BRPI0712595A2 - uso de timosina alfa 1 para o tratamento de doenças imunológicas. - Google Patents
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Abstract
USO DE TIMOSINA ALFA 1 PARA O TRATAMENTO DE DOENçAS IMUNOLóGICAS. é descrito o uso da timosina alfa 1 para preparar um medicamento útil para a prevenção ou tratamento da doença enxerto-versus-hospedeiro ou reação de rejeição a enxerto em transplante de órgáos, num indivíduo humano, no qual as células, tecidos ou órgáos para transplante são selecionados do grupo compreendendo: células tronco, células tronco hematopoiéticas, medula óssea, coração, fígado, rim, pulmão, pâncreas, intestino delgado, córnea ou pele.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE Tl- MOSINA ALFA 1 PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS IMUNOLÓGI- CAS".
A presente invenção se refere ao uso de timosina alfa 1 para preparar um medicamento para o tratamento da doença enxerto versus hos- pedeiro.
No transplante de medula óssea ou transfusão sangüínea, ou transplante de órgão a partir de um doador para um receptor sem histocom- patibilidade com o doador, os linfócitos do doador migram para o receptor.
Se o receptor não puder rejeitar os linfócitos do doador, os linfócitos do doa- dor tomam e se proliferam no corpo do receptor e atacam tecidos incluindo uma doença.
Pacientes com leucemia, falência renal, cardíaca, pulmonar ou hepática no estágio final, o transplante de órgão é muito comumente usado no tratamento. Por exemplo, aloenxertos (enxertos de órgãos coletados de doadores diferentes do próprio/própria paciente ou hospedeiro/receptor do enxerto) de vários tipos, por exemplo, rim, coração, pulmão, fígado, medula óssea, pâncreas, córnea, intestino delgado e pele (por exemplo, lâminas e- pidérmicas) são atualmente rotineiramente efetuados. Xenoenxertos (enxer- tos de órgãos coletados de animais não-humanos), tais como válvulas cardí- acas de porcos, também sendo usadas clinicamente para substituir suas contrapartes humanas disfuncionais.
Para assegurar o transplante de órgãos bem sucedido, é dese- jável obter o enxerto do gêmeo idêntico do paciente ou de seu membro da família imediato. Isso ocorre porque transplantes de órgãos evocam uma variedade de respostas imunes no hospedeiro, o que resulta na rejeição do enxerto e da doença enxerto-versus-hospedeiro (de agora em diante, referi- da como "GVHD").
A resposta imune é primariamente desencadeada pelas células Tatravés do reconhecimento de aloantígenos, e os principais alvos na rejei- ção de transplante são formas não-auto alélicas dos antígenos do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de classe I e de classe II. Na rejei- ção aguda, as células apresentadoras de antígeno do doador, tais como as células dendríticas e os monócitos migram do aloenxerto para os Iinfonodos regionais, onde elas são reconhecidas como estranhas pelas células CD4+ Th do receptor, estimulando a proliferação de células TH. Após a proliferação das células TH, uma população de células efetoras (incluindo células T CD4+ e T CD8+ citotóxicas) é gerada, as quais migram e se infiltram para o enxerto e medeiam a rejeição ao enxerto (Noelle et al. (1991) FASEB 5 (13): 2770).
enquanto a rejeição aguda é um processo dependente de célu- las T, uma ampla estrutura de mecanismos efetores participam na destruição do enxerto. Através da liberação de citocinas e de interações célula-a-célula, uma montagem diversa de linfócitos incluindo células T CD4+, células T cito- tóxicas CD8+, células B formadoras de anticorpo e outros leucócitos proin- flamatórios é recrutada na resposta anti-aloenxerto. As células de enxerto apresentadoras de antígeno são destruídas diretamente pelas células T CD8+ citotóxicas. As células T CD4+ ativadas produzem interleucina 2 (de agora em diante referida como "IL-2"), a qual é essencial para a ativação tanto de células T CD8+ quanto de células B. Adicionalmente, as células T CD4+ produzem outras citocinas, tal como IFN-_ e IL-4 que também contri- buem para a destruição do aloenxerto. Além disso, o interferon-u (de agora em diante, referido como "IFN-i:") induz a expressão intensificada de molé- culas MHC de classe I e Il no tecido do enxerto, as quais são mais pronta- mente atacadas pelas células efetoras alorreativas. IFN-_ intensifica a ativi- dade de macrófagos e afeta muitas células inflamatórias levando à reação de hipersensibilidade do tipo retardada e inflamação, causando danos não- específicos ao enxerto. Essas reações aparentam ser a causa primária da rejeição aguda precoce que pode ocorrer nas primeiras poucas semanas após o transplante. Se não tratada, a rejeição aguda progride para um pro- cesso rápido e severo que causa a destruição do transplante em alguns di- as.
Por outro lado, quando um linfócito T do doador reconhece as diferenças baseando-se num grupo de marcadores genéticos, geralmente referidos como antígenos de leucócitos humanos (HLA) e ele começa a ata- car o novo corpo, isto é, o corpo do paciente. Embora a maioria dos pacien- tes e doadores são parelhados o tanto quanto possível para os marcadores HLA. Muitos marcadores menores, entretanto, diferem entre doadores e pa- cientes, exceto quando o paciente e o doador são gêmeos idênticos. Antes de um transplante, a tipagem extensiva do doador e do receptor é efetuada para garantir que o doador e o receptor sejam muito próximos imunologica- mente. Independentemente dessa tipagem, existem diferenças imunológicas que não podem ser detectadas e que os linfócitos T no enxerto do doador são capazes de detectar. Como resultado, os linfócitos T do doador come- çam a atacar o corpo do paciente causando GVHG.
Existem duas formas de GVHG: a GVHD aguda e crônica. G- VHG aguda geralmente ocorre nos primeiros três meses depois de um transplante. As células T presentes na medula óssea do doador no momento do transplante atacam a pele, fígado, estômago e/ou intestinos do paciente.
Os sinais mais precoces de GVHG aguda são geralmente erupções na pele que aparecem nas mãos, pés e face. Diferentemente de vesículas da pele, os pacientes com GVHD severa também desenvolvem grandes quantidades de diarréia aquosa ou sanguinolenta com cólicas devido ao ataque das célu- las T do doador no estômago e intestinos. Icterícia (amarelamento da pele e olhos) é a indicação usual de que a doença GVHD envolve o fígado. Quanto mais órgãos envolvidos e piores os sintomas, pior a doença GVHD.
No caso do transplante de medula óssea, particularmente, G- VHD é outro obstáculo para a sobrevivência de pacientes transplantados. Storb (1984) "Pathophysiology and prevention of graft-versus-host disease" em Advances in lmmunobiology: Blood cell antigens and bone marrow trans- plantation, Mc Cullogh e Sandier, editors, Alan, Inc., N. Y., p.337. Uma gran- de proporção de indivíduos afligidos por GVHD morrem como resultado de GVHD. Weiden et al. (1980) "Graft-versus-host disease in allogeneic marrow transplantation", em Biology of Bone-Marrow Transplantation, Gale and Fox, editors, Academic Press, N.Y., p37.
Timosina alfa 1 é um composto bem conhecido no campo médi- co. Esse composto é um peptídeo ácido presente no extrato de timo o qual apresenta propriedades imunorregulatórias em vários ensaios in vitro e in vivo (1972; Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 69, 1800-1803).
O uso prévio da timosina alfa 1 é bem conhecido.
W02004087067 se refere ao uso da timosina alfa 1 para preve- nir infecção por Aspergillus fumigatus num hospedeiro imunocomprometido sendo tratado com um transplante de medula óssea.
A administração subeutânea de timosina alfa 1 em camundon- gos nus previamente inoculados com células de câncer de pulmão de célu- las não-pequenas humanas ("NSCLC") reduziu significativamente o volume tumoral.
As metástases pulmonares em camundongos com fibrossarco- ma induzido por metileolantreno também foram reduzidas por timosina alfa 1, e o crescimento de sarcoma local, assim como metástases no fígado e η pulmão de células de Iinfossarcoma foram significativamente reduzidas em camundongos BALB/c tratados com timosina alfa 1.
O uso da timosina alfa 1 para preparar um medicamento para a prevenção ou tratamento de GVHD não é conhecido na técnica.
Para proteger pacientes de GVHD1 vários agentes imunossu- pressores foram empregados. Atualmente, a rejeição ao haloenxerto é con- trolada usando agentes imunossupressores tais como ciclosporina A, azatio- prina, corticosteróides incluindo prednisona e metilprednisona, ciclofosfami- da e FK506. Ciclosporina A, o imunossupressor mais poderoso e mais fre- qüentemente usado, revolucionou o campo da cirurgia de transplante de ór- gãos. Outros agentes imunossupressores, tais como FK506, rapamicina, ácido micofenólico, 15-desoxispergualina, mimoribina, misoprostol, OKT3 e anticorpos do receptor anti-IL-2 tem sido usados no tratamento e/ou preven- ção da rejeição de transplante de órgão. Briggs, Immunology letters, 29 (1- 2), 89-94, 1991; FASEB 3: 3411, 1989. Embora o desenvolvimento de novos fármacos imunossupressores tenha levado a uma melhoria substancial dos pacientes, esses fármacos estão associados com uma alta incidência de efeitos colaterais, tais como nefrotoxicidade e/ou hepatoxicidade. Por exemplo, ciclosporina A tem toxicidades associadas e efei- tos colaterais quando usada mesmo em doses terapêuticas. Embora FK506 seja cerca de 10 a 100 vezes mais potente do que a ciclosporina A na inibi- ção da transcrição da IL-2 induzida por ativação in vitro e rejeição de enxerto in vivo, ela geralmente apresenta efeitos colaterais tais como neurotoxicida- de e nefrotoxicidade. Deste modo, ainda existe a necessidade pelo trata- mento e profilaxia por GVHD com perfis de toxicidade melhorados.
Foi agora descoberto que a timosina alfa 1 é um agente útil para inibir ou tratar doença de enxerto-versus-hospedeiro ou reação de rejeição a enxerto em transplantes de órgãos num indivíduo mamífero.
É, conseqüentemente, um objeto da presente invenção o uso da timosina alfa 1 para preparar um medicamento útil para a prevenção ou tra- tamento de doença de enxerto-versus-hospedeiro ou reações de rejeição a enxerto depois do transplante de órgãos, num indivíduo mamífero tal como um paciente humano o qual receba células, tecido ou órgão(s).
As células, tecido ou órgão de acordo com a presente invenção podem ser selecionados do grupo compreendendo: células tronco, células tronco hematopoiéticas, medula óssea, coração, fígado, rim, pulmão, pân- creas, intestino delgado, córnea ou pele.
A timosina alfa 1 de acordo com a presente invenção pode ser administrada num indivíduo, o qual está num regime de condicionamento mieloablativo ou não-mieloablativo.
A timosina alfa 1, de acordo com a presente invenção, pode ser administrada ao paciente numa quantidade farmaceuticamente eficaz numa janela de tempo predeterminada antes e/ou depois do transplante, opcio- nalmente juntamente com um agente imunossupressor selecionado do grupo compreendendo prednisona, metilprednisolona, ciclofosfamida, ciclosporina A, FK506, talidomida, azatioprina, Daclizumab, Infliximab, MEDI-205, abx-cbl ou ATG.
Os seguintes exemplos ilustram adicionalmente a invenção.
INTRODUÇÃO
Timosina alfa 1 é um peptídeo tímico de ocorrência natural (Ex- pert Opin. Biol. Ther. 2004; 4: 559-573) que promove a maturação e produ- ção de citocina em CDs humanos e de murino pela sinalização através de receptores tipo Toll (TLRs), incluindo TLR9 (Blood. 2004; 103: 4232-4239). Pela influência do balanço de CDs produzindo IL-12 e IL-10, a timosina alfa 1 age como um regulador imune capaz de induzir a imunidade protetora ao Aspergillus fumigatus (Blood. 2004; 103: 4232-4239) a estimulação TLR9 pode também levar á ativação IDO através de mecanismos incluindo sinali- zação de IFN tipo I autócrina (J. Immunol. 2005; 175: 5601-5605; Eur. J. Immunol. 2005; 36: 8-11) e pode promover a geração mediada por pCD de células CD4+ CD25+ (J. Immunol. 2004; 173: 4433-4442, as quais são com- ponentes essenciais da imunidade protetora dependente de IDO a fungos (J. Immunol. 2005; 174: 2910- 2918; J Immunol. 2006; 176: 1712-1723). De a- cordo com a presente invenção, foi avaliada a atividade da timosina alfa 1 no balanço da imunidade e tolerância por CDs e a geração de células reg T. CDs foram derivados de precursores da medula óssea (murino) ou de san- gue periférico (humano) usando ou GM-CSF/IL-4 (GM-CDs) ou Iigante FLT3 (FL-CDs), os quais são conhecidos por expandir tanto CDs convencionais quanto pCDs (J. Immunol. 2005; 174: 6592-6597) com ou sem timosina alfa 1. CDs foram analisador quanto á expressão de IDO e capacidade de mediar à iniciação Th 1U reg in vivo e in vitro contra A. fumigatus e aloantígenos. A especialização e complementaridade na iniciação e tolerância por diferentes populações CD foram descobertas. Entretanto, pela ativação de um progra- ma tolerogênico dependente de IDO através de TLR9 e sinalização de IFNR tipo I, timosina alfa 1 agiu durante a diferenciação de CD para alterar o ba- lanço da inflamação e da tolerância.
MATERIAIS E MÉTODOS
Camundongos
Camundongos BALB/c e C57BL6 congênitos de 8 a 10 semanas de idade foram obtidos de Charles River/Harlan Breeding Laboratories (Cal- co, Itália). Camundongos TLR9-/- ou IFN-apR-/- homozigóticos num fundo de C57BL6 foram criados sob condições livres de patógenos específicas nos equipamentos animais da Universidade de Perugia, Perugia. Procedimentos envolvendo animais e seus cuidados foram conduzidos em conformidade com as leis e políticas nacionais.
Doadores e Pacientes
Células mononucleares de sangue periféricas foram obtidas de doadores saudáveis e sete receptores de HSCT haploidênticos sem célula T, com consentimento informado por escrito. A tipagem do doador, o enxerta- mento e GVHD foram avaliados conforme descrito (Blood. 2005; 106: 4397- 4406). Camundongos C57BL6 irradiados Ietalmente (8 Gy) modelo HSCT experimental foram infundidos com células da medula óssea sem célula T de camundongos BALB/c (Blood. 2003; 102: 3807-3814). Para GVHD, esplenó- citos T CD3+ doadores purificados foram adicionados ao enxerto (Science. 2002; 295: 2097 - 2100). Os camundongos individuais foram classificados semanalmente de 0 a 2 para cada critério GVHD (ver legenda da Figura 3) sem conhecimento do grupo de tratamento.
A. Infecção por fumigatus.
A cepa de A. fumigatus, as condições de cultivo e infecção fo- ram conforme descrito em Blod. 2004; 103: 4232 - 4239. Os camundongos foram anestesiados com avertina 2,5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
A quantificação do crescimento fúngico nos pulmões foi feita pelo ensaio de quitina e os resultados estão expressos como microgramas de glicosamina por par de pulmões, e a marcação com PAS foi feita conforme descrito em Blood. 2004; 103: 4232 - 4239.
Reagentes
Timosina alfa 1 e o peptídeo misturado (sTimosina alfa 1) (am- bos de SciCIone Pharmaceuticals, Inc. San Mateo, CA) foram fornecidos como purificados, polipeptídeos acetilados Iiofilizados estéreis sem endoto- xina ((Blood. 2004; 103: 4232-4239). Os pós Iiofilizados foram reconstituídos em água estéril.
Geração de subgrupo CD e culturas
GM-CDs ou FL-CDs foram obtidos a partir de monócitos CD14+ purificados a partir de doadores saudáveis ou pacientes transplantados (1 mês depois de HSCT) cultivados em meio modificado Iscove por 7 a 9 dias, na presença de rGM-CSF (Schering-Plough, Milão, Itália) e rlL-4 (Peprotech, Inalco, Milão, Itália) ou FLT3-L (Immunex Corporation, Seattle, WA) (Blood. 2004; 103: 4232-4239). A recuperação de CD foi entre 20 e 30% reduzida em culturas a partir de pacientes transplantados. GM-CDs ou FL-CDs de murino foram obtidos a partir de células da medula óssea por 7 a 9 dias, conforme descrito (Blood. 2004; 103: 4232 - 4239). Timosina alfa 1 e sTimo- sina alfa 1 foram adicionados às culturas em 20 ng/mL. CDs (> 99% de CD11c+ consistindo de 90 a 95% de CD8-, 5 a 10% de CD8+ e 1 a 5% de células B220+) foram purificados a partir do baço (spCDs) por seleção ativa- da magnética usando MicroBeads e MidiMacs CD11c (Miltenyi Biotech). AS populações CD foram ainda separadas em frações de CD8-, CD8+ e B220+ através de MicroBeads CD8 ou B220 (Miltenyi Biotech). Os CDs foram pul- sados em meio Iscove sem soro por 24 horas com Aspergillus conidia ou Zymosan não-opsonizado vivo de Saccharomyces cerevisiae (Sigma) ou CpG-ODN 2006 conforme descrito. 7 fagocitose oi feito conforme descrito (Blood. 103: 4232 - 4239). As fotografias foram tomadas usando uma Câme- ra Colorida de Microscópio de Alta Resolução AxioCam, usando o software AxioVision REI 3.1 (Carl Zeiss, Milão, Itália).
Citometria de fluxo
CDs foram analisados quanto à expressão de antígeno com um citofluorômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) equipado com o software CELLQuestTM e usando mABs conjugados da PharMingen (Blood 2004; 103: 4232 - 4239).
Expressão de IDO e análise funcional
A expressão de IDO e a atividade funcional foram avaliadas con- forme descrito em Nat. Immunol. 2002; 3: 1097-1101. A geração, purificação e atividade de células T reg células T CD4+ esplênicas foram co-cultivadas com CDs pulsadas com conidia por 5 dias 7 antes do ensaio de citometria de fluxo ou ELISPOT. 1-MT (Sigma-AIdrich) foi usado em 2 μΜ. Células CD4+CD25+ e CD4+CD25- (> de 90% de pureza em análise FACS) foram separadas por seleção de células magnética do pulmão e TLN (J. Immunol. 2006; 176: 1712-1723). Par a inibição de célula T reg, as células T Reg 5 χ 104 TLN foram adicionadas em 3 χ 105 células CD4+CD25-, ambas de ca- mundongos transplantados, estimulados com 3 χ 104 spCDs pulsados com Aspergillus conidia autólogos ou com 1,5 χ 105 spCDs alogênicos a partir de camundongos doadores ingênuos por cinco dias antes da marcação com H3- timidina. CD11b+Gr-1+PMN peritoneal purificado (> de 98% de pureza em análise FACS) (2 χ 106) foram expostas a conidias em repouso na presença de 4 χ 105 CD4+CD25+ por 60 min para produção oxidante ou 24 horas para a produção de citocinas (J. Immunol. 2006; 176: 1712 - 1723).
Citocina e Ensaio ELISPOT
O conteúdo de citocina foi avaliado por ensaios de imunossor- vência ligados à enzima (Endogen Human Elisa, R&D Systems and Euroclo- ne, Milão, Itália). Os kits de ensaio AID EIiSpot (Amplimedical, Buttigliera Alta, Turin, Itália) foram usados em células T CD4+ esplênicas purificadas com CDs pulsados com conidia por 5 dias para enumerar as células produ- toras de citocina (Blood 2003; 102: 3807 - 3814). 1-MT foi usado a 2 μΜ.
Transferência adotiva, desafio fúngico e avaliação da prote- ção
Os camundongos receberam injeções intraperitoneais duas ve- zes de CDs, em intervalos semanais, começando no dia depois de HSCT e infectados uma semana depois da última administração de CD. Três dias mais tarde, os homogenatos de pulmão, células T CD4+ (> de 98% em A- NÁLISE facs), CD4+CD25- (> de 98%) ou CD4+CD25+ (> de 82%) purifica- das com os kits de isolamento Miltenyi Biotec específicos foram avaliadas quanto ao padrão pro- e antiinflamatório (TNF-a/IL-10 em homogenatos de pulmão), Th1 (IFN-) ou Th2 (IL-4) produção de citocinas por células CD4+ estimulada com CDs pulsados com Aspergillus (Blood. 2003; 102: 3807- 3814) freqüência de CD25 + IL-10 + TGF-β + células T reg, linfoproliferação e expressão gênica por RT-PCR. Para a proliferação, TLN + linfócitos T CD4+ foram plaqueados (105 células/poço) com 105 células de esplenócitos alogênicos irradiados/poço ou spCDs autólogos pulsados com conidia ou 10 μg/mL de ConA por cinco dias antes da marcação com H3-timidina. Geração de clones de célula T huana específicos de Asper- gillus e linfoproliferação
Clones de células T CD4+ humanos específicos foram gerados a partir de células T CD4+CD45RA+ do sangue periférico adicionadas em concentrações de diluição Iimitantes em células do sangue periférico autólo- gas do alimentador irradiado (20 Gy) e estimuladas com CDs pulsadas com conidia ou CDs alogênicos (Blood. 2005; 106: 4397-4406). Os clones em cultivo foram avaliados quanto á especificidade contra CDs pulsados com fungos, CDs alogênicos, células irradiadas autólogas (como um controle ne- gativo) e fitoemaglutinina 0,5% (como um controle positivo) marcação por H3-timidina (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido) ou conteú- do de citocina em sobrenadantes 2 dias depois (Blood. 2005; 106: 4397- 4406).
Transcriptase reversa (RT)-PCR
Extração, síntese de RNA e PCR de DNAc, seqüências de inici- adores gene-específicos, temperaturas de anelamento e ciclos de amplifica- ção foram feios conforme descrito em J. Immunol. 2006; 176: 1712 - 1723). As eficiências de amplificação foram validadas e normalizadas contra GAP- DH.
Análise estatística
Teste t pareado de Student foi usado para determinar a signifi- cância dos valores nos grupos experimentais (significância foi definida como P < 0,05). Os dados de sobrevivência foram analisados usando o teste U de Mann-Whitney. Grupos in vivo consistiram de 6 animais.
EXEMPLO 1
Timosina alfa 1 expande pCDs de precursores da medula óssea e ativa o catabolismo de triptofano.
Para avaliar como a timosina alfa 1 poderia afetar as proprieda- des fenotípicas e funcionais de CDs de murino, as células da medula óssea cresceram por 7 a 9 dias em meio contendo GM-CSF/IL-4 ou FLT3L, na pre- sença de timosina alfa 1 ou um controle, peptídeo misturado. Depois da ma- turação, as células foram analisadas por citometria de fluxo e microscopia ótica (Figura 1A). Ao contrário ao FLT3L, o tratamento somente com GM- CSF/IL-4 não permitiu a emergência de uma elevada fração de pCDs, con- forme revelado pela porcentagem de células B220+CD11c+ na análise FACS e pelo exame da morfologia usando microscopia ótica. Entretanto, a timosina alfa 1, a qual não afetou o rendimento total de células, aumentou muito a ocorrência de pCDs em GM-CDs, conforme revelado por um número elevado de CDs B220+CD11c+ e uma recuperação muito reduzida de célu- las CD11 b+CD11 c+ convencionais.
Embora a timosina alfa 1 seja conhecida por afetar a hematopoi- ese, a expansão das células B220+CD11C+ não foi observada somente com timosina alfa 1. As células B220+CD11c+ não foram aumentadas em FL- CDs tratadas com timosina alfa 1 nem foram em GM-CDs tratados com o peptídeo de controle. A expansão de pCDs por timosina alfa 1 não foi obser- vada em GM-CDs de camundongos TLR9-/- ou IFN-apR-/-, indicando de- pendência dos efeitos de timosina alfa 1 na sinalização de IFNR tipo 1 e TLR9.
EXEMPLO 2
Timosina alfa 1 promove a indução de IL-12 por CDs mielói- des e de IL-10 por pCDs.16
Timosina alfa 1 induziu a liberação de IL-12 e de IL-10 por GM- CDs em resposta ao Aspergillus conidia e de IL-10, mais do que IL-12, por FL-CDs (Figura 1B). A produção de 1-10 por CDs em resposta aos fungos é regulada por uma via dependente de IDO (J Immunol. 2005; 174: 2910- 2918); No ajuste atual, a produção de IL-10 por qualquer população em res- posta à timosina alfa 1 não ocorreu com células de camundongos TLR9-/- ou IFN^R-/- e foi do mesmo modo bloqueada pela adição do inibidor IDO 1- metil-DL-triptofano (1-MT) nas culturas (Figura 1B). A indução de IDO fun- cional por timosina alfa 1 tanto em FL-CDs quanto em GM-CDs foi confirma- da por análise de imunoblot e pela avaliação da atividade enzimática em termos de conversão de CD do triptofano para quinurenina. Novamente, a indução da proteína IDO e a função pela timosina alfa 1 não foi observada em CDs de camundongos TLR9-/- ou IFN-apR-/- (Figura 1C). EXEMPLO 3
CDs IDO+ induzidos por timosina alfa 1 ativam células T reg in vitro
Para correlacionar a expressão de IDO e a produção de IL-10 por CDs com atividades regulatórias possíveis, nós examinamos a capaci- dade relativa de CDs induzidos por timosina alfa 1 de induzir a iniciação Th1 / T reg específica de antígeno in vitro por linfócitos T CD4+ esplênicos em resposta ao Aspergillus conidia. Figura 2A mostra que a Timosina alfa 1 au- mentou a iniciação por células T CD4+ produtoras de IFN-.-/IL-10 por GM- CDs e para células produtoras de IL-10 por FL-CDs. Semelhantemente ao bloqueio IDO, a depleção de B220+CD11c+ de timosina alfa 1-GM-CDs abo- liu a ativação de célula Treg (dados não mostrados). O bloqueio de IDO por 1-MT preveniu a ativação de células CD4+ produtoras de IL-10, porém não teve efeito nas células produtoras de IFN-, sugerindo que IDO está casual- mente e seletivamente ligado à iniciação das células T produtoras de IL-10. Devido ao fato do estímulo de TLR9 ativar IDO (J. Immunol. 2005; 175: 5601 - 5605) e também promover a geração mediada por pCD de células T CD4+CD25+ reg (J. Immunol. 2004; 173: 4433 - 4442) a ocorrência de célu- las T CD4+CD25+ expressando marcadores de atividade T reg, tal como o fator de transcrição forkhead Foxp3 e antígeno do linfócito T citotóxico (C- TLA-4). A análise citofluorimétrica revelou que células T CD4+CD25+ foram expandidas por co-cultivo com CDs (Figura 2B). Entretanto, uma proporção significativa das células T CD4+CD25+ mancharam positivamente para Foxp3 intracelular e CTLA-4 de superfície quando cultivadas na presença de CDs induzidas por timosina alfa-1. O efeito foi negado pelo bloqueio IDO. FL-CDs também induziram células Foxp3 + T reg, embora num grau menor. De acordo com os dados na Figura 1C sugerindo que o catabolismo do trip- tofano é intensificado por FLT3L, 1-MT aparentou interferir com a expansão de células T Foxp3+CTLA4+CD25+ co-cultivadas com FL-CDs. Conseqüen- temente, o desenvolvimento de células T CD4+CD25+ in vitro aparentemen- te ocorre através de um mecanismo envolvendo o catabolismo de triptofano CD e é promovido por timosina alfa 1. EXEMPLO 4
GM-CDs condicionados com timosina alfa 1 protege os hos- pedeiros de aspergiloses em HSCT
CDs pulsados com fungos agem como uma potente vacina anti- fúngica em HSCT.7 experimental. Devido ao fato da regulação ser absolu- tamente requerida para balancear a inflamação e tolerância em JSCT24,25, assim como na imunidade antifúngica (J. Immunol. 2005; 174: 2910-2918).
Foi examinado se CDs tratados com timosina alfa 1 poderiam afetar a iniciação e tolerância in vivo num ajuste experimental de HSCT. Camundongos transplantados foram infundidos com CDs pulsados com fun- gos, infectados com ASpergiIIus conidia e monitorados quanto à sobrevivên- cia, crescimento fúngico e patologia inflamatória nos pulmões. Semelhante- mente aos CDs esplênicos,7 FL-CDs porém não GM-CDs conferiram resis- tência à infecção de um modo dose-dependente, uma vez que os camun- dongos sobreviveram à infecção e controlaram o crescimento fúngico depois da transferência de 5 χ 105 (Figura 3A), porém não de 5 χ 104 CDs. Um efei- to paradoxal foi observado em camundongos tratados com GM-CDs1 pelo fato de que os camundongos falharam ao desafio de sobrevivência apesar do controle efetivo de crescimento fúngico. Entretanto, o tratamento com timosina alfa 1, o qual não afetou o potencial de vacinação de FL-CDs, au- mentou dramaticamente a de GM-CDs, conforme mostrado pela proteção completa produzida pela transferência de GM-CDs tratados com timosina alfa 1 (Figura 3A). FL-CDs engloba populações equivalentes às misturas de pCDs.20 CD8+, CD8- e B220+LyC6+ esplênicos coletadas. Para analisar as contribuições de diferentes subgrupos ao potencial de vacinação de CDs, as frações purificadas de FL-CD ou populações esplênicas foram examinadas, sozinhas ou em combinação, quanto á capacidade de induzir a proteção à aspergilose em HSTC. Os resultados mostraram que nem CDs CD8- nem CD8+ sozinhos conferiram resistência à infecção, conforme julgado pelo ex- tensivo crescimento e disseminação fúngico. Entretanto, a proteção foi ob- servada na combinação de dois subgrupos e foi semelhante àquela obser- vada com pCDs purificados ou de culturas de baço ou de FL-CD (dados não mostrados). Conseqüentemente, a combinação de atividades funcionalmen- te distintas foi do mesmo modo responsável pela ação protetora in vivo de FL-CDs e de GM-CDs tratados com timosina alfa 1 no ajuste experimental de aspergilose em HSCT.
EXEMPLO 5
Condicionamento com timosina alfa 1 de GM-CDs gera uma imu- notoxicidade moderada do componente imune
A histopatologia revelou que o recrutamento de células inflamatórias local e as reações foram altas nos pulmões de camundongos tratados com GM-CD, porém baixas em camundongos infundidos com GM-CDs tratados com timosina alfa-1 ou com FL-CDs (Figura 3B). Essas descobertas sugeri- ram que uma toxicidade inflamatória severa estava provavelmente associada com a transferência de GM-CDs, um efeito aliviado pelo pré- condicionamento de timosina alfa 1 dos GM-CDs. Para desmascarar direta- mente o potencial pela imunotoxicidade de CDs, e seu "amansamento" pela timosina alfa 1, as diferentes populações de CD foram infundidas nos ca- mundongos receberam diferentes quantidades de células T doadoras junta- mente com o enxerto.
Os camundongos foram ou deixados não-infectados para a ava- liação de GVHD ou infectados para a avaliação da suscetibilidade de infec- ção. Embora o início de GVHG depois do transplante de células tronco seja dependente da apresentação de antígeno direta por APCs do hospedeiro (Science. 1999; 285: 412 - 415; Nat. Med. 2004; 10: 510-517), a apresenta- ção de antígeno indireta por APCs doadores também foi descrita (Nat Med. 2004; 10: 987-992). Em concordância com as descobertas anteriores (Sci- ence. 2002; 295: 2097 - 2100), a severidade de GVHD foi dependente da quantidade de células T infundidas, sinais de GVHD sendo observados den- tro de 10 e 30 dias depois da respectiva infusão de 5 χ 105 ou 1 χ 105 células Τ. A co-administração de GM-CDs acelerou muito a indução de GVHG pelas 105 células T porém, semelhantemente, ao FL-CDs, GM-CDs tratados com timosina alfa-1 preveniu totalmente o efeito (Figura 3C). em termos de sus- cetibilidade de infecção, a sobrevivência não foi modificada depois da infu- são de células T doadoras ou sozinhas ou juntamente com GM-CDs. Ao contrário, semelhantemente aos camundongos que receberam FL-CDs, os camundongos infundidos com GM-CDs tratados com timosina alfa 1 sobrevi- veram à infecção (Figura 3D). Juntos, esses resultados sugerem que, como spCDs, FL-CDs são totalmente competentes na indução da proteção anti- fúngica depois da transferência adotiva em receptores HSCT. Ao contrário, GM-CDs são dotados com imunotoxicidade, incluindo a promoção de infla- mação e GVHD, uma atividade no hospedeiro responsável pelos efeitos re- gulatórios iniciados pela timosina alfa 1 in vitro.
Exemplo 6
CDs induzidas por timosina alfa-1 primadas para respostas anti- fúngicas Th1/Treg
Para determinar se CDs tratadas com Timosina alfa-1 induzirão células T reg in vivo, foram avaliados níveis de produção de TNF-a/IL-10 em homogenatos do pulmão e expressão de genes codificando para IFN-, o fa- tor de transcrição GATA-3 e Foxp3específico para Th2 em células T CD4+ TLN. Foram também avaliados a presença de células T CD4+CD25+ em células pulmonares e TLN, como populações T reg funcionalmente distintas são encontradas nos pulmões e TLN de camundongos com aspergiloses (J. Immunol. 2006; 176:1712-1723). Os resultados mostraram modelos distintos de produção de TNF-a/IL-10 nos grupos diferentes. TNF-a foi alto e IL-010 foi baixo em camundongos ou não tratados ou infundidos com GM-CDs, o contrário sendo verdade em camundongos recebendo FL-CDs e particular- mente GM-CDs tratados com Timosina alfa-1 (Figura 4A). A avaliação da atual produção de IFN-/IL-4 por células T CD4+ revelou que a quantidade de IFN- foi mais alta e que IL-4 inferior em dados camundongos.
GM-CDs tratadas com Timosina alfa-1 ou determinados irres- pectivos FL-CDs de seu tratamento (Figura 4A). Análises PCR mostraram que a expressão de RNAm Ifng esteve sempre presente; RNAm Gata3 foi detectado em camundongos ou não tratados ou tratados com FL-CDs não expostos a Timosina alfa-1, e RNAm Foxp3 foi expresso em determinados camundongos FL-CDs, independente de exposição a Timosina alfa 1, ou determinadas GM-CDs tratadas com Timosina alfa-1 (Figura 4B). Níveis de receptor TNF induzido por glicocorticóide (RTIG) foram avaliados e foram encontrados ser amplamente expressos, com nenhuma diferença significan- te entre os grupos experimentais. Análises citofluorimétricas revelaram que o número de células T CD4+CD25+ aumentaram em TLN e pulmões de ca- mundongos infundidos com qualquer tipo de CD, se não tratado ou tratado com Timosina alfa 1 (Figura 4C). Interessantemente, algum tipo de compar- timentalização diferencial foi observada em que GM-CDs tratadas com Ti- mosina alfa-1 induziram T reg nos pulmões mais que TLN e o oposto foi ver- dadeiro para FL-CDs tratadas com Timosina alfa-1. Células T CD4+CD25+ recuperadas de camundongos que receberam GM-CDs ou FL-CDs tratadas com Timosina alfa-1 não coraram positivamente para o marcador de ativa- ção CD69, como observado com células recuperadas de camundongos que receberam GM-CDs não tratadas (Figura 4C). Consistente com a noção que a migração e ocupação de Iinfonodos drenantes é requerida para aceitação de enxertos, 29 células T CD25+ recuperadas de camundongos que recebe- ram FL-CDs ou GM-CDs tratadas com Timosina alfa-1 também coraram po- sitivamente para o marcador CD62L. Células T reg TLN continham altos nú- meros de células produtoras de IL-10 ou TGF-β (Figura 4A), enquanto célu- las T reg pulmonares continham mais células produtoras de IL-10 que TGF- β·
Todos juntos, esses resultados sugerem que GM-CDs expostas a Timosina alfa-1 convertem uma resposta inflamatória/Th1 para uma res- posta T reg/Th1 protetora sob transferência adotiva in vivo. Entretanto, a descoberta que células T reg induzidas ficam em diferentes compartimentos pode ser relacionada a possíveis diferenças fenotípicas e funcionais. Isto pode ser consistente com a descoberta que a divisão de trabalho ocorre en- tre populações T reg funcionalmente distintas que são coordenadamente ativadas nos pulmões e TLN de camundongos expostos a Aspergillus (J. Immunol. 2006; 176:1712-1723). Alternativamente, após um primeiro nível de ativação e iniciação nos Iinfonodos por reconhecimento cognato, células T reg ativadas podem se tornar células T reg efetoras capazes de trafegar para tecidos infectados onde elas controlam a resposta inflamatória local.
Exemplo 7
Células T reg anti-fúngicas inibem a alorreatividade e inflamação
Para avaliar a atividade supressora de células T reg CD25+, cé- lulas TLN a camundongos que receberam diferentes subgrupos de CD foram avaliados para resposta proliferativa à esplenócitos alogênicos, Aspergillus conidia ou mitógeno. Os resultados mostraram que proliferação alogênica, mas não específica à Aspergillus foi observada em camundongos recebendo células T sozinhas ou juntas com GM-CDs. Em contraste a alorreatividade diminuiu mas a reatividade específica à patógeno recuperada em camun- dongos recebendo FL-CDs ou GM-CDs tratadas com Timosina alfa-1, embo- ra em um grau inferior comparado àquele de doadores controles (Figura 5A). Como a resposta ao mitógeno foi comparável entre os camundongos trata- dos com CD, esses resultados sugerem que células T reg diretamente im- pactam em ambas, a reatividade Th 1 específica a patógeno e a alogênica. Para clarificar esta questão, células T CD4+CD25+ purificadas de TLN foram avaliadas para a habilidade de bloquear a proliferação específica a Aspergil- Ius ou aloantígeno de, e a produção de IFN- por, correspondendo as T CD4+CD25-. Enquanto as T CD4+CD25+ foram hiperresponssivas à aloan- tígenos e Aspergillus, a alorreatividade e as respostas específicas a antíge- no foram ambas reduzidas em presença de células T CD4+CD25+de ca- mundongos recebendo FL-CDs ou GM-CDs tratadas com Timosina alfa-1 (Figura 5B). Como células T reg pulmonares são providas com potente ativi- dade antiinflamatória na aspergiloidose pulmonar (J. Immunol. 2006, 176: 1712-1723), a atividade supressiva de células T CD4+CD25+ pulmonares da atividade efetora anti-fúngica de neutrófilos, tais como TNF-a e produção de oxidante, foi também examinada por causa dessas funções são perfeitamen- te sensíveis a atividade supressora de células T reg (J. Immunol. 2006, 176: 1712-1723). Ambas as funções foram significantemente inibidas pelas célu- las T reg pulmonares e particularmente pela fração T reg induzida por GM- CDs tratadas com Timosina alfa-1 (Figura 5B).
Exemplo 8 Timosina alfa-1 promove mobilização e iniciação anti-fúngica T reg/Th1 de CDs humana
Para avaliar se Timosina alfa 1 pode afetar a iniciação potencial de T reg/Th1 de CDs humanas, GM- ou FL-CDs foram derivadas de células CD14+ periféricas a partir de doadores saudáveis em presença de Timosina alfa 1. Como com culturas de CD murinas, Timosina alfa 1 promoveu a mobi- lização de pCDs CD123+ enquanto diminui aquelas CDs CD1a+ das culturas tratadas com GM-CSF/IL-4.
Nenhum efeito foi observado nas culturas FLT3-L (Figura 6A). Timosina alfa 1 significantemente modificou a sensibilidade microbiana de GM-CDs ou FL-CDs em termos de fagocitose (a partir de 30 a 56% de fago- citose em GM-CDs e de 32 a 58% de fagocitose em FL-CDs). Interessante- mente, entretanto, Timosina alfa 1 também promoveu a fagocitose de am- bos, GM- e FL-CDs derivadas de pacientes em um mês após o transplante (Figura 6B). Em termos de atividade funcional, Timosina alfa 1 converteu as GM-CDs produtoras de IL-12 inflamatórias em pCDs tolerogênicas que, simi- lares a FL-CDs, produziram níveis aumentados de IL-10 (Figura 6C) e prima- ram células T CD4+ para produzirem IL-10 in vitro (Figura 6D). Como pCDs produzindo IFNs do tipo I são conhecidas por participarem na indução e ma- nutenção de tolerância bem como nos efeitos tolerogênicos de Timosina alfa 1, a produção de IFN-a em resposta a Aspergillus conidia ou Zimosan (ten- ciona ser um controle positivo para GM-CDs) ou CpG ODN (um controle po- sitivo para FL-CDs) foram também comparadas. IFN-a foi principalmente produzido por FL-CDs ou GM-CDs tratadas com Timosina alfa-1 (Figura 6C).
Finalmente, foi examinado se o tratamento com Timosina alfa 1 pode modifi- car a habilidade das CDs de ativarem reatividade de célula T específica para fungo- ou aloantígeno. Figura 6E mostra que Timosina alfa-1 não modificou nem a resposta de célula T antígeno-específica induzida por CDs nem a ca- pacidade aloestimulatória de qualquer tipo de CD. Como normalmente, a indução de reatividade de célula T fungo-específica foi totalmente ausente em CDs de pacientes transplantados. Esses dados indicam então que Timo- sina alfa 1, por induzir CDs inflamatórias, pode encontrar os requerimentos para uma bem sucedida iniciação de célula T reg/Th1 anti-fúngica em au- sência de alorreatividade em transplantes hematopoiéticos.
Os resultados obtidos, relatados nos exemplos acima menciona- dos, mostraram que Timosna alfa-1 expande uma fração de pCD em GM- CDs que é competente para função IDO e que pCDs IDO+ são necessárias e suficientes para mediar a imunidade antimicrobiana e tolerância aloantigê- nica em HSCT experimental.
Isto demonstra que Timosina alfa 1 atua como um hormônio na- tural contribuindo para a indução e manuntenção da tolerância periférica na fisiologia e estado parafisiológico.
A presente invenção contempla um pacote terapêutico para dis- pensar ou, para uso na dispensação de um paciente sendo tratado para a prevenção ou tratamento de doença enxerto-versus-hospedeiro ou reações de rejeição de enxerto em transplante de órgãos, compreendendo uma ou mais doses únicas, cada dose única compreendendo uma quantidade de timosina alfa-1, e opcionalmente uma quantidade de uma gente imunossu- pressor.
A presente invenção contempla um artigo de fabricação compre- endendo material de acondicionamento e timosina alfa-1, e opcionalmente um agente imunossupressor, contido dentro do referido material de acondi- cionamento, em que a timosina alfa-1 é terapeuticamente afetiva para a pre- venção ou tratamento de doença enxerto-versus-hospedeiro ou reações de rejeição de transplante em transplante de órgãos, e em que o material de acondicionamento compreende um rótulo que indica que a timosina alfa 1 pode ser utilizada para a prevenção ou tratamento de doença enxerto- versus-hospedeiro ou reações de rejeição de enxerto em transplante de ór- gão.
De acordo com a presente invenção, timosina alfa 1 e opcional- mente o agente imunossupressor podem ser administrados em uma forma separada ou na forma de uma dose unitária compreendendo os ingredientes ativos e opcionalmente diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitá- veis. De acordo com a presente invenção quando a timosina alfa-1 e o agente imunossupressor são administrados na forma separada (isto é, 2 administrações diferentes), os referidos ingredientes ativos podem ser admi- nistrados seqüencialmente (isto é, no mesmo momento) ou seqüencialmente de acordo com o esquema sugerido no rótulo acima mencionado.
No uso de acordo com a invenção, os termos "tratar" ou "trata- mento" caracterizam-se por seus significados usuais que incluem prevenção, proibição, alívio, inibição, melhora, interrupção, contenção, diminuição ou reversão da progressão, ativação ou redução da severidade da GVHD.
No uso de acordo com a invenção, o termo "quantidade efetiva" refere-se a uma quantidade do composto que é capaz de desempenhar o resultado tencionado. Por exemplo, uma quantidade efetiva de timosina alfa- 1, e opcionalmente o agente imunossupressor que é administrados em uma esforço para tratar a GVHD é aquela quantidade que é requerida para pre- venir, proibir, aliviar, melhorar, interromper, conter, diminuir ou reverter a progressão, ou reduzir a severidade da referida GVHD, e a dose diária a ser administrada dependerá, de acordo com o julgamento do médico de primei- ros cuidados, do peso do paciente, idade e condição geral do paciente.
A presente invenção também inclui métodos de empregar as formulações farmacêuticas que contêm como o ingrediente ativo timosina alfa-1, e opcionalmente um agente imunossupressor, em associação com veículos farmacêuticos. Um versado na técnica pode conhecer tais formula- ções e suas fabricações, ver, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEU- TICAL SCIENCES, (16ã ed. 1980).
As formulações podem ser preparadas em uma forma de dose única do ingrediente ativo. O termo "forma de dose única" refere-se a unida- des fisicamente discretas adequadas como doses unitárias para pacientes humanos, cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada de timo- sina alfa-1, e opcionalmente o agente imunossupressor, calculado para pro- duzir o efeito terapêutico desejado, em associação com excipiente farmacêu- tico adequado.
Timosina alfa 1, e opcionalmente o agente imunossupressor po- de ser administrada na forma de uma composição farmacêutica em combi- nação com veículos ou excipientes farmaceuticamente adequados, a pro- porção e natureza dos quais são determinadas pela solubilidade e proprie- dades químicas do composto nos veículos e/ou excipientes selecionados, a via de administração escolhida, e prática farmacêutica padrão.
Composições farmacêuticas são preparadas em uma forma bem conhecida na técnica farmacêutica. Ver, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16ãed. 1980).
O veículo ou excipiente podem ser um material sólido, semi- sólido, ou líquido, que pode ser vir como um veículo ou meio para o ingredi- ente. Veículos ou excipientes adequados são bem conhecidos na técnica. A composição farmacêutica pode ser adaptada para uso oral, inalatório, paren- teral ou tópico e pode ser administrado a um paciente na forma de compri- midos, cápsulas, aerossóis, inalantes, supositórios, solução, suspensões, lipossoma ou semelhantes.
DISCUSSÃO DOS DESENHOS:
FIGURA 1
Timosina alfa 1 expande pCDs a partir de precursores da medula óssea e ativa catabolismo de triptofano
(A)Expressão na superfície de CD11c, CD11b e B220 em CDs derivadas de medula óssea de camundongos C57BL6, TLR9-/- ou IFN-apR -/- e cultiva- dos com GM-CSF/IL-4 (GM-CDs) ou FLT3L (FL-CDs) em presença de Tio- misina alfa-1 (+) ou um peptídeo misturado (). Porcentagem de células duplo positivas é indicada.
(B) Produção de citocina (ELISA) por GM-CDs ou FL-CDs cultivadas em meio livre de soro (1x106 células/mL) com Aspergillus conidia não opsoniza- da (5x105/mL) por 24 horas. O inibidor de IDO, 1-MT foi adicionado a 2 μΜ. Dados são resultados agregados a partir de três experimentos independen- tes. O limite de detecção (pg/mL) dos ensaios foram < 16 para IL-12p70 e < 12 para IL-10.
(C) Função IDO aumentada e expressão em CDs derivadas como em (A). Células foram avaliadas ara a expressão da proteína IDO por imunoblotting e para produção de quinunerina. Controles positivo e negativo consistiram de transfectantes MC24 expressando a proteína IDO e células MC22 trans- fectadas com mock, respectivamente (não mostrado na figura).
Dados são médias ± EP de amostras em triplicatas em um expe- rimento representativo de três.
FIGURA 2
Células T reg ativadas por IDO + CDs induzidas por Timosina alfa 1 in vitro
(A)Freqüência de células T CD4+ esplênicas produzindo IFN-.- /IL-10 ativadas por GM-CDs tratadas com timosina alfa-1 pulsadas com Αε- pergillus ou FL-CDs. 1-MT estava presente nas culturas selecionadas. Pla- cas foram lidas com o AID-EIiSpot Reader System (Amplimedical). Valores são médias ± EP por 106 células de amostras de 3-5 experimentos, calcula- dos utilizando replicatas de duas diluições seriadas. (*) P < 0,05, células não expostas versus expostas a conidia; (**) P < 0,05, células não expostas ver- sus expostas a timosina.
Números representam a porcentagem de células dupla positivas.
FIGURA 3
CDs tratadas com timosina alfa 1 protegem de aspergilose em HSCT expe- rimental
Camundongos C57BU6 Ietalmente irradiados receberam 2x106 células de medula óssea alogênicas depletadas de células T a partir de ca- mundongos BALB/c 2 semanas antes da injeção intra-raquidiana de 2χ10δ/80 μΙ_ de salina contendo Aspergillus conidia. Um e sete dias após o transplante, camundongos receberam GM- ou FL-CDs pulsadas com Asper- gillus e crescidas em timosina alfa 1, intraperitonealmente.
Resistência à infecção foi avaliada em termos de MST (tempo mediano de sobrevivência em dias) e crescimento fúngico no pulmão (pg/conteúdo de glicosamina do órgão, barras indicando erro padrão) 3 dias após infecção ou no tempo de morte (A). Também mostrado na figura são patologia pulmonar inflamatória (B), ocorrência de reatividade GVHD (C) e susceptibilidade à infecção (D) em presença de células T doadores. (B) Se- ções coradas com ácido de Schiff periódicas foram preparadas a partir de pulmões de camundongos infectados com Aspergillus conidia 3 dias antes ou de não serem tratados (nenhum) ou de receberem diferentes tipos de CDs. Sinais severos de danos da parede brônquica e necrose e recrutamen- to de raras célula inflamatória foram observados nos pulmões de camundon- gos não tratados ou tratados com GM-CD, como oposto aos camundongos recebendo GM-CDs tratadas co timosina alfa 1 ou FL-CDs, cujos pulmões foram caracterizados por poucos infiltrados de células inflamatórias de cura com nenhuma evidência de dano da parede brônquica e resposta inflamató- ria. Aumento χ 200. (*) P< 0,05, camundongos recebendo CDs vs camun- dongos não tratados. (C)Indices patológicos para camundongos representa- tivos recebendo, com o enxerto, números diferentes de células T doadoras sozinhas ou junto com diferentes tipos de CD. O grau de GVHD sistêmico foi avaliado por um sistema de pontuação que soma mudanças em cinco parâ- metros clínicos: perda de peso, postura (arqueamento), atividade, textura da pele, e integridade da pele (índice máximo = 10). (*) P < 0,05, camundongos recebendo as células T + células T versus GM-CDs - timosina alfa 1 + GM- CDs não tratadas. (D) Sobrevivência a infecção em camundongos tratados como em (C).
FIGURA 4
CDs induzidas por timosina alfa 1 primam para respostas T reg/Th1 anti- fúngicas in vivo
Modelos de respostas T reg/Th/inflamatórias 3 dias após a inje- ção em camundongos tratados como na legenda da Figura 2.
(A)Niveis de TNF-a/IL-10 foram avaliados por ELISA específico nos homo- genatos do pulmão e produção de IFN-/IL-4 foram avaliados em células T
CD4+ de TLN co-cultivadas com CDs pulsadas com Aspergillus. Barras indi- cam erro padrão. Células T CD4+CD25+ TLN produzindo IL-10 ou TGF-β foram numeradas por ensaio de ELISPOT. Resultados são expressos como o número médio de células produzindo citocina (± EP) por 2x105 células. *P < 0,05, CD de camundongos não tratados versus tratados . (**) P < 0,05, CDs não tratadas versus tratadas com timosina alfa 1.
(B) RNA total foi extraído com células T CD4+ purificadas recentemente de TLN de camundongos tratados ou não tratados (nenhum). Estas expressões de diferentes RNAms em cada população celular foram determinadas por RT-PCR. A expressão de um gene de manutenção , Hapdh RNAm, foi utili- zado como um controle interno. Os dados mostrados são resultados repre- sentativos de três experimentos.
(C) Análise fenotípica de células isoladas de pulmão ou TLN de camundon- gos infundidos ou não (nenhum) com diferentes tipos de CDs, (-) indicando camundongos não infectados, não tratados. Células T CD4+ foram seqüen- cialmente reagidas com mAcs anti-CD69 conjugado com FITC (clone HI.2F3) e anti-CD25 conjugado com PE. Números representam a porcenta- gem de células positivas sob um total de células analisadas. Coloração con- trole de células com Ac irrelevante foi utilizada para obter os valores de fluo- rescência basais. Histogramas são representativos de um de quatro experi- mentos independentes.
FIGURA 5
Células T reg induzidas por timosina alfa 1 inibem alorreatividade (A)Linfócitos T CD4+ murinos de TLN de camundongos transplantados fo- ram estimulados com esplenócitos alogênicos irradiados, CDs esplênicas autólogas estimuladas com conidia ou Concanavalina A. A proliferação de célula T foi avaliada em um ensaio de MLR de 5 dias e medida por incorpo- ração de H3 timidina nas últimas 8 horas, (*) P < 0,05, camundongos doado- res versus transplantados. (***) P < 0,05, CDs não tratadas versus tratadas com timosina alfa 1. (B e C) Atividade proliferativa e produção de IFN- por células T CD4+CD25- a partir de camundongos recipientes contra CDs es- plênicas autólogas pulsadas com Aspergillus conida (B) CDs esplênicas (BALB/c) alogenêicas (C) em presença de células T CD4+CD25+ de TLN a partir de camundongos recipientes recebendo FL-CDs (a) ou GM-CDs - ti- mosina alfa 1 (b). Os dados mostrados são resultados representativos de um ou três experimentos independentes. (*) P < 0,05, células não estimuladas versus reatividade específica a Aspergillus- ou aloantígeno. (**) P < 0,05, CDs não tratadas versus tratadas com timosina alfa 1. (D) Neutrófilos perito- neais (PMN) foram expostos a conidia em repouso em presença de células T CD4+CD25+ a partir de FL-CD tratadas (a) ou camundongos tratados com GM-CD - timosina alfa 1 (b) por 60 minutos (para produção oxidante, ex- pressos em nanomols 02-/106 células) ou 24 horas para produção de citoci- na (pg/mL por ELISA). (*) P < 0,05, PMN não exposto versus exposto a co- nidia. (**) P < 0,05, PMN expostos a T reg versus não expostos. (***) P < 0,05, CD25+a) versus CD25+ b) T reg. Figura 6
Timosina alfa 1 promove mobilização e iniciação anti-fúngica de T reg / Th1 de CDs humanas
(A)Expressão na superfície de CD11c, CD1a e CD123 de CDs derivadas de células CD14+ periféricas de doadores diferentes com GM-CSF/IL-4 (GM- CDs) ou FLT3L (FL-CDs) em presença de tiomisina alfa 1. Porcentagem de células positivas é indicada.
(B) Fagocitose de conidia por GM- ou FL-CDs expostas (+) ou não (-) à timosina alfa 1 a partir de sete recipientes de células T depletou o
HSCT haploidêntico. Os dados são as médias ± EP e expressos como % de internalização (números dentro das figuras). (*) P < 0,05, células não trata- das versus tratadas com timosina alfa 1.
(C) Produção de citocina (pg/mL por ELISA) por CDs induzidas por timosina alfa 1 a partir de doadores saudáveis cultivadas em meio livre de soro (1x106 células /mL) com Aspergillus conidia não opsonizada (5x105/mL) ou 10 μ/mL de Zimosan ou 2 pg/mL de CpG-B IDN 2006 por 24 horas. Os dados mostrados são resultados agregados a partir de três expe- rimentos independentes e apresentados na média ± DP. Os limites de de- tecção (pg/mL) dos ensaios foram : < 2 para IL-12p70, < 5 para IL-10, e < 3 para ng/mL para IFN-a.
(D) Produção de citocina por clones de células T CD4+ específicas para As- pergillus do sangue periférico a partir de doadores saudáveis em resposta a CDs tratadas com .a1 pulsadas com Aspergillus. Barras indicam erro padrão.
Os limites de detecção (pg/mL) dos ensaios foram: < 0,5 para IL-4 e IFN-. *P<0,05, células não estimuladas vs estimuladas com conidia. (**) P<0,05, células não expostas versus expostas a timosina alfa 1. (E) Freqüência de clones de célula T alorreativas ou específicas para Asper- gillus respondendo a tipos diferentes de CDs pulsadas com fungo ou CDs não pulsadas, respectivamente, a partir de doadores saudáveis ou pacientes transplantados. Clones em crescimento foram avaliados para especificidade após 2 dias de estimulação com CDs. (*) P<0,05. Células sangüíneas perifé- ricas versus GM-CDs (-). (**) P <0,05, HSCT-CDs versus todas as outras CDs. Nd1 não feito.
Claims (8)
1. Uso da timosina alfa 1 para preparar um medicamento útil para a prevenção ou tratamento da doença enxerto-versus-hospedeiro ou reação de rejeição a enxerto em transplante de órgãos, num indivíduo hu- mano.
2. Uso, de acordo com a Reivindicação 1, no qual o indivíduo de mamífero é um paciente humano.
3. Uso, de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, no qual o paci- ente é um receptor de células, tecido ou órgão.
4. Uso, de acordo com a Reivindicação 3, no qual as células, tecidos ou órgãos para transplante é selecionado do grupo compreendendo: células tronco, células tronco hematopoiéticas, medula óssea, coração, fíga- do, rim, pulmão, pâncreas, intestino delgado, córnea ou pele.
5. Uso, de acordo com a Reivindicação 1, no qual o paciente está num regime de condicionamento mieloablativo.
6. Uso, de acordo com a Reivindicação 1, no qual o paciente está num regime de condicionamento não-mieloablativo.
7. Uso, de acordo com a Reivindicação 1, no qual a timosina al- fa 1 é administrada ao paciente numa quantidade farmaceuticamente eficaz numa janela de tempo predeterminada e/ou depois do transplante.
8. Uso, de acordo com a Reivindicação 1, no qual a timosina al- fa 1 é administrada juntamente com um agente imunossupressor seleciona- do do grupo compreendendo prednisona, metilprednisolona, ciclofosfamida, ciclosporina A, FK506, talidomida, azatioprina, Daclizumab, Infliximab, MEDI- -205, abx-cbl ou ATG.
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|---|---|---|---|
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] | ||
| B08K | Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette] |