BRPI0712791A2

BRPI0712791A2 - co-cristal de maleato de azd 1152, forma cristalina, método de preparação de um co-cristal de maleato de azd 1152, composição farmacêutica, e, uso de um co-cristal de maleato de azd 1152

Info

Publication number: BRPI0712791A2
Application number: BRPI0712791-0A
Authority: BR
Inventors: George Joseph Sependa; Richard Storey
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2012-09-04
Also published as: ECSP088890A; AU2007251304A1; CL2007001388A1; CA2650519A1; UA95108C2; WO2007132227A1; GB0609621D0; EP2027114A1; NO20084580L; US20080045481A1; RU2008149242A; UY30351A1; CN101448823A; MX2008014550A; US7625910B2; KR20090009297A; ZA200809172B; JP2009537498A; AR060963A1; SA07280243B1

Abstract

"CO-CRISTAL DE MALEATO DE AZD 1152, FORMA CRISTALINA, MéTODO DE PREPARAçãO DE UM CO-CRISTAL DE MALEATO DE AZD 1152, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, USO DE UM CO-CRISTAL DE MALEATO DE AZD 1152". A presente invenção refere-se a um novo co-cristal de diidrogeno fosfato de 2-{etil[3-({4-[(5-{ 2- (3-fluorofenil) amino]-2-oxoetil}-1H-pirazol-3-il)amino]quinazolin-7-il}oxi)propil}amino } etila (AZD 152) que é um inibidor de aurora quinase, que é últil no tratamento de doenças hiperproliferativas, tais como o câncer.

Description

"CO-CRISTAL DE MALEATO DE AZD 1152, FORMA CRISTALINA, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM CO-CRISTAL DE MALEATO DE AZD 1152, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM CO- CRISTAL DE MALEATO DE AZD 1152"

A presente invenção refere-se a um novo co-cristal e de um modo mais particular a uma nova forma de co-cristal de diidrogeno fosfato de 2- { etil [3 -({4- [(5 - {2- [(3 -fluorofenil) amino]-2-oxoetil}-lH-pirazol-3-il) amino]quinazolin-7-il}oxi) propil] amino}etila (aqui referido como a AZD 1152), que é um inibidor de aurora quinase, que é útil no tratamento de doenças hiperproliferativas, tais como o câncer. De um modo mais específico, a invenção refere-se a um co-cristal de maleato de AZD 1152, a um processo para a preparação de um co-cristal de maleato de AZD 1152, a composições farmacêuticas contendo um co-cristal de maleato de AZD 1152, ao uso de um co-cristal de maleato de AZD 1152 na manufatura de um medicamento para o tratamento de doenças hiperproliferativas tais como o câncer, e a métodos para o tratamento de doenças hiperproliferativas, tais como o câncer, no corpo humano ou animal, através da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um co-cristal de maleato de AZD 1152. Esta invenção refere-se também a uma forma cristalina particular de um co-cristal de maleato de AZD 1152.

O câncer (e outras doenças hiperproliferativas) é caracterizado pela proliferação celular descontrolada, que ocorre quando a regulação normal da proliferação celular é perdida. Esta perda parece, muitas vezes, ser o resultado do dano genético a vias celulares que controlam um progresso da célula através de seu ciclo celular.

Em eucariotos, uma cascata ordenada de fosforilação de proteína é considerada como controlando o ciclocelular. Várias famílias de proteína quinases, que desempenham funções críticas nesta cascata, foram identificadas. A atividade de muitas destas quinases é aumentada em tumores humanos, quando comparados ao tecido normal. Isto pode ocorrer através ou de níveis aumentados de expressão de proteína (por exemplo, como um resultado da amplificação do gene), ou através de alterações na expressão de co- ativadores ou de proteínas inibitórias.

O primeiro identificado, e mais amplamente estudado destes reguladores do ciclo celular são as quinases dependentes de ciclina (ou CDKs). Mais recentemente, as proteínas quinases, que são estruturalmente distintas da família CDK, foram identificadas e consideradas como desempenhando funções críticas na regulação do ciclo celular. Estas quinases parecem também ser importantes na oncogênese e incluem os homólogos humanos das proteínas Drosophila aurora e S. cerevisiae Ipl 1. Os três homólogos humanos destes genes aurora -A, aurora -B e aurora -C (também conhecidos como aurora2, Aurorai e aurora 3, respectivamente, codificam as proteínas serina- treonina quinases reguladas pelo ciclo celular (sumariadas em Adams et al., 2001, Trends in Cell Biology. 11 (2) : 49-54). Estes apresentam um pico de expressão e atividade de quinase através de G2 e mitose. Várias observações implicam o envolvimento de proteínas aurora humanas no câncer. O gene aurora A mapeia o cromossoma 20 ql3, uma região que e freqüentemente amplificada em tumores humanos, que incluem tanto os tumores da mama e os tumores do cólon. Aurora A pode ser o principal gene alvo deste amplicon, pois o DNA de aurora - A é amplificado e o mRNA é expressado em mais do que 50% de cânceres colorretais humanos primários. Nestes tumores, os níveis de proteína aurora -A parecem estar grandemente elevados, comparados ao tecido normal adjacente. Em adição, a transfecção de fibroblastros de roedores com aurora- A humana conduz à transformação, conferindo a capacidade para o crescimento em ágar mole e a formação de tumores em camundongos nus (Bischoff et al., 1998, The EMBO Journal. 17 (11): 3052 - 3065). Outros trabalhos (Zhou et al., 1998, Nature Genetics, 20 (2): 189-93) demonstraram que a super- expressão de aurora- A conduz a um aumento no número de centrossomas e a um aumento na aneuploidia, um evento conhecido no desenvolvimento de câncer.

Foi também demonstrado que existe um aumento na expressão de aurora- B (Adams et al., 2001, Chromsoma. 110 (2): 65 -74 e de aurora- C (kimura et al., 1999, Journal of Biological Chemisry, 274 (11) ; 7334 - 40) em células de tumor quando comparadas a células normais. A Aurora - B é super- expressada em células e câncer e foi demonstrado que níveis aumentados de aurora- B podem estar correlacionados com estágios avançados de câncer colorretal (Katayama et al. (1999), J. Natl. Câncer Inst. 91:1160). Além disso, um relatório sugere que a super- expressão de aurora B induz a aneuploidia através da fosforilação aumentada de histona H3 em serina IOe que as células que super- expressam aurora - B formam tumores mais agressivos, que desenvolvem metástases (Ota, T. et al., 2002, Câncer Res., 62: 5168 - 5177). Aurora - B é uma proteína passageira de cromossoma, que existe em um complexo estável com pelo menos três outras proteínas passageiras, Survivin, INCENP e Borealin (Carmena M . et al. 2003, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4: 842 - 854). A Survivin é também regulada para cima no câncer e contém um domínio BIR (Inibidor de Baculovirus de Repetição de proteína de apoptose (IAP) e pode, portanto, desempenhar uma função na proteção de células de tumor contra a apoptose e/ ou a catástrofe mitótica.

Com relação a aurora- C, a sua expressão é tida como estando restrita aos testículos, mas foi considerado como estando super- expressada em várias linhagens de câncer. (Katayama H. et al., 2003, Câncer and Metastasis Reviews, 22: 451-464).

De um modo importante, foi também demonstrado que a eliminação de expressão de aurora- A e da função através de tratamento de oligonucleotídeo anti- sentido de linhagens celulares de tumor humano (WO 97/ 22702 e WO 99/37788) conduz a uma interrupção do ciclo celular e exerce um efeito antiproliferativo nestas linhagens celulares de tumor. De um modo adicional, foi demonstrado que os inibidores de molécula pequena de aurora- A e de aurora -B possuem um efeito antiproliferativo em células de tumor humano (Keen et al., 2001, Poster # 2455, American Association of Câncer Research Annual Meeting), como possui também a eliminação seletiva da expressão de aurora - B isoladamente através de tratamento de sRNA (Ditchfield et al., 2003, Journal of Cell Biology, 161 (2) : 267 - 280). Isto indica que a inibição da função de aurora- A e/ ou de aurora -B terá um efeito antiproliferativo, que pode ser útil no tratamento de tumores humanos e de outras doenças hiperproliferativas. A inibição de aurora quinases como uma abordagem terapêutica a estas doenças pode apresentar vantagens significativas em relação as vias de sinalização alvo do ciclo celular (por exemplo, aquelas ativadas através de tirosina quinases do receptor do fator de crescimento, tais como o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) ou outros receptores). Como o ciclo celular está finalmente a jusante de todos estes diversos eventos de sinalização, as terapias celulares dirigidas ao ciclo celular, tais como a inibição de aurora quinases, seriam previstas como sendo ativas contra todas as células de tumor em proliferação, enquanto que as abordagens dirigidas a moléculas de sinalização específicas (por exemplo, EGFR) seriam previstas para que fossem ativas apenas no subconjunto de células de tumor que expressam aqueles receptores. Acredita-se também que exista uma "conversa cruzada" entre estas vias de sinalização, significando que a inibição de um componente pode ser compensada por outro.

Os inibidores de aurora quinases são descritos nos Pedidos de Patente Internacionais WO 03/ 55491 e WO 2004/ 05871, e em particular a WO 2004/ 058781 expõe um composto que possui a fórmula estrutural que se segue, aqui referida como a AZD 1152: AZDl 152

<formula>formula see original document page 6</formula>

A AZDl 152 é uma pró-droga, que é convertida de um modo rápido e completo (no plasma humano) para a porção ativa aqui referida como AZDl 152 HQPA:

<formula>formula see original document page 6</formula>

AZDl 152 HQPA

A AZDl 152 HQPA é um inibidor competitivo de ATP e inibidor reversível de aurora quinases, com atividade potente contra aurora A, B- INCENP e C- INCENP (Ki's 1369 ± 419, 2 nM, 0, 359 ± 0, 386 nM e 17,03 ± 12, 2 nM, respectivamente). O AZD 1152 é considerado como inibindo o crescimento de tumor em um painel de xenoenxertos de tumor humano colorretal (SW 620, HCTl 16, Colo205) e de pulmão (A 549, Calu- 6), com significação estatística.

O AZD 1152 é exposto na WO 2004/ 058781 como o sal de diidrocloreto e como a base livre em formas hidratadas. E exposta, em particular, a forma livre no triidrato para a forma de tetraidrato.

A partir de uma perspectiva de manufatura, as formas hidratadas são problemáticas, pois elas requerem com que os controles estejam em posição durante a manufatura, secagem, armazenamento e processamento. Em adição, a obtenção e a manutenção de uma amostra do composto com um composto estequiométrico consistente para a razão de água e difícil. No caso das formas previamente expostas de AZD 1152, e em particular no caso da forma livre, as moléculas são apenas ligadas, de um modo solto, a cada molécula de AZD 1152, de tal modo que a extensão de associação e de desassociação de moléculas de água à droga AZDl 152 varia grandemente com a temperatura e a umidade relativa. Portanto, para um determinado peso de AZD 1152, a quantidade efetiva de AZD 1152 em termos do número de moléculas de AZD 1152 irá depender da temperatura e da umidade relativa, à medida em que o conteúdo de água varie. A eficácia de qualquer dose determinada pelo peso é, deste modo, também dependente da temperatura e da umidade relativa à qual ela é exposta. A Sorção de Vapor Dinâmica foi usada para medir a variação no nível de água associada com AZDl 152 com umidade.

A WO 2004/ 058781 expõe, em termos gerais, certos sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui expostos. AZD 1152 é apenas exposto com o sal de diidrocloreto e com a forma livre. Nenhuma outra forma de AZD 1152 é mencionada. Em particular, a WO 2004/ 058781 não expõe qualquer outro cristal de AZD 1152 e, com certeza, não considera se quaisquer co- cristais particulares de compostos particulares deveriam possuir benefícios surpreendentes e em partículas não possuiriam benefícios que melhorassem os problemas aqui discutidos.

De um modo inesperado e surpreendente, verificamos que o co-cristal de maleato de AZD 1152 existe em uma forma anidra, que é substancialmente não- higroscópica. Além disso, embora a razão estequiométrica da droga para maleato possa variar dentro de uma faixa de, por exemplo, 0,8:1 a 1,2 :1, ou de 0,9:1 a 1,1: 1, verificamos que o co-cristal de maleato de AZD 1152 aqui exposto possui uma razão estequiométrica reprodutível de droga para maleato de substancialmente 1: 1. A eficácia de uma dose em peso de co-cristal de maleato de AZD 1152 é portanto afetada pela temperatura e pela umidade relativa em uma extensão muito menor do que aquela da forma livre, do sal de diidrocloreto e de outras formas de co- cristal de AZD 1152, que foram avaliadas. Em adição, o co-cristal de maleato de AZD 1152 é mais fácil de ser manufaturado, pois existe menos necessidade de controlar os níveis de umidade no processo de manufatura. A natureza anidra do co-cristal de maleato significa ainda que será possível formulá-lo usando condições aquosas limitadas e/ou ambientes de alta temperatura, devido ao risco mais baixo de hidratação/ desidratação durante condições de processamento que utilizam ambientes aquosos, por exemplo, a granulação a úmido.

Em adição, foi verificado que um co-cristal de maleato de AZD 1152 contém, de um modo surpreendente, um menor teor de impurezas do que a forma livre. De modo particular, parece que certas impurezas recalcitrantes, que estão presentes na forma livre, estão presentes, de um modo surpreendente, em uma extensão muito menor após a conversão da forma livre à forma de maleato.

Deste modo, a presente invenção provê um co-cristal de maleato de AZD 1152.

Para evitar quaisquer dúvidas, os termos "co-cristal de maleato de AZD 1152", "co-cristal de maleato AZD 152" ou "maleato AZD 1152" (ou qualquer outro termo similar aqui suado) refere-se a todas as formas de associação entre AZD 1152 e o ácido maleico, incluindo as formas de sal. De um modo particular, estes termos abrangem:

(i) uma associação não- iônica entre o AZD 1152 e o ácido maleico (isto é, em que não ocorreu transferência de próton entre a droga e o ácido maleico); ou

(ii) uma interação iônica, em que a transferência de próton entre o AZD 1152 e o ácido maleico ocorreu, de modo a formar um sal de maleato de AZD 1152, ou

(iii) misturas de (i) e (ii) acima. Em uma modalidade particular da invenção, o co-cristal de maleato compreende uma associação não- iônica entre a droga AZD 1152 e o ácido maleico (isto é, em que não ocorreu transferência de próton entre a droga e o ácido maleico).

Em uma modalidade alternativa da invenção, o co-cristal de maleato é um sal de maleato de AZD 1152.

Em uma modalidade particular, um co-cristal de maleato de AZD 1152 é formado pela mistura da forma livre de AZD 1152 com ácido maleico, em um solvente adequado, tal como metanol, sulfóxido de dimetila (DMSO) ou uma mistura de DMSO com metanol, acetonitrila, e outros solventes similares. O co-cristal de maleato pode ser isolado deixando com que ocorra a cristalização e então isolando o material cristalino resultante. A identidade de um co-cristal de maleato de AZD 1152 da presente invenção pode ser confirmada através de análise de ressonância magnética nuclear por próton (RMN).

Deve ser entendido que um composto ou um co-cristal da invenção pode exibir o fenômeno de tautomerismo e que os desenhos das fórmulas neste relatório representam apenas uma das possíveis formas tautoméricas. Deve ser entendido que a invenção abrange qualquer forma tautomérica, que possua uma atividade inibitória de Aurora quinase e, em particular, atividade inibitória de Aurora-A e/ ou Aurora- B quinase, e não está simplesmente limitada a qualquer forma tautomérica utilizada nos desenhos das fórmulas.

A presente invenção também se refere a uma forma cristalina particular do co-cristal de maleato de AZD 1152. Esta forma cristalina é preparada através da cristalização do cristal de maleato de AZD 1152 a partir de um solvente orgânico, tal como uma mistura de metanol e de sulfóxido de dimetila (DMSO). Outros detalhes experimentais são providos nos Exemplos.

Deste modo, a invenção provê uma forma cristalina do co- cristal de maleato de AZD 1152.

A forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152 é caracterizada pelo fato de que ela provê um padrão de difração de raio X no pó, substancialmente como mostrado na Figura 1.

Os picos de difração de pó por raio X para a forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152 são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 10</column></row><table>

De acordo com a presente invenção, é provida uma forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, em que o referido co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó com pelo menos um pico específico em cerca de 2-teta = 15,2°.

De acordo com a presente invenção, é provida uma forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, em que o referido co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó com picos específicos em cerca de 2-teta= 12,9°.

De acordo com a presente invenção, é provida uma forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, em que o referido co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó com picos específicos em cerca de 2-teta = 15,2 ou 10,2°.

De acordo com a presente invenção, é provida uma forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, em que o referido co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó com picos específicos em cerca de 2-teta =18,1

De acordo com a presente invenção, é provida uma forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, em que o co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó com pelo menos um pico específico em cerca de 2-tetra = 10,2°, 12, 9o, 15, 2o ou 18,1°.

De acordo com a presente invenção, é provida uma forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, em que o referido co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó com picos específicos em cerca de 2-teta = 12, 9o e 15, 2o e/ ou 10,2°.

De acordo com a presente invenção, é provida uma forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, em que o referido co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó com picos específicos em cerca de um de ou combinação dos valores 2-teta0 apresentados na Tabela 1.

De acordo com a presente invenção, e provida uma forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, em que o referido co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó substancialmente idêntico que o padrão de difração de raio X no pó apresentado na Figura 1.

Quando é aqui mencionado que a presente invenção refere-se à forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152, o grau de cristalinidade, conforme determinado por dados de difração de pó por raio X é, de um modo conveniente, maior do que cerca de 60%, de um modo mais conveniente maior do que cerca de 80%, de um modo preferido maior do que cerca de 90%. Nos parágrafos precedentes, que definem os picos de difração de pó por raio X para as formas cristalinas do co-cristal de maleato de AZD 1152, o termo " a cerca de " é usado na expressão " a cerca de 2- teta = ..." para indicar que a posição precisa dos picos (isto é, os valores de ângulo 2- teta citados) não devem ser construídos como sendo valores absolutos, devido ao fato de que, como será apreciado por aqueles versados na arte, a posição precisa dos picos pode variar ligeiramente entre uma máquina e outra, por exemplo a partir de uma amostra para outra, ou como um resultado de variações leves na medição das condições utilizadas. É também mencionado nos parágrafos precedentes, que as formas cristalinas do co-cristal de maleato de AZD 1152 proporcionam padrões de difração de pó por raio X substancialmente idênticos aos padrões de difração de pó por raio X apresentados na Figura 1, e possuem substancialmente os picos mais proeminentes (valores de ângulo 2-teta) mostrados na Tabela 1 e em particular a cerca de 2- teta = 10, 2°, 12, 9°, 15, 2° ou 18, 1°. Será apreciado que o uso do termo " substancialmente" neste contexto tem também a intenção de indicar que os valores de ângulo 2-teta dos padrões de difração de pó por raio X podem variar ligeiramente a partir de uma máquina para a outra, a partir de uma amostra para a outra, ou como um resultado de variações leves nas condições de medição utilizadas, de tal modo que as posições de pico apresentadas na Figura ou cotadas na Tabela não devem ser novamente construídas como valores absolutos.

A este respeito, é conhecido na técnica que pode ser obtido um padrão de difração de raio X no pó, que possui um ou mais erros de medição, dependendo das condições de medição (tais que um equipamento, preparação de amostra, ou máquina usada). De um modo particular, é geralmente conhecido que as intensidades em um padrão de difração de raio X no pó podem flutuar, dependendo das condições de medição e da preparação da amostra. Por exemplo, as pessoas versadas na técnica de difração de pó por raio X irão perceber que a intensidade relativa dos picos pode ser afetada por, por exemplo, grãos com tamanho acima de 30 mícrons e com razões de aspecto não- unitárias, o que pode afetar a análise das amostras. A pessoa versada na técnica irá perceber que a posição dos reflexos pode ser afetada pela altura precisa, na qual a amostra é assentada do difractômetro e a calibração zero do difractômetro. A planaridade superficial da amostra pode ter também um pequeno efeito. Deste modo, aquele versado na técnica irá apreciar que os dados do padrão de difração aqui apresentados não devem ser construídos como absolutos (para informação adicional, vide Jenkins, R & Snyder, R. L.K. " Introduction to X- Ray Powder Diffractmetry", John Wiley & Sons, 1966). Portanto, deve ser entendido que a forma cristalina do co- cristal de maleato de AZD 1152 da presente invenção não está limitada aos cristais, que fornecem padrões de difração de pó por raio X idênticos aos padrões de difração de pó por raio X apresentados na Figura 1, e que quaisquer cristais, que fornecem padrões de difração de pó por raio X substancialmente idênticos àqueles mostrados na Figura 1 recaem dentro do escopo da presente invenção. Uma pessoa versada na técnica de difração de pó por raio X é capaz de julgar a identidade substancial dos padrões de difração de pó por raio X.

De um modo geral, um erro de medição de um ângulo de difração em um difractograma de raio X no pó é de cerca de 2-teta = 0, 5o ou menos (ou, de um modo mais adequado, de cerca de 2-teta = 0,2° ou menos) e um tal grau de um erro de medição deveria ser levado em conta, quando da consideração do padrão de difração de raio X no pó na Figura 1, e quando da interpretação das posições de pico referidas no texto acima e na Tabela 1. Além disso, quando é mencionado, por exemplo, que o co-cristal possui um padrão de difração de raio X no pó com pelo menos um pico específico em cerca de 2- teta = 15, 2o (ou qualquer um dos ângulos acima mencionados) então este pode ser interpretado como sendo 2- teta = 15, 2° mais ou menos 0,5°, ou 2- teta = 15,2 0 mais ou menos 0,2° C.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provido um método de preparação de um co-cristal de maleato de AZD 1152, como aqui definido, o referido método compreendendo o estágio de misturar uma solução da forma livre de AZD 1152 com ácido maleico, em um solvente adequado, tal como metanol, N-metil-2-pirrolidona, sulfóxido de dimetila (DMSO) ou uma mistura de DMSO com metanol, acetonitrila, e outros solventes similares. O método pode ainda compreender os estágios de cristalização, e de um modo opcional, isolamento do co-cristal de maleato de AZD 1152 cristalino assim formado.

O processo pode, de um modo adicional, compreende os estágios adicionais de lavagem do co-cristal de maleato de AZD 1152 com um solvente adequado, e secagem do co-cristal de maleato de AZD 1152.

De um modo adequado, a forma livre de AZD 1152 é dissolvida em um solvente adequado (tal que sulfóxido de dimetila, metanol uma mistura dos mesmos ou N-metil-2-pirrolidona) e geralmente misturada com uma solução de ácido maleico (que é dissolvida ou no mesmo ou em um solvente compatível). De modo alternativo, o ácido maleico sólido pode ser adicionado à solução da forma livre de AZD 1152 (ou vice-versa, isto é, a solução da forma livre de AZDl 152 pode ser adicionada ao ácido maleico sólido). De um modo adequado, a solução é agitada de modo a facilitar a mistura da forma livre isenta de AZD 1152 e do ácido maleico adicionado. Os materiais (de um modo ideal, mas não exclusivamente em uma razão de 1: 1) podem ser misturados em temperatura ambiente, embora o procedimento possa ser também executado em temperaturas mais altas.

Qualquer método adequado, conhecido na técnica para o isolamento da forma de maleato cristalina de AZD 1152 pode ser usado. De um modo adequado, o co-cristal de maleato de AZD 1152 é coletado através de filtração. De um modo preferido, o co-cristal de maleato lavado de AZD 1152 é secado sob vácuo.

De um modo geral, uma razão da forma livre de AZD 1152: ácido maleico de 1:1 é desejada. E desejado que uma razão de 1:1 possa ser obtida através da mistura da forma livre de AZD 1152 e de ácido maleico em composições em qualquer ponto na faixa de 0,6 - 1,4 da forma livre de AZD 1152: 1,0 de ácido maleico. De um modo adequado, a razão da forma livre de AZD 1152: ácido maleico na mistura está dentro da faixa de 0,9- 1,1 e de modo particular de 1,0 - 1,1 da forma livre de AZD 1152 : para 1,0- 1,1 de ácido maleico. De um modo geral, deve ser usado um excesso de ácido maleico e, de modo particular a razão de forma livre de AZD 1152 : ácido maleico na mistura está dentro da faixa de 0,6 -1,0 e de modo particular de 0,9 -1,0 da forma livre de AZD 1152 : 1,0 de ácido maleico.

O co-cristal de maleato de AZD 1152 irá, de um modo típico, ser autocristalizado, mas será apreciado por aquele versado na técnica que a semeadura pode ser usada, ser requerido ou desejado, de modo a promover a formação do co-cristal.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provida uma composição farmacêutica, que compreende um co-cristal de maleato de AZD 1152, conforme aqui definido em associação com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições da invenção podem estar em uma forma adequada para o uso oral (por exemplo, como comprimidos, pastilhas, cápsulas moles ou duras, suspensões aquosas ou oleosas, emulsões, pós dispersáveis ou grânulos, xaropes ou elixires), para o uso tópico (por exemplo, como cremes, ungüentos, géis, ou soluções aquosas ou oleosas ou suspensões), para a administração através de inalação (por exemplo, como um pó finamente dividido ou como um aerossol líquido), para a administração através de insuflação (por exemplo como um pó finamente dividido) ou para a administração parenteral (por exemplo, como uma solução aquosa ou oleosa estéril) ou para a administração parenteral (por exemplo, como uma solução aquosa ou oleosa estéril, para a dosagem intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intramuscular ou como um supositório para a dosagem retal).

As composições da invenção podem ser obtidas através de procedimentos convencionais, através do uso de excipientes farmacêuticos convencionais, bem conhecidos na técnica. Deste modo, as composições destinadas ao uso oral podem conter, por exemplo, um ou mais agentes colorantes, adoçantes, aromatizantes e/ ou conservantes.

Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados para uma formulação de comprimido incluem, por exemplo, diluentes inertes, tais como lactose, carbonato de sódio, fosfato de cálcio ou carbonato de cálcio, agentes de granulação e de desintegração, tais como o amido de milho ou o ácido algênico. Agentes de ligação, tais como o amido; agentes lubrificantes, tais como o estearato de magnésio, o ácido esteárico ou o talco; agentes conservantes, tais como p- hidroxibenzato de etila ou propila, e anti- oxidantes, tais como o ácido ascórbico. As formulações de comprimido podem ser não revestidas ou revestidas, seja para modificar a sua desintegração e subseqüente absorção do ingrediente ativo no interior do trato gastrointestinal, ou de modo a aperfeiçoar a sua estabilidade e/ou aparência, em qualquer caso, usando agentes de revestimento convencionais e procedimentos bem conhecidos na técnica.

As composições para o uso oral podem estar sob a forma de cápsulas de gelatina duras, nas quais o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim, ou como cápsulas de gelatina mole, nas quais o ingrediente ativo é misturado com água ou com um óleo, tal como óleo de amendoim, parafina líquida, óleo de soja, óleo de coco, ou de modo preferido óleo de oliva, ou qualquer outro veículo aceitável.

As suspensões aquosas contêm, de um modo geral, o ingrediente ativo em uma forma finamente pulverizada, junto com um ou mais agentes de suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, metil celulose, hidroxipropil metil celulose, alginato de sódio, polivinil - pirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes de dispersão ou umectação, tais como lecitina ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, (por exemplo, estearato de polioxietileno), ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetilenooxicetanol, ou os produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados a partir de ácidos graxos e de um hexitol, tais como o monooleato de poliooxietileno sorbitol, ou os produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetilenoxicetanol ou os produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados a partir de ácidos graxos e de um hexitol, tal como monooleato de poliooxietileno sorbitol, ou os produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados a partir de ácidos graxos e de anidridos de hexitol, por exemplo monooleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquosas podem também conter um ou mais conservantes (tais que p- hidroxibenzoato de etila ou de propila, antioxidantes (tais que o ácido ascórbico, agentes de coloração, agentes de aromatização, e/ ou agentes adoçantes (tais que sacarose, sacarina ou aspartame).

As suspensões oleosas podem ser formuladas através da suspensão do ingrediente ativo em um óleo vegetal (tal que óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de sésamo, ou óleo de coco) ou em um óleo mineral (tal que parafina líquida). As suspensões oleosas podem também conter um agente de espessamento, tal como cera de abelhas, parafina dura ou álcool cetílico. Os agentes adoçantes, tais como aqueles expostos acima, e os agentes aromatizantes podem ser adicionados de modo a prover uma preparação oral agradável. Estas composições podem ser conservadas através da adição de um antioxidante, tal como o ácido ascórbico.

Pós dispersáveis ou liofilizados e grânulos adequados para a preparação de uma suspensão ou solução aquosa através da adição de água contêm, de um modo geral, o ingrediente ativo junto com um agente de dispersão ou de umectação, um agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes de dispersão ou umectação e agentes de suspensão são exemplificados por aqueles já mencionados acima. Excipientes adicionais, tais como os adoçantes, aromatizantes e colorantes, podem também estar presentes.

As composições farmacêuticas da invenção podem estar também sob a forma de emulsões óleo-em- água. A fase oleosa pode ser um óleo vegeta, tal como óleo de oliva ou óleo de amendoim, um óleo mineral, tal como, por exemplo, parafina líquida ou uma mistura de quaisquer destes. Agentes de emulsificação adequados podem ser, por exemplo, gomas de ocorrência natural, tais como goma de acácia ou goma de tragacanto, fosfatídeos de ocorrência natural, tais como soja, lecitina, um éster ou éster parcial derivado a partir de ácidos graxos e de anidridos de hexitol (por exemplo monooleato de sorbitano) e os produtos de condensação dos referidos ésteres parciais com óxido de etileno, tais como o monooleato de polioxietileno sorbitano. As emulsões podem também conter agentes adoçantes, aromatizantes e conservantes.

Os xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçantes, tais como glicerol, propileno glicol, sorbitol, aspartame ou sacarose, e podem também conter um agente de desemulsificação, um conservante, aromatizante e/ou colorante.

As composições farmacêuticas podem estar sob a forma de uma suspensão aquosa ou oleosa, soluções, emulsões ou sistemas particulares, que podem ser formulados de acordo com os procedimentos conhecidos, usando um ou mais dos agentes de dispersão ou umectação e agentes de suspensão, que foram mencionados acima. Uma preparação injetável estéril pode ser também uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não- tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo uma solução em polietileno glicol.

As formulações de supositório podem ser preparadas através da mistura do ingrediente ativo com um excipiente não- irritante adequado, que está sólido em temperaturas ordinárias, mas líquido em temperaturas retais e será, portanto, fundido no reto, de modo a liberar a droga. Excipientes adequados incluem, por exemplo, manteiga de cacau e polietileno glicóis.

Formulações tópicas, tais como cremes, ungüentos, géis e soluções ou suspensões aquosas ou oleosas podem, de um modo geral, ser obtidas através da formulação de um ingrediente ativo com um veículo ou diluente convencional, topicamente aceitável, usando um procedimento convencional, bem conhecido na técnica.

Composições para a administração através de insuflação podem estar sob a forma de um pó finamente dividido contendo partículas de diâmetro médio de, por exemplo 30 μm ou muito menos, de um modo preferido de 5 μm ou menos, e de modo mais preferido entre 5 μm e 1 μm, o pó em si mesmo compreendendo ou o ingrediente ativo isoladamente ou diluído com um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis, tais como a lactose. O pó para a insuflação é então convenientemente retido em uma cápsula contendo, por exemplo, de 1 a 50 mg de ingrediente ativo para o uso com um dispositivo turbo- inalador, tal como o uso para a insuflação do agente conhecido cromoglicato de sódio.

As composições para a administração através de inalação podem estar sob a forma de um aerossol pressurizado convencional, disposto de modo a dispensar o ingrediente ativo ou como um aerossol contendo sólido finamente dividido ou gotículas de líquido. Os propelentes de aerossol convencionais, tais como os hidrocarbonetos ou os hidrocarbonetos fluorados voláteis podem ser usados e o dispositivo de aerossol é disposto, de modo conveniente, para dispensar uma quantidade dosada do ingrediente ativo.

Quando à informação adicional a respeito da formulação, faz- se referência ao leitor ao Capítulo 25.2, no Volume 5 de Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press, 1990.

Além disso, em um aspecto adicional da invenção, é provido um co-cristal de maleato de AZD 1152 para o uso em terapia. É ainda provido um co-cristal de maleato de AZD 1152 para o uso como um medicamento. Um outro aspecto da invenção provê um co-cristal de maleato de AZD 1152 para o uso como um medicamento para o tratamento de doenças hiperproliferativas, tais como o câncer e em particular o câncer colorretal, de mama, pulmão, próstata, bexiga, renal ou pancreático ou leucemia ou linfoma. As leucemias ou linfomas aqui mencionados podem ser tumores de linhagem mielóide, tais como leucemia mielóide aguda ou de linhagem linfóide.

De um modo adicional, um co-cristal de maleato de AZD 1152 é provido para o uso em um método de tratamento de um animal de sangue quente, tal como o homem, através de terapia. Um outro aspecto da invenção provê um co-cristal de maleato de AZD 152 para o uso em um método de tratamento de doenças hiperproliferativas, tais como o câncer, e em particular o câncer colorretal, de mama, pulmão, próstata, bexiga, renal ou pancreático, ou leucemia ou linfoma.

Em um outro aspecto da invenção, é provido o uso de um co- cristal de maleato de AZD 1152 na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, em que a inibição de uma ou mais aurora quinase(s) é benéfica. Em particular, é considerado que a inibição de aurora quinase A e/ ou aurora quinase B pode ser benéfica. De um modo preferido, a inibição de aurora quinase B é benéfica. Em um outro aspecto da invenção, é provido o uso de um co-cristal de maleato de AZD 1152 na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças hiperproliferativas, tais como o câncer, e em particular o câncer colorretal, de mama, pulmão, próstata, bexiga, renal ou pancreático ou leucina ou linfoma.

De acordo ainda com um outro aspecto da invenção, é provido um co-cristal de maleato de AZD 1152 para o uso no método de tratamento de um ser humano, que sofra de uma doença, na qual a inibição e uma ou mais aurora quinase (s) é benéfica, que compreende os estágios de administração a uma pessoa, que esteja em necessidade da mesma, de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um co-cristal de maleato de AZD 1152. De um modo particular, é considerado que a inibição de aurora quinase AJ e/ ou aurora quinase B pode ser benéfica. De um modo preferido, a inibição de aurora quinase B é benéfica. E ainda provido um co-cristal de maleato de AZD 1152 para o uso em um método de tratamento de um ser humano, que sofra de uma doença hiperproliferativa, tal como o câncer e em particular o câncer colorretal, de mama, pulmão, próstata, bexiga, renal ou pancreático ou leucemia ou linfoma, que compreende os estágios de administrar a uma pessoa, que esteja em necessidade da mesma, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um co-cristal de maleato de AZD 1152. O uso de um co-cristal de maleato de AZD 1152 em qualquer um dos métodos de tratamento de um ser humano acima descrito constitui um dos aspectos desta invenção.

Para os usos terapêuticos acima mencionados, a dose administrada irá variar de acordo com o composto empregado, o modo de administração, o tratamento desejado, o distúrbio indicado e a idade e sexo do animal ou paciente. O tamanho da dose seria deste modo calculado de acordo com princípios bem conhecidos de medicina.

Quando do uso de um co-cristal de maleato de AZD 1152 para propósitos terapêuticos ou profiláticos, ele será, de um modo geral, administrado de um modo tal como uma dose diária na faixa de, por exemplo, 0,05 mg/ kg a 50 mg/ kg de peso corpóreo seja recebida, fornecida, se requerido, em doses divididas. De um modo geral, doses mais baixas serão administradas quando uma via parenteral for empregada. Deste modo, por exemplo, para a administração intravenosa, uma dose na faixa, por exemplo, de 0,05 mg/ kg a 25 mg/ kg de peso corpórea será, de um modo geral, usada. De um modo similar, para a administração através de inalação, uma dose na faixa, por exemplo, de 0,06 mg/ kg a 25 mg/ kg de peso corpóreo será usada.

Tratamento aqui definido pode ser aplicado como a terapia única ou pode envolver, em adição ao composto da invenção, cirurgia ou radioterapia ou quimioterapia convencional. Uma tal quimioterapia pode incluir uma ou mais das seguintes categorias de agentes antitumor:

(i) drogas antiproliferativas /antineoplásticas e combinações das mesmas, tal como usadas em oncologia média, tais como agentes de alquilação (por exemplo eis- platina, carboplatina, ciclofosfamida, nitrogênio mostada, melfalano, clorambucila, bussulfano e nitriosouréias); antimetabólitos (por exemplo antifolatos, tais como fluoropirimidinas, tais como 5-fluorouracila e tegafur, raltitrexed, metotrexato, citosina arabinosídeo e hidroxiuréia; antibióticos antitumor (por exemplo, antraciclinas, tais como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina - C, dactinomicina e mitramicina) ; agentes antimitóticos (por exemplo, vinca alcalóides, tais como vincristina, vinblastina, vindesina e vinorebina e taxóides, tais como taxol e taxotere); e inibidores de topoisomerase (por exemplo, epipodofilotoxinas, tais como etoposídeo e teniposídeo, amsacrina, topotecano e camptotecina);

(ii) agentes citostáticos, tais como antiestrogênios (por exemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno e iodoxifeno), reguladores para baixo do receptor de estrogênio (por exemplo, fulvestratrante), antiandrógenos (por exemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida e acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH ou agonistas de LHRH (por exemplo, goserelina, leuprorelina e buserelina), progestógenos (por exemplo, acetato de megestrol), inibidores de aromatase (por exemplo, tais como anastrozol, letrozol, vorazol e exemestano) e inibidores de 5 a- redutase, tais como finasterida;

(iii) agentes, que inibem a invasão celular do câncer (por exemplo, os inibidores de metaloproteinase, tais como marimastat e os inibidores da função do receptor do ativador de plasminogênio uroquinase);

(iv) inibidores da função do fator de crescimento, por exemplo tais inibidores incluem os anticorpos do fator de crescimento, anticorpos do receptor do fator de crescimento (por exemplo, o anticorpo anti-erbb2 trastuzumab [Herceptin™] e o anticorpo anti-erbbl cetuximab [C225]), inibidores de farnesil transferase, inibidores de tirosina quinase e inibidores de serina- treonina quinase, por exemplo inibidores da família do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, inibidores de tirosina quinase da família EGFR, tais como N- (3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxi-6- (3- morfolinopropóxi) quinazolin-4-amina (gefinitib, AZD 1839), N-(3- etinilfenil)-6,7-bis (2-metoxietóxi) quinazolin-4-amina (erlonitib, AZD 1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietóxi) quinazolin-4-amina (erlonitib, OSI- 774) e 6-acrilamido- N- (3- cloro-4-fluorofenil)-7- (3-morfolinopropóxi) quinazolin-4-amina (Cl 1033)), por exemplo, os inibidores da família do fator de crescimento derivado de plaqueta e, por exemplo, os inibidores da família do fator de crescimento de hepatócito.

(v) agentes antiangiogênicos, tais como aqueles que inibem os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (por exemplo o anticorpo do fator de crescimento da célula endotelial antivascular bevacizumab [Avastin™], compostos, tais como aqueles descritos nos Pedidos de Patente Internacionais WO 97/ 22596, WO 97/ 30035, WO 97/32856 e WO 98/ 13354 e os compostos que operam através de outros mecanismos (por exemplo, linomida, inibidores da função de integrina ανβ3ε angiostatina):

(vi) agentes de dano vascular, tais como Combretastatina A4 e os compostos expostos nos Pedidos de Patente Internacionais WO 99/ 02166, WO 00/ 40529, WO 00/ 41669, WO 01/ 92224, WO 02/ 04434 e WO 02/08213;

(vii) terapias anti- sentido, por exemplo aquelas que são dirigidas aos alvos acima relacionados, tais como ISIS 2503, uma terapia anti- ras;

(viii) abordagens de terapia genética, que incluem, por exemplo, abordagens para substituir genes aberrantes, tais como o aberrante p53 ou o aberrante BRCAl ou BRCA2, GDEPT (terapia de pró-droga de enzima dirigida ao gene), tais como aqueles que usam citosina deaminase, timidina quinase ou uma enzima nitrorredutase bacteriana, e abordagens para aumentar a tolerância do paciente à quimioterapia ou à radioterapia, tais como a terapia genética de resistência a múltiplas drogas ; e

(ix) abordagens de imunoterapia, incluindo, por exemplo, abordagens ex- vivo e abordagens in vivo, de modo a aumentar a imunogenicidade das células de tumor do paciente, tais como a transfecção com citoquinas, tais como interleucina 2, interleucina 4 ou o fator de estimulação da colônia de granulócito - macrófago, abordagens para diminuir a energia da célula T, abordagens que utilizam células imunes transfectadas, tais como as células dendríticas transfectadas com citoquina, abordagens que usam linhagens de célula tumoral transfectada com citoquina usando anticorpos anti- idiotípicos.

Em adição, um co-cristal de maleato de AZD 1152 pode ser usado em combinação com um ou mais inibidores do ciclocelular. Em particular no caso de inibidores do ciclo celular que inibem bubl, bubRl ou CDK. Um tal tratamento conjunto pode ser alcançado por meio da dosagem simultânea, seqüencial ou separada dos componentes individuais do tratamento. Tais produtos combinados empregam os compostos desta invenção dentro da faixa de dosagem aqui descrita e o outro agente farmaceuticamente ativo dentro desta faixa de dosagem aprovada.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provida uma combinação adequada para o uso no tratamento de distúrbios proliferativos celulares (tais que o câncer), que compreendem um co-cristal de maleato de AZD 1152, como aqui antes definido, e um agente antitumor adicional, como aqui antes descrito.

De acordo com este aspecto da invenção, é provido um produto farmacêutico, que compreende um co-cristal de maleato de AZD 1152, tal como aqui antes descrito, e um agente antitumor adicional, como aqui antes descrito, para o tratamento conjunto de distúrbios proliferativos celulares (tais que o câncer).

Em adição a seu uso em medicina terapêutica, um co-cristal de maleato de AZD 1152 é também útil como uma ferramenta farmacológica no desenvolvimento e padronização de sistemas de teste in vitro e in vivo para a avaliação dos efeitos de inibidores da atividade do ciclo celular em animais de laboratório, tais como gatos, cachorros, coelhos, macacos, ratos e camundongos, como parte da pesquisa quanto a novos agentes terapêuticos.

Nas outras características acima de composição farmacêutica, processo, método, uso e manufatura de medicamento, as modalidades alternativas e preferidas dos compostos da invenção aqui descritos também são aplicáveis.

O(s) co-cristal (ais) de maleato da invenção inibem a atividade de serina- treonina quinase das auroras quinases, em particular da aurora quinase A e/ ou aurora quinase B e, deste modo, inibem o ciclocelular e a proliferação celular. Os compostos, que inibem a aurora quinase B são de particular interesse. Estas propriedades podem ser avaliadas, por exemplo, usando um ou mais dos procedimentos expostos abaixo.

(a) Teste de inibição de aurora quinase A in vitro

Este teste determina a capacidade de um composto de teste para inibir a atividade de serina - treonina . O DNA que codifica a aurora A pode ser obtido através da síntese do gene total, ou através de clonagem. Este DNA pode ser então expresso em um sistema de expressão adequado, de modo a obter um polipeptídeo com atividade de serina - treonina quinase. No caso de aurora A, a seqüência de codificação foi isolada a partir do cDNA através de reação de cadeia de polimerase (PCR) e clonado nos sítios de endonuclease de restrição de BamHl e Notl do vetor de expressão de baculovírus pFastBac HTc (GibcoBRl/ Life Technologies). O iniciador 5'- PCR continha uma seqüência de reconhecimento para a endonuclease de restrição BamHl 5' para a seqüência de codificação aurora A. Isto permitiu a inserção do gene aurora A no quadro com os resíduos 6 histidina, região de espaçador, e o sítio de clivagem de protease rTEV, codificado pelo vetor pFastBac. O iniciador 3' PCR substituiu o códon de interrupção de aurora A com uma seqüência de codificação adicional seguida por um códon de interrupção e uma seqüência de reconhecimento para a endonuclease de restrição Notl. Esta seqüência de codificação adicional (5' TAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TCT TAA 3'O codificou a seqüência de polipeptídeo YPYDVPDYAS . Esta seqüência, derivada da proteína hemaglutina de influenza é usada, de um modo freqüente, como uma seqüência de epítopo de rótulo, que pode ser identificada através do uso de anticorpos monoclonais específicos. O vetor pFastBac recombinante codificou, portanto, uma proteína Aurora A rotulada C terminalmente com epítopo de hemaglutina de influenza, rotulada N- terminalmente com 6 his. Os detalhes dos métodos para a montagem das moléculas de DNA recombinantes pode ser encontrada em textos convencionais, por exemplo, em Sambrook et ai. 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press e Ausuubel et al., 1999, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc.

A produção do vírus recombinante pode ser executada de acordo com o protocolo do fabricante de GibcoBRL. Em resumo, o vetor pFastBac, que porta o gene aurora A, foi transformado em células de E. coli DHlOBac contendo o genoma de baculovírus (DNA bacmid) e através de um evento de transposição nas células, uma região do vetor pFastBac contendo um gene de resistência de gentamicina e o gene aurora A incluindo o promotor poliedrina de baculovírus foi transposto diretamente ao interior do DNA bacmid. Através de seleção em gentamicina, canamicina, tetraciclina e X-gal, as colônias brancas resultantes deveriam conter o DNA bacmid recombinante que codifica aurora A . O DNA bacmid foi extraído a partir de uma cultura em pequena escala de várias colônias brancas BHlOBac e transfectado ao interior de células de Spodoptera frugiperda Sf21, desenvolvidas em um meio TC 100 (Gibco BRL) contendo 10% de soro usando o reagente CellFECTIN (GibcoBRL) de acordo com as instruções do fabricante. As partículas de vírus foram coletadas através da coleta do meio de cultura da célula 72 horas após a transfecção. 0,5 ml do meio foram usados para infectar 100 ml da cultura de suspensão de Sf21s contendo 1 χ 10 células /ml. O meio de cultura da célula foi coletado 48 horas após a infecção e a titulação do vírus determinada usando um procedimento de ensaio de placa padrão. Os materiais de vírus foram suados para infectar as células Sf99 e "High 5" em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3, de modo a verificar a expressão da proteína aurora A recombinante.

Para a expressão em grande escala da atividade de aurora A quinase, células de inseto Sf21 foram desenvolvidas a 28°C em um meio TC100, suplementado com 10% de soro bovino fetal (Viralex) e 0, 2% de F68 Pluronic (Sigma) em um gabarito de rolo Wheaton a 3 r.p.m. Quando a densidade celular alcançou 1,2 χ 10^6 células ml"1, elas foram infectadas com o vírus recombinante de aurora A de placa-pura, em uma multiplicidade de infecção de 1, e coletadas 48 horas após. Todos os estágios de purificação subseqüentes foram executados a 4°C. As pelotas de célula de inseto congeladas, contendo um total de 2,0 χ 10^8 células foram descongeladas e diluídas com tampão de Iise (HEPES 25 mM (N -[2- hidroxietiljpiperazina- N'-[ácido 2-etanossulfônico) em pH de 7, 4 a 4°C, KCl 100 mM, NaF 25 mM, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila), 2- mercaptoetanol 2 mM, imidazol 2 mM, 1 μg/ ml de aprotinina, 1 μg/ ml de pepstatina, 1 μg/ ml de leupstatina), usando 1,0 ml por 3 χ 10^7 células. A Iise foi alcançada usando um aparelho de homogeneização Dounce, seguindo-se ao que o lisado foi centrifugado a 41. 000 g durante 35 minutos. O sobrenadante aspirado foi bombeado sobre uma coluna de cromatografia de 4 mm de diâmetro contendo 500 μl de Ni NTA (ácido nitrilo-triacético), agarose (Qiagen, produto n° 30250), que havia sido equilibrada em tampão de lise. Um nível de linha de referência de absorção de UV para o eluente foi alcançado após a lavagem da coluna com 12 ml de tampão de lise, seguido por 7 ml de tampão de lavagem (HEPES 25 mM, pH de 7,4 a 4°C, KCL 100 mM, imidazol 20 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM). A proteína aurora A ligada foi eluída a partir da coluna usando um tampão de eluição (HEPES 25 mM, pH 7, 4, a 4 °C, KCl 100 mM, imidazol 400 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM). Uma fração de eluição (2,5 ml) correspondendo ao pico na absorção de UV foi coletada. A fração de eluição contendo aurora A quinase ativa, foi dialisada, de um modo exaustivo, contra o tampão de diálise (HEPES 25 mM, pH 7,4, a 4o C, 45% de glicol (v/v), KCl 100 mM, 0, 25% de Nomidet P 40 (v/v), ditiotreitol 1 mM).

Cada nova batelada da enzima aurora A foi titulada no ensaio através de diluição com o diluente da enzima (Tris- HCl 25 mM, ρ H 7,5, KCl 12, 5 mM, DTT 0, 6 mM). Para uma batelada de banho típica (que pode ser obtida de Upstate), o material de enzima é diluído em 1 μΐ por ml, com o diluente da enzima e 20 μΐ da enzima diluída são usados para cada reservatório de ensaio. Os compostos de teste (em sulfóxido de dimetila (DMSO) 10 mM foram diluídos com água e 10 μΐ do composto diluído foram transferidos a reservatórios nas placas de ensaio. Os reservatórios de controle "total " e "neutro" continham 2, 5% de DMSO em vez do composto. Vinte microlitros de enzima recém diluída foram adicionados a todos os reservatórios, com exceção dos reservatórios "neutros". Vinte microlitros de diluente de enzima foram adicionados aos reservatórios "neutros". Vinte microlitros da mistura da reação (Tris-HCl 25 mM, KCl 12, 7 mM, NaF 2, 5 mM, ditiotreitol 0,6 mM, MnCl2 6, 25 MnCl2, ATP 7, 5 mM, substrato de peptídeo 6, 25 μΜ [biotina- LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG]) contendo 0,2 μCi [γ33Ρ]ΑΤΡ (Amersham Pharmacia, atividade específica ≥ 2500 Ci/ mmol) foram então adicionados a todos os reservatórios de teste, de modo a iniciar a reação. As placas foram incubadas, em temperatura ambiente, durante 60 minutos. De modo a interromper a reação, 100 μΐ de ácido ortofosfórico a 20% w/v foram adicionados a todos os reservatórios. A substância de peptídeo foi capturada em uma tela de filtro P30 de nitrocelulose positivamente carregada (Whatman) usando um coletor de placa de 96 reservatórios (Tom Tek) e então testado quando à incorporação de 33P com um contador de placa Beta. " Os valores de controle "Neutro" (sem enzima) e "Total" (sem composto) foram usados para determinar a faixa de diluição do composto de teste, que forneceu 50% de inibição da atividade de enzima (valores de IC50).

(b) Teste de inibição de aurora B quinase in vitro

Este teste determina a capacidade de um composto de teste de modo a inibir a atividade de serina -treonina quinase. O DNA que codifica aurora B pode ser obtido através de síntese de gene total ou através de clonagem. Este DNA pode ser então expressado em um sistema de expressão adequado, de modo a que seja obtido o polipeptídeo com atividade de serina - treonina quinase. No caso de aurora B, a seqüência de codificação foi isolada a partir do cDNA através de reação de cadeia de polimerase (PCR) e clonada no sistema pFastBac, de um modo similar àquele acima descrito para aurora A (isto é, sem a expressão direta de uma proteína aurora B rotulada com 6- histidina).

Para a expressão em larga escala da atividade de aurora B quinase, as células de inseto Sf21 foram desenvolvidas a 28°C em um meio TClOO suplementado com 10% de soro de novilho fetal (Viralex) e 0,2% de F68 Plurnic (Sigma) em um gabarito de rolo a 3 r.p.m. Quando a densidade total alcançou 1,2 χ 106 células ml-1, elas foram infectada com um vírus recombinante aurora B de placa - pura, em uma multiplicidade de infecção de 1 e coletadas 48 horas após. Todos os estágios de purificação subseqüentes foram executados a 4°C . As pelotas de células de inseto congeladas contendo um total de 2,0 χ 10 células foram descongeladas e diluídas com tampão de Iise (HEPES 50 mM (N- [2- hidroxietil] piperazina-N'- [ácido 2- etanossulfônico]), em pH de 7,5, a 4°C, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonila), ditiotreitol 1 mM, 1 μg/ ml de aprotinina, 1 μg/ ml de pepstatina, 1 μg/ ml de leupetina), usando 1,0 ml por 2 χ 10 células. A Iise foi alcançada usando um aparelho de homogeneização sônica, seguindo-se ao que o lisado foi centrifugado a 41. 000 g durante 35 minutos. O sobrenadante aspirado foi bombeado sobre uma coluna de cromatografia de 5 mm de diâmetro contendo 1,0 ml de sefarose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech), que havia sido equilibrada em tampão de lise. Um nível de linha de referência de absorção de UV para o eluente foi alcançado após a lavagem da coluna com 12 ml de tampão de lise, seguido por 7 ml de tampão de lavagem (HEPES 25 mM, pH de 7,4 a 4°C, ditiotreitol 1 mM). A proteína aurora B ligada foi eluída a partir da coluna usando um gradiente de tampão de eluição (HEPES 25 mM, pH 7, 4, a 4°C, NaCl 0, 6 M, ditiotreitol 1 mM, sendo processado em de 0% de tampão de eluição a 100% de tampão de eluição, durante 15 minutos, em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/ minuto). Frações de eluição (1,0 ml) correspondendo ao pico na absorção de UV foi coletada. As frações de diluição foram dialisada, de um modo exaustivo, contra o tampão de diálise (HEPES 25 mM, pH 7,4, a 4°C, 45% de glicerol (v/v), KCl 100 mM, 0, 05% (v/v) de IGEPAL CA 630 (Sigma Aldrich), ditiotreitol 1 mM). As frações dialisada foram testadas quanto à atividade de aurora B quinase.

A enzima Aurora B- INCENP (conforme fornecida por Upstate) foi preparada pela ativação de aurora B (5 μΜ) em Tris- HCl 50 mM, pH 7, 5, EGTA 0, ImM, 0,1% de 2-mercaptoetanol, vandato de sódio 0,1 mM, acetato de magnésio 10 mM, ATP 0,1 mM com 0, 1 mg/ ml de GST- INCENP [826 -919] a 3 0°C, durante 30 minutos.

Cada nova batelada da enzima aurora A foi titulada no ensaio através de diluição com o diluente da enzima (Tris- HCl 25 mM, ρ H 7,5, KCl 12,5 mM, DTT 0, 6 mM). Para uma batelada típica, o material de enzima é diluído em 15 μΐ por ml, com o diluente da enzima e 20 μΐ da enzima diluída são usados para cada reservatório de ensaio. Os compostos de teste (em sulfóxido de dimetila (DMSO) 10 mM foram diluídos com água e 10 μΐ do composto diluído foram transferidos a reservatórios nas placas de ensaio. Os reservatórios de controle "total " e "neutro" continham 2, 5% de DMSO em vez do composto. Vinte microlitros de enzima recém diluída foram adicionados a todos os reservatórios, com exceção dos reservatórios "neutros". Vinte microlitros de diluente de enzima foram adicionados aos reservatórios "neutros". Vinte microlitros da mistura da reação (Tris-HCl 25 mM, KCl 12, 7 mM, NaF 2, 5 mM, ditiotreitol 0,6 mM, MnCl2 6, 25 MnCl2, ATP 15 mM, substrato de peptídeo 6, 25 μΜ [biotina- LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG]) contendo 0,2 μCi [γ33Ρ]ΑΤΡ (Amersham Pharmacia, atividade específica > 2500 Ci/ mmol) foram então adicionados a todos os reservatórios de teste, de modo a iniciar a reação. As placas foram incubadas, em temperatura ambiente, durante 60 minutos. De modo a interromper a reação, 100 μl de ácido ortofosfórico a 20% v/v foram adicionados a todos os reservatórios. A substância de peptídeo foi capturada em uma tela de filtro P30 de nitrocelulose positivamente carregada (Whatman) usando um coletor de placa de 96 reservatórios (Tom Tek) e então testado quando à incorporação de 33P com um contador de placa Beta. "Os valores de controle "Neutro" (sem enzima) e "Total" (sem composto) foram usados para determinar a faixa de diluição do composto de teste, que forneceu 50% de inibição da atividade de enzima (valores de IC50).

(c) Ensaio de fenótipo celular e fosforilação de substrato in vitro

Este ensaio é usado para determinar os efeitos celulares de compostos sobre células de tumor de cólon SW 620 in vitro. Os compostos causam de um modo típico, a inibição dos níveis de fosfoistona H3 e um aumento na área nuclear das células.

10^4 células SW620 por reservatório foram colocadas em 100 μl de meio DMEM (contendo 10% de FCS e 1% de glutamina) (DMEM é Dulbecco's Modified Eagle's Médium (Sigma D 6546) em placas de 96 reservatórios Costar e deixados durante a noite a 37°C e a 5 de CO2 para aderirem. As células foram então dosadas com o composto diluído em meio (50 μl são adicionados a cada reservatório para fornecer concentrações de 0,00015μ - 1 μΜ do composto) e após 24 horas de tratamento com o composto, as células foram fixadas.

As células foram primeiramente examinadas usando um microscópio luminoso e quaisquer alterações celulares na morfologia foram observadas. 100 μl de 3,7% de formaldeído foram então adicionados a cada reservatório, e a placa foi deixada durante pelo menos 30 minutos, em temperatura ambiente. A decantação e o sacudimento em sobre uma toalha de papel removeram o fixador e as placas foram lavadas uma vez em PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (Sigma D 8537)) usando uma lavadora de placa automatizada. 100 μl de PBS e 0, 5% de Triton X-100 foram adicionados e as placas foram colocadas em um agitador durante 5 minutos. As placas foram então lavadas em 100 μl de PBS e a solução extraída. 50 μl de anticorpo primário, antifosfoistona de coelho H3 a 1: 500 em PBS 1 % de BSA (albumina de soro bovino) e então 0,5% de Tween, foram adicionados. O policlonal de coelho antifosfoistona H3-6-750 foi adquirido de Upstate Biotechnology. As placas foram deixadas durante 1 hora em temperatura ambiente em um agitador.

No dia seguinte, o anticorpo foi extraído e as placas foram lavadas, duas vezes, com PBS. Em uma área descoberta, 50 μl de anticorpo secundário, Hoechst a 1: 10.000 e IgGA de coelho anticabra Alexa Flúor 488 a 1:200 (sondas moleculares cat. N0 11008) em PBS 1% de BSA, foram adicionados 0,5% de Tween. As placas foram enroladas em uma folha de estanho, e agitadas durante 1 hora em temperatura ambiente. O anticorpo foi extraído e as placas foram lavadas, duas vezes, com PBS. 200 μl de PBS foram adicionados a cada reservatório e as placas foram agitadas durante 10 minutos, e PBS foi removido. 100 μl de PBS foram adicionados a cada reservatório e as placas foram vedadas prontas para a análise. A análise foi executada suando um algoritmo Arrayscan Target Ativation de modo a medir os níveis celulares de fosfoistona H3 e as alterações na área nuclear. Os resultados foram relatados como a concentração efetiva, requerida para fornecer 50% de inibição dos níveis de fosfoistona H3 e similarmente para um aumento de 50% na área nuclear das células (valores de EC50).

A invenção é aqui ilustrada por meio de Exemplos não- limitativos, dados e Figuras, nos quais, a não ser que mencionado de outro modo:

(i) os rendimentos são fornecidos apenas a título de ilustração e não são necessariamente o máximo alcançável; (ii) quando o produto é usado para a semeadura, ele pode ser obtido através de um processo anteriormente conhecido, tais como aqueles descritos na WO 2004/ 058781;

(iii) a identidade do co-cristal de maleato de AZD 1152, preparado como aqui descrito, foi confirmada por RMN 1H em 400 MHz de sulfóxido de dimetila hexadeuterado com a adição de tetrametilsilano (TMS) para a referência (TMS = 0,00 ppm).

Como aqui descrito, AZD 1152 e AZD 1152HQPA são expostos na WO 2004/058781. Os detalhes do processo providos na WO 2004/ 058781 em relação a AZD1152, AZD1152HQPA e todos os intermediários em via para os referidos compostos são incorporados a este, a título referencial, em sua totalidade.

Método de Preparação 1

Estágio 1- Preparação de 7-(3-hidroxipropóxi) quinazolin-4(3H)-ona

Ácido 2-amino-4-fluorobenzóico e 1,3-propanodiol foram agitados de um modo conjunto e aquecidos a 120°C. Acetato de formamidina foi adicionado e a mistura foi agitada durante 3,5 horas de modo a fornecer 7- fluoroquinazolina-4-ona. Uma solução de hidróxido de potássio em 1,3- propanodiol foi então adicionada à mistura durante um período de 2 horas e 50 minutos, que foi então resfriada a 15° C . Seguindo-se a isto, a mistura foi aquecida a 125° durante 5 horas, antes que fosse resfriada a 75°C. Ácido clorídrico diluído (cerca de 6% p/p) foi adicionado, de um modo gradual, à mistura da reação, até que um pH de 4,5 fosse alcançado. A mistura foi resfriada a 0°C durante 6 horas e mantida nesta temperatura durante um período adicional de uma hora, antes do isolamento do produto bruto através de centrifugação. O material bruto foi lavado com água e secado in vácuo antes da dissolução em metanol, em um refluxo brando e concentração parcial, sob uma pressão reduzida, em uma temperatura de 42a solução foi então resfriada a 0°C durante um período de 3 horas e o produto resultante foi isolado através de filtração, antes da secagem in vácuo. 7- (3-Hidroxipropóxi) quinazolin-4(3H)- ona foi recuperado em um rendimento de 73%.

RMN 1H (DMSO d6) : 11, 90 (br s, 1H), 8,04 (s, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,10 (m, 2H), 4,17 (t, 2H), 3, 58 (t, 2H), 1,92 (m, 2H):

MS (+ ve ESI): 221 (M + H)+.

Estágio 2- Preparação de 4-cloro-7-(3-cloropropóxi)quinazolina

7-(3-Hidroxipropóxi) quinazolin-4(3H)-ona, tolueno e N5N- diisopropil-formamida (DIPF) foram misturados de um modo conjunto e aquecidos a 76°C, antes que cloreto de tionila fosse adicionado durante um período de 1 hora a 76°C . Cloreto de tionila adicional foi então adicionado durante um período de 1 hora, após o que a temperatura foi mantida em 76°C, durante 1 hora. A mistura foi refluída durante 11 horas, de modo a produzir uma solução clara, que foi então resfriada 38°C e submetida à destilação à vácuo para a remoção de tolueno e cloreto de tionila. Tolueno foi então adicionado e a solução foi mantida a 35°C, ao mesmo tempo em que foi clarificada com o auxílio de um filtro (celita ou harbolita e carvão ativado). A solução resultante foi parcialmente concentrada antes que heptano fosse adicionado e a mistura foi resfriada a O0C e agitada durante 23 horas. A suspensão castanho clara que foi formada foi isolada através de filtração, lavada com heptano frio e então secada in vácuo, a 3O0C, de modo a fornecer 4- cloro-7-(3-cloropropóxi)quinazolina (63, 6%).

RMN 1H (DMSO d6): 13, 25 (br s, 1H), 8,34 (s, 1H), 8,06 (d, 1H), 7,17 (Μ, 2H), 4,21 (t, 2H), 3, 83 (t, 2H), 2,23 (m, 2H):

MS (+ ve ESI): 257, 259 (M + H)+.

Estágio 3-Preparação do ácido (3- {7-(3-cloropropóxi)quinazolin-4- il]amino}-lH-pirazol-5-il) acético

4-Cloro-7-(3-cloropropóxi) quinazolina foi adicionado a 1 equivalente molar de uma solução do ácido (3- amino-lH-pirazol-5-il)acético em N-metilpirrolidinona (NMP) e então deixado durante um período de 12 horas. Foi observado que a cristalização do produto ocorre cm e sem semeadura e com e sem a adição de acetonitrila como um anti- solvente. O sólido resultante foi isolado através de filtração, lavado com N- metilpirrolidinona e acetonitrila e então secado in vácuo, de modo a fornecer o hidrocloreto do ácido (3-{[7-(3-cloropropóxi) quinazolin-4-il] amino}-1H- pirazol-5-il) acético como um sólido bege.

RMN Ή (DMSO d6; contém NMP como um solvato): 8,92 (s, 1H), 8,8 (d, 1 H), 7,46 (pr de d, 1H), 7, 38 (d, 1H), 6,7 (s, 1H), 4,32 (t, 2H), 3,85 (t, 2H), 3,73 (s, 2H), 3,3 (t, 2H), 2,7 (s, 3H), 2,51 (m, 6H), 2, 27 (m, 2H), 2, 18 (t, 2H), 1, 93 (m, 2H).

MS (+ ve ESI) : 362, 1015 (M + H)+.

Estágio 4- Preparação de 2-(3-{[7-(3-cloropropóxi)quinazolin-4-il] amino}- 1H-pirazol-5-il)-N-(3-fluorofenil) acetamida

4-Dimetilaminopiridina (DMAP), N-metilmorfolina e 3- fluoroanilina (em um grande excesso) foram adicionados a uma suspensão do hidrocloreto do ácido (3-{[7- (3-cloropropóxi) quinazolin-4-il] amino}-lH- pirazol-5-il) acético em Ν,Ν-dimetilacetamida (DMA) e a suspensão resultante foi agitada na ou abaixo da temperatura ambiente. Uma solução de hidrocloreto de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC1. HCl), previamente dissolvida em água, foi então adicionada, de um modo controlado, durante um período de 8 horas, de modo a manter a reação em temperatura ambiente. A mistura foi semeada com uma pequena quantidade de produto e então deixada em agitação durante várias horas. O anti- solvente acetonitrila, seguido por água, foi também adicionado, de modo a precipitar mais produto. O material foi isolado através de filtração e a torta lavada com uma mistura de N,N- dimetilacetamida: água : acetonitrila, acetonitrila quente e então secada (in vácuo ou sob uma corrente de nitrogênio) de modo a fornecer 2-(3-{[7- (3-cloropropóxi) quinazolin-4-il] amino}-H-pirazol-5-il)- N- (3- fluorofenil) acetamida. RMN 1Ή (DMSO d6; contém DMA residual): 10,4 (s, 1H), 8,9 (s, 1H), 8,8 (d, 1H), 7,59 (pr f m, 1H), 7,46 (pr de d, 1H), 7,33 (m, 2H), 7,29 (d, 1 H), 6, 85 (Μ, 1H), 6,75 (s, 1H), 4,35 (t, 2H), 3, 85 (t, 4H), 2, 95 (s), 2, 83 (s), 2, 56 (s), 2, 25 (m, 2H), 1, 95 (s):

MS (+ ve ESI): 455 (M + H)+.

Estágio 5- Preparação de 2-(3-Γ(7-{ 3-fetil (2-hidroxietiO aminolpropóxil- quinazolin-4-il) amino]-lH- pirazol-5-il)-N- (3-fluorofenil) acetamida (AZD 1152 HQPA)

2-(3-{[7-(3-Cloropropóxi) quinazolin-4-il] amino}-lH-pirazol- 5-il)-N-(3-fluorofenil) acetamida e 2-(etilamino)etanol (12 equivalentes molares) foram adicionados a Ν,Ν-dimetilacetamida sob uma atmosfera inerte (tal que a provida por nitrogênio) e a mistura foi aquecida a 90°C, com agitação. Após 12 horas, água foi adicionada de um modo controlado e a batelada foi semeada com o produto enquanto ainda quente. A mistura foi mistura foi resfriada a 20°C, em um modo cuidadosamente controlado, de modo a cristalizar o produto na forma requerida. O produto foi então filtrado e lavado com uma mistura de água/ N, N-dimetilacetamida e acetonitrila. Seguindo-se a isto, a torta foi suspensa durante um período com acetonitrila quente (40°C), filtrada, lavada com mais acetonitrila e então secada (in vácuo ou sob uma corrente de nitrogênio) de modo a fornecer 2-{3-[(7-{3-[etil(2- hidroxietil) amino] propóxi}-quinazolin-4-il) amino]-lH-pirazol-5-il}-N-(3- fluorofenil) acetamida como um sólido bege, em um rendimento de -90%.

RMN 1H (DMSO d6): 10,55 (s, 1H), 9,45 (br s, 1H), 8, 98 (s, 1H), 8,8 (d, 1H), 7,63 (pr de m, 1H), 7,47 (pr de d, 1 H), 7,37 (Μ, 2H), 7,32 (d, 1H), 6, 9 (Μ, 1H), 6, 77 (s, 1H), 4,32 (t, 2H), 3,83 (br s, 2H), 3, 76 (t, 2H), 4 (M + H).+

Estágio 6- Preparação de 2-[[3-(Τ4- [(5-j2-[(3-fluorofeniO aminol-2-oxoetil|- 1H- pirazol-3-il)amino1 -quinazolin-7-il}oxi)propill(etil)amino] etil fosfato [AZD 1152 t-Bu P (5) éster] de mono (terc-butila)

2-{3-[(7-{3-[Etil(2-hidroxietil)amino] propóxi}-quinazolin-4- il)amino]-lH- pirazol-5-il}-N(3- fluorofenil)acetamida e hidrocloreto de piridina foram misturados em N, N-dimetilacetamida e a solução foi resfriada a -15°C. Di-terc-butil dietilfosforamidita (1,5- 2,1 equivalentes molares) foram então adicionados, ao mesmo tempo em que a temperatura foi mantida.

A mistura da reação foi tratada in situ com 30% p/p de peróxido de hidrogênio (cerca de 4,2 equivalentes molares), ao mesmo tempo em que a temperatura foi mantida abaixo da temperatura ambiente. O peróxido de hidrogênio remanescente foi destruído pela adição de metabissulfito de sódio (com uma solução aquosa a 10% ρ/ ν), ao mesmo tempo em que a temperatura foi mantida abaixo de 40°C. A solução resultante de 2-[[3-({4- [(5-{2-[(3- fluorofenil) amino]-2-oxetil}-1H-pirazol-3-il) amino] quianolin-7- il}oxi) propil] (etil) amino] etil fosfato de di-terc-butila foi então aquecida a 40°C e uma solução de hidróxido de sódio (2M) foi adicionada, de modo a ajustar o pH para 5 - 6,5 . A temperatura e o pH foram mantidos durante um período de cerca de 90 minutos, com semeadura. A água foi então carregada e o pH ajustado adicionalmente a dentro de uma faixa de pH de 8-9, de modo a otimizar a recuperação. A mistura da reação quente foi diretamente filtrada, de modo a fornecer 2-[[3-({4-[(5-{2- [(3-fluorofenil) amino]-2-oxoetil}-IH- pirazol-3-il) amino] quinazolin-7-il} oxi)propil](etil) amino]etil fosfato de mono-terc-butila, que foi lavado com uma mistura de N,N-dimetilacetamida / água e a água finalmente secada (in vácuo ou em uma corrente de gás inerte adequada) de modo a fornecer 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil) amino]-2- oxoetil}-1H -pirazol-3-il) amino]-quinazolin-7-il}oxi) propil](etil) amino]etil fosfato de mono(terc-butila) como um sólido bege, de modo a fornecer um rendimento de entre 86 -93% .

RMN 1H (DMSO d6): 10, 48 (s, 1H), 9,75 (br s, 1H, 8,98 (s, 1H), 8,85 (d, 1H), 7,67 (pr de m, 1H), 7,48 (pr de d, 1H), 7, 37 (m, 2H), 7,3 (d, 1H), 6, 87 (m, 1H), 6, 83 (s, 1H), 4,34 (t, 2H), 4, 28 (m, 2H), 3, 88 (s, 2H), 3,53 (Μ, 2H), 3,43 (m, 2H), 3,33 (m, 2H), 2,3 (Μ, 2H), 1, 47 (s, 9H), 1,32 (t, 3H):

MS (+ ve ESI) : (M+ H)+ 644, 2761 fragmento (menos butila) 588,2147.

Estágio 7- Preparação de diidrogeno fosfato de 2-(etiir3-({ 4- IY5-I2-(3- fluorofenil) amino] -2-oxoetil} -IH- pirazol-3-il) amino] quinazolin-7- il- oxi) propil] amino} etila (AZO 1152)

2-[[3-({4- [(5- {2- [(3 -fluorofenil)amino] -2-oxoetil} -1H- pirazol-3- il) amino]-quinazolin-7-il} oxi) propil] (etil) amino] etil fosfato de mono(terc-butila foi suspenso em uma mistura a 1:1 de água/ tetraidrofurano (THF) e tratado em temperaturas elevadas (preferivelmente de 50-60°C) com um excesso de entre 1,5 e 0,3 equivalentes molares de ácido clorídrico durante um período de cerca de 1 hora. A solução quente foi tornada básica através do uso de hidróxido de sódio 2,0 M a dentro de uma faixa de pH de 4,5- 5,5, resfriada a 60°C, e semeada. Água foi adicionada à suspensão de um modo controlado, com o resfriamento controlado da mistura de cristalização à temperatura ambiente e o produto foi isolado através de filtração. A torta do filtro foi lavada com água e secada in vácuo. Após a secagem e sólido diidrogeno fosfato de 2-{etil[3-({ 4-[(5- {2- [(3-fluorofenil) amino]-2-oxoetil} -lH-pirazol-3-il)amino] quinazolin-7-il}oxi) propil] amino} etila foi equilibrado, sob condições ambientais, a um peso constante, de modo a fornecer uma forma hidratada como um material similar a agulhas amarelo pálido.

RMN 1 H (DMSO d6):

MS (+ ve ESI): 587, 8 (M + H)+

RMN 1H (DMSO d6) : 10,53 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,54 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,37 (m, 2H), 7,27 (s, 1H), 7,21 (d, 1H), 6,88 (Μ, 1H), 6,65 (s, 1H), 4, 27 (t, 2H), 4, 05 (m, 2H), 3, 75 (s, 2H), 3,24 (m, 2H), 3,21 (t, 2H), 3,13 (q, 2H), 2, 18 (Μ, 2H), 1,24 (t, 3H):

MS (+ ve ESI): 588 (M + H)+

C26H31FN7O6P + 3,0 H2O requer C, 48, 7%; H, 5, 8%; N, 15,3%; Encontrado C, 48, 8%; H, 5,35% ; N, 15, 15%.

Estágio 8 - Preparação de diidrogeno fosfato, maleato [maleato de AZD 1152] de 2-1 etilD-d 4-IY5-Í 2- r(3-fluorofenil)amino1-2- oxoetil} -1H- pirazol-3- il) amino] quinazolin-7- il} oxi) propil] amino } etila

Ácido 2-butenodióico (Z) (1,57 equivalentes molares; 449, 80 μmoles; 52,21 mg) foi dissolvido em metanol (123, 54 mmoles; 5,00 mol; 3, 96 g) e a esta solução foi adicionada uma solução metanólica previamente preparada de AZD 1152 (como a forma livre de triidrato -1,00 equivalentes molares, 286,14 μηιο^; 40,00 ml; 31, 87 g) seguido por mais metanol (123,54 mmoles; 5,00 ml; 3, 96 g). A mistura foi deixada em agitação durante a noite, em temperatura ambiente. Uma suspensão branca foi produzida e o sólido foi recuperado através de filtração e então secado in vácuo. A análise através de RMN conformou que o co-cristal era o maleato.

Estágio Alternativo 8:

AZD 1152 bruto (estimado em 7,44 g @ 100%, 11, 61 milimoles) foi adicionado a sulfóxido de dimetila (36 1) e deixado em condições ambientais, de modo a produzir uma solução castanho pálida. A esta solução, foi adicionada uma solução de ácido maleico (1,76 g, 15, 16 milimoles, 1,31 equivalentes molares) em metanol (36 ml) e a mistura foi deixada em repouso durante a noite, em temperatura ambiente. No dia seguinte, uma alíquota da solução clara foi transferida a um frasco, agitada e deixada vedada durante várias horas. Um depósito de sólido branco foi formado e este foi transferido ao frasco e deixado em agitação. De um modo gradual, a solução se tornou turva e o sólido foi depositado. A suspensão foi deixada sedimentar durante vários dias, e novamente filtrada. A torta foi lavada com uma mistura a 1:12 de sulfóxido de dimetila/metanol (15 ml no total), suspensa in situ com metanol (3 χ 25 ml) e então secada in vácuo. RMN confirmou que o sólido era o co-cristal de maleato de AZD 1152 (em um rendimento de cerca de 78,7%).

Método de Preparação 2

Estágio 1-Preparação de 2-(3-(17- (3-cloropropóxQquinazolin-4-il] amino) - 1H- pirazol-5-il)-N-(3- fluorofenil) acetamida

A uma suspensão de hidrocloreto do ácido (3-{[7-(3- cloropropóxi) quinazolin-4-il]amino}-1H-pirazol-5-il)acético (preparado como descrito no Método de Preparação 1 acima) em N,N- dimetilacetamida (DMA) é adicionado 4-dimetilaminopiridina (DMAP) ao mesmo tempo em que é mantida uma temperatura de 15- 25°C (de um modo ideal 15°C), seguido por N-metil morfolina, enquanto a temperatura é também mantida. 3- Fluoroanilina (em um grande excesso, que está, de um modo ideal, entre ΙΟ- 15 equivalentes molares) é adicionado em uma taxa tal a manter a temperatura abaixo de 25°C. Enquanto isto, hidrocloreto de 1-etil-3- (3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC1. HCl) é dissolvido em água, de modo a fornecer uma solução de cerca de 42% ρ/ ν (a quantidade de água presente é importante para o resultado da cristalização posteriormente no processo). Esta solução é adicionada de um modo controlado à suspensão, durante um período de 8 horas, de modo a manter a reação entre 20-25°C ; então a mistura é semeada com cristais da forma preferida do produto (de um modo ideal, em uma quantidade de cerca de 1% do rendimento esperado). A mistura é agitada durante cerca de 16 horas, ao mesmo tempo em que a temperatura é mantida (de um modo ideal de 20-25°C) e então o anti- solvente acetonitrila, seguido por água, é adicionado de um modo controlado e para manter a temperatura entre 20-25°C, seguido por um período de agitação estendido de cerca de 21 horas; isto se destina a otimizar a recuperação e a forma do produto. O material é isolado através de filtração e a torta é lavada com uma mistura de Ν,Ν-dimetilacetamida: água : acetonitrila (razões em volume de 5: 3 : 2), acetonitrila e é então secada (in vácuo ou sob uma corrente de nitrogênio) de modo a fornecer 2-(3-{[7-(3-cloropropóxi) quinazolin-4-il] amino} -IH- pirazol-5-il)-N- (3- fluorofenil) acetamida contendo algum DNA em cerca de 76-78% de rendimento.

RMN 1H (DMSO d6; contém DMA residual): 10,4 (s, 1H), 8,9 (s, 1H), 8,8 (d, 1H), 7,59 (pr de m, 1H), 7,46 (pr de d, 1H), 7, 33 (m, 2H), 7,29 (d, 1H), 6, 85 (m, 1H), 6, 75 (s, 1H), 4,35 (t, 2H), 3, 85 (t, 4H), 2, 95 (s), 2, 56 (s), 2,25 (m, 2H), 1,95 (s):

MS (+ ve ESI): 455 (M + H)+.

Estágio 2 - (Preparação de 2- { 3- [(7- { 3- l~etil(2- hidroxietil) amino] propóxi} - quinazolin-4-il) amino] -1H- pirazol-5-il}- N- (3- fluorofenil) acetamida (AZD 1152 HQPA)

2- (3- {{7- (3-Cloropropóxi) quinazolin-4-il] amino}-lH- pirazol-5-il)-N-(3-fluorofenil) acetamida e 2-(etilamino)etanol (de um modo ideal 12 equivalentes molares) são adicionados a N5N- dimetilacetamida sob uma atmosfera inerte (tal que a provida por nitrogênio) e a mistura é aquecida a 90°C, com agitação. Após um período de 12-16 horas (de um modo ideal, 12 horas) a reação é novamente resfriada a cerca de 85°C e a água é adicionada, de um modo controlado, de modo a manter a temperatura entre 80-85°C. A batelada é ajustada para 80°C e semeada com cristais da forma preferida do produto (de um modo ideal, uma quantidade de cerca de 1% do rendimento esperado). A mistura foi resfriada a 20°C de um modo cuidadosamente controlado, durante um período de 20 horas, de modo a cristalizar o produto na forma requerida e em um tamanho suficiente para fornecer uma boa taxa de filtração. O produto é então filtrado e lavado com uma mistura de água / Ν,Ν-dimetilformamida e acetonitrila e, de um modo adequado, o licor é extraído de modo a fornecer uma forma hidratada do produto. Seguindo-se a isto, a torta é suspensa in situ durante um período (de um modo ideal, 2 horas) com acetonitrila quente (de um modo ideal em uma temperatura de 40°C) e então é filtrada, lavada com mais acetonitrila e então é secada (in vácuo ou sob uma corrente de nitrogênio) de modo a fornecer o 2-{ 3- [(7-{ 3-[etil(2-hidroxietil) amino] propóxi}-quinazolin-4-il) amino]-1H- pirazol-5-il}-N-(3-fluorofenil) acetamida como um sólido bege, em um rendimento de 85 -90 %.

RMN Ή (DMSO d6) : 10,55 (s, 1H), 9,45 (br s, 1H), 8,98 (s, 1H0, 8,8 (d, 1H), 7,63 (pr d em, 1H), 7,47 (pr de d, 1H), 7,37 (m, 2H), 7, 32 (d, 1H), 6, 9 (m, 1H), 6, 77 (s, 1 H), 4,32 (t, 2H), 3, 83 (br s, 2H), 3,76 (t, 2H), 3,35 (m, 2H), 3,25 (m, 4H), 2, 25 (m, 2H) 1, 25 (t, 3H):

MS (+ ve ESI): 508, 4 (M + H)+

Estágio 3-2IT3-({4-r('5-(2-r(3-fluorofenin amino1-2-oxoetiü-lH-pirazol-3- il)amino"l-quinazolin-7-il} oxi) propil~l(etil)amino]fosfato[AZD 1152 t-Bu P(5) éster] de mono (terc-butila)

A uma suspensão de hidrocloreto de piridina em N,N- dimetilacetamida foi carregada uma solução de 2-{3-[(7-{3-[Etil(2- hidroxietil) amino]propóxi}-quinazolin-4-il)amino]-lH-pirazol-5-il}-N- (3- fluorofenil) acetamida e di-terc-butil dietilfosforamidita (de um modo ideal, 1 equivalente molar) em N,N- dimetilacetamida durante um período de tempo estendido (de um modo ideal 3 horas) e mantendo a temperatura entre -20 a - 10°C (de um modo ideal, -15°C). Isto foi seguido pela adição posterior de di- terc-butil dietilfosforamidita (de um modo ideal, 0,5 equivalentes molares) durante um período de 1 hora, e também mantendo a temperatura entre -20 a - 10°C (de um modo ideal, -15°C).

A mistura da reação é tratada in situ com 30% de peróxido de hidrogênio p/p (cerca de 4, 2 equivalentes molares), ao mesmo tempo em que a temperatura foi mantida abaixo de -10°C (de um modo ideal, de - 12 a -8°C) e mantida durante um período nesta temperatura (de um modo ideal, 16 horas). O peróxido de hidrogênio remanescente é descrito pela adição de metabissulfito de sódio (como uma solução aquosa p/v), ao mesmo tempo em que a temperatura é mantida a abaixo de 40° C.

A solução resultante de 2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil) amino] -2-oxoetil} -1H-pirazol-3 -il)amino] quinazolin-7-il} oxi)propil] (etil) amino] etil fosfato de di-terc-butila foi então aquecida a 40°C e a solução de hidróxido de sódio (de um modo ideal, 2 M) adicionada de modo a ajustar o pH para 5,5- 6,5 (de um modo ideal para um pH de 6) através de semeadura com material cristalino adequado. A temperatura é mantida em uma faixa de pH de 5-6 através da adição de solução de hidróxido de sódio extra, durante um período de pelo menos 2 horas. Agua é então carregada e pH é adicionalmente ajustado de modo a que esteja dentro de uma faixa de pH de 8-9 (de um modo ideal em um pH de 8,8) ao mesmo tempo em que a temperatura é mantida (de um modo ideal a 40°C, mas dentro de uma faixa de 35-45°C) durante um período de 16 horas, de modo a otimizar a recuperação.

A mistura da reação quente é filtrada diretamente, de modo a fornecer 2-[[3- ({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil) amino]-2-oxotil}-lH- pirazol-3-il) amino] quinazolin-7-il}oxi)propil](etil)amino] etil fosfato de mono-terc-butila, que foi lavado várias vezes cm água e finalmente secado (ou in vácuo ou em uma corrente de um gás inerte adequado) de modo a fornecer o 2-[[3-({ 4-[(5-{2- [(3-fluorofenil) amino]-2-oxoetil}-lH-pirazol-3-il) amino]-quinazolin-7-il} oxi) propil] (etil)amino]etil fosfato de mono(terc-butila como um sólido bege, em um rendimento de entre 86 -93% .

RMN 1H (DMSO d6): 10, 48 (s, 1H), 9,75 (br s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,85 (d, 1H), 7, 67 (pr de m, 1H), 7,48 (pr de d, 1H), 7,37 (m, 2H), 7, 3 (d, 1H), 6, 87 (m, 1H), 6,83 (s, 1H), 4,34 (t, 2H), 4, 18 (m, 2H), 3, 88 (s, 2 H), 3,53 (m, 2H), 3,43 (m, 2H), 3,33 (m, 2H), 2,3 (Μ, 2H), 1, 47 (s, 9H), 1,32 (t, 3H):

MS (+ ν ESI) : (M + H)+ fragmento 644, 2761 (menos butila) 588,2147.

Estágio 4- Preparação de diidrogeno fosfato de 2-{etil [3-({4-Γ(5-{2-[(3- fluorofenil)amino1 -2-oxoetil}-1H- pirazol-3 -iDaminol quinazolin-7-il}oxi) propil] amino} etila CAZD 1152)

2-[[3-({4-[(5-{2-[(3-fluorofenil) amino]-oxoetil}-lH-pirazol- 3-il)amino]-quinazolin-7-il} oxi) propil] (etil) aminojetil fosfato de mono (terc-butila) foi suspenso em uma mistura de água/ tetraidrofurano (THF) e tratado com um excesso de entre 1,5 e 3,0 equivalentes molares de ácido clorídrico (de um modo ideal em uma concentração de 2 M e contendo 1,5 equivalentes molares). A mistura é aquecida a de 55-65°C (de um modo ideal a 60°C) e mantida a 60°C durante cerca de 1 hora. A solução quente é então tornada básica usando hidróxido de sódio (de um modo preferido em uma concentração de 2 M e contendo 1,7 equivalentes molares) de um modo a fornecer um pH dentro de uma faixa de pH de 5, 0- 5,5 e então semeado a de 55-65°C (de um modo ideal a 60°C) com cristais da forma preferida do produto (de um modo ideal em uma quantidade de cerca de 0,05% p/p do rendimento esperado). A mistura é agitada nesta temperatura durante pelo menos uma hora antes que a água seja adicionada e a suspensão é agitada e resfriada, de um modo controlado, durante um período de cerca de 12 horas, antes de ser agitada em temperatura ambiente durante pelo menos 4 horas, e então o produto é isolado através de filtração. A torta do filtro é lavada, de um modo sucessivo, com água e THF e ou secada in vácuo ou usando um procedimento de umidificação, pelo que um gás inerte umedecido com vapor d'água é passado sobre o sólido, até que um peso constante seja obtido. Após a secagem in vácuo, o sólido diidrogeno fosfato de 2-{etil[3-({4-[(5-{2-[(3- fluorofenil)amino]-2-oxoetil}-lH-pirazol-3-il)amino] quinazolin-7- il}oxi)propil] amino}etila é equilibrado, sob condições ambientais, a um peso constante, de modo a fornecer uma forma hidratada como um material similar a agulhas amarelo pálido. O produto é obtido em um rendimento de cerca de 81%.

RMN 1H (DMSO d6): MS (+ ve ESI): 587, 8 (Μ + H)+

RMN 1H (DMSO d6) : 10, 53 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,54 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,37 (m, 2H), 7,27 (s, 1 H), 7,21 (d, 1H), 6, 88 (m, 1H), 6,65 (s, 1 H), 4,27 (t, 2H), 4,05 (m, 2H), 3, 75 (s, 2 H), 3,24 (Μ, 2H), 3,21 (t, 2H), 3,13 (q, 2H), 3,13 (q, 2 H), 2, 18 (m, 2H), 1,24 (t, 3H):

MS (+ ve ESI): 588 (M + H)+

C26H31FN7O6P + 3,0 H2O requer C, 48, 7%; H, 5, 8%; N, 15, 3%; Encontrado C, 48, 8%; H, 5, 35%; N, 15, 15%.

Estágio 5- Preparação de maleato de diidrogeno fosfato [AZD 1152 maleatol de 2-{etiir3-((4-IY5-{ 2-[(3- fluorofenil)aminol-2-oxoetill-lH-pirazol-3- il)amino] quinazolin-7-il|oxi) propil] amino} etila

Acido 2-butenodióico (Z) (1,57 equivalentes molares; 449, 80 μmoles; 52,212 mg) foi dissolvido em metanol (123,54 mmoles; 5,0 ml; 3, 96 g) e a esta solução foi adicionada uma solução metanólica previamente preparada de AZD 1152 (como a forma livre de triidrato -1,00 equivalentes molares, 286,14 pmoles; 40,00 ml; 31,87 g) seguido por mais metanol (123, 54 mmoles; 5,00 ml; 3, 96 g). A mistura foi deixada em agitação durante a noite, em temperatura ambiente. Uma suspensão branca foi produzida e o sólido foi recuperado através de filtração e secado in vácuo.

A análise através de RMN confirmou que co-cristal era o maleato de AZD 1152.

Alternativa para o Estágio 5 acima :

AZD 1152 bruto (estimado em 7,44 g @ 100%, 11, 61 milimoles) foi adicionado a sulfóxido de dimetila (36 ml) e deixado em temperatura ambiente, de modo a produzir uma solução castanho pálida. A esta solução, foi adicionada uma solução de ácido maleico (1,76 g, 15,16 milimoles, 1,31 equivalentes molares) em metanol (36 ml) e a mistura foi deixada em repouso durante a noite, em temperatura ambiente. No dia seguinte, uma alíquota de uma solução clara foi transferida a um frasco, agitada e deixada vedada durante várias horas. Um depósito de um sólido branco foi formado e este foi transferido para o frasco e deixado em agitação.

De um modo gradual, a solução tornou-se turva e o sólido foi depositado. A suspensão foi deixada sedimentar durante vários dias e finalmente foi filtrada. A torta foi lavada com uma mistura a 1:1 de sulfóxido de dimetila/ metanol (15 ml no total) suspensa in situ com metanol (3 χ 25 ml) e então secada in vácuo. A análise através de RMN confirmou que o co-cristal era o maleato de AZD 1152 (em um rendimento de cerca de 78, 7%).

Alternativa adicional ao Estágio 5 acima :

AZD 1152 (como a forma livre de triidrato - 1,00 equivalente molar, 8,51 mmoles; 5, 74 g) e ácido 2-butenodióico (Z) (1,20 equivalentes molares; 10,2 mmoles; 1, 19 g) são dissolvidos em sulfóxido de dimetila (35 ml) e aquecidos a 60°C. O anti- solvente acetonitrila (20 ml) foi adicionado à mistura quente e então a mistura foi semeada com cristais da forma preferida do produto maleato de AZD 1152 (0,005 equivalentes molares ; 42, 6 micromoles; 30, 7 mg, de um modo ideal uma quantidade de cerca de 0,5% p/p do rendimento esperado). A mistura da reação é mantida a 60°C durante 4 horas, antes que uma outra carga de acetonitrila (40 ml) seja adicionada durante um período de 3 horas. A mistura é deixada em agitação a 60°C durante de 12- 20 horas (de um modo ideal, durante 16 horas). A reação é resfriada a 20°C em um modo controlado e o produto é isolado através de filtração. A torta é lavada com uma mistura de sulfóxido de dimetila/ acetonitrila (razão em volume de 1:2), seguido por acetonitrila. O sólido é secado in vácuo sob uma corrente de gás inerte quente (de um modo ideal, a 40°C) de modo a fornecer o maleato de AZD 1152 como o sólido branco em cerca de 88% de rendimento.

Breve Descrição dos Desenhos:

Figura 1: Padrão de difração de raio X no pó para o co-cristal de maleato de AZD 1152 (preparado através do Método 1 acima) - com valores 2Θ representados graficamente no eixo horizontal e a intensidade linear relativa (contagem) representada graficamente no eixo vertical.

Figura 2: Um Termograma de Calorimetria de Varredura Diferencial para o co-cristal de maleato de AZD 1152 preparado de acordo com o método 1 acima.

Figura 3: Um Termograma de Calorimetria de Varredura Diferencial para o co-cristal de maleato de AZD 1152, preparado de acordo com o Método 2 acima.

Figura 4: Representação Gráfica de Isoterma de Sorção de Vapor Dinâmica para uma batelada de co-cristal de maleato de AZD 1152 preparada de acordo com o Método 1 acima .

Figura 5: Representação Gráfica de Isoterma de Sorção de Vapor Dinâmica para uma batelada de co-cristal de maleato de AZD 1152 preparada de acordo com o Método 2 acima.

Figura 6!Representação Gráfica de Sorção de Vapor Dinâmica para a forma livre de AZD 1152.

Figura 7: Padrão de Difração de Pó de Raio X para o co-cristal de maleato de AZD 1152 (preparado através do Método 2 acima) - com valores 2Θ no eixo horizontal e a intensidade linear relativa (contagem) representada graficamente no eixo vertical.

Dados de Caracterização

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

A estrutura e a razão aproximada de componentes no co-cristal pode ser confirmada com espectroscopia por RMN de próton. Os dados típicos são apresentados abaixo. <formula>formula see original document page 49</formula>

<table>table see original document page 49</column></row><table>

NR = Sem Ressonância

A integração por RMN é ajustada aproximadamente com uma razão de ácido maleico para AZD 1152 a 1:1,04.

Calorimetria de Varredura Diferencial

A Análise de Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foi conduzida em um co-cristal de maleato de AZD 1152 de acordo com os Métodos de Preparação usando um Mettler DSC820e. As amostras tipicamente inferiores a 5 mg de material contidas em uma panela de alumínio de 40 μl com uma tampa perfurada foram aquecidas em uma faixa de temperatura de 25°C a 325°C, em uma taxa de aquecimento constante de 10°C por minuto. Um gás de purga usando nitrogênio foi usado - taxa de fluxo de 100 ml por minuto.

Os resultados para uma batelada de um co-cristal de maleato de AZD preparada de acordo com o Método 1 acima (vide figura 2) indicam que o co-cristal de maleato apresenta uma endoterma aguda, ampla, com uma temperatura inicial de 180°C devido à fusão. Seguindo-se à fusão, um grande evento endotérmico é observado devido à degradação do ácido maleico seguindo-se à fusão. Será entendido que os valores de pico da temperatura inicial e/ ou de pico de DSC podem variar ligeiramente de uma máquina para a outra, de um método para o outro, ou de uma amostra para a outra, e deste modo os valores são cotados de modo a que não sejam construídos como absolutos.

Os resultados para o co-cristal de maleato de AZD 1152, preparado através do Método 2 acima) vide Figura 3) indicam que o co-cristal do maleato apresenta uma endoterma aguda, grande, com uma temperatura inicial de 183°C devido à fusão. Seguindo-se à fusão, um grande evento endotérmico é observado devido à degradação do ácido maleico seguindo-se à fusão. Será entendido que os valores de temperatura iniciais e/ ou de pico do DSC podem variar ligeiramente a partir de uma máquina para a outra, de um método para o outro, ou de uma amostra para a outra, e deste modo os valores cotados não devem ser construídos como absolutos.

Sorção de Vapor Dinâmica

Instrumento Analítico: Analisador de Sorção de Vapor Dinâmica de Sistemas de Medições Superficiais

Cerca de 5 mg de material contido em um retentor de quartzo, em uma temperatura especificada, foram submetidos a nitrogênio umidificado em uma taxa de fluxo de 200 ml/ minuto de nitrogênio a 25°C nas umidades relativas que se seguem (RH): 0, 20, 40, 60, 80, 95, 80, 60, 40, 20, 0% de RH em duplicata.

O peso do material em uma umidade relativa particular foi monitorado até que ele estivesse estável de acordo com um critério de peso de uma alteração de peso de 0,002% do peso por minuto, sendo efetuada a média em 10 minutos. Se o peso estivesse ainda sendo alterado, então ele permaneceria em uma umidade relativa particular, até que o peso estivesse estável (até um período de tempo máximo de 12 horas).

Os resultados para uma batelada de co-cristal de maleato de AZD 1152, preparado de acordo com o Método 1, são apresentados na Figura 4. Os resultados para uma batelada de co-cristal de maleato de AZD 1152, preparado de acordo com o Método 2 acima, são apresentados na Figura 5.

Os resultados de Sorção de Vapor Dinâmica apresentados nas Figuras 4 e 5 indiciam que a amostra é não- higroscópica e que a absorção de peso é atribuída à adsorção superficial. A perda de peso observada na Figura 5 durante o Ciclo 1 é atribuída a uma pequena quantidade de solvente representa na amostra de manufatura. Isto é confirmado pelo peso reduzido em 0% de RH. Uma vez que este solvente tenha sido evaporado, o material mantém o seu peso em 0% de RH. Esta observação será plenamente entendida por aquele versado na técnica.

A Sorção de Vapor Dinâmica da forma livre de AZD 1152 é apresentada na Figura 6.

A Sorção de Vapor Dinâmica da forma livre de AZD 1152 indica que o nível de água é bastante variável, dependendo da umidade relativa de armazenamento. Esta alteração no nível de água é devida a diferentes estados de hidratação, que podem estar em uma faixa a partir de um estado desidratado a um estado tetraidratado e mais alto.

Difração de Pó por Raio X E mencionado acima que o padrão de difração de raio X no pó para o co-cristal de maleato de AZD 1152 é apresentado na Figura 1.

Um método de manufatura adicional para o maleato de AZD 1152 foi apresentado no Método 2 acima. O padrão de difração de raio X no pó para o co-cristal de maleato de AZD 1152 produzido pelo Método 2 é apresentado na Figura 7. Os picos principais são apresentados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Como acima mencionado, é conhecido na técnica que pode ser obtido um padrão de difração de raio X no pó, que possui um ou mais erros de medição, dependendo das condições de medição (tais que o equipamento, a preparação da amostra, ou a máquina usada). De um modo particular, é geralmente conhecido que as intensidades em um padrão de difração de raio X no pó podem flutuar dependendo das condições de medição e da preparação da amostra. Por exemplo, aqueles versados na técnica de difração de pó por raio X irão perceber que a intensidade relativa dos picos pode ser efetuada, por exemplo, pelos grãos com tamanho acima de 30 mícrons e com razões de aspecto não- unitárias, o que pode afetar a análise das amostras. A pessoa versada na técnica irá também perceber que as posições dos reflexos pode ser afetada pela altura precisa, na qual a amostra é assentada no difractômetro e pela calibração zero do difractômetro. A planaridade superficial da amostra pode também ter algum pequeno efeito. Deste modo, aquele versado na técnica irá apreciar que os dados do padrão de difração aqui apresentados não devem ser construídos como absolutos (para informação adicional vide Jenkins, R & Snyder, R. L. "Introduction to X- Ray Powder Diffractometry", John Wiley & Sons, 1996).

Deve ser também mencionado que, de um modo geral, um erro de medição em um ângulo de difração em um difractograma de raio X no pó é de cerca de 2- teta =0,5° ou menos (ou, de um modo mais adequado, de cerca de 2- teta = O, 2o ou menos) e um tal grau de erro de medição deve ser levado em conta quando da consideração do padrão de difração de raio X no pó na Figura 1, e quando da interpretação das posições de pico, às quais faz-se referência no texto acima e na Tabela 1.

Tendo isto em mente, aquele versado na técnica irá apreciar que os dados apresentados na Figura 7 e na Tabela 2 indicam que o co-cristal de maleato de AZD 1152, produzido pelo Método 2, é a mesma forma cristalina que o co-cristal de maleato de AZD 1152 produzido pelo Método 1 (e apresentado na Figura 1 e na Tabela 1).

Claims

1. Co-cristal de maleato de AZD 1152, caracterizado pelo fato de que o AZD 1152 é: <formula>formula see original document page 54</formula>

2. Forma cristalina, caracterizada pelo fato de ser do co-cristal de maleato de AZD 1152, como definido na reivindicação 1.

3. Forma cristalina do co-cristal de maleato de AZD 1152 de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o referido co- cristal possui um padrão de di fração de raio X no pó com picos específicos em cerca de 2- teta = 12,9° e 15,2° e/ ou 10,2°.

4. Método de preparação de um co-cristal de maleato de AZD 1152 como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende o estágio de misturar uma solução de forma livre de AZD 1152 com ácido maleico, em um solvente adequado, tal como metanol, sulfóxido de dimetila (DMSO) ou uma mistura dos mesmos.

5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um co-cristal de maleato de AZD 1152, como definido na reivindicação 1 em associação com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

6. Co-cristal de maleato de AZD 1152 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o uso em terapia.

7. Uso de um co-cristal de maleato de AZD 1152, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, em que a inibição de uma ou mais aurora quinase(s) é benéfica.

8. Uso de um co-cristal de maleato de AZD 1152, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças hiperproliferativas, tais como câncer.