BRPI0713000A2 - proteÍnas de ligaÇço de cadeia énica multivalente com funÇço efetiva - Google Patents

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BRPI0713000A2
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cell
protein
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binding domain
fgf
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BRPI0713000-7A
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Peter Armstrong Thompson
Jeffey A Ledbetter
Martha S Hayden-Ledbetter
Laura Sue Grosmaire
Robert Bader
William Brady
Lioudmila Tchistiakova
Maximillian T Follettie
Valerie Calabro
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Trubion Pharmaceuticals Inc
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Abstract

PROTEÍNAS DE LIGAÇçO MULTIVALENTES DE CADEIA SIMPLAS COM FUNÇçO EFETORA São fornecidos peptídeos de ligação multivalentes, incluindo pepetídeos de ligação bioespecíficos, que possuem função efetora de imunogobulina juntamente com ácidos nucléicos codificadores, vetores e células hospedeiras, além de métodos para a produção desses peptídeos e métodos para sua utilização para o tratamento ou prevenção de diversas doenças, distúrbios ou condições, bem como para atenuar menos um sintoma associado a essas doenças, distúrbios ou condições.

Description

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO MULTXVALENTES DE CADEIA SIMPLES COM
FUNÇÃO EFETORA
CAMPOS DA INVENÇÃO
A invenção está relacionada de forma geral ao campo das moléculas de ligação multivalentes e aplicações terapêuticas destas.
A listagem de seqüências está sendo submetida como um arquivo de texto e como um arquivo em PDF em conformidade com as exigências aplicáveis para depósito eletrônico. A listagem de seqüências foi criada em 12 de junho de 2007. A listagem de seqüências é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Em um mamífero saudável, o sistema imunológico protege o corpo contra lesões por substâncias estranhas e patógenos. No entanto, em alguns casos, o sistema imunológico apresenta um mau funcionamento, produzindo lesão traumática e/ou doença. Por exemplo, as células B podem produzir anticorpos que reconhecem autoproteínas, e não proteínas estanhas, levando à produção dos auto- anticorpos característicos de doenças autoimunes como, por exemplo, lúpus eritematoso, artrite reumatóide, e semelhantes. Em outros casos, o efeito tipicamente benéfico do sistema imunológico no combate a materiais estranhos é contra-produtivo, por exemplo, após um transplante de órgão. Foi reconhecido o poder do sistema imunológico de mamíferos e, em particular, do sistema imunológico humano, e foram feitos esforços para controlar o sistema para evitar ou atenuar as conseqüências deletérias à saúde que resultam do funcionamento normal do sistema imunológico em um ambiente anormal (por exemplo, transplante de órgão) ou do funcionamento anormal do sistema imunológico em um ambiente de outro modo aparentemente normal (por exemplo, progressão de doença autoimune). Adicionalmente, foram feitos esforços para explorar o sistema imunológico a fim de gerar diversas metodologias diagnosticas e terapêuticas alvo-específicas que se baseiam na capacidade de anticorpos para reconhecer e se ligar especificamente a alvos antigênicos com especificidade.
Uma forma pela qual o sistema imunológico protege o corpo é pela produção de células especializadas denominadas Iinfócitos B ou células B. As células B produzem anticorpos que se ligam e, em alguns casos, medeiam a destruição de uma substância estranha ou um patógeno. No entanto, em alguns casos, o sistema imunológico humano e, especificamente, os linfócitos B do sistema imunológico humano, apresentam um mau funcionamento e uma doença é causada. Há vários cânceres que envolvem a proliferação descontrolada de células B. Também há várias doenças autoimunes que envolvem a produção de anticorpos por células B que, em vez de se ligarem às substâncias estranhas e aos patógenos, se ligam a partes do corpo. Além disso, há diversas doenças autoimunes e inflamatórias que envolvem as células B em sua patologia, por exemplo, por meio da apresentação de antigeno inadequada das células B às células T, ou por meio de outras vias que envolvem células B. Por exemplo, camundongos com tendência autoimune deficientes em células B não desenvolvem doença renal autoimune, vasculite ou auto-anticorpos (Shlomchik e cols., J. Bxp. Med. 1994, 180: 1.295-306) . Curiosamente, esses mesmos camundongos com tendência autoimune que possuem células B, mas são deficientes na produção de imunoglobulinas, desenvolvem doenças autoimunes quando induzidos experimentalmente (Chan e colsJ. Bxp. Med.
1999, 189: 1.639-48), indicando que as células B têm uma participação integral no desenvolvimento de doença autoimune.
As células B podem ser identificadas por moléculas em sua superfície celular. CD20 foi a primeira molécula de superfície específica para a linhagem de células B humanas identificada por um anticorpo monoclonal. Ela é uma fosfoproteína hidrofóbica transmembrana de células B não glicosilada de 35 kDa que tem tanto sua extremidade amino quanto sua extremidade carbóxi situadas dentro da célula (Einfeld e cols,, EMBO J. 1988, 7: 711-17). CD20 é expresso por todas as células B maduras normais, mas não é expressa por células B precursoras ou células plasmãticas. Não foram identificados ligantes naturais para CD20, e a função de CD2 0 na biologia das células B ainda não é totalmente 2 0 compreendida.
Outra molécula da superfície celular específica para a linhagem de células B é CD37. CD37 é uma proteína altamente glicosilada de 40-52 kDa que pertence à família de tetraspanina transmembrana de antígenos da superfície celular. Ela atravessa a membrana celular quatro vezes, formando duas alças extracelulares e expondo suas extremidades amino e carbóxi ao citoplasma. CD37 é altamente expresso em células B (slg+) produtoras de anticorpos normais, mas não é expresso em pré-células B ou em células plasmãticas. A expressão de CD37 em células T em repouso e ativadas, monócitos e granulõcitos é baixa, e não hã expressão de CD37 detectãvel em células NK (natural killer), plaquetas ou eritrócitos. Veja Belov e cols., Câncer Res., 61(11): 4.483-4.489 (2001); Schwartz-Albiez e cols., J. Immunol., 140(3): 905-914 (1988); e Link e cols., J. Immunol. , 137(9): 3.013-3.018 (1988). Além das células B normais, quase todas as malignidades de origem nas células B são positivas para a expressão de CD3 7, incluindo leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma não Hodgkin (NHL) e leucemia de células pilosas (Moore, e cols. 1987 ; Merson e Brochier 1988; Faure, e cols. 1990). CD37 participa da regulação da função de célula B, já que se verificou que camundongos desprovidos de CD37 possuem níveis baixos de IgGl sérica e possuem resposta humoral deficiente aos antígenos virais e a antígenos-modelo. Parece que atua como uma molécula co-estimulante não clássica ou por influência direta na apresentação de antígeno por meio da formação de complexo com moléculas de MHC da classe II. Veja Knobeloch e cols., Mol. Cell. Biol., 20(15): 5.363-5.369 (2000).
Ocorreu o desenvolvimento de pesquisas e de fármacos com base no conceito de que as próprias moléculas da superfície celular específicas para a linhagem de células B como, por exemplo, CD3 7 e CD2 0, podem ser alvos para anticorpos que se ligariam e mediariam a destruição de células B cancerígenas e que causam doenças autoimunes que possuem CD3 7 e CD2 0 em suas superfícies. Tendo sido denominado "imunoterapia", os anticorpos feitos (ou baseados em anticorpos feitos) em um animal não humano que se ligam ao CD37 ou CD20 foram dados a um paciente para eliminar células B cancerígenas ou que causam doenças autoimunes.
A tecnologia de anticorpo monoclonal e métodos de engenharia genética facilitaram o desenvolvimento de moléculas de imunoglobulina para o diagnóstico e tratamento de doenças humanas. A estrutura do domínio de imunoglobulinas é passível de manipulação, pelo fato de que os domínios de ligação de antígeno e os domínios que conferem funções efetoras podem ser trocados entre classes e subclasses de imunoglobulina. A estrutura e a função de imunoglobulinas são revisadas, por exemplo, em Harlow e cols., Edsw "Antibodies: A Laboratory Manual", Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988). Uma introdução extensa, bem como informações detalhadas sobre todos os aspectos da tecnologia de anticorpo recombinante, pode ser encontrada no livro texto "Recombinant Antibodies" (John Wiley & Sons, NY, 1999) . Uma coleção abrangente de protocolos laboratoriais detalhados da engenharia de anticorpos pode ser encontrada em R. Kontermann e S. Diibel (eds.), "The Antibody Engineering Lab Manual" (Springer Verlag, Heidelberg/Nova York, 2000).
Uma molécula de imunoglobulina (abreviadamente Ig) é uma proteína multimérica, tipicamente composta por dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos (H2L2) que são unidos em um complexo macromolecular por ligações dissulfeto intercadeias, ou seja, ligações covalentes entre os grupos sulfidrila de resíduos de cisteína vizinhos. São definidas cinco classes de imunoglobulina humana com base na sua composição de cadeia pesada, e são denominadas IgG, IgM, IgAi IgE e IgD. Os anticorpos da classe IgG e da classe IgA são ainda divididos em subclasses, especificamente, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, e IgAl e IgA2, respectivamente. As ligações dissulfeto intercadeias unem diferentes áreas da mesma cadeia polipeptídica, o que resulta na formação de alças que, junto com aminoácidos adjacentes, constituem os domínios da imunoglobulina. Na porção do terminal amino, cada cadeia leve e cada cadeia pesada possuem uma única região variável que apresenta uma variação considerável na composição de aminoácidos de um anticorpo para outro. A região variável da cadeia leve, Vl, possui um único domínio de ligação de antígeno e se associa à região variável de uma cadeia pesada, Vh (que também contém um único domínio de ligação de antígeno), para formar o sítio de ligação de antígeno da imunoglobulina, o Fv.
Além de regiões variáveis, cada uma das cadeias do anticorpo de comprimento total possui uma região constante que contém um ou mais domínios. As cadeias leves possuem uma região constante que contém um único domínio. Dessa forma, as cadeias leves possuem um domínio variável e um domínio constante. As cadeias pesadas possuem uma região constante que contém vários domínios. As cadeias pesadas nos anticorpos IgG, IgA e IgD possuem três domínios, que são designados CHi5, Ch25 e CH3; as cadeias pesadas nos anticorpos IgM e IgE possuem quatro domínios, CHi5, Ch25, Ch3 e CH4 ■ Dessa forma, as cadeias pesadas possuem um domínio variável e três ou quatro domínios constantes. Vale ressaltar a organização constante desses domínios em todas as espécies conhecidas, com as regiões constantes contendo um ou mais domínios estando localizadas no terminal C ou próximas a ele de ambas as cadeias leves e pesadas de moléculas de imunoglobulina, com os domínios variáveis localizados em direção aos terminais N das cadeias leves e pesadas. A estrutura e a função das imunoglobulinas são revisadas, por exemplo, em Harlow e cols., Eds., "Antibodies: A Laboratory Manual", Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988).
As cadeias pesadas das imunoglobulinas também podem ser divididas em três regiões funcionais: a região Fd (um fragmento que compreende Vh e cHi, ou seja, os dois domínios do terminal N da cadeia pesada), a região de dobradiça (hinge) e a região Fc (a região do "fragmento cristalizãvel") . A região Fc contém os domínios que interagem com receptores de imunoglobulina nas células e com os elementos iniciais da cascata do complemento. Dessa forma, a região ou fragmento Fc é geralmente considerada responsável pelas funções efetoras de uma imunoglobulina como, por exemplo, ADCC (citotoxicidade dependente de anticorpos mediada por células), CDC (citotoxicidade dependente de complemento) e fixação de complemento, ligação aos receptores Fc, maior meia-vida in vivo em relação a um polipeptídeo que não possui uma região Fc, ligação de proteína A e, talvez, até mesmo transferência placentária (Capon e cols., Nature, 337: 525-531, (1989)). Além disso, um polipeptídeo que contém uma região Fc permite a dimerização/multimerização do polipeptídeo. Esses termos também são usados para regiões análogas das outras imunoglobulinas.
Embora todos os isótipos de imunoglobulina humana contenham uma estrutura reconhecível em comum, cada isótipo exibe um padrão distinto de função efetora. IgG, apenas como exemplo, neutraliza toxinas e vírus, opsoniza, fixa complemento (CDC) e participa na ADCC. IgM, em contraste, neutraliza patógenos sangüíneos e participa da opsonização. IgA, quando associada à sua porção secretora, é secretada e fornece uma defesa primária à infecção microbiana através da mucosa; ela também neutraliza toxinas e apóia a opsonização. IgE medeia respostas inflamatórias, estando centralmente envolvida no recrutamento de outras células necessárias para montar uma resposta completa. IgD é conhecida por fornecer uma função imunorreguladora, controle da ativação de células B. Essas caracterizações de funções efetoras de isótipos fornecem uma ilustração não abrangente das diferenças que podem ser encontradas dentre os isótipos humanos.
A região de dobradiça, encontrada nos anticorpos das classes IgG, IgA, IgD e IgE, atua como um espaçador flexível, permitindo que a porção Fab se mova livremente no espaço. Em contraste com as regiões constantes, os domínios de dobradiça são estruturalmente diversos, variando tanto em seqüência quanto em comprimento entre as classes e subclasses de imunoglobulinas. Por exemplo, o comprimento e a flexibilidade da região de dobradiça variam entre as subclasses de IgG. A região de dobradiça de IgGl engloba os aminoácidos 216-231 e, por ser livremente flexível, os fragmentos Fab podem girar em torno de seus eixos de simetria e se mover dentro de uma esfera centrada na primeira das duas pontes dissulfeto intercadeias pesadas. IgG2 possui uma dobradiça mais curta do que IgGl, com 12 resíduos de aminoácidos e quatro pontes dissulfeto. A região de dobradiça de IgG2 não possui um resíduo de glicina, é relativamente Curtai e contém uma hélice dupla rígida de poliprolina, estabilizada por pontes dissulfeto intercadeias pesadas extras. Essas propriedades restringem a flexibilidade da molécula de IgG2. IgG3 difere das outras subclasses por sua região de dobradiça estendida única (com um comprimento de cerca de quatro vezes o da dobradiça de IgGl) , que contém 62 aminoãcidos (incluindo 21 prolinas e 11 cisteínas), formando uma hélice dupla inflexível de poliprolina. Em IgG3, os fragmentos Fab são relativamente distantes do fragmento Fc, o que dã à molécula uma maior flexibilidade. A dobradiça alongada em IgG3 também é responsável por seu peso molecular mais elevado, comparada com as outras subclasses. A região de dobradiça de IgG4 é mais curta do que a de IgGl, e sua flexibilidade é intermediária entre a de IgGl e de IgG2. A flexibilidade das regiões de dobradiça relatadas diminui na ordem IgG3>IgGl>IgG4>IgG2. As quatro subclasses de IgG também diferem entre elas com relação às suas funções efetoras. Essa diferença está relacionada às diferenças em termos de estrutura, incluindo diferenças com relação à interação entre a região variável, os fragmentos Fab e o fragmento Fc constante.
De acordo com estudos cristalográficos, a região de dobradiça de imunoglobulina pode ainda ser subdividida funcionalmente em três regiões: a região de dobradiça superior, a região central e a região de dobradiça inferior (Shin e cols., 1992 Irnmunological Reviews 130: 87). A região de dobradiça superior inclui aminoãcidos da extremidade carboxil de cHi ao primeiro resíduo na dobradiça que restringem o movimento, geralmente o primeiro resíduo de cisteína que forma uma ligação dissulfeto intercadeias entre as duas cadeias pesadas. O comprimento da região de dobradiça superior está relacionado â flexibilidade segmentar do anticorpo. A região de dobradiça central contém as pontes dissulfeto intercadeias pesadas, e a região de dobradiça inferior une a extremidade do terminal amino do domínio CH2 e inclui resíduos em CH2. Id. A região de dobradiça central da IgGl humana contém a seqüência Cys-Pro-Pro-Cys que, quando dimerizada por formação de ligação dissulfeto, resulta em um octapeptídeo cíclico que supostamente atua como um pivô, conferindo, dessa forma, flexibilidade. A região de dobradiça também pode conter um ou mais sítios de glicosilação, que incluem diversos tipos estruturalmente distintos de sítios para adesão de carboidrato. Por exemplo, IgAl contém cinco sítios de glicosilação dentro de um segmento de 17 aminoãcidos da região de dobradiça, o que confere resistência da polipeptídeo da região de dobradiça às proteases intestinais, considerada uma propriedade vantajosa para uma imunoglobulina secretora.
Mudanças conformacionais permitidas pela estrutura e flexibilidade da região de dobradiça da seqüência de polipeptídeos da imunoglobulina também podem afetar as funções efetoras da porção Fc do anticorpo. As três categorias gerais de funções efetoras associadas à região Fc incluem: (1) ativação da cascata clássica do complemento, (2) interação com células efetoras, e (3) compartimentalização de imunoglobulinas. As diferentes subclasses da IgG humana variam nas eficácias relativas com as quais fixam complemento, ou ativam e amplificam as etapas da cascata do complemento. Veja, por exemplo, Kirschfink, 2001 Immunol. Rev. 180: 177; Chakraborti e cols. , 2 00 0 Cell Slgnal 12: 607; Kohl e cols. , 199 9 Mol, Immunol. 36: 893; Marsh e cols., 1999 Curr. Opln. Nephrol. Hypertens. 8: 557; Speth e cols., 1999 Wlen Klln. Wochenschr. 111: 3 78.
Exceções à estrutura H2L2 de anticorpos convencionais ocorrem em alguns isótipos das imunoglobulinas encontradas em camelideos {camelos, dromedários e lhamas; Hamers- Casterman e cols., 1993 Nature 363: 446; Nguyen e cols., 1998 J. Mol. Blol. 275: 413), cações-lixa (nurse sharks) (Roux e cols. , 1998 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. A. 95: 11.804), e na quimera americana {spotted ratfish) (Nguyen, e cols. , 2002 Immunog-enetics 54 (1) : 39-47) . Esses anticorpos podem formar aparentemente regiões de ligação de antígeno usando apenas a região variável da cadeia pesada, ou seja, esses anticorpos funcionais são homodímeros somente de cadeias pesadas {denominados "anticorpos de cadeia pesada" ou "HCAbs"). Apesar das vantagens da tecnologia de anticorpo no diagnóstico e tratamento de doenças, há alguns aspectos desvantaj osos no desenvolvimento de tecnologias de anticorpos inteiros como reagentes diagnósticos e/ou terapêuticos. Anticorpos inteiros são estruturas protéicas grandes exemplificadas pela estrutura heterotetramérica do isótipo IgG, que contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Essas moléculas grandes criam obstáculos estéricos em certas aplicações. Por exemplo, nos tratamentos de tumores sólidos, anticorpos inteiros não penetram facilmente no interior do tumor. Além disso, o tamanho relativamente grande de anticorpos inteiros cria um desafio para assegurar que a administração in vivo de moléculas desse tipo não induza uma resposta imune. Além disso, a geração de moléculas de anticorpo ativo tipicamente envolve o cultivo de células eucarióticas recombinantes capazes de fornecer processamento pós- tradução apropriado das moléculas nascentes do anticorpo, e essas células podem ser de difícil cultivo e de difícil indução de uma forma que gere rendimentos comercialmente úteis do anticorpo ativo.
Recentemente, foram construídas moléculas de imunoglobulina menores para superar problemas associados às metodologias de imunoglobulinas inteiras. Um fragmento de anticorpo variável de cadeia simples (scFv) compreende um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo unido por meio de um peptídeo curto a um domínio variável de cadeia leve de anticorpo {Huston e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1988, 85: 5.879-83). Em função do pequeno tamanho das moléculas de scFv, elas exibem uma penetração mais 2 0 eficaz em tecidos do que imunoglobulinas inteiras. Um scFv antitumoral exibiu uma penetração tumoral mais rápida e uma distribuição mais equilibrada por toda a massa tumoral do que o anticorpo quimérico correspondente {Yokota e cols., Câncer Res. 1992, 52: 3.402-08) . Apesar das vantagens que as moléculas de scFv trazem à
soroterapia, existem várias desvantagens em relação a essa abordagem terapêutica. Um scFv é depurado rapidamente da circulação, o que pode reduzir os efeitos tóxicos em células normais, mas essa depuração rápida impede a liberação de uma dose eficaz mínima ao tecido-alvo. A fabricação de quantidades adequadas de scFv para administração aos pacientes tem sido desafiadora, em função das dificuldades na expressão e no isolamento de scFv que afetam de forma adversa o rendimento. Durante a expressão, as moléculas de scFv não têm estabilidade e freqüentemente se agregam por causa do pareamento de regiões variáveis de diferentes moléculas. Além disso, os níveis de produção de moléculas de scFv em sistemas de expressão em mamíferos são baixos, limitando o potencial para uma fabricação eficiente de moléculas de scFv para terapia (Davis e cols., J. Biol. Chem. 1990, 265: 10.410-18); Traunecker e cols., EMBO J. 1991, 10: 3.655-59) . Foram exploradas estratégias para o aumento da produção, incluindo a adição de sítios de glicosilação às regiões variáveis (Jost, C.R. Patente U.S. N0 5.888.773, Jost e cols. , J. Biol. Chem. 1994, 69: 26 . 267-73) .
Outra desvantagem em relação à utilização de scFv para terapia é a ausência de função efetora. Um scFv sem uma função citolítica, por exemplo, a citotoxicidade dependente de anticorpos mediada por células (ADCC) e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) associadas à região constante de uma imunoglobulina, pode ser ineficaz para o tratamento de doenças. Embora o desenvolvimento da tecnologia de scFv tenha começado há mais de 12 anos, atualmente não há produtos de scFv aprovados para terapia.
Alternativamente, foi proposto que a fusão de um scFv a outra molécula, por exemplo, uma toxina, se beneficiaria da atividade de ligação de antígeno específica e do pequeno tamanho de um scFv para liberar a toxina a um tecido-alvo (Chaudary e cols., Nature 1989, 339: 394; Batra e cols., Mol. Cell, Biol. 1991, 11: 2.200). Portanto, a conjugação ou fusão de toxinas aos soFvs foi oferecida como uma estratégia alternativa para gerar moléculas antígeno- específicas potentes, mas a dosagem desses conjugados ou quimeras pode ser limitada por toxicidade excessiva e/ou inespecífica em função da porção de toxina dessas preparações. Os efeitos tóxicos podem incluir elevação suprafisiológica das enzimas hepãticas e síndrome de extravasamento vascular, e outros efeitos indesejados. Além disso, as próprias imunotoxinas são altamente imunogênicas mediante administração a um hospedeiro, e os anticorpos do hospedeiro gerados contra a imunotoxina limitam sua utilidade potencial para tratamentos terapêuticos repetidos de um indivíduo.
0 tratamento não cirúrgico do câncer, por exemplo, irradiação externa e quimioterapia, pode sofrer de eficácia limitada por causa dos efeitos tóxicos sobre tecidos e células normais, em função da ausência de especificidade que esses tratamentos exibem em relação às células cancerígenas. Para superar essa limitação, foram desenvolvidas metodologias de tratamento direcionado para aumentar a especificidade do tratamento para as células e tecidos que dele necessitam. Um exemplo de uma metodologia direcionada desse tipo para uso in vivo é a administração de conjugados de anticorpos, com o anticorpo designado para reconhecer especificamente um marcador associado a uma célula ou tecido que necessita de tratamento, e o anticorpo estando conjugado a um agente terapêutico, por exemplo, uma toxina, no caso do tratamento de câncer. Anticorpos, como agentes sistêmicos, circulam até compartimentos sensíveis e indesejáveis do corpo, por exemplo, a medula óssea. Na lesão aguda por radiação, a destruição de compartimentos Iinfóides e hematopoiéticos é um fator importante no desenvolvimento de septicemia e subseqüente morte. Além disso, os anticorpos são proteínas globulares grandes que podem exibir uma penetração baixa de tecidos que necessitam de tratamento.
Pacientes humanos e indivíduos não humanos que sofrem de diversos processos de doença em estágio final freqüentemente necessitam de transplante de órgão. O transplante de órgão, no entanto, deve competir com a resposta imune adversa do receptor e luta contra a rejeição imunológica do órgão transplantado por depressão da resposta imune celular do receptor ao órgão estranho com agentes citotóxicos que afetam as partes linfóides e outras partes do sistema hematopoiético. A aceitação do enxerto é limitada pela tolerância do receptor a essas substâncias químicas citotóxicas, muitas das quais são similares aos agentes anticâncer (antiproliferativos). Da mesma forma,, quando se utilizam agentes antimicrobianos citotóxicos, particularmente fãrmacos antivirais, ou quando se utilizam fãrmacos citotóxicos para o tratamento de doenças autoimunes, por exemplo, no tratamento do lúpus eritematoso sistêmico, uma limitação séria são os efeitos tóxicos dos agentes terapêuticos na medula óssea e nas células hematopoiéticas do corpo.
O uso de terapias direcionadas, por exemplo, terapia direcionada de conjugados de anticorpos, é planejado para localizar uma quantidade máxima do agente terapêutico no local de ação desejado, como possível, e o sucesso dessas terapias é revelado pela proporção relativamente elevada de sinal em relação ao nível de fundo de agente terapêutico. Exemplos de anticorpos direcionados incluem conjugados de agentes diagnósticos ou terapêuticos de anticorpo ou fragmentos de anticorpo, peptídeos com especificidade de célula ou de tecido, e hormônios e outras moléculas de ligação de receptor. Por exemplo, foram usados anticorpos contra determinantes diferentes associados às células patológicas e normais, bem como associados a microorganismos patogênicos, para a detecção e tratamento de uma ampla gama de condições patológicas ou lesões. Nesses métodos, o anticorpo de direcionamento é conjugado diretamente a um agente de detecção ou terapêutico apropriado, como descrito, por exemplo, em Hansen e cols., Patente U.S. N0 3.927.193 e Goldenberg, Patentes U.S. Nos 4.331.64 7, 4.34 8.376, 4.3 61.544, 4.4 68,457, 4.4 44.744, 4.460.459, 4.460.561, 4.624.846 e 4.818.709.
Um problema encontrado nos métodos de direcionamento diretos, ou seja, em métodos nos quais o agente diagnóstico ou terapêutico (o "agente ativo") é conjugado diretamente à porção de direcionamento, é que uma fração relativamente pequena do conjugado realmente se liga ao local-alvo, enquanto a maioria do conjugado permanece na circulação e compromete, de uma forma ou de outra, a função do conjugado direcionado. Para assegurar a localização máxima do agente ativo, é administrado tipicamente um excesso do conjugado direcionado, assegurando que um pouco do conjugado irá permanecer não ligado e contribuirá para os níveis de fundo do agente ativo. Um conjugado diagnóstico, por exemplo, um conjugado de imagem radioimunocintigrãfico ou por ressonância magnética que não se ligue ao seu alvo, pode permanecer em circulação, aumentando, dessa forma, o nível de fundo e diminuindo a resolução da técnica diagnostica. No caso de um conjugado terapêutico que possui uma toxina como agente ativo {por exemplo, um radioisótopo, fãrmaco ou composto tóxico) anexada a uma porção de direcionamento de circulação prolongada como, por exemplo, anticorpo, o conjugado circulante pode produzir uma toxicidade inaceitável ao hospedeiro, por exemplo, toxicidade para a medula ou efeitos colaterais sistêmicos.
A Patente U.S. N0 4.782.840 revela um método para a redução do efeito dos níveis elevados da radiação de fundo durante cirurgia. 0 método envolve a injeção de um paciente com anticorpos específicos para tecido neoplãsico, com os anticorpos marcados com radioisótopos que possuem uma meia- vida adequadamente longa, por exemplo, Iodo-125. Após injeção do anticorpo marcado radioativamente, a cirurgia é retardada em pelo menos 7-10 dias, preferivelmente 14-21 dias, para permitir que qualquer anticorpo marcado radioativamente não ligado sej a depurado a um nível de fundo.
A Patente U.S. N0 4 .932.412 revela métodos para a redução ou correção de uma radiação de fundo inespecífica durante detecção intra-operatória. Os métodos incluem a administração a um paciente que recebeu um anticorpo primário marcado radioativamente de um agente de contraste, e a subtração do agente ou segundo anticorpo que se liga ao anticorpo primário.
Além da produção dos anticorpos descritos acima, o sistema imunológico inclui diversos tipos de células que possuem efeitos biológicos poderosos. Durante a
hematopoiese, células-tronco derivadas da medula óssea se
diferenciam em células maduras do sistema imunológico
(células "B") ou em precursores de células que migram para
fora da medula óssea para amadurecerem no timo (células " T " )
As células B são fundamentais para o componente humoral de uma resposta imune. As células B são ativadas por uma apresentação apropriada de um antígeno, para se tornarem células plasmãticas secretoras de anticorpos; a apresentação de antigeno também resulta em uma expansão clonal das células B ativadas. As células B são primariamente responsáveis pelo componente humoral de uma resposta imune. Uma célula plasmãtica exibe tipicamente cerca de IO5 moléculas de anticorpo (IgD e IgM) em sua superfície.
Os Iinf ócitos T podem ser divididos em duas categorias. As células T citotóxicas, Iinfócitos Tc ou CTLs (células T CD8+) matam células que abrigam antígeno de superfície estranho em associação com MHC da Classe Ii e podem matar células que possuem parasitas intracelulares (bactérias ou vírus), desde que a célula infectada exiba um antígeno microbiano em sua superfície. As células Tc matam células tumorais e são responsáveis pela rejeição de células transplantadas. As células Tc reconhecem complexos de antígeno-MHC da Classe I em células-alvo, entram em contato com eles, e liberam o conteúdo de grânulos diretamente na membrana da célula-alvo, o que lisa a célula.
Uma segunda categoria de células T consiste nas células T helper ou linfócito Th (células T CD4 + ) , que produzem linfocinas que são fatores "auxiliares" na maturação de células B em células plasmãticas secretoras de anticorpos. As células Th também produzem certas linfocinas que estimulam a diferenciação de linfócitos T efetores e a atividade de macrófagos. As células Thl reconhecem antigeno em macrófagos em associação com MHC da Classe II e se tomam ativadas (por IL-1) , para a produção de linfocinas, incluindo o IFN-γ que ativa macrófagos e células NK. Essas células medeiam vários aspectos da resposta da imunidade mediada por células, incluindo reações de
hipersensibilidade do tipo retardada. As células Th2 reconhecem antigeno em associação com MHC da Classe II em uma célula de apresentação de antigeno ou APC (por exemplo, macrófagos migratórios e células dendríticas), e depois produzem interleucinas e outras substâncias que estimulam a proliferação e a atividade específicas de células B e de células T.
Além de servirem como APCs que iniciam interações, desenvolvimento e proliferação de células T, os macrófagos estão envolvidos na expressão da imunidade mediada por células, pois se tornam ativados por IFN-γ produzido em uma resposta imune mediada por células. Macrófagos ativados possuem um potencial fagocítico aumentado e liberam substâncias solúveis que causam inflamação e destroem muitas bactérias e outras células. Células natural killer são células citotóxicas que lisam células que abrigam novos antígenos, independentemente do seu tipo de MHC, e lisam até mesmo algumas células que não abrigam proteínas MHC. Células T natural killer, ou células NK, são definidas por sua habilidade para matar células que exibem um antígeno estranho (por exemplo, células tumorais), independentemente do tipo de MHC, e independentemente de sensibilização (exposição) prévia ao antígeno. As células NK podem ser ativadas por IL-2 e IFN-γ, e lisam células da mesma forma que os Iinfócitos T citotóxicos. Algumas células NK possuem receptores para o domínio Fc do anticorpo IgG (por exemplo, CD16 ou FcyRIII) e são, portanto, capazes de se ligar à porção Fc de IgG na superfície de uma célula-alvo e liberar componentes citolíticos que matam a célula-alvo por meio de citotoxicidade dependente de anticorpos mediada por células.
Outro grupo de células é formado pelos granulócitos ou leucócitos polimorfonucleares (PMNs). Neutrófilos, um tipo de PMN, matam invasores bacterianos e fagocitam seus restos. Os eosinófilos são outro tipo de PMN, e contêm grânulos que se mostram citotóxicos quando liberados sobre outra célula, por exemplo, uma célula estranha. Basófilos, um terceiro tipo de PMN, são mediadores significativos de respostas fisiológicas poderosas (por exemplo, inflamação) que exercem seus efeitos por liberação de diversos compostos biologicamente ativos, por exemplo, histamina, serotonina, prostaglandinas e leucotrienos. Comum a todos esses tipos de células é a capacidade de exercer um efeito fisiológico dentro de um organismo, freqüentemente por morte e, opcionalmente, remoção, de composições deletérias como, por exemplo, células estranhas.
Embora diversas células mamíferas, incluindo células do sistema imunológico, sejam capazes de exercer diretamente um efeito fisiológico (por exemplo, morte da célula, tipificada por Tc, NK, alguns PMNs, macrófagos, e semelhantes), outras células contribuem indiretamente para um efeito fisiológico. Por exemplo, a apresentação inicial de um antígeno a uma célula T virgem (naive) do sistema imunológico exige a apresentação de MHC que comanda o contato célula-célula. Além disso, freqüentemente há necessidade de um contato entre uma célula T ativada e uma célula B antigeno-especifica para que se obtenha uma resposta imunogênica em particular. Uma terceira forma de contato célula-célula freqüentemente observada em respostas imunes é o contato entre uma célula B ativada e células dendriticas foliculares. Cada uma dessas exigências de contato célula-célula complica o direcionamento de um agente ativo biologicamente a certo alvo.
Acredita-se que a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) seja um mecanismo significativo para a depuração de células-alvo específicas como, por exemplo, células tumorais. CDC é uma série de eventos que consiste em uma coleção de enzimas que se tomam ativadas umas pelas outras em cascata. 0 complemento possui um papel importante na depuração de antígenos, obtida por suas quatro funções principais: (1) vasodilatação local; (2) atração de células imunes, especialmente fagócitos (quimiotaxia); (3) marcação de organismos estranhos para fagocitose (opsonização); e (4) destruição de organismos invasores pelo complexo de ataque â membrana (ataque MAC) . A molécula central é a proteína C3 . Ela é uma enzima que é dividida em dois fragmentos por componentes da via clássica ou da via alternativa. A via clássica é induzida por anticorpos, especialmente IgG e IgM, enquanto a via alternativa é estimulada de forma inespecífica por produtos bacterianos como, por exemplo, lipopolissacarídeos (LPS). Resumidamente, os produtos da divisão de C3 incluem um pequeno peptídeo C3a que é quimiotãtico para células imunes fagocíticas e resulta em vasodilatação local ao causarem a liberação do fragmento C5a por C5. A outra parte de C3, C3b, reveste antigenos na superfície de organismos estranhos e atua para opsonizar o organismo para destruição. C3b também reage com outros componentes do sistema complemento para formar uma MAC que consiste em C5b, C6, Cll C8 e C9.
Há problemas associados ao uso de anticorpos em terapia humana, já que a resposta do sistema imunológico a qualquer antígeno, até mesmo o mais simples, é "policlonal", ou seja, o sistema fabrica anticorpos de uma ampla gama de estruturas, tanto em suas regiões de ligação quanto em suas regiões efetoras.
Foram usadas duas abordagens em uma tentativa de reduzir o problema de anticorpos imunogênicos. A primeira é produção de anticorpos quiméricos nos quais a parte de ligação de antígeno (regiões variáveis) de um anticorpo monoclonal de camundongo é fundida à parte efetora (região constante) de um anticorpo humano. Em uma segunda abordagem, foram alterados anticorpos por meio de uma técnica conhecida como enxerto de região determinante de complementaridade (CDR) ou "humanização". Esse processo foi ainda aprimorado para incluir alterações, sendo denominado "remodelagem" (^reshaping") (Verhoeyen, e cols., 1988 Science 239: 1.534-1.536; Riechmann, e cols., 1988 Nature 332: 323-337; Tempest, e cols., Bio/Technol. 1991 9: 266- 271), "hiper-quimerização" (Queeni e cols., 1989 Proc. Natl. Acad. Scí. U.S.A. 86: 10.029-10.033; Co, e cols., 1991 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 2.869-2.873 ; Col e cols., 1992 J. Immunol. 148: 1.14 9-1.154), e ^veneerin9" (Mark, e cols., Em: Metcalf B.W., Dalton B.J., eds . "Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential". Nova York: Plenum Press, 1994: 291-312).
Uma média de menos de um anticorpo terapêutico por ano foi introduzida no mercado, começando em 1986, onze anos após a publicação de anticorpos monoclonais. Foram introduzidos cinco anticorpos monoclonais murídeos em medicina humana ao longo de um período de dez anos, de 1986 a 1995, incluindo "muromonab-CD3" (OrthoClone 0KT3®) para rej eição aguda de transplantes de órgãos; "edrecolomab" (Panorex®) para câncer cólon-retal; "odulimomab" (Antilfa®) para rejeição de transplantes; e "ibritumomab" (Zevalin® yiuxetan) para Iinfoma não Hodgkin. Adicionalmente, um Fab monoclonal, "abeiximab" (ReoPro®), foi comercializado para a prevenção de re-oclusão da artéria coronãria. Três anticorpos monoclonais quiméricos também foram lançados: "rituximab" (Rituxan®), para o tratamento de linfomas de células B; "basiliximab" (Simulect®), para rejeição de transplantes; e "infliximab" (Remicade®), para o tratamento de artrite reumatóide e doença de Crohn. Adicionalmente, "abeiximab" (ReoPro®), um fragmento Fab de 47,6 kD de um anticorpo monoclonal quimérico humano-murídeo, é comercializado como um auxiliar na intervenção coronãria percutânea para a prevenção de complicações cardíacas isquêmicas em pacientes submetidos a intervenção coronãria percutânea. Finalmente, foram lançados sete "anticorpos monoclonais humanizados". «Daclizumab» (Zenapax®) é usado para evitar a rejeição aguda de rins transplantados; "palivizumab" (Synagis®) para RSV; "trastuzumab" (Herceptin®) se liga a HER-2, um receptor de fator de crescimento encontrado em células de cânceres e mama; "gemtuzumab" (Mylotarg®) para leucemia mielógena aguda (AML); e "alemtuzumab" (MabCampath®) para leucemia linfocítica crônica; "adalimumab" (Humira® (D2E7)) para o tratamento de artrite reumatóide; e "omalizumab" (Xolair®) para o tratamento de asma persistente.
Dessa forma, várias tecnologias de anticorpos receberam atenção no esforço de desenvolver e comercializar substâncias terapêuticas e paliativos eficazes. Infelizmente, problemas continuam a comprometer a promessa de cada uma dessas terapias. Por exemplo, a maioria dos pacientes com câncer tratados com rituximab apresenta recidiva, geralmente em até cerca de 6-12 meses, e foram relatadas reações fatais à infusão em até 24 horas após a infusão de rituximab. Insuficiência renal aguda necessitando de diálise com casos de resultado fatal também foi relatada em tratamentos com rituximab, bem como reações mucocutâneas graves, ocasionalmente fatais. Adicionalmente, são necessárias doses elevadas de rituximab para injeção intravenosa, pois a molécula é grande, de aproximadamente 150 kDa, e a difusão nos tecidos linfóides, onde muitas células tumorais podem residir, é limitada.
A administração de trastuzumab pode resultar no desenvolvimento de disfunção ventricular, insuficiência cardíaca congestiva, e reações de hipersensibilidade graves (incluindo anafilaxia), reações à infusão e eventos pulmonares. A terapia imunossupressora com daclizumab está
associada a um risco aumentado para o desenvolvimento de
distúrbios Iinfoproliferativos e infecções oportunísticas.
A morte por insuficiência hepática, que surge em
decorrência da grave hepatotoxicidade e de doença veno-
oclusiva (VOD), foi relatada em pacientes que receberam gemtuzumab.
A hepatotoxicidade também foi relatada em pacientes que recebem alemtuzumab. Ocorreram casos de pancitopenia/hipoplasia da medula, trombocitopenia autoimune idiopática e anemia hemolítica autoimune sérios e, em alguns casos, raros, fatais, em pacientes que recebem a terapia com alemtuzumab. Alemtuzumab também pode causar reações sérias à infusão, além de infecções oportunísticas. Em pacientes tratados com adalimumab, foram relatadas infecções sérias e sépsis, incluindo casos fatais, bem como a exacerbação de sintomas clínicos e/ou evidências radiogrãficas de doenças desmielinizantes, e pacientes tratados com adalimumab em experimentos clínicos apresentaram uma incidência maior de linfoma do que a taxa esperada na população geral. Omalizumab supostamente induz malignidades e anafilaxia.
0 câncer inclui uma ampla gama de doenças, que afetam aproximadamente um em quatro indivíduos em todo o mundo. A proliferação rápida e desregulada de células malignas é a característica fundamental de muitos tipos de câncer, incluindo malignidades hematológicas. Embora os pacientes com uma condição maligna hematológica tenham se beneficiado dos avanços na terapia do câncer nas últimas duas décadas (Multani e cols., 1998 J. Clin. Oncology 16: 3.691-3.710) e O
os tempos de remissão tenham aumentado, a maioria dos
pacientes ainda apresenta recidivas e sucumbe à sua doença.
Barreiras à cura com fármacos citotóxicos incluem, por
exemplo, resistência da célula tumoral e a alta toxicidade
da quimioterapia, o que evita uma dosagem ótima em muitos pacientes.
Foi relatado que o tratamento de pacientes com linfoma
de células B de grau baixo ou folicular com o uso de um
anticorpo monoclonal quimérico CD20 induz respostas
parciais ou completas nos pacientes (McLaughlin e cols.,
1996 Blood 88:90a (resumo, supl. 1); Maloney e cols., 1997
BlOOd 90: 2.188-95). No entanto, como observado acima, a
recidiva do tumor comumente ocorre em até seis meses a um
ano. São necessários avanços adicionais na soroterapia para
induzir respostas mais duráveis, por exemplo, no linfoma de
células B de grau baixo, e para permitir um tratamento
eficaz de linfoma de grau elevado e de outras doenças de células B.
Outra abordagem tem sido o direcionamento de radioisõtopos aos linfomas de células B com o uso de anticorpos monoclonais específicos para CD20. Embora a eficácia da terapia seja supostamente aumentada, a toxicidade associada decorrente da meia-vida in vivo longa do anticorpo radioativo aumenta, algumas vezes exigindo que o paciente seja submetido ao resgate de células-tronco (Press e cols., 1993 N. En9. J. Med. 329: 1.219-1.224; Kaminski e cols., 1993 N. En9. j. Med. 329: 459-65). Anticorpos monoclonais para CD20 também foram clivados com proteases para a geração de fragmentos Ffab-J2 ou Fab, antes da adesão do radioisótopo. Hã relatos de que isso aumenta a penetração do conjugado de radioisótopo no tumor e encurta a meia-vida in vivo, reduzindo, dessa forma, a toxicidade para os tecidos normais. No entanto, essas moléculas não possuem funções efetoras, que incluem fixação de complemento e/ou ADCC.
Doenças autoimunes incluem doenças tireoidianas autoimunes, que incluem doença de Graves e tireoidite de Hashimoto. Somente nos Estados Unidos, há cerca de 20 milhões de pessoas que possuem alguma forma de doença tireoidiana autoimune. A doença tireoidiana autoimune decorre da produção de auto-anticorpos que estimulam a tireóide, causando hipertireoidismo (doença de Graves), ou destroem a tireóide, causando hipotireoidismo (tireoidite de Hashimoto). A estimulação da tireóide é causada por auto-anticorpos que se ligam e ativam a tireóide, estimulando o receptor de hormônio (TSH). A destruição da tireóide é causada por auto-anticorpos que reagem com outros antigenos da tireóide. O tratamento atual para a doença de Graves inclui cirurgia, terapia com iodo radioativo ou fãrmaco antitireoidiano. O iodo radioativo é amplamente usado, uma vez que as medicações antitireoidianas possuem efeitos colaterais significativos e a recorrência da doença é elevada. A cirurgia é reservada para pacientes com grandes bócios ou quando hã necessidade de uma normalização muito rápida da função tireoidiana. Não há tratamentos direcionados à produção de auto-anticorpos responsáveis pela estimulação do receptor de TSH. O tratamento atual para a tireoidite de Hashimoto é levotiroxina sódica, e provavelmente o tratamento é feito por toda a vida, por causa da baixa probabilidade de remissão. A terapia supressiva demonstrou que diminui os bócios na tireoidite de Hashimoto, mas não são conhecidas terapias que reduzam a produção de auto-anticorpos para atacar o mecanismo da doença.
A artrite reumatóide (RA) é uma doença crônica caracterizada por inflamação das articulações, que causa edema, dor e perda de função. Estima-se que a RA afete 2,5 milhões de pessoas nos Estados Unidos. A RA é causada por uma combinação de eventos, que incluem uma infecção ou lesão inicial, uma resposta imune anormal e fatores genéticos. Embora células T e células B auto-reativas estejam presentes na RA, a detecção de níveis elevados de um anticorpo que se acumula nas articulações, denominado fator reumatóide, é usada no diagnóstico de RA. 0 tratamento atual pra RA inclui muitas medicações para reduzir da dor e tornar mais lenta a progressão da doença. Não foi encontrada nenhuma terapia que possa curar a doença. As medicações incluem fãrmacos antiinflamatórios não esteróides (NSAIDS) e fãrmacos anti-reumãticos modificadores da doença (DMARDS). NSAIDS são úteis na doença benigna, mas não conseguem evitar a progressão até a destruição da articulação e debilidade na RA grave. Tanto NSAIDS quanto DMARDS estão associados a efeitos colaterais significativos. Apenas um novo DMARD, Leflunomida, foi aprovado em mais de 10 anos. A Leflunomida bloqueia a produção de auto-anticorpos, reduz a inflamação e torna mais lenta a progressão da RA. No entanto, esse fãrmaco também causa efeitos colaterais graves que incluem náuseas, diarréia, perda de cabelo, erupções e lesão hepática.
O Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLE) é uma doença autoimune causada por lesões recorrentes dos vasos
sangüíneos em vários órgãos, que incluem os rins, a pele e
as articulações. Estima-se que o SLE afete mais de 500.000
pessoas nos Estados Unidos. Em pacientes com SLE, uma
interação defeituosa entre células T e células B causa a
produção de auto-anticorpos que atacam o núcleo das
células. Esses incluem anticorpos anti-DNA de fita dupla e
anti-Sm. Auto-anticorpos que se ligam aos fosfolipideos
também são encontrados em aproximadamente metade dos
pacientes com SLE, e são responsáveis pela lesão dos vasos
sangüíneos e contagens sangüíneas baixas. Complexos imunes
se acumulam nos rins, vasos sangüíneos e articulações de
pacientes com SLE, onde causam inflamação e lesão tecidual.
Nenhum tratamento para o SLE comprovadamente cura a doença.
NSAIDS e DMARDS são usados para o tratamento, dependendo da
gravidade da doença. A plasmaferese com troca de plasma
para a remoção de auto-anticorpos pode causar a melhora
temporária em pacientes com SLE. Há uma concordância geral
de que os auto-anticorpos são responsáveis pelo SLE e,
portanto, novas terapias que eliminem a linhagem de células
B, permitindo que o sistema imunolõgico seja reinicializado
à medida que novas células B são geradas a partir de
precursores, dariam esperança de um benefício duradouro em pacientes com SLE.
A síndrome de Sjõgren é uma doença autoimune
caracterizada por destruição das glândulas produtoras de umidade do corpo. A síndrome de Sjõgren é um dos distúrbios autoimunes mais prevalentes, estimando-se que atinja até 4 milhões de pessoas noS Estados Unidos. Aproximadamente 0 metade das pessoas que sofrem com a síndrome de Sjõgren também tem uma doença do tecido conjuntivo, por exemplo, RA, enquanto a outra metade possui síndrome de Sjõgren primária, sem outra doença autoimune concomitante. Auto- anticorpos, incluindo anticorpos antinucleares, fator reumatõide, anti-fodrina e anti-receptor muscarínico estão freqüentemente presentes em pacientes com síndrome de Sjõgren. 0 tratamento convencional inclui corticosterõides, e terapias adicionais mais eficazes seriam benéficas.
A púrpura trombocitopênica imune (ITP) é causada por auto-anticorpos que se ligam às plaquetas sangüíneas e causam sua destruição. Alguns casos de ITP são causados por fãrmacos, e outros estão associados â infecção, gravidez ou doença autoimune como, por exemplo, SLE. Aproximadamente metade de todos os casos é classificada como sendo de origem idiopãtica. 0 tratamento de ITP é determinado pela gravidade dos sintomas. Em alguns casos, não é necessário tratamento, embora na maioria dos casos sejam usados fármacos imunossupressores, incluindo corticosterõides ou infusões intravenosas de imunoglobulina para a eliminação de células T. Outro tratamento que normalmente resulta em um número aumentado de plaquetas é a remoção do baço, o órgão que destrói plaquetas cobertas com anticorpos. Fãrmacos imunossupressores mais potentes, incluindo ciclosporina, ciclofosfamida ou azatioprina, são usados para pacientes com casos graves. A remoção de auto- anticorpos por passagem do plasma dos pacientes sobre uma coluna de Proteína A é usada como tratamento de segunda linha em pacientes com doença grave. São necessárias terapias adicionais mais eficazes.
A esclerose múltipla (MS) também é uma doença autoimune. Ela é caracterizada por inflamação do sistema nervoso central e destruição de mielina, que isola as fibras das células nervosas no cérebro, medula vertebral e no corpo. Embora a causa da MS seja desconhecida, é amplamente aceito que células T autoimunes sejam contribuintes primários para a patogênese da doença. No entanto, níveis elevados de anticorpos estão presentes no líquido cefalorraquidiano de pacientes com MS, e alguns prevêem que a resposta de células B que leva ã produção de anticorpos seja importante para a mediação da doença. Não foi estudada nenhuma terapia de eliminação de células B em pacientes com MS, e não hã cura para MS. O tratamento atual consiste em corticosteróides, que podem reduzir a duração e a gravidade dos ataques, mas não afetam a evolução da MS ao longo do tempo. Foi aprovada recentemente uma nova biotecnologia para terapias com interferon (IFN) para a MS, mas são necessárias terapias adicionais mais eficazes.
A miastenia gravis (MG) é um distúrbio neuromuscular autoimune crônico que é caracterizado por fraqueza dos grupos musculares voluntários. MG afeta cerca de 40.000 pessoas nos Estados Unidos. A MG é causada por auto- anticorpos que se ligam aos receptores de acetilcolina expressos nas junções neuromusculares. Os auto-anticorpos reduzem ou bloqueiam os receptores de acetilcolina, evitando a transmissão de sinais dos nervos para os músculos. Não hã cura para a MG. Os tratamentos comuns incluem imunossupressão com corticosteróides, ciclosporina, ciclofosfamida ou azatioprina. A remoção cirúrgica do timo é usada freqüentemente para embotar a resposta autoimune. A plasmaferese, usada para reduzir os níveis de auto- 15
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anticorpos no sangue, é eficaz na MG, mas possui curta duração, na medida em gue a produção de auto-anticorpos continua. Λ Plasmaferese β normalmente reservada para
fraqueza muscular grave anfpq Hi=
' da cirurgia. Seriam
> benéficas terapiaS novas e eficazeS.
A psoríase afeta aproximadamente cinco milhões de pessoas, e é caracterizada por inflamação autoimune na pele. A psoríase também está associada à artrite em 30* (artrite psoriática,. Muitos tratamentos foram usados, incluindo esterõides, retinõides com Iuz αν, derivados da vitamina D, ciclosporina e metotrexato, mas fica evidente que a psoriase seria beneficiada por terapias novas e eficazes. A esolerodermia é uma doença autoimune crônica do tecido conjuntivo que também é conhecida como esclerose sistêmica. A esolerodermia é caracterizada por uma superprodução de colágeno, causando um espessamento da pele, e aproximadamente 300.000 pessoas nos Estados Unidos possuem esolerodermia, que também seria beneficiada por terapias novas e eficazes.
Fica evidente a partir da discussão apresentada
anteriormente a necessidade de composições e métodos
aprimorados para tratar, atenuar ou evitar diversas
doenças, distürbios e condições, incluindo câncer e doenças autoimunes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção satisfaz pelo menos uma das necessidades mencionadas anteriormente na técnica pelo fornecimento de proteínas que contêm pelo menos dois domínios de ligação específicos, em que aqueles dois domínios estão ligados por uma sub-região constante derivada de uma molécula de anticorpo anexada em seu terminal C a um ligante aqui denominado um ligante scorpion, e ácidos nucléicos que codificam essas proteínas, além da produção, usos diagnósticos e terapêuticos de tais proteínas e ácidos nucléicos. A sub-região constante compreende um domínio derivado de um domínio CH2 de imunoglobulina e, de preferência, um domínio derivado de um domínio CH3 de imunoglobulina, mas não contém um domínio ou região derivada de, ou que corresponde a, um domínio CHi de imunoglobulina. Previamente, acreditava-se que a colocação de uma região constante derivada de um anticorpo no interior de uma proteína interferiria com a função do anticorpo, por exemplo, com a função efetora, por analogia com a colocação convencional de regiões constantes de anticorpos nos terminais carbóxi de cadeias de anticorpos. Além disso, a colocação de um ligante scorpion, que pode ser um peptídeo semelhante à dobradiça de imunoglobulina (dobradiça-like), no terminal C a uma sub-região constante é uma organização que difere da organização de imunoglobulinas de ocorrência natural. A colocação de uma sub-região constante (com um ligante scorpion anexado no terminal C da região constante) no interior de uma cadeia de polipeptídeos ou proteínas de acordo com a invenção, no entanto, resultou em proteínas que exibem função efetora e capacidades de ligação multivalente {mono- ou multiespecífica) relativamente desimpedidas por
impedimentos estéricos. Como ficará evidente para aqueles habilitados na técnica considerando-se a presente apresentação, essas proteínas possuem um design modular e podem ser construídas por seleção de qualquer um entre diversos domínios de ligação para o domínio de ligação 1 ou domínio de ligação 2 (ou para quaisquer domínios de ligação adicionais encontrados em uma proteína em particular de acordo com a invenção), por seleção de uma sub-região constante que possui função efetora e por seleção de um ligante Scorpionl semelhante ou não à dobradiça {por exemplo, peptídeos da região peduncular do receptor de lectina C do tipo II), com a proteína exibindo uma organização geral do domínio de ligação I-N-sub-região constante-ligante scorpion-domínio de ligação 2-C. Aqueles habilitados na técnica observarão ainda que proteínas com uma estrutura desse tipo, e os ácidos nucléicos que codificam essas proteínas, terão uma ampla variedade de aplicações, incluindo aplicações médicas e veterinárias.
Um aspecto da invenção é dirigido a uma proteína de ligação multivalente de cadeia simples com função efetora, ou scorpion (os termos são aqui utilizados de forma intercambiável), que compreende um primeiro domínio de ligação derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo) ou uma molécula imunoglobulina-liJce, uma sub- região constante que fornece uma função efetora, uma sub- região constante localizada no terminal C em relação ao primeiro domínio de ligação; um ligante scorpion localizado no terminal C em relação à sub-região constante; e um segundo domínio de ligação derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo) ou molécula imunoglobulina- Iikel localizado no terminal C em relação ã sub-região constante; localizando, dessa forma, a sub-região constante entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação. A proteína de ligação de cadeia simples pode ser multiespecífica, por exemplo, biespecífica, na medida em que se ligaria a dois ou mais alvos distintos, ou ela pode ser monoespecífica, com dois sitios de ligação para o mesmo alvo. Além disso, todos os domínios da proteína são encontrados em uma única cadeia, mas a proteína pode formar homo-multímeros, por exemplo, por formação de ligação dissulfeto intercadeias. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação e/ou o segundo domínio de ligação é/são derivado(s) de regiões variáveis de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina, da mesma imunoglobulina ou de imunoglobulinas diferentes (por exemplo, anticorpos). A(s) imunoglobulina(s) pode ser de qualquer vertebrado, por exemplo, um mamífero, incluindo um ser humano, e pode ser quimérica, humanizada, fragmentos, variantes ou derivados de imunoglobulinas de ocorrência natural.
A invenção contempla proteínas nas quais o primeiro e o segundo domínios de ligação são derivados da mesma imunoglobulina ou de imunoglobulinas diferentes (por exemplo, anticorpos), e nas quais o primeiro e o segundo domínios de ligação reconhecem o mesmo alvo molecular ou alvos moleculares diferentes (por exemplo, marcadores da superfície celular, por exemplo, proteínas ligadas à membrana). Além disso, o primeiro e o segundo domínios de ligação podem reconhecer o mesmo epitopo ou epitopos diferentes. 0 primeiro e o segundo alvos moleculares podem estar associados à primeira e à segunda células-alvo, vírus, veículos e/ou objetos. Em modalidades preferidas de acordo com esse aspecto da invenção, cada primeiro domínio de ligação, segundo domínio de ligação e sub-região constante é derivado de uma imunoglobulina humana, por exemplo, um anticorpo IgG. Ainda em outras modalidades, a proteína de ligação multivalente com função efetora possui pelo menos um entre o primeiro dominio de ligação e o segundo dominio de ligação que reconhece pelo menos um alvo molecular sem células, por exemplo, uma proteína não associada a uma célula, por exemplo, uma proteína depositada ou uma proteína solúvel. Alvos moleculares sem células incluem, por exemplo, proteínas que nunca estiveram associadas a uma célula, por exemplo, compostos administrados como, por exemplo, proteínas, além de proteínas que são secretadas, clivadas, presentes em exossomos, ou de algum outro modo descarregadas ou
separadas de uma célula.
As moléculas-alvo reconhecidas pelos primeiros e segundos domínios de ligação podem ser encontradas em, ou em associação com, células procarióticas, células eucarióticas, vírus (incluindo bacteriófago), veículos orgânicos ou inorgânicos de moléculas-alvo, e objetos estranhos iguais ou diferentes. Além disso, essas moléculas-alvo podem estar em células, vírus, veículos ou objetos fisicamente distintos do mesmo tipo (por exemplo, duas células eucarióticas, células procarióticas, vírus ou veículos distintos), ou essas moléculas-alvo podem estar em células, vírus, veículos ou obj etos que diferem no tipo (por exemplo, uma célula eucariótica e um vírus). Células- alvo são aquelas células associadas a uma molécula-alvo reconhecida por um domínio de ligação, e incluem células endógenas ou autólogas, além de células exógenas ou estranhas (por exemplo, células microbianas infecciosas, células mamíferas transplantadas, incluindo células sangüíneas transfundidas). A invenção compreende alvos para o primeiro e/ou o segundo domínios de ligação que sejam encontrados na superfície de uma(s) célula(s)-alvo associada(s) a uma doença, distúrbio ou condição de um mamífero, por exemplo, um ser humano. Células-alvo exemplares incluem uma célula cancerígena, uma célula associada a uma doença ou distúrbio autoimune, e uma célula infecciosa (por exemplo, uma bactéria infecciosa). Uma célula de um organismo infeccioso, por exemplo, um parasita de mamífero, também é contemplada como uma célula-alvo. Em algumas modalidades, uma proteína da invenção é a proteína de ligação multivalente (por exemplo, multiespecífica) com função efetora, em que pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhece um alvo selecionado do grupo que consiste em um antígeno tumoral, um alvo de célula B, um membro da superfamília dos receptores de TNF, um membro da família Hedgehog, uma tirosina quinase receptora, uma molécula relacionada ao proteoglicano, um membro da superfamília TGF-beta, uma molécula relacionada a Wnti um ligante de receptor, um alvo de célula T, um alvo de célula dendrítica, um alvo de célula NK, um alvo celular de monócito/macrófago e um alvo
de angiogênese.
Em algumas modalidades da proteína descrita acima, o antígeno tumoral é selecionado do grupo que consiste em antígeno 1 do carcinoma de células escamosas (SCCA-I), (proteína T4-A), antígeno 2 do carcinoma de células escamosas (SCCA-2), antígeno do carcinoma ovariano CA125 (1A1-3B) (KIAAO049) , mucina 1 (mucina associada a tumor) , (mucina associada ao carcinoma), (mucina epitelial polimórfica), (PEM), (PEMT), (EPISIALINA), (antígeno da membrana epitelial associado a tumor), (EMA), (H23AG), (mucina urinãria reativa ao amendoim), (PUM), (antígeno DF3 associado ao carcinoma de mama), antígeno tumoral CTCL sel- 1, antígeno tumoral CTCL sel4- 3, antígeno tumoral CTCL se20-4, antígeno tumoral CTCL se20-9, antígeno tumoral CTCL se33-1, antígeno tumoral CTCL se37-2, antígeno tumoral CTCL se57-1, antígeno tumoral CTCL se89-l, antígeno da membrana específico da próstata, glicoproteína oncofetal do trofoblasto 5T4, herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi Orf73, MAGE-Cl (antígeno de câncer/testículo CT7), antígeno MAGE-Bl (antígeno MAGE-XP) (DAM 10) , antígeno MAGE-B2 (DAM6) , antígeno MAGE- 2, antígeno MAGE-4a, antígeno MAGE- 4b, antígeno do câncer de cólon NY-CO-45, antígeno do câncer de pulmão NY-LU-12 variante A, antígeno de superfície associado ao câncer, antígeno do adenocarcinoma ARTl, antígeno paraneoplãsico associado ao câncer cerebral- testicular {antígeno onconeuronal MA2; antígeno neuronal paraneoplãsico), antígeno ventral neuro-oncológico 2 (N0VA2), gene do antígeno do carcinoma hepatocelular 520, antígeno tumor-associado C0-029, antígeno tumor-associado MAGE-X2, sarcoma sinovial, X breakpoint 2, antígeno do carcinoma de células escamosas reconhecido por célula T1 antígeno do câncer de cólon definido sorologicamente 1, antígeno do câncer de mama definido sorologicamente NY-BR- 15, antígeno do câncer de mama definido sorologicamente NY- BR-16, cromogranina A; proteína secretora da paratireóide
1, DUPAN-2, CA 19-9, CA 72-4, CA 195 e L6.
Modalidades do método descrito acima compreendem um alvo de célula B selecionado do grupo que consiste em CDlO, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24 , CD37, CD38, CD39, CD40, CD7 2, CD7 3, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD78, CD79a/b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD89, CD98, CD126, CD12 7, CDwl3O, CD138 e CDwl50.
Em outras modalidades do método descrito acima, o membro da superfamilia dos receptores de TNF é selecionado do grupo que consiste em 4 -IBB/TNFRSF9, NGF R/TNFRSF16, BAFF R/TNFRSF13C, osteoprotegerina/TNFRSFUB,
BCMA/TNFRSF17, OX4 0/TNFRSF4, CD2 7/TNFRSF7, RANK/TNFRSFllAi CD3 0/TNFRSF8, RELT/TNFRSF19L, CD4 0/TNFRSF5, TACI/TNFRSF13B, DcR3/TNFRSF6B, TNF RI/TNFRS FlA, DcTRAIL R1/TNFRSF23, TNF RIFTNFRSF1B, DcTRAIL R2/TNFRSF22, TRAIL Rl/TNFRSFlOAi DR3/TNFRSF2 5, TRAIL R2/TNFRSFlOB, DR6/TNFRSF21, TRAIL R3/TNFRSF10C, EDAR, TRAIL R4/TNFRSFlOD, Fas/TNFRSF6, TROY/TNFRSF19, GITR/TNFRSF18, TWEAK R/TNFRSF12,
HVEM/TNFRSF14, XEDAR, linfotoxina beta R/TNFRSF3, ligante de 4 -1BB/TNFSF9, linfotoxina, APRIL/TNFSF13, linfotoxina beta/TNFSF3, BAFF/TNFSF13C, ligante de 0X40/TNFSF4, ligante de CD27/TNFSF7, TL1A/TNFSF15, ligante de CD30/TNFSF8, TNF- alfa/TNFSFlA, ligante de CD4 0/TNFSF5, TNF-beta/TNFSFlB, EDA-A2, TRAIL/TNFSFIO, ligante de Fas/TNFSF6,
TRANCE/TNFS Fl1, ligante de GITR/TNFSF18, TWEAK/TNFSFl2 e
LIGHT/TNFSF14.
O método descrito acima também inclui modalidades nas quais o membro da família Hedgehog é selecionado do grupo que consiste em Patched e Smoothened. Ainda em outras modalidades, a molécula relacionada ao proteoglicano é selecionada do grupo que consiste em proteoglicanos e reguladores deste. Modalidades adicionais do método se dirigem a processos nos quais a tirosina quinase receptora é selecionada do grupo que consiste em Axl, FGF R4, Clq Rl/CD93 , FGF R5, DDRli Flt-3, DDR2 , HGF R, Dtki IGF-I R, EGF R, IGF-II Rf Eph, INSRR, EphAl, Insulina R/CD220, EphA2, M-CSF Rf EphA3, Merf EphA4, MSP R/Ron, EphA5, MuSK, EphA6, PDGF R alfa, EphA7, PDGF R beta, EphAS, Ret, EphBl, RORl, EphB2, ROR2, EphB3, SCF R/c-kit, EphB4, Tie-If EphB6, Tie-2, ErbB2, TrkA, ErbB3, TrkB, ErbB4, TrkC, FGF Rli VEGF Rl/Flt-1, FGF R2, VEGF R2/Flk-1, FGF R3 e VEGF R3/Flt-4.
Em outras modalidades do método, membro da superfamília do fator de transformação de crescimento (TGF)-beta é selecionado do grupo que consiste em Activina RIA/ALK-2, GFR alfa-1, Activina RIB/ALK-4, GFR alfa-2, Activina RUA, GFR alfa-3, Activina RIIBi GFR alfa-4, ALK- 1, MIS RHi ALK-7, Ret, BMPR-IA/ALK-3, TGF-beta Rl/ALK-5, BMPR-IB/ALK-6, TGF-beta RH, BMPR-II, TGF-beta RHb,
Endoglina/CD105 e TGF-beta RUI.
Ainda outras modalidades do método compreendem uma molécula relacionada a Wnt selecionada do grupo que consiste em Frizzled-If Frizzled-8, Frizzled-2, Frizzled~9, Frizzled-3, sFRP-1, Frizzled-4, sFRP-2, Frizzled-5, sFRP-3, Frizzled-6, sFRP-4, Frizzled-7, MFRP, LRP 5, LRP 6, Wnt-If Wnt-8a, Wnt-3a, Wnt-IObf Wnt-4, Wnt-Ilf Wnt-5a, Wnt-9a e
Wnt-7a.
Em outras modalidades do método, o ligante de receptor é selecionado do grupo que consiste em ligante de 4- 1BB/TNFSF9, linfotoxina, APRIL/TNFSF13, linfotoxina beta/TNFSF3, BAFF/TNFSF13C, ligante de OX40/TNFSF4, ligante de CD27/TNFSF7, TL1A/TNFSF15, ligante de CD3 0/TNFSF8, TNF- alfa/TNFSFlA, ligante de CD40/TNFSF5, TNF-beta/TNFSF1B, EDA-A2, TRAIL/TNFSF10, ligante de Fas/TNFSF6, TRANCE/TNFSF11, ligante de GITR/TNFSFl8 , TWEAK/TNFSF12 , LIGHT/TNFSFl4, Anfiregulina, NRGl isoforma GGF2 , Betacelulina, NRGl isoforma SMDF, EGF, NRGl-alfa/HRGl-alfa, Epigeni NRGl-beta 1/HRGl-beta 1, Epiregulina, TGF-alfa, HB- EGF, TMEFFl/Tomoregulina-1, Neuregulina-3, TMEFF2, IGF-Ii IGF-II, Insulina, Activina A, Activina B, Aetivina AB, Activina C, BMP-2, BMP-7, BMP-3, BMP-8, BMP-3b/GDF-10, BMP- 9, BMP-4, BMP-15, BMP-5, Decapentaplégico, BMP-6, GDF-I, GDF-8, GDF-3, GDF-9, GDF-5, GDF-11, GDF-6, GDF-15, GDF-7, Artemina, Neurturina, GDNF, Persefina, TGF-beta, TGF-beta 2, TGF-beta 1, TGF-beta 3, LAP (TGF-beta 1), TGF-beta 5, TGF-beta Latente 1, TGF-beta Latente bpl, TGF-beta 1.2, Lefty, Nodal, MIS/AMH, FGF ácido, FGF-12, FGF básico, FGF- 13, FGF-3, FGF-16, FGF-4, FGF-17, FGF-5, FGF-19, FGF-6, FGF-2 O, FGF- 8, FGF-21, FGF-9, FGF-23, FGF-10, KGF/FGF-7, FGF-11, Neuropilina-1, P1GF, Neuropilina-2, P1GF-2, PDGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-B, VEGF-B, PDGF-C, VEGF-C, PDGF-D, VEGF- D e PDGF-AB.
Ainda em outras modalidades, o alvo de célula T é selecionado do grupo que consiste em 2B4/SLAMF4, IL-2 R alfa, 4-IBB/TNFRSF9, IL-2 R beta, ALÇAM, B7-1/CD80, IL-4 R, B7-H3, BLAME/SLAMF8, BTLA, IL-6 R, CCR3, IL-7 R alfa, CCR4, CXCRl/IL-8 RA, CCR5, CCR6, IL-IO R alfa, CCR7, IL-IO R beta, CCR8, IL-12 R beta 1, CCR9, IL-12 R beta 2, CD2, IL- 13 R alfa 1, IL-13, CD3 , CD4, ILT2/CD85j , ILT3/CD85k, ILT4/CD85d, ILT5/CD85a, Integrina alfa 4/CD49d, CD5 , Integrina alfa E/CD103, CD6, Integrina alfa M/CDllb, CD8, Integrina alfa X/CDllc, Integrina beta 2/CD18, KIR/CD158, CD27/TNFRSF7, KIR2DL1, CD28, KIR2DL3, CD3 0/TNFRSF8, KIR2DL4/CD15 8d, CD31/PECAM-I, KIR2DS4, ligante de CD4O/TNFSF5, LAG-3, CD4 3, LAIRl, CD4 5, LAIR2, CD8 3, Leukotriene Β4 RI, CD84/SLAMF5, NCAM-Ll, CD94, NKG2A, CD97, NKG2C, CD229/SLAMF3, NKG2D, CD2F-10/SLAMF9, ΝΤ-4, CD69, NTB-A/SLAMF6, cadeia gama comum/IL-2 R gama, Osteopontinaf CRACC/SLAMF7, PD-I1 CRTAM, PSGL-I, CTLA-4, RANK/TNFRSF11A, CX3CR1, CX3CL1, L-Selectina, CXCR3, SIRP beta 1, CXCR4, SLAM, CXCR6, TCCR/WSX-1, DNAM-1, Timopoietina,
EMMPRIN/CD14 7, TIM-1, EphBS, TIM-2, Fas/TNFRSF6, TIM-3, ligante de Fas/TNFSF6, ΤΙΜ-4, Fc gama RIII/CD16, TIM-6, GITR/TNFRSF18, TNF RI/TNFRS FlA, Granulisina, TNF RII/TNFRSFlB, HVEM/TNFRSF14 , TRAIL R1/TNFRSF1QA, ICAM- 1/CD54, TRAIL R2/TNFRSFlOB, ICAM-2/CD102, TRAIL
R3/TNFRSF10C, IFN-gama Rl, TRAIL R4/TNFRSFIOD, IFN-gama R2,
TSLP, IL-I RI e TSLP R.
Em outras modalidades, ο receptor de célula NK é
selecionado do grupo que consiste em 2B4/SLAMF4, KIR2DS4,
CD155/PVR, KIR3DL1, CD94 , LMIR1/CD300A, CD69, LMIR2/CD300C,
CRACC/SLAMF7, LMIR3/CD30OLF, DNAM-I, LMIR5/CD30OLB, Fc
épsilon RII, LMIR6/CD300LE, Fc gama RI/CD64, MICA, Fc gama
RIIB/CD3 2b, MICB, Fe gama RIIC/CD32c, MULT-1, Fc gama
RIIA/CD32a, Nectina-2/CD112, Fc gama RIII/CD16, NKG2A,
FcRHl/IRTA5, NKG2C, FcRH2/IRTA4, NKG2D, FcRH4/IRTAl, NKp3 0,
FCRH5/IRTA2, NKp44, Receptor Fc-Iike 3/CD16-2, NKp46/NCRl,
NKpSO/KLRFl, NTB-A/SLAMF6, Rae-Il Rae-I alfa, Rae-I beta,
Rae-I delta, H60, Rae-I épsilon, ILT2/CD85j, Rae-I gama,
ILT3/CD85k, TREM-1, ILT4/CD85d, TREM-2, ILT5/CD85a, TREM- 3,
KIR/CD158, TREML1/TLT-1, KIR2DL1, ULBP-1, KIR2DL3, ULBP-2,
KIR2DL4/CD15 8d e ULBP-3.
Em outras modalidades, o alvo celular de monôcito/macrófago é selecionado do grupo que consiste em B7-1/CD80, ILT4/CD85d, B7-H1, ILT5/CD85a, cadeia beta comum, Integrina alfa 4/CD49d, BLAME/SLAMF8, Integrina alfa X/CDllc, CCL6/C10, Integrina beta 2/CD18, CD15 5/PVR, Integrina beta 3/CD61, CD31/PECAM-1, Latexina, CD36/SR-B3, Leucotrieno B4 Rlf CD4 O/TNFRS F 5, LIMPII/SR-B2, CD43, LMIRl/CD3 O OA, CD45, LMIR2/CD3OOc, CD68, LMIR3/CD3 O OLF, CD84/SLAMF5, LMIR5/CD3OOLB, CD97, LMIR6/CD300LE, CD163, LRP-I, CD2F-10/SLAMF9, MARCO, CRACC/SLAMF7, MD-1, ECF-L, MD- 2 , EMMPRIN/CD147, MGL2, Endoglina/CD105,
Osteoactivina/GPNMB, Fc gama RI/CD64, Osteopontina, Fc gama RIIB/CD3 2b, PD-L2, Fe gama RIIC/CD32c, Siglec-3/CD33, Fc gama RIIA/CD32a, SIGNR1/CD209, Fc gama RIII/CD16, SLAM, GM- CSF R alfa, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TLR3, IFN-gama RI, TLR4, IFN-gama R2, TREM-Ii IL-I RH, TREM -2, ILT2/CD85j, TREM-3, ILT3/CD85k, TREMLl/TLT-1, 2B4/SLAMF4, IL-IO R alfa, ALÇAM, IL-IO R beta, Aminopeptidase N/ANPEP, ILT2/CD85j, cadeia beta comum, ILT3/CD85k, Clq R1/CD93, ILT4/CD85d, CCRl, ILT5/CD85a, CCR2, Integrina alfa 4/CD49d, CCR5, Integrina alfa M/CDllb, CCR8, Integrina alfa X/CDllc, CD155/PVR, Integrina beta 2/CD18, CD14, Integrina beta 3/CD61, CD3 6/SR-B3, LAIRli CD43, LAIR2, CD45, Leueotrieno B4 RI, CD6 8, LIMPII/SR-B2, CD84/SLAMF5, LMIRl/CD30OAi CD97, LMIR2/CD3 OOc, CD163, LMIR3/CD3 OOLF, fator da coagulação Ill/fator tecidual, LMIR5/CD300LB, CX3CR1, CX3CL1, LMIR6/CD300LE, CXCR4, LRP-1, CXCR6, M-CSF R, DEP-1/CD148, MD-1, DNAM-1, MD-2, EMMPRIN/CD147, MMRf Endoglina/CD105 , NCAM-Ll, Fe gama RI/CD64, PSGL-1, Fc gama RIII/CD16, RP105, G-CSF R, L-Selectina, GM-CSF R alfa, Siglec-3/CD33, HVEM/TNFRSF14, SLAM, ICAM-1/CD54, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TREM-1, IL-6 R, TREM-2, CXCRl/lL-8 RA, TREM-3 e TREMLl/TLT- Ainda em outras modalidades do método, um alvo de célula dendritica é selecionado do grupo que consiste em CD3 6/SR-B3, LOX-l/SR-El, CD68, MARCO, CD163, SR-AI/MSR, CD5L, SREC-I, CL-P1/C0LEC12, SREC-II, LIMPII/SR-B2, RP105, TLR4, TLRl, TLR5, TLR2, TLR6, TLR3, TLR9, ligante de 4- 1BB/TNFSF9, IL-12/IL- 23 p4 0 , 4-Amino-1,8-naftalimida, ILT2/CD85j, CCL21/SCkine, ILT3/CD85k, 8-oxo-dG, ILT4/CD85d, 8D6A, ILT5/CD8 5a, A2B5, Integrina alfa 4/CD4 9d, Aag, Integrina beta 2/CD18, AMICA, Langerina, B7-2/CD8 6, Leucotrieno B4 RI, B7-H3, LMIR1/CD300A, BLAME/SLAMF8, LMIR2/CD3 OOc, Clq R1/CD93, LMIR3/CD300LF, CCR6,
LMIR5/CD3 0 0LB, CCR7, LMIR6/CD30OLE, CD40/TNFRSF5,
MAG/Siglec-4a, CD43, MCAM, CD45, MD-Ii CD68, MD-2, CD83, MDL-1/CLEC5A, CD84/SLAMF5, MMR, CD97, NCAM-Lli CD2F- 10/SLAMF9, Osteoactivina/GPNMB, Chem 23 , PD-L2, CLEC-I, RPlO 5, CLEC-2, Siglec-2/CD22, CRACC/SLAMF7, Siglec-3/CD33, DC-SIGN, Siglec-5, DC- SIGNR/CD299, Siglec-6, DCAR, Siglec- 7, DCIR/CLEC4A, Siglec-9, DEC-205, Siglec-10, Dectina- 1/CLEC7A, Siglec-Fi Dectina-2/CLEC6A, SIGNR1/CD209, DEP- 1/CD14 8, SIGNR4, DLEC, SLAM, EMMPRIN/CD14 7, TCCR/WSX-1, Fc gama RI/CD64, TLR3, Fc gama RIIB/CD32b, TREM-1, Fc gama RIIC/CD32c, TREM- 2, Fc gama RIIA/CD32a, TREM-3, Fc gama RIII/CDl6, TREMLl/TLT-1, ICAM-2/CD102 e Vanilóide RI.
Ainda em outras modalidades do método, o alvo de angiogênese é selecionado do grupo que consiste em Angiopoietina-1, Angiopoietina-IiJce 2, Angiopoietina-2, Angiopoietina-IiAre 3, Angiopoietina-3, Angiopoietina-Iiice 7/CDT6, Angiopoietina-4, Tie-I, Angiopoietina-Iike 1, Tie- 2, Angiogenina, iNOS, fator da coagulação III/fator tecidual, nNOS, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, DANCEi OSM, EDG-Ii Plfr, EG-VEGF/PK1, Proliferina, Endostatina, ROB04, Eritropoietina, Trombospondina-1, Cininostatina,
Trombospondina-2, MFG-E8, Trombospondina-4, oxido nítrico, VG5Q, eNOS, EphAl7 EphABi EphA2, EphAS, EphA3, EphA7, EphA4, EphA8, EphBl, EphB4, EphB2, EphBSi EphB3, Efrina-Al, Efrina-A4, Efrina-A2, Efrina-A5, Efrina-A3, Efrina-Bl, Efrina-B3, Efrina-B2, FGF ácido, FGF-12, FGF básico, FGF- 13, FGF-3, FGF-16, FGF-4, FGF-17, FGF-5, FGF-19, FGF-6, FGF-2 O, FGF-8, FGF-21, FGF-9, FGF-23, FGF-IO, KGF/FGF-7, FGF-11, FGF RI, FGF R4 , FGF R2, FGF R5, FGF R3, Neuropilina-1, Neuropilina-2, Semaforina 3A, Semaforina 6B, Semaforina 3C, Semaforina 6C, Semaforina 3E, Semaforina 6D, Semaforina 6A, Semaforina 7A, MMP, MMP-Ilf MMP-I, MMP-12, MMP-2, MMP-13, MMP-3, MMP-14, MMP-7, MMP-15, MMP-8, MMP- 16/MT3-MMP, MMP-9, MMP-24/MT5-MMP, MMP-IO, MMP-25/MT6-MMP, TIMP-I, TIMP-3, TIMP-2, TIMP-4, ACE, IL-13 R alfa 1, IL-13, Clq R1/CD93, Integrina alfa 4/CD49d, VE-Caderina, Integrina beta 2/CDl8, CD31/PECAM-1, KLF4, CD36/SR-B3, LYVE-1, CD151, MCAMi CL-Pl/COLECl2, Nectina-2/CD112, fator da coagulação Ill/fator tecidual, E-Selectina, D6, P-Selectina, DC- SIGNR/CD299, SLAM, EMMPRIN/CD147, Tie-2, Endoglina/CD105, TNF RI/TNFRS FlA, EPCR, TNF RIFTNFRSF1B, Eritropoietina R, TRAIL R1/TNFRSF10A, ESAM, TRAIL R2/TNFRSF10B, FABP5, VCAM- 1, ICAM-1/CD54, VEGF R2/Flk-1, ICAM-2/CD102, VEGF R3/Flt-4,
IL-I RI e VG5Q.
Outras modalidades do método fornecem proteínas de ligação multivalentes nas quais pelo menos um entre o domínio de ligação Ieo domínio de ligação 2 se liga especificamente a um alvo selecionado do grupo que consiste em antígeno da membrana especifico para a próstata (folato hidrolase 1) , receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE, também conhecido como receptor de produtos finais de glicosilação avançada ou AGER), IL-17 A, IL-17 F, P19 (IL23A e IL12B) , Dickkopf-I (Dkkl), NOTCH 1, NG2 (sulfato de condroitina proteoglicano 4 ou CSPG4) , IgE (IgHE ou IgH2) , IL-22R (IL22RA1) , IL-21, oligômeros de amilóide β (oligômeros Ab) , proteína precursora do amilóide β (APP), Receptor NOGO (RTN4R), Proteína 5 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP5), IL-4, miostatina (GDF8) , antígeno very late 4, um alfa 4, integrina beta 1 (VLA4 ou ITGA4) , um alfa 4, integrina beta 7 encontrada em leucócitos e IGF-IR. Por exemplo, um alvo de VLA4 pode ser reconhecido por uma proteína de ligação multivalente na qual pelo menos um entre o domínio de ligação Ieo domínio de ligação 2 é um domínio de ligação derivado de
Natalizumab (Antegren).
Em algumas modalidades, a célula cancerígena é uma célula hematopoiética, transformada ou cancerígena. Em algumas dessas modalidades, pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhece um alvo selecionado do grupo que consiste em um alvo de célula B, um alvo de monócito/macrófago, um alvo de célula dendrítica, um alvo de célula NK e um alvo de célula T, cada um como aqui definido. Além disso, pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação pode reconhecer um alvo mielóide, incluindo, sem limitação, CD5, CD10, CDllbl CDllcl CD13, CD14, CD15, CD18, CDl9, CD2 O, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD29, CD30, CD31, CD33, CD34, CD35, CD38, CD43 , CD45, CD64, CD66, CD68, CD70, CD80, CD8 6, CD87, CD88, CD8 9, CD98, CDlOO, CD103, CDlll, CDl12, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120af CD12 Ob, CDwl23, CDwl31, CD141, CD162, CD163, CD177, CD312, IRTAl, IRTA2, IRTA3, IRTA4, IRTA5, Β-Β2, Β-Β8 e receptor de
antlgeno de célula B.
Outras modalidades da invenção se destinam à proteína de ligação multivalente, como aqui descrita, que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 103, 105, 107, 109, 332, 333, 334, e 345. Outras modalidades são dirigidas à proteína de ligação multivalente que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364 e 365.
Em outras modalidades, a proteína de ligação multivalente e multiespecífica com função efetora possui um primeiro domínio de ligação e um segundo domínio de ligação que reconhecem um par de alvos selecionado do grupo que consiste em EPHB4-KDR e TIE-TEK. Nessas modalidades, a proteína possui um primeiro domínio de ligação que reconhece EPHB4 e um segundo domínio de ligação que reconhece KDR, ou um primeiro domínio de ligação que reconhece KDR e um segundo domínio de ligação que reconhece EPHB4. De forma análoga, a proteína pode ter um primeiro domínio de ligação que reconhece TIE e um segundo domínio de ligação que reconhece TEK, ou um primeiro domínio de ligação que reconhece TEK e um segundo domínio de ligação
que reconhece TIE.
Em um aspecto relacionado, a invenção fornece uma
proteína de ligação multivalente com função efetora, em que a sub-região constante reconhece um receptor Fc de célula efetora (por exemplo, FcyRI, FcyRII, FcyRIII, FcaR e FceRI). Em modalidades particulares, a sub-região constante reconhece uma proteína da superfície de uma célula efetora selecionada do grupo que consiste em CD2, CD3, CD16, CD28, CD32, CD40, CD56, CD64, CD89, FceRIi KIR, trombospondina R, NKG2D, 2B4/NAIL e 41BB. A sub-região constante pode compreender um domínio CH2 e um domínio CH3 derivado de imunoglobulinas, isótipos de anticorpos ou variantes alélicas iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, o domínio Ch3 é truncado e compreende uma seqüência do terminal C selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 3 6 6, 367, 368, 369, 370 e 371. De preferencia, o domínio Ch2 e o ligante scorpion são derivados da mesma classe ou da mesma subclasse de imunoglobulina, quando o ligante for um peptídeo dobradiça-lí Jce derivado de uma
imunoglobulina.
Algumas proteínas de acordo com a invenção também são contempladas como ainda compreendendo um ligante scorpion de pelo menos cerca de 5 aminoãcidos anexado à sub-região constante e anexado ao segundo domínio de ligação, localizando, dessa forma, o ligante scorpion entre a sub- região constante e o segundo domínio de ligação. Tipicamente, o comprimento do peptídeo ligante scorpion ê entre 5-45 aminoãcidos. Ligantees scorpion incluem peptídeos dobradiça-Iike derivados de regiões de dobradiça de imunoglobulina, por exemplo, regiões de dobradiça de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgE. De preferência, um ligante scorpion dobradiça-Iike reterá pelo menos uma cisteína capaz de formar uma ligação dissulfeto intercadeias sob condições fisiológicas. Ligantees scorpion derivados de IgGl podem ter uma cisteína ou duas cisteínas, e, de preferência, reterão a cisteina que corresponde a uma cisteína da dobradiça do terminal N de IgGl. Em algumas modalidades, o ligante scorpion é estendido em relação a uma região de dobradiça cognata da imunoglobulina e, em modalidades exemplares, compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 351, 352, 353 e 354. Peptídeos não-dobradiça-líJce também são contemplados como ligantees scorpion, desde que esses peptídeos forneçam espaçamento e flexibilidade suficientes para gerar uma proteína de cadeia simples capaz de formar dois domínios de ligação, um localizado em direção a cada terminal (N e C) da proteína em relação a um domínio da sub-região constante localizado mais centralmente. Ligantees scorpion não-dobradiça-liice exemplares incluem peptídeos da região peduncular de lectinas C do tipo II, por exemplo, as regiões pedunculares de CD69, CD72, CD94, NKG2A e NKG2D. Em algumas modalidades, o ligante scorpion compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos : 373, 374, 375, 376 e 377.
As proteínas também podem compreender um ligante de pelo menos cerca de 5 aminoãcidos anexado à sub-região constante e anexado ao primeiro domínio de ligação, localizando, dessa forma, o ligante entre a sub-região constante e o primeiro domínio de ligação. Em algumas modalidades, os ligantees são encontrados entre a sub- região constante e cada um dos dois domínios de ligação, e esses ligantees podem ser da mesma seqüência ou de uma seqüência diferente, e do mesmo comprimento ou de comprimentos diferentes.
A sub-região constante das proteínas de acordo com a invenção fornece pelo menos uma função efetora. Qualquer função efetora conhecida na técnica como estando associada a uma imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo) é contemplada, por exemplo, uma função efetora selecionada do grupo que consiste em citotoxicidade dependente de anticorpos mediada por células (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC), meia-vida in vivo relativamente prolongada (em relação à mesma molécula desprovida de uma sub-região constante), ligação de FcR, ligação de proteína A, e semelhantes. Em algumas modalidades, as meias-vidas prolongadas de proteínas da invenção são de pelo menos 28 horas em um ser humano. Evidentemente, proteínas destinadas à administração a indivíduos não humanos exibirão meias-vidas relativamente prolongadas naqueIes indiví duo s não humano s, e não necessariamente em seres humanos.
Em geral, as proteínas (incluindo polipeptídeos e peptídeos) da invenção exibem uma afinidade de ligação de menos de ICT9 M, ou pelo menos IO"6 M, para pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação.
Outro aspecto da invenção se dirige a uma composição farmacêutica que compreende uma proteína, como aqui descrita, e um adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Qualquer adjuvante, veículo ou excipiente conhecido na técnica é útil nas composições farmacêuticas da invenção.
Ainda outro aspecto da invenção fornece um método de produção de uma proteína, como descrita acima, que compreende a introdução de um ácido nucléico que codifica a proteína em uma célula hospedeira e a incubação da célula hospedeira sob condições adequadas à expressão da proteína, expressando, dessa forma, a proteína, preferivelmente em um nível de pelo menos 1 mg/litro. Em algumas modalidades, o método ainda compreende o isolamento da proteína por sua separação de pelo menos uma proteína com a qual está associada mediante expressão intracelular. Células hospedeiras adequadas para a expressão dos ácidos nucléicos para a produção das proteínas da invenção incluem, sem limitação, uma célula hospedeira selecionada do grupo que consiste em uma célula VERO, uma célula HeLa, uma célula CHO, uma célula COS, uma célula W138, uma célula BHK, uma célula HepG2, uma célula 3T3, uma célula RN, uma célula MDCKf uma célula A549, uma célula PC12, uma célula K562, uma célula HEK293, uma célula N, uma célula de Spodoptera frugiperda, uma célula de Saccharomyces cerevisiae, uma célula de Pichia pastoris, qualquer uma entre diversas células fúngicas, e qualquer uma entre diversas células bacterianas (incluindo, sem limitação, Eseheriehia eoli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e um
estreptomiceto).
A invenção também fornece um método de produção de um ácido nucléico que codifica a proteína, como descrito acima, que compreende a ligação de forma covalente da extremidade 3' de um polinucleotídeo que codifica um primeiro domínio de ligação derivado da região variável de uma imunoglobulina à extremidade 5' de um polinucleotídeo que codifica uma sub-região constante, ligado de forma covalente à extremidade 5' de um polinucleotídeo que codifica um ligante scorpion à extremidade 3' do polinucleotídeo que codifica a sub-região constante, e ligado de forma covalente à extremidade 5' de um polinucleotídeo que codifica um segundo domínio de ligação derivado da região variável de uma imunoglobulina à extremidade 3' do polinucleotídeo que codifica o ligante scorpion, gerando, dessa forma, um ácido nucléico que codifica uma proteína de ligação multivalente com função efetora. Cada uma dessas regiões codificadoras pode ser separada por uma região codificadora para um ligante ou peptídeo dobradiça -Iiice como parte de uma estrutura de cadeia simples de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, o método produz um polinucleotídeo que codifica um primeiro domínio de ligação que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 2 (região variável anti-CD20, orientada Vl-Vh), ID. DE SEQ. N0 : 4 (região variável anti-CD28, orientada Vl-Vh) e ID. DE SEQ. N0: 6 (região variável anti-CD28, orientada Vh- Vl) na forma de cadeia simples, e não necessita de montagem a partir de polipeptídeos codificados separadamente, o que deve ocorrer para proteínas heteromultiméricas, incluindo anticorpos naturais. Seqüências de polinucleotídeos exemplares que codificam primeiros domínios de ligação são polinucleotídeos que compreendem qualquer um dos IDS. DE
SEQ. Nos: 1, 3 OU 5 .
Esse aspecto da invenção também fornece métodos para a produção de ácidos nucléicos codificadores que ainda compreendem um polinucleotídeo ligante inserido entre o polinucleotídeo que codifica um primeiro domínio de ligação e o polinucIeotIdeo que codifica uma sub-região constante, o polinucleotídeo ligante que codifica um peptídeo ligante de pelo menos 5 aminoãcidos. Adicionalmente, esses métodos produzem ácidos nucléicos que ainda compreendem um polinucleotideo ligante inserido entre o polinucleotídeo que codifica uma sub-região constante e o polinucleotídeo que codifica um segundo domínio de ligação, o polinucleotídeo ligante que codifica um peptídeo ligante de pelo menos 5 aminoãcidos. De preferência, os ligantees peptídicos codificados possuem entre 5 e 45 aminoãcidos.
A identidade das regiões do ligante presentes entre BDl e EFD ou EFD e BD 2 pode ser derivada de outras seqüências identificadas de membros homólogos da superfamília das imunoglobulinas. No desenvolvimento de novos ligantees derivados de seqüências existentes presentes em membros homólogos da superfamília das imunoglobulinas, pode ser preferível evitar trechos de seqüências similares àqueles localizados entre a extremidade de um domínio C-Iike e o domínio transmembrana, na medida em que essas seqüências são freqüentemente substratos para a clivagem por protease de receptores de superfície da célula para a criação de formas solúveis. Comparações de seqüências entre membros diferentes da superfamília e subfamílias de Ig podem ser comparadas quanto a similaridades entre moléculas nas seqüências liganteas que unem múltiplos domínios V-Iike ou entre os domínios V e C-like. A partir dessa análise, podem surgir padrões de seqüências conservadas, de ocorrência natural; essas seqüências, quando usadas como ligantees entre subdomínios das proteínas de fusão multivalentes, devem ser mais resistentes à protease, podem facilitar a dobragem entre as regiões em alça da Ig, e não seriam imunogênicas, já que ocorrem nos domínios extracelulares de moléculas endõgenas da superfície celular.
Os próprios ácidos nucléicos compreendem outro aspecto da invenção. São contemplados ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das proteínas da invenção aqui descritas. Dessa forma, os ácidos nucléicos da invenção compreendem, na ordem de 5' para 3', uma região codificadora para um primeiro domínio de ligação, uma seqüência da sub-região constante e uma região codificadora para um segundo domínio de ligação. Também são contemplados ácidos nucléicos que codificam proteínas variantes nas quais os dois domínios de ligação e as seqüências da sub- região constante são, coletivamente, pelo menos 80% e, de preferência, pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas em termos de seqüência de aminoácidos em relação às seqüências combinadas de uma seqüência conhecida da região variável de imunoglobulina e de uma seqüência conhecida da sub-região constante. Alternativamente, as proteínas variantes da invenção são codificadas por ácidos nucléicos que hibridizam para um ácido nucléico que codifica uma proteína não variante da invenção sob condições de hibridização rigorosas de cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M a 65-680C, ou cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M e formamida 50% a 42°C. Ácidos nucléicos variantes da invenção exibem a capacidade para hibridizar sob as condições definidas imediatamente acima, ou exibem 90%, 95%, 99% ou 99,9% de identidade de seqüência para um ácido nucléico que codifica uma proteína não variante de acordo com a invenção.
Em aspectos relacionados, a invenção fornece um vetor que compreende um ácido nucléico como descrito acima, além de células hospedeiras que compreendem um vetor ou um ácido nucléico, como aqui descrito. Qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado (por exemplo, plasmídeos, fagomídeos, fasmídeos, cosmídeos, virus, cromossomos artificiais, vetores shuttle, e semelhantes) e aqueles habilitados na técnica irão reconhecer quais vetores são particularmente adequados para certa finalidade. Por exemplo, nos métodos de produção de uma Proteína, de acordo com a invenção, é selecionado um vetor de expressão operacional na célula hospedeira de escolha. De forma similar, é contemplada qualquer célula hospedeira capaz de ser geneticamente transformada com um ácido nucléico ou vetor da invenção. Células hospedeiras preferidas são células hospedeiras eucarióticas superiores, embora células hospedeiras eucarióticas inferiores (por exemplo, levedura) e células hospedeiras procarióticas (bacterianas) sejam contempladas.
Outro aspecto da invenção se dirige a um método de indução de lesão a uma célula-alvo que compreende o contato de uma célula-alvo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína, como aqui descrita. Em algumas modalidades, a célula-alvo é colocada em contato in vivo por administração da proteína, ou de um ácido nucléico codificador, como organismo que necessita. São contemplados dentro desse aspecto da invenção métodos nos quais a proteína de ligação multivalente de cadeia simples induz uma quantidade aditiva de lesão à célula-alvo, que é aquela quantidade de lesão esperada pela soma da lesão atribuível aos anticorpos separados que compreendem um ou outro dos domínios de ligação. Também são contemplados métodos nos quais a proteína de ligação multivalente de cadeia simples induz uma quantidade de lesão sinérgica à célula-alvo comparada à soma da lesão induzida por um primeiro anticorpo que compreende o primeiro domínio de ligação, mas não o segundo domínio de ligação, e um segundo anticorpo que compreende o segundo domínio de ligação, mas não o primeiro domínio de ligação. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multivalente de cadeia simples é multiespecífica e compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD19/CD20, CD20/CD21, CD2 0/CD22, CD2 0/CD40, CD20/CD79a, CD20/CD79b, CD20/CD81, CD21/CD7 9b, CD3 7/CD7 9b, CD79b/CD81, CDl9/CL II (ou seja, classe II do MHC) , CD20/CL II, CD30/CL II, CD37/CL II, CD72/CL II e CD79b/CL II.
Esse aspecto da invenção também compreende métodos nos quais a proteína de ligação multivalente e multiespecífica de cadeia simples induz uma quantidade inibida de lesão à célula-alvo comparada â soma da lesão induzida por um primeiro anticorpo que compreende o primeiro domínio de ligação, mas não o segundo domínio de ligação, e um segundo anticorpo que compreende o segundo domínio de ligação, mas não o primeiro domínio de ligação. Modalidades exemplares incluem métodos nos quais a proteína de ligação multivalente e multiespecífica de cadeia simples compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD20/CL II, CD21/CD79b, CD22/CD79b, CD40/CD79b, CD70/CD79b, CD7 2/CD7 9b, CD7 9a/CD79b, CD7 9b/CD8 0, CD7 9b/CD8 6, CD21/CL II, CD22/CL II, CD23/CL II, CD40/CL II, CD70/CL II, CD80/CL II, CD86/CL II, CD19/CD22, CD20/CD22, CD21/CD22, CD22/CD23, CD22/CD3 0, CD22/CD37, CD22/CD40, CD22/CD70, CD22/CD72, CD22/79a, CD22/79b, CD22/CD80, CD22/CD86 e CD22/CL II.
Em um aspecto relacionado, a invenção fornece um método de tratamento de um distúrbio de proliferação celular, por exemplo, câncer, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína (como aqui descrita) ou de um ácido nucléico codificador, a um organismo que necessita. Aqueles habilitados na técnica, incluindo profissionais médicos e veterinários, são capazes de identificar organismos que necessitam de tratamento. Distúrbios contemplados pela invenção passíveis de tratamento incluem um distúrbio selecionado do grupo que consiste em um câncer, um distúrbio autoimune, infecção pelo vírus do sarcoma de Rous e inflamação. Em algumas modalidades, a proteína é administrada por expressão in vivo de um ácido nucléico que codifica a proteína, como aqui descrito. A invenção também compreende a administração da proteína por uma via selecionada do grupo que consiste em injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intramuscular, injeção subcutânea, inj eção intraperitoneal e inj eção direta no tecido.
Outro aspecto da invenção é dirigido a um método para a atenuação de um sintoma associado a um distúrbio de proliferação celular que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína, como aqui descrito, a um organismo que necessita. Aqueles habilitados na técnica também são capazes de identificar aqueles distúrbios, ou doenças ou condições, que exibem sintomas que podem ser atenuados. Em algumas modalidades, o sintoma é selecionado do grupo que consiste em dor, calor, edema e rigidez articular.
Ainda outro aspecto da invenção se dirige a um método de tratamento de uma infecção associada a um agente infeccioso que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma Proteína, de acordo com a invenção a um paciente que necessita, em que a proteína compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a uma molécula-alvo do agente infeccioso. Agentes infecciosos passíveis de tratamento de acordo com esse aspecto da invenção incluem células procarióticas e eucarióticas, vírus (incluindo bacteriófago), objetos estranhos e organismos infecciosos como, por exemplo, parasitas (por exemplo, parasitas de mamíferos).
Um aspecto relacionado da invenção é dirigido a um método para a atenuação de um sintoma de uma infecção associada a um agente infeccioso que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma Proteína, de acordo com a invenção a um paciente que necessita, em que a proteína compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a uma molécula-alvo do agente infeccioso. Aqueles habilitados nas técnicas médicas e veterinárias serão capazes de determinar uma quantidade eficaz de uma proteína em cada caso específico, com a utilização de experimentação de rotina.
Ainda outro aspecto relacionado da invenção é um método de redução do risco de infecção atribuível a um agente infeccioso, que compreende a administração de uma quantidade profilaticamente eficaz de uma Proteína, de acordo com a invenção a um paciente em risco de desenvolver a infecção, em que a proteína compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a uma molécula-alvo do agente infeccioso. Aqueles habilitados na técnica relevante serão capazes de determinar uma quantidade profilaticamente eficaz de uma proteína em cada caso específico, com a utilização de experimentação de rotina.
Outro aspecto da invenção se dirige à proteína de ligação multivalente de cadeia simples descrita acima, em que pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD2 2, CD2 3, CD30, CD37, CD40, CD70, CD72, CD79a, CD79b, CD8 0, CD81, CD8 6 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
Em certas modalidades, um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente ao CD20 e, em algumas dessas modalidades, o outro domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD 21, CD2 2, CD23, CD30, CD3 7, CD4 0, CD7 0, CD7 2, CD7 9a, CD79b, CD80, CD81, CD86 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal. Por exemplo, em uma modalidade, o primeiro domínio de ligação é capaz de se ligar especificamente ao CD2 0, enquanto o segundo domínio de ligação é capaz de se ligar especificamente, por exemplo, ao CD19. Em outra modalidade, o primeiro domínio de ligação se liga ao CD19, enquanto o segundo domínio de ligação se liga ao CD20. Uma modalidade na qual ambos os domínios de ligação se ligam ao CD20 também é contemplada.
Em certas outras modalidades de acordo com esse aspecto da invenção, um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente ao CD79b, e, em algumas dessas modalidades, o outro domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD3 0, CD3 7, CD40, CD70, CD72, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD 8 6 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal. Modalidades exemplares incluem proteínas de ligação de cadeia simples multiespecíficas e multivalentes distintas nas quais um primeiro domínio de ligação:segundo domínio de ligação se liga especificamente ao CD79b:CD19 ou CD19:CD79b. Uma proteína de ligação multivalente que possui primeiro e segundo domínios de ligação que reconhecem CD79b também é contemplada.
Ainda em outras modalidades, um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente a um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal e, em algumas dessas modalidades, o outro domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD37, CD40, CD70, CD72, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD86 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal. Por exemplo, em uma modalidade, o primeiro domínio de ligação é capaz de se ligar especificamente a um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal, enquanto o segundo domínio de ligação é capaz de se ligar especificamente, por exemplo, ao CDl9. Em outra modalidade, o primeiro domínio de ligação se liga ao CD19, enquanto o segundo domínio de ligação se liga a um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal. Uma modalidade na qual ambos os domínios de ligação se ligam a um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal também é contemplada.
Ainda em outras modalidades de acordo com esse aspecto da invenção, um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente ao CD22, e, em algumas dessas modalidades, o outro domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD3 0, CD37, CD4 0, CD7 0, CD72, CD79a, CD7 9b, CD8 0, CD81, CD 8 6 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal. Modalidades exemplares incluem proteínas de ligação de cadeia simples multiespecíficas e multivalentes distintas nas quais um primeiro domínio de ligação:segundo domínio de ligação se liga especificamente ao CD22:CD19 ou CD19:CD22. Uma proteína de ligação multivalente que possui primeiro e segundo domínios de ligação que reconhecem CD22 também é contemplada.
Um aspecto relacionado da invenção é dirigido à proteína de ligação multivalente de cadeia simples descrita acima em que a proteína possui um efeito sinérgico sobre o comportamento de uma célula-alvo em relação à soma dos efeitos de cada um dos domínios de ligação. Em algumas modalidades, a proteína compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD20-CD19, CD20-CD21, CD20-CD22, CD2 0-CD40, CD20-CD79a, CD20-CD79b e CD20- CD81.
A invenção ainda compreende uma proteína de ligação multivalente de cadeia simples como descrita acima, em que a proteína possui um efeito aditivo sobre o comportamento de uma célula-alvo em relação à soma dos efeitos de cada um dos domínios de ligação. Modalidades de acordo com esse aspecto da invenção incluem proteínas multiespecíficas que compreendem um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD20-CD23, CD20-CD30, CD20-CD37, CD20-CD70, CD20-CD20-CD86, CD79b-CD37, CD79b-CD81, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD30, e peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade
principal-CD72.
Ainda outro aspecto relacionado da invenção é uma proteína de ligação multivalente de cadeia simples, como descrita acima, em que a proteína possui um efeito inibidor sobre o comportamento de uma célula-alvo em relação à soma dos efeitos de cada um dos domínios de ligação. Em algumas modalidades, a proteína é multiespecífica e compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD2 0-peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal, CD79b-CD19, CD79b-CD20, CD7 9b-CD21, CD79b-CD22, CD79b-CD23, CD79b-CD30, CD79b-CD40, CD79b-CD70, CD79b-CD72, CD79b-CD79a, CD7 9b-CD80, CD79b- CD8 6, CD79b-peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal, peptídeo da classe II do
complexo de histocompatibilidade principal-CD19, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal- CD20, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD21, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD22, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD23, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD37, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD4 0, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD70, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD79a, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD7 9b, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD80, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD86, CD22-CD19, CD22-CD40, CD22-CD79b, CD22-CD86 e CD22-peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
Outro aspecto da invenção é um método de identificação de pelo menos um dos domínios de ligação da molécula de ligação multivalente, por exemplo, uma molécula de ligação muitiespecífica descrita acima, que compreende: (a) o contato de um anticorpo anti-isotípico com um anticorpo que reconhece especificamente um primeiro antigeno e um anticorpo que reconhece especificamente um segundo antigeno; (b) o contato adicional de um alvo que compreende pelo menos um dos referidos antígenos com a composição da etapa (a) ; e (c) a medida de uma atividade do alvo, em que a atividade é usada para identificar pelo menos um dos domínios de ligação da molécula de ligação multivalente. Em algumas modalidades, o alvo é uma célula doente, por exemplo, uma célula cancerígena {por exemplo, uma célula B cancerígena) ou uma célula B produtora de auto-anticorpo.
Em cada um dos métodos da invenção descritos anteriormente, é contemplado que o método pode ainda compreender diversas proteínas de ligação multivalentes de cadeia simples. Em algumas modalidades, um domínio de ligação de uma primeira proteína de ligação multivalente de cadeia simples e um domínio de ligação de uma segunda proteína de ligação multivalente de cadeia simples induzem um efeito sinérgico, aditivo ou inibidor sobre uma célula- alvo, por exemplo, uma quantidade sinérgica, aditiva ou inibidora de lesão à célula-alvo. Os efeitos sinérgicos, aditivos ou inibidores de diversas proteínas de ligação multivalentes de cadeia simples são determinados por comparação dos efeitos dessas diversas proteínas com o efeito combinado de um anticorpo que compreende um dos domínios de ligação e um anticorpo que compreende o outro domínio de ligação.
Um aspecto relacionado da invenção é dirigido a uma composição que compreende diversas proteínas de ligação multivalentes de cadeia simples como descrito acima. Em algumas modalidades, a composição compreende diversas proteínas de ligação multivalentes de cadeia simples, em que um domínio de ligação de uma primeira proteína de ligação multivalente de cadeia simples e um domínio de ligação de uma segunda proteína de ligação multivalente de cadeia simples são capazes de induzir um efeito sinérgico, aditivo ou inibidor sobre uma célula-alvo, por exemplo, uma quantidade sinérgica, aditiva ou inibidora de lesão à célula-alvo.
A invenção ainda engloba uma composição farmacêutica que compreende a composição descrita acima, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Além disso, a invenção compreende um kit que compreende a composição como aqui descrita, e um conjunto de instruções para a administração da referida composição para exercer um efeito sobre uma célula-alvo, por exemplo, para danificar a célula-alvo.
Finalmente, a invenção também engloba um kit que compreende a proteína, como aqui descrita, e um conjunto de instruções para a administração da proteína para tratar um distúrbio de proliferação celular ou para atenuar um sintoma do distúrbio de proliferação celular.
Outras características e vantagens da presente invenção serão mais bem compreendidas por referência à descrição detalhada a seguir, incluindo os exemplos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra uma reapresentação esquemãtica das moléculas multivalentes de cadeia simples previstas pela invenção. Subdomínios individuais do cassete de expressão da proteína de fusão são indicados por formas/blocos separados na figura. BDl refere-se ao domínio de ligação 1, ligante 1 refere-se a qualquer peptídeo ligante ou dobradiça-li.ke potencial entre BDl e o "domínio da função efetora", indicado como EFD. Esse subdomínio é normalmente uma forma projetada do domínio Fc de IgGl humana, mas pode incluir outros subdomínios com uma ou mais funções efetoras, como aqui definidas. Ligante 2 refere-se à seqüência ligantea, caso exista, presente entre o terminal carbóxi do EFD e o domínio de ligação 2, BD2.
A Figura 2 mostra um IVestern blot de proteínas não reduzidas expressas em células COS. A proteína foi secretada no meio de cultura, e sobrenadantes de cultura isolados após 48-72 horas de células transfectadas transitoriamente por centrifugação. Trinta microlitros, 30 μΐ de sobrenadante bruto foram carregados em cada poço do gel. Identificações das raias: 1- marcadores de peso molecular, com os numerais indicando quilodáltons; 2- 2H7- IgG-STDl-2E12 LH; 3- 2H7-IgG-STDl-2E12 HL, 4- 2H7-IgG-STD2- 2E12 LH; 5- 2H7-IgG-STD2-2E12 HL; 6- 2E12 LH SMIP; 7- 2E12 HL SMIP; 8- 2H7 SMIP. "2H7" refere-se a uma construção de cadeia simples, em que BDl codifica o domínio de ligação específico para CD20 (2H7) na orientação Vl-Vh; "2E12" refere-se a um domínio de ligação específico para CD2 8; - IgG- refere-se a uma construção de cadeia simples, com uma dobradiça que codifica uma seqüência em que todos os C são mutados para S (sss) , e os domínios CH2 e CH3 de IgGl contêm mutações que eliminam ambas as funções efetoras, ADCC e CDC {P238S e P331 S) , "STD 1" refere-se a um ligante de 20 de aminoãcidos (identificado na Figura 7 como "STDl=20aa") inserido adjacente ao BD2 na orientação Vl-Vh, ou 2E12 (VL- VH) . "STD1-HL" refere-se a uma construção similar à descrita anteriormente, mas com as regiões BD2 V na orientação Vh-Vl, da seguinte forma: 2H7-sssIgG (P238/331S)-ligante de 20 aminoãcidos-2E12 (Vh-Vl) . "STD2- LH" refere-se a 2H7-sssIgG (P238/331S)-ligante de 38 aminoácidos-2E12 (Vl-Vh); "STD2-LH" refere-se a 2H7-sssIgG (P238/331SS)-Iigante de 38 aminoãcidos-2E12 (Vh-Vl); "SMIP" refere-se a pequeno produto imunofarmacêutico modular; e "H" geralmente refere-se a Vh , enquanto "L" geralmente refere-se a Vl. A menos que indicado de forma diferente, todas as orientações de proteínas são orientações do terminal N para o terminal C.
A Figura 3 mostra dois gráficos de colunas que ilustram as propriedades de ligação dos derivados LH e HL de 2H7-sssIgG (P238S/P331S)-STDl-2el2 expressos por células COS. Esses experimentos foram realizados com sobrenadantes de cultura brutos, e não com proteínas purificadas. Diluições seriais desde não diluído até 16X dos sobrenadantes de cultura foram incubadas com células que expressam CD20 (WIL-2S) ou células que expressam CD28 (CD28 CHO) . A atividade de ligação nos sobrenadantes foi comparada com amostras de controle que testam a ligação do SMIP de especificidade única relevante, por exemplo, TRU- 015 ou 2el2 VLVH, ou SMIPs de 2el2VHVL. A ligação em cada amostra foi detectada com o uso de anti-IgG humana de cabra conjugada ao isotiocianato de fluoresceína (FITC) em uma
diluição de 1:100.
A Figura 4 é um histograma que mostra o padrão de ligação de versões purificadas com proteína A das proteínas testadas na Figura 3 às células WIL2-S. "TRU015" é um SMIP específico para CD20. Duas proteínas de ligação multiespecíficas com função efetora também foram analisadas: "2H7-2E12 LH" possui domínio de ligação 2, específico para CD28, na orientação Vl-Vh; "2H7-2E12 HL" possui domínio de ligação 2, específico para CD28, na orientação Vh-Vl. Cada uma das proteínas foi testada quanto à ligação a 5 \x<3/ml, e a ligação detectada com anti-IgG humana de cabra conjugada a FITC a 1:100. Veja a descrição para a Figura 2 acima para descrições mais completas das moléculas testadas.
A Figura 5 mostra dois histogramas que ilustram a
ligação por proteínas de ligação multiespecíficas com função efetora purificadas com proteína A âs células CHO que expressam CD28. "2H7-2E12 LH" possui domínio de ligação 2, específico para CD28, na orientação Vl-Vh; "2H7-2E12 HL" possui domínio de ligação 2, específico para CD28, na orientação Vh-Vl. Cada uma das proteínas foi testada quanto à ligação a 5 μg/ml, e a ligação foi detectada com anti-IgG humana de cabra conjugada a FITC a 1:100. Veja as descrições na Figura 2 para uma descrição mais completa das moléculas testadas.
Figura 6: A) mostra uma tabela que identifica os ligantees que unem a sub-região constante e o domínio de ligação 2. Os ligantees são identificados por nome, seqüência, identificador de seqüência, comprimento de seqüência, e a seqüência da fusão com domínio de ligação 2. B) mostra uma tabela que identifica diversas construções que identificam elementos de moléculas exemplificadas de acordo com a invenção. Além da identificação das moléculas de ligação multivalentes por nome, os elementos dessas moléculas são revelados em termos de domínio de ligação 1 (BDl), da sub-região constante (domínio hinge e efetor ou EFD) , um ligante (veja a Fig. βA para informações adicionais em relação aos ligantees), e domínio de ligação 2 (BD2). São fornecidas as seqüências das várias proteínas de ligação multivalentes exemplificadas, e são identificadas na figura por um identificador de seqüência. Outras proteínas de ligação multivalentes possuem elementos ou ordens de elemento alteradas, com alterações previsíveis na seqüência em relação às seqüências reveladas.
A Figura 7 mostra um gráfico composto em colunas que
ilustra a ligação de proteínas purificadas em uma concentração fixa, única, às células WIL-2S que expressam CD20 e às células CHO que expressam CD28. "H1-H6" refere-se às moléculas 2H7-sss-hIgG-Hx-2el2 com os ligantees H1-H6 e as regiões 2el2 V na orientação de Vh-Vl. "L1-L6" refere-se às moléculas 2H7-sss-hlgG-Lx-2el2 com os ligantees L1-L6 e as regiões 2el2 V na orientação de Vl-Vh. Todas as moléculas foram testadas em uma concentração de 0,72 μ^/ϊηΐ, e a ligação detectada com o uso de anti-IgG humana de cabra conjugada a FITC a 1:100. A intensidade de fluorescência média para cada amostra foi então tabulada como gráficos de barras pareadas para os dois tipos de células-alvo testados versus cada uma das construções multivalentes que estão sendo testadas, L1-L6 ou H1-H6. A Figura 8 mostra fotografias de géis de SDS-PAGE não
redutores e redutores corados como Coomassie. Esses géis mostram o efeito da seqüência ligantea variante/comprimento sobre a proteína 2H7-sss-hlgG-Hx-2el2 HL sobre as quantidades das duas bandas de proteína predominantes visualizadas no gel.
A Figura 9 mostra Western Blots das proteínas de fusão [2H7-sss-hIgG-H6-2el2] e os SMIPs de especificidade única relevantes sondados com: (a) CD28mIgG ou com b) um Fab reativo com a especificidade de 2H7. Os resultados mostram que a presença do ligante H6 resulta na geração de formas clivadas das construções multivalentes que não possuem a especificidade de ligação de CD28.
A Figura 10 mostra curvas de ligação das diferentes variantes de ligante para as formas do ligante H1-H6 [TRU015-sss-IgG-Hx-2el2 HL] . O Primeiro painel mostra as curvas de ligação para ligação as células WIL-2S que expressam CD20. O segundo painel mostra as curvas de ligação para ligação das diferentes formas às células CHO CD28. Essas curvas de ligação foram geradas com diluições seriais de proteina de fusão purificada com proteína A, e a ligação detectada com o uso de anti-IgG humana de cabra
conjugada a FITC a 1:100.
A Figura 11 mostra uma tabela que resume os resultados do fracionamento por SEC (cromatografia por exclusão de tamanho) de proteínas de fusão multiespecíficas 2H7-sss~ IgG-2el2 HL com ligantees variantes H1-H7. Cada linha na tabela lista uma variante do ligante diferente das proteínas de fusão [2H7-sss-IgG-Hx-2el2-HL]. O tempo de retenção do pico de interesse (POI) , e a percentagem da proteína de fusão presente no POI7 e a percentagem de proteína encontrada em outras formas, também são tabulados. A clivagem das moléculas também é listada, com o grau de clivagem indicado de forma qualitativa, com (Sim), Sim, e SIM, ou Não sendo as quatro escolhas possíveis.
A Figura 12 mostra dois gráficos com curvas de ligação para proteínas de fusão multiespecíficas [2H7-sss-hIgG-Hx- 2el2] com ligantees variantes H3, H6, e ligantees H7 às células que expressam CD20 ou CD28. As diluições seriais das proteínas de fusão purificadas com proteína A de 10 μ9/ιη1 a 0,005 μ9/πι1 foram incubadas com células WIL-2S que expressam CD20 ou células CHO CD28. A ligação foi detectada com o uso de anti-IgG humana de cabra conjugada a FITC a 1:100. 0 Painel A mostra a ligação às células WIL-2S, e o painel B mostra a ligação às células CHO CD28.
A Figura 13 mostra os resultados de um ensaio de
ligação alternativo gerado pelas moléculas usadas para a Figura 12. Nesse caso, as proteínas de fusão foram inicialmente ligadas às células WIL-2S que expressam CD20, e a ligação foi então detectada com CD28mIgG (5 μg/ml) e reagente de anticamundongo FITC a 1:100. Esses resultados demonstram a ligação simultânea tanto ao CD2 0 quanto ao CD28 na mesma molécula.
A Figura 14 mostra resultados obtidos com o uso de outra variante da construção de fusão multiespecífica. Nesse caso, foram feitas modificações na especificidade para BD2, de forma que as regiões para o anticorpo G28-1 fossem usadas para criar um domínio de ligação específico para CD37. São mostrados dois gráficos que ilustram a habilidade relativa de anticorpos de CD20 e/ou CD37 para bloquear a ligação da proteína de fusão multiespecífica [2H7-sss-IgG-Hx-G28-1] às células Ramos ou BJAB que expressam os alvos de CD20 e CD37. Cada tipo de célula foi pré-incubado com o anticorpo específico para CD20 {25 μg/ml) ou o anticorpo específico para CD37 (10 μg/ml) ou ambos os reagentes (esses são reagentes de camundongo anti- humanos) , antes da incubação com a proteína de fusão multiespecífica. A ligação da proteína de fusão multiespecífica foi então detectada com um reagente anti- IgG humana de cabra conjugado a FITC a 1:100 (pré-adsorvido 3 0 ao camundongo para eliminar reatividade cruzada). A Figura 15 mostra os resultados de um ensaio de ADCC realizado com células BJAB-alvo, células efetoras PBMC e com a proteína de fusão específica para CD20-hIgG-CD37 como o reagente de teste. Para uma descrição completa do procedimento, veja o exemplo apropriado. 0 gráfico tabula a concentração de proteína de fusão versus o % de morte específica em cada dosagem testada para os reagentes SMIP de especificidade única, e para as variantes LH e HL de [2H7-sss-hlgG-STDl-G2 8-1] . Cada série de dados tabula os efeitos de dose-resposta para uma dessas proteínas de fusão de cadeia simples de especificidade única ou multiespecíficas.
A Figura 16 mostra uma tabela que tabula os resultados de um experimento de co-cultivo em que os PBMC foram cultivados na presença de TRU-015, G28-1 SMIP, ambas as moléculas juntas, ou a variante [2H7-sss-IgG-H7-G28~lHL] . As proteínas de fusão foram usadas a 20 μg/ml, e incubadas por 24 horas ou 72 horas. As amostras foram então coradas com anticorpos de CD3 conjugados a FITC, e anticorpos específicos para CD19 ou CD40 conjugados a PE, e depois submetidas ã citometria de fluxo. A percentagem de células em cada saída foi então tabulada.
A Figura 17 mostra dois gráficos de colunas dos efeitos sobre a apoptose da linhagem de células B após incubação por 24 horas com a molécula de [2H7-sss-hIgG-H7- G28-1 HL] ou SMIPs de especificidade única para CD2 0 e/ou CD37 de controle isoladamente ou em combinação. A percentagem de células positivas para anexina V-iodeto de propídio é tabulada em função do tipo de reagente de teste 3 0 usado para os experimentos de co-incubação. 0 Painel A mostra os resultados obtidos com o uso de células Ramos, e o painel B mostra os resultados para células Daudi. Cada SMIP único dirigido ao CD2 0 ou CD3 7 é mostrado nas concentrações indicadas; além disso, quando foram usadas combinações dos dois reagentes, a quantidade relativa de cada reagente é mostrada entre parênteses. Para a proteína de fusão muitiespecífica CD20-CD3 7, foram testadas as concentrações de 5, 10 e 20 μ9/τη1.
A Figura 18 mostra dois gráficos das variantes da molécula de [2H7-hIgG-G19-4} e sua ligação às células que expressam CD3 (Jurkats) ou células que expressam CD20 (WIL- 2S) . As moléculas incluem [HL de 2H7-sss-hIgG-STDl-G19-4] , LH e [HL de 2H7-csc-hIgG-STDl-G19-4] . Proteínas de fusão purificadas com Proteína A foram tituladas a partir de 20 μ9/πι1 até 0,05 μ9/πι1, e a ligação detectada com o uso de anti-IgG humana de cabra conjugada a FITC a 1:100. A MFI (intensidade de fluorescência média) é tabulada como uma função da concentração de proteína.
A Figura 19 mostra os resultados de ensaios de ADCC realizados com as variantes da molécula [HL de 2H7-hIgG- STDl- G19 - 4 ] com uma dobradiça SSS ou uma dobradiça CSC, células BJAB-alvo, e PBMCs humanos totais como células efetoras ou PBMC com eliminação de células NK como células efetoras. A morte foi pontuada como uma função da 2 5 concentração das proteínas de fusão multiespecíficas. A morte observada com essas moléculas foi comparada com aquela observada com o uso de G19-4, TRU-015 ou de uma combinação desses dois reagentes. Cada série de dados tabula um reagente de teste diferente, com o percentual de morte específica tabulado como uma função da concentração de proteína.
A Figura 2 0 mostra a percentagem de células B Ramos que coraram positivas com Anexina V (Ann) e/ou iodeto de propídio (PI) após incubação de um dia para o outro com cada membro de uma painel-matriz de anticorpos de células B (2 μ9/πι1) na presença, ou ausência, de um anticorpo anti- CD2 0 {presente a 2 μ5/πι1, quando adicionado) . Anticorpo secundário de cabra anticamundongo sempre esteve presente em uma proporção de concentração de duas vezes em relação aos outros anticorpos {anticorpo da matriz isoladamente, ou anticorpo da matriz e anticorpo anti-CD20). Barras com listras verticais - anticorpo da matriz (2 μ5/τη1) representado no eixo X e anticorpo de cabra anticamundongo (4 μ9/ιη1) . Barras com listras horizontais - anticorpo da matriz (2 μ9/πι1) representado no eixo X, anticorpo anti- CD2 0 {2 μ9/τη1) , e anticorpo de cabra anticamundongo (4 μ9/πι1) . A condição de "2a etapa" serviu como controle e envolveu a adição de anticorpo de cabra anticamundongo a 4 μg/ml· (barra com listras verticais) ou 8 μ9/τη1 (barra com listras horizontais), sem um anticorpo da matriz ou anticorpo anti-CD20. "CL II" (classe II do MHC) nas figuras refere-se a um anticorpo monoclonal que reage de forma cruzada com HLA DR, DQ e DP, ou sej a, aos antígenos da Classe II do MHC.
2 5 A Figura 21 mostra a percentagem de células B Ramos
que coraram positivas com Anexina V (Ann) e/ou iodeto de propí dio {PI) após incubação de um dia para o outro com cada membro de uma painel-matriz de anticorpos de células B (2 μ3/πι1) na presença, ou ausência, de um anticorpo anti-
3 0 CD79b (presente a 0,5 ou 1,0 μ9/πι1, quando adicionado) . Veja a descrição da Figura 2 0 para a identificação das amostras "CL II" e "2a etapa". Barras com listras verticais — anticorpo da matriz {2 μ9/πι1) e anticorpo de cabra anticamundongo {4 ^ig/ml) ; barras com listras horizontais — anticorpo da matriz (2 μ9/πι1) , anticorpo anti-CD79b (1,0 μ9/πι1) e anticorpo de cabra anticamundongo (6 μι^/πιΐ) ; barras pontilhadas — anticorpo da matriz (2 μ9/τη1) , anticorpo anti-CD79b (0,5 μ9/πι1) e anticorpo de cabra anticamundongo (5 μ9/τη1) . A Figura 22 mostra a percentagem de células B Ramos
que coraram positivas com Anexina V (Ann) e/ou iodeto de propídio (PI) após incubação de um dia para o outro com cada membro de uma painel-matriz de anticorpos de células B (2 ^ig/ml) na presença, ou ausência, de um anticorpo anti-CL II (presente a 0,25 ou 0,5 ^ig/ml, quando adicionado). Veja a descrição da Figura 20 para a identificação das amostras "CL II" e "2a etapa". Barras com listras verticais — anticorpo da matriz (2 μ9/τη1) e anticorpo de cabra anticamundongo (4 μ9/πι1) ; barras com listras horizontais — anticorpo da matriz (2 μ9/πι1) , anticorpo anti-CL II (0,5 ^ig/ml) e anticorpo de cabra anticamundongo (5 ^ig/ml) ; barras pontilhadas — anticorpo da matriz (2 μ9/τη1) , anticorpo anti-CL II (0,25 ^g/nil) e anticorpo de cabra anticamundongo (4,5 μ9/πι1) . 2 5 A Figura 23 mostra a percentagem de células B DHL-4
que coraram positivas com Anexina V (Ann) e/ou iodeto de propídio (PI) após incubação de um dia para o outro com cada membro de uma painel-matriz de anticorpos de células B (2 μ9/πι1) na presença, ou ausência, de um anticorpo anti- CD22 (presente a 2 μ9/τϊΐ1, quando adicionado) . Veja a descrição da Figura 2 0 para a identificação das amostras "CL II" e w2a etapa". Barras sólidas - anticorpo da matriz (2 μ3/πι1) e anticorpo de cabra anticamundongo (4 μ9/ιτι1) ; barras com listras inclinadas — anticorpo da matriz {2 μ3/πι1) , anticorpo anti-CD22 (2 μ9/πι1) e anticorpo de cabra anticamundongo (8 μ9/τη1) .
Figura 24 fornece um gráfico que demonstra a inibição direta do crescimento de linhagens de células de Iinfoma Su-DHLG (triângulos) e DoHH2 (quadrados) por SMIP sem CD20 (símbolos fechados) ou scorpion monoespecífico CD20xCD20 (símbolos abertos).
A Figura 25 é um gráfico que mostra a inibição direta do crescimento de linhagens de células de Iinfoma Su-DHL-6 (triângulos) e DoHH2 (quadrados) por SMIP sem anti-CD3 7 (símbolos fechados) ou scorpion monoespecífico anti-CD37 (símbolos abertos).
A Figura 2 6 apresenta um gráfico que mostra a inibição direta do crescimento de linhagens de células de linfoma Su-DHL-6 (triângulos) e DoHH2 (quadrados) por uma combinação de dois SMIPs monoespecíficos diferentes (símbolos fechados) ou por um scorpion biespecífico CD20- CD37 (símbolos abertos).
A Figura 27 é um gráfico que revela a inibição direta do crescimento de linhagens de células de linfoma Su-DHL-6 (triângulos) e WSU-NHL (quadrados) por SMIP sem CD 2 0 e combinação de SMIP CD3 7 (símbolos fechados) ou scorpion biespecífico CD20xCD37 (símbolos abertos).
A Figura 28 fornece histogramas que mostram os efeitos sobre o ciclo celular de scorpions. Amostras de células de 3 0 linfoma DoHH2 foram deixadas separadamente não tratadas, tratadas com SMIP 016 ou tratadas com o scorpíon monoespecífico CD37 χ CD37. Barras abertas: fase sub-Gl do ciclo celular; barras pretas: fase G0/G1; sombreado: fase S; e com listras: fase G2/M.
A Figura 2 9 apresenta gráficos de dados que
estabelecem que o tratamento de células de linfoma com scorpions causou uma capacidade de sinalização aumentada, comparada com SMIPs livres, como medida pelo fluxo de íon cálcio.
A Figura 30 fornece gráficos que demonstram
citotoxicidade celular dependente de scorpion.
A Figura 31 mostra gráficos de dados que indicam que scorpions medeiam a citotoxicidade dependente de complemento.
A Figura 32 fornece dados de forma gráfica que mostram
ligação por ELISA comparativa de um SMIP e um scorpion para isoformas de baixa afinidade (B) e de alta afinidade (A) de FcyRIII (CDl6).
A Figura 33 apresenta gráficos que estabelecem a
ligação de um SMIP e um scorpion a tipos alélicos de baixa afinidade (A)- e de alta afinidade (B)- de FcyRIII (CD16) na presença de células-alvo.
A Figura 34 é um histograma que mostra o nivel de expressão de um scorpion CD2 0 χ CD2 0 em dois experimentos
(frasco 1 e frasco 2) sob seis condições de cultura diferentes. Barras pretas sólidas: frasco 1; com barras com listras: frasco 2.
A Figura 3 5 fornece um histograma que mostra o rendimento de produção de um scorpion CD2 0 χ CD3 7.
A Figura 36 apresenta géis de SDS-PAGE {sob condições redutoras e não redutoras) de um SMIP e de um scorpion.
A Figura 37 fornece um gráfico que mostra que scorpions retêm a capacidade de ligação às células-alvo. Quadrados preenchidos: SMIP de CD20; triângulos preenchidos: SMIP de CD37; círculos preenchidos: SMIP de CD2 0 (2Lm2 0 -4) humanizado; diamante aberto: scorpion monoespecífico CD37 χ CD37; quadrados abertos: scorpion biespecífico CD20 χ CD37; e triângulos abertos: scorpion humanizado de CD20 (2Lm20-4) χ scorpion humanizado de CD20
(2 Lm2 0 -4) .
A Figura 38 contém gráficos que mostram os resultados de ensaios de ligação competitiva que estabelecem que os domínios de ligação do terminal N e C de scorpion participam na ligação à célula-alvo.
A Figura 39 apresenta dados na forma de gráficos que
mostram que scorpions possuem off-rates menores do que SMIPs.
A Figura 4 0 mostra um gráfico que estabelece que scorpions são estáveis no soro in vivo, caracterizado por
2 0 uma meia-vida circulante sustentada, reprodutível, para o scorpion.
A Figura 41 fornece um gráfico de dose-resposta para um scorpion biespecífico CD2 0 χ CD3 7, que demonstra a eficácia in vivo da administração de scorpion.
2 5 A Figura 42 mostra a ligação à célula B-alvo por um
scorpion monoespecífico CD2 0xCD2 0 (S012 9) e glico- variantes.
A Figura 43 fornece gráficos que ilustram scorpions CD2 0xCD2 0 {parentes e glico-variantes) induzindo morte
3 0 mediada por ADCC de células B BJAB. A Figura 44 mostra um gel que revela os efeitos sobre a estabilidade do scorpion que surgem em decorrência de alterações no ligante scorpion, incluindo alteração da seqüência daquele ligante e extensão do ligante por adição de uma seqüência H7 ao ligante, indicada por um " + " na linha H7 sob o gel.
A Figura 45 mostra a ligação às células WIL-2S de um scorpion CD20xCD20 (S0129) e variantes do ligante scorpion deste.
A Figura 46 mostra a morte celular direta de diversas células B por um scorpion CD20xCD20 e por um SMIP de CD20.
A Figura 47 revela a morte celular direta de linhagens de células B adicionais por um scorpion monoespecifico CD2 0xCD2 0.
A Figura 48 mostra as capacidades de morte celular direta de cada um dos dois scorpions monoespecif icos, ou seja, CD2 0xCD2 0 e CD37xCD37, e um scorpion biespecífico CD2 0xCD3 7, esse último exibindo uma forma diferente de curva de morte.
A Figura 4 9 representa graficamente a resposta de células B Su-DHL-6 a cada um de um scorpion CD2 0xCD2 0 (SO129) , CD37XCD37 e CD20xCD37.
A Figura 50 mostra a capacidade de um scorpion biespecífico CD19xCD3 7 e Rituxan® para matar diretamente células B Su-DHL-6.
A Figura 51 fornece histogramas que mostram a morte direta de células B DHL-4 por diversos scorpions de ligação de CD2 0 e SMIPs, bem como por Rituxan®, como indicado na figura. Barras azuis: células vivas; barras marrons à direita de cada par: Anexina+/PI+. A Figura 52 fornece uma representação gráfica da morte celular direta de vários scorpions de ligação de CD20 e SMIPs, bem como por Rituxan®, como indicado na figura.
A Figura 53 fornece gráficos da atividade de ADCC induzida por vários scorpions de ligação de CD2 0 e SMIPs, como indicado na figura, bem como por Rituxan®.
A Figura 54 fornece gráficos da atividade de CDC induzida por vários scorpions de ligação de CD20 e SMIPs, como indicado na figura, bem como por Rituxan®. A Figura 55 fornece histogramas que mostram os níveis
de ligação de Clq aos scorpions de ligação de CD20 ligados às células B Ramos.
A Figura 56 fornece gráficos de dispersão de análises FACS que mostram a perda de potencial da membrana mitocondrial atribuível aos scorpions de ligação de CD20 {2Lm2 0-4x2Lm2 0-4 e 011x2Lm20-4) e Rituxan, em relação aos controles (painel superior); histogramas da percentagem de células com potencial da membrana mitocondrial rompida (MMP rompida: barras pretas) são mostrados no painel inferior. A Figura 57 fornece histogramas que mostram a ausência
relativa de ativação de caspase 3 por scorpions de ligação de CD20 (2Lm20-4x2Lm20-4 e 011x2Lm20-4) , Rituximab, CD95 e controles.
A Figura 5 8 fornece um composto de quatro análises Western blot de Poli (ADP-ribose) Polimerase e caspases 3, 7 e 9 de células B que apresentam pouca degradação de qualquer uma dessas proteínas atribuível à ligação dos scorpions de ligação de CD20 às células.
A Figura 59 é um eletrof oretograma em gel de DNAs 3 0 cromossômicos de célula B que apresenta o grau de fragmentação atribuível à ligação dos scorpions de ligação de CD20 às células.
A Figura 60 é um eletroforetograma em gel de imunoprecipitados obtidos com um anticorpo anti- fosfotirosina e com um anticorpo anti-SYK. Os imunoprecipitados foram obtidos de lisados de células B que entraram em contato com scorpions de ligação de CD2Q, como indicado na figura.
A Figura 61 fornece gráficos do índice de combinação de scorpions de ligação de CD20 em terapias combinadas com doxorrubicina, vincristina e rapamicina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições de peptídeos relativamente pequenos que possuem pelo menos duas regiões ou domínios de ligação, que podem fornecer uma ou mais especificidades de ligação, derivados de domínios de ligação variáveis de imunoglobulinas, por exemplo, anticorpos, dispostos terminalmente em relação a um domínio efetor, que compreendem pelo menos parte de uma região constante de imunoglobulina {ou seja, uma fonte da qual uma sub-região constante, como aqui definida, possa ser derivada), além de ácidos nucléicos, vetores e células hospedeiras envolvidas na produção recombinante desses peptídeos, e métodos de utilização das composições de peptídeos em diversas aplicações diagnosticas e terapêuticas, incluindo o tratamento de um distúrbio, bem como a atenuação de pelo menos um sintoma de um distúrbio desse tipo. As composições de peptídeos organizam vantajosamente um terminal C do segundo domínio de ligação 3 0 ao domínio efetor, um arranjo que fornece inesperadamente ligação estericamente não impedida ou menos impedida por pelo menos dois domínios de ligação do peptídeo, ao mesmo tempo em que retém uma função efetora ou funções do domínio efetor disposto centralmente.
0 primeiro e o segundo domínios de ligação dos
peptídeos multivalentes de acordo com a invenção podem ser iguais (ou seja, podem possuir seqüências de aminoácidos idênticas ou substancialmente idênticas e ser monoespecíficos) ou diferentes (e ser multiespecíficos) . Embora diferentes em termos de estrutura primária, o primeiro e o segundo domínios de ligação podem reconhecer e se ligar ao mesmo epitopo de uma molécula-alvo, e seriam, portanto, monoespecíficos. Em muitos casos, no entanto, os domínios de ligação diferirão estruturalmente e se ligarão a sítios de ligação diferentes, resultando em uma proteína multiespecífica e multivalente. Aqueles sítios de ligação diferentes podem existir em uma única molécula-alvo ou em moléculas-alvo diferentes. No caso das duas moléculas de ligação reconhecerem moléculas-alvo diferentes, aquelas 2 0 moléculas-alvo poderão existir, por exemplo, sobre ou na mesma estrutura (por exemplo, a superfície da mesma célula), ou aquelas moléculas-alvo podem existir sobre ou em estruturas ou locais separados. Por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica de acordo com a 2 5 invenção pode ter domínios de ligação que se ligam especificamente à molécula-alvo nas superfícies de tipos distintos de células. Alternativamente, um domínio de ligação pode se ligar especificamente a um alvo em uma superfície celular e o outro domínio de ligação pode se ligar especificamente a um alvo que não é encontrado associado a uma célula, por exemplo, uma proteína estrutural extracelular (da matriz) ou uma proteína livre (por exemplo, solúvel ou estromal).
0 primeiro e o segundo domínios de ligação são derivados de uma ou mais regiões das mesmas estruturas protéicas de imunoglobulina, ou de estruturas protéicas de imunoglobulina diferentes como, por exemplo, . moléculas de anticorpo. 0 primeiro e/ou o segundo domínios de ligação podem exibir uma seqüência idêntica a seqüência de uma região de uma imunoglobulina, ou podem ser uma modificação de uma seqüência desse tipo para fornecer, por exemplo, propriedades de ligação alteradas ou estabilidade alterada. Essas modificações são conhecidas na técnica e incluem alterações na seqüência de aminoãcidos que contribuem diretamente para a propriedade alterada como, por exemplo, ligação alterada, por exemplo, por produzirem uma estrutura secundária ou de ordem mais elevada alterada no peptídeo. Também são contempladas seqüências de aminoãcidos modificadas que resultam da incorporação de aminoãcidos não nativos, por exemplo, aminoãcidos convencionais não nativos, aminoácidos não convencionais e imino ácidos. Em algumas modalidades, a seqüência alterada resulta em processamento pós-tradução alterado, por exemplo, levando a um padrão de glicosilação alterado.
2 5 Qualquer um entre uma ampla gama de domínios de
ligação derivados de uma imunoglobulina ou polipeptídeo imunoglobulina-Iike (por exemplo, receptor) é contemplado para uso em scorpions. Domínios de ligação derivados de anticorpos compreendem as regiões CDR de um domínio Vl e um
3 0 domínio Vh , observadas, por exemplo, no contexto da utilização de um domínio de ligação de um anticorpo humanizado. Domínios de ligação que compreendem domínios Vl e Vh completos derivados de um anticorpo podem ser organizados em qualquer orientação. Um scorpion de acordo com a invenção pode ter qualquer um dos domínios de ligação aqui descritos. Para scorpions que possuem pelo menos um domínio de ligação que reconhece uma célula. B7 scorpions exemplares possuem pelo menos um domínio de ligação derivado de CD3, CDlO, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD38, CD39, CD40, CD72, CD73, CD74, CDw7 5, CDw7 6, CD7 7 , CD7 8, CD7 9a/b, CD8 0, CD81, CD8 2 , CD83, CD84, CD8 5 , CD86, CD8 9, CD98, CD126, CD127, CDwl30, CD138 ou CDwl5 0. Em algumas modalidades, o scorpion é uma proteína de ligação multivalente que compreende pelo menos um domínio de ligação que possui uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6 , 103, 105, 107 e 109. Em algumas modalidades, um scorpion compreende um domínio de ligação que compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 332-345. Em algumas modalidades, um scorpion compreende um domínio de ligação que compreende uma seqüência derivada de domínios Vl e Vh de imunoglobulina, em que a seqüência é selecionada do grupo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 355-365. A invenção ainda contempla scorpions
2 5 que compreendem um domínio de ligação que possui a
orientação oposta de Vl e Vh e possuem seqüências dedutxveis a partir de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 355-365 .
Para modalidades nas quais um ou ambos os domínios de
3 0 ligação são derivados de mais de uma região de uma imunoglobulina {por exemplo, uma região Vl de Ig e uma região Vh de Ig), as diversas regiões podem ser unidas por um peptideo ligante. Além disso, pode ser usado um ligante para unir o primeiro domínio de ligação a uma sub-região constante. A união da sub-região constante a um segundo domínio de ligação (ou seja, domínio de ligação 2 disposto em direção ao terminal C de um scorpion) é obtida por um ligante scorpion. Esses ligantees scorpion têm preferivelmente entre cerca de 2-45 aminoácidos, ou 2-38 aminoácidos, ou 5-45 aminoácidos. Por exemplo, o ligante Hl tem comprimento de 2 aminoácidos, e o ligante STD2 tem comprimento de 3 8 aminoácidos. Além das considerações gerais sobre o comprimento, uma região ligantea scorpion adequada para uso nos scorpions de acordo com a invenção inclui uma região de dobradiça de anticorpo selecionada do grupo que consiste em dobradiças de IgG, IgA, IgD e IgE e variantes destas. Por exemplo, o ligante scorpion pode ser uma região de dobradiça de anticorpo selecionada do grupo que consiste em IgGl humana, IgG2 humana, IgG3 humana e 2 0 IgG4 humana, e variantes destas. Em algumas modalidades, a região ligantea scorpion possui um único resíduo de cisteína para a formação de uma ligação dissulfeto intercadeias. Em outras modalidades, o ligante scorpion possui dois resíduos de cisteína para a formação de ligações dissulfeto intercadeias. Em algumas modalidades, uma região ligantea scorpion é derivada de uma região de dobradiça de imunoglobulina ou uma região peduncular de Iectina C e compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287, 289, 297, 3 05, 3 07, 309, 310, 311, 313, 314, 315, 316,317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 34 6, 351, 3 52, 3 53, 3 54, 3 73, 3 74, 3 75, 376 e 377. Mais geralmente, qualquer seqüência de aminoãcidos identificada na listagem de seqüências como fornecendo uma seqüência derivada de uma região de dobradiça é contemplada para uso como um ligante scorpion nas moléculas scorpion de acordo com a invenção. Além disso, um ligante scorpion derivado de uma dobradiça de Ig é um domínio de peptídeo dobradiça-liJce que possui pelo menos uma cisteína livre capaz de participar em uma ligação dissulfeto intercadeias. De preferência, um ligante scorpion derivado de um peptídeo de dobradiça de Ig retém uma cisteína que corresponde à cisteína da dobradiça disposta em direção ao terminal N daquela dobradiça. De preferência, um ligante scorpion derivado de uma dobradiça de IgGl possui uma cisteína ou possui duas cisteínas que correspondem às cisteínas da dobradiça. Adicionalmente, um ligante scorpion é uma região peduncular de uma molécula de lectina C do Tipo II. Em algumas modalidades, um scorpion compreende um ligante scorpion que possui uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 373-377.
A sub-região constante disposta centralmente é derivada de uma região constante de uma proteína de imunoglobulina. A sub-região constante geralmente é derivada de uma porção CH2 de uma região Ch de uma imunoglobulina no abstrato, embora possa ser derivada de uma porção Ch2-Ch3. Opcionalmente, a sub-região constante
pode ser derivada de uma porção dobradiça-CH2 ou dobradiça- Ch2 - CH3 de uma imunoglobul ina, colocando um pept ideo que corresponde a um terminal N da região de dobradiça de Ig na sub-região constante e disposta entre a sub-região constante e o domínio de ligação 1. Além disso, porções da sub-região constante podem ser derivadas das regiões Ch de imunoglobulinas diferentes. Além disso, o peptídeo que corresponde a um CH3 de Ig pode ser truncado, deixando uma seqüência de aminoãcidos do terminal C selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 366-371. Prefere-se, no entanto, que, em modalidades nas quais uma dobradiça de scorpíon é um peptídeo dobradiça-Iike derivado de uma dobradiça de imunoglobulina, o ligante scorpíon e a sub- região constante sejam derivados do mesmo tipo de imunoglobulina. A sub-região constante fornece pelo menos uma atividade associada a região Ch de uma imunoglobulina como, por exemplo, citotoxicidade dependente de anticorpos mediada por células (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação de proteína A, ligação a pelo menos um receptor Fc, estabilidade detectãvel de forma reprodutível em relação a uma Proteína, de acordo com a invenção, exceto pela ausência de uma sub-região constante e, talvez, transferência placentãria quando a transferência por gerações de uma molécula de acordo com a invenção fosse vantajosa, como reconhecido por aqueles habilitados na técnica. Da mesma forma que domínios de ligação descritos acima, a sub-região constante é derivada de pelo menos uma molécula de imunoglobulina, e exibe uma seqüência de aminoãcidos idêntica ou substancialmente idêntica para uma região ou regiões de pelo menos uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a sub-região constante é modificada em relação à seqüência ou seqüências de pelo menos uma imunoglobulina (por substituição de um ou mais aminoãcidos ou imino ácidos não nativos convencionais ou não convencionais, por exemplo, sintéticos), resultando em uma estrutura primária que pode gerar uma estrutura secundária ou de ordem mais elevada alterada com propriedades alteradas a ela associadas, ou pode levar a alterações no processamento pós-tradução, por exemplo, glicosilação.
Para aqueles domínios de ligação e sub-regiões constantes que exibem uma seqüência de aminoãcidos idêntica ou substancialmente idêntica a um ou mais polipeptídeos de imunoglobulina, as modificações pós-tradução da molécula de acordo com a invenção podem resultar em uma molécula modificada em relação ã(s) imunoglobulina(s) que serve como base para a modificação. Por exemplo, com a utilização de metodologias conhecidas na técnica, uma célula hospedeira pode ser modificada, por exemplo, uma célula CHO, de uma forma que leva a um padrão alterado de glicosilação de polipeptídeo em relação àquele polipeptídeo em uma célula hospedeira não modificada (por exemplo, CHO).
Fornecido com essas moléculas e os métodos de sua produção recombinante in vivo, foram abertas novas avenidas de substâncias diagnosticas e terapêuticas direcionadas para permitir, por exemplo, o recrutamento direcionado de células efetoras do sistema imunológico (por exemplo, Iinfócitos T citotóxicos, células natural killer, e semelhantes) às células, tecidos, agentes e obj etos estranhos a serem destruídos ou seqüestrados, por exemplo, células cancerígenas e agentes infecciosos. Além de localizar células terapêuticas em um local de tratamento, os peptídeos são úteis na localização de compostos terapêuticos como, por exemplo, proteínas marcadas ■ radiativamente. Além disso, os peptldeos também são úteis da depuração de composições deletérias, por exemplo, por associação de uma composição deletéria, por exemplo, uma toxina, com uma célula capaz de destruir ou eliminar aquela toxina (por exemplo, um macrófago). As moléculas da invenção são úteis na modulação da atividade de moléculas parceiras de ligação como, por exemplo, receptores da superfície celular. Isso é mostrado na Pigura IV, em que a sinalização apoptõtica por meio de CD2O e/ou CD3 7 é acentuadamente intensificada por uma molécula da presente invenção, o efeito dessa sinalização é a morte da célula- alvo. Doenças e condições nas quais a eliminação de populações de células definidas é benéfica incluiriam doenças infecciosas e parasíticas, condições e autoimunes, malignidades, e semelhantes. AqueIes habilitados na técnica reconheceriam que não há limitação da abordagem para o aumento da sinalização apoptõtica A sinalização mitótica e a sinalização que leva à diferenciação, ativação ou inativação de populações de células definidas podem ser induzidas por moléculas da presente invenção por meio da seleção apropriada de moléculas parceiras de ligação. Considerações adicionais sobre a revelação da invenção serão facilitadas por uma
consideração das seguintes definições expressas dos termos aqui utilizados.
Uma "proteína de ligação de cadeia simples» é um arranjo contíguo simples de aminoácidos ligados de forma covalente, com a cadeia capaz de se Iigar especificamente a um ou mais parceiros de ligação que compartllham
determinantes suficientes de um sitio de Iiga9a0 a ser
ligado de forma detectável pela proteína de ligação de cadeia Simples. Parceiros de ^^ ^^ ^^
proteínas, carboidratos, lipídeos e pequenas moléculas.
Para facilitar a exposição, «derivados» e «variantes» de proteínas, polipeptídeos e peptídeos de acordo com a invenção são descritos em termos de diferenças das proteínas e/ou polipeptídeos e/ou peptídeos de acordo com a invenção, o gue significa que os derivados e variantes, que
-o Proteínas/polipeptídeos/peptídeos de acordo com a
ls ÍnVSn?ã0' ^ —— polipeptídeos ou peptídeos
nao derivatizadas ou não variantes da invenção da forma
definida. Aqueles habilitados na técnica compreenderão que oS próprios derivados e variantes são proteínas, polipeptídeos e peptídeos de acordo com a invenção
"anticorpo" β usado na definição ^ ^
Um
consistente com seu significado na técnica,
e inclui
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proteínas, polipeptídeos e peptídeos capazes de se Iigar a Pelo menos um parceiro de ligação, por exemplo, um antígeno proteináceo ou não proteinãceo. Om «anticorpo», como aqui usado, inclui membros da Superfamilia das imunoglobulinas
^ "P«cie, de composição de cadeia
simples ou mültiplas, e variantes, análogos, derivados e fraçjmentos dessas moléculas. Kspecificamente, um "anticorpo» inclui qualquer forma de anticorpo conhecida na técnica, incluindo, sem limitação, anticorpos monoclonais e policlonais, anticorpos quiméricos, anticorpos com enxerto 10
um s
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de CDR, anticorpos humanizados, fragmentos variáveis de cadeia simples, anticorpos biespecíficos, díãbodies, fusões de anticorpos, e semelhantes.
Um -domínio de ligação" é uma regiãQ do peptídeQ; ^
exemplo, um fragmento de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo) , gue se Iiga especificamente a um ou mais parceiros de ligação específicos. Caso existam vários parceiros de ligação, aqueles parceiros compartilharão determinantes de ligação SUfxcientes para se ligar de forma detectável ao domínio de ligação. De preferência, o domínio de ligação é uma seqüência de aminoãcidos contíguos.
«epitopo" β aqui usado em seu significado comum de iitio antigênico ünico, ou seja, um determinante antigênico, em uma substância (por exemplo, uma proteína)
com o qUal um anticorpo interage especificamente, por exemplo, por ligação. Outros ^ ^ ^^
significados bem definidos na técnica das imunoglobulinas
exemplo, anticorpo), por exemplo, «região variável
leve", região variável d eqaria'' ·~
pesada , "região constante leve"
"região constante pesada", «região de dobrada dl
anticorpo", «região determinante de complementaridade" "região estrutural", »isôtipo de antlcQrpo„ _
"fragmento variável de cadeia simples" ou «scFv"'
"quimera", "anticorpo com enxerto de CDR" ' -anticorpo humanizado", «anticorpo modelado", »fusão de
anticorpos", e semelhantes, recebem, cada um deles, seus
significados bem definidos na técnica a m
Lecmca, a menos que aqui
indicado expressamente de forma diferente.
Termos compreendidos por aqueles habilitados na técnica como se referindo 4 tecnologia de anticorpos recebem o Significado adquirido na ^^ & ^ ^
aqux indicado expressamente de forma Exempios
desses termos são e „Vh„ # que ^ ^^ ^ ^ ^
ilgaÇão variável derivada de uma cadeia ieve β pesada ^
anticorpo, reSpectivamente; e Cl e CH, que se referem a _
-região constante de imUnoglobulina„, ou ^ ^
constante de-r-ί varqa ^
derivada de uma cadeia leve ou pesada de
"'Γ"0' ——, com essa última região sendo alnda divlsivel em dominios da região constanfce ^ ^
CH4, dependendo do isõtipo de anticorpo (IgA, IgD, IgE :9G'.;9M) d° qUal * ** derivada. CDR Signiflca
região determinante de complementaridade". üma „região de
Γ""" é ^^ ^ SeqÜênCÍa * ™os -erpost. entre; e gue conect^ ^ ^ ^ ^ ^
cadeia simples de um anticorpo, que é conhecida na t.cnioa Por fornecer .IexiMlidade, na forma de uma Mobradi,- aos anticorpos inteiros.
üma c°nstante" é um termo aqui definido
Para se referir a uma se^ncla de peptideos, pollpeptideos ou proteinas que corresponde, ou é derivada, de um ou mais domínios da região constante de um anticorpo. Dessa forma
Uma SUb"re9Íã° COn— — incluir qualquer um ou todos
Γ, Se9UÍnteS d°mínlos: ™ —° cH1, uma região de
IgE^ e IgM) , e um dominioC, (lgE, IgM) . ^^ _ ^
regiao constante, como aqui definida, pode se referir a uma
região do polipeptideo que corresponde a Uma região
constante inteira de um anticorpo, ou a uma porção desta. Tipicamente, uma sub.região __ ^ ^ 10
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ou de ácido nucléico codificador, da invenção possui uma dobradiça, um domínio C„2 e um domínio C„3.
Uma "função efetora" é uma função associada ou fornecida por uma região constante de um anticorpo. Funções ' efetoras exemplares incluem citotoxicidade dependente de anticorpos mediada por células (ADCC) , ativação de complemento e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação de receptor Fc e meia-vida plasmática aumentada, além de transferência placentãria. üma função efetora de uma Composição, de acordo com a invenção é detectãvel; preferivelmente, a atividade especifica da composição, de acordo com a invenção para aquela função é aproximadamente a mesma que a atividade específica de um anticorpo do tipo selvagem com relação àquela função efetora, ou seja, a sub-região constante da molécula de Ilação multivalente preferivelmente não perdeu nenhuma função efetora em relação a um anticorpo do tipo secagem On "Iigante- é um peptídeo, ou polinucleotídeo, que
Une °U Uga OUtrOS P-Ptideoa OU polinucleotídeos Tipicamente, um peptídeo Iigante é um oligopeptídeo de
cerca de 2-so aminoãcidos, com ligantees polinucleotídicos
típicos que codificam um ligante peptídico desse tipo e
dessa forma, possuem cerca de 6-1S0 nucleotídeos dé
comprimento. Ugantees unem o primeiro domínio de ligação a
u™ domínio da sub-região constante. üm Iigante peptídico
exemplar é (Cly4Ser)3. Um Iigante SC0rpÍ0n é usado para unir a extremidade do terminal c de uma sub_região
constante a um segundo domínio de ligação, o ligante -o,Pio, pode ser derivado de uma região de dobradiça de imunocjlobulina ou da região p.duncular de uma Iectina C do 10
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tipo II, como descrito com mais detalhe abaixo.
Um "alvo" possui mais de um significado, com o contexto da sua utilização definindo um significado não ambíguo em cada caso. Em seu significado mais restrito, um > "alvo» é um sitio de ligação, ou seja, o domínio de ligação de um parceiro de ligação para uma composição de peptideo de acordo com a invenção. Em um sentido mais amplo, -alvo" OU "alvo molecular» refere-se a todo o parceiro de ligação (por exemplo, uma proteína), que necessariamente exibe o sítio de ligação. Cada um dos alvos específicos, por exemplo, "CD20", -CD3V", e semelhantes, recebe o sxgnifiçado comum que o termo adquiriu na técnica. üma "célula-alvo" é qualquer célula procariôtica ou eucariótica, seja ela saudável ou doente, que está associada a uma molécula-alvo de acordo com a invenção Evidentemente, moléculas-alvo também são encontradas não associadas a qualquer célula (ou seja, um alvo sem célula) ou em associação com outras composições como, por exemplo vírus (incluindo bacteriófago), veículos orgânicos ou inorgânicos de moléculas-alvo, e objetos estranhos.
Exemplos de materiais com os quais uma molécula-alvo POde estar associada incluem células autólogas (por exemplo, células cancerígenas ou outras células doentes) agentes infecciosos (por exemplo, células infecciosas e vxrus infecciosos), e semelhantes. Oma molécula-alvo pode estar associada a uma célula enucleada, uma membrana celular, um lipossomo, uma esponja, um gel, uma cápsula, um comprimido, e semelhantes, que podem ser usados para liberar, transportar ou localizar uma molécula-alvo independentemente do uso destinado (por exemplo, pari tratamento médico, em conseqüência de um resultado benigno
ou não intencional, ou para promover uma ameaça
bioterrorista). Os termo, «sem células», «sem vírus», "sem veículo», «sem objeto„, e semelhantes referem_se às
moléculas-alvo que não estão associadas à composição ou material especificado.
«Afinidade de ligação» refere-se à potência da ligação não covalente das composições de peptídeos da invenção e seus parceiros de ligação. De preferência, afinidade de
ligação refere-se a uma medida quantitativa da atração entre membros de um par de ligação.
Om «adjuvante» é uma substância que aumenta ou auxilia
° efeito funcional de um composto com o qual está em
associação, por exemplo, na forma de uma composição
farmacêutica que compreende um agente ativo e um adjuvante
üm «excipiente» é uma substância inerte usada como diluente
na formulação de uma composição farmacêutica, üm «veículo»
é uma substância tipicamente inerte usada para fornecer um
veiculo para a liberação de uma composição farmacêutica
"Célula hospedeira» refere-se a qualquer célula
procariótica ou eucariôtica, na qual se encontra um
polinucleotídeo, uma proteína ou um peptídeo de acordo com a invenção.
«introdução» de um ácido nucléico ou polinucleotídeo em uma célula hospedeira significa permitir a entrada do ácido nucléico ou polinucleotídeo dentro daquela célula por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, precipitações In vitro mediadas por um sal e outras formas de transformação de ácido nucléico/polinucleotídeo desnudo ou ácido 15
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nucléico/polinucleotídeo derivado de vetor, infecção mediada por vírus e, opcionalmente, transdução, com ou se, uma molécula auxiliar (helper), liberação de projétil balístico, conjugação, e semelhantes.
> a "incubação" de uma célula hospedeira significa a
manutenção daquela célula sob condições ambientais
conhecidas na técnica por serem adequadas para certa
finalidade, por exemplo, expressão gênica. Essas condições,
que incluem temperatura, força iônica, tensão de oxigênio,
concentração de dióxido de carbono, composição de
nutrientes, e semelhantes, são bem conhecidas na técnica.
o "isolamento" de um composto, por exemplo, uma
proteína ou um peptídeo de acordo com a invenção, significa
a separação daquele composto de pelo menos um composto
distinto com o qual é encontrado associado na natureza, por
exemplo, em uma célula hospedeira que expressa o composto a
ser isolado, por exemplo, por isolamento de meio de cultura
gasto que contém o composto das células hospedeiras crescidas naquele meio.
Um «organismo que necessita» é qualquer organismo em risco, ou que sofre de qualquer doença, distúrbio ou condição que seja passível de tratamento ou atenuação com uma Composição, de acordo com a invenção, incluindo, sem limitação, qualquer uma das várias formas de câncer qualquer uma dentre diversas doenças autoimunes! envenenamento por radiação em decorrência de proteínas marcadas radiativamente, peptídeos e compostos semelhantes, toxinas ingeridas ou produzidas internamente e semelhantes, como ficará evidente mediante revisão de toda a especificação. De preferência, um organismo que : necessita de tratamento é um paciente humano.
"Melhora" de um sintoma de uma doença significa a redução de forma detectável da gravidade daquele sintoma da doença, como seria conhecido na técnica. sintomas exemplares incluem dor, calor, edema e rigidez articular.
A menos que claramente definido pelo contexto, os termos "proteína", «peptídeo» e «polipeptídeo" são aqui utilizados de forma intercambiável, com cada um se referindo a pelo menos uma cadeia contígua de aminoácidos. De forma análoga, os termos "polinucleotídeo", «ácido nucléico" e «molécula de ácido nucléico" são utilizados de forma intercambiável, a menos que claramente definido pelo
contexto que se deseje um significado particular e não intercambiável.
O termo «sal farmaceuticamente aceitável» refere-se
aos sais dos compostos da presente invenção derivados da
combinação desses compostos e um ácido orgânico ou
inorgânico (sais de adição ácida, ou uma base orgânica ou inorgânica (sais de adição básica).
Utilizando-se os termos definidos acima, será
apresentada a seguir uma descrição geral dos vários
aspectos da invenção. Apôs a descrição geral, serão
apresentados exemplos de trabalho para fornecer evidências
suplementares da operabilidade e utilidade da invenção aqui revelada.
Proteínas e polipeptídeos
Em certas modalidades da invenção, são fornecidas quaisquer das proteínas de ligação multivalentes com função efetora aqui descritas, incluindo proteínas de fusão ^O domínio de ligação-imunoglobulina, em que a proteína ou peptídeo de ligação multivalente com função efetora compreende duas ou mais seqüências de polipeptídeos do domíni o de ligaçao. Cada uma das seqüências de polipeptídeos do domínio de ligação é capaz de se ligar ou se ligar especificamente a um alvo(s), por exemplo, um antígeno(s) , cujo alvo(s) ou antígeno(s) pode ser igual ou pode ser diferente. A seqüência de polipeptídeos do domínio de ligação pode ser derivada de uma região variável do antígeno ou pode ser derivada de moléculas imunoglobulina- líke, por exemplo, receptores que se dobram em formas que simulam moléculas de imunoglobulina. Os anticorpos dos quais os domínios de ligação são derivados podem ser anticorpos que são policlonais, incluindo anticorpos policlonais monoespecíficos, monoclonais (mAbs),
recombinantes, quiméricos, humanizados (por exemplo, com enxerto de CDR), humanos, de cadeia simples, catalíticos, e qualquer outra forma de anticorpo conhecida na técnica, além de fragmentos, variantes ou derivados destes. Em algumas modalidades, cada um dos domínios de ligação da Proteína, de acordo com a invenção é derivado de uma região variável completa de uma imunoglobulina. Em modalidades preferidas, cada um dos domínios de ligação é baseado em uma região variável de Ig humana. Em outras modalidades, a proteína é derivada de um fragmento de uma região variável de Ig. Nessas modalidades, prefere-se que cada seqüência de polipeptídeos do domínio de ligação corresponda às seqüências de cada uma das regiões determinantes de complementaridade de certa região variável de Ig. Também são contemplados dentro da invenção domínios de ligação que correspondem a menos do que todas as CDRs de certa região variável de Ig, desde que esses domínios de ligação retenham a capacidade de se ligar especificamente a pelo menos um alvo.
A proteína de ligação multivalente com função efetora também possui uma seqüência da sub-região constante derivada de uma região constante de imunoglobulina, preferivelmente uma região constante da cadeia pesada de anticorpo, justaposta covalentemente entre os dois domínios de ligação na proteína de ligação multivalente com função efetora.
A proteína de ligação multivalente com função efetora também possui um ligante scorpion que une a extremidade do terminal C da sub-região constante à extremidade do terminal N do domínio de ligação 2. 0 ligante scorpion não é um peptídeo helicoidal, e pode ser derivado de uma região de dobradiça de anticorpo, de uma região que conecta domínios de ligação de uma imunoglobulina, ou da região peduncular de Iectinas C do tipo II. 0 ligante scorpion pode ser derivado de uma região de dobradiça do tipo selvagem de uma imunoglobulina, por exemplo, uma região de dobradiça de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD ou IgE. Em outras modalidades, a invenção fornece proteínas de ligação muitivalentes com dobradiças alteradas. Uma categoria de regiões de dobradiça alteradas adequadas à inclusão nas proteínas de ligação multivalentes é a categoria de dobradiças com um número alterado de resíduos de cisteína, particularmente aqueles resíduos Cys conhecidos na técnica como estando envolvidos na formação de ligação dissulfeto intercadeias em moléculas de contrapartida de imunoglobulina que possuem dobradiças do tipo selvagem. Dessa forma, as proteínas podem ter uma dobradiça de IgGl na qual um dos três resíduos Cys capazes de participar nas formações de ligação dissulfeto intercadeias esteja ausente. Para indicar a subestrutura de cisteína de dobradiças alteradas, a subseqüência Cys é apresentada do terminal N para o terminal C. Utilizando-se esse sistema de identificação, as proteínas de ligação multivalentes com dobradiças de IgG alteradas incluem estruturas de dobradiça caracterizadas como cxc, xxc, ccx, xxc, xcx, cxx e xxx. 0 resíduo Cys pode tanto ser eliminado quanto substituído por um aminoãcido que produza uma substituição conservadora ou uma substituição não conservadora. Em algumas modalidades, a cisteína é substituída por uma serina. Para proteínas com ligantees scorpion que compreendem dobradiças de IgGl, o número de cisteínas que corresponde às cisteínas da dobradiça é reduzido a 1 ou 2, pref erivelmente com uma daquelas cisteínas que correspondem à cisteína da dobradiça disposta mais próxima ao terminal N da dobradiça.
Para proteínas com ligantees scorpion que compreendem dobradiças de IgG2, pode haver 0, 1, 2, 3 ou 4 resíduos Cys. Para ligantees scorpion que compreendem dobradiças de IgG2 alteradas que contêm 1, 2 ou 3 resíduos Cys, todos os subconjuntos possíveis de resíduos Cys são contemplados. Dessa forma, para ligantees que possuem uma Cys, as proteínas de ligação multivalentes podem ter o seguinte motivo Cys na região de dobradiça: cxxx, xcxx, xxcx ou xxxc. Para ligantees scorpion que compreendem variantes de dobradiça de IgG2 que possuem 2 ou 3 resíduos Cys, todas as combinações possíveis de resíduos Cys retidos e substituídos (ou eliminados) são contempladas. Para proteínas de ligação multivalentes com ligantees scorpion que compreendem regiões de dobradiça IgG3 alteradas ou regiões de dobradiça IgG4 alteradas, uma redução nos resíduos Cys de 1 para menos do que o número completo de resíduos Cys na região de dobradiça é contemplada, independentemente de se a perda ocorre por eliminação ou substituição de aminoácidos conservadora ou não conservadora (por exemplo, serina). De forma similar, proteínas de ligação multivalentes que possuem um ligante scorpion que compreende uma dobradiça de IgA, IgD ou IgE do tipo selvagem são contempladas, bem como regiões de dobradiça alteradas correspondentes que possuem um número reduzido de resíduos Cys que se estende de 0 a um a menos do que o número total de resíduos Cys encontrados na dobradiça do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades que possuem uma dobradiça de IgGl, o primeiro resíduo Cys, ou do terminal N, da dobradiça é retido. Para proteínas com regiões de dobradiça do tipo selvagem ou alteradas, é contemplado que as proteínas de ligação multivalentes serão moléculas de cadeia simples capazes de formar homomultímeros, tais como dímeros, por exemplo, por formação de ligação dissulfeto. Além disso, proteínas com dobradiças alteradas podem ter alterações nos terminais da região de dobradiça, por exemplo, perda ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos no terminal N, no terminal C ou em ambos os terminais de certa região ou domínio, por exemplo, um domínio de dobradiça, como aqui revelado.
Em outra modalidade exemplar, a sub-região constante é derivada de uma região constante que compreende uma região de dobradiça de IgD nativa ou projetada. A dobradiça de IgD humana do tipo selvagem possui uma cisteína que forma uma ligação dissulfeto com a cadeia leve na estrutura nativa da IgD. Em algumas modalidades, essa cisteina da dobradiça de IgD é mutada (por exemplo, eliminada) para gerar uma dobradiça alterada para uso como uma região de conexão entre domínios de ligação de, por exemplo, uma molécula biespecífica. Outras mudanças ou eliminações ou alterações de aminoãcidos em uma dobradiça de IgD que não resultem em inflexibilidade indesejada da dobradiça estão dentro do escopo da invenção. Regiões de dobradiça de IgD nativas ou projetadas de outras espécies também estão incluídas dentro do escopo da invenção, bem como dobradiças de IgD humanizada nativas ou projetadas de espécies não humanas, e regiões de dobradiça (diferentes de IgD) de outros isótipos de anticorpos humanos ou não humanos (por exemplo, a dobradiça de IgG2 de lhama).
A invenção ainda compreende sub-regiões constantes anexadas aos ligantees scorpion que podem ser derivadas de dobradiças que correspondem a uma região de dobradiça conhecida, por exemplo, uma dobradiça de IgGl ou uma dobradiça de IgD, como observado acima. A sub-região constante pode conter uma região de dobradiça modificada ou alterada (em relação à do tipo selvagem) na qual pelo menos um resíduo de cisteína que sabidamente participa na ligação dissulfeto intercadeias é substituído por outro aminoãcido em uma substituição conservadora (por exemplo, Ser para Cys) ou uma substituição não conservadora. A sub-região constante não inclui uma região do peptídeo ou domínio que corresponde a um domínio Chi de imunoglobulina. Seqüências alternativas de dobradiça e liganteas que podem ser usadas como regiões de conexão são de porções de receptores da superfície celular que conectam domínios V- Iike de imunoglobulina ou domínios C-Iike de imunoglobulina. Regiões entre domínios V-Iike de Ig nos quais o receptor da superfície celular contém múltiplos domínios V-Iike de Ig em tandem, e entre domínios C-Iike de Ig nos quais o receptor da superfície celular contém múltiplas regiões de C-Iike em tandem de Ig, também são contempladas como regiões de conexão. Seqüências de dobradiça e liganteas possuem comprimento tipicamente de 5 a 60 aminoãcidos, e podem ser primariamente flexíveis, mas também podem fornecer características mais rígidas. Além disso, ligantees freqüentemente fornecem um espaçamento que facilita a minimização do impedimento estérico entre os domínios de ligação. De preferência, esses peptídeos de dobradiças e ligantees possuem estrutura primariamente de hélice a, com mínima estrutura de β-sheet. As seqüências preferidas são estáveis no plasma e soro, e são resistentes 2 0 à clivagem proteolítica. As seqüências preferidas podem conter um motivo de ocorrência natural ou adicionado como, por exemplo, o motivo de CPPC que confere uma ligação dissulfeto para estabilizar a formação de dímero. As seqüências preferidas podem conter um ou mais sítios de glicosilação. Exemplos de seqüências de dobradiça e liganteas preferidas incluem, sem limitação, as regiões interdomínios entre as regiões V-Iike e Ig C-Iike de Ig de CD2 , CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD150, CDl66 e CD244.
A sub-região constante pode ser derivada de uma região constante de camelídeo como, por exemplo, uma IgG2 ou IgG3
de lhama ou de camelo.
É especificamente contemplada uma sub-região constante
que possui a região Ch2-Ch3 cie qualquer classe de Ig, ou de qualquer subclasse de IgG, por exemplo, IgGl (por exemplo, IgGl humana). Em modalidades preferidas, a sub-região constante e o ligante scorpion derivado de uma dobradiça de imunoglobulina são, ambos, derivados da mesma classe de Ig. Em outras modalidades preferidas, a sub-região constante e o ligante scorpion derivado de uma dobradiça de imunoglobulina são, ambos, derivados da mesma subclasse de Ig. A sub-região constante também pode ser um domínio CH3 de qualquer classe ou subclasse de Ig, por exemplo, IgGl (por exemplo, IgGl humana), desde que esteja associada a pelo menos uma função efetora de imunoglobulina.
A sub-região constante não corresponde a uma região constante de imunoglobulina completa (ou seja, CHi- dobradiça-CH2-CH3) da classe de IgG. A sub-região constante pode corresponder a uma região constante de imunoglobulina completa de outras classes. Domínios constantes de IgA, por exemplo, uma dobradiça de IgAl, uma dobradiça de IgA2, domínios CH2 de uma IgA e domínios CH3 de uma IgA com um apêndice mutado ou ausente, também são contemplados como sub-regiões constantes. Além disso, qualquer domínio constante de cadeia leve pode funcionar como uma sub-região constante, por exemplo, CK ou qualquer Cl . A sub-região constante também pode incluir JH ou JK, com ou sem uma dobradiça. A sub-região constante também pode corresponder a anticorpos projetados nos quais, por exemplo, um enxerto de alça foi construído efetuando-se substituições de aminoácidos selecionadas usando a estrutura central de uma IgG para gerar um sítio de ligação para um receptor diferente de um FcR natural (CD16, CD32, CD64, FcSRl), como seria entendido na técnica. Qualquer sub-região constante exemplar desse tipo é uma região Ch2-Ch3 de IgG modificada
para ter um sítio de ligação de CD89.
Esse aspecto da invenção fornece uma proteína ou um peptídeo de ligação multivalente que possui função efetora, que compreende, que consiste basicamente em ou que consiste em: (a) uma seqüência de polipeptídeos do domínio de ligação disposta no terminal N derivada de uma imunoglobulina que está fundida ou de algum outro modo conectada a (b) uma seqüência de polipeptídeos da sub- região constante derivada de uma região constante de imunoglobulina, que preferivelmente inclui uma seqüência da região de dobradiça, em que o polipeptídeo da região de dobradiça pode ser como aqui descrito, e pode compreender, consistir basicamente em, ou consistir em, por exemplo, uma seqüência de polipeptídeos alternativa da região de dobradiça, por sua vez fundida ou de algum outro modo conectada a (c) uma segunda seqüência de polipeptídeos do domínio de ligação disposta no terminal C nativa ou projetada derivada de uma imunoglobulina.
A seqüência de polipeptídeos da sub-região constante disposta centralmente derivada de uma região constante de imunoglobulina é capaz de pelo menos uma atividade imunológica selecionada do grupo que consiste em citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, CDC, fixação de complemento e ligação de 3 0 receptor Fe, e cada um dos polipeptídeos do domínio de ligação é capaz de se ligar ou se ligar especificamente a um alvo, por exemplo, um antígeno, em que os alvos podem ser iguais ou diferentes, e podem ser encontrados efetivamente no mesmo ambiente fisiológico (por exemplo, a superfície da mesma célula) ou em ambientes diferentes (por exemplo, superfícies celulares diferentes, em uma localização na superfície celular e uma localização fora da
célula, por exemplo, em solução).
Esse aspecto da invenção também compreende proteínas
ou polipeptídeos variantes que exibem uma função efetora que são pelo menos 80% e, de preferência, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticos a uma proteína multivalente com função efetora de seqüência específica, como aqui revelada.
Polinucleotxdeos
A invenção também fornece polinucleotídeos
(polinucleotídeos isolados ou purificados ou puros) que codificam as proteínas ou peptídeos de acordo com a invenção, vetores (incluindo vetores de clonagem e vetores de expressão) que compreendem esses polinucleotídeos, e células (por exemplo, células hospedeiras) transformadas ou transfectadas com um polinucleotídeo ou vetor de acordo com a invenção. Na codificação das proteínas ou dos polipeptídeos da invenção, os polinucleotídeos codificam um primeiro domínio de ligação, um segundo domínio de ligação e um domínio Fc, todos derivados de imunoglobulinas, preferivelmente imunoglobulinas humanas. Cada domínio de ligação pode conter uma seqüência que corresponde a uma seqüência da região variável de comprimento total (cadeia pesada e/ou cadeia leve), ou a uma seqüência parcial desta, desde que cada um desses domínios de ligação retenha a capacidade para se ligar especificamente. O domínio Fc pode ter uma seqüência que corresponde a uma seqüência do domínio Fc de imunoglobulina de comprimento total ou a uma seqüência parcial desta, desde que o domínio Fc exiba pelo menos uma função efetora, como aqui definida. Além disso, cada um dos domínios de ligação pode estar unido ao domínio Fc por meio de um ligante peptídico que tipicamente possui pelo menos 8 e, de preferência, pelo menos 13 aminoãcidos de comprimento. Uma seqüência ligantea preferida é uma seqüência com base no motivo Gly4Ser, por exemplo,
(Gly4Ser)3.
Variantes da proteína de ligação multivalente com função efetora também são englobadas pela invenção. Polinucleotídeos variantes são pelo menos 90% e, de preferência, 95%, 99% ou 99,9% idênticos a um dos polinucleotídeos de seqüência definida como aqui descrito, ou que hibridiza para um daqueles polinucleotídeos de seqüência definida sob condições de hibridização rigorosas de cloreto de sódio 0,015 M, extrato de sódio 0,0015 M a 65 - 6 8 0C ou cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M e formamida 50% a 42°C. As variantes de polinucleotídeo retêm a capacidade para codificar uma proteína de ligação multivalente com função efetora.
0 termo "rigoroso" é usado para se referir às condições que são normalmente compreendidas na técnica como rigorosas. 0 rigor da hibridização é determinado principalmente pela temperatura, força iônica e pela concentração de agentes desnaturantes como, por exemplo, formamida. Exemplos de condições rigorosas para hibridização e lavagem são cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M a 65-68°C ou cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M e formamida 50% a 42°C. Veja Sambrook e cols., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).
Condições mais rigorosas (por exemplo, temperatura maior, força iônica menor, formamida mais elevada ou outro agente desnaturante) também podem ser usadas; no entanto, a taxa de hibridização será afetada. Em casos relacionados â hibridização de desoxioligonucleotídeos, condições de hibridização rigorosas exemplares adicionais incluem lavagem em 6x SSC, pirofosfato de sódio 0,05% a 37°C (para oligonucleotídeos de 14 bases) , 480C (para
oligonucleotideos de 17 bases), 550C (para
oligonucleotideos de 20 bases) e 60°C (para oligonucleotideos de 23 bases).
Em um aspecto relacionado da invenção, é fornecido um método de produção de um polipeptideo ou proteína ou de outra construção da invenção, por exemplo, incluindo uma proteína ou um peptídeo de ligação multivalente que possui função efetora, que compreende as etapas de: (a) cultura de uma célula hospedeira, como aqui descrita ou fornecida, sob condições que permitem a expressão da construção; e (b) isolamento do produto de expressão, por exemplo, a proteína ou o peptídeo de ligação multivalente com função efetora da célula hospedeira ou da cultura da célula hospedeira.
Construções
A presente invenção também está relacionada a vetores, e construções preparadas a partir de vetores conhecidos, cada um incluindo um polinucleotídeo ou ácido nucléico da invenção e, em particular, às construções de expressão recombinante, incluindo qualquer uma das várias construções conhecidas, incluindo construções de liberação, úteis para terapia gênica, que incluem quaisquer ácidos nucléicos que codificam proteínas de ligação e polipeptídeos com função efetora multivalentes, por exemplo, multiespecíficos, incluindo biespecíficos, como aqui fornecidos; às células hospedeiras que são projetadas geneticamente com vetores e/ou outras construções da invenção, e aos métodos de administração de construções de expressão ou outras construções que compreendem seqüências de ácidos nucléicos que codificam proteínas de ligação multivalentes, por exemplo, multiespecíficas, incluindo biespecíficas, com função efetora, ou fragmentos ou variantes destas, por
técnicas recombinantes.
Várias construções da invenção, incluindo proteínas de
ligação multivalentes, por exemplo, multiespecíficas, com função efetora, podem ser expressas em praticamente qualquer célula hospedeira, incluindo células hospedeiras in vivo, no caso de uso para terapia gênica, sob o controle de promotores apropriados, dependendo da natureza da construção (por exemplo, tipo de promotor, como descrito acima), e da natureza da célula hospedeira desejada (por exemplo, pós-mitótica terminalmente diferenciada ou em divisão ativa; por exemplo, manutenção de uma construção passível de expressão como um epissoma ou integrada no
genoma da célula hospedeira).
Vetores de clonagem e de expressão apropriados para uso com hospedeiros eucarióticos e procarióticos são descritos, por exemplo, em Sambrook, e cols., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edição, Cold Spring Harbor, NY, (1989) . Vetores de clonagem/expressão exemplares incluem, sem limitação, vetores de clonagem, vetores shuttle e construções de expressão, que podem ser baseados em plasmídeos, fagomideos, fasmídeos, cosmideos, virus, cromossomos artificiais, ou qualquer veiculo de ácido nucléico adequado à amplificação, transferência e/ou expressão de um polinucleotídeo nele contido que é conhecido na técnica. Como aqui observado, em modalidades preferidas da invenção, a expressão recombinante é efetuada em células mamíferas que foram transfectadas, transformadas ou transduzidas com um ácido nucléico de acordo com a invenção. Veja também, por exemplo, Machida, C.A., "Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols"; Wolff, J.A. , "Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer" (Birkhauser 1994); Stein, U. e Waltheri W. (eds., "Gene Therapy of Câncer: Methods and Protocols" Humana Press 2000); Robbins, P.D. (ed.), "Gene Therapy Protocols" (Humana Press 1997); Morgan, J.R. (ed.), "Gene Therapy Protocols" (Humana Press 2002); Meager, A. (ed.) , "Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations: From Laboratory to Clinic" (John Wiley & Sons Inc. 1999); MacHida, C.A. e Constant, J.G., "Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols" (Humana Press 2002); "New Methods Of Gene Therapy For Genetic Metabolic Diseases NIH Guide», Volume 22, Número 35, Io de outubro de 1993. Veja também as Patentes U.S. Nos 6.384.210, 6.384.203, 6.384.202, 6.384.018, 6.383.814, 6.383.811, 6.3 83.7 95, 6.383.794, 6.383.785, 6.383.753, 6.383.74 6, 6.383.743, 6.383.738, 6.383.73 7, 6.383.733, 6.3 83.522, 6.383.512, 6.383.481, 6.383.478, 6.383.138, 6.380.382, 6.380.371, 6.380.369, 6.380.362, 6.380.170, 6.380.169,
6.379.967 e 6.379.966.
Tipicamente, as construções de expressão são derivadas
de vetores de plasmídeo. Uma construção preferida é um vetor pNASS modificado (Clontech, Palo Alto, CA), que possui seqüências de ácidos nucléicos que codificam um gene de resistência à ampicilina, um sinal de poliadenilação e um sítio do promotor T7. Outros vetores mamíferos de expressão adequados são bem conhecidos (veja, por exemplo, Ausubel e cols., 1995; Sambrook e cole., supra; veja também, por exemplo, catálogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ). Podem ser preparadas construções atualmente preferidas que incluem uma seqüência que codifica diidrofolato redutase (DHFR) sob controle regulador adequado, para a promoção de níveis de produção aumentados da proteína de ligação muitivalente com função efetora, cujos níveis resultam de amplificação gênica após aplicação de um agente de seleção
apropriado (por exemplo, metotrexato).
Geralmente, vetores de expressão recombinante incluirão origens de replicação e marcadores selecionáveis que permitem a transformação da célula hospedeira, e um promotor derivado de um gene altamente expresso para dirigir a transcrição de uma seqüência estrutural abaixo, como descrito acima. Um vetor em ligação operacional com um polinucleotídeo de acordo com a invenção gera uma construção de clonagem ou expressão. Construções de clonagem/expressão exemplares contêm pelo menos um elemento de controle de expressão, por exemplo, um promotor, ligado operacionalmente a um polinucleotídeo da invenção. Elementos de controle de expressão adicionais como, por exemplo, intensificadores, sítios de ligação fator- específicos, finalizadores e sítios de ligação de ribossomo também são contemplados nos vetores e construções de clonagem/expressão de acordo com a invenção. A seqüência estrutural heteróloga do polinucleotídeo de acordo com a invenção é montada na fase apropriada com seqüências de iniciação e terminação da tradução. Dessa forma, por exemplo., os ácidos nucléicos que codificam a proteína de ligação multivalente como aqui fornecida podem ser incluídos em qualquer uma dentre diversas construções de vetor de expressão como uma construção de expressão recombinante para a expressão de uma proteína desse tipo em uma célula hospedeira. Em certas modalidades preferidas, as construções são incluídas em formulações que são administradas in vivo. Esses vetores e construções incluem seqüências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas, por exemplo, derivados de SV4 0; plasmídeos 2 0 bacterianos; DNA de fago; plasmídeos de levedura; vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral, por exemplo, do vírus da vacínia, de adenovírus, da bouba aviãria e da pseudoraiva, ou retrovírus com replicação deficiente, como descrito abaixo. No entanto,
2 5 qualquer outro vetor pode ser usado para a preparação de
uma construção de expressão recombinante e, em modalidades preferidas, um desse tipo será replicável e viável no hospedeiro.
As seqüências de DNA apropriadas podem ser inseridas
3 0 em um vetor, por exemplo, por diversos procedimentos. Em geral, uma seqüência de DNA é inserida em um sítio de clivagem de endonuclease de restrição apropriado por procedimentos conhecidos na técnica. São contempladas técnicas padronizadas para clonagem, isolamento, amplificação e purificação de DNA, para reações enzimáticas que envolvem DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição, e semelhantes, e várias técnicas de separação. Várias técnicas padronizadas são descritas, por exemplo, em Ausubel e cols. (1993 "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA); Sambrook e cols. (1989 "Molecular Cloning", Segunda Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis e cols. (1982 "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Glover (Ed.) (1985 "DNA Cloning" Vol. I e II, IRL Press, Oxford, UK); Hames e Higgins (Eds.), (1985 "Nucleic Acid Hybridization", IRL Press, Oxford, UK); e em outros.
A seqüência de DNA no vetor de expressão está ligada operacionalmente a pelo menos uma seqüência de controle de expressão apropriada (por exemplo, um promotor constitutivo ou um promotor regulado) para dirigir a síntese de mRNA. Exemplos representativos dessas seqüências de controle de expressão incluem promotores de células eucarióticas ou seus vírus, como descrito acima. Regiões promotoras podem ser selecionadas de qualquer gene desejado com o uso de vetores CAT (cloranfenicol transferase) ou de outros vetores com marcadores selecionáveis. Promotores eucarióticos incluem promotores de CMV imediatos iniciais, de timidina quinase de HSV, de SV40 inicial e tardio, LTRs 3 0 de retrovírus e metalotioneína-I de camundongo. A seleção do vetor e do promotor apropriados é do conhecimento daqueles habilitados na técnica, e a preparação de certas construções de expressão recombinante particularmente preferidas que compreendem pelo menos um promotor ou promotor regulado ligado operacionalmente a um ácido nucléico que codifica uma proteína ou polipeptídeo de acordo com a invenção é aqui descrita.
A transcrição do DNA que codifica proteínas e polipeptídeos da invenção por eucariotas superiores pode ser aumentada por inserção de uma seqüência intensificadora no vetor. Exemplos incluem o intensificador de SV4 0 no lado tardio da origem de replicação bp 100 a 270, um intensificador do promotor inicial de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação e intensificadores de adenovírus.
Terapias gênicas que utilizam os ácidos nucléicos da invenção também são contempladas, compreendendo estratégias para a substituição de genes defeituosos ou a adição de novos genes às células e/ou tecidos, e estão sendo desenvolvidas para aplicação no tratamento de câncer, na correção de distúrbios metabôlicos e no campo de imunoterapia. As terapias gênicas da invenção incluem o uso de várias construções da invenção, com ou sem um veículo ou veículo de liberação ou construções separadas, para o tratamento das doenças, distúrbios e/ou condições aqui observados. Essas construções também podem ser usadas como vacinas para tratamento ou prevenção das doenças, distúrbios e/ou condições aqui observados. Vacinas de DNA, por exemplo, utilizam os polinucleotídeos que codificam determinantes imunogênicos de proteína e ácido nucléico para estimular o sistema imunológico contra patógenos ou células tumorais. Essas estratégias podem estimular imunidade adquirida ou inata, ou podem envolver a modificação da função imune por meio da expressão de citocina. A terapia gênica in vivo envolve a injeção direta de material genético em um paciente ou animal, tipicamente para tratar, evitar ou atenuar uma doença ou sintomas associados a uma doença. Vacinas e modulação imune são terapias sistêmicas. Com terapias tecido-específicas in vivo, por exemplo, aquelas destinadas ao tratamento de câncer, liberação gênica localizada e/ou sistemas de expressão/direcionamento são preferidos. Diversos vetores de terapia gênica que têm como alvo tecidos específicos são conhecidos na técnica, e foram desenvolvidos procedimentos para se dirigir fisicamente a tecidos específicos, por exemplo, com o uso de tecnologias baseadas em cateter, todas as quais são aqui contempladas.
Abordagens ex vivo para terapia gênica também são aqui contempladas, e envolvem a remoção, modificação genética, 2 0 expansão e re-administração das próprias células de um indivíduo, por exemplo, de um paciente humano. Exemplos incluem transplante de medula óssea para o tratamento de câncer ou a modificação genética de células progenitoras Iinfóides. A terapia gênica ex vivo é aplicada
2 5 preferivelmente ao tratamento de células que são facilmente
acessíveis, e que podem sobreviver em cultura durante o processo de transferência gênica {por exemplo, células sangüíneas ou da pele).
Vetores de terapia gênica úteis incluem vetores
3 0 adenovirais, vetores lentivirais, vetores de vírus adeno- associado (AAV), vetores do vírus do herpes simples (HSV), e vetores retrovirais. Terapias gênicas também podem ser realizadas com o uso de "DNA desnudo", liberação baseada em lipossomos, liberação baseada em lipídeos (incluindo DNA anexado a lipídeos carregados positivamente), eletroporação e projeção balística.
Em certas modalidades, incluindo, sem limitação, modalidades de terapia gênica, o vetor pode ser um vetor viral como, por exemplo, um vetor retroviral (Miller e cola., 1989 BioTechniques 7:980; Coffin e Varmus, 1996 "Retrovírus", Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). Por exemplo, retrovírus dos quais os vetores de plasmídeo retroviral podem ser derivados incluem, sem limitação, vírus da leucemia murídea de Moloney, vírus da necrose esplênica, retrovírus como, por exemplo, vírus do sarcoma de Rous, vírus do sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviaria, vírus da leucemia do macaco gibão, vírus da imunodeficiência humana, adenovírus, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário.
Retrovírus são vírus de RNA que podem replicar e se integrar no genoma de uma célula hospedeira por meio de um intermediário de DNA. O intermediário de DNA, ou pró-vírus, pode ser integrado de forma estável no DNA da célula hospedeira. De acordo com certas modalidades da presente invenção, uma construção de expressão pode compreender um retrovírus no qual um gene estranho que codifica uma proteína estanha é incorporado no lugar do RNA retroviral normal. Quando o RNA retroviral entra em uma célula hospedeira coincidente com infecção, o gene estranho também é introduzido na célula, e pode então ser integrado no DNA da célula hospedeira como se fosse parte do genoma retroviral. A expressão desse gene estranho dentro do hospedeiro resulta na expressão da proteína estanha.
A maioria dos sistemas de vetor retroviral que foram desenvolvidos para terapia gênica se baseia em retrovirus murídeos. Esses retrovirus existem em duas formas, como partículas virais livres denominadas vírions, ou como pró- vírus integrados no DNA da célula hospedeira. A forma de vírion do vírus contém as proteínas estruturais e enzimáticas do retrovirus (incluindo a enzima transcriptase reversa) , duas cópias de RNA do genoma viral, e porções da membrana plasmática da célula fonte que contém glicoproteína do envelope viral. O genoma retroviral é organizado em quatro regiões principais: a Repetição Longa Terminal (LTR), que contém elementos cis-atuantes necessários para a iniciação e terminação da transcrição e é situada tanto 5' quanto 3' em relação aos genes codificadores, e os três genes que codificam gag, pol e env. Esses três genes, gag, pol e env, codificam, respectivamente, estruturas virais internas, proteínas enzimáticas (por exemplo, integrase) e a glicoproteína do envelope (designada gp70 e pl5e) que confere a infectividade e especificidade de hospedeiros do vírus, além do peptídeo "R" de função indeterminada.
2 5 Foram desenvolvidas linhagens de células de
empacotamento (packaging cells) e linhagens de células produtoras de vetor separadas em função de questões de segurança em relação aos usos de retrovirus, incluindo usos em construções de expressão. Resumidamente, essa
3 0 metodologia emprega o uso de dois componentes, um vetor retroviral e uma linhagem de células de empacotamento (PCL). O vetor retroviral contém repetições longas terminais (LTRs) , o DNA estranho a ser transferido, e uma seqüência de empacotamento (y) . Esse vetor retroviral não irá se reproduzir por si próprio porque os genes que codificam proteínas estruturais e do envelope não estão incluídos dentro do genoma do vetor. A PCL contém genes que codificam as proteínas gag, pol e env, mas não contém o sinal de empacotamento "y" . Dessa forma, a própria PCL só pode formar partículas de vírion vazias. Dentro desse método geral, o vetor retroviral é introduzido na PCL, criando, dessa forma, uma linhagem de células produtoras de vetor (VCL) . Essa VCL fabrica partículas de vírion que contêm apenas o genoma estranho do vetor retroviral e, portanto, foi considerada anteriormente como sendo um vetor retroviral seguro para uso terapêutico.
Uma "construção de vetor retroviral" refere-se a uma montagem que é, dentro de modalidades preferidas da invenção, capaz de dirigir a expressão de uma(s) seqüência(s) ou gene{s) de interesse, por exemplo, seqüências de ácidos nucléicos que codificam uma proteína de ligação multivalente. Resumidamente, a construção de vetor retroviral deve incluir uma LTR 5', um sítio de ligação de tRNA, um sinal de empacotamento, uma origem de síntese de DNA de segunda fita e uma LTR 3'. Pode ser incluída uma ampla gama de seqüências heterólogas dentro da construção de vetor, incluindo, por exemplo, seqüências que codificam uma proteína (por exemplo, proteína citotóxica, antígeno associado a doenças, molécula imune acessória ou 3 0 gene de substituição) , ou que são, elas próprias, úteis como uma molécula (por exemplo, como uma seqüência de ribozima ou anti-senso).
As construções de vetor retroviral da presente invenção podem ser prontamente construídas a partir de uma ampla gama de retrovírus, incluindo, por exemplo, retrovírus do tipo B, CeD, além de espumavírus e lentivírus (veja, por exemplo, "RNA Tumor Viruses", Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985) . Esses retrovírus podem ser prontamente obtidos a partir de depósitos ou coleções como, por exemplo, a "American Type Culture Collection" ("ATCC"; Rockville, Maryland), ou isolados de fontes conhecidas com o uso de técnicas comumente disponíveis. Qualquer um dos retrovírus acima pode ser prontamente utilizado a fim de montar ou construir construções de vetor retroviral, células de empacotamento ou células produtoras da invenção, considerando a revelação aqui fornecida e técnicas recombinantes padronizadas (por exemplo, Sambrook e cols., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, 1985 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82: 488).
Promotores adequados para uso em vetores virais geralmente podem incluir, sem limitação, a LTR retroviral; o promotor de SV4 0; e o promotor do citomegalovírus humano (CMV) descrito em Miller, e cols., 1989 Biotechniques 7: 980-990, ou qualquer outro promotor (por exemplo, promotores celulares como, por exemplo, promotores celulares eucarióticos que incluem, sem limitação, os promotores de histona, pol III, e de β-actina). Outros promotores virais que podem ser empregados incluem, sem limitação, promotores adenovirais, promotores de timidina quinase (TK) e promotores de parvovírus B19. A seleção de um promotor adequado será evidente para aqueles habilitados na técnica a partir dos ensinamentos aqui apresentados, e pode ser feita entre promotores regulados ou promotores como descritos acima.
0 vetor de plasmídeo retroviral é empregado para a transdução de linhagens de células de empacotamento para formar linhagens de células produtoras. Exemplos de células de empacotamento que podem ser transfectadas incluem, sem limitação, as linhagens celulares PE501, PA317, φ-2, φ-AM, PAl 2, T19-14X, VT-19-17-H2, tpCRE, (pCRIP, GP+E-86, GP+envAml2 e DAN, como descrito em Miller, "Human Gene Therapy", 1: 5-14 (1990). O vetor pode efetuar a transdução das células de empacotamento por meio de meios conhecidos na técnica. Esses meios incluem, sem limitação, eletroporação, o uso de lipossomos, e precipitação de CaPO4. Em uma alternativa, o vetor de plasmideo retroviral pode ser encapsulado em um lipossomo, ou acoplado a um lipídeo, e depois administrado a um hospedeiro. A linhagem de células produtoras gera partículas
infecciosas do vetor retroviral que incluem a(s) seqüência(s) de ácidos nucléicos que codifica as proteínas de ligação multivalentes com função efetora. Essas partículas do vetor retroviral podem então ser empregadas para a transdução de células eucarióticas, in vitro ou in vivo. As células eucarióticas transduzidas expressarão a(s) seqüência(s) de ácidos nucléicos que codifica a proteína ou o polipeptídeo. As células eucarióticas que podem ser transduzidas incluem, sem limitação, células-tronco embrionárias, além das células-tronco hematopoiéticas, hepatócitos, fibroblastos, células mononucleares e polimorfonucleares circulantes do sangue periférico, incluindo células mielomonociticas, linfócitos, mioblastos, macrófagos teciduais, células dendriticas, células de Kupffer, células linfóides e reticuloendoteliais dos Iinfonodos e baço, ceratinócitos, células endoteliais e células epiteliais brônquicas.
Células hospedeiras
Um aspecto adicional da invenção fornece uma célula hospedeira transformada ou transfectada, ou que de algum outro modo contém qualquer um dos polinucleotideos ou das construções de clonagem/expressão da invenção. Os polinucleotideos e as construções de clonagem/expressão são introduzidos em células adequadas com a utilização de qualquer método conhecido na técnica, incluindo transformação, transfecção e transdução. Células hospedeiras incluem as células de um indivíduo submetido à terapia celular ex vivo que incluem, por exemplo, terapia gênica ex vivo. Células hospedeiras eucarióticas contempladas como um aspecto da invenção quando abrigam um polinucleotideo, vetor ou Proteína, de acordo com a invenção incluem, além das próprias células de um indivíduo (por exemplo, as próprias células de um paciente humano), células VERO, células HeLa, linhagens de células de ovário de hamster chinês (CHO) (incluindo células CHO modificadas capazes de modificar o padrão de glicosilação de moléculas de ligação multivalentes expressas (veja o Pedido de Patente U.S. Publicado N0 2003/0115614 Al, aqui incorporado por referência), células COS (por exemplo, COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, células ΗΕΚ293, células HepG2, células N, células 3T3, células de Spodoptera frugiperda (por exemplo, células Sf9), células de Saccharomyces cerevísiae, e qualquer outra célula eucariótica conhecida na técnica como sendo útil na expressão, e, opcionalmente, isolamento, de uma proteína ou de um peptídeo de acordo com a invenção. Também são contempladas células procarióticas, que incluem, sem limitação, Escherichia eoli, Baeillus subtilis, Salmonella typhimurium, um estreptomiceto ou qualquer célula procariótica conhecida na técnica como sendo adequada à expressão e, opc ionalmente, isolamento, de uma proteína ou de um peptídeo de acordo com a invenção. No isolamento da proteína ou do peptídeo de células procarióticas, em particular, é contemplado que podem ser usadas metodologias conhecidas na técnica para a extração de proteínas de corpos de inclusão. A seleção de um hospedeiro apropriado está dentro do escopo daqueles habilitados na técnica com base nos ensinamentos aqui apresentados.
As células hospedeiras proj etadas podem ser cultivadas em um meio nutriente convencional modificado da forma adequada para a ativação de promotores, seleção de transformantes ou amplificação de genes específicos. As condições de cultura para células hospedeiras específicas selecionadas para expressão, por exemplo, temperatura, pH, e semelhantes, ficarão prontamente evidentes para aqueles habilitados na técnica. Vários sistemas de cultura de células mamíferas também podem ser empregados para a expressão de proteínas recombinantes. Exemplos de sistemas de expressão em mamíferos incluem as linhagens C0S-7 de 3 0 fibroblastos de rim de macaco, descritas por Gluzman, 1981 Cell 23:175, e outras linhagens celulares capazes de expressar um vetor compatível, por exemplo, as linhagens de células C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. Vetores de expressão mamíferos compreenderão uma origem de replicação, um promotor adequado e, opcionalmente, um intensificador, e também quaisquer sítios de ligação de ribossomo necessários, um sítio de poliadenilação, sítios splice doadores e receptores, seqüências de terminação da transcrição, e seqüências não transcritas flanqueadoras 5', por exemplo, como aqui descrito, em relação à preparação de construções de expressão de proteína de ligação multivalente. As seqüências de DNA derivadas do splice de SV4 0 e os sítios de poliadenilação podem ser usados para fornecer os elementos genéticos não transcritos necessários. A introdução da construção na célula hospedeira pode ser efetuada por diversos métodos com os quais aqueles habilitados na técnica estão familiarizados, incluindo, sem limitação, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrana ou eletroporação {Davis e cols., 1986 "Basic Methods in Molecular Biology").
Em uma modalidade, uma célula hospedeira é transduzida por uma construção viral recombinante que dirige a expressão de uma proteína ou de um polipeptídeo de acordo com a invenção. A célula hospedeira transduzida produz partículas virais que contêm proteínas ou polipeptídeos expressos derivados de porções da membrana celular de um hospedeiro incorporadas pelas partículas virais durante o brotamento viral. Composições farmacêuticas
Era algumas modalidades, as composições da invenção, por exemplo, uma proteína de ligação multivalente ou uma composição que compreende um polinucleotídeo que codifica > uma proteína desse tipo, como aqui descrita, são adequadas para serem administradas sob condições e por um período suficiente para permitir a expressão da proteína codificada em uma célula hospedeira in vivo ou in vitro, para terapia gênica, e semelhantes. Essas composições podem ser formuladas em composições farmacêuticas para administração de acordo com metodologias bem conhecidas. Composições farmacêuticas geralmente compreendem uma ou mais construções de expressão recombinante e/ou produtos de expressão dessas construções, em combinação com um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. Esses veículos serão atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Para formulações baseadas em ácidos nucléicos ou para formulações que compreendem produtos de expressão de acordo com a invenção, cerca de 0,01 ^g/kg a cerca de 100 mg/kg do peso corporal serão administrados, por exemplo, pela via intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa, ou por qualquer via conhecida na técnica como sendo adequada, sob certo conjunto de circunstâncias. Uma dosagem preferida, por exemplo, é de cerca de 1 μg/kg a cerca de 1 mg/kg, com cerca de 5 μg/kg a cerca de 200 μg/kg sendo particularmente preferidos.
Ficará evidente para aqueles habilitados na técnica que o número e a freqüência de administrações dependerão da resposta do hospedeiro. Veículos farmaceuticamente aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Por exemplo, solução salina estéril e solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico podem ser usadas. Podem ser fornecidos conservantes, estabilizantes, corantes, e semelhantes na composição farmacêutica. Por exemplo, benzoato de sódio, ácido ascórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzóico podem ser adicionados como conservantes. Jd. a 1449. Além disso, antioxidantes e agentes de suspensão podem ser usados. Jd. Os compostos da presente invenção podem ser usados tanto na forma de base livre quanto na forma de sal, com ambas as formas sendo consideradas dentro do escopo da presente invenção.
As composições farmacêuticas que contêm uma ou mais construções de ácido nucléico da invenção, ou as proteínas que correspondem aos produtos codificados por essas construções de ácido nucléico, podem estar em qualquer forma que permita que a composição seja administrada a um paciente. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um sólido, líquido ou gás (aerossol). Vias de administração típicas incluem, sem limitação, oral, as vias tópica, parenteral (por exemplo, sublingual ou bucal), sublingual, retal, vaginal e intranasal. 0 termo "parenteral", como aqui usado, inclui inj eções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intra-esternais, intracavernosas,
intratecais, intrameatais, injeção intra-uretral ou técnicas de infusão. A composição farmacêutica é formulada 3 0 de forma a permitir que os ingredientes ativos nela contidos estej am biodisponíveis mediante administração da composição a um paciente. As composições que serão administradas a um paciente assumem a forma de uma ou mais unidades de dosagem, nas quais, por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um ou mais compostos da invenção na forma de aerossol que pode conter diversas unidades de dosagem.
Para administração oral, um excipiente e/ou aglutinante pode estar presente. Exemplos são sacarose, caulim, glicerina, amido, dextrinas, alginato de sódio, carboximetilcelulose e etil celulose. Agentes corantes e/ou flavorizantes podem estar presentes. Pode ser empregado um revestimento.
A composição pode estar na forma de um liquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. 0 líquido pode ser para administração oral ou para liberação por injeção, apenas como exemplos. Quando destinadas à administração oral, composições preferidas contêm, além de uma ou mais construções de fusão de domínio de ligação-imunoglobulina ou produto expresso, um ou mais entre um agente adoçante, conservantes, corantes e intensificadores do sabor. Em uma composição destinada à administração por inj eção, pode ser incluído um ou mais entre um tensoativo, conservante, agente umidificante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizante e agente isotônico.
Uma composição farmacêutica líquida, como aqui usada, esteja ela na forma de uma solução, suspensão ou outra semelhante, pode incluir um ou mais dos seguintes 3 0 adj uvantes: diluentes estéreis, por exemplo, água para injeção, solução salina, preferivelmente soro fisiológico, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, por exemplo, mono- ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como meio solvente ou de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos como, por exemplo, álcool benzilico ou metil parabeno; antioxidantes como, por exemplo, ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como, por exemplo, ácido etilenodiaminatetraacético; tampões como, por exemplo, acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade como, por exemplo, cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser embalada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses feitos de vidro ou plástico. 0 soro fisiológico é um adj uvante preferido. Uma composição farmacêutica inj etável é preferivelmente estéril.
Pode ser desejável incluir outros componentes na preparação, por exemplo, veículos de liberação que incluem, sem limitação, sais de alumínio, emulsões água-em-óleo,
2 0 veículos oleosos biodegradáveis, emulsões óleo-em-água,
microcápsulas biodegradáveis e lipossomos. Exemplos de substâncias imunoestimuladoras (adjuvantes) para uso nesses veículos incluem N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), lipopolissacarídeos (LPS), glucano, IL-12, GM-CSF, interferon gama e IL-15.
Embora qualquer veículo adequado conhecido por aqueles habilitados na técnica possa ser empregado nas composições farmacêuticas desta invenção, o tipo de veículo irá variar, dependendo do modo de administração e de se uma liberação
3 0 sustentada é desejada. Para administração parenteral, por exemplo, injeção subcutânea, o veículo preferivelmente compreende água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose e carbonato de magnésio, pode ser empregado. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, galactida polilática) também podem ser empregadas como veículos para as composições farmacêuticas desta invenção. Microesferas biodegradáveis adequadas são reveladas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 4.897.268 e 5.075.109. A esse respeito, prefere-se que a microesfera seja maior do que aproximadamente 25 mícrons.
As composições farmacêuticas também podem conter diluentes, por exemplo, tampões, antioxidantes, por exemplo, ácido ascórbico, polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose ou dextrinas), agentes quelantes (por exemplo, EDTA), glutationa e outros estabilizantes e excipientes. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica inespecífica são diluentes exemplares adequados. De preferência, o produto é formulado como um Iiofilizado com a utilização de soluções excipientes apropriadas (por exemplo, sacarose) como diluentes.
As composições farmacêuticas de acordo com a invenção também incluem proteínas estabilizadas e formulações farmacêuticas líquidas estáveis de acordo com tecnologia conhecida na técnica, incluindo a tecnologia revelada no Pedido de Patente U.S. Publicado N0 2006/0008415 Al, aqui incorporado por referência. Essas tecnologias incluem a derivatização de uma proteína, em que a proteína compreende um grupo tiol acoplado a N-acetil-L-cisteína, N-etil- maleimida ou cisterna.
Como descrito acima, a presente invenção inclui
composições capazes de liberar moléculas de ácidos nucléicos que codificam proteínas de ligação multivalentes com função efetora. Essas composições incluem vetores virais recombinantes, por exemplo, retrovírus (vej a WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 e WO 94/03622), adenovírus (veja Berkner, 1988 Biotechniques 6: 616-627; Li e cols. , 19 93 Hum. Gene Ther. 4: 4 03-4 09; Vincent e cols., Nat. Genet. 5: 130-134 ; e Kolls e cols., 1994 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 215-219), vírus da varíola (veja Patente U.S. N0 4.769.330; Patente U.S. N0 5.017.487 e WO 89/01973), moléculas de ácido nucléico da construção de expressão recombinante em complexo com uma molécula policatiônica (veja WO 93/03709) , e ácidos nucléicos associados a lipossomos (veja Wang e cols., 1987 2 0 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 84: 7.851). Em certas modalidades, o DNA pode estar ligado a adenovírus mortos ou inativados (veja Curiel e cols., 1992 Hum. Gene Ther. 3: 147-154; Cotton e cols., 1992 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 6.094). Outras composições adequadas incluem combinações DNA-Iigante (veja Wu e cols., 1989 J. Biol. Chem. 264: 16.985-16.987) e lipídeo-DNA (veja Felgner e cols., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7.413-7.417).
Além de procedimentos diretos in vivo, podem ser usados procedimentos ex vivo, nos quais as células são removidas de um hospedeiro (por exemplo, um indivíduo como, por exemplo, um paciente humano), modificadas e colocadas no mesmo animal hospedeiro ou em outro animal hospedeiro. Ficará evidente que é possível utilizar qualquer uma das composições observadas acima para a introdução de construções da invenção, tanto as proteínas/polipeptídeos quanto os ácidos nucléicos que as codificam em células do tecido em um contexto ex vivo. Protocolos para métodos virais, físicos e químicos de captação são bem conhecidos na técnica. Geração de anticorpos
Anticorpos policlonais dirigidos contra um polipeptídeo de antígeno geralmente são produzidos em animais (por exemplo, coelhos, hamsters, cabras, carneiros, cavalos, porcos, ratos, gerbos, porquinhos-da-índia, camundongos, ou qualquer outro mamífero adequado, além de outras espécies não mamíferas) por meio de múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais do polipeptídeo do antígeno ou de um fragmento deste e um adj uvante. Adj uvantes incluem, sem limitação, adjuvante de Freund completo ou incompleto, géis minerais como, por exemplo, hidróxido de alumínio, e substâncias tensoativas como, por exemplo, lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas e dinitrofenol. BCG (bacilos de Calmette-Guerin) e Corynebacteriurn parvum também são adjuvantes potencialmente úteis. Pode ser útil conjugar um polipeptídeo do antígeno a uma proteína transportadora que seja imunogênica na espécie a ser imunizada; veículos típicos incluem hemocianina keyhole limpet, albumina sérica, tireoglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja. Além disso, agentes de agregação como, por exemplo, alume, são usados para intensificar a resposta imune. Após imunização, os animais são sangrados e o soro é testado quanto à titulação do anticorpo anti-polipeptídeo do antígeno com o uso de técnicas convencionais. Anticorpos policlonais podem ser utilizados nos soros dos quais foram detectados, ou podem ser purificados dos soros, usando, por exemplo, cromatografia por afinidade do antígeno.
Anticorpos monoclonais dirigidos contra polipeptídeos do antígeno são produzidos com a utilização de qualquer método que permita a produção de moléculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultura. Por exemplo, podem ser feitos anticorpos monoclonais pelo método do hibridoma, como descrito em Kohler e cols., Nature 256: 495 [1975]; a técnica do hibridoma de célula B humana (Kosbor e cols., Immunol Today 4: 72, 1983; Cote e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 2.026-2.030, 1983) e a técnica do hibridoma do EBV (Cole e cols. , Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss Inc, Nova York N.Y., pp 77-96, (1985).
2 0 Quando é empregada a técnica do hibridoma, podem ser
usadas linhagens de células de mieloma. As linhagens celulares adequadas para uso em procedimentos de fusão que produzem hibridoma preferivelmente não produzem anticorpo endógeno, possuem alta eficiência de fusão, e exibem deficiências enzimãticas que a tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que apoiam o crescimento apenas das células fundidas desejadas (hibridomas). Por exemplo, quando o animal imunizado for um camundongo, poderá ser usado P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-Il, MPCll-X45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bul; para ratos, pode-se usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210; e U-2 66, GMl500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6 são úteis em relação às fusões de células.
Em uma modalidade alternativa, podem ser produzidos anticorpos humanos a partir de bibliotecas de exibição de fago (Hoogenboom e cols., J. Mol. Biol. 227: 381 [1991]; Marks e cols., J. Mol. Biol. 222: 581; veja também a Patente U.S. N0 5.885.793) . Esses processos simulam a seleção imune por meio da exibição de repertórios de anticorpos na superfície de bacteriófago filamentosos, e a seleção subseqüente de fago por sua ligação a um antígeno de escolha. Uma dessas técnicas é descrita no Pedido PCT Nc PCT/US98/17364, depositado no nome de Adams e cols., que descreve o isolamento de anticorpos agonistas de alta afinidade e funcionais para receptores MPL e msk com a utilização dessa abordagem. Nessa abordagem, pode ser criado um repertório completo de genes de anticorpos humanos por clonagem de genes V humanos naturalmente reorganizados de linfócitos do sangue periférico, como descrito previamente (Mullinax, e cols. , Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87: 8.095-8.099 [1990]).
Alternativamente, pode ser criado um repertório sintético inteiro da cadeia pesada humana a partir dos segmentos não organizados do gene V por montagem de cada segmento Vh humano com segmentos D de nucleotídeos aleatórios, juntamente com um segmento J humano (Hoogenboom, e cols. , J. Mol. Biol. 227: 381-388 [1992] ) . Da mesma forma, pode ser construído um repertório de cadeia leve por combinação de cada segmento V humano com um segmento J (Griffiths, e cols. , EMBO J. 13 : 3 .245-3 .260 [1994]). NucleotIdeos que codificam o anticorpo completo (ou seja, tanto as cadeias pesadas quanto as cadeias leves) são ligados como um fragmento Fv de cadeia simples, e esse polinucleotldeo é ligado a um nucleotídeo que codifica uma pequena proteína de revestimento de f ago filamentoso. Quando essa proteína de fusão é expressa na superfície do fago, um polinucleotldeo que codifica um anticorpo específico poderá ser identificado por seleção com o uso de um antígeno imobilizado. Além dos métodos clássicos de geração de anticorpos
policlonais e monoclonais, qualquer método para a geração de qualquer forma conhecida de anticorpo é contemplado. Além de anticorpos policlonais e monoclonais, formas de anticorpos incluem anticorpos quimerizados, anticorpos humanizados, anticorpos com enxerto de CDR e fragmentos e variantes de anticorpos.
Variantes e derivados de agentes de ligação específicos
Em um exemplo, são aqui fornecidas variantes de inserção nas quais um ou mais resíduos de aminoácidos suplementam uma seqüência de aminoácidos do agente de ligação específico. As inserções podem estar localizadas em um dos terminais ou em ambos os terminais da proteína, ou podem estar posicionadas dentro de regiões internas da seqüência de aminoácidos do agente de ligação específico. Produtos variantes da invenção também incluem produtos maduros do agente de ligação específico, ou seja, produtos do agente de ligação específico nos quais seqüências líderes ou sinalizadoras são removidas, e a proteína 3 0 resultante possui resíduos adicionais no terminal amino. Os resíduos adicionais do terminal amino podem ser derivados de outra proteína, ou podem incluir um ou mais resíduos que não são identificáveis como sendo derivados de uma proteína específica. Polipeptídeos com um resíduo adicional de metionina na posição -1 (por exemplo, Met-1-peptídeos de ligação multivalentes com função efetora) são contemplados, bem como polipeptídeos da invenção com resíduos adicionais de metionina e lisina nas posições -2 e -1 (Met-2-Lys-l- proteínas de ligação multivalentes com função efetora). Variantes dos polipeptídeos da invenção que possuem resíduos adicionais Met, Met-Lys ou Lys (ou um ou mais resíduos básicos em geral) são particularmente úteis para o aumento da produção de proteína recombinante em células hospedeiras bacterianas. A invenção também engloba polipeptídeos específicos da
invenção que possuem resíduos de aminoácidos adicionais que surgem em decorrência de sistemas de expressão específicos. Por exemplo, o uso de vetores disponíveis comercialmente que expressam um polipeptídeo desejado como parte de um produto de fusão glutationa-S-transferase (GST) fornece o polipeptídeo desej ado que possui um resíduo adicional de glicina na posição -1 após clivagem do componente GST do polipeptídeo desejado. Variantes que resultam da expressão em outros sistemas de vetor também são contempladas, incluindo aquelas nas quais tags de hístidina são incorporados na seqüência de aminoácidos, geralmente no terminal carbóxi e/ou amino da seqüência.
Em outro aspecto, a invenção fornece variantes de eliminação nas quais um ou mais resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo da invenção são removidos. Eliminações podem ser efetuadas em um terminal ou em ambos os terminais do polipeptideo, ou pela remoção de um ou mais resíduos dentro da seqüência de aminoácidos. Variantes de eliminação incluem necessariamente todos os fragmentos de um polipeptideo de acordo com a invenção.
Fragmentos de anticorpo referem-se aos polipeptideos que possuem uma seqüência que corresponde a pelo menos parte da região variável de uma seqüência de imunoglobulina. Os fragmentos podem ser gerados, por exemplo, por clivagem enzimãtica ou química de polipeptideos que correspondem aos anticorpos de comprimento total. Outros fragmentos de ligação incluem aqueles gerados por técnicas sintéticas ou por técnicas de DNA recombinante como, por exemplo, a expressão de plasmídeos recombinantes que contêm seqüências de ácidos nucléicos que codificam regiões variáveis parciais de anticorpo. Fragmentos polipeptídicos preferidos exibem propriedades imunológicas únicas, ou específicas, para um alvo como aqui descrito. Os fragmentos da invenção que possuem as propriedades imunológicas desejadas podem ser preparados por qualquer um dos métodos bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica.
Ainda em outro aspecto, a invenção fornece variantes de substituição de polipeptideos de ligação multivalentes que possuem função efetora. As variantes de substituição incluem aqueles polipeptideos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Em algumas modalidades, as substituições possuem natureza 3 0 conservadora; no entanto, a invenção engloba substituições que também são não conservadoras. Os aminoácidos podem ser classificados de acordo com suas propriedades físicas e pela contribuição para a estrutura secundária e terciária da proteína. Uma substituição conservadora é reconhecida na técnica como uma substituição de um aminoácido por outro aminoãcido que possua propriedades similares. Substituições conservadoras exemplares são apresentadas na Tabela A (veja WO 97/09433, página 10, publicada em 13 de março de 1997 e PCT/GB96/02197, depositada em 9/6/96), imediatamente abaixo.
Tabela A
Substituições conservadoras I CADEIA LATERAL CARACTERÍSTICA AMINOÁCIDO Alifãtica Não polar GAPILV Polar — não carregado STMNQ Polar - carregado DEKR Aromãtica HFWY Outra NQDE
Alternativamente, os aminoácidos conservadores podem ser agrupados como descrito em Lehninger, [Biochemistryl Segunda Edição; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), ρ. 71- 77], como apresentado na Tabela B, imediatamente abaixo.
Tabela B
Substituições conservadoras II CADEIA LATERAL CARACTERÍSTICA AMINOÁCIDO Não polar (hidrofóbica) A. Alifática: ALIVP B. Aromática F W C. Contendo M enxofre D. Limite G Não carregada- polar A. Hidroxil STY B. Amidas N Q C. Sulfidrila C D. Limite G Carregada positivamente (básica) KRH Carregada negativamente (ácida) D E
Substituições conservadoras II CADEIA LATERAL CARACTERÍSTICA AMINOÁCIDO Não polar (hidrofóbica) A. Alifãtica: ALIVP B. Aromãtica: F W C. Contendo enxofre M D. Limite G Não carregada-polar A. Hidroxil STY B. Amidas N Q C. Sulfidrila C D. Limite G Carregada KRH positivamente (básica) Carregada negativamente (ácida) D E
A invenção também fornece derivados de polipeptideos
do agente de ligação especifico. Derivados incluem polipeptideos do agente de ligação específico que abrigam modificações diferentes de inserções, eliminações ou substituições de resíduos de aminoácidos. De preferência, as modificações possuem natureza covalente, e incluem, por exemplo, ligação química com polímeros, lipídeos, outras porções orgânicas e inorgânicas. Derivados da invenção podem ser preparados para aumentar a meia-vida circulante de um polipeptídeo do agente de ligação específico, ou podem ser projetados para aumentar a capacidade de direcionamento para o polipeptídeo às células, tecidos ou órgãos desejados.
A invenção ainda engloba proteínas de ligação multivalentes com função efetora que são modificadas ou derivatizadas covalentemente para incluir uma ou mais adesões de polímeros hidrossolúveis como, por exemplo, polietileno glicol, polioxietileno glicol ou polipropileno glicol, como descrito nas Patentes U.S. Nos: 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 e 4.179.337. Ainda outros polímeros úteis conhecidos na técnica incluem monometoxi-polietileno glicol, dextrana, celulose e outros polímeros baseados em carboidratos, poli-{N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de polipropileno óxido/etileno óxido, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, além de misturas desses polímeros. São particularmente preferidas proteínas derivatizadas com polietileno glicol (PEG). Polímeros hidrossolúveis podem ser unidos em posições específicas, por exemplo, no terminal amino das proteínas e polipeptídeos de acordo com a invenção, ou anexados aleatoriamente a uma ou mais cadeias laterais do polipeptídeo. 0 uso de PEG para o aumento das capacidades terapêuticas é descrito na Patente U.S. N0 6.133.426 para Gonzales, e cols.
Sítios-alvo para mutagênese de imunoglobulina Estão disponíveis algumas estratégias para manipular propriedades inerentes de uma imunoglobulina antígeno- específica (por exemplo, um anticorpo) que não estão disponíveis para moléculas de ligação que não se baseiam em imunoglobulina. Um bom exemplo das estratégias que favorecem, por exemplo, moléculas baseadas em anticorpo, em relação a essas alternativas é a modulação in vivo da afinidade de um anticorpo por seu alvo por meio da 2 0 maturação da afinidade, que se beneficia da hipermutação somática de genes de imunoglobulina para gerar anticorpos de afinidade crescente à medida que a resposta imune progride. Adicionalmente, foram desenvolvidas tecnologias recombinantes para alterar a estrutura de imunoglobulinas e regiões e domínios da imunoglobulina. Dessa forma, podem ser produzidos polipeptídeos derivados de anticorpos que exibem afinidade alterada por certo antígeno, e diversos protocolos de purificação e testes de monitoramento são conhecidos na técnica para a identificação e purificação ou isolamento desses polipeptídeos. Com a utilização dessas técnicas, podem ser obtidos polipeptídeos que compreendem domínios de ligação derivados de anticorpos que exibem afinidade diminuída ou aumentada por um antígeno. As estratégias para a geração das variantes do polipeptídeo que exibem afinidade alterada incluem o uso de mutagênese sítio-específica ou aleatória do DNA que codifica o anticorpo para alterar os aminoãcidos presentes na proteína, seguida por uma etapa de rastreamento projetada para recuperar variantes de anticorpo que exibem a alteração desej ada, por exemplo, afinidade aumentada ou diminuída em relação ao anticorpo parente não modificado ou de referência.
Os resíduos de aminoãcidos mais comumente visados nas estratégias mutagênicas para alterar a afinidade são aqueles na região determinante de complementaridade (CDR) ou região hipervariãvel das regiões variáveis da cadeia leve e pesada de um anticorpo. Essas regiões contêm os resíduos que interagem físico-quimicamente com um antígeno, além de outros aminoãcidos que afetam o arranjo espacial
2 0 desses resíduos. No entanto, foi demonstrado que os
aminoãcidos nas regiões estruturais dos domínios variáveis fora das regiões CDR também fazem contribuições substanciais para as propriedades de ligação de antígeno de um anticorpo, e podem ser visados para manipular essas propriedades. Veja Hudson, P.J. Curr. Opin. Biotech., 9: 395-402 (1999) e referências nele citadas.
Podem ser produzidas bibliotecas de variantes de anticorpo menores e mais eficazmente rastreadas restringindo-se a mutagênese aleatória ou sítio-dirigida a
3 0 sítios nas CDRs que correspondem ãs áreas com tendência ã "hipermutação" durante a maturação somática do processo de
afinidade. Veja Chowdhuryf e cols., Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) e referências nele citadas. Os tipos de elementos de DNA conhecidos por definirem sitios de hipermutação dessa forma incluem repetições diretas e invertidas, certas seqüências de consenso, estruturas secundárias e palíndromos. As seqüências de DNA de consenso incluem a seqüência de quatro bases Purina-G-Pirimidina-A/T (ou seja, A ou G-G-C ou T-A ou T) eo códon de serina AGY (em que Y pode ser C ou T).
Dessa forma, outro aspecto da invenção é um conjunto de estratégias mutagênicas para a modificação da afinidade de um anticorpo por seu alvo. Essas estratégias incluem mutagênese da região variável inteira de uma cadeia pesada e/ou leve, mutagênese apenas das regiões CDR, mutagênese dos sítios de hipermutação de consenso dentro das CDRs, mutagênese de regiões estruturais, ou qualquer combinação dessas abordagens ("mutagênese" nesse contexto poderia ser aleatória ou sítio-dirigida). A delineação definitiva das regiões CDR e a identificação de resíduos que compreendem o sítio de ligação de um anticorpo podem ser obtidas pela solução da estrutura do anticorpo em questão, e do complexo anticorpo:ligante, por meio de metodologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, cristalografia por raios X. Vários métodos baseados na análise e caracterização dessas estruturas cristais do anticorpo são conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e podem ser empregados para aproximar as regiões CDR. Exemplos desses métodos usados comumente incluem as definições de Kabat, Chothia, AbM e de contato. A definição de Kabat se baseia na variabilidade de seqüência e é a definição mais comumente usada para prever regiões CDR (Johnson, e cols., Nucleic Acids Research, 28: 214-8 (2000)). A definição de Chothia se baseia na localização das regiões estruturais em alça (Chothia e cols., J. Mol. Biol., 196: 901-17 [1986]; Chothia e cols., Nature, 342: 877-83 [1989]). A definição AbM é uma combinação das definições de Kabat e Chothia. AbM é um conjunto integral de programas para modelagem da estrutura de anticorpos produzido por "Oxford Molecular Group" (Martin, e cols., Proc. Natl. Acad. Sci .U.S.A. 86: 9.268- 9.272 [1989]; Rees, e cols. "ABMTM, a computer program for modeling variable regions of antibodies" , Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.) . A suíte AbM modela a estrutura terciaria de um anticorpo a partir da seqüência primária com a utilização de uma combinação de bases de dados de conhecimento e métodos ab initio. Uma definição adicional, conhecida como a definição de contato, foi recentemente introduzida. Veja MacCallum e cols., J. Mol. Biol., 5: 732- 45 (1996) . Essa definição se baseia em uma análise das estruturas cristais complexas disponíveis.
Por convenção, os domínios de CDR na cadeia pesada são tipicamente denominados Hl, H2 e H3, e são numerados seqüencialmente em uma ordem do terminal amino ao terminal carbóxi. As regiões CDR na cadeia leve são tipicamente denominadas LI, L2 e L3, e são numeradas seqüencialmente na ordem do terminal amino ao terminal carbóxi.
A CDR-Hl tem comprimento de aproximadamente 10 a 12 resíduos e tipicamente começa 4 resíduos após um Cys de acordo com as definições de Chothia e AbM, ou tipicamente 5 resíduos mais tarde, de acordo com a definição de Kabat. 0 Hl é tipicamente seguido por um Trp, tipicamente Trp-Val, mas também Trp-Ile ou Trp-Ala. 0 comprimento de Hl é de aproximadamente 10 a 12 resíduos de acordo com a definição AbM/ enquanto a definição de Chothia exclui os últimos 4 resíduos.
A CDR-H2 tipicamente começa 15 resíduos após o final de Hl de acordo com as definições de Kabat e AbM. Os resíduos que precedem H2 são tipicamente Leu-Glu-Trp-Ile- Gly, mas há diversas variações. H2 é tipicamente seguido pela seqüência de aminoácidos Lys/Arg-
Leu/Ile /Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/He/Ala. De acordo com a definição de Kabat, o comprimento de H2 é de aproximadamente 16 a 19 resíduos, enquanto a definição AbM prevê o comprimento como sendo tipicamente de 9 a 12 resíduos.
A CDR-H3 tipicamente começa 3 3 resíduos após o final de H2 e é tipicamente precedida pela seqüência de aminoácidos Cys-Ala-Arg. H3 é tipicamente seguido pelo
2 0 aminoácido Gly. O comprimento de H3 varia de 3 a 25
resíduos.
A CDR-Ll tipicamente começa aproximadamente no resíduo 24, e irá tipicamente seguir um Cys. 0 resíduo após a CDR- Ll é sempre Trp, e tipicamente começará com uma das seguintes seqüências: Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln ou Trp-Tyr-Leu. 0 comprimento de CDR-Ll é de aproximadamente 10 a 17 resíduos.
A CDR-L2 começa aproximadamente 16 resíduos após o final de LI. Ela geralmente segue os resíduos Ile-Tyr, Val-
3 0 Tyr, Ile-Lys ou Ile-Phe. 0 comprimento de CDR-L2 é de aproximadamente 7 resíduos.
A CDR-L3 tipicamente começa 33 resíduos após o final de L2, e tipicamente segue um Cys. L3 é tipicamente seguida pela seqüência de aminoãcidos Phe-Gly-XXX-Gly. 0 comprimento de L3 é de aproximadamente 7 a 11 resíduos.
Foram descritos na técnica vários métodos para a modificação de anticorpos, incluindo, por exemplo, métodos de produção de anticorpos humanizados nos quais a seqüência da estrutura central da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humanizada é 65% a 95% idêntica à seqüência da estrutura central da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina doadora. Cada cadeia da imunoglobulina humanizada normalmente compreenderá, além das CDRs, aminoácidos da estrutura central da imunoglobulina doadora que sejam, por exemplo, capazes de interagir com as CDRs para efetuar a afinidade de ligação, por exemplo, um ou mais aminoácidos que estão imediatamente adjacentes a uma CDR na imunoglobulina doadora, ou aqueles em até cerca de 3 angstrons, como previsto por modelagem molecular. Cada uma das cadeias pesadas e leves pode ser projetada com a utilização de um ou de todos os vários critérios de posição. Quando combinadas em um anticorpo intacto, imunoglobulinas humanizadas são substancialmente não imunogênicas em seres humanos e retêm substancialmente a mesma afinidade que a imunoglobulina doadora para o antígeno, por exemplo, uma proteína ou outro composto que
contenha um epitopo.
Em um exemplo, são descritos métodos para a produção
de anticorpos, e fragmentos de anticorpo, que possuem
especificidade de ligação similar a um anticorpo parente, mas que possuem características humanas aumentadas. Anticorpos humanizados são obtidos por embaralhamento de cadeias usando, por exemplo, tecnologia de exibição de fago e um polipeptídeo que compreende a região variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo não humano específico para um antígeno de interesse, que é depois combinada com um repertório de regiões variáveis humanas complementares da cadeia (leve ou pesada). São identificados pareamentos híbridos que são específicos para o antígeno de interesse, cadeias humanas dos pareamentos selecionados são combinadas com um repertório de domínios variáveis humanos complementares (pesados ou leves). Em outra modalidade, um componente de uma CDR de um anticorpo não humano é combinado com um repertório de partes de componentes de CDRs de anticorpos humanos. Da biblioteca de dímeros de polipeptídeo de anticorpo resultante, são selecionados híbridos que podem ser usados em uma segunda etapa de embaralhamento de humanização; alternativamente, essa segunda etapa é eliminada, caso o híbrido já tenha caráter humano suficiente para ter valor terapêutico. Métodos de modificação para aumentar o caráter humano são conhecidos na técnica.
Outro exemplo é um método para a produção de anticorpos humanizados usando uma seqüência de aminoãcidos de CDR como substituição para a seqüência de aminoãcidos de CDR humana correspondente e/ou usando uma seqüência de aminoãcidos de FR como substituição para as seqüências de aminoãcidos de FR humana correspondentes.
Ainda outro exemplo fornece métodos para a identificação dos resíduos de aminoãcidos de um domínio variável de anticorpo que podem ser modificados, sem diminuir a afinidade nativa do domínio de ligação de antígeno, ao mesmo tempo em que se reduz sua imunogenicidade com relação a uma espécie heteróloga, e métodos para a preparação dessas regiões variáveis de anticorpo modificadas como úteis para administração a espécies heterólogas.
A modificação de uma imunoglobulina, por exemplo, um anticorpo, por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica é projetada para se obter afinidade de ligação aumentada ou diminuída por um antígeno, e/ou para reduzir a imunogenicidade do anticorpo no receptor e/ou para modular os níveis da atividade efetora. Em uma abordagem, anticorpos humanizados podem ser modificados para eliminar sítios de glicos ilação a fim de aumentar a afinidade do anticorpo por seu antígeno cognato (Co, e cols., Mol. Immunol. 30: 1.361-1.367 [1993]). Técnicas como, por exemplo, "remodelagem", hiperquimerização" e
"veneering/resurfacing" produziram anticorpos humanizados 2 0 com maior potencial terapêutico (Vaswami, e cols., Annals of Allergyt Asthmaf & Immunol 81: 105 (1998); Roguska, e cols., Prot. Engineer. 9: 895-904 (1996)). Veja também a Patente U.S. N0 6.072.035, que descreve métodos para a remodelagem de anticorpos. Embora essas técnicas diminuam a imunogenicidade do anticorpo por redução do número de resíduos estranhos, elas não evitam respostas anti- idiotípicas e anti-alotípicas após administrações repetidas dos anticorpos. Alternativas a esses métodos para a redução de imunogenicidade são descritas em Gilliland e cols., J. Immunol. 62(6): 3.663-71 (1999). Em muitos casos, a humanização de anticorpos resulta na perda da capacidade de ligação de antígeno. Portanto, é preferível "rnutar de forma retrógrada" o anticorpo humanizado para incluir um ou mais dos resíduos de aminoãcidos encontrados no anticorpo original (mais freqüentemente de roedor), em uma tentativa de restaurar a afinidade de ligação do anticorpo. Veja, por exemplo, Saldanha e cols., Mol. Iimunol. 36: 709-19 (1999).
Demonstrou-se que a glicosilação de imunoglobulinas afeta as funções efetoras, a estabilidade estrutural e a taxa de secreção por células produtoras de anticorpo (veja Leatherbarrow e cols., Mol. Irmunol. 22:407 (1985), aqui incorporado por referência). Os grupos carboidrato responsáveis por essas propriedades estão geralmente anexados às regiões constantes de anticorpos. Por exemplo, a glicosilação de IgG em Asn 297 no domínio CH2 facilita a capacidade plena da IgG para ativar a citólise dependente de complemento (Tao e cols. , J. Irmunol. 14 3: 2.595 (1989)). A glicosilação de IgM em Asn 402 no domínio CH3, por exemplo, facilita a montagem adequada e a atividade citolítica do anticorpo (Muraoka e cols., J. Xmmunol. 142:695 (1989)) . A remoção de sítios de glicosilação nas posições 162 e 419 nos domínios CHi e Ch3 de um anticorpo IgA leva à degradação intracelular e à inibição de pelo menos 90% da secreção (Taylor e cols., Wall, Mol. Cell. Bíol. 8: 4.197 (1988)). Conseqüentemente, as moléculas da invenção incluem imunoglobulinas alteradas por mutação que exibem padrões de glicosilação alterados por mutação de resíduos específicos em, por exemplo, uma sub-região constante, para alterar a função efetora. Veja Co e cols., Mol. Immunol. 30: 1.361-1.367 (1993), Jacquemon e cols., J. Thromb. Haemost. 4: 1.047-1.055 (2006), Schuster e cols., Câncer Res. 65: 7 . 934-7.941 (2005) e Warnock e cols., Biotechnol Bioeng. 92: 831-842 (2005), cada um deles aqui
incorporado por referência.
A invenção também inclui moléculas de ligação muitivalentes que possuem pelo menos um domínio de ligação que é pelo menos 80%, preferivelmente 90% ou 95% ou 99% idêntico em seqüência a uma seqüência conhecida da região variável de imunoglobulina e que possui pelo menos um resíduo que difere dessa região variável de imunoglobulina, em que o resíduo alterado adiciona um sítio de glicosilação, altera a localização de um ou mais sítios de glicosilação ou, de preferência, remove um sítio de glicosilação, em relação â região variável de imunoglobulina. Em algumas modalidades, a alteração remove um sítio de glicosilação ligado ao N em uma estrutura central da região variável de imunoglobulina, ou remove um sítio de glicosilação ligado ao N que ocorre na estrutura central da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina na região que se estende aproximadamente no resíduo de amxnoãcido 65 até aproximadamente no resíduo de aminoãcido 85, com o uso da convenção de numeração de Co e cols., J. Immunol. 148: 1.149, (1992).
Qualquer método conhecido na técnica é contemplado para a produção das moléculas de ligação multivalentes que exibem padrões de glicosilação alterados em relação a uma seqüência de imunoglobulina de referência. Por exemplo, pode ser empregada qualquer uma entre diversas técnicas genéticas para alterar um ou mais resíduos em particular. Alternativamente, as células hospedeiras usadas para a
produção podem ser projetadas para produzir o padrão de glicosilação alterado. Um método conhecido na técnica, por exemplo, fornece glicosilação alterada na forma de variantes divididas, não fucosiladas, que aumentam a ADCC. As variantes resultam da expressão em uma célula hospedeira que contém uma enzima modificadora de oligossacarideo. Alternativamente, a tecnologia Potelligent de BioWa/Kyowa Hakko é contemplada para reduzir o teor de fucose de moléculas glicosiladas de acordo com a invenção. Em um método conhecido, é fornecida uma célula CHO hospedeira para a produção recombinante de imunoglobulinas que modifica o padrão de glicosilação da região Fc da imunoglobulina, por meio da produção de GDP-fucose. Essa tecnologia é disponível para modificar o padrão de glicosilação de uma sub-região constante de uma molécula de ligação multivalente de acordo com a invenção.
Além de modificar as propriedades de ligação de domínios de ligação, por exemplo, dos domínios de ligação de imunoglobulinas, e além dessas modificações como humanização, a invenção compreende a modulação da função efetora por alteração ou mutação de resíduos que contribuem para a função efetora, por exemplo, a função efetora de uma sub-região constante. Essas modificações podem ser efetuadas com a utilização de qualquer metodologia conhecida na técnica, por exemplo, a abordagem revelada em Presta e cols., Biochem. Soe. Trans. 30: 487-490 (2001) , aqui incorporada por referência. Abordagens exemplares incluiriam o uso do protocolo revelado em Presta e cols. para modificar resíduos específicos conhecidos por afetarem a ligação em uma ou mais sub-regiões constantes que correspondem a FCyRI, FCyRIIf FCyRIIIi FCaR e FCsR.
Em outra abordagem, a tecnologia "Xencor XmAb" é disponível pra proj etar sub-regiões constantes que correspondem aos domínios Fc para aumentar a função efetora de morte celular. Veja Lazar e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 103(11): 4.005-4.010 (2006), aqui incorporado por referência. Com a utilização dessa abordagem, por exemplo, podem ser geradas sub-regiões constantes otimizadas para especificidade e ligação a FcyR, aumentando, dessa forma, a função efetora de morte celular.
Produção de proteínas de ligação multivalentes com
função efetora
Podem ser utilizados diversos sistemas de vetor de expressão/hospedeiro para conter e expressar a proteína de ligação multivalente (com função efetora) da invenção. Esses sistemas incluem, sem limitação, microorganismos como, por exemplo, bactérias transformadas com bacteriófago recombinante, plasmídeo, cosmídeo ou outros vetores de expressão; leveduras transformadas com vetores de expressão ou shuttle de levedura; sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressão de vírus (por exemplo, baculovírus); sistemas de células de plantas transfectadas com vetores de expressão de vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais. Células mamíferas que são úteis nas produções de proteína de ligação multivalente recombinante incluem, sem limitação, células VERO, células HeLa, linhagens de células de ovãrio de hamster chinês (CHO), células COS (por exemplo, COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RN, MDCK, A54 9, PC 12, K562 e células HEK2 93. Protocolos exemplares para a expressão recombinante da proteína de ligação multivalente serão aqui descritos posteriormente.
Um vetor de expressão pode compreender a unidade de transcrição que compreende uma montagem de: (1) um elemento ou elementos genéticos que possuem um papel regulador na expressão gênica, por exemplo, um promotor, intensificador, ou sítio de ligação fator-específico, (2) uma seqüência estrutural ou uma seqüência que codifica o agente de ligação que é transcrito em mRNA e traduzido em proteína, e (3) seqüências de iniciação e de terminação de transcrição apropriadas. As unidades estruturais destinadas a serem usadas em leveduras ou em sistemas de expressão eucarióticos preferivelmente incluem uma seqüência líder que permite a secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hospedeira. Alternativamente, quando a proteína de ligação multivalente recombinante for expressa 2 0 sem uma seqüência líder ou de transporte, ela poderá incluir um resíduo metionina no terminal amino. Esse resíduo pode ou não ser subseqüentemente clivado da proteína recombinante expressa para fornecer uma proteína de ligação multivalente final. Por exemplo, as proteínas de ligação multivalentes
podem ser expressas de forma recombinante em leveduras com o uso de um sistema de expressão disponível comercialmente, por exemplo, o Sistema de Expressão Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), de acordo com as instruções do fabricante. Esse sistema se baseia na seqüência pré-pró-alfa para dirigir a secreção, mas a transcrição da inserção é conduzida pelo promotor de álcool oxidase (AOXl) mediante indução por metanol. 0 peptídeo de ligação multivalente secretado pode ser purificado do meio de crescimento de levedura, por exemplo, pelos métodos usados para purificar o peptideo dos sobrenadantes de células bacterianas e mamíferas.
Alternativamente, o cDNA que codifica o peptideo de ligação multivalente pode ser clonado no vetor de expressão de baculovírus pVL13 93 (PharMingenf San Diego, CA) . Esse vetor pode ser usado de acordo com as instruções do fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda em meio sem proteína SF9 e para produzir proteína recombinante. A proteína de ligação multivalente pode ser purificada e concentrada do meio com o uso de uma coluna de heparina-Sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Sistemas de insetos para a expressão de proteína, por exemplo, o sistema SF9, são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em um desses sistemas, vírus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) pode
2 0 ser usado como um vetor para expressar genes estranhos nas
células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A seqüência que codifica o peptídeo de ligação multivalente pode ser clonada em uma região não essencial do vírus, por exemplo, o gene de poliedrina, e colocada sob controle do promotor de poliedrina. A inserção bem sucedida do peptídeo de ligação multivalente tornará o gene de poliedrina inativo e produzirá vírus recombinante desprovido de proteína de revestimento. 0 vírus recombinante pode ser usado para infectar células de S.
3 0 frugiperda ou larvas de Trichoplusia nas quais o peptídeo é expresso (Smith e cols., J. Vlrol. 46: 584, 1983; Engelhard e cols., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 91: 3.224-7, 1994).
Em outro exemplo, a seqüência de DNA que codifica o peptídeo de ligação multivalente pode ser amplificada por PCR e clonada em um vetor apropriado, por exemplo, pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ). O vetor pGEX é projetado para produzir uma proteína de fusão que compreende glutationa-S- transferase (GST), codificada pelo vetor, e uma proteína de ligação multivalente codificada por um fragmento de DNA inserido no sítio de clonagem do vetor. Podem ser gerados iniciadores para a PCR para incluir, por exemplo, um sítio de clivagem apropriado. Quando a proteína de ligação multivalente for usada exclusivamente para facilitar a expressão da porção de fusão ou for de algum modo indesejável como adesão ao peptídeo de interesse, a fusão da proteína de ligação multivalente recombinante poderá então ser clivada da porção GST da proteína de fusão. A construção de pGEX-3X/peptídeo de ligação multivalente é transformada em células de E. coli XL-I Blue (Stratagene, La Jolla CA) , e os transformantes individuais são isolados e desenvolvidos. O DNA de plasmídeo de transformantes individuais é purificado, e pode ser parcialmente seqüenciado com o uso de um seqüenciador automatizado para confirmar a presença da inserção do ácido nucléico que codifica a proteína de ligação multivalente desejado na
orientação adequada.
A proteína de ligação multivalente fundida, que pode ser produzida como um corpo de inclusão insoluvel nas bactérias, pode ser purificada da seguinte forma. As células hospedeiras podem ser coletadas por centrifugação,- lavadas em NaCl 0,15 Μ, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; e tratadas com lisozima 0,1 mg/ml (Sigma Chemical Co.) por 15 minutos em temperatura ambiente. O lisado pode ser depurado por sonificação, e os restos de células podem ser peletizados por centrifugação por 10 minutos a 12.000 X g. O péIete que contém a proteína de ligação multivalente fusão pode ser ressuspenso em Tris 50 mM, pH 8 e EDTA 10 mM, estratifiçado sobre glicerol 50%, e centrifugado por 30 minutos a 6.000 g. 0 pélete pode ser ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) padronizada sem Mg++ e Ca++. A fusão da proteína de ligação multivalente pode ser adicionalmente purificada por fracionamento do pélete ressuspenso em um gel de poliacrilamida desnaturante SDS (Sambrook e cols. ) . 0 gel é embebido em KCl 0,4 M para visualizar a proteína, que é removida e eluída eletricamente em tampão de processamento em gel desprovido de SDS. Caso a proteína de fusão de GST/peptídeo de ligação multivalente seja produzida em bactérias como uma proteína solúvel, ela poderá ser purificada com o uso do Módulo de Purificação de GST (Pharmacia Biotech).
A fusão da proteína de ligação multivalente é preferivelmente submetida à digestão para clivagem da GST do peptídeo de ligação multivalente da invenção. A reação de digestão (20-40 μg de proteína de fusão, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg (Sigma) em 0,5 ml de PBS)) pode ser incubada 16-4 8 horas em temperatura ambiente e carregada em um gel de SDS-PAGE desnaturante para fracionar os produtos de reação. O gel pode ser embebido em KCl 0,4 M para visualizar as bandas de proteína. A identidade da 3 0 banda de proteína que corresponde ao peso molecular esperado do peptídeo de ligação multivalente pode ser confirmada por análise da seqüência de aminoãcidos com a utilização de um seqüenciador automatizado (Applied Biosystems Modelo 473A, Foster City, CA). Alternativamente, a identidade pode ser confirmada realizando-se HPLC e/ou espectrometria de massa dos peptídeos.
Alternativamente, uma seqüência de DNA que codifica o peptideo de ligação multivalente pode ser clonada em um plasmídeo que contém um promotor desejado e, opcionalmente, uma seqüência líder (veja, por exemplo, Better e cols., Science, 240: 1.041-43, 1988). A seqüência dessa construção pode ser confirmada por seqüenciamento automatizado. 0 plasmideo pode então ser transformado em uma cepa de E. coli adequada, por exemplo, a cepa MClO61, usando procedimentos padronizados que empregam incubação com CaCl2 e tratamento por choque térmico das bactérias (Sambrook e cols.}. As bactérias transformadas podem crescer em meio LB suplementado com carbenicilina ou outra forma adequada de seleção, como é conhecido na técnica, e a produção da proteína expressa pode ser induzida por crescimento em um meio adequado. Se presente, a seqüência líder pode efetuar a secreção do peptídeo de ligação multivalente e ser clivada durante a secreção. A proteína recombinante secretada pode ser purificada do meio de cultura bacteriana pelos métodos aqui descritos abaixo.
Sistemas hospedeiros mamíferos para a expressão da proteína recombinante são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e são os sistemas preferidos. Podem ser escolhidas cepas de células hospedeiras para uma habilidade específica para processar a proteína expressa ou produzir certas modificações pós-tradução que serão úteis na geração da atividade da proteína. Essas modificações do polipeptídeo incluem, sem limitação, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Diferentes células hospedeiras como, por exemplo, células CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, e semelhantes, possuem maquinãrio celular e mecanismos característicos específicos para essas atividades pós-tradução, e podem ser escolhidas para assegurar modificação e processamento corretos da
proteína estanha.
É preferível que as células transformadas sejam usadas para a produção de longo prazo, de alto rendimento, de proteína e, dessa forma, é desejável a expressão estável. Após essas células serem transformadas com vetores que preferivelmente contêm pelo menos um marcador selecionãvel juntamente com o cassete de expressão desejado, as células crescem por 1-2 dias em um meio enriquecido, antes de serem movidas para o meio seletivo. 0 marcador selecionãvel é projetado para conferir resistência à seleção, e sua presença permite o crescimento e a recuperação de células que expressam com sucesso a proteína estanha. Os agrupamentos resistentes de células transformadas de forma estável podem ser proliferados com a utilização de técnicas de cultura de tecido adequadas à célula.
Podem ser usados diversos sistemas de seleção para recuperar as células que foram transformadas para a produção da proteína recombinante. Esses sistemas de seleção incluem, sem limitação, genes de timidina quinase de HSV, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase e adenina fosforibosiltransferase, em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Além disso, a resistência anti- metabólito pode ser usada como base da seleção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato; gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico; neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G418 e confere resistência ao clorsulfuron; e hygro, que confere resistência à higromicina. Genes selecionáveis adicionais que podem ser úteis incluem trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano, ou hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina. Marcadores que dão uma indicação visual para a identificação de transformantes incluem antocianinas, β-glucuronidase e seu substrato, GUS, e luciferase e seu substrato, luciferina.
Purificação de proteínas Técnicas de purificação de proteínas são bem
conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Essas técnicas envolvem, em um nível, o fracionamento bruto das frações polipeptídicas e não polipeptídicas. Após a separação do polipeptídeo de ligação muitivalente de pelo
2 0 menos outra proteína, o polipeptídeo de interesse é
purificado, mas freqüentemente é interessante a purificação adicional com o uso de técnicas cromatográficas e eletroforéticas para se obter a purificação parcial ou completa (ou purificação até a homogeneidade). Métodos analíticos particularmente adequados à preparação de um peptídeo de ligação multivalente puro são cromatografia por troca iônica, cromatografia por exclusão; eletroforese em gel de poliacrilamida e concentração isoelétrica. Métodos de purificação de peptídeos particularmente eficientes são
3 0 cromatografia líquida rápida de proteína e HPLC. Certos aspectos da presente invenção estão relacionados â purificação e, em modalidades especificas, a purificação substancial de uma proteína codificada ou peptídeo de ligação multivalente. 0 termo "proteína ou peptídeo de ligação multivalente purificado", como aqui usado, visa se referir a uma composição, isolável de outros componentes, em que a proteína ou o peptídeo de ligação multivalente é purificado em qualquer grau em relação ao seu estado obtenível naturalmente. Uma proteína ou peptídeo de ligação multivalente purificado, portanto, também se refere a uma proteína ou a um peptídeo de ligação multivalente, livre do ambiente no qual ocorre naturalmente.
Geralmente, "purificado" refere-se a uma composição de proteína de ligação multivalente que foi submetida ao fracionamento para remover vários outros componentes, e cu j a composição substancialmente retém sua atividade biológica expressa. Quando é usado o termo "substancialmente purificado", essa designação refere-se a uma composição de proteína de ligação multivalente na qual a proteína ou o peptídeo de ligação multivalente forma o componente principal da composição, por exemplo, constituindo cerca de 50%, cerca de 6 0%, cerca de 7 0%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99% ou mais da proteína, por peso, na composição.
Vários métodos para a quantificação do grau de purificação da proteína de ligação multivalente serão do conhecimento daqueles habilitados na técnica à luz da presente especificação. Esses incluem, por exemplo, a 3 0 determinação da atividade de ligação específica de uma fração ativa, ou por avaliação da quantidade de polipeptídeos de ligação multivalentes dentro de uma fração por análise SDS/PAGE. Um método preferido para avaliação da pureza de uma fração de proteína de ligação multivalente é pelo cálculo da atividade de ligação da fração, para compará-Io com a atividade de ligação do extrato inicial e, dessa forma, calcular o grau de purificação, aqui avaliado por um "número de vezes de purificação". As unidades reais usadas para representar a quantidade de atividade de ligação dependerão, evidentemente, da técnica de ensaio em particular escolhida para acompanhar a purificação e se a proteína ou o peptídeo de ligação multivalente expresso exibe ou não uma atividade de ligação detectãvel.
Várias técnicas adequadas ao uso na purificação de proteínas de ligação multivalentes são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Essas incluem, por exemplo, precipitação com sulfato de amônio, PEG, anticorpos, e semelhantes, ou desnaturação por aquecimento, seguida por centrifugação; etapas de cromatografia como, por exemplo, 2 0 cromatografia por troca iônica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa, filtração com hidroxilapatita e por afinidade; concentração isoelétrica; eletroforese em gel; e combinações dessas e de outras técnicas. Como geralmente é conhecido na técnica, acredita-
2 5 se que a ordem de realização das várias etapas de
purificação possa ser alterada, ou que certas etapas possam ser omitidas, e ainda resultem em um método adequado para a preparação de uma proteína de ligação multivalente substancialmente purificada.
3 0 Não há uma exigência geral de que a proteína de ligação multivalente sempre seja fornecida em seu estado mais purificado. Na verdade, é contemplado que proteínas de ligação menos substancialmente multivalentes terão utilidade em certas modalidades. A purificação parcial pode ser obtida com a utilização de menos etapas de purificação em combinação, ou pela utilização de formas diferentes do mesmo esquema geral de purificação. Por exemplo, observa-se que uma cromatografia em coluna de troca catiônica realizada com o uso de um aparelho de HPLC geralmente resultará em uma purificação maior do que a mesma técnica utilizando um sistema de cromatografia de baixa pressão. Métodos que exibem um grau baixo de purificação relativa podem ter vantagens na recuperação total do produto de proteína de ligação multivalente, ou na manutenção da atividade de ligação de uma proteína de ligação multivalente expressa.
Sabe-se que a migração de um polipeptídeo pode variar, algumas vezes significativamente, com diferentes condições de SDS/PAGE (Capaldi e cola., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1977) . Será observado, portanto, que, sob diferentes condições de eletroforese, os pesos moleculares aparentes de produtos de expressão da proteína de ligação multivalente purificada ou parcialmente purificada podem variar. Células efetoras
Células efetoras para a indução, por exemplo, de ADCC, ADCP (fagocitose celular dependente de anticorpo), e semelhantes, contra uma célula-alvo incluem leucócitos, macrófagos, monócitos, neutrófilos ativados, células natural killer (NK) ativadas e eosinófilos humanos. Células efetoras expressam FcaR (CD89) , FcyRIi FcyRII, FcyRIII, e/ou FeeRl e incluem, por exemplo, monócitos e neutrófilos ativados. Verificou-se que a expressão de FcyRI, por exemplo, é supra-regulada por interferon gama (IFN-y) . Essa expressão intensificada aumenta a atividade citotóxiea de monócitos e neutrófilos contra células-alvo.
Conseqüentemente, as células efetoras podem ser ativadas com (IFN-y) ou com outras citocinas (por exemplo, TNF-a ou β, fator de estimulação de colônias, IL-2) para aumentar a presença de FcyRI na superfície das células, antes de elas serem colocadas em contato com uma proteína multivalente da invenção.
As proteínas multivalentes da invenção fornecem uma função efetora de anticorpo, por exemplo, citotoxicidade mediada por células efetoras dependente de anticorpos (ADCC), para uso contra uma célula-alvo. Proteínas multivalentes com função efetora são administradas isoladamente, como aqui ensinado, ou após serem acopladas a uma célula efetora, formando, dessa forma, uma "célula efetora ativada". Uma "célula efetora ativada" é uma célula efetora, como aqui definida, ligada a uma proteína multivalente com função efetora, também como aqui definida, de tal forma que a célula efetora seja fornecida eficazmente com uma função de direcionamento, antes da
administração.
Células efetoras ativadas são administradas in vivo como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. 0 número de células administradas está na ordem de IO8-IO9, mas ira variar, dependendo da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter localização da célula efetora na célula-alvo, e para fornecer um nível desejado de função da célula efetora naquele local, por exemplo, morte celular por ADCC e/ou fagocitose. 0 termo "solução fisiologicamente aceitável", como aqui usado, visa incluir qualquer solução de veículo que estabilize as células efetoras direcionadas para administração in vivo, incluindo, por exemplo, solução salina e soluções-tampão aquosas, solventes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, e semelhantes.
Conseqüentemente, outro aspecto da invenção fornece um método de indução de uma função efetora específica de anticorpo, por exemplo, ADCC, contra uma célula em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma proteína multivalente (ou do ácido nucléico codificador) ou de célula efetora ativada em um meio fisiologicamente aceitável. As vias de administração podem variar, e as vias de administração adequadas serão determinadas por aqueles habilitados na técnica
2 0 considerando-se as variáveis específicas do caso e
procedimentos de rotina, como é conhecido na técnica.
Efeitos independentes de células
Também são fornecidos efeitos independentes de células pelas moléculas multivalentes da invenção, por exemplo, fornecendo-se uma funcionalidade de CDC. 0 sistema complemento é uma cascata bioquímica do sistema imunológico que ajuda a depurar materiais estranhos como, por exemplo, patógenos, de um organismo. Ele é derivado de proteínas plasmáticas muito pequenas que trabalham em conjunto na
3 0 indução de citólise de uma célula-alvo por ruptura da membrana plasmática da célula-alvo. 0 sistema complemento consiste em mais de 35 proteínas solúveis e ligadas à célula, 12 das quais estão diretamente envolvidas nas vias do complemento. As proteínas estão ativas em três vias bioquímicas que levam à ativação do sistema complemento: a via clássica do complemento, a via alternativa do complemento, e a via de lectina de ligação de Anticorpos, em particular a classe IgGl, também podem "fixar" complemento. Uma descrição detalhada dessas vias pode ser obtida na técnica, e não será repetida nesta especificação, mas vale ressaltar que a citotoxicidade dependente de complemento não depende da interação de uma molécula de ligação com uma célula, por exemplo, uma célula B, do sistema imunológico. Também vale ressaltar que o sistema complemento é regulado por proteínas de regulação do complemento. Essas proteínas estão presentes em concentrações maiores no plasma do sangue do que as proteínas do complemento. As proteínas de regulação do complemento são encontradas nas superfícies de células self, fornecendo um mecanismo para evitar que as células self sejam visadas pelas proteínas do complemento. Supõe-se que o sistema complemento participe de várias doenças com um componente imune, por exemplo, síndrome de Barraquer- Simons, doença de Alzheimer, asma, lúpus eritematoso, várias formas de artrite, doença cardíaca autoimune e esclerose múltipla. Deficiências na via terminal predispõem um indivíduo tanto a doenças autoimunes quanto a infecções
(particularmente meningite).
Doenças, distúrbios e condições
A invenção fornece as proteínas de ligação multivalentes com função efetora, e variantes e derivados destas, que se ligam a um ou mais parceiros de ligação, e esses eventos de ligação são úteis no tratamento, prevenção ou atenuação de um sintoma associado a uma doença, distúrbio ou condição patológica, preferivelmente que aflige seres humanos. Em modalidades preferidas desses métodos, a proteína de ligação multivalente (e multiespecífica) com função efetora associa uma célula que abriga um alvo, por exemplo, um marcador da superfície celular tumor-específico, a uma célula efetora, por exemplo, uma célula do sistema imunológico que exibe atividade citotóxica. Em outras modalidades, a proteína de ligação multivalente, multiespecífica, com função efetora se liga especificamente a dois marcadores da superfície celular diferentes específicos para uma doença ou um distúrbio ou uma condição, para assegurar que o alvo correto está associado a uma célula efetora, por exemplo, uma célula citotóxica do sistema imunológico. Adicionalmente, a proteína de ligação multivalente com função efetora pode ser usada para induzir ou aumentar a atividade do antígeno, ou para inibir a atividade do antígeno. As proteínas de ligação multivalentes com função efetora também são adequadas às terapias combinadas e a
regimes paliativos.
Em um aspecto, a presente invenção fornece composições e métodos úteis para o tratamento ou prevenção de doenças e condições caracterizadas por níveis aberrantes de atividade do antígeno associados a uma célula. Essas doenças incluem cânceres e outras condições hiperproliferativas, por exemplo, hiperplasia, psoríase, dermatite de contato, distúrbios imunológicos e inf ertilidade. Uma ampla variedade de cânceres, incluindo tumores sólidos e leucemias, responde às composições e aos métodos aqui revelados. Os tipos de câncer que podem ser tratados incluem, sem limitação: adenocarcinoma da mama, próstata e cólon; todas as formas de carcinoma broncogênico do pulmão; mielóide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; sindrome carcinóide maligna; doença cardíaca carcinóide; e carcinoma (por exemplo, Walker, de células basais, baso-escamoso, de Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, de célula de Merkel, mucinoso, pulmonar de pequenas células, oat cells, papilar, fibroso, bronquiolar, broncogênico, de células escamosas e de células transicionais). Tipos de cânceres adicionais que podem ser tratados incluem: distúrbios histiocíticos; leucemia; histiocitose maligna; doença de Hodgkin; pequena imunoproliferativa; Iinfoma não Hodgkin; plasmacitoma; reticuloendoteliose; melanoma; condroblastoma; condroma; condrossarcoma; fibroma;
fibrossarcoma; tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; lipossarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; cordoma; craniofaringioma;
desgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miossarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor trofoblãstico. Além disso, os seguintes tipos de cânceres também são contemplados como sensíveis ao tratamento: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cistadenocarcinoma; cistadenoma; tumor de células granulosas; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor de células da ilhota; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de Sertoli; tumor de células da teca; leiomioma; Ieiomiossarcoma; mioblastoma; mioma;
miossarcoma; rabdomioma; rabdomiossarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; paraganglioma não cromafina. Os tipos de cânceres que podem ser tratados também incluem, sem limitação, angioceratoma; hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose;
glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma;
hemangiopericitoma; hemangiossarcoma; linfangioma;
linfangiomioma; Iinfangiossarcoma; pinealoma;
carcinossarcoma; condrossarcomacistossarcoma f ilóide; fibrossarcoma; hemangiossarcoma; leiomiossarcoma;
Ieucossarcoma; Iipossarcoma; Iinfangiossarcoma;
miossarcoma; mixossarcoma; carcinoma ovariano;
rabdomiossarcoma; sarcoma; neoplasmas; neurof ibromatose; e displasia cervical. A invenção ainda fornece composições e métodos úteis no tratamento de outras condições nas quais as células tornaram-se imortalizadas ou hiperproliferativas em decorrência da expressão anormalmente elevada de antígeno.
Exemplos dos diversos distúrbios hiperproliferativos que respondem às composições e aos métodos da invenção cânceres de células B incluem Iinfornas de células B (por exemplo, várias formas de doença de Hodgkin, Iinfoma não Hodgkin (NHL) ou linfomas do sistema nervoso central), leucemias (por exemplo, leucemia Iinfoblãstica aguda (ALL), leucemia IinfocItica crônica (CLL), leucemia de células pilosas e leucemia mieloblãstica crônica) e mielomas (por exemplo, mieloma múltiplo). Cânceres de células B adicionais incluem pequeno linfoma linfocitico, leucemia prolinfocitica de células Bi linfoma Iinfoplasmacítico, linfoma da zona marginal esplênica, mieloma de células plasmãticas, plasmocitoma solitário dos ossos, plasmocitoma extra-ósseo, linfoma de células B da zona marginal extranodal do tecido linfóide associado ã mucosa (MALT), linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastinico (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de efusão primária, Iinfoma/leucemia de Burkitt, proliferações de células B de potencial maligno incerto, granulomatose linfomatóide e distúrbio linfoproliferativo
pós-transplante.
Distúrbios caracterizados por produção de auto- anticorpos são freqüentemente considerados doenças autoimunes. Doenças autoimunes incluem, sem limitação: artrite, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, policondrite, artrite psoriática, psoríase, dermatite, polimiosite/dermatomiosite, miosite por corpo de inclusão, miosite inflamatória, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia e esclerose sistêmicas, síndrome CREST, respostas associadas à doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome do sofrimento respiratório, sindrome do sofrimento respiratório do adulto (ARDS), meningite, encefalite, uveite, colite, glomerulonefrite, condições alérgicas, eczema, asma, condições que envolvem infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesão leucocitãria, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), lúpus eritematoso cutâneo subagudo, lúpus discóide, mielite lúpica, cerebrite lúpica, diabetes de surgimento juvenil, esclerose múltipla, > encefalomielite alérgica, neuromielite óptica, febre reumãtica, coréia de Sydenham, respostas imunes associadas à hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e Iinfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose, incluindo granulomatose de Wegener e doença de Churg-Strauss, agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite/angexte por hipersensibilidade, ANCA e vasculite reumatóide), anemia aplásica, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolitica imune, incluindo anemia hemolitica autoimune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia pura de células vermelhas (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese de leucócitos, distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central (SNC), sindrome de lesão de múltiplos órgãos, miastenia gravis, 2 0 doenças mediadas por complexo antigeno-anticorpo, doença da membrana basal anti-glomerular, sindrome do anticorpo anti- fosfolipídeo, neurite alérgica, doença de Behcet, sindrome de Castleman, sindrome de Goodpasture, sindrome miastênica de Lambert-Eaton, sindrome de Reynaud, sindrome de Sjõrgen,
2 5 sindrome de Stevens-Johnson, rej eição de transplantes de
órgãos sólidos, doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), penfigóide bolhoso, pênfigo, poliendocrinopatias autoimune, espondiloartropatias soro-negativas, doença de Reiter, sindrome stiff-man, arterite de células gigantes, nefrite
3 0 por complexo imune, nefropatia por IgA, polineuropatias por IgM ou neuropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), púrpura de Henoch-Schonlein, trombocitopenia autoimune, doença autoimune dos testículos e do ovário, incluindo orquite e ooforite autoimune, hipotireoidismo primário; doenças endócrinas autoimunes, incluindo tireoidite autoimune, tireoidite crônica {tireoidite de Hashimoto), tireoidite subaguda, hipotireoidismo
idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndromes poliglandulares autoimunes (ou sindromes de endocrinopatia poliglandular), diabetes do Tipo I, também chamado diabetes melito insulino-dependente (IDDM) e sindrome de Sheehan; hepatite autoimune, pneumonite Iinfóide intersticial (HIV), bronquiolite obliterante (não transplante) vs. NSIP, sindrome de Gui1Iain-Barré, vasculite de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e arterite de células gigantes (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença de Kawasaki e poliarterite nodosa), poliarterite nodosa (PAN), espondilite anquilosante, doença 2 0 de Berger (nefropatia por IgA) , glomerulonefrite rapidamente progressiva, cirrose biliar primária, psilose celiaca (enteropatia por glúten), crioglobulinemia, crioglobulinemia associada à hepatite, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença da artéria coronária, febre 2 5 familiar do Mediterrâneo, poliangeíte microscópica, sindrome de Cogan, sindrome de Whiskott-Aldrich e tromboangelte obliterante.
A artrite reumatóide (RA) é uma doença crônica caracterizada por inflamação das articulações, levando a edema, dor e perda de função. Pacientes que possuem RA por um período de tempo prolongado normalmente exibem destruição articular progressiva, deformidade, incapacidade e até mesmo morte prematura. Além da RA, doenças, distúrbios e condições inflamatórias em geral são passíveis de tratamento, prevenção ou atenuação dos sintomas (por exemplo, calor, dor, edema, vermelhidão) associados ao processo de inflamação, e as composições e os métodos da invenção são benéficos no tratamento, prevenção ou atenuação de processos inflamatórios aberrantes ou anormais, incluindo RA.
A doença de Crohn e uma doença relacionada, a colite ulcerativa, são as duas categorias principais de doenças que pertencem a um grupo de enfermidades denominado "doença inflamatõria do intestino" (IBD). A doença de Crohn é um distúrbio crônico que causa inflamação do trato digestivo ou gastrintestinal (GI) . Embora possa envolver qualquer área do trato GI da boca ao ânus, ela afeta mais comumente o intestino delgado e/ou cólon. Na colite ulcerativa, o envolvimento GI limita-se ao cólon. A doença de Crohn pode ser caracterizada por anticorpos contra antígenos de neutrófilos, ou seja, pelo "anticorpo perinuclear anti- neutrófilo" (pANCA) e Saccharomyces cerevisiae, ou seja, o "anticorpo anti-Saccharomyces cerevisiae" (ASCA). Muitos pacientes com colite ulcerativa possuem o anticorpo pANCA
2 5 no sangue, mas não o anticorpo ASCA, enquanto muitos
pacientes com doença de Crohn exibem anticorpos ASCA, e não anticorpos pANCA. Um método de avaliar a doença de Crohn é a utilização do índice de Atividade de Doença de Crohn (CDAI) , com base nas pontuações de 18 variáveis
3 0 prognósticas coletadas pelos médicos. Valores do CDAI iguais ou inferiores a 150 estão associados à doença quiescente; valores acima indicam doença ativa, e valores acima de 450 são observados em casos da doença extremamente graves [Best e cols., "Development of a Crohn's disease activity index". Gastroenterolo^y 70: 439-444 (1976)] . No entanto, desde o estudo original, alguns pesquisadores usam um "valor subjetivo" de 200 a 250 como uma pontuação saudável.
0 lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é uma doença autoimune causada por lesões recorrentes aos vasos sangüíneos em vários órgãos, incluindo os rins, a pele e articulações. Nos pacientes com SLE, uma interação defeituosa entre células T e células B resulta na produção de auto-anticorpos que atacam o núcleo das células. Há uma concordância geral de que os auto-anticorpos são responsáveis pelo SLE e, portanto, novas terapias que eliminem a linhagem de células B, permitindo que o sistema imunológico seja reiniciado com novas células B geradas por precursores, dariam esperanças para um benefício de longo
2 0 prazo em pacientes com SLE.
A esclerose múltipla (MS) também é uma doença autoimune. Ela é caracterizada por inflamação do sistema nervoso central e destruição de mielina, que isola as fibras das células nervosas no cérebro, na medula vertebral e no corpo. Embora a causa da MS seja desconhecida, é amplamente aceito que células T autoimunes sej am contribuintes primários para a patogênese da doença. No entanto, níveis elevados de anticorpos estão presentes no líquido cefalorraquidiano de pacientes com MS, e algumas
3 0 teorias prevêem que a resposta de células B que leva à produção de anticorpos seja importante para mediação da doença.
A doença tireoidiana autoimune decorre da produção de auto-anticorpos que estimulam a tireóide a causar hipertireoidismo (doença de Graves) ou destroem a tireóide, causando hipotireoidismo (tireoidite de Hashimoto). A estimulação da tireóide é causada por auto-anticorpos que se ligam e ativam o receptor do hormônio estimulante da tireóide (TSH). A destruição da tireóide é causada por auto-anticorpos que reagem com outros antígenos da tireóide.
Doenças, distúrbios e condições adicionais sensíveis aos benefícios fornecidos pelas composições e pelos métodos da invenção incluem síndrome de Sjõgren, que é uma doença autoimune caracterizada por destruição das glândulas produtoras de umidade do corpo. Além disso, a púrpura trombocitopênica imune (ITP) é causada por auto-anticorpos que se ligam às plaquetas sangüíneas e causam sua destruição, e essa condição é adequada à aplicação dos materiais e métodos da invenção. A miastenia gravis (MG) , um distúrbio neuromuscular autoimune crônico caracterizado por auto-anticorpos que se ligam aos receptores de acetilcolina expressos em junções neuromusculares, levando à fraqueza dos grupos musculares voluntários, é uma doença que possui sintomas que são tratáveis com o uso da composição e dos métodos da invenção, e espera-se que a invenção seja benéfica no tratamento e/ou na prevenção de MG. Além disso, espera-se que infecções pelo vírus do sarcoma de Rous sejam passíveis de tratamento ou atenuação de pelo menos um sintoma, com as composições e os métodos da invenção.
Outro aspecto da presente invenção é a utilização dos materiais e métodos da invenção para evitar e/ou tratar qualquer condição hiperproliferativa da pele, incluindo psorlase e dermatite de contato ou outras doenças hiperproliferativas. Por exemplo, a psoríase, que é caracterizada por inflamação autoimune da pele e também está associada â artrite em 30% dos casos, bem como esclerodermia, doença inflamatória do intestino, incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa. Foi demonstrado que pacientes com psoriase e dermatite de contato possuem atividade elevada do antígeno dentro dessas lesões (Ogoshi e cols., J. Inv, Dermatol., 110: 818-23 [1998]). As proteínas de ligação multivalentes e multiespecificas podem liberar uma célula citotóxica do sistema imunológico, por exemplo, diretamente às células dentro das lesões que expressam niveis elevados de antígeno. As proteínas de ligação multivalentes, por exemplo, multiespecificas, podem ser administradas por via subcutânea nas vizinhanças das lesões, ou com a utilização das diversas vias de administração aqui descritas, e de outras que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
Também é contemplado o tratamento de miopatia inflamatória idiopãtica (IIM), incluindo dermatomiosite (DM) e polimiosite (PM) . As miopatias inflamatórias foram categorizadas com a utilização de diversos esquemas de classificação. 0 esquema de classificação de Miller (Miller, Rheum. Dis, Clin. North. Am. 20: 811-826, 19 94) identifica 2 miopatias inflamatórias idiopáticas (IIM), polimiosite (PM) e dermatomiosite (DM). A polimiosite e a dermatomiosite são doenças inflamatórias crônicas, debilitantes, que envolvem os músculos e, no caso de DM, a pele. Esses distúrbios são raros, com uma incidência anual relatada de aproximadamente 5 a 10 casos por milhão de adultos, e de 0,6 a 3,2 casos por milhão de crianças por ano nos Estados Unidos (Targoff, Curr. Probl. Dermatol. 1991, 3: 131-180). A miopatia inflamatória idiopãtica está associada a morbidade e mortalidade significativas, com até metade dos adultos afetados apresentando um grau de invalideζ importante (Gottdiener e cols. , Am. J. Cardiol. 1978, 41: 1 .141-49) . Miller (Rheum. Dis. Clin. North Am. 1994, 20: 811-826 e "Arthritis and Allied Conditions"/ Capítulo 75, Eds. Koopman e MoreIand, Lippincott Williams e Wilkins, 2 005) define cinco grupos de critérios usados para o diagnóstico de MII, ou seja, avaliação dos Critérios para Miopatia Inflamatória Idiopática (IIMC), incluindo fraqueza muscular, evidências de degeneração na biópsia, elevação dos níveis séricos de enzimas associadas aos músculos, 2 0 tríade eletromagnética de miopatia, evidências de erupções na dermatomiosite, e também inclui evidências de auto- anticorpos como critérios secundários.
Fatores associados à MII, incluindo enzimas associadas aos músculos e auto-anticorpos, incluem, sem limitação, creatina quinase (CK), lactato desidrogenase, aldolase, proteína C-reativa, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e auto-anticorpo antinuclear (ANA) , anticorpos específicos para miosite (MSA) e anticorpo para antígenos nucleares extraiveis. Doenças autoimunes preferidas sensíveis aos métodos da invenção incluem doença de Crohn, síndrome de Guillain- Barré (GBS; também conhecida como polineuropatia desmielinizante inflamatória aguda, polirradiculoneurite idiopática aguda, polineurite idiopãtica aguda e paralisia ascendente de Landry), lúpus eritematoso, esclerose múltipla, miastenia gravis, neurite óptica, psoríase, artrite reumatóide, hipertireoidismo {por exemplo, doença de Graves), hipotireoidismo (por exemplo, doença de Hashimoto), tireoidite de Ord (uma tireoidite similar à doença de Hashimoto), diabetes melito (tipo 1) , anemia aplásica, sindrome de Reiter, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, sindrome do anticorpo antifosfolipideo (APS), síndrome de opsoclônus mioclônus (OMS), arterite temporal (também conhecida como "arterite de células gigantes"), encefalomielite aguda disseminada (ADEM), sindrome de Goodpasture, granulomatose de Wegener, doença celíaca, pênfigo, poliartrite canina, anemia hemolítica autoimune quente. Além disso, a invenção contempla métodos para o tratamento ou atenuação de um sintoma associado às
2 0 seguintes doenças: endometriose, cistite intersticial,
neuromiotonia, esclerodermia, vitiligo, vulvodinia, doença de Chagas que causa cardiopatia chagásica (cardiomegalia), sarcoidose, sindrome da fadiga crônica e disautonomia.
Acredita-se que o sistema complemento participe de muitas doenças com um componente imune, por exemplo, doença de Alzheimer, asma, lúpus eritematoso, várias formas de artrite, doença cardíaca autoimune e esclerose múltipla, todas contempladas como doenças, distúrbios ou condições passíveis de tratamento ou de atenuação de sintomas com o
3 0 uso dos métodos de acordo com a invenção. Certas sub-regiões constantes são preferidas, dependendo da função ou funções efetoras específicas a serem exibidas por uma molécula de ligação multivalente de cadeia simples. Por exemplo, IgG (IgGl, 2 ou 3) e IgM são preferidas para ativação de complemento, IgG de qualquer subtipo é preferida para opsonização e neutralização de toxinas; IgA é preferida para ligação a patógenos; e IgE para ligação de parasitas como, por exemplo, vermes.
Como exemplo, FcRs que reconhecem a região constante de anticorpos IgG foram encontrados em leucócitos humanos como três tipos distintos de receptores Fcy, que são distinguiveis por propriedades estruturais e funcionais, bem como por estruturas antigênicas detectadas por anticorpos monoclonais CD. Eles são conhecidos como FcyRI, FcyRII e FcyRIII, e são expressos dif erencialmente em subconjuntos (sobrepostos) de leucócitos.
FcgRI (CD64) , um receptor de alta afinidade expresso em monócitos, macrófagos, neutrófilos, precursores mielóides e células dendríticas, é composto pelas isoformas Ia e Ib. FcgRI possui uma afinidade elevada por IgGl humana monomérica e IgG3. Sua afinidade por IgG4 é cerca de 10 vezes menor, e não se liga à IgG2. FcgRI não apresenta polimorfismo genético.
FcyRII (CD3 2) , composta pelas isoformas IIa, IIbl, IIb2, IIb3 e IIc, é o tipo de FcyR humano mais amplamente distribuído, sendo expresso na maioria dos tipos de leucócitos sangüíneos, bem como em células de Langerhans, células dendríticas e plaquetas. FcyRII é um receptor de baixa afinidade que só se liga â IgG agregada. É a única classe de FcyR capaz de se ligar à IgG2. FcyRIIa mostra polimorfismo genético, resultando em dois alótipos distintos, FcyRIIa-H131 e FcyRIIa-R131, respectivamente. Esse polimorfismo funcional é atribuível a uma única diferença de aminoãcido: um único resíduo de histidina (H) ou uma arginina (R) na posição 131, que é critica para a ligação à IgG. FcyRIIa se liga prontamente a IgG e IgG3 humanas, e parece que não se liga à IgG4. O FcyRIIa-Hl31 possui uma afinidade bem maior para IgG2 em complexo do que o alótipo FcyRIIa-R131. FcyRIII (CD16) possui duas isoformas ou tipos
alélicos, ambos capazes de se ligar a IgGl e IgG3. 0 FcyRIIa, com uma afinidade intermediária por IgG, é expresso em macrófagos, monócitos, células natural killer (NK) e subconjuntos de células T. FcyRIIIb é um receptor de baixa afinidade por IgG,
expresso seletivamente em neutrófilos. É um receptor altamente móvel, com colaboração eficiente com outros receptores da membrana. Estudos com dímeros de IgG de mie Ioma demonstraram que apenas IgGl e IgG3 se ligam ao FcyRIIIb (com baixa afinidade), enquanto não foi verificada ligação com IgG2 e IgG4. 0 FcyRIIIb abriga um polimorfismo co-dominante, bi-alélico, com os alótipos serldo designados NAl (antígeno de neutrófilo) e NA2.
Ainda outro aspecto da invenção é uso dos materiais e métodos da invenção para combater, ao tratar, evitar ou atenuar, os efeitos de infecção resultante de qualquer um dentre diversos agentes infecciosos. As moléculas de ligação multiespecificas e multivalentes da invenção são projetadas para recrutar eficiente e eficazmente o sistema 3 0 imunológico do organismo do hospedeiro para resistir à infecção que surge em decorrência de um organismo estranho, uma célula estranha, um vírus estranho ou um obj eto inanimado estranho. Por exemplo, uma molécula de ligação multiespecífica pode ter um domínio de ligação que se liga especificamente a um alvo em um agente infeccioso, outro domínio de ligação que se liga especificamente a um alvo em uma célula de apresentação de antígeno, por exemplo, CD 40, CD 8 0, CD8 6, DC-SIGN, DEC-205, CD8 3, e semelhantes. Alternativamente, cada domínio de ligação de uma molécula de ligação multivalente pode se ligar especificamente a um agente infeccioso e, dessa forma, neutralizar mais eficazmente o agente. Além disso, a invenção contempla moléculas de ligação multivalentes e multiespecíficas que se ligam especificamente a um alvo em um agente infeccioso e a um parceiro de ligação não associado a uma célula, o que pode ser eficaz em conjunto com uma função efetora da molécula de ligação multiespecífica no tratamento ou na prevenção de infecção causada por um agente infeccioso.
Células infecciosas contempladas pela invenção incluem 2 0 qualquer célula infecciosa conhecida, incluindo, sem limitação, qualquer uma dentre diversas bactérias (por exemplo, E. coli patogênica, S. typhimurium, P. aeruginosa, B. anthracis, C. botulínum, C. difficile, C. perfringens, H. pylori, V. cholerae, e semelhantes), micobactérias,
2 5 micoplasma, fungos {incluindo levedura e bolores) e
parasitas (incluindo qualquer membro parasítico conhecido entre protozoãrios, trematódeos, cestódeos e nematódeos) . Vírus infecciosos incluem, sem limitação, vírus eucarióticos (por exemplo, adenovírus, buniavírus,
3 0 herpesvírus, papovavírus, paramixovírus, picornavírus, poxvírus, reovírus, retrovírus, e semelhantes), além de bacteriófagos. Objetos estranhos incluem objetos que entram em um organismo, preferivelmente um ser humano, independentemente do modo de entrada e independentemente de se há a intenção de ferir. Em função da prevalência crescente de agentes infecciosos resistentes a multifármacos {por exemplo, bactérias), particularmente como agentes etiológico de infecção hospitalar, os materiais e métodos da invenção fornecem uma abordagem de tratamento que evita as dificuldades impostas por resistência antibiótica crescente.
Doenças, condições ou distúrbios associados aos agentes infecciosos e passíveis de tratamento (profilãtico ou terapêutico) com os materiais e métodos aqui revelados incluem, sem limitação, antraz, aspergilose, meningite bacteriana, pneumonias bacterianas (por exemplo, pneumonias por clamidia), blastomicose, botulismo, brucelose, candidíase, cólera, coccidiomicose, criptococose, E. coli diarréica, êntero-hemorrágica ou êntero-toxigênica, difteria, mormo, histoplasmose, legionelose, lepra, listeriose, nocardiose, pertussis, salmonelose,
escarlatina, esporotricose, amidalite estreptocócica, síndrome do choque tóxico, diarréia do viajante e febre tifóide.
Aspectos e detalhes adicionais da invenção ficarão
evidentes a partir dos exemplos que serão apresentados a seguir, que visam ser ilustrativos, e não limitantes. 0 Exemplo 1 descreve a clonagem recombinante de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina. 0 3 0 Exemplo 2 descreve a construção de pequenos produtos imunofarmacêuticos modulares. O Exemplo 3 descreve a construção de um protótipo de cassete para uma proteína de ligação multivalente com função efetora. 0 Exemplo 4 descreve estudos de ligação e expressão com esse protótipo inicial da molécula. O Exemplo 5 descreve a construção de construções alternativas derivadas desse protótipo inicial da molécula, nas quais a seqüência da região do ligante entre o EFD e BD2 foi alterada tanto no comprimento quanto na seqüência. Além disso, ele descreve formas alternativas nas quais a orientação de regiões V no domínio de ligação 2 também foi alterada. O Exemplo 6 descreve estudos subseqüentes de ligação e funcionais sobre essas construções alternativas com formas variantes do ligante, que identificam a clivagem na região do ligante em várias dessas formas derivadas, e as novas variantes de seqüência desenvolvidas para solucionar esse problema. O Exemplo 7 descreve a construção de uma modalidade preferida alternativa das proteínas de fusão muitivalentes e multiespecíficas, nas quais BDl e BD2 se ligam aos antígenos no mesmo tipo de célula (CD20 e CD37), ou outra proteína de fusão multiespecífica na qual a especificidade de ligação de antígeno para BD2 foi alterada para um CD3 humano, em vez de CD28. O Exemplo 8 descreve os estudos de ligação e funcionais realizados com as construções multiespecíficas CD20-hIgG-CD37. 0 Exemplo 9 descreve os estudos de ligação e funcionais com as construções da proteína de fusão multivalente CD20-hIgG-CD3. O Exemplo 10 revela moléculas de ligação multivalentes que possuem ligantees com base em regiões específicas dos domínios 3 0 extracelulares de membros da superfamília das imunoglobulinas. 0 Exemplo 11 revela ensaios para a identificação de domínios de ligação supostamente eficazes em moléculas de ligação multivalentes na obtenção de pelo menos um efeito benéfico identificado como estando associado a essas moléculas {por exemplo, tratamento de doenças).
Exemplo 1
Clonagem de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de
imunoglobulina
Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado
para despertar anticorpos a certo alvo antigênico. Além disso, qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para clonar as regiões variáveis da cadeia leve e/ou pesada de imunoglobulina, bem como a sub-região constante de um anticorpo ou anticorpos. O método a seguir fornece um método de clonagem exemplar. A. Isolamento de RNA total
Para clonar as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de imunoglobulina, ou a sub-região constante, RNA 2 0 total é isolado de células de hibridoma que secretam o anticorpo apropriado. Células (2 χ IO7) da linhagem de células de hibridoma são lavadas com Ix PBS e peletizadas por meio de centrifugação em um tubo de polipropileno de 12 χ 75 mm de fundo redondo (Falcon no. 2059). Reagente de 2 5 Isolamento de RNA Total TRIzol™ (Gibco BRL, Life Technologies, N0 de catálogo 15596-018) é adicionado (8 ml) a cada tubo, e as células são lisadas por meio de pipetagem repetida. O lisado é incubado por 5 minutos em temperatura ambiente, antes da adição de 1,6 ml (0,2 χ volume) de clorofórmio e agitação vigorosa por 15 segundos. Após repouso por 3 minutos em temperatura ambiente, os lisados são centrifugados a 9.000 rpm por 15 minutos em um rotor pré-resfriado a 4°C Beckman JA-17 a fim de separar as fases aquosas e orgânicas. A fase aquosa superior {cerca de 4,8 ml) é transferida para um novo tubo e misturada gentilmente com 4 ml de isopropanol. Após uma incubação de 10 minutos em temperatura ambiente, o RNA é precipitado por centrifugação a 9.000 rpm em um rotor JA-17 a 4°C por 11 minutos. O péIete de RNA é lavado com 8 ml de etanol 75% gelado, e re-peletizado por centrifugação a 7.000 χ rpm por 7 minutos em um rotor JA-17 a 4°C. 0 etanol lavado é decantado, e os péletes de RNA são secos ao ar por 10 minutos. Os péletes de RNA são ressuspensos em 150 μΐ de ddH20 tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) contendo 1 μΐ de Inibidor RNase (N° de Catálogo 799017; Boehringer Mannhe im/Roche) por 1 ml de ddH20 tratada com DEPC. Os péletes são ressuspensos por pipetagem suave e são incubados por 20 minutos a 55°C. As amostras de RNA são quantificadas por medida da OD260 nm de alíquotas diluídas
2 0 (1,0 unidade de OD26Onm = 40 μ5/τη1 de RNA) .
B. Amplificação rápida de extremidades de cDNA É realizada RACE 5' para amplificar as extremidades das regiões variáveis de cadeia pesada e leve, ou da sub- região constante. 0 Sistema RACE 5' para o Kit para Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA versão 2.0 (Life Technologies, N0 de Catálogo 18374-058) é usado de acordo com as instruções do fabricante. Iniciadores de oligonucleotídeos degenerados RACE 5' são proj etados para combinar, por exemplo, com as regiões constantes das duas
3 0 classes comuns de cadeias pesadas de imunoglobulina de camundongo (IgGl e IgG2b) com a utilização do programa de proj eto de oligonucleotídeos Oligo versão 5.1 (Molecular Biology Insights, Cascade CO). Também são projetados iniciadores para combinar com a região constante da cadeia leve de IgG kappa de camundongo. Essa é a única classe de cadeia leve de imunoglobulina e, portanto, não há necessidade de degeneração no projeto do iniciador. As seqüências dos iniciadores são as seguintes: Nome da seqüência ID. DE SEQ. N0
Cadeia pesada GSPl
5' AGGTGCTGGAGGGGACAGTCACTGAGCTGC3' 7
Cadeia pesada abrigada
5' GTCACWGTCACTGRCTCAGGGAARTAGC3' 8
(W = A OU T; R = A ou G) Cadeia leve GSPl
5' GGGTGCTGCTCATGCTGTAGGTGCTGTCTTTGC3 ' 9
Cadeia leve abrigada 5' CAAGAAGCACACGACTG
AGGCACCTCCAGATG 3' 10
Iniciador de ancoragem abreviado RACE 5' 5' GGCCACGCGTCGACTAGTACGG
GNNGGGNNGGGNNG 3' 11
Para amplificar o componente da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, a reação de transcriptase reversa é realizada em um tubo de PCR de paredes finas de 0,2 ml contendo 2,5 pmol de iniciador de cadeia pesada GSPl {ID. DE SEQ. N°: 7), 4 pg de RNA total isolado de um clone de hibridoma adequado (por exemplo, clone 4A5 ou clone 4B5) , e 12 μΐ de ddH20 tratada com DEPC. Da mesma forma, para o componente de cadeia leve de camundongo, a reação de transcriptase reversa é realizada em um tubo de PCR de paredes finas de 0,2 ml contendo 2,5 pmol de um iniciador de cadeia leve GSPl (ID. DE SEQ. N°: 9), 4 pg de RNA total de um clone de hibridoma adequado {por exemplo, clone 4A5 ou clone 4B5) , e 12 μΐ de ddH20 tratada com DEPC.
As reações são realizadas em um ciclador térmico programãvel PTC-100 (MJ research Inc., Waltham, MA) . A mistura é incubada a 700C por 10 minutos para desnaturar o RNA, e depois resfriada em gelo úmido por 1 minuto. Os tubos são centrifugados brevemente a fim de coletar umidade das tampas dos tubos. Subseqüentemente, são adicionados os seguintes componentes ã reação: 2,5 μΐ de IOx tampão de PCR (Tris-HCl 200 mM, pH 8,4, KCl 500 mM) , 2,5 μΐ de MgCl2 25 mM, 1 μΐ de mistura de dNTP 10 mM e 2,5 μΐ de DTT 0,1 M. Após mistura de cada tubo por pipetagem suave, os tubos são colocados em um ciclador térmico PTC-10 0 a 42 0C por 1 minuto para pré-aquecer a mistura. Subseqüentemente, 1 μΐ {200 unidades) de Transcriptase Reversa SuperScript™ II (Gibco-BRL; N0 de Catálogo 18089-011) é adicionado a cada tubo, misturado gentilmente por pipetagem, e incubado por 45 minutos a 42°C. As reações são cicladas até 70°C por 15 minutos para terminar a reação, e depois cicladas até 37°C. Mistura de RNase (1 μΐ) é então adicionada a cada tubo de reação, misturada gentilmente e incubada a 37°C por 30 minutos.
0 cDNA de primeira fita gerado pela reação de transcriptase reversa é purificado com o Cartucho Spin de Isolamento de DNA GlassMAX (Gibco-BRL) de acordo com as instruções do fabricante. A cada reação de primeira fita, 120 μΐ de solução de ligação de NaI 6 M são adicionados. A solução de cDNA/Nal é então transferida em um cartucho spin GlassMAX, e centrifugada por 20 segundos a 13.000 χ g. As inserções do cartucho são cuidadosamente removidas, e o fluxo é descartado dos tubos. Os cartuchos spin são então colocados de volta nos tubos vazios, e 0,4 ml de tampão de lavagem gelado (4°C) Ix é adicionado a cada cartucho spin. Os tubos são centrifugados a 13.000 χ g por 20 segundos e o fluxo é descartado. Essa etapa de lavagem é repetida mais três vezes. Os cartuchos GlassMAX são então lavados 4 vezes com 0,4 ml de etanol 70% gelado (4°C) . Após o fluxo da lavagem final de etanol 70% ser descartado, os cartuchos são colocados de volta nos tubos e centrifugados a 13.000 χ g por mais 1 minuto a fim de secar completamente os cartuchos. As inserções do cartucho spin são então transferidas para um tubo de recuperação de amostra fresco, onde 50 μΐ de ddH20 tratada com DEPC a 650C (pré-aquecida) são rapidamente adicionados a cada cartucho spin. Os cartuchos são centrifugados a 13.00 0 χ g por 3 0 segundos para eluir o cDNA.
2 0 C. Tailing de desoxinucleotidil transferase terminal
(TdT)
Para cada amostra de cDNA de primeira fita, são adicionados os seguintes componentes a um tubo de PCR de 0,2 ml de paredes finas: 6,5 μΐ de ddH20 tratada com DEPC, 5,0 μΐ de 5x tampão de tailing, 2,5 μΐ de dCTP 2 mM, e 10 μΐ da amostra de cDNA purificado por GlassMAX apropriado. Cada reação de 24 μΐ é incubada por 2-3 minutos em um ciclador térmico a 940C para desnaturar o DNA, e resfriada em gelo úmido por 1 minuto. O conteúdo do tubo é coletado
3 0 por centrifugação breve. Subseqüentemente, 1 μΐ de desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) é adicionado a cada tubo. Os tubos são misturados por pipetagem suave, e incubados por 10 minutos a 37°C em um ciclador térmico PTC- 100. Apôs essa incubação de 10 minutos, o TdT é inativado por aquecimento por ciclagem até 65 0C por 10 minutos. As reações são resfriadas em gelo e o cDNA de primeira fita TdT-tailed é armazenado a -20°C.
D. PCR de cDNA de primeira fita dC-tailed Amplificações por PCR em duplicata (duas reações de PCR independentes para cada amostra de cDNA de primeira fita dC- tailed) são realizadas em um volume de 50 μΐ contendo 200 μΜ de dNTPs, 0,4 μΜ de iniciador de ancoragem abreviado RACE 5' (ID. DE SEQ. N°: 11) e 0,4 μΜ de Cadeia pesada abrigada GSP2 (ID. DE SEQ. N0 : 8) ou Cadeia leve abrigada GSP2 (ID. DE SEQ. N0 : 10) , Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, 5 μΐ de cDNA dC-tailed e 5 unidades de DNA polimerase Expand™ Hi-Fi (Roche/ Boehringer Mannheim GmbH, Alemanha). As reações de PCR são amplificadas com o uso de um protocolo de temperatura de
2 0 anelamento "Touch-down/Touch-up" em um ciclador térmico
programãvel PTC-100 (MJ Research Inc.) com as seguintes condições: desnaturação inicial de 95°C por 40 segundos, 5 ciclos a 94 ° C por 20 segundos, 61°C - 2°C/ciclo por 20 segundos, 72°C por 40 segundos + 1 segundo/ciclo, seguidos por 5 ciclos a 94°C por 25 segundos, 53°C + l°C/ciclo por 2 0 segundos, 72°C por 4 6 segundos + 1 segundo/ciclo, seguidos por 20 ciclos a 94°C por 25 segundos, 55°C por 20 segundos, 72 0C por 51 segundos + 1 segundo/cic Io, e uma incubação final de 720C por 5 minutos.
3 0 E. Clonagem de TOPO TA Os produtos de PCR resultantes são purificados era gel por um gel de agarose 1,0% com o uso do sistema de purificação em gel QIAQuick {QIAGEN Inc., Chatsworth, CA), clonados por TA em pCR2.1 com a utilização do kit TOPO TA Cloning® (Invitrogen, San Diego, CA, N0 de Catálogo K4550- 40) e transformados em células TOPliF' de E. coli (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Os clones com inserções são identificados por avaliação azul/branco de acordo com as instruções do fabricante, em
que os clones brancos são considerados clones positivos. Culturas de 3,5 ml de caldo de líquido de Luria (LB) contendo 50 μ9/τη1 de ampicilina são inoculadas com colônias brancas e desenvolvidas a 37°C de um dia para o outro (cerca de 16 horas) com agitação a 225 rpm.
0 Kit "QIAGEN Plasmid Miniprep" (QIAGEN Inc., N0 de
Catálogo 12125) é usado para purificar DNA de plasmídeo das culturas de acordo com as instruções do fabricante. 0 DNA de plasmídeo é suspenso em 34 μΐ de Ix tampão TE (pH 8,0) e a seguir os clones positivos seqüenciados como descrito
2 0 previamente por seqüenciamento fluorescente de
didesoxinucleotídeo e detecção automatizada com o uso de reagentes "ABI Big Dye Terminator 3.1" em diluições 1:4- 1:8, e analisado com a utilização de um seqüenciador de DNA ABI 310 0. Os iniciadores de seqüenciamento usados incluem
OS iniciadores T7 (5' GTAATACGACTCACTATAGG 3'; ID. DE SEQ. N°: 12) e M13 reverso (5' CAGGAAACAGCTATGACC 3'; ID. DE SEQ. N0: 13) . Os resultados do seqüenciamento confirmarão que os clones correspondem às seqüências de IgG de camundongo.
3 0 F. Síntese gênica de novo com o uso de PCR por extensão de oligonucleotídeos superpostos
Esse método envolve o uso de iniciadores de oligonucleotídeos superpostos e PCR usando DNA polimerase de alta fidelidade ou uma mistura de polimerases para sintetizar uma região V de imunoglobulina ou outro gene. Começando no meio da seqüência da região V, são projetados iniciadores de 40-50 bases de tal forma que a cadeia em crescimento seja estendida em 20-30 bases, em qualquer direção, e iniciadores contíguos sobrepostos por um mínimo de 20 bases. Cada etapa de PCR exige dois iniciadores, um que inicia na fita anti-senso (iniciador adiante ou senso) e um que inicia na fita senso (iniciador reverso ou anti- senso) para criar um produto de PCR em crescimento de fita dupla. Durante o projeto do iniciador, podem ser feitas alterações na seqüência de nucleotídeos do produto final para criar sítios de enzima de restrição, destruindo sítios de enzima de restrição existentes, adicionar ligantees flexíveis, alterar, eliminar ou inserir bases que alteram a seqüência de aminoácidos, otimizar a seqüência de DNA global para aumentar a síntese de iniciador e se adaptar às regras de uso de códon para o organismo contemplado para uso na expressão do gene sintético.
Pares de iniciadores são combinados e diluídos de tal forma que o primeiro par este j a a 5 μΜ e cada par subseqüente possua uma concentração 2 vezes maior até 80 μΜ. Um μΐ de cada uma dessa misturas de iniciadores é amplificado em uma reação de PCR de 50 μΐ usando "Platinum PCR SuperMix-High Fidelity" (Invitrogen, San Diego, CA, N0 de Catálogo 12532-016). Após uma desnaturação inicial de 2 minutos a 940C, são realizados 30 ciclos de PCR com o uso de ura perfil de ciclagem de 94°C por 20 segundos, 60°C por segundos; e 68°C por 15 segundos. Os produtos de PCR são purificados com o uso de colunas de purificação por PCR Qiaquick (Qiagen Inc., N0 de Catálogo 28704) para remover iniciadores e enzima em excesso. Esse produto de PCR é então re-amplifiçado com o conjunto seguinte de pares de iniciadores similarmente diluídos com o uso de condições de PCR exatamente como descritas acima, mas aumentando o tempo de extensão de cada ciclo até 680C por 3 0 segundos. O produto de PCR resultante é novamente purificado por iniciadores e enzimas, como descrito acima, e clonado e seqüenciado por TOPO-TA, exatamente como descrito na seção E acima.
Exemplo 2
Construção de pequenos produtos imunofarmacêuticos
modulares (SMIPs)
Foi construída uma proteína de ligação multivalente, multiespecífica, com função efetora, que continha um domínio de ligação 1 na forma de um scFv de cadeia simples recombinante (murídeo/humano) designado 2H7 (VL-ligante- VH) . O scFv 2H7 é um pequeno produto imunofarmacêutico modular (SMIP) que reconhece especificamente CD20. 0 domínio de ligação foi baseado em uma seqüência de anticorpo CD2 0 humano publicamente disponível, Números de Acesso no GenBank, M17953 para Vh, e M17954 para Vl. SMIPs específicos para CD20 são descritos nas Publicações de Patente U.S. de co-autoria 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049, aqui incorporadas em suas totalidades por referência. O ligante peptídico que separa Vl e Vh foi um 3 0 ligante de 15 aminoácidos que codifica a seqüência: Asp- Gly3Ser-(Gly4Ser)2- O domínio de ligação 1 estava localizado no terminal N da proteína de ligação multiespecífica, com o terminal C daquele domínio ligado diretamente ao terminal N de uma sub-região constante contendo uma dobradiça, domínios CH2 e CH3 (na orientação amino para carbóxi) . A sub-região constante era derivada de um anticorpo IgGl, que foi isolado por amplificação por PCR de IgGl humana de PBMCs humanos. A região de dobradiça foi modificada por substituição de três resíduos Ser no lugar dos três resíduos Cys presentes na versão do tipo selvagem do domínio de dobradiça de IgGl humana, codificado pela seqüência de 15 aminoãcidos: EPKSCDKTHTCPPCP (ID. DE SEQ. N0 : 14; os três resíduos Cys substituídos por resíduos Ser são indicados em negrito). Em modalidades alternativas, a região de dobradiça foi modificada em uma ou mais das cisteínas, de tal forma que foram geradas dobradiças dos tipos SSS e CSC. Além disso, a prolina final era algumas vezes substituída com uma serina, além das substituições de cisteína.
2 0 A extremidade do terminal C do domínio CH3 foi anexada
covalentemente a uma série de domínios de ligantees alternativos justapostos entre o terminal C da sub-região constante e o terminal amino do domínio de ligação 2. Proteínas de ligação multivalentes com função efetora preferidas terão um desses ligantees para afastar a sub- região constante do domínio de ligação 2, embora o ligante não seja um componente essencial das composições de acordo com a invenção, dependendo das propriedades de dobragem de BD2. Para algumas moléculas multivalentes específicas, o
3 0 ligante pode ser importante para a separação de domínios, enquanto para outras ele pode ser menos importante. 0 ligante foi anexado à extremidade do terminal N de scFv 2E12 (Vli-Iigante-Vij), que reconhece especificamente CD28. 0 ligante que separa os domínios Vh e Vl da parte de scFv 2E12 da molécula de ligação multivalente era um ligante de de aminoãcidos (Gly4Ser)4, e não um ligante-padrão (Gy4Ser)3 normalmente inserido entre os domínios V de um Sc Fv. Verificou-se que o ligante mais longo melhora as propriedades de ligação do scFv 2el2 na orientação Vh-Vl.
A molécula de ligação multivalente e multiespecífica construída continha um domínio de ligação 1, que compreende a seqüência de peptídeos líder de 2E12 dos aminoãcidos 1-23 do ID. DE SEQ. N°: 171; a região variável da cadeia leve 2H7 murídea anti-CD20 humano, que está refletida na posição 24 no ID. DE SEQ. N0 : 171; um ligante Asp-Gly3-Ser- (Gly4Ser)2/ que começa no resíduo 130 no ID. DE SEQ. N°: 171, a região variável da cadeia pesada murídea 2H7 anti- CD2 0 humano com uma substituição de aminoácido de leucina para serina (VHL IlS) no resíduo 11 no domínio variável para VH, e que possui um único resíduo serina na extremidade da região da cadeia pesada (ou seja, VTVS, em que uma seqüência ortodoxa seria VTVSS) (N° de Acesso no Genbank M17 953), e interposta entre os dois domínios de ligação BDl (2H7) e BD2 (2E12) é uma sub-região constante de IgGl humana, que inclui uma região de dobradiça modificada que compreende uma seqüência "CSC" ou uma seqüência "SSS", e domínios CH2 e CH3 do tipo selvagem. As seqüências de nucleotídeos e de aminoãcidos da proteína de ligação multivalente com função efetora são apresentadas nos IDS. DE SEQ. Nos: 228 e 229 para as formas CSC, respectivamente, e IDS. DE SEQ. Nos: 17 0 e 171 para as formas SSS.
Foram criadas linhagens de células que expressam estavelmente por transfecção através de eletroporação de plasmídeo de expressão recombinante sem cortes ou linearizado, em células de ovário de hamster chinês (células CHO DG44), seguida por seleção em meio contendo metotrexato. As culturas em batelada e os poços principais que produzem o maior nível de proteína de ligação multivalente foram amplificados em níveis crescentes de metotrexato, e as culturas adaptadas foram subseqüentemente clonadas por diluição limitante. As células CHO transfectadas que produzem a proteína de ligação multivalente foram cultivadas em biorreatores ou wave bags com o uso de meio sem soro obtido de JRH Biosciences (Excell 302, N0 de Catálogo 14324) 1.000 M, suplementado com glutamina 4 mM (Invitrogen, 25030-081), piruvato de sódio (Invitrogen 11360-070, diluído até IX), aminoãcidos não essenciais (Invitrogen, 11140-050, diluição final até IX), penicilina-estreptromicina 100 Ul/ml (Invitrogen, 15140-122), e insulina recombulin a 1 ^ig/ml (Invitrogen, 97-503311). Também podem ser usados outros meios basais CHO sem soro para a produção, por exemplo, CD-CHO, e semelhantes.
A proteína de fusão foi purificada dos sobrenadantes
de cultura de CHO gasto por cromatografia por afinidade com Proteína A. A proteína de ligação multivalente foi purificada com o uso de uma série de etapas de cromatografia e filtração, incluindo um filtro de redução de vírus. Os sobrenadantes da cultura celular foram filtrados, e depois submetidos à cromatografia por afinidade com Sefarose proteína A sobre uma coluna GE 16/40 Healthcare XK. Após a ligação de proteína à coluna, a coluna foi lavada em dPBS, e depois NaCl 1,0 M, fosfato de sódio 2 0 mM pH 6,0, e a seguir NaCl 2 5 mM, NaOAc 2 5 mN, pH 5,0, para a remoção de proteínas de ligação inespecíficas. A proteína ligada foi eluída da coluna em Glicina 100 mM (Sigma), pH 3,5, e trazida até pH 5,0 com ácido 2-(N- morfolino) etanossulfônico (MES) 0,5 M, pH 6,0. As amostras de proteína foram concentradas até 25 mg/ml em preparação para purificação por GPC. A cromatografia por exclusão de tamanho foi realizada em um aparelho GE Healthcare AKTA Explorer 100 Air, com o uso de uma coluna GE Healthcare XK e Superdex 200, grau preparativo (GE Healthcare). O material foi então concentrado e formulado com
fosfato de sódio 20 mM e sacarose 240 mM, com um pH resultante de 6,0. A composição foi filtrada antes de ser preenchida em frascos estéreis em várias concentrações, dependendo da quantidade de material recuperada. 2 0 Exemplo 3
Construção de cassete de expressão de scorpion Um ácido nucléico contendo o scFv 2H7 sintético (anti- CD20; ID. DE SEQ. N°: 1) ligado a uma sub-região constante como descrito em Exemplo 2 foi designado TRU-015. 0 ácido nucléico TRU-015, além dos ácidos nucléicos scFv 2E12 Sintético (anti-CD2 8 VL-VH; ID. DE SEQ. N°: 3) e SCFv 2E12 sintético (anti-CD2 8 VH-VL; ID. DE SEQ. N°: 5) que codificam pequenos produtos imunofarmacêuticos modulares, foram usados como modelos para amplificação por PCR dos vários componentes do cassetes de scorpion. 0 modelo, ou arcabouço (scaffold), para o domínio de ligação 1 e para a sub-região constante foi fornecido por TRU-015 (o ácido nucléico que codifica scFv 2H7 (anti-CD20) ligado à sub- região constante), e esse modelo foi construído no vetor de expressão pD18. Os ácidos nucléicos observados acima que contêm scFv 2E12 em uma entre duas orientações (Vl-Vh e Vh- Vl) forneceram a região codificadora para o domínio de ligação 2.
Ch2Ch3 da dobradiça SSS de TRU-015 para a inserção de BD2/ligante
Uma versão da IgGl de scFv 2H7 sintético contendo a dobradiça SSS foi usada para criar um cassete de scorpíon ao servir como modelo para a adição de um sítio EcoRI para substituir o códon de parada e o sítio XbaI existentes. Essa molécula foi amplificada por PCR usando o iniciador 9 (ID. DE SEQ. N°: 23; veja a Tabela 1) e o iniciador 87 (ID. DE SEQ. N°: 40; veja a Tabela 1), além da mistura "Platinum PCR High Fidelity" (Invitrogen) . 0 fragmento de 1,5 Kbp resultante foi purificado e clonado no vetor pCR2.1-T0P0 (Invitrogen) , transformado em E. coli cepa TOPlO (Invitrogen), e a seqüência de DNA verificada.
Tabela 1 Nome dos inciadores de PCR
1 hVK3L-F3H3 2 hVK3L-F2 3 hVK3L-F1-2H7VL 4 2H7VH-NheF G4 S-NheR 6 01 SVH-XhoR 7 GIH-C-XHO 8 G1H-S-XHO 9 CH3R-EcoR1 G1-XBA-R 11 G4 SLinKRI-S 12 G4SUnkR1-AS 13 2E12 VLXbaR 14 2E12VLR1F 2E12VHR1F 16 2E12VHXbaR 17 2e12VHdXbaF1 18 2e12VHdXbaR1 19 IgBsrGIF IgBsrGIR
Seqüência 5 T-3T
GC G ATAAAGCTTGCCGCCATG GAA GCACCAGCGCAGCTTCTCTTCC ACCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTG CTACTCTGGCTCCCAGATACCACCG GGCTCCCAGATACCACCGGTCAAAT TGTTCTCTCCCAGTCTCCAG GCGATAGCTAGCCAGGCTT ATCTAC AGCAGTCTGG
GC GATAGCTAGCCCCAC CTCCTC CA GATCCACCACCGCCCGAG GCGTACTCGAGGAGACGGTGACCGT GGTCCCTGTG
GCAGTCTCGAGCGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTC
GCAGTCTCGAGCGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTC
GCGTGAGAATTCTTACCCGGAGACAGG
GAGAGGCTC 23
GCGACGTCTAGAGTCATTTACCCGGAG ACAGG 24
AATT ATGGTG GCGGTGGCTCGGGCGGT GGTGGATCTGGAGGAGGTGGGAGTGGG 25 AATTCCCACTCCCACCTCCTCCAGATCCA CCACCGCCCGAGCCACCGCCACCAT 26
GC GTG TCTAG ATTAAC GTTTG ATTTCC AG CTTGGTG 27
GCGATGAATTCTGACATTGTGCTCACCCA ATCTCC 28
GCGATGAATTCTCAGGTGCAGCTGAAGGA GTCAG 29
G C GAGTC TAG ATT AAG AG G AG ACGGTG AC TGAGGTTC 30
GG GTCTGG AGTGGCTGGGAATG ATATG 31
ATTCCCAGCCACTCCAGACCCTTTCCTG 32
GAGAACCACAGGTGTACACCCTG 33
GC AGGGTGT ACACCTGTGGTTCTCG 34
ID. DE
SEQ. H0
15
16
17
18
19
20 21 22 Iniciadores de s eqüenc: i amento
82 M13R
63 M13F
84 T7
85 pD18F-17
86 pD18F-20
87 pD18F-1
88 pD18R-s
89 CH3seqF1
90 CH3seqF2
91 CHSseqR 1
92 CH3seqR2
CAG G AA AC AG C TATGAC GTAAAAC G AC G GC CAGTG GTAATACGACTCACTATAGG AACTAGAGAACCCACTG
GCTAACTAGAGAACCCACTG
ATAC G AC TCA CT AT AGG G
GCTCTAGC ATTTAG G TGAC CATGAGGCTCTGCACAAC
C CTCTAC AGC AAGCTC AC GGTTCTTG GTC AGCTC ATC GTGAGCTTGCTGTAGAGG
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
Tabela 1. Iniciadores de oligonucleotídeos usados para construir cassete de scorpion CD20-CD28. Os iniciadores são separados em 2 grupos, de PCR e Seqüenciamento. Os iniciadores de PCR foram usados para construir o cassete, e os iniciadores de seqüenciamento foram usados para confirmar a seqüência de DNA de todos os intermediários e das construções finais.
Fusão de n2H7 Vk e da seqüência líder VK3 humana
A mutagênese por PCR dirigida por oligonucleotídeo foi usada para introduzir um sítio de restrição AgeI (ACCGGT) na extremidade 5' da região codificadora para TRU-015 VK, e um sítio de restrição Nhe I (GCTAGC) na extremidade 3' da região codificadora para o ligante (G4S)3 usando os iniciadores 3 e 5 da Tabela 1. Como o iniciador 3 também codifica os últimos 6 aminoácidos do líder de VK3 humana (gb:X01668), foi usada PCR por superposição para adicionar seqüencialmente as seqüências do terminal N do líder, incluindo uma box de Kozak de consenso e sítio de restrição HinDIII (AAGCTT) usando os iniciadores 1, 2 e 5 da Tabela 1.
Construção de dobradiça-CH2CH3 SSS de IgGl n2H7 Os iniciadores 4 e β (IDS. DE SEQ. Nos: 18 e 20, respectivamente; Tabela 1) foram usados para re-amplificar a Vh de TRU-015 com um sítio NheI 5' para fundir com a Vk para TRU-015 e um sítio Xho I (5'-CTCGAG-3' ) na junção da extremidade 3' com os domínios da CH2CH3 de dobradiça de IgGl. Da mesma forma, a região CH2-CH3 da dobradiça de IgGl foi amplificada com o uso dos iniciadores 8 e 9 da Tabela 1, introduzindo um sítio Xho I 5' e substituindo a extremidade 3' existente com um sítio EcoRI (5'-GAATTC-3')
para clonagem, e destruindo o códon de parada para permitir a tradução do Domínio de Ligação 2 anexado abaixo do domínio CH3. Essa versão do cassete de scorpion se distingue do cassete descrito previamente pelo prefixo wn". Além da proteína de ligação muitivalente descrita
acima, uma Proteína, de acordo com a invenção pode ter um domínio de ligação, o domínio de ligação 1 ou 2, ou ambos, que corresponde a uma única região variável de uma imunoglobulina. Modalidades exemplares desse aspecto da invenção incluiriam domínios de ligação que correspondem ao
2 0 domínio Vh de um anticorpo camelídeo, ou uma V única
modificada ou não modificada de um anticorpo de outra espécie capaz de se ligar ao antígeno-alvo, embora qualquer domínio variável único seja contemplado como útil nas proteínas da invenção.
Construções de VL-VH e VH-VL de 2E12
A fim de tornar os scFvs 2E12 compatíveis com o cassete, um sítio Xba I (5'-TCTAGA-3' ) interno teve que ser destruído usando os iniciadores de oligonucleotídeos superpostos 17 e 18 da Tabela 1. Esses dois iniciadores em
3 0 combinação com pares de iniciadores 14/16 (Vl-Vh) ou 13/15 (Vh-Vl) foram usados para amplificar os dois domínios de ligação orientados opostamente, de tal forma que ambos tivessem sítios EcoRI e XbaI nas suas extremidades 5' e 3', respectivamente. Os iniciadores 13 e 16 também codificam um códon de parada (TAA) imediatamente em frente ao sítio Xba I.
Construção LH/HL 2el2 de IgGl 2H7 SSS
Adição do ligante de Domínio efetor-Domínio de Ligação
2 (ligantees STD - STDl e STD2)
Os iniciadores complementares 11 e 12 da Tabela 1 foram combinados, aquecidos até 70°C e resfriados lentamente até a temperatura ambiente para permitir o anelamento das duas fitas. Grupos fosfato 5' foram adicionados com o uso de polinucleotídeo T4 quinase (Roche) em tampão de ligação IX com ATP 1 mM (Roche) usando o protocolo do fabricante. O ligante de fita dupla resultante foi então ligado no sítio EcoRI entre as regiões codificadoras para o terminal Ch3 de IgGl e o começo do Domínio de Ligação 2 com o uso de DNA T4 ligase (Roche). As construções de DNA resultantes foram rastreadas quanto à presença de um sítio EcoRI ma junção ligante-BD2 e a seqüência de nucleotídeos GAATTA na junção C113-Iigante. A construção correta do ligante STDl foi então re-digerida com EcoRIl e a ligação do ligante repetida para produzir uma molécula que tinha um ligante composto por duas repetições idênticas (STD 2) da seqüência Lx 1. As construções de DNA foram novamente rastreadas como acima.
Exemplo 4 Estudos de expressão Foram feitos estudos de expressão nos ácidos nucléicos descritos acima que codificam proteínas de ligação multivalentes com função efetora. Os ácidos nucléicos que codificam proteínas de ligação multivalentes foram transfectados transitoriamente em células COS e as células transfectadas foram mantidas sob condições bem conhecidas qUe permitem a expressão gênica heteróloga nessas células. 0 DNA foi transfectado transitoriamente em células COS com o uso de PEI ou DEAE-Dextrana, como descrito previamente (PEI = Boussif O. e cols., PNAS 92: 7.297-7.301, (1995), aqui incorporado por referência; Pollard H. e cols. , JBC 273: 7.507-7.511, (1998), aqui incorporado por referência). Foram feitas várias transfecções independentes de cada nova molécula a fim de determinar o nível de expressão médio para cada nova forma. Para transfecção por PEI, as células COS foram plaqueadas sobre placas de cultura de tecido de 60 mm em meio DMEM/FBS 10%, e incubadas de um dia para o outro, de forma que fossem aproximadamente 90% confluentes no dia da transfecção. 0 meio foi mudado para DMEM sem soro sem antibióticos, e incubado por 4 horas. 0 meio de transfecção (4 ml/placa) continha DMEM sem soro com 50 pg de PEI e 10-20 pg do DNA plasmídeo de interesse. 0 meio de transfecção foi misturado por turbilhonamento, incubado em temperatura ambiente por 15 minutos, e adicionado às placas após aspiração do meio existente. As culturas foram incubadas por 3-7 dias, antes da coleta de sobrenadantes. Os sobrenadantes da cultura foram testados quanto à expressão de proteína por SDS-PAGE, Western blotting, a ligação verificada por citometria de fluxo e a função testada com o uso de diversos ensaios, incluindo ADCC, CDC, e experimentos de co-cultura. Análise SDS-PAGE e análise IVestern blotting
Foram preparadas amostras de sobrenadantes de cultura brutos (normalmente 3 0 μΐ/poço) ou alíquotas de proteína purificada, contendo 8 pg de proteína por poço, e 2X tampão Tris-Glicina SDS (Invitrogen) foi adicionado até uma concentração final Ix. Dez (10) μΐ de Marcador SeeBlue (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram processados para fornecer padrões de tamanho de peso molecular (PM). As variantes das proteínas de ligação multivalentes (de fusão) foram submetidas à análise SDS-PAGE em géis Novex Tris-glicina 4- 20% (Invitrogen, San Diego, CA) . As amostras foram carregadas usando tampão de amostra Novex Tris-glicina SDS (2X) sob condições redutoras ou não redutoras após aquecimento a 950C por 3 minutos, seguido por eletroforese a 175 V por 60 minutos. A eletroforese foi realizada com o uso de tampão de processamento IX Novex Tris-Glicina SDS (Invitrogen).
Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF com o uso de um aparelho eletroblotter semi-seco (Ellard, Seattle, WA) por 1 hora a 100 mAmp. Os tampões de transferência para Western incluíam os seguintes três tampões presentes em papel de filtro Whatman saturado, e empilhados em sucessão: N0 1 contém 36,34 g/litro de Tris, pH 10,4, e metanol 20%; N0 2 contém
3.02 g/litro de Tris, pH 10,4, e metanol 20%; e N0 3 contém
3.03 g/litro de Tris, pH 9,4, 5,25 g/litro de ácido 8-amino capróico, e metanol 20%. As membranas foram bloqueadas em BLOTTO = leite desnatado 5% em PBS de um dia para o outro com agitação. As membranas foram incubadas com anti-IgG humana de cabra con j ugada a HRP (específica para Fc, Caltag) a 5 μ9/τη1 em BLOTTO por uma hora, e depois lavadas 3 vezes por 15 minutos cada em PBS-Tween 20 0,5%. As membranas úmidas foram incubadas com solução ECL por 1 minuto, seguida por exposição à película X-omat por 20 segundos. A Figura 2 mostra um IVestern Blot de proteínas expressas no sobrenadante de cultura de célula COS {30 μΐ/poço) submetidas à eletroforese sob condições não redutoras. As raias são indicadas com marcadores 1-9 e contêm as seguintes amostras: Raia 1 (valor de corte = Marcadores SeeBlue, kDa são indicados ao lado do blot. Raia 2= 2H7-SSSlgG P238 5/P3 315-STDl-2el2 VlVh; Raia 3= 2H7- sssIgG P2385/P3315-STDl-2el2 VhVl; Raia 4 = 2H7-sssIgG P23 8 5/P3 31S-STD2-2el2 VlVh; Raia 5 = 2H7-sssIgG P2385/P33IS-STD2 -2el2 VhVl; Raia 6 = 2el2 VlVh SMIP; Raia 7 = 2el2 VhVl SMIP; Raia 8 = 2H7 SMIP. 2H7 nessas construções está sempre na orientação Vl-Vh, sssIgG indica a identidade da dobradiça/ligante localizada na posição do ligante 1, como mostrado na Figura 5, P238S/P331S indica a versão de IgGl humana com mutações do tipo selvagem (primeiro aa listado) para mutante (segundo aa listado) e a posição de aminoãcido na qual ocorrem nos domínios Cii2 e CH3 de IgGl humana do tipo selvagem, STDl indica o ligante de 2 0 aminoácidos (18 + sítio de restrição) localizado na posição do ligante 2, como mostrado na Figura 5, e STD2 indica o 2 5 ligante 3 8 de aminoácidos (36 + sítio de restrição) localizado na posição do ligante 2, como mostrado na Figura 6 .
Estudos de ligação
Foram feitos estudos de ligação para avaliar as propriedades de ligação biespecíficas dos peptídeos de ligação multivalentes e multiespecíficos CD20/CD28. Inicialmente, foram adicionadas células WIL2-S às placas de 96 poços, e centrifugadas até peletizar as células. Às placas semeadas, foi adicionada proteína CD20/CD28 purificada, usando titulações de duas vezes através da placa a partir de 20 ^ig/ml reduzindo até 0,16 μ9/τη1. Uma série de diluições de duas vezes de proteína purificada TRU-015 (fonte do domínio de ligação 1) também foi adicionada aos poços da placa semeada, com a concentração de TRU-015 variando de 20 μ9/τη1 a 0,16 μ9/τη1. Um poço sem proteína serviu como controle do nível de fundo.
As placas semeadas contendo as proteínas foram incubadas no gelo por uma hora. Subseqüentemente, os poços foram lavados uma vez com 200 μΐ de FBS 1% em PBS. Anticorpo anti-humano de cabra marcado com FITC (específico para Fc) a 1:100 foi então adicionado a cada poço, e as placas foram novamente incubadas no gelo por uma hora. As placas foram então lavadas uma vez com 200 μΐ de FBS 1% em PBS, e as células foram ressuspensas em 200 μΐ de FBS 1% e analisadas por FACS.
Para avaliar as propriedades de ligação do peptídeo anti-CD2 8 2E12 VhVl, células CHO que expressam CD2 8 foram plaqueadas por semeadura em poços individuais de uma placa de cultura. A proteína CD20/CD28 purificada foi então adicionada aos poços individuais com o uso de um esquema de diluição de duas vezes, que se estende de 20 μ9/τη1 reduzindo até 0,16 μ9/πι1. A proteína purificada 2E12IgG- VhVl SMIP foi adicionada aos poços semeados individuais, novamente com o uso de um esquema de diluição de duas vezes, ou seja, de 20 μ$/χα1 até 0,16 μ^/πιΐ. Um poço não recebeu proteína para fornecer um controle do nível de fundo. As placas foram então incubadas no gelo por uma hora, lavadas uma vez com 200 μΐ de FBS 1% em PBS, e anticorpo anti-humano de cabra marcado com FITC (específico para Fe, CalTag, Burlingame, CA) a 1:100 foi adicionado a cada poço. As placas foram novamente incubadas no gelo por uma hora e subseqüentemente lavadas uma vez com 200 μΐ de FBS 1% em PBS. Após a ressuspensão das células em 200 μΐ de FBS 1%, a análise FACS foi realizada. Os resultados mostraram que as proteínas de ligação muitivalentes com o domínio de ligação 1 no terminal N de CD2 0 se ligaram ao CD20; aquelas proteínas que possuem o domínio de ligação 2 do terminal C de CD28 na orientação N-Vh-Vl-C também se ligaram ao CD28.
Foi demonstrado que as proteínas expressas se ligam ao
CD2 0 apresentado em células WIL-2S (veja Figura 3) e ao CD2 8 apresentado em células CHO {veja a Figura 3) por citometria de fluxo (FACS), demonstrando, dessa forma, que BDl ou BD2 poderia funcionar para se ligar ao antígeno-alvo específico. Cada conjunto de dados nos gráficos na Figura 3 mostra a ligação de diluições seriais das diferentes proteínas de ligação multivalentes (de fusão) sobre as faixas de titulação indicadas. Os dados obtidos com a utilização dessas construções iniciais indicam que as proteínas de ligação multivalentes (de fusão) com a versão 2 do domínio de ligação usando 2el2 na orientação VhVl expressam melhor e se ligam melhor ao CD28 do que a forma na orientação Vl-Vh em concentrações equivalentes.
A Figura 4 mostra uma apresentação gráfica dos 3 0 resultados de estudos de ligação realizados com proteínas purificadas de cada uma dessas transfecções/construções. A figura mostra os perfis de ligação das proteínas às células WIL-2S que expressam CD2 0, demonstrando que a molécula multivalente se liga ao CD20 tão bem quanto o SMIP de especificidade única na mesma concentração. Os painéis superior e inferior da Figura 5 mostram os perfis de ligação da especificidade BD2 (2el2=CD2 8) às células CHO CD2 8. Para ligação de domínio de ligação 2 ao CD2 8, a orientação das regiões V afetou a ligação do 2el2. As proteínas de ligação muitivalentes 2H7-sss-hIgG-STDl-2el2 com o 2el2 na orientação Vh-Vl (HL) apresentaram ligação em um nível equivalente ao SMIP de especificidade única, enquanto a molécula 2el2 LH mostrou uma ligação menos eficiente na mesma concentração. Exemplo 5
Construção de várias formas de ligante das proteínas de
fusão multivalentes Este exemplo descreve a construção das diferentes formas do ligante listadas na tabela mostrada na Figura 6. Construção de ligantees CH3-BD2 Hl a H7
Para explorar o efeito do comprimento e da composição do ligante CH3-BD2 sobre a expressão e ligação das moléculas scorpíon, foi proj etado um experimento para comparar a molécula 2H7sssIgGl-Lxl-2el2HL existente com um conjunto maior de construções similares com diferentes ligantees. Usando 2H7sssIgGl-Lxl-2el2HL como modelo, foi feita uma série de reações de PCR utilizando os iniciadores listados na Tabela de oligonucleotídeos 2, o que criou ligantees que tinham comprimento variando de 0 de 16 3 0 aminoácidos. Esses ligantees foram construídos como fragmentos de ácido nucléico que transpunham a região codifiçadora para CH3 no sítio BsrGI até o final do ácido nucléico que codifica a junção ligante-BD2 no sítio EcoRI.
Tabela 2
5
Home dos ID. N° Inciadores Seqüência 5'-31 SEQ . de PCR G CGATAGAATTCCCAGATC CACC ACCG CCCGA 1 L1-11R GCCACCGCCACCAT AATTC GCGATAGAATTCCCAGAGCCACCGCCACCATA 46 2 L1-6R ATTC GCGTATGAATTCCCCGAGCCACCGCCACCCTTA 47 3 L3R CCCGGAGACAGG GCGTATGAATTCCCAGATCCACCACCGCCCGAG 48 4 L4R CCACCG CCAC C CTTAC GCGTATGAATTCCCGCTGCCTCCTCCCCCAGATC 49 L5R GACCACCGCC 50 6 IgBsrGIF G AGAAC CAC AGGTGTAC ACC CTG 51 GCGATAGAATTCGGACAAGGTGGACACCCCTTAC 7 L-CPPCPR CCGGAGACAGGGAGAG 52
15
Tabela 2. Seqüências de iniciadores usados para gerar variantes do ligante CH3-BD2.
A Figura 6 mostra a estrutura esquemática de uma proteína de fusão multivalente (de fusão) e mostra a
orientação das regiões V para cada domínio de ligação, a seqüência presente na posição do ligante 1 (são listados somente os resíduos Cys) e a seqüência (e identificador) para o(s) ligante (s) localizada na posição do ligante 2 das moléculas.
2 5 Exemplo 6
Estudos de ligação e funcionais com formas variantes do ligante dos protótipos de proteínas de fusão multivalentes
2H7-IgG~2el2
Este exemplo mostra os resultados de uma série de
3 0 estudos de expressão e de ligação no "protótipo" de construção 2H7-sssIgG-Hx-2el2 VhVl com vários ligantees (Hl- H7) presentes na posição do ligante 2. Cada uma dessas proteínas foi expressa por transfecção transitória em larga escala de COS e purificação das moléculas com o uso de cromatografia por afinidade com proteína A, como descrito nos exemplos anteriores. As proteínas purificadas foram então submetidas às análises que incluem SDS-PAGE, Western blotting, estudos de ligação analisados por citometria de fluxo, e ensaios funcionais quanto à atividade biológica.
Estudos de ligação que comparam as diferentes
orientações de BD2
Foram feitos estudos de ligação como descrito nos exemplos anteriores, exceto que foi usado material purificado por proteína A, e uma quantidade constante de
proteína de ligação (de fusão) foi usada para cada variante estudada, ou seja, 0,72 μ3/τη1. A Figura 7 mostra um gráfico de colunas que compara as propriedades de ligação de cada variante do ligante e variante de orientação de 2el2 para células-alvo CD20 e CD28. H1-H6 referem-se às construções
2 0 com os ligantees H1-H6 e 2el2 na orientação Vh-Vl . L1-L6
referem-se às construções com os ligantees H1-H6 e 2el2 na orientação Vl-Vh. Os dados demonstram que a especificidade do domínio de ligação 2 para 2el2 se liga bem mais eficazmente quando presente na orientação HL (amostras Hl-
H6) do que quando na orientação LH (amostras L1-L6) . 0 efeito do comprimento do ligante é complicado pela descoberta, com mostrado no conjunto seguinte de figuras, de que moléculas com os ligantees mais longos contêm algumas moléculas clivadas de especificidade única que não
3 0 possuem a especificidade de ligação de CD2 8 no terminal carbóxi. Foram feitos outros experimentos que visavam a ligação de ligantees selecionados, com os resultados mostrados nas Figuras 10, 12 e 13.
Análise SDS-PAGE de variantes purificadas do ligante
H1-H7
Foram preparadas amostras de alíquotas de proteína purificada, contendo 8 pg de proteína por poço, e tampão 2X Tris-Glicina SDS (Invitrogen) foi adicionado até uma concentração final de Ix. Para amostras/géis reduzidos, IOX tampão de redução foi adicionado até Ix às amostras, mais tampão Tris-Glicina SDS. Dez (10) μΐ de Marcador SeeBlue (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram processados para gerar padrões de peso molecular. As variantes das proteínas de ligação multivalentes (de fusão) foram submetidas a análises SDS-PAGE em géis de Novex Tris-glicina 4-20% (Invitrogen, San Diego, CA) . As amostras foram carregadas com o uso de tampão de amostra Novex Tris-glicina SDS (2X) sob condições redutoras ou não redutoras após aquecimento a 95°C por 3 minutos, seguido por eletroforese a 175 V por 60 minutos. A eletroforese foi realizada com o uso de tampão de processamento IX Novex Tris-Glicina SDS (Invitrogen). Os géis foram corados após eletroforese em corante Coomassie SDS PAGE R-250 por 30 minutos com agitação, e descorados por pelo menos uma hora. A Figura 8 mostra os géis corados 2 5 com Coomassie não reduzidos e reduzidos das variantes das proteínas de ligação multivalentes (de fusão) [2H7-sss-hIgG P238S/P331S-Hx-2el2 VhVl] , juntamente com TRU-015 e 2el2 HLSMIP como amostras de controle. À medida que o comprimento do ligante é aumentado, a quantidade de proteína processada no tamanho aproximado do SMIP (ou 52 kDa) aumenta. O aumento da quantidade de proteína nessa banda corresponde a uma diminuição na quantidade de proteína na banda superior processada em torno de 9 0 kDa. Os dados do gel indicam que a molécula de comprimento total está sendo clivada no ligante ou próximo a ele, para gerar uma molécula que não possui a região BD2. Um fragmento de BD2 menor não está presente, indicando (1) que a seqüência de nucleotídeos dentro da seqüência ligantea pode estar criando um sítio de splice oculto que remove o fragmento menor do transcrito de RNA unido, ou (2) que a proteína é clivada proteoliticamente após tradução do polipeptídeo de tamanho integral, e que o fragmento de BD2 menor é instável, ou seja, suscetível ao processamento proteolítico. O Western blotting de algumas dessas moléculas indica que todas as proteínas contêm a seqüência de CD2 0 BDl, mas a banda menor não possui a reatividade de CD2 8 BD2. Não foi observada nenhuma banda menor que migra no tamanho de scFv "desnudo" (25-27 kDa) em qualquer um dos géis ou blots, o que indica que esse fragmento peptídico menor não está presente nas amostras.
Ligação por Western Blot de BDl e BD2 por Fab específico para 2H7 ou CD28mIg
A Figura 9 mostra os resultados de Western blotting das proteínas de ligação multivalentes (de fusão) 2H7-sss- h!gG~H6 comparados com cada SMIP de especificidade única.
A eletroforese foi realizada sob condições não redutoras, e sem fervura das amostras antes da carga. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF usando um aparelho eletroblotter semi- seco {Ellard, Seattle, WA) por 1 hora a 100 mAmp. As membranas foram bloqueadas em BLOTTO (leite desnatado 5% em PBS) de um dia para o outro com agitação. Figura 9A: as membranas foram incubadas com o AbyD02429.2, um Fab dirigido ao anticorpo de 2H7, a 5 μg/ml em BLOTTO por uma hora, e depois lavadas 3 vezes por 5 minutos cada em PBS- Tween 2 0 0,5%. As membranas foram então incubadas em 6X His-HRP por uma hora em uma concentração de 0,5 μ9/πι1. Os blots foram lavados três vezes por 15 minutos cada em PB ST. As membranas úmidas foram incubadas com solução ECL por 1 minuto, seguida por exposição à película X-omat por 20 segundos.
Figura 9B: as membranas foram incubadas com CD2 8Ig (Ancell, Bayport, MN) a 10 μ9/πι1 em BLOTTO, e depois lavadas três vezes por 15 minutos cada em PBS-Tween 2 0 0,5%. As membranas foram então incubadas em anticorpo anticamundongo de cabra conj ugado ã HRP (CalTag, Burlingame, CA) a 1:3.000 em BLOTTO. As membranas foram lavadas três vezes, por 15 minutos cada, e depois incubadas em solução ECL por 1 minuto, seguido por exposição ã película X-omat por 20 segundos. Os resultados dos IVestern blots indicaram que o domínio de ligação de CD2 8 estava presente na fração de "monômero" multivalente que migra em aproximadamente 9 0 kDa, e em formas de ordem superior. Não havia bandas detectáveis que migrassem na posição esperada para um fragmento de tamanho de SMIP único ou de scFv desnudo. Quando o Fab anti-idiótipo de CD20 foi usado, foi detectado um fragmento com tamanho de SMIP, indicando a presença de um fragmento peptídico contendo (2H7-sss-hIgG) , e sem a porção CD28 scFy BD2 da proteína de fusão.
Estudos de ligação em ligantees selecionados A Figura 10 mostra os resultados de estudos de ligação realizados nas proteínas de fusão purificadas 2H7-sss-hIgG- Hx-2el2. Foram feitos estudos de ligação para avaliar as propriedades de ligação biespecíficas dos peptídeos de ligação multiespecíficos CD2 0/CD2 8. Inicialmente, células WIL2-S foram plaqueadas com a utilização de técnicas convencionais. Às placas semeadas, foi adicionada proteína CD20/CD28 purificada, com o uso de titulações de duas vezes ao longo da placa a partir de 20 μg/ml até 0,16 μ9/τη1. Uma série de diluições de duas vezes de proteína TRU-015 (fonte do domínio de ligação 1) purificada também foi adicionada aos poços da placa semeada, com a concentração de TRU-015 se estendendo de 2 0 ^ig/ml até 0,16 μ9/πι1. Um poço sem proteína serviu como controle do nível de fundo. As placas semeadas contendo as proteínas foram
incubadas no gelo por uma hora. Subseqüentemente, os poços foram lavados uma vez com 20 0 μΐ de FBS 1% em PBS. Anticorpo anti-humano de cabra marcado com FITC (específico para Fc) a 1:100 foi então adicionado a cada poço, e as 2 0 placas foram novamente incubadas no gelo por uma hora. As placas foram então lavadas uma vez com 200 μΐ de FBS 1% em PBS e as células foram ressuspensas em 200 μΐ de FBS 1% e analisadas por FACS.
Para avaliar as propriedades de ligação do peptídeo 2E12 VhVl anti-CD28, células CHO que expressam CD28 foram plaqueadas por semeadura em poços individuais de uma placa de cultura. A proteína CD2 0/CD2 8 purificada foi então adicionada aos poços individuais com o uso de um esquema de diluição de duas vezes, estendendo-se de 20 μ9/πι1 até 0,16 μ^/'^Ι. A proteína SMIP 2E12IgGvHvL purificada foi adicionada aos poços semeados individuais, novamente com o uso de um esquema de diluição de duas vezes, ou seja, de 20 μ9/πι1 até 0,16 μ9/πι1. Um poço não recebeu proteína para fornecer um controle do nível de fundo. As placas foram então incubadas no gelo por uma hora, lavadas uma vez com 200 μΐ de FBS 1% em PBS, e anticorpo anti-humano de cabra marcado com FITC (Fe Sp) a 1:100 foi adicionado a cada poço. As placas foram novamente incubadas no gelo por uma hora e subseqüentemente lavadas uma vez com 2 00 μΐ de FBS 1% em PBS. Após ressuspensão das células em 200 μΐ de FBS 1%, a análise FACS foi realizada. Foi demonstrado que as proteínas expressas se ligam ao CD20 apresentado em células WIL-2S (veja Figura 10A) e ao CD28 apresentado em células CHO (veja a Figura 10B) por citometria de fluxo (FACS), demonstrando, dessa forma, que BDl ou BD2 poderia funcionar para se ligar ao antígeno-alvo específico. Além disso, foi demonstrado que o ligante usado (H1-H6) não afeta significativamente a avidez de ligação ao antígeno-alvo.
Fracionawento por SEC de proteínas de ligação multivalentes (de fusão) . A proteína de ligação (de fusão) foi purificada dos sobrenadantes de células de cultura por cromatografia por afinidade com Sefarose proteína A sobre uma coluna GE Healthcare XK 16/40. Após ligação de proteína à coluna, a coluna foi lavada em dPBS, e depois NaCl 1,0 M, fosfato de sódio 20 mM pH 60, e a seguir NaCl 25 mM, NaOAc mN, pH 5,0, para a remoção de proteínas de ligação inespecíficas. A proteína ligada foi eluída da coluna em Glicina 100 mM (Sigma), pH 3,5, e trazida até o pH 5,0 com ácido 2-(N-Morfolino) etanossulfônico (MES) 0,5 M, pH 6,0. 3 0 As amostras de proteína foram concentradas até 25 mg/ml com a utilização de técnicas convencionais em preparação para a purificação por GPC. A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) foi realizada em um aparelho GE Healthcare AKTA Explorer 100 Air, usando uma coluna GE Healthcare XK e Superdex 200, grau preparativo (GE Healthcare).
A Figura 12 mostra uma tabela que resume os resultados do fracionamento por SEC das diferentes proteínas de ligação (de fusão). Com o aumento do comprimento do ligante, a complexidade das moléculas em solução também aumenta, o que torna difícil isolar o pico de interesse, ou POI, de formas de ordem superior por HPLC. 0 ligante H7 parece resolver muito dessa complexidade de uma forma mais homogênea em solução, de tal forma que as formas solúveis migram principalmente como um POI único em aproximadamente 172 kDa.
Estudos de ligação adicionais
Foi realizada uma segunda série de experimentos (veja Figuras 12 e 13) com um subconjunto menor de proteínas de ligação multivalentes (de fusão), dessa vez comparando os ligantees H3, H6 e H7. Os dados demonstram que o nível de ligação cai mais significativamente para a ligação ao CD28 do que para a ligação ao CD20, mas ambos caem ligeiramente à medida que o comprimento do ligante aumenta. Além disso, os dados mostraram que o ligante H7 exibiu o maior nível de ligação a ambos os antígenos. Esses dados foram obtidos com a utilização de proteínas de ligação multivalentes (de fusão) purificadas com proteína A, mas não foram purificadas adicionalmente por SEC e, portanto, várias formas das moléculas podem ser observadas presentes em solução. Os resultados também indicaram que a forma truncada pode ter sido menos estável do que. o verdadeiro polipeptídeo multivalente, na medida em que as curvas de ligação não parecem refletir plenamente a quantidade significativa da forma de especificidade única presente em solução para o ligante H6.
Demonstração de ligação multiespecífica por uma única molécula
Foi realizado um ensaio de ligação alternativo (veja Figura 13) , no qual a ligação ao CD20 na superfície de células WIL-2S foi detectada com um reagente específico para o CD2 8 BD2, demonstrando, dessa forma, que a ligação simultânea pode ocorrer para ambos os antígenos-alvos, envolvendo tanto BDl quanto BD2 na mesma proteína de ligação multiespecífica (de fusão) (veja a Figura 12). Esse ensaio demonstra a propriedade de ligação multiespecífica das proteínas.
Exemplo 7
Construção de proteínas de ligação multiespecífica (de fusão) com especificidades alternativas em BD2
Além do protótipo da molécula de ligação multiespecífica CD20-CD28, foram feitas duas outras formas com regiões alternativas do domínio de ligação 2, incluindo domínios de ligação de CD37 e CD3. Também foram feitas moléculas com vários dos domínios de ligantees descritos para as proteínas de ligação (de fusão) multiespecíficas [HL de 2H7-sss-IgG-Hx/STDx-2el2]. A construção dessas moléculas de ligação multiespecífica (de fusão) adicionais é descrita abaixo.
Construção do domínio de ligação anti-CD37
Tabela 3 HNome
23 G281LH~MheR
24 G281LH-NheF
G281-LH-LPinF
26 G281-LH-HXhoR
27 G281-LH-LEcoF
28 G281-LH-HXbaR
29 G281-HL-HF
G281-HL-HR3
31 G281-HL-HR2
32 G281-HL-HNheR
33 G281-HL-LNheF
Seqüência
ACTG CTGCAGCTGGACC GCGCT AGCTCCGCCGCCACCCGAC GGCGGAGCTAGCGCGGTCCAGC TGCAGCAGTCTGGACCTG 54
GCGATCACCGGTGACATCCAGAT GACTCAGTCTCCAG 55
GCGATACTC G AGG AG ACGGTG AC TGAGGTTCCTTGAC 56
GCG ATCG AATTC AG AC ATC CAGAT GACTCAGTCTCCAG 57
GCGATTCTAGATTAGGAAGAGACG GTGACTGAGGTTCCTTGAC 58
GCG ATAACCGGTGC GGTCC AGCTG CAGCAGTCTGGAC 59
GACCCACCACCGCCCGAGCCACCG CCACCAGAAGAG ACGGTGACTGAG G 60 TTC
ACTCCCGCCTCCTCCTGATCCGCCG CCACCCGAC CCACCACCGCCCGAG 61 GAGTCATCTGG ATGTCG CTAGC ACTC CCGCCTCCTCCTGATC 62
ATCAGGAGGAGGCGGGAGTGCTAGC GACATCCAGATGACTCAGTC 63
GCGATACTCGAGCCTTTGATCTCCAG TTCGGTGCCTC 64
GCGATATCTAGACTCAACCTTTGATCT CCAGTTCGGTGCCTC 65
GCGATAGAATTCGCGGTCCAGCTGCA GCAGTCTGGAC 66
ID. DE SEQ. H°
53
34 G281-HL-LXhoR
G281-HL-LXbaR
36 G281-HL-EcoF
Tabela 3. Iniciadores de oligonucleotideos usados para gerar domínios de ligação G28-1 anti-CD3 7 tanto para moléculas de SMIP quanto para scorpions.
0 G28-1 scFv (ID. DE SEQ. N0 :102) foi convertido no SMIP G28-1 LH por PCR com a utilização dos iniciadores na Tabela 3 acima. Com a combinação dos iniciadores 23 e 25 com 10 ng de G28-1 scFv, a VK foi amplificada por 30 ciclos de 94 ° C, 2 0 segundos, 58 °C, 15 segundos, 68 °C, 15 segundos usando a mistura de PCR Platinum PCR Supermix Hi-Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA) em um ciclador térmico ABI 9700. O produto dessa PCR tinha os sítios de restrição PinAI (AgeI) na extremidade 5' da VK e NheI na extremidade do ligante scFv (G4S)3. A Vh foi alterada de forma similar por combinação dos iniciadores 24 e 26 com 10 ng de G28-1 scFv em uma PCR processada sob as condições idênticas às da VK acima. Esse produto de PCR tinha os sítios de restrição NheI na extremidade 5' da Vh e XhoI na extremidade 3'. Em função de ter sido projetada uma superposição de identidade de seqüência significativa nos iniciadores 23 e 24, a Vk e a Vh foram diluídas 5 vezes, e depois adicionadas em uma proporção de 1:1 a uma PCR usando os iniciadores flanqueadores 25 e 26, e um scFv de comprimento total foi amplificado da forma acima mostrada por prolongamento do tempo de extensão a 68 0C de 15 segundos para 45 segundos. Esse produto de PCR representava todo o G28-1 scFv como um fragmento PinAI-XhoI, e foi purificado por purificação em uma coluna MinElute (Qiagen) para a remoção de iniciadores, enzimas e sais em excesso. 0 eluato foi digerido até o fim com PinAI (Invitrogen) e XhoI (Roche) em tampão H IX (Roche) a 37°C por 4 horas em um volume de 50 μΐ. 0 produto de PCR digerido foi então submetido à eletroforese em um gel de agarose 1%, o fragmento foi removido do gel e re~ purificado em uma coluna MinElute usando tampão QG e incubando a mistura de gel-tampão a 50°C por 10 minutos com mistura intermitente para dissolver a agarose e, a seguir, a purificação na coluna foi idêntica à usada para remoção do iniciador pós-PCR. G28-1 LH digerido com 3 μΐ de PinAI- XhoI foi combinado com SMIP pD18-n2H7sssIgGl digerido com 1 μΐ PinAI-XhoI em uma reação de 10 μΐ com 5 μΐ de 2X tampão de ligação LigaFast (Promega, Madison, WI) e 1 μΐ de DNA T4 ligase (Roche), bem misturados e incubados em temperatura ambiente por 10 minutos. Três μΐ dessa ligação foram então transformados em TOP 10 competente (Invitrogen) usando o protocolo do fabricante. Esses transformantes foram plaqueados em placas de ãgar LB com 10 0 μ9/πι1 de carbenicilina (Tekinova) , e incubados de um dia para o outro a 37 0C. Após 18 horas de crescimento, as colônias foram escolhidas e inoculadas em 1 ml de Caldo T (Teknova) contendo 100 μ<3/τ(\1 de carbenicilina em uma placa profunda de 96 poços, e cresceram de um dia para o outro em uma incubadora em agitação a 37°C. Após 18-24 horas de crescimento, o DNA foi isolado de cada cultura de um dia para o outro usando o kit QIAprep 96 Turbo (Qiagen) no BioRobot 8000 (Qiagen) . Dez μΐ de cada clone foram então digeridos com enzimas de restrição HindIII e XhoI em tampão B IX em um volume de reação de 15 μΐ. 0 DNA digerido foi submetido à eletroforese em géis de agarose E 1% (Invitrogen, CA) para análise de sítios de restrição. Os clones que continham um fragmento HindIII-XhoI do tamanho correto tiveram suas seqüências verificadas. A HL de SMIP G28-1 foi construída de forma similar por colocação de um sítio PinAI na extremidade 5' e um ligante (G4S) 4 terminando em um sítio Nhe I do G28-1 Vh usando os iniciadores 29, 30 31 e 32 da Tabela X acima. A VK foi alterada por PCR usando os iniciadores 33 e 34 da Tabela X, de tal forma que um sítio NheI fosse introduzido na extremidade 5' da VK e XhoI na extremidade 3'. Essas PCRs foram então combinadas como acima e amplificadas com os iniciadores f lanqueadores 29 e 34, para gerar um DNA de G28-1 scFv intacto na orientação Vh-Vl que foi clonado em SMIP pD18-(n2H7)sssIgGl digerido com PinAI-XhoI, exatamente 3 0 como ocorreu com o SMIP G28-1 LH. Construção de LH/HL de 2H7sssIgGl-STDl-G28-l
Usando as HLs de G28-1 LH e SMIP G28-1 como modelos, os domínios de ligação anti-CD37 de LH e HL foram alterados por PCR de tal forma que seus sítios de restrição flanqueadores fossem compatíveis com o cassete de scorpion. Um sítio EcoRI foi introduzido na extremidade 5' de cada scFv usando o iniciador 27 (LH) ou 36 (HL) e um códon de parada/sítio XbaI na extremidade 3' usando o iniciador 28 (LH) ou 35 (HL) . Os DNAs resultantes foram clonados em pD18-2H7sssIgG-STDl digerido com EcoRI-XbaI.
Construção de HL de 2H7sssIgGl-Hx-G28-l
DNAs de HL de 2H7sssIgGl-Hx-2e12 foram digeridos com BsrGI e EcoRI, e o fragmento de 3 25 bp que consiste na extremidade do terminal C de IgGl e ligante. Esses serviram de substituintes para a região equivalente na HL de 2H7sssIgGl-STDl-G19-4 por remoção do ligante STDl com o uso de BsrGI-EcoRI e substituindo-o com os ligantees correspondentes dos clones de HL de 2H7sssIgGl-Hx-2el2.
Construção do domínio de ligação anti-CD3 Tabela 4
25
30
N*
1 2
3
4
5
Home dos inciadores
de PCR
hVK3L~F3H3 hVK3L~F2 hVK3L-F1-2H7VL 2H7VH-NheF G4 S-NheR
Sequencia 5'-3 T
GCGATAAAGCTTGCCGCCATGGAA GC ACC AGCGC AGCTTCTCTTCC ACCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTG CTACTCTGGCTCCCAGATACCACCG GGCTC CCAGATAGCACCGGTCAAAT TGTTCTCTCCCAGTCTCCAG GCGAT AGCTAGCCAGGCTT ATCTAC AGCAGTCTGG
GCGATAGCTAGCCCCACCTCCTCCA G ATCCACCAC CGCCC GAG GCGTACTCGAGGAGACGGTGACCGT
ID. DE
SEQ. N
15
16 17
19 5
10
15
20
TGCAACAGTCTGGACCTG 93
ACC GCCAC CAGAGG AGAC G G TGACCGT
64 194-HL-HR1 GGTCCCTGCGCCCCAGACATCGAAGTAC ACCTCCTCCAGATCCACCACCGCCCG 94 65 66 194-HL-HRO 194-HL-LF1 AGCCACCGCCACCAGAGGAGACGGTG GCGGGGGAGGTGGCAGTGCTAGCGA CATCCAGATGACACAGACTACATC GCGAATACTCGAGCGI I IG GTTAC CA 95 96 67 68 l94-HL~LR3Xho 194-HL-LR3Xba GTTTGGTG GCGATATCTAGATTACCGTTTGGTTAC CAGTTTGGTG GCGTATGAGAATTCAGAGGTCCAGCTG 97 98 69 194-HL-HF1R1 CAACAGTCTGGACCTG GCGTATGAGAATTCTGACATCCAGA 99 70 194-LH-LF1R1 TGACACAGACTACATC GCG TATCTAG ATTAGG AG AC GGTG ACC 100 71 194-I H-HRIXhfi GTGGTnnnTGnGCnCCAGACATCGAAG 101 Tabela 4. Oligonucleotídeos usados para gerar domínio de ligação anti~CD3 a partir da seqüência G19-4 scFv.
0 domínio de ligação G19-4 foi sintetizado por extensão dos iniciadores de oligonucleotídeos superpostos como descrito previamente. A PCR da cadeia leve foi feita em duas etapas, iniciando por combinação dos iniciadores 43/44, 42/45, 41/46 e 40/47 em concentrações de 5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ e 40 μΜ,respectivamente, em Platinum PCR Supermix Hi-Fidelity por 3 0 ciclos de 94°C, 2 0 segundos, 600C, 10 segundos, 68 °C, 15 segundos. Um μΐ do produto de PCR resultante foi re-amplifiçado usando uma mistura de iniciadores de 39/48 (10 μΜ), 38/49 (20 μΜ) e 37/50 (40 μΜ) para a orientação LH, ou 66/67 (40 μΜ) para a orientação HL, usando as mesmas condições de PCR, com exceção da extensão a 68°C, que foi aumentada para 2 5 segundos. A VK na orientação LH foi ligada por PinAI na extremidade 5' e por NheI na extremidade 3', enquanto a orientação HL tinha NheI na extremidade 5' e XhoI na extremidade 3'.
Para sintetizar a cadeia pesada, foram preparadas misturas de iniciadores com as mesmas concentrações acima por combinação dos iniciadores 56/57, 55/58, 54/59 e 53/60 2 5 para a etapa da primeira de PCR. Na segunda PCR, os iniciadores 52/61 (20 μΜ) e 51/62 (50 μΜ) foram amplificados com 1 μΐ da primeira PCR usando as mesmas condições de PCR que a segunda PCR da cadeia leve para fazer a orientação LH com NheI na extremidade 5' e XhoI na extremidade 3'. Os iniciadores 52/61(10 μΜ), 63/64 (20 μΜ), 63 {20 μΜ)/65 (40 μΜ) e 63(20 μΜ)/65 (80 μΜ) foram combinados em uma segunda PCR com 1 μΐ da PCR anterior, para criar a cadeia pesada na orientação HL com PinAI na extremidade 5' e NheI na extremidade 3'. Como observado em relação âs construções anteriores, foi projetada uma superposição suficiente nos iniciadores centrada em torno do sítio NheI, de tal forma que a LH de G19-4 foi sintetizada por combinação das PCRs da cadeia pesada e leve na orientação LH e re-amplificação com os iniciadores flanqueadores 37 e 62, e a HL de G19-4 foi sintetizada por combinação das PCRs da HL e re-amplificação com iniciadores 63 e 67.
Os produtos de PCR de LH/HL de G19-4 de comprimento total foram separados por eletroforese em gel de agarose, removidos do gel e purificados com colunas MinElute Qiagen, como descrito anteriormente. Esses DNAs foram então clonados em TOPO em pCR2.1 (Invitrogen), transformados em TOP 10 e as colônias avaliadas, primeiro por tamanho de fragmento EcoRI, e depois por seqüenciamento de DNA. LH/HL de G19-4 foram então clonadas em pD18-IgGl por meio de PinAI-XhoI para expressão em células mamíferas.
Construção de LH/HL de 2H7sssIgGl-STDl-G19~4
Usando SMIPs de LH de G19-4 e HL de G19-4 como modelos, os domínios de ligação anti-CD3 de LH e HL foram alterados por PCR de tal forma que seus sítios de restrição flanqueadores fossem compatíveis com o cassete de scorpion. Um sítio EcoRI foi introduzido na extremidade 5' de cada scFv usando o iniciador 27 (LH) ou 36 (HL) e um códon de parada/sítio XbaI na extremidade 3' usando o iniciador 28 (LH) ou 35 (HL) . Os DNAs resultantes foram clonados em pD18-2H7sssIgG-STDl digerido com EcoRI-XbaI.
Construção de HL de 2H7sssIgGl-Hx~G19-4
DNAs de HL de 2H7sssIgGl-Hx-2el2 foram digeridos com BsrGI e EcoRI, e o fragmento de 325 bp que consiste na extremidade do terminal C do IgGl e ligante. Esses serviram de substitutos para a região equivalente na HL de 2H7sssIgGl-STDl-G19-4 por remoção do ligante STDl com o uso de BsrGI-EcoRI e substituindo-o com os ligantees correspondentes dos clones de HL de 2H7sssIgGl-Hx-2el2.
Ficam evidentes a partir da consideração das diversas
proteínas de ligação muitivalentes aqui reveladas as características das moléculas que são passíveis de combinação na formação das moléculas da invenção. Essas características incluem o domínio de ligação 1, uma sub-
região constante, incluindo um domínio de dobradiça ou dobradiça-Iike, um domínio de ligante e um domínio de ligação 2. A característica modular intrínseca do design dessas novas proteínas de ligação faz com que seja fácil para aqueles habilitados na técnica manipular a seqüência
2 0 de DNA nas extremidades do terminal N e/ou do terminal C de qualquer módulo desejável, de tal forma que ela possa ser inserida em praticamente qualquer posição para criar uma nova molécula que exibe funcionalidade alterada ou aumentada comparada com a(s) molécula(s) parente(s) da qual
2 5 foi derivada. Por exemplo, qualquer domínio de ligação
derivado de um membro da superfamília das imunoglobulinas é contemplado como o domínio de ligação 1 ou como o domínio de ligação 2 das moléculas de acordo com a invenção. Os domínios de ligação derivados incluem domínios que possuem
3 0 seqüências de aminoácidos, e até mesmo seqüências de polinucleotídeos codificadoras, que possuem uma correspondência uma a uma com a seqüência de um membro da superfamllia das imunoglobulinas, além de variantes e derivados que preferivelmente compartilham 80%, 90%, 95%, 99% ou 99,5% de identidade de seqüência com um membro da superfamllia das imunoglobulinas. Esses domínios de ligação (1 e 2) estão preferivelmente ligados a outros módulos das moléculas de acordo com a invenção por meio de ligantees que podem variar em termos de seqüência e comprimento, como aqui descrito em outra seção, desde que os ligantees sejam suficientes para fornecer qualquer espaçamento e flexibilidade necessários para que a molécula obtenha uma estrutura terciãria funcional. Outro módulo das proteínas de ligação multivalentes é a região de dobradiça, que pode corresponder â região de dobradiça de um membro da superfamllia das imunoglobulinas, mas pode ser uma variante desta, por exemplo, as regiões de dobradiça "CSC" ou "SSS" aqui descritas. Além disso, a sub-região constante compreende um módulo das proteínas de acordo com a invenção que pode corresponder a uma sub-região de uma região constante de um membro da superfamllia das imunoglobulinas, o que é tipificado pela estrutura de uma sub-região constante da dobradiça -CH2-CH3. Variantes e derivados de sub-regiões constantes também são contemplados, possuindo 2 5 preferivelmente seqüências de aminoãcidos que compartilham 80%, 90%, 95%, 99% ou 99,5% de identidade de seqüência com um membro da superfamllia das imunoglobulinas.
As estruturas primárias exemplares das características dessas moléculas são apresentadas na Tabela 5, que revela a seqüência de polinucleotídeos e de aminoácidos cognata de domínios de ligação 1 e 2 ilustrativos, além da estrutura primária de uma sub-região constante, incluindo um domínio de dobradiça ou dobradiça-liJce, e um ligante que pode ser interposto, por exemplo, entre região da extremidade do terminal C de uma sub-região constante e a extremidade do terminal N de um domínio de ligação 2 de uma proteína de ligação multivalente. Exemplares adicionais das moléculas de acordo com a invenção incluem as características descritas acima nas quais, por exemplo, um ou ambos os domínios de ligação 1 e 2 compreendem um domínio derivado de um domínio Vl ou Vh-Iike de um membro da superfamília das imunoglobulinas e um domínio Vh ou Vii-Iike derivado do mesmo membro ou de um membro diferente da superfamília das imunoglobulinas, com esses domínios separados por um ligante tipificado por qualquer um dos ligantees aqui revelados. São contempladas moléculas nas quais a orientação desses domínios é Vl-Vh ou Vh-Vl para BDl e/ou BD2. Uma apresentação mais completa das estruturas primárias de várias características das moléculas de ligação multivalentes de acordo com a invenção é encontrada na tabela anexada ao final desta especificação. A invenção ainda compreende polinucleotídeos que codificam essas moléculas.
Tabela 5
25
30 Dominxo de l..xijuçâo
Secjviericxa de nucleotídeos
S ecfucnci.i» de aminoácidos
ID. DE SEQ, Hos (Seq. de amino á oi do s
LH a!: gg a r. t: i:. t o a a g !:. g o a ç a tt1t c a g ctt cccgctaa ccagtgcttcagcce taatg-ccagaçgacaaattgttctc tcccaytoLccagcaatectg tetgc Stctccaggggagaaggtcacaatqa cttgcagggccagctcaagtgtaagt tacatgcactggtaccagcagaagcc. aggatcctcccccaaaccctggau1t atgccccatceaacctggcttctgga gtccctgctcgctt-.cag-ggcagtgg gtctgçgaectcttactcteteaeaa tcageagagtgqagqctçaagatqet gccac-tattactgccaçcagtgçag ttttaacccacccacgtt.cggtgetg ggaccaagctggagctgaaagatggc ggtggctcgggeggtggtggatccgg aggaggtgggaçetctcaggcttatc taeagcagtctggggetgagtcggtg aggcctggggccteagtgaagatgtc etgcaaggottctggctacacattta ccagctact^ata tgcactgggtaaag cagacacctagacagggcctggaatg gatt.gçagc t a 11.1. a t. c c a g g a a a t. g gtgatacttcetaeaatcagaagçte aagggcaaggccacactçactgtaga caaàtcctccagcacagcctacar.gc agctcageagecLgscateLgaagac tctgcggtcta-c ttctg^geaagagt ggtgtactatagtaacr.cttactggt acttcçatgtctggggcacagggacc aeggteaccgtctct_
md r q vq i f s f i .1 i s a s ν í rn s r g q i ν 1 s qs pa χ ι s aspge κ ν c rn t c r & & s s vsym hwyqqkpgsspkpwiyapsnlasgvpa ri-sçsgsgtsys ItisrveaecUa tyy cqqvsf npptfgagtkle-l kdggqsgg
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teis c ka s g y t í t s y nmhw ν kqt ρ r qg 1 ev/iça Iypgngdtsynqk fkqka Ll Lv dkssstaymqissltsedsavyfcarv vyysnsywyfdvvíçjr.gttvtvs Dominio Seqüência de 5i: *e ligação nuoleoUdeuM ;ís;íís; Seqüência de *;··;>■; aminoácidoS Λϊ·;;ί> 1 ΐ Í; í;y i] 1ϊ J í t; ? ç 1 ^"-fí? Ii í^l í fí H í?; I í^'-'"r Íí a ID. DE SEQ. Hos (Seq. de minoácidos atggactttcaagtgcagattttcaq cttcc-gctaar-cagt.gcttcagcc-a taatgtccagaçgagtcgacattçtg ctcacccaatctccagcttctttggc tgtgtctctaggtcagaçagccacca tctcctgcagagccagtgaaagtgtt gaaLartatgtcacaagCttaatgcs gtgg Laccaacagaaaccaggacagc caeccaaactcctcatccctgctgct agcaacgtagaatctggggtcccfcgc- caggtttagtggoagtgçgtctggga ca.gacttLagccLc3aca tccatcct gtggaggaggatgatattgcaatgta ttter.gr.cagcaaagt.açgaaggctc ca LgçacglLcggtggaggcaeeaag ctggaaatcaaacggggtggcggtgg atccggcggaggtgggtegggtggcg gcqgatctcaggtgcagctgaaggag tcaggacctggcctggtggcgccctc acagaçcctgtceatcacatgcaccg tctcagggttcccattaaceggccat ggtgtaaactgggttcgccagccccc a g g a a a g g g t. c t g g a g t g g c t g g g a a Lgatacggggtgatggaagcacagac tataattcagctctcaaatccagact atcgatcaccaaggacaactccaaga gccaagtttt.cr. taaaaatgaacagt. ctgcaaactgangacacagccagata ctactgtgcccgagatggttatagta ac t tf. ca 1t a c c a t.gr. r. a t gg a o t a o LggggtcaaggaacctcagtcaccgL ctcctct MPF«VQIF3? LLI^ASVJ -ISPGVDIYL TQSPASLAVSLGQRAT3 SCRASESVEY YVT S LMQWY QQK PGQP PK LLI S AASlvV SSGVPARFSGSGSGTDFSLKIHPVEED DlMiyFCQQSRKVPWTFGGGTKLEIKR GGGGSGGGGSGGGGSQVQLKF.SGPGLV APSOSLSITCTVSGFSLTGYGVMWVRQ PPGKGLEKLGMIWGDGSTDYNSALKSR LSlTKDNSKSQVFLKM^SLQTDDTARY YCARDGY SWFHYYVMDYWGQGT SVTVS 3 (4} 2el2 HL atggattttcaagtgcaçattttcag c 11 c c t g c t a a: c a g t g c 11 c a g u c a La a tqtccaqaggaq tccagg tgcag ctgaaggagtcaggacczggcctggt ggcgeccLcacagagcctgtccatca catgeaccgtcccagggttcteacta accggctatggcgtaaaetgggttcg ccagcctccaggaaagggtctggagt ggeLgggaatga Latgggglgatgga agcaeagactacaattcagctctcaa a t: c c a g a o t:. a t. c g a t c a c c a a g g a c a actccaagagccaagttx Lcltaaaa atgaacagtctgca-aactgatgacac agecagatactactgtgcccgagatg qt tacagtaaccttcatt.actat.gtt atggactactggggtcaaggaacctc agtcaccgtetcctctgggggtggag gctctggtggcggtggaeccggcgga ggtgggtcgggtggcggcggatctga cattgt.gctcacccaatctccagctt cLttggcLgtgtctctaggtcagaga gccaccatctcctgcagagccagtga aagtgttgaatattatg-cacaagtt taatgcagtggtaccaaeagaaacca MDFOVQIFSFLLISASVIMSRGVQVQL KESG PGLVAPSQSLSITCTVSGFS LTG YGVN WVRQ P PGKG l. F. W I-GMIWG DGSTD YKSALKSRLSITKDNSKSQVFLKKNSL QTDDTARYYCARDGYSMFHYYVMDYWG QGTSVTVS5GGGGSGGGGSÜGGGSGG3 GSDIVLTQS PAS LAVS LGQRATISCRA SESVEYYVTSLKQWYQQKPGQPPKLLI 5 AA $ MVE S GV PA R F S G S G S G T D F S L NI BPVEEDDIAMYFCQQSRKVPWTFGGGT KLSIKR 5 !δ)
30 Domínio de ligaçã Ί Seqüência de 3 nucleotxdeos S equencxa de ; ' · · j ID. DE : :i arainoaciaos SEQ. Mos (Seq. de aminoácidos ggacagccacccaaactcctcatetc tgctgctagcaacgtagaatetgçgg tccctgccaggr.ttagtçgcagtggg tctggçacagactttagcctcaacat ecatcctgLggaggaggatgatattg caatg~atttctgteagcaaagtagg aaggttccatggacgttcggtggagg caccaagctggaaa tcaaacgt G28-1 LK accggtgocrttccagatçactcagtc tccagcctccctatctgcatctgtgg gagagactgt caccatcacatgtcga. acaagtgaaaatgtttacagttatt.t ggcttggtatcagcagaaacagggaa aatctcctcagotcctggtctctttt gcaaaaaccttagcagaaggtgtcco a tcaaggttcaçtggcag Lggatcag gcacacagtttüctctgaagatcagc agcctgcagcctgaagattctggaag ttatttctgteaacatcattccga ta atccg-ggacgttcggtggaggcacc gaactggag&tcaaaggtggcgg-gg ctcgqqcggtgqtgggtcgggtqçcg gcgga-ctgctagcgcagtccagctg ca g c a α t c t gg a cc tg agct-.gga a a a gcctggegcttcagLgaagaLttcct gcaaggcttct.ggttactc cittcact ggctacaaLatgaactgggLgaagea gaaIaaLggaaagagccttgagtgga ttggaaatattgatccttattatggt ggtacCacctacaaccggaagttcaa gggcaaggccacattgactgtagaea aatcctccagcacagcccacatgcag ctcaagagtctgacatc^gaggacte tgcaguctattactgtgcaagatcgg tcgg c c c ta t g ça c t a o t ggggtcaa ggaacctcagtcaccgtctegag DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSS NVY SY T AW YQQKQGK S PQLLVSFA KTL AEGVPSRFSGSGSGTQFSLKISSLQPE DSG S YFCQ H H SDN PWT TGGG T E LEIKG GGGSGGGGSGGGGSASAVQLQCSGPEL EKPGAS'VKI SCKhSGY SFTG YWÍNWVK QKNGKSLEWIGNIDPYYGGTTYiNRKFK GKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSA VYYCARSVGPMDYWGCGTBVTVS 102 (103) G28-1 HL accggtgaggtccagctçcaacagtc LggaecLgaactggtgaagcctggag cttcaatgaagatttcccgcaaqçcc tctggttactcatteacrggctacat egtgaactggetgaageagagceatg gaaagaaccttgagtggattggactt attaatceatacaaaggtettac~ae etacaaccagaaattcaagggcaagg ceaeattaacty tagacaagtcazcc agcacagcctacatggagctcctcag tctgacatctgaagactctgeagtct attactgtgcaagatctgggtactat ggtgactcggactggtacttcgacgt ctgggçcgcagçgaccacggtcaccg tctcctctggtggcggtggctcgggc ggtgg-ggatctggaggaggtggçag cgggggaggtggcagtgctagcgaca tccaga Lgaeaeagaetaea Leetcc ctgtcc-gcctctctggqagacagagt caccatcagttçcagggcaagtcagg EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGY SFTGYlliZNWLKQSHGKMLEisjIG LIHPY KGLTTYNQKFKGKATLTVPKSSSTAYM SLLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDKY FDl^GAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGG G SGGGG SAS DIQMTQT TSSL SAS LGDR VTISC RASQDI RNYLWrWYQQKFDG TVK LLIYYTSRLKSGVPSRFSGSGSGTDYS L TlANLQPSDIA T Y FC OQGN T I. PW T F G GGTKLVTKRS 104 (105) Domínio de ligação S eqüência de |§;3 nucleotideos 'Séqüericlá 'cíé _ _ ^aminOáçidos_________________·..,!·&£ ID. DE SEQ. Hos (Seq. de imlno á cdL do s acattcgcaattatttaaactggrat cagcagaaaccagatggaactgttaa actcctgatctactacacatcaagat tacactcaggagtcecatcaaggttc agtggcagtgggtctggaaeagat La LtctctcaceattgccaaccLgcaac cagaagatattgccacttacttttgc caacagggLaat.acgctt.ccg Lggac gt tcqgtqgaggcaccaaactgqtaa ccaaacgctcgag Gl 9--4 LH accggrgacatccagatgacacaçac tacatcctcccr.gtctgeotctctgg gagacagagLcaccatcagttgcagg gca agt caggaca 11 cgcaa L1 a c 1t aaactggtatcageagaaaocagatg gaa ctg LLaa a c LccLga Lc Lac Lac acateaagatt.aoactcaggagtccc atcaaggtteagtggcagtgggtctg gaacagat. LatLeLeteacca Ltgcc aacctgcaaccagaagatattgceac ttacttttgccaacagggtaatacgc ttccgtggacqttcggtggaqgcacc aaactçgtaaccaaacgçggtggcgg tggctcgggcggtggtgçatetggag gaggLgggagcgeLagcgaggLceag ctgcaacaqtctggacc^gaactqgt g a a g e e r. g g a g e t r. e a a t g a a g a ?. t t ceLgcaaggeclcLggLtaeLcatLe actggctacatcgtgaact.ggct.gaa gcagagceatggaaagaaccttgagt ggatr.çgacttatt.aatccatacaaa ggtcttactacctacaaccagaaatt caaggçeaaggccacatr,aactgr.ag acaagtoatccagcacagcctacatg gagctcctcag tct gacatctgaaga ctctgcagtctattactgtgcaagat. etgggtactatggLgaetcggactgg tacttcgatgcctgggqcgeagggac cacggtcaccg-ctcctcgag BIQMTQTTSS LSAS LG DRVTISCPASQ DIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRL HSGVPSRFSGSG5GTDYSLTIANLQPE DIATYFCQQGMTLPWTFGGGTKLVTKR GGGGSGGGGSGGGGSASEVQLQQSGPS LVKPGASMKISCKASGYSFTGYIVNKL KQSBGKNLS^IGLINPYKGLTTYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDS AVYYCARSGYY6DSDWYFDVWGAGTTV TVSS 106 (1Q~1 Gl 9-4 HL accgg-gaggtccagctgcaacagtc tggacctgaactggtgaagcctgçag cttcaatgaagatttccrgcaaggcc tctggttactcattcactggctacat cgtgaacr.ggcr.gaagcagagccatg ga a aga a ccL Lgag Lgg a L Lgga e L L attaatecatacaaaggccttaccac ctacaaecagaaattcaagggcaagg ccacattaactgtagacaagteatce agcacagcctacatggagctcctcag tctgacatctgaagactctgcagtct. a t L a e t g t g c a a g a t c t g g g L a e L a L ggtgactcggactggtacttcgargt ctggggcgcagggaccacggtcaccg tetcc-cctggtçgcggtggctcgggc ggtggtggatctggaggaggtgggag cgctagcgacatccaga::gacacaga SVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGY SFTGYIVKWLKQSHGKMLEWIGLIMPY KGLTTYMQKFKGKATLTVDKSSSTAYM 5 L LS LT S E DS AV Y YC AR S G Y YG DS DW Y FDVKKiAGTTVTVSSGGGGfiGGGGSGGG GSftSDTQMTQTTSS I.S AS LGDRVTISC RA5QDIRKYLMWYQQKPDGTVKLLlYY TSRLRSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIAN LQ PI%D3 AT YFCQQGNTLfvriTG GGTK1, VTKRS 20Q (103) ( Domínio Seqüência de : Ie ligação nucleotideos Scqui^ncia de : ! :·Qminoacidos ID. DE SEQ. Hos (Seq. de aminoácidos ctacarcctccctgtctrc z-tctctq ggagacagagt.caccatcagt--t.gcag ggcaagtcaggacattcçcaattatt taaactggtatcagcagaaaccagat ggaactgttaaactcetgatctacta cacatcaagatcacactcaggaqtcc eatcaaggttcagtggcagtgggtct ggaacagalUittctctcaccattgc caacctgcaaccagaagatattgcca cttacttttgccaacagggtaatacg cttccgtggacgttcggtggaggcac caaactygtaaccaaacgctcgag
ÍRegião de í; dobradiça i: Seqüência de nucleotideos Seqüência de aminoácidos [D. DE SEQ. H0 (seq. de aa) SSSfs) - hlgGl gagcccaaatcttctgacaaaact ca c ac a t c t cc ac cga gc tca EPKSSDKT H T S PPS S 230 (2.31) CSC (S) - h T gG l gagcccaaatcttgtgacaaaact cacacat.ct.ccaccgtqctca SPKSCDKTHISPPCS 232 (233) S5C (S) - hlgGl gagcccaaatct tct.gacaaaact cacacatctccaccgtgctca KPKSSDKTHTSPPCS 110 (IU) 3CC(S)" hlgGl gagcccaaatcttctgacaaaact cacacalg cccaccgtgctca EPKSSDKTHTCPPCS 112 (113) css (s) ·· KigGl gagcccaaatcttgtgacaaaact cacacatctccaccgaqctca SPKSCDKTHTSPPSS 113 (US) SCS (sO - hlgGl gagcccaaa tcttqtgacaaaact cacacatgtccaccgagctca EPFSSDKTHTCPPSS .1)6 (117) CCC (S) - hlgGl g a q c c c a a a t c 1t g r. g a ca a a a c t cacacatgtccaccgtgctca S P K S C DKT H T S P PC S .118 (110) ccc(p)- h 1 gG 1 gagcccaaatcttgtgacaaaact cacacatgtccaccgtgccca SPKSCDKTHTSPPCP 120 (12.1) SSS(p)- hlgGl gagcccaaatcttctgacaaaact cacacatctccaccgagccca SPKSSDKTHTSPPSP 122 (123) csc(p)" hlgGl gagcceaaatcttgtçacaaaact c a c a c a t c t c ca c c< j t g c c c a SPKSCDKTHTSPPCP 124 (125) SGC (p) - hlgGl gagcccaaatcttctgacaaaact cacacatctccaccgtgccca SPKSSDKTHTS PPCP 126 (127) scc(p)- hlgGl gagcccaaatcttctgacaaaact c a c a c. a t g t c c a c cgtqc c c a EPKSSDKTHTCPPCP 128 (129) C55(p) hlgGl gagcccaaatcttgtgacaaaact cacacatctccaccgagccca £ P K S C D K1J' H T S P P S P 130 (131) scs(p)- ri IaGl gagcccaaatcttgtgacaaaact c a c a c a t g t c c a c a g a g c c e a SPKSSDKTHTCPPSP 132 (133) <· rop. ρ "EFD gi cc<.Kcnl q^-ccci SCPPCP 134 (135) Sequencia de nucleotideos Seqüência de aminoacidos [D. DE SEQ. H0 (seq. de aa) η IgG l (P238S) Cri;,Cri^ gcaoct ^aocL 1991 XI^tcg tcagtcttcctcttccccccaaaa cccaaggacaccctcatgatctcc cggacccct-gaggtcacatgcgtg gtggtgqacgtgagccacgaagac ^II IGM.sV! 1.1 ΡΡΚΜΟΊ I,M's RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALEiAPIEKT ISKAKGQPREPQVYT 142 (143)
30 cctgaggtcaagttcaactcjg::ac gtggaeggcgtggaggtgcataat gccaagacaaagcegegggaggag cagcacaacagcacgtaccgfcgtg gtcagcgtcctcaccgtcctgcac caggactggctgaatggcaaggag tacaag tgcaaggtctccaacaaa gccctcccagcccccatcgagaaa acaat.ctceaaagccaaagggcag ccccgagaaccacaggtgtaeace ctgcccccatcccgggatgagctg accaagaaccaggtcagcctgacc tgcctggtcaaaggcttetatccc agcçacatcgccgtggagtgggag ageaa r.gggcagocggagaacaac tacaagaccacgecteecgLgcLg gac-ccgacggctccctcttcctc tacagcaagctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtc ttcccatgcrccgtgatgcatgag gctctgcacaaccacnacacgcag a aga gec L c L ccc tgtctccqgçtaaatça LPPSRDELTKMQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGOPENNYKTTPrVL DSDGSFFLYS KLTVDK S RWQOGM V FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K hlgGl (P331S) CivCVi qcacctgaactcctgggtggaccg tcagtcttcctcttccccccaaaa cccaaggacaccct ca tga te ;:.cc cqgacccctqaggteacatgcgtg gtgcrggacgtgagccacgaagac cctgaggLcaagttcaacLggtac gtggacggcgtggaggtgcataat gccaagacaaagccgcgggaggag cag-acaacagcacgr.accgtçtg gtcagcgtcctcaccgtcctgcac caggactggctgaatçgcaaggag cacaagtgcaaggtctcoaaeaaa gccctcccagcctcca tcgagaaa acaatctccaaagccaaagggcag ccccgagaaccacaggtgtacacc ctgcccccatcccggqa tqagctg accaagaaccaggtcagcctgacc tgcc tggtcaaaggct tct.atccc agcgacatcçccgtggagtggçag agcaatgggcagccggagaacaac r.a c a aga cc a cgc c t o c cg t g c t g gcictccgaegycLcctIcLtcctc tacagcaagctcaccgtggacaag agcagçítggcagcaggggaacgtc ttctcatgctcegtgatgcatgag gctctgcacaaccaccacacgcag a ag a g c c t. c r. c c c tg t c t ccggg t a a a tga Λ PS LLGG P SVFLFP PK PKDT LHIS RTPE V T CVVV DV S H E DPEVKFNWY VIXaVE VHN AKT K PRS E QY MST Y RV VSV l.TV Γ .HQDW LNGK tí Y KCK VS M K ALPASIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKMQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPBNNYKTTfc1 PVL DS DG S F FL Y SKLTVDK S RWQQGMV FSCSVMHEALHMHYTQKSLfiLSPG K 144 (145) hl gG 1 (P 2 3 8 S / P331S) f p gcacctgaa ct cctqgg tg<ja'ccg tcagtcttcctcttccccccaaaa cccaaggacaccctcatgatctcc cggaccectgagg tcacaLgcg tg qtggtggacgtgagccacgaaqac cctgaggtcaagttcaactggr.ac gtggacggcgtggaggtgcataat gccaagacaaagccgcgggaggag cagracaacagcacgraccgtgtg qtcaqegtcctcaccgtcctgcae AtiELl1GGssvi-1LFPPKPlOTLM': S RT PEVTCVVVDVSH S DPEVK FNWY VDGVEVHNAKTKPRSEQYNSTYKV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSMK ALPAS .1 EKTI SKAKGQPKfT-PQVYT LPPSRDELTKMQVSLTCLVKoFYP SDIAV E W E; S N G Q P E N M Y K T T P ? VI, DSDGSFFLYSKLTVDKSKWQQGMV FSC SVtiHEALHNHYTQKSLSLS PG K 146 (14"') côgçactggctgaatggcaagqaçj fca c a a α t g c a a gg t c c oca a c a a a gccclcceagccLccaIcgayaaa acaatctccaaagccaaagggcag ccccgagaaccaeaggtgtacacc c t. g c c: c o c a r. e o cg g c; a r g a g c: r. g a c c a a g a a oca g g t. c a g c c Cga c c cgcctggtcaaAggcctctdtccc agcçacaLcgccgtggagtgggag ageaatgqqcBqccqgagaacaac tacaagaccacgcctcccgtgctg gac ~ ccg a cggc t ce t. t.c 1t cc t. c tacaqcaagetcaccqLgqacaaq agcaggtg-gcagcaggggaacgtc r.tcr.c:atgcr.ccgt.gat.gcar-gag guteLgcacaaccactacacgcag aagagcctccccctgtcCccgggt aaar.ga Vxnculador Seqüência de nucleotxdeos - Secjuencia de aminoacidos . Identificador de setjUência & (149) STDI a=r- itgr g'U tf « <jgtggtqt3 a CCtgqaqgaggtqgq agtaggaatcct 11 jt iGGC SGGGG > -<■, SC-I >· STD2 aatr.atggt.ggoggtçgctcgçgc ggtgyLygatetggaygegqtggg aqtçqgaatLatgqtqgcqqtgqc tcgggcggtggtggatctggagga cr g t Cj g g λ α t: α cj g ã a 1r. e t NYGGGGSGGGGSGGGGSGNYGGGG .SG GG GS GG G G S G H £ 150 í J5L) Hl aat.tct NS 1Γ>2 (153) H;· qq t g qcq q t.o y C t cg q q g a a tLC L GGGGSGHS ]5<1 (155) H 3 α à 11 <41 y g t. g g cgg 1c: q c L c t y g g aatvet NYGGGGSGNS 1 ^>6 £]5'í} H 4 ggtggcggtggctcgggcggtggt eqa Lc v.qqgaa L Lot GGGG3GGGGSGNS I5ô (159) HS a At t a r.ggr.ggoggtggctcgggc eq 11 j q 1.1! q j L c L qq q a a t C t MY GG GG SGGG GSGKS 160 (Ibl) H 6 ggtggcqgtqgcLcyaycgqtggL gga-ctgggggaggaggcãgcggg aattct G G G G S G G G 3 S G G G G S G í IS 162. (163) H"' gqgtqv.ccacet LiftccgaaLtct GCP?CPNS 16 0 (16b) (G4S)3 ggtçsgcggtçgstccggeggaçgt qgq tcqggζq gcggcgga tct GGGSGGGSGGGK :i&6 (1(>?) (G4S)4 ggtggcggtçgctcgçgcggtçgt ggar-ctggaggaggt.gggagcçgg ggaggtggeagt GGGSGGGS3GGSGGGGS ISS (160)
Tabela 5. Estruturas primárias (seqüências de polinucleotídeos e de aminoãcidos cognata) de características exemplares de moléculas de ligação rrultivalentes.
Exemplo 8
Estudos de ligação e funcionais com proteínas de fusão multiespecíficas alternativas
Fbram realizados experimentos equivalentes aos experimentos descritos acima para a molécula de ligação multiespecífica CD20-IgG-CD28 (de fusão) prototípica para cada uma das moléculas de ligação multivalentes adicionais descritas acima. Hm geral, os dados obtidos para essas moléculas adicionais eqüivalem aos resultados observados para a molécula-protótipo. Alguns dos resultados que se 15
20
25
30
sobressaem nesses experientes serão apresentados abaixo Λ Figura I4 mostra resultados ^ ^^ ^ ^^
realizados em uma das novas moléculas, nos quais tanto BD1
quanto BD2 se Iigam aos antígenos-alvos na mesma célula ou S tipo de célula, nesse caso, CD20 e CD37. Essa proteína de
fusão multivalente e multiespecífica (de fusão) foi Poetada com o domínio de ligação ! se ligando ao CD2Q (2HV; orientação Vl-Vh), . 0 dominio de ^^ a ^ ligando ao CD3 vL-vH (LH) ou ^ {hl) de q
experimento foi realizado a fim de demQnstrar ^ propriedades multiespecíficas da proteína.
Estudos de bloqueio·, células R n u-,
ceiuias B Imf oblastóides Ramos
ou BJAB (2 5 ύ- Iii5I -ρ
(2,5 χ io) forara pré-incubadas em placas de 96
Poços com fundo em em meio de coloração (pbs com soros de camundongo 2%) com anticorpQ ^
W/ml) ou anticorpo murídeo anti-CD37 (10 w/nl), ambos em conjunto, ou meio de coloração isoladamente por 45 minutos - gelo no escuro. Os anticorpos de bloqueio foram pré- incubados com as células por 10 minutos em temperatura ambiente, antes da adição da proteína de ligação multiespecífica (de fusão) nas faixas de concentração indicadas, normalmente de 0,02 Mg/ml a 10 ^ e incubados por mais 45 minutos no gelo no escuro. As células foram lavadas 2 ve2es em meio de coloração, e incubadas por
Uma h^a n° 9S1° C°m humana de cabra contada a
FITC (1:100) Caltag (Burlincramp rai
y ^urnngame, CA) em meio de coloração
Para detectar a ligação das proteínas de Iiga^
multiespecíficas (de fusão) ãs células. As células foram
então lavadas 2 vezes com PBq
com PBS, e fixadas com
paraf ormaideí do 1% (N° dp
IN de Catalogo 19943, usb, Cleveland, Ohio) . As células foram analisadas por citometria de fluxo
com a utilização de um instrumento FACsCalibur e do
software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Cada
série de dados tabula a ligação da proteína de fusão de HL
de 2H7-sss-hlgG-STDl-G2 8-1 na presença de anticorpos de
bloqueio de CD20, CD37 ou tanto CD20 quanto CD37. Embora
esse experimento tenha usado um dos ligantees clivados,
somente a presença de ambos os anticorpos de bloqueio
elimina completamente a ligação pela proteína de ligação
multiespecífica (de fusão), demonstrando que a maioria das
moléculas possui função de ligação tanto para CD20 quanto
para CD37. Os dados foram similares para as duas linhagens
celulares testadas nos painéis AeB, Ramos e BJAB, em que
o anticorpo de bloqueio de CD20 foi mais eficaz do que o
anticorpo de bloqueio de CD37 na redução' do nível de
ligação observado pela proteína de ligação multiespecífica (de fusão).
Ensaios de ADCC
A Figura 15 mostra os resultados de ensaios de ADCC realizados nas proteínas de ligação multiespecíficas (de fusão) CD20-CD37. Os ensaios de ADCC foram realizados com o uso de células Iinfoblastóides B BJAB como alvos, e PBMCs humanos como células efetoras. As células BJAB foram marcadas com 500 pCi/ml de cromato de sódio 51Cr (250 pCi/pg) por 2 horas a 37°C em IMDM/FB S 10%. As células marcadas foram lavadas três vezes em RPMI/FBS 10%, e ressuspensas a 4 χ IO5 células/ml em RPMI. Sangue total humano heparinizado foi obtido de doadores internos anônimos, e as PBMCs isoladas por fracionamento sobre gradientes de Meios de Separação de Linfócitos (LSMi ICN Biomedical). As capas de leucócitos foram coletadas e lavadas duas vezes em RPMI/FBS 10%, antes da ressuspensão em RPMI/FBS 10% em uma concentração final de 5 χ IO6 células/ml. As células foram contadas por exclusão de azul tripano usando um hemocitômetro, antes de serem usadas em ensaios subseqüentes. Foram adicionadas amostras de reagente ao meio RPMI com FBS 10% a 4 vezes a concentração final, e foram preparadas três diluições seriais de 10 vezes para cada reagente. Esses reagentes foram então adicionados às placas de 96 poços com fundo em »u» a 50 pi/poço para as concentrações finais indicadas. As células BJAB marcadas com 51Cr foram adicionadas às placas a 50 μΐ/poço (2 X IO4 células/poço). Os PBMCs foram então adicionados às placas a 100 μΐ/poço (5 χ IO5 células/poço) até uma proporção final de 25:1 de células efetoras (PBMC):alvo (BJAB). As células efetoras e alvo foram adicionadas ao meio isoladamente para medir o nível de morte de fundo. As células marcadas com 51Cr foram adicionadas ao meio isoladamente para medir a liberação espontânea de 51Cr ao meio com NP40 5% (N° de Catálogo 28324, Pierce, Rockford, IL) para medir a liberação máxima de 51Cr. As reações foram preparadas em poços em triplicata de uma placa de 95 poços. As proteínas de ligação muitiespecíficas (de fusão) foram adicionadas aos poços era uma concentração final que varia de 0,01 Mg/ml a 10 μ9/π,1, como indicado nos gráficos. Cada série de dados tabula uma proteína de ligação multiespecífioa (de fusão) diferente ou os SMIP3 de especificidade única correspondentes nas faixas de titulação descritas. Deixou-se que as reações evoluíssem por S horas a 3 7°C em CO2 5%, antes da coleta e contagem. Vinte e cinco μΐ do sobrenadante de cada poço foram então transferidos para uma Placa Luma 9 6 (N° de Catálogo 6006633, Perkin Elmer, Boston, Mass) e secos de um dia para o outro em temperatura ambiente. A CPM liberada foi medida em um Packard TopCounNXT. 0 percentual de morte específica foi calculado subtraindo-se (cpm {média de amostras em triplicata} da amostra - cpm de liberação espontânea)/(cpm de liberação mãxima-cpm de liberação espontânea) χ 100. Os dados são tabulados como % de morte específica versus concentração de proteína. Os dados demonstram que a proteína de ligação multiespecífica (de fusão) é capaz de mediar a atividade de ADCC contra células que expressam o(s) antígeno(s)-alvo, bem como os SMIPs de especificidade única por CD20 e/ou CD37, mas não mostram aumento no nível dessa função efetora.
Experimentos co-cultivo
A Figura 16 mostra os resultados de experimentos projetados para verificar outras propriedades desse tipo de proteína de ligação multiespecífica (de fusão), na qual o fato de possuir dois domínios de ligação contra alvos expressos na mesma célula ou tipo de célula talvez resulte em efeitos sinérgicos por sinalização/ligação por meio dos dois receptores de superfície ligados. Os experimentos de co-cultivo foram realizados usando PBMCs isolados, como descrito para os ensaios de ADCC acima. Esses PBMCs foram ressuspensos em meio de cultura a 2 χ IO6 células/ml em um volume final de 500 μΐ/poço, e cultivados isoladamente ou incubados com SMIPs de especificidade única por CD20, CD37, CD20+CD37, ou com a proteína de ligação multiespecífica (de fusão) usando o ligante H7, [HL de 2H7-sss-IgG-H7-G28-l]. Cada um dos reagentes de teste foi adicionado em uma concentração final de 2 0 μ9/τη1. Após 24 horas de cultura, não foram observadas diferenças reais no % de células B em cultura; no entanto, quando as células eram submetidas à citometria de fluxo, o agrupamento de células era visível no padrão de coloração FWD X 90 para as culturas contendo a proteína de ligação multiespecífica (de fusão), indicando que as células B que expressam os dois antígenos-alvos estavam engajadas na adesão homotípica. Após 72 horas em cultura, a proteína de ligação multiespecífica (de fusão) produziu a morte de quase todas as células B presentes. A combinação dos dois SMIPs de especificidade única também diminui drasticamente a percentagem de células B, mas não ao nível observado com a molécula de ligação multiespecífica. Esses dados sugerem que a utilização de ambos os domínios de ligação por CD2 0 e CD3 7 na mesma molécula multiespecífica resulta na adesão homotípica entre células B, e também pode resultar na ligação de antígenos tanto CD2 0 quanto CD37 na mesma célula. Sem se prender a uma teoria, o efeito sinérgico na eliminação de células- alvo pode ser causado: (1) pela ligação por meio dos domínios de ligação 1 e 2 nos mesmos tipos de células, e/ou (2) por interações do domínio da função efetora {sub-região constante) das moléculas de ligação multivalentes com 2 5 monócitos ou outros tipos de células na cultura de PBMCs que resultam em morte retardada. A cinética desse efeito de morte não é rápida, levando mais de 24 horas até ser obtido, indicando que ele pode ser um efeito secundário, sendo necessária a produção de citocinas ou de outras moléculas, antes de os efeitos serem observados. Ensaio de apoptose
A Figura 17 mostra os resultados de experimentos projetados para explorar a indução de apoptose após tratamento de linhagens de células B com as proteínas de ligação multivalentes e multiespecificas (de fusão) [HL de 2H7-sss-hIgG-H7-G2 8-1] ou com SMIPS de especificidade única por CD2 0 e/ou CD3 7, isoladamente e em combinação um com o outro. Células Ramos (painel A; ATCC N0 CRL-1596) e células Daudi (painel B; ATCC N0 CCL-213) foram incubadas de um dia para o outro (24 horas) a 37°C em CO2 5% em meio completo Iscoves (Gibco) com FBS 10% a 3 X 105 células/ml, e 5, 10 ou 2 0 pg/ml de proteínas de fusão. Para experimentos de combinação com os SMIPs de especificidade única, as proteínas foram usadas nas seguintes concentrações: TRU-015 (SMIP dirigido contra CD20) = 10 pg/ml, com 5 pg/ml de LH de G28-1 (SMIP dirigido contra CD37). Alternativamente, TRU- 015 = 2 0 pg/ml foi combinado com LH de G2 8 -1 a 10 pg/ml. As células foram então coradas com Anexina V-FITC e iodeto de propídio, usando o Kit de Detecção de Apoptose BD 2 0 Pharmingen I (N0 de Catálogo 55 6547), e processadas de acordo com as instruções do kit. As células foram gentilmente turbilhonadas, incubadas no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos, e diluídas em 400 μΐ de tampão de ligação antes da análise. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo em um instrumento FACsCalibur (Becton Dickinson) usando o software CellQuest (Becton Dickinson). Os dados são apresentados como gráficos de colunas que tabulam a percentagem de células positivas para Anexina V/iodeto de propídio versus tipo de tratamento. Nitidamente, a proteína de ligação muitiespecífica (de fusão) é capaz de induzir um nível significativamente mais elevado de morte apoptótica em ambas as linhagens celulares do que os reagentes de especificidade única, mesmo quando usados em juntos. Essa atividade funcional aumentada reflete uma interação da ligação coordenada de receptores de BDl e BD2 (específico para CD20 e CD37) sobre as células-alvo.
Exemplo 9
Propriedades de ligação e funcionais de proteínas de ligação multiespecífica (de fusão) 2H7-hIgG-G19-4
Esse exemplo descreve as propriedades de ligação e funcionais das proteínas de fusão multiespecíficas 2H7- hIgG-G19-4. A construção dessas moléculas é descrita no Exemplo 7. A expressão e purificação são como descritas em Exemplos anteriores.
Foram efetuados experimentos de ligação como descrito para as moléculas prévias, exceto que as células-alvo usadas para medir a ligação ao CD3 foram células Jurkat que expressam CD3 em sua superfície. Veja a Figura 18, onde o 2 0 gráfico superior mostra curvas de ligação obtidas para ligação das moléculas multiespecíficas CD20-CD3 às células Jurkat com o uso de proteínas purificadas diluídas serialmente de 20 a 0,05 μ9/πι1. A orientação HL da especificidade de Gl9-4 parece se ligar melhor ao antígeno
2 5 CD3 do que a orientação LH. O painel inferior mostra as
curvas de ligação obtidas para o BDl, o domínio de ligação que reconhece CD20. Todas as moléculas se ligam bem, e em um nível aproximadamente equivalente a um SMIP de especificidade única por CD20.
3 0 Ensaios de ADCC Para os dados apresentados na Figura 19, foram realizados ensaios de ADCC como descrito em no Exemplo anterior. Nesse caso, todas as proteínas de fusão eram variantes ou combinações 2H7-hIgG-G19-4 dos SMIPs de especificidade única (2H7, específico para CD2 0) ou anticorpos (G19-4, específico para CD3) . Além disso, para os dados apresentados no painel inferior da Figura 19, as células NK foram eliminadas dos PBMCs antes do uso, por eliminação de glóbulos magnéticos utilizando um aparelho de separação por coluna MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) e microglóbulos magnéticos de CD16 específicos para células NK (N° de Catálogo: 130-045-701) . Os dados apresentados nos dois painéis demonstram que todas as moléculas multiespecíficas CD20-hIgG-CD3 medeiam ADCCi
independentemente se as células NK são eliminadas ou se são usados PBMC totais no ensaio. Para o TRU-015 ou combinações de Gl9-4 e TRU015, apenas culturas que contêm células NK podiam mediar ADCC. G19-4 não funcionou bem em qualquer ensaio contra alvos de células BJAB, que não expressam CD3, 2 0 embora G19-4 possa ter se ligado às células T NK que expressam CD3 e ativado essas células no primeiro ensaio mostrado. A morte observada no painel inferior para as proteínas de ligação multiespecíficas (de fusão) é provavelmente mediada pela ativação de citotoxicidade na população de células T por ligação ao CD3, contra os alvos BJAB que expressam o antígeno CD20. Essa atividade de morte parece ser relativamente insensível à dosagem das moléculas ao longo da faixa de concentração usada, e ainda é significativamente diferente das outras moléculas testadas, até mesmo em uma concentração de 0,01 ^ig/ml. Exemplo 10 Molécula de ligação multivalentes
Outras modalidades include domínios de ligantees derivados de imunoglobulinas. Mais especificamente, as seqüências-fonte para esses ligantees são seqüências obtidas por comparação de regiões presentes entre os domínios V-Iike ou os domínios V- e C-Iike de outros membros da superfamília das imunoglobulinas. Como essas seqüências são normalmente expressas como parte do domínio extracelular de receptores da superfície celular, espera-se que elas sejam mais estáveis à clivagem proteolítica, e também não devem ser imunogênicas. Um tipo de seqüência que supostamente não é útil no papel de um ligante para as proteínas de ligação multivalentes (de fusão) é o tipo de seqüência expresso em membros expressos na superfície da superfamília das imunoglobulinas, mas que ocorrem na região interveniente entre o domínio C-Iike e o domínio transmembrana. Muitas dessas moléculas foram observadas em forma solúvel, e são clivadas nessas regiões intervenientes próximas â membrana celular, indicando que as seqüências são mais suscetíveis à clivagem do que o resto da molécula.
Os ligantees descritos acima são inseridos em um SMIP de especificidade única, entre o domínio de ligação e o domínio da função efetora, ou são inseridos em uma das duas posições do ligante possíveis em uma proteína de fusão multivalente (de fusão), como aqui descrito.
Uma listagem completa das seqüências reveladas nesse pedido é fornecida em anexo, e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. 0 código de cores que indica 3 0 a seqüência de várias regiões ou domínios dos polinucleotídeos e polipeptídeos em particular é útil na identificação de uma região ou um domínio correspondente na seqüência de qualquer uma das moléculas aqui reveladas.
Exemplo 11
Matriz de rastreamento para candidatos a scorpion que visam
células B
Introdução
Como uma forma de identificação de combinações de domínios de ligação pareados de anticorpo monoclonal que mais provavelmente gerariam moléculas de ligação multivalentes, ou scorpions, úteis e potentes contra uma população-alvo, uma série de anticorpos monoclonais contra célula B antígenos foi testada em uma matriz de combinação contra linhagens de células B que representam vários Iinfornas não Hodgkin. Para assegurar que todas as comparações possíveis de pareamento de anticorpos que sabida ou supostamente se ligam à célula de interesse são testadas, pode ser usada uma matriz de anticorpos bidimensional para guiar o design de estudos que utilizam certo tipo de célula. Anticorpos monoclonais contra numerosos antígenos de célula B conhecidos por suas designações de agrupamento (CDs) são registrados na coluna da esquerda. Alguns desses anticorpos (designados pelo(s) antígeno(s) ao qual se ligam especificamente), ou seja, CD19, CD2 0, CD21, CD22, CD23, CD30, CD37, CD40, CD70, CD72, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD86 e CL II (Classe II do MHC) , foram incubados, isoladamente ou em combinação com outros membros desse conjunto de anticorpos monoclonais, com células-alvo antígeno-positivas. Os domínios variáveis desses anticorpos são contemplados como domínios de ligação em modalidades exemplares das moléculas de ligação multivalentes. Usando os conhecimentos da técnica e procedimentos rotina, aqueles habilitados na técnica são capazes de identificar seqüências de anticorpo adequadas {ácido nucléico que codifica seqüências, além de seqüências de aminoãcidos) , por exemplo, em bases de dados publicamente disponíveis, para a geração de um anticorpo adequado, ou fragmento deste (por exemplo, por clonagem baseada em hibridização, PCR, síntese peptídica, e semelhantes), e para a construção moléculas de ligação multivalentes com a utilização destes compostos. Fontes de anticorpos exemplares dos quais os domínios de ligação foram obtidos, como aqui descrito, são fornecidos na Tabela 6. Tipicamente, será usada uma estratégia de clonagem ou de síntese que realiza as regiões CDR de uma cadeia de anticorpo, embora qualquer anticorpo, fragmento deste ou derivado deste que retenha a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno-alvo seja contemplada.
Definida com mais detalhe, a clonagem de regiões
2 0 variáveis da cadeia pesada e/ou leve de anticorpos por
hibridomas é padrão na técnica. Não há necessidade de que a seqüência da região variável de interesse sej a conhecida a fim de obter aquela região com o uso de técnicas convencionais de clonagem. Veja, por exemplo, Gilliland e cols., Tlssue Antigens 47(1): 1-20 (1996). Para preparar polipeptídeos de cadeia simples que compreendem uma região variável que reconhece um antígeno de leucócito murídeo ou humano, foi derivado um método para a clonagem e expressão rápidas que gerasse uma proteína funcional em até duas a
3 0 três semanas do isolamento de RNA de células de hibridoma. As regiões variáveis foram clonadas Poe poli-G tailing do cDNA de primeira fita, seguido por PCT de ancoragem com um iniciador de ancoragem poli-C a diante e um iniciador especifico reverso para a seqüência da região constante.
Ambos os iniciadores contêm sítios flanqueadores de endonuclease de restrição para inserção em pUC19. Foram gerados conjuntos de iniciadores de PCR para isolamento de genes de Vl e Vh murídeas, de hamster e de rato. Após determinação de seqüências de consenso para um par específico de Vl e VH/ os genes de Vl e Vh foram ligados por um DNA que codifica um ligante peptídico interveniente (tipicamente que codifica (Gly4Ser)3) e os cassetes do gene VL-ligante-VH foram transferidos no vetor de expressão mamífero pCDM8. As construções foram transfectadas em células COS e os sFvs foram recuperados do sobrenadante do meio de cultura condicionado. Esse método foi usado com sucesso para gerar sFv funcional para CD2, CD3, CD4, CD8, CD2 8, CD4 O, CD4 5 humanos e CD3 e gp3 9 murídeos, de hibridomas que produzem anticorpos murídeos, de rato ou hamster. Inicialmente, os sFvs foram expressos como proteínas de fusão com os domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgGl humana para facilitar a caracterização e purificação rápidas com o uso de reagentes anti-IgG humana de cabra ou proteína A. sFv ativo também podia ser expresso com um
2 5 pequeno peptídeo, por exemplo, um tag, ou em uma forma sem
tail. A expressão de formas sem taíl de CD3 (G19-4) sFv demonstrou atividade de sinalização celular aumentada e revelou que sFvs possuem potencial para receptores de ativação.
3 0 Alternativamente, a identificação da seqüência de aminoácidos primária dos domínios variáveis de anticorpos monoclonais pode ser obtida diretamente, por exemplo, por proteólise limitada do anticorpo, seguida por seqüenciamento do peptídeo do terminal N usando, por exemplo, o método de degradação de Edman ou por espectroscopia de massa por fragmentação. Métodos de seqüenciamento do terminal N são bem conhecidos na técnica. Após a determinação da seqüência de aminoácidos primária, os domínios variáveis, é montado um cDNA que codifica essa seqüência por métodos de síntese de ácido nucléico sintético {por exemplo, PCR), seguidos por geração de scFv. Os métodos necessários ou preferidos de manipulação de ácido nucléico são padronizados na técnica.
Fragmentos, derivados e análogos de anticorpos, como descrito acima, também são contemplados como domínios de ligação adequados. Além disso, qualquer uma das sub-regiões constantes descritas acima é contemplada, incluindo sub- regiões constantes que compreendem qualquer uma das regiões de dobradiça descritas acima. Adicionalmente, as moléculas multivalentes de cadeia simples de ligação descritas nesse exemplo podem incluir qualquer um ou todos os ligantees aqui descritos.
Os anticorpos monoclonais foram inicialmente expostos às células e depois entrecruzados com o uso de um anticorpo
2 5 de segunda-etapa anticamundongo de cabra {2a etapa) .
Opcionalmente, é possível entrecruzar os anticorpos, antes do contato das células com os anticorpos, por exemplo, por entrecruzamento dos anticorpos em solução. Como outra alternativa, os anticorpos monoclonais poderiam ser
3 0 entrecruzados em uma fase sólida por adsorção sobre o fundo plástico de poços de cultura de tecido, ou "capturados" nesse plástico por meio de anticorpo de cabra anticamundongo adsorvido ao plástico, seguido por ensaios baseados em placas para avaliar, por exemplo, a interrupção do crescimento ou a viabilidade celular.
A inversão de fosfatidilserina do lado citosólico da membrana celular para a superfície celular exterior daquela membrana plasmática é um indicador aceito de eventos pró- apoptõticos. A progressão até a apoptose leva à perda da integridade da membrana celular, o que pode ser detectado pela entrada de um corante de intercalação impermeável à célula, por exemplo, iodeto de propídio (PI) . Após exposição da célula aos anticorpos monoclonais, isoladamente ou em combinação, a dual, foi realizado um ensaio pró-apoptótico, e populações de células tratadas foram classificadas quanto à inclusão positiva na superfície celular de anexina V (ANN) e/ou PI.
Análise da ligação de Anexina V/internalização de iodeto de propídio
Células e condições de cultura de células. Foram feitos experimentos para examinar o efeito do entrecruzamento de dois anticorpos monoclonais diferentes contra alvos expressos em quatro linhagens de células B humanas. Os efeitos sobre as linhagens celulares foram medidos por determinação dos níveis de coloração com ANN e/ou PI após exposição. As linhagens de células B humanas BJAB, Ramos (ATCC # CRL-15 96) , Daudi (ATCC # CCL-213) e DHL-4 (DSMZ # ACC495) foram incubadas por 24 horas a 37°C em CO2 5% em meio completo com Iscoves (Gibco) FBS 10%. As células foram mantidas em uma densidade entre 2-8 χ IO5 células/ml, e uma viabilidade tipicamente >95%, antes do estudo.
Os experimentos foram feitos em uma densidade celular de 2 χ IO5 células/ml, e com 2 ^ig/ml de cada anticorpo monoclonal comparativo de uma matriz contra antigenos de célula B. Cada anticorpo monoclonal comparador foi adicionado a 2 ^ig/ml, isolada ou individualmente, quando combinado com cada anticorpo monoclonal da matriz, também a 2 ^ig/ml. A Tabela 6 lista o número de catálogo e as fontes de anticorpos monoclonais usados nesses experimentos. Para o entrecruzamento desses anticorpos monoclonais em solução, IgG anticamundongo de cabra (Jackson Labs N0 de catálogo 115-001-008) foi adicionada a cada poço em uma proporção de concentração de 2:1 (anticamundongo de cabra:cada anticorpo monoclonal) , por exemplo, um poço com apenas um anticorpo monoclonal a 2 μg/ml teria anticamundongo de cabra adicionado até uma concentração final de 4 ^ig/ml, enquanto poços com tanto com anticorpo monoclonal comparador (2 μg/ml) quanto um anticorpo monoclonal da matriz (2 μ^/ηιΐ) teriam 8 μg/ml de anticorpo anticamundongo de cabra adicionados ao poço.
Após 24 horas de incubação a 37°C em CO2 5%, as células foram coradas com Anexina V-FITC e iodeto de propídio usando o Kit de Detecção de Apoptose Anexina V- FITC I BD Pharmingen (#556547) . Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, e ressuspensas em "tampão de ligação" a 1 χ IO6 células/ml. Cem microlitros das células em tampão de ligação foram então corados com 5 μΐ de Anexina V-FITC e 5 μΐ de iodeto de propidio. As 3 0 células foram gentilmente misturadas e incubadas no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos. Quatrocentos microlitros de tampão de ligação foram então adicionados a cada amostra. As amostras foram então lidas em um FACsCalibur (Becton Dickinson) e analisadas com o uso do software CellQuest (Becton Dickinson).
Tabela β
Nome Número de catálogo Fornecedor comercial Anti-CDl9 #C22 6 9-74 US Biological (Swampscott, MA) Anti-CD2 0 #169-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD21 #170-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD22 #171-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD2 3 #172-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD3 O #179-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD3 7 #186-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD4 O #300-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD7O #222-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD72 #C242 8-4IBl US Biological (Swampscott, MA) Anti-CD7 9a #235-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD79b #301-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD8 0 #110-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD81 #302-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CD8 6 #307-820 Ancell Corp. (Bayport, MN) Anti-CL II DR, DQi DP #131-820 Ancell Corp. (Bayport, MN)
Tabela 6. Anticorpos contra antigenos de célula B usados nesse estudo e suas fontes.
A adição do anticorpo de entrecruzamento (por exemplo, anticorpo anticamundongo de cabra) ao anticorpo monoclonal A isoladamente resultou em sensibilidade celular aumentada, sugerindo que uma molécula de ligação multivalente, ou scorpion, construída com dois domínios de ligação que reconhecem o mesmo antígeno seria eficaz no aumento da sensibilidade celular. Sem se prender a uma teoria, essa sensibilidade aumentada poderia ser causada por agrupamento de antígeno e sinalização alterada. Os membros da família dos receptores de TNF, por exemplo, necessitam da homo- multimerização para a transdução de sinal, e scorpions com domínios de ligação equivalentes em cada extremidade da molécula poderiam facilitar essa interação. 0 agrupamento e subseqüente sinalização por CD4 0 é um exemplo desse fenômeno no sistema de células B. Como mostrado nas Figuras 20, 21 e 22, a adição do
anticorpo monoclonal A e anticorpo monoclonal B contra diferentes antígenos produzirá efeitos pró-apoptóticos aditivos ou, em algumas combinações, mais do que aditivos (ou seja, sinérgicos) sobre as células tratadas. Na Figura 20, por exemplo, a combinação de anti-CD20 com anticorpos monoclonais contra outros antígenos de célula B resultou, em graus variáveis, em sensibilidade celular aumentada. Algumas combinações, por exemplo, anti-CD20 combinado com anti-CD19 ou anti-CD20 combinado com anti-CD21, no entanto, produziram efeitos pró-apoptóticos mais do que aditivos, indicando que as moléculas de ligação multivalentes ou scorpions compostos por esses domínios de ligação devem ser particularmente eficazes na eliminação de células B transformadas. Em relação à Figura 20, a percentagem de 3 0 células que exibem atividades pró-apoptóticas quando expostas ao anticorpo anti-CD 20 isoladamente é de cerca de 33% (barra com listras verticais que correspondem a "2 0" , ou seja, o anticorpo anti-CD20); a percentagem de células pró-apoptóticas mediante exposição ao anticorpo anti-CD19 é de cerca de 12% (barra com listras verticais na Fig. 20 que corresponde a "19" , ou seja, o anticorpo anti-CD19); e a percentagem de células pró-apoptóticas mediante exposição a ambos os anticorpos, anti-CD20 e anti-CD19, é de cerca de 73 % (barra com listras horizontais na Fig. 20 que corresponde a "19"). Os 73% de células pró-apoptóticas após exposição a ambos anticorpos são significativamente maiores do que os 45% (33% + 12%) referentes à soma dos efeitos atribuíveis a cada anticorpo individual, indicando um efeito sinérgico atribuível ao par de anticorpos anti~CD19 e anti-CD 20. As moléculas de ligação muitivalentes úteis incluem moléculas nas quais os dois domínios de ligação levam a um efeito aditivo sobre o comportamento de células B, bem como as moléculas de ligação multivalentes nas quais os dois domínios de ligação levam a efeitos sinérgicos sobre o comportamento de células B. Em algumas modalidades, um domínio de ligação não terá efeitos detectãveis sobre o parâmetro medido do comportamento de célula, com cada um dos domínios de ligação pareados contribuindo para aspectos distintos das atividades da molécula de ligação multivalente, por exemplo, uma molécula de ligação muitivalente e muitiespecífica (por exemplo, domínio de ligação A se liga a uma célula-alvo e promove apoptose, enquanto o domínio de ligação B se liga a uma substância terapêutica solúvel, por exemplo, uma citotoxina). Dependendo do design de uma molécula de ligação multivalente, a questão relacionada ao tipo de efeito combinado (aditivo, sinérgico ou inibidor) dos dois domínios de ligação sobre uma célula-alvo pode não ser relevante, pois um dos domínios de ligação é específico para um parceiro de ligação não celular (por exemplo, solúvel) ou é específico para um parceiro de ligação associado a uma célula, mas em um tipo de célula diferente.
Pareamentos exemplares de domínios de ligação que produzem efeitos aditivos, sinérgicos ou inibidores, como mostrado nas Figuras 20-23, ficam evidentes a partir das Tabelas 7 e 8.
A Tabela 7 fornece dados quantitativos extraídos de cada uma das Figuras 20-23 em termos da percentagem de células que coram positivas para ANN e/ou PI. A Tabela 8 fornece cálculos que utilizam os dados da Tabela 7 que fornecem uma base para determinar se a interação de certo par de anticorpos gerou um efeito aditivo, sinérgico ou inibidor, novamente, como avaliado pela percentagem de células que coram positivas para ANN e/ou PI.
Tabela 7
Name Anti-CD2 0 Anti-CD7 9b Anti-CL II Anti-CD22 Anti-CDl9 13/73* 18/76/66 14/47/46 12/11 Anti-CD2 0 3 3/NA 42/94/92 33/71/76 28/33 Anti-CD21 14/75 22/50/76 18/24/40 11/11 Anti-CD22 8/55 12/39/33 12/19/17 10/12 Anti-CD2 3 8/41 12/63/55 14/22/17 10/12 Anti-CD3 0 8/38 14/72/61 12/56/61 10/11 Anti-CD3 7 15/45 19/92/86 20/60/62 19/20 Anti-CD4 0 10/48 12/44/30 13/21/28 14/13 Anti-CD7 0 9/40 12/56/39 15/21/15 10/10 Anti-CD72 ND 16/60/64 30/78/63 17/17 Anti-CD79a 21/66 43/42/50 28/55/51 14/14 Anti-CD7 9b 46/88 70/70/68 45/80/76 26/16 Anti-CD8 0 7/41 14/35/30 15/19/17 11/11 Anti-CD81 14/65 25/86/83 25/54/43 19/20 Anti-CD8 6 7/38 16/58/42 15/24/18 14/11 Anti-CL II 53/77 52/96/98 47/52/43 72/57
Nas colunas 2-4 da Tabela 7, os valores numéricos refletem as alturas das barras do histograma nas Figuras 20-22, respectivamente, com o primeiro número em cada célula representando a altura de uma barra com listras verticais, o segundo número representando a altura de uma barra com listras horizontais e, quando presente, o terceiro número refletindo a altura de uma barra pontilhada. Na coluna 5, o primeiro número reflete a altura de uma barra sólida, e o segundo número reflete a altura de uma barra com listras inclinadas na Figura 23.
Tabela 8
Nome Anti-CD20 Anti-CD7 9b Anti-CL II Anti-CD2 2 Anti-CDl9 S: 13+3 3=4 6 * A: 18+56-74 A: 18+43=61 S: 14+26=40 S: 14+18=32 I: 12+10=22 Anti-CD2 0 ND A: 42+56=98 A: 42+43=85 S: 33+26=59 S: 33+18=51 A/I:28+10=38 Anti-CD21 S: 14+33=47 I: 2 2+5 6=78 S: 22+43=65 I: 18+26=44 A: 18+18=36 I: 11+10=21 Anti-CD22 S: 8+33=41 I: 12+56=68 I: 12+43=55 I: 12+26=38 I: 12+18=30 ND Anti-CD23 A: 8+33=41 A: 12+56=68 A: 12+43=55 I: 14+26=40 I: 14+18=32 I: 10+10=20 Anti-CD3 0 A: 8+33=41 A: 14+56=70 S: 12+26=38 I:10+10=20 Nome Anti-CD20 Anti-CD7 9b Anti-CL II Anti-CD22 A: 14+43=57 S: 12 + 18=3 0 Anti-CD3 7 A: 15+33=48 S: 19+56=75 S: 19+43=62 S: 20+26=46 S: 20+18=38 I: 19+10=29 Anti-CD4 0 A/S:10 + 33=43 I: 12+56=68 I: 12+43=55 I: 13+26=39 A: 13+18=31 I: 14+10=24 Anti-CD7 0 A: 9+33=42 I: 12+56=68 I: 12+43=55 I: 15+26=41 I: 15+18=33 I: 10+10=20 Anti-CD72 ND I: 16+56=72 A: 16+43=59 S: 30+26=56 S: 30+18=48 I: 17+10=27 Anti-CD79a S: 21+33=54 I: 43+56=99 I: 43+43=86 A: 28+26=54 A: 28+18=46 I: 14+10=24 Anti-CD79b S: 46+33=79 ND S: 45+26=71 S: 45+18=63 I: 26+10=36 Anti-CD8 0 A: 7+33=40 I: 14+56=70 I: 14+43=57 I: 15+26=41 I: 15+18=33 I: 11+10=21 Anti-CD81 S: 14+33=47 A: 25+56=81 S: 25+43=68 A: 25+26=51 A: 25+18=43 I: 19+10=29 Anti-CD86 A: 7+33=40 I: 16+56=72 I: 16+43=59 I: 15+26=41 I: 15+18=33 I: 14+11=25 Anti-CL II I: 53+33 = 86 A: 52+56 = 108 A: 52+43=95 ND I: 72+10=82
"A" significa que um efeito "aditivo" foi observado "S" significa que um efeito "sinérgico" foi observado "I" significa que um efeito "inibidor" foi observado
* Equação esquemática: A+B=C, em que "A" é o percentual de células positivas para ANN e/ou PI em função do anticorpo da matriz isoladamente, "B" é o percentual de células positivas para AJSTN e/ou PI em função do anticorpo comum (anti-CD20 para a Fig. 20, anti-CD79b para a Fig. 21, anti- CLII para a Fig. 22 e anti-CD22 para a Fig. 23), e "C" é o efeito aditivo esperado (veja a Tabela 7, acima, para os dados quantitativos que correspondem às Figuras 20-23). Quando duas equações estiverem presentes em uma célula, a equação superior reflete os resultados do uso da maior concentração indicada de anticorpo comum; a equação inferior reflete uso da menor concentração indicada de anticorpo comum.
Em algumas modalidades, os dois domínios de ligação interagem de uma forma inibidora, aditiva ou sinérgica na sensibilização (ou dessensibilização) de uma célula-alvo como, por exemplo, uma célula B. a Figura 23 mostra os efeitos protetores, ou inibidores, resultantes da combinação do anticorpo anti-CD22 com anticorpos monoclonais fortemente pró-apoptóticos como, por exemplo, o anticorpo anti-CD79b ou anticorpo anti-classe II do MHC (ou seja, anti-CL II) . Por exemplo, a Figura 23 e a Tabela 7 mostram que o anticorpo anti-CD2 2 isoladamente não induz mais do que cerca de 10% de células exibam comportamento pró-apoptótico (barra sólida que corresponde a "22" na Fig. 23) e anti-CD7 9b induz cerca de 26% de células pró- apoptóticas (barra sólida que corresponde a "CD79b" na Fig. 23). Em combinação, no entanto, ant i-CD2 2 e ant i-CD7 9b induzem apenas cerca de 16% de células pró-apoptóticas (barra com listras inclinadas que corresponde a "7 9b" na Fig. 23). Dessa forma, os anticorpos combinados induzem 16% de células pró-apoptóticas, o que é menos do que 38% da soma dos efeitos individuais atribuíveis ao anti-CD22 (12%) e anti-CD79b (26%). Com a utilização dessa abordagem, uma inspeção da Figura 23 e/ou das Tabelas 7-8 revela que o anticorpo anti-CD22 e, por extensão, uma molécula de ligação multivalente e multiespecífica que compreende um domínio de ligação anti-CD22, quando usada em combinação separada com cada um dos seguintes anticorpos (ou domínios de ligação correspondentes): anti-CD19, anti-CD20, anti- CD21, anti-CD2 3, anti-CD30, anti-CD37, anti-CD40, anti- CD70 , anti-CD72, anti-CD7 9a, anti-CD79b, anti-CD80, anti- CD81, anti-CD8 6 e anticorpos/domínios de ligação anti- classe II do MHC, produzirão um efeito global inibido.
Sem se prender a uma teoria, os dados podem ser interpretados como uma indicação de que o anticorpo anti- CD22, ou uma molécula de ligação multivalente e multiespecífica que compreende um domínio de ligação anti- CD 22, protegerá contra, ou atenuará um efeito de, qualquer um dos anticorpos listados imediatamente acima. De forma mais geral, uma molécula de ligação multivalente e multiespecífica que compreende um domínio de ligação anti- CD22 inibirá o efeito que surge da interação com qualquer um de CDl9, CD20, CD21, CD23, CD30, CD37, CD40, CD70, CD72, CD7 9a, CD7 9b, CD8 0, CD81, CD8 6, e moléculas de MHC da classe II. Pode ser observado na Figura 23 e na Tabela 8 que o anticorpo anti-CD22 e, por extensão, um domínio de ligação que compreende um domínio de ligação anti-CD22, funcionará como um inibidor ou atenuador da atividade de qualquer anticorpo/domínio de ligação que reconheça um marcador da superfície de células B como, por exemplo, um antígeno CD. Espera-se que moléculas de ligação multivalentes, incluindo moléculas de ligação multivalentes e multiespecíficas, sej am úteis no refinamento de regimes de tratamento para diversas doenças nas quais a atividade de um domínio de ligação precisa ser atenuada ou controlada.
Al ém do efeito inibidor, aditivo ou sinérgico combinado de dois domínios de ligação que interagem com uma célula-alvo, tipicamente por meio da ligação de ligantes da superfície da célula, os resultados experimentais aqui revelados estabelecem que certo par de domínios de ligação pode fornecer um tipo diferente de efeito combinado, dependendo das concentrações relativas dos dois domínios de ligação aumentando, dessa forma, a versatilidade da invenção. Por exemplo, a Tabela 8 revela que anti-CD21 e anti-CD7 9b interagem de uma forma inibidora na maior concentração testada de anti-CD7 9b, mas esses dois anticorpos interagem de forma sinérgica na menor concentração testada de anti-CD7 9b. Embora algumas modalidades utilizarão um único tipo de molécula de ligação multivalente, ou seja, uma molécula de ligação multivalente monoespecífica que compreende, por exemplo, um único domínio de ligação de CD21 e um único domínio de ligação de CD7 9b, a invenção compreende misturas de moléculas de ligação multivalentes que permitirão ajustes das concentrações relativas de domínio de ligação para se obter um efeito desejado como, por exemplo, um efeito inibidor, aditivo ou sinérgico. Além disso, os métodos da invenção englobam o uso de uma única molécula de ligação multivalente em combinação com outra molécula de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo convencional, para ajustar ou otimizar as concentrações relativas de domínios de 1 igaçao. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de determinar concentrações relativas úteis de domínios de ligação com a utilização de técnicas padronizadas (por exemplo, por projeto de matrizes experimentais de duas séries de diluição, uma para cada domínio de ligação).
Sem se prender a uma teoria, reconhece-se que a ligação de um ligante pode induzir ou modular a aparência da superfície de um segundo ligante no mesmo tipo de célula, ou ela pode alterar o contexto da superfície do segundo ligante, de modo a alterar sua sensibilidade à ligação por uma molécula de ligação específica, por exemplo, um anticorpo ou uma molécula de ligação multivalente.
Embora tenham sido aqui exemplificados com o uso de linhagens e antígenos de células B, esses métodos podem determinar otimamente moléculas de ligação multivalentes (ou seja, scorpions) que sejam aplicáveis a outros quadros de doença e populações de célula-alvo, incluindo outras células normais, seus equivalentes celulares aberrantes, incluindo células hematopoiéticas estimuladas cronicamente, células de carcinoma e células infectadas.
Outros fenótipos de sinalização, por exemplo, mobilização de Ca2+; tirosina fosfo-regulação; ativação de caspase; ativação de NF-κΒ; citocina, elaboração de fator de crescimento ou quimiocina; ou expressão gênica (por exemplo, em sistemas repórteres) também podem ser usados em métodos de rastreamento quanto aos efeitos diretos de combinações anticorpo monoclonal.
Como alternativa ao uso de um anticorpo secundário para entrecruzar os anticorpos primários e mimetizar a
estrutura da molécula de ligação multivalente
ou scorpion,
outras moléculas que se ligam à porção Fc de anticorpos, incluindo receptores Fc solúveis, proteína A, componentes do complemento, incluindo Clq, lectina de ligação de manose, glóbulos ou matrizes contendo agentes reativos ou de entrecruzamento, agentes químicos bifuncionais de entrecruzamento e adsorção ao plástico, poderiam ser usadas para entrecruzar múltiplos anticorpos monoclonais contra o mesmo antígeno ou contra antígenos diferentes.
Exemplo 12
Proteína de ligação multivalente com função efetora ou
scorpion, estruturas
A estrutura esquemática geral de um polipeptídeo scorpion é H2N-domínio de ligação 1-Iigante scorpion-sub- região constante-domínio de ligação 2. Scorpions também podem ter uma região de dobradiça-Iike, tipicamente uma região do peptídeo derivada de uma dobradiça de anticorpo, disposta no terminal N em relação ao domínio de ligação 1. Em algumas modalidades de scorpion, o domínio de ligação 1 e o domínio de ligação 2 são derivados de um domínio de ligação de imunoglobulina, por exemplo, derivados de uma Vl e uma Vh . A Vl e a Vh são tipicamente unidas por um ligante. Foram eitos experimentos para demonstrar que polipeptídeos scorpion podem ter domínios de ligação que diferem de um domínio de ligação de imunoglobulina, incluindo um domínio de ligação de Ig do qual o domínio de ligação scorpion foi derivado, por diferenças de seqüências de aminoácidos que resultam em uma divergência de seqüências de tipicamente menos do que 5% e, de preferência, menos do que 1%, em relação ao domínio de ligação de Ig-fonte.
Freqüentemente, as diferenças de seqüências resultam em mudanças de aminoãcidos únicas com, por exemplo, substituições. Uma localização preferida para estas mudanças de aminoácidos é em uma ou mais regiões de um domínio de ligação scorpion que correspondem, ou exibem pelo menos 80% e, de preferência, 85% ou 90%, de identidade de seqüência para uma região determinante de complementaridade (CDR) de Ig de um domínio de ligação de Ig do qual o domínio de ligação scorpion foi derivado. Mais orientações são fornecidas por comparação de modelos de peptídeos que se ligam ao mesmo alvo, por exemplo, CD2 0. Com relação ao CD20, o mapeamento de epitopos revelou que o anticorpo 2H7, que se liga ao CD2 0, reconhece o motivo Ala- Asn-Pro-Ser (ANPS) de CD20, e espera-se que scorpions de ligação de CD2 0 também reconhecerão esse motivo. Prevê-se que alterações na seqüência de aminoácidos que fazem com que o motivo ANPS seja profundamente embutido em uma bolsa formada de regiões do domínio de ligação scorpion que correspondem às CDRs de Ig sejam ligantes funcionais de CD20. Estudos de modelagem também revelaram que regiões do scorpion que correspondem à CDR3 (Vl) , CDR1-3 (Vh) entram em contato com CD20, e espera-se que alterações que mantêm ou facilitam esses contatos gerem scorpions que se ligam ao CD2 0 .
Além de facilitar a interação de um scorpion com seu alvo, são contempladas alterações nas seqüências de domínios de ligação scorpion (em relação às seqüências cognatas do domínio de ligação de Ig) que promovem a interação entre regiões do domínio de ligação scorpion que correspondem aos domínios Vl e Vh de Ig. Por exemplo, em uma região do scorpion de ligação de CD2 0 que corresponde à VL, a seqüência SYIV pode ser alterada por substituição de um aminoãcido para Val (V33), por exemplo, His, resultando na seqüência SYIH. Espera-se que essa alteração acentue a interação entre regiões do scorpion que correspondem aos domínios Vl e Vh. Além disso, espera-se que a adição de um resíduo no terminal N de uma região do scorpion que corresponde à VH-CDR3 irá alterar a orientação daquela região do scorpion, afetando provavelmente suas características de ligação, porque a Ser do terminal N de Vh-CDR3 faz contato com CD20. Ensaios de rotina revelarão aquelas orientações que produzem alterações desejáveis nas características de ligação. Contempla-se também que mutações em regiões do scorpion que correspondem à VH-CDR2 e/ou Vh-CDR3 criarão novos contatos potenciais com um alvo, por exemplo, CD20. Por exemplo, com base nos estudos de modelagem, espera-se que substituições de Y105 e W106 (encontrados na seqüência NSYW) em uma região que corresponde à VH-CDR3 alterarão as características de ligação de um scorpion de uma forma que possa ser usado um ensaio de rotina para a identificação de scorpions com características de ligação modificadas. Como exemplo adicional, espera-se que uma alteração na seqüência de um domínio de ligação scorpion que corresponde a uma VL-CDR3 de Ig, por exemplo, o Trp (W) na seqüência CQQW, irá afetar a ligação. Tipicamente, alterações em uma região do scorpion que corresponde a uma CDR de Ig serão rastreadas por aqueles scorpions que exibem um aumento da afinidade pelo alvo.
Com base na estrutura-modelo do domínio de ligação de scFv de CD20 humanizado 20-4, nas informações publicadas em relação à estrutura da alça extrace lular de CD2 0 (Du, e cols.f J. Biol. Chem. 282(20): 15.073-80 (2007)) e no epitopo de ligação de CD2 0 reconhecido pelo anticorpo 2H7 de camundongo (que foi a fonte de CDRs para o domínio de ligação de scFv humanizado 20-4), foram projetadas mutações nas regiões CDR do scorpion 2Lm20-4x2Lm20-4 com o objetivo de aumentar a afinidade de sua ligação ao CD20. Primeiro, as mutações foram projetadas para influenciar a conformação da CDR de 20-4 e promover a ligação mais eficiente à alça extracelular de CD2 0. Segundo, as alterações introduzidas foram proj etadas para fornecer novas interações intermoleculares entre o scorpion 2Lm2 0-4x2Lm20-4 e seu alvo. Essas mutações incluem: Vl CDRl V33H. ou seja, uma substituição de His para Val na posição 33 da CDRl na região VL), VL CDR3 W90Y, VH CDR2 D57E, VH CDR3 inserção de V após o resíduo S99, VH CDR3 Y101K, VH CDR3 N103G, VH CDR3 N104G e VH CDR3 Y105D. Em função dos efeitos sinérgicos esperados da combinação de algumas dessas mutações, foram projetados 11 mutantes, que combinam diferentes mutações, como mostrado na Tabela 9 (resíduos introduzidos por 2 0 mutação estão em negrito e sublinhados).
Tabela 9
VlCDRI Vl CDR3 Vh CDR2 Vh CD R3 R ASSS VS VIH QQWSFN PPT AIY PCiNOOTS Y NQK FKG SVYYSN YWYFDL RASSSVSY1II QQWSFN PPT AIY PC INCiDTS YNQ KF KC1 SVYY G GY W Y FDL RASSSV SYIH QQ W SFN PPT AlYPGNGDTSYNQKFKCi SYYSNSDWYFDL RASSSVSYIH QQWS FNPPT AIYPGNCiDTSYNQKFKCi SYYSGGDWYFDL RASSSVSYfV QQWSFNiPPT A l YPGNGDTSYNQ K FKG SY KSNSY WY PDL RASSS VSYIV QQWSPN PPT AIYPGNGETSYNQKFKG S Y YS N S Y W Y F D L RASSSVSYIV QQ YSFNPPT AIYPGNGDTSYNQKFKG SYYSNSYWYFDL Foram introduzidas mutações nos domínios de ligação do scorpion CD20xCD20 (2Lm20-4x2Lm20-4) por mutagênese por PCR usando os iniciadores que codificam a região da seqüência alterada. Após confirmação da seqüência, fragmentos de DNA que codificam os fragmentos scFv de 2Lm2 0-4 com mutações correspondentes foram clonados em um vetor de expressão convencional contendo uma região codificadora para a sub- região constante de um scorpion, resultando em um polinucleotídeo contendo a seqüência de DNA completa de novas versões do scorpion 2Lm20-4x2Lm20-4. As variantes do scorpion 2Lm20-4x2Lm2 0-4 com mutações de CDR foram produzidas por expressão em um sistema transitório de células COS e purificadas por meio de cromatograf ia com Proteína A e exclusão de tamanho (SEC). As propriedades de ligação das variantes do scorpion 2Lm20-4x2Lm20~4 foram avaliadas por análise FACS com o uso de células B primárias e as linhagem de células B de linfoma WIL2-S.
Também foram gerados outros mutantes usando uma abordagem similar para otimizar domínios de ligação de CD20. O SMIP de CD20 designado TRU015 serviu como substrato para a geração de mutantes e, a menos que observado de forma diferente, todos os domínios eram domínios humanos. Verificou-se que os seguintes mutantes contêm domínios de ligação de CD20 úteis e funcionais. A molécula 018008 continha uma substituição de Q (código de aminoãcidos com uma letra) para S na posição 27 da CDRl em VL, uma substituição de S para T na posição 28 na CDRl de VH e uma substituição de L para V na posição 102 na CDR3 de VH. As seguintes seqüências parciais do ligante scorpion, que correspondem â seqüência CCCP em um dobradiça de IgGl, foram combinadas separadamente com as VL e VH mutadas: CSCS, SCCS e SCCP, consistentes com o design modular de scorpions. A molécula 018009 continha uma substituição de Q para S na posição 27 de CDRl de VL, uma substituição de S para T na posição 28 de CDRl de VH e substituições de S para V na posição 96, L para V na posição 102 e eliminação do V na posição 95, todas em CDR3 de VH. As mesma subseqüências do ligante scorpion descritas acima como sendo encontradas nos ligantees scorpion usados em 018008 foram usadas em 018009. A molécula 018010 continha substituições de um Q para S na posição 27, um I para M na posição 33 e um V para H na posição 34, todas em CDRl de VL, juntamente com uma substituição S para T na posição 28 de CDRl de VH e uma substituição de L para V na posição 102 na CDR3 de VH. Os ligantees scorpion definidos pelas subseqüências CSCS e SCCS foram usados com 018010. 018011 continha as mesmas mutações na CDRl de VL e na CDRl de VH descritas para 018010, juntamente com a eliminação de V na posição 95, substituição de S para V na posição 96 e substituição de L para V na posição 102, todas em CDR3 de VH. Os ligantees scorpion definidos pelas subseqüências CSCS, SCCS e SCCP foram usados em moléculas 018011. A VL de 018 014 era uma VL de camundongo não mutada, com uma VH humana contendo a alteração de S para T em 2 8 na CDRli e alteração de L para V em 102 na CDR3. 018015 também continha uma VL de camundongo não mutada, juntamente com uma VH humana contendo uma alteração de S para T em 2 8 de CDRl e, na CDR 3 , uma eliminação de V em 95, substituição de S para V em 96, e substituição de L para V em 102. A molécula 2Lm5 tinha uma alteração de Q para S em 27 na CDRl de VL, um F para Y em 2 7 e uma S para T em 3 0, ambas na CDRl de VH, além da eliminação do V em 95, S para V em 96 e L para V em 102, todas em CDR3 de VH. Os ligantees scorpion definidos pelas subseqüências CSCS, SCCS e SCCP foram usados separadamente em cada uma de 018014 e 018015. 2Lm5-l era igual ao 2Lm5, exceto que 2Lm5-l não tinha mutações na CDRl de VH, e somente um ligante scorpion definido pela subseqüência CSSS foi usado. 2Lm6-l tinha as mutações de 2Lm5 e uma substituição de T para S em 92 e S para F em 93 na CDR3 de VL, e somente o ligante scorpion definido pela subseqüência CSSS foi usado. As únicas mutações em 2Lml6 foram as mutações na CDR3 de VH listadas acima para 2Lm5-l. Os ligantees scorpion definidos pelas subseqüências CSCS, SCCS e SCCP foram usados separadamente em 2Lml6. 2Lml6-l substituiu Q para S em 27 na CDRl de VL e substituiu T para S em 92, e S para F em 93, ambas na CDR3 de VL e, na CDR3 de VH, eliminou V em 95, substituiu S para V em 96 e substituiu L para V em 10 2 / somente o ligante scorpion definido pela subseqüência CSSS foi usado. 2Lml9-3 substituiu Q para S em 27, I para M em 33 e V para H em 34, todas em CDRl de VL, juntamente com as mutações na CDR3 de VH listadas para 2Lml6-l. Os ligantees scorpion definidos pelas subseqüências CSCS, SCCS e SCCP foram usados separadamente em 2Lml9-3. A molécula 2Lm20-4 continha uma substituição de I para M em 33 e um V para H em 34, ambas na CDRl de VL, juntamente com as mutações na CDR3 de VH listadas para 2Lml6-l. Para 2Lm5-l, 2Lm6-l, 2Lml6, 2Lml6-l, 2Lml9-3 e 2Lm20-4, também houve uma substituição de S para L na posição 11 na região estrutural de VH. Os ligantees scorpion definidos pelas subseqüências CSCS, SCCS e SCCP foram usados separadamente em 2Lm20-4. Finalmente, a substituição de S para P na posição 331 estava presente nos seguintes mutantes: 018008 com o ligante scorpion definido por CSCS, 018009 com cada um dos ligantees scorpion definido por CSCS e SCCP, 018 010 com o ligante scorpion definido por CSCS, 018011 com o ligante scorpion definido por SCCP, 018014 com o ligante scorpion definido por CSCS, 018 015 com o ligante scorpion definido por CSCS, 2Lml6 com ligantees scorpion definidos por qualquer um de CSCS, SCCS e SCCP; 2Lml9-3 com um ligante scorpion definido por CSCS ou SCCP e 2Lm2 0-4 com um ligante scorpion definido por CSCS ou SCCP.
Além disso, são contempladas alterações no comprimento de um ligante que unem duas regiões de um domínio de ligação, por exemplo, as regiões de um domínio de ligação scorpion que correspondem a uma VL e VH de Ig. Por exemplo, espera-se que a remoção de um Asp do terminal C em ligantees interdomínios nos quais é encontrado afete as características de ligação de um scorpion, já que é uma substituição de Gly para Asp.
Também são contemplados scorpions que possuem um ligante scorpion {interposto no terminal C em relação à sub-região constante e no terminal N em relação ao domínio de 1 igação 2) que sej a alongado em relação a uma região de dobradiça de uma Ig, com resíduos de aminoãcidos sendo adicionados no terminal C em relação a qualquer cisteína no scorpion que corresponda a uma cisteína da dobradiça de Ig, com a cisteína do scorpion sendo capaz de formar uma ligação dissulfeto intercadeias. Foram construídos e são caracterizados abaixo scorpions que contêm essas características.
Foram feitos esforços para aumentar a expressão, a estabilidade e a potência terapêutica de scorpions por meio da otimização do ligante scorpion que une covalentemente uma sub-região constante e o domínio de ligação 2 disposto no terminal C. 0 scorpion prototípico usado para estudos de otimização continha um scFV anti-CD20 (domínio de ligação 1) fundido no terminal N em relação à sub-região constante derivada da CH2 e CH3 de IgGl, com um segundo scFv anti-CD20 fundido no terminal C em relação àquela sub-região constante. Espera-se que esse scorpion, como moléculas de imunoglobulina, se associe por meio da região constante (ou sub-região) para formar um complexo homodimérico com cadeias peptídicas ligadas por ligações dissulfeto. Para obter alto nível de expressão de uma molécula tetravalente estável com alta afinidade por seu alvo CD2 0, o ligante scorpion entre a sub-região constante e o segundo domínio de ligação deve obedecer as seguintes considerações. Primeiro, o impedimento estérico entre os domínios de ligação homólogos carregado pelos dois fragmentos scFv (um fragmento scFv em cada um dos dois monômeros de scorpion) deve ser minimizado para facilitar a manutenção das conformações nativas de cada domínio de ligação. Segundo, as configurações e orientações dos domínios de ligação devem permitir a associação produtiva de domínios e alta afinidade ligação de cada domínio de ligação ao seu alvo. Terceiro, o próprio ligante scorpion deve ser relativamente resistente à protease e não imunogênico.
Na construção de scorpion CD20xCD20 exemplar S0129, o terminal C de CH3 e o segundo domínio de scFV anti-CD2 0 estavam ligados pelo ligante scorpion 2H7, um peptídeo derivado de, e que corresponde a, um fragmento de uma seqüência natural de dobradiça de IgGl humana. 0 ligante scorpion 2H7 serviu como base para os esforços com o uso de modelagem por computador destinados a aumentar a expressão de scorpions e aprimorar as características de ligação das moléculas expressas.
Para analisar o ligante scorpion 2H7, a estrutura tridimensional de uma forma dimérica da dobradiça de IgGl humana foi modelada usando o software Insight II. A estrutura cristal de scFV anti-CD20 na orientação Vh-Vl foi escolhida como uma estrutura de referência para os domínios de ligação 2 0-4 (código de entrada no banco de dados de proteínas RCSB: 1A14). Na IgGl intacta, a dobradiça conecta o terminal C do domínio CHi ao terminal N do domínio CH2, com a configuração de cada domínio sendo tal que resíduos de cisteína da dobradiça possam parear para formar um homodímero. Na molécula scorpion exemplar, o ligante 2H7 derivado da dobradiça conectava a extremidade do terminal C do domínio scorpion derivado do domínio CH3 de IgGl à extremidade do terminal N daquela porção do domínio de ligação scorpion 2 derivado de um domínio VH2 de IgGl. Usando a estrutura tridimensional modelada do scFV Vh-Vl, as expectativas da distância ótima entre as extremidades do terminal C dos ligantees 2H7 foram influenciadas por três considerações. Primeiro, a estabilidade da dobradiça deve ser mantida, e a estabilidade é ajudada pela dimerização, por exemplo, homodimerização, o que significa que as cisteínas da dobradiça devem ser capazes de parear na presença dos dois domínios de ligação dobrados. Segundo, dois domínios de ligação, por exemplo, scFVs, devem acomodar os terminais C do ligante 2H7, sem interferência estérica a fim de permitir a dobragem correta da proteína. Terceiro, as CDRs de cada domínio de ligação devem ser estar voltadas na mesma direção, como em um anticorpo nativo, pois cada domínio de ligação do scorpion prototípico pode se ligar a receptores adjacentes (CD20) na mesma superfície celular. À luz dessas considerações, espera-se que a distância entre as duas extremidades do terminal N de scFvs seja de aproximadamente 2 8 Á. Espera-se que a distância entre as extremidades do terminal C dos ligantees 2H7 projetados teoricamente em formas diméricas de scorpion sej a de cerca de 16 Â. Para acomodar as distâncias esperadas necessárias às otimização do desempenho de um scorpion, o terminal C do ligante 2H7 foi estendido em pelo menos 3 aminoácidos. Espera-se que tal extensão permita a formação de ligações dissulfeto entre resíduos de cisteína do ligante 2H7, para permitir a dobragem correta do domínio de ligação 2 do terminal C, e para facilitar uma orientação correta das CDRs. Além disso, na IgGl intacta, em função da presença dos domínios CHi e VLi entre a dobradiça e domínios de ligação, a distância entre os domínios de ligação carregada pelas duas cadeias é ainda aumentada, e espera-se que isso favoreça ainda mais o entrecruzamento de receptores adjacentes na mesma superfície celular. Em função das considerações descritas acima, foi projetado um conjunto de ligantees com comprimentos diferentes (Tabela 10). Para minimizar a imunogenicidade, foram usados resíduos naturais presentes na extremidade do terminal N do domínio CH2 (Ala-Pro-Glu- Leu ou APEL) para alongar o ligante scorpion 2H7 por adição de seqüência ao terminal C do ligante scorpion. As construções mais longas continham uma ou múltiplas unidades do ligante (Gly4Ser) conhecido por ser resistente à protease e flexível. As construções de scorpion CD2 0xCD2 0 contendo
ligantees scorpion estendidos entre o domínio CH3 da sub- região constante e o domínio de ligação de scFv do terminal C foram construídas com o uso de mutagênese por PCR, e subclonadas em um vetor de expressão mamífera convencional. 2 0 O efeito do comprimento do ligante sobre a expressão do scorpion CD2 0xCD2 0 poderia ser analisada comparando-se o rendimento da proteína secretada em experimentos de expressão transitória com a utilização de células COS ou HEK293, ou por análise da síntese e acúmulo de proteína nas células por análises Western blot ou por estudos pulse- chase com metionina/cisteína marcada com [35]S.
Tabela 10
N° da Seq. Seqüência da extensão Seqtiênc ia estendida do Const. central vinculador scorpion do vinc. Scorpion (2H7) 10
Scorpions glicosilados também são contemplados e, nesse contexto, contempla-se que células hospedeiras que expressem um scorpíon possam se cultivadas na presença de um modificador de carboidrato, que é aqui definido como um composto orgânico pequeno, preferivelmente de peso molecular menor do que 1.000 dáltons, que inibe a atividade de uma enzima envolvida na adição, remoção ou modificação de açúcares que são parte de um carboidrato anexado a um polipeptídeo, como ocorre durante a maturação de carboidrato ligada ao N de uma proteína. A glicosilação é um processo complexo que ocorre no retículo endoplasmãtico ("glicosilação central") e nos corpos de Golgi ("glicosilação terminal"). Diversos inibidores de glicosidase e/ou manosidase fornecem um ou mais dos efeitos desejados de aumento da atividade ADCC, aumento da ligação de receptor Fc e alteração do padrão de glicosilação. Inibidores exemplares incluem, sem limitação,
castanospermina e kifunensina. Os efeitos da expressão de scorpions na presença de pelo menos um desses inibidores serão revelados no exemplo seguinte.
Exemplo 13
Níveis de expressão e caracterização da proteína scorpion
Os níveis de expressão da proteína scorpion foram determinados e as proteínas expressas foram caracterizadas para demonstrar que o design da proteína leva a produtos que possuem benefícios práticos. Um scorpion monoespecífico CD20xCD20 e um scorpion biespecífico CD20xCD37 foram expressos in células CHO DG44 em cultura utilizando as técnicas convencionais.
Foi observado o nível basal da expressão estável do scorpion CD20xCD20 S0129 (21m20-4x21m20-4) em células CHO DG4 4 cultivadas na presença de vários suplementos nutrientes, como mostrado na Fig. 34. Todos os meios de cultura continham metotrexato 50 nM, uma concentração que mantinha o número de cópias do polinucleotídeo codificador de scorpion. 0 polinucleotídeo continha uma região codificadora para a proteína scorpion que não era códon- otimizada para a expressão em células CHO DG44. 0 polinucleotídeo foi introduzido em células com o uso do vetor pD18. Como fica evidenciado pala Fig. 34, foram obtidos níveis de expressão de cerca de 7-46 μg/ml.
Também foram determinados os níveis de expressão após amplificação do polinucleotídeo que codifica um scorpion biespecífico CD20xCD37. 0 vetor pD18 foi usado para clonar a região codificadora do scorpion CD2 0xCD3 7 e o plasmídeo foi introduzido em células CHO DG44. A amplificação do polinucleotídeo codificador foi obtida com o uso da metodologia de dhfr-metotrexato conhecida na técnica, em 3 0 que são usadas concentrações crescentes de MTX para selecionar um número de cópia aumentado do gene de diidrofolato redutase (dhfr), o que leva à co-amplificação do polinucleotídeo de interesse intimamente ligado. A Fig. mostra que foram observados tipicamente níveis estáveis de expressão de cerca de 22-118 Mg/ml do scorpion biespecífico CD20xCD37. A variabilidade do rendimento foi observada sob diferentes condições, incluindo concentração de metotrexato usada para amplificação, mas essas variáveis são passíveis de otimização por aqueles habilitados na técnica. Diversas outras moléculas scorpion aqui descrita também foram submetidas às análises de expressão em células CHO e/ou COS, com os resultados apresentados na Tabela 11, abaixo. Esses resultados demonstram que podem ser obtidos rendimentos significativos de proteínas scorpion com a utilização de técnicas convencionais e otimização de rotina da técnica de amplificação.
As proteínas expressas também foram caracterizadas por análise SDS-PAGE para avaliar os graus de homogeneidade e integridade das proteínas expressas, e para confirmar o peso molecular de peptídeos monoméricos. Os géis de poliacrilamida desnaturantes (Tris Glicina 4-20%) foram processados sob condições redutoras e não redutoras. Os resultados apresentados na Fig. 3 6 revelam bandas únicas de proteína para cada um de SMIP 2Lm2 0-4 SCC e scorpion monoespecífico S1000 (CD2 0(21m2 0-4)xCD2 0(21m2 0-4) (S0126) dos pesos moleculares monoméricos esperados sob condições redutoras. Esses dados estabelecem que SMIPs e scorpions são passíveis de purificação em uma forma intacta. Sob condições não redutoras, foi observada uma quantidade 3 0 residual de um peptídeo consistente com o tamanho esperado de um SMIP monomérico, com a grande maioria da proteína aparecendo em um única banda bem definida consistente com uma estrutura dimérica. Sob essas condições não redutoras, a proteína do scorpion monoespecífico mostrou uma única banda bem definida de um peso molecular consistente com uma estrutura dimérica. As estruturas diméricas tanto do SMIP quanto do scorpion são consistentes com suas estruturas monoméricas, cada uma delas contendo um ligante scorpion dobradiça-Iike que contém pelo menos uma cisteína capaz de participar na formação de ligação dissulfeto.
O efeito dos ligantees scorpion sobre a expressão e integridade de scorpions também foi avaliado, e os resultados são mostrados na Tabela 12. Essa tabela lista variantes do ligante scorpion do scorpion monoespecífico CD20xCD20 (2Lm20-4x2Lm20-4) S0129 e do scorpion CD20xCD28 S0033 {2H7sccpIgGl-H7-2el2), sua integridade como moléculas de cadeia única, e seus níveis de expressão transitória em células COS em relação ao scorpion parente S0129 ou S0033, como apropriado, com um ligante H7 (definido como 100%). A Tabela 13 fornece dados que resultam de uma avaliação de variantes do ligante scorpion incorporadas no scorpion CD2 0xCD2 0, juntamente com dados análogos para o scorpion CD20xCD28. A Tabela 13 fornece dados que resultam de uma avaliação de variantes de S0129 contendo ligantees scorpion que não são ligantees dobradiça-IiJce que contêm pelo menos uma cisteína capaz de formação de ligação dissulfeto; em vez disso, os ligantees scorpion nessas moléculas são derivados de pedúnculos de lectina C do Tipo II. Fica evidente a partir dos dados apresentados na Tabela 13 que ligantees scorpion dobradiça-Iike podem estar associados aos scorpions expressos em níveis maiores ou menores do que o ligante scorpion parente não modificado em ensaios de expressão transitória. Além disso, algumas das variantes de ligante exibem maior resistência à clivagem proteolítica do que o ligante parente não modificado, uma preocupação para todas ou quase todas as proteínas expressas. Os dados da Tabela 13 mostram que ligantees não dobradiça-IiJce como, por exemplo, ligantees derivados da região peduncular de Iec tinas C do Tipo II, são encontrados em scorpions que exibem características de ligação que variam ligeiramente dos scorpions que contêm ligantees scorpion dobradiça-líJce. Adicionalmente, o scorpion que contém um ligante scorpion não dobradiça-Iike exibe função efetora (ADCC) que se igualam ou excedem a ADCC associada aos scorpions que possuem ligantees scorpion dobradiça-Iike.
Tabela 11
Nome do liga nte Seqüência ascendente (CH3) Variantes do liganter S0129 (2Lm20-4 χ 2Lm20- 4) - aa seql Baseada em AAs Expressa o em COS2 Clivad o3 Express ão em CHO2 U ftí* UiLfchHj* 147 1Θ IiH 100 H16 QKStSLSPGK ISVKADF L TFSIG N S CDSO 25 174 4 Hie QKSlSlSPGK ISVLAWFSOPÈÍCNS cd86 25 m + + H19 QKSl.Sl.SPGK LWLAJíFSQPEiSC PPCPNS CDee + H? : SO 161 4 109 H2Q qkslslsf3gk riromfisiiswws cdsg 2& 170 H 32 OKzSLS LSPGK RfHLNVSERPFPPMS C D 22 25 184 + + .......... H4? QKSLSLS5G ISVKADfLTPSlGNS ?A m ι 2M HdS QiKSLSlfrPG KAOFtTPSIGNS hl 5 21 Í37 HSO Q lsvcanfsqpéígns Hl ϋ te 21 lí B1 QKS LSVLANFSQPEIGNS Hia 110 R$2 okàTsispü SOPEIVPI-SNS HlS 20 95 H53 QKSLSL SOPElVPISCPPGPNâ H19 26 96 H 54 q SVLANFSQPEISCPPCPNS H19 21 72 +/- HSõ OKSLSLSPG RÍHQMNSEL5VLANS H26 24- 113 + 16} H 56 qkslslspg QMNSEiSVUWS h2-s 21 130 HS7 QKS-i slspg vserpfppns h32 1© 118 H66 UKSLSLijf-Xj LKPF FT C GSADTCPfiS c d 72 i 21 103 „ HSS ok-sls |kpfftcgsadtc p«s €□72 \ 20 -
1 NFS é ura motivo de consenso de glicosilação
2 Expressão transitória em COS (placas 6W) ou CHO (frasco simples) reletivo a S0129-H7 (%)
3 Produtos do clivado observados por SOS-PAGE/corante de prata: - = nenhum; + = banda fraca,· ++ = bandas forte; +++>50% clivado φ
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Em um experimento, um scorpion monoespecifico CD20xCD20 (S0129) foi expresso em células cultivadas em 200 μΜ de castanospermina (S0129 C5200) ou 10 μΜ (excesso) de kifunensina (S0129 KF 10) e a ligação, ou coloração, de células WIL-2S pelo scorpion expresso foi medida, como mostrado na Fig. 42. Além disso, estudos comparativos de ligação, um scorpion S0129 glicosilado se ligou ao CD16 (FCyRIII) aproximadamente três vezes melhor do que o scorpion S0129 não glicosilado.
Em outro estudo, a morte mediada por ADCC de células B BJAB por scorpion CD20xCD20 humanizado (S0129) foi explorada. Os resultados mostrados na Fig. 43 estabelecem que o scorpion, quando expresso em células cultivadas na presença de castanospermina ou kifunensina, leva a uma morte mediada por ADCC de células B BJAB significativamente mais potente para certa concentração de exposição ao scorpion.
Exemplo 14
Ligação de scorpion a. Espaçamento do domínio
Scorpions biespecificos são capazes de se ligar a pelo menos dois alvos simultaneamente, utilizando os pares de domínios de ligação nos terminais N e C da molécula. Ao fazê-lo, para alvos na superfície celular, a composição pode entrecruzar ou causar a co-aproximação física dos alvos. Será observado por aqueles habilitados na técnica que muitos sistemas de receptores são ativados por meio 2 5 deste entrecruzamento, resultando em indução de sinal que produzem alterações no fenótipo celular. O design das composições aqui reveladas teve o objetivo, em parte, de maximizar essa sinalização e controlar o fenótipo resultante.
As dimensões aproximadas das composições de domínios do scorpion, bem como as expectativas de flexibilidade interdomínios em termos de faixas de ângulos interdomínios, são conhecidas e foram consideradas no projeto da arquitetura do scorpion. Para scorpions que utilizam domínios de ligação scFv para os domínios de ligação 1 e 2 {BD1 e BD2) , uma dobradiça do terminal N de IgGl (Hl) , e o ligante H7 PIMS aqui descrito, o domínio de ligação no terminal Neo domínio de ligação no terminal C podem estar, no máximo, a cerca de 150-180 Â de distância e, no mínimo, a cerca de 20-30 Á de distância. Os domínios de ligação no terminal N podem estar, no máximo, a cerca de 90-100 Ã de distância e, no mínimo, a cerca de 10-20 Á de distância (Deisenhofer, e cols., 1976, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. Bd. 357, S. 435-445; Gregory, e cols., 1987, Mol. Iwmunol. 24 (8) : 821-9.; Poljak, e cols., 1973, Proc. Natl. Acad. Sci., 1973, 70: 3.305-3.310; Bongini, e cols., 2004, Proc. Natl. Acad. Sei. 101: 6.466-6.471; Kienberger, e cols., 2004, EMBO Reports, 5: 579-583, cada um deles aqui incorporado por referência). A escolha dessas dimensões foi feita, em parte, para permitir distâncias receptor-receptor de menos de cerca de 50 Á em complexos receptores ligados ao scorpion, na medida em que distâncias abaixo desta podem ser ótimas para a sinalização máxima de certos oligômeros de receptor (Paar, e cols., 2002, J. Immunol., 169: 856- 864, aqui incorporado por referência), ao mesmo tempo em que permitem a incorporação de estruturas Fc necessárias para a função efetora.
Os domínios de ligação nos terminais N e C de scorpions foram projetados para serem estruturas flexíveis para facilitar a ligação ao alvo e permitir uma variedades de geometrias dos alvos ligados. Também será observado por aqueles habilitados na técnica que a flexibilidade entre os domínios de ligação do terminal N ou C (BDl e BD2, respectivamente) e entre os domínios de ligação e o domínio Fc da molécula, bem como as distâncias máximas e mínimas entre receptores ligados por BDl e/ou BD2, podem ser modificadas, por exemplo, por escolha de domínio de dobradiça do terminal N (Hl) e, por analogia estrutural, pelo domínio do ligante scorpion localizado mais próximo ao terminal C (H2) . Por exemplo, domínios de dobradiça de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA2, dobradiças sintéticas e o domínio CH2 dobradiça-Iike de IgM mostra graus diferentes de flexibilidade, além de diferentes comprimentos. Aqueles habilitados na técnica saberão que a escolha ótima de Hl e do ligante scorpion (H2) dependerá do sistema(s) receptor para o qual o scorpion é projetado para interagir, bem como do fenótipo de sinalização desejado induzido pela ligação do scorpion.
Em algumas modalidades, os scorpions possuem um 2 0 ligante scorpion (H2) que é um ligante dobradiça-liice que corresponde a uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça de IgGl. Essas modalidades incluem scorpions que possuem uma seqüência de aminoácidos da dobradiça de scorpion que uma seqüência que se estende em direção ao terminal N em relação, por exemplo, à seqüência H7 ou à seqüência de dobradiça de IgGl do tipo selvagem. Ligantees scorpion exemplares desse tipo teriam a seqüência da dobradiça H7 se estendendo em direção ao terminal N por H2N-APEL(X)y-CO2H, em que χ é uma unidade do ligante Gly4Ser e y é um número entre 0 e 3. Para exemplifica a influência do ligante scorpion sobre a estabilidade do scorpion, foi feito um estudo com o uso de dois scorpions, um scorpion biespecífico CD20xCD28 e um scorpion monoespecifico CD20xCD20. Para cada um desses dois designs de scorpion, foram inseridos vários ligantees scorpion. Em particular, os ligantees scorpion H16 e H17, que basicamente diferem pelo fato de que H17 possui a seqüência de H16 com a seqüência de H7 anexada ao terminal C, e ligantees scorpion H18 e 19, nos quais analogamente a seqüência de H7 está anexada ao terminal C de Hl8 na geração de Hl9. Para cada uma dessas duas estruturas centrais de scorpion (2 0x2 8 e 2 0x20), cada um dos quatro ligantees scorpion descritos acima foi inserido na localização apropriada. A expressão transitória dessas construções foi obtida em células COS, e as proteínas scorpion encontradas nos sobrenadantes de cultura foram purificadas em poços revestidos com proteína A/G (Pierce kit SEIZS IP) . As proteínas purificadas foram fracionadas em géis de SDS-PAGE e visualizadas por coloração com prata. A inspeção da Fig. 44 revela que a seqüência adicional H7 no ligante scorpion se soma à estabilidade de cada tipo de ligante scorpion e cada tipo de proteína scorpíon. Em outras palavras, a anexação de H7 ao terminal C de H16 ou H18 se somou à estabilidade da molécula scorpion, e essa observação ocorria independentemente do scorpion ser CD20xCD28 ou CD20xCD20. In termos ligação ao alvo, as proteínas scorpion que possuem a arquitetura CD20xCD20 exibiram propriedades de ligação similares às do scorpion monoespecifico CD20xCD20 humanizado parente S0129, como mostrado na Fig. 45.
Além das modalidades precedentes, no entanto, pode ser desejável evitar que os receptores ligados se aproximem a cerca de 50 Á uns dos outros para intencionalmente criar sinais submáximos (Paar, e cols., J. Immunol., 16 9: 856- 864) . Nesse caso, seria adequada a escolha de Hl e ligante Scorpion (H2) que fossem mais curtos e menos flexíveis do que aqueles descritos acima.
As mesmas considerações sobre espaçamento se aplicam aos ligantees scorpion que não são dobradiça-Iike. Esses ligantees scorpion são exemplificados pela classe de peptídeos que possuem a seqüência de aminoácidos de uma região peduncular de uma lectina C. Dobradiças de scorpion exemplares que compreendem uma região peduncular de lectina C são dobradiças de scorpion derivadas da região peduncular CD7 2, da região peduncular CD94 e da região peduncular NKG2A. Scorpions que contêm essas dobradiças de scorpion foram construídos e caracterizados em termos de expressão, susceptibilidade à clivagem e possibilidade de purificação. Os dados são apresentados na Tabela 14.
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a b. Ligação de domínios de ligação dos terminais NeC Os domínios do terminal C e do terminal■ N participam na ligação à célula-alvo
As habilidades de ligação à célula-alvo de um SMIP de CD2 0 (TRUO15) , de um SMIP de CD37 (SMIP016), de uma combinação de CD20 e SMIP de CD37S (TRU015+SMIP016) e do scorpion biespecifico CD2 0xCD3 7 {015x016) foram avaliadas pela medida da capacidade de cada uma dessa moléculas para bloquear a ligação de um anticorpo que compete especificamente pela ligação ao alvo relevante, CD3 7 ou CD20. Os anticorpos de competição eram anticorpo monoclonal anti-CD37 marcado com FITC ou anticorpo monoclonal anti- CD20 marcado com PE, como apropriado. Células B Ramos forneceram os alvos. Células B Ramos a 1,2 χ 107/ml em PBS com soros de
camundongo 5% (#100-113, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA) (meios de coloração) foram adicionados a placas de 96 poços com fundo em "V" (25 μΐ/poço). Os vários SMIPs e scorpions foram diluídos até 7 5 μg/ml em meios de coloração e foram feitas diluições de 4 vezes até as concentrações indicadas na Fig. 38. Os compostos diluídos foram adicionados às células plaqueadas em adição aos meios isoladamente para poços de controle. As células foram incubadas por 10 minutos com os compostos, e depois anticorpo anti-CD37 com FITC (#186-040, Ancell, Bayport, MN) a 5 μg/ml e anticorpo anti-CD20 com PE (#555623, BD Pharmingen, San Jose, CA) a 3 μg/ml (puro) foram adicionados em conjunto aos poços em 25 μΐ de meios de coloração. As células foram incubadas no gelo no escuro por 45 minutos, e depois lavadas 2,5 vezes com PBS. As células foram fixadas com paraf ormaldeído 1% (#19943 1 LT, USB Corp, Cn Ivel and, OH) e depois processadas em um FACs Calibur {BD Biosciencesi San Jose7 CA).
Os dados foram analisadas com o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Os resultados mostrados na Fig. 3 8 estabelecem que todos os SMIPs, combinações de SMIP e scorpíons contendo um sítio de ligação de CD20 competiram com sucesso com anticorpo anti-CD20 marcado com PE pela ligação às células B Ramos (painel superior); todos os SMIPs, combinações de SMIP e scorpions contendo um sítio de ligação para CD3 7 competiram com sucesso com anticorpo anti-CD3 7 marcado com FITC pela ligação às células B Ramos (painel inferior). O scorpion biespecífico CD20xCD37, portanto, demonstrou ter sítios de ligação no terminal N e C operacionais para alvos em células B.
c. Persistência na superfície celular
Uma investigação da persistência na superfície celular de SMIPs e scorpions (monoespecífico e biespecífico) ligados na superfície de células B revelou que scorpions exibiram maior persistência na superfície celular do que SMIPs. Células B Ramos a 6 χ 106/ml (3 χ 105/poço) em meios de coloração (soro de cabra 2,5%, soros de camundongo em PBS 2,5%) foram adicionadas às placas de 96 poços com fundo em "V" . Os reagentes de teste foram preparados em duas vezes a concentração final em meios de coloração por produção de uma diluição serial de 5 vezes de um estoque inicial de 500 nM, e depois foram adicionados 1:1 às células B Ramos. Além disso, também foram plaqueados controles de meios. As células foram incubadas no escuro, no gelo, por 45 minutos. As placas foram então lavadas 3,5 vezes com PBS gelado. 0 reagente secundário, anticorpo de cabra anti-IgG humana com FITC (#H10501, Caltag/Invitrogen, CarlsbadiCA) foi então adicionado em uma diluição de 1:100 em meios de coloração. As células foram incubadas por 3 0 minutos no escuro, no gelo. As células foram então lavadas 2,5 vezes por centrifugação com PBS gelado, fixadas com uma solução de paraf ormaldeido 1% {#19943 1 LT, USB Corp, Cniveland, OH) e depois processadas era um FACs Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Os dados foram analisadas com o software CellQuest (BD Biosciencesf San Jose, CA) . Os resultados da análise dos dados são apresentados na Fig. 37, que mostra a ligação de vários SMIPs,. um scorpion monoespecífico CD2 0xCD2 0 e um scorpion biespecifico CD20xCD37 aos seus alvos em células B Ramos.
Dois tubos de células B Ramos (7 χ 105/ml) foram incubados por 3 0 minutos no gelo, com cada um dos dois compostos sendo investigado, ou seja, um SMIP de CD2 0 humani zado (2Lm2 0 -4) e um scorpion humani zádo CD20xCD2 0 (2Lm20-4x2Lm20-4) , cada um a 25 μ9/τη1 em meios Iscoves com FBS 10%. Ao final do periodo de incubação, ambos os tubos foram lavados 3 vezes por centrifugação. Um tubo de células foi então plaqueado em uma placa de 9 6 poços com fundo achatado as 2 χ IO5 células/poço em 150 μΐ de meios Iscoves, com uma placa então indo para uma incubadora a 37°C e a outra incubada no gelo. 0 segundo tubo de cada conjunto foi ressuspenso em PBS gelado com soro de camundongo 2% e azida de sódio 1% (meios de coloração) , e plaqueado em uma placa de 9 6 poços com fundo em "V" a 2 χ IO5 células/poço para coloração imediata com o anticorpo secundário, ou seja, anti-IgG humana de cabra conjugada a FITC (#Η10 5 01, Caltag/Invitrogen, Carlsbad, CA). 0 anticorpo secundário foi adicionado em uma diluição final de 1:100 em meios de coloração, e as células foram coradas no gelo, no escuro, por 30 minutos. As células foram então lavadas 2,5 vezes com PBS gelado, e . fixadas com paraformaldeído 1% (#19943 1 LT, USB Corp, Cníveland, OH).
Nos momentos designados na Fig. 39, as amostras foram coletadas das placas de 96 poços com fundo achatado, incubadas a 370C ou no gelo, e colocadas em placas de 96 poços com fundo em "V" (2 χ IO5 células/poço) . As células foram lavadas uma vez com meios de coloração gelados, regsuspensas, e o anticorpo secundário foi adicionado em uma diluição final de 1:100 em meios de coloração. Essas células foram incubadas no gelo, no escuro, por 3 0 minutos. As células foram então lavadas 2,5 vezes por centrifugação em PBS gelado, e subseqüentemente fixadas com paraformaldeído 1%. As amostras foram processadas em um FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA) e os dados analisados com o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Os resultados apresentados na Fig. 39 demonstram que a ligação de um SMIP e um scorpion â superfície de células B persiste por pelo menos seis horas, com o scorpion monoespecíf ico humanizado CD20xCD2 0 (2Lm2 0 - 4x2Lm2 0-4) persistindo por um período mais prolongado do que SMIP de CD20 humanizado (2Lm20-4).
Exemplo 15
Morte celular direta por scorpions monoespecíficos e
biespecíficos
Foram feitos experimentos para avaliar a capacidade de moléculas de scorpion monoespecífico e biespecífico para matar diretamente células de linfoma, ou seja, matar essas células sem envolvimento de ADCC ou CDC. Em particular, as linhagens de células de linfoma Su-DHL-6 e DoHH2 foram submetidas separadamente a um scorpíon monoespecífico, ou seja, um scorpion CD2 0xCD2 0 ou um scorpion CD3 7xCD3 7, ou a um scorpion biespecífico CD20xCD37.
Culturas de células de linfoma Su-DHL-6, DoHH2, Rec-I e WSU-NHL foram estabelecidas com a utilização de técnicas convencionais, e algumas dessas culturas foram então expostas individualmente a um SMIP de CD20 monoespecífico, um scorpion monoespecífico (CD20xCD20 ou CD37xCD37) ou um scorpion biespecífico {CD20xCD37 ou CD19xCD37). A exposição de células aos SMIPs ou aos scorpions foi efetuada sob condições que não resultam em entrecruzamento. As células permaneceram em contato com as moléculas por 96 horas, e após esse período o crescimento foi medido por detecção de ATP, como é conhecido na técnica. A morte celular atribuível ao SMIP de CD2 0 e ao scorpion monoespecíf ico CD20xCD20 é aparente na Fig. 24 e na Tabela 15. A
2 0 capacidade de morte celular do scorpion monoespecífico
CD3 7xCD3 7 é aparente na Fig. 25 e na Tabela 15, a habilidade do scorpion biespecífico CD20xCD37 para matar células de linfoma é aparente na Fig. 26 e na Tabela 15 e a capacidade do scorpion biespecífico CD19xCD37 para matar células de linfoma é evidente na Fig. 27 e na Tabela 15. Os dados foram reunidos em pool a partir de três experimentos independentes, e os pontos representam a média ± SEM. Os valores de IC50 na Tabela 15 foram determinados a partir das curvas nas Figs. 24, 25 e 26, como observado na legenda
3 0 da Tabela 15, e são definidos como a concentração que resulta em 50% de inibição, comparada como culturas não tratadas. Os dados nas figuras e na tabela demonstram que scorpions são mais de 10 vezes mais potentes na morte dessas linhagens celulares do que o SMIP livre usando os mesmos domínios de ligação.
Tabela 15
Linhagem celular IC50 (nM) SU-DHL-6 DOHH2 WSU-NHL SMIP de CD20 * >100 60 NA scorpion CD2 0xCD2 0 * 0, 3 4,0 NA SMIP de CD3 7 * ★ >100 >100 NA scorpion CD37xCD37 ** 10 1,2 NA SMIP de CD2 0 e SMIP de CD3 7 * * * 6 2 NA scorpion CD20XCD37 *** 0,05 0, 05 NA SMIP de CDl9 e SMIP de CD3 7 * * * * 0,16 NA 0,40 scorpion CD19xCD37 **** 0,005 NA 0, 04
* Data derivados da Fig. 24.
** Data derivados da Fig. 25.
*** Data derivados da Fig. 26.
**** Data derivados da Fig. 27.
Foram efetuados experimentos adicionais com o scorpion CD2 0xCD2 0 humanizado S012 9 em células Su-DHL-4, Su-DHL-6, DoHH2, Rec-I e WSU-NHL. Os resultados são apresentados na Fig. 46 e na Fig. 47. Os dados fornecidos nessas figuras estendem os achados discutidos acima ao mostrarem que scorpions possuem a capacidade de matar diretamente diversas linhagens celulares.
Os achados acima foram estendidos a outros scorpions monoespecificos e biespecificos, com cada scorpion demonstrando capacidade para matar diretamente células B. Células B DoHH2 foram expostas in vitro ao scorpion monoespecífico CD20xCD20, a um scorpion monoespecifico CD3 7xCD3 7 ou a um scorpion biespecífico CD20xCD37. Os resultados apresentados na Fig. 48 demonstram que scorpions biespecificos possuem curvas de morte que são diferentes na forma de scorpions monoespecificos.
0 cultivo de células Su-DHL-6 na presença de 70 nM de scorpion CD20xCD20 (S0129), scorpion CD20xCD37 ou scorpion CD37xCD37 também levou à morte direta de células B em um ambiente in vitro (Fig. 49). Consistentemente, as células Su-DHL-6 expostas a um scorpion biespecífico CD19xCD37 ou ao Rituxan® levaram à morte celular direta, com a letalidade do scorpion biespecífico exibindo em doses menores, como revelado na Fig. 50.
Outra demonstração de morte celular direta foi apresentada por exposição de células DHL-4 a quatro scorpions monoespecificos independentes que reconhecem CD2 0. Foram projetadas duas versões do scorpion CD20xCD20 para incorporar dois domínios de ligação 20-4 (20-4x20-4 e S0129) e os dois segundos incorporam um híbrido dos domínios de ligação 011 e 20-4. Todas as quatro versões construídas e purificadas independentemente dos dois designs de scorpion CD20xCD20, (20-4x20-4 e S0129) e híbrido {011x20-4 e 011x20-4AAsp), mataram eficazmente as células DHL-4 de uma forma direta. Para esse estudo, as células DHL-4 foram tratadas in vi tro com 1 μ9/ιη1 das proteínas indicadas por 24 horas. As células foram então coradas com Anexina V e iodeto de propídio, marcadores iniciais e tardios de morte celular, respectivamente, e as populações de células foram quantificadas por FACS. Os
resultados apresentados na Fig. 51 estabelecem a capacidade de morte direta de cada uma das construções de CD2 0xCD2 0, como evidenciado por coloração aumentada mostrada em barras pretas. Além disso, os resultados demonstram que as proteínas híbridas 011x20-4 exibiram um ligeiro aumento na
morte celular direta em relação aos scorpions baseados em 20-4x20-4, apesar do fato de que cada um desses scorpions reconheceu CD20 de forma monoespecífica. Em um conjunto separado de experimentos, a dose-resposta das quatro construções de scorpion independentes foi determinada por
2 0 análise FACS de populações de células que coraram com
Anexina V e iodeto de propídio. Os resultados, mostrados na Fig. 52, demonstram aumentos proporcionais à dose na morte celular resultante de tratamento das células DHL-4 com cada uma das construções de scorpion independentes.
Exemplo 16
Funções acessórias mediadas por scorpions (ADCC & CDC) a. Citotoxicidade celular dependente de scorpion Foram feitos experimentos para determinar se scorpions mediariam a morte de células B BJAB de Iinfoma. Observou-se
3 0 que células B BJAB de Iinfoma eram mortas com scorpions CD2 0 e/ou CD3 7.
Inicialmente, 1 χ 107/ml de células B BJAB foram marcadas com 500 pCi/ml de 51Cr cromato de sódio (#CJS1, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por 2 horas a 37°C em meios Iscoves com FBS 10%. As células B BJAB carregadas com 51Cr foram então lavadas 3 vezes em meio RPMI com FBS 10%, e ressuspensas a 4 χ 105/ml em RPMI. Células mononucleares (PBMCs) do sangue periférico de doadores internos foram isoladas de sangue total heparinizado por meio de centrifugação sobre Meio de Separação de Linfócitos (#50494, MP Biomedicals, Aurora, Oh), lavadas 2 vezes com meio RPMI, e ressuspensas a 5 χ 106/ml em RPMI com FBS 10%. Amostras de reagentes foram adicionadas ao meio RPMI com FBS 10% a 4 vezes a concentração final, e foram preparadas três diluições seriais de 10 vezes para cada reagente. Esses reagentes foram então adicionados a placas de 9 6 poços com fundo em "U" a 50 μΐ/poço até as concentrações finais indicadas. As células BJAB marcadas com 51Cr foram então adicionadas ãs placas a 50 μΐ/poço (2 χ 104/poço). As PBMCs foram então adicionadas âs placas a 100 μΐ/poço (5 χ 105/poço) para uma proporção final de 25:1 de efetores (PBMC) :alvo (BJAB) . Os efetores e os alvos foram adicionados ao meio isoladamente para medir ao nível de morte de fundo. As células BJAB marcadas com 51Cr foram adicionadas ao meio isoladamente para medir a liberação espontânea de 51Cr, e ao meio com NP40 5% (#28324, Pierce, Rockford, In) para medir a liberação máxima de 51Cr. As placas foram incubadas por 6 horas a 3 7 0C em CO2 5%. Cinqüenta μΐ (25 μΐ também seriam adequados) do 3 0 sobrenadante de cada poço foram então transferidos para uma LumaPlate-9 6 (#6006633, Perkin Elmer, Boston, Mass) e secos de um dia para o outro em temperatura ambiente.
Após secagem, as emissões radioativas foram quantificadas como cpm em um Packard TopCount-NXT. Os valores da amostra eram a média de amostras em triplicata. O percentual de morte específica foi calculado usando a seguinte equação: % de Morte = {(amostra — liberação espontânea)/(liberação máxima — liberação espontânea)) χ 100. Os gráficos na Fig. 30 mostram que as células B BJAB foram mortas por scorpions monoespecíficos CD20xCD20 e CD37XCD37. A combinação de SMIP de CD20 e SMIP de CD37 também matou as células B BJAB. Esses resultados demonstram que scorpions exibem citotoxicidade celular dependente de scorpion, e espera-se que essa funcionalidade seja fornecida pela sub-região constante do scorpion, que fornece atividade de ADCC.
b. Papel do scorpion na citotoxicidade dependente de complemento
Experimentos também demonstraram que scorpions possuem atividade de Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) . 0 experimento envolveu a exposição de células B Ramos aos SMIPs de CD19 e/ou CD37 e scorpions, como descrito abaixo e como mostrado na Fig. 31.
0 experimento foi iniciado por adição de 5 a 2,5 χ IO5 células B Ramos aos poços de placas de 96 poços com fundo em "V" em 50 μΐ de meio Iscoves {sem FBS) . Os compostos de teste em Iscoves (ou somente Iscoves) foram adicionados aos poços em 5 0 μΐ em duas vezes a concentração final indicada. As células e reagentes foram incubados por 4 5 minutos a 37°C. As células foram lavadas 2,5 vezes em Iscoves sem FBS, e ressuspensas em Iscoves com soro humano (# A113, Quidel, San Diego, CA) em placas de 96 poços nas concentrações indicadas. As células foram então incubadas por 90 minutos a 37 0C. As células foram lavadas por centrifugação e ressuspensas em 12 5 μΐ de PBS gelado. As células foram então transferidas para tubos agrupados de FACs (#4410, CoStari Corning, NY) , e 125 μΐ de PBS com iodeto de propídio (# P-16063, Molecular Probes, Eugene, OR) a 5 ^ig/ml foram adicionados. As células foram incubadas com o iodeto de propidio por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro, e depois colocadas no gelo, quantificadas e analisadas em um FACsCalibur com o software CellQuest (Becton Dickinson). Os resultados apresentados na Fig. 31 estabelecem que o SMIP de CD19, mas não o SMIP de CD37, exibe atividade de CDC, com uma combinação dos dois SMIPs exibindo aproximadamente o mesmo nível de atividade de CDC que o SMIP de CD19 isoladamente. 0 scorpion CD19xCD3 7, no entanto, exibiu atividade de CDC significativamente maior do que SMIP isoladamente ou em 2 0 combinação, estabelecendo que a arquitetura do scorpion fornece um nível maior de citotoxicidade dependente de complemento do que outros designs moleculares.
c. Atividade de ADCC/CDC de scorpions monoespecíficos CD2 0XCD2 0
Três scorpions monoespecíficos CD20xCD20 distintos
foram examinados quanto à funcionalidade de ADCC e CDC, junto com controles apropriados. A ADCC foi testada com o uso de técnicas convencionais, e os resultados são apresentados na Fig. 53. Fica evidente na Figura a atividade de ADCC apreciável, mas não idêntica, associada a cada um dos scorpions monoespecíficos CD20xCD20 testados.
Para avaliar a CDC, amostras de células B Ramos (4 χ IO5) foram incubadas com cada um dos scorpions CD20xCD2 0 (0, 0,5, 5, 50 e 500 nM) e soro (10%) por 3,5 horas a 37°C. A morte celular foi avaliada por coloração com 7-AAD e análise FACS. Os resultados são apresentados na Fig. 54, que revela que os scorpions exibem alguma atividade de CDC. Em um experimento similar, amostras de células B Ramos (4 χ IO5) foram incubadas com proteína scorpion CD20xCD2 0 (5, 50, 100 nM) e soro (10%) por 2 horas a 37°C. As células foram lavadas 2X e incubadas com anticorpo anti-Clq humano com FITC. 0 Clq ligado foi avaliado por análise FACS, e os resultados são apresentados na Fig. 55. Esses resultados são consistentes com os resultados apresentados na Fig. 54, de que cada um dos scorpions monoespecíficos CD20xCD20 estava associado a alguma atividade de CDC, embora menos atividade do que a que estava associada a um SMIP de CD20.
d. Interações de scorpions com FcyRIII
estudos ELISA demonstraram que scorpions ligados a FcyRIII (CD16) baixo (uma isoforma ou tipo alélico de baixa afinidade) em níveis aumentados na ausência de células- alvo. As placas de ELISA foram inicialmente revestidas com CD16mIgG de baixa ou alta afinidade com a utilização de técnicas convencionais. A habilidade dessa proteína de fusão imobilizada para capturar um SMIP de CD20 ou um scorpion monoespecífico CD2 0xCD2 0 foi avaliada. SMIPs e scorpions ligados foram detectados com anticorpo secundário anti-IgG humana de cabra (HRP), e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi determinada. PBS isoladamente (controle negativo) é mostrado como um ponto único. Os resultados são apresentados na Fig. 32A (captura pela fusão da isoforma de CD16 de alta afinidade) e 32B (captura pela fusão da isoforma de CD16 de baixa afinidade). Fica evidente a partir das Figs. 32A e 32B que tanto SMIP de CD2 0 quanto scorpion monoespecífico CD2 0xCD2 0 mostraram ligação aumentada para fusões da isoforma de CD16 de alta e baixa afinidade, com o scorpion CD20xCD20 mostrando um aumento dramático na ligação à fusão da isoforma de baixa afinidade com concentração crescente de proteína.
A ligação de scorpions às isoformas de FcyRIII na presença de células-alvo também foi avaliada. Os dados mostram a ligação aumentada de scorpions a ambas as isoformas ou tipos alélicos de FcyRIII (CD16), de baixa e alta afinidade, na presença de células-alvo com concentração crescente de proteína.
Na realização do experimento, células-alvo CD2 0- positivas foram expostas aos SMIPs de CD20 ou aos scorpions monoespecíficos CD20xCD2 0 sob condições que permitiam a ligação do SMIP ou scorpion às células-alvo CD20-positivas. Subseqüentemente, a célula-alvo que abriga SMIP ou scorpion foi exposta à isoforma de CD16 de alta ou baixa afinidade marcada com IgFc de camundongo. Um Fc anticamundongo de cabra marcada foi então adicionado como anticorpo secundário para marcar o CD16 imobilizado marcado com o IgFc de camundongo. As células foram então detectadas com o uso de citometria de fluxo em um FACs Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA) , e analisadas com o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Como mostrado na Fig. 33, concentrações aumentadas de cada um dos SMIPs de CD20 e do scorpion monoespecífico CD20xCD20 levam ã ligação aumentada às isoformas de CD16 na presença de células-alvo, com o aumento na ligação do scorpion CD20xCD20 sendo mais significativo do que a ligação aumentada observada com o SMIP de CD20.
Exemplo 17
Efeitos no ciclo celular de scorpions sobre células-alvo de
Iinfoma
Os efeitos no ciclo celular de scorpions foram avaliados por exposição de células de Iinfoma aos SMIPs, scorpions monoespecíficos e scorpions biespecíficos. Mais particularmente, células de linfoma DoHH2 (0,5 χ IO6) foram tratadas por 24 horas com rituximab 0,4 nM, scorpion CD20xCD37, combinação de TRU-015 (SMIP de CD20) + SMIP-016 (0,2 nM cada) , SMIP-016 10 0 nM ou scorpion CD3 7xCD3 7 100 nM. Essas concentrações representam cerca de 10 vezes mais do que o valor de IC50 do scorpion em um ensaio de inibição do crescimento de 96 horas (veja as Figs. 24-27). As culturas foram marcadas por 20 minutos a 37°C com BrdU 10 μΜ (bromodesoxiuridina) . Após fixação, as células foram coradas com anticorpo anti-BrdU-FITC e contra-coradas com iodeto de propidio. Os valores na Fig. 28 representam a média +/- DP de 4 culturas em replicadas de 2-3 experimentos independentes. Todos os dados de amostras foram analisados ao mesmo tempo e reunidos em pool para apresentação com o uso de gráficos de pontos da incorporação de BrdU e PI. Os gráficos demonstram que um efeito importante do tratamento com scorpion é uma eliminação de células em fase S1 além de um aumento no compartimento G0/G1.
Exemplo 18 Efeitos fisiológicos de scorpions
a. Potencial mitocondrial
Scorpions CD2 0xCD2 0 induziram perda de potencial da membrana mitocondrial em células B DHL4, como revelado em um ensaio de JC-I. JC-I é um corante catiônico de carbocianina que exibe acúmulo potencial-dependente nas mitocôndrias (Kit de ensaio Mitoprobe® JC-I para citometria de fluxo de Molecular Probes). JC-I é mais específico para a membrana mitocondrial do que a para a membrana plasmãtica, e é usado para determinar mudanças no potencial da membrana mitocondrial. Um acúmulo nas mitocôndrias é indicado por uma mudança na fluorescência de verde (529 nm) para vermelho (590 nm).
Na realização do experimento, células B DHL-4 (5 χ IO5 células/ml) foram inicialmente cultivadas em placas de 24 poços, e tratadas por 24 horas com 1 μ9/πι1 de scorpion CD20xCD20, Rituximab, anticorpo IgG de controle ou 5 μΜ de estaurosporina a 37°C, C025%, em uma incubadora padronizada de cultura de tecido. 0 corante JC-I {10 μΐ/ml, concentração final de 2 μΜ) foi adicionado, e as células foram incubadas por mais 3 0 minutos a 3 7 °C. As células foram coletadas por centrifugação (5 minutos a 1.200 rpm), lavadas com 1 ml de PBS, e ressuspensa em 500 μΐ de PBS. As células foram analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur, BD) com filtros de excitação de 488 nM e de emissão de 530 nM e 585 nM. Para os gráficos representativos de dispersão mostrados na Fig. 56, a fluorescência vermelha foi medida no eixo Yea fluorescência verde foi medida no eixo X. A despolarização da membrana mitocondrial foi medida como uma diminuição na fluorescência vermelha, como observado no controle positivo de CCCP (carbonil cianeto 3-clorofenilhidrazona), um rompedor conhecido da membrana mitocondrial. Para confirmar que JC-I respondia às mudanças no potencial de membrana, células B DHL-4 foram tratadas com duas concentrações de CCCP (50 μΜ e 250 μΜ) por 5 minutos a 3 70C, CO2 5%. Um controle positivo adicional era formado por células tratadas com o inibidor de quinase de amplo espectro estaurosporina para induzir apoptose. Os resultados mostrados na Fig. 56 são gráficos dot-plot de 10.000 contagens, com a fluorescência vermelha tabulada no eixo Y e a fluorescência verde tabulada no eixo X. Um resumo do histograma da percentagem de células com potencial da membrana mitocondrial rompida (MMP rompida: barras pretas) é mostrado na Fig 56. Esses resultados demonstram que o tratamento com scorpion 20-4x20-4 ou com o scorpion 011x20 gerou uma diminuição no potencial da membrana mitocondrial associada à morte celular.
b. Fluxo de cálcio
Scorpion moléculas foram analisadas quanto às influências sobre as vias de sinalização celular, usando a mobilização de Ca++, uma característica comum da sinalização celular, como uma medida desta.
Células de linfoma SU-DHL-6 foram marcadas com corante Calco 4 e tratada com as moléculas de teste identificadas abaixo. As células foram lidas por 2 0 segundos para determinar a fluorescência de fundo, e depois foram adicionados SMIPs/scorpions (primeira linha pontilhada na Fig. 28), e a fluorescência foi medida em 600 segundos. Em 600 segundos, foi adicionado um excesso de 8 vezes de F (ab) 12 entrecruzado de cabra anti-humano, e a fluorescência foi medida por mais 3 00 segundos. O Painel (A) da Fig. 2 8 mostra os resultados obtidos com uma combinação de SMIP de CD20 e SMIP de CD37 (linha vermelha); ou obtidos com um scorpion biespecífico CD2 0xCD3 7 (linha preta), comparadas com células não estimuladas (linha azul) . No painel B da Fig. 28, os resultados do tratamento das células com SMIP de CD20 isoladamente (linha vermelha) resultou em mobilização de Ca++, mas isso não foi tão robusto quanto o sinal gerado pelo scorpion monoespecifico CD20xCD20 (linha preta). Os gráficos de mobilização de Ca++ da Fig. 2 8 representam a f luorescência de poços em triplicata tratados com quantidades eqüimolares de scorpion e combinações de SMIP/SMIP.
c. Caspases 3, 7 e 9
A habilidade de scorpions de ligação de CD20 para matar diretamente células B, como evidenciado.por coloração aumentada de Anexina V e iodeto de propidio e a perda de potencial da membrana mitocondrial levaram a uma investigação adicional de efeitos adicionais relacionados à apoptose de scorpions de ligação de CD20 em células Β. A abordagem seguida foi a realização de ensaios de Apo-I em células B DHL-4 expostas aos scorpions CD20xCD20 ou aos controles apropriado. 0 ensaio de Apo-I se baseia em um substrato peptidico sintético para caspase 3 e 7. Os componentes do ensaio são disponíveis por Promega ("ApoONE® Homogeneuous Caspase-3/7 Assay"). A clivagem mediada por Caspase do peptídeo marcado Z-DEVD-Rodamina 110 libera o marcador fluorescente de rodamina IlOf o que é medido com o uso de uma excitação a 485 nm e uma detecção a 530 nm. No experimento, 100 μΐ de células B DHL-4 (1 χ IO6 células/ml) foram plaqueadas em placas de cultura de tecido pretas de 96 poços de fundo achatado e tratadas por 24 ou 48 horas com 1 μ9/τη1 de scorpion CD20xCD20, Rituximab, um anticorpo IgG de controle, ou 5 μΜ de estaurosporina a 370C, CO2 5%, em uma incubadora padronizada de cultura de tecido (a estaurosporina é uma molécula pequena, um inibidor da proteína quinase de amplo espectro, que é conhecida na técnica como um indutor potente de apoptose clássica em vários tipos de células). Após 24 ou 48 horas, 100 μΐ do substrato diluído 100 vezes foram adicionados a cada poço, misturados gentilmente por um minuto em uma agitadora de placas (3 00 rpm) , e incubados em temperatura ambiente por duas horas. A fluorescência foi medida com o uso de um filtro de excitação de 485 nM e um filtro de emissão de 52 7 nM {Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems). Os gráficos que mostram a intensidade média de fluorescência de tratamentos em triplicata mais/menos desvio padrão após 24 horas e 4 8 horas (24 horas apenas para estaurosporina) são apresentados na Fig. 57. Esses resultados estabelecem que scorpions de ligação de CD20 não matam diretamente células B por uma via apoptótica que envolve ativação de caspase 3/7.
Os resultados obtidos no ensaio de Apo-I foram confirmados por análises Western blot projetado para detectar a clivagem pró-caspase que resulta em caspase ativada ou para detectar clivagem de PARP (Poli (ADP- Ribose) Polimerase), uma proteína conhecida por ser clivada por caspase 3 ativada. As células B DHL-4 foram expostas a um scorpion de ligação de CD20 ou a um controle por 4, 24, ou 48 horas, e os lisados de células foram fracionados em SDS-PAGE e blotted para análises Western com o uso de técnicas convencionais. A Fig. 58 apresenta os resultados na forma de uma coleção de Western blots. Os três Westerns inferiores utilizaram anticorpos anti-caspase para detectar mudanças do peso molecular da enzima caspase, refletindo ativação proteolitica. Para as caspases 3, Ί e 9, não houve evidências de ativação de caspase por qualquer uma das moléculas de ligação de CD20. A estaurosporina serviu como controle positivo para o ensaio, e induziu clivagem pró- caspase por caspase ativa para cada uma das caspases 3, 7 e 9. 0 quarto Western mostrado na Fig. 58 revela que PARP, um substrato conhecido de caspase 3 ativada, não foi clivado, consistente com a incapacidade de scorpions de ligação de CD20 para ativar caspase 3. Os resultados de todos esses experimentos são consistentes na comprovação de que a ativação de caspase 3 não é uma característica significativa da morte celular direta de células B DHL-4 induzida por scorpions de ligação de CD20.
Além disso, foi feito um estudo ao longo do tempo para determinar o efeito de proteínas de ligação de CD2 0, incluindo um scorpion CD20xCD20, sobre Caspase 3. Células B DoHH2 ou Su-DHL-6 foram incubadas com 10 nM de proteína de ligação de CD20 (scorpion S0129, SMIP 2Lm20-4 ou Rituxan) + /- Ig CD16 solúvel (40 nM) , Ig CD16 solúvel isoladamente, ou meios. As células foram cultivadas em RPMI completo com FBS 10% a 3 χ 10s/poço/300 μΐ, e coletadas em 4 horas, 24 horas ou 72 horas. As amostras do ponto de tempo de 72 horas foram plaqueadas em 500 μΐ do agente de teste. As células foram lavadas com PBS, e depois coradas para caspase-3 intracelular ativa com o uso da Caspase 3 de BD Pharmingen, Forma Ativa, "mAB Apoptosis Kit:FITC" {N° de Catálogo 55048, BD Pharmingen, San Jose, CA) . Resumidamente, após 2 lavagens adicionais em PBS gelado, as células foram suspensas em solução gelada de cytofix/cytoperm e incubadas no gelo por 20 minutos. As células foram então lavadas por centrifugação, aspiradas e lavadas duas vezes com tampão Perm/Wash em temperatura ambiente. As amostras foram então coradas com 20 μΐ de FITC-anti-caspase 3 em 100 μΐ de tampão Perm-Wash em temperatura ambiente no escuro por trinta minutos. As amostras foram então lavadas duas vezes com tampão Perm- Washl e ressuspensas em 500 μΐ de tampão Perm-Wash. As células lavadas foram então transferidas para tubos de FACs e processadas em um FACs Calibur {BD Biosciences, San Jose, CA) e analisadas com o software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA). Os resultados são mostrados na Tabela 16.
Tabela 16
Molécula (10 nM) Percentagem de células Caspase 3-positivas Percentagem em Iive gate 4 horas 24 horas 48 horas 4 horas 24 horas 48 horas RTXN 7 25 7 75 53 56 e CD16 hi (4X) 27 47 21 79 60 43 SMIP de CD 2 0 (2Lm2 0-4) 5 5 10 89 85 81 e CD16 hi 28 54 21 61 60 41 Scorpion CD20xCD20 humanizado (S00129) 1 13 14 69 68 61 e CDl6 hi 30 31 15 67 75 72 Meios 7 5 9 89 82 80 e CD16 hi 6 5 9 91 83 80
Os resultados de todos esses experimentos são consistentes para mostrar que há uma ativação limitada de caspase 3 na ausência de CD16, o que não implica na ativação de caspase 3 como uma característica significativa da morte celular direta induzida por scorpions de ligação de CD2 0.
d. Fragmentação de DNA
A indução das vias clássicas de sinalização apoptótica em última análise resulta em condensação e degradação fragmentada do DNA cromossômico. Para determinar se scorpions de ligação de CD2 0 matam diretamente células B por meio de um mecanismo apoptótico clássico, o estado do DNA cromossômico da célula B foi examinado após exposição das células ao scorpions de ligação de CD20, ou a controles. Inicialmente, as células B DHL-4 foram tratadas in vitro por 4, 24 ou 48 horas com uma molécula de ligação de CD20, ou seja, o scorpion monoespecifico CD20xCD20 {2Lm20-4x2Lm20-4) , o scorpion CD20xCD20 (011x2Lm20-4) ou Rituximab, ou com um controle. Subseqüentemente, as células foram lisadas e o DNA cromossômico foi purificado com o uso de técnicas convencionais. 0 DNA cromossômico foi então tece seu tamanho fracionado por eletroforese em gel. 0 eletroforetograma em gel mostrado na Fig. 59 revela a ausência de fragmentação de DNA que demonstrasse que a morte célula gerada por scorpions de ligação de CD20 não fosse mediada por uma via apoptótica clássica. Células tratadas com estaurosporina foram usadas como controle positivo nesses ensaios.
e. Fosforilação de SYK
A SYK é uma proteína fosfo-regulada com vários sítios de fosforilação que funcionam como um repressor da transcrição. SYK está localizada no núcleo da célula, mas é capaz de re-localização rápida na membrana mediante ativação. Para ativação, SYK deve reter sua seqüência de localização nuclear. SYK ativada participa da supressão de tumores de câncer de mama, e SYK é ativada por sinais pró- apoptóticos como, por exemplo, radiação ionizante, ligação de BCR e entrecruzamento da classe II do MHC. Além disso, foi demonstrado que SYK afeta as vias de PLC-γ e do Ca++. Em função dessas observações, a capacidade de scorpions de ligação de CD2 0 afetar SYK foi investigada.
Células B DHL-6 foram expostas a um scorpion biespecífico CD20xCD37 por 0, 5, 7 ou 15 horas, e as células foram lisadas. Os lisados foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-fosfotirosina ou com um anticorpo anti-SYK. Os imunoprecipitados foram fracionados por eletroforese em gel, e os resultados são mostrados na Fig. 60. Fica evidente a partir da inspeção da Fig. 60 a incapacidade do scorpion biespecífico CD20xCD37 em induzir fosforilação de SYK, dessa forma, ativando-o. Consistente com os estudos descritos acima sobre ativação de caspase e fragmentação de DNA cromossômico, não parece que scorpions de ligação de CD20 matem diretamente células B usando uma via apoptótica clássica como, por exemplo, a via caspase dependente. Embora sem se fixar a uma teoria, espera-se que os scorpions de ligação de CD20 matem diretamente células B por meio de uma via independente de caspase e SYK que não apresenta significativamente fragmentação do DNA cromossômico, pelo menos não no mesmo intervalo de tempo em que a fragmentação ocorre durante a apoptose dependente de caspase.
Exemplo 19 Aplicações de scorpions a. Atividade in vivo de scorpions
A atividade de scorpions também foi avaliada com a utilização de um modelo em camundongo.
As medidas da atividade de scorpion in vivo envolveram a administração de 10-300 pg de scorpion e subseqüentes determinações ao longo do tempo de concentrações séricas daquele scorpion. Os resultados desses estudos, apresentados como curvas da concentração sérica para cada um dos dois scorpions biespecificos (ou seja, S0033, um scorpion CD20xCD27 e um scorpion CD20xCD37) a partir de estudos farmacocinéticos de três semanas em camundongos são apresentados na Fig. 40. Os dados na Fig. 4 0 mostram que leva pelo menos 500 horas após a administração antes que os níveis séricos de cada um dos dois scorpions biespecificos retornem aos níveis basais. Dessa forma, scorpions apresentam estabilidade sérica e meias-vidas circulantes reprodutíveis e sustentadas in vivo.
A eficácia in vivo de scorpions também foi avaliada. Um modelo agressivo de xenoenxerto de Ramos foi usado em experimentos paralelos com SMIPs versus controles de imunoglobulina históricas. As curvas de sobrevida fornecidas na Fig. 41 revelam que a administração de 10 pg de scorpion biespecífico teve uma influência desprezível sobre a sobrevida, mas a administração de 100-300 pg teve um efeito positivo significativo sobre a sobrevida de camundongos que abrigam xenoenxertos de Ramos.
b. Terapias combinadas
É contemplado que scorpions terão aplicação na prevenção, tratamento ou atenuação de um sintoma de uma ampla gama condições que afetam o homem, outros mamíferos e outros organismos. Por exemplo, espera-se que os scorpions de ligação de CD20 sejam úteis no tratamento ou na prevenção de diversas doenças associadas a células B excessivas ou aberrantes. Na verdade, qualquer doença passível de um tratamento que envolva a eliminação de células B seria passível de tratamento com um scorpion de ligação de CD2 0. Além disso, scorpions, por exemplo, scorpions de ligação de CD20, podem ser usados em terapias combinadas com outras substâncias terapêuticas. Para ilustrar a viabilidade de uma ampla gama de terapias combinadas, o scorpion monoespecífico CD20xCD20 (S0129) foi administrado às células B Su-DHL-6 em combinação com doxorrubicina, vincristina ou rapamicina. A doxorrubicina é um veneno de topoisomerase II que interfere com a bioquímica do DNA e pertence a uma classe de fãrmacos contemplada para tratamento anticâncer. A rapamicina (Sirolimus) é um antibiótico macrolídeo que inibe a iniciação da síntese protéica e suprime o sistema imunológico, sendo útil no transplante de órgãos e como antiproliferativo usado com endopróteses (stents) coronárias para inibir ou evitar a re-estenose. A
vincristina é um alcalóide da vinca que inibe a formação de túbulos e tem sido usada para o tratamento de câncer.
Os resultados experimentais mostrados na Fig. 61 são apresentados como valores do índice de Combinação para cada combinação ao longo de uma gama de níveis de efeitos. As interações do scorpion monoespecifico CD20xCD20 S0129 são diferentes para cada classe de fármaco, embora com Rituxan® (RTXN) as formas dos gráficos sejam similares. 0 efeito observado com doxorrubicina em concentrações elevadas pode refletir uma mudança em direção à ligação monovalente. Os dados estabelecem que scorpions de ligação de CD20 podem ser usados em combinação com várias outras substâncias terapêuticas, e estas combinações devem ficar evidentes para aqueles habilitados na técnica a luz da presente especificação.
Variações nos temas estruturais para moléculas de ligação multivalentes com função efetora, ou scorpions, ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica 2 0 mediante revisão da presente especificação, e essas estruturas variantes estão dentro do escopo da invenção. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
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<2 2 3 > anti-CD20 (2H7) LH (DNA)
<4 0 0 > 1
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180 ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccccatcca acctggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagtt ttaacccacc cacgttcggt 360 gctgggacca agctggagct gaaagatggc ggtggctcgg gcggtggtgg atctggagga 420 ggtgggagct ctcaggctta tctacagcag tctggggctg agtcggtgag gcctggggcc 480 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540 gtaaagcaga cacctagaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600 gatacttcct acaatcagaa gttcaagggc aaggccacac tgactgtaga caaatcctcc 660 agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgaag actctgcggt ctatttctgt 720 gcaagagtgg tgtactatag taactcttac tggtacttcg atgtctgggg cacagggacc 780 acggtcaccg tctct 795
<210 > 2
<211> 265
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Polipeptídeo sintético 35
50
<22 0>
<223> anti-CD20 (2Η7) LH (AA)
<22 0>
<221> misc_caracterίstica <222> (1) . . (22)
<2 2 3 > Líder
<220>
<221> misc_característica
<22 2 > (23) . . (128)
<223 > VL
<2 2 0 >
<221> misc_característica
<222 > (12 9) . . (144)
<223> Ligante
<22 0 >
<221> misc_característica
<22 2 > (145) . . (265)
<223 > VH
<4 0 0 > 2
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
3 0 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
40 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95
4 5 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
130 135 140
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala
55 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
165 170 175
6 0 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190 10
30
Gly Ala Xle Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
260 265
<210> 3
<211> 813
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<2 23> Polinucleotideo sintético
< 22 0 >
<223> anti-CD2 8 (2el2) LH (DNA)
<4 0 0 > 3
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60
agaggagtcg acattgtgct cacccaatct ccagcttctt tggctgtgtc tctaggtcag 120
agagccacca tctcctgcag agccagtgaa agtgttgaat attatgtcac aagtttaatg 180
3 5 cagtggtacc aacagaaacc aggacagcca cccaaactcc tcatctctgc tgctagcaac 240
gtagaatctg gggtccctgc caggtttagt ggcagtgggt ctgggacaga ctttagcctc 300
aacatccatc ctgtggagga ggatgatatt gcaatgtatt tctgtcagca aagtaggaag 360
40
gttccatgga cgttcggtgg aggcaccaag ctggaaatca aacggggtgg cggtggatcc 420
ggcggaggtg ggtcgggtgg cggcggatct caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc 48 0
45 ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc 540
ggctatggtg taaactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg 600
^ atatggggtg atggaagcac agactataat tcagctctca aatccagact atcgatcacc 660
aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca 720
gccagatact actgtgcccg agatggttat agtaactttc attactatgt tatggactac 780
55 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tct 813
< 210 > 4 <211> 271 <212 > PRT 60 <213> Seqüência artificial <2 2 O >
<223> Polipeptídeo sintético <2 2 0 >
<223> anti-CD28 (2el2) LH (AA) < 2 2 0 >
<221> raisc_característica
<222> (1)..(23)
<223 > Líder
<22 0 >
<221> misc_característica
<222> (24)..(135)
<22 3 > VL
<22 0>
<2 21> misc__car ac ter í stica
<222 > (136) . . (150)
<223 > Ligante
<2 2 0>
<221> misc_caracteristica
<222 > (151) . . (271)
<223 > VH
<400> 4
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15
35
40
Val Ile Met Ser Arg Gly Val Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 25 30
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala 40 45
Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn 45 65 70 75 80
50
Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 85 90 95
55
Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met 100 105 HO
Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125
6 0 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155
5
160
Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly 165 170 175
10
Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly 180 185 190
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp 195 200 205
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser 210 215 220
Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr 225 230 235 240
25
30
Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Asn Phe His Tyr Tyr 245 250 255
Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 260 265 270
< 210 > 5
< 211> 828
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
40 <22 0 >
<223 > Polinucleotídeo sintético
<22 0 >
< 22 3 > anti-CD2 8 (2el2) HL (DNA)
45
50
55
60
:4 0 0 > 5
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60 agaggagtcc aggtgcagct gaaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 120 ctgtccatca catgcaccgt ctcagggttc tcattaaccg gctatggtgt 'aaactgggtt 180 cgccagcctc caggaaaggg tctggagtgg ctgggaatga tatggggtga tggaagcaca 240 gactataatt cagctctcaa atccagacta tcgatcacca aggacaactc caagagccaa 300 gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccagatacta ctgtgcccga 360 gatggttata gtaactttca ttactatgtt atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 420 accgtctcct ctgggggtgg aggctctggt ggcggtggat ccggcggagg tgggtcgggt 480 ggcggcggat ctgacattgt gctcacccaa tctccagctt ctttggctgt gtctctaggt 540 cagagagcca 5 ccatctcctg cagagccagt gaaagtgttg aatattatgt cacaagttta 600 atgcagtggt accaacagaa accaggacag ccacccaaac tcctcatctc tgctgctagc 660 aacgtagaat ctggggtccc tgccaggttt a^tggcagtg ggtctgggac agactttagc 720 ctcaacatcc atcctgtgga ggaggatgat attgcaatgt atttctgtca gcaaagtagg 780 aaggttccat ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaacgt 828
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<210 > 6 < 211 > 276 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <2 2 0 > <223 > Polipeptídeo sintético <2 2 0 > <223 > anti-CD28 (2el2) HL (AA) <2 2 0 > <221 > misc característica < 22 2 > (1) .. (23) <223 > Líder <220> <221> misc característica <222 > (24) . . (144) <223 > VH < 22 0 > <2 21 > misc_característica <2 22 > (145) . . (164) < 223 > Ligante <2 2 0 > <221 > misc_característica < 222 > (165) . . (276) <223 > VL <4 0 0 > 6
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Val Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro 25 30
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 40 45
6 0 Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Xle Trp Gly Asp Gly Ser Thr 65 70 75 80
5
Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn 85 90 95
10
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp 100 105 HO
Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Asn Phe His Tyr 115 120 125
Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
25
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 165 170 175
3 0 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 180 185 190
Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 195 200 205
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser 210 215 220
40
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser 225 230 235 240
45
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys 245 250 255
0 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 260 265 270
Glu Ile Lys Arg 55 275
<210 > 7
<211> 30
6 0 <212> DNA
<213> Seqüência artificial 10
25
40
55
< 22 0 >
<223> Iniciador sintético <22 0 >
<223> GSPl de Cadeia pesada <400 > 7
aggtgctgga ggggacagtc actgagctgc 3 0
< 210 > 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
< 2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
< 22 0 >
<223> Cadeia Pesada aninhada
<4 00 > 8
gtcacwgtca ctgrctcagg gaartagc 2 8
< 210 > 9
< 211> 33 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220 >
<223 > Iniciador sintético
<220 >
<223> Light Chain GSPl
<4 00 > 9
gggtgctgct catgctgtag gtgctgtctt tgc 33
< 210 > 10 <211> 32 <212> DNA 45 <213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Iniciador sintético
50 <2 20 >
<223> Cadeia Leve aninhada
< 4 00 > 10
caagaagcac acgactgagg cacctccaga tg 32
<210 > 11
<211> 36
<212> DNA
60 <213> Seqüência artificial 10
15
20
35
50
<22 0 >
<223> Iniciador sintético <22 0 >
<223> Iniciador de ancoragem de Raça reduzida <22 0 >
<221> misc_característica
< 2 2 2 > (24) . . (25)
<223> η is a, c, g, or t
<22 0>
<221> misc__carac ter í stica
<222 > (29) . . (30)
<223> nisa, c, g, ort
<22 0 >
<221> misc_característica
<2 2 2 > (34) . . (35)
<223> η is a, c, g, or t
<4 Q0> 11
ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 3 6
< 210 > 12 <211> 20
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Iniciador sintético
<22 0 >
<223> T7 iniciador
<400 > 12
gtaatacgac tcactatagg 2 0
40 <210 > 13
<211> 18
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
45 <22 0 >
<223> Iniciador sintético
<22 0 >
<223> M13 iniciador reverso
<4 0 0 > 13
caggaaacag ctatgacc ig
55 <210 > 14 <211> 15 <212 > PRT <213> Homo sapiens
60 <22 0 >
<223> Domínio de dobradiça de IgGl humana <4 00> 14
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 10 15
<210 > 15
<211> 46
<212 > DNA
<213> Homo sapiens
15
20
25
35
40
45
50
55
60
<220>
<22 3 > hVK3L-F3H3 <4 0 0> 15
gcgataaagc ttgccgccat ggaagcacca gcgcagcttc tcttcc 46
<210 > <211 > <212> <213 > 16 50 DNA Homo sapiens <2 2 0 > <2 2 3 > hVK3LF2 <4 Q0> 16 accagcgcag cttctcttcc tcctgctact <210 > <211> <212 > <213 > 17 45 DNA Homo sapiens <220> <22 3 > hVK3 LFl2HVL <4 0 0 > ggctcc 17 caga taccaccggt caaattgttc <210 > <211> <212 > <213 > 18 35 DNA Seqüência artificial <22 0> <22 3 > Iniciador sintético <22 0 > <223 > 2H7VHNheF <4 0 0 > 18 gcgatagcta gccaggctta tctacagcag <210> 19
50
45
35
<211> 43 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético <22 O >
<22 3 > G4SNheR
<4 0 0 > 19
gcgatagcta gccccacctc ctccagatcc accaccgccc gag 43
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
2 0 <22 3> Iniciador sintético < 2 2 0 >
< 2 2 3 > 015VHXhoR
<4 0 0 > 20
gcgtactcga ggagacggtg accgtggtcc ctgtg 35
<210> 21
< 211 > 37
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
3 5 <223> Iniciador sintético <220>
<223> GlHC-Xho
40 <4 0 0 > 21
gcagtctcga gcgagcccaa atcttgtgac aaaactc 37
<210> 22
45 <211 > 37
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
0 <223> Iniciador sintético <22 0 >
<22 3 > GlH-S-Xho
55 <4 0 0 > 22
gcagtctcga gcgagcccaa atcttctgac aaaactc 37
<210 > 23
60 <211 > 36
<212 > DNA <213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Iniciador sintético
5
<220>
<22 3 > CH3RECOR1
<400> 23
gcgtgagaat tcttacccgg agacagggag aggctc 36
<210 > 24
<211> 32
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0>
<223> Iniciador sintético
20
35
50
<2 2 0 >
<22 3 > Gl XBZ-R
<4 0 0 > 24
gcgacgtcta gagtcattta cccggagaca gg 3 2
<210 > 25
<211> 54
3 0 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0>
<223> Iniciador sintético
<22 0>
<22 3 > G4SLinkRl-S
<400> 25
4 0 aattatggtg gcggtggctc gggcggtggt ggatctggag gaggtgggag tggg 54
<210 > 26
<211> 54
4 5 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Iniciador sintético
<22 0 >
<2 2 3 > G4SLinkRl-AS
<4 0 0 > 26
55 aattcccact cccacctcct ccagatccac caccgcccga gccaccgcca ccat 54
<210 > 27
<211> 36
6 0 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial 10
<22 0 >
<223> Iniciador sintético <220>
<223 > 2E12VLXbaR <4Q0> 27
gcgtgtctag attaacgttt gatttccagc ttggtg 36
<210 > 28 <211> 35 <212 > DNA <213 > <22 0 > Seqüência artificial <22 3 > Iniciador sintético <220 > <223 > 2E12VLR1F <4 0 0 > 28 gcgatgaatt ctgacattgt gctcacccaa <210 > 29 <211 > 34 <212 > DNA <213 > <2 2 0 > Seqüência artificial <223 > Iniciador sintético <22 0> < 22 3 > 2E12VHR1F <4 0 0 > 29 40 gcgatgaatt ctcaggtgca gctgaaggag <210 > 30 <211> 37 <212 > DNA 45 <213 > < 22 0 > Seqüência artificial <22 3 > Iniciador sintético 50 <2 2 0 > <223 > 2El2VHXbaR <4 0 0 > 30 55 gcgagtctag attaagagga gacggtgact <210> 31 <211 > 27 <212 > DNA 60 <213 > Seqüência artificial
35
34
37 10
15
30
45
55
60
<22 0 >
<22 3 > Iniciador sintético < 2 2 0 >
<223> 2el2VHdXbaFl <4 00 > 31
gggtctggag tggctgggaa tgatatg 27
<210 > 32 <211> 28 < 212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3 > Iniciador sintético < 2 2 0 >
2 0 <223> 2 el2VHdXbaRl
<4 00 > 32
attcccagcc actccagacc ctttcctg 28
25
<210 > 33
< 211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<22 3> Iniciador sintético <220>
<2 2 3 > IgBsrGlF
<400 > 33
gagaaccaca ggtgtacacc ctg 23
40
<210 > 34 <211> 25 <212> DNA
<213> Seqüência artificial < 2 2 0 >
<223> Iniciador sintético <22 0 >
50 <223 > IgBsrGlR
<4 00> 34
gcagggtgta cacctgtggt tctcg 25
<210 > 35
<211> 17
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <2 2 0 > <223> Iniciador sintético <2 2 O >
<223 > M13R
5
<4 OO > 35
caggaaacag ctatgac 17
<210 > 36
<211> 18
< 212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<2 23> Iniciador sintético
<2 2 0 >
<223 > M13F
<400> 36
gtaaaacgac ggccagtg 18
20
< 210 > 37
<211> 20
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
35
50
<2 2 0 > <223 > T7
<4 00> 37
gtaatacgac tcactatagg 2 0
40 <210 > 38 <211> 17 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
45 <2 2 0 >
<22 3> Iniciador sintético
< 2 2 0 >
<2 23 > pDl8F-17 <4 0 0 > 38
aactagagaa cccactg 17
55 <210 > 39 <211> 20 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
60 <2 2 0 >
<223> Iniciador sintético <220 >
<22 3 > pD18F-20
<4 00> 39
gctaactaga gaacccactg 2 0
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético <2 2 0 >
<2 2 3 > pD18F-l
<4 0 0 > 40
atacgactca ctataggg 18
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
3 0 <22 3> Iniciador sintético
<220 >
<223 > pD18R-s
<4 0 0 > 41
gctctagcat ttaggtgac 19
<210 > 42
40 <211> 18
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
4 5 <223> Iniciador sintético
<22 0 >
<2 2 3 > CH3seqFl
50 <4 0 0 > 42
catgaggctc tgcacaac 18
<210 > 43
55 <211> 18
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
6 0 <223> Iniciador sintético <22 O >
<2 2 3 > CH3seqF2
<4 O O > 43 cctctacagc aagctcac
<210 > 44
<211> 19
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<220 >
<223 > Iniciador sintético <22 0 >
< 2 23 > CH3seqRl
15
<4 00 > 44
2 0 ggttcttggt cagctcatc 19
< 210 > 45 <211> 18 2 5 <212 > DNA
<213 > Seqüência artificial
<22 0 >
<2 23> Iniciador sintético
30
45
60
< 22 0 >
<22 3 > CH3 seqR2
<4 00> 45
3 5 gtgagcttgc tgtagagg 18
< 210 > 46
<211> 51
4 0 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<220 >
<223> Iniciador sintético <220>
< 2 23 > Ll-IlR
<4 00 > 46
50 gcgatagaat tcccagatcc accaccgccc gagccaccgc caccataatt c 51
<210 > 47
<211> 36
5 <212> DNA
<213 > Seqüência artificial
<2 20 >
<223> Iniciador sintético
<220> <22 3 > L1-6R
<400> 47
gcgatagaat tcccagagce accgccacca taattc 36
5
<210 > 48
<211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Iniciador sintético
< 2 2 0 >
<2 2 3 > L3R
<4 00> 48
gcgtatgaat tccccgagcc accgccaccc ttacccggag acagg 45
20
<210> 49
<211> 49
<212> DNA
2 5 <213> Seqüência artificial
< 2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
<2 2 0 >
<2 2 3 > L4R
<4 0 0 > 49
gcgtatgaat tcccagatcc accaccgccc gagccaccgc cacccttac 49
35
< 210 > 50
<211> 44
<212 > DNA
40 <213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
45 <22 0 >
<22 3 > L5R
50
<4 00> 50
gcgtatgaat tcccgctgcc tcctccccca gatccaccac cgcc 44
<210> 51 < 211> 23 <212> DNA
55 <213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Iniciador sintético
60 <22 0 > <22 3 >
IgBsrGlF <400> 51
gagaaccaca ggtgtacacc ctg 23
<210 > 52 <211 > 50 <212 > DNA < 213 > Seqüência artificial <22 0 > <223 > Iniciador sintético <22 0> <22 3 > L-CPPCPR < 4 0 0 > 52 gcgatagaat tcggacaagg tggacacccc ttacccggag <210 > 53 <211 > 41 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <22 0 > <223 > G281LH-NheR < 22 0 > <223 > Iniciador sintético <4 0 0 > 53 actgctgcag ctggaccgcg ctagctccgc cgccacccga < 210 > 54 <211 > 40 <212 > DNA < 213 > Seqüência artificial 40 < 22 0 > <223 > Iniciador sintético <2 2 0 > 45 <223 > G281LH-NheF <400> 54 ggcggagcta gcgcggtcca gctgcagcag tctggacctg 50 <210> 55 <211 > 37 <212 > DNA < 213 > Seqüência artificial 55 < 22 0 > <223 > Iniciador sintético <220> 60 <2 23 > G281-LH-LPinF
50
41
40 10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
20/267
<400> 55
gcgatcaccg gtgacateca gatgactcag tctccag
<210 > 56 < 211 > 37 < 212 > DNA <213 > Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Iniciador sintético <22 0 >
<22 3> G28I-LH-HXhoR <4 00> 56
gcgatactcg aggagacggt gactgaggtt ccttgac
< 210 > 57 < 211 > 38 < 212 > DNA < 213 > Seqüência artificial < 2 2 0 > <223 > Iniciador sintético <22 0 > <223 > G281-LH-LEcoF <4 0 0 > 57
gcgatcgaat tcagacatcc agatgactca gtctccag
<210 > 58 <211> 43 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial < 2 2 0 > < 2 2 3 > Iniciador sintético < 2 2 0 > < 2 2 3 > G281-LH-HXbaR <4 00 > 58
gcgattctag attaggaaga gacggtgact gaggttcctt gac
< 210 > 59 < 211 > 37 < 212 > DNA <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Iniciador sintético <220 >
<223 > G281-HL-HF <400> 59 gcgataaccg gtgcggtcca gctgcagcag tctggac 37
<210> 60
<211> 52
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
<22 3> Iniciador sintético < 22 0 >
<223 > G281-HL-HR3
<400> 60
gacccaccac cgcccgagcc accgccacca gaagagacgg tgactgaggt tc 52
< 210 > 61
< 211> 49
< 212 > DNA
<213> Seqüência artificial <■22 0>
<22 3> Iniciador sintético
< 22 0 >
<223 > G281-HL-HR2
<4 00 > 61
actcccgcct cctcctgatc cgccgccacc cgacccacca ccgcccgag 4 9
<210> 62 <211> 42
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
4 0 <22 3> Iniciador sintético <2 2 0 >
<223> G28I-HL-HNheR
45 <4 0 0 > 62
gagtcatctg gatgtcgcta gcactcccgc ctcctcctga tc 42
<210> 63
50 <211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
55 <2 23> Iniciador sintético <220>
<2 23 > G281-HL-LNheF
60 <4 0 0 > 63
atcaggagga ggcgggagtg ctagcgacat ccagatgact cagtc 45 10
15
25
40
55
<210> 64 < 211 > 37 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial < 22 0 > <223 > Iniciador sintético <22 0 > < 22 3 > G2 81-HL-LXhoR <4 0 0 > 64 gcgatactcg agcctttgat ctccagttcg < 210 > 65 <211 > 42
37
2 0 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223 > Iniciador sintético < 22 0 >
<22 3> G28I-HL-LXhoR
<4 0 0 > 65
3 0 gcgatatcta gactcaacct ttgatctcca gttcggtgcc tc 42
35
<210 > 66 <211 > 37 <212 > DNA < 213 > Seqüência artificial
<220>
<2 23> Iniciador sintético <2 2 0 >
<223> G281-HL-EcoF
<4 00 > 66
45 gcgatagaat tcgcggtcca gctgcagcag tctggac 37
50
< 210 > 67 <211> 40 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <220> <223 > Iniciador sintético <220>
<2 2 3 > 194-LH-LFl
<4 0 0 > 67
60 gcgtatgaac cggtgacatc cagatgacac agactacatc 40 <210 > 68
< 211> 50
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
<22 0 >
<223 > 194-LP2
15
40
<4 00 > 68
atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag 50
<210> 69
<211> 52
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
< 22 0 >
<22 3 > 194-LF3
<4 00> 69
3 0 gtctgcctct ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg ac 52
<210> 70
< 211> 50
3 5 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<2 23> Iniciador sintético
< 2 2 0 >
<223 > 194-LF4
<4 0 0 > 70
4 5 gttgcagggc aagtcaggac attcgcaatt atttaaactg gtatcagcag 5 0
<210 > 71
<211> 50
0 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
55
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético <22 0 >
<223 > 194-LF5
<4 00> 71
60 atttaaactg gtatcagcag aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc 50 <210 > 72
<211> 50
< 212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Iniciador sintético
<22 0 >
<22 3 > 194-LF6
15
30
45
<4 0 0 > 72
gaactgttaa actcctgatc tactacacat caagattaca ctcaggagtc 50
<210 > 73
<211> 52
<212> DNA
< 213 > Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Iniciador sintético
<22 0 >
<22 3 > 194-LF7
<400 > 73
caagattaca ctcaggagtc ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga ac 52
<210 > 74
<211> 52
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0>
<223 > Iniciador sintético
40 <22 0 >
<2 2 3 > 194-LR7
<400> 74
caggttggca atggtgagag aataatctgt tccagaccca ctgccactga ac 52
<210 > 75
< 211> 50
<212 > DNA
50 <213> Seqüência artificial
<220 >
<223> Iniciador sintético
55 <220>
<223 > 194-LR6
60
<4 0 0 > 75
gcaaaagtaa gtggcaatat cttctggttg caggttggca atggtgagag 50 <210> 76
<211> 51
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
5
<22 O >
<22 3> Iniciador sintético
<220 >
< 22 3 > 194-LR5
<4 00> 76
gaacgtccac ggaagcgtat taccctgttg gcaaaagtaa gtggcaatat c 51
15
<210 > 77
< 211> 52 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220 >
<22 3> Iniciador sintético
< 2 2 0 >
<223 > 194-LR4
<4 0 0 > 77
cgtttggtta ccagtttggt gcctccaccg aacgtccacg gaagcgtatt ac 52
20
35
30
<210 > 78
<211> 46
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<22 3> Iniciador sintético <220>
40 <223 > 194-LR3
<4 00 > 78
accaccgccc gagccaccgc caccccgttt ggttaccagt ttggtg 46
50
45
< 210 > 79 <211> 50 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<22 3> Iniciador sintético
<22 0 >
55 <223 > 194-LR2
<4 00 > 79
gctagcgctc ccacctcctc cagatccacc accgcccgag ccaccgccac 50
60
<210 > 80 10
25
40
55
<211> 42
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Iniciador sintético <2 2 0 >
<223 > 194-LH-LRl
<400 > 80
gttgcagctg gacctcgcta gcgctcccac ctcctccaga tc 42
<210 > 81
<211> 54
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Iniciador sintético
<220>
<223 > 194-LH-HFl <4 0 0 > 81
gatctggagg aggtgggagc gctagcgagg tccagctgca acagtctgga cctg 54
<210 > 82
<211> 50
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Iniciador sintético
<220>
<22 3 > 194-HF2
<4 0 0 > 82
agctgcaaca gtctggacct gaactggtga agcctggagc ttcaatgaag 50
45 <210> 83
<211> 50
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
50 < 22 0 >
<22 3> Iniciador sintético
<22 0>
<22 3 > 194-HF3
<4 0 0 > 83
agcctggagc ttcaatgaag atttcctgca aggcctctgg ttactcattc 50
60 <210 > 84 <211> 53 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
< 22 O >
<22 3> Iniciador sintético <22 O >
< 22 3 > 194-HF4 <4 0 0 > 84
gcaaggcctc tggttactca ttcactggct acatcgtgaa ctggctgaag cag 53
<210 > 85
<211> 52
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
2 0 <22 3> Iniciador sintético
<220 >
<223 > 194-HF5
<4 0 0 > 85
atcgtgaact ggctgaagca gagccatgga aagaaccttg agtggattgg ac 52
<210 > 86
< 211 > 52
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
< 2 2 0 >
3 5 <22 3> Iniciador sintético
< 22 0 >
<223 > 194-HF6
40 <4 00 > 86
gaaccttgag tggattggac ttattaatcc atacaaaggt cttactacct ac 52
<210 > 87
45 <211> 52
<212> DNA
< 213 > Seqüência artificial <22 0 >
0 <22 3> Iniciador sintético
< 2 2 0 >
<223 > 194-HR6
55 <4 0 0 > 87
aatgtggcct tgcccttgaa tttctggttg taggtagtaa gacctttgta tg 52
< 210 > 88
60 < 211> 52
<212 > DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético
5
<2 2 O >
<223 > 194-HR5 <4 O O > 88
catgtaggct gtgctggatg acttgtctac agttaatgtg gccttgccct tg 52
<210> 89 <211 > 55 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial
20
35
50
< 22 0 >
<223> Iniciador sintético < 22 0 >
<223 > 194-HR4
<400> 89
actgcagagt cttcagatgt cagactgagg agctccatgt aggctgtgct ggatg 55
30
<210 > 90 <211 > 52 <212 > DNA < 213 > Seqüência artificial
< 2 2 0 >
<223> Iniciador sintético <22 0 >
< 22 3 > 194-HR3
<400> 90
4 0 accatagtac ccagatcttg cacagtaata gactgcagag tcttcagatg tc 52
45
<210 > 91 < 211 > 52 < 212 > DNA < 213 > Seqüência artificial <2 2 0 > <2 2 3 > Iniciador sintético < 22 0 >
<223 > 194-HR2
<4 00 > 91
55 gcgccccaga catcgaagta ccagtccgag tcaccatagt acccagatct tg 52
<210> 92
<211> 52
6 0 <212> DNA
<213> Seqüência artificial 10
< 22 0 >
<22 3 > Iniciador sintético <2 2 0 >
< 22 3 > 194-LH-HRl <4 0 0 > 92
gcgaatactc gaggagacgg tgaccgtggt ccctgcgccc cagacatcga ag 52
<210 > 93 <211 > 42 < 212 > DNA <213 > < 2 2 0 > Seqüência artificial < 223 > Iniciador sintético <22 0 > <223 > 194-HL-HFl <4 0 0 > 93 gcgtatgaac cggtgaggtc cagctgcaac < 210 > 94 < 211 > 55 <212 > DNA <213 > < 2 2 0 > Seqüência artificial <223 > Iniciador sintético <22 0 > < 22 3 > 194-HL-HRl <400 > 94 40 accgccacca gaggagacgg tgaccgtggt < 210 > 95 <211 > 52 <212 > DNA 45 <213 > < 22 0 > Seqüência artificial < 22 3 > Iniciador sintético 50 <2 2 0 > <223 > 194-HL-HRO <4 00 > 95 55 acctcctcca gatccaccac cgcccgagcc <210 > 96 <211> 49 < 212 > DNA 60 <213 > Seqüência artificial
42
55
52 <22 0 > <223 > Iniciador sintético < 22 0 > <223 > 194-HL-LFl <4 0 0 > 96 gcgggggagg tggcagtgct agcgacatcc agatgacaca < 210 > 97 <211> 34 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Iniciador sintético <22 0 > <22 3 > 194-HL-LR3Xho <4 0 0 > 97 gcgaatactc gagcgtttgg ttaccagttt ggtg <210> 98 <211> 37 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial < 22 O > < 22 3 > Iniciador sintético < 22 0 > < 22 3 > 194-HL-LR3Xba <400 > 98 gcgatatcta gattaccgtt tggttaccag tttggtg 40 <210 > 99 <211 > 43 <212> DNA < 213 > Seqüência artificial 45 <2 2 0 > <223 > Iniciador sintético <220> 50 < 22 3 > 194-HL-HFlRl <4 0 0 > 99 gcgtatgaga attcagaggt ccagctgcaa cagtctggac 55 <210 > 100 <211 > 41 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial 60 <22 0 >
49
34
37
43 5
20
35
40
60
<22 3> Iniciador sintético <2 2 0 >
<223 > 194 -LH-LFlRl <400 > 100
gcgtatgaga attctgacat ccagatgaca cagactacat c 41
<210 > 101
<211> 54
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
< 2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
< 22 0 >
<223> 194-LH-HRlXba
<4 0 0 > 101
gcgtatctag attaggagac ggtgaccgtg gtccctgcgc cccagacatc gaag 54
<210 > 102
<211> 725
<212> DNA
<213 > Seqüência artificial
<220>
<2 23> Polinucleotldeo sintético
<22 0 >
<223 > G28-1 VLVH (DNA)
<4 0 0 > 102
accggtgaca tccagatgac tcagtctcca gcctccctat ctgcatctgt gggagagact 6 0
gtcaccatca catgtcgaac aagtgaaaat gtttacagtt atttggcttg gtatcagcag 12 0 aaacagggaa aatctcctca gctcctggtc tcttttgcaa aaaccttagc agaaggtgtg 180 ccatcaaggt tcagtggcag tggatcaggc acacagtttt ctctgaagat cagcagcctg 24 0
45 cagcctgaag attctggaag ttatttctgt caacatcatt ccgataatcc gtggacgttc 3 00
ggtggaggca ccgaactgga gatcaaaggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 3 60
Çjgcggcggat ctgctagcgc agtccagctg cagcagtctg gacctgagct ggaaaagcct 420
50
ggcgcttcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggttact cattcactgg ctacaatatg 480
aactgggtga agcagaataa tggaaagagc cttgagtgga ttggaaatat tgatccttat 54 0
55 tatggtggta ctacctacaa ccggaagttc aagggcaagg ccacattgac tgtagacaaa 600
tcctccagca cagcctacat gcagctcaag agtctgacat ctgaggactc tgcagtctat 660
tactgtgcaa gatcggtcgg ccctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 720
tcgag 725 10
30
50
<210 > 103
< 211> 239
<212 > PRT
<213 > Seqüência artificial <22 0 >
<223> Polipeptídeo sintético <220 >
<223 > G-28-1 VLVH (AA)
<220>
<2 21> misc_caracterIstica
<222> (1) . . (107)
<223 > VL
<220>
2 0 <221> misc_característica
<222 > (108) . . (124)
<223 > Ligante
< 22 0 >
2 5 <221> misc_característica
<2 22 > (125) . . (239)
<223 > VH
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
3 5 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 40 35 40 45
Ser Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
45
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Gln His His Ser Asp Asn Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 55 100 105 110
Gly Gly Gly Gly 115
60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ala Val Gln Leu 120 125 Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile 130 135 140
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp 145 150 155 160
Val Lys Gln Asn Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp 165 170 175
15
20
Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Arg Lys Phe Lys Gly Lys Ala 180 185 190
Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys 195 200 205
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val 210 215 220
2 5 Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 225 230 235
< 210 > 104 < 211 > 767
< 212 > DNA
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
3 5 <223> Polinucleotídeo sintético <220>
<223 > G28-1 VHVL (DNA)
40 <4 0 0 > 104 accggtgagg tccagctgca acagtctgga cctgaactgg tgaagcctgg agcttcaatg 60 aagatttcct gcaaggcctc tggttactca ttcactggct acatcgtgaa ctggctgaag 120 45 cagagccatg gaaagaacct tgagtggatt ggacttatta atccatacaa aggtcttact 180 acctacaacc agaaattcaa gggcaaggcc acattaactg tagacaagtc atccagcaca 240 50 gcctacatgg agctcctcag tctgacatct gaagactctg cagtctatta ctgtgcaaga 300 tctgggtact atggtgactc ggactggtac ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc 360 accgtctcct ctggtggcgg tggctcgggc ggtggtggat ctggaggagg tgggagcggg 420 55 ggaggtggca gtgctagcga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 480 ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattcgcaa ttatttaaac 540 60 tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctactacac atcaagatta 600 cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 660 attgccaacc tgcaaccaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 720 ccgtggacgt tcggtggagg caccaaactg gtaaccaaac gctcgag 767
<210> 105 <211> 253 <212 > PRT <213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<2 2 3> PolipeptIdeo sintético
<2 2 0 >
<223 > G28-1 VHVL (AA)
<220>
<221> misc_característica <222> (1)..(121) <223> VH
<2 2 0 >
<221> misc_característica <2 22 > (122) . . (144) <223> Ligante
<220>
<2 21> misc_característica <222> (145)..(253) <223 > VL
<4 0 0 > 105
3 5 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 40 20 25 30
Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 40 45
45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
50
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
5 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 60 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser 130 135 140
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 145 150 155 160
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 165 170 175
20
25
45
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 180 185 190
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro 210 215 220
3 0 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val Thr Lys Arg Ser 245 250
<210 > 106 <211> 749
4 0 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> PolinucIeotídeo sintético <220 >
<223 > G19-4 VLVH (DNA)
50 <4 00 > 106 accggtgaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attcgcaatt atttaaactg gtatcagcag 55 aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc tactacacat caagattaca ctcaggagtc ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tgccaacctg caaccagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtggacgttc 60 ggtggaggca ccaaactggt aaccaaacgg ggtggcggtg gctcgggcgg tggtggatct
60 120 180 240 300 360 10
15
20
50
55
ggaggaggtg ggagcgctag cgaggtccag ctgcaacagt ctggacctga actggtgaag 420
cctggagctt caatgaagat ttcctgcaag gcctctggtt actcattcac tggctacatc 480
gtgaactggc tgaagcagag ccatggaaag aaccttgagt ggattggact tattaatcca 540
tacaaaggtc ttactaccta caaccagaaa ttcaagggca aggccacatt aactgtagac 600
aagtcatcca gcacagccta catggagctc ctcagtctga catctgaaga ctctgcagtc 660
tattactgtg caagatctgg gtactatggt gactcggact ggtacttcga tgtctggggc 720
gcagggacca cggtcaccgt ctcctcgag 749
<210 > 107 <211> 247 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220 >
<223> Polipeptideo sintético <22 0 >
<223> G-19-4 VLVH (AA) < 22 0 >
<221> misc_característica
<222> (1) . . (108)
<223 > VL
< 2 2 0 >
<221> misc_característica
<222 > (109) . . (125)
<223 > Ligante
<22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (126) . . (247)
4 0 <223 > VH
<4 0 0 > 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
45 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95
5
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val Thr Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110
10
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Glu Val Gln 115 120 125
Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys 130 135 140
Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn 145 150 155 160
Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile 165 170 175
25
Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys 180 185 190
30
Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 195 200 205
Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 210 215 220
Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 40 225 230 235 240
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245
45
50
55
60
60
<210> 108 <211 > 752 <212 > DNA < 2 13 > Seqüência artificial <2 2 0 > <223 > Polinucleotídeo sintético <22 0 > <22 3 > G19-4 VHVL (DNA) <4 00 > 108 accggtgagg tccagctgca acagtctgga aagatttcct gcaaggcctc tggttactca cagagccatg gaaagaacct tgagtggatt ggacttatta atccatacaa aggtcttact 180
acctacaacc agaaattcaa gggcaaggcc acattaactg tagacaagtc atccagcaca 24 0
' 5
gcctacatgg agctcctcag tctgacatct gaagactctg cagtctatta ctgtgcaaga 300
tctgggtact atggtgactc ggactggtac ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc 360
accgtctcct ctggtggcgg tggctcgggc ggtggtggat ctggaggagg tgggagcgct 420
agcgacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 480
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt cgcaattatt taaactggta tcagcagaaa 540
15
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac tacacatcaa gattacactc aggagtccca 600
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattgc caacctgcaa 660
ccagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgtg gacgttcggt 720
ggaggcacca aactggtaac caaacgctcg ag 752
<210 > 109 <211> 248 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Polipeptídeo sintético
<220>
<223 > G19-4 VHVL (AA) <2 2 0 >
<221> misc_característica
<222> (1) . . (122)
<2 2 3 > VH
<22 0 >
<221> misc_característica
< 222 > (123 ) . . (139) <2 2 3 > Ligante
<22 0 >
< 221> misc_característica <222 > (140) . . (248)
< 2 2 3 > VL
<4 00 > 109
35
40
45
50
55
60
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 25 30
Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
10
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr 130 135 140
25
Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
30
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 165 170 175
3 5 Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg 180 185 190
Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 40 195 200 205
Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
210 215 220
45
Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
50
Thr Lys Leu Val Thr Lys Arg Ser 245
55 <210 > 110
<211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
60 <22 0 > < 22 3 >
Iniciador sintético <220>
<221> misc_característica
<22 3 > SSC(s)-hlgGl (DNA)
5
<400> 110
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgtgctca 45
<210 > 111
<211> 15
<212> PRT
<213 > Seqüência artificial <22 0>
<223> Peptídeo sintético
<22 0 >
<221> misc_característica 2 0 <223> ssc(s)-hlgGl (AA)
<4 0 0 > 111
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15
<210 > 112
<211> 45
3 0 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
35
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético <22 0 >
<221> misc_caracteristica
<223 > scc(s)-hlgGl (DNA)
40 <4 0 0 > 112
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgtccaccgt gctca 45
<210 > 113
45 < 211 > 15
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
50 <223> Peptídeo sintético
<22 0>
<221> misc_característica
55 <223> scc (s)-hlgGl (AA)
<4 0 0 > 113
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 60 1 5 10 15 10
30
35
<210> 114
< 211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
<22 0>
<221> misc_característica <223 > css(s)-hlgGl (DNA)
<4 00> 114
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tctccaccgagctca 45
< 210 > 115
<211 > 15
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> peptídeo sintético <220>
<221> misc_característica
<22 3> css(s)-hlgGl (AA)
<40 0> 115
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser 10 15
<210 > 116 <211> 45 <212 > DNA 40 <213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3 > Polinucleotídeo sintético
45
< 2 2 0 >
<221> misc_característica < 2 2 3 > scs(s)-hlgGl (DNA)
50 <4 0 0 > 116
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgtccaccga gctca 45
<210 > 117
55 <211> 15 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
60 <223> Peptídeo sintético 10
15
<220>
<221> misc_característica <22 3> scs(s)-hlgGl (AA)
<400 > 117
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser 10 15
<210 > 118
<211> 45
<212 > DNA
<213 > Seqüência artificial <220>
<223> Iniciador sintético
<4 0 0 > 118
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgtccaccgt gctca 45
< 210 > 119
<211 > 15
<212 > PRT
<213 > Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Peptídeo sintético
<400> 119
3 5 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 10 15
<210 > 120
40 <211 > 45
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
45 <223> Iniciador sintético
<40 0> 120
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgtccaccgt gccca
50
<210 > 121 <211 > 15 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <220 > < 22 3 > Peptídeo sintético <4 0 0 > 121 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 10 15
5
<210> 122 <211 > 45 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <220 > < 223 > Iniciador sintético <400> 122
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccga gccca 45
<210 > 123
<211> 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220 >
<223> Feptídeo sintético <4 0 0 > 123
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 10 15
25
30
35
40
<221> misc_característica
<223 > CSC(p)-hlgGl (DNA)
<4 00 > 124
45 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tctccaccgt gccca 45
<210 > 124 < 211 > 45 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <22 0 > < 2 23 > Iniciador sintético <22 0 >
< 210 > 125
< 211> 15 50 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
55
60
< 2 2 0 >
<223> Peptídeo sintético
< 2 2 0 >
<221> misc_característica
<223 > csc(p)-hlgGl (AA)
<4 00 > 125 10
15
35
40
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 10 15
<210 > 126
<211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Iniciador sintético
< 22 0 >
<221> misc_característica <223 > ssc(p)-hlgGl (DNA)
<4 0 0 > 126
gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccgt gccca 45
< 210 > 127
<211 > 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Peptídeo sintético <22 0 >
<221> misc_característica
<22 3 > ssc(p)-hlgGl (AA)
<4 0 0 > 127
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 10 15
<210 > 128
<211> 45
<212> DNA
45 <213> Seqüência artificial
. <22 0>
<223> Iniciador sintético
50 <220>
<221> misc_característica
<22 3 > scc(p)-hlgGl (DNA)
<4 0 0 > 128
55 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgtccaccgt gccca 45
<210> 129
<211> 15
60 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial 10
30
35
<22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético <22 0 >
<221> misc_característica
<2 2 3 > scc(p)-hlgGl (AA)
<4 0 0 > 129
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 10 15
<210 > 130 <211> 45 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<22 3> Iniciador sintético
<22 0 >
<221> misc_característica <22 3 > css(p)-hlgGl (DNA)
<400> 130
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tctccaccga gccca 4 5
<210 > 131 <211> 15 <212> PRT
<213 > Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Peptídeo sintético <22 0>
40 <2 21> misc_característica
<2 2 3 > css(p)-hlgGl (AA)
<4 0 0 > 131
4 5 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 10 15
<210 > 132
50 <211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
5 <22 3> Iniciador sintético <22 0 >
<2 21> misc_característica
<223 > ssc(p)-hlgGl (DNA)
60
<4 0 0 > 132 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgtccaccga gccca 45
<210> 133
<211> 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Peptideo sintético <22 0 >
<221> misc_característica
<22 3 > ssc(ρ)-hlgGl (DNA)
15
<4 0 0 > 133
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro
10 15
<210> 134
<211> 18
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial < 22 0 >
<221> misc_característica
<223 > ssc(p) (DNA)
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
<4 0 0 > 134
agttgtccac cgtgccca 18
35
20
25
<210> 135
<211> 6
<212 > PRT
40 <213 > Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Peptídeo sintético
45 <400 > 135
Ser Cys Pro Pro Cys Pro
50
55
<210> 136
<211> 7
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
<4 0 0 > 136 60 tgatcag 15
20
35
40
<210 > 137 <211> 2 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
<223> Peptideo sintético
<4 0 0 > 137
Asp Gln 1
<210 > 138
<211> 7
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
<4 0 0 > 138 ctcgagt
<210 > 139
<211> 2
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Peptideo sintético
<4 0 0 > 139
Ser Ser 1
<210 > 140
<211> 654
<212 > DNA
45 <213> Homo sapiens
<220 >
<223> hlgGl do tipo selvagem 50 <4 0 0 > 140
gcacctgaac tcctgggtgg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120 55 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300
60
cccatcgaga aaacaatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360 15
20
25
45
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 654
<210 > 141 <211 > 217 <212 > PRT <213 > Homo sapiens < 22 0 > < 22 3 > hlgGl do tipo <4 0 0 > 141
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 25 30
3 0 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80
40
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110
0 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 55 130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160
60 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
15
<210 > 142 <211> 654 <212> DNA
2 0 <213 > Homo sapiens
<22 0 >
<223 > hlgGl {P238S) <4 0 0 > 142
gcacctgaac tcctgggtgg atcgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 6 0
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120
3 0 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 24 0
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 3 00
35
cccatcgaga aaacaatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420
4 0 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 654
45
<210 > 143
50 <211> 217
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<220>
5 <223> hlgGl (P238S)
<4 0 0 > 143
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 60 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 25 30
5
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95
20
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110
25
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125
3 0 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175
40
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190
4 5 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 50 210 215
60
<210 > 144 <211 > 654 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens <22 0 > <22 3 > hlgGl (P331S <4 0 0 > 144 40
45
55
60
gcacctgaac tcctgggtgg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300 tccatcgaga aaacaatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 654
10
15
20
<210> 145
<211> 217
<212 > PRT
< 213 > Homo sapiens
<22 0 >
<223 > hlgGl (P331S:
<400 > 145
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 50 65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95
Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 HO
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 150
10
15
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190
2 0 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
<210 > 146
<211> 654
3 0 <212 > DNA
<213> Homo sapiens
< 2 2 0 >
<22 3 > hlgGl (P238S/P331S) <4 00 > 146
35
40
45
50
55
60 < 210 > 147 <211> 217
gcacctgaac tcctgggtgg atcgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 120 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180 ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 300 tccatcgaga aaacaatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 360 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atga 654 < 212 > PRT <213> Homo sapiens
<2 2 0 >
<223 > hlgGl (P238S/P331S) <400> 147
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95
Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 HO
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tvr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210 > 148
< 211> 60
<212 > DNA
<213 > Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Iniciador sintético
10
<2 2 0 >
<223 > STDl (DNA)
<4 00> 148
aattatggtg gcggtggctc gggcggtggt ggatctggag gaggtgggag tgggaattct 60
<210 > 149
<211> 20
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
25
35
<2 2 0 >
<223> peptídeo sintético
<22 0 >
<223 > STDl (AA)
<4 0 0 > 149
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 10 15
Ser Gly Asn Ser 20
40 <210 > 150
<211> 114
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
45 < 2 2 0 >
<223> Xniciador sintético
<220>
50 <2 2 3 > S TD 2 (DNA) <4 00> 150
aattatggtg gcggtggctc gggcggtggt ggatctggag gaggtgggag tgggaattat 60
5 ggtggcggtg gctcgggcgg tggtggatct ggaggaggtg ggagtgggaa ttct 114
<210> 151
< 211> 38
60 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial 10
30
55
60
<22 0 >
<223> Peptídeo sintético
<2 2 0 >
<2 2 3 > STD2 (AA)
<4 0 0 > 151
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 10 15
Ser Gly Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 25 30
Gly Gly Ser Gly Asn Ser 35
<210> 152
<211> 6
2 5 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<22 3> Iniciador sintético
<22 0 >
<223> Ligante Hl (PN)
<4 00 > 152 3 5 aattct
<210 > 153
<211> 2
40 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Peptldeo sintético
45
<220>
<223> Ligante Hl (AA)
50 <400> 153
Asn Ser 1
<210 > 154
<211> 24
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 > <2 2 3> Iniciador sintético <220>
<223 > Ligante H2 (PN) <4 OO > 154
ggtggcggtg gctcggggaa ttct 24
<210 > 155
<211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220 >
<223> Iniciador sintético
20
25
30
35
50
55
<220>
<2 2 3 > Ligante H2 (AA)
<400> 155
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn 1 5 < 210 > 156 <211 > 30 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <220> <223 > Iniciador sintético <220 >
<223 > Ligante H3 (PN)
<4 00> 156 4 0 aattatggtg gcggtggctc tgggaattct
<210 > 157
<211> 10
4 5 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223 > Peptideo sintético <22 0 >
<223 > Ligante H3 (AA) <400> 157
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser 10
60 <210 > 158 <211> 39 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 O >
<223> Iniciador sintético <2 2 O >
<223> Ligante H4 (PN) <4 0 0 > 158
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtggatct gggaattct 39
<210> 159 <211> 13 <212 > PRT <2 13 > Seqüência artificial <22 0 > <223 > Peptideo sintético <2 2 0 > <22 3 > Ligante H4 (AA) <4 00> 159
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser 10
30
<210 > 160 <211 > 45 < 2 12 > DNA <213 > Seqüência artificial <2 2 0 > <223 > Iniciador sintético <220 > <223 > Ligante H5 (PN) <4 00 > 160
aattatggtg gcggtggctc gggcggtggt ggatctggga attct
45
< 210 > 161 <211 > 15 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <220 > <223 > peptideo sintético <22 0 > <223 > Ligante H5 (AA) <4 00 > 161
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser 60 1 5 10 15 <210 > 162 <211> 54 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial
<220 >
<223> Iniciador sintético
<220 >
<223> Ligante H6 (PN)
15
35
60
<4 0 0 > 162
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtggatct gggggaggag gcagcgggaa ttct 54
<210 > 163 <211> 18 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial
<2 2 0 >
<2 23 > peptídeo sintético
< 22 0 >
<223 > Ligante H6 (AA)
<4 00 > 163
3 0 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 10 15
Asn Ser
<210> 164 <211 > 24 40 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <220 > <223 > Iniciador sintético 45 <220 > <22 3 > Ligante H7 (PN) <400> 164 50 gggtgt ccac cttgtccgaa ttct < 210 > 165 <211 > 8 55 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial < 2 2 0 > <223 > Peptídeo sintético
24
<22 0 > <223> Ligante Η7 (AA) <4 00> 165
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser
<210 > 166
<211> 45
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Iniciador sintético <220>
<223> Ligante(G4S)3 <4 00 > 166
ggtggcggtg gatccggcgg aggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210 > 167
<211> 12
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
3 0 <223> Peptideo sintético <22 0 >
<223 > Ligante(G4S)3
<4 0 0 > 167
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 10
40
<210 > 168
<211> 60
<212> DNA
<213 > Seqüência artificial
45
<220 >
<223 > Iniciador sintético <2 2 0 >
0 <2 23> Ligante(G4S)4
<4 0 0 > 168
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtggatct ggaggaggtg ggagcggggg aggtggcagt 60
55
60
<210 > 169
<211 > 17
<2 12 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 > 10
35
45
55
<223> Peptídeo sintético <2 2 0 >
<2 2 3 > Ligante(G4S)4 <4 QQ> 169
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 10 15
Ser
<210 > 170 <211> 2337 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético <2 2 0 >
<2 2 3 > 2H7sssIgGl-STDl-2el2HL (DNA) <4 0 0 > 170
aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60
gtcataatgt ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct 120
3 0 ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg 180
taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct 240 tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 300 agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca 360 cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt 420
4 0 ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagtcggtg 480
aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac 540 aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat 600 ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta 660 gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg 720
0 gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg 780
ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac acatccccac cgagctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt -cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020 60 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080
840 900 10
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa acaatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1260
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 13 8 0
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500
ccgggtaaga attatggtgg cggtggctcg ggcggtggtg gatctggagg aggtgggagt 1560
gggaattctc aggtgcagct gaaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 1620
ctgtccatca catgcaccgt ctcagggttc tcattaaccg gctatggtgt aaactgggtt 1680
20
cgccagcctc caggaaaggg tctggagtgg ctgggaatga tatggggtga tggaagcaca 1740
gactataatt cagctctcaa atccagacta tcgatcacca aggacaactc caagagccaa 1800
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccagatacta ctgtgctcga 1860
gatggttata gtaactttca ttactatgtt atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 1920
accgtctcct ctgggggtgg aggctctggt ggcggtggat ccggcggagg tgggtcgggt 1980
30
ggcggcggat ctgacattgt gctcacccaa tctccagctt ctttggctgt gtctctaggt 2040
cagagagcca ccatctcctg cagagccagt gaaagtgttg aatattatgt cacaagttta 2100
atgcagtggt accaacagaa accaggacag ccacccaaac tcctcatctc tgctgctagc 2160
aacgtagaat ctggggtccc tgccaggttt agtggcagtg ggtctgggac agactCtagc 2220
ctcaacatcc atcctgtgga ggaggatgat attgcaatgt atttctgtca gcaaagtagg 2280
aaggttccat ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaacgtta atctaga 2337
40
<210 > 171
45 <211 > 772
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
50 <223> polipeptídeo sintético <220 >
<223 > 2H7sssIgGl-STDl-2el2HL (AA)
55 <22 0 >
< 221> misc_característica
<222> (1)..(22)
<223 > Líder
60 <22 0 >
<221> misc característica 10
<222> (23)..(128 <2 2 3 > VL
<2 2 0 > <2 21> <222> <223>
<22 0> <221> <222 > <2 2 3 >
misc_caracteristica (129)..(144) Ligante
misc_caracterίstica
(145) . . (265) VH
15
<2 2 0 > <221> <22 2 > <223 >
misc_característica (268) . . (281) Dobradiça
20
<220> <2 21> <222> <22 3 >
misc_característica (500)..(519) Ligante de EFD-BD2
25
<220> <2 21> <2 2 2 > <223 >
misc_característica
(520)..(640) VH 2
30
<2 2 0 > <2 21> <22 2 > <223>
misc_característica (641)..(660) Ligante2
35
<220> <2 21 > <22 2 > <22 3 >
misc__caracteristica
(661) . . (772) VL 2
40
<4 0 0 > 171
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
45 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 50 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
55
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85
90
95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110
10
15
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
2 0 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205
30
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
35
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10
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20
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ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta 660
30
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ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960
40
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15
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35
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20
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20
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Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn 705 710 715 720
Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln 725 730 735
Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 45 740 745 750
Lys Arg
50
<210 > 184
<211> 2301
<212 > DNA
5 <213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Polinucleotideo sintético
60 <220>
<22 3 > 2H7sssIgGl-H2-2el2HL (DNA) <4 0 0 > 184
aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag gtcataatgt ccagaggaca aattgttctc ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg taccagcaga agcoaggatc ctcccccaaa
10
tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc
20
aataCgcact gggtaaagca gacacctaga ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag
2 5 gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag
gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat
30
acatccccac cgagcccagc acctgaactc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc
3 5 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg
40
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc
4 5 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag
0 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac
ccgggtaagg gtggcggtgg ctcggggaat
ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc
55
accggctatg gtgtaaactg ggttcgccag atgatatggg gtgatggaag cacagactat 60 accaaggaca actccaagag ccaagttttc
attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60
tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct 120
gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg 180
ccctggattt atgccccatc caacctggct 240
gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 300
tattactgcc agcagtggag ttttaaccca 360
ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt 420
tatctacagc agtctggggc tgagtcggtg 480
aaggcttctg gctacacatt taccagttac 540
cagggcctgg aatggattgg agctatttat 600
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ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960
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cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080
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cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1260
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ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 1800 10
acagccagat actactgtgc tcgagatggt tatagtaact ttcattacta tgttatggac 1860
tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctctgggg gtggaggctc tggtggcggt 1920 ggatccggcg gaggtgggtc gggtggcggc ggatctgaca ttgtgctcac ccaatctcca 198 0
gcttctttgg ctgtgtctct aggtcagaga gccaccatct cctgcagagc cagtgaaagt 2 04 0
gttgaatatt atgtcacaag tttaatgcag tggtaccaac agaaaccagg acagccaccc 2100
aaactcctca tctctgctgc tagcaacgta gaatctgggg tccctgccag gtttagtggc 2160 agtgggtctg ggacagactt tagcctcaac atccatcctg Cggaggagga tgatattgca 2 22 0 atgtatttct gtcagcaaag taggaaggtt ccatggacgt tcggtggagg caccaagctg 2280
gaaatcaaac gttaatctaga 2301
<210> 185
<211> 760
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Polipeptideo sintético
<2 2 0 >
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<221> misc__caracteri stica
<222> (1)..(22)
<22 3 > Líder
< 22 0 >
<22l> misc_característica
<222 > (23 ) . . (127)
<22 3 > VL
<22 0 >
<221> misc_característica
<222> (128) . . (144)
<223> Ligante
<22 0 >
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<2 2 3 > VH
<220>
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<220>
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<2 2 0 >
30
35
40
45
50
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<22 2 > (508) . . (628)
<223> VH2
<220>
<221> misc_característica
<222> (629)..(648)
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<22 0 >
<221> misc_característica
<22 2 > (649) . . (760)
<223> VL2
<4 0 0 > 185
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
20
35
55
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 25 30
2 5 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95
4 0 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 45 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
50
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
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5
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
10
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser 260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 275 280 285
25
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300
30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 340 345 350
40
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365
45
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 370 375 380
0 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 55 405 410 415
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 420 425 430
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 465 470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 485 490 495
15
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser Gln Val Gln Leu Lys 500 505 510
20
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr 515 520 525
2 5 Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val 530 535 540
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Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile 565 570 575
35
Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu 580 585 590
4 0 Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser 595 600 605
Asn Phe His Tyr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 45 610 615 620
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 625 630 635 640
50
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 645 650 655
55
Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg 660 665 670
60 Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr 675 680 685 5
10
30
45
55
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser 690 695 700
Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 705 710 715 720
Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala 725 730 735
Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly 740 745 750
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 755 760
< 210 > 186 < 211> 2307 2 5 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<220 >
<223> Polinucleotideo sintético <22 0 >
<223 > 2H7sssIgGl-H3-2el2HL (DNA)
<4 00 > 186
3 5 aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60
gtcataatgt ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct 120
ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg 180
4 0 taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct 240
tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 300
agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca 360
cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt 420
ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagtcggtg 480
50 aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac 540
aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat 600
ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta 660
gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg 720
gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg 780
60 ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 840 10
acatccccac cgagcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 102 0
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa acaatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200
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gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440
20
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500
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tcattaaccg gctatggtgt aaactgggtt cgccagcctc caggaaaggg tctggagtgg 1680
ctgggaatga tatggggtga tggaagcaca gactataatt cagctctcaa atccagacta 1740
30
tcgatcacca aggacaactc caagagccaa gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact 1800
gatgacacag ccagatacta ctgtgctcga gatggttata gtaactttca ttactatgtt 1860
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4 0 gaaagtgttg aatattatgt cacaagttta atgcagtggt accaacagaa accaggacag 2100
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45
attgcaatgt atttctgtca gcaaagtagg aaggttccat ggacgttcgg tggaggcacc 2280 aagctggaaa tcaaacgtta atctaga 2307
50
<210 > 187 <211> 762 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
55
<220 >
<223> polipeptídeo sintético <22 0 >
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<222> (1) . . (22)
<223> Líder
5
<220>
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<222> (23) . . (128)
<223 > VL <22 0 >
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< 222 > (129) . . (144) <223 > Ligante
<220>
<221> misc_característica
< 222 > (145) . . (265) <223> VH
<22 0 >
<221> misc_característica
<2 2 2 > (268) . . (282)
<223 > Dobradiça
<220>
<221> misc_característica
<222 > (500) . . (509)
<223> Ligante de EFD-BD2
<220>
< 2 21> misc_característica
<2 2 2 > (510) . . (630)
<223 > VH2
<2 2 0 >
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<222> (631) . . (650)
<223 > Ligante2
40 < 2 2 0 >
<221> misc_caracteristica
<222 > (651) . . (762)
<22 3 > VL2
45 <4 0 0 > 187
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
, c io 15
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Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 25 30
5 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 60 50 55 60 Pro Lys Pro 65
5
Ala Arg Phe
Ser Arg Val
Ser Phe Asn 115
Asp Gly Gly 130
20
Gln Ala Tyr 145
Ser Val Lys
Asn Met His
30
Gly Ala Ile 195
35
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40
Met Gln Leu 225
4 5 Ala Arg Val
Gly Thr Gly
50
Asp Lys Thr 275
55
Gly Pro Ser 290
60
Ile Ser Arg
Trp Ile Tyr Ala 70
Ser Gly Ser Gly 85
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Pro Pro Thr Phe
Gly Ser Gly Gly 135
Leu Gln Gln Ser 150
Met Ser Cys Lys 165
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Tyr Pro Gly Asn
Ala Thr Leu Thr 215
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Val Tyr Tyr Ser 245
Thr Thr Val Thr 260
His Thr Ser Pro
Val Phe Leu Phe 295
Thr Pro Glu Val
Pro Ser Asn Leu Ala 75
Ser Gly Thr Ser Tyr 90
Ala Ala Thr Tyr Tyr 105
Gly Ala Gly Thr Lys 120
Gly Gly Ser Gly Gly 140
Gly Ala Glu Ser Val 155
Ala Ser Gly Tyr Thr 170
Thr Pro Arg Gln Gly 185
Gly Asp Thr Ser Tyr 200
Val Asp Lys Ser Ser 220
Ser Glu Asp Ser Ala 235
Asn Ser Tyr Trp Tyr 250
Val Ser Asp Gln Glu 265
Pro Ser Pro Ala Pro 280
Pro Pro Lys Pro Lys 300
Thr Cys Val Val Val
Ser Gly Val Pro 80
Ser Leu Thr Ile 95
Cys Gln Gln Trp 110
Leu Glu Leu Lys 125
Gly Gly Ser Ser
Arg Pro Gly Ala 160
Phe Thr Ser Tyr 175
Leu Glu Trp Ile 190
Asn Gln Lys Phe 205
Ser Thr Ala Tyr
Val Tyr Phe Cys 240
Phe Asp Val Trp 255
Pro Lys Ser Ser 270
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Asp Thr Leu Met
Asp Val Ser His 305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 340 345 350
10
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365
15
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2 0 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 405 410 415
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 420 425 430
30
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Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln 675 680 685
35
40
60
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala 690 695 700
Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 705 710 715 720
Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp 725 730 735
4 5 Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe 740 745 750
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 50 755 760
< 210 > 188 <211> 2316 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial < 2 2 0 > <223 > Polinucleotideo sintético <22 0 > <223 > 2H7sssIgGl-H4-2el2HL (DNA) <4 O O > 188
aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60
120
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1740
1800
gtcataatgt ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagtcggtg aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg ggcacaggga acatccccac ccacggtcac cgagcccagc cgtctctgat acctgaactc caggagccca ctggggggac aatcttctga cgtcagtctt caaaactcac cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 40 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa acaatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 45 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 50 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaagg gtggcggtgg ctcgggcggt ggtggatctg ggaattctca ggtgcagctg 55 aaggagtcag gacctggcct ggtggcgccc tcacagagcc tgtccatcac atgcaccgtc tcagggttct cattaaccgg ctatggtgta aactgggttc gccagcctcc aggaaagggt 60 ctggagtggc tgggaatgat atggggtgat ggaagcacag actataattc agctctcaaa tccagactat cgatcaccaa ggacaactcc aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc cagatactac tgtgctcgag atggttatag taactttcat 1860
tactatgtta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc tgggggtgga 1920
5
ggctctggtg gcggtggatc cggcggaggt gggtcgggtg gcggcggatc tgacattgtg 1980
ctcacccaat ctccagcttc tttggctgtg tctctaggtc agagagccac catctcctgc 2040
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15
20
25
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5
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15
Pro Gly Lys
20
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Gly Met Ile
35
Ser Arg Leu
40
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Gly Gly Ser
55
Leu Thr Gln
60
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Asn Gly Gln Pro
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Ile Thr Cys Thr 535
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Tyr Ser Asn Phe 615
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Ser Gly Gly Gly Gly 650
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Glu Ser Val Glu Tyr
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Lys Leu Thr Val
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10
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30
35
40
45
50
55
60
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Pro Gly Lys
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Gly Tyr Gly
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2220 2280 2331
20
cctccaggaa agggtctgga gtggctggga atgatatggg gtgatggaag cacagactat aattcagctc tcaaatccag actatcgatc accaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccagat actactgtgc tcgagatggt tatagtaact ttcattacta tgttatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctctgggg gtggaggctc tggtggcggt ggatccggcg gaggtgggtc gggtggcggc ggatctgaca ttgtgctcac ccaatctcca gcttctttgg ctgtgtctct aggtcagaga gccaccatct cctgcagagc cagtgaaagt gttgaatatt atgtcacaag tttaatgcag tggtaccaac agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tctctgctgc tagcaacgta gaatctgggg tccctgccag gtttagtggc agtgggtctg ggacagactt tagcctcaac atccatcctg tggaggagga tgatattgca atgtatttct gtcagcaaag taggaaggtt ccatggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac gttaatctag a
<210 > 193
<211 > 770
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<2 22 > (1) . . (22)
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20
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
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Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
35
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
40
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95
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Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 50 115 120 125
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55
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60
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Val Val
Gly Thr 260
Thr His 275
Ser Val
Arg Thr
Pro Glu
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Ser Leu 230
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Thr Ser
Phe Leu
Pro Glu 310
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Thr Lys
Val Leu
Cys Lys
Ser Lys 390
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Asn Gly 200
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Thr Ser
Ser Asn
Thr Val
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Phe Asn
Pro Arg
Thr Val 360
Val Ser 375
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170
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Asp Lys
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Ser Pro
Pro Lys
Cys Val
Trp Tyr 330
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Leu His
Asn Lys
Gly Gln
Gln Gly Ser Tyr
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Val Asp
Gln Tyr
Gln Asp
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Pro Arg 395
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Val Tyr
Phe Asp
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Glu Leu 285
Asp Thr
Asp Val
Gly Val
Asn Ser 350
Trp Leu 365
Pro Ala
Glu Pro
175
Trp Ile Lys Phe
Ala Tyr
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Ser Ser
Leu Gly
Leu Met
Ser His 320
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Asn Gly
Pro Ile
Gln Val 400
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5
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15
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20
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35
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40
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10
30
35
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25
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50
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aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat 600
60 J
ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag
5
gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat 1O acatccccac cgtgcccagc acctgaactc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag
15
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg
2 O aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca
25
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag
3 O tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac
ccgggtaagg ggtgtccacc ttgtccgaat ggcagcgtgg cgccctcaca gagcctgtcc
35
accggctatg gtgtaaactg ggttcgccag atgatatggg gtgatggaag cacagactat
4 O accaaggaca actccaagag ccaagttttc
acagccagat actactgtgc tcgagatggt tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc
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60
<210 > 195
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2301 10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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25
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< 22 2 > (508) . . (629) <22 3 > VH2
< 22 0 >
< 221> raisc_característica
<222> (630) . . (646)
<223 > Ligante2
<220 >
<221> misc_característica
< 22 2 > (647) . . (754)
<22 3 > VL2
30
45
50
<4 00 > 197
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
3 5 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 40 35 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95
55 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 HO
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 60 115 120 125 Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
5
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205
20
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
25
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
3 0 Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser 260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 275 280 285
40
Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300
45
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320
0 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 55 340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365
60 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 370 375 380
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 405 410 415
10
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15
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2 0 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 450 455 460
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 485 490 495
30
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35
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4 0 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn Trp Leu 530 535 540
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Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr 565 570 575
50
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55
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6 0 Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr 610 615 620 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 625 630
- 5
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 660
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 635 640
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
650 655
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser 665 670
Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly 675 680 685
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20
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705 710
25
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3 0 Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 740
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val 700
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr 715 720
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val Thr 745 750
Lys Arg
35
< 210 > 198
<211> 2298
4 0 < 212 > DNA
<213> Seqüência artificial
45
55
<22 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético <22 0 >
<2 2 3 > 2H7sssIgGl-H7-G281 HL (DNA)
<4 0 0 > 198
50 aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca
gtcataatgt ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 60 agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca 360
60 120 180 240 300 10
20
30
40
50
cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt 420 ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagtcggtg 480 aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac 540 aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat 600 ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta 660 gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg 720 gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg 780 ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 840 acatccccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 900 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1260 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaagg ggtgtccacc ttgtccgaat tctgaggtcc agctgcaaca gtctggacct gaactggtga agcctggagc ttcaatgaag atttcctgca aggcctctgg ttactcattc actggctaca tcgtgaactg gctgaagcag agccatggaa agaaccttga gtggattgga 4 5 cttattaatc catacaaagg tcttactacc tacaaccaga aattcaaggg caaggccaca
ttaactgtag acaagtcatc cagcacagcc tacatggagc tcctcagtct gacatctgaa 1800 gactctgcag tctattactg tgcaagatct gggtactatg gtgactcgga ctggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc gtctcctctg gtggcggtgg ctcgggcggt ggtggatctg gaggaggtgg gagcggggga ggtggcagtg ctagcgacat ccagatgaca 55 cagactacat cctccctgtc tgcctctctg ggagacagag tcaccatcag ttgcagggca agtcaggaca ttcgcaatta tttaaactgg tatcagcaga aaccagatgg aactgttaaa ctcctgatct actacacatc aagattacac tcaggagtcc catcaaggtt cagtggcagt 2160 gggtctggaa cagattattc tctcaccatt gccaacctgc aaccagaaga tattgccact 2220
1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740
1860 1920 1980 2040 2100
60 tacttttgcc aacagggtaa tacgcttccg tggacgttcg gtggaggcac caaactggta accaaacggt aatctaga
<210> 199
<211> 759
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 O >
<223> polipeptídeo sintético <22Q>
<223> 2H7sssIgGl-H7-G281 HL (w/2e!2 Líder) (AA)
<220>
<221> misc_característica
<2 22 > (1) . . (22)
<223 > Líder
<220>
<221> misc_característica
<222> (23) . . (128}
<223 > VLl
<22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (129) . . (144)
<2 2 3 > Ligante
<220>
<221> misc_caracteristica
<222 > (145) . . (265)
< 2 2 3 > VHl
<220>
<221> misc_característica
< 2 2 2 > (268) . . (282) <223 > Dobradiça
<22 0 >
<2 21> misc_característica
< 22 2 > (500) . . (507)
<223> Ligante de EFD-BD2
<22 0 >
< 2 21> misc__caracterí stica <222 > (508) . . (629)
< 2 2 3 > VH2
< 2 2 0 >
<221 > misc__caracterí stica
<222> (630) . . (651)
<223 > Ligante2
< 22 0 >
<2 21> misc_característica
<222> (652) . . (759) <223 > VL2 <400> 199
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 25 30
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Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 HO
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 225 230 235 240
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser 260 265 270
10
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 275 280 285
Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
325 330 335
25
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 340 345 350
30
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
370 375 380
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
40 385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 405 410 415
45
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 420 425 430
50
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 435 440 445
55 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 60 465 470 475 480 His Glu Ala Leu
Pro Gly Lys Gly 500
Gln Ser Gly Pro 515
Cys Lys Ala Ser 530
Lys Gln Ser His 545
Tyr Lys Gly Leu
Leu Thr Val Asp 580
Leu Thr Ser Glu 595
Tyr Gly Asp Ser 610
Val Thr Val Ser 625
Gly Gly Gly Ser
Gln Thr Thr Ser 660
Ser Cys Arg Ala 675
Gln Lys Pro Asp 690
Leu His Ser Gly 705
Asp Tyr Ser Leu
His Asn His Tyr 485
Cys Pro Pro Cys
Glu Leu Val Lys 520
Gly Tyr Ser Phe 535
Gly Lys Asn Leu 550
Thr Thr Tyr Asn 565
Lys Ser Ser Ser
Asp Ser Ala Val 600
Asp Trp Tyr Phe 615
Ser Gly Gly Gly 630
Gly Gly Gly Gly 645
Ser Leu Ser Ala
Ser Gln Asp Ile 680
Gly Thr Val Lys 695
Val Pro Ser Arg 710
Thr Ile Ala Asn
Thr Gln Lys Ser 490
Pro Asn Ser Glu 505
Pro Gly Ala Ser
Thr Gly Tyr Ile 540
Glu Trp Ile Gly 555
Gln Lys Phe Lys 570
Thr Ala Tyr Met 585
Tyr Tyr Cys Ala
Asp Val Trp Gly 620
Gly Ser Gly Gly 635
Ser Ala Ser Asp 650
Ser Leu Gly Asp 665
Arg Asn Tyr Leu
Leu Leu Ile Tyr
700
Phe Ser Gly Ser 715
Leu Gln Pro Glu
Leu Ser Leu Ser 495
Val Gln Leu Gln 510
Met Lys Ile Ser 525
Val Asn Trp Leu
Leu Ile Asn Pro 560
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Glu Leu Leu Ser 590
Arg Ser Gly Tyr 605
Ala Gly Thr Thr
Gly Gly Ser Gly 640
Ile Gln Met Thr 655
Arg Val Thr Ile 670
Asn Trp Tyr Gln 685
Tyr Thr Ser Arg
Gly Ser Gly Thr 720
Asp Ile Ala Thr 725 730 735
Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly 740 745 750
Thr Lys Leu Val Thr Lys Arg 755
< 210 > 200
<211> 1533
<212> DNA
<213> Seqüência artificial < 22 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético
10
15
30
<220>
<223 > 2el2-sss-IgGl HL SMIP (DNA) <400> 200
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60
2 5 agaggagtcc aggtgcagct gaaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 120
ctgtccatca catgcaccgt ctcagggttc tcattaaccg gctatggtgt aaactgggtt 180
cgccagcctc caggaaaggg tctagagtgg ctgggaatga tatggggtga tggaagcaca 240
gactataatt cagctctcaa atccagacta tcgatcacca aggacaactc caagagccaa 3 00
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccagatacta ctgtgctcga 360
gatggttata gtaactttca ttactatgtt atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 420
accgtctcct ctgggggtgg aggctctggt ggcggtggat ccggcggagg tgggtcgggt 480
ggcggcggat ctgacattgt gctcacccaa tctccagctt ctttggctgt gtctctaggt 540
40
cagagagcca ccatctcctg cagagccagt gaaagtgttg aatattatgt cacaagttta 600
atgcagtggt accaacagaa accaggacag ccacccaaac tcctcatctc tgctgctagc 660
45 aacgtagaat ctggggtccc tgccaggttt agtggcagtg ggtctgggac agactttagc 720
ctcaacatcc atcctgtgga ggaggatgat attgcaatgt atttctgtca gcaaagtagg 780
aaggttccat ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaacgtga tcaggagccc 84 0 aaatcttctg acaaaactca cacatcccca ccgtccccag cacctgaact cctgggggga tcgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct
55 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 1020
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1080
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1140
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagcct ccatcgagaa aacaatctcc 1200
50
60
900 960 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1260
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1320
5
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1380
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1440
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1500
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1533
< 210 > 201
<211> 510
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
< 2 2 0 >
<223> Polipeptídeo sintético
25
30
35
40
45
50
55
60
< 22 0 >
<223> 2el2-sss-IgGl HL SMIP (AA) <22 0 >
< 221> misc_caracterIstica <222> (1) . - (22)
<22 3 > Lider
<220>
<221> misc_caracteristica
<222> (24) . . (144)
<223> VH
<22 0 >
<221> misc_característica
<222> (145) . . (164)
<223 > Ligante
<22 0 >
< 221> misc_caracterIstica <2 2 2 > (165) . . (276)
<223 > VL
<2 2 0 >
<221> misc_característica
<222 > (279) . . (293)
<223 > Dobradiça
<4 00> 201
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Val Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro 25 30
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 40 45
Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro 50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr 65 70 75 80
10
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Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 145 150 155 160
30
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 165 170 175
35
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 180 185 190
4 0 Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 195 200 205
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser
45 210 215 220
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
225 230 235 240
50
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys 245 250 255
5 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 260 265 270
Glu Ile Lys Arg Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 60 275 280 285 Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe 290 295 300
5
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 305 310 315 320
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
325 330 335
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 340 345 350
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
355 360 365
20
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
370 375 380
25
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 385 390 395 400
3 0 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
405 410 415
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 420 425 430
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 435 440 445
40
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 450 455 460
45
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
465 470 475 480
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 50 485 490 495
55
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 505 510
<210 > 202
<211> 1518
<212 > DNA
60 <213> Seqüência artificial <22 O >
<22 3 > PolinucleotIdeo sintético <22 O >
<223> 2el2-sss-IgGl LH SMIP (DNA) <400 > 202
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60 agaggagtcg acattgtgct cacccaatct ccagcttctt tggctgtgtc tctaggtcag 120 agagccacca tctcctgcag agccagtgaa agtgttgaat attatgtcac aagtttaatg 180 cagtggtacc aacagaaacc aggacagcca cccaaactcc tcatctctgc tgctagcaac 240 gtagaatctg gggtccctgc caggtttagt ggcagtgggt ctgggacaga ctttagcctc 300 aacatccatc ctgtggagga ggatgatatt gcaatgtatt tctgtcagca aagtaggaag 360 gttccatgga cgttcggtgg aggcaccaag ctggaaatca aacggggtgg cggtggatcc 420 ggcggaggtg ggtcgggtgg cggcggatct caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc 480 ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc 540 ggctatggtg taaactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctagagtg gctgggaatg 600 atatggggtg atggaagcac agactataat tcagctctca aatccagact atcgatcacc 660 aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca 720 gccagatact actgtgctcg agatggttat agtaactttc attactatgt tatggactac 780 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tctgatcagg agcccaaatc ttctgacaaa 840 actcacacat ccccaccgtc cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 900 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 960 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1020 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1080 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1140 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacaa tctccaaagc caaagggcag 1200 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1260 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1320 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1380 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1440 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1500 ctgtctccgg gtaaatga 1518
<210 > 203 <211> 505
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Polipeptídeo sintético
<22 0>
<223 > 2el2-sss-IgGl LH SMIP (AA)
10
15
20
25
30
35
40
45
<220 >
<221> misc_característica
<222> (1) . . (23)
<2 2 3 > Lider
<220>
< 221> misc_característica
<222> (24) . . (135)
<223> VL
<220>
< 221> misc_característica <222> (136) . . (150)
<22 3 > Ligante
<22 0 >
<2 21> misc_caracteristica
<222 > (151) . . (271)
<223 > VH
<220>
<221> raisc_caracteristica
< 22 2 > (274) . . (288) <22 3 > Dobradiça
<4 0 0 > 203
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Val Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 25 30
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala 40 45
0 Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln 50 55 60
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn 55 65 70 75 80
Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 85 90 95
60 Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met 100 105 110
Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly 145 150 155 160
15
20
Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly 165 170 175
Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly 180 185 190
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp 195 200 205
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser
210 215 220
30
Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr 225 230 235 240
35
Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Asn Phe His Tyr Tyr 245 250 255
4 0 Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp 260 265 270
Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
45 275 280 285
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 290 295 300
50
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
305 310 315 320
55
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 325 330 335
6 0 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 340 345 350 5
10
25
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 355 360 365
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 370 375 380
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 385 390 395 400
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
405 410 415
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 420 425 430
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 435 440 445
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 450 455 460
3 0 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 465 470 475 480
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 485 490 495
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 505
40
<210 > 204 <211> 1498 <212 > DNA 4 5 <213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Polinucleotídeo sintético
50 <22 0 >
<22 3 > G28-1 LH SMIP (DNA)
<400 > 204
55
aagcttgccg ccatggaagc accagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60 gataccaccg gtgacatcca gatgactcag tctccagcct ccctatctgc atctgtggga 120 gagactgtca ccatcacatg tcgaacaagt gaaaatgttt acagttattt ggcttggtat 180 cagcagaaac agggaaaatc tcctcagctc ctggtctctt ttgcaaaaac cttagcagaa 240 10
50
<22 0 >
5 <221> misc_característica
<22 2 > (1) . . (20)
< 22 3 > Líder
<220>
6 0 <2 21> misc_característica
<222> (21) . . (127)
840 900
ggtgtgccat caaggttcag tggcagtgga tcaggcacac agttttctct gaagatcagc 300
agcctgcagc ctgaagattc tggaagttat ttctgtcaac atcattccga taatccgtgg 360
acgttcggtg gaggcaccga actggagatc aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 420
tcgggtggcg gcggatctgc tagcgcagtc cagctgcagc agtctggacc tgagctggaa 480
aagcctggcg cttcagtgaa gatttcctgc aaggcttctg gttactcatt cactggctac 540
aatatgaact gggtgaagca gaataatgga aagagccttg agtggattgg aaatattgat 600
ccttattatg gtggtactac ctacaaccgg aagttcaagg gcaaggccac attgactgta 660
gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcaagagtc tgacatctga ggactctgca 720
gtctattact gtgcaagatc ggtcggccct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 780 accgtctcga gcgagcccaa atcttctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca
20
cctgaactcc tgggtggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 960
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1020
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1080
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1140
3 0 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1200
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1260
ttctatccaa gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1320
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1380
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1440
40 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaagtg actctaga 1498
< 210 > 205
<211> 492
4 5 < 212 > PRT
<213 > Seqüência artificial
<22 0 >
<223> polipeptídeo sintético <22 0 >
<223 > G28-1 LH SMIP (AA) <22 3> VL <22Q>
<221> misc_característica
<22 2 > (128) . . (144)
<223 > Ligante
<220>
<221> raisc_característica
<222 > (145) . . (260)
<223 > VH
<220 >
<221> misc_característica
<22 2 > (261) . . (275)
<223 > Dobradiça
<4 00 > 205
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15
Asp Thr Thr
25
Ala Ser Val 35
30
Val Tyr Ser 50
3 5 Gln Leu Leu 65
Arg Phe Ser
40
Ser Leu Gln
45
Asp Asn Pro 115
50
Gly Gly Gly 130
5 Ala Val Gln 145
Ser Val Lys
60
Gly Asp Ile Gln 20
Gly Glu Thr Val
Tyr Leu Ala Trp 55
Val Ser Phe Ala 70
Gly Ser Gly Ser 85
Pro Glu Asp Ser 100
Trp Thr Phe Gly
Ser Gly Gly Gly 135
Leu Gln Gln Ser 150
Ile Ser Cys Lys 165
Met Thr Gln Ser Pro 25
Thr Ile Thr Cys Arg 40
Tyr Gln Gln Lys Gln 60
Lys Thr Leu Ala Glu 75
Gly Thr Gln Phe Ser 90
Gly Ser Tyr Phe Cys 105
Gly Gly Thr Glu Leu 120
Gly Ser Gly Gly Gly 140
Gly Pro Glu Leu Glu 155
Ala Ser Gly Tyr Ser 170
Ala Ser Leu Ser 30
Thr Ser Glu Asn 45
Gly Lys Ser Pro
Gly Val Pro Ser 80
Leu Lys Ile Ser 95
Gln His His Ser 110
Glu Ile Lys Gly 125
Gly Ser Ala Ser
Lys Pro Gly Ala 160
Phe Thr Gly Tyr 175 Asn Met Asn
5
Gly Asn Ile 195
Lys Gly Lys 210
Met Gln Leu 225
Ala Arg Ser
20
Thr Val Ser
25
Pro Cys Pro 275
3 0 Pro Pro Lys 290
Thr Cys Val 305
Asn Trp Tyr
40
Arg Glu Glu
45
Val Leu His 355
0 Ser Asn Lys 370
Lys Gly Gln 55 385
Asp Glu Leu
60
Phe Tyr Pro
Trp Val Lys Gln 180
Asp Pro Tyr Tyr
Ala Thr Leu Thr 215
Lys Ser Leu Thr 230
Val Gly Pro Met 245
Ser Glu Pro Lys 260
Ala Pro Glu Leu
Pro Lys Asp Thr 295
Val Val Asp Val 310
Val Asp Gly Val 325
Gln Tyr Asn Ser 340
Gln Asp Trp Leu
Ala Leu Pro Ala 375
Pro Arg Glu Pro 390
Thr Lys Asn Gln 405
Ser Asp Ile Ala
Asn Asn Gly Lys Ser 185
Gly Gly Thr Thr Tyr 200
Val Asp Lys Ser Ser 220
Ser Glu Asp Ser Ala 235
Asp Tyr Trp Gly Gln 250
Ser Ser Asp Lys Thr 265
Leu Gly Gly Pro Ser 280
Leu Met Ile Ser Arg 300
Ser His Glu Asp Pro 315
Glu Val His Asn Ala 330
Thr Tyr Arg Val Val 345
Asn Gly Lys Glu Tyr 360
Pro Ile Glu Lys Thr 380
Gln Val Tyr Thr Leu 395
Val Ser Leu Thr Cys 410
Val Glu Trp Glu Ser
Leu Glu Trp Ile 190
Asn Arg Lys Phe 205
Ser Thr Ala Tyr
Val Tyr Tyr Cys 240
Gly Thr Ser Val 255
His Thr Cys Pro 270
Val Phe Leu Phe 285
Thr Pro Glu Val
Glu Val Lys Phe 320
Lys Thr Lys Pro 335
Ser Val Leu Thr 350
Lys Cys Lys Val 365
Ile Ser Lys Ala
Pro Pro Ser Arg 400
Leu Val Lys Gly 415
Asn Gly Gln Pro 420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 450 455 460
10
15
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490
< 210 > 206
< 211> 1522 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
< 2 2 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético
< 2 2 0 >
< 2 2 3 > G2 8-1 HL SMIP (DNA)
30
35
45
55
<400> 206
aagcttgccg ccatggaagc accagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca
60 120
gataccaccg gtgcggtcca gctgcagcag tctggacctg agtcggaaaa gcctggcgct
tcagtgaaga tttcctgcaa ggcttctggt tactcattca ctggctacaa tatgaactgg 180
gtgaagcaga ataatggaaa gagccttgag tggattggaa atattgatcc ttattatggt 240
40 ggtactacct acaaccggaa gttcaagggc aaggccacat tgactgtaga caaatcctcc 300
ggcacagcct acatgcagct caagagtctg acatctgagg actctgcagt ctattactgt 360
gcaagatcgg tcggccctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcttct 420
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatcaggagg aggcgggagt 480
gctagcgaca tccagatgac tcagtctcca gcctccctat ctgcatctgt gggagagact 540
50 gtcaccatca catgtcgaac aagtgaaaat gtttacagtt atttggcttg gtatcagcag 600
aaacagggaa aatctcctca gctcctggtc tcttttgcaa aaaccttagc agaaggtgtg 660
ccatcaaggt tcagtggcag tggatcaggc acacagtttt ctctgaagat cagcagcctg 720
cagcctgaag attctggaag ttatttctgt caacatcatt ccgataatcc gtggacgttc 780
ggtggaggca ccgaactgga gatcaaaggc tcgagcgagc ccaaatcttc tgacaaaact 840 60 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctgggtg gaccgtcagt cttcctcttc
900 10
20
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 960
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1020
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1080
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1260
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1440
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1500
tctccgggta agtgactcta ga 1522
<210 > 207
<211> 500
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223 > Polipeptídeo sintético <22 0 >
<223 > G28-1 HL SMIP (AA)
<22 0 >
<221> misc_característica
<222> (1) . . (20)
<223 > Líder
40 <2 2 0 >
<2 21> misc_característica
< 222 > (21) . . (136) <22 3 > VH
45 <22 0 >
<221> raisc_característica
<222> (137)..(158)
<22 3 > Ligante
50 <2 2 0 >
< 2 21> misc_característica <222> (159) . . (266)
<223 > VL
55 <22 0>
<2 21> misc_característica
<222> (268) . . (283)
<223 > Dobradiça
60 <4 0 0 > 207 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 10 15
Asp Thr Thr Gly Ala Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Ser Glu 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser 35 40 45
Phe Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Asn Asn Gly Lys Ser 50 55 60
15
Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Tyr
65 70 75 80
20
Asn Arg Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 85 90 95
2 5 Gly Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 HO
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140
35
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp Ile 145 150 155 160
4 0 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr
165 170 175
Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Ala 45 180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Ser Phe 195 200 205
50
Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 210 215 220
55
Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 225 230 235 240
6 0 Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Gln His His Ser Asp Asn Pro Trp Thr Phe
245 250 255 Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys Gly Ser Ser Glu Pro Lys Ser 260 265 270
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 275 280 285
10
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350
25
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365
30
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380
Ile Glu Lys 385
Val Tyr Thr
40
Ser Leu Thr
45
Glu Trp Glu 435
0 Pro Val Leu 450
Val Asp Lys 55 465
Met His Glu
60
Thr Ile Ser Lys 390
Leu Pro Pro Ser 405
Cys Leu Val Lys 420
Ser Asn Gly Gln
Asp Ser Asp Gly 455
Ser Arg Trp Gln
470
Ala Leu His Asn 485
Ala Lys Gly Gln Pro 395
Arg Asp Glu Leu Thr 410
Gly Phe Tyr Pro Ser 425
Pro Glu Asn Asn Tyr 440
Ser Phe Phe Leu Tyr 460
Gln Gly Asn Val Phe 475
His Tyr Thr Gln Lys 490
Arg Glu Pro Gln 400
Lys Asn Gln Val 415
Asp Ile Ala Val 430
Lys Thr Thr Pro 445
Ser Lys Leu Thr
Ser Cys Ser Val 480
Ser Leu Ser Leu 495 Ser Pro Gly Lys 500
<210 > 208
<211> 1522
< 212 > DNA
<213 > Seqüência artificial
<220>
<223> Polinucleotídeo sinCético
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<220>
< 22 3 > G19-4 LH SMIP (DNA) <4 00> 208
aagcttgccg ccatggaagc accagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60 gataccaccg gtgacatcca gatgacacag actacatcct ccctgtctgc ctctctggga 120 gacagagtca ccatcagttg cagggcaagt caggacattc gcaattattt aaactggtat 180 cagcagaaac cagatggaac tgttaaactc ctgatctact acacatcaag attacactca 240 ggagtcccat caaggttcag tggcagtggg tctggaacag attattctct caccattgcc 300 aacctgcaac cagaagatat tgccacttac ttttgccaac agggtaatac gcttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa actggtaacc aaacggggtg gcggtggctc gggcggtggt 420 ggatctggag gaggtgggag cgctagcgag gtccagctgc aacagtctgg acctgaactg 480 gtgaagcctg gagcttcaat gaagatttcc tgcaaggcct ctggttactc attcactggc 540 tacatcgtga actggctgaa gcagagccat ggaaagaacc ttgagtggat tggacttatt 600 aatccataca aaggtcttac tacctacaac cagaaattca agggcaaggc cacattaact 66 0 gtagacaagt catccagcac agcctacatg gagctcctca gtctgacatc tgaagactct 720 gcagtctatt actgtgcaag atctgggtac tatggtgact cggactggta cttcgatgtc 780 tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tcgagcgagc ccaaatcttc tgacaaaact 840 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctgggtg gaccgtcagt cttcctcttc 900 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 960 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1020 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1080 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 12 60 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1440 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1500 tctccgggta agtgactcta ga 1522
<210> 209
<211> 500
<212 > PRT
< 213 > Seqüência artificial <220 >
<223> polipeptídeo sintético
< 2 2 0 >
<223 > G19-4 LH SMIP (AA)
<22 0>
<221> misc_característica
< 2 2 2 > (1) . . (20}
<223 > Lider
< 2 2 0 >
< 221> misc_característica
< 2 2 2 > (21) . . (128) <223 > VL
<22 0 >
< 2 21> misc_característica <222 > (129) . . (145)
< 2 2 3 > Ligante
<22 0 >
< 2 21> misc_característica
<222> (146) . . (267)
<223 > VH
40 <22 0 >
<2 21> misc_característica
<222> (268) . . (282)
<2 2 3 > Dobradiça
45 <400 > 209
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 10 15
50
Asp Thr Thr Gly Asp Xle Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 25 30
55 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 40 45
Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 60 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ala 85 90 95
Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 100 105 110
Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val Thr Lys Arg 115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135
20
Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln 145 150
25
Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys 165
3 0 Tyr Ile Val Asn Trp Leu Lys 180
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 140
Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 155 160
Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 170 175
Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp 185 190
Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr Asn Gln Lys 195 200 205
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 210 215 220
40
Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240
45
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 245 250 255
0 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser 260 265 270
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 55 275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 290 295 300
60 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 355 360 365
15
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 370 375 380
20
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 385 390 395 400
2 5 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 435 440 445
35
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 450 455 460
40
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 465 470 475 480
4 5 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leii Ser Leu
485 490 495
Ser Pro Gly Lys 50 500
<210 > 210 <211> 1525 <212> DNA 55 <213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<2 23> Polinucleotídeo sintético
60 < 2 2 0 >
<223 > G19-4 HL SMIP (DNA) <4 0 0 > 210 aagcttgccg ccatggaagc accagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 60 gataccaccg gtgaggtcca gctgcaacag tctggacctg aactggtgaa gcctggagct 120 tcaatgaaga tttcctgcaa ggcctctggt tactcattca ctggctacat cgtgaactgg 180 ctgaagcaga gccatggaaa gaaccttgag tggattggac ttattaatcc atacaaaggt 240 cttactacct acaaccagaa attcaagggc aaggccacat tgactgtaga caagtcatcc 300 agcacagcct acatggagct cctcagtctg acatctgaag actctgcagt ctattactgt 360 gcaagatctg ggtactatgg tgactcagac tggtacttcg atgtctgggg cgcagggacc 420 acagtcaccg tctcctctgg cggcggtggc tcgggcggtg gtggatctgg aggaggtggg 480 agcgctagcg acatccagat gacacagact acatcctccc tgtctgcctc tctgggagac 540 agagtcacca tcagttgcag ggcaagtcag gacattcgca attatttgaa ctggtatcag 600 cagaaaccag atggaactgt taaactcctg atctactaca catcaagact acactcagga 660 gtcccatcaa ggttcagtgg cagtgggtct ggaacagatt attctctcac cattgccaac 720 ctgcaaccag aagatattgc cacttacttt tgccaacagg gtaatacact tccctggacg 780 ttcggtggag ggaccaaact ggtgaccaaa cgctcgagcg agcccaaatc ttctgacaaa 840 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg gtggaccgtc agtcttcctc 900 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 960 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1020 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1080 40 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1140 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1200 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1260 45 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1320 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1380 50 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1440 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1500
ctgtctccgg gtaagtgact ctaga 1525
55
<210 > 211 <211> 501 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
60
<22 0 > 10
15
20
25
30
35
40
<223> Polipeptídeo sintético <220>
<223 > G19-4 HL SMIP (AA) <2 2 0 >
<221> misc_característica
<222> (1) . . (20)
<2 23 > Líder
<2 2 0 >
<221> misc_caracteristica
<222> (21) . . (142)
<2 23 > VH
<2 2 0 >
<2 21> misc_caracteristica
<222> (143) . . (159)
<223> Ligante
<220>
<221> misc_característica
<222> (160) . . (267)
<223> VL
< 22 0 >
< 221> misc_característica
< 22 2 > (270) . . (284)
< 223 > Dobradiça
<4 0 0 > 211
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser 40 45
45 Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Asn 50 55 60
Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr
50 65 70 75 80
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 85 90 95
55
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110
6 0 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr 115 120 125 Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140
5
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp 145 150 155 160
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu 180 185 190
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 195 200 205
20
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220
25
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro Glu 225 230 235 240
3 0 Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
245 250 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val Thr Lys Arg Ser Ser Glu Pro Lys 260 265 270
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 275 280 285
40
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 290 295 300
45
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 305 310 315 320
50 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
325 330 335
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 340 345 350
55
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 355 360 365
60
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 370 375 380
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 385 390 395 400
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 405 410 415
10
15
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 420 425 430
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 435 440 445
2 0 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 450 455 460
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 465 470 475 480
30
35
40
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 485 490 495
Leu Ser Pro Gly Lys 500
<210 > 212
< 211> 2328
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético
<2 2 0 >
4 5 <223> n2H7sssIgGl-STDl-2el2HL (DNA)
<4 0 0 > 212 aagcttgccg ccatggaagc accagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca 50 gataccaccg gtcaaattgt tctctcccag tctccagcaa tcctgtctgc atctccaggg gagaaggtca caatgacttg cagggccagc tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag 55 cagaagccag gatcctcccc caaaccctgg atttatgccc catccaacct ggcttctgga gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcaga gtggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccagcagt ggagttttaa cccacccacg 60 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa gatggcggtg gctcgggcgg tggtggatct
60 120 180 240 300 360 420 99aSSaSgtg gagctagcca ggcttateta cagcagtctg gggctgagct ggtgaggcct 480
ggggcctcag tgaagatgtc ctgcaaggct tctggctaca catttaccag ttacaatatg 54 0
cactgggtaa agcagacacc tagacagggc ctggaatgga ttggagctat ttatccagga 600
aatggtgata cttcctacaa tcagaagttc aagggcaagg ccacactgac tgtagacaaa 660
tcctccagca cagcctacat gcagctcagc agcctgacat ctgaagactc tgcggtctat 720
10
ttctgtgcaa gagtggtgta ctatagtaac tcttactggt acttcgatgt ctggggcaca 780
gggaccacgg tcaccgtctc gagcgagccc aaatcttctg acaaaactca cacatcccca 84 0
ccgagcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 900
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgCggtggt ggacgtgagc 960
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1020
20
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 114 0
ctcccagccc ccatcgagaa aacaatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 12 6 0
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
30
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440
3 5 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaag 1500
aattatggtg gcggtggctc gggcggtggt ggatctggag gaggtgggag tgggaattct 1560
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgCccatc 1620
40
acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc ggctatggtg taaactgggt Ccgccagcct 1680
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg atggaagcac agactataat 1740
45 tcagctctca aatccagact atcgatcacc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 1800
aaaatgaaea gtctgcaaac tgatgacaca geeagatact actgtgctcg agatggttat 1860
agtaactttc attactatgt tatggactac tggggtcaag gaaeeteagt caccgtctcc 1920
50
tctgggggtg gaggctctgg tggcggtgga tccggcggag gtgggtcggg tggcggcgga 1980
tctgacattg tgctcaccca atctccagct tctttggctg tgtctctagg tcagagagcc 2040
55 accatctcct gcagagccag tgaaagtgtt gaatattatg tcacaagttt aatgeagtgg 2100
taceaaeaga aaccaggaca gccacccaaa ctcctcatct ctgctgctag caacgtagaa 2160
tctggggtcc ctgccaggtt tagtggcagt gggtctggga cagactttag cctcaacatc 2220
60
catcctgtgg aggaggatga tattgeaatg tatttctgtc agcaaagtag gaaggttcca 2280 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgtt aatctaga 232;
15
<210 > 213 <211 > 769 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial
< 22 0 >
<22 3> Polipeptídeo sintético
<22 0>
<223> n2H7sssIgGl-STDl~2el2HL (AA)
<2 2 0 >
<221> misc_característica
<222 > (1) . . (20)
<223 > Líder
<22 0 >
<221> misc_característica
<2 2 2 > (21) . . (127)
<22 3 > VL
<22 0 >
<221> raisc_característica
<22 2 > (128) . . (142)
<22 3 > Ligante
<22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (143) . . (264)
<223 > VH
< 22 0 >
<221> misc_característica
< 22 2 > (265) . . (279) 4 0 <22 3> Dobradiça
< 22 0 >
<221> misc_característica
< 22 2 > (497) . . (516)
45 <223> Ligante de EFD-BD2
< 22 0 >
<22l> misc_caracteristica
<222> (517) . . (637)
50 < 22 3 > VH2
< 22 0 >
<221> misc_característica
<222> (638) . . (657)
55 < 22 3 > Ligante2
< 22 0 >
<221> misc_característica
< 222 > (658) .. (769)
6 0 <22 3> VL2 <400> 213
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 10 15
5
Asp Thr Thr Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 25 30
10
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 40 45
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 50 55 60
Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95
25
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe 100 105 110
30
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gly 115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ala 130 135 140
Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val 40 145 150 155 160
Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met 165 170 175
45
His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala 180 185 190
50
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 195 200 205
5 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 210 215 220
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 60 225 230 235 240 Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr 245 250 255
5
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 260 265 270
His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
305 310 315 320
20
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 325 330 335
25
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 340 345 350
3 0 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 385 390 395 400
40
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 405 410 415
45
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 420 425 430
0 Asn Gly Gln Pro 435
Ser Asp Gly Ser 450
55
Arg Trp Gln Gln 465
60
Leu His Asn His
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 440
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 455
Gly Asn Val Phe Ser Cys 470
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
Thr Pro Pro Val Leu Asp 445
Leu Thr Val Asp Lys Ser 460
Ser Val Met His Glu Ala 475 480
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 490 495
Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 500 505 510
Ser Gly Asn Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 515 520 525
10
Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser 530 535 540
15
Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly 545 550 555 560
2 0 Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn
565 570 575
Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser 580 585 590
Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg 595 600 605
30
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Asn Phe His Tyr Tyr Val Met 610 615 620
35
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 625 630 635 640
4 0 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
645 650 655
Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 45 660 665 670
Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr 675 680 685
50
Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 690 695 700
5 Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro 705 710 715 720
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile 60 725 730 735 5
His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser 740 745 750
Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 755 760 765
Arg
<210 > 214
<211> 2313
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
<223> Polinucleotideo sintético <22 0 >
< 2 2 3 > n2H7 ' sssIgGl-STD2-2el2LH (DNA) <4 00 > 214 aagcttgccg ccatggaagc accagcgcag cttctcttcc tcctgctact ctggctccca gataccaccg gtcaaattgt tctctcccag tctccagcaa tcctgtctgc atctccaggg gagaaggtca caatgacttg cagggccagc tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagccag gatcctcccc caaaccctgg atttatgccc catccaacct ggcttctgga gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcaga gtggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccagcagt ggagttttaa cccacccacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa gatggcggtg gctcgggcgg tggtggatct 40 ggaggaggtg gagctagcca ggcttatcta cagcagtctg gggctgagct ggtgaggcct ggggcctcag tgaagatgtc ctgcaaggct tctggctaca catttaccag ttacaatatg 45 cactgggtaa agcagacacc tagacagggc ctggaatgga ttggagctat ttatccagga aatggtgata cttcctacaa tcagaagttc aagggcaagg ccacactgac tgtagacaaa tcctccagca cagcctacat gcagctcagc agcctgacat ctgaagactc tgcggtctat 50 ttctgtgcaa gagtggtgta ctatagtaac tcttactggt acttcgatgt ctggggcaca gggaccacgg tcaccgtctc gagcgagccc aaatcttctg acaaaactca cacatcccca 55 ccgagcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 60 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 10
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1140
ctcccagccc ccatcgagaa aacaatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaag 1500
aattatggtg gcggtggctc gggcggtggt ggatctggag gaggtgggag tgggaattct 1560
gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctaggtca gagagccacc 1620
atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa tattatgtca caagtttaat gcagtggtac 1680
20
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgctagcaa cgtagaatct 1740
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55
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25
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30
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40
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<223> Dobradiça
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35
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25
30
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15
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55
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30
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Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile 545 550 555 560
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45
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Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 705 710 715 720
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Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 755 760 765
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50
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440
55 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500
ccgggtaaga attatggtgg cggtggctcg ggcggtggtg gatctggagg aggtgggagt 1560
gggaattctc aggtgcagct gaaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 1620
ctgtccatca catgcaccgt ctcagggttc tcattaaccg gctatggtgt aaactgggtt 1680
60 cgccagcctc caggaaaggg tctggagtgg ctgggaatga tatggggtga tggaagcaca 174 0
gactataatt cagctctcaa atccagacta tcgatcacca aggacaactc caagagccaa 1800
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccagatacta ctgtgctcga 1860
gatggttata gtaactttca ttactatgtt atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 1920
accgtctcct ctgggggtgg aggctctggt ggcggtggat ccggcggagg tgggtcgggt 1980
ggcggcggat ctgacattgt gctcacccaa tctccagctt ctttggctgt gtctctaggt 2040
cagagagcca ccatctcctg cagagccagt gaaagtgttg aatattatgt cacaagttta 2100
15
atgcagtggt accaacagaa accaggacag ccacccaaac tcctcatctc tgctgctagc 2160
aacgtagaat ctggggtccc tgccaggttt agtggcagtg ggtctgggac agactttagc 2220
ctcaacatcc atcctgtgga ggaggatgat attgcaatgt atttctgtca gcaaagtagg 2280
aaggttccat ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaacgtta atctaga 2337
<210 > 229
<211> 772
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Polipeptideo sintético
<22 0 >
<223> 2H7cscIgGl-STDl-2el2HL (w/2E12 Líder) (AA)
35
40
45
50
55
60
<22 0 >
<221> misc_caracteristica
<222 > (1) . . (22)
<223 > Líder
<220 >
<221> misc_característica
< 222 > (23) . . (128) <223 > VL
<22 0 >
<221> misc_característica
<2 22 > (129) . . (144)
<223 > Ligante
< 22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (145) . . (265)
<223 > VH
<22 0 >
<221> misc_característica
<2 22 > (268) . . (282)
<223 > Dobradiça
<220> <221> misc_característica
<222 > (500) . . (519)
<223> Ligante de EFD-BD2
<22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (520) . . (640)
<223 > VH2
<220>
<221> misc_característica
<222> (641) . . (660)
<223 > Ligante2
<22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (661) . . (772)
<223 > VL2
<4 00> 229
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 10 15
25
45
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 25 30
3 0 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 40 45
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80
40
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110
0 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125
Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 55 130 135 140
60
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220
15
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
225 230 235 240
20
Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp 245 250 255
2 5 Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys 260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly 275 280 285
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300
35
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320
40
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 325 330 335
4 5 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365
50
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 370 375 380
55
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 385 390 395 400
6 0 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
405 410 415 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 420 425 430
5
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 435 440 445
10
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 465 470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 485 490 495
Pro Gly Lys Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 500 505 510
25
Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro 515 520 525
30
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser 530 535 540
3 5 Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro 545 550 555 560
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr 40 565 570 575
Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn 580 585 590
45
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp 595 600 605
0 Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Asn Phe His Tyr 610 615 620
Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 55 625 630 635 640
60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 645 650 655 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 660 665 670
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 675 680 685
Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 690 695 700
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser 705 710 715 720
15
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser 725 730 735
20
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys 740 745 750
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 755 760 765
Glu Ile Lys Arg 770
<210> 230
<211> 45
3 5 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
40
55
60
<22 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético < 2 2 0 >
<223 > scs (s) -hlgGl (DNA)
<4 0 0 > 230
4 5 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tctccaccga gctca 45
< 210 > 231
<211> 15
50 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Polipeptídeo sintético <220>
<22 3 > scs(s) -hlgGl (AA)
<4 0 0 > 231
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser 15
<210 > 232
<211> 45
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Polinucleotideo sintético <220 >
<223 > CCC (s) (DNA)
<4 0 0 > 232
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tctccaccgt gctca 4 5
<210 > 233
<211> 15
<212 > PRT
<213 > Seqüência artificial <22 0 >
2 5 <22 3 > Polipeptideo sintético < 22 0 >
<223> ccc (s) (AA)
<400> 233
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 10 15
35
40
<210 > 234
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<22 3> Polinucleotideo sintético
45 <2 2 0 >
<223 > Ligante H8 (PN)
50
<4 0 0 > 234
gggtctccac cttctccgaa ttct 24
<210 > 235 <211> 8
<212 > PRT 55 <213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223 > Peptídeo sintético
60 <4 0 0 > 235 Gly Ser Pro Pro Ser Pro Asn Ser 1 5
< 210 > 236 <211 > 21 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <220 > <223 > Polinucleotídeo sintético <22 0 > <223 > Ligante H9 (PN) <4 0 0 > 236 tctccacctt ctccgaattc t <210 > 237 <211> 7 < 212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Peptídeo sintético < 2 2 0 > <223 > Ligante H9 (AA)
21
<400> 237 3 5 Ser Pro Pro Ser Pro Asn Ser
1 5 <210> 238 40 < 4 0 0 > 238 000 <210> 239 45 <4 0 0 > 239 000 <210 > 240 50 <211 > 51 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial
<22 0 >
55 <22 3> Polinucleotídeo sintético <2 2 O >
<223> Ligante Hll (PN) 60 <4Q0> 240
gagcccacat ctaccgacaa aactcacaca tctccaccca gcccgaattc t 51 10
15
<210 > 241 <211> 17 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético <220>
<223 > Ligante Hll (AA) <400 > 241
Glu Pro Thr Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Asn 10 15
Ser
< 210 > 242 <211> 51 2 5 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético
30
45
50
<22 0 >
<223 > Ligante H12 (PN)
<4 00 > 242
3 5 gagcccacat ctaccgacaa aactcacaca tctccaccca gcccgaattc t 51
<210 > 243
<211> 17
40 <212 > PRT
<213 > Seqüência artificial
<22 0 >
<223 > Peptídeo sintético < 2 2 0 >
<223> Ligante H12 (AA) <4 00> 243
Glu Pro Thr Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Asn 10 15
55 Ser
<210> 244
<211> 51
<212> DNA
6 0 <213> Seqüência artificial 10
15
40
<22 0 >
<223> PolinucIeotídeo sintético <22 0>
<22 3> Ligante H13 (PN) <4 0 0 > 244
gagcccacat ctaccgacaa aactcacaca tctccaccca gcccgaattc t 51
< 210 > 245 <211> 17 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Peptídeo sintético <2 2 0 >
<223 > Ligante H13 (AA) <4 00> 245
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Asn 1 5 10 15
Ser
<210> 246
<211> 36
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> PolinucIeotídeo sintético
< 2 2 0 >
<223> Ligante H15 (PN)
<4 00> 246
ggcggtggtg gctcctgtcc accttgtccg aattct 36
45 <210 > 247
<211> 12
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
50 <2 2 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<2 2 0 >
55 <223> Ligante H15 (AA) <4 00> 247
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser 60 1 5 10 <210> 248
<211> 45
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 O >
<22 3> PolinucIeotídeo sintético
<22 O >
<223> Ligante H16 (PN)
15
25
30
<400> 248
ctgtctgtga aagctgactt cctcactcca tccatcggga attct 45
<210 > 249
<211> 15
<212> PRT
2 0 <213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<220 >
< 2 2 3 > Ligante H16 (AA) <4 00> 249
Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Leu Thr Pro Ser Ile Gly Asn Ser 10 15
<210 > 250
<211> 60
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial
40 <22 0 >
<22 3> Polinucleotídeo sintético
<2 2 0 >
45 <223> Ligante H17 (PN) <4 00> 250
ctgtctgtga aagctgactt cctcactcca tccatctcct gtccaccttg cccgaattct 60
50
55
<210 > 251 <211> 20 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Peptídeo sintético
60 <2 2 0 >
<223> Ligante H17 (AA) 10
20
35
40
45
50
55
60
<400> 251
Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Leu Thr Pro Ser Ile Ser Cys Pro Pro 10 15
Cys Pro Asn Ser 20
< 210 > 252 <211> 45 <212 > DNA <213 > Seqüência
<22 0 >
<22 3> Polinucleotídeo sintético
<22 0 >
< 22 3 > Ligante H18 (PN)
<4 0 0 > 252
ctgtctgtgc tcgctaactt cagtcagcca gagatcggga attct 45
30
<210 > 253 <211 > 15 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Peptideo sintético < 2 2 0 > <223 > Ligante H18 (AA) <4 0 0 > 253
Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Gly Asn Ser 10 15
<210 > 254 <211 > 60 < 212 > DNA < 213 > Seqüência artificial < 2 2 0 > <223 > Polinucleotídeo sintético <22 0 > <223 > Ligante H19 (PN) <4 0 0 > 254
ctgtctgtgc tcgctaactt cagtcagcca gagatctcct gtccaccttg cccgaattct 60 <210 > 255
< 211> 20
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
<223> Peptídeo sintético
<22 0 >
<223 > Ligante H19 (AA)
<4 Q0> 255
Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Ser Cys Pro Pro 10 15
Cys Pro Asn Ser 20
< 210 > 256
<211> 45
2 5 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Polinucleotídeo sintético
30
<2 2 0 >
<223> Ligante H20 (PN)
<4 0 0 > 256
ctgaaaatcc aggagagggt cagtaagcca aagatctcga attct 45
< 210 > 257
40 <211> 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
4 5 <223> Peptideo sintético
50
55
<22 0 >
<223> Ligante H20 (AA) <400 > 257
Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Asn Ser 10 15
< 210 > 258
<211> 60
<212> DNA
60 <213> Seqüência artificial <22 O >
<223> Polipeptídeo sintético
10
15
20
40
<22 0 >
<223> Ligante H21 (PN) <4 00> 258
ctgaaaatcc aggagagggt cagtaagcca aagatctcct gtccaccttg cccgaattct 60
<210 > 259 <211> 20 <2 12 > PRT <2 13 > Seqüência artificial <2 2 0 > <2 2 3 > Peptídeo sintético <22 0 > <223 > Ligante H21 (AA) <4 0 0 > 259
2 5 Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Cys Pro Pro 10 15
Cys Pro Asn Ser 20
<210 > 260 <211> 45 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<2 2 0 >
<22 3> Polipeptídeo sintético
<22 0>
<223> Ligante H22 (PN)
<4 0 0 > 260
45 ctggatgtga gtgagaggcc ttttcctcca cacatccaga attct 4 5
50
<210 > 261 <211> 15 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Peptideo sintético <22 0 > <22 3 > Ligante H22 (AA)
55
60 <4 0 0 > 261 Leu Asp Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His Ile Gln Asn Ser 10 15
<210> 262 < 211 > 63 <212 > DNA < 213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Polinucleotideo sintético < 22 0 > <223 > Ligante H23 (PN) <4 0 0 > 262
30
35
50
55
60
ctggatgtga gtgagaggcc ttttcctcca cacatccagt cctgtccacc ttgcccgaat 60
63
tct <210> 263 <211 > 21 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Peptídeo sintético <22Q>
< 22 3 > Ligante H23 (AA) <4 0 0 > 263
Leu Asp Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His Ile Gln Ser Cys Pro 10 15
4 0 Pro Cys Pro Asn Ser 20
45
<210 > 264 < 211 > 45 < 212 > DNA <213 > Seqüência artificial <22 0 > <2 2 3 > Polinucleotideo sintético <220 > < 2 2 3 > Ligante H24 (DNA) <4 0 0 > 264 cgggaacagc tggcagaggt cactttgagc <210 > 265 < 211 > 15 <212 > PRT
45 <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Peptideo sintético <22 0 > <2 2 3 > Ligante H24 (AA) <4 00> 265 Arg Glu Gln Leu Ala Glu Val Thr 1 5 <210> 266 <211> 60 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <2 2 0 > <223 > Polinucleotídeo sintético <220> <22 3 > Ligante H25 (PN) <4 0 0 > 266 cgggaacagc tggcagaggt cactttgagc <210 > 267 <211 > 20 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial < 2 2 0 > <2 23 > Peptideo sintético 40 <2 2 0 > <223 > Ligante H25 (AA)
15
60
<4 00> 267
4 5 Arg Glu Gln Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Leu Lys Ala Cys Pro Pro 10 15
Cys Pro Asn Ser 50 20
<210 > 268
<211> 45
55 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Polinucleotídeo sintético
60 <220>
<223> Ligante H26 (PN)
<4 OO > 268
cggattcacc agatgaactc cgagttgagc gtgctcgcga attct 45
<210 > 269
<211> 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
15
25
30
40
<220>
<223> Peptídeo sintético
<2 2 0 >
<22 3 > Ligante H26 (AA)
<4 0 0 > 269
Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Ser 10 15
< 210 > 270
<211> 60
<212> DNA
<213 > Seqüência artificial <22 0 >
<22 3> PolinucleotIdeo sintético
<220 >
<223> Ligante H27 (PN)
<4 0 0 > 270
cggattcacc agatgaactc cgagttgagc gtgctcgctt gtccaccctg cccgaattct 60
<210 > 271 <211> 20 <212 > PRT 45 <213 > Seqüência artificial <2 2 0 > <223 > Peptídeo sintético 50 <2 2 0 > <2 2 3 > Ligante H27 (AA) <4 00> 271
5 Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Cys Pro Pro 10 15
Cys Pro Asn Ser 60 20 10
25
35
40
50
<210 > 272
<211> 45
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
<2 2 3> Polinucleotideo sintético
<22 0>
<223 > Ligante H28 (PN)
<400> 272
gataccaaag ggaagaacgt cctcgagaag atcttctcga attct 45
<210 > 273
<211> 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Peptídeo sintético
<22 0 >
<223> Ligante H28 (AA)
<4 0 0 > 273
Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Ser Asn Ser 10 15
<210 > 274
<211> 63
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<22 3> Polinucleotideo sintético
45 <22 0 >
<223> Ligante H29 (PN)
<4 0 0 > 274
gataccaaag ggaagaacgt cctcgagaag atcttcgact cctgtccacc ttgcccgaat 60
tct 63
<210 > 275
55 <211 > 21
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220> 60 <22 3 >
Peptídeo sintético 10
30
35
<220>
<223> Ligante Η29 (AA) <4 O 0 > 275
Asp Thr Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Ser Cys Pro 10 15
Pro Cys Pro Asn Ser 20
< 210 > 276 <211> 45 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <22 0 > <223 > PolinucIeotídeo sintético <220 > <223 > Ligante H3 0 (PN) <4 0 0 > 276
ctgccacctg agacacagga gagtcaagaa gtcaccctga attct 45
<210> 277
<211> 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial < 22 0 >
<223> Peptídeo sintético
40 <22 0 >
<223> Ligante H30 (AA)
<4 0 0 > 277
4 5 Leu Pro Pro Glu Thr Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Asn Ser 10 15
<210 > 278 50 <211> 63 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
55 <223> Polinucleotideo sintético
<22 0 >
<223> Ligante H31 (PN)
60
<400> 278 10
ctgccacctg agacacagga gagtcaagaa gtcaccctgt cctgtccacc ttgcccgaat 60
tct 63
<210> 279
<211> 21
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3 > Peptideo sintético
<220>
<223> Ligante H31 (AA)
<4 0 0 > 279
2 0 Leu Pro Pro Glu Thr Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Ser Cys Pro 10 15
Pro Cys Pro Asn Ser 20
< 210 > 280 <211 > 45 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético
35
<2 2 0 >
<223> Ligante H32 (PN) 40 <4 0 0 > 280
cggattcacc tgaacgtgtc cgagaggccc tttcctccga attct 45
<210 > 281
45 <211 > 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
50 <223 > Peptídeo sintético
55
60
<220>
<223> Ligante H32 (AA) <400 > 281
Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro Asn Ser 10 15 <210 > 282
<211> 60
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Polinucleotídeo sintético
<22 0 >
<223 > Ligante H33 (PN)
15
25
30
40
45
50
55
<4 00> 282
cggattcacc tgaacgtgtc cgagaggccc tttcctccct gtccaccctg cccgaattct 60
< 210 > 283
< 211> 20 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Peptídeo sintético
< 2 2 0 >
<223> Ligante H33 (AA) <4 0 0 > 283
Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro Cys Pro Pro 10 15
3 5 Cys Pro Asn Ser 20
<210 > 284
<4 00> 284 000
<210> 285
<4 0 0 > 285 000
<210 > 286
<4 00 > 286 000
<210 > 287
<4 00> 287 000
<210> 288 60 <211> 39 <212> DNA <213> Seqüência artificial <22 O >
<223> Peptídeo sintético
< 2 2 0 >
<223> Ligante H36 (PN) <4 0 0 > 288
gggtgtccac cttgtccagg cggtggtgga tcgaattct 39
< 210 > 289 <211> 13 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial
<220 >
<223> Peptídeo sintético
<2 2 0 >
<223> Ligante H3S (AA)
25
<4 00> 289
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser 10
30
<210 > 290
<4 0 0 > 290 000
< 210 > 291
<4 0 0 > 291 40 000
< 210 > 292
<4 00 > 292 45 000
<210 > 293
<4 0 0 > 293 50 000
<210 > 294
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<400> 295 60 000 <210 > 296
<211> 27
<212> DNA
< 213 > Seqüência artificial <22 O >
<223> Polinucleotídeo sintético
<2 2 0 >
<223> Ligante H40 (PN)
15
25
30
60
<400> 296
ggatgtccac cttgtcccgc gaattct 2 7
<210 > 297 <211> 9 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial
< 2 2 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<2 2 0 >
<223> Ligante H40 (AA) <4 00 > 297
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Asn Ser
1 5 <210> 298 <4 0 0 > 298 000 40 <210 > 299 <211> 9 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial 45 <2 2 0 > < 2 2 3 > Peptídeo sintético <22 0 >
0 <221> misc_característica <223> Ligante H41
<4 0 0 > 299
55 Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Asn Ser 1 5
< 210 > 300 <4 0 0 > 300 ooo
<210 > 301 <211 > 8 <212 > PRT < 213 > Seqüência artificial
10
15
<220 >
<22 3 > Peptídeo sintético <22 0 >
<223> Ligante H4 2(AA) <400> 301
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser 1 5
<210 > 302
<400> 302 000
<210 > 303
<4 0 0 > 303 000
<210 > 304 <211> 36 <212 > DNA <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > PolinucIeotídeo sintético <22 0 > 40 <223 > Ligante H44 (PN) <4 0 0 > 304 ggaggagcta gttgtccacc ttgtcccggg 45 <210 > 305 <211 > 12 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial 50 < 22 0 > <223 > Peptídeo sintético 55 <220 > <223 > Ligante H44 (AA) <400 > 305
36
6 0 Gly Gly Ala Ser Cys Pro Pro Cys Pro Gly Asn Ser 10 10
<210 > 306
<211> 36
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<22 3> PolinucIeotídeo sintético
<22 0>
<223> Ligante H45 (PN) <4 0 0 > 306
ggaggagcca gttgtccacc ttgtgccggg aattct 36
<210> 307 <211 > 12 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
2 5 <22 3> Peptídeo sintético
30
35
50
55
<22 0 >
<223> Ligante H45 (AA) <4 0 0> 307
Gly Gly Ala Ser Cys Pro Pro Cys Ala Gly Asn Ser 10
<210 > 308
<211> 33
<212 > DNA
40 <213> Seqüência artificial
<22 0>
<223> Polinucleotídeo sintético
45 <22 0 >
<223> Ligante H46
<4 0 0 > 308
ggaggagcca gttgtccacc ttgtgcgaat tct 3 3
<210> 309
<211> 11
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<22 0 >
60 <223> Ligante H46 <4OO> 309
Gly Gly Ala Ser Cys Pro Pro Cys Ala Asn Ser
10
<210 > 310 <211> 15 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Peptídeo sintético
15
20
40
<22 0>
<223> Ligante H47 <400> 310
Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Leu Thr Pro Ser Ile Gly Asn Ser 10 15
<210> 311 <211> 12 <212 > PRT <213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223 > Peptídeo sintético
<22 0 >
<223 > Ligante H48
<400> 311
3 5 Lys Ala Asp Phe Leu Thr Pro Ser Ile Gly Asn Ser 10
< 210 > 312
<4 0 0 > 312 000
<210 > 313
45 <211 > 15
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
0 <22 3 > Peptídeo sintético < 22 0 >
<223> Ligante H50
55 <4 0 0 > 313
Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Gly Asn Ser 10 15
60
<210 > 314 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Peptideo sintético
<22 O >
<223> Ligante Η51 <4 00 > 314
Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Gly Asn Ser 1 5 10 15
< 210 > 315
< 211> 11 2 0 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
25
30
<220 >
<223 > Peptídeo sintético <22 0 >
<223 > Ligante H52 <4 0 0 > 315
Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ser 10
<210 > 316
< 211> 16
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
40 <22 0 >
<22 3 > Peptideo sintético
<22 0 >
45 <223> Ligante H53 <4 0 0 > 316
Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser 50 1 5 10 15
<210 > 317 <211> 19
5 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
60
<220 >
<22 3 > Peptídeo sintético <22 Q>
<223> Ligante H54 <400> 317
Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Ser Cys Pro Pro Cys 10 15
Pro Asn Ser
<210> 318 <211 > 15 < 212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <223 > Peptideo sintético <22 0 > <223 > Ligante H55 <4 0 0 > 318 Arg Ile ; His Gln Met Asn Ser 1 5 <210 > 319 <211 > 12 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <220 > <223 > Peptídeo sintético 40 <22 0 >
15
<223 > Ligante H56 <4 0 0 > 319
4 5 Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Ser 10
50
<210 > 320 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial
<22 0 >
5 <22 3 > Peptideo sintético
60
<220>
<223> Ligante H57 <400> 320 10
Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro Asn Ser 10
<210 > 321
< 211> 15
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<22 0 >
<223> Ligante H58 <4 0 0 > 321
Lys Pro Phe Phe Thr Cys Gly Ser Ala Asp Thr Cys Pro Asn Ser 1 5 10 15
<210 > 322 < 211 > 15 <212 > PRT < 213 > Seqüência artificial <22 0 > <223 > Peptídeo sintético <22 0 > <22 3 > Ligante H5 9 <4 0 0 > 322 Lys Prc > Phe Phe Thr Cys Gly 1 5 < 210 > 323 40 < 211 > 14 < 212 > PRT < 213 > Seqüência artificial < 22 0 > 45 < 22 3 > Peptídeo sintético
15
50
55
< 22 0 >
<223> Ligante H60 <4 0 0 > 323
Gln Tyr Asn Cys Pro Gly Gln Tyr Thr Phe Ser Met Asn Ser 10
<210 > 324
<211> 21
<212 > PRT
6 0 <213 > Seqüência artificial < 22 O >
<22 3> Peptídeo sintético
<220>
<223> Ligante H61 <4 0 0 > 324
Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly Pro Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser 10 15
Asp Cys Pro Asn Ser 20
<210> 325 <211 > 21 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <223 > Peptídeo sintético <22 0> <2 2 3 > Ligante H62 <4 0 0 > 325
Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala Arg 10 15
35
His Cys Pro Asn Ser 20
40 <210 > 326 <211> 19 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
45 <22 0 >
<223> Peptídeo sintético
<220 >
50 <223 > Ligante H63 <400> 326
Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr 55 1 5 10 15
Cys Asn Ser
60 10
35
40
45
50
<210> 327 <211> 21 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial < 22 0 >
<223> Peptídeo sintético <400> 327
Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala Arg 10 15
His Cys Pro Asn Ser 20
<210> 328 < 211> 21 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Peptídeo sintético <22 0 > < 22 3 > Ligante H65 <4 0 0 > 328
Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly Pro Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser 10 15
Asp Cys Pro Asn Ser 20
<210> 329 <211 > 21 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial < 22 0 > <223 > Peptídeo sintético < 22 0 > <223 > Ligante H66 <4 0 0 > 329
Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly Pro Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser 55 1 5 10 15
Asp Cys Pro Asn Ser 20
60 <210 > 330
<211> 21
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<2 23> Peptídeo sintético
<22 0 > <223 > Ligante H67 <4 00 > 330 Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly 1 5 Asp Cys Pro Asn Ser 20 <210 > 331 <211 > 118 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <223 > <22 0 > Peptideo sintético <223 > Ligante H68 <4 00> 331
35
55
15
Arg Thr Arg Tyr Leu Gln Val Ser Gln Gln Leu Gln Gln Thr Asn Arg 10 15
4 0 Val Leu Glu Val Thr Asn Ser Ser Leu Arg Gln Gln Leu Arg Leu Lys 25 30
Ile Thr Gln Leu Gly Gln Ser Ala Glu Asp Leu Gln Gly Ser Arg Arg 45 35 40 45
Glu Leu Ala Gln Ala Gln Glu Ala Leu Gln Val Glu Gln Arg Ala His 50 55 60
50
Gln Ala Ala Glu Gly Gln Leu Gln Ala Cys Gln Ala Asp Arg Gln Lys 65 70 75 80
Thr Lys Glu Thr Leu Gln Ser Glu Glu Gln Gln Arg Arg Ala Leu Glu 85 90 95
6 0 Gln Lys Leu Ser Asn Met Glu Asn Arg Leu Lys Pro Phe Phe Thr Cys 100 105 110 15
20
Gly Ser Ala Asp Thr Cys 115
<210 > 332 <211> 10 <212> PRT <213 > Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<2 2 0 >
<223> anti-CD-20 VL CDRl
<40Q> 332
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 10
<210> 333 <211 > 10 <2 12 > PRT <2 13 > Seqüência artificial <2 2 0 > <2 2 3 > Peptideo sintético <2 2 0 > <2 2 3 > ant i-CD-2 0 VL CDRl <4 0 0 > 333
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile Val 40 1 5 10
45 <210> <211> <212 > <213 > 334 9 PRT Seqüência artificial 50 <22 0 > <22 3 > Peptídeo sintético <22 0 > <223> anti-CD-20 VL CDR3 55 <400> 334
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 1 5
60
<210 > 335 <211> 9
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
< 2 2 O >
<223> Peptideo sintético
<220 >
<223 > anti-CD-2 0 VL CDR3 <400> 335
Gln Gln Tyr Ser Phe Asn Pro Pro Thr 1 5
<210 > 336 <211> 17 2 0 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
25
35
<220 >
<22 3> Peptideo sintético
< 22 0 >
<223> anti-CD-2 0 VH CDR2
<4 00 > 336
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 10 15
Gly
40 < 210 > 337
< 211> 17
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
45 < 2 2 0 >
<223 > Peptideo sintético
<2 2 0 >
50 <2 2 3 > anti-CD-20 VH CDR2 <4 00 > 337
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 55 1 5 10 15
Gly
60 <210> 338
<211> 12
<212 > PRT
<213 > Seqüência artificial <2 2 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
< 22 0 >
<223> anti-CD20 VH CDR3
<400> 338
Ser Val Tyr Tyr Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 10
<210> 339 <211> 12 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
2 5 <223 > Peptídeo sintético
<22 0 >
<223> anti-CD20 VH CDR3 <40 0> 339
30
35
45
50
Ser Val Tyr Tyr Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 10
<210 > 340 <211> 12 <212 > PRT 40 <213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<22 0 >
<223 > anti-CD2 0 VH CDR3 <4 0 0 > 340
Ser Tyr Tyr Ser Asn Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 10
55 <210 > 341
<211> 12
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
60 <22 0 >
<22 3 > Peptídeo sintético 10
<220 >
<223 > anti-CD20 VH CDR3 <4 0 0 > 341
Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 10
<210> 342 <211> 12 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial
<22 0>
<2 2 3> Peptídeo sintético
<220>
<223> anti-CD2 0 VH CDR3
<4 00> 342
Ser Tyr Lys Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 10
20
25
30
35
40
Ser Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 45 1 5 10
50
55
60
< 210 > 343 < 211> 12 < 212 > PRT <213 > Seqüência artificial < 22 0 > < 2 2 3 > Peptídeo sintético <220> <22 3 > anti-CD20 VH CDR3 <4 0 0 > 343
<210 > 344 <211> 12 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <220 > <22 3 > Peptídeo sintético <22 0 > <22 3 > anti-CD-20 VH CDR3 <4 0 0 > 344 Ser Tyr Lys Ser Asn Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 10
< 210 > 345 <2 11> 12 <2 12> PRT <2 13 > Seqüência artificial
<2 2 0 >
<223> Peptídeo sintético
<22 0 >
<223 > anti-CD2 0 VH CDR3 <4 0 0 > 345
Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10
<210 > 346 < 211 > 8 < 212 > PRT < 213 > Seqüência artificial
<220 >
<223> Peptideo sintético
30
< 22 0 >
<223> Seqüência (2H7) de núcleo de ligante Scorpion
<4 00 > 346
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser 1 5
40
45
<210> 347
< 211> 4 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
50 <220>
<223> Seqüência de Extensão
<4 0 0 > 347
5 Ala Pro Glu Leu 1
<210> 348 60 <211 > 9
<212 > PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Peptídeo sintético
<220>
<22 3> Seqüência de Extensão <4 0 0 > 348
Ala Pro Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser
15
20
<210 > 349 <211> 14 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<220>
<223> Seqüência de Extensão
<4 00> 349
3 0 Ala Pro Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 10
<210 > 350
<211> 19
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
40 <223> Peptideo sintético
<22 0 >
<22 3> Seqüência de Extensão <400> 350
45
50
55
60
Ala Pro Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 10 15
Gly Gly Ser
<210 > 351
<211> 12
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 > <22 3> Peptídeo sintético
< 22 0 >
<22 3> Ligante Scorpion Estendido <4 00> 351
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser Ala Pro Glu Leu 1 5 10
<210> 352
<211> 17
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Ligante Scorpion Estendido
20
25
<40 0> 352
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser Ala Pro Glu Leu Gly Gly Gly Gly 10 15
Ser
< 210 > 353 < 211 > 22 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial
< 22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
40 <220 >
<223> Ligante Scorpion Estendido
<4 0 0 > 353
4 5 Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser Ala Pro Glu Leu Gly Gly Gly Gly 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 20
<210> 354 <211 > 27 < 212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Peptídeo sintético < 2 2 O >
<223> Ligante Scorpion Estendido <4 00> 354
5
Gly Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser Ala Pro Glu Leu Gly Gly Gly Gly 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 25
<210 > 355
<211> 51
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
2 0 <223 > Peptideo sintético
25
30
35
40
45
50
<22 0 >
<22 3 > VL CDRl-X-VL CDR3-X- VH CDR2-X-VH CDR3 <22 0 >
<221> misc_característica
<222> (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de arainoácidos entre VL CDRl e VL CDR3 <22 0 >
<221> misc_característica
<222> (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDR3 e VH CDR2 < 2 2 0 >
<221> misc_característica
<22 2 > (39) . . (39)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3
<4 0 0 > 355
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Xaa Gln Gln Trp Ser Phe
10 15
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 25 30
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Val Tyr Tyr Ser Asn Tyr Trp Tyr 40 45
55 Phe Asp Leu 50
<210 > 356 60 <211> 51 <212> PRT <213> Seqüência artificial <22 O >
<22 3> Peptídeo sintético
<220>
<223 > VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3
< 2 2 0 >
<221> misc_característica < 2 2 2 > (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDRl e VL CDR3
< 2 2 0 >
<221> misc_característica < 2 2 2 > (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDR3 e VH CDR2
<22 0>
<221> misc_característica < 2 2 2 > (39) . . (39)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3 <4 0 0 > 356
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Xaa Gln Gln Trp Ser Phe
10 15
30
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 25 30
3 5 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Val Tyr Tyr Gly Gly Tyr Trp Tyr 40 45
Phe Asp Leu 40 50
< 210 > 357 < 211 > 51 <212> PRT < 213 > Seqüência artificial < 2 2 0 > < 2 2 3 > Peptídeo sintético
45
50
< 2 2 0 >
< 223 > VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3
55 < 22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDRl e VL CDR3
60 <220>
<221> misc característica 10
25
35
55
<2 2 2 > (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDR3 e VH CDR2 <22 0 >
<221> misc_característica <222 > (39) . . (39)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3 <400> 357
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Xaa Gln Gln Trp Ser Phe 10 15
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 25 30
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Tyr Ser Asn Ser Asp Trp Tyr 35 40 45
Phe Asp Leu 50
<210 > 358
<211> 51
<212 > PRT
3 0 <213> Seqüência artificial
<22 0>
<223> Peptídeo sintético
<22 0 >
< 2 2 3 > VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3
<22 0 >
4 0 <221> misc_característica
<222 > (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDRl e VL CDR3 < 22 0 >
4 5 <221> misc__caracterí stica
<222> (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDR3 e VH CDR2 < 22 0 >
50 <221> misc_característica
< 22 2 > (39) . . (39)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3
<4 00> 358
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Xaa Gln Gln Trp Ser Phe 10 15
6 0 Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 25 30 55
60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Tyr Ser Gly Gly Asp Trp Tyr 40 45
Phe Asp Leu 50
< 210 > 359 <211> 51 <212 > PRT < 213 > Seqüência artificial < 22 0 > < 22 3 > Peptídeo sintético
10
15
<220>
< 22 3 > VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3
<22 0 >
<221> misc_característica
<222> (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de aminoãcidos entre VL CDRl e VL CDR3
<22 0 >
<221> misc_característica
<222> (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDR3 e VH CDR2
<22 0 >
<221> misc_característica
<222> (39) . . (39)
<223> Xaa uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3
<4 0 0 > 359
4 0 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile Val Xaa Gln Gln Trp Ser Phe
10 15
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 45 20 25 30
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Lys Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr 40 45
50
Phe Asp Leu 50
<210 > 360
<211> 51
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial < 22 0 > <2 23> Peptídeo sintético
<22 0 >
<223 > VLCDRI-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3 <220>
<221> misc_característica
<222 > (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de aminoãcidos entre VL CDRl e VL CDR3
<22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoãcidos entre VL CDR3 e VH CDR2
<22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (39) . . (39)
2 0 <22 3> Xaa = uma faixa de aminoãcidos entre VH CDR2 e VH CDR3
<400 > 360
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile Val Xaa Gln Gln Trp Ser Phe
1 5 10 15
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr 25 30
30
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr 40 45
35
Phe Asp Leu 50
40 <210 > 361
< 211> 51 <212> PRT
< 213 > Seqüência artificial
45 <22 0 >
<223 > Peptideo sintético
<22 0 >
50 <22 3 > VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3 < 22 0 >
<221> misc_característica
<222> (11) . . (11)
55 <22 3 > Xaa = uma faixa de aminoãcidos entre VL CDRl e VL CDR3
< 22 0 >
<221> misc_característica
< 222 > (21) . . (21)
60 <223 > Xaa = uma faixa de aminoãcidos entre VL CDR3 e VH CDR2 10
15
35
40
45
50
55
60
<220>
<2 21> misc__caracterí stica
<222> (39) . . (39}
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3 <4 0 0 > 361
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile Val Xaa Gln Gln Tyr Ser Phe 10 15
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 25 30
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr 40 45
2 0 Phe Asp Leu 50
<210 > 362 <211> 51 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
3 0 <223> Peptídeo sintético
<22 0 >
<22 3> VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3
<2 2 0 >
<221> misc_característica
<222> (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDRl e VL CDR3 < 2 2 0 >
<2 21> misc_característica
<2 2 2 > (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDR3 e VH CDR2 <22 0 >
<221> misc_característica
<22 2 > (39) . . (39)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3
<4 0 0 > 362
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Xaa Gln Gln Trp Ser Phe
10 15
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 25 30
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Lys Ser Asn Ser Asp Trp Tyr 40 45
Phe Asp Leu 50
<210> 363
< 211> 51 <212> PRT
<213 > Seqüência artificial
<220>
<22 3 > Peptídeo sintético
15
< 22 0 >
<22 3> VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3
<22 0 >
<221> misc_característica
<222> (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDRl e VL CDR3
<22 0 >
<221> misc_característica
<222 > (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDR3 e VH CDR2
<22 0 >
<221> misc_característica
< 222 > (39) . . (39)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3
<4 00 > 363
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Xaa Gln Gln Trp Ser Phe 10 15
40
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr 25 30
4 5 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Tyr Ser Asn Ser Asp Trp Tyr 40 45
Phe Asp Leu 50 50
<210 > 364 <211> 51 55 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
60
< 22 0 >
<22 3> Peptideo sintético <220>
< 2 2 3 > VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3
< 22 O >
<221> misc_característica
<222 > (11) . . (11)
<223> Xaa = uma faixa de aminoãcidos entre VL CDRl e VL CDR3 <2 2 0 >
<221> misc_característica
<222 > (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VL CDR3 e VH CDR2 <220>
<221> misc__carac ter í stica
<2 22 > (39) . . (39)
<223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3
20
25
<4 00> 364
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Xaa Gln Gln Tyr Ser Phe 10 15
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 25 30
3 0 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Tyr Ser Asn Ser Asp Trp Tyr 40 45
Phe Asp Leu 50
< 2 10 > 365 <2 11> 51 <2 12 > PRT 40 <213 > Seqüência artificial <2 2 0 > <223> Peptídeo sintético 45 <2 2 0 > <2 2 3 > VLCDRl-X-VLCDR3-X- VHCDR2-X-VHCDR3 <220> 50 < 2 21 > misc característica <2 22 > (11) . . (H) <2 2 3 > Xaa = uma faixa de aminoácidos entre <2 2 0 >
55 <221> misc_característica
<222> (21) . . (21)
<223> Xaa = uma faixa de aminoãcidos entre VL CDR3 e VH CDR2 <220>
6 0 <221> misc_característica
<222> (39) . . (39) <223> Xaa = uma faixa de aminoácidos entre VH CDR2 e VH CDR3 <4 00 > 365
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Xaa Gln Gln Tyr Ser Phe 10 15
Asn Pro Pro Thr Xaa Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr 20 25 30
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Xaa Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Asp Trp Tyr 40 45
15
Phe Asp Leu 50
20
25
<210 > 366
<211> 10
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0>
<22 3> Peptídeo sintético
<22 0 >
<223> Seqüência de CH3 parcial
<4 0 0 > 366
3 5 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 10
< 210 > 367
40 < 211 > 9
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
4 5 <22 3> Peptideo sintético
<22 0 >
<223> Seqüência de CH3 parcial
50
55
<40 0> 367
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5
<210 > 368
<211> 1
<212> PRT
60 <213> Seqüência artificial 10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
264/267
<2 2 0 >
<223> Peptídeo sintético <220>
<223> Seqüência de CH3 parcial
<400> 368
Gln 1
< 210 > 369 <211> 3 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223 > Peptideo sintético
<22 0 >
<22 3> Seqüência de CH3 parcial
<4 0 0 > 369
Gln Lys Ser 1
<210 > 370
<211> 6
<212 > PRT
<213 > Seqüência artificial <22 0 >
<223> Peptídeo sintético
< 22 0 >
<223> Seqüência de CH3 parcial <4 0 0 > 370
Gln Lys Ser Leu Ser Leu 1 5
<210 > 371
<211> 5
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<22 3> Peptídeo sintético
<220> <22 3 >
Seqüência de CH3 parcial <4 OO> 371
Gln Lys Ser Leu Ser 1 5
<210> 372
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<22 3 > Peptídeo sintético
15
20
<22 0>
<223 > Ligante Scorpion
<4 0 0 > 372
Gly Cys Pro Pro Cys 1 5
<210 > 373
< 211> 12
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0>
<22 3> Peptideo sintético
<2 2 0 >
3 5 <223> Ligante Scorpion <4 0 0 > 373
Gln Tyr Asn Cys Pro Gly Gln Tyr Thr Phe Ser Met 40 1 5 10
<210> 374 <211> 11 4 5 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
50
<22 0 >
<22 3> Peptídeo sintético
<22 0 >
< 2 2 3 > Ligante Scorpion
55 <400> 374
60
Pro Phe Phe Thr Cys Gly Ser Ala Asp Thr Cys 10
<210 > 375 <211> 18
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 O >
<22 3> Peptídeo sintético
<22 0 >
<22 3> Ligante Scorpion <4 0 0 > 375
Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly Pro Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser 1 5 10 15
20
Asp Cys
<210 > 376 <211> 18 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > <22 3 > Peptídeo sintético <220> <22 3 > Ligante Scorpion <4 0 0 > 376 Gln Arg • His Asn Asn Ser Ser 1 5 40 His Cys <210 > 377 45 <211 > 17 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0 > 50 <22 3 > Peptideo sintético <22 0 >
15
<22 3> Ligante Scorpion
55
<400> 377
Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr 10 15
60 Cys
<210 > 378 <211 > 10 < 212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 0> <223> Peptideo sintético <2 2 0 > <223> anti-CD20 VL CDRl (TRU <4 0 0 > 378
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10
25
30
35
<210 > 379 <211> 13 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial < 22 0 > < 22 3 > Peptideo sintético <2 2 0 > <22 3 > anti-CD2 0 VH CDR3 (TRU <4 0 0 > 379
Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 10

Claims (98)

1. Proteína de ligação multivalente de cadeia simples com função efetora caracterizada por compreender: a. um primeiro domínio de ligação derivado de uma imunoglobulina ou molécula imunoglobulina-like; b. uma sub-região constante que fornece uma função efetora, a sub-região constante da imunoglobulina localizada no terminal C em relação ao primeiro domínio de ligação; c. um ligante scorpion localizado no terminal C em relação â sub-região constante; e d. um segundo domínio de ligação derivado de uma imunoglobulina ou molécula imunoglobulina-liice localizado no terminal C em relação à sub-região constante; localizando, dessa forma a sub-região constante entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação.
2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação compreende uma região variável leve derivada de uma primeira imunoglobulina e uma região variável pesada derivada de uma segunda imunoglobulina.
3. Proteína, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a primeira imunoglobulina e a segunda imunoglobulina são a mesma imunoglobulina.
4. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende uma região variável leve derivada de uma primeira imunoglobulina e uma região variável pesada derivada de uma segunda imunoglobulina.
5. Proteína, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a primeira imunoglobulina e a segunda imunoglobulina são a mesma imunoglobulina.
6. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhecem o mesmo alvo molecular.
7. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhecem o mesmo epitopo.
8. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhecem alvos moleculares diferentes na mesma célula eucariótica, célula procariótica, vírus, veículo ou objeto.
9. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhecem alvos moleculares associados âs células eucarióticas, células procarióticas, vírus, veículos ou objetos fisicamente distintos.
10. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhece pelo menos um alvo molecular não associado a uma célula eucariótica, célula procariótica, vírus, veículo ou obj eto.
11. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação, o segundo domínio de ligação e a sub-região constante são, cada um, derivados de uma imunoglobulina humana.
12. Proteína, de acordo com a reivindicação, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhece um alvo em uma célula cancerígena.
13. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhece um alvo selecionado do grupo que consiste em um antígeno tumoral, um alvo de célula B, um membro da superfamília do receptor de TNF, um membro da família Hedgehog, uma tirosina quinase receptora, uma molécula relacionada ao proteoglicano, um membro da superfamília TGF-beta, uma molécula relacionada a Wnt, um ligante de receptor, um alvo de célula T, um alvo de célula dendrítica, um alvo de célula NKi um alvo celular de monócito/macrófago e um alvo de angiogênese.
14. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o antígeno tumoral é selecionado do grupo que consiste em antígeno 1 do carcinoma de células escamosas, antígeno 2 do carcinoma de células escamosas, antígeno do carcinoma ovariano CA125, mucina 1, antígeno tumoral CTCL sei-1, antígeno tumoral CTCL sel4-3, antígeno tumoral CTCL se20-4, antígeno tumoral CTCL se20-9, antígeno tumoral CTCL se33-l, antígeno tumoral CTCL se37-2, antígeno tumoral CTCL se57-l, antígeno tumoral CTCL se89- 1, antígeno da membrana específico da próstata, glicoproteína oncofetal do trofoblasto 5T4, herpesvírus Associado ao sarcoma de Kaposi Orf73, MAGE-Cl, MAGE-Bl antigeno, antigeno MAGE-B2, antigeno MAGE-2, antigeno MAGE- 4a, antigeno MAGE-4b, antigeno do câncer de cólon NY-CO-45, antigeno do câncer de pulmão NY-LU-12 variante A, antigeno de superfície associado ao câncer, antigeno do adenocarcinoma ARTl, antigeno paraneoplásico associado ao câncer cerebral-testicular, antigeno ventral neuro- oncológico 2, gene do antigeno do carcinoma hepatocelular 520, antigeno tumor-associado C0-029, antigeno MAGE-X2 tumor-associado, sarcoma sinovial X breakpoint 2, antigeno do carcinoma de células escamosas reconhecido por célula T, antigeno do câncer de cólon definido sorologicamente 1, antigeno do câncer de mama definido sorologicamente NY-BR- 15, antigeno do câncer de mama definido sorologicamente NY- BR-16, cromogranina A; proteína secretora da paratireóide 1, DUPAN-2, CA 19-9, CA 72-4, CA 195 e L6.
15. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o alvo de célula B é selecionado do grupo que consiste em CDlO, CDl9, CD20, CD21, CD2 2, CD23, CD24, CD37, CD38, CD39, CD40, CD72, CD73, CD74, CDw7 5, CDw76, CD77, CD78, CD79a/b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD8 5, CD8 6, CD8 9, CD98, CD12 6, CD12 7, CDwl3 0, CD138 e CDwl50.
16. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o membro da superfamília do receptor de TNF é selecionado do grupo que consiste em 4- 1BB/TNFRSF9, NGF R/TNFRSF16, BAFF R/TNFRSF13C, osteoprotegerina/TNFRSFUB, BCMA/TNFRSFl7 , 0X4 0/TNFRSF4 , CD2 7/TNFRSF7, RANK/TNFRS FlIA, CD30/TNFRSF8, RELT/TNFRSFl9L, CD40/TNFRSF5, TACI/TNFRSF13B, DcR3/TNFRSF6B, TNF RI/TNFRSF1A, DcTRAIL R1/TNFRSF23, TNF RIFTNFRSF1B, DcTRAIL R2/TNFRSF22, TRAIL Rl/TNFRSFIOA, DR3/TNFRSF25, TRAIL R2/TNFRSF10B, DR6/TNFRSF21, TRAIL R3/TNFRSFlOC, EDAR, TRAIL R4/TNFRSFlODi Fas/TNFRSF6, TROY/TNFRSF19, GITR/TNFRSFl8, TWEAK R/TNFRSF12, HVEM/TNFRSF14, XEDAR, linfotoxina beta R/TNFRSF3, ligante de 4-IBB/TNFSF9 , linfotoxina, APRIL/TNFSF13, linfotoxina beta/TNFSF3, BAFF/TNFSF13C, ligante de OX40/TNFSF4, ligante de CD27/TNFSF7, TL1A/TNFSF15, ligante de CD30/TNFSF8, TNF-alfa/TNFSFlA, ligante de CD4 0/TNFSF5, TNF-beta/TNFSFIB, EDA-A2, TRAIL/TNFSF10, ligante de Fas/TNFSF6, TRANCE/TNFSF11, ligante de GITR/TNFSF18, TWEAK/TNFSF12 e LIGHT/TNFSF14.
17. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o membro da família Hedgehog é selecionado do grupo que consiste em Patched e Smoothened.
18. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a tirosina quinase receptora é selecionada do grupo que consiste em Axl, FGF R4, Clq Rl/CD 9 3, FGF R5, DDRl, Flt-3, DDR2, HGF R, Dtki IGF-I R, EGF R, IGF-II R, Eph, INSRR, EphAl, Insulina R/CD220, EphA2, M-CSF R, EphA3, Mer, EphA4, MSP R/Ron, EphA5, MuSK, EphA6, PDGF R alfa, EphA7, PDGF R beta, EphA8, Ret, EphBl, RORl, EphB2, ROR2, EphB3, SCF R/c-kit, EphB4, Tie-1, EphBS, Tie-2, ErbB2, TrkA, ErbB3, TrkB, ErbB4, TrkC, FGF RI, VEGF Rl/Flt-1, FGF R2, VEGF R2/Flk-1, FGF R3 e VEGF R3/Flt~4.
19. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a molécula relacionada ao proteoglicano é selecionada do grupo que consiste em proteoglicanos e reguladores destes.
20. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o membro da superfamília do fator de transformação de crescimento (TGF)-beta é selecionado do grupo que consiste em Activina RIA/ALK-2, GFR alfa-1, Activina RIB/ALK-4, GFR alfa-2, Activina RUA, GFR alfa-3, Activina RIB, GFR alfa-4, ALK-1, MIS RII, ALK- 7, Ret, BMPR- IA/ALK-3 , TGF-beta RFALK-5, BMPR-IB/ALK-6 , TGF-beta RII, BMPR-IIi TGF-beta RIIb, Endoglina/CD105 e TGF-beta RIU.
21. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a molécula relacionada a Wnt é selecionado do grupo que consiste em Frizzled-1, Frizzled-8, Frizzled-2, Frizzled-9, FrizzIed-3, sFRP-I, Frizzled-4, sFRP-2, Frizzled-5, sFRP-3, Frizzled-6, sFRP-4, Frizzled-7, MFRP, LRP 5, LRP 6, Wnt-1, Wnt-8a, Wnt-3a, Wnt- 10b, Wnt-4, Wnt-11, Wnt-5a, Wnt-9a e Wnt-7a.
22. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o ligante de receptor é selecionado do grupo que consiste em ligante de 4- 1BB/TNFSF9, linfotoxina, APRIL/TNFSFl3, linfotoxina beta/TNFSF3, BAFF/TNFSF13C, ligante de 0X4 0/TNFSF4, ligante de CD27/TNFSF7, TL1A/TNFSF15, ligante de CD3 0/TNFSF8, TNF- alfa/TNFSFlA, ligante de CD40/TNFSF5, TNF-beta/TNFSF1B, EDA-A2, TRAIL/TNFSF10, ligante de Fas/TNFSF6, TRANCE/TNFSFl1, ligante de GITR/TNFSF18, TWEAK/TNFSF12 , LIGHT/TNFSF14, Anfiregulina, NRGl isoforma GGF2 , Betacelulina, NRGl isoforma SMDF, EGF, NRGl-alfa/HRGl-alfa, Epigen, NRGl-beta 1/HRGl-beta 1, Epiregulina, TGF-alfa, HB- EGF, TMEFFl/Tomoregulina-1, Neuregulina-3, TMEFF2, IGF-1, IGF-II, Insulina, Act ivina A, Activina B, Activina AB, Activina C, BMP-2, BMP-7, BMP-3, BMP-8, BMP-3b/GDF- 10, BMP-9, BMP-4, BMP-15, BMP-5, Decapentaplégico, BMP-6, GDF-1, GDF-8, GDF-3, GDF-9, GDF-5, GDF-11, GDF-6, GDF-15, GDF-7, Artemina, Neurturina, GDNF, Persefina, TGF-beta, TGF-5 beta 2, TGF-beta 1, TGF-beta 3, LAP (TGF-beta 1), TGF-beta5, TGF-beta Latente 1, TGF-beta Latente bpl, TGF-beta 1.2, Lefty, Nodal, MIS/AMH, FGF ácido, FGF-12, FGF básico, FGF-13, FGF-3, FGF-16, FGF-4, FGF-17, FGF-5, FGF-19, FGF-6, FGF-2 0, FGF-8, FGF-21, FGF-9, FGF-23, FGF-IO, KGF/FGF-7,FGF-Il, Neuropilina-1, P1GF, Neuropilina-2, P1GF-2, PDGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-B, VEGF-B, PDGF-C, VEGF-C, PDGF-D, VEGF- D e PDGF-AB.
23. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o receptor de célula T é selecionado do grupo que consiste em 2B4/SLAMF4, IL-2 R alfa, 4 -1BB/TNFRSF9, IL-2 R beta, ALÇAM, B7-1/CD80, IL-4 R, B7-H3, BLAME/SLAMF8, BTLA, IL-6 R, CCR3, IL-7 R alfa, CCR4 , CXCRl/IL-8 RA, CCR5, CCR6, IL-IO R alfa, CCR7, IL-IO R beta, CCR8, IL-12 R beta 1, CCR9, IL-12 R beta 2, CD2, IL-13 R alfa 1, IL-13 , CD3, CD4, ILT2/CD85j , ILT3/CD8 5k, ILT4/CD85d, ILT5/CD85a, Integrina alfa 4/CD49d, CD5, Integrina alfa E/CD103, CD6, Integrina alfa M/CDllb, CD8, Integrina alfa X/CDllc, Integrina beta 2/CD18, KIR/CD158, CD27/TNFRSF7, KIR2DL1, CD28, KIR2DL3, CD30/TNFRSF8, KIR2DL4/CD158d, CD31/PECAM-1, KIR2DS4, ligante de CD40/TNFSF5, LAG-3, CD43, LAIRl, CD45, LAIR2, CD83, Leucotrieno B4 RI, CD84/SLAMF5, NCAM-Ll, CD94, NKG2A, CD97, NKG2C, CD22 9/SLAMF3, NKG2D, CD2F-10/SLAMF9, NT-4, CD69, NTB-A/SLAMF6, cadeia gama comum/IL-2 R gama, Osteopontina, CRACC/SLAMF7, PD-1, CRTAM, PSGL-1, CTLA-4, RANK/TNFRS Fl IA, CX3CR1, CX3CL1, L-Selectina, CXCR3, SIRP beta 1, CXCR4, SLAM, CXCR6, TCCR/WSX-1, DNAM-1, Timopoietina, EMMPRIN/CD14 7, TIM- 1, EphB6, ΤΙΜ-2, Fas/TNFRSF6, ΤΙΜ-3, ligante de Fas/TNFSF6, ΤΙΜ-4, Fc gama RIII/CD16, TIM-6, GITR/TNFRSF18, TNF RI/TNFRSF1A, Granulisina, TNF RIFTNFRSF1B, HVEM/TNFRSF14, TRAIL R1/TNFRSF10A, ICAM- 1/CD54, TRAIL R2/TNFRSFlOB, ICAM-2/CD102, TRAIL R3/TNFRSF10C, IFN-gama Rl, TRAIL R4/TNFRSFlOD, IFN-gama R2, TSLP, IL-I RI e TSLP R.
24. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o receptor de célula NK é selecionado do grupo que consiste em 2B4/SLAMF4, KIR2DS4, CDl55/PVR, KIR3DL1, CD94, LMIR1/CD300A, CD6 9, LMIR2/CD30Oc, CRACC/SLAMF7, LMIR3/CD30OLF, DNAM-1, LMIR5/CD300LB, Fc épsilon RII, LMIR6/CD300LE, Fe gama RI/CD64, MICA, Fc gama RIIB/CD32b, MICB, Fc gama RIIC/CD32c, MULT-1, Fe gama RIIA/CD32a, Nectina-2/CD112, Fc gama RIII/CD16, NKG2A, FeRHl/1RTA5, NKG2C, FcRH2/IRTA4, NKG2D, FcRH4/IRTAl, NKp3 0, FeRH5 / IRTA2, NKp44, Receptor Fc~líA:e 3/CD16-2, NKp46/NCRl, NKp8 0/KLRFl, NTB-A/SLAMF6, Rae-Ii Rae-I alfa, Rae-I beta, Rae-I delta, H6 0, Rae-I épsilon, ILT2/CD8 5j, Rae-I gama, ILT3/CD85k, TREM-1, ILT4/CD85d, TREM-2, ILT5/CD85a, TREM-3, KIR/CD158, TREMLl/TLT-1, KIR2DL1, ULBP-1, KIR2DL3 , ULBP-2, KIR2DL4/CD158d e ULBP-3.
25. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o receptor celular de monócito/macrófago é selecionado do grupo que consiste em B 7-1/CD 8 0, ILT4/CD85d, B7-H1, ILT5/CD85a, cadeia beta comum, Integrina alfa 4/CD49d, BLAME/SLAMF8, Integrina alfa X/CDl Ic, CCL6/C10, Integrina beta 2/CD18, CD15 5/PVR, Integrina beta 3/CD61, CD31/PECAM-1, Latexina, CD36/SR-B3, Leucotrieno B4R1, CD40/TNFRSF5, LIMPII/SR-B2, CD43 , LMIRl/CD3 00A, CD45, LMIR2/CD3OOc, CD68, LMIR3/CD300LF, CD84/SLAMF5, LMIR5/CD3 OOLB, CD97, LMIR6/CD3OOLE, CD163, LRP-1, CD2F-10/SLAMF9, MARCO, CRACC/SLAMF7, MD-1, ECF-Li MD-2 , EMMPRIN/CD14 7, MGL2, Endoglina/CD105, Osteoactivina/GPNMB, Fe gama RI/CD64, Osteopontinai Fe gama RIIB/CD32b, PD-L2, Fe gama RIIC/CD32c, Siglec-3/CD33, Fc gama RIIA/CD32a, SIGNR1/CD209, Fe gama RIII/CD16, SLAMi GM- CSF R alfa, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TLR3, IFN-gama Rli TLR4, IFN-gama R2 , TREM-1, IL-I RIIi TREM-2, ILT2/CD85j, TREM-3, ILT3/CDeSki TREMLl/TLT-1, 2B4/SLAMF4, IL-IO R alfa, ALÇAM, IL-IO R beta, Aminopeptidase N/ANPEP, ILT2/CD85j, cadeia beta comum, ILT3/CD85k, Clq R1/CD93, ILT4/CD85d, CCRli ILT5/CD8 5a, CCR2, Integrina alfa 4/CD4 9d, CCR5, Integrina alfa M/CD1 Ibi CCR8, Integrina alfa X/CD1 1 Ci CD155/PVR, Integrina beta 2/CD18, CD14, Integrina beta3/CD61, CD36/SR-B3, LAIRl, CD43, LAIR2, CD45, Leueotrieno B4 RI, CD68, LIMPII/SR-B2, CD84/SLAMF5, LMIR1/CD3OOAi CD97, LMIR2/CD3 OOc, CD163, LMIR3/CD3OOLFi fator da coagulação III/fator tecidual, LMIR5/CD3 0 OLB, CX3CR1, CX3CL1, LMIR6/CD3OOLE, CXCR4, LRP-Ii CXCR6, M-CSF R, DEP-1/CD148, MD-I, DNAM-1, MD-2, EMMPRIN/CD147, MMR, Endoglina/CDl05, NCAM-Ll, Fc gama RI/CD64, PSGL-1, Fc gama RIII/CD16, RP105, G-CSF R, L-Selectina, GM-CSF R alfa, Siglec-3/CD33, HVEM/TNFRSF14, SLAM, ICAM-1/CD54, TCCR/WSX-1, ICAM-2/CD102, TREM-1, IL-6 R, TREM-2, CXCR1/IL-8 RAi TREM-3 e TREMLl/TLT-1 .
26. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o receptor de célula dendrítica é selecionado do grupo que consiste em CD3 6/SR- B3, LOX-l/SR-El, CD6 8, MARCO, CD163, SR-AI/MSR, CD5L, SREC- I, CL-Pl/COLECl2, SREC-IIi LIMPII/SR-B2, RP105, TLR4, TLRl, TLR5 , TLR2, TLR6, TLR3, TLR9, ligante de 4 -IBB/TNFSF9, IL- 12/IL-23 p4 0, 4-Amino-i,8-naftalimida, ILT2/CD8 5j, CCL21/6CkÍne, ILT3/CD8 5k, 8-oxo-dG, ILT4/CD8 5d, 8D6A, ILT5/CD85a, A2B5, Integrina alfa 4/CD49d, Aag, Integrina beta 2/CD18, AMICA, Langerina, B7-2/CD86, Leucotrieno B4 RI, B7-H3, LMIR1/CD300A, BLAME/SLAMF8, LMIR2/CD3 OOc, Clq R1/CD93, LMIR3/CD300LF, CCR6, LMIR5/CD3OOLB, CCR7, LMIR6/CD3 0 0LE, CD4 0/TNFRSF5, MAG/SÍglec-4a, CD43, MCAM, CD4 5 , MD-I, CD68, MD-2, CD83, MDL-1/CLEC5A, CD84/SLAMF5, MMRi CD9 7, NCAM-Lli CD2F-10/SLAMF9, Osteoactivina/GPNMB, Chem 23, PD-L2, CLEC-1, RP105, CLEC-2, Siglec-2/CD22, CRACC/SLAMF7, Siglec-3/CD33, DC-SIGN, Siglec-5, DC- SIGNR/CD2 9 9, Siglec-6, DCAR, Siglec-7, DCIR/CLEC4A, Siglec- 9, DEC-2 05, Siglee-10, Dectina-1/CLEC7A, Siglec-F, Deetina- ,2/CLEC6A, SIGNR1/CD209, DEP-1/CD148, SIGNR4, DLEC, SLAM, EMMPRIN/CD147, TCCR/WSX-1, Fc gama RI/CD64, TLR3, Fc gama RIIB/CD32b, TREM -1, Fe gama RIIC/CD32e, TREM- 2, Fe gama RIIA/CD32a, TREM-3, Fc gama RIII/CD16, TREMLl/TLT-1, ICAM- 2/CDl02 e Vanilóide RI.
27. Proteína, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o alvo de angiogênese é selecionado do grupo que consiste em Angiopoietina-I, Angiopoietina-IiJce 2, Angiopoietina-2, Angiopoietina-Iiice 3, Angiopoietina-3, Angiopoietina-IiJce 7/CDT6, Angiopoietina-4, Tie-I, Angiopoietina-IiJce 1, Tie-2, Angiogenina, iNOS, fator da coagulação III/fator tecidual, nNOS, CTGF/CCN2, N0V/CCN3, DANCE, OSM, EDG-1, Plfr, EG- VEGF/PK1, Proliferina, Endostatina, ROB04, Eritropoietina, Trombospondina-I, Cininostatina, Trombospondi.na-2, MFG-E8 , Trombospondina-4, oxido nítricô, VG5Q, eNOS, EphAl, EphA5, EphA2, EphA6, EphASi EphA7, EphA4, EphA8, EphBl, EphB4, EphB2, EphBG, EphB3, Efrina-Al, Efrina-A4, Efrina-A2, Efrina-A5, Efrina-A3, Efrina-Bl, Efrina-B3, Efrina-B2, FGF ácido, FGF-12, FGF básico, FGF-13, FGF-3, FGF-16, FGF-4, FGF-I7, FGF-5, FGF-19, FGF-6, FGF-20, FGF-8, FGF-21, FGF-9, FGF-23, FGF-IO, KGF/FGF-7, FGF-11, FGF RI, FGF R4, FGF R2 , FGF R5, FGF R3, Neuropilina-1, Neuropilina-2, Semaforina 3A, Semaforina 6B, Semaforina 3C, Semaforina 6C, Semaforina 3E, Semaforina 6D, Semaforina 6A, Semaforina 7A, MMP, MMP-11, MMP-1, MMP- 12 , MMP-2, MMP-13, MMP-3, MMP-14 , MMP-7, MMP-15, MMP-8, MMP- 16/MT3-MMP, MMP-9, MMP-24/MT5-MMP, MMP-10 , MMP-2 5/MT6-MMP, TIMP-1, TIMP-3, TIMP-2, TIMP-4, ACE, IL-13 R alfa 1, IL-13, Clq R1/CD93, Integrina alfa 4/CD49d, VE-Caderina, Integrina beta 2/CD18, CD31/PECAM-1, KLF4, CD3 6/SR-B3, LYVE-1, CD151, MCAM, CL-P1/C0LEC12, Nectina-2/CDl12, fator da coagulação III/fator tecidual, E- Selectina, D 6, P-Selectina, DC-SIGNR/CD299, SLAM, EMMPRIN/CD147, Tie-2, Endoglina/CD105, TNF RI/TNFRSF1A, EPCR, TNF RIFTNFRSF1B, Eritropoietina R, TRAIL R1/TNFRSF10A, ESAM, TRAIL R2/TNFRSFlOB, FABP5, VCAM-I, ICAM-I/CD54, VEGF R2/Flk-1, ICAM-2/CD102, VEGF R3/Flt-4, IL-I RI e VG5Q.
28. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente a um alvo selecionado do grupo que consiste em antígeno da membrana específico para a próstata (folato hidrolase 1) , receptor do fator dè crescimento epidérmico, receptor para produtos finais : de glicação avançada, IL-17 A, IL-17 F, P19, Dickkopf-1,· N0TCH1, NG2, IgHE, IL-22R, IL-21, um oligôraero de amilóide β, uma Proteína Precursora de amilóide β, Receptor NOGO (RTN4R), Proteína 5 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade, IL-4, miostatina, antígeno very late 4 e IGF-1R.
29. Proteína, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula hematopoiética transformada.
30. Proteína, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que pelo menos, um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhece um alvo selecionado do grupo que consiste em um alvo de célula B, um alvo de célula T, um alvo de célula dendrítica, ou um alvo de célula NK.
31. Proteína, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação reconhece um alvo selecionado do grupo que consiste em CD5, CDl 0, CDllc, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD30, CD38, CD45, CD70, CD80, CD86, CD103, IRTAl, IRTA2, IRTA3, IRTA4, IRTA5, B-B2, B-B8 e receptor de antígeno de célula B.
32. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 2, 4, 6, 103, 105, 107, 109, 332, 333, 334 e 345.
33. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364 e 365.
34. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sub-região constante reconhece um receptor Fc de célula efetora.
35. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sub-região constante reconhece uma proteína da superfície de uma célula efetora se1ecionada do grupo que consiste em CD16, CD32a, CD32b, CD64, CD89, FceRl, FcRn, e plgR.
36. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sub-região constante compreende um domínio CH2 e um domínio CH3.
37. Proteína, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o domínio CH3 é truncado e compreende uma seqüência do terminal C selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 366, 367, 368, 369, 370 e 371.
38. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante scorpion é derivado de uma dobradiça de imunoglobulina.
39. Proteína, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o ligante scorpion possui um a número reduzido, mas diferente de zero, de cisteínas em relação à dobradiça da qual o ligante scorpion é derivado, e em que uma cisteína corresponde à cisteína da dobradiça do terminal N da dobradiça de imunoglobulina.
40. Proteína, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o ligante scorpion ê derivado de uma região de dobradiça de IgGl e em que o ligante compreende 1 ou 2 cisteínas, ainda em que o ligante retém a cisteina que corresponde a uma cisteína da dobradiça do terminal N da região de dobradiça de IgGl.
41. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante scorpion é derivado da região peduncular de uma lectina C.
42. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante scorpion compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 373, 374, 375, 376 e 377.
43. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante scorpion compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 351, 352, 353 e 354.
44. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada ainda por compreender um ligante de pelo menos cerca de 5 aminoãcidos anexado à sub-região constante e anexado ao primeiro domínio de ligação localizando, dessa forma, o ligante entre a sub-região constante e o primeiro domínio de ligação.
45. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a afinidade de ligação de pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação é de menos de IO"9 M.
46. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a afinidade de ligação de pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação é de pelo menos IO"6 M.
47. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a função efetora é selecionada do grupo que consiste em citotoxicidade dependente de anticorpos mediada por células (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC); .
48. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, 5 caracterizada pelo fato de que a meia-vida in vivo da proteína é de pelo menos 28 horas em um ser humano.
49. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a Proteína, de acordo com a reivindicação 1 e um adjuvante, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
50. Ácido nucléico caracterizado por codificar uma Proteína da reivindicação 1.
51. Vetor caracterizado por compreender um ácido nucléico de acordo com a reivindicação 50.
52. Célula hospedeira caracterizada por compreender um vetor da reivindicação 51.
53. Método de produção da Proteína da reivindicação 1 caracterizado por compreender: a. introdução de um ácido nucléico que codifica a Proteína, de acordo com a reivindicação 1 em um célula hospedeira; e b. incubação da célula hospedeira sob condições adequadas à expressão da proteína expressando, dessa forma, a proteína em um nível de pelo menos 1 mg/ml.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado ainda por compreender o isolamento da proteína.
55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula VERO, uma célula HeLa, uma célula CHO, uma célula COS, uma célula W13 8, uma célula BHK, uma célula HepG2, uma célula 3T3, uma célula RIN, uma célula MDCK, uma célula A549, uma célula PC12, uma célula K562, uma célula HEK293, uma célula N, uma célula de Spodoptera frugiperda, uma célula de Saccharomyces cerevisiae, uma célula de Pichia pastoris, uma célula fúngica e uma célula bacteriana.
56. Método de produção de um ácido nucléico que codifica a Proteína da reivindicação 1 caracterizado por compreender: a. a ligação de forma covalente da extremidade 3' de um polinucleotídeo que codifica um primeiro domínio de ligação derivado da região variável de uma imunoglobulina à extremidade 5' de um polinucleotídeo que codifica uma sub- região constante; b. a ligação de forma covalente da extremidade 5' de um polinucleotídeo que codifica um ligante scorpion à extremidade 3' do polinucleotídeo que codifica a sub-região constante; e c. a ligação de forma covalente da extremidade 5' de um polinucleotídeo que codifica um segundo domínio de ligação derivado da região variável de uma imunoglobulina à extremidade 3' do polinucleotídeo que codifica o ligante seorpion gerando, dessa forma, um ácido nucléico que codifica uma proteína de ligação multivalente com função efetora.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica um primeiro domínio de ligação compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N0 : 1 (região variável anti-CD20) , ID. DE SEQ. N0 : 3 (região variável anti-CD28, orientada Vl-Vh) e ID. DE SEQ. N°: 5 (região variável anti-CD28, orientada Vh-Vl).
58. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado ainda por compreender um ligante polinucleotidico inserido entre o polinucleotideo que codifica um primeiro domínio de ligação e o polinucleotideo que codifica uma sub-região constante, o ligante polinucleotidico que codifica um ligante peptídico de pelo menos 5 aminoácidos.
59. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado ainda por compreender um ligante polinucleotidico inserido entre o polinucleotideo que codifica uma sub-região constante e o polinucleotideo que codifica um segundo domínio de ligação, o ligante polinucleotidico que codifica um ligante peptídico de pelo menos 5 aminoácidos.
60. Método de indução de lesão a uma célula-alvo caracterizado por compreender o contato de unia célula-alvo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma Proteína, de acordo com a reivindicação 1.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é colocada em contato in vivo por administração da proteína a um organismo que necessita.
62. Método de tratamento de um distúrbio de proliferação celular caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma Proteína, de acordo com a reivindicação 1 a um organismo que necessita.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é selecionado do grupo que consiste em um câncer, um distúrbio autoimune, uma infecção pelo virus do sarcoma de : Rous e uma 5 inflamação.
64. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a proteína é administrada por expressão in vivo de um ácido nucléico que codifica a Proteína, de acordo com a reivindicação 1.
65. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a proteína é administrada por uma via selecionada do grupo que consiste em injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intramuscular, inj eção subcutânea, intraperitoneal inj eção e inj eção direta no tecido.
66. Método para a atenuação de um sintoma associado a um distúrbio de proliferação celular caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma Proteína, da reivindicação 1 a um organismo que necessita.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o sintoma é selecionado do grupo que consiste em dor, calor, edema e rigidez articular.
68. Método de tratamento de uma infecção associada a um agente infeccioso caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da Proteína, de acordo com a reivindicação 1 a um paciente que necessita, em que a proteína compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a uma molécula-alvo do agente infeccioso.
69. Método para a atenuação de um sintoma de uma infecção associada a um agente infeccioso caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz da Proteína, de acordo com a reivindicação 1 a um paciente que necessita, em que a proteína compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a uma molécula-alvo do agente infeccioso.
70. Método de redução do risco de infecção atribuível a um agente infeccioso caracterizado por compreender a administração de uma quantidade profilaticamente eficaz da Proteína, de acordo com a reivindicação 1 a um paciente em risco de desenvolver a infecção, em que a proteína compreende um domínio de ligação que se liga especificamente a uma molécula-alvo do agente infeccioso.
71. Kit caracterizado por compreender a Proteína da reivindicação 1 e um conjunto de instruções para a administração da proteína para tratar um distúrbio de proliferação celular ou para atenuar um' sintoma do distúrbio de proliferação celular.
72. Proteína de ligação multivalente de cadeia simples, de acordo com a reivindicação 1, :caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD37, CD40, CD7 0, CD72, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD86 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
73. Proteína, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente ao CD20.
74. Proteína, de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o outro domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD22, CD23:, CD30, CD37, CD4 0, CD7 0, CD7 2, CD7 9a, CD7 9b, CD8 0, CD81, CD8 6 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
75. Proteína, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente ao CD79b.
76. Proteína, de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que o outro domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD37, CD40, CD7 0, CD72, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD86 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
77. Proteína, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente a um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
78. Proteína, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o outro domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD37, CD4 0, CD 7 0, CD72, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD86 e Utn peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
79. Proteína, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que um entre o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação se liga especificamente ao CD22.
80. Proteína, de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o outro domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD30, CD37, CD4 0, CD7 0, CD7 2, CD7 9a, CD7 9b, CD8 0, CD81, CD8 6 e um peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
81. Proteína, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que a proteína possui um efeito sinérgico sobre o comportamento de uma célula-alvo em relação à soma dos efeitos de cada um dos domínios de ligação, e em que a proteína compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD20-CD19, CD2 0-CD21, CD2 0-CD2 2, CD2 0-CD4 0, CD2 0-CD7 9a, CD2 0-CD7 9b e CD20- CD81.
82. Proteína, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que a proteína possui um efeito aditivo sobre o comportamento de uma célula-alvo em relação à soma dos efeitos de cada um dos domínios de:ligação, e em que a proteína compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD20-CD23, CD20-CD30, CD20-CD37, CD2 0-CD7 0, CD2 0-CD8 0, CD2 0-CD8 6, CD7 9b-CD3 7, CD7 9b-CD81, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD3 0 e peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD72.
83. Proteína, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que a proteína possui um efeito inibidor sobre o comportamento de uma célula-alvo em relação à soma dos efeitos de cada um dos domínios de ligação, e em que a proteína compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD20- peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal, CD79b-CD19, CD79b-CD20, CD79b-CD21, CD79b-CD22, CD7 9b-CD23, CD79b-CD30, CD79b-CD40, CD79b-CD70, CD79b-CD72, CD79b-CD79a, CD79b-CD80, CD79b-CD86, CD79b-peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD19, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD20, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD21, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD22, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD23, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD37, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD40, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD70, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD79a, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD7 9b, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD80, peptídeo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD81, peptideo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal-CD86, CD22-CD19, CD22-CD40, CD22-CD79b, CD22-CD86 e CD22-peptideo da classe II do complexo de histocompatibilidade principal.
84. Método de identificação de pelo menos um dos domínios de ligação da molécula de ligação multivalente da reivindicação 1 caracterizado por compreender: (a) o contato de um anticorpo anti-isotípico com um anticorpo que reconhece especificamente um primeiro antígeno e um anticorpo que reconhece especificamente um segundo antígeno; (b) o contato adicional de um alvo que compreende pelo menos um dos antígenos com a composição da etapa (a); e (c) a medida de uma atividade do alvo, em que a atividade é usada para identificar pelo menos um dos domínios de ligação da molécula de ligação multivalente.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o alvo é uma célula doente.
86. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação multivalente de cadeia simples induz uma quantidade de lesão sinérgica â célula-alvo comparada à soma da lesão induzida por um primeiro anticorpo que compreende o primeiro domínio de ligação, mas não o segundo domínio de ligação, e um segundo anticorpo que compreende o segundo domínio de ligação, mas não o primeiro domínio de ligação.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação multivalente de cadeia simples compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD19/CD20, CD2 0/CD21, CD2 0/CD22, CD2 0/CD4 0, CD2 0/CD79a, CD2 0/CD7 9b, CD2 0/CD81, CD2l/CD7 9b, CD3 7/CD7 9b, CD7 9b/CD81, CDl9/CL II, CD20/CL II, CD30/CL II, CD37/CL II, QOl2/CL II e CD79b/CL II.
88. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação multivalente de cadeia simples induz uma quantidade inibida de lesão à célula-alvo comparada à soma da lesão induzida por um primeiro anticorpo que compreende o primeiro domínio de ligação, mas não o segundo domínio de ligação, e um segundo anticorpo que compreende o segundo domínio de ligação, mas não o primeiro domínio de ligação.
89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação multivalente de cadeia simples compreende um par de domínios de ligação que reconhece especificamente um par de antígenos selecionados do grupo que consiste em CD20/CL II, CD2l/CD79b, CD22/CD79b, CD40/CD79b, CD70/CD79b, CD72/CD79b, CD79a/CD79b, CD79b/CD80, CD79b/CD86, CD21/CL II, CD2 2/CL II, CD23/CL II, CD40/CL II, CD7 0/CL II, CD80/CL II, CD86/CL II, CD19/CD22, CD20/CD22, CD21/CD22, CD22/CD23, CD22/CD30, CD22/CD3 7, CD22/CD4 0, CD2 2/CD7 0, CD22/CD72, CD22/7 9a, CD22/79b, CD22/CD80, CD22/CD86 e CD22/CL II.
90. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado ainda por compreender diversas proteínas de ligação multivalentes de cadeia simples.
91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que um domínio de ligação de uma primeira proteína de ligação multivalente de cadeia simples e um domínio de ligação de uma segunda proteína de ligação multivalente de cadeia simples induzem uma quantidade de lesão sinérgica à célula-alvo.
92. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que um domínio de ligação de uma primeira proteína de ligação multivalente de cadeia simples e um domínio de ligação de uma segunda proteína de ligação multivalente de cadeia simples induzem uma quantidade inibida de lesão à célula-alvo.
93. Composição caracterizada por compreender diversas proteínas de ligação multivalentes de cadeia simples da reivindicação 1.
94. Composição, de acordo com a reivindicação 93, caracterizada pelo fato de que um domínio de ligação de uma primeira proteína de ligação multivalente de cadeia simples e um domínio de ligação de uma segunda proteína de ligação multivalente de cadeia simples são capazes de induzir uma quantidade de lesão sinérgica to uma célula-alvo.
95. Composição, de acordo com a reivindicação 93, caracterizada pelo fato de que um domínio de ligação de uma primeira proteína de ligação multivalente de cadeia simples e um domínio de ligação de uma segunda proteína de ligação multivalente de cadeia simples são capazes de induzir uma quantidade aditiva de lesão to uma célula-alvo.
96. Composição, de acordo com a reivindicação 93, caracterizada pelo fato de que um domínio de ligação de uma primeira proteína de ligação multivalente de cadeia simples e um domínio de ligação de uma segunda proteína de ligação multivalente de cadeia simples são capazes de induzir uma quantidade inibida de lesão to uma célula-alvo.
97. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a composição da reivindicação 93 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
98. Kit caracterizado por compreender a composição da reivindicação 93 e um conjunto de instruções para a administração da composição to lesão uma célula-alvo.
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