BRPI0712344A2 - estabilização de enzimas - Google Patents

Abstract

ESTABILIZAçãO DE ENZIMAS. A presente invenção refere-se a composições detergentes líquidas que compreendem inibidores de enzimas tripeptídeos. Métodos para uso do inibidor de enzima tripeptídeo para estabilizar as composições detergentes líquidas também são fornecidos. Também são fornecidas composições detergentes líquidas nas quais o inibidor de enzima tripeptídeo inibe pelo menos o crescimento de pelo menos uma flora ou fauna microbiológica na composição detergente líquida.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ESTABILI- ZAÇÃO DE ENZIMAS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a sistemas estabilizantes de enzi- ma, bem como a métodos para uso e a composições contendo os mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Composições líquidas contendo protease são bem-conhecidas, especialmente no contexto de lavagem de roupas. Um problema comumente encontrado em tais composições líquidas contendo protease é o fenômeno de degradação através da enzima protease das enzimas secun- dárias na composição, como amilase, lipase e celulase, ou na própria protease. Como resultado, a estabilidade da enzima secundária ou da própria protease na composição líquida é afetada e a composição, conseqüentemente, tem um desempenho menos satisfatório.

Em resposta a este problema, foi proposto o uso de vários inibidores de protease ou estabilizantes. Por exemplo, referências propuseram o uso dos seguintes compostos para auxiliar na estabilização das enzimas: cloridrato de benzamidina, álcoois alifáticos inferiores ou ácidos carboxílicos, certos aldeídos de peptídeo, misturas de solventes à base de poliol e compostos de boro, sais de magnésio e/ou de cálcio (como formiato de cálcio).

Apesar do fato de que estes compostos têm sido usados com sucesso variado em composições líquidas, eles não são isentos de proble- mas. Por exemplo, eles podem ser um tanto quanto caros e/ou podem criar complicações para os formuladores, especialmente para detergentes líqui- dos. Outros inibidores ou estabilizantes são menos caros para se usar, mas não estabilizam as enzimas o suficiente. Deste modo, ainda existe uma ne- cessidade de um inibidor de protease que seja econômico, eficaz e adequa- do ao uso em uma composição líquida, como uma composição líquida para lavagem de roupas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspecto da invenção refere-se a uma composição detergen- te líquida que compreende:

(a) um tensoativo;

(b) uma enzima protease;

(c) um inibidor reversível de protease de peptídeo, sendo que o inibidor reversível de protease de peptídeo é um inibidor de enzima tripeptídeo;

(d) um ingrediente auxiliar;

em que a composição detergente líquida compreende, adicionalmente, pelo menos um dos seguintes:

(i) o inibidor reversível de protease de peptídeo tem uma cons- tante de afinidade para a enzima protease de cerca de 50 nM a cerca de 2 uM; e/ou

(ii) uma razão molar entre o inibidor reversível de protease de peptídeo e a enzima protease de cerca de 1:1 a cerca de 20:1.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para es- tabilização de enzimas em uma composição detergente líquida, em que a composição detergente líquida compreende uma ou mais enzimas protease, e em que o método compreende pelo menos a etapa de adição de uma quantidade estabilizadora eficaz de um inibidor reversível de protease de peptídeo à composição detergente líquida, em que o inibidor reversível de protease de peptídeo tem a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 3</formula>

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma composição de- tergente líquida que compreende:

(a) um tensoativo;

(b) uma enzima protease;

(c) um inibidor reversível de protease de peptídeo, em que o ini- bidor reversível de protease de peptídeo é um inibidor de enzima tripeptídeo; e

(d) um ingrediente auxiliar; em que o inibidor reversível de protease de peptídeo inibe, pelo menos, o crescimento de pelo menos uma flora ou fauna microbiológica no detergente líquido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições - Para uso na presente invenção, o termo "composi- ção detergente líquida" refere-se a qualquer composição para tratamento de roupas para lavar que não é sólida (isto é, tablete ou grânulo) ou tem forma gasosa. Exemplos de composições detergentes líquidas para lavagem de roupas incluem detergentes líquidos de lavagem de roupas para tarefas pe- sadas, destinados ao uso no ciclo de lavagem de máquinas de lavar auto- máticas, detergentes líquidos para lavagem de roupas finas e para preser- vação das cores, como aqueles adequados à lavagem de peças de vestuá- rio delicadas, por exemplo aquelas feitas de seda ou lã, seja no caso de la- vagem à mão ou no ciclo de lavagem de máquinas de lavar automáticas. As composições correspondentes tendo consistência fluível porém mais rígida, conhecidas como géis, são da mesma forma abrangidas. Outras composi- ções para tratamento de roupas para lavar sob a forma de líquido ou gel a- brangidas na presente invenção incluem concentrados diluíveis das compo- sições anteriormente mencionadas, composições para tratamento de roupas para lavar sob a forma de dose unitária, de aspersão, de pré-tratamento (in- clusive bastão de gel rígido) e de enxágüe, ou outras formas embaladas destas composições, por exemplo, aquelas vendidas em garrafas, potes ou sachês de álcool polivinílico, dotados de um ou dois compartimentos, e simi- lares. As composições da presente invenção adequadamente têm uma reo- logia suficientemente fluida para que possam ser dosadas ou pelo consumi- dor, ou por sistemas de dosagem automática controlados por eletrodomésti- cos de lavagem de roupas para uso doméstico ou comercial. As formas de gel rígido podem ser usadas como produtos para pré-tratamento ou reforça- dores, vide por exemplo US20040102346A1, ou podem ser dispensadas em sistemas de dispensação automática, por exemplo mediante a dissolução local, na presença de um fluxo de água.

Em geral, as composições da presente invenção podem ser iso- trópicas ou não-isotrópicas. Entretanto, elas geralmente não se dividem em camadas separadas, como detergentes com separação de fases descritos na técnica. Uma composição ilustrativa é não-isotrópica, e, durante o arma- zenamento, ela pode ser (i) isenta de divisão em duas camadas ou, (ii) se a composição se divide em camadas, uma única camada principal está pre- sente e compreende ao menos cerca de 90%, em peso, mais especifica- mente, mais que cerca de 95%, mais especificamente ainda, mais que cerca de 99% da composição. Outras composições ilustrativas são completamente isotrópicas.

"Gel", para uso na presente invenção, inclui um gel cuja viscosi- dade diminui sob cisalhamento, com uma viscosidade em escoamento na faixa de 1.000 a 5.000 mPa.s (miliPascal segundos), mais especificamente, menor que 3.000 mPa.s, mais especificamente ainda, menor que 1.500 mPa.s. Os géis incluem líquidos viscosos. Mais especificamente, um líquido viscoso pode ser um fluido Newtoniano, que não sofre alteração de viscosi- dade com a alteração na condição de fluxo, como mel ou xarope. Este tipo de líquido viscoso tem dispensação muito difícil e trabalhosa. Um tipo dife- rente de gel líquido é aquele cuja viscosidade diminui sob cisalhamento, isto é, o mesmo é viscoso sob baixo cisalhamento (por exemplo, em repouso) e ralo a altas taxas de fluxo. A reologia dos géis cuja viscosidade diminui sob cisalhamento é descrita com mais detalhes na literatura; vide, por exemplo, W004027010A1 Unilever.

Outras composições ilustrativas, de acordo com a presente in- venção, são géis derramáveis que têm, especificamente, uma viscosidade de pelo menos 1.500 mPa.s, mas não mais que 6.000 mPa.s, mais especifi- camente, não mais que 4.000 mPa.s, mais especificamente ainda, não mais que 3.000 mPa.s e, mais especificamente ainda, não mais que 2.000 mPa.s.

Ainda outras composições ilustrativas, de acordo com a presen- te invenção, são géis não-derramáveis que têm, especificamente, uma vis- cosidade de pelo menos 6.000 mPa.s, mas não mais que 12.000 mPa.s, mais especificamente, não mais que 10.000 mPa.s, mais especificamente ainda, não mais que 8.000 mPa.s e, mais especificamente ainda, não mais que 7.000 mPa.s.

Composições ilustrativas específicas para tratamento de roupas para lavar sob a forma de líquido ou gel, da presente invenção, incluem de- tergentes líquidos de lavagem de roupas para tarefas pesadas para uso em ciclos de lavagem de máquinas de lavar automáticas e detergentes líquidos para roupas finas e/ou para preservação das cores. Estes, adequadamente, têm as seguintes características reológicas: viscosidade de não mais que 1.500 mPa.s, mais especificamente, não mais que 1.000 mPa.s, ainda mais especificamente, não mais que 500 mPa.s. Em uma modalidade, estas composições têm uma viscosidade de 30 a 400 mPa.s e são ou Newtonia- nas ou sua viscosidade diminui sob cisalhamento. Nestas definições, e ex- ceto quando especificamente indicado em contrário, todas as viscosidades declaradas são aquelas medidas a uma taxa de cisalhamento de 21 s"1, e a uma temperatura de 25°C. A viscosidade pode, na presente invenção, ser medida com qualquer instrumento adequado, por exemplo, um reômetro Carrimed CSL2, a uma taxa de cisalhamento de 21 s"1.

Inibidor reversível de protease de peptídeo - As enzimas estabi- lizantes da presente invenção compreendem um inibidor reversível de pro- tease de peptídeo, sendo que o inibidor reversível de protease de peptídeo tem uma constante de afinidade para a enzima protease de cerca de 50nM a cerca de 2uM; e/ou a razão molar entre o inibidor reversível de protease de peptídeo e a enzima protease é de cerca de 1 : 1 a cerca de 20 : 1

Em uma modalidade, o inibidor reversível de protease de peptí- deo é um inibidor de enzima tripeptídeo. Por inibidor de enzima tripeptídeo, entende-se um composto que compreende três aminoácidos ou seus deri- vados que podem ser substituídos ou não-substituídos. Um inibidor de en- zima tripeptídeo ilustrativo tem a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 6</formula>

Fórmula I

Na Fórmula I, A é uma porção ácido diamino, mais especifica- mente, a porção ácido diamino é uma combinação de dois aminoácidos se- lecionados a partir de alanina (Ala), arginina (Arg)1 asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp)1 cisteina (Cys), glutamina (Gln), ácido glutâmico (GIu), glicina (GIy)1 histidina (His), homofenilalanina (HPhe), isoleucina (lie), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), fenilglicina (PGIy), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e valina (Vai).

Em uma modalidade, A compreende duas dentre: alanina, glici- na, leucina, valina, isoleucina, prolina, lisina, fenilalanina, homofenilalanina, fenilglicina, triptofano, glicina, arginina, metionina e combinações das mes- mas, mais especificamente ainda, valina e alanina.

A porção ácido diamino pode ser qualquer isômero óptico ade- quado, ou seja, a porção ácido diamino pode ser opticamente ativa tanto em uma configuração em L como em D1 ou combinações das mesmas, pode ser opticamente inativa, ou pode ser uma mistura racêmica. Semelhantemente, os aminoácidos individuais que compreendem a porção ácido diamino e/ou o inibidor reversível de protease de peptídeo podem ser opticamente ativos tanto em uma configuração em L como em D, ou combinações das mesmas, podem ser opticamente inativos, ou podem ser uma mistura racêmica.

Na fórmula I, X é H, um grupo receptor de elétrons e misturas dos mesmos. Alguns exemplos não-limitadores de grupos removedores de elétrons adequados incluem, mas não se limitam a, CF2H, CH2F, CF2-R CHF-R, CO2-R, CH2C1, imidazóis substituídos ou não-substituídos, tioamida- zóis substituídos ou não-substituídos, benzimidazóis substituídos ou não- substituídos, e misturas dos mesmos, em que R é selecionado do grupo consistindo em alquilas 1-C6 lineares ou ramificadas, substituídas ou não- substituídas; e porções de cicloalquila C4-C8 lineares ou ramificadas, substi- tuídas ou não-substituídas; e misturas dos mesmos.

Na fórmula I, Z é uma porção terminal N selecionada a partir de:

<formula>formula see original document page 7</formula>

e misturas dos mesmos, mais especificamente, <formula>formula see original document page 8</formula>

e misturas dos mesmos; e, mais especificamente ainda,

<formula>formula see original document page 8</formula>

e misturas dos mesmos.

R' é independentemente selecionado a partir de uma alquila Ci - C6 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; uma fenila; uma al- quil arila C7-C9 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; uma por- ção cicloalquila C4-C8 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; e misturas dos mesmos, mais especificamente, uma alquila C1-C6 linear ou ramificada; uma fenila; uma alquil arila C7-C9 linear ou ramificada; e misturas dos mesmos, e, mais especificamente ainda, uma alquila C1-C6 linear ou ramificada; um alquil heterocíclico C5-C9 linear ou ramificado, substituído ou não-substituído; e misturas dos mesmos.

Alguns exemplos não-limitadores ilustrativos de inibidores de enzima tripeptídeo adequados são:

<formula>formula see original document page 8</formula>

e misturas dos mesmos.

O inibidor reversível de protease de peptídeo pode ser produzido de qualquer maneira adequada. Exemplos ilustrativos de um processo ade- quado para a produção do inibidor reversível de protease de peptídeo pode ser encontrado na Patente U.S. n° 6.165.966.

Em uma modalidade, a composição compreende de cerca de 0,00001% a cerca de 5%, especificamente, de cerca de 0,00001% a cerca de 3%, mais especificamente, de cerca de 0,00001% a cerca de 1%, em peso da composição, de inibidor reversível de protease de peptídeo.

Constante de afinidade - Em uma modalidade o inibidor reversí- vel de protease de peptídeo tem uma constante de afinidade para a enzima protease de cerca de 50 nM a cerca de 2 uM, especificamente, de cerca de 100 nM a cerca de 1 uM. A constante de afinidade do inibidor da enzima protease é o produto da concentração de enzimas livres e a concentração de inibidor livre, dividido pela concentração do complexo de enzima ou inibidor.

Sem se ater à teoria, acredita-se que um inibidor reversível de protease de peptídeo com uma constante de afinidade maior que cerca de 2uM tem uma força de ligação insuficiente para se ligar à protease e, con- seqüentemente, evita que a protease se degrade ou degrade qualquer outra enzima presente. De modo inverso, um inibidor reversível de protease de peptídeo com uma constante de afinidade menor que cerca de 50nM tem uma afinidade muito forte com a protease, de modo que, quando o deter- gente líquido é diluído sob condições de lavagem típicas (isto é, quando o detergente é adicionado a uma lavagem de roupas), o inibidor reversível de protease de peptídeo não irá liberar a protease o suficiente para atingir o desempenho desejado. Descobriu-se, surpreendentemente, que um inibidor reversível de protease de peptídeo com uma constante de afinidade entre estas faixas, especificamente de cerca de 50nM a cerca de 2uM, tem força suficiente para se ligar a uma protease antes do uso (estabilizando, deste modo, a protease), e sob diluição (quando a composição líquida é adiciona- da a uma solução de lavagem típica), a enzima protease é reativada à me- dida que o inibidor reversível de protease de peptídeo se dissipa da enzima protease.

Determinação da Constante de Afinidade do Inibidor Reversível de Peptídeo para uma Enzima Protease A constante de afinidade de um inibidor para uma protease pode ser determinada misturando-se a enzima protease e o inibidor reversível de protease de peptídeo juntos em um cadi- nho contendo 1 mL de um tampão de fosfato de potássio de 50 mM com 8 de pH, sob temperatura e pressão ambientes, isto é, 25°C e 1 atmosfera. A enzima protease é usada em uma concentração de 20 nM e o inibidor rever- sível de protease de peptídeo a uma concentração de 4,2 μΜ. (ou 0 μΜ para a referência) A quantidade de protease ativa é medida mediante a adição de um substrato, especificamente, succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilina. O aumento da densidade óptica à 410 nm é medida durante um intervalo de seis segundos, começando dentro de quinze segundos após a adição do substrato, usando-se um espectrofotômetro como um Beckman DU-70. As medições foram executadas em diferente concentrações de substrato, es- pecificamente 400, 200, 100, e 50 pg/rnL. Os resultados foram marcados em um gráfico de Lineweaver-Burk, com o inverso da velocidade de reação marcado em uma posição oposta ao inverso da concentração de substrato. O coeficiente angular é determinado e comparado ao coeficiente angular de um gráfico similar de experimentos de controle executados na ausência do inibidor. A razão entre o coeficiente angular na presença de inibidor e o coe- ficiente angular na ausência de inibidor reversível de protease de peptídeo é igual a (1 + [l]/Ki) onde [I] é a concentração de inibidor e Ki é a constante de afinidade para o inibidor e a protease.

Razão molar - Em uma modalidade alternativa, o inibidor rever- sível de protease de peptídeo e a enzima protease estão presentes nas composições detergentes líquidas a uma razão molar entre cerca de 1:1 a cerca de 20:1, especificamente de cerca de 1:1 a cerca de 10:1.

Enzima Protease - As composições e os métodos da presente invenção compreendem uma ou mais enzimas protease. Em uma modalida- de, as composições e os métodos da presente invenção incluem uma enzi- ma protease de cerca de 0,0001% a cerca de 5%, especificamente, de cer- ca de 0,001% a cerca de 2%, mais especificamente, de cerca de 0,001% a cerca de 1%, mais especificamente ainda, de cerca de 0,001% a cerca de 0,2%, mais especificamente ainda, de cerca de 0,005% a cerca de 0,1%, em peso da composição detergente, de uma enzima protease.

Qualquer protease adequada ao uso em detergentes pode ser usada. Tais proteases podem ser de origem animal, vegetal ou microbiana, tanto com proteases modificadas (química ou geneticamente variantes) e não-modifiçadas incluídas.

Uma classe de proteases adequadas é a classe das assim cha- madas serina endopeptidases [E.C. 3.4.21], um exemplo das quais é a pro- tease de serina [E.C. 3.4.21.62], Alguns exemplos ilustrativos não- limitadores de protease de serina são subtilisinas, por exemplo subtilisinas derivadas de bacilo (por exemplo, B. subtilis, B. lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. alcalophilus), por exemplo, subtilisinas BPN e BPN', subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147, subtilisina 168, subtilisi- na PB92, suas mutações e misturas das mesmas.

Alguns exemplos ilustrativos não-limitadores de proteases de serina comercialmente disponíveis são Alcalase®, Savinase®, Kannase®, Everlase®, disponíveis junto à Novozymes; Purafect®, Purastar OxAm®, Properase®, disponíveis junto à Genencor; BLAP e variantes de BLAP, dis- poníveis junto à Henkel; e proteases similares a protease K-16, disponíveis junto à KAO. Proteases adicionais ilustrativas são descritas, por exemplo, em EP130756, W091 /06637, W095/10591, W099/20726, US 5030378 (Protease "A") e EP251446 (Protease "B").

Solventes Orgânicos à Base de Poliol - Em uma modalidade, a composição detergente líquida e os métodos da presente invenção podem compreender menos que cerca de 5%, em peso da composição detergente, especificamente menos que cerca de 3%, em peso da composição deter- gente, mais especificamente, menos que cerca de 1%, em peso da compo- sição detergente, mais especificamente ainda, é substancialmente isenta de solventes orgânicos à base de poliol. Por "substancialmente isenta de sol- ventes orgânicos à base de poliol" entende-se que, mais especificamente, nenhum solvente orgânico à base de poliol é propositalmente adicionado à formulação, mas também, o versado na técnica compreende que traços de solventes orgânicos à base de poliol podem estar presentes como impure- zas ou como auxiliares no processo ou na estabilização de outros aditivos, isto é, a composição contém menos que cerca de 0,1% em peso da compo- sição, de solventes orgânicos à base de poliol.

Por "solventes orgânicos à base de poliol", entende-se solventes orgânicos de baixo peso molecular, compostos por átomos de carbono, oxi- gênio e hidrogênio, e que compreendem 2 ou mais grupos hidroxila, como etanodiol, 1,2 e 1,3 propanodiol, glicerol, glicóis e éteres de glicol, sorbitol, manitol, 1,2 benzenodiol, e misturas do mesmos. Esta definição abrange especialmente os dióis, especialmente os dióis vicinais que são capazes de formar complexos com ácido bórico e borato para produzir ésteres de borato.

Estes solventes orgânicos à base de poliol foram usados no passado em combinação com derivados de ácido bórico como um sistema estabilizante de enzima protease. A seleção de um inibidor reversível de protease de peptídeo com uma constante de afinidade da enzima protease de cerca de 50nM a cerca de 2uM, significa que o uso destes solventes or- gânicos à base de poliol pode ser reduzido, economizando assim, dinheiro e tempo.

Derivados de ácido bórico - Em outra modalidade, as composi- ções e os métodos da presente invenção podem compreender menos que cerca de 5%, em peso da composição detergente, especificamente menos que cerca de 3%, em peso da composição detergente, mais especificamen- te, menos que cerca de 1%, em peso da composição detergente, mais es- pecificamente ainda, é substancialmente isenta de derivados de ácido bóri- co. Por "substancialmente isenta de derivados de ácido bórico" entende-se que, mais especificamente, nenhum derivado de ácido bórico é proposital- mente adicionado à formulação, mas também, o versado na técnica com- preende que traços de derivados de ácido bórico podem estar presentes como impurezas ou como auxiliares no processo e na estabilização em ou- tros aditivos, isto é, a composição contém menos que cerca de 0,1%, em peso da composição, de derivados de ácido bórico.

Por "derivados de ácido bórico" entende-se compostos contendo boro como ácido bórico em si, ácidos bóricos substituídos e outros derivados de ácido bórico, que estão, pelo menos em parte, presentes na solução co- mo ácido bórico ou um equivalente químico do mesmo, como um ácido bóri- co substituído. Alguns exemplos ilustrativos mas não-limitadores de deriva- dos de ácido bórico são: ácido bórico, óxido bórico, bórax, boratos de metal alcalino (como orto, meta e piroborato de sódio e pentaborato de sódio), e misturas dos mesmos.

Conforme observado aqui, estes derivados de ácido bórico fo- ram usados no passado em combinação com solventes orgânicos à base de poliol como um sistema estabilizante de enzima protease. A seleção de um inibidor reversível de protease de peptídeo, com uma constante de afinidade da enzima protease de cerca de 50nM a cerca de 2uM, significa que o uso destes derivados de ácido bórico pode ser reduzido, economizando assim, dinheiro e tempo.

Tensoativos - Em uma modalidade, a composição detergente líquida da presente invenção pode conter um ou mais agentes ativos de su- perfície (tensoativos). O tensoativo pode ser selecionado a partir de tensoa- tivos aniônicos, não-iônicos, catiônicos, anfotéricos, zwitteriônicos e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, detergentes tensoativos para uso na presente invenção são misturas de tensoativos aniônicos e não-iônicos, po- rém, deve-se compreender que qualquer tensoativo pode ser usado sozinho ou em combinação com qualquer outro tensoativo ou tensoativos. Quando presente na composição detergente concentrada, o tensoativo pode com- preender, de cerca de 0,1% a cerca de 70%, mais especificamente, de cer- ca de 1% a cerca de 50%, em peso, da composição detergente líquida.

Exemplos ilustrativos de tensoativos aqui utilizáveis são descri- tos na patente U.S. N0 3.664.961, patente U.S. n° 3.919.678, patente U.S. n° 4.062.647, patente U.S. n° 4.316.812, patente U.S. n° 3.630.929, patente U.S. n° 4.222.905, patente U.S. n° 4.239.659, patente U.S. n° 4.497.718; patente U.S. n° 4.285.841, patente U.S. n° 4.284.532, patente U.S. n° 3.919.678, patente U.S. n° 2.220.099 e patente U.S. n° 2.477.383. Os ten- soativos são geralmente bem-conhecidos, sendo descritos com mais deta- lhes na Encyclopedia of Chemical Technology, de Kirk Othmer, 3a. Ed., Vo- lume 22, páginas 360 a 379, "Surfactants and Detersive Systems", Deter- gents & Emulsifiers, de McCutcheon, pela M.C. Publishing Co., (Edição nor- te-americana 1997), Surface Active Agents, Their Chemistry and Techno- logy, de Schwartz, et al., New York, EUA.: Interscience Publishers, 1949; e informações e exemplos adicionais são dados em "Surface Active Agents and Detergents" (Volumes I e II de Schwartz, Perry and Berch).

O tensoativo não-iônico, quando presente na composição deter- gente líquida, pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 70%, mais especificamente, de cerca de 1% a cerca de 50%, mais especificamente ainda, de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso da com- posição detergente líquida. Exemplos ilustrativos de tensoativos não-iônicos adequados são: etoxilatos de álcool (por exemplo, Neodol 25-9, disponível junto à Shell Chemical Co.), etoxilatos de alquil fenol (por exemplo, Tergitol NP-9, disponível junto à Union Carbide Corp.), alquil poliglicossídeos (por exemplo, Glucapon 600CS, disponível junto à Henkel Corp.), glicóis de poli- óxi-etilenado e polióxi propileno (por exemplo Pluronic L-65, disponível junto à BASF Corp.), ésteres de sorbitol (por exemplo Emsorb 2515, disponível junto à Henkel Corp.), ésteres de sorbitol polióxi-etilenado (por exemplo, Emsorb 6900, disponível junto à Henkel Corp.), alcanolamidas (por exemplo Alkamide DC212/SE, disponível junto à Rhone Poulenc Co.), e N- alquipirro- lidonas (por exemplo Surfadone LP-100, disponível junto à ISP Technologies Inc.); e combinações dos mesmos.

O tensoativo aniônico, quando presente na composição deter- gente líquida, pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 70%, mais especificamente de cerca de 1% a cerca de 50%, mais especificamente ainda de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso da compo- sição detergente líquida. Exemplos ilustrativos de tensoativos aniônicos a- dequados são: sulfonatos de alquil benzeno linear (por exemplo, Vista C- 500, comercialmente disponível junto à Vista Chemical Co.), sulfonatos de alquil benzeno linear ramificados (por exemplo, MLAS), sulfatos de alquila (por exemplo, Polystep B-5, comercialmente disponível junto à Stepan Co.), sulfatos de alquila ramificados, sulfatos de alquila de polióxi-etilenado (por exemplo, Standapol ES-3, disponível comercialmente junto à Stepan Co.), sulfonatos de alfa olefinas (por exemplo, Witconate AOS, disponível comer- cialmente junto à Witco Corp.), alfa sulfo metil ésteres (por exemplo, Alpha- Step MCp-48, disponível comercialmente junto à Stepan Co.) e isetionatos (por exemplo, Jordapon Cl, disponível comercialmente junto à PPG Industri- es Inc.), e combinações dos mesmos.

O tensoativo catiônico, quando presente na composição deter- gente líquida, pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 70%, mais especificamente, de cerca de 1% a cerca de 50%, mais especificamente ainda, de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso da com- posição detergente líquida. Tensoativos catiônicos específicos incluem hale- tos de alquil dimetil amônio C8-C18 e análogos em que uma ou duas por- ções de hidroxietil substituem uma ou duas porções de metil.

O tensoativo anfotérico, quando presente na composição deter- gente líquida, pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 70%, mais especificamente, de cerca de 1% a cerca de 50%, mais especificamente ainda, de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso da com- posição detergente líquida. Exemplos de tensoativos anfotéricos são: 3(dodecilamino)proprionato de sódio, 3-(dodecilamino)propano-1-sulfonato de sódio, 2-(dodecilamino)etilsulfato de sódio, 2-(dimetilamino) octadeca- noato de sódio, 3-(N-carboximetildodecilamino)propano 1- sulfonato de dis- sódio, octadecila-iminodiacetato de dissódio, 1-carboximetil-2- undecilimida- zol de sódio, e N,N-bis(2-hidroxietil)-2-sulfato-3- dodecoxipropilamina de sódio.

O tensoativo zwitteriônico, quando presente na composição de- tergente líquida, pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 70%, mais especificamente, de cerca de 1% a cerca de 50%, mais especificamente ainda, de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso da composição detergente líquida.

Enzima não-protease - As composições e os métodos da pre- sente invenção podem incluir uma enzima não-protease, especificamente, de cerca de 0,00001% a cerca de 2%, mais especificamente, de cerca de 0,0005% a cerca de 1%, mais especificamente ainda, de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, em peso da composição detergente, de uma enzima não- protease.

As enzimas não-protease podem ser incluídas em quantidades eficazes na composição de limpeza líquida para lavagem de roupas da pre- sente invenção para uma ampla variedade de propósitos de lavagem de te- cidos, inclusive para remoção de manchas baseadas em proteína, carboi- drato ou triglicerídeo, por exemplo, e/ou para a restauração de tecidos.

Exemplos de enzimas não-protease adequadas incluem, mas não se limitam a, hemicelulases, peroxidases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, pectato liases, queratanases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, mananases, β-glucanases, arabinosi- dases, hialuronidase, condroitinase, lacases, amilases e combinações dos mesmos. Outros tipos de enzimas também podem ser incluídos. Estes po- dem ser de qualquer origem adequada, como origem vegetal, animal, bacte- riana, fúngica e de levedura. No entanto, sua escolha é orientada por diver- sos fatores como atividade e/ou estabilidade de pH ótima, estabilidade tér- mica e estabilidade em relação os detergentes ativos, builders e outros.

Uma combinação potencial de enzimas, além da protease, com- preende uma mistura de enzimas detersivas convencionais como lipase, cutinase, celulases e/ou amilase. As enzimas detersivas são descritas com mais detalhes na patente U.S. n° 6.579.839 e em W001/02530.

Uma lista não-limitadora de enzimas não-protease adequadas disponíveis comercialmente inclui: amilases (a e/ou β) descritas na WO 94/02597 e na WO 96/23873. Exemplos disponíveis comercialmente são Purafect Ox Am® [Genencor] e Termamyl®, Natalase®, Ban®, Fungamyl® e Duramyl® [todos disponíveis junto à Novozymes]. Celulases incluem celu- lases bacterianas ou fúngicas, por exemplo aquelas produzidas por Humico- la insolens, particularmente DSM 1800, por exemplo, 50Kda e ~43kD [Ca- rezyme®]. São adequadas, também, as celulases EGIII de Trichoderma Ion- gibrachiatum. As lipases adequadas incluem aquelas produzidas pelos gru- pos Pseudomonas e Chromobacter. São preferenciais, por exemplo, Lipola- se®, Lipolase Ultra®, Lipoprime® e Lipex® da Novozymes. São adequadas, também, as cutinases [EC 3.1.1.50] e esterases. São adequados, também, carboidrases, por exemplo, mananase (US6060299), pectato Iiase (W099/27083) ciclomaltodextrina glucanotransferase (W096/33267) xiloglu- canase (W099/02663). As enzimas alvejantes incluem, por exemplo, pero- xidases, lacases, oxigenases, (por exemplo, catecol 1,2 dioxigenase, Iipoxi- genase (WO 95/26393), e haloperoxidases (não-heme).

Ingredientes auxiliares - As composições e os métodos da pre- sente invenção podem incluir um ingrediente auxiliar, especificamente de cerca de 0,0001% a cerca de 95%, mais especificamente, de cerca de 0,001% a cerca de 70%, em peso da composição detergente, de um ingre- diente auxiliar.

Em uma modalidade da presente invenção, o ingrediente auxiliar pode ser selecionado de builders, abrilhantadores, inibidores de transferên- cia de corantes, quelantes, polímeros de poliacrilato, agentes dispersantes, corantes, corantes tonalizantes, perfumes, elementos auxiliares ao proces- samento, aditivos de alvejamento, ativadores de alvejamento, precursores de alvejante, catalisadores de alvejamento, solventes, co-solventes, hidró- tropos, carreador líquido, estabilizantes de fase, polímeros para liberação de sujeiras, estabilizantes de enzimas, enzimas, agentes de suspensão de su- jeiras, agentes anti-redeposição, polímeros defloculantes, bactericidas, fun- gicidas, absorvedores de UV, agentes antiamarelamento, antioxidantes, a- brilhantadores ópticos, supressores de espuma, opacificantes, reforçadores de espuma, agentes anti-corrosão, seqüestradores de radicais, seqüestran- tes de cloro, estruturantes, aditivos amaciantes de tecidos, outros agentes de benefício para tratamento de tecidos, agentes de ajuste de pH, agentes branqueadores fluorescentes, argilas esmectitas, agentes estruturantes, conservantes, espessantes, agentes colorantes, aditivos amaciantes de te- cidos, modificadores de reologia, enchimentos, germicidas e misturas dos mesmos. Outros exemplos de ingredientes auxiliares adequados e teores de uso são descritos na patente U.S. n° 3.936.537, concedida em 3 de Feverei- ro de 1976 a Baskerville, Jr. et al.; patente U.S. n° 4.285.841, Barrat et al., concedida em 25 de Agosto de 1981; patente U.S. n° 4.844.824 Mermelstein et al., concedida em 4 de Julho de 1989; patente U.S. n° 4.663.071, Bush et al.; patente U.S. n° 4.909.953, Sadlowski, et al., concedida em 20 de Março de 1990; patente U.S. n° 3.933.672, concedida em 20 de Janeiro de 1976 a Bartoletta et al.; patente U.S. n° 4.136.045, concedida em 23 de janeiro de 1979 a Gault et al; patente U.S. n° 2.379.942; patente U.S. n° 3.308.067; patente U.S. n° 5.147.576 concedida a Montague et al; patente britânica n° 1.470.250; patente britânica n° 401.413 concedida a Marriott; patente britâ- nica n° 461.221 concedida a Marriott and Guam; patente britânica n° 1.429.143; e patente U.S. n° 4.762.645, Tucker et al, concedida em 9 de Agosto de 1988).

Alguns exemplos não-limitadores de alguns ingredientes auxilia- res possíveis são descritos a seguir.

Aditivos de alvejamento exemplificadores incluem alvejantes como peróxido de hidrogênio, perborato, percarbonato ou peroxiácidos co- mo ácido 6-ftalimido peróxi hexanóico e misturas dos mesmos.

Quelantes adequados são ácido S,S-etilenodiamina dissuccínico (EDDS), Tiron® (também conhecido como Catecol-2,5-dissulfonato como o sal solúvel em ácido ou água), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pen- tacetato de dietilenotriamina (DTPA), ácido 1-hidroxietilideno-1,1-difosfônico (HEDP), ácido dietileno triamina pentametileno fosfônico (DTPMP), ácidos e sais dipicolínicos e/ou ácidos dos mesmos, e misturas dos mesmos. Outros exemplos de agentes quelantes e teores de uso adequados são descritos nas patentes U.S. n° 3.812.044, 4.704.233, 5.292.446, 5.445.747, 5.531.915, 5.545.352, 5.576.282, 5.641.739, 5.703.031, 5.705.464, 5.710.115, 5.710.115, 5.712.242, 5.721.205, 5.728.671, 5.747.440, 5.780.419, 5.879.409, 5.929.010, 5.929.018, 5.958.866, 5.965.514, 5.972.038, 6.172.021 e 6.503.876.

Exemplos de builders adequados que podem ser usados inclu- em fosfatos, polifosfatos, boratos, silicatos e carbonatos de metal alcalino solúveis em água; amino policarboxilatos solúveis em água; sabões de ácido graxo; sais de ácido fítico solúveis em água; policarboxilatos; zeólitos ou a- luminossilicatos, e combinações dos mesmos. Exemplos específicos destes são: trifosfatos de sódio e potássio, pirofosfatos, ortofosfatos, hexametafos- fatos, tetraboratos, silicatos e carbonatos; sais de ácido melítico solúveis em água, ácido cítrico, e ácido carbóxi metil óxi succínico, sais de polímeros de ácido itacônico e ácido maléico, tartarato monossuccinato, tartarato dissuc- cinato; e misturas dos mesmos. Outro ingrediente auxiliar opcional é um espessante. Exemplos ilustrativos de espessantes incluem modificadores de reologia, estruturantes e combinações dos mesmos. Exemplos ilustrativos de estruturantes aqui utilizáveis incluem metil celulose, hidróxi propil metil celulose, disponível sob o nome comercial Methocel®, junto a Dow Chemical, goma de xantano, go- ma gelana, goma guar e hidróxi propil goma guar, succinoglicano e triidróxi estearina. Outros exemplos ilustrativos de estruturantes são os estruturantes não-poliméricos hidroxifuncionais. Um estruturante é incorporado em uma composição para estabelecer características reológicas desejadas em um produto líquido. Quando presentes, estes compostos auxiliares opcionais estão presentes nas composições em teores que fornecem as característi- cas desejadas, especificamente de cerca de 0,01% a cerca de 1%, em pe- so, mais especificamente, de cerca de 0,015% a cerca de 0,75%, em peso, mais especificamente ainda, de 0,02% a 0,5%, em peso da composição da presente invenção.

O estruturante não-polimérico hidroxifuncional é selecionado de materiais hidroxifuncionais cristalinos não-poliméricos que podem formar sistemas estruturantes filamentares por toda a matriz líquida, quando eles são cristalizados in situ dentro da matriz. Esses materiais podem ser carac- terizados, geralmente, como ácidos graxos, ésteres graxos ou ceras graxas cristalinas, contendo hidroxila. Exemplos ilustrativos e não-limitadores espe- cíficos de estruturantes contendo hidroxila incluem óleo de rícino e seus de- rivados. Mais especificamente, derivados de óleo de rícino hidrogenado co- mo óleo de rícino hidrogenado e cera de rícino hidrogenada. Estruturantes à base de óleo de rícino cristalinos, contendo hidroxila e disponíveis comerci- almente incluem THIXCIN®, disponível junto a Rheox, Inc. Vide, também, a patente U.S. n° 6.080.708 e a Publicação PCT n0 WO 02/40627. Outro es- truturante comercialmente disponível é o 1,4-di-O-benzil-D-Treitol em suas formas R,R e S,S, e quaisquer misturas, opticamente ativas ou não.

As composições detergentes da presente invenção podem, tam- bém, opcionalmente conter baixos teores de materiais que servem como estabilizantes de fase e/ou co-solventes para as composições líquidas da presente invenção. Materiais desse tipo incluem alcanóis C1-C3 inferiores, como metanol, etanol e/ou propanol. As alcanolaminas C1-C3 inferiores, co- mo mono, di e trietanolaminas também podem ser usados, por si só ou em combinação com os alcanóis inferiores. Se presentes, estabilizantes de fa- se/co-solventes podem, opcionalmente, compreender de cerca de 0,1% a cerca de 5,0%, em peso das composições da presente invenção.

Carreador líquido - As composições líquidas de limpeza, de a- cordo com a presente invenção, podem conter, também, um carreador líqui- do. Tipicamente, a quantidade de carreador líquido quando presente nas composições da presente invenção, será relativamente grande, freqüente- mente compreendendo o equilíbrio da composição para limpeza, mas pode compreender de cerca de 5% a cerca de 85%, em peso, da composição para limpeza. Em uma modalidade são usados baixos teores de carreador líquido, de 5% a 20%, em peso da composição para limpeza.

Em outra modalidade, as composições podem compreender pe- lo menos cerca de 60%, mais especificamente pelo menos cerca de 65%, mais especificamente ainda pelo menos cerca de 70%, ainda mais especifi- camente ainda pelo menos cerca de 75%, em peso da composição para limpeza do carreador líquido.

O tipo de carreador líquido aquoso não-ativo de superfície de mais baixo custo é, logicamente, a própria água. Em uma modalidade, a á- gua, quando presente, é selecionada de destilada, desionizada, filtrada e combinações dos mesmos. Em outra modalidade, a água pode ser não- tratada.

Estabilizante de Enzimas Adicionais Opcionais - Em uma moda- lidade opcional, estabilizantes de enzimas adicionais opcionais podem estar incluídos. Estes estabilizantes de enzimas adicionais opcionais incluem a- queles estabilizantes de enzimas conhecidos, além do inibidor reversível de protease de peptídeo aqui descrito. Exemplos ilustrativos destes estabilizan- tes de enzimas adicionais opcionais incluem qualquer sistema estabilizante conhecido como compostos de cálcio e/ou de magnésio, carboxilatos de baixo peso molecular, compostos orgânicos relativamente hidrofóbicos (isto é, determinados ésteres, éteres dialquil glicólicos, álcoois ou alcoxilatos de álcool), carboxilato de éter alquílico em adição a uma fonte de íon de cálcio, hipoclorito de benzamidina, álcoois alifáticos inferiores e ácidos carboxílicos, sais de N,N-bis(carboximetil) serina, copolímero de ácido (met)acrílico-éster de ácido (met)acrílico e PEG, composto de lignina, oligômero de poliamida, ácido glicólico ou seus sais, poli hexametileno biguanida ou N,N-bis-3-amino propil-dodecil amina ou seu sal, e misturas dos mesmos. Vide, também, U.S. 3.600.319, de Gedge, et al., EP 0 199 405 A, de Venegas, e U.S. 3.519.570

Formulação da Composição Detergente Líquida - Composições detergentes líquidas podem ser preparadas através da mistura dos ingredien- tes essenciais e opcionais aqui descritos, em qualquer ordem desejada, para fornecer composições contendo componentes nas concentrações desejadas. As composições líquidas, de acordo com a presente invenção, podem tam- bém estar em "forma compacta", em tal caso, as composições detergentes líquidas, de acordo com a presente invenção, irão conter uma menor quanti- dade de água, em comparação a detergentes líquidos convencionais.

O inibidor reversível de protease de peptídeo e a enzima protea- se podem ser adicionados separadamente na composição detergente líqui- da, ou podem ser pré-misturados um com o outro antes de serem adiciona- dos à composição detergente líquida.

As composições detergentes líquidas podem ter qualquer cor ou aparência desejada, especificamente opaca, translúcida, ou transparente, como as composições da patente U.S. n° 6.630.437, concedida a Murphy et al. em 7 de Outubro de 2003. Para propósitos da invenção, contanto que um comprimento de onda na faixa de luz visível tenha uma transmitância maior que 25%, ela será considerada como transparente ou translúcida.

As composições, de acordo com a presente invenção, podem ter qualquer pH adequado, especificamente um pH de cerca de 5,5 a cerca de 11, mais especificamente de cerca de 6 a cerca de 9, mais especificamente ainda de cerca de 6 a cerca de 8,5. O pH da composição é medido como uma solução pura sob condições normais de temperatura e pressão, isto é, a 21°C e à pressão de 1 atmosfera.

Embalagem do Detergente - As composições detergentes, de acordo com a presente invenção, podem ser apresentadas ao consumidor em uma embalagem padrão, ou podem ser apresentadas em qualquer em- balagem adequada. Recentemente, garrafas com múltiplos compartimentos, contendo múltiplas formulações que são dispensadas e combinadas, têm sido usadas para composições detergentes. As composições da presente invenção podem ser formuladas para inclusão de tais embalagens. Além disso, embalagens de dose unitária também se tornaram comumente usa- das para composições detergentes. Tais embalagens também são adequa- das para uso com as composições da presente invenção. A embalagem po- de ser de qualquer cor ou aparência desejada, especificamente, opaca, translúcida, transparente, ou mesmo combinações dos mesmos. Embala- gens ilustrativas mas não-limitadoras podem ser encontradas na patente U.S. N0 6.630.437, concedida a Murphy et al. em 7 de Outubro de 2003.

Métodos de Uso - A presente invenção apresenta também um método para limpeza de tecidos. Tal método emprega o contato destes teci- dos com uma solução aquosa para lavagem formada a partir de uma quan- tidade eficaz das composições detergentes líquidas descritas anteriormente neste documento. O contato entre os tecidos e a solução de lavagem geral- mente irá ocorrer sob condições de agitação.

A agitação é tipicamente implementada em máquinas de lavar para melhorar a limpeza. A lavagem é tipicamente seguida de secagem do tecido molhado, como em uma secadora de roupas convencional, pendu- rando-as em um varal externo, num cabide de secagem interno, ou simila- res. Uma quantidade eficaz da composição detergente líquida na solução aquosa de lavagem na máquina de lavar pode ser, especificamente, de cer- ca de 500 a cerca de 10.000 ppm, mais especificamente, de cerca de 2.000 a cerca de 10.000 ppm, sob condições de lavagem européias típicas e pode ser, especificamente, de cerca de 1.000 a cerca de 3.000 ppm, sob condi- ções de lavagem americanas típicas. Nas máquinas de lavar de alta eficiên- cia (AE) mais novas nos EUA, concentrações mais altas do produto são Iibe- radas no tecido e, portanto, as cargas de sujeira e corante na solução de lavagem são ainda mais altas. A concentração do produto e os níveis de matéria-prima são, desse modo, ajustados para acomodar as alterações de condições de lavagem devidas a mudanças na máquina de lavar.

Estabilização Antibacteriana - Descobriu-se, surpreendentemen- te, que os inibidores reversíveis de protease de peptídeo da presente inven- ção também podem ser usados para estabilizar composições líquidas, espe- cificamente composições detergentes líquidas, contra ataque microbiano.

Especificamente, os inibidores reversíveis de protease de peptídeo inibem pelo menos o crescimento de pelo menos uma flora ou fauna microbiológica (também conhecidas como organismos microbiológicos) no detergente líqui- do, especificamente inibe pelo menos a contaminação do detergente líquido por pelo menos uma flora ou fauna microbiológica, mais especificamente previne o crescimento de pelo menos uma flora ou fauna microbiológica no detergente líquido. Em uma modalidade, os inibidores reversíveis de protea- se de peptídeo inibem pelo menos o crescimento de pelo menos uma bacté- ria no detergente líquido, especificamente inibe pelo menos a contaminação do detergente líquido por ao menos uma bactéria, mais especificamente previne o crescimento de pelo menos uma bactéria no detergente líquido.

Em outra modalidade, os inibidores reversíveis de protease de peptídeo ini- bem pelo menos o crescimento de pelo menos uma bactéria Gram-negativa no detergente líquido, especificamente inibem pelo menos a contaminação do detergente líquido por ao menos uma bactéria Gram-negativa, mais es- pecificamente previnem o crescimento de pelo menos uma bactéria Gram- negativa no dito detergente líquido, mais especificamente ainda produzem uma redução de 2 log de bactérias Gram-negativas no detergente líquido, ainda mais especificamente ainda uma redução de 3 log de bactérias Gram- negativas no detergente líquido. Por "inibir" entende-se que a população to- tal de pelo menos uma flora ou fauna microbiológica, especificamente bacté- rias, mais especificamente bactérias Gram-negativas, permanece aproxima- damente a mesma, ou estática. Por "flora ou fauna microbiológica" entende- se vida microbiana, como mofo, fungos, bactérias (tanto gram-negativas como gram-positivas), vírus, micróbios, príons, e similares.

Esta contaminação microbiana pode surgir de várias fontes du- rante a fabricação, como contaminantes aéreos, manuseio e eventos de contaminação cruzada, e similares. Durante o uso do consumidor, o deter- gente líquido pode ficar potencialmente contaminado a partir de várias fon- tes, como contaminantes aéreos, manuseio e eventos de contaminação cru- zada, e similares.

Os inibidores reversíveis de proteases de peptídeo fornecem pelo menos uma inibição de pelo menos um destes contaminantes microbi- anos no detergente líquido, preservando desse modo, o detergente líquido. Este benefício surpreendente significa, potencialmente, que a quantidade de conservantes microbianos convencionais pode ser reduzida ou, potencial- mente, até mesmo eliminada, reduzindo, assim, os custos associados à produção e venda do detergente líquido.

Alguns exemplos ilustrativos não-limitadores de bactérias Gram- negativas incluem Pseudomortas, como Pseudomonas aeruginosa, e Pseu- domonas fluorescens; Burkholderia, como Burkholderia Pseudomona cepa- cia; Klebsiella, como Klebsiella oxytoca; Serratia, Escherichia, como Esche- richia colr, ou espécies de fontes ambientais similares, como Citrobacter fre- undii e Serratia liquefaciens.

Para determinar se um composto é capaz de inibir pelo menos o crescimento de pelo menos uma bactéria Gram-negativa no detergente lí- quido, o seguinte teste é realizado.

Uma mistura de bactérias Gram-negativas, também conhecida como coquetel Gram-negativo ou coquetel, é preparada. O coquetel Gram- negativo compreende uma mistura de Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525, Burkholderia (Pseudomonas) cepacia ATCC 25416, Klebsiella oxytoca ATCC 13182, Escherichia coli ATCC 8739, Citrobacter freundii ATCC 8090 e Serratia liquefaciens ATCC 27592. O coquetel de bactérias Gram-negativas é preparado através do crescimento de cada organismo individualmente em placas contendo um meio de crescimento e tomando-se colônias isoladas para a preparação do coquetel Gram-negativo. O meio de crescimento é um TSA (ágar tríptico de soja, disponível junto à Becton Dickinson). O TSA contém, por litro de água: 15 g de digesto pancreático de caseína, 5 g de digesto enzimático de farinha de soja, 5 g de cloreto de sódio, e 15 g de ágar com o pH ajustado para 7,3 ± 0,2, usando ácido clorídrico, HCL (J. T.Baker).

As colônias individualmente selecionadas são adicionadas à so- lução salina esterilizada e ajustadas no padrão McFarIand n- 2 (disponível junto à bioMerieux, Inc.) para preparar uma suspensão de solução salina padronizada para o organismo. Isto é repetido para cada organismo indivi- dualmente, preparando, assim, uma suspensão em solução salina padroni- zada para cada organismo. Um volume igual (1 ml) de cada suspensão em solução salina padronizada dos seguintes elementos do coquetel são mistu- rados um ao outro: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525, Burkholderia (Pseudomonas) cepacia ATCC 25416, Klebsiella oxytoca ATCC 13182, Escherichia coli ATCC 8739, Citro- bacter freundii ATCC 8090 e Serratia Iiquefaciens ATCC 27592.

Um detergente líquido para lavagem de roupas inoculado é pre- parado através da adição de 0,5 mL do coquetel de bactérias Gram- negativas, conforme preparado acima, a 49,5 mL do detergente líquido para lavagem de roupas padrão, descrito na Tabela A abaixo. Este detergente líquido para lavagem de roupas padrão também contém de cerca de 0,00001% a cerca de 5%, em peso da composição, de um ou mais dos ini- bidores de enzimas tripeptídeos aqui descritos.

Tabela A

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1 Lutensol FP620 disponível junto à BASF

Como o coquetel contém, aproximadamente, de 107 a 108 ufc/mL (unidades formadoras de colônias/ml), o nível de inóculos resul- tantes no detergente líquido para lavagem de roupas inoculado é de 105 a 106 ufc/mL O detergente líquido para lavagem de roupas inoculado é arma- zenado a 35°C, sob umidade relativa de cerca de 60% e à pressão-padrão, isto é, 1 atmosfera. São removidas amostras de 1 mL do detergente líquido para lavagem de roupas inoculado nos seguintes intervalos: 1 dia, 2 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias. Estas amostras de 1 mL são imediatamente neutralizadas através da adição de um neutralizador, especificamente um neutralizador polivalente universal (PVUN) que contém (por litro de água destilada): 30 g de Polissorbato 80 (disponível sob o nome Tween 80, junto à VWR International), 5 g de Tiosulfato de sódio, 1 g de L-Histidina1 1 g de Peptona, 8,5 g de Cloreto de sódio, 14,3 g de Lecitina com o pH ajustado para 7,0 ± 0,2 com HCL.

Cada amostra neutralizada é então submetida a uma diluição serial, até uma diluição de 10"5, para permitir a contagem completa da popu- lação microbiana sobrevivente. Por exemplo, 1 mL da amostra é adicionado a 9 mL de PVUN, resultando em uma diluição de 1:10, ou uma diluição de 10"1. Uma amostra de 1 mL desta diluição de 1:10 é então adicionada a ou- tros 9 ml de PVUN, resultando em uma diluição de 1:100, ou uma diluição de 10"2, e assim por diante. As diluições seriais são executadas até 10"5. 1,0 mL das várias diluições (101 ou 10"5) são então semeadas ou em superfície ou em profundidade no TSA (ágar tríptico de soja, Becton Dickinson) e de- pois incubadas por 72 horas a 35°C ± 2°C.

Depois da incubação, as lâminas são contadas e registradas como sobreviventes (ufc/ml) versus tempo (dias 1, 2, 7, 14, 21 e 28 dias). Os resultados são registrados como o Iog do número de células viáveis em dias de amostragem específicos. Se a população microbiana de pelo menos uma bactéria Gram-negativa do detergente líquido para lavagem de roupas ino- culado é mantida aproximadamente estática, isto é, nenhum aumento vs. a inoculação original, então o inibidor de enzima tripeptídeo inibiu pelo menos o crescimento de pelo menos uma bactéria Gram-negativa nos detergentes líquidos para lavagem de roupas. Se a população microbiana de pelo menos uma bactéria Gram-negativa no detergente líquido para lavagem de roupas inoculado é reduzida, isto é, uma diminuição vs. a inoculação original, então, o inibidor de enzima tripeptídeo preveniu o crescimento de pelo menos uma bactéria Gram-negativa nos detergentes líquidos para lavagem de roupas.

Os seguintes resultados podem ser obtidos para o inibidor de enzima tripeptídeo com a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 27</formula>

Este inibidor de enzima tripeptídeo é adicionado ao detergente líquido para lavagem de roupas padrão em uma quantidade de 0,004%, em peso, da composição. Os resultados deste teste mostraram que o inibidor de enzima tripeptídeo previne o crescimento de bactérias Gram-negativas nos detergentes líquidos para lavagem de roupas.

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O mesmo experimento pode ser feito usando-se cepas individu- ais, ao invés do coquetel, para avaliar a inibição de cada cepa individual.

Exemplos - As seguintes composições detergentes líquidas na Tabela 1 são preparadas e colocadas em armazenamento por 3 semanas a 30°C. A estabilidade da protease é então determinada. O exemplo B é uma composição ilustrativa da presente composição e dos métodos. O exemplo B mostra a estabilidade da protease significativamente aprimorada em rela- ção ao exemplo comparativo A.

Tabela 1

<table>table see original document page 28</column></row><table>

1 Lutensit Z, disponível junto à BASF

2 Lutensol FP620, disponível junto à BASF 3 Lutensol PG105K, disponível junto à BASF

4 Protease "B" em EP251446.

5 Inibidor Reversível de Protease com a seguinte estrutura

<formula>formula see original document page 29</formula>

Exemplos ilustrativos não-limitadores adicionais de detergentes líquidos são dados nas Tabelas 2, 3 e 4.

Tabela 2

<table>table see original document page 29</column></row><table> <table>table see original document page 30</column></row><table>

1 Lutensit Ζ, disponível junto à BASF

2 Protease B em EP251446.

3 Inibidor reversível de protease com a seguinte estrutura

<formula>formula see original document page 30</formula>

4 Inibidor reversível de protease com a seguinte estrutura

<formula>formula see original document page 30</formula>

5 Inibidor reversível de protease com a seguinte estrutura

<formula>formula see original document page 30</formula>

6 Silicone catiônico conforme WO 2002/18528.

Tabela 3

<table>table see original document page 30</column></row><table> <table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table>

1 Lutensit Z1 disponível junto à BASF

2 Lutensol FP620, disponível junto à BASF

3 Lutensol PG105K, disponível junto a BASF

4 conforme o Exemplo 1 em US 5308530.

5 Protease "B" em EP251446.

6 Arquad 2HT

7 Polímero de celulose catiônica, disponível junto à Amerchol

8 Inibidor reversível de protease com a seguinte estrutura

9 Inibidor reversível de protease com a seguinte estrutura

<formula>formula see original document page 32</formula>

10 Inibidor reversível de protease com a seguinte estrutura

<formula>formula see original document page 32</formula>

11 Inibidor reversível de protease com a seguinte estrutura <formula>formula see original document page 33</formula>

Tabela 4

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<formula>formula see original document page 34</formula>

Todos os documentos citados na Descrição Detalhada da In- venção estão, em sua parte relevante, aqui incorporados por referência, sendo que a citação de qualquer documento não deve ser interpretada co- mo admissão de que este represente técnica anterior com respeito à pre- sente invenção. Se algum significado ou definição de um termo deste docu- mento escrito entrar em conflito com algum significado ou definição do termo em um documento incorporado por referência, o significado ou definição atribuída ao termo neste documento escrito terá precedência.

As composições da presente invenção podem incluir, consistir essencialmente em, ou consistir nos componentes da presente invenção, bem como outros ingredientes aqui descritos. Como aqui utilizada, a expres- são "consistir essencialmente em" significa que a composição ou o compo- nente pode conter ingredientes adicionais, mas somente se estes não alte- rarem substancialmente as características básicas e novas das composi- ções ou métodos reivindicados.

Todas as porcentagens aqui mencionadas estão em peso, exce- to onde especificado em contrário. Deve-se compreender que cada limite numérico máximo mencionado neste relatório descritivo inclui cada um dos limites numéricos inferiores, como se tais limites numéricos inferiores esti- vessem expressamente registrados no presente documento. Cada limite numérico mínimo mencionado neste relatório descritivo inclui cada um dos limites numéricos superiores, como se tais limites numéricos superiores esti- vessem expressamente registrados no presente documento. Cada intervalo numérico mencionado neste relatório descritivo inclui cada intervalo numéri- co mais restrito que esteja situado dentro desse intervalo numérico mais amplo, como se tais intervalos numéricos mais restritos estivessem expres- samente registrados no presente documento. Todas as temperaturas estão em graus Celsius (°C), exceto onde indicado em contrário.

Embora modalidades específicas da presente invenção tenham sido ilustradas e descritas, deve ficar óbvio aos versados na técnica que vá- rias outras alterações e modificações podem ser feitas sem que se desvie do caráter e âmbito da invenção. Portanto, pretende-se cobrir nas reivindi- cações anexas todas essas alterações e modificações que se enquadram no escopo da presente invenção.

Claims (20)

1. Composição detergente líquida caracterizada por compreender: (a) um tensoativo; (b) uma enzima protease; (c) um inibidor reversível de protease de peptídeo, em que o dito inibidor reversível de protease de peptídeo é um inibidor de enzima tripeptí- deo; (d) um ingrediente auxiliar; em que a dita composição detergente líquida compreende, adicionalmente, pelo menos um dos seguintes: (i) o dito inibidor reversível de protease de peptídeo que tem uma constante de afinidade para a dita enzima protease de cerca de 50nM a cerca de 2uM; e/ou (ii) uma razão molar entre o dito inibidor reversível de protease de peptídeo e a dita enzima protease de cerca de 1:1 a cerca de 20:1.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito inibidor de enzima tripeptídeo tem a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 36</formula> em que A é uma porção ácido diamino; X é H, um grupo removedor de elé- trons e misturas dos mesmos; e Z é uma porção terminal de nitrogênio sele- cionada a partir de: <formula>formula see original document page 36</formula> e misturas dos mesmos, em que cada R' é independentemente selecionado a partir de alquila C1-C6 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; fenila; alquil arila C7-C9 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; porção cicloalquila C4- C8 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; alquila heterocíclica C5-C9 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; e misturas dos mesmos.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender menos que cerca de 3%, em peso da composição, de de- rivados de ácido bórico.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser substancialmente isenta de derivados de ácido bórico.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita enzima protease é uma protease de serina.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender menos que cerca de 3%, em peso da composi- ção, de solventes orgânicos à base de poliol.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito inibidor de enzima tripeptídeo é selecionado a partir de: <formula>formula see original document page 37</formula> e misturas dos mesmos.

8. Artigo comercial, caracterizado pelo fato de compreender: (a) um recipiente; e (b) um detergente líquido para lavagem de roupas, como defini- do na reivindicação 1, armazenado no dito recipiente.

9. Artigo comercial, de acordo com a reivindicação 8, caracteri- zado pelo fato de que o dito recipiente é transparente ou translúcido.

10. Método para estabilização de enzimas em uma composição detergente líquida, caracterizado pelo fato de que a dita composição deter- gente líquida compreende uma ou mais enzimas protease e em que o dito método compreende pelo menos a etapa de adição de uma quantidade es- tabilizadora eficaz de um inibidor reversível de protease de peptídeo à dita composição detergente líquida, em que dito inibidor reversível de protease de peptídeo tem a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 38</formula>

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita composição detergente líquida compreende menos que cerca de 1%, em peso da composição, de derivados de ácido bórico.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita composição é substancialmente isenta de solventes orgânicos à base de poliol.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita composição é uma composição detergente para tare- fas pesadas adequada para tratamento de lavagem de roupas.

14. Composição detergente líquida caracterizada por compreender: (a) um tensoativo; (b) uma enzima protease; (c) um inibidor reversível de protease de peptídeo que é um ini- bidor de enzima tripeptídeo; (d) um ingrediente auxiliar; em que dito inibidor reversível de protease de peptídeo inibe pelo menos o crescimento de pelo menos uma flora ou fauna microbiológica no dito deter- gente líquido.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o dito inibidor de enzima tripeptídeo tem a seguinte fór- mula: <formula>formula see original document page 38</formula> em que A é uma porção ácido diamino; X é H, um grupo removedor de elé- trons e misturas dos mesmos; e Z é uma porção terminal de nitrogênio sele- cionada a partir de: <formula>formula see original document page 39</formula> e misturas dos mesmos, em que cada R' é independentemente selecionado de alquila C1-C6 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; fenila; alquil arila C7-C9 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; porção cicloalquila C4-C8 linear ou ramificada, substituída ou não-substituída; alquila heterocíclica C5-C9 li- near ou ramificada, substituída ou não-substituída; e misturas dos mesmos.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o dito inibidor reversível de protease de peptídeo inibe pelo menos a contaminação do dito detergente líquido por pelo menos uma flora ou fauna microbiológica.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o dito inibidor reversível de protease de peptídeo evita o crescimento de pelo menos uma flora ou fauna microbiológica no dito deter- gente líquido.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o dito inibidor reversível de protease de peptídeo inibe pelo menos o crescimento de pelo menos uma bactéria gram-negativa no dito detergente líquido.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o dito inibidor reversível de protease de peptídeo inibe pelo menos a contaminação do dito detergente líquido por pelo menos uma bactéria gram-negativa.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- da pelo fato de que o dito inibidor reversível de protease de peptídeo tem a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 39</formula>