Gln Leu Gly Leu Arg Glu Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 38 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDRl 3Β6 <400> 38
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser 1 5 10
<210> 39 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR2 3Β6 <400> 39
Arg Val Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR3 3Β6 <400> 40
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe Thr 1 5
<210> 41 5 <211> 397 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 3d11 10 <400> 41
atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 60 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 120 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 180 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 240 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 300 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 360 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag 397
<210> 42 <211> 132 20 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy chain Variable Region 3D11 <400> 42
Met Ala vai Pro vai Leu Phe Leu Cys Leu vai Ala Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15
vai Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu ser Gly Pro Gly Leu vai Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu ser Ile Thr Cys Thr vai Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45
Thr ser Tyr ser Leu His Trp vai Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu 65
Ser Leu Met
Val Phe Leu
Tyr cys Ala 115
Thr vai ser 130
<210> 43 <211> 385 <212> DNA <213> Seqüência Artificial
<220>
4
<223> Synthetic Light (kappa) chain variable Region 3D11 <400> 43
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 120 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 360 gctgggacca agctggagct gaaac 385
<210> 44 <211> 128 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> synthetic Light (kappa) Chain variable Region 3D11
<400> 44
Met Asp Phe Gln vai Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
Gly vai Ile Trp Ala Gly 70
Ser Arg Leu Thr Ile Arg 85
Lys Met Asn Ser Leu Gln 100 105
Arg Glu Arg Phe Ala Tyr 120
Ala
Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser
75 80
Lys Asp Asn Ser Lys ser Gln 90 95
Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu vai 125 vai Lys Ile
Met ser Ala 35
Ser Ser vai 50
Pro Lys Arg 65
Ala Arg Phe
ser Ser Met
r ser ser Asn 115
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDRl 3D11 <400> 45
Ser Tyr ser Leu His 1 5
<210> 46 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR2 3D11 <400> 46
vai Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser ser Leu Met Ser
5 10 15
Ser Arg Gly Gln lie vai Leu Thr Gln ser Pro Ala Ile 20 25 30
Tyr Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
40 45
Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys ser Gly Thr Ser
55 60
Trp Ile Tyr Asp Thr ser Lys Leu Ala Ser Gly vai Pro
70 75 80
Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Ser Tyr ser Leu Thr lie
85 90 95
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 120 125 1 5 10 15
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR3 3D11
<400> 47
Glu Arg Phe Ala Tyr
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> seqüência Artificial 15 <220>
m
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDRl 3D11
<400> 48
Ser Ala ser Ser Ser vai Ser Tyr Met His
1 5 10
20 <210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain cdr2 3D11
<400> 49
Asp Thr ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR3 3D11
<400> 50
Gln Gln Trp ser Ser Asn Pro Leu Thr
<210> 51
<211> 424
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial 10 <220>
<223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 1D3
<400> 51
atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 a tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 360 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 420 tcag 424
<210> 52
<211> 141
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Heavy chain variable Region 1D3 <400> 52
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu vai Leu Val Leu Lys Gly 15 10 15
vai Lys Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp vai Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80
Asp ser vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile 100 105 110
Tyr Tyr Cys vai Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met 115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
130 135 140
<210> 53 15 <211> 382 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> synthetic Light (kappa) Chain variable Region 1D3 20 <400> 53
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt
60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc
120 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag
180 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca
240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct
300 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg
360 gggaccaaac tggaaataaa ac 382
<210> 54 <211> 127 30 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220> <223> Synthetic Light (kappa) Chain variable Region 1D3 <400> 54
Met Ser vai Pro Thr Gln vai Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15
Asp vai Arg Cys Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro Ala Ser Leu ser
20 25 30
Val Ser vai Gly Glu Thr vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly vai Pro ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln ser Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 55 <211> 5 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDRl 1d3 <400> 55
Asp Tyr Tyr Met ser 1 5
<210> 56 <211> 17 <212> PRT
<213> seqüência Artificial <220> <223> Synthetic Heavy Chain CDR2 1D3 <400> 56
Tyr lie Ser ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser vai Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 57 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR3 1d3 <400> 57
Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10
<210> 58 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDRl 1D3 <400> 58
Arg Thr ser Glu Asn Ile Tyr ser Asn Leu Ala 1 5 10
<210> 59 <211> 7 <212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR2 1D3 <400> 59
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain cdr3 1d3
<400> 60
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr 10 1 5
<210> 61
<211> 424
<212> DNA
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 1F3
<400> 61
ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag 60 tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 120 ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 360 gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 424 tcag
<210> 62
<211> 141
<212> PRT
<213> seqüência Artificial 30 <220>
<223> Synthetic Heavy Chain variable Region 1F3
<400> 62 Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu lie Phe Leu vai Leu vai Leu Lys Gly 1 5 10 15
Val Lys Cys Glu vai Gln Leu vai Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30
ser Gly Gly Ser Leu Lys Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Met Ser Trp vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp vai Ala Tyr Ile ser Ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Pro 10 65 70 75 80
Asp ser vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser ser Leu Lys ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met j
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr ser vai Thr vai ser Ser
130 135 140
<210> 63 20 <211> 382
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain variable Region 1F3 25 <400> 63
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt
60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc
120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 360 gggaccagac tggaaattaa ac 382 <210> 64 <211> 127 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial 5 <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain variable Region 1F3 <400> 64
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30
vai ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Asp Ala Thr His Leu Pro Asp Gly vai Pro ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95
ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 65 25 <211> 5
<212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDRl 1F3
<400> 65
asη Tyr Phe Met ser
1 5 <210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR2 1f3
<400> 66
Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR3 1F3
<400> 67
Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDRl 1F3
<400> 68
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR2 1f3
<400> 69
Asp Ala Thr His Leu Pro Asp
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial 10 <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR3 1F3
<400> 70
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 71
<211> 424
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy chain variable Region 3Α12
<400> 71
atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 120 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 360 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcag 424
<210> 72 <211> 141 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain variable Region 3A12 <400> 72
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu lie Phe Leu vai Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15
Val Lys Cys Glu vai Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gln
20 25 30
Pro Gly Gly ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Met ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp vai Ala Tyr Ile ser ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Pro , 65 70 75 80
Asp ser vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn ser Leu Lys ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met 115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr ser vai Thr vai Ser Ser
130 135 140
<210> 73 <211> 382 25 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain variable Region 3A12 <400> 73
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tagaaataaa ac 382
<210> 74 <211> 127 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) chain variable Region 3Α12 <400> 74
Met Ser Val Pro Thr Gln vai Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu ser 20 25 30 J.
vai ser vai Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr lie Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys ser Pro 50 55 60
Gln Leu Leu vai His Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp Gly vai Pro ser 65 70 75 80
Arg Phe ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Gln Tyr ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
ser Leu Gln ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys
115 120 125
<210> 75 <211>
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220> <223> Synthetic Heavy Chain CDRl 3A12 <400> 75
Asn Tyr Phe Met Ser 1 5
<210> 76 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR2 3A12 <400> 76
Tyr lie Ser Ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Pro Asp ser vai Lys 15 10 15
, Gly <210> 77 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Heavy Chain CDR3 3a12 <400> 77
Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDRl 3 a 12 <400> 78
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr lie Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR2 3Α12 <400> 79
Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp 1 5
<210> 80 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial Ί <220>
<223> Synthetic Light Ckappa) Chain CDR3 3Α12 <400> 80
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 81 <211> 974 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Reference Mouse IgGl Heavy Chain Constant Region 000453) <400> 81 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 60 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 120 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gagtctgacc 180 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagccc tcggcccagc gagaccgtca 240 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 300 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 360 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 420 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 480 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 540 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 600 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 660 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 720 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 780 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg aatggctctt 840 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 900 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 960 ctcctggtaa atga 974
<210> 82
<211> 974
<212> DNA
<21Β> Seqüência Artificial
<220>
<22β> Mouse IgGl Heavy Chain constant Region Determined for 1α3, idB, 1f3, and 2β8 Cderived from aj strain mice) <400> 82
ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 60 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 120 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc 180 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca 240 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 300 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 360 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 420 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 480 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 540 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 600 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 660 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 720 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 780 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 840 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 900 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 960 ctcctggtaa atga 974
<210> 83 5 <211> 323 <212> dna
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Reference Mouse Kappa Light Chain Constant Region (v00807) and Mouse Kappa Light Chain constant Region Determined for 1d3, 1f3, and 2b8 (derived from aj strain mice) <400> 83
gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 60 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 120 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 180 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga gcttcaacag gaatgagtgt tag 323
<210> 84 20 <211> 323 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Mouse Kappa Light Chain constant Region Determined for 1a3 containing one altered nucleotide as position 207 compared to 1d3, 1f3, and 2b8 <400> 84
gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 60 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 120 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 180 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac 240 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 240 300 gcttcaacag gaatgagtgt tag 323
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic οΐigonucleotide primer BD smart ιι α
<400> 85
aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30
<210> 86
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer RACE CDS
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> η is a, c, g, t or u
<400> 86
tttttttttt tttttttttt tttttvn 27
<210> 87
<211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer of universal primer Mix A
<400> 87 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210> 88
<211> 22
<212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer of Universal Primer Mix A
<400> 88
ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial 10 <220>
<223> Synthetic IgGl Constant Region specific primer
<400> 89
tatgcaaggc ttacaaccac a 21
<210> 90
<211> 28
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic IgGl Constant Region specific primer
<400> 90
gccagtggat agacagatgg gggtgtcg 28
<210> 91
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer
<400> 91
ctcattcctg ttgaagctct tgacaat 27
<210> 92
<211> 23
<212> DNA <213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer
<400> 92
cgactgaggc acctccagat gtt 23
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> seqüência Artificial 10 <220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer T7
<400> 93
taatacgact cactataggg 20
<210> 94
<211> 17
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide primer Ml3 Forward
<400> 94
gtaaaacgac ggccagt 17
<210> 95
<211> 18
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> synthetic oligonucleotide primer M13 Reverse
<400> 95
caggaaacag ctatgacc !8
<210> 96
<211> 63
<212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide <400> 96
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg tcc
<210> 97 <211> 54 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide <400> 97
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt <210> 98 <211> 62 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide <400> 98
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg tt
<210> 99 <211> 53 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide <400> 99
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt <210> 100
forward primer
ccaccatgaa ctttgggctc agattgattt
reverse primer
catttaccag gagagtggga gagg
forward primer
ccaccatggg atggagctat atcatcctct
reverse primer
catttaccag gagagtggga gag <211> 62
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 100
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ta
<210> 101
<211> 54
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 101
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 102
actggctagc atgtgggtga ccaaactcct
<210> 103
<211> 46
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 103
gtgatggtga tggtgatggc ggccgcatga
163
forward primer
ccaccatgga atcacagact ctggtcttca 60
62
reverse primer
taacactcat tcctgttgaa gctc 54
prime hHGF Nhel primer
3 prime hHGF Notl his tag primer
ctgtggtacc ttatat 46 <210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide 5 prime His IgFc primer
<400> 104
actggcggcc gccatcacca tcaccatcac
<210> 105
<211> 31
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic oligonucleotide 3 prime IgFc BamHl primer
<400> 105
actgggatcc tcactattta cccggggaca g
<210> 106
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic hHGF-Fc (G555E) sense primer
<400> 106
catgatgtcc acgaaagagg agatgag
<210> 107
<211> 27
<212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic hHGF-Fc (G555E) antisense primer
<400> 107
ctcatctcct ctttcgtgga catcatg <210> 108
<211> 37
<212> DNA
<213> seqüência Artificial 5 <220>
<223> Synthetic hHGF-Fc (C561R) sense primer
<400> 108
ggaagaggag atgagaaacg caaacaggtt ctcaatg 37
<210> 109
<211> 37
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic hHGF-Fc (C561R) antisense primer
<400> 109
cattgagaac ctgtttgcgt ttctcatctc ctcttcc 37
<210> 110
<211> 29
<212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> synthetic Fragment 1 Primer for mHGF alpha chain 5 prime Nhel
<400> 110
atcggctagc atgatgtggg ggaccaaac 29
<210> 111
<211> 36
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Fragment 1 primer for mHGF alpha chain 5 prime Nhel
<400> 111
ggttttgttt tgttgacgcc caacatttac cctaag 36 <210> 112
<211> 36
<212> DNA
<21Β> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Fragment 2 Primer for hHGF beta chain aa V495-L585
<400> 112
ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattc 36
<210> 113
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Fragment 2 Primer for hHGF beta chain aa V495-L585
<400> 113
tctagaccaa aattacttcg aacgagctgg acgttaggac 40
<210> 114
<211> 40
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic Fragment 3 Primer for mHGF beta chain c-terminus 3 prime Notl
<400> 114
agatctggtt ttaatgaagc ttgctcgacc tgcaatcctg 40
<210> 115
<211> 48
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic Fragment 3 Primer for mHGF beta chain c-terminus 3 prime NotI <400> 115
cactaccact accactaccg ccggcgtgtt gaacatacag ttttaatg 48
<210> 116
<211> 38
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic mutagenesis primer 1
<400> 116
catcaccatc accatcacta agcgggtctg gtgccacg 38
<210> 117
<211> 38
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic mutagenesis primer 2 <400> 117
cgtggcacca gacccgctta gtgatggtga tggtgatg 38
<210> 118 20 <211> 2922 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> nucleotide sequence of synthetic hHGF-Fc protein
<400> 118
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60 ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120 gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180 accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240 ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300 ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360 aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420 tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540
cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600
tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660
ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720
caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780
cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840
gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900
gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960
tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020
cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080
gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140
ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200
ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260
gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320
cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380
tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440
gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500
acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560
ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620
ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680
tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740
ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800
aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860
ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920
aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980
gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040
caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100
aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160
ttaacatata aggtaccaca gtcatgcggc cgccatcacc atcaccatca ctccgcgggt 2220
ctggtgccac gcggtagtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 2280
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2340 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2400 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2460 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2520 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2580 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 2640 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 2700 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2760 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 2820 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2880 cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ag 2922
<210> 119 <211> 919 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> amino acid sequence of synthetic hHGF-Fc protein (without signal sequence and pro domain) <400> 119
Pro Ala Leu Lys lie Lys Thr Lys Lys vai Asn Thr Ala Asp Gln Cys 1 5 10 15
Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu Pro Phe Thr cys Lys Ala
20 25 30
Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn
35 40 45
Ser Met ser ser Gly Val Lys Lys Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu
50 55 60
Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys lie Ile Gly Lys Gly Arg 65 70 75 80
Ser Tyr Lys Gly Thr vai Ser Ile Thr Lys ser Gly lie Lys Cys Gln
85 90 95
Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly
115 120 125
Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr ser Asn Pro Glu vai Arg Tyr
130 135 140
Glu vai Cys Asp Ile Pro Gln Cys ser Glu vai Glu cys Met Thr Cys 145 150 155 160
Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys
165 170 175
Ile cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu
180 185 190
Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn
195 200 205
Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr
210 215 220
Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn 225 230 235 240
Asp Thr Asp vai Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly
245 250 255
Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys
260 265 270
Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro Glu
275 280 285
Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp
290 295 300
Gly ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg vai 305 310 315 320
Gly Tyr Cys Ser Gln lie Pro Asn cys Asp Met Ser His Gly Gln Asp
325 330 335
Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr
340 345 350
Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu 355 360 365 His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn
370 375 380
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 385 390 395 400
Gly Asn Pro Leu lie Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu
405 410 415
Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile vai Asn Leu Asp His Pro Val Ile ser
420 425 430
Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg vai vai Asn Gly lie Pro Thr Arg
435 440 445
Thr Asn Ile Gly Trp Met vai ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile
450 455 460
Cys Gly Gly ser Leu Ile Lys Glu ser Trp vai Leu Thr Ala Arg Gln 465 470 475 480
Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile
485 490 495
His Asp vai His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn
500 505 510
vai ser Gln Leu vai Tyr Gly Pro Glu Gly ser Asp Leu vai Leu Met
515 520 525
Lys Leu Ala Arg Pro Ala vai Leu Asp Asp Phe vai Ser Thr Ile Asp
530 535 540
Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr lie Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser vai 545 550 555 560
Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg
565 570 575
vai Ala His Leu Tyr lie Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His
580 585 590
Arg Gly Lys vai Thr Leu Asn Glu Ser Glu lie Cys Ala Gly Ala Glu
595 600 605
Lys Ile Gly ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu vai 610 615 620 Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly vai Ile vai Pro Gly 625 630 635 640
Arg Gly Cys Ala lie Pro Asn Arg Pro Gly He Phe vai Arg vai Ala
645 650 655
Tyr Tyr Ala Lys Trp lie His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys vai Pro
660 665 670
Gln ser Cys Gly Arg His His His His His His Ser Ala Gly Leu vai
675 680 685
Pro Arg Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
690 695 700
Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 705 710 715 720
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys vai vai Val
725 730 735
Asp vai ser His Glu Asp Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp
740 745 750
Gly vai Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
755 760 765
Asn ser Thr Tyr Arg vai vai ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp
770 775 780
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Ala Leu 785 790 795 800
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
805 810 815
Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
820 825 830
Asn Gln vai ser Leu Thr cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
835 840 845
Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
850 855 860
Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 865 870 875 880 Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
885 890 895
Cys ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 900 905 910
Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 915 <210> 120 <211> 2901 <212> DNA 10 <213> Seqüência Artificial <220>
<223> nucleotide sequence encoding synthetic mhm (V495-L585)-Fc chimeric
protein
<400> 120
atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60 ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120 catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180 aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240 tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300 cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360 gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420 gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480 cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540 gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600 cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660 cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720 ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcctgat 780 ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840 attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900 tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960 ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020 aaatgcaagg accttagaga aaattattgc cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080 tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt ggctactgct ctcaaattcc caagtgtgac 1140 gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200 aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260 catatcttct gggagccaga tgctagcaaa ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320 gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 1380 cctatttccc gttgtgaagg agatactaca cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440 atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac 1500 ataggatgga tggttagttt gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560 aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620 gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt 1680 ctcaatgttt cccagctggt atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt 1740 gctcgacctg caatcctgga taactttgtc agtacaattg atttacctag ttatggttgt 1800 acaatccctg aaaagaccac ttgcagtatt tacggctggg gctacactgg attgatcaac 1860 gcggatggtt tattacgagt agctcatctg tatattatgg ggaatgagaa atgcagtcag 1920 caccatcaag gcaaggtgac tttgaatgag tctgagttat gtgctggggc tgaaaagatt 1980 ggatcaggac catgtgaggg agattatggt ggcccactca tttgtgaaca acacaaaatg 2040 agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt cgtggatgtg ccatcccaaa tcgtcctggt 2100 atttttgttc gagtagcata ttatgcaaaa tggatacaca aagtaatttt gacatacaag 2160 ttgtgcggcc gccatcacca tcaccatcac tccgcgggtc tggtgccacg cggtagtgac 2220 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 2280 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 2340 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 2400 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 2460 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 2520 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 2580 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 2640 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 2700 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 2760 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 2820 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 2880 tccctgtccc cgggtaaata g 2901 <210> 121 <211> 911 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> amino acid sequence of synthetic mhm-Fc Active form (signal sequence and pro domai η removed) <400> 121
Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys vai Asn ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15
Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala 20 25 30
Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn 35 40 45
Ser Met Ser ser Gly vai Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu
50 55 60
Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys lie Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80
Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln 85 90 95
Pro Trp Asn ser Met lie Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp 100 105 110
Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro
115 120 125
Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu vai Arg Tyr Glu vai Cys Asp lie 130 135 140
Pro Gln Cys Ser Glu vai Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr 145 150 155 160
Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp 165 170 175
Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro 180 185 190
Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro 195 200 205
Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys
210 215 220
Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala vai Asn Glu Thr Asp vai Pro 225 230 235 240
Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly
245 250 255
Thr ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly lie Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser
260 265 270
Gln Tyr Pro His Lys His Asp Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys
275 280 285
Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu ser Pro
290 295 300
Trp cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg vai Gly Tyr Cys Ser Gln 305 310 315 320
Ile Pro Lys Cys Asp vai Ser Ser Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn
325 330 335
Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ser Gly Leu Thr
340 345 350
Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His lie Phe
355 360 365
Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
370 375 380
Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile 385 390 395 400
Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile ser Arg cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro
405 410 415
Thr lie vai Asn Leu Asp His Pro vai lie Ser Cys Ala Lys Thr Lys
420 425 430
Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn lie Gly Trp
435 440 445
Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu 450 455 460
Ile Lys Glu Ser Trp vai Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro ser Arg 465 470 475 480
Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp vai His Gly
485 490 495
Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln vai Leu Asn vai ser Gln Leu vai
500 505 510
Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro
515 520 525
Ala lie Leu Asp Asn Phe vai ser Thr Ile Asp Leu Pro ser Tyr Gly
530 535 540
Cys Thr lie Pro Glu Lys Thr Thr Cys ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr 545 550 555 560
Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg vai Ala His Leu Tyr
565 570 575
Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys vai Thr
580 585 590
Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys lie Gly Ser Gly
595 600 605
Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys
610 615 620
Met Arg Met Val Leu Gly vai Ile vai Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile 625 630 635 640
Pro Asn Arg Pro Gly lie Phe vai Arg vai Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp
645 650 655
Ile His Lys vai lie Leu Thr Tyr Lys Leu Cys Gly Arg His His His
660 665 670
His His His Ser Ala Gly Leu vai Pro Arg Gly Ser Asp Lys Thr His
675 680 685
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser vai
690 695 700
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr 705 710 715 720
Pro Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp vai Ser His Glu Asp Pro Glu
725 730 735
vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu vai His Asn Ala Lys
740 745 750
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai ser
755 760 765
vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
770 775 780
Cys Lys vai ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile 785 790 795 800
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro
805 810 815
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys Leu
820 825 830
vai Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn
835 840 845
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro Val Leu Asp ser
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 865 870 875 880
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys ser vai Met His Glu Ala Leu
885 890 895
His Asn His Tyr Thr Gln Lys ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 900 905 910
<210> 122 <211> 1398 <212> dna
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 1a3 Heavy Chain Sequenee (1a3 Heavy Chain Variable Region and IgGl Constant Region) <400> 122
atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180
gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 240
gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 360
ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420
tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480
aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540
acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600
gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660
gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720
agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780
ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840
gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900
gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960
gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020
gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080
ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140
gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200
tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260
tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320
ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380
cactctcctg gtaaatga 1398 <210> 123 <211> 446 <212> PRT 30 <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1α3 Heavy Chain Sequence (1a3 Heavy Chain variable Region and IgGl Constant Region) (without signa! sequence) <400> 123
Glu vai Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Ala Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser ser Leu Lys ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser vai Thr vai Ser ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
115 120 125
ser vai Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
130 135 140
vai Thr Leu Gly Cys Leu vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr 145 150 155 160
vai Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser ser Gly vai His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala vai Leu Gln ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser vai Thr Val
180 185 190
Pro ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr vai Thr Cys Asn vai Ala His
195 200 205
Pro Ala ser Ser Thr Lys vai Asp Lys Lys lie vai Pro Arg Asp Cys
210 215 220
Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr vai Pro Glu Val Ser ser vai Phe 225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp vai Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
245 250 255
Lys vai Thr Cys vai vai vai Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe ser Trp Phe vai Asp Asp vai Glu vai His Thr Ala Gln Thr
275 280 285
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser vai Ser Glu
290 295 300
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320
Arg vai Asn ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln vai Tyr Thr lie Pro Pro
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val ser Leu Thr Cys Met Ile
355 360 365
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met Asp Thr Asp 385 390 395 400
Gly Ser Tyr Phe vai Tyr ser Lys Leu Asn vai Gln Lys ser Asn Trp
405 410 415
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
420 425 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 124 <211> 705 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 1A3 Light chain Sequence (1a3 Kappa variable Region and constant Region) <400> 124
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcatg 600 m ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 125 <211> 214 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial 20 <220>
<223> Protein sequence Defining synthetic Full Length 1a3 Light Chain Sequence (1a3 Kappa variable Region and Constant Region) Cwithout signal sequence) <400> 125
Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro Ala ser Leu ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Thr vai Thr ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu vai 35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr vai Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn vai Lys Trp Lys lie Asp Gly ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160
Asn ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Met Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 126 <211> 1386 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid sequence Encoding synthetic Full Length 2b8 Heavy Chain sequence (2B8 Heavy Chain variable Region and IgGl Constant Region) <400> 126
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240
gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 360
ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 420
acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480
accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540
ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600
ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660
gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720
tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780
cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840
agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900
gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960
cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020
gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080
caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140
tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200
ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260
tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320
gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380
aaatga 1386 <210> 127 <211> 442 <212> PRT 25 <213> seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 2Β8 Heavy Chain sequence (2β8 Heavy Chain variable Region and IgGl Constant Region) (without signal sequence) <400> 127
Gln vai Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser vai Lys Leu ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp vai Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu lie Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu ser ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys 10 85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly ser lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr vai Ser ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser vai Tyr Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn ser Met vai Thr Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Thr Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly ser Leu Ser ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln 165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser ser ser vai Thr vai Pro ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn vai Ala His Pro Ala ser ser 195 200 205
Thr Lys vai Asp Lys Lys Ile vai Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 210 215 220
Cys Ile Cys Thr vai Pro Glu vai Ser ser vai Phe lie Phe Pro Pro 225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp vai Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro Lys vai Thr Cys 245 250 255
vai vai vai Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu vai Gln Phe ser Trp 260 265 270 Phe vai Asp Asp vai Glu vai His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn ser Thr Phe Arg ser vai ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg vai Asn ser 305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys vai Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp Ile Thr vai Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly ser Tyr Phe 385 390 395 400
Val Tyr ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 128 <211> 705 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid sequence Encoding synthetic Full Length 2b8 Light Chain Sequence (2b8 Kappa Variable Region and Constant Region) <400> 128
atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 180 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 300 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaggc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 129 <211> 214 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial 15 <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 2β8 Light Chain Sequence (2β8 Kappa variable Region and Constant Region) (without signa! sequence) <400> 129
20 Asn He Val Met Thr Gln ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15
Glu Arg vai Thr Leu Ser Cys Lys Ala ser Glu Asn vai vai ser Tyr
20 25 30
Val ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser Ser vai Arg Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110
Pro Thr Val ser lie Phe Pro Pro Ser ser Glu Gln Leu Thr ser Gly
115 120 125
Gly Ala ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140
Asn vai Lys Trp Lys Ile Asp Gly ser Glu Arg Gln Asn Gly vai Leu 145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp ser Thr Tyr ser Met Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr ser Pro lie vai Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 130 <211> 1386 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial 20 <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 2f8 Heavy Chain Sequence (2f8 Heavy Chain Variable Region and lgG1 Constant Region) <400> 130
atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 60 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 180 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 240 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 300 30 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 360 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 420 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1260 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380 aaatga 1386
<210> 131
<211> 442
<212> PRT
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> protein Sequence Defining synthetic Full Length 2F8 Heavy Chain Sequence (2f8 Heavy chain variable Region and IgGl Constant Region) (without signal sequence)
<400> 131
Gln vai Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu vai Arg pro Gly Thr 1 5 10 15
ser vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30
Tyr lie His Trp vai Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Lys Ile Gly Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu ser Ser Leu Thr ser Asp Asp Ser Ala vai Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Leu Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr vai Ser ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser vai Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly ser Ala Ala Gln Thr Asn ser Met vai Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Thr Trp Asn 145 150 155 160
ser Gly Ser Leu ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser vai Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr vai Thr Cys Asn vai Ala His Pro Ala ser ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210 215 220
Cys Ile Cys Thr vai Pro Glu Val ser ser vai Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp vai Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys vai Thr Cys
245 250 255
vai vai vai Asp Ile ser Lys Asp Asp Pro Glu vai Gln Phe Ser Trp
260 265 270
Phe Val Asp Asp vai Glu vai His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser vai ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg vai Asn Ser 305 310 315 320
Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln vai Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys vai Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp lie Thr vai Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly ser Tyr Phe 385 390 395 400
vai Tyr ser Lys Leu Asn vai Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410 415
Thr Phe Thr Cys Ser vai Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 132 <211> 717 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 2f8 Light Chain Sequence (2f8 Kappa variable Region and Constant Region) <400> 132
atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 240 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717
<210> 133 <211> 218 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial 10 <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 2F8 Light Chain sequence (2f8 Kappa variable Region and constant Region) (without signa! sequence)
<400> 133
Asp Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Ala ser Leu Ala vai Ser Leu Gly 1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile ser Cys Lys Ala Ser Gln ser vai Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn ser Tyr Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45
Lys vai Leu Ile Tyr vai Ala ser Asn Leu Glu ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80
Pro vai Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser lie
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val ser Ile Phe Pro Pro Ser ser Glu Gln 115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Lys Asp Ile Asn vai Lys Trp Lys He Asp Gly Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160
Asn Gly vai Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp ser Thr 165 170 175
Tyr ser Met ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 180 185 190
His Asn ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 134
<211> 1392
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial 15 <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Full Length 3b6 Heavy Chain Sequenee (3b6 Heavy Chain variable Region and IgGl Constant Region) <400> 134
atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 120 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 240 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 300 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 360 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 420 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 600 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 660 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 720 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 780 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 840 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 900 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 960 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1020 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1080 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1140 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1200 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1260 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1320 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1380 cctggtaaat ga 1392
<210> 135 <211> 444 <212> PRT <213> seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3β6 Heavy Chain Sequence (3β6 Heavy Chain variable Region and IgGl Constant egion) (without signal sequence) 20 <400> 135
Gln vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu vai Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15
ser vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr vai Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Trp Met Asn Trp vai Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp ser Asn Tyr Asn Gly Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 30 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Gln Leu Gly Leu Arg Glu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr vai Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser vai 115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn ser Met vai Thr 130 135 140
Leu Gly Cys Leu vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Thr 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu ser ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai 10 165 170 175
Leu Gln ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser ser vai Thr vai Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro ser Glu Thr vai Thr Cys Asn vai Ala His Pro Ala 195 200 205
Ser Ser Thr Lys vai Asp Lys Lys lie vai Pro Arg Asp Cys Gly Cys 210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr vai Pro Glu vai ser ser vai Phe lie Phe 225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp vai Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys vai 245 250 255
Thr Cys Val vai vai Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu vai Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe vai Asp Asp vai Glu vai His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg ser vai ser Glu Leu Pro 290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg vai 305 310 315 320
Asn ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Thr 325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln vai Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 340 345 350 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys vai 355 360
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr vai
370 375
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 385 390
Tyr Phe vai Tyr Ser Lys Leu Asn 405
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser vai 420
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 435 440
<210> 136 <211> 711 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 3B6 Light Chain sequenee (3B6 Kappa Variable Region and Constant Region) <400> 136
atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 60 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 120 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 180 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 300 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 360 ggagggggga ccaagctgga aataaagcgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420 ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 480 ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 540 gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 600 ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 660 aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta g 711
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp 365
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 380
Pro lie Met Asp Thr Asp Gly ser 395 400
vai Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
410 415
Leu His Glu Gly Leu His Asn His 425 430
Ser Pro Gly Lys <210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3Β6 Light Chain Sequence (3β6 Kappa variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 137
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg vai Thr lie Thr Cys Lys Ala ser Gln Asp lie Lys ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45
Tyr Arg vai Asn Arg Leu Val Asp Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp ser Ser Leu Thr lie Thr Ser Leu Glu Asn 65 70 75 80
Glu Asp Met Gly lie Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr vai Ser Ile Phe Pro Pro Ser ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125
Gly Ala Ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp lie
130 135 140
Asn vai Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly vai Leu 145 150 155 160
Asn ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 138
<211> 1361
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetic Full Length 3D11 Heavy chain Sequenee (3D11 Heavy Chain variable Region and lgG1 constant Region) <400> 138 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 60 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 120 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 180 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 240 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 300 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 360 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc 420 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg 480 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc 540 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg 600 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc 660 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata 720 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc 780 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc 840 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc 900 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag 960 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt 1080 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac 1140 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac 1200 aagaacactc agcccatcat ggacacagat ggctcttact tcgtctacag caagctcaat 1260 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc 1320 ctgcacaacc accatactga tcccactctc ctggtaaatg a 1361
<210> 139 <211> 437 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial 10 <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3D11 Heavy Chain sequence (3D11 Heavy chain variable Region and lgG1 Constant Region) (without signal sequence) <400> 139
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr vai ser Gly Phe Ser Leu Thr ser Tyr
20 25 30
Ser Leu His Trp vai Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly vai lie Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser ser Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr lie Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln vai Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu vai Thr vai Ser
100 105 110
Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser vai Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser 115 120 125
Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met vai Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr vai Thr Trp Asn ser Gly Ser Leu Ser 145 150 155 160
Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln ser Asp Leu Tyr Thr
165 170 175
Leu ser ser ser Val Thr vai Pro ser ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr
180 185 190
Val Thr Cys Asn vai Ala His Pro Ala ser Ser Thr Lys vai Asp Lys
195 200 205
Lys Ile vai Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr vai
210 215 220
Pro Glu Val Ser Ser vai Phe lie Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp vai 225 230 235 240
Leu Thr He Thr Leu Thr Pro Lys vai Thr Cys vai vai vai Asp Ile
245 250 255
ser Lys Asp Asp Pro Glu vai Gln Phe Ser Trp Phe vai Asp Asp vai
260 265 270
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
275 280 285
Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu
290 295 300
Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala 305 310 315 320
Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro
325 330 335
Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys
340 345 350
Val ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr
355 360 365
Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr
370 375 380
Gln Pro lie Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu 385 390 395 400 Asn vai Gln Lys ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser
405 410 415
Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser
420 425 430
His ser Pro Gly Lys 435
<210> 140 <211> 708 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid sequence Encoding synthetic Full Length 3D11 Light Chain Sequence (3D11 Kappa variable Region and constant Region) <400> 140
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 120 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 360 gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 480 taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 540 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 600 acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 660 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag 708
<210> 141
<211> 213
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3d11 Light Chain sequence (3D11 Kappa variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 141
Gln lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Tyr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Lys vai Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser ser Ser vai ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala ser Gly vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly ser 50 55 60
Gly Ser Gly Thr ser Tyr ser Leu Thr Ile Ser ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr vai ser Ile Phe Pro Pro Ser ser Glu Gln Leu Thr ser Gly Gly 115 120 125
Ala Ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140
vai Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly vai Leu Asn 145 150 155 160
ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr ser Pro lie vai Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 142 <211> 1398
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 1d3 Heavy
Chain Sequence (1d3 Heavy Chain variable Region and lgG1 Constant Region)
<400> 142
atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 360 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 420 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380 cactctcctg gtaaatga 1398
<210> 143 <211> 446
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1d3 Heavy chain sequence (1D3 Heavy Chain variable Region and IgGl constant Region) Cwithout signal sequence) <400> 143
Glu vai Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp vai
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met ser ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
vai Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser vai lie vai ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
115 120 125
Ser vai Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
130 135 140
vai Thr Leu Gly Cys Leu vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr 145 150 155 160
vai Thr Trp Asn Ser Gly ser Leu Ser Ser Gly vai His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala vai Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser Ser ser Val Thr vai 180 185 190 Pro ser ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr vai Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala ser Ser Thr Lys vai Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210 215 220
Gly Cys Lys Pro Cys lie Cys Thr Val Pro Glu vai ser ser vai Phe 225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp vai Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro
245 250 255
Lys vai Thr cys vai vai vai Asp lie ser Lys Asp Asp Pro Glu vai
260 265 270
Gln Phe Ser Trp Phe vai Asp Asp vai Glu vai His Thr Ala Gln Thr
275 280 285
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Phe Arg ser vai Ser Glu
290 295 300
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320
Arg vai Asn ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile ser
325 330 335
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln vai Tyr Thr lie Pro Pro
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys vai Ser Leu Thr Cys Met lie
355 360 365
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr vai Glu Trp Gln Trp Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn vai Gln Lys ser Asn Trp
405 410 415
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser vai Leu His Glu Gly Leu His
420 425 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 144
<211> 705
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetic Full Length 1d3 Light Chain Sequenee (1D3 Kappa variable Region and constant Region) <400> 144
atgagtgtge ccaeteaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt
60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 145 <211> 214 <212> PRT
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1d3 Light Chain sequence (1D3 Kappa variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 145
Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ala ser Leu Ser vai ser vai Gly 1 5 10 15
Glu Thr vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr ser Glu Asn lie Tyr Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys ser Pro Gln Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60
Ser Gly ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg lie Asn ser Leu Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110
Pro Thr vai Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140
Asn vai Lys Trp Lys Ile Asp Gly ser Glu Arg Gln Asn Gly vai Leu 145 150 155 160
Asn ser Trp Thr Asp Gln Asp ser Lys Asp ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175
ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr ser Pro Ile vai Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 146
<211> 1398
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial 30 <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 1F3
Heavy Chain Sequenee (1f3 Heavy Chain variable Region and IgGl constant Region) <400> 146
atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 360 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380 cactctcctg gtaaatga 1398
<210> 147
<211> 446
<212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1F3 Heavy Chain Sequence (1F3 Heavy chain variable Region and IgGl Constant Region) (without signal sequence) <400> 147
Glu vai Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gln ser Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe ser Asn Tyr
20 25 30
Phe Met Ser Trp vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp ser vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser ser Leu Lys ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
vai Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser vai Thr vai ser ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro 115 120 125
ser vai Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn ser Met 130 135 140
vai Thr Leu Gly Cys Leu vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr 145 150 155 160
vai Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu ser Ser Gly vai His Thr Phe Pro 25 165 170 175
Ala vai Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser Ser Ser Val Thr vai
180 185 190
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr vai Thr Cys Asn vai Ala His 195 200 205
Pro Ala ser Ser Thr Lys vai Asp Lys Lys Ile vai Pro Arg Asp Cys 210 215 220
Gly Cys Lys Pro cys lie Cys Thr vai Pro Glu vai Ser ser vai Phe 225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp vai Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro
245 250 255
Lys vai Thr Cys vai vai vai Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu vai 260 265 270
Gln Phe Ser Trp Phe vai Asp Asp Val Glu vai His Thr Ala Gln Thr
275 280 285
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn ser Thr Phe Arg Ser vai Ser Glu 290 295 300
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320
Arg vai Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln vai Tyr Thr Ile Pro Pro 340 345 350
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys vai Ser Leu Thr Cys Met Ile
355 360 365
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp lie Thr vai Glu Trp Gln Trp Asn Gly 370 375 380
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro lie Met Asp Thr Asp 385 390 395 400
Gly Ser Tyr Phe vai Tyr ser Lys Leu Asn vai Gln Lys ser Asn Trp
405 410 415
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys ser vai Leu His Glu Gly Leu His 420 425 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 148 <211> 705 30 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 1f3 Light Chain Sequenee (1f3 Kappa variable Region and Constant Region) <400> 148
atgagtgtge eeacteaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 360 gggaccagac tggaaattaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 149 <211> 214 <212> prt
<213> Seqüência Artificial 20 <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 1f3 Light Chain sequence (1f3 Kappa Variable Region and constant Region) (without signal sequence) <400> 149
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala ser Leu ser vai Ser vai Gly 15 10
Glu Thr vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu vai 35 40 45
Tyr Asp Ala Thr His Leu Pro Asp Gly vai Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60 Ser Gly ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys lie Asn ser Leu Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr vai ser lie Phe Pro Pro ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn vai Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly vai Leu 145 150 155 160
Asn ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr ser Pro Ile vai Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 <210>
150 <211>
1398 <212> DNA
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 3A12 Heavy Chain Sequenee (3A12 Heavy Chain variable Region and IgGl Constant Region) <400> 150
atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc tgtgcagcct 120
ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 240
gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 360
ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420
tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 480
aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 540
acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 600
gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 660
gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 720
agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 780
ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 840
gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 900
gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 960
gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1020
gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1080
ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1140
gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1200
tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1260
tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1320
ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1380
cactctcctg gtaaatga 1398
<210> 151
<211> 446
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3Α12 Heavy
Chain Sequence (3Α12 Heavy chain variable Region and IgG1 constant Region) (without signa! sequence)
<400> 151
Glu vai Gln Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly ser Leu Lys lie ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Phe Met ser Trp vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser ser Gly Gly Gly ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn ser Leu Lys ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser vai Thr vai ser ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
115 120 125
ser vai Tyr Pro Leu Ala Pro Gly ser Ala Ala Gln Thr Asn ser Met
130 135 140
vai Thr Leu Gly Cys Leu vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160
vai Thr Trp Asn ser Gly Ser Leu Ser ser Gly vai His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala vai Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu ser Ser Ser Val Thr Val
180 185 190
Pro ser ser Thr Trp Pro ser Glu Thr vai Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala Ser ser Thr Lys vai Asp Lys Lys lie vai Pro Arg Asp Cys
210 215 220
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr vai Pro Glu vai Ser ser Val Phe 225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp vai Leu Thr lie Thr Leu Thr Pro
245 250 255
Lys vai Thr Cys vai vai vai Asp lie Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Ser Trp Phe vai Asp Asp vai Glu vai His Thr Ala Gln Thr
275 280 285
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser vai Ser Glu 290 295 300
Leu Pro lie Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320
Arg vai Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln vai Tyr Thr lie Pro Pro 340 345 350
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys vai Ser Leu Thr Cys Met Ile
355 360 365
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr vai Glu Trp Gln Trp Asn Gly 370 375 380
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp 385 390 395 400
Gly Ser Tyr Phe vai Tyr Ser Lys Leu Asn vai Gln Lys ser Asn Trp
405 410 415
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser vai Leu His Glu Gly Leu His 420 425 430
Asn His His Thr Glu Lys ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 152 <211> 705 25 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length 3A12 Light Chain Sequence (3A12 Kappa variable Region and Constant Region) 30 <400> 152
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tagaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 153 <211> 214 <212> PRT
<213> seqüência Artificial 15 <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length 3Α12 Light Chain Sequence (3α12 Kappa variable Region and Constant Region) (without signal sequence) <400> 153
Asp Ile Gln Met Thr Gln ser Pro Ala Ser Leu ser vai ser vai Gly 1 5 10 15
Glu Thr vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr lie Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu vai 35 40 45
His Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gln ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110
Pro Thr vai ser Ile Phe Pro Pro ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140
Asn vai Lys Trp Lys lie Asp Gly ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160
Asn ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr ser Pro Ile vai Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 154 <211> 1404 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetic Full Length Chimerie 2b8 Heavy Chain (Mouse Variable Region and Human IgGl constant Region) (allotype Glm(17,l)) <400> 154
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210> 155 <211> 448 <212> PRT <213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Chimeric 2β8 Heavy Chain Cchimeric 2Β8 IgGl (Glm(17,l) allotype) (without signal sequence) 25 <400> 155
Gln vai Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu vai Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15
Ser vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp vai Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys Ser Ser ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala vai Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly Ser lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr vai ser ser Ala ser Thr Lys Gly Pro ser vai Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr vai ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser Ser Val Val Thr vai Pro ser ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn vai Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys vai Asp Lys Lys vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys vai vai vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu vai His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai
290 295 300
Ser vai Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325
Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360
Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390
ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405
Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe ser 420 425
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys ser
435 440
<210> 156 <211> 705 20 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Eneoding synthetie Full Length Chimerie 2b8 Light Chain (Mouse Variable Region and Human constant Region) 25 (chimerie 2b8 Kappa (Km(3))) <400> 156
atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 60 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 180 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 300 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 360
315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 330 335
Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu 350
Asn Gln vai ser Leu Thr Cys 365
Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser 380
Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp 395 400
Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser 410 415
Cys Ser vai Met His Glu Ala 430
Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 445 gggaccaggc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 705
<210> 157 <211> 214 < 212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Chimeric 2Β8 Light chain CChimeric 2β8 Kappa) (without signal sequence) <400> 157
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met ser Met Ser vai Gly 1 5 10 15
Glu Arg vai Thr Leu ser Cys Lys Ala ser Glu Asn vai vai ser Tyr
20 25 30
vai ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala ser Asn Arg Asn Thr Gly vai Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser ser vai Arg Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys vai Gln 145
Glu Ser vai
Ser Thr Leu
Ala Cys Glu 195
Phe Asn Arg 10 210
<210> 158 <211> 412 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized hu2b8 Hvl-f.l Heavy Chain variable Region <400> 158
atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca
<210> 159 <211> 118 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Hvl-f.l Heavy Chain variable Region (without signa! sequence)
Trp Lys vai Asp Asn Ala 150
Thr Glu Gln Asp Ser Lys 165
Thr Leu ser Lys Ala Asp 180 185
vai Thr His Gln Gly Leu 200
Gly Glu Cys
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 155 160
Asp ser Thr Tyr Ser Leu Ser 170 175
Tyr Glu Lys His Lys vai Tyr 190
Ser Ser Pro vai Thr Lys Ser 205
ctacaggcac ccacgccgag 60 gggctacagt gaaaatctcc 120 actgggtgca acaggcccct 180 acggtcatac taactacaat 240 ctacagacac agcctacatg 300 actgtgcaac aaactatgtt 360 ccgtctcctc ag 412 <400> 159
Glu val Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr val Ile Ser Cys Lys vai Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp vai Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg vai\l Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Tyr val Gly ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser ser
115
<210> 160
<211> 992
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Human IgG1 Heavy Chain Constant Region (Glm(17,l) allotype)
<400> 160
cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 300 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 720 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 960 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 992
<210> 161 <211> 330 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial 15 <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Human IgGl Heavy Chain constant Region (Glm(17,l) allotype) <400> 161
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser 35 40 45
Gly vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu ser Ser vai Val Thr vai Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai Asp Lys 30 85 90 95
Lys vai Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys
130 135 140
vai vai Val Asp vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr vai Asp Gly vai Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln vai ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
vai Phe Ser Cys ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gln Lys ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 162 <211> 1404 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequenee Eneoding synthetic Full Length Heavy Chain Humanized hu2b8 Hvlf.l variable Region and Human IgGl CGlm(17,1) allotype) Heavy Chain Constant Region
<400> 162
atggaetgea eetggaggat ectcetettg gtggeageag ctaeaggeae ccacgeegag 60
gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 120
tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 180
ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240
gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 300
gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 360
ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380
ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210> 163
<211> 448
<212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Heavy Chain Humanized Hu2b8 Hvlf.l variable Region and Human IgGl Heavy Chain Constant Region (Glm(17,l) allotype) (without signal sequence)
<400> 163
Glu Val Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile ser Cys Lys vai Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp vai Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu lie Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg vai Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Tyr vai Gly ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser vai Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln
165 170 175
Ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser ser vai Val Thr vai Pro Ser Ser
180 185 190
ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn vai Asn His Lys Pro Ser
195 200 205 Asn Thr Lys vai Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp vai ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu vai His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai
290 295 300
Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys 355 360 365
Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala vai Glu Trp Glu ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe ser Cys ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445
<210> 164 <211> 412 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized Hu2b8 HvSa.l Heavy Chain variable Region <400> 164
atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag 412
<210> 165 15 <211> 118 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2b8 Hv5a.1
Heavy chain variable Region (without signa! sequence) <400> 165
Glu vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
25 20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro ser Phe 50 55 60
Gln Gly His vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser ser Leu Lys Ala ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu vai Thr Val Ser ser 5 115
<210> 166 <211> 1404 <212> DNA
<213> seqüência Artificial 10 <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized Hu2b8 Hv5a.l Heavy Chain variable Region and Human IgGl (Glm(17,l) allotype) Heavy Chain Constant Region <400> 166
atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210> 167
<211> 448 <212> prt
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized hu2b8 Hv5a.1
Heavy Chain Variable Region and Human IgGl (Glm(17,l) allotype)
Heavy Chain constant Region (without signal sequence)
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile ser Cys Lys Gly ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr 20 25 30
Trp Met His Trp vai Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Gln Gly His vai Thr lie ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala 25 65 70 75
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly Ser lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Leu vai Thr vai Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe 115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
Glu
Tyr
Met
Phe
Tyr 80 Cys
Thr
Pro
Gly 130 135 140
Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln
165 170 175
ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser ser vai vai Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro ser
195 200 205
Asn Thr Lys vai Asp Lys Lys vai Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu vai Thr Cys vai Val Val Asp vai Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys ser vai Met His Glu Ala 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 168
<211> 412
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized hu2b8 Hv5-51.1
Heavy Chain variable Region
<400> 168
atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag 412
<210> 169 <211> 118
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Hv5-51.1
Heavy Chain Variable Sequence (without signal sequence)
<400> 169
Glu vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys
Trp Met His 35
Gly Glu lie 50
Gln Gly Gln 65
Leu Gln Trp
Ala Arg Asn
Leu vai Thr 115
<210> 170 <211> 1404 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized Hu2B8 HV5-51.1
Heavy Chain variable Region and Human IgGl (Glm(17,1) allotype) Heavy Chain Constant Region <400> 170
atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540
Ile Ser Cys Lys Gly Ser 20 25
Trp vai Arg Gln Met Pro 40
Asn Pro Thr Asn Gly His 55
vai Thr Ile ser Ala Asp 70
Ser Ser Leu Lys Ala Ser 85
Tyr vai Gly Ser lie Phe 100 105
vai Ser ser
Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 45
Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 60
Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr
75 80
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 110 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210> 171 <211> 448 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial 20 <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized hu2b8 Ην5-51.1
Heavy Chain Variable Region and Human IgGl (Glm(17,l) allotype) Heavy chain Constant Region (without signal sequence) <400> 171
Glu vai Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10
ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35
40
45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro ser Phe
50
55
60 Gln Gly Gln Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr vai ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser vai Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 10 130 135 140
Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp Asn 145 150 155 160
ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln 165 170 175
ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser vai vai Thr vai Pro ser ser 180 185 190
ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn vai Asn His Lys Pro ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys vai Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser 225 230 235 240
vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 250 255
25 Thr Pro Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp vai Ser His Glu Asp Pro 260 265 270
Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu vai His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai 290 295 300
Ser vai Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys
Ile Ser Lys
Pro Pro Ser 355
Leu vai Lys
370 Asn Gly Gln 10 385
Ser Asp Gly
Arg Trp Gln
Leu His Asn 435
<210> 172
<211> 388
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid sequence Encoding synthetic Humanized hu2b8 Kvl-39.1
Kappa Chain variable Region
<400> 172 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaac 388
<210> 173
vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys
360 365
Gly Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser
375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp 390 395 400
ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Gln Gly Asn vai Phe ser Cys Ser vai Met His Glu Ala 420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 440 445 <211> 107
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized hu2b8 Kvl-39.1
Kappa Chain variable Region (without signa! sequence) <400> 173
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro ser ser Leu ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15
Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala ser Glu Asn vai vai ser Tyr 20 25 30
vai ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Gly Ala ser Asn Arg Asn Thr Gly vai Pro ser Arg Phe ser Gly 50 55 60
Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
<210> 174 <211> 323 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Human Kappa Chain constant Region (Km(3) allotype) (allele 2)
<400> 174
gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 180 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300 gcttcaacag gggagagtgt tga 323
<210> 175 <211> 107 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Human Kappa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (aliele 2) <400> 175
Arg Thr vai Ala Ala Pro ser vai Phe Ile Phe Pro Pro ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys ser Gly Thr Ala ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys vai Gln Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn ser Gln Glu Ser vai Thr Glu Gln Asp ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys vai Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro vai Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 176 <211> 711 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized Hu2B8 kv-39.1 Light Chain variable Region and Human Kappa Chain constant Region (Km(3) allotype) (aliele 2) <400> 176
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a 711
<210> 177 <211> 214 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized Hu2b8 Kvl-39.1
Light Chain variable Region and Human Kappa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 177
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser ser Leu Ser Ala ser vai Gly 1 5 10 15
Asp Arg vai Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn vai vai Ser Tyr
20 25 30
vai ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr vai Ala Ala 100 105 110
Pro Ser vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys vai Gln Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser vai Thr Glu Gln Asp ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys vai Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro vai Thr Lys ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 178 <211> 382 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized Hu2b8 Kv3-15.1 Light Chain variable Region
<400> 178
atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 360 gggaccaagc tggagatcaa ac 382
<210> 179 <211> 107 <212> PRT
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2b8 Kv3-15.1 Light Chain variable Region Cwithout signa! sequence)
<400> 179
Glu Ile vai Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu ser vai Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu ser Cys Lys Ala ser Glu Asn vai vai Ser Tyr 20 25 30
15 vai Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Gly Ala ser Asn Arg Asn Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln ser 20 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr Cys Gly Gln ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
<210> 180
<211> 705
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Encoding synthetic Full Length Humanized hu2b8 Kv3-15.1
Light Chain variable Region and Human Kappa Chain Constant
Region (Km(3) allotype) (allele 2) <400> 180
atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 360 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga 705
<210> 181 <211> 214 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized hu2b8 Kv3-15.1 Light Chain variable Region and Human Kappa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 2) (without signal sequence)
<400> 181
Glu Ile vai Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu ser vai Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val vai Ser Tyr 20 25 30
vai Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys vai Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn ser Gln
145 150 155 160
Glu ser vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys vai Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro vai Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 182 20 <211> 412 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid sequence Encoding synthetic Humanized LR2B8HC
Heavy Chain variable Region
<400> 182
atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa 60 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 120 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 180 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 240 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 300 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 360 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc ag 412
<210> 183 <211> 118 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized LR2B8HC Heavy Chain variable Region (without signal sequence) <400> 183
Gln vai Gln Leu vai Gln Pro Gly Ala Glu vai vai Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15
ser vai Lys Leu ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp vai Asn Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly Glu lie Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu ser ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly ser lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr vai Ser Ser
115 <210> 184 <211> 992 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Human IgGl 1 Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (allele 1) <400> 184
ccagcacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagcacctctgggg 60
gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtgacggtgtcgt 120
ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180
gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggcacccagacct 240
acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 300
aatcttgtga caaaactcac acatgtccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360
cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420
aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480
acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540
gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600
agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660
aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 720
tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780
15 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840
tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900
agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaa cactacacgc 960
agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga 992
<210> 185
<211> 330
<212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Human IgGl Heavy Chain
constant Region (Glm(3) allotype) (alIele 1 or 2) <400> 185
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser ser Lys
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser ser vai vai Thr vai Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn vai Asn His Lys Pro ser Asn Thr Lys vai Asp Lys
85 90 95
Arg vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser vai Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys
130 135 140
vai vai vai Asp vai ser His Glu Asp Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr vai Asp Gly vai Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 vai Phe Ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 186
<211> 1404 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Heavy
Chain Humanized LR2B8HC Heavy Chain Variable Region and Human IgGl
Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (aliele 1)
<400> 186
atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa 60 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 120 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 180 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 240 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 300 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 360 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc agccagcaca 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ccccgggtaa atga 1404
<210> 187 <211> 448 <212> prt
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Heavy Chain Humanized lr2b8hc Heavy Chain variable Region and Human IgGl Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (allele 1) (without signal sequence)
<400> 187
Gln 1
ser
20 Trp
Gly
Lys 25 65 Met
Ala
30 Leu Leu
vai Gln Leu vai Gln Pro Gly Ala Glu vai vai Lys Pro Gly Thr
5 10 15
vai Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Met His Trp vai Asn Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys Ser Thr ser Thr Ala Tyr
70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys
85 90 95
Arg Asn Tyr vai Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175
ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser vai vai Thr vai Pro Ser ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn vai Asn His Lys Pro ser 195 200 205
Asn Thr Lys vai Asp Lys Arg vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg 245 250 255
Thr Pro Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp vai ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai Glu vai His Asn Ala 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai 290 295 300
ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu
340 345 350
pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys 355 360 365
Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser 370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 188 <211> 412 10 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized LRMR2B8HC Heavy Chain Variabie Region
<400> 188
atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag 60 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 120 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 180 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 240 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 300 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 360 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc ag 412
<210> 189 <211> 118 25 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized lrmr2b8hc Heavy Chain variabie Region (without signal sequence) 30 <400> 189
Gln vai Gln Leu vai Gln Pro Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Glu lie Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu ser Ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr vai ser ser 115
<210> 190
<211> 1404
<212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid sequence Encoding synthetic Full Length Heavy
Chain Humanized LRMR2B8HC Heavy Chain Variable Region and Human lgG1 Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) (aiIele 1) <400> 190
atgggttggt catatattat actctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag 60 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 120 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 180 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 240 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 300 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 360 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc agccagcaca 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ccccgggtaa atga 1404
<210> 191
<211> 448 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial 20 <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Heavy Chain Humanized lrmr2b8hc Heavy Chain variable Region and Human lgGl Heavy Chain constant Region (Glm(3) allotype) (allele 1) (without signal sequence)
<400> 191
Gln vai Gln Leu vai Gln Pro Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15
Ser vai Lys Leu ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Glu lie Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr vai Asp Lys ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly ser lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro ser Ser Lys ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser vai vai Thr vai Pro Ser Ser
180 185 190
ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn vai Asn His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys vai Asp Lys Arg vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser 225 230 235 240
vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 245 250 255
Thr Pro Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp vai Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai Glu vai His Asn Ala 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn ser Thr Tyr Arg vai vai 290 295 300
Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp 385 390 395 400
ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 192 <211> 360 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized LR2B8LC Light Chain variable Region
<400> 192
atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc 60 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 120 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 180 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 240 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 300 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa 360 <210> 193 <211> 107
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized LR2B8LC Light Chain Variable Region Çwithout signal sequence) <400> 193
Asp lie vai Met Thr Gln Ser Pro Asp 1 5
Glu Arg vai Thr Leu Asn Cys Lys Ala
20 25
vai Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40
Tyr Gly Ala ser Asn Arg Asn Thr Gly
50 55
ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu 65 70
Glu Asp vai Ala Asp Tyr His Cys Gly 85
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu 100 105
<210> 194 <211> 323 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Human Kappa Chain constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 194
gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca
ser Met Ala Met ser Val Gly 10 15
Ser Glu Asn vai vai Ser Tyr 30
Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie 45
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 60
Thr lie ser ser vai Gln Ala
75 80
Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 90 95
Ile Lys gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300 gcttcaacag gggagagtgt tag 323
<210> 195 <211> 107 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Encoding synthetic Human Kappa Chain Constant Region (Ktn(3) allotype) (aiIele 1)
<400> 195
Arg Thr vai Ala Ala Pro ser vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys vai Gln Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu ser vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys vai Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu ser ser
85 90 95
Pro vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 196 <211> 705 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid sequence Encoding synthetic Full Length Humanized lr2b8lc Light Chain variable Region and the Human Kappa Chain constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 196
atggaaagtc agacccttgt attcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc 60 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 120 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 180 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 240 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 300 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa 360 ggaaccaaac tcgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705
<210> 197 <211> 214 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized lr2b8lc Light Chain variable Region and the Human Kappa Chain constant Region (Km(3) allotype) (allele 1)
<400> 197
Asp lie vai Met Thr Gln ser Pro Asp Ser Met Ala Met Ser vai Gly
1 5 10 15
Glu Arg vai Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn vai vai Ser Tyr
20 25 30
vai ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser vai Gln Ala 65 70 75 80
Glu Asp vai Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr vai Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys vai Gln Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gln ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro vai Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 198 <211> 382 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized LRMR2B8LC Light Chain variable Region <400> 198
atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga 60 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 120 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 180 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 240 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 300 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 360 ggcactaaac ttgaaattaa ac 382
<210> 199 <211> 107 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein sequence Defining synthetic Humanized lrmr2b8lc Light Chain variabie Region (without signal sequence)
<400> 199
Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Asp 1 5
Glu Arg vai Thr Leu Asn Cys Lys Ala
20 25
vai ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
35 40
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Glu ser Gly
50 55
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu 65 70
Glu Asp vai Ala Asp Tyr His Cys Gly 85
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu 100 105
<210> 200 <211> 705 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid sequence Encoding synthetic Full Length Humanized LRMR2B8LC Light Chain variabie Region and the Human Kappa Chain constant Region (Km(3) allotype) (allele 1)
Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 10 15
Ser Glu Asn vai vai Ser Tyr 30
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45
vai Pro Asp Arg Phe ser Gly 60
Thr lie Ser ser vai Gln Ala
75 80
Gln ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 90 95
Ile Lys <400> 200
atggaatccc aaacccttgt tttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga 60 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 120 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 180 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 240 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 300 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 360 ggcactaaac ttgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705
<210> 201
<211> 214
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized 20 lrmr2b8lc Light Chain variable Region and the Human Kappa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 1) <400> 201
Asp lie vai Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Met ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg vai Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn vai Val Ser Tyr 20 25 30
vai Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly 30 50 55 60
ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser ser vai Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp vai Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr vai Ala Ala
100 105 110
Pro ser vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys vai Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu ser vai Thr Glu Gln Asp ser Lys Asp ser Thr Tyr ser Leu ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys vai Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro vai Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 202 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Heavy Chain Cdr2 sequence (Kabat Definition) of synthetic humanized Hu2B8 Hvlf.l antibody <400> 202
Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 203
<211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Heavy chain CDR2 sequence (Kabat Defini tiοη) of synthetic humanized Hu2b8 Hv5a.l antibody <400> 203
Glu lie Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15
Gly
<210> 204 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Heavy Chain CDR2 sequence (Kabat Defini tion) of synthetic humanized LR2B8HC antibody <400> 204
Glu lie Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 205 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Heavy Chain cdr2 sequence (Kabat Defini tion) of synthetic humanized LRMR2B8HC antibody <400> 205
Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15
Gly <210> 206 <211> 7 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Light Chain CDR2 sequence (Kabat Defini tiοη) of synthetic humanized lrmr2b8lc antibody <400> 206
Gly Ala ser Asn Arg Glu Ser 1 5
<210> 207 <211> 992 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Human IgGl Heavy Chain constant Region (GlmC3) allotype) (allele 2) <400> 207
cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 300 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaag accatctcca 660 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 720 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 960 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 992
<210> 208
<211> 330
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Human IgGl Heavy Chain Constant Region (Glm(3) allotype) Callele 1 or 2)
<400> 208
Ala ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser ser Lys 1 5 10 15
Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln ser Ser Gly Leu Tyr ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val vai Thr vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai Asp Lys
85 90 95
Arg vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
25 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser vai Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys
130 135 140
vai vai Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr vai Asp Gly vai Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai Ser vai Leu Thr vai Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln vai ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr ser Lys Leu Thr vai Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn %
290 295 300
vai Phe Ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 20 325 330
<210> 209
<211> 1404
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Chain Contai-ning Humanized Hu2b8 hv5-51.1 Heavy Chain variable Region and the Human IgGl Heavy Chain Constant Region Glm(3) allotype (allele 2)
<400> 209 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga agaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210> 210 <211> 448 <212> PRT
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Heavy Chain Contai ning Humanized hu2b8 Hv5-51.1 and the Human IgG1 Heavy Chain constant Regi on Glm(3) allotype (allele 2) (without signal sequence)
<400> 210
Glu Val Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 ser Leu Lys Ile ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp vai Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr lie ser Ala Asp Lys ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Tyr vai Gly Ser lie Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu vai Thr vai Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser vai Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu Gln 20 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser ser vai vai Thr vai Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn vai Asn His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys vai Asp Lys Arg vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240
vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 30 245 250 255
Thr Pro Glu vai Thr Cys vai vai vai Asp vai Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai Glu vai His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val vai
290 295 300
Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala vai Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe ser Cys ser vai Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys ser Leu ser Leu ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 211 <211> 2209 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic HGF mhm (V495-L585) <400> 211
atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240
tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300
cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360
gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420
gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480
cacagctttt tgccttcgag ctatcgcggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 540
cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 600
gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg tgaaagctac 660
agaggtccca tggatcacac agaatcaggc aagacttgtc agcgctggga ccagcagaca 720
ccacaccggc acaagttctt gccagaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 780
tgccgcaatc ctgatggcaa gccgaggcca tggtgctaca ctcttgaccc tgacaccact 840
tgggagtatt gtgcaattaa aacgtgcgct cacagtgctg tgaatgagac tgatgtccct 900
atggaaacaa ctgaatgcat tcaaggccaa ggagaaggtt acaggggaac cagcaatacc 960
atttggaatg gaattccctg tcagcgttgg gattcgcagt accctcacaa gcatgatatc 1020
actcccgaga acttcaaatg caaggacctt agagaaaatt attgccgcaa tccagatggg 1080
gctgaatcac catggtgttt taccactgac ccaaacatcc gagttggcta ctgctctcag 1140
attcccaagt gtgacgtgtc aagtggacaa gattgttatc gtggcaatgg gaaaaattac 1200
atgggcaact tatccaaaac aaggtctgga cttacatgtt ccatgtggga caagaatatg 1260
gaggatttac accgtcatat cttctgggag ccagatgcta gcaaattgaa taagaattac 1320
tgccggaatc ctgatgatga tgcccatgga ccttggtgct acacggggaa tcctcttatt 1380
ccttgggatt attgccctat ttcccgttgt gaaggagata ctacacctac aattgtcaat 1440
ttggaccatc ctgtaatatc ctgtgccaaa acaaaacaac tgcgggttgt aaatgggatt 1500
ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 1560
ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 1620
gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 1680
aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 1740
gttttaatga agcttgctcg acctgcaatc ctggataact ttgtcagtac aattgattta 1800
cctagttatg gttgtacaat ccctgaaaag accacttgca gtatttacgg ctggggctac 1860
actggattga tcaacgcgga tggtttatta cgagtagctc atctgtatat tatggggaat 1920
gagaaatgca gtcagcacca tcaaggcaag gtgactttga atgagtctga gttatgtgct 1980
ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggagatt atggtggccc actcatttgt 2040
gaacaacaca aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatc 2100 ccaaatcgtc ctgttatttt tgttcgagta gcatattatg caaaatggat acacaaagta 2160 attttgacat acaagttgtg cggccgccat caccatcacc atcactaag 2209
<210> 212
<211> 680
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic HGF mhm495-585 active
<400> 212
Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys vai Asn Ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15
Ala Asn Arg Cys lie Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala
20 25 30
Phe vai Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn 35 40 45
Ser Met ser Ser Gly vai Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu
50 55 60
Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr lie Arg Asn Cys lie Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80
Ser Tyr Lys Gly Thr vai ser Ile Thr Lys ser Gly lie Lys Cys Gln
85 90 95
Pro Trp Asn ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro ser ser
100 105 110
Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly 115 120 125
Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu vai Arg Tyr
130 135 140
Glu vai Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu vai Glu Cys Met Thr Cys 145 150 155 160
Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys
165 170 175
Thr Cys Gln Arg Trp Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu 180 185 190
Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn
195 200 205
Pro Asp Gly Lys Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr 210 215 220
Thr Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala vai Asn 225 230 235 240
Glu Thr Asp Val Pro Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly 245 250 255
Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys 260 265 270
Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Lys His Asp Ile Thr Pro Glu
275 280 285
Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp 290 295 300
Gly Ala Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn lie Arg vai 305 310 315 320
Gly Tyr Cys Ser Gln lie Pro Lys Cys Asp vai Ser ser Gly Gln Asp 325 330 335
20 Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu ser Lys Thr 340 345 350
Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu
355 360 365
His Arg His lie Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn 25 370 375 380
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 385 390 395 400
Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu 405 410 415
Gly Asp Thr Thr Pro Thr lie vai Asn Leu Asp His Pro vai Ile Ser 420 425 430
Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg vai vai Asn Gly Ile Pro Thr Arg 435 440 445
Thr Asn Ile Gly Trp Met vai Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His lie
450 455 460
Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp val Leu Thr Ala Arg Gln 465 470 475 480
Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile
485 490 495
His Asp vai His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln vai Leu Asn 500 505 510
val ser Gln Leu vai Tyr Gly Pro Glu Gly ser Asp Leu vai Leu Met 515 520 525
Lys Leu Ala Arg Pro Ala Ile Leu Asp Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp
530 535 540
Leu Pro Ser Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys ser Ile 545 550 555 560
Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg
565 570 575
vai Ala His Leu Tyr lie Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His 580 585 590
Gln Gly Lys vai Thr Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu 595 600 605
Lys Ile Gly ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu lie
610 615 620
Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met vai Leu Gly Val Ile val Pro Gly 625 630 635 640
Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro vai Ile Phe vai Arg vai Ala
645 650 655
Tyr Tyr Ala Lys Trp lie His Lys vai lie Leu Thr Tyr Lys Leu Cys 660 665 670
Gly Arg His His His His His His 675 680
<210> 213 <211> 2194 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic HGF mhm (I499-R556) <400> 213
atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60
ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120
catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180
aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240
tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300
cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360
gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420
gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480
cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540
gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600
cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660
cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720
ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcctgat 780
ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840
attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900
tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960
ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020
aaatgcaagg accttagaga aaattattgc cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080
tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt ggctactgct ctcagattcc caagtgtgac 1140
gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200
aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260
catatcttct gggagccaga tgctagcaaa ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320
gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 1380
cctatttccc gttgtgaagg agatactaca cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440
atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac 1500
ataggatgga tggttagttt gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560 1800 1860
aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620 gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ggaagaggag aggagaaaag aaaacagatt 1680 ctcaatattt cccagctggt atatggccct gaaggatcag atctggtttt actgaagctt 1740 gctcgacctg caatcctgga taactttgtc agtacaattg atttacctag ttatggttgt acaatccctg aaaagaccac ttgcagtatt tacggctggg gctacactgg attgatcaac gcggatggtt tattacgagt agctcatctg tatattatgg ggaatgagaa atgcagtcag 1920 caccatcaag gcaaggtgac tttgaatgag tctgagttat gtgctggggc tgaaaagatt 1980 ggatcaggac catgtgaggg agattatggt ggcccactca tttgtgaaca acacaaaatg 2040 agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt cgtggatgtg ccatcccaaa tcgtcctggt 2100 atttttgttc gagtagcata ttatgcaaaa tggatacaca aagtaatttt gacatacaag 2160 ttgtgcggcc gccatcacca tcaccatcac taag 2194
<210> 214 <211> 675 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic HGF mhm 499-556 active <400> 214
Pro Leu Leu Lys He Lys Thr Lys Lys vai Asn ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15
Ala Asn Arg Cys lie Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala
20 25 30
Phe vai Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn 35 40 45
Ser Met Ser ser Gly vai Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu 50 55 60
Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile lie Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80
ser Tyr Lys Gly Thr vai Ser lie Thr Lys Ser Gly lie Lys Cys Gln 30 85 90 95
pro Trp Asn Ser Met lie Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp 100 105 HO Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro
115 120 125
Trp Cys Phe Thr ser Asn Pro Glu vai Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile 130 135 140
Pro Gln cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr 145 150 155 160
Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp
165 170 175
Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro 180 185 190
Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro
195 200 205
Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys 210 215 220
Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala vai Asn Glu Thr Asp vai Pro 225 230 235 240
Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly
245 250 255
Thr ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly lie Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser 260 265 270
Gln Tyr Pro His Lys His Asp lie Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys
275 280 285
Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu Ser Pro 290 295 300
25 Trp cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg vai Gly Tyr Cys Ser Gln 305 310 315 320
Ile Pro Lys Cys Asp Val Ser Ser Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn
325 330 335
Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg ser Gly Leu Thr 340 345 350
Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe 355 360 365 Trp Glu Pro Asp Ala ser Lys Leu Asn Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
370 375 380
Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile 385 390 395 400
Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro
405 410 415
Thr lie vai Asn Leu Asp His Pro vai Ile ser Cys Ala Lys Thr Lys
420 425 430
Gln Leu Arg vai vai Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp
435 440 445
Met vai ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu
450 455 460
Ile Lys Glu ser Trp vai Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg 465 470 475 480
Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly
485 490 495
Arg Gly Glu Glu Lys Arg Lys Gln Ile Leu Asn Ile ser Gln Leu vai
500 505 510
Tyr Gly Pro Glu Gly ser Asp Leu Val Leu Leu Lys Leu Ala Arg Pro
515 520 525
Ala lie Leu Asp Asn Phe vai Ser Thr lie Asp Leu Pro Ser Tyr Gly
530 535 540
Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr 545 550 555 560
Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg vai Ala His Leu Tyr
565 570 575
Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys vai Thr
580 585 590
Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly
595 600 605
Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys 610 615 620 Met Arg Met vai Leu Gly vai Ile vai Pro Gly Arg Gly Cys Ala lie
625
630
635
640
Pro Asn Arg Pro Gly lie Phe vai Arg vai Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp
645
650
655
lie His Lys vai lie Leu Thr Tyr Lys Leu Cys Gly Arg His His His
660
665
670
His His His 675 <210> 215 10 <211> 2194 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Synthetic HGF mhm (W507-L585)
<400> 215
atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60
ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120
catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180
aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240
tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300
cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360
gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420
gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480
cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540
gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600
cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660
cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720
ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcctgat 780
ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840
attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900
tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960
ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020 aaatgcaagg accttagaga aaattattgc cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080 tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt ggctactgct ctcagattcc caagtgtgac 1140 gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200 aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260 catatcttct gggagccaga tgctagcaaa ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320 gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 1380 cctatttccc gttgtgaagg agatactaca cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440 atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattccaac acaaacaaca 1500 gtaggatgga tggttagttt gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560 aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620 gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt 1680 ctcaatgttt cccagctggt atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt 1740 gctcgacctg caatcctgga taactttgtc agtacaattg atttacctag ttatggttgt 1800 acaatccctg aaaagaccac ttgcagtatt tacggctggg gctacactgg attgatcaac 1860 gcggatggtt tattacgagt agctcatctg tatattatgg ggaatgagaa atgcagtcag 1920 caccatcaag gcaaggtgac tttgaatgag tctgagttat gtgctggggc tgaaaagatt 1980 ggatcaggac catgtgaggg agattatggt ggcccactca tttgtgaaca acacaaaatg 2040 agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt cgtggatgtg ccatcccaaa tcgtcctggt 2100 atttttgttc gagtagcata ttatgcaaaa tggatacaca aagtaatttt gacatacaag 2160 ttgtgcggcc gccatcacca tcaccatcac taag 2194
<210> 216
<211> 675
<212> PRT
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Synthetic HGF mhm507-585 active <400> 216
ργο Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15
Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala 20 25 30
Phe val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn 35 40 45
Ser Met ser ser Gly vai Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu
50 55 60
Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80
ser Tyr Lys Gly Thr vai Ser Ile Thr Lys ser Gly Ile Lys Cys Gln
85 90 95
Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp
100 105 110
Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro
115 120 125
Trp Cys Phe Thr ser Asn Pro Glu vai Arg Tyr Glu vai Cys Asp Ile
130 135 140
Pro Gln Cys ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr 145 150 155 160
Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp
165 170 175
Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro
180 185 190
Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro
195 200 205
Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys
210 215 220
Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala vai Asn Glu Thr Asp vai Pro 225 230 235 240
Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly
245 250 255
Thr Ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly lie Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser
260 265 270
Gln Tyr Pro His Lys His Asp Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys
275 280 285
Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu Ser Pro 290 295 300
Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg vai Gly Tyr Cys Ser Gln 305 310 315 320
Ile Pro Lys Cys Asp vai Ser Ser Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn 325 330 335
Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ser Gly Leu Thr
340 345 350
Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His lie Phe 355 360 365
Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 370 375 380
Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile 385 390 395 400
Pro Trp Asp Tyr Cys Pro lie ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro 405 410 415
Thr Ile vai Asn Leu Asp His Pro vai lie Ser Cys Ala Lys Thr Lys
420 425 430
Gln Leu Arg vai vai Asn Gly lie Pro Thr Gln Thr Thr vai Gly Trp 435 440 445
Met vai ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His lie Cys Gly Gly Ser Leu 450 455 460
lie Lys Glu Ser Trp vai Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro ser Arg 465 470 475 480
Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly lie His Asp vai His Gly 485 490 495
Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln vai Leu Asn vai Ser Gln Leu vai
500 505 510
Tyr Gly Pro Glu Gly ser Asp Leu vai Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro 515 520 525
Ala lie Leu Asp Asn Phe vai ser Thr lie Asp Leu Pro Ser Tyr Gly 530 535 540
Cys Thr lie Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser lie Tyr Gly Trp Gly Tyr 545 550 555 560
Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg vai Ala His Leu Tyr
565 570 575
Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys vai Thr
580 585 590
Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys lie Gly ser Gly
595 600 605
Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu lie Cys Glu Gln His Lys
610 615 620
Met Arg Met Val Leu Gly vai lie vai Pro Gly Arg Gly Cys Ala lie 625 630 635 640
Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe vai Arg vai Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp
645 650 655
Ile His Lys vai Ile Leu Thr Tyr Lys Leu Cys Gly Arg His His His 660 665 670
His His His 675

Claims (100)

1. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF)1 a proteína de ligação compreendendo: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRli-CDR 12- CDR l3, em que (i) CDRu compreende a seqüência de aminoácidos Xi X2 Ser X4 X5 Χβ X7 X8 Xg Χίο X11 X12 X13 X14 X15, em que o aminoácido Xi é Arg, Lys, ou Ser, X2 é Ala ou Thr1 X4 é Glu, Gln1 ou Ser, X5 é Asn, Asp, ou Ser, X6 é Ile ou Vai, X7 é Asp, Lys, Ser, Vai, ou Tyr1 X8 é uma ligação peptídica ou Tyr, X9 é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, Xn é uma ligação peptídica ou Asn, Xi2 é uma ligação peptídica, lie, ou Ser, X13 é Asn ou Tyr, X14 é lie, Leu, Met, ou Vai, Xi5 é Ala, Asn, His, ou Ser, (ii) CDRi_2 compreende a seqüência de aminoácidos X16 X17 Xi8 X19 X20 X21 X22, em que o aminoácido Xi6 é Ala, Asp, Arg, Gly, ou Vai, X17 é Ala, Thr, ou Vai, Xi8 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, Lys, ou He, X2o é Leu ou Arg, X21 é Ala, Asn, Glu, Val, ou Pro, X22 é Asp, Ser, ou Thr. (iii) CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, em que o aminoácido X23 é Leu, Gly, ou Gln, X24 é His ou Gln1 X25 é Phe, Ser, Trp, ou Tyr, X26 é Asp, lie, Ser, Trp, ou Tyr, X27 é Gly, 20 Glu, Asn, ou Ser, X28 é Asp, Asn, Phe, Thr, ou Tyr, X30 é Leu, Phe, Pro, ou Tyr. (b) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade, em que as regiões de determinação de complementaridade da cadeia leve de imu-25 noglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina definem um sítio de ligação que se liga a HGF humano.
2. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF), a proteína de ligação compreendendo: (a) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDR m-CDR H2-CDR H3em que (i) CDRhi compreende a seqüência de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5 em que o aminoácido X1 é Asp, Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe, Ser, Trp, ou Tyr, X4 é lie, Leu, ou Met, X5 é Asn, His, ou Ser, (ii) CDRh2 compreende a seqüência de aminoácidos X6 Ne Xe Χθ Xio X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X1S X19 X20 X21 X22, em que o aminoácido X6 é Lys, Gln, Glu, Vai, ou Tyr, X8 é Asn, Gly1 Ser1 Trp, ou Tyr, X9 é Ala, Pro ou Ser, X10 é Gly ou Thr, X11 é uma ligação peptídica, Asp, Asn, Gly, ou Ser, X13 é Asp, Asn, His, ou Ser, X14 é Ser ou Thr, X15 é Asn ou Tyr, X17 é Asn ou Pro, X18 é Ala, Asp, Gly, Gln, Glu, Pro, ou Ser, X19 é Asn, Lys, Met, ou Ser, X20 é Leu, Phe ou Vai, X21 is Lys, Met, ou Gln, X22 is Asp, Gly ou Ser (iii) CDRh3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg, Asn, Gln, ou Glu, X24 é Gly, Leu, Arg, ou Tyr, X25 é uma ligação peptídica, Asp, ou Gly, X26 é uma ligação peptídica ou Gly, X27 é uma ligação peptídica ou Tyr, X28 é uma ligação peptídica, Leu, ou Tyr, X29 é uma ligação peptídica, Gly, Leu, Arg, ou Vai, X30 é uma ligação peptídica, Asp, Gly, ou Glu, X31 é uma ligação peptídica, Asn, Arg, Ser, ou Tyr, X32 é uma ligação peptídica, Ala, Gly, lie, ou Tyr, X33 is Met ou Phe, X34 é Ala ou Asp; e (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade, em que as regiões de determinação de complementaridade da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina definem um sítio de ligação que se liga a HGF humano.
3. Anticorpo isolado da reivindicação 2, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a estrutura CDRl1-CDR L2-CDR L3, em que (i) CDRL1 compreende a seqüência de aminoácidos X-1 X2 Ser X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, em que o aminoácido X1 é Arg, Lys, ou Ser, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu, Gln, ou Ser, X5 é Asn, Asp, ou Ser, X6 é Ile ou Vai, X7 é Asp, Lys, Ser, Vai, ou Tyr, X8 é uma ligação peptídica ou Tyr, X9 é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, X11 é uma ligação peptídica ou Asn, X12 é uma ligação peptídica, lie, ou Ser, X13 é Asn ou Tyr, X14 é lie, Leu, Met, ou Vai, Xi5 é Ala, Asn, His, ou Ser, (ii) CDRl2 compreende a seqüência de aminoácidos X16 X17 X18 Χ10 Χ20 Χ21 Χ22, em que o aminoácido X16 é Ala, Asp, Arg1 Gly, ou Vai, X17 é Ala, Thr, ou Val, X18 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, Lys, ou He, X20 é Leu ou Arg, X21 é Ala, Asn, Glu, Vai, ou Pro, X22 é Asp, Ser, ou Thr, e (iii) CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 5 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, em que o aminoácido X23 é Leu, Gly, ou Gln, X24 é His ou Gln, X25 é Phe, Ser, Trp1 ou Tyr, X26 é Asp, lie, Ser, Trp, ou Tyr, X27 é Gly, Glu, Asn, ou Ser, X2e é Asp, Asn, Phe, Thr, ou Tyr, X3o é Leu, Phe, Pro, ou Tyr.
4. Proteína de ligação da reivindicação 1, 2 ou 3 em que as regi- ões de determinação de complementaridade estão interpostas entre regiões de arcabouço.
5. Proteína de ligação da reivindicação 4 em que as seqüências de CDR estão interpostas entre regiões de arcabouço humanas ou humanizadas.
6. Ácido nucléico isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve de imunoglobulina da reivindicação 1.
7. Vetor de expressão que contém uma seqüência de nucleotídeos da reivindicação 6.
8. Célula hospedeira que contem o vetor de expressão da reivin- dicação 7.
9. Método para produzir uma proteína de ligação, o método compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira da reivindicação 8 sob condições tais que a célula hospedeira expresse a região variável da cadeia leve de imunoglobulina; e (b) coletar a região variável da cadeia leve de imunoglobulina.
10. Método da reivindicação 9, em que, após a etapa (b), a região variável da cadeia leve de imunoglobulina é ligada covalentemente a uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina, tal que as regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada juntas se liguem a HGF humano.
11. Ácido nucléico isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina da reivindicação 2.
12. Vetor de expressão que contém uma seqüência de nucleotídeos da reivindicação 11.
13. Célula hospedeira que contém o vetor de expressão da rei- vindicação 12.
14. Método para produzir uma proteína de ligação, o método compreendendo: (a) cultivar as células hospedeiras da reivindicação 13 sob condições tais que a célula hospedeira expresse a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina; e (b) coletar a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina.
15. Método da reivindicação 14, em que, após a etapa (b), a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina é ligada covalentemente a uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, tal que as regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada juntas se liguem a HGF humano.
16. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) compreendendo: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRL1-CDR L2-CDR L3, em que (i) CDRu compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Ns: 8 (1A3), SEQ ID Ns: 18 (2B8), SEQ ID Ns: 28 (2F8), SEQ ID Ns: 38 (3B6), SEQ ID N2: 48 (3D11), SEQ ID N2: 58 (1D3), SEQ ID N2: 68 (1F3), e SEQ ID Ns: 78 (3A12). (ii) CDRl2 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N2: 9 (1A3), SEQ ID N2: 19 (2B8), SEQ ID N2: 29 (2F8), SEQ ID N2: 39 (3B6), SEQ ID N2: 49 (3D11), SEQ ID N2: 59 (1D3), SEQ ID N2: 69 (1F3), SEQ ID N2: 79 (3A12); e (iii) CDRL3 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N2: 10 (1A3), SEQ ID N2: 20 (2B8), SEQ ID N2: 30 (2F8), SEQ ID Ns: 40 (3Β6), SEQ ID Ns: 50 (3D11), SEQ ID Ns: 60 (1D3), SEQ ID Ne: 70 (1F3), e SEQ ID Ns: 80 (3A12); e (b) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina e a região variável da 5 cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um único sítio de ligação para ligação de HGF humano.
17. A proteína de ligação da reivindicação 16, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende (i) uma CDRu que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 8(1A3), (ii) uma CDRl2 que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 9 (1A3), e (iü) uma CDRl3 que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 10(1A3).
18. A proteína de ligação da reivindicação 16, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende (i) uma CDRLi que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 18 (2B8), (ii) uma CDR|_2 que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 19 (2B8), e (iii) uma CDRl3 que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 20 (2B8).
19. A proteína de ligação da reivindicação 16, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende (iv) uma CDRLi que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 28 (2F8), (v) uma CDR|_2 que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 29 (2F8), e (vi) uma CDRl3 que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 30 (2F8).
20. Proteína de ligação da reivindicação 16, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende (i) uma CDRu que compreende a seqüência SEQ ID N°: 38 (3B6), (ii) uma CDRL2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 39 (3B6), e (iii) uma CDRL3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 40 (3B6).
21. Proteína de ligação da reivindicação 16, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende (i) uma CDRL1 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 48(3D11), (ii) uma CDRL2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 49 (3D11), e (iii) uma CDRL3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 50 (3D11).
22. Proteína de ligação da reivindicação 16, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende (i) uma CDRu que compreende a seqüência SEQ ID N°: 58 (1D3), (ii) uma CDRL2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 59 (1D3), e (iii) uma CDRL3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 60 (1D3).
23. Proteína de ligação da reivindicação 16, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende (i) uma CDRli que compreende a seqüência SEQ ID N°: 68 (1F3), (ii) uma CDRL2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 69 (1F3), e (iii) uma CDRL3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 70 (1F3).
24. Proteína de ligação da reivindicação 16, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende (i) uma CDRu que compreende a seqüência SEQ ID N°: 78 (3A12), (ii) uma CDRi_2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 79 (3A12), e (iii) uma CDRl3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 80 (3A12).
25. Proteína de ligação da reivindicação 16, em que CDRL1 CDR L2 e CDR L3 estão interpostas entre regiões de arcabouço de imunoglobulina humana ou humanizada.
26. Proteína de ligação da reivindicação 16, em que a proteína de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
27. Proteína de ligação da reivindicação 26, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
28. Pproteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) compreendendo: (a) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDR H1-CDR H2-CDR H3 em que (i) CDRhi compreende uma seqüência selecionada do grupo que coN°iste em SEQ ID N°: 5 (1A3), SEQ ID N°: 15 (2B8), SEQ ID N°: 25 (2F8), SEQ ID N9: 35 (3B6), SEQ ID N2: 45 (3D11), SEQ ID N°: 55 (1D3), SEQ ID NQ: 65 (1F3), e SEQ ID N°: 75 (3A12); (ii) CDRH2 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 6 (1A3), SEQ ID N°: 16 (2B8), SEQ ID N°: 26 (2F8), SEQ ID N°: 36 (3B6), SEQ ID N2: 46 (3D11), SEQ ID N°: 56 (1D3), SEQ ID N: 66 (1F3), SEQ ID N°: 76 (3A12), SEQ ID N2: 202 (Hu2B8 Hv1f.1), e SEQ ID N2: 203 (Hu2B8 Hv5a.1 e Hu2B8 Hv5-51.1), e (iii) CDRh3 compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 7 (1A3), SEQ ID N2: 17 (2B8), SEQ ID N°: 27 (2F8), SEQ ID Ne: 37 (3B6), SEQ ID N2: 47 (3D11), SEQ ID N°: 57 (1D3), SEQ ID N2: 67 (1F3), e SEQ ID N2: 77 (3A12); e (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e a região variá- vel da cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para ligação de HGF humano.
29. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende (i) uma CDRH1 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 5 (1A3), (ii) uma CDRH2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 6 (1A3), e (iii) uma CDRH3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 7 (1A3).
30. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende (i) uma CDRm que compreende a seqüência SEQ ID N°: 15 (2B8), (ii) uma CDRH2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 16 (2B8), SEQ ID Ne: 202 (Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID Ne: 203 (Hu2B8 Hv5a.1 or Hu2B8 Hv5-51.1) e (iii) uma CDRh3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 17 (2B8).
31. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende (i) uma CDRm que compreende a seqüência SEQ ID N°: 25 (2F8), (ii) uma CDRh2 que compreende a seqüência SEQ ID N8: 26 (2F8), e (iii) uma CDRH3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 27 (2F8).
32. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende (i) uma CDRm que compreende a seqüência SEQ ID NQ: 35 (3B6), (ii) uma CDRH2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 36 (3?6), e (iii) uma CDRh3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 37 (3B6).
33. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende (i) uma CDRhi que compreende a seqüência SEQ ID N°: 45 (3D11), (ii) uma CDRH2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 46 (3D11), e (iii) uma CDRH3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 47 (3D11).
34. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende (i) uma CDRm que compreende a seqüência SEQ ID N°: 55 (1D3), (ii) uma CDRH2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 56 (1D3), e (iii) uma CDRh3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 57 (1D3).
35. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende (i) uma CDRm que compreende a seqüência SEQ ID N3: 65 (1F3), (ii) uma CDRH2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 66 (1F3), e (iii) uma CDRH3 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 67 (1F3).
36. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende (i) uma CDRm que compreende a seqüência SEQ ID N2: 75 (3A12), (ii) uma CDRH2 que compreende a seqüência SEQ ID N°: 76 (3Α12), e (iii) uma CDRH3 que compreende a seqüência SEQ ID Ns: 77 (3A12).
37. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que CDRm.CDR 5 H2 e CDR H3 estão interpostas entre regiões de arcabouço de imunoglobulina humana ou humanizada.
38. Proteína de ligação da reivindicação 28, em que a proteína de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno desse.
39. Arcabouço de ligação da reivindicação 38, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
40. Ácido nucléico isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve de imunoglobulina da reivindicação 16.
41. Vetor de expressão que contem o ácido nucléico da reivindicação 40.
42. Célula hospedeira que contém o vetor de expressão da reivindicação 41.
43. Método para produzir uma proteína de ligação, o método compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira da reivindicação 42 sob condi- ções tais que a célula hospedeira expresse a região variável da cadeia leve de imunoglobulina; e (b) coletar a região variável da cadeia leve de imunoglobulina.
44. Método da reivindicação 43, em que, após a etapa (b), a região variável da cadeia leve de imunoglobulina é ligada covalentemente a uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina, tal que as regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada juntas se liguem a HGF humano.
45. Ácido nucléico isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina da reivindicação 28.
46. Vetor de expressão que contem a seqüência de ácido nu- cléico da reivindicação 45.
47. Célula hospedeira que contem o vetor de expressão da reivindicação 46.
48. Método dee produzir uma proteína de ligação, o método compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira da reivindicação 47 sob condições tais que a célula hospedeira expresse a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina; e (b) coletar a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina.
49. Método da reivindicação 48, em que, após a etapa (b), a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina é ligada covalentemente a uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, tal que as regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada juntas se liguem a HGF humano.
50. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) compreendendo: uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que coN°iste nos resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 4 (1A3), resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 14 (2B8), resíduos 20-131 de SEQ ID N°: 24 (2F8), resíduos 23-129 de SEQ ID N°: 34 (3B6), resíduos 23-128 de SEQ ID N°: 44 (3D11), resíduos 21-127 de SEQ ID N9: 54 (1D3), e resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 64 (1F3), resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 74 (3A12), SEQ ID N°: 173 (região variável da cadeia Kappa de Hu2B8 Kv1-39.1), SEQ ID N°: 179 (região variável de cadeia Kappa Hu2B8 Kv3-15.1), e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina selecionada do grupo que coN°iste nos resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 2 (1A3), resíduos 20-137 de SEQ ID N°: 12 (2B8), resíduos 20-137 de SEQ ID N°: 22 (2F8), resíduos 20-139 de SEQ ID N°: 32 (3B6), resíduos 20-132 de SEQ ID N°: 42 (3D11), resíduos 20-141 de SEQ ID Ne: 52 (1D3), resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 62 (1F3), e resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 72 (3A12), SEQ ID Ng: 159 (região variável de cadeia pesada de Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID N°: -165 (região variável de cadeia pesada de Hu2B8 Hv5a.1), e SEQ ID N°: 169 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv5-51.1).
51. Proteína de ligação da reivindicação 50, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 4 (1A3) e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 2 (1A3).
52. Proteína de ligação da reivindicação 50, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 14 (2B8) e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-137 de SEQ ID Ne: 12 (2B8).
53. Proteína de ligação da reivindicação 50, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-131 de SEQ ID N°: 24 (2F8) e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-137 de SEQ ID N°: 22 (2F8).
54. Proteína de ligação da reivindicação 50, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 23-129 de SEQ ID N°: 34 (3B6) e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-139 de SEQ ID N°: 32 (3B6).
55. Proteína de ligação da reivindicação 50, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 23-128 de SEQ ID N°: 44 (3D11) e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-132 de SEQ ID N°: 42 (3D11).
56. Proteína de ligação da reivindicação 50, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 54 (1D3) e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 12 (1D3).
57. Proteína de ligação da reivindicação 50, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de ami-noácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 64 (1F3) e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 62 (1F3).
58. Proteína de ligação da reivindicação 50, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 74 (3A12) e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a seqüência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID Ne: 72 (3A12).
59. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) compreendendo: uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 173 (região variável da cadeia leve de Hu2B8 Kv1-39.1), SEQ ID N°: 179 (região variável da cadeia leve de Hu2B8 Kv3-15.1); e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 159 (região variável de cadeia pesada de Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID N°: 165 (região variável de cadeia pesada de Hu2B8 Hv5a.1), SEQ ID N°: 169 (região variável de cadeia pesada de Hu2B8 Hv5-51.1).
60. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) compreendendo: uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + coN°tante kappa (alótipo Km(3) (alelo 2)), SEQ ID N°: 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + coN°tante Kappa (alótipo Km(3) (alelo 2)); e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 163 (Hu2B8 Hv1f.1 + CoN°tante de IgG1 (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID N°: 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + CoN°tante de IgG1 (alótipo G1m(17,1)), SEQ ID N°: 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + CoN°tante de IgGI (alótipo G1m(17,1)) e SEQ ID N°: 210 (Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante de IgG1 (alótipo G1m(3) (alelo 2)).
61. Proteína de ligação da reivindicação 50, 59 ou 60, em que a proteína de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
62. Proteína de ligação da reivindicação 61, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
63. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF), a proteína de ligação compreendendo: (i) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade; e (ii) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade, em que as regiões de determinação de complementaridade da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação que se liga a HGF humano reduzido.
64. Proteína de ligação da reivindicação 63, em que a proteína de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
65. Proteína de ligação da reivindicação 64, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
66. Proteína de ligação da reivindicação 63, em que as regiões de determinação de complementaridade estão interpostas entre regiões estruturais.
67. Proteína de ligação da reivindicação 63, em que a cadeia pesada de imunoglobulina é de IgG1.
68. Proteína de ligação da reivindicação 63, em que a proteína de ligação se liga a HGF humano contendo uma substituição de cisteína por arginina na posição 561 ou uma substituição de glicina por glutamato na posição 555.
69. Proteína de ligação da reivindicação 63, em que a proteína de ligação se liga a cadeia α de HGF humano.
70. Proteína de ligação da reivindicação 63, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende pelo menos uma re- gião de determinação de complementaridade (CDR) selecionada do grupo que consiste em CDRL1, CDRL2 e CDRL3, em que CDRu compreende a seqüência de aminoácidos X1 X2 Ser X4 X5 Xe X7 Xe X9 X10 Xn X12 X13 X14 X15, em que o aminoácido X1 é Arg ou Lys, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu ou Gln, X5 é Asn1 Ser, ou Asp, Xe é Ile ou VaL, X7 é Tyr, Asp, ou Lys, Xe é uma ligação peptídica ou Tyr, Xg é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, Xn é uma ligação peptídica ou Asn, X12 é uma ligação peptídica ou Ser, X13 é Asn ou Tyr, Xi4 é Ile ou Leu, Xi5 é Ala, Asn, ou Ser, em que CDRl2 compreende a seqüência de aminoácidos X16 X17 X18 X19 Leu X2i X22, em que o aminoácido Xi6 é Ala, Asp, Val, ou Arg, X17 é Ala ou Vai, Xi8 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, ou He, X21 é Ala, Glu, Vai, ou Pro, X22 é Asp ou Ser e em que CDRL3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, em que o aminoácido X23 é Leu ou Gln, X24 é His ou Gln, X25 é Phe, Ser, ou Tyr, X26 é Asp, lie, ou Trp, X27 é Gly ou Glu, X2e é Asp, Phe, ou Thr, X30 é Phe, Pro, ou Tyr.
71. Proteína de ligação da reivindicação 63 ou 70, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) selecionada do grupo que consiste em CDRH1, CDRH2 e CDRH3, em que CDRH1 compreende a seqüência de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5, em que o aminoácido Xi é Asp, Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe, Trp, ou Tyr, X4 é Ile ou Met, X5 é Asn, His, ou Ser. em que CDRH2 compreende a seqüência de aminoácidos X6 Ile Xe X9 Gly X11 Gly Xi3 Xi4 Xi5 Tyr Xi7 Xi8 X19 X20 Lys X22, em que o aminoácido X6 é Lys, Gln, ou Tyr, X8 é Gly, Ser, ou Tyr, X9 é Pro ou Ser, Xn é Asp, Gly, ou Ser, Xi3 é Asp ou Ser, X14 é Ser ou Thr, X15 é Asn ou Tyr, X17 é Asn ou Pro, X18 é Ala, Asp, Gly, ou Glu, X19 é Asn, Met, ou Ser, X20 é Phe ou Vai, X22 é 30 Asp ou Gly e em que CDRh3 compreende a seqüência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 Asp Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg ou Gln, X24 é Gly ou Leu, X25 é Asp, Gly, ou uma ligação peptídica, X26 é Gly ou uma ligação peptídica, X27 é uma ligação peptídica ou Tyr, X2e é Leu, uma ligação peptídica ou Tyr1 X29 é a Gly, Arg ou Leu, X30 é Asp, Gly ou Glu, X31 é a Tyr, Arg ou Asn, X32 é Ala, Gly ou Tyr, X33 é Met ou Phe.
72. Proteína de ligação da reivindicação 70, em que a cadeia leve de imunoglobulina compreende (i) uma CDRu que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 8 (1A3), SEQ ID N°: 28 (2F8), SEQ ID N°: 38 (3B6), SEQ ID N°: 58 (1D3), e SEQ ID N°: 68 (1F3), (ii) uma CDRL2 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 9 (1A3), SEQ ID N°: 29 (2F8), SEQ ID N°: 39 (3B6), SEQ ID N°: 59 (1D3), e SEQ ID N°: 69 (1F3), e (iii) uma CDRl3 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste de SEQ ID N°: 10 (1A3), SEQ ID N2: 30 (2F8), SEQ ID N°: 40 (3B6), 15 SEQ ID N°: 60 (1D3), e SEQ ID N2: 70 (1F3).
73. Proteína de ligação da reivindicação 72, em que as seqüências de CDR estão interpostas entre regiões de arcabouço humanas ou humanizadas.
74. Proteína de ligação da reivindicação 72, em que a região 20 variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 4 (1A3), resíduos 20-131 de SEQ ID N°: 24 (2F8), resíduos 23-129 de SEQ ID N°: 34 (3B6), resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 54 (1D3), e resíduos 21-127 de SEQ ID N°: 64 (1F3).
75. Proteína de ligação da reivindicação 71, em que a cadeia pesada da imunoglobulina compreende (i) uma CDRHi que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 5 (1A3), SEQ ID N°: 25 (2F8), SEQ ID N°: 35 (3B6), SEQ ID N9: 55 (1D3), e SEQ ID N°: 65 (1F3), (ii) uma CDRH2 que tem uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°: 6 (1A3), SEQ ID N°: 26 (2F8), SEQ ID N9: 36 (3B6), SEQ ID N2: 56 (1D3), e SEQ ID N°: 66 (1F3), e (iii) uma CDRh3 que tem uma seqüência selecionada do grupo que coN°iste em SEQ ID N°: 7 (1A3), SEQ ID N°: 27 (2F8), SEQ ID N°: 37 (3B6), SEQ ID N°: 57 (1D3), e SEQ ID N°: 67 (1F3).
76. Proteína de ligação da reivindicação 75, em que as seqüências de CDR estão interpostas entre regiões de arcabouço humanas ou humanizadas.
77. Proteína de ligação da reivindicação 75, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 2 (1A3), resíduos 20-137 de SEQ ID N°: 22 (2F8), resíduos 20-139 de SEQ ID N°: 32 (3B6), resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 52 (1D3), e resíduos 20-141 de SEQ ID N°: 62 (1F3).
78. Ácido nucléico isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve de imunoglobulina da reivindicação 63, 70, 72 ou 74.
79. Vetor de expressão que contém a seqüência de ácido nucléico da reivindicação 78.
80. Célula hospedeira que contém o vetor de expressão da reivindicação 79.
81. Ácido nucléico isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina da reivindicação 63, 71, 75 ou 77.
82. Vetor de expressão que contem a seqüência de ácido nucléico da reivindicação 81.
83. Célula hospedeira que contém o vetor de expressão da reivindicação 82.
84. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) que compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina, em que a proteína de ligação isolada compete pela ligação a HGF com pelo menos um anticorpo de referência selecionado do grupo que coN°iste em (i) um anticorpo que tem uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina dos resíduos 20-131 de SEQ ID N°: 24 (2F8) e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina dos resíduos 20-137 de SEQ ID Ne: 22 (2F8), (ii) um anticorpo que tem uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina dos resíduos 23-129 de SEQ ID N°: 34 (3B6), e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina dos resíduos 20-139 de SEQ ID N°: 32 (3B6) e (iii) um anticorpo que tem uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina dos resíduos 23-128 de SEQ ID N°: 44 (3D11) e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina dos resíduos 20-132 de SEQ ID Ne: 42 (3D11).
85. Proteína de ligação da reivindicação 84, em que a proteína de ligação se liga ao mesmo epítopo de HGF que um dos anticorpos de referência.
86. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) um kd de 4,0x10"5 s"1 ou menor.
87. Proteína de ligação da reivindicação 86, em que o kd é 3,0x10"5 s"1 ou menor.
88. Proteína de ligação da reivindicação 87, em que o kd é 2,0x10"5 S1 ou menor.
89. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) humano com Kd de 20 pM ou menor.
90. Proteína de ligação da reivindicação 89, em que o Kd é de 10 pM ou menor.
91. Proteína de ligação da reivindicação 90, em que o Kd é de 5 pM ou menor.
92. Pproteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF), em que o anticorpo se liga a HGF humano com Kd menor a 37SC do que a 25°C.
93. Proteína de ligação da reivindicação 92, em que a proteína de ligação tem um Kd menor do que 5 pM a 37°C.
94. Método de inibir ou reduzir a proliferação de uma célula tu-moral que compreende expor a célula a uma quantidade eficaz da proteína de ligação da reivindicação 1, 2, 3, 16, 28, 50, 59, 60, 63, 70, 71, 72, 74, 75, 77, 84, 86 ou 89 para reduzir ou inibir a proliferação da célula tumoral.
95. Método de inibir ou reduzir a proliferação de uma célula tumoral que compreende expor a célula a uma quantidade eficaz da proteína de ligação que inibe ou reduz a proliferação da célula tumoral, em que a proteína de ligação se liga especificamente a HGF humano, mas não reduz substancialmente a habilidade de HGF humano se ligar a c-Met.
96. Método da reivindicação 95, em que a proteína de ligação compreende a proteína de ligação da reivindicação 22, 23, 24, 34, 35, 36, 56, 57, 58, 84, 86 ou 89.
97. Método da reivindicação 94 ou 95, em que a célula tumoral é uma célula tumoral humana.
98. Método de inibir ou reduzir o crescimento do tumor em um mamífero, o método compreendendo expor o mamífero a uma quantidade eficaz da proteína de ligação da reivindicação 1, 2, 3, 16, 28, 50, 59, 60, 63, 84, 86, 89 ou 92 para inibir ou reduzir a proliferação do tumor.
99. Método de tratar um tumor em um mamífero, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz da proteína de ligação da reivindicação 1, 2, 3, 16, 28, 50, 59, 60, 63, 84, 86, 89 ou 92.
100. Método da reivindicação 98 ou 99, em que o mamífero é um humano.
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