BRPI0712964A2 - processo para a erradicação de elementos patogênicos compreendendo gerar iodo molecular no local - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA ERRADICAçAO DE ELEMENTOS PATOGêNICOS COMPREENDENDO A GERAçAO DE IODO MOLECULAR NO LOCAL. é revelado um processo de matar ou substancialmente erradicar um elemento patogênico no trato respiratório superior de um mamífero. O processo compreende gerar iodo molecular (I~ 2~) no local utilizando uma reação de oxidante-redutora com uma concentração mínima de pelo menos aproximadamente 25 ppm de I~ 2~ e I~ 2~ compreende pelo menos 40% dos átomos de iodo totais. Também é revelado um processo para inibir superantigenos utilizando iodo molecular.

Description

PROCESSO PARA A ERRADICAÇÃO DE ELEMENTOS PATOGÊNICOS COMPREENDENDO A GERAÇÃO DE IODO MOLECULAR NO LOCAL

CAMPO

A aplicação de iodo molecular para a erradicação de elementos patogênicos incluindo S. aureus e micróbios resistentes a antibiótico a partir do trato respiratório superior de mamíferos e para inibir a ativação de células imunes. Iodo molecular também é empregado na inibição de superantígenos no tratamento de dermatite atópica, eczema, psoriase, impetigo ou sinusite.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Transporte nasal de Staphylococcus aureus é um fator de risco bem definido para infecção subsequente em quase todas as categorias de pacientes hospitalizados que foram estudadas. 0 transporte de S. aureus foi estudado extensamente em pacientes cirúrgicos (cirurgia geral, ortopédica e torácica), em pacientes em hemodiálise, em pacientes em diálise peritoneal ambulatorial continua (CAPD), pacientes infectados por HIV e em pacientes em unidades de tratamento intensivo.

A morbidez e mortalidade e impacto econômico de infecções de sítio cirúrgico (SSIs) são enormes. Imagina-se que SSIs, as infecções nosocomiais mais comuns entre pacientes cirúrgicos, causam complicação em aproximadamente 500.000 das 27 milhões de operações estimadas realizadas anualmente nos Estados Unidos. S. aureus é o patógeno mais freqüentemente identificado em SSIs. As despesas hospitalares anuais estimadas associadas a essas infecções são mais de $1.6 bilhão. SSIs prolongam a permanência em hospital em mais de 5 dias por episódio. Mais importante, os pacientes com SSI têm propensão duas vezes mais de morrer no período pós-operatório. A patogenicidade de S. aureus é normalmente associada à capacidade de uma cepa especifica produzir enzimas de coagulase, porém esses organismos contêm antigenos e produzem toxinas com propriedades superantigênicas e foram envolvidas em pelo menos dois estados de doença. Enterotoxinas de S. aureus ativam células-T por ligarem à cadeia beta variável do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II do receptor de célula-T fora do entalhe especifico de antigeno. Estudos clínicos demonstram que superantigenos bacterianos induzem síntese de Ig-E que podem ter um grande impacto sobre doença de via aérea superior e inferior como polipose nasal e asma.

A eliminação de transporte nasal de S. aureus parece ser a estratégia mais direta para evitar os efeitos negativos reais e em potencial de S. aureus na cavidade nasal bem como outras áreas do trato respiratório superior que, para fins da presente invenção, é definido como incluindo o nariz, seios paranasais, faringe, traquéia, brônquios e boca. A introdução de ungüento de mupirocina no final da década de 80 se destinava a atender essa necessidade. 0 unguento nasal de mupirocina é um tratamento eficaz para eliminar S. aureus. 0 tratamento de portadores com mupirocina na cavidade nasal resulta em uma redução significativa da taxa de infecção nosocomial de S. aureus para pacientes de hemodiálise e CAPD. Um exame de estudos de mupirocina concluiu que o tratamento de portadores de S. aureus com mupirocina na cavidade nasal reduz significativamente (50%) da taxa de infecção nosocomial por S. aureus. Muitos experimentos com mupirocina randomizados e não randomizados indicam que o tratamento nasal com mupirocina de pacientes antes da cirurgia reduz a infecção pós-operatória de Staphylococcus aureus. As cepas resistentes a mupirocina foram descritas logo após sua introdução. Além disso, o uso aumentado de mupirocina, especialmente para infecções crônicas, levou a uma incidência aumentada de resistência. Em uma pesquisa recente na Espanha, níveis de resistência à mupirocina em isolados clínicos foram reportados como tendo aumentado de 7,7% em 1998 para 17% em 2000, e alguns hospitais reportaram incidências tão elevadas quanto 63%. A difusão contínua de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) e o aumento em cepas resistentes à mupirocina evita o uso profiláti co desse produto e destaca a necessidade de agentes alternativos. Antes que mupirocina possa ser administrada a um paciente com suspeita de ser um portador de S. aureus ele deve ser testado em relação à presença de S. aureus em suas narinas nasais. Isso requer que um profissional médico tire material da cavidade nasal para a avaliação subsequente em relação à presença de S. aureus por um laboratório de microbiologia; um processo que demora pelo menos 24 horas e freqüentemente 48 horas.

A maioria dos pesquisadores que estudam mupirocina para eliminação do transporte de S. aureus em pacientes hospitalizados comentou que o uso profilático ou aplicação pré-cirúrgica generalizada levará ao aumento das taxas de S. aureus resistente à mupirocina. Em alguns casos os pesquisadores procuraram tratamentos alternativos para erradicar S. aureus das narinas nasais. Um agente antimicrobiano bem conhecido, polivinil pirrolidona-iodo (PVP-I), foi investigado por vários grupos para erradicar S. aureus e MRSA na cavidade nasal.

Nesses estudos PVP-I foi diluído para reduzir toxicidade potencial e os resultados foram promissores. Esses pesquisadores destacam que PVP-iodo provê propriedades úteis para tratamento antiinfeccioso local em geral e para descontaminação superficial em particular. O espectro de ação microbiana é amplo mesmo após tempos de exposição curtos e não ocorre nenhuma resistência microbiana conhecida a iodo. Ao contrário de antibióticos PVP-I não somente destrói bactérias, como também inibe eficazmente a liberação de fatores patogênicos, como exotoxinas, endotoxinas e enzimas que destroem tecido.

A reivindicação de rótulo nos germicidas à base de iodo se baseia em "iodo total" que é medido por titulação de tiossulfato. Infelizmente, três espécies de iodo são tituladas por tiossulfato:triiodeto, HOI (ácido hipoiodoso) e I2. A maioria esmagadora do iodo titulado nesses germicidas existe como triiodeto. As concentrações elevadas de iodo, agentes de tamponamento (pH < 4) e povidona nesses germicidas são incluídas para melhorar a estabilidade da molécula de I2.

Os formuladores dessas composições não consideraram o uso na cavidade nasal. As aplicações da técnica anterior utilizando iodo na cavidade nasal não fazem tentativa para otimizar a eficácia à propriedades de toxicidade desses agentes visto que são destinados a uso na pele. Quando esses agentes são aplicados na pele a única espécie de iodo que é de preocupação com relação à toxicidade sistêmica é a espécie I2 uma vez que é a única espécie de iodo que pode penetrar na pele. Quando PVP-I é aplicado à pele de mamíferos uma quantidade menor do que 0,01% do iodo contido nessas composições é absorvido sistemicamente. Consequentemente, a quantidade de iodo que é absorvida sistemicamente é tão baixa que não é possível detectar o aumento em iodo sistêmico (caso haja) acima do nível antecedente. Consequentemente, a razão de I2 para outra espécie de iodo em formulações complexas de iodo aplicadas à epiderme não é uma consideração de segurança significativa. Entretanto, quando composições baseadas em iodo são aplicadas a membranas de mucosa o risco para a tireóide é distinto. Por exemplo, quando PVP-I é administrado à cavidade nasal, 100% do iodo administrado é absorvido sistemicamente.

Kramer em Dermatology, vol. 204 (suplemento) 1; 86-91, 2002, examinou o potencial de irritação de iodoforos na cavidade nasal e tecido de cartilagem. O teste em membrana corioalantóica de ovo de galinha (HET-CAM) e o teste de explante foram utilizados para avaliar a tolerabilidade de PVP-I. Como mostrado na tabela A abaixo 10% de PVI-I inibe crescimento.

Tabela A. Taxas de crescimento em teste de explante com tecido peritoneal preparado

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Masano em Postgrad Med J. 1993, 69 Suppl 3, S122- 5 tratou pacientes e profissionais de saúde com creme de PVP-I. A aplicação diária de 10% de PVP-I por 2 meses não induziu bócio, porém os níveis de THS em quatro de sete membros da família foram elevados. Esses resultados indicam que iodo, como quase todos os outros ingredientes químicos e biológicos em formulações nasais, é absorvido na cavidade nasal. Kramer e Gluck em Krankenhaus- und Praxishygiene (Hospital and Practice Hygiene); Kramer, A., Heeg, P. e outros, Eds.; Munchem, Fischer BEI Elsevier: 2001; pág. 252-268 reconheceram preocupações de segurança relacionadas ao uso de agentes com níveis elevados de iodo e PVP-I diluído a uma concentração de 1,25% antes da aplicação na cavidade nasal. Um total de 88 voluntários (77 homens e 11 mulheres) foram tratados duas vezes por dia por três dias e os efeitos colaterais principais reportados foram secura, coceira e espirro. Nenhuma disfunção de tireóide foi observada. A técnica anterior não descreve uma abordagem que forneça uma composição com um índice terapêutico elevado (razão entre eficácia e efeitos colaterais).

A patente US número 6.171.611 descreve uma solução salina de hidratação nasal (0,65%) feita de água, iodo ou um sal de iodo que é tamponado em pH fisiológico, a saber pH 7,4 porém não identifica os parâmetros de formulação básica que permitiriam que uma pessoa elaborasse uma composição biocida da matéria. 0 iodo descrito em 6.171.611 é "iodo" ou um "sal de iodo" selecionado do grupo que consiste em iodato de amônio, iodeto de amônio, iodato de cálcio, iodeto de cálcio, monocloreto de iodo, tricloreto de iodo, iodato de magnésio, iodeto de magnésio, iodato de potássio, iodeto de potássio, iodato de sódio, iodeto de sódio, iodato de zinco e iodeto de zinco. É bem sabido por uma pessoa versada na técnica que esses sais de iodeto não são biocidas; na realidade, em um pH de 7,4 os sais de iodeto nesse grupo não são biocidas individualmente ou quando combinados. Além disso, um pH de 7,4 não é compatível com a espécie de I2 uma vez que I2 não é estável em um pH de 7,4 e em um pH de 7,4 a espécie de I2 hidrolisa muito rapidamente para formar outras espécies de iodo incluindo iodeto, HOI, iodato e triiodeto. A patente US número 5.962.029 descreve a hidrólise de I2 em um pH de 7 e acima. Em um pH de 7,0 aproximadamente 21% do I2 é hidrolisado em uma hora; em um pH de 8,0 a perda aumenta para 78% em uma hora. Essa não é uma observação nova uma vez que a taxa de hidrólise de I2 foi primeiramente publicada há mais de 50 anos atrás por Wyss em Arch Biochem 1945, 6, 261-268. Konig e outros em Dermatology 1997, 195 Supl. 2, 42-48 estudaram o efeito de PVP-I sobre células de leucócito polimorfonuclear (PMN). Células PMN desempenham um papel na resposta imune por subjugar um patógeno estranho e processar o mesmo antes de apresentar o antigeno processado ao sistema imune. Células PMN subjugam um patógeno utilizando um processo conhecido como figocitose. Após fagocitose, o patógeno é movido para um fagolisozoma onde enzimas degradativas lisam ativamente o patógeno. Quando elementos patogênicos são lisados liberam proteínas como TNF-α que podem estimular uma resposta imune. Respostas imunes como essas são bem conhecidas em várias condições médicas incluindo dermatite atópica, eczema, psoríase, impetigo e sinusite. Konig e outros combinaram uma cepa de S. aureus de estado enterotoxina desconhecido com várias concentrações de PVP-I, adicionaram células PMN e incubaram então a mistura por 6 horas. Os dados indicam que células PMN liberaram quantidades crescentes de TNF-α à medida que PVP-I é diluído demonstrando a inativação de PVP-I da citocina TNF-α após sua liberação a partir de células de PMN. A reação de PVP-I observada por Konig foi uma resposta específica de PMN (reconhecimento-fagocitose- processamento).

Hill e Casewell J.Hosp. Infect 2000, 45, 198-205 demonstraram que as secreções nasais de 11 amostras diferentes reduziram a atividade biocida de PVP-I. Calcularam que 1,0 mililitro de secreções nasais inativaram o equivalente de aproximadamente 22,5 mg de PVP-I. Esse não é um resultado surpreendente uma vez que é sabido que o nariz tem um aparelho mucociliar bem definido. 0 muco de via aérea consiste em duas camadas, uma camada periciliar de baixa viscoelasticidade que envolve os cílios, e uma camada mais viscosa que se desloca no topo da camada periciliar. As glicoproteinas primárias que compreendem muco nasal são mucinas. Mucinas contêm uma concentração muito elevada de cisteina que pode reagir com I2 e desse modo neutralizar sua atividade. Consequentemente, é necessário assegurar uma concentração mínima de I2 que possa superar qualquer mucina residual que reside na cavidade nasal.

Dada a presença de uma biocarga na cavidade nasal, um dos parâmetros de formulação chave é a concentração mínima de iodo biocida (isto é, I2) necessária para eficácia. Em teoria, a concentração de I2 é uma função da quantidade de material que é contatada com o interior da cavidade nasal. Na prática, é somente exeqüível utilizar aproximadamente 0,25 grama de material por narina se a formulação for fornecida na forma de um gel, creme ou unguento e não mais de duas vezes aquela quantidade (isto é, 0,5 grama por narina) se a formulação for fornecida como um líquido na forma de gotas nasais ou um spray. A patente US número 6.171.611 reivindica uma faixa de concentração mais baixa de 0,001% de iodo em peso que é equivalente a 10 ppm de I2 (considerando que todas as espécies de iodo estavam presentes na forma biocida). Verificou-se, de acordo com a presente invenção que uma concentração de 10 ppm de I2 não é adequada para eliminar S. aureus quando a formulação é fornecida como um gel. Mesmo quando a composição é pulverizada na cavidade nasal, desse modo permitindo que um número maior de moléculas de I2 entre em contato com as membranas da cavidade nasal, uma composição de 10 ppm não é adequada para superar a biocarga associada à mucina endógena. DEFINIÇÕES

O termo "iodo molecular", como utilizado aqui, refere-se à espécie de I2 que é freqüentemente mencionada como iodo diatômico ou iodo elementar na literatura. 0 termo iodo molecular se refere a I2 que pode reagir com elementos patogênicos em que o I2 não é complexado com outras moléculas.

0 termo "ânion iodeto", como utilizado aqui, refere-se à espécie que é representada pelo símbolo químico I". Contra-íons apropriados para o ânion iodeto incluem sódio, potássio, cálcio e similares.

0 termo "triiodeto", como utilizado aqui, refere- se à espécie que é representada pelo símbolo químico I"3. É reconhecido por uma pessoa versada na técnica que triiodeto pode dissociar em um ânion iodeto e uma molécula de iodo molecular livre.

0 termo "iodo total", como utilizado aqui, refere-se ao iodo contido em todas as seguintes espécies de iodo: iodo molecular livre, iodeto, formas organicamente complexadas de iodo, triiodeto, iodato, iodita, ácido hipoiodoso (HOI), etc.

0 termo "índice terapêutico" tem sido tradicionalmente definido como a razão entre o efeito desejado e o efeito indesejado. Deve ser observado que uma única droga pode ter muitos índices terapêuticos, um para cada de seus efeitos indesejáveis em relação a uma ação de droga desejada. I2 é a única forma biologicamente ativa de iodo nas composições previstas; toxicidade é associada a todas as formas de iodo. Portanto, o termo "índice terapêutico" como utilizado aqui, se refere à concentração mais baixa de iodo total que obtém o efeito clínico desejado. O termo "odor desagradável" de I2 se refere à pressão de vapor de I2 gerada a 20°C a partir de 0,15 mL de uma composição que, em 67 segundos, tornará uma tira de 2,54 cm de papel de iodeto de potássio e amido umedecida (Whatman International, Ltd., cat. No. 2602-500A) azul quando o papel de amido é verticalmente alinhado com e aderido ao topo dentro de um tubo de plástico graduado independente de 50 mL, vedado (Corning no. de cat. 4308 97).

O termo "taxa de geração de iodo", como utilizado aqui, refere-se à taxa na qual iodo molecular é formado. As composições no presente pedido necessitarão todas ser ativadas por mistura e então aplicadas à superfície de interesse. A aplicação das composições nesse pedido deve ocorrer de 20 segundos a 60 minutos após mistura; portanto, a taxa de geração de I2 é uma consideração significativa.

O termo "razão de iodo molecular", como utilizado aqui, refere-se à razão entre iodo molecular (I2) e todas as outras espécies de iodo incluindo iodo complexado.

O termo "superantígeno" se refere a uma classe de estimulantes imunes que são exclusivos porque não exigem processamento celular e apresentação para extrair uma resposta. A enterotoxina B de S. aureus é uma enterotoxina potente. Superantigenos ativam indiscriminadamente células- T do sistema imune causando respostas inflamatórias localizadas bem como em todo o sistema incluindo síntese e liberação de citotoxinas. Superantígenos são secretados como exotoxinas por bactérias. Superantígenos se ligam externamente ao domínio νβ dos receptores de célula-T (TCR) e à cadeia complementar de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade do tipo II (MHC II) causando ativação de célula-T independente de antígeno.

O termo "iodação" se refere à adição química de um átomo de iodo a uma molécula orgânica. Iodo é conhecido por iodar o grupo amino, grupos de sulfidral, átomos de carbono aromáticos contendo grupos de hidroxila e ligações insaturadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, a concentração mínima necessária para fornecer uma atividade biocida eficaz no trato respiratório superior é 25 ppm de I2. Esse valor mínimo se baseia nas medições microbiológicas quantitativas com materiais para exame, tirados da cavidade nasal. Por conseguinte, quando iodeto e iodato são utilizados como a espécie oxidante e redutora uma concentração mínima de 20 ppm de iodeto e 6, 9 ppm de iodato é necessária respectivamente quando a razão de I2 gerada é pelo menos 40%.

Uma consideração principal ao formular I2 para uso na cavidade nasal é a pressão de vapor da molécula de I2. Vapor de iodo é considerado como sendo mais irritante em uma base molar do que vapor de cloro ou bromo. Vapor de iodo causa irritação no nariz e garganta, tosse, respiração ofegante, laringite. O Canadian Center for Occupational Health and Safety indica que exposição repetida a vapor de iodo ou exposição a concentrações elevadas de vapor de iodo pode causar espasmo da via aérea, aperto no peito, dificuldade de respiração, inflamação severa e acúmulo de fluido na laringe, vias aéreas superiores e pulmões. Os seres humanos podem trabalhar sem incômodo a 0,1 ppm de I2 atmosférico; com dificuldade a 0,15 - 0,2 ppm e são incapazes de trabalhar em concentrações de 0,3 ppm. Entretanto, o limite de odor para I2 foi reportado em 0,9 ppm de modo que a irritação pode ocorrer antes da detecção do odor. Evidentemente, se um odor for detectado então o nível de I2 não é ótimo. Dada as preocupações de segurança bem estabelecidas para I2 na fase de vapor é necessário manter um nível que não causará dano.

Em 25°C e 1,0 atmosfera de pressão a constante de equilíbrio para sublimação de I2 é 4 x 10-4. Esse equilíbrio é responsável pela pressão de vapor de I2 de 0,3 mm a 25°C e 1,0 mm a 38,7°C. Utilizando pressão atmosférica padrão, uma concentração máxima de I2 atmosférico de aproximadamente 1300 ppm poderia aumentar a temperatura do corpo. Portanto, a administração de I2 na cavidade nasal pode levar a um odor desagradável. Se um odor forte for detectado com uma formulação específica então a mucosa nasal está sendo exposta a uma concentração de I2 que foi estabelecida como insegura. O limite superior de I2 em água é 330 ppm de modo que é teoricamente possível obter uma concentração de 300 ppm de I2 em uma formulação totalmente aquosa que estaria compreendida no escopo desse pedido. Verificou-se que uma solução de 300 ppm de I2 emite um odor que é facilmente detectável por seres humanos e não é ótimo para administração repetida na cavidade nasal.

A caracterização de um odor do I2 está relacionada diretamente à pressão de vapor de I2 em uma formulação específica. Alguns agentes apropriados para incorporação nas formulações consideradas nesse pedido, por exemplo, ciclodextrinas, têm a capacidade de reduzir a pressão de vapor de I2 mesmo enquanto a espécie de I2 permanece ativa quimicamente, isto é detectável por análise potenciométrica. O potencial efetivo para gerar um odor detectável do I2 em uma formulação específica deve ser medido e não pode ser previsto para a maioria das matrizes de formulação diferentes de água.

A eficácia, como determinado pela eliminação de S. aureus, deve ser equilibrada contra odor de I2 e irritação nasal ao estabelecer o nível superior de I2 apropriado para uso em uma formulação nasal. Uma concentração de 300 ppm de I2 a 37°C produz um odor forte que não é ótimo. É evidente que a concentração ótima de uso de I2 é o mínimo necessário para eliminar S. aureus da cavidade nasal. Verificou-se que uma formulação de gel apropriadamente formada contendo 250 ppm de I2 foi aceitável com relação a odor. Para fins desse pedido a concentração preferida de I2 é uma que fornece uma pressão de vapor que é igual ou menor do que aquela observada em uma solução de 250 ppm de I2 em 0.1 N de ácido clorídrico.

O tempo de permanência para um agente aplicado à cavidade nasal é afetado por uma variedade de fatores. Um desses é a localização de depósito uma vez que depósito na porção anterior do nariz provê um tempo de permanência nasal mais longo. Uma segunda consideração é a viscosidade da composição visto que uma viscosidade mais elevada provê um tempo de permanência mais longo. Esse pedido prevê formulações com uma viscosidade que varia de um valor que é substancialmente similar à água (isto é, 10 cp) até valores com uma viscosidade de 40.000 cp. A velocidade de morte de I2 é extremamente rápida (segundos) e o tempo de permanência não é previsto como sendo um fator significativo de biocarga inerente na cavidade nasal ou a questão de assegurar que I2 é uniformemente perturbado na cavidade nasal de modo que possa contatar elementos patogênicos.

O pH da mucosa nasal é preferivelmente mantido em uma faixa de 4,5 a 6,5 uma vez que isso permite que a lisozima endógena inative bactérias. Além disso, movimento ciliar normal é mantido nessa faixa de pH. I2 pode ser formulado para permanecer estável durante o tempo de permanência previsto da droga na cavidade nasal nessa faixa de pH. A faixa de pH preferida das formulações descritas nesse pedido situa-se entre 3,0 e 6,0. O volume de um medicamento de gel por narina previsto nesse pedido está entre 25 e 500 μL com 100 - 250 μΕ sendo os volumes de dose mais comuns. Se a formulação tiver uma viscosidade que é 10 cp ou menos então um volume tão grande quanto 3 mL pode ser administrado. Portanto, uma capacidade de tampão de formulação adequada é necessária para manter o pH desejado no local. O uso de preservativos para evitar crescimento microbiano é previsto nesse pedido com a condição de que tais preservativos sejam eficazes entre pH 2,0 e 6,0. Umectantes são previstos nesse pedido e podem ser adicionados facilmente em produtos nasais baseados em gel; os exemplos comuns incluem glicerina, sorbitol e manitol.

lodo é um átomo relativamente volumoso com um peso molecular de 129. A interação entre receptor de célula-T (TCR) e superantigeno de enterotoxina de Staphylococcus aureus (SE) é bloqueada pela ligação covalente de I2 com aminoácidos compreendido no domínio de ligação. o efeito líquido dessas reações é o de evitar a reação de ligação entre superantígenos S. aureus e receptores de célula-T. Isso significa que I2 pode evitar a ligação de SE a receptores de célula-T na ausência de S. aureus uma vez que S. aureus secreta SE no meio em volta da bactéria. Os exemplos desses locais incluem o vestíbulo nasal, seios, pele e ferimentos. Além disso, a ligação de I2 a esses aminoácidos pode bloquear a capacidade de cinases de adicionar grupos de fosfato a tirosina, serina, histidina e treonina que, por sua vez, bloqueariam os processos de sinalização de células. A capacidade de I2 de interferir com ligação de célula-T via superantigeno e fosforilação de proteína antes da sinalização de célula provê um meio anteriormente não identificado para mitigar as respostas imunes severas causadas por S. aureus. A presente invenção descreve um processo para inibir uma resposta de célula-T/linfócito que não tem uma etapa de processamento fagocitico e portanto inibe uma resposta de célula-T/linfócito à enterotoxina. Na realidade, o processo da presente invenção ensina como bloquear a ligação de superantigeno ao receptor de célula- T. Essa invenção também descreve um processo que erradicará S. aureus a partir do trato respiratório superior porém não irrita o tecido nasal ou causa toxicidade sistêmica.

DESCRIÇÃO

A formação de I2 em uma composição aquosa é preferivelmente gerada de acordo com a presente invenção a partir de uma reação por um oxidante e um redutor em um modo que pelo menos 40% do iodo total presente na composição aquosa é I2 em uma concentração mínima de I2 acima de aproximadamente 25 ppm. A concentração de I2 considerada nesse pedido varia de 25 ppm a 250 ppm com pelo menos 40%, porém preferivelmente pelo menos 50% do iodo total estando na forma de I2. A concentração preferida de I2 é de 25 ppm a 150 ppm. A concentração mais preferida de iodo molecular é de 50 ppm a 75 ppm.

A concentração de iodo total considerada nesse pedido varia de 25 ppm até 500 ppm. A concentração preferida de iodo total é de 25 ppm a 300 ppm. A concentração mais preferida de I2 total é de aproximadamente 50 a 150 ppm.

A razão de I2 considerada nesse pedido varia de 40 a 100%. A razão preferida de iodo molecular é de 70 a 100%. A razão mais preferida de iodo molecular é 100%.

A taxa de geração de iodo é definida aqui, como o tempo necessário para que a geração de I2 atinja um valor máximo. A taxa de geração de iodo considerada nesse pedido varia de segundos para reações controladas por difusão como aquela entre iodeto e iodato em um ambiente aquoso até uma elevada de 15 minutos. A taxa mais preferida de geração de I2 considerada nesse pedido é de 2-5 segundos. É possível pôr em prática esse pedido por diluir composições estáveis de iodo e então imediatamente aplicar o produto da diluição. Essa abordagem também é considerada de acordo com o presente pedido e seria considerada como tendo uma taxa de geração de I2 instantânea.

Inúmeros processos conhecidos na técnica podem ser utilizados para gerar I2 como considerado nesse pedido. Para geração no local de I2 a partir de iodeto os oxidantes mais comuns são compostos de cloro ativo e peróxido de hidrogênio. O oxidante preferido para gerar I2 a partir de iodeto é iodato. Iodato pode ser introduzido como um sal a partir do seguinte grupo: iodato de cálcio, iodato de sódio, iodato de potássio, iodato de magnésio, iodato de zinco, iodato de amônio, e similares. Iodo molecular pode também ser gerado por diluição de formulações que contêm iodo complexado ou por dissolução de iodo elementar como é feito em vários dispositivos utilizados para desinfecção de água.

Fontes secas apropriadas de ânion iodeto incluem iodeto de sódio, iodeto de cálcio, iodeto de amônio, iodeto de magnésio, iodeto de zinco e iodeto de potássio bem com outros sais de iodeto. Qualquer composto que forneça ânion iodeto após dissolução em um ambiente aquoso é apropriado para essa aplicação. Os sais simples de iodeto são preferidos e têm a vantagem de serem mais baratos. Adicionalmente, têm uma vida de armazenagem longa em forma sólida e líquida.

Os tipos de composições considerados de acordo com essa aplicação incluem líquidos, géis, cremes, unguentos e emulsões com a condição de que cremes e emulsões à base de óleo não são considerados nessa aplicação. O tipo de composição não é um aspecto determinativo dessa aplicação em vez disso a concentração absoluta e relativa de I2 e I2 complexado são os dois aspectos mais críticos da presente invenção. Os exemplos de tipos diferentes de composições são fornecidos, como exemplo, na seção Exemplos desse pedido. É evidente a partir desses experimentos que muitos tipos diferentes de composições são compatíveis com os ensinamentos desse pedido.

Os espessantes úteis no contexto da invenção são preferivelmente tirados do grupo que consiste em alquil celuloses, alcóxi celuloses, goma xantana, goma guar, ácido poliorgano sulfônico e misturas dos mesmos. Os espessantes são escolhidos com base em compatibilidade com os outros ingredientes de formulação e viscosidade desejada. Dito em termos gerais o espessante deve estar presente em um nível de aproximadamente 0,01 - 10% em peso, e mais preferivelmente de aproximadamente 0,1 - 1% em peso.

Ciclodextrinas são oligossacarídeos não redutores, cíclicos, solúveis em água, cristalinos compreendidos de unidades de glucopiranose. I2 é substancialmente menos hidrofílico do que água, e portanto tem o potencial de ser incluído na cavidade de ciclodextrina na presença de água. Tal complexação de I2 com uma ciclodextrina reduz sua capacidade de evaporar. Há três classes de ciclodextrinas (isto é, α, β e γ) compreendidas de 6, 7 e 8 unidades de glucopiranose respectivamente. Ciclodextrinas são potencialmente úteis para as formulações consideradas nesse pedido uma vez que podem ligar I2 e desse modo reduzir a pressão de vapor efetiva de I2 em uma formulação. Tampões apropriados para as composições consideradas nesse pedido incluem água e misturas hidroalcoólicas tamponadas com glicina, ácido ftálico, ácido citrico, fosfatos, ácido dimetil glutárico, acetato, ácido succinico, ácido ftálico, ácido málico, ácido bórico e similares. Os sais comumente disponíveis desses agentes, por exemplo, citrato de sódio, fosfato de potássio, maleato de cálcio, são igualmente apropriados para uso nessas composições consideradas nesse pedido.

Genericamente, qualquer agente de condicionamento dispersível, umectantes e emolientes, conhecidos por aqueles versados na técnica pode ser utilizado na presente invenção. Emolientes preferidos a serem utilizados na invenção são tirados do grupo que consiste em glicerina, propileno glicol, sorbitol, lanolina, derivados de lanol ina, polietileno glicol, aloe vera, dioleatos de glicose polietoxilado de glucamato contendo pelo menos 100 unidades etóxi na fração de polietileno glicol, disponível, glicose de metil polietoxilado contendo pelo menos 10 unidades etóxi, alantoína, alginatos, sais de monoéster de sulfossuccinatos, ácidos graxos de alfa hidróxi, ésteres de ácidos graxos, ceramidas, e misturas dos mesmos. Em termos gerais, os agentes de condicionamento são utilizados em um nível de aproximadamente 0,5 - 20% em peso. Os agentes de condicionamento mais preferidos são sorbitol, óleo mineral, glicerina e/ou manitol, e são normalmente empregados em um nível de aproximadamente 1 - 20% em peso, e mais preferivelmente de aproximadamente 2 - 10% em peso.

Agentes de quelação ou sequestrantes podem ser agentes de estabilização úteis na invenção particularmente quando uma forma complexada de iodo está presente. Agentes de quelação comumente disponíveis podem ser utilizados na invenção incluindo agentes de quelação tanto inorgânico como orgânico. Agentes de quelação orgânicos incluem ácido poliacético de alquil diamina, agentes de quelação como EDTA(sal de tetrassódio de ácido etilenodiaminatetracético) , agentes de estabilização do tipo ácido acrílico e ácido poliacrílico, agentes de quelação do tipo fosfonato e ácido fosfônico e outros. Sequestrantes orgânicos preferível incluem ácidos fosfônicos e sais de fosfonato incluindo 1-hidróxi etilideno-1,1- ácido difosfônico, amino [tri(ácido metileno fosfônico)], etileno diamina [tetra(ácido metileno fosfônico)], 2-fosfonobutano-1,2,4-ácido tricarboxíIico bem como sais de metal alcalino, sais de amônio, ou sais de amina de alcanol ou alquila incluindo sais de amino mono-, di- ou trietanol. Agentes de quelação inorgânicos incluem materiais de polifosfato comumente disponíveis como pirofosfato de sódio, tripolifosfato de sódio ou potássio juntamente com espécie de polifosfato mais elevado ou cíclico. Preferivelmente, um tal agente sequestrante é utilizado em uma concentração que varia de aproximadamente 0,05% em peso a aproximadamente 0,5% em peso da composição.

Ácidos orgânicos comumente disponíveis que podem ser utilizados na invenção incluem ácido benzóico, ácido mandélico, ácido sórbico, ácido cítrico, ácidos alcanóicos inferiores e seus sais do tipo alimentício, como sais de amônio ou potássio sódico dos mesmos. Esses ácidos orgânicos, seus sais, ou misturas dos mesmos estão presentes na composição em uma quantidade entre aproximadamente 0,010 a 0,5 por cento em peso, pref erivelmente de 0, 050 a 0,20 por cento em peso. Os ácidos orgânicos atualmente preferidos são ácido mandélico, ácido benzóico, ácido cítrico e ácido sórbico, com ácido benzóico adequadamente presente como benzoato de sódio e ácido sórbico adequadamente presente como o ácido livre. Cada um desses ácidos, ou seus sais, e outros, individualmente ou em combinações, pode ser incorporado nas composições consideradas nessa invenção.

A presente invenção demonstra que uma aplicação dependente de dose de iodo molecular reage com superantigeno de enterotoxina Staphylococcus aureus e torna o mesmo incapaz de se ligar a linfócitos de célula-T como medido pela falha de células-T em sintetizar e liberar várias citocinas. A capacidade de iodo interferir com ligação de célula-T, de superantigeno em um modo dependente de dose é uma observação nova da presente invenção.

Os ensinamentos e exemplos nesse pedido não fazem nenhuma tentativa para enumerar especificamente a técnica anterior inteira na área de preparados tópicos de iodo. Excipientes que são conhecidos como sendo compatíveis com iodo também podem ser de uso com composições e condições descritas nesse pedido. Tais excipientes incluem tensoativos, espessantes, umectantes, emolientes, agentes condicionadores de pele, agentes de estabilização, meios de opacificação, agentes de umedecimento, óleos essenciais, agentes de quelação, tampões, preservativos, ácidos orgânicos e fragrâncias.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Secreções nasais foram coletadas de 10 voluntários (7 homens e 3 mulheres) após exercício em ar frio (entre -6,66 e 2,77°C); quatro dos voluntários estavam resfriados. Secreções gotejando ou assoadas foram coletadas em béqueres graduados de plástico (Fisher, Scientific) e os topos foram cobertos com Parafilm M. As amostras iniciais foram congeladas até que todas as amostras foram coletadas. As amostras foram misturadas com água (2 partes de amostra para 1 parte de água (v/v) ) e submetidas a vórtice em um modo pulsátil até que todas as amostras estavam substancialmente homogêneas e alíquotas uniformes foram capazes de ser removidas com uma pipeta.

Cristais de iodo (ACS Reagents Grade, Sigma-Aldrich) foram colocados em um frasco volumétrico de 1 litro e então 0.01N HCl foi adicionado ao frasco QS até 1 litro; uma rolha de borracha foi colocada no topo do frasco para evitar evaporação. A rolha de borracha tinha um tubo de vidro pequeno inserido através da mesma; o topo desse tubo foi vedado com parafilm. Os cristais de I2 foram agitados em temperatura ambiente por 3 horas com uma barra de agitação magnética e placa de agitação magnética. Após duas horas o tubo de vidro foi empurrado para baixo de tal modo que o fundo do tubo estava localizado em um ponto aproximadamente 7,62 cm acima do fundo do frasco. As amostras da solução de I2 saturado foram retiradas através desse tubo de vidro utilizando seringa de vidro de 50 mL com uma agulha hipodérmica calibre 18 que tinha um tubo de plástico fino (PVC ID 0,046") fixado em sua extremidade. A rolha foi, portanto, mantida no frasco durante todo o tempo. As amostras da solução de I2 de material foram retiradas e a concentração de I2 foi determinada como sendo 330 ppm utilizando o processo potenciométrico de Gottardi.

Uma alíquota de 0,25 mL das secreções nasais submetidas a vórtice foi colocada em um frasco dram (15 χ 45 mm) e uma tampa foi colocada no topo. Alíquotas de um tampão de ácido cítrico pH 5,0 (100 mM) foram colocadas em 7 frascos dram (29 χ 65 mm) e vedadas colocando uma tampa de plástico fina sobre os frascos. Um mL da solução de I2 de material foi injetado nos frascos contendo 1, 3, 6, 10 ou 15 mL do tampão de ácido cítrico de 100 mM; isso forneceu soluções contendo 165, 83, 47, 30 e 21 ppm de I2. Uma amostra (0,25 mL) foi retirada de cada solução de I2 e injetada através da tampa de plástico para dentro das amostras de secreções nasais submetidas a vórtice; as amostras combinadas foram misturadas por vórtice. Uma amostra de controle recebeu 0,25 mL de tampão de ácido citrico sem nenhum I2. Todas as amostras foram deixadas incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.

Após dez minutos 1,0 mL de tiossulfato de sódio a 0,5% foi adicionado a cada amostra incluindo o controle. Placas de Agar de soja Tripticase (TSA) foram inoculadas por espalhar 0,5 mL de cada amostra através da superfície das placas de TSA. As placas foram incubadas por 24 h em 37 graus Centígrados. As placas foram examinadas em relação à presença de colônias bacterianas após 24 horas de incubação. A cavidade nasal é útil à replicação bacteriana uma vez gue os mucopolissacarídeos fornecem uma fonte de nutrientes; conseguentemente, toda bactéria necessita ser eliminada para um agente ser eficaz. Conseguentemente, as placas foram marcadas como positivas (a presença de colônias) ou negativas (a ausência de colônias). Os resultados são mostrados na Tabela 1 e indicam gue secreções nasais afetam a capacidade de I2 de inativar elementos patogênicos. Esse resultado não é surpreendente uma vez gue os mucopolissacarídeos gue compreendem secreções nasais contêm uma percentagem relativamente elevada de grupos de sulfidral.

Tabela 1. Efeito de secreção nasal de inativação por I2 de bactérias nasais endógenas

<table>table see original document page 23</column></row><table> A concentração mínima de I2 necessária para eliminar S. aureus a partir da cavidade nasal foi avaliada em voluntários humanos. Trinta e cinco voluntários adultos foram utilizados para avaliar a capacidade de concentrações diferentes de I2 de eliminar S. aureus da cavidade nasal. Espécimes foram tirados das narinas anteriores de adultos por tirar material para exame 1,5 cm anterior de cada vestíbulo nasal com um BBL CultureSwab. A mecha de algodão foi girada 4 vezes em torno das paredes internas de cada abertura nasal e então colocado em meio de Stewart e transportado para o laboratório para avaliação. Placas de TSA II foram inoculadas com os cotonetes de algodão. As placas foram inoculadas a 37°C em um incubador sem CO2. Após incubação, as placas de TSA II foram examinadas em relação a colônias sugestivas de S. aureus. S. aureus foram identificados utilizando processos padrão incluindo o teste de coagulase e coloração de Gram. Os voluntários foram classificados em relação a transporte nasal de S. aureus em cinco ocasiões separadas, com 1 semana de separação. Somente portadores persistentes (isto é, pelo menos 80% de culturas positivas) foram utilizados para o teste.

O artigo de teste consistiu em um sistema de líquido-gel de dois componentes. 0 gel e líquido foram misturados antes da aplicação na cavidade nasal com uma mecha de algodão. O gel foi preparado utilizando ácido cítrico USP (10% peso/v), glicerina NF (10% peso/v), NF carbóxi metil celulose (0,75% peso/v), NF e ácido bórico (0,3% peso/v); o pH do gel foi ajustado para 3,0 com hidróxido de sódio. Uma mistura aquosa de iodeto de sódio USP (0,354% peso/v) e iodato de potássio FCC (0,303%) em carbonato de sódio (0,2% peso/v) foi preparada. O tratamento com I2 foi preparado antes do uso misturando 9 partes do gel com 1 parte da solução aquosa; isso forneceu uma mistura com 300 ppm de I2 como determinado pelo processo potenciométrico de Gottardi e por titulação de tiossulfato.

EXEMPLO 2

Sete concentrações diferentes de I2 foram utilizadas. Os tratamentos de I2 diferentes foram preparados misturando quantidades diferentes do gel de carbóxi metil celulose (CMC) com a mistura aquosa de iodeto/iodato. A Tabela 2 identifica as concentrações de I2 e os volumes relativos de solução de iodato/iodeto-gel utilizados.

Tabela 2. Concentração de I2 para aplicação nasal

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Voluntários cronicamente colonizados foram tratados com artigo de teste por cinco (4) dias consecutivos. Em cada dia de tratamento os voluntários tiveram gel ativado aplicado antes do inicio do dia de trabalho e então 6 horas após. 0 gel de CMC foi misturado com a mistura de iodeto/iodato e então aplicado em cada uma das narinas de cada voluntário com cotonetes com ponta de algodão estéril. 0 gel de CMC foi ativado e então aplicado em 5 minutos. Para aplicar o gel os cotonetes foram imersos no gel ativado e então girados dentro de cada narina; isso foi feito duas vezes para cada aplicação com cada narina. Antes do tratamento uma BBL CultureSwab foi tirada para confirmar a presença de S. aureus; uma segunda BBL CultureSwabs foi tirada 24 horas após término do tratamento. Os voluntários também foram avaliados 1 e 2 semanas após o último tratamento. <table>table see original document page 26</column></row><table>

EXEMPLO 3

Um gel de ácido acrílico reticulado foi utilizado para avaliar o rendimento de I2 versus várias variáveis de formulação. Polímeros de ácido acrílico reticulado têm propriedades reológicas que podem tornar os mesmos úteis para uso na cavidade nasal. Além disso, polímeros de ácido acrílico reticulado são isentos de odor e têm um número elevado de grupos de ácidos carboxílico no polímero, que ajuda a manter um pH acídico estável. Três géis diferentes (B182, NoE-026, NoE-004) foram preparados para explorar o rendimento de I2 versus concentrações diferentes dos excipientes na formulação.

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Um béquer foi carregado com aproximadamente 400 ml de água; o polímero de ácido poliacrílico de interesse, por exemplo Carbopol 980 NF, foi então adicionado e agitado em um misturador Lightnin LabMaster a 800 - 1000 rpm por 1 - 2 horas até que o Carbopol foi hidratado e então a glicerina foi adicionada. Uma solução contendo EDTA, ácido bórico, e 10 N NaOH em 80 ml de água foi então adicionada à mistura. A mistura foi então agitada por 1 hora em 600 ppm e armazenada em temperatura ambiente e então QS até 1 litro. Uma solução de material de iodeto de sódio e iodato de sódio foi preparada para mistura com o gel para gerar quantidades definidas de I2. Iodeto de sódio (0,60 gramas) e iodato de sódio (2,0 gramas) foram dissolvidos em 120 ml de água que continha 1,4 ml de 10 N NaOH. O pH final dos géis foi entre 4,5 e 6,0.

Um ml de gel foi misturado com 1,0 ml de mistura de iodeto/iodato de material. As reações foram paradas a 0,5, 1,0, 2,0 e 4,0 minutos. Os géis foram então extraídos com 10 ml de clorofórmio e 50 ml de um tampão de 1.0 N fosfato pH 4,8 que contém 300 gramas de sulfato de sódio por litro. A absorvência em 520 nm foi medida em um espectrofotômetro Schimadzu UV-1602. Gel NoE-026 foi testado preparado fresco e comparado com gel NoE-026 armazenado a 40°C por 4 meses. O rendimento de I2 estava acima de 50% em todos os casos; a armazenagem dos géis não pareceu causar impacto no rendimento de I2. A taxa da reação entre iodeto e iodato é conhecida como sendo controlada por difusão e não é surpreendente que o rendimento de I2 não era uma função de tempo.

<table>table see original document page 27</column></row><table>

EXEMPLO 4

O odor de I2 percebido das formulações consideradas nesse pedido se baseia diretamente em utilidade. O potencial efetivo para gerar um odor detectável de I2 em uma formulação especifica deve ser medido e não pode ser previsto para a maioria das matrizes de formulação diferentes de água. Esse experimento provê um meio quantitativo de caracterizar o odor percebido a partir das composições complexas consideradas nesse pedido com base no odor de I2 percebido por seres humanos em um meio aquoso.

Várias concentrações diferentes de I2 puro em 0.1N HCl foram preparadas por dissolução de cristais de I2 (Sigma-Aldrich cat no. 266426-250G) em um frasco volumétrico de vidro com rolha no lugar. Uma tira de 2,54 cm de papel de iodeto de potássio e amido (Whatman International, Ltd., Cat. No. 2602-500A) foi totalmente umedecido com água destilada e alinhado verticalmente nivelado com a superfície do interior de um tubo de plástico graduado independente de 50 mL (Corning Cat. No. 430897). Após o papel de amido ter aderido ao lado interno da parede 150 μΐ das soluções de I2 foram transferidas para o fundo do tubo de plástico; a seção inferior desses tubos tem formato cônico e retém esse volume de fluido em uma área relativamente bem definida. Após as amostras serem transferidas para o tubo de plástico graduado o topo foi imediatamente atarraxado e um cronômetro foi iniciado. O tempo necessário para que o papel de amido se torne azul foi registrado em segundos.

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Cinco voluntários (3 homens; 2 mulheres) foram utilizados para avaliar o odor a partir das soluções aquosas de I2. Uma sala sem odor não adjacente a um laboratório, lanchonete ou banheiro foi utilizada para a avaliação. Os indivíduos selecionados para avaliar o odor de iodo não tinham resfriados ou alergias. Os testes foram realizados de manhã e os voluntários foram instruídos a tomar um banho de chuveiro na manhã do teste e não utilizar loções ou pós-barba naquela manhã. Os voluntários foram instruídos a identificar qualquer amostra que fornecia um odor desagradável. Nenhum dos voluntários detectou nenhum odor em concentrações de I2 de 22,5 ppm ou menos. Todos os voluntários foram capazes de detectar a presença de um aroma acima de 55 ppm porém esse odor não era considerado como questionável (4 entre 5 voluntários) até que a concentração de I2 era 275 ppm e acima.

EXEMPLO 5

Esse experimento demonstra que uma aplicação dependente de dose de I2 reage com superantígenos, como enterotoxina de Staphylococcus aureus B (SEB), tornando os mesmos incapazes de ligar-se a linfócitos de célula-T. A estimulação de células-T por ligação de superantígeno é necessária para síntese de citocina. Os inventores estavam investigando processos de desinfetar células cultivadas de mamíferos para matar bactérias ou fungos/levedura sem matar as células de mamífero. As células de mamífero escolhidas eram leucócitos de sangue periférico humano (PBL) coletados frescos utilizando tubos BD Vacutainer de preparação de célula CPT com citrato de sódio. Procedimentos anteriormente descritos foram utilizados para fornecer linfócitos altamente enriquecidos, que incluem células tanto B como T. Staphylococcus aureus foi obtido de um hospital local em um agar inclinado. O isolado de S. aureus era de um paciente que sofria de envenenamento por alimento. O isolado de S. aureus expressou SEB. Linfócitos (10VmL contado por hemocitômetro) foram suspensos em solução de sal equilibrada de Hanks com HEPES (3 mM) e soro bovino fetal a 2% (v/v) e quantidades variáveis de S. aureus foram adicionadas variando de IO3- 105 cfu/ml e ensaios foram incubados a 37°C por uma hora. Após uma hora 500 microlitros de I2 foram adicionados a várias culturas em várias concentrações (0,1 - 100 ppm de iodo molecular livre, concentração final). Após um período adicional de 10 minutos 200 microlitros de uma solução 2N de tiossulfato de sódio foram adicionados; alíquotas de 100 microlitros foram removidas de cada recipiente de reação e semeadas para isolamento de S. aureus em placas de agar nutriente; tubos de reação foram então retornados ao incubador (37°C) . Os resultados eram de um certo modo previsíveis. Culturas de Iinfócito-S.aureus (IO3-IO5) tratadas com 0,1 - 10 ppm do iodo tinham S. aureus viável que cresceu no agar.

Os recipientes de reação com 10 - 100 ppm de I2 não tinham S. aureus viável. Entretanto, a descoberta surpreendente ocorreu três dias após. Cada recipiente de reação foi examinado utilizando o microscópio/hemocitômetro para observar e contar o número de linfócitos. Os recipientes de reação com IO5 de S. aureus e 10 ppm de iodo tinham 100 vezes mais de linfócito (~108/mL) do que culturas similares tratadas com 100 ppm de I2. Esses resultados eram confusos. Os requerentes sabiam que a cepa de S. aureus utilizada nesses experimentos expressava SEB, um superantígeno conhecido. Os requerentes previram que algo desencadeou a proliferação de linfócitos a 10 ppm de I2 porém não a 100 ppm de I2 e assumiram que era S. aureus SEB. A hipótese chave foi que I2 bloqueou a proliferação de linfócito em concentrações de I2 mais elevadas porque de algum modo o I2 bloqueou uma reação entre S. aureus e linfócitos. Esses resultados induziram os requerentes a executar experimentos que poderiam explicar o resultado de proliferação.

Os requerentes decidiram que o modo mais direto para testar a hipótese deles era misturar S. aureus SEB com I2; neutralizar a mistura com tiossulfato de sódio e então tratar linfócitos frescos com a solução neutralizada. Os requerentes puderam então medir síntese de citocina após interação com células-T. Os requerentes escolheram medir interleucina 6 (IL-6) e interferon gama (IFN-y) como marcadores de estimulação de célula-T com base em estudos publicados. Todos os reagentes incluindo S. aureus SEB (US Biological, Swampscott, MA; cat. No. S7965-35A), anticorpo de IgG monoclonal de anti-enterotoxina B de camundongo purificado, IgG monoclonal de camundongo purificado para interferon IFN-γ e a citocina IL-6 foram adquiridos de fontes comerciais. Os experimentos de controle foram realizados utilizando PBL fresco e 1 pg/mL de SEB. Dois imunoensaios ELISA de captura de sítio em placas para microtitulação com 96 cavidades foram adquiridos como kits comerciais IFN-γ (eBioscience, San Diego, CA; no. do cat. 88-7314-76) e IL-6 (eBioscience, San Diego, CA; no. do cat. 88-7066). A enzima utilizada foi peroxidase de raiz forte (HRP) e os ligadores eram biotina-estreptavidina, o substrato foi tetrametil benzidina (TMB); a revelação da cor foi terminada com ácido sulfúrico e a cor foi lida a 570 nm com um espectrofotômetro UV-1602 Schimadzu. A densidade óptica de cada desconhecido foi determinada e comparada com as concentrações de IL-6 e IFN-γ obtido utilizando padrões fornecidos com cada kit comercial.

Curvas padrão foram preparadas para IL-6 (6-200 pg/mL) e IFN-γ (0,1 - 3,0 ng/mL). I2 foi preparado fresco em uma concentração de material de 330 ppm/mL e alíquotas foram adicionadas a vários tubos de reação para obter a concentração de iodo final desejada. SEB (10 microlitros) foi misturado não diluído com I2 (10 microlitros) e tampão (1M tampão de citrato pH 5,0) em temperatura ambiente por 30 minutos. Após 1 hora, 5 μΐ, de 2N tiossulfato de sódio foi adicionado a todas as amostras e suavemente agitado para assegurar total neutralização do I2. Células de PBL, o SEB iodado foram suavemente misturados em tubos de reação e colocados a 37°C. Após 1 hora, as células estavam na forma de pellets e 5 μΐ foi removido do sobrenadante de cada tubo e analisado em relação à presença de citocinas IL-6 e IF-γ na fração isenta de células. As amostras do sobrenadante também foram coletadas em 12, 24, 36 e 48 horas e analisadas em relação a IL-β e IFN-γ. As cavidades de amostra das placas para microtitulação com 96 cavidades dos imunoensaios ELISA, foram lavadas duas vezes após ligação de rótulo para assegurar remoção de toda azida de sódio utilizada para preservar SEB. Os resultados desses ensaios (mostrados abaixo) demonstram que em uma concentração de >25 ppm de I2 inibe a capacidade dos superantígenos de ativar síntese de células-T de citocinas.

Concentração de IL-6 (pg/ml) ver sus tempo em Horas

<table>table see original document page 32</column></row><table> Concentração de IF-γ (ng/mL) ver sus tempo em Horas

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Claims (16)

1. Processo para matar ou substancialmente erradicar um elemento patogênico no trato respiratório superior de um mamífero, o processo compreendendo gerar iodo molecular (I2) no local, utilizando uma reação oxidante-redutora em uma composição aquosa em um pH abaixo de 7 com uma concentração mínima de pelo menos aproximadamente 25 ppm de I2, onde I2 compreende pelo menos -40% dos átomos de iodo totais na composição aquosa, e administrar a composição aquosa ao mamífero posteriormente ou substancialmente simultaneamente com a geração de iodo molecular.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, onde I2 é gerado de uma fonte de iodeto e iodato em uma concentração mínima de 20 ppm de iodeto e 6, 9 ppm de iodato respectivamente.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, onde a composição aquosa compreende ainda uma ciclodextrina selecionada do grupo que consiste em α-ciclodextrina, β- ciclodextrina e γ-ciclodextrina.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que o patógeno é Staphylococcus aureus.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que a faixa de concentrações de I2 gerado é de 50 a -250 ppm.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que a concentração máxima de I2 é determinada pelo controle em relação à presença de um odor de I2 ao colocar a composição aquosa no fundo de um cilindro de plástico graduado, independente vedado; aderir uma tira de 2,54 cm de um papel de iodeto de potássio e amido, umedecida, em uma parede lateral interna superior do cilindro de plástico; e alcançar um tempo de pelo menos 67 segundos para tornar o papel de iodeto de potássio e amido totalmente azul em temperatura ambiente.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que o pH da composição está em uma faixa de 3,0 a 6,0.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição aquosa está em um volume de 100 a 2000 μl.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição aquosa está em uma formulação para fornecer uma característica selecionada do grupo que consiste em um líquido, gel, creme, unguento e emulsão.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, em que a composição aquosa é um sistema de gel-líquido.

11. Processo de inibir superantígenos de ativar células imunes, o processo compreendendo aplicar iodo molecular em um superantígeno em uma concentração suficiente para evitar que o superantígeno ative uma reação de célula imune.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que uma composição aquosa é aplicada em tecido de mamífero em uma concentração mínima de pelo menos aproximadamente 30 ppm de I2.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 11, para tratar condições conhecidas para gerar uma resposta imune por superantígenos, incluindo dermatite atópica, eczema, psoríase, impetigo, sinusite e asma.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que os superantígenos são enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB).

15. Processo, de acordo com a reivindicação 11, em que as células imunes são leucóticos de sangue periférico humano.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos 50% do iodo total presente está na forma de I2-