BRPI0712897A2 - método e sistema para detectar e/ou quantificar um analito em uma amostra - Google Patents

Abstract

MéTODO E SISTEMA PARA DETECTAR E/OU QUANTIFICAR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA. A presente invenção descreve a provisão de um controle interno de técnicas analíticas envolvendo rotulação de analitos, tais como SERRS, para detecção de um analito, particularmente uma biomolécula de uma amostra, com melhorada precisão.

Description

"MÉTODO E SISTEMA PARA DETECTAR E/OU QUANTIFICAR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método para a detecção de um analito, particularmente uma biomolécula de uma amostra, por uma técnica analítica envolvendo rotulação de analitos, em que a precisão e/ou confiabilidade da medição é de importância.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A detecção sensível e precisa, qualitativa ou quantitativamente, de baixas concentrações de biomoléculas, tais como proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos, ácidos nucleicos, lipídeos, polissacarídeos, hormônios, neurotransmissores, metabólitos etc. provou ser um objetivo ilusório com usos potenciais muito difundidos em diagnósticos médicos, patologia, toxicologia, epidemiologia, guerra biológica, amostragem ambiental, campos forenses e numerosos outros.

Um exemplo particular é a detecção do DNA, p. ex., em diagnósticos médicos (a detecção de agentes infecciosos como bactérias e vírus patogênicos, o diagnóstico de doenças genéticas herdadas e adquiridas etc.) em testes forenses como parte de investigações criminais, em disputas de paternidade, em seqüenciamento do genoma completo etc.

Embora a identificação e/ou quantificação de uma amostra purificada possa às vezes ser realizada com base nas propriedades físico- químicas do próprio analito, muitos ensaios de detecção fazem uso de uma 'sonda', que é uma molécula conhecida tendo uma forte afinidade e, preferivelmente, também um alto grau de especificidade para o analito. Onde o analito for uma proteína ou peptídeo, esses ensaios são referidos como ensaios de ligação de ligando. Um dos ensaios de ligação de ligando mais comuns são os imunoensaios. Os imunoensaios tipicamente empregam um anticorpo que especificamente se liga ao antígeno dentro do analito, para formar um complexo de anticorpo-antígeno. Os ensaios de ligação de ligando são especialmente pertinentes a diagnósticos médicos. Na prática médica moderna, os ensaios de ligação de ligando são rotineiramente realizados em sangue, urina, saliva etc. de pacientes, a fim de determinar a presença ou níveis de anticorpos, antígenos, hormônios, medicamentos, venenos, toxinas, medicamentos ilegais etc. Os ensaios de ligação de ligando estão também sendo usados para monitorar contaminação de água subterrânea, toxinas e pesticidas em alimentos, processos biológicos industriais e em muitas áreas de pesquisa biológica.

A detecção do DNA tipicamente faz uso da hibridização de uma 'sonda" que é uma seqüência de nucleotídeo específica do DNA alvo. Tais ensaios são comumente usados na detecção específica de agentes infecciosos ativos, para a identificação de DNA em análises forenses e na identificação de defeitos genéticos.

Um aspecto comum destes ensaios de detecção é com freqüência a rotulação da sonda específica de analito com uma substância traçável. A detecção da substância traçável (a seguir referida como umrótulo), ligada ao analito, é indicativa da quantidade de analito da amostra. A detecção do rótulo pode ser assegurada usando-se uma de uma variedade de diferentes técnicas, dependendo da natureza do rótulo empregado. Os atuais métodos de detecção tipicamente envolvem a detecção de anticorpos fluorescentemente rotulados ou sondas de oligonucleotídeos, que podem ligar-se ao analito ou biomolécula alvo. A reatividade cruzada e ligação não- específica podem complicar a detecção fluorescente das biomoléculas em amostras complexas. Mesmo onde elevada especificidade de sonda for obtida, a sensibilidade da detecção fluorescente é com freqüência insuficiente para identificar baixas concentrações de biomoléculas. Isto é particularmente verdadeiro quando a biomolécula a ser detectada está presente em baixas concentrações em uma mistura complexa de outras moléculas, onde a interferência, extinção da fluorescência e elevada fluorescência de fundo podem todas atuar para obscurecer ou diminuir o sinal da biomolécula alvo.

A espectroscopia Raman intensificada na superfície (ressonância) ou SE(R)RS é uma técnica que está rapidamente progredindo na fluorescência para detecção, em vista de sua sensibilidade impressionante. A espectroscopia Raman utiliza o fenômeno de dispersão Raman. Quando a luz passa através de uma amostra opticamente transparente, uma fração da luz é espalhada em todas as direções. A maior parte dos fótons dispersos são do mesmo comprimento de onda que o da luz incidente. Isto é conhecido como dispersão Rayleigh. Entretanto, uma pequena fração da luz dispersa tem um diferente comprimento de onda e uma ligeira alteração aleatória de fase. Os comprimentos de onda do espectro de emissão Raman de Stokes (Anti- Stokes) são mudados para mais longos (ou mais curtos) comprimentos de onda relativos ao comprimento de onda de excitação. O espectro Raman é característico da composição e estrutura químicas das moléculas absorvendo luz de uma amostra, enquanto a intensidade da dispersão Raman é dependente da concentração destas moléculas. A dispersão Raman intrinsecamente fraca pode ser aumentada por fatores de até IO8 ou mais quando um composto é adsorvido em ou próximo de superfícies metálicas asperizadas, p.ex., nanopartículas de ouro, prata, cobre e certos outros metais. A técnica associada com este fenômeno é conhecida como dispersão Raman aumentada na superfície (SERS). O aumento da sensibilidade de detecção é mais significativo quanto mais próximo o analito situa-se da superfície "ativa". A posição ótima é na primeira camada molecular em torno da superfície, isto é, dentro de cerca de 30 nm da superfície. Isto pode ser conseguido por, pela exemplo, espermina, que neutraliza a carga líquida sobre os ácidos nucleicos, a fim de que as moléculas possam ficar em estreita proximidade da superfície de prata.

Um outro aumento e IO3 a IO5-Vezes na sensibilidade pode ser obtido operando-se na freqüência de ressonância do analito ou, como é mais comumente realizado, fazendo-se uso de uma substância ou corante 'SERS- ativo' ou fixado ao analito (capaz de gerar um espectro SE(R)RS quando apropriadamente iluminado) e operando na freqüência de ressonância do corante. Isto é denominado espectroscopia de "dispersão Raman de ressonância". A combinação do efeito de intensificação de superfície e o efeito de ressonância para fornecer "dispersão Raman de ressonância intensificada na superfície" ou SERRS aumenta fortemente a sensibilidade. Em comparação com a fluorescência, um sinal SERRS pode ser mais facilmente discriminado da contaminação e segundo plano.

Outra vantagem chave da SE(R)RS é a possibilidade de multiplexar utilizando-se um único comprimento de onda de excitação. Cada corante ativo-SE(R)RS usado como um rótulo fornece uma única impressão digital, que pode ser reconhecida em uma mistura de corante sem separação, como seria necessário para espectroscopia de fluorescência. Há cerca de 50 corantes especialmente projetados para SE(R)RS, cada um dos quais fornece um único espectro. A SE(R)RS é assim um método altamente sensível e específico para detecção de biomolécula, fornecendo suficiente sensibilidade para detectar baixas concentrações de biomoléculas. As técnicas bioanalíticas empregando SE(R)RS têm demonstrado permitir a detecção de quantidades de atomol (IO"18 mol) de proteínas ou danas até concentrações de fentomol (IO"15 mol em 400 μΐ). Os limites de detecção de molécula única foram informados para rodamina 6G, adenina, violeta cristal e outras moléculas SERRS-ativas. A espectroscopia Raman é aplicada muito largamente, de análise de material em física a uma larga variedade de aplicações em biologia.

Ainda que métodos de detecção muito sensíveis, tais como SE(R)RS estejam disponíveis, análise quantitativa precisa permanece um desafio. Cada método tipicamente requer a produção de reagentes e o fornecimento de condições de detecção específicas, cuja variabilidade pode afetar a precisão da detecção.

Também para métodos de detecção baseados em SE(R)RS5 vários fatores foram informados afetarem a confiabilidade e precisão da detecção. As superfícies SE(R)RS-ativas têm uma estrutura e dinâmica complexas, que tornam difícil manufaturá-las em uma maneira reprodutível. Além disso, a intensificação de SE(R)RS é fortemente dependente da distância entre o analito e a superfície SE(R)RS-ativa. Além disso, variações de intensificação SE(R)RS ocorrem com a cobertura de superfície do analito na superfície SE(R)RS-ativa (relacionada com a distribuição dos pontos quentes SE(R)RS-ativos). Além disso, medições de concentração quantitativas usando-se métodos ópticos (incluindo SE(R)RS bem como Raman ou fluorescência normal) devem competir com variações de intensidade produzidas por mudanças de excitação, eficiência de coleta ou ambas.

Na arte, correção de tais variações é muitíssimo freqüentemente abordada usando-se um padrão interno e/ou externo para calibrar a correlação entre o sinal óptico e a concentração (ou quantidade) para o analito de interesse. Foi proposto melhorar a precisão da quantificação de SE(R)RS (coloidal) utilizando-se o sinal SE(R)RS gerado por uma monocamada auto-montada (SAM) como um padrão interno. Com este método, a elevada cobertura da SAM é presumida evitar a quimissorção do analito nas superfícies SE(R)RS e, assim, melhorar a reprodutibilidade. Entretanto, esta abordagem foi constatada ter numerosas limitações intrínsecas, resultando em erros de previsão relativamente grandes (erro de predição de raiz média de 0,5 M para amostras entre 0,1 e 5 M) observados quando utilizando-se este método de padrão interno SAM.

Foi proposto que, assegurando-se que o analito e moléculas padrão internas tenham propriedades químicas virtualmente idênticas, sua intensidade SE(R)RS relativa é muito menos sensível a variações de solução colóides de batelada-para-batelada e parâmetros de excitação/coleta óptica. Isto permitiria melhoria da precisão das medições de SE(R)RS quantitativas em uma larga faixa de concentrações, com melhorada precisão e reprodutibilidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O objetivo da invenção é prover um método alternativo ou aperfeiçoado para a detecção, p. ex., qualitativa ou quantitativamente, de um analito por uma técnica de detecção envolvendo a rotulação do analito. Uma vantagem do método é a confiabilidade melhorada e/ou precisão da medição.

Em um aspecto da presente invenção, uma referência interna é incluída para desse modo assegurar melhorada confiabilidade e precisão da detecção. Mais particularmente, isto é conseguido introduzindo-se uma medição adicional que é igualmente determinada pela presença e/ou quantidade do analito da amostra e, assim, pode servir como uma referência interna para a detecção direta do analito. Quando trabalhando-se com uma quantidade predeterminada de rótulo, a detecção e/ou quantificação da fração de rótulo não ligado provê uma referência interna sobre a detecção/quantificação direta do analito, que é baseada na medição da fração do rótulo ligado.

A presente invenção assim provê métodos para detectar e, opcionalmente, quantificar a presença de um analito em uma amostra, compreendendo as etapas de: a) contatar a amostra potencialmente compreendendo o analito com uma quantidade predeterminada de rótulo capaz de ligar-se ao analito; b) detectar a fração do rótulo ligado ao analito, por meio do que a quantidade do rótulo ligado ao analito é indicativa da presença (e, opcionalmente, da quantidade) do analito da amostra; e compreendendo ainda a etapa de (c) detectar a fração de rótulo não ligado ao analito, por meio do que a quantidade do rótulo não ligado ao analito provê um controle interno indiretamente indicativo da presença (e opcionalmente da quantidade de analito da amostra) em que dita etapa de detecção de (b) e (c) é assegurada utilizando-se um método de detecção óptica.

De acordo com uma forma de realização, a detecção da fração de rótulo ligado ao analito e a detecção da fração de rótulo que não é ligada ao analito é preformada sem separação anterior, isto é, dentro da mesma amostra. Isto pode ser conseguido, p. ex., pelo uso de um rótulo, que pode ser diferencialmente detectado em um estado ligado ou não ligado. Os rótulos que são usados são rótulos ópticos. De acordo com uma forma de realização particular, é feito uso de um rótulo que é um fluorescente e/ou um rótulo ativo-SE(R)RS cuja máxima freqüência de absorção é mudada de uma primeira para uma segunda freqüência em associação de dito fluorescente e/ou rótulo SE(R)RS-ativo com dita superfície SE(R)RS-ativa. Alternativamente, é feito uso de um rótulo, que é provido como um sinalizador molecular, a fim de assegurar um diferente sinal para o rótulo, quando ligado ao analito e quando não ligado ao analito.

De acordo com uma forma de realização alternativa, os métodos da presente invenção incluem ainda, antes da etapa (b), uma etapa de separação, por meio da qual a fração do rótulo ligado ao analito é separada da fração do rótulo não ligado ao analito. Esta etapa de separação pode envolver a remoção de uma ou ambas as frações da amostra ou pode ser uma separação física das frações dentre de uma amostra.

De acordo com uma forma de realização, isto é conseguido capturando-se a fração de rótulo ligado em um substrato e fisicamente removendo-se o substrato ou a fração de rótulo não ligado da amostra. A fração de rótulo ligado pode ser capturada em um substrato por meio de uma sonda de captura, que captura o analito no substrato. De acordo com uma forma de realização, a sonda de captura é uma sonda de captura específica de analito. Alternativamente, a ligação do analito com o substrato ocorre através de uma etiqueta de biotina no analito, que é contatada com uma etiqueta de estreptavidina do substrato. A etiqueta de biotina pode ser incorporada dentro do analito por amplificação de PCR.

Outras formas de realização específicas da presente invenção referem-se a métodos em que a separação da fração ligada e não ligada de rótulo é assegurada pela ligação da fração ligada a um substrato ou uma etiqueta, que é reativa a uma força física ou química e a aplicação da forma física ou química (tal como uma força gravitacional, campo magnético) é usada para (re)mover a fração ligada.

Os métodos da presente invenção são aplicáveis à detecção de virtualmente qualquer tipo de analito, tal como mas não limitado a um ácido nucleico, uma proteína, um carboidrato, um lipídeo, uma substância química, um anticorpo, um microorganismo ou uma célula eucariótica. Formas de realização particulares dos métodos da presente invenção referem-se à detecção e/ou quantificação de seqüências de ácido nucleico tais como DNA.

Muitíssimo particularmente, os métodos da presente invenção são métodos pelos quais as etapas de detecção (b) e (c) descritas acima são asseguradas usando-se um método de detecção óptica. Muitíssimo especificamente, as etapas de detecção (b) e (c) dos métodos da presente invenção são asseguradas usando-se SE(R)RS, por meio do que o rótulo é um rótulo SE(R)RS-ativo. Em uma forma de realização particular, os métodos assim ainda compreendem, antes da etapa (b) e (c), uma etapa que envolve a contatação da fração de rótulo ligado com o analito e da fração do rótulo não ligada ao analito com uma superfície SE(R)RS-ativa. Onde a detecção do rótulo ligado e não-ligado for realizada dentro da mesma amostra, o rótulo ligado e não-ligado são contatados com a superfície SE(R)RS-ativa simultaneamente, adicionando-se a superfície SE(R)RS ativa na amostra. Em uma forma de realização particular, a superfície SE(R)RS-ativa usada nos métodos da presente invenção é uma suspensão coloidal de nanopartículas de prata ou ouro, ou seus colóides agregados. Tipicamente, quando trabalhando com uma amostra em que o analito não está presente em uma forma purificada, isto é, em uma amostra em que outros componentes estão presentes, o rótulo usado nos métodos da presente invenção é um rótulo específico de analito, isto é, capaz de ligar-se especificamente ao analito. Contudo, é também considerado que, onde o analito estiver presente em uma forma purificada e os métodos da invenção forem usados para fins de quantificação, é suficiente que o rótulo ligue-se ao analito.

Onde o rótulo usado nos métodos da presente invenção for um rótulo específico de analito, isto pode ser assegurado utilizando-se uma sonda específica de analito ligada a um rótulo. Tipicamente, onde o analito for uma seqüência de nucleotídeo, a sonda específica de analito pode ser uma seqüência de nucleotídeo complementar.

A presente invenção também fornece um sistema para detectar e/ou quantificar a presença de um analito em uma amostra, compreendendo:

a) meio para contatar dita amostra potencialmente compreendendo dito analito com uma quantidade predeterminada de rótulo capaz de ligar-se a dito analito.

b) meio para detectar a fração de rótulo ligada a dito analito; por meio do que a quantidade de rótulo ligado a dito analito é indicativa da presença e, opcionalmente, da quantidade de analito em dita amostra; e

c) meio para detectar a fração de rótulo não ligado a dito analito; por meio do que a quantidade de rótulo não ligado a dito analito, deduzida de dita quantidade predeterminada de rótulo, provê um controle interno indicativo da presença e, opcionalmente, da quantidade de analito em dita amostra.

O sistema pode ser usado para análise de analito, p. ex., em diagnóstico molecular.

As características, aspectos e vantagens acima da presente invenção tornar-se-ão evidentes pela seguinte descrição detalhada, tomada em conjunto com os desenhos anexos, que ilustram, por meio de exemplo, os princípios da invenção. Esta descrição é dada para fins de exemplo somente, sem limitar o escopo da invenção. Os algarismos de referência citados abaixo refere-se aos desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um desenho esquemático de uma forma de realização particular do método de detecção da presente invenção, para medir rótulo ligado e não-ligado a analito.

A Figura 2 é uma desenho esquemático de uma forma de realização do método da presente invenção como aplicado à detecção SE(R)RS de DNA em uma amostra.

A Figura 3A é um exemplo dos espectros de SE(R)RS dos rótulos ligados a analito e não ligados, de acordo com uma forma de realização da invenção. Uma comparação dos espectros fornece informação extra sobre a concentração do analito.

A Figura 3B é um exemplo dos espectros de fluorescência dos espectros de rótulos ligados e não-ligados no analito, de acordo com uma forma de realização da invenção. Uma comparação dos espectros fornece informações extras sobre a concentração do analito.

As Figuras 4A e B são representações esquemáticas dos sistemas de acordo com diferentes formas de realização da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O termo "analito", como aqui usado, refere-se à substância a ser detectada na amostra de teste empregando-se a presente invenção. Uma lista não limitativa de analitos considerada pela presente invenção é provida na descrição.

O termo "rótulo", como aqui usado, refere-se a uma molécula ou material capaz de gerar um sinal detectável. Uma lista não limitativa de rótulos consideradas para uso nos métodos da presente invenção é provida na descrição.

A expressão "fração de rótulo ligado" como aqui usada refere- se àqueles rótulos que, quando adicionando-se uma quantidade predeterminada de rótulo a uma amostra, se ligam ao analito.

A expressão "fração de rótulo não-ligado", como aqui usada, refere-se àqueles rótulos que, quando adicionando-se uma quantidade predeterminada de rótulo a uma amostra, não se liga ao analito.

Será entendido que, nos métodos da presente invenção, é feita referência às frações de rótulo ligado e não-ligado, independentemente de se, na detecção, qualquer rótulo é detectado na fração pertinente.

Uma "sonda específica de analito" como aqui usado, é uma sonda capaz de especificamente ligar-se ao analito e a que um rótulo pode ser ligado. A ligação da sonda ao analito pode ser baseada em qualquer tipo de interação, incluindo mas não limitado a seqüências de nucleotídeos complementares, interação antígeno/anticorpo, ligação ligando/receptor, interação de enzima/substrato etc.

Um "rótulo específico de analito" como aqui usado, refere-se a um rótulo que é capaz de especificamente ligar-se ao analito, por suas características inerentes ou como resultado do rótulo ser ligado a uma sonda específica de analito.

Uma "sonda de captura" como aqui usada refere-se a uma molécula capaz de ligar uma molécula ou um complexo de moléculas a um substrato.

Um "substrato" como aqui usado refere-se a um material a que moléculas ou complexos de moléculas podem ser ligados e que pode ser manipulado. Exemplos típicos de substratos incluem mas não são limitados a placas de microtítulo, sondas, chips etc.

Uma "superfície SE(R)RS-ativa" como aqui usada refere-se a uma superfície metálica que contribui para forte intensificação da dispersão Raman quando analitos são adsorvidos ou estão em estreita proximidade dela. A superfície pode, p. ex., ser uma superfície metálica cauterizada ou asperizada, um sol metálico ou uma agregação de partículas colóides metálicas. Uma lista mais extensa de superfícies SE(R)RS-ativas é para ser encontrada na descrição abaixo.

A presente invenção será descrita com respeito a formas de realização particulares e com referência a certos desenhos, porém a invenção não é limitada a eles, mas somente pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não serão interpretados como limitantes do escopo. Os desenhos descritos são somente esquemáticos e não são limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode ser exagerado e não feito em escala para fins ilustrativos. Onde o termo "compreendendo" for usado no presente relatório e reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Onde um artigo indefinido ou definido for usado quando referindo- se a um substantivo singular, p. ex., "um" ou "uma", "o", "a", este inclui um plural daquele substantivo, a menos que outra coisa seja especificamente citada.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma técnica analítica para a detecção e/ou quantificação de um analito de uma amostra com base na rotulação do analito, por meio do que uma quantidade predeterminada de rótulo é contatada com a amostra e, além da detecção e/ou quantificação do rótulo ligado, também a fração não ligada do rótulo é quantificada. Assim, de acordo com uma forma de realização, o método da invenção inclui as etapas de (Figura 1):

contatar uma amostra suspensa para conter um analito com uma quantidade predeterminada de rótulo capaz de ligar-se ao analito, e

detectar e/ou quantificar a fração de rótulo ligado ao analito (fração de rótulo ligada) e detectar e/ou quantificar a fração de rótulo não ligada no analito (fração não ligada de rótulo).

A invenção é baseada na concepção de que, quando trabalhando-se com uma quantidade predeterminada de rótulo (rótulo total ou .100%), a detecção da fração de rótulo ligada provê informação direta sobre a presença e/ou concentração do analito (x ou a% de rótulo total), enquanto ao mesmo tempo a detecção da fração de rótulo não ligada (y ou b% do rótulo total) deve indiretamente prover a mesma informação (rótulo total - y = x; ou .100% - b%"= a%) e pode assim servir como uma referência ou controle interno.

A introdução de uma referência interna de acordo com o método da presente invenção assegura uma detecção mais precisa e confiável de analitos.

O método da presente invenção pode, em princípio ser aplicado a qualquer técnica de detecção analítica, por meio do que a detecção é baseada na ligação de um rótulo ao analito e detecção do rótulo ligado ao analito. Muitíssimo particularmente, os métodos da presente invenção são adequados para métodos de detecção que permitam a detecção quantitativa precisa do rótulo em uma larga faixa de concentrações. Tipicamente, os métodos de detecção baseados na detecção utilizando-se um rótulo requer a adição de um excesso de rótulo na amostra, para assegurar detecção precisa. Dependendo da quantidade de analito na amostra, a fração de rótulo não ligado varia de muito grande (isto é, próxima à ou a mesma que a quantidade predeterminada de rótulo em excesso adicionado) a muito pequena. Tipicamente, quando trabalhando-se com sondas de DNA, as concentrações de rótulo dentro de uma faixa de IO"6 M e IO"9 M são usadas.

Os métodos da presente invenção são métodos que envolvem a detecção de um analito. A natureza do analito a ser detectado não é crítica para a invenção e pode ser qualquer molécula ou agregado de moléculas de interesse para detecção. Uma lista não-exaustiva de analitos inclui uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, aminoácido, ácido nucleico, oligonucleotídeo, nucleotídeo, nucleosídeo, carboidrato, polissacarídeo, lipopolissacarídeo, glicoproteína, lipoproteína, nucleoproteínas, lipídeo, hormônio, esteróide, fator de crescimento, citocina, neurotransmissor, receptor, enzima, antígeno, alérgeno, anticorpo, metabólito, co-fator, nutriente, toxina, veneno, medicamento, agente de guerra biológica, agente bio-perigoso, agente infeccioso, priônio, vitamina, imunoglobulinas, albumina, hemoglobina, fator de coagulação, interleucina, interferon, citocina, um peptídeo compreendendo um epítopo específico de tumor e um anticorpo para qualquer uma das substâncias acima. Um analito pode compreender um ou mais agregados complexos, tais como mas não limitados a um vírus, bactéria, fungo, microorganismo tal como Salmonella, Streptococcus, Legionella, E. coli, Giardia, Cryptosporidium, Rickettsia, esporo, mofo, levedura, algas, amebas, dinoflagelado, organismo unicelular, patógeno ou célula, e moléculas de superfície de célula, fragmentos, portões, componentes, produtos, moléculas orgânicas pequenas, ácidos nucleicos e oligonucleotídeos e metabólitos de microorganismos.

De acordo com uma forma de realização particular, um analito é um DNA tal como um gene, DNA viral, DNA bacteriano, DNA fungico, DNA de mamífero ou fragmentos de DNA. O analito pode ser RNA tal como RNA viral, mRNA, rRNA. O analito pode também ser cDNA, oligonucleotídeos ou DNA, RNA, PNA sintético, oligonucleotídeos sintéticos, oligonucleotídeos modificados ou outro análogo de ácido nucleico. Pode compreender ácidos nucleicos se filamento único e de filamento duplo. Pode, antes da detecção, ser submetido a manipulações tais como digestão com enzimas de restrição, cópia por meio de polimerases de ácido nucleico, cisalhamento ou sonicação, assim permitindo que ocorra fragmentação.

A invenção é particularmente adequada para métodos de detecção, que envolvam detecção pelo uso de um rótulo, tal como mas não limitado a um corante fluorescente, cromogênico ou quimioluminescente, um rádio-isótopo, metal e/ou nanopartícula magnética etc.

Portanto, as etapas de detecção realizadas nos métodos da invenção serão determinadas pelo rótulo usado e incluem mas não são limitadas a fluorescência, colorimetria, absorção, reflexão, polarização, refração, eletroquímica, quimiluminescência, dispersão de Rayleigh e dispersão de Raman, SE(R)RS, dispersão de luz de ressonância, ressonância de plasmônio de superfície acoplada por grade, contagem de cintilação, sensores magnéticos, detecção eletroquímica (tal como voltametria de extração de ânodo) etc.

Rótulos adequados para uso nos diferentes métodos de detecção são numerosos e extensamente descritos na arte. Rótulos fluorescentes incluem mas não são limitados a isotiocianatos de fluoresceína (FITC), carboxifluoresceínas, tais como tetrametilrodamina (TMR), carbóxi tetrametil-rodamina (TAMRA), carbóxi-X-rodamina (ROX), sulforrodamina .101 (Texas Red™), corantes Atto (Sigma Aldrich), Fluorescent Red e Fluorescent Orange, ficoeritrina, ficocianina e corantes Crypto-Fluor™. Os radioisótopos mais comuns incluem beta-emissores tais como 3H e 14C e emissores gama, tais como iodo-125 ( I). Outros rótulos descritos usados em ensaios quantitativos e qualitativos incluem mas não são limitados a dendrímeros, pontos quantitativos, substâncias fosforescentes de conversão ascendente e nanopartícuias.

O método da presente invenção é particularmente adequado para métodos de detecção baseados em espectroscopia Raman intensificada na superfície (ressonância) (SE(R)RS), que permite detecção quantitativa sensível em uma larga faixa de concentrações.

Embora a detecção do analito nos métodos da invenção seja baseada em SE(R)RS, o rótulo é um material que é SE(R)RS-ativo, isto é, que é capaz de gerar um espectro SERS ou SERRS quando apropriadamente iluminado, também referido aqui como um rótulo ou corante SE(R)RS-ativo. Exemplos não limitativos de rótulos SE(R)RS-ativos incluem corantes de fluoresceína, tais como 5-(e 6-) carbóxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetóxi fluoresceína, 5-carbóxi-2',4',5',7'-tetraclorofluoresceína e 5- carboxifluoresceína; corantes de rodamina tais como 5- (e 6-) carbóxi rodamina, 6-carboxitetrametil rodamina e 6-carboxirrodamina X, ftalocianinas tais como metila, nitrosila, sulfonila e amino ftalocianinas, corantes azo tais como aqueles listados na Patente U.S. No. 6127120, azometinas, cianinas e xantinas, tais como derivativos de metila, nitro, sulfano e amino, e succinilfluoresceínas. Cada um destes pode ser substituído de qualquer maneira convencional, dando origem a um grande número de rótulos úteis.

De acordo com uma forma de realização particular, o rótulo SE(R)RS-ativo é uma rodamina carbóxi, FAM ou ΤΕΤ. Foi demonstrado que uma curva de calibração para um oligonucleotídeo rotulado com carboxirrodamina R6G alcança um limite de detecção de 1,05 χ IO"12 M (que, levando-se em conta os efeitos da diluição, correspondeu a uma detecção de 0,5 fentomoles do oligonucleotídeo rotulado do volume da amostra). Ao mesmo tempo, o gráfico de calibração de R6G (bem como para FAM e ΤΕΤ) mostrou ser linear em uma faixa de IO"7 M a 10"11 M (LGC 'Evaluation of the sensivity of SERRS-based DNA detecção, Janeiro de 2004, LGC/Mfb/2004/02, disponível em

http://www.mfbprog.org.uk/themes/theme/publications item.asp?intThemeID-10&intPublicationID=865).

E observado que a escolha do rótulo pode ser influenciada por fatores tais como a freqüência de ressonância do rótulo, a freqüência de ressonância de outras moléculas presentes na amostra etc. Rótulos SE(R)RS- ativos de uso para detectar biomoléculas são descritos na arte, tais como nas Patentes U.S. Nos. US 5306403, US 6002471 e US 6174677.

A detecção por espectroscopias intensificadas na superfície, tais como espectroscopia Raman intensificada na superfície (ressonância) (SE(R)RS) é baseada na forte intensificação da dispersão Raman observada para analitos adsorvidos em uma superfície metálica asperizada, que podem ser colóides. Assim, isto requer a detecção do rótulo na presença de uma apropriada 'superfície SE(R)RS-ativa". Tipicamente, a superfície é uma superfície metálica nobre (Au, Ag, Cu) ou alcalina (Li, Na, Κ). A superfície metálica pode, por exemplo, ser uma superfície metálica cauterizada ou de outro modo asperizada, um sol metálico, de acordo com uma forma de realização particular, uma agregação de partículas metálicas colóides como o último resulta em intensificações para SERRS maiores do que 10 - IOiz da dispersão Raman. As nanopartículas metálicas compondo a superfície SE(R)RS-ativa nos métodos de detecção da presente invenção podem também ser dispostos em películas ilha nanoparticuladas metálicas, substratos baseados em nanopartículas revestidas com metal, películas poliméricas com nanopartículas metálicas embutidas e similares. A superfície metálica pode ser um metal nu ou pode compreender uma camada de óxido metálico em uma superfície metálica. Pode incluir um revestimento orgânico, tal como de citrato ou de um polímero adequado, tal como polilisina ou polifenol, para aumentar sua capacidade sorptiva.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção, as partículas colóides metálicas compondo a superfície SE(R)RS- ativa são nanopartículas ou nanopartículas colóides agregadas em uma maneira controlada, tal como descrito no US 20050130163 Al. Métodos alternativos de preparar nanopartículas são conhecidos (p. ex., Patentes U.S. Nos. 6054495, 6127120, 6149868). As nanopartículas podem também ser obtidas de fontes comerciais (p. ex., Nanoprobes Inc., Yaphank, N.Y.; Polysciendes, Inc., Warrington, Pa). As partículas metálicas podem ser de qualquer tamanho, contanto que elas dêem origem a um efeito SE(R)RS. Tipicamente, elas têm um diâmetro de cerca de 4 - 50 nm, muitíssimo particularmente entre 25 - 40 nm, dependendo do tipo de metal.

Nos métodos de detecção e/ou quantificação da presente invenção fazendo uso de métodos de detecção SE(R)RS, é considerado que (pelo menos) um dos componentes usados ou uma combinação deles, isto é, o rótulo, a sonda, a sonda rotulada, o analito ou o analito ligado por rótulo seja adsorvido em uma superfície metálica. Tal adsorção pode ser mediada por ligação direta ou por um composto ligador, envolvendo ligação não-covalente ou covalente. Várias opções e modos de adsorção são conhecidos na arte e descritos, p. ex., nas Patentes U.S. Nos. 6127120 e 6972173. Tipicamente, a adsorção na superfície SE(R)RS-ativa metálica é assegurada pela adição de uma poliamina monomérica ou polimérica, mais particularmente uma poliamina alifática de cadeia curta, tal como espermina. Assim, de acordo com uma forma de realização, os métodos da invenção compreenderão, antes da detecção, a adição de uma poliamina à amostra a ser detectada por SE(R)RS.

Alternativa ou adicionalmente, a sonda específica de analito é modificada a fim de promover ou facilitar a quimissorção na superfície SE(R)RS-ativa. Isto pode ser assegurado pelo menos parcialmente reduzindo- se a carga negativa total da sonda específica de analito. Mais particularmente, onde a sonda específica de analito for um nucleotídeo, isto pode ser assegurado incorporando-se dentro do ácido nucleico ou unidade de ácido nucleico um ou mais grupos funcionais compreendendo uma base Lewis, tal como grupos amino, como descrito na Patente U.S. No. 6127120.

De acordo com mais uma forma de realização, um grupo funcional (tal como, p. ex., uma base de Leiws) é provido no rótulo SE(R)RS ativo, a fim de promover ou facilitar a quimissorção na superfície SE(R)RS- ativa. Opcionalmente, o rótulo ou corante SE(R)RS-ativo e partículas metálicas são aprisionados em uma conta de polímero como descrito em US .2005/0130163, que pode opcionalmente ainda conter partículas magnéticas, tornando as contas magnéticas, o que pode ser de interesse na separação (vide abaixo).

Onde um ou mais do rótulo, sonda ou sonda rotulada for/forem adsorvidos na superfície SE(R)RS-ativa, a detecção de rótulo tanto ligado como não ligado pode ser assegurada de uma maneira similar.

De acordo com uma forma de realização alternativa da invenção, o analito é adsorvido na superfície SE(R)RS-ativa metálica, p. ex., pelo uso das modificações químicas descritas acima ou por meio de um ligador específico. De acordo com esta forma de realização, o rótulo não- ligado, quando separado do rótulo ligado, não está em contato com a superfície SE(R)RS-ativa. A fim de assegurar a detecção do rótulo não ligado, ele pode ser contatado com uma superfície SE(R)RS-ativa metálica. Opcionalmente, isto pode ser assegurado contatando-se a sonda com uma superfície SE(R)RS-ativa metálica (ou um excesso de analito que tenha sido ligado a uma superfície SE(R)RS-ativa metálica).

Os métodos da presente invenção envolvem a detecção de tanto a fração de rótulo ligada ao analito (fração de rótulo ligado) como a fração de rótulo não-ligado ao analito (fração de rótulo não ligada). De acordo com uma forma de realização da invenção, a fração de rótulo ligado e não- ligado é medida usando-se o mesmo método de detecção. Assim, de acordo com esta forma de realização, tanto a fração ligada como não ligada são detectadas utilizando-se, p. ex., SE(R)RS ou fluorescência (Figuras 3a e 3b). Alternativamente, entretanto é considerado que a fração ligada e não ligada de ser medida usando-se diferentes métodos de detecção. De acordo com a última forma de realização, o rótulo ligado pode ser medido, p. ex., usando-se SE(R)RS, enquanto o rótulo ligado pode ser medido com base em outro método de detecção, p. ex., fluorescência. Deve ser entendido que isto requer o uso de um rótulo, que seja detectável em dois diferentes métodos ou o uso de um rótulo duplo. Como o espectro de SE(R)RS de um corante é específico de molécula, a maior parte dos corantes fluorescentes pode, em princípio, também ser detectada com base em seu espectro SE(R)RS. O uso de diferentes métodos de detecção para a detecção da fração ligada e não ligada do rótulo nos métodos da presente invenção é de interesse onde, p. ex., a superfície SE(R)RS-ativa for ligada ao analito (vide acima).

Como indicado acima, o método da presente invenção pode ser aplicado em qualquer método que envolve detecção de um analito pela ligação a um rótulo. Embora a ligação do rótulo ao analito seja crítica, é considerado que esta ligação não precisa necessariamente ser específica de analito. Onde o método da invenção for aplicado para a detecção quantitativa de analito puro, é na realidade suficiente que o rótulo seja capaz de ligar-se ao analito (contanto que a ligação não ocorra com quaisquer dos materiais usados no ensaio, p. ex., o recipiente da amostra). A capacidade de um rótulo ligar-se a um analito pode ser baseada na ligação inerente do rótulo ao analito, p. ex., incorporação aleatória de um corante no meio do DNA de duplo filamento.

Tipicamente, entretanto, onde a detecção de um analito de uma amostra for necessária, a ligação do rótulo ao analito deve ser uma ligação específica, utilizando-se um rótulo específico de analito. De acordo com uma forma de realização, isto é assegurado ligando-se um rótulo a uma "sonda" específica de analito. A natureza da sonda específica de analito será determinada pela natureza do analito a ser detectado. Muitíssimo comumente, a sonda é desenvolvida com base em uma interação específica com o analito, tal como mas não limitado a ligação de antígeno-anticorpo, seqüências de nucleotídeo complementares, carboidrato-lectina, seqüências de peptídeo complementares, ligando-receptor, coenzima-enzima, inibidores de enzima- enzima etc. A sonda específica de analito ligada ao rótulo resulta em um "rótulo específico de analito" que, de acordo com esta forma de realização da invenção, é um rótulo capaz de ligar-se especificamente ao analito.

De acordo com uma forma de realização particular da presente invenção, o analito de interesse é um oligonucleotídeo e a sonda específica de analito é uma sonda de oligonucleotídeo, cuja seqüência é complementar ao analito de interesse. Esta sonda de oligonucleotídeo é ligada a um rótulo, a fim de obter-se um rótulo específico de analito.

Métodos para preparar os nucleotídeos rotulados e incorporá- los dentro dos ácidos nucleicos são descritos na arte (p. ex., Patentes U.S. Nos. 4962037; 5405747; 6136543; 6210896).

Em uma forma de realização particular da invenção, um rótulo SE(R)RS é usado que é ligado diretamente à sonda de oligonucleotídeo ou via um composto ligador. Os rótulos SE(R)RS-ativos que contêm grupos reativos projetados para covalentemente reagir com outras moléculas, tais como nucleotídeos ou ácidos nucleicos, são comercialmente disponíveis (p. ex., Molecular Probes, Eugene, Oreg.). Os rótulos SE(R)RS-ativos que são covalentemente ligados aos precursores de nucleotídeo podem ser comprados de fontes comerciais padrão (p. ex., Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.; Promega Corp., Madison, Wis.; Ambion, Inc., Austin, Tex.; Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.).

Onde o analito for uma seqüência de nucleotídeo, o rótulo específico de analito pode ser uma sonda que pode ser usada na detecção específica do analito por hibridização da sonda específica de analito no analito e detecção do rótulo ligado e não ligado de acordo com a invenção. Alternativamente, os métodos da invenção podem envolver amplificação do analisando empregando-se, p. ex., PCR, por meio do que o rótulo específico de analito é incorporado dentro do produto PCR. De acordo com os métodos da presente invenção, uma quantidade predeterminada de rótulo específico de analito (ou iniciador rotulado) é usada e tanto o rótulo específico de analito incorporado como o (quantidade do) rótulo específico de analito não ligado são detectados.

A presente invenção refere-se a um método de detecção e/ou quantificação de um analito, baseado na ligação de um rótulo no analito, por meio do que a precisão e confiabilidade de detecção são melhoradas contatando-se a amostra com uma quantidade predeterminada de rótulo e detecção tanto da fração ligada como da fração não ligada do rótulo.

De acordo com uma forma de realização da invenção, a fração ligada como não-ligada do rótulo podem ser individualmente detectadas e/ou quantificadas sem separação anterior, isto é, dentro da mesma amostra, isto pode ser conseguido de acordo com uma forma de realização da invenção pelo uso de um rótulo (específico de analito) cujo sinal é modificado na ligação ao analito. Um exemplo de tal rótulo são rótulos ligados a um sinalizador molecular. Por exemplo, é feito uso de uma sonda que é complementar à seqüência alvo, duplamente rotulada com um corante e um extintor (p. ex., Dabcyl) em cada uma de suas duas extremidades. Em seu estado fechado, o sinal do corante é extinto pelo extintor. Quando a seqüência complementar hibridiza no DNA alvo, o sinalizador abre-se completamente e um sinal pode ser detectado. Um outro exemplo de rótulos capazes de especificamente ligarem-se a um analito e, desse modo, causar uma mudança de sinal é provido para SERRS no WO 2005/019812. Ali, são descritos sinalizadores SERRS que são sondas duplamente rotuladas com um diferente corante em cada uma de suas duas extremidades. O segundo corante é especificamente projetado de modo que seja capaz de imobilizar a sonda de oligonucleotídeo em uma apropriada superfície metálica. Na ausência do DNA alvo, o sinalizador é imobilizado no "estado fechado" sobre a superfície metálica, resultando na detecção de um espectro SERRS correspondendo a ambos os corantes. Quando a seqüência complementar hibridiza no DNA alvo, o sinalizador abre-se completamente e um dos corantes é removido da superfície. Isto faz com que os sinais SERRS mudem. Alternativamente, pode ser feito uso de sondas de oligonucleotídeo rotuladas por fluoróforo, por meio do que a polarização da fluorescência do rótulo aumenta na ligação ao ácido nucleico alvo (Walker e Linn (1996) Clinicai Chemistry. 42: 1604 - 1608).

Em uma outra forma de realização, é feito uso de um rótulo SE(R)RS-ativo, cuja máxima freqüência de absorção é mudada de uma primeira para uma segunda freqüência, na associação do rótulo com a superfície metálica SE(R)RS-ativa, com base nos espectros de absorção mudados das moléculas de corante adsorvidas nas superfícies das partículas metálicas (como descrito por Franzen e al. (2002) J. Phys. Chem. 106/6533-6540; Noginov e al. (2005) J. Opt. A: Pure Appl. Opt. 7:S219-S299). De acordo com esta forma de realização, o analito é associado com a superfície metálica SE(R)RS-ativa. Ao contatar o rótulo SE(R)RS-ativo com a amostra, o rótulo SE(R)RS-ativo que é especificamente ligado ao analito é desse modo associado com a superfície metálica e emite um diferente espectro do rótulo SE(R)RS-ativo, que permanece não ligado na amostra. Por exemplo, uma sonda de oligonucleotídeo rotulada SE(R)RS-ativa pode sofrer uma mudança na freqüência de absorção máxima na hibridização nos fragmentos de DNA que são associados com nanopartículas de prata e pode, portanto, ser detectada em sua forma hibridizada (ligada) bem como em sua forma não-hibridizada (não ligada) dentro da mesma amostra.

De acordo com outra forma de realização dos métodos da presente invenção, a detecção da fração ligada como não ligada do rótulo requer uma separação anterior destas frações. A separação do rótulo ligado e não-ligado pode ser conseguida por qualquer processo que remova os rótulos não-ligados e/ou o rótulo ligado por analito da amostra, para permitir sua detecção individual. Técnicas de separação exemplares incluem sedimentação, precipitação, centrifiigação, ligação específica a um substrato, eletroforese de gel, incluindo mas não limitado a focalização isoelétrica e eletroforese capilar; dieletroforese; separação, incluindo mas não limitado a técnicas de separação ativadas por fluorescência; cromatografia, incluindo mas não limitado a HPLC, FPLC, cromatografia de exclusão (filtragem gel) de tamanho, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de imunoafinidade e cromatografia de fase inversa. Um exame detalhado das técnicas de separação pode ser encontrado e, entre outros lugares, Rapley; Sambrook e al.; Sambrook and Russel; Ausbel e al.; Molecular Probes Handbook; Pierce Applications Handbook; Capillary Electrophoresis: Theory and Practice, P. Grossman e J. Colburn, eds., Academic Press (1992); Wenz e Schroth, Publicação Internacional PCT No. WO 01/92579; M. Ladisch, Bioseparations Engineering: Principies, Practice and Economics, John Wiley & Sons (2001); e Liebler, Introduction to Proteonics, Humana Press (2002).

De acordo com uma forma de realização, a separação do rótulo ligado e não ligado é conseguida por ligação do analito a um substrato. Tipicamente isto envolve uma "sonda de captura", que é ligada ao substrato e capaz de especificamente ligar-se ao antígeno. Onde o analito for uma seqüência de nucleotídeo, a sonda de captura é tipicamente um oligonucleotídeo complementar a uma região dentro do analito. Onde o rótulo for também ligado a uma sonda, é tomado cuidado para que a sonda específica de analito e a sonda de captura sejam complementares a diferentes seqüências dentro do analito. Alternativamente, o analito é provido com uma etiqueta, o que permite a separação do analito (e conseqüentemente do rótulo ligado ao analito) da amostra. Isto pode ser conseguido, p. ex., quando a seqüência de nucleotídeo alvo (analito) é amplificada usando-se um iniciador etiquetado, por meio do que a etiqueta permite ligação a um substrato. De acordo com uma forma de realização específica, uma etiqueta de biotina é introduzida dentro do analito amplificado usando-se um iniciador com uma etiqueta de biotina. No método de captura de biotina-estreptavidina, o analito biotinilado é capturado pela ligação da molécula de biotina a um substrato revestido com estreptavidina, tal como contas, ou poços revestidos com estreptavidina de uma placa de microtítulo.

Alternativamente, onde o analito for uma proteína ou peptídeo, a sonda de captura pode ser um anticorpo específico de analito ligado a um substrato. A ligação do analito (e conseqüentemente do rótulo ligado ao analito) a um substrato permite a separação física do rótulo ligado e não- ligado. Por exemplo, onde contas magnéticas forem usadas, estas podem ser removidas da amostra aplicando-se um campo magnético. Alternativamente, o analito pode ser capturado por ligação às sondas de captura imobilizadas fixadas a uma microplaca-de-título, após o que o sobrenadante compreendendo o rótulo não-ligado pode ser removido.

De acordo com ainda outra forma de realização da invenção, a detecção é baseada em SE(R)RS e a etapa de separação das frações de rótulo ligado e não-ligado faz uso da superfície e ou rótulo SE(R)RS-ativa. Mais particularmente, de acordo com esta forma de realização, a superfície e/ou rótulo SE(R)RS-ativo inerentemente funciona como ou é/são provida(s) com uma etiqueta que pode ser submetida a uma força física ou química. Por exemplo, o peso de uma nanopartícula de metal de SE(R)RS-ativa pode ser usada nas técnicas de separação pode ser usada nas técnicas de separação como descrito no US 2005/0130163. Alternativamente, a superfície SE(R)RS- ativa compreende uma etiqueta que é um material magnético (p. ex., partículas magnéticas em uma conta de SE(R)RS-ativa) e a separação da fração de rótulo ligado e não-ligado é assegurada aplicando-se um campo magnético ou introduzindo-se um objeto magnético na amostra. De acordo com uma forma de realização, a superfície SE(R)RS-ativa magnética ligada ao rótulo de SE(R)RS-ativo específico de analito é adicionada à amostra em uma quantidade predeterminada, após o que uma fração do rótulo de SE(R)RS-ativo específico de superfície/analito SE(R)RS magnético liga-se ao analito da amostra. O analito é ligado a um substrato por meio de uma sonda de captura. A fração não-ligada do rótulo de SE(R)RS-ativo pode ser removida usando-se um eletroímã e pode ser liberada (desligando-se o ímã) em um frasco separado. Em outra forma de realização da invenção, um rótulo SE(R)RS-ativo específico de analito, ligado a uma superfície SE(R)RS-ativa magnética e uma sonda biotinilada são usados como (p. ex., para diante e para trás) iniciadores para amplificação de analito de DNA mediada por PCR. O produto PCR é tanto rotulado SE(R)RS como por biotina. Um eletroímã introduzido dentro de um poço de placa de microtítulo contendo o produto PCR é ligado para coletar todas as sondas magnéticas da amostra (isto é, incorporado no produto PCR e superfície magnética não ligada, ligada ao rótulo SE(R)RS-ativo. O ímã é então removido da amostra e imerso dentro de outro poço, que é revestido por estreptavidina. Quando o ímã é desligado, o produto PCR, também contendo a etiqueta de biotina, é capturado pela estreptavidina. Os rótulos SE(R)RS-ativos magnéticos não ligados podem ser removidos ligando-se novamente o eletroímã e transferidos para outro frasco para detecção de acordo com a invenção.

De acordo com ainda outra forma de realização, dos métodos da presente invenção, a detecção da fração ligada e não ligada do rótulo é realizada dentro da mesma amostra, isto é, sem a remoção de uma ou outra das frações da amostra, porém fazendo-se uso de diferentes zonas de detecção dentro de uma amostra. Assim, de acordo com esta forma de realização, uma separação ou movimento físico da fração ligada e/ou não ligada é assegurada dentro de um vaso de reação. Tal movimento físico dentro de um vaso de reação pode ser assegurado pelo uso de sondas rotuladas específicas de analito ou uma superfície SE(R)RS-ativa provida com uma etiqueta que pode ser submetida a uma força física/química, permitindo o movimento das sondas ligadas e/ou não ligadas. Exemplos de tais forças incluem forças magnéticas, forças eletrocinéticas etc. De acordo com uma forma de realização específica, a etiqueta da sonda específica de analito é uma partícula ferromagnética que, quando submetida a uma força magnética, é capaz de mover a sonda na direção da força magnética.

A presente invenção refere-se a métodos aperfeiçoados para a detecção e/ou quantificação de um analito, mais particularmente um analito de uma amostra. Embora os métodos descritos aqui geralmente refiram-se a um 'analito', é igualmente considerado que os métodos da presente invenção podem ser aplicados onde diversos analitos estão sendo detectados ou quantificados simultaneamente, usando-se diferentes rótulos específicos de analito. Muitíssimo particularmente, pode ser feito uso de diferentes rótulos específicos de analito, que possam ser diferencialmente detectados usando-se o mesmo método de detecção, tal como mas não limitado a diferentes rótulos fluorescentes (tais como, porém não limitado a isotiocianatos de fluoresceína (FITC); carboxifluoresceínas (tais como tetrametilrodamina (TMR); carbóxi tetrametil-rodamina (TAMRA); carbóxi-X-rodamina (ROX): sulforrodamina .101 (Texas Red™)) corantes Atto (Sigma Aldrich); Fluorescent Red e Fluorescent orange; corantes de ficoeritrina, ficocianina e Crypto-Fluor™, pontos quantitativos, ou corantes SE(R)RS-ativos. Como cada um dos rótulos será específico para um diferente analito, é possível medir-se, para cada rótulo, as frações tanto ligadas como não ligadas, para obter-se a validação interna da detecção de acordo com a presente invenção.

A presente invenção permite a melhoria da precisão e a confiabilidade da detecção e/ou quantificação de um ou mais analitos em uma amostra. O termo "amostra" é usado em um amplo sentido aqui e é destinado a incluir uma larga faixa de materiais biológicos, bem como composições derivadas ou extraídas de tais materiais biológicos. A amostra pode ser qualquer preparação adequada em que o analito é para ser detectado. A amostra pode compreender, por exemplo, um tecido ou fluido corporal, tal como mas não limitado a sangue (incluindo frações de plasma e plaquetas), fluido espinhal, muco, catarro, saliva, sêmen, fezes ou urina ou qualquer fração deles. Amostras exemplares incluem sangue integral, células sangüíneas vermelhas, células sangüíneas brancas, revestimento de pele, cabelo, unhas e material cuticular, esfregões, incluindo mas não limitado a esfregões bucais, esfregões de garganta, esfregões vaginais, esfregões uretrais, esfregões cervicais, esfregões de garganta, esfregões retais, esfregões de lesão, esfregões de abscesso, esfregões nasofaríngeos e similares, fluido linfático, fluido amniótico, fluido cerebroespinhal, efusões peritoneais, efusões pleurais, fluido de cistos, fluido sinovial, humor vítreo, humor aquoso, fluido de bolsa, colírios, aspirados de olho, plasma, soro, lavagem pulmonar, aspirados de pulmão, material de biópsia de qualquer tecido do corpo. O artífice hábil observará que lisados, extratos ou material obtido de qualquer uma das amostras biológicas exemplares acima são também considerados como amostras. Células de cultura de tecido, incluindo material explantado, células primárias, linhagens de células secundárias e similares, bem como lisados, extratos, sobrenadantes ou materiais obtidos de quaisquer células, tecidos ou órgãos estão também dentro do significado do termo amostra biológica como aqui usado. Amostras compreendendo microorganismos e vírus são também consideradas no contexto da detecção de analito usando-se os métodos da invenção. Os materiais obtidos de cenários forenses estão também dentro do significado pretendido do termo amostra. As amostras podem também compreender gêneros alimentícios e bebidas, água suspeita de contaminação etc. Estas listas não pretendem ser exaustivas.

Em uma forma de realização particular da invenção, a amostra é pré-tratada para facilitar a detecção da amostra com o método de detecção. Por exemplo, tipicamente um pré-tratamento da amostra resultando em um semi-isolamento ou isolamento do analito ou assegurando a amplificação do analito é considerado. Muitos métodos e kits estão disponíveis para pré-tratar amostras de vários tipos.

A preparação ou pré-tratamento da amostra será determinado pelo método de detecção. Por exemplo, quando detecção usando-se SE(R)RS é considerada, a amostra pode ser em qualquer forma apropriada, tal como um sólido, uma solução ou suspensão ou um gás, adequadamente preparada para possibilitar registro de seu espectro SE(R)RS. A amostra de detecção pode estar em qualquer pH adequado.

De acordo com uma forma de realização particular da invenção, o analito é um ácido nucleico, tal como uma seqüência de DNA genômico ou um ácido nucleico de um microorganismo patogênico. Uma variedade de métodos estão disponíveis para isolar os ácidos nucleicos das amostras. As técnicas de isolamento do ácido nucleico exemplares incluem (1) extração orgânica seguida por precipitação de etanol, p. ex., usando-se um reagente orgânico de fenol/clorofórmio (p. ex., Ausbel e al. eds., Current Protocols em Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1995, incluindo suplementos até junho de 2003), preferivelmente usando-se um extrator de DNA automatizado, p. ex., Model 341 DNA Extractor disponível na Applied Biosystems (Foster City, Calif.); (2) métodos de adsorção de fase estacionária (p. ex., Patente U.S. No. 5.234.809; Walsh e al., BioTechniques .10(4): 506-513 (1991); e (3) métodos de precipitação de DNA induzida por sal (p. ex., Miller e al., Nucl. Acids Res., 16 (3): 9- 10 (1988)), tais métodos de precipitação sendo tipicamente referidos como métodos de cristalização. Os kits comercialmente disponíveis podem ser usados para acelerar tais métodos, por exemplo, Genomic DNA Purification Kit e o Total RNA Isolation System (ambos disponíveis na Promega, Madison, Wis.). Outrossim, tais métodos foram automatizados ou semi-automatizados usando-se, por exemplo, o ABI PRISM.TM 6700 Automated Nucleic Acid Workstation (Applied Byosystems, Foster City, Calif.) ou o ABI PRISM.TM 6100 Nucleic Acid PrepStation e protocolos associados, p. ex., NucPrep. TM. Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal e Plant Tissue, Applied Biosystems Protocolo 4333959 Rev. A (2002), Isolation of Total RNA from Cultured Cells, Applied Byosistems Protocolo 4330254 Rev. A (2002); e ABI PRISM.TM. Cell Lysis Control Kit, Applied Biosystems Protocolol 4316607 Rev. C (2001).

Os métodos de isolamento acima podem ainda compreender uma etapa de digestão de enzima, p. ex., digestão com uma enzima proteolítica e/ou uma etapa de amplificação enzimática, p. ex., por PCR e/ou uma etapa de cisalhamento/sonicação para fragmentação.

Como indicado acima, os métodos da presente invenção são de particular interesse nos métodos de detecção e/ou quantificação baseados na espectroscopia de Raman intensificada na superfície (ressonância) (SE(R)RS). Embora referência seja geralmente feita a SE(R)RS aqui, deve ser entendido que os métodos de detecção baseados em outros tipos de espectroscopias são também considerados, por exemplo mas não limitado a fluorescência intensificada na superfície, dispersão Raman normal, dispersão Raman de ressonância, espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS), dispersão Raman simulada, espectroscopia Raman inversa, espectroscopia Raman de ganho estimulado, dispersão hiper-Raman, examinador de leiser óptico molecular (MOLE) ou mic-rossonda Raman ou microscopia Raman ou microespectroscopia Raman confocal ou Raman tridimensional ou de varredura, espectroscopia de saturação Raman, Raman de ressonância resolvida no tempo, espectroscopia de desacoplamento Raman ou microscopia Raman-UV.

Em uma forma de realização particular da invenção, o método da invenção envolve SERRS, uma vez que operando na freqüência de ressonância do rótulo fornece-se sensibilidade aumentada. Neste caso, a fonte de luz usada para gerar o espectro Raman é uma fonte de luz coerente, p. ex., um leiser, sintonizada substancialmente à máxima freqüência de absorção do rótulo sendo usado. Esta freqüência pode mudar ligeiramente em associação do rótulo com a superfície e o analito SE(R)RS ativos e/ou a espécie de ligação do analito, porém a pessoa hábil será bem capaz de sintonizar a fonte de luz para acomodar isto. A fonte de luz pode ser sintonizada a uma freqüência próxima do máximo de absorção do rótulo ou a uma freqüência no ou próxima de um pico secundário do espectro de absorção do rótulo. O SERRS pode alternativamente envolver operar na freqüência ressonante dos plasmônios da superfície ativa.

Nos métodos da invenção baseados na detecção SE(R)RS, tipicamente um pico, correspondendo, p. ex., ao máximo de absorção do rótulo, é selecionado para excitação e a detecção pode ser realizada em um único comprimento de onda do espectro de "impressão digital". Alternativamente, especialmente quando diferentes analitos estão sendo detectados ao mesmo tempo usando-se diferentes rótulos SERRS, o inteiro espectro de "impressão digital" pode ser detectado a fim de identificar cada rótulo. Entretanto, também com diferentes rótulos tendo únicas linhas espectrais, a intensidade do sinal pode ser detectado em uma freqüência ou freqüências da linha espectral escolhida.

Tipicamente, a etapa de detecção de um método de detecção baseado em SE(R)RS será realizada utilizando-se luz incidente de um leiser, tendo uma freqüência no espectro visível. A freqüência exata escolhida dependerá do rótulo, superfície e analito. As freqüências da área vermelha do espectro visível tendem, no todo, a dar origem a melhores efeitos de intensificação de superfície. Entretanto, é possível considerar situações em que outras freqüências, por exemplo, nas faixas ultravioleta ou próxima do infravermelho, poderiam ser usadas. A seleção e, se necessário, a sintonização de uma fonte de luz apropriada, com uma apropriada freqüência e potência, situar-se-á bem dentro da capacidade de uma pessoa de habilidade comum na arte, particularmente com referência à literatura de SE(R)RS disponível. As fontes de excitação para uso nos métodos de detecção baseados em SE(R)RS incluem mas não são limitadas a leiseres de nitrogênio, leiseres de hélio-cádmio, leiseres de íon de argônio, leiseres de íon de criptônio etc. Múltiplos leiseres podem fornecer uma larga escolha de linhas de excitação, o que é crítico para espectroscopia Raman de Ressonância. De acordo com uma forma de realização específica, um leiser de íon de argônio é usado em um instrumento integrado LabRam (Jobin Yvon) em uma excitação de 514,5 nm.

O feixe de excitação pode ser focalizado em um substrato usando-se uma lente objetiva. A lente objetiva pode ser usada tanto para excitar a amostra como para coletar o sinal Raman, utilizando-se um divisor de feixe holográfico, para produzir uma geometria de ângulo reto para o feixe de excitação e o sinal Raman emitido. A intensidade dos sinais Raman precisa ser medida em relação a um segundo plano intenso do feixe de excitação. O segundo plano é principalmente luz dispersa Rayleigh e reflexão especular, que podem ser seletivamente removidas com filtros ópticos de alta eficiência. Por exemplo, um filtro de corte holográfico pode ser usado para reduzir a radiação dispersa Rayleigh.

O sinal de emissão Raman intensificado na superfície pode ser detectado por um detector Raman. Uma variedade de unidades de detecção de uso potencial na espectroscopia Raman é conhecida na arte e qualquer unidade de detecção Raman conhecida pode ser usada. Um exemplo de uma unidade de detecção Raman é descrito, p.ex., na Patente U.S. No. US 6002471. Outros tipos de detectores podem ser usados, tais como um dispositivo acoplado por carga (CCD), com um dispositivo acoplado por carga intensificado aumentado em vermelho (RE-ICCD), um fotodiodo de silício ou tubos fotomultiplicadores dispostos sozinhos ou em série para amplificação em cascata do sinal. Eletrônica de contagem de fótons pode ser usada para detecção sensível. A escolha do detector dependerá largamente da sensibilidade da detecção necessária para realizar um ensaio particular. Diversos dispositivos são adequados para coletar sinais SE(R)RS, incluindo espelhos seletivos de comprimentos de onda, elementos ópticos holográficos para detecção de luz dispersa e guias de onda de fibra-óptica.

O aparelho para obter-se e/ou analisar um espectro SE(R)RS pode incluir alguma forma de processador de dados, tais como um computador. Uma vez o sinal SE(R)RS tenha sido capturado por um detector apropriado, seus dados de freqüência e intensidade tipicamente serão passados para um computador para análise. O espectro Raman de impressão digital será comparado com os espectros de referência para identificação do composto ativo Raman detectado ou a intensidade do sinal nas freqüências medidas será usada para calcular a quantidade de composto ativo Raman detectado.

A presente invenção fornece métodos aperfeiçoados para detecção baseada em rótulo de um analito. Sistemas, kits, reagentes e ferramentas estão dentro do escopo da presente invenção, que são adaptados à aplicação dos métodos da presente invenção, tais como substratos especificamente adaptados (compreendendo áreas com e sem a sonda de captura) etc.

A Fig. 4A é uma representação esquemática do sistema de acordo com uma forma de realização da presente invenção. O sistema (100) para detectar e opcionalmente quantificar a presença de um analito em uma amostra compreende a fonte 106 para uma amostra suspeita de conter um analito e a fonte 108 contendo rótulo capaz de ligar-se ao analito e meio 110 para prover analito e uma quantidade predeterminada de rótulo para o meio 102 para contatar a amostra compreendendo o analito com uma quantidade predeterminada de rótulo capaz de ligar-se ao analito. O meio 110 pode incluir alimentações gravimétricas da amostra e/ou analito e pode também incluir um arranjo de tubos/condutos e válvulas, p. ex., válvulas selecionáveis e controláveis, para permitir a provisão dos fluidos das fontes 106, 108 para o meio de contato 102. Alternativamente, os fluidos podem ser bombeados das fontes 106, 108 para o dispositivo de contato 102.

O dispositivo de contato 102 pode incluir meio para separar os rótulos ligados dos rótulos não ligados de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima.

Os circuitos de controle e análise 112 podem ser providos para controlar a operação do meio 110. Além disso, o meio 104 para detectar a fração do rótulo ligado ao analito e à fração do rótulo não ligado ao analito é também provido. O meio 104 pode estar sob o controle dos circuitos de análise 112. Os sinais representativos das detecções podem ser supridos aos circuitos de controle e análise 112, que pode ser adaptado para realizar algoritmos para verificar se as detecções de rótulos não ligados e ligados são consistentes entre si e para exibir os resultados em qualquer meio de exibição adequado 114, tal como uma unidade de display visual, plotador, impressora. Os circuitos de controle e análise 112 pode ter uma conexão com uma área local ou rede de área larga para transmissão dos resultados para um local remoto. Os circuitos de controle e análise 112 podem ser implementados de qualquer maneira adequada, p. ex., hardware dedicado ou um computador adequadamente programado, microcontrolador ou processador embutido, tal como um microprocessador, sistema de porta programável, tal como uma PAL, PLA ou FPGA, ou similar.

A Figura 4B mostra uma forma de realização alternativa de um sistema de acordo com a presente invenção. Os itens com os mesmos números de referência que na Figura 4A têm a mesma função. A diferença principal entre a Figura 4A e Figura 4B é que o meio de detecção 104 é provido como dois diferentes meios de detecção 104A e 104B para detecção dos rótulos não ligados e ligados, respectivamente. Qualquer um dos métodos de detecção descritos acima pode ser implementado pelo meio de detecção 104A e/ou B.

EXEMPLOS Exemplo 1. Incorporação de uma referência interna na detecção do HIV

No presente exemplo, a detecção do HIY é realizada com base na presença do gene gag (analito) em uma amostra (como descrito por Isola e al.. 1998, Anal. Chem. 70: 1352- 1356).

Quando um rótulo cresyl fast violet (CFV) é usado, que é incorporado dentro do analito durante uma amplificação PCR empregando um iniciador de oligonucleotídeo específico de gag, que foi rotulado com CFV (como descrito em Isola e al., acima).

De acordo com a presente invenção, uma quantidade predeterminada de oligonucleotídeo específico de gag rotulado CFV é usada na reação PCR.

Uma sonda de captura é projetada, que é uma seqüência de nucleotídeo específica para uma seqüência do gene gag dentro da seqüência do produto PCR amplificado, porém diferente das seqüências dos iniciadores PCR, que é provido com um ligador (p. ex., um ligador 5'-amino de seis carbonos), capaz de ligar-se a um suporte sólido, tal como uma placa de poliestireno derivatizada. A sonda de captura é então localizada no suporte.

Após bloquear os sítios não reagidos da placa derivatizada, o produto PCR de filamento duplo dentro da mistura de reação PCR é desnaturado por ebulição em água por 5 minutos e rapidamente esfriando-se sobre gelo para evitar reassociação do DNA. A mistura é adicionada à placa com a sonda de captura e permitida hibridizar na presença de uma solução de hibridização. Após hibridização, o tampão sobre a placa é cuidadosamente removido e transferido para outra placa. A placa de hibridização é enxaguada com 100 μΐ de tampão e o líquido de enxágüe é também coletado.

A superfície SERS ativa é adicionada após a hibridização adicionando-se uma camada de 100 Â de prata por evaporação tanto à placa hibridizada como à placa contendo a solução de hibridização em excesso e líquido de enxágüe. Os espectros de SERS são retirados das duas amostras. O espectro da placa hibridizada fornece uma indicação direta da quantidade de DNA de gag na amostra. O espectro da solução de hibridização em excesso, compreendendo a fração de oligonucleotídeo específico de gag rotulado CFV não ligado, quando deduzido da quantidade predeterminada de oligonucleotídeo específico de gag rotulado CFV adicionada à amostra, provê um controle interno para a quantidade de DNA de gag na amostra.

Exemplo 2. Incorporação de uma referência interna na detecção de Chlamydia

No presente exemplo, a detecção da bactéria patogênica Clhamydia trachomatis é realizada com base na presença da seqüência genética ompl (analito) em uma amostra.

O gene ompl de uma amostra é amplificado por PCR usando- se um iniciador para diante etiquetado no término-5' com biotina e um iniciador inverso em um primeiro poço.

Um oligonucleotídeo de DNA específico de ompl de base-17 é etiquetado no término-5' com um corante de fluoresceína substituído, .2,5,1 ',3',7',9'-hexacloro-5-carboxifluoresceína, disponível comercialmente como "HEX". O resultante oligonucleotídeo específico de ompl rotulado HEX ("sonda HEX") tem uma seqüência dentro da seqüência do produto PCR ompl amplificado, porém diferente das seqüências dos iniciadores PCR ("aninhados") e é complementar ao filamento em que o iniciador biotinilado é incorporado.

Uma quantidade predeterminada de sonda HEX é usada para hibridização no produto PCR biotinilado amplificado ompl do primeiro poço.

O complexo biotinilado-hibridizado é capturado usando-se contas magnéticas revestidas de estreptavidina. Um eletroímã é ligado para coletar todas as contas magnéticas. O eletroímã é então removido da solução e imerso dentro de um segundo poço. Desta maneira, todas as sondas HEX não ligadas permanecem no primeiro poço e todas as sondas HEX ligadas-ompl são transferidas para o segundo poço. As últimas são liberadas do complexo biotinilado-hibridizado por calor antes da detecção. Os iniciadores biotinilados em excesso da reação PCR também ligadas às contas revestidas com estreptavidina não são rotuladas HEX e, assim, não têm um sinal SERRS especificamente detectável.

A detecção das sondas HEX não ligadas do primeiro poço e das sondas HEX liberadas por calor do segundo poço é realizada como segue. Colóides de prata reduzidos por citrato são preparados de acordo com o procedimento descrito em US 6.127.120. Uma solução deste colóide é preparada em água destilada. Uma solução aquosa de cloridreto de espermina é adicionada a ambos os poços, seguido por uma alíquota da solução colóide de prata. A espermina assegurará a formação de colóides agregados, desse modo contribuindo com a intensificação de SERRS e também auxiliará na adsorção da sonda HEX sobre os colóides de prata. Ambas as suspensões coloidais são submetidas a exame SERRS.

O espectro do segundo poço contendo a fração de sondas ligadas, isto é, as sondas HEX especificamente ligadas a ompl antes da liberação do calor, fornece uma indicação direta da quantidade de DNA ompl da amostra. O espectro do primeiro poço contendo a fração de sondas não ligadas, quando deduzido da quantidade predeterminada de sonda HEX adicionada à amostra, fornece um controle interno para a quantidade de DNA ompl na amostra.

Exemplo 3. Incorporação de uma referência interna na detecção de uma mutação genética pré-disponível

O DNA extraído de uma amostra de paciente é amplificada usando-se oligonucleotídeos específicos de alelo. Dois iniciadores para diante são usados juntamente com um iniciador inverso. Os iniciadores para diante são imobilizados via um ligador de término-5' nas contas SERRS-ativas, compreendendo um rótulo SERRS-ativo e uma superfície SERRS-ativa como descrito em US 2005/0130163. Uma quantidade predeterminada de iniciador para diante é usada. O iniciador inverso é imobilizado via o término-5' com biotina. O produto PCR incorpora tanto a conta SERRS-ativa como a etiqueta de biotina.

A mistura da reação PCR é localizada em uma placa de microtítulo revestida de estreptavidina. Tanto o produto PCR biotinilado como os iniciadores biotinilados são capturados na placa. O fluido em excesso é removido da placa e transferido para uma placa não-revestida. Este contém o iniciador para diante em excesso ligado às contas SERRS-ativas.

Os espectros SERRS são retirados nas contas SERRS-ativas imobilizadas e nas contas SERRS-ativas não ligadas.

A capacidade dos SERRS de identificar diferentes rótulos sem separação torna possível utilizarem-se diferentes iniciadores com diferentes rótulos e identificar a presença do produto PCR (e iniciador para diante não ligado) para cada um dos iniciadores de uma amostra.

Exemplo 4. Incorporação de uma referência interna na detecção do DNA eubacteriano

As bactérias são freqüência encontradas como contaminantes nas culturas de célula. Estudos identificaram uma incidência total de 6,5% de contaminação bacteriana estática em culturas de célula examinadas. Assim, muitas culturas de célula não têm sinais visuais de contaminação bacteriana, geralmente indicada pela descoloração do fluido. Além disso, foi demonstrado que antibióticos padrão não somente são ineficazes contra infecção bacteriana resistentes, mas também têm um forte impacto no metabolismo, crescimento e diferenciação celulares.

Empregando-se uma sonda específica para a região de codificação do RNA ribossomal 16S do genoma de eubacteriae, é possível detectarem-se as espécies de eubacteria usualmente encontradas como contaminantes contidos no ar em culturas de célula. A sensibilidade da detecção SERRS torna possível detectar concentrações muito baixas de DNA e, assim, preceder a etapa de amplificação.

Uma amostra de sobrenadante de célula é contatada com uma quantidade predeterminada da sonda específica de RNA 16S, ligada a um rótulo SERRS Cy3, e permitida hibridizar.

A mistura de hibridização é localizada em uma placa a que uma diferente sonda específica de RNA 16S foi ligada. Após permitir a hibridização do DNA alvo a que o rótulo Cy3 é ligado à sonda de captura, o fluido é removido e transferido para uma segunda placa. A placa é enxaguada e o fluido de enxágüe é também transferido para a segunda placa.

A superfície SE(R)RS-ativa é adicionada à primeira placa após a hibridização pela adição de uma camada de 100 Á de prata por evaporação. A presença de sonda específica de RNA 16S não ligada na segunda placa é determinada por fluorescência.

Exemplo 5. Incorporação de uma referência interna na detecção de hGH em um ELISA sanduíche

Eletrodos de prata são incubados a 37 0C e são então incubados em uma solução de Hormônio de Crescimento anti-humano (hGH) em 1% de NaHCO, como descrito na Patente U.S. No. 5266498. Os eletrodos são então saturados com uma solução de B SA.

Uma faixa de diluição de uma amostra compreendendo hGH e de um padrão de hGH são produzidas em tampão e as películas de prata são incubadas com bateladas de diferentes concentrações de amostra e padrão. Após serem lavadas, as películas são contatadas com uma quantidade predeterminada de anti-hGH rotulado diaminobenzidina (DAB) (p. ex., 40 μg/ml) e incubadas. O fluido de reação é removido e transferido para um frasco de detecção. As películas são ainda enxaguadas.

Espectros de SERRS são obtidos dos eletrodos. Concentração do anti-hGH rotulado DAB não ligado no fluido de reação são determinados enzimaticamente, com base na comparação com um padrão.

Os valores obtidos pela detecção direta do anti-hGH rotulado DAB nas películas de prata e pela detecção do anti-hGH rotulado-DAB não ligado são comparados para determinar a confiabilidade da detecção.

Claims (12)

1. Método para detectar e/ou quantificar um analito em uma amostra usando SE(R)RS, dito método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) contatar dita amostra compreendendo dito analito com uma quantidade predeterminada de rótulo SE(R)RS-ativo capaz de ligar-se a dito analito; b) detectar a fração de rótulo SE(R)RS-ativo ligado a dito analito; por meio do que a quantidade de rótulo SE(R)RS-ativo ligado a dito analito é indicativa da presença e/ou quantidade de dito analito em dita amostra; e c) detectar a fração do rótulo SE(R)RS-ativo não ligado a dito analito; por meio do que a quantidade de rótulo SE(R)RS-ativo não ligado em dito analito, deduzida de dita quantidade predeterminada de rótulo SE(R)RS- ativo, fornece um controle interno indicativo da presença e/ou quantidade de dito analito em dita amostra.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dita etapa de detecção (b) e dita etapa de detecção (c) ser realizada dentro da mesma amostra.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda, antes da etapa (b) e (c), contatar dita fração de rótulo ligado a dito analito e de dita fração de rótulo não ligada a dito analito com uma superfície SE(R)RS-ativa.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dito rótulo ser um rótulo específico de analito.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dito rótulo específico de analito compreender uma sonda específica de analito.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de dito analito ser uma seqüência de nucleotídeo e dita sonda específica de analito ser um oligonucleotídeo tendo uma seqüência complementar a uma seqüência dentro de dito analito.

7. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser feito uso de um rótulo que permite detecção diferencial de dito rótulo ligado a dito analito e dito rótulo que não é ligado a dito analito.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a freqüência de absorção máxima de dito rótulo SE(R)RS ativo é mudada de uma primeira para uma segunda freqüência, em associação de dito rótulo SE(R)RS-ativo com dita superfície SE(R)RS-ativa.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda, antes da etapa (b) de separar a fração de rótulo ligada a dito analito da fração de rótulo não ligada a dito analito.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de dita separação de dita fração de rótulo ligado e dita fração de rótulo não ligado ser assegurada fazendo-se uso de uma sonda específica de analito, que é provida com uma etiqueta que pode ser submetida a uma força física ou química.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que antes da etapa (b) e (c) dita fração de rótulo ligado a dito analito e dita fração de rótulo não ligado a dito analito são contatadas com uma superfície SE(R)RS-ativa e em que dita separação é assegurada utilizando-se uma superfície SE(R)RS-ativa, que funciona como ou é provida com uma etiqueta, que pode ser submetida a força física ou química.

12. Sistema para detectar e/ou quantificar a presença de uma analito em uma amostra usando SE(R)S, dito sistema caracterizado pelo fato de compreender: a) meio para contatar dita amostra potencialmente compreendendo dito analito com uma quantidade predeterminada de rótulo SE(R)RS-ativo capaz de ligar-se a dito analito; b) meio para detectar a fração de rótulo SE(R)RS-ativo ligado a dito analito; por meio do que a quantidade de rótulo SE(R)RS-ativo ligado a dito analito é indicativa da presença e opcionalmente da quantidade de analito em dita amostra; e c) meio para detectar a fração de rótulo SE(R)RS-ativo não ligado a dito analito; por meio do que a quantidade de rótulo SE(R)RS-ativo não ligado a dito analito, deduzida de dita quantidade predeterminada de rótulo SE(R)RS-ativo, provê um indicativo de controle interno da presença e, opcionalmente, da quantidade de analito em dita amostra.