BRPI0713092A2 - produção microbilógica de ácido 3-hidroxiisobutìrico - Google Patents

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Abstract

PRODUçãO MICROBIOLóGICA DE áCIDO 3-HIDROXIISOBUTìRICO. A presente invenção refere-se a uma célula que foi modificada em comparação com seu tipo selvagem de um tal modo que seja capaz de formar mais, em comparação com seu selvagem, ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico por meio de metilmalonato-semialdeído ou 3-hidroxibutíril-coenzima A como precursores. A invenção também se refere a método de gerar uma célula geneticamente modificada, à célula geneticamente modificada obtenível por estes métodos, ao método de produzir ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico, ao método de produzir ácido metacrílico ou ésteres metacrílicos, e ao método de produzir ácido polimetacrílico ou ésteres polimetacrílico. A presente invenção além disso, refere-se a um DNA isolado, a um vetor, ao uso deste vetor para transformar uma célula, em uma célula transformada, e a um polipeptídeo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ÁCIDO 3-HIDROXIISOBUTÍRICO".
A presente invenção refere-se às células que foram genetica- mente modificadas em comparação com seu tipo selvagem, aos métodos de geração de uma célula geneticamente modificada, às células geneticamente modificadas obteníveis por estes métodos, a um processo para a preparação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido .3-hidroxiisobutírico, a um processo para a preparação de ácido metacrílico ou ésteres metacrílicos, e a um processo para a preparação de ácido poli- metacrílico ou ésteres polimetacrílico. A presente invenção também refere- se a um DNA isolado, a um vetor, ao uso deste vetor para a transformação de uma célula, a uma célula transformada, e a um polipeptídeo.
Ácido metacrílico é um importante intermediário que é emprega- do para a preparação de polímeros, em particular na forma de seus ésteres de alquila. Um exemplo de um derivado de ácido metacrílico bem conhecido é o éster de metila de ácido metacrílico. A produção anual global atual de quantidades de metacrilato de metila a aproximadamente 1,5 milhão de to- neladas. Os ésteres polimetacrílicos são matérias-primas no setor de plásti- cos com uma multiplicidade de usos.
Ácido metacrílico é geralmente produzido comercialmente por meio da oxidação de fase de gás heterogênea de compostos de C4-carbono tais como butileno, isobutileno, butano, isobutano, álcool de t-butila ou meta- croleína por catálise de duas etapas em composições de oxido de multi- metal sólidas como o catalisador. A mistura de gás de produto resultante, que, além de ácido metacrílico, também compreende um grande número de produtos secundários, é subseqüentemente ou submetida a uma reação de condensação total, geração de solução de ácido metacrílico aquoso, ou ab- sorvida em uma mistura de solvente adequada. Isto é geralmente seguido por purificação adicional das fases líquidas resultantes por meio de destila- ção, cristalização, extração, ou uma combinação destas medidas. Além da oxidação de fase de gás catalítica de compostos de C4-carbono, ácido meta- crílico pode também ser formado de ácido isobutírico por desidrogenação oxidativa cataiítica, tal como é descrito, por exemplo, na patente EP-A-O 356 315. Uma outra possibilidade para preparo de ácido metacrílico é o que é conhecido como o "processo de ACH", em que cianoidrina de acetona e áci- do sulfúrico são reagidos com a formação de metacrilamida como intermedi- ário, a qual em seguida reage também com água para produzir ácido meta- crílico. O ácido metacrílico resultante é subseqüentemente purificado por destilação. Este processo é descrito, por exemplo, na patente EP-A-1 359137.
A desvantagem destes processos convencionais para a prepa- ração de ácido metacrílico é, entre outros, que durante tanto a preparação do ácido metacrílico em si quanto durante as subsequentes etapas, que en- volvem purificação por destilação, as etapas de processo, que causam es- tresse térmico, resultam, devido à suscetibilidade pronunciada de ácido me- tacrílico à polimerização, na formação de dímeros ou oligômeros; isto não apenas implica esforços de purificação adicional, mas também produz per- das.
Foi um objetivo da presente invenção superar as desvantagens da técnica anterior.
Em particular, foi um objetivo da presente invenção para forne- cer um processo para a preparação de ácido metacrílico que gera ácido me- tacrílico com um mínimo de etapas que envolvem estresse térmico.
Além disso, pretende-se que este processo torne possível a pre- paração de ácido metacrílico de recursos renováveis, em particular de car- boidratos e/ou glicerol. Uma contribuição para obtenção dos objetivos acima menciona-
dos é fornecida por uma célula que foi geneticamente modificada em compa- ração com seu tipo selvagem de um tal modo que seja capaz de formação de mais ácido 3-hidroxiisobutírico, ou polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hídroxiisobutírico, mas de preferência mais ácido 3-hidroxiisobutírico, em comparação com seu tipo selvagem, esta formação de preferência ocor- rendo por meio de semialdeído de metilmalonato ou por meio de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor. No evento em que a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de semialdeído de metilmalonato como precursor, é além disso preferi- do que a formação ocorra por meio de sucinil-coenzima A, propionil- coenzima A ou acriloil-coenzima A, especialmente de preferência por meio de sucinil-coenzima A, como intermediário adicional. No evento em que a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor, é além disso preferido que a formação ocorra por meio de isobutiril-coenzima A ou por meio de 3-hidroxibutiril-coenzima A, de prefe- rência por meio de 3-hidroxibutiril-coenzima A, como intermediário adicional.
O termo "precursor" tal como usado no presente contexto define um composto químico que pode ser convertido enzimaticamente em ácido 3- hidroxiísobutírico em apenas um etapa de reação, enquanto o termo "inter- mediário" define um composto químico que não pode ser convertido enzima- ticamente em ácido 3-hidroxiisobutírico em apenas uma etapa de reação.
O termo "ácido 3-hidroxiisobutírico" tal como usado no presente contexto sempre descreve o correspondente ácido C4-Carboxilico na forma em que ele está presente como uma função do pH, depois de ter sido for- mado pelos microorganismos em questão. Como uma conseqüência, o ter- mo sempre compreende a forma de ácido puro (ácido 3-hidroxiisobutírico), a forma de base pura (3-hidroxiisobutirato) e misturas de formas protonadas e desprotonadas do ácido. Além disso, o termo "ácido 3-hidroxiisobutírico" compreende, em princípio, tanto o estereoisômero (R) quanto o (S), o este- reoisômero (S) sendo especialmente preferido.
O fraseado "que é capaz de formação de mais ácido 3- hidroxiisobutírico ou polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico em comparação com seu tipo selvagem" também aplica-se no evento em que o tipo selvagem da célula geneticamente modificada não é capaz de formação de qualquer ácido 3-hidroxiisobutírico ou polihidroxial- canoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico, mas pelo menos nenhuma quantidade detectável destes compostos, e que quantidades detectáveis destes componentes são apenas capazes de serem formadas depois da modificação genética.
Um "tipo selvagem" de uma célula de preferência refere-se a uma célula cujo genoma está presente em um estado tal como gerado natu- ralmente como o resultado de evolução. O termo é usado tanto para a célula inteira quanto para genes individuais. Como uma conseqüência, o termo "ti- po selvagem" não cobre em particular aquelas células, ou aqueles genes, cujas seqüências de gene foram pelo menos em parte modificadas pelo ho- mem por meio de métodos recombinantes. O ácido 3-hidroxiisobutírico pode subseqüentemente dar origem
ao ácido metacrílico por submissão dele a uma reação de desidratação sob condições suaves. No caso de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico, as vesículas presentes nas células, que são recheadas com estes polihidroxialcanoatos, podem ser isoladas e os polímeros podem subseqüentemente ser clivados para produzir ácido 3-hidroxiisobutírico, que pode então ser desidratado para produzir ácido metacrílico.
Neste contexto, é preferido de acordo com a invenção que a cé- lula geneticamente modificada tenha sido geneticamente modificada de um tal modo que ela forme pelo menos duas vezes, especialmente de preferên- cia pelo menos 10 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, até mais preferivelmente pelo menos 1000 vezes e mais preferivelmente pelo menos 10 000 vezes mais ácido 3-hidroxiisobutírico ou polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico do que o tipo selvagem da célula dentro de um intervalo de tempo definido, de preferência dentro de 2 horas, até mais preferivelmente dentro de 8 horas e mais preferivelmente dentro de 24 horas. O aumento na formação de produto pode ser determinado neste contexto, por exemplo, por desenvolvimento da célula de acordo com a in- venção e da célula do tipo selvagem em cada caso separadamente, mas sob condições idênticas (densidade de célula idêntica, meio de nutriente idêntico, condições de cultura idênticas) durante um intervalo de tempo particular em um meio de nutriente adequado e subseqüentemente determinação da quantidade de produto alvo (ácido 3-hidroxiisobutírico ou polihidroxialcanoa- tos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico) no meio de nutriente.
As células de acordo com a invenção podem ser células procari- óticas ou eucarióticas. Elas podem tomar a forma de células mamíferas (tais como, por exemplo, células humanas), de células de planta ou de microor- ganismos tais como leveduras, fungos ou bactérias, com microorganismos sendo especialmente preferidos e bactérias e leveduras sendo mais preferi- das.
Bactérias, leveduras ou fungos adequados são em particular a- quelas bactérias, leveduras ou fungos que foram depositadas no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Bruns- wick, Germany, como cepas bacterianas, de levedura ou fúngicas. Bactérias que são adequadas de acordo com a invenção pertence aos gêneros deta- lhados sob
http://www.dsmz.de/species/bactérias.htm, leveduras que são adequadas de acordo com a invenção pertencem àqueles gêneros que são detalhados sob http://www.dsmz.de/species/leveduras.htm, e fungos que são adequados de acordo com a invenção são aqueles que são detalhados sob http://www.dsmz.de/species/fungos.htm.
Células que são especialmente preferidas de acordo com a in- venção são aquelas dos gêneros Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Laetobaeillus, Lactocoecus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyees, Eseheriehia, Zymomonas, Yarrowia, metylobaeterium, Rals- tonia, Pseudomonas, Burkholderia e Clostridium, com Brevibacterium fla- vum, Brevibacterium lactofermentum, Eseheriehia coli, Saccharomyces cere- visiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacte- rium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, metylobaeterium extroquens, Ralstonia eutropha, especialmente Ralstonia eutropha H16, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter calcoaceti- cus e Pichia pastoris sendo especialmente preferidos.
De acordo com uma primeira variante da célula de acordo com a invenção, a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoa- tos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de semialdeído de metilmalonato como precursor.
De acordo com uma primeira modalidade especial desta primeira variante da célula de acordo com a invenção, é preferido que a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou do polihidroxialcanoato com base em ácido 3- hidroxiisobutírico preferencialmente ocorra por meio de sucinil-coenzima A como intermediário, onde a célula preferencialmente é capaz de utilização de carboidratos, glicerol ou glutamato como a fonte de carbono. Aqui, pode ser vantajoso, no contexto da primeira modalidade
especial da primeira variante da célula de acordo com a invenção, que a cé- lula de acordo com a invenção caracteriza uma atividade aumentada de uma enzima E1, que catalisa a conversão de sucinil-coenzima A em metilmalonil- coenzima A, em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 1). O termo "atividade aumentada de uma enzima" tal como usado
acima em conexão com a enzima Ei e no que segue no contexto das enzi- mas E2 etc. Deve de preferência ser entendido como atividade intracelular aumentada.
O que agora segue em aumento da atividade enzimática em cé- lulas aplica-se tanto ao aumento da atividade da enzima E1 quanto a todas as enzimas mencionadas depois disso, cuja atividade pode, se apropriado, ser aumentada.
Em princípio, um aumento na atividade enzimática pode ser al- cançado por aumento do número de cópia da(s) sequência(s) de gene que codificam a enzima, por uso de um forte promotor ou por uso de um gene ou alelo que codifica uma enzima correspondente com uma atividade aumenta- da, e, se apropriado, combinação destas medidas. Células que foram gene- ticamente modificadas de acordo com a invenção são geradas, por exemplo, através de transformação, transdução, conjugação ou uma combinação des- tes métodos com um vetor que compreende o gene desejado, um alelo des- te gene ou partes deste, e um vetor que torna possível a expressão do gene. A expressão heteróloga é alcançada em particular por integração do gene, ou dos alelos, no cromossoma da célula ou em um vetor extracromosso- malmente replicante.
Uma visão geral sobre as possibilidades para aumento da ativi- dade enzimática em células com piruvato carboxilase a título de exemplo é encontrada em DE-A-100 31 999, que é por meio desta incorporada através de referência e cujo conteúdo de descrição quanto às possibilidades para aumento da atividade enzimática em células forma parte da descrição da presente invenção.
A expressão das enzimas ou genes mencionados aqui acima e em cada caso a seguir pode ser detectada no gel com a ajuda de separação de gel de proteína uni- e bidimensional e subsequente identificação visual da concentração de proteína usando software de avaliação adequado. Quando o aumento em uma atividade enzimática é com base exclusivamente em um aumento na expressão do gene em questão, a quantificação do aumento na atividade enzimática pode ser determinada de uma maneira simples por comparação das separações de proteína uni- ou bidimensional entre o tipo selvagem e a célula geneticamente modificada. Um convencional método de preparo dos géis de proteína em bactérias corineformes, e de identificação das proteínas, é o procedimento descrito por Hermann e outros (Electropho- resis, 22: 1712.23 (2001)). A concentração de proteína pode também ser analisada através de hibridização de mancha do Oeste usando um anticorpo que é específica quanto à proteína a ser detectada (Sambrook e outros, Mo- lecular Cloning: a Iaboratory manual, 2- Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) seguido por avaliação visual com software adequado para determinação da concentração (Lohaus e Me- yer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie .111: 2630-2647). A atividade de proteínas de ligação de DNA pode ser me- dida por meio de ensaios de mudança de faixa de DNA (também referido como retardo de gel) (Wilson e outros (2001) Journal of Bacteriology, 183: .2151-2155). O efeito de proteínas de ligação de DNA na expressão de ou- tros genes pode ser detectado por vários métodos extensivamente descritos do ensaio de gene repórter (Sambrook e outros, Molecular Cloning: a labora- tory manual, 2- Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har- bor, N.Y. USA, 1989). As atividades enzimáticas intracelulares podem ser detectadas por vários métodos que foram descritos (Donahue e outros (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray e outros (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Iivradoberg e outros (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823). No evento que nenhum método específico para determinação da atividade de uma enzima particular é deta- lhado no que segue, a determinação do aumento na atividade enzimática, e também a determinação da redução em uma atividade enzimática, é de pre- ferência realizada por meio dos métodos descritos em Hermann e outros, Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus e outros, Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) e Wilson e outros (2001) JournaIofBacteriology, 183: 2151-2155 (2001).
Se aumento da atividade enzimática é realizado por mutação do gene endógeno, tais mutações podem ser geradas ou indiretas, usando mé- todos tradicionais tais como, por exemplo, por irradiação de UV ou por pro- dutos químicos mutagênicos, ou diretas por meio de métodos recombinantes tais como deleção(ções), inserção(ções) e/ou substituição(ções) de nucleotí- deo. Estas mutações dão origem a células geneticamente modificadas. Mu- tantes especialmente preferidos de enzimas são em particular também aque- las enzimas que não são mais capazes de serem inibidas por realimentação, ou que são pelo menos capazes de serem inibidas por realimentação, em comparação com a enzima de tipo selvagem.
Se aumento da atividade enzimática é realizado por aumento da expressão de uma enzima, então, por exemplo, o número de cópia dos res- pectivos genes é aumentado, ou o promotor e regiões reguladoras ou o sítio de ligação ribossômico, que está localizado a montante do gene estrutural, são mutados. Cassetes de expressão que são incorporados a montante do gene estrutural agem da mesma maneira. Por meio de promotores induzí- veis é adicionalmente possível aumentar a expressão em qualquer ponto desejado no tempo. Além do gene de enzima pode também ser designado a ele os que são conhecidos como seqüências realçadoras assim como se- quências reguladoras; estes também realizam uma expressão de gene au- mentada por meio de uma interação melhorada entre RNA polimerase e DNA. Medidas para extensão da vida do mRNA também melhoram expres- são. Além disso, prevenção da degradação da proteína de enzima também realça a atividade enzimática. Aqui, os genes ou construções de gene estão ou presentes em plasmídeos em diferentes números de cópia, ou então eles estão integrados e amplificados no cromossoma. Como uma alternativa, su- perexpressão dos genes em questão pode também ser alcançada por modi- ficação da composição de meios e do controle da cultura.
Instruções para fazer isso podem ser encontradas pelo trabalha- dor versado em Martin e outros (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)) em Guerrero e outros (Gene 138, 35-41 (1994)), Ttaisiya e Morinaga (Bi- o/Technology 6, 428-430 (1988)), em Eikmanns e outros (Gene 102, 93-98 (1991)), em EP-A-O 472 869, em US 4,601,893, em Schwarzer e Puhler ((Bi- o/Technology 9, 84-87 (1991), em Reinscheid e outros (aplicado and Envi- ronmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), em LaBarre e outros (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), em WO-A-96/15246, em Malumbres e outros (Gene 134, 15-24 (1993), em JP-A-10-229891, em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), entre outros, e em livros didáticos conhecidos de biologia genética e molecular. As medidas acima descritas dão origem a células geneticamente modificadas, assim co- mo dão origem às mutações.
Plasmídeos, por exemplo, plasmídeos epissômicos, são empre- gados para aumento da expressão dos genes em questão. Plasmídeos ade- quados são em particular aqueles que são replicados em bactérias corine- formes. Um grande número de vetores de plasmídeo conhecidos tais como, por exemplo, pZ1 (Menkel e outros, aplicado and Environmental Microbio- Iogy 64: 549-554 (1989)), pEKExI (Eikmanns e outros, Gene 107: 69-74 (1991)) ou pHS2-1 (Sonnen e outros, Gene 107: 69-74 (1991)) são com ba- se nos plasmídeos crípticos pHM1519, pBL1 ou pGA1. Outros vetores de plasmídeo tais como, por exemplo, aqueles com base em pCG4 (US .4,489,160) ou pNG2 {Serwold-Davis e outros, FEMS Microbiology Letters 66: .119-124 (1990)} ou pAG1 (US 5,158,891), podem ser empregados da mes- ma maneira.
Outros que são adequados são aqueles vetores de plasmídeo com a ajuda de que o método de amplificação de genes por integração no cromossoma pode ser aplicado, como foi descrito, por exemplo, por Reins- cheid e outros (aplicado and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994)) para duplicação ou amplificação do opéron hom-thrB. Neste método, o gene inteiro é clonado em um vetor de plasmídeo que é capaz de replicação em um hospedeiro (tipicamente Escherichia coli), mas não em Corynebacterium glutamicum. Vetores adequados são, por exemplo, pSUP301 (Simon e ou- tros, Bio/Technology 1: 784-791 (1983)), pK18mob ou pK19mob (Scháfer e outros, Gene 145: 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biologieal Chemistry .269: 32678-84 (1994)), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, the Netherlands), pEM1 (Schrumpf e outros, Journal of Baeteriology 173: 4510-4516)) ou pBGS8 (Spratt e outros, Gene 41: 337-342 (1986)). O vetor de plasmídeo, que contém o gene a ser amplificado, é subseqüentemente transferido na cepa de Corynebaeterium glutamicum desejada por meio de conjugação ou transformação. O método de conjugação é descrito, por exemplo, em Schãfer e outros, Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994). Métodos de transformação são descritos, por exemplo, em Thierbach e outros, Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Duni- can e Shivnan1 Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) e Tauch e outros, FEMS Mierobiology Letters 123: 343-347 (1994). Seguindo recombinação homólo- ga por meio de um evento de cruzamento, a cepa resultante compreende pelo menos duas cópias do gene em questão.
A frase "uma atividade de uma enzima Ex que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem" usada aqui acima e no que segue é de preferência sempre entendido como significando uma atividade da respecti- va enzima Ex que é aumentada por um fator de pelo menos 2, especialmente de preferência de pelo menos 10, mais preferivelmente de pelo menos 100, até mais preferivelmente de pelo menos 1000 e mais preferivelmente de pelo menos 10 000. Além disso, a célula de acordo com a invenção que caracte- riza "uma atividade de uma enzima Ex que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem", em particular também uma célula cujo tipo selva- gem caracteriza nenhuma atividade, ou pelo menos nenhuma detectável, desta enzima Ex e que apenas mostra uma atividade detectável desta enzi- ma Ex depois de aumento da atividade enzimática, por exemplo, por meio de superexpressão. Neste contexto, o termo "superexpressão", ou o fraseado "aumento na expressão" usada no que segue também compreende o caso que uma célula de partida, por exemplo, uma célula do tipo selvagem, carac- teriza nenhuma expressão, ou pelo menos nenhuma detectável, e expressão detectável da enzima Ex é apenas induzida por métodos recombinantes.
Desta maneira, a frase "atividade reduzida de uma enzima Ex" usada a seguir é entendido como significando uma atividade que é de prefe- rência reduzida por um fator de pelo menos 0,5, especialmente de preferên- cia de pelo menos 0,1, mais preferivelmente de pelo menos 0,01, até mais preferivelmente de pelo menos 0,001 e mais preferivelmente de pelo menos .0,0001. A redução na atividade de uma enzima específica pode ser obtida, por exemplo, por mutação direta, pela adição de inibidores competitivos ou não competitivos ou por outras medidas para redução da expressão de uma enzima específica que são conhecidas ao trabalhador versado.
No caso da enzima E1, que catalisa a conversão de sucinil- coenzima A em metilmalonil-coenzima A, esta de preferência toma a forma de uma metilmalonil-coenzima A mutase (EC 5.4.99.2). Esta enzima é de preferência codificada pelo gene selecionado do grupo consistindo em mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmA1, mcmA2, mcmB, mcm1, mcm2, mcm3, icmA, meaA1 e meaA2. A seqüência de nucle- otídeo destes genes pode ser encontrada, por exemplo, na "Kyoto Encyclo- pedia of Genes and genomas" (base de dados de KEGG), nas bases de da- dos do Centro Nacional para Informação de Biotecnologis (NCBI) da Biblio- teca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, USA) ou da base de dados de seqüência de nucleotídeo dos Laboratórios de Biologias Moleculares Euro- péia (EMBL, Heidelberg, Germany e Cambridge, UK). De acordo com uma modalidade especialmente preferida da primeira variante da célula de acordo com a invenção, a enzima Ei toma a forma da metilmalonil-coenzima A mutase de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que é codificada por um gene com a seqüência de DNA tal como mostrado em SEQ ID Nq 01 e que possui o aminoácido tal como mos- trado em SEQ ID Nq 02.
Além disso, ela é preferido de acordo com uma primeira alterna- tiva da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na pre- paração de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico, que a célula, se apropriado em adição à ativi- dade aumentada da enzima Ei, caracteriza uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E2 até E4 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 2): - de uma enzima E2, que catalisa a conversão de metilmalonil- coenzima A em malonato de metila;
- de uma enzima E3, que catalisa a conversão de malonato de metila em semialdeído de metilmalonato;
- de uma enzima E4 que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em ácido 3-hidroxiisobutírico.
Neste contexto, células que são especialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas em que a atividade das seguintes enzi- mas ou combinações de enzima é aumentada: E2, E3, E4, E2E3, E2E4, E3E4, E2E3E4, onde E2E3E4 é mais preferido. Além disso, é possível que uma en- zima seja também capaz de catalisação de pelo menos duas das etapas de reação acima descritas. Desta forma, por exemplo, é possível empregar uma enzima que caracteriza tanto a atividade de enzima E2 quanto aquela de en- zima E3 (e que por esse motivo catalisa a conversão de metilmalonil- coenzima A diretamente em semialdeído de metilmalonato) tal como, por exemplo, a coenzima A de malonila redutase de Sulfolobus tokodaii, que é codificada pela seqüência de DNA com a SEQ ID Ng 03 e que possui a se- qüência de aminoácido tal como mostrado em SEQ ID Ne 04, ou então uma enzima que caracteriza todas as três atividades enzimáticas E2, E3 e E4, tais como a coenzima A de malonila redutase de Chloroflexus aurantiacus (Hu- gler e outros, Journal of Bacteriology 184, páginas 2404-2410, 2002).
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E2 é uma metilmalonil-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.17),
E3 é uma aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.3) ou uma aldeído oxidase (EC 1.2.3.1)
E4 é uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou uma 3-hidroxiacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35).
A enzima E2 é de preferência codificada pelo gene de aoxl. A metilmalonil-coenzima A hidrolase de fígado de rato é descrita, por exemplo, em Kovachy e outros, "Recognition, isolamento, and characterization of rat Iiver D-metilmalonyl coenzima A hidrolase", J. Biol. Chem. 258 (1983), pági- nas 11415-11421.
A enzima E3 é de preferência codificada por genes selecionados do grupo consistindo em aldh2, aldh3a1, aldh3a2, aldhlbl, aldh9a1, al- dh7a1, aldh1a4, aldhlal, aldh1a2, mgc80785, mgc83352, mgc89020, dmel- CG31075, cg3752, cg9629, alh-9, alh-1, alh-2, Í508.35, t7023.15, f 1511.19, tT17F15.130, aldl, ald2, ald4, ald5, ald6, ac1044Wp, adr417wp, msc7, tb06.5F5.780, aldH, puuC, putA, aldA, badH, alkH, pcD, rsp1591, rs01031, exaC, acoD, dhaL, pchA, aldB, dhaS, betB, ywdH, ycbD, aldX, aldY, aldA1, aldA2, aldC, pcd, cg10546, cg12668, cg12796, scg11A.05, sci30A.27c, sce9.27c, sckl3.05c, sc5H4.03, thcA, gabD2, alkH, aldH, aldH1, aldY1, aldY2, aldY3, aldY4, aldY5, aldY6, aldY7 e aldhT.
Genes adequados para a enzima E4 são selecionados do grupo consistindo em hibadh, cg15093, cg15093, cg4747, mwL2.23, t13k14.90, f 19b15.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, glxR, SCM1.40c, hibD, ehhahd, hadh2, hadhsc, hsd17B4, loc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech-8, ech- .9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2, hbd-3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd-9, hbd-10, fadJ, rs04421, rs02946, rs05766, bbsD, bbsC, fadB1, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1, fabJ, scbac19f3.11, sci35.13, sc- bac8d1.10c, sc5f2a.15, sc6a5.38, fadC2, fadC4, fadC5, fadC6, had e paaH. .3-Hidroxiisobutirato desidrogenases também adequadas são descritas, por exemplo, em Bannerjee e outros (1970), J. Biol. Chem, 245, páginas 1828 to .1835, Steele e outros (1992), J. Biol. Chem., 267, páginas 13585 to 13592, Harris e outros (1988), J. Biol. Chem., 263, páginas 327 to 331, Harris e ou- tros, Biochim. Biophys. Acta, 1645 (1), páginas 89 to 95, Hawes e outros (2000), Methods Enzymol., 324, páginas 218 to 228, Harris e outros, J. Biol. Chem., 275 (49), páginas 38780 to 38786, Rougraff e outros (1988), J. Biol. Chem., 263(1), páginas 327 to 331, Robinson e outros, J. Biol. Chem., 225, páginas 511 to 521, Hawes e outros (1995), Biochemistry, 34, páginas 4231 to 4237, Hasegawa J. (1981), Agric. Biol. Chem., 45, páginas 2805 to 2814, Hawes e outros (1996), FEBS Lett., 389, páginas 263 to 267, Hawes e ou- tros (1996), Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism, Plenum Press, New York, páginas 395 to 402, Adams e outros (1994), Struc- ture, 2, páginas 651 to 668, Zhang et et. (1999), Biochemistry, 38, páginas .11231 to 11238, Mirny e outros, (1999), J. Moi Biol., 291, páginas 177 to .196 e Lokanath e outros (2005), J Mol Biol. A descrição destas publicações é por meio desta incorporadas através de referência e forma parte da descri- ção da presente invenção.
As seqüências de nucleotídeo dos genes acima mencionados e de outros genes para as enzimas E2 até E4 pode também ser encontrada na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL, entre outros.
De acordo com uma modalidade especialmente preferida desta alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na preparação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico, é preferido que a coenzima A de malonila redutase de Sulfolobus tokodaii, que é codificada pela seqüência de DNA com a SEQ ID Ns 03 e que possui a seqüência de aminoácido tal como mos- trado em SEQ ID N2 04, seja empregada para a conversão de metilmalonil- coenzima A em semialdeído de metilmalonato. De acordo com outra modali- dade especialmente preferida desta variante, a coenzima A de malonila re- dutase de Chloroflexus aurantiacus (Hugler e outros, Journal of Bacteriology 184, páginas 2404-2410, 2002) é empregada para a conversão de metilma- lonil-coenzima A em ácido 3-hidroxiisobutírico.
Além disso, é preferido no contexto desta primeira alternativa da primeira modalidade especial da célula de acordo com a invenção que a cé- lula caracterize uma atividade de uma enzima E5, que caracteriza a conver- são de semialdeído de metilmalonato em propionil-coenzima A, que é redu- zida em comparação com seu tipo selvagem, esta enzima de preferência tomando a forma de uma semialdeído de metilmalonato desidrogenase (EC 1.2.1.27).
De acordo com uma segunda alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na preparação de ácido 3- hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico, é preferido que a célula, se apropriado além da atividade aumentada da enzima Ei, caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E4 até E7 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 3):
- de uma enzima E6, que catalisa a conversão de (R) metilmalo- nil-coenzima A em (S) metilmalonil-coenzima A;
- de uma enzima E7, que catalisa a conversão de (S) metilmalo- nil-coenzima A em propionil-coenzima A;
- de uma enzima E5, que catalisa a conversão de propionil-
coenzima A em semialdeído de metilmalonato;
- de uma enzima E4, que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em ácido 3-hidroxiisobutírico.
Neste contexto, células que são especialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes en- zimas ou combinações de enzima é aumentada: E4, E5, E6, E7, E7, E4E5, E4E6, E4E7, E5E6, E5E7, E6E7, E4E5E6, E4E5E7, E4E6E7, E5E6E7 e E4E5E6E7, com E4E5E6E7 sendo mais preferido.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E6Seja uma metilmalonil-coenzima A epimerase (EC 5.1.99.1)
E7 seja uma metilmalonil-coenzima A descarboxilase (EC 4.1.1.41),
E5Seja uma semialdeído de metilmalonato desidrogenase (EC 1.2.1.27), e
E4 seja uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase
(EC 1.1.1.31) ou uma 3-hidroxiacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35).
Neste contexto, enzimas E4 preferidas são aquelas que já foram mencionadas acima no contexto da primeira variante da primeira modalidade preferida da célula de acordo com a invenção.
A enzima E6 é de preferência codificada pelo gene de mcee. Uma metilmalonil-coenzima A descarboxilase (enzima E7) adequada é des- crita, por exemplo, por Benning e outros em Biochemistry, Vol. 39 (2000), páginas 4630-4639.
Genes adequados para a enzima E5 são de preferência selecio- nados do grupo consistindo em aldh6a1, cg17896, t22c12.10, ald6, putA1, mmsA, mmsA-1, mmsA-2, mmsA-3, mmsA-4, msdA, iolA e iolAB.
Genes adequados para a enzima E7 são de preferência selecio- nados do grupo consistindo em mmdA, bcc, oadB, oadB2, oadB3, SC1C2.16, SC1G7.10, pccB1, accA2, mmdB, mmdC e ppcB.
As seqüências de nucleotídeo dos genes acima mencionados para as enzimas E5, E6 e E7 podem, entre outros, também ser encontradas na base de dados de KEGG.
De acordo com uma terceira alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como intermediário e semi- aldeído de metilmalonato como precursor na preparação de ácido 3- hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico, é preferido que a célula, se apropriado além da atividade aumentada da enzima Ei, caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E4, E5 e E7 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 4):
- de uma enzima E7, que catalisa a conversão de metilmalonil- coenzima A em propionil-coenzima A;
- de uma enzima E5, que catalisa a conversão de propionil- coenzima A em semialdeído de metilmalonato;
- de uma enzima E4, que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em ácido 3-hidroxiisobutírico.
Esta trilha corresponde essencialmente à segunda variante da
primeira modalidade preferida da célula de acordo com a invenção, mas, como oposta à segunda variante, propionil-CoA é preparada diretamente de metilmalonil-coenzima A. Enzimas e genes preferidos para as enzimas E4, E5 e E7 são aqueles genes ou enzimas que já foram mencionados acima em conexão com a segunda variante.
Além disso, pode de acordo com a primeira modalidade especial da célula de acordo com a invenção (e também de acordo com todas as mo- dalidades que ainda devem ser descritas a seguir) também ser preferido que a célula seja capaz de conversão do ácido 3-hidroxiisobutírico formado em um polihidroxialcanoato. Tais polihidroxialcanoatos são depositados intrace- Iularmente por muitos microorganismos na forma de grânulos altamente re- frativos. Neste contexto, é especialmente preferido que a célula de acordo com a invenção caracterize uma atividade de pelo menos uma das, de prefe- rência das duas, seguintes enzimas E9 e Ei0 que é aumentada em compara- ção com seu tipo selvagem (veja Figura 5):
- de uma enzima E8, que catalisa a conversão de ácido 3- hidroxiisobutírico em 3-hidroxiisobutiril-coenzima A;
- de uma enzima E9, que catalisa a conversão de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A para um polihidroxialcanoato com base em ácido 3-hidroxiisobutírico.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E8 seja uma 3-hidroxiisobutiril CoA hidrolase (EC 3.1.2.4) e
E9 seja um polihidroxialcanoato sintase.
Tal como já foi explicado acima, a primeira modalidade preferida da célula de acordo com a invenção gera ácido 3-hidroxiisobutírico ou os polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico de sucinil co- enzima A como intermediário e de semialdeído de metilmalonato como pre- cursor. Aqui, pode fazer sentido em princípio influenciar não apenas uma ou mais das atividades de enzima acima mencionadas Ei até E9, mas também aquelas atividades de enzima que levam a uma formação aumentada de sucinil-coenzima A na célula.
No evento que, de acordo com a primeira modalidade especial da primeira variante da célula de acordo com a invenção, a formação de áci- do 3-hidroxiisobutírico ou dos polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico ocorre a partir de carboidratos ou glicerol por meio de suci- nil-coenzima A como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor, é, de acordo com uma modalidade especial da primeira, segunda ou terceira alternativa acima descrita da célula de acordo com a invenção, preferido que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das, de preferência das duas, seguintes enzimas E10 e E11 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 6):
- de uma enzima E10, que catalisa a conversão de fosfoenolpiru- vato em oxaloacetato;
- de uma enzima E11, que catalisa a conversão de piruvato em oxaloacetato.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E10 Seja uma fosfoenolpiruvato carboxilase (EC 4.1.1.31) e
E11 seja uma piruvato carboxilase (EC 6.4.1.1).
A enzima E10 é de preferência codificada pelo genes seleciona- dos do grupo consistindo em f12m16.21, f14n22.13, k15m2.8, ppc, clpA, pepC, capP, cgl1585, pepC, pck ppc e pccA, onde o gene de ppc é especi- almente preferido. Fosfoenolpiruvato carboxilases que são preferidas de a- cordo com a invenção são também descritas em particular em US 4.757.009, US 4.980.285, US 5.573.945, US 6.872.553 e US 6.599.732. Quanto a fos- foenolpiruvato carboxilases, o conteúdo de descrição destas publicações é por meio desta incorporada através de referência e forma parte da descrição da presente invenção.
A enzima En é de preferência codificada pelos genes seleciona-
dos do grupo consistindo em pc, pcx, cg1516, cg1516, pyc-1, pyc-2, a- ar162Cp, pyrl, accC-2, pycA, pycA2, pca, cgl0689, pyc, pycB, accC, oadA, acc e accC1, onde o gene de pyc é especialmente preferido. Piruvato carbo- xilases que são preferidas de acordo com a invenção são também descritas em particular em US 6.455.284, US 6.171.833, US 6.884.606, US 6.403.351, US 6.852.516 e US 6.861.246. Uma piruvato carboxilase adicional que é es- pecialmente preferida de acordo com a invenção é aquela mutante que é descrita em "A novel mhetodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lisina-produção de mutanf, Ohnishi Je outros, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), páginas 217-223 (2002).
As seqüências de nucleotídeo de genes adequados das enzimas E11 e E12 podem ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL. Partindo do estágio intermediário de oxaloacetato, há diversas
possibilidades para chegar em sucinil-coenzima A, que pode então ser con- vertida em ácido 3-hidroxiisobutírico por meio de metilmalonil-coenzima A por meio das três variantes mencionadas no início.
Uma primeira trilha é conduzida por meio de fumarato como in- termediário. Neste caso é preferido de acordo com uma primeira modalidade especial da primeira, segunda ou terceira alternativa acima descrita da célula de acordo com a invenção, onde semialdeído de metilmalonato é formado como precursor e sucinil-coenzima A como intermediário, que a célula, se apropriado adicionalmente a uma atividade aumentada da enzima E10 ou E11, caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E12 até E15 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 7): - de uma enzima E12, que catalisa a conversão de oxaloacetato em malato;
- de uma enzima E13, que catalisa a conversão de malato em fumarato;
- de uma enzima E14, que catalisa a conversão de fumarato em sucinato;
- de uma enzima E15, que catalisa a conversão de sucinato em sucinil-coenzima A.
Neste contexto, células que são especialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes en- zimas ou combinações de enzima é aumentada: E12, E13, E14, E15, Ei2Ei3, Ei2Ei4, Ei2E-I5, Ei3E14, E-I3E-I5, E14Ei5, E12E-I3E14, E-I2E13Ei5, E12E14Ei5, E13E14E15, E12E13E14E15, com E12E13Ei4E15 sendo mais preferido.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima E12Seja uma malato desidrogenase (EC 1.1.1.37) ou uma malato quinona oxidorredutase (1.1.99.16),
E13 é uma fumarato hidratase (EC 4.2.1.2),
E14 é uma sucinato desidrogenase (EC 1.3.99.1 ou EC 1.3.5.1) ou uma sucinato quinona oxidorredutase (1.3.5.1), e
E15 é uma sucinato coenzima A Iigase (EC 6.2.1.4 ou EC .6.2.1.5).
A enzima E12 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em mdhl, mdh2, mor1, cg10748, cg10749, cg5362, mdh-1, f46e10.10, f19p19.13, f12m16.14, t30l20.4, k15m2.16, f1p2.70, f17i14.150, mnl12.18, mik19.17, mdh3, adl164cp, adr152cp, a- dr252wp, mdhA, mdhC, mdhB, ybiC, mdh, yiaK, ybiC, alID, citH, yjmC, citH, cgl2380, Idh, sqdB, mqo, yojH, mqoA, mqoB, mqol, mqo2, mqo3, mqo4 e cgl2001, onde o gene de mqo e o gene de mdh são especialmente preferi- dos.
A enzima E13 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em fh, fh1, sc4094, sc4095, t30b22.19, k3k7.11, acr013/cp, fuml, fum2, fum3, fum4, fumH, fumA, fumB, fumC, fumC1, fumC2, fum, ttdA, ttdB, fumB-alpha, fumB-beta, citG, citB, fumX, fum-1 e fum-2, onde o gene de fum é especialmente preferido.
A enzima E14 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em sdhl, sdh2, sdh3, sdh4, sdh5, sdh6, osml, osm2, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, frdA, frdB, frdC, frdD, ifcA-1, ifcA-2, sdhB-1, sdhB-2, frdC2, cgl0370, cgl0371, cgl0372, scm10.10c, scm10.11c, sem 10.12c, sc5g8.25c, sc5g8.26c, scbac-31e11.02c, scbac31e11.02c, sc4b10.10c, sdhA2, sdhB2, sdhA1, sdhB1, qcrB2, sdhA3, sdhB3, frdB1 e frdB2, onde os genes sdhA, sdhB e sdhC são especialmente preferidos. A enzima Ei5 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em suclgl, suclg2, loc434885, cg10622, dmel- CG6255, f11a3.3, f8l15.30, mkd15.11, Isc1, Isc2, ael211wp, afr134cp, scsA, scsB, sucC e sucD.
Mais uma vez, as seqüências de nucleotídeo de genes adequa- dos das enzimas E12 até E15, podem também ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL.
No evento em que a atividade de uma ou mais das enzimas E12 até E15 é aumentada, pode também provar-se vantajoso que a célula carac- teriza uma atividade de uma das seguintes enzimas Ei6 até E23 que é redu- zida em comparação com seu tipo selvagem:
- de uma enzima Ei6, que catalisa a conversão de oxaloacetato em citrato;
- de uma enzima E17, que catalisa a conversão de malato em oxaloacetato;
- de uma enzima E18, que catalisa a conversão de sucinil- coenzima A em sucinato,
- de uma enzima E19, que catalisa a conversão de oxaloacetato em fosfoenolpiruvato,
- de uma enzima E2o, que catalisa a conversão de oxaloacetato em piruvato,
- de uma enzima E21, que catalisa a conversão de oxaloacetato em aspartato, - de uma enzima E22, que catalisa a conversão de malato em piruvato,
- de uma enzima E23, que catalisa a conversão de piruvato em acetato.
Células que são especialmente preferidas de acordo com a in- venção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combi- nações de enzima é reduzida: Ei6, Ei7, E18, Ei9, E2o, E21, e E16E17E18E19E20E21E22E23.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E16Seja uma citrato sintase (EC 2.3.3.1 ou EC 2.3.3.8),
E17 seja uma malato oxidase (EC 1.1.3.3),
Enseja uma sucinil CoA hidrolase (EC 3.1.2.3),
E19Seja uma fosfoenolpiruvato carboxicinase
(EC 4.1.1.49 ou 4.1.1.32)
E2oseja uma oxaloacetato descarboxilase (EC 4.1.1.3),
E2-I é uma aspartato transaminase (EC 2.6.1.1),
E22 é uma malato desidrogenase
(EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.39 ou EC 1.1.1.40),
E23 é uma piruvato desidrogenase (EC 1.2.1.51).
A enzima Ei6 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em glt, cs, csl, cg3861, cts-1, f7f 19.21, f4i1.16, t20n10.90, t20n10.100, t209.80, cit1, cit2, cit3, aar004cp, agr002wp, cshA, gltA, citZ, cit, prpC, cisY, eis, mmgD, citA, gltA1, gltA2, gltA3, cgl0829, prpC1, sed 10.20, citA1, citA2, citA3, acly, cg8322, f5e6.2, k7jJ8.14 e citE, onde gltA é mais preferido.
A enzima E19 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em pckA, pckl, pck2, cg10924, cg17725, cg17725, pckG, ppcK, cgl2863, pck e 2sck36.02.
A enzima E20 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em oadA, oadB, oadC, oadG, oag3, eda, dcoA, oadA1, oadA2, pycB e mmdB.
A enzima E21 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em myn8.7, gltl, adr290wp, gltB, gltD, gltl, glsl, gltA, glt, glxD, gltD1, gltD2, gdh2, agl040Cp, gdhA1, gdhA, gdhA2, gluD, gluD1, gluD2, rocG, ypcA, gudB, Í11Í18.2, t2i1.150, mrg7.13, f19c24.7, gdh, gdhl, gdh2, gdh3, gotl, got2, cg4233, cg8430, f23n19.17, f13j11.16, t26c19.9, f7f1.18, F10N7.200, t1611.170, f15n18.110, t20d1.70, aat1, aat2, abl038wp, afr211cp, agxl, bna4, aatA, aatB, ybdL, aspC, yfbQ, aat, avtA1, avtA2, tyrB, avtA, avtB, argD1, argD2, aspB1, aspB2, aspB3, aspB, aspC1, aspC2, aspC3, aspC4, RS05143, aspAT, ywfG, yhdR, argD, mtnV, alaT, hisC, avtA1, avtA2, avtA3, cgl0240, cgl1103, cgl2599, cgl2844, 2sck36.07c, sc9e12.21, sc2h4.04c, tyrB, gtp, gtpl, gtp2, cg1640, f20d23.34, f26f24.16, f24j13.15, t10d10.20 e agr085wp, onde aspC, aatA, gdh, gudB, gdhA, gltB e gltD são especialmente preferidos.
A enzima E2I é de preferência por genes selecionados do grupo consistindo em myn8.7, gltl, adr290wp, gltB, gltD, gltl, glsl, gltA, glt, glxD, gltD1, gltD2, gdh2, agl040Cp, gdhA1, gdhA, gdhA2, gluD, gluD1, gluD2, rocG, ypcA,
A enzima E22 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em me, mel, me2, me3, mae, mael, mae2, sfcA, sfcA1, maeA, maeB, tme, yqkJ, ywkA, yqkJ, malS, ytsJ, mleA, mleS, mez, sce59.10c, 2sc7g11.23, malS1, malS2, dme, maeB1, maeB2, mdh, mdhl, mdh2, dmel_cg10120, dmel_cg10120, dmel-cg5889, f19k16.27, f6f22.7, t22p22.60, f18a17.1, mod1, tme, mao, cgl3007, malS e malE.
A enzima E23 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em me, mel, me2, me3, mae, mael, mae2, sfcA, sfcA1, maeA, maeB, tme, yqkJ, ywkA, yqkJ, malS, ytsJ, mleA, mleS, mez, sce59.10c, 2sc7g11.23, malS1, malS2, dme, maeB1, maeB2, mdh, mdhl, mdh2, dmel_cg10120, dmel_cg10120, dmel-cg5889, f19k16.27, f6f22.7, t22p22.60, f18a17.1, mod1, tme, mao, cgl3007, malS e malE.
Além disso, é preferido de acordo com a invenção que, no even- to onde a provisão aumentada de sucinil-coenzima A na célula ocorre por meio da trilha (oxaloacetato —> malato fumarato —> sucinil-coenzima A) acima descrita, a provisão de equivalentes de redução na célula é também aumentada de uma maneira alvejada.
Uma possibilidade de aumento dos equivalentes de redução consiste em aumento da trilha de fosfato de pentose oxidativa. Neste contex- to, é especialmente preferido que as atividades de 6-fosfato desidrogenase de glicose (EC 1.1.1.49) e/ou de 6-fosfogliconato desidrogenase (EC .1.1.1.44), que é de preferência codificada pelo gene de gnd, sejam aumen- tadas enquanto, se apropriado, simultaneamente inibindo glicólise, por e- xemplo, por diminuição da atividade de 6-fosfato isomerase de glicose, tal como descrito em WO-A-01/07626. Além da, ou em vez da, promoção direta da trilha de fosfato de pentose, pode além disso ser preferido fornecer equi- valentes de redução por fornecimento de, às células, etanol como a fonte de carbono e por promoção da, nas células, conversão do etanol em acetaldeí- do por meio de álcool desidrogenases (EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2, EC 1.1.1.71 ou EC 1.1.99.8) e da conversão adicional do acetaldeído em acetil coenzima A por meio de acetaldeído desidrogenases (EC 1.2.1.10). Mais uma vez, genes adequados para álcool desidrogenases e acetaldeído desidrogena- ses, podem ser encontrados em bases de dados de gene que são conheci- das ao trabalhador versado, tais como, por exemplo, a base de dados de KEGG, a base de dados de NCBI ou a base de dados de EMBL. Uma segunda trilha de oxaloacetato até sucinil-coenzima A é conduzida por meio de citrato como intermediário. Neste caso, é preferido de acordo com uma segunda modalidade especial da primeira, segunda ou ter- ceira alternativa acima descrita da célula de acordo com a invenção que a célula, se apropriado além de uma atividade aumentada da enzima E10 ou E11, caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E13 até E16 e E24 até E26 que é aumentada em comparação com seu tipo sel- vagem (veja Figura 8):
- de uma enzima E16, que catalisa a conversão de oxaloacetato
em citrato;
- de uma enzima E24, que catalisa a conversão de citrato em iso-
citrato;
- de uma enzima E25, que catalisa a conversão de isocitrato em glioxalato e sucinato;
- de uma enzima E26, que catalisa a conversão de glioxalato em
malato;
fumarato;
sucinato;
- de uma enzima E13, que catalisa a conversão de malato em
- de uma enzima Ei4, que catalisa a conversão de fumarato em
- de uma enzima E15, que catalisa a conversão de sucinato em sucinil-coenzima A.
Neste contexto, células que são especialmente preferidas de
acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes en- zimas ou combinações de enzima é aumentada: Ei3, E14, E15, Ei6, E24, E25, E26. E-I3Ei4, E-|3Ei5, E13E16, E13E24, E13E25, Ε-Ι3Ε26, E14E15, E14E-i6, E14E24. Ε14Ε25> E-|4E26, E-I5E-I6, E15E24, Ei5E25, E15E26 e Ei3E14EisEi6E24E2SE2C1 onde E13E14E15E16E24E2SE26 é mais preferido.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima E13Seja uma fumarato hidratase (EC 4.2.1.2), E14 seja uma sucinato desidrogenase (EC 1.3.99.1 ou EC 1.3.5.1) ou uma sucinato quinona oxidorredutase (1.3.5.1), E15 seja uma sucinato coenzima A Iigase (EC 6.2.1.4 ou EC 6.2.1.5),
E16Seja uma citrato sintase (EC 2.3.3.1 ou EC 2.3.3.8), E24Seja uma aconitato hidratase (EC 4.2.1.3), E25 é uma isocitrato Iiase (EC 4.1.3.1) e E26 é uma malato sintase (EC 2.3.3.9).
Genes preferidos para as enzimas E13 até E16 são aqueles que já foram descritos acima em conexão com a primeira trilha de oxaloacetato até sucinil-coenzima A.
A enzima E24 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em acol, aco2, ratireb, dmel-CG4706, dmel- CG4900, dmel-cg6342, cg9244, t3p4.5, f10m23.310, f4b14.100, adl032Wp, afr629wp, acnA, acnB, acnC, acnD, rpfA, acnA1, acnA2, acnM, citB, IeuC, cgl1540, sacA, pode e aco, onde acnA e acnB são especialmente preferidos.
A enzima E25 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em msd21.4, icl1, icl2, adl066cp, agl057wp, aceA, icl, aceAa, aceAb, cgl0097 e cgl2331, onde aceA é especialmente preferido.
De acordo com uma modalidade particular, genes que são preferidos são aqueles que codificam uma isocitrato Iiase que é desregulada no nível de gene ou nível de proteína.
A enzima E26 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em med24.5, mlsS1, acr268cp, masA, glcB, aceB, mis, glcB-1, glcB-2, cgl2329, masZ, aceB1, aceB2 e mas, onde o gene de aceB é especialmente preferido.
Mais uma vez, as seqüências de nucleotídeo de genes adequa- dos das enzimas E24 até E26 podem ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL. Quando a provisão de oxaloacetato de fosfoenolpiruvato ou de
piruvato é promovida por aumento da atividade da enzima Ei0 ou E11, o su- cinato que é formado, além de glioxalato, na clivagem do isocitrato pela iso- citrato Iiase pode também ser utilizado para a formação de sucinil-coenzima A. Além disso, pode ser vantajoso nesta segunda trilha do oxaloacetato ao sucinato reduzir a atividade de uma enzima E27, que catalisa a conversão de isocitrato em 2-oxoglutarato e que de preferência toma a forma de uma isoci- trato desidrogenase (EC 1.1.1.41 ou EC 1.1.1.42). De preferência, a isocitra- to desidrogenase toma a forma de uma enzima que é codificada por um ge- ne selecionado do grupo consistindo em idhl, idh2, cg7176, cg7176, cg7176, f20d21.16, f12p19.10, t15n1.80, idpl, idp2, idp3, aal022Wp, a- er061Cp, idhC, idhM, icdA, icd, idh, icdl, icd2, IeuB, citC, citC, cgl0664, leuB2, idh3A, idg3B, idh3G, cg12233, dmel-CG5028, dmel-CG6439, f6p23.14, f23e12.180, f8d20.160, f12e4.20, adl223wp e afr137cp, onde icdA e citC são especialmente preferidos. Uma terceira trilha do oxaloacetato à sucinil-coenzima A é con-
duzida por meio de 2-oxoglutarato como intermediário. Neste caso, é prefe- rido de acordo com uma terceira modalidade especial da primeira, segunda ou terceira alternativa acima descrita da célula de acordo com a invenção que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E16, E24, E27 e E2S que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem, se apropriado além de uma atividade aumentada da enzima Ei0 ou Ei1 (veja Figura 9):
- de uma enzima E16, que catalisa a conversão de oxaloacetato em citrato;
- de uma enzima E24, que catalisa a conversão de citrato em iso- citrato;
- de uma enzima E27, que catalisa a conversão de isocitrato em .2-oxoglutarato;
- de uma enzima E28, que catalisa a conversão de 2-oxoglutarato em sucinil-coenzima A.
Neste contexto, células que são especialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes en- zimas ou combinações de enzima é aumentada: E16, E24, E27, E28, Ei6E24, Ei6E27, Ei6E28l E24E27, E24E2S1 E27E28, Ei6E24E27l Ei6E24E28l E24E27E28 e E16E24E27E28l onde E16E24E27E28 é mais preferido.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima E16 seja uma citrato sintase (EC 2.3.3.1 ou EC 2.3.3.8),
E24Seja uma aconitato hidratase (EC 4.2.1.3),
E27 seja uma isocitrato desidrogenase (EC 1.1.1.41 ou EC .1.1.1.42) e
E28Seja uma 2-oxoglutarato sintase (EC 1.2.7.3). Genes preferidos para as enzimas Ei6, E24 e E27 são aqueles que já foram descritos acima em conexão com a primeira e segunda trilha do oxaloacetato à sucinil-coenzima A.
A enzima E28 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em korA, korB, kor D1 korA1, korA2, korB1, korB2, oorA, oorB, oorC, oorD, oforA, oforB, porA, porB, porA1, porA2, porA3, po- rA4, porG, porG1, porG2, porB1, porB2, porB3, SCD20.12c, SCD20.13c, SCAH10.34c, SCAH10.35c, korG, orA, orB, korG1 e korG2. Além disso, E28 pode também tomar a forma de um complexo de desidrogenase consistindo em uma pluralidade de sub-unidades que possuem diferentes atividades en- zimáticas. Em particular, ela pode tomar a forma de um complexo de desi- drogenase compreendendo uma oxoglutarato desidrogenase (EC 1.2.4.2), uma diidrolipoil desidrogenase (EC 1.8.1.4) e uma sucinil transferase de re- síduo de diidrolipoillisina (EC 2.3.1.61). Neste contexto, a oxoglutarato desi- drogenase (EC 1.2.4.2) é de preferência codificada por genes selecionados do grupo consistindo em ogdh, ghdhl, Ioc239017, mgc68800, mgc80496, cg11661, t22e16.70, mpA24.10, kgdl, aer374cp, sucA, odhA, kgdA e c- gl1129, onde sucA e odhA são especialmente preferidos. A diidrolipoil desi- drogenase (EC 1.8.1.4) é de preferência codificada por genes selecionados do grupo consistindo em dld, dld-prov, dldh, cg7430, t2j15.6, k14a17.6, at3g 17240, mgd8.71pd1, afr512wp, dld1, Ipd, tb03.26j7.650, tb04.3m 17.450, tb927.8.7380, tb08.10k10.200, IpdA, IpdG, IpdV, Ipd3, acoD, IpdAI, lpdA2, lpdA3, odhL, pdhD, pdhD1, pdhD2, pdhD3, pdhD42, IpdAchI, lpdAch2, Ip- dAc, acoL, bfmbC, bkdD, cgl0366, cgl0688, scm1.17c, pdhL, sck13.11, lpdB2 e dld1, onde Ipd é especialmente preferido. Neste contexto, o sucinil transfe- rase de resíduo de diidrolipoilisina (EC 2.3.1.61) é de preferência codificada por genes selecionados do grupo consistindo em dlst, dlst-prov, mgc89125, dmel_CG5214, f10m23.250, k13p22.8, kgd2agl200wp, kgd2, odhB, sucB, aceF, kgdB, sucB1, sucB2, pdhC, dlaT, kgd, sc5F7.20 e sc4B10.24c, onde sucB e odhB são especialmente preferidos.
As seqüências de nucleotídeo de genes adequados da enzima E28 ou das subunidades acima mencionadas da enzima E2e, podem, mais uma vez, ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL.
As trilhas acima descritas do oxaloacetato à sucinil-coenzima A partem de fosfoenolpiruvato ou de piruvato como precursores de substrato. Neste contexto, pode além disso ser preferido geneticamente modificar as células de um tal modo que elas sejam capazes de fornecimento de especi- almente grandes quantidades de piruvato ou fosfoenolpiruvato partindo de carboidratos e/ou de glicerol. No evento em que as células são capazes de utilização de glice- rol como fonte de nutriente, é preferido que a célula de acordo com a inven- ção exiba uma atividade de pelo menos uma, de preferência todas, das se- guintes enzimas E29 até E42 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem:
- de uma enzima E29, que facilita a difusão de glicerol na célula,
- de uma enzima E3o, que catalisa a conversão de glicerol em 3- fosfato de glicerol,
- de uma enzima E3-I, que catalisa a conversão de 3-fosfato de glicerol em fosfato de diidroxiacetona,
- de uma enzima E32, que catalisa a transferência de súlfur ao aceptor de súlfur tiorredoxina 1,
- de uma enzima E33, que catalisa a hidrólise de fosfolipídeos com formação de álcoois e glicerol,
- de uma enzima E34, que catalisa o transporte de 3-fosfato de glicerol na célula em permuta por fosfato;
- de uma enzima E35, que catalisa a conversão de fosfato de dii- droxiacetona em 3-fosfato de gliceraldeído,
- de uma enzima E36, que catalisa a conversão de 3-fosfato de gliceraldeído em 1,3-bifosfoglicerato,
- de uma enzima E37, que catalisa a conversão de 1,3- bifosfoglicerato em 3-fosfoglicerato,
- de uma enzima E38, que catalisa a conversão de 3- fosfoglicerato em 2-fosfoglicerato,
- de uma enzima E39, que catalisa a conversão de 2- fosfogIicerato em fosfoenolpiruvato,
- de uma enzima E40, que catalisa a conversão de fosfoenolpiru- vato em piruvato,
- de uma enzima E41, que catalisa a conversão de glicerol em diidroxiacetona,
- de uma enzima E42, que catalisa a conversão de diidroxiaceto- na em fosfato de diidroxiacetona. Neste contexto, células que são especialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes en- zimas ou combinações de enzima é reduzida:
<formula>formula see original document page 31</formula>
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima E29seja uma aquagliceroporina (facilitadora de glicerol) que é de preferência codificada pelo gene de glpF,
E30 seja uma glicerol cinase (EC 2.7.1.30) que é de preferência codificada pelo gene de glpK,
E31 seja uma 3-fosfato desidrogenase de glicerol (EC 1.1.99.5), de preferência uma 3-fosfato desidrogenase de glicerol dependente de FAD, onde a 3-fosfato desidrogenase de glicerol é de preferência codificada pelo gene de glpA, o gene de glpB, o gene de glpC ou o gene de glpD, especial- mente de preferência pelo gene de glpD,
E32 é uma súlfur transferase que é codificada pelo gene de glpE,
E33 é uma glicerol fosfodiesterase (EC 3.1.4.46) que é de prefe- rência codificada pelo gene de glpQ,
E34 é uma 3-fosfato permease de glicerol que é de preferência codificada pelo gene de glpT,
E35 é uma fosfato isomerase de triose (EC 5.3.1.1), E36 é uma 3-fosfato desidrogenase de gliceraldeído (EC
.1.2.1.12),
E37 é uma fosfogIicerato cinase (EC 2.7.2.3), Ε38 é uma fosfoglicerato mutase (EC 5.4.2.1),
E39 é uma enolase (EC 4.2.1.11),
E4O é uma piruvato cinase (EC 2.7.1.40),
E41 é uma glicerol desidrogenase (EC 1.1.1.6) que é de prefe- rência codificada pelo gene de gldA, e
E42 é uma diidroxiacetona cinase (EC 2.7.1.29) que é de prefe- rência codificada pelo gene de dhaK.
As seqüências de gene das enzimas acima mencionadas po- dem, mais uma vez, ser encontradas nas bases de dados de gene que são conhecidas ao trabalhador versado, em particular a base de dados de KEGG, a base de dados de NCBI ou a base de dados de EMBL.
Além disso, o gene de gap, que codifica 3-fosfato desidrogenase de gliceraldeído (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), o gene de tpi, que codifica fosfato isomerase de triose (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), e o gene de pgk, que codifica 3- fosfoglicerato cinase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076- .6086), são também conhecidos de outras fontes.
Uso dos genes conhecidos das enzimas E29 até E42, é possível preparar células geneticamente modificadas nas quais pelo menos uma, de preferência pelo menos duas, mais preferivelmente pelo menos três e mais preferivelmente todas as atividades das enzimas E29 até E42 foi aumentada por meio das técnicas (mutação da enzima ou aumento na expressão da enzima) descritas no início em conexão com a enzima Ei. Estas células são capazes de serem cultivadas na presença de glicerol como a fonte de car- bono apenas (ou então juntas com carboidratos como fonte de carbono adi- cional).
Além de aumento de uma ou mais das atividades enzimáticas E29 até E42, pode, no evento em que a célula é capaz de utilização de glice- rol como fonte de carbono, também ser vantajoso quando os seguintes ge- nes são expressos, de preferência heterologamente expressos, nas células de acordo com a invenção:
- o gene de glpG ou o gene de 3925, - o gene de glpX,
- o gene de dhaR, o gene de ycgU ou o gene de b1201,
- o gene de fsa, o gene de mipB, o gene de ybiZ ou o gene de
B0825,
- o gene de talC, o gene de fsaB, o gene de yijG ou o gene de
b3946.
Mais uma vez, as seqüências de nucleotídeo destes genes po- dem ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL. No evento em que as células são capazes de utilização de car- boidratos como fonte de nutriente, é preferido que a célula de acordo com a invenção caracterize uma atividade de pelo menos uma, de preferência de todas, das seguintes enzimas E43 até E45 e E36 até E4O que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem:
- de uma enzima E43, que catalisa a conversão de 6-fosfato de a- D-glicose em 6-fosfato de β-D-frutose,
- de uma enzima E44, que catalisa a conversão de 6-fosfato de β- D-frutose em 1,6-bifosfato de β-D-frutose,
- de uma enzima E45, que catalisa a conversão de 1,6-bifosfato de β-D-frutose para 3-fosfato de gliceraldeído e fosfato de diidroxiacetona,
- de uma enzima E36, que catalisa a conversão de 3-fosfato de gliceraldeído em 1,3-bifosfoglicerato,
- de uma enzima E37, que catalisa a conversão de 1,3- bifosfogIicerato em 3-fosfogIicerato,
- de uma enzima E38, que catalisa a conversão de 3- fosfoglicerato em 2-fosfoglicerato,
- de uma enzima E39, que catalisa a conversão de 2- fosfoglicerato em fosfoenolpiruvato, e
- de uma enzima E40, que catalisa a conversão de fosfoenolpiru- vato em piruvato.
Neste contexto, células geneticamente modificadas que são es- pecialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combinações de enzima é aumentada:
E36, E37, E38, E39, E40, E43, E44, E45, E36E37, E36E38, E36E39, E36E40, E36E43, E36E44, E36E45, E37E38, E37E39, E37E40, E37E43, E37E44, E37E45, E38E39, E38E40, E38E43, E38E44, E38E45, E39E40, E39E43, E39E44, E39E45, E40E43, E40E44, E40E45, E43E44, E43E45, E44E45 eE36E37E38E39-E40E43E44E45.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E43seja uma 6-fosfato isomerase de glicose (EC 5.3.1.9),
E44seja uma 6-fosfofruto cinase (EC 2.7.1.11),
E45seja uma bisfosfato aldolase de frutose (EC 4.1.2.13),
E36 seja uma 3-fosfato desidrogenase de gliceraldeído (EC 1.2.1.12),
E37seja uma fosfoglicerato cinase (EC 2.7.2.3),
E38 Seja uma fosfoglicerato mutase (EC 5.4.2.1),
E39 seja uma enolase (EC 4.2.1.11) e
E40 seja uma piruvato cinase (EC 2.7.1.40).
Mais uma vez, as seqüências de nucleotídeo destes genes po- dem ser encontradas ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL.
No evento em que a célula é capaz de utilização de carboidratos como fonte de carbono, é também preferido promover não apenas as enzi- mas acima mencionadas E43 até E45 e E36 até E40, mas também a captação de glicose nas células, por exemplo, por aumento da atividade de enzimas do sistema de fosfotransferase, em particular aquelas enzimas que são codi- ficadas por genes de ptsl, ptsH e ptsM, ou por realce de glicocinase (EC 2.7.1.2), que é de preferência codificada pelo gene de glk. Neste contexto, referência é feita em particular a US 6.680.187, US 6.818.432, US 6.913.910 e US 6.884.614, cujo conteúdo de descrição com referência às possibilida- des para superexpressão dos genes de ptsl, ptsH, ptsM e glk é por meio desta incorporado através de referência e forma parte da descrição da pre- sente invenção. No evento em que carboidratos atuam como fonte de carbo- no, pode também ser vantajoso promover a trilha de fosfato de pentose de uma maneira alvejada, por exemplo, por aumento da atividade de 6-fosfato desidrogenase de glicose (EC 1.1.1.49) e de 6-fosfogliconato desidrogenase (EC 1.1.1.44), que é de preferência codificada pelo gene de gnd, enquanto, se apropriado, simultaneamente inibindo glicólise, por exemplo, por enfra- quecimento da atividade de 6-fosfato isomerase de glicose, tal como é des- crito em WO-A-01/07626.
No evento em que, de acordo com a modalidade especial da célula de acordo com a invenção onde semialdeído de metilmalonato é for- mado como precursor e sucinil-coenzima A como intermediário, as células formam ácido 3-hidroxiisobutírico ou polihidroxialcanoatos com base em áci- do 3-hidroxiisobutírico por meio de oxaloacetato e piruvato como intermediá- rios, pode além disso ser preferido reduzir a atividade de pelo menos uma, de preferência de todas, das seguintes atividades enzimáticas na célula:
- de uma enzima que catalisa a conversão de oxaloacetato em fosfoenolpiruvato, tal como, por exemplo, fosfoenilpiruvato carboxicinase (EC 4.1.1.49) (veja também DE-A-199 50 409),
- de uma enzima que catalisa a conversão de piruvato em aceta- to tal como, por exemplo, piruvato oxidase (EC 1.2.2.2) (veja também DE-A-199 51 975),
- de uma enzima que catalisa a conversão de 6-fosfato de a-D- glicose em 6-fosfato de β-D-frutose (veja também US 09/396.478),
- de uma enzima que catalisa a conversão de piruvato em Iactato tal como, por exemplo, 1-Iactato desidrogenase (EC 1.1.1.27) ou Iactato- malato trans-hidrogenase (EC 1.1.99.7),
- de uma enzima que catalisa a conversão de piruvato em acetil- coenzima A tal como, por exemplo, piruvato desidrogenase (EC 1.2.1.51),
- de uma enzima que catalisa a conversão de piruvato em acetil fosfato tal como, por exemplo, piruvato oxidase (EC 1.2.3.3),
- de uma enzima que catalisa a conversão de piruvato em aceta- to, tal como, por exemplo, piruvato desidrogenase (EC 1.2.2.2),
- de uma enzima que catalisa a conversão de piruvato em fosfo-
enolpiruvato tal como, por exemplo, fosfoenolpiruvato sintase (EC 2.7.9.2) ou piruvato, fosfato dicinase (EC 2.7.9.1), - de uma enzima que catalisa a conversão de piruvato em alani- na tal como, por exemplo, alanina transaminase (2.6.1.2) ou alanina-oxo- ácido transaminase (EC 2.6.1.12), e/ou
- de uma enzima que converte piruvato em acetolactato tal co- mo, por exemplo, ácido sintase de acetoidróxi (EC 2.2.1.6).
Células que são especialmente preferidas de acordo com a in- venção e que são capazes de formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou poli- hidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxibutírico de carboidratos como fonte de carbono por meio de sucinil-coenzima A como intermediário e em que uma ou mais das atividades enzimáticas acima mencionadas, em parti- cular uma das atividades enzimáticas E1 até E45, mais preferivelmente as atividades enzimáticas E1, E1E2E3E4, E1E4E5E6E7 ou e EiE4E5E7, pode ser aumentada são aqueles microorganismos que foram descritos por Bennett e outros, Metab. Eng. (2005), 7 (3), páginas 229 até 239, Bennett e outros, Biotechnol. Bioeng. (2005), 90 (6), páginas 775 até 779, Bennett e outros, Biotechnol. Prog. (2005), 21 (2), páginas 358 até 365, Bennett e outros (2005), Appl. Microbiol. Biotechnol., 67 (4), páginas 515 até 523, Vemuri e outros (2002), Applied and Environmental Microbiology 68 (4), páginas 1715 to 1727 e em US 6.455.284.
Se, de acordo com a primeira modalidade especial da célula de acordo com a invenção, a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou dos po- Iihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico partindo de L- glutamato como fonte de carbono ocorre por meio de sucinil-coenzima A como intermediário, é, em uma modalidade especial adicional da célula de acordo com a invenção, na qual semialdeído de metilmalonato é formado como precursor e sucinil-coenzima A como intermediário, além disso preferi- do de acordo com a invenção que ela caracterize uma atividade de pelo me- nos uma das, de preferência das duas, seguintes enzimas E28 e E46 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 10):
- de uma enzima E46, que catalisa a conversão de L-glutamato em 2-oxoglutarato;
- de uma enzima E28, que catalisa a conversão de 2-oxoglutarato em sucinil-coenzima A.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E46 seja uma glutamato sintase (EC 1.4.1.13 ou EC 1.4.1.14), uma glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3 ou EC 1.4.1.4) ou uma aspartato transaminase (EC 2.6.1.1 ou EC 2.6.1.2) e
E28é uma 2-oxoglutarato sintase (EC 1.2.7.3).
Preferida como enzima E2B são aquelas que já foram menciona- das no início como enzimas E2S preferidas.
A enzima E46 é de preferência codificada pelos genes seleciona- dos do grupo consistindo em: myn8., gltl, adr290wp, gltB, gltD, yeiT, aegA, ygfT, gltD-1, gltD-2, gltl, glt2, glsl, gltA, glt, glxD, gltA, yerD, cgl0184, c- gl0185, sc3c9.12, gdhl, gdh2, agl40cp, gdhA, gdhA1, gdhA2, gluD, rocG, ypcA, gudB, gluD, gdhA, gdhA2, gdh, gdhA-1, gdhA2-2, gdhA-3, gluD1, gluD2, glud1-prov, gludla, t11M8.2, t2M.150, mrg7.13, gotl, got2, caspat, got2-prov, xr406-prov, 406-prov, cg4233, cg4233, cg8430, cg8430, f23n19.17, f13j11.16, t26c19.9, f7f1.18, f10n7.200, t16l1.170, f15n18.110, t20d1.70, aat, aatl, aat2, abl038wp, afr211cp, agxl, bnA4, aatA, aatB, ybdL, aspC, yfbQ, ydcR, avtA2, aspC-1, aspC-2, aspC-3, aspC-4, aspB, aspB-1, aspB-2, aspB-3, aspB-4, argD1, argD2, aatAc, ywfG, mtnV, alaT, avtA1, av- tA2, avtA3, cgl0240, cgl1103, cgl2599, cgl2844, dapC, 2sck36.07c, sc9e12.21, sc2h4.04c, aspB1, aspB2, aspB3, tyrB, gpt, gptl, gpt2, mgc82097, cg1640, c32f10.8, f20d23.34, f26f24.16, f24j13.15, t10d10.20 ou agrwp.
Mais uma vez, as seqüências de nucleotídeo destes genes po- dem ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL.
De acordo com uma segunda modalidade especial da célula de acordo com a invenção, onde a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de semialdeído de metilmalonato como precursor, é preferido que a forma- ção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou do polihidroxialcanoato com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorra por meio de propionil-coenzima A como in- termediário, onde a célula é capaz de preferencialmente utilização de car- boidratos, glicerol, metano ou metanol como fonte de carbono. Neste contex- to, uma variedade de trilhas existem para chegar em ácido 3- hidroxiisobutírico ou polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico, partindo de propionil-coenzima A.
De acordo com uma primeira alternativa desta segunda modali- dade especial da célula de acordo com a invenção, a formação de interme- diário propionil-coenzima A ocorre por meio de acetil-coenzima A como in- termediário adicional. Neste contexto, é especialmente preferido que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E4, E5 e E47 até E52 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 11):
- de uma enzima E47, que catalisa a conversão de acetil- coenzima A em malonil-coenzima A;
- de uma enzima E48, que catalisa a conversão de malonil-
coenzima A em semialdeído de malonato;
- de uma enzima E49, que catalisa a conversão de semialdeído de malonato em 3-hidroxipropionato;
- de uma enzima E5o, que catalisa a conversão de 3- hidroxipropionato em 3-hidroxipropionil-coenzima A;
- de uma enzima E51, que catalisa a conversão de 3- hidroxipropionil-coenzima A em acriloil-coenzima A;
- de uma enzima E52, que catalisa a conversão de acriloil- coenzima A em propionil-coenzima A;
- de uma enzima E5, que catalisa a conversão de propionil-
coenzima A em semialdeído de metilmalonato;
- de uma enzima E4, que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em 3-hidroxiisobutirato.
Neste contexto, células geneticamente modificadas que são es- pecialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combinações de enzima é aumentada: E47, E48, E49, E5O, E5i , E52, E4, E5 e E47E48E4gE5oE5i E52E4E5. Além disso, é particularmente preferido neste contexto que a
enzima
E4 é uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou uma 3-hidroxiacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35), E5 é uma semialdeído de metilmalonato desidrogenase (EC1.2.1.27),
E47 é uma malonil-coenzima A descarboxilase (EC 4.1.1.9), uma malonato-coenzima A transferase (EC 2.8.3.3), uma metilmalonil-coenzima A carboxitransferase (EC 2.1.3.1) ou uma acetil-coenzima A carboxilase (EC 6.4.1.2),
E48 é uma semialdeído de malonato desidrogenase (EC1.2.1.18),
E49 é uma 3-hidroxipropionato desidrogenase (EC 1.1.1.59), E50 é uma 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.4), E51 é uma enoil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.17) e
E52 é uma acil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.3). Genes preferidos para as enzimas E4 e E5 são aqueles que já foram descritos acima em conexão com a primeira modalidade especial da célula de acordo com a invenção. A enzima E47 é de preferência codificada por genes seleciona-
dos do grupo consistindo em mlycd, t19b17.4, tb08.2904.110, matA, acac, acaca, acacb, f5j5.21, f15c21.2, t8p21.5, accl, aar071wp, accA, accB, accC, accD, accC1, accC2, mmdA, fabG, accD1, accD2, accD3, cgl0831, accBC, dtsR1, accDA, scc24.16c e cgl1327, onde accA, accC e accD são mais pre- feridos.
A enzima E48 é de preferência codificada pelo gene de iolD. A enzima E5i é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em echSl, ehhadh, hadha, echsl-prov,
cg 4 3 8 9, cg4 38 9, cg6543, cg6984, cgS778, ech-1, ech-2, ech-3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, pa&F, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpíF, phaA, phaB, echAl, echA2, echA3, echA4, echAS, echA6, echA7, echAS, e- chA9, echAS, echAlO, echAll, echA12; echA13, echAl4, e- chAl5, echAl6, echA17, echA18, echA19, echA20, echA21, fad- .1, fad-2, fad-3, dcaE, hcaA, fadJ, rsp0671, rsp0035, rsp064 8, rsp0647, rs03234, rs03271, rs04421, rs04419, rs02820, rs02946, paaGl, paaG2, paaG3, ech, pksH, ydbS, eccHl, eccH2, pimF, fabJl, fabJ2, caiD2, ysiB, yngF, yusL, fucA, cgl0919, scf41.23, scdl0.16, sckl3.22, scp8.07c, stbacl6h6.14, sc5f2a.l5, sc6a5.38, hbd-1, hbd-2, hdb-3, hdb-4, hdb-5, hdb-6, hdb-7, hdb-8, hdb-9, hdb-10, fad-1, fad-2, fad-3, fad-4, fad-5, paaF-1, paaF-2, paaF-3, paaF-4, paaF-5, paaF-6, paaF-7 .
e crt.
A enzima E52 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em acadl, acadm, acadIO, acad11, acadm-prov, acadl-prov, mgc81873, cg12262, cg4703, cg4860, f3e22.5, afl213wp, acdC, fadE13, acd-1, acd-2, acd-3, acd-4, acd-5, acd-6, acd-7, acd-8, acd-9, acd- .10, acd-11, acd-12, acd, fadE1, fadE2, fadE3, fadE4, fadE5, fadE6, fadE7, fadE13, fadE14, fadE15, fadE16, fadE17, fadE18, fadE19, fadE20, fadE21, fadE22, fadE23, fadE26, fadE27, fadE30, fadE31, fadE33, fadE35, fadE38, fadE45, fadE, caiA, aidB, RSp0036, RS03588, mmgC, acdA-3, bcd, acdA, acdH1, acdH2, acdH3, aidB, acdl e acdH. As seqüências de nucleotídeo de genes adequados para as en- zimas E47 até E52, em particular também das enzimas E49 e E50, podem ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL.
De acordo com uma segunda alternativa deste segunda modali- dade especial da célula de acordo com a invenção, a formação do interme- diário propionil-coenzima A também ocorre por meio de acetil-coenzima A como intermediário adicional, onde, de acordo com esta alternativa, a propi- onil-coenzima A não é convertida diretamente no semialdeído de metilmalo- nato, mas por meio de metilmalonil-coenzima A. Neste contexto, é especial- mente preferido que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E2 até E4, E6, E7 e E47 até E52 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 12):
- de uma enzima E47, que catalisa a conversão de acetil- coenzima A em malonil-coenzima A;
- de uma enzima E48, que catalisa a conversão de malonil- coenzima A em semialdeído de malonato;
- de uma enzima E49, que catalisa a conversão de semialdeído de malonato em 3-hidroxipropionato;
- de uma enzima E50, que catalisa a conversão de 3- hidroxipropionato em 3-hidroxipropionil-coenzima A;
- de uma enzima E51, que catalisa a conversão de 3- hidroxipropionil-coenzima A em acriloil-coenzima A;
- de uma enzima E52, que catalisa a conversão de acriloil-
coenzima A em propionil-coenzima A;
- de uma enzima E7, que catalisa a conversão de propionil- coenzima A em (S)-metilmalonil-coenzima A;
- de uma enzima E6, que catalisa a conversão de (S)- metilmalonil-coenzima A em (R)-metilmalonil-coenzima A;
- de uma enzima E2, que catalisa a conversão de (R)- metilmalonil-coenzima A em malonato de metila;
- de uma enzima E3, que catalisa a conversão de malonato de metila em semialdeído de metilmalonato;
- de uma enzima E4, que catalisa a conversão de semialdeído de
metilmalonato em 3-hidroxiisobutirato.
Neste contexto, células geneticamente modificadas que são es- pecialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combinações de enzima é aumentada: E2, E3, E4, E6, E7, E47, E4q, E49, E50, E51, E52 e E2E3E4E6E7E47E48E49E5oE5-|E52.
Enzimas e genes destas enzimas preferidos são aqueles genes e enzimas que já foram mencionados acima em conexão com as enzimas E2 até E4, E6, E7 e E47 até E52.
De acordo com uma terceira alternativa deste primeira alternati- va da segunda modalidade especial da célula de acordo com a invenção, a formação do intermediário propionil-coenzima A também ocorre por meio de acetil-coenzima A como intermediário adicional, onde, de acordo com esta alternativa, a propionil-coenzima A é, mais uma vez, não convertida direta- mente em semialdeído de metilmalonato, mas por meio de (R)-metilmalonil- coenzima A (e não por meio de (S)-metilmalonil-coenzima A). Neste contex- to, é especialmente preferido que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E2 até E4, E7 e E47 até E52 que é aumen- tada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 13):
- de uma enzima E47, que catalisa a conversão de acetil- coenzima A em malonil-coenzima A;
- de uma enzima E48, que catalisa a conversão de malonil- coenzima A em semialdeído de malonato;
- de uma enzima E49, que catalisa a conversão de semialdeído de malonato em 3-hidroxipropionato;
- de uma enzima E50, que catalisa a conversão de 3- hidroxipropionato em 3-hidroxipropionil-coenzima A;
- de uma enzima E5-I, que catalisa a conversão de 3-
hidroxipropionil-coenzima A em acriloil-coenzima A;
- de uma enzima E52, que catalisa a conversão de acriloil- coenzima A em propionil-coenzima A;
- de uma enzima E7, que catalisa a conversão de propionil- coenzima A em metilmalonil-coenzima A;
- de uma enzima E2, que catalisa a conversão de metilmalonil- coenzima A em malonato de metila;
- de uma enzima E3, que catalisa a conversão de malonato de metila em semialdeído de metilmalonato;
- de uma enzima E4, que catalisa a conversão de semialdeído de
metilmalonato em 3-hidroxiisobutirato.
Neste contexto, células geneticamente modificadas que são es- pecialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combinações de enzima é aumentada: E2, E3, E4, E7, E47, E48, E49, E5o, E51, E52 e E2E3E4E7E47E48E49E5oE5iE52.
Enzimas e genes destas enzimas preferidas são, mais uma vez, aqueles genes e enzimas que já foram mencionados acima em conexão com as enzimas E2 até E4, E7 e E47 até E52.
De acordo com uma quarta alternativa da segunda modalidade especial da célula de acordo com a invenção, a formação do intermediário propionil-coenzima A também ocorre por meio de acetil-coenzima A como intermediário adicional, onde, de acordo com esta alternativa, acetoacetil- coenzima A é formada como intermediário. Neste contexto, pode ser preferi- do que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E8 e E53 até E6I que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem:
- de uma enzima E53, que catalisa a conversão de acetil- coenzima A em acetoacetil-coenzima A;
- de uma enzima E54, que catalisa a conversão de acetoacetil- coenzima A em 3-hidroxibutanoil-coenzima A;
- de uma enzima E55, que catalisa a conversão de 3- hidroxibutanoil-coenzima A em crotonil-coenzima A;
- de uma enzima E56, que catalisa a conversão de crotonil- coenzima A em butiril-coenzima A;
- de uma enzima E57, que catalisa a conversão de butiril- coenzima A em etilmalonil-coenzima A;
- de uma enzima E58, que catalisa a conversão de etilmalonil- coenzima A em metilsucinil-coenzima A;
- de uma enzima E59, que catalisa a conversão de metilsucinil- coenzima A em isobutiril-coenzima A;
- de uma enzima E6o, que catalisa a conversão de isobutiril- coenzima A em metacrilil-coenzima A;
- de uma enzima E6i, que catalisa a conversão de metacrilil- coenzima A em 3-hidroxiisobutiril-coenzima A;
- de uma enzima E8, que catalisa a conversão de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutirato.
Neste contexto, células geneticamente modificadas que são es- pecialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combinações de enzima é aumentada: Ε8, E53, E54, E55, E56, Ε57, Ε58, Ε59, Ε60, Ε61 e Ε8Ε53Ε54Ε55Ε56Ε57Ε58Ε59Ε60Ε61 ·
Esta trilha metabólica e as enzimas que desempenham um pa- pel nesta trilha metabólica são descritos, por exemplo, em Korotkova e ou- tros, Journal of Bacteriology (2002), páginas 1750 até 1758.
De acordo com uma quinta alternativa da segunda modalidade especial da célula de acordo com a invenção, a formação do intermediário propionil-coenzima A ocorre por meio de, mais uma vez, acetil-coenzima A como intermediário adicional, onde, de acordo com esta alternativa, acetoa- cetil-coenzima A é formada como intermediário adicional mas onde, neste caso, etilmalonil-coenzima A é formada diretamente de crotonil-coenzima A. Neste contexto, pode ser preferido que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E8 e E53 até E56 e E62 até E65 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 14):
de uma enzima E53, que catalisa a conversão de duas unidades de acetil-coenzima A em acetoacetil-coenzima A;
de uma enzima E54, que catalisa a conversão de acetoacetil- coenzima A em 3-hidroxibutiril-coenzima A;
de uma enzima E55, que catalisa a conversão de 3-hidroxibutiril- coenzima A em crotonil-coenzima A;
-de uma enzima E56, que catalisa a conversão de crotonil- coenzima A em etilmalonil-coenzima A;
de uma enzima E62, que catalisa a conversão de etilmalonil- coenzima A em metilsucinil-coenzima A;
de uma enzima E63, que catalisa a conversão de metilsucinil- coenzima A em mesaconil-coenzima A;
de uma enzima E64, que catalisa a conversão de mesaconil- coenzima A em β-metilmalil-coenzima A;
de uma enzima E65, que catalisa a conversão de β-metilmalil- coenzima A em glioxilato e propionil-coenzima A.
Por isso, a partir de propionil-coenzima A pode da maneira aci- ma descrita (aumento da atividade de uma ou mais das enzimas E7, E2, E3 e E4, aumento da atividade de uma ou mais das enzimas E7, E6, E2, E3 e E4, ou aumento da atividade de uma das, ou de ambas as, enzimas E4 e E5). Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima E53Seja uma β-cetotiolase (EC 2.3.1.9),
E54 seja uma acetoacetil-coenzima A redutase (uma EC .1.1.1.36),
E55Seja uma enoil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.17), E56Seja uma crotonil-coenzima A descarboxilase, E62seja uma etilmalonil-coenzima A mutase (EC 5.4.99.2), E63Seja uma metilsucinil-coenzima A desidrogenase, E64Seja uma mesaconil-coenzima A hidratase, e E65Seja uma β-metilmalil/L-malil-coenzima A liase. A enzima E53 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em acatl, acat2, Ioc484063, loc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, kat-1, erg10, ygeF, atoB, fa- dAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-uma, bktB, phaA, tioL, thIA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thl, vraB, th1, mvaC, thiL, paaJ, fa- dA3, fadA4, fadA5, fadA6, cgl12392, catF, sc8f4.03, thiL1, thiL2, acaB1, a- caB2, acaB3, acaB4 ou, onde acatl, acat2, atoB e phbA e o gene corres- pondente de Rhodobacter sphaeroides são especialmente preferidos.
A enzima E54 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em phbB, fabG, phbN1, phbB2 ou cgl12444, onde phbB é especialmente preferido e o gene correspondente de Rhodobacter sphaeroides é especialmente preferido.
A enzima E55 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em echsl' ehhadh' hadha' echsl"prov'
cg4389, cg4389, cg6543, cg6S84, cg8778, ech-1, ech-2, ech-3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, ec;i2, paaF, paaG, yfc X, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echAl, echA2, echA3, echA4, echA5, echA6, echA7, echA6, e- chA9, echAS, echAl0, echAl1, echAl2, echAl3, echA14, e- chAl5, echAl6, echA17, echAlB, echAl?, echA20, echA21, fad- 45
1, fad-2, fad-3, dcaE, hcaA, íadJ, rsp0671, rsp0035, rsp0648, rspQ647, rsÜ3234, rs03271, rs04421, rs04419, rs02820, rs02946, paaGl, paaG2, paaG3, ech, pksH, ydbS, eccHl, eccH2, pimF, fabJl, fabJ2, caiD2, ysiB, yngF, yusL, fucA, cgl0919, scf41.23, scdlQ.16, sckl3.22, scp8.07c, stbacl6h6.14, sc5f2a.l5, sc6a5.38, hbd-1, hbd-2, hdb-3, hdb-4, hdb-5, hdb-6, hdb-7, hdb-8, hdb-9, hdb-10, fad-1, fad-2, fad-3, fad-4, fad-5, paaF-1, paaF-2, paaF-3, paaF-4,
paaF-5, paaF-6, paaF-7 e crt on(Je Q gene correspondente de Rhodo-
bacter sphaeroides é especialmente preferido.
A enzima que é de preferência empregada como enzima E56 é uma enzima de Flhodobacter sphaeroides que é codificada pela seqüência de DNA com a SEQ ID Nq 05 e que possui a seqüência de aminoácido tal como mostrado em SEQ ID Nq 06.
Genes adequados para a enzima E62 são selecionados do grupo
consistindo em mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmA1, mcmA2, mcmB, mcml, mcm2, mcm3, icmA, meaA1 e meaA2, on- de, mais uma vez, o gene correspondente de Rhodobacter sphaeroides é especialmente preferido. Genes preferidos para as enzimas E63, E64 e E65 são, em particu-
lar, os genes para estas enzimas de Rhodobacter sphaeroides.
Exemplos adicionais de seqüências de nucleotídeo dos genes acima mencionados podem também ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL, entre outros.
Como já foi explicada acima, a primeira alternativa da segunda modalidade preferida célula de acordo com a invenção gera ácido 3- hidroxiisobutírico ou os polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico por meio de propionil-coenzima A e acetil-coenzima A co- mo intermediários. Neste contexto, pode ser significante, em princípio, influ- enciar não apenas uma ou mais das atividades enzimáticas acima mencio- nadas E2 até E8 e E47 até E65, mas também aquelas atividades enzimáticas que efetuam um aumento na formação de acetil-coenzima A na célula.
No evento em que ácido 3-hidroxiisobutírico é formado de car- boidratos ou glicerol como fonte de carbono, pode ser preferido que a célula caracterize uma atividade aumentada em uma enzima E66, que catalisa a conversão de piruvato em acetil-coenzima A. Esta enzima E66 de preferência toma a forma de uma piruvato desidrogenase (EC 1.2.1.51).
No evento em que ácido 3-hidroxiisobutírico é formado de fontes de C1-carbono tais como, por exemplo, metano ou metanol, pode ser prefe- rido que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das enzimas E67 até E71 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem:
- de uma enzima E67, que catalisa a conversão de metano em metanol;
- de uma enzima E68, que catalisa a conversão de metanol em formaldeído;
- de uma enzima E69, que catalisa a conversão de formaldeído em 5,10-metilenotetraidrofolato;
a- de uma enzima E70, que catalisa a conversão de 5,10- metilenotetraidrofolato em 5-metiltetraidrofolato;
a- de uma enzima E71, que catalisa a conversão de 5- metiltetraidrofolato em acetil-coenzima A.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E67Seja uma metano monooxigenase (EC 1.14.13.25),
E68 seja uma metanol desidrogenase (EC 1.1.1.244),
E69 seja uma semialdeído dé metilmalonato desidrogenase (EC 1.2.1.27),
E70 é uma metilenotetraidrofolato redutase (EC 1.5.1.20),
E71 é um monóxido de carbono desidrogenase (EC 1.2.99.2).
As seqüências de nucleotídeo de genes adequados para as en- zimas E63 até E67 podem ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL.
De acordo com uma terceira modalidade especial da célula de acordo com a invenção, onde a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de semialdeído de metilmalonato como precursor, é preferido que a forma- ção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou do polihidroxialcanoato com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de acriloil-coenzima A como inter- mediário, onde a célula é capaz de preferencialmente utilização de carboi- dratos, glicerol ou glutamato como fonte de carbono.
Em conexão com a terceira modalidade especial da célula de acordo com a invenção, é especialmente preferido quando esta célula carac- teriza uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas Ei0 até E12, E56, E72 e E73 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (ve- ja Figura 15):
- de uma enzima E72, que catalisa a conversão de beta-alanina a beta-alanil-coenzima A,
- de uma enzima E73, que catalisa a conversão de beta-alanil- coenzima A em acrilil-coenzima A,
- de uma enzima E56, que catalisa a conversão de acrilil- coenzima A em metilmalonil-coenzima A,
- de uma enzima E10, que catalisa a conversão de metilmalonil- coenzima A em malonato de metila;
- de uma enzima Eu, que catalisa a conversão de malonato de metila em semialdeído de metilmalonato;
- de uma enzima E12, que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em ácido 3-hidroxiisobutírico.
Neste contexto, células que são especialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes en- zimas ou combinações de enzima é aumentada: E56Ei0, E56En, E56Ei2, E56E10En e E72EysE56E10Ei1E12. Em conexão com a quarta modalidade es- pecial, também, da célula de acordo com a invenção, pode ser vantajoso superexpressar uma enzima que é capaz de catalisação de pelo menos du- as das etapas de reação acima descritas. Aqui também, é possível, por e- xemplo, empregar uma enzima que caracteriza tanto a atividade da enzima E10 quanto a atividade da enzima E11, tal como, por exemplo, a malonil- coenzima A redutase de Sulfolobus tokodaii, que é codificada pela seqüên- cia de DNA com a SEQ ID Nq 03 e que caracteriza a seqüência de aminoá- cido tal como mostrado em SEQ ID Nq 04. Além disso, é, em princípio, tam- bém possível no contexto da quarta modalidade especial da célula de acordo com a invenção empregar uma célula que já é capaz de formação de espe- cialmente grandes quantidades de acrilil-coenzima A.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E72Seja uma coenzima A transferase (EC 2.8.3.1) ou uma coen- zima A sintetase, de preferência uma coenzima A transferase,
E73Seja uma beta-alanil-coenzima A amônia-liase (EC 4.3.1.6), E56 é uma crotonil-coenzima A descarboxilase E10 é uma metilmalonil-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.17),
E11 é uma aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.3) ou uma aldeído oxidase (EC 1.2.3.1) e
E12 é uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou uma 3-hidroxiacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35).
Enzimas E72 preferidas com uma atividade de CoA transferase são aquelas de Megasphaera elsdenii, Clostridium propionicum, Clostridium kluyveri e também de Escherichia coli. Exemplos que podem ser menciona- das neste ponto de uma seqüência de DNA codificando uma CoA transfera- se é a seqüência de Megasphaera elsdenii referida como SEQ ID N9: 24 em WO-A-03/062173. Enzimas que são também preferidas são aquelas varian- tes da CoA transferase que são descritas em WO-A-03/062173.
Enzimas E73 adequadas com uma atividade de beta-alanil- coenzima A amônia-liase são, por exemplo, aquelas de Clostridium propioni- cum. Seqüências de DNA que codificam uma tal enzima podem ser obtida, por exemplo, de Clostridium propionicum tal como descrito no Exemplo 10 em WO-A-03/062173. A seqüência de DNA que codifica a beta-alanil- coenzima A amônia-liase de Clostridium propionicum é especificada em WO- A-03/062173 como SEQ ID N°: 22.
Uma enzima E56 que é de preferência empregada é, mais uma vez, a crotonil-coenzima A descarboxilase de Rhodobacter sphaeroides, que é codificada pela seqüência de DNA com a SEQ ID N° 05 e que caracteriza a seqüência de aminoácido tal como mostrado em SEQ ID N° 06. Esta en- zima não é apenas capaz de conversão de crotonil-coenzima A em etilmalo- nil-coenzima A, mas também de conversão de acrilil-coenzima A em metil- malonil-coenzima A.
Genes adequados para as enzimas E10 até E12 já foram mencio- nadas em conexão com a primeira variante da célula de acordo com a in- venção, onde é também preferido em conexão com a segunda variante, o gene acima descrito de Sulfolobus tokodaii é especialmente preferido como gene para a enzima E11.
De acordo com uma variante especialmente preferida da terceira modalidade especial da célula de acordo com a invenção, esta célula carac- teriza pelo menos uma atividade da enzima E10 e E56 ou das enzimas E-|0, E11 e E56 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem, onde a E10 ou as enzimas E10 e E11 é codificada por uma seqüência de DNA tal co- mo mostrado em SEQ ID Nq 03 e a enzima E56 é codificada por uma se- quência de DNA tal como mostrado em SEQ ID Ne 05. Neste contexto, é preferido quando a atividade aumentada destas duas enzimas é alcançada por superexpressão dos, na célula, polipeptídeos com SEQ ID N9 04 e SEQ ID Ns 06 ou então aquelas seqüências de aminoácido com pelo menos 50%, de preferência pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65% e mais preferivelmente pelo menos .70% de identidade com a seqüência de aminoácido tal como mostrado em SEQ ID Ng 04 e SEQ ID Ns 06, respectivamente. Neste contexto, estas duas seqüências de DNA podem ser integradas no genoma da célula ou então estar presentes em um vetor dentro da célula. Em conexão com a acima descrita terceira modalidade especial da célula de acordo com a invenção, pode além disso ser vantajoso quando a célula caracteriza não apenas um aumento na atividade da enzima E56 e/ou da atividade da enzima E10 ou das enzimas E10 e E11, mas pelo menos uma, de preferência ambas, das seguintes propriedades: - uma atividade de uma enzima E11, que catalisa a conversão de piruvato em oxaloacetato ou de uma enzima E74, que catalisa a conversão de fosfoenolpiruvato em oxaloacetato, mas de preferência de uma enzima E11, que catalisa a conversão de piruvato em oxaloacetato, que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem, e
- uma atividade aumentada de uma enzima E75, que catalisa a conversão de aspartato em beta-alanina.
A enzima E11 de preferência toma a forma de uma carboxilase, especialmente de preferência de uma piruvato carboxilase (EC número 6.4.1.1), que catalisa a conversão de piruvato em oxaloacetato. uma piruvato carboxilase que é especialmente preferida neste contexto é o mutante que é descrito em "A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine-produção de mutant." Ohni- shi J e outros, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), páginas 217-223 (2002). Nesta mutação, o aminoácido prolina na posição 458 foi substituído por serina. A descrição desta publicação com referência às pos- sibilidades de preparo de mutantes de piruvato carboxilato é por meio desta incorporada por referência e forma parte da descrição da presente invenção.
A enzima E75 de preferência toma a forma de uma descarboxila- se, especialmente de preferência de um descarboxilato de glutamato ou de uma aspartato descarboxilase, com uma 1-aspartato 1-descarboxilase (EC número 4.1.1.11) que é codificada pelo gene de panD sendo mais preferido. Aspartato descarboxilase catalisa a conversão de aspartato em beta-alanina. Genes para aspartato descarboxilase (genes de panD) de, entre outros, Es- cherichia coli (FEMS Microbiology Letters, 143, páginas 247-252 (1996)), " Photorhabdus Iuminescens subsp. Laumondii, Mycobacterium bovis subsp. Bovis') e de um grande número de outros microorganismos já foram clona- dos e sequenciados. DE-A-198 55 313 descreve em particular a seqüência de nucleotídeo do gene de panD de Corynebaeterium glutamicum. Em prin- cípio, é possível usar genes de panD de qualquer origem possível, não im- porta se de bactérias, leveduras ou fungos. Além disso, é possível empregar todos os alelos do gene de panD, em particular também aqueles que são o resultado da degeneração do código genético ou de mutações de sentido neutro por função. Uma aspartato descarboxilase que é especialmente pre- ferida de acordo com a invenção, além da aspartato descarboxilase de Corynebacterium glutamicum, é o mutante de Escherichia coli DV9 (Vallari e Rock, Journal of Bacteriology, 164, páginas 136-142 (1985)). A descrição desta publicação com referência a mutante o acima mencionado é por meio desta incorporada através de referência e forma parte da descrição da pre- sente invenção. A preparação de células recombinantes nas quais tanto a atividade da piruvato carboxilase quanto a atividade da aspartato descarbo- xilase são aumentadas é descrita em DE-A-10 2005 048 818.
De acordo com uma segunda variante da célula de acordo com a invenção, a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcano- atos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor.
No evento em que, na célula de acordo com a invenção, a for- mação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor, tal como especificado na segunda variante, é preferida de acordo com uma primeira modalidade especial em que a formação de ácido .3-hidroxiisobutírico ou do polihidroxialcanoato com base em ácido 3- hidroxiisobutírico ocorre por meio de isobutiril-coenzima A como intermediá- rio, onde a célula é capaz de preferencialmente utilização de carboidratos, glicerol ou L-valina como fonte de carbono.
No evento em que carboidratos ou glicerol atuam como a fonte de carbono, é preferido, de acordo com uma primeira alternativa desta pri- meira modalidade especial da segunda variante da célula de acordo com a invenção que esta célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E76 até E79, E6o, E6I e E8 que é aumentada em compara- ção com seu tipo selvagem (veja Figura 16):
- de uma enzima E76, que catalisa a conversão de piruvato em 2- acetolactato;
- de uma enzima E77, que catalisa a conversão de 2-acetolactato em 2,3-diidroxiisovalerato;
- de uma enzima E78, que catalisa a conversão de 2,3- diidroxiisovalerato em 2-oxoisovalerato; - de uma enzima E79, que catalisa a conversão de 2- oxoisovalerato em isobutiril-coenzima A;
- de uma enzima E6o, que catalisa a conversão de isobutiril- coenzima A em metacrilil-coenzima A;
- de uma enzima E6-I1 que catalisa a conversão de metacrilil-
coenzima A em 3-hidroxiisobutiril-coenzima A;
- de uma enzima E8, que catalisa a conversão de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutirato.
Neste contexto, células geneticamente modificadas que são es- pecialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combinações de enzima é aumentada: Ee, Eeo, Εβι, E76, E77, E78, E79 e E8E6oE6i E76E77E78E79.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima Ee seja uma 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.4),
E76 seja uma acetolactato sintase (EC 2.2.1.6),
E77Seja uma diidroxiisovalerato desidrogenase (EC 1.1.1.86), E78Seja uma 2,3-diidroxiisovalerato desidratase (EC 4.2.1.9), E79 seja uma 2-oxoisovalerato desidrogenase (EC 1.2.1.25 ou
EC 1.2.4.4),
E6O seja uma acil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.3), uma
butiril-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.2) ou uma 2-metilacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.12), e
E6I seja uma enoil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.17). Enzimas preferidas E8, E60 e E6I são aquelas que já foram des- critas acima.
A enzima E76 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em ilvbl, t8p19.70, ilvl, ilv2, ilv6, aal021wp, a- el305cp, ilvl, ilvH, ilvN, ilvB, ilvM, ilvG, ilvN, budB, ilvN-1, ilvN-2, atrC, ilvX, iolD, budB, alsS, ilvK, ilvB1, ilvB2, ilvB3, ilvN1, ilvN2, cgl1271, cgl1272, iolD e scc57A.40c.
A enzima E77 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em f14p22.200, ilv5, acl198Wp, ilvC, ilvY, ilvC-1, ilvC-2, ilvC-3 e cgl1273, onde o gene de ilvC é mais preferido.
A enzima E78 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em f14o13.18, ilv3, acl117wp, ilvD, cgl1268, ilvD1 e ilvD2, onde ilvD é mais preferido.
No evento em que L-valina atua como fonte de carbono, é prefe- rido de acordo com uma segunda modificação da primeira modalidade espe- cial da segunda alternativa da célula de acordo com a invenção, onde a for- mação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor e isobutiril-coenzima A como intermediário, que esta célu- la caracterize uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E79, E80, E6o, E6i e E8 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem (veja Figura 17):
- de uma enzima E8o, que catalisa a conversão de L-valina em 2- oxoisovalerato;
- de uma enzima E79, que catalisa a conversão de 2- oxoisovalerato em isobutiril-coenzima A;
- de uma enzima E6o, que catalisa a conversão de isobutiril- coenzima A em metacrilil-coenzima A;
- de uma enzima E6i, que catalisa a conversão de metacrilil- coenzima A em 3-hidroxiisobutiril-coenzima A;
- de uma enzima E8, que catalisa a conversão de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutirato.
Neste contexto, células geneticamente modificadas que são es- pecialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combinações de enzima é aumentada:
E8, Εβο. Εβι, E79, E8O e ΕβΕβοΕβι EygE8O-
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E8Seja uma 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.4),
E6O seja uma acil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.3), uma butiril-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.2) ou uma 2-metilacil-coenzima A desidrogenase
(EC 1.3.99.12),
E61 seja uma enoil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.17), E79 seja uma 2-oxoisovalerato desidrogenase (EC 1.2.1.25 ou EC 1.2.4.4), e
E8O seja uma aminoácido transferase (EC 2.6.1.42). Enzimas preferidas E8, E6o, E6i e E79 são aquelas que já foram descritas acima.
A enzima E80 é de preferência codificada por genes seleciona- dos do grupo consistindo em bcatl, bcat2, t27l1.8, t27i1.9, f2j10.5, f2j10.4, t12h1.16, mmb12.20, t9c5.3, mpa24.13, bati, bat2, adl384wp, eca39, bcaA, ilvE, ilvE1, ilvE2, ilvE3, ywaA, ybgE, bcaT e cgl2204, onde ilvE é especial- mente preferido.
As seqüências de nucleotídeo de genes adequados para a en- zima E80 podem, mais uma vez, ser encontradas na base de dados de KEGG, na base de dados de NCBI ou na base de dados de EMBL.
Em conexão com esta segunda alternativa da primeira modali- dade especial da segunda variante da célula de acordo com a invenção, po- de além disso ser vantajoso reduzir a atividade de uma enzima E4 que cata- lisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em ácido 3- hidroxiisobutírico, onde esta enzima E4 de preferência toma a forma de uma 3- hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou de uma 3-hidroxiacil- coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35).
De acordo com a segunda modificação da primeira modalidade especial da segunda variante da célula de acordo com a invenção, onde a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor e isobutiril-coenzima A como intermediário e partindo de L-valina como fonte de carbono, pode além disso ser preferido empregar aquelas células que são já capazes de formação de grandes quantidades de L-valina. Neste contexto, células adequadas são em particular aquelas que foram descritas por Blombach e outros em Applied Environmental Microbio- logy, Vol. 73 (7) (2007), páginas 2079-2084.
No evento em que Crcompostos tais como, por exemplo, meta- no ou metanol atuam como fonte de carbono, é preferido em uma segunda modalidade especial da segunda variante da célula de acordo com a inven- ção, onde a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoa- tos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico ocorre por meio de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor, que a formação ocorra por meio de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como intermediário. Neste contexto, é pre- ferido que a célula caracterize uma atividade de pelo menos uma das se- guintes enzimas E8, E53, E54 e E81 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem:
- de uma enzima E53, que catalisa a conversão de acetil- coenzima A em acetoacetil-coenzima A;
- de uma enzima E54, que catalisa a conversão de acetoacetil- coenzima A em 3-hidroxibutiril-coenzima A;
- de uma enzima E81, que catalisa a conversão de 3- hidroxibutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutiril-coenzima A;
- de uma enzima E8, que catalisa a conversão de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutirato.
Neste contexto, células geneticamente modificadas que são es- pecialmente preferidas de acordo com a invenção são aquelas nas quais a atividade das seguintes enzimas ou combinações de enzima é aumentada: E8, E53, E54, E8i e E8E53E54E8I.
Neste contexto, é especialmente preferido que a enzima
E8 seja uma 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.4),
E53Seja uma β-cetotiolase (EC 2.3.1.9),
E54Seja uma acetoacetil-coenzima A redutase (uma
EC 1.1.1.36), e
E81 seja uma isobutiril-coenzima mutase (EC 5.4.99.13).
Enzimas preferidas E8, E53 e E54 são aquelas que já foram des- critas aqui acima. Uma enzima E81 preferida é a isobutiril-coenzima mutase de cepa de β-proteobacterium L108 que é descrita em Applied And Envi- ronmental Microbiology, Vol. 72 (6), 2006, páginas 4128-4135.
De acordo com uma modalidade especial da célula de acordo com a invenção, é também preferido que esta célula caracterize uma ex- pressão do gene de glbO que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem. Além disso, pode sob certas circunstâncias ser preferido que a célula de acordo com a invenção caracterize uma atividade da proteína de transporte de citrato que é codificada pelo gene de dctA ou o gene de citP, cuja atividade é reduzida em comparação com seu tipo selvagem.
Uma contribuição para a solução dos problemas mencionados
no início é além disso fornecida por um método de preparo de uma célula geneticamente modificada que é capaz de formação de ácido 3- hidroxiisobutírico ou polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico por meio de semialdeído de metilmalonato ou isobutiril-
coenzima A, como precursores, compreendendo a etapa do método de au- mento da, na célula, atividade de pelo menos uma das enzimas acima des- critas, de preferência de uma ou mais das enzimas
- E1 até E4,
- Ei, E4, E5, E6 e E7,
-Ei1E4lEseE7,
- E4, E5 e E47 até E52,
- E2 até E4, E6, E7 e E47 até E52,
- E2 até E4, E7 e E47 até E52,
- E8 e E53 até E6I,
25 - E8, E6O, E6I e E76 até E79,
- E8, E6o, E6I, E7g e E8O, ou
- E8, E53, E54 e E82
na célula, onde aumento da atividade enzimática é de preferência realizada pelos métodos descritos no início.
30 Outra contribuição para a solução dos problemas mencionados
no início é fornecida pelas células obteníveis pelo método acima descrito.
Outra contribuição para a solução dos problemas mencionados no início é fornecida por um método de produção de ácido 3- hidroxiisobutírico ou polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico, compreendendo a etapa do método de condução de uma célula de acordo com a invenção em contato com um meio de nutriente compreendendo, como fonte de carbono, carboidratos, glicerol, dióxido de carbono, metano, metanol, L-valina ou L-glutamato sob condições sob as quais ácido 3-hidroxiisobutírico ou polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico são formados da fonte de carbono, e, se apropriado, iso- lamento do ácido 3-hidroxiisobutírico do meio de nutriente.
As células geneticamente modificadas de acordo com a inven- ção podem estar em contato com o meio de nutriente, e desta forma cultiva- das, ou continuamente ou em forma de batelada no método de batelada ou no método de batelada de alimentação ou no método de batelada de alimen- tação repetida a fim de produzir 3-hidroxiisobutirato ou polihidroxialcanoatos com base em 3-hidroxiisobutirato. Um método semicontínuo tal como descri- to em GB-A-1009370 é também praticável. Uma visão geral sobre métodos de cultura conhecidos é descrita no livro didático por Chmiel ("Bioprozesste- chnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik' [Bioprocess technology 1. introduction to bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro didático por Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrieh- tungen", [Bioreatores and peripheral equipment] Vieweg Verlag, Braunsch- weig/Wiesbaden, 1994).
O meio de cultura a ser usado deve adequadamente alcançar os requerimentos das cepas em questão. Descrições de meio de culturas para vários microorganismos podem ser encontradas no livro didático "Manual of Methods for General Bacteriology" da Sociedade Americana para Bacterio- logia (Washington D.C., USA, 1981).
Fontes de carbono que podem ser usadas são carboidratos tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose, óleos e gorduras tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de côco, ácidos graxos tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linólico, álcoois tais como, por exemplo, glicerol e metanol, hidrocarbonetos tais como meta- no, aminoácidos tais como L-glutamato ou L-valina, ou ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético. Estas substâncias podem ser usadas sin- gularmente ou como uma mistura. É especialmente preferido empregar car- boidratos, em particular monossacarídeos, oligossacarídeos ou polissacarí- deos, tal como descrito em US 6 01 494 e US 6 136 576, ou C5-açúcares, ou glicerol.
Fontes de nitrogênio que podem ser usadas são compostos compreendendo nitrogênio orgânico tais como peptonas, extrato de Ievedu- ra, extrato de carne, extrato de malte, licor macerado de milho, moagem de soja e uréia, ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas singularmente ou como uma mistura.
Ácido fosfórico, diidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfa- to de dipotássio ou os correspondentes sais compreendendo sódio podem ser usados como fontes de fósforo. O meio de cultura deve também com- preender sais de metais tais como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sul- fato de ferro, que são requeridos para desenvolvimento. Finalmente, fatores de desenvolvimento essenciais tais como aminoácidos e vitaminas podem ser empregados além das substâncias acima mencionadas. Além do mais, precursores adequados podem ser adicionados ao meio de cultura. Os ma- teriais de entrada acima mencionados podem ser adicionados à cultura na forma de uma batelada única ou então alimentados de uma maneira ade- quada durante cultivo. O pH para a cultura pode ser controlado por emprego, de uma
maneira apropriada, de compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia e amônia aquosa, ou compostos acídicos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Espumação pode ser controlada por emprego de anti-espumas tais como, por exemplo, ésteres de poliglicol de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substancias adequadas que possuam um efeito seletivo, tais como, por exemplo, antibióticos. Condições aeróbicas são mantidas por introdução de, na cultura, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio tais como, por exemplo, ar ambiente. A temperatura de cultura é normalmente 20°C a 45°C e de preferência 25°C a 40°C. Pode ser preferido empregar, como células, aquelas células que são descritas em US 6 803 218, em particular quando usando células que são capazes de conversão de glicerol como o substrato. Neste caso, as células podem ser cultivadas em temperaturas na faixa de 40 a 100°C.
O isolamento de ácido 3-hidroxiisobutírico da solução de nutrien- te é de preferência realizado continuamente, sendo além disso preferido neste contexto também produzir ácido 3-hidroxiisobutírico por fermentação de uma maneira contínua, de modo que o processo inteiro da produção de ácido 3-hidroxiisobutírico até seu isolamento do licor de fermentação possa ser realizado continuamente. Para o isolamento contínuo da produção de ácido 3-hidroxiisobutírico do licor de fermentação, o primeiro é continuamen- 15 te passado por um dispositivo para remoção dos microorganismos emprega- dos durante fermentação, de preferência por meio de um filtro com um nível de exclusão na faixa de 20 a 200 kDa, onde uma separação de sólido/líquido ocorre. É também praticável empregar uma centrífuga, um dispositivo de sedimentação adequado ou uma combinação destes dispositivos, sendo es- pecialmente preferido primeiro separar pelo menos parte dos microorganis- mos por sedimentação e subseqüentemente alimentar o licor de fermenta- ção, que foi livrado de parte dos microorganismos, a ultrafiltragem ou a um dispositivo de centrifugação.
Depois que os microorganismos foram removidos, o produto de fermentação, que é enriquecido com referência a sua ácido fração 3- hidroxiisobutírica, é alimentado a um sistema de separação, de preferência um sistema de separação de múltiplas etapa. Este sistema de separação fornece uma pluralidade de etapas de separação que são conectadas em série, de cujas etapas em cada caso retornam linhagens separadas e voltam ao tanque de fermentação. Além disso, tubos de saída fora das respectivas etapas de separação. As etapas de separação individuais podem operar pe- lo princípio da eletrodiálise. da osmose reversa, da ultrafiltragem ou da nano- filtragem. Como uma regra, estes são dispositivos de separação de mem- brana nas etapas de separação individuais. A seleção das etapas de sepa- ração individuais é uma função da natureza e do nível dos subprodutos de fermentação e resíduos de substrato.
Além do ácido 3-hidroxiisobutírico sendo separado por meio de eletrodiálise, osmose reversa, ultrafiltragem ou nanofiltragem, no decorrer do que uma solução de ácido 3-hidroxiisobutírico aquosa é obtida como o pro- duto final, o ácido 3-hidroxiisobutírico pode também ser separado por extrati- vos métodos da solução de fermentação que foi livrada de microorganismos, em cujo caso, finalmente, o ácido 3-hidroxiisobutírico puro pode ser obtido. Para separar o ácido 3-hidroxiisobutírico por extração, é possível adicionar, à solução de fermentação, por exemplo, compostos de amônio ou aminas a fim de formar um sal de amônio de ácido 3-hidroxiisobutírico. Este sal de amônio pode em seguida ser separado da solução de fermentação por adi- ção de um extrator orgânico e subseqüentemente aquecimento da mistura resultante, por meio do que o sal de amônio é concentrado na fase orgânica. Em seguida, o ácido 3-hidroxiisobutírico pode ser isolado desta fase, por exemplo, por etapas de extração adicionais, produzindo o ácido 3- hidroxiisobutírico puro. Mais detalhes quanto ao método de separação po- dem ser encontrados em WO-A-02/090312, cuja descrição quanto à separa- ção de ácidos hidroxicarboxílicos de soluções de fermentação é por meio desta incorporada através de referência e forma parte da descrição do pre- sente pedido.
Dependendo do modo no qual o ácido 3-hidroxiisobutírico é se- parado da solução de fermentação, ou uma solução aquosa de ácido 3- hidroxiisobutírico compreendendo 2 a 90% em peso, de preferência 7,5 a 50% em peso e especialmente de preferência 10 a 25% em peso de ácido 3- hídroxiisobutírico, ou então ácido 3-hidroxiisobutírico puro é obtida.
Além disso, o ácido 3-hidroxiisobutírico preparado pelo método de acordo com a invenção pode também ser neutralizado, ou antes, durante ou depois da purificação, para cuja finalidade bases tais como, por exemplo, hidróxido de cálcio ou hidróxido de sódio podem ser empregadas. Uma contribuição para solução dos problemas mencionados no início é fornecida em particular também por um método de preparo de ácido metacrílico ou ésteres metacrílicos, compreendendo as etapas do método
IA) preparação de ácido 3-hidroxiisobutírico pelo método descrito acima e, se apropriado, isolamento e/ou neutralização do ácido 3- hidroxiisobutírico do ácido 3-hídroxiisobutírico,
IB) desidratação do ácido 3-hidroxiisobutírico com formação de ácido metacrílico e, se apropriado, esterificação do metacrilato ou do ácido metacrílico.
De acordo com etapa do método IB), o ácido 3-hidroxiisobutírico é desidratado com formação de ácido metacrílico, para cuja finalidade é possível ou empregar o ácido 3-hidroxiisobutírico puro isolado da solução de fermentação ou então a solução aquosa de ácido 3-hidroxiisobutírico, que foi isolado quando preparando a solução de fermentação, também sendo pos- sível concentrar a solução aquosa de ácido 3-hidroxiisobutírico, se apropria- do, antes da etapa de desidratação, por exemplo, por meio de destilação, se apropriado na presença de um transportador adequado.
A reação de desidratação pode, em princípio, ser realizada em fase líquida ou na fase de gás. Além disso, é preferido de acordo com a in- venção que a reação de desidratação seja realizada na presença de um ca- talisador, com a natureza do catalisador empregado dependendo de se uma reação de fase de gás ou uma de fase líquida é realizada.
Catalisadores de desidratação adequados são tanto catalisado- res acídicos quanto catalisadores alcalinos. Catalisadores acídicos são pre- feridos, em particular porque eles mostram menos tendência para formar oligômeros. O catalisador de desidratação pode ser empregado tanto como um catalisador homogêneo quanto como um heterogêneo. Se o catalisador de desidratação está presente na forma de um catalisador heterogêneo, é preferido que o catalisador de desidratação esteja em contato com um su- porte x. Suportes χ adequados são todos os sólidos acreditados pelo traba- lhador versado serem adequados. No presente contexto, é preferido que os sólidos possuam volumes de poro adequados que são adequados para boa ligação e absorção do catalisador de desidratação. Além disso, volumes de poro totais tais como especificados por DIN 66133 em uma faixa de 0,01 a 3 ml/g são preferidos, e volumes de poro totais na faixa de 0,1 a 1,5 ml/g são especialmente preferidos. Além do mais, é preferido que os sólidos que são adequados como suporte χ possuam uma área de superfície na faixa de0,001 a 1000 m2/g, de preferência na faixa de 0,005 a450 m2/g e além disso preferido na faixa de 0,01 a 300 m2/g tal como determinado por teste de BET tal como especificado em DIN 66131. Um suporte que pode ser empregado para o catalisador de desidratação pode primeiramente ser material de vo- lume com um diâmetro de partícula médio na faixa de 0,1 a 40 mm, de prefe- rência na faixa de 1 a 10 mm, e além disso de preferência na faixa de 1,5 a 5 mm. A parede do reator de desidratação pode além disso atuar como supor- te. Além disso, o suporte pode ser acídico ou alcalino de per si, ou então um catalisador de desidratação acídico ou alcalino pode ser aplicado a um su- porte inerte. Técnicas de pedido que podem ser mencionadas em particular são imersão ou impregnação ou então incorporação em uma matriz de su- porte.
Suportes χ adequados, que podem também caracterizar proprie- dades de catalisador de desidratação, são, em particular, silicatos naturais ou sintéticos tais como, em particular, mordenita, montmorilonita, zeólitos acídicos; suportes que são revestidos com ácidos inorgânicos monobásicos, dibásicos ou polibásicos, em particular ácido fosfórico, ou com sais acídicos de ácidos inorgânicos, tais como substâncias do tipo de óxido ou silicato, por exemplo, AI2O3, TiO2; óxidos e óxidos mistos tais como, por exemplo, γ- AI2O3 e ZnO-AI2O3 óxidos mistos dos heteropoliácidos.
De acordo com uma modalidade de acordo com a invenção, o suporte χ consiste pelo menos em parte de um composto do tipo de óxido. Tais compostos do tipo de óxido deveriam caracterizar pelo menos um dos elementos selecionados dentre Si, Ti, Zr, Al, P ou uma combinação de pelo menos dois destes. Tais suportes podem também atuar como próprio catali- sador de desidratação, devido a suas propriedades acídicas ou alcalinas. Uma classe preferida de compostos, tanto como suporte a título de χ quanto a título de catalisador de desidratação compreendem óxidos de silí- cio/alumínio/fósforo. Substâncias alcalinas preferidas que atuam tanto como catalisador de desidratação quanto também como suporte χ compreendem álcali, alcalinos terrosos, lantânio, lantóides ou uma combinação de pelo menos dois destes na forma de seus óxidos. Tais catalisadores de desidra- tação acídicos ou alcalinos estão comercialmente disponíveis tanto por De- gussa AG quanto por Sudchemie AG. Uma classe adicional são permutado- res de íon. Mais uma vez, estes podem estar presentes tanto em forma alca- Iina quanto em acídica.
Catalisadores de desidratação homogêneos adequados são, em particular, ácidos inorgânicos, de preferência ácidos contendo fósforo e além disso de preferência ácido fosfórico. Estes ácidos inorgânicos podem ser imobilizados no suporte χ por imersão ou impregnação.
O uso de catalisadores heterogêneos provou ser particularmente vantajoso em particular no caso de desidratação de fase de gás. No caso de desidratação de fase líquida, no entanto, tanto catalisadores de desidratação homogêneos quanto heterogêneos são empregados.
Além disso, é preferido que o método de acordo com a invenção envolva o uso de um catalisador de desidratação com um valor de H0 na fai- xa de +1 a -10, de preferência na faixa de +2 a -8,2 e além disso de prefe- rência, no caso de desidratação de fase líquida, na faixa de +2 a -3 e em desidratação de fase de gás na faixa de -3 a -8,2. O valor de H0 corresponde à função de ácido tal como definido por Hámmert e pode ser determinado pelo que é conhecido como titulação de amina e o uso de indicadores, ou pela absorção de uma base gasosa (veja "Studies in Surface Science and Catalytics", vol. 51, 1989: "New solid Acids and Bases, their catalytic Proper- ties", K. Tannabe e outros).
De acordo com uma modalidade especial do método de acordo com a invenção, o catalisador sólido acídico empregado é uma estrutura de suporte porosa que foi posta em contato com um ácido inorgânico, de prefe- rência com ácido fosfórico ou com super-ácidos tais como, por exemplo, oxi- do de zircônio sulfatado ou fosfatado e que é com base de preferência em pelo menos 90% em peso, além disso de preferência pelo menos 95% em peso e mais preferivelmente pelo menos 99% em peso de um oxido de silí- cio, de preferência um SiO2. A condução em contato da estrutura de suporte porosa com o ácido inorgânico é de preferência realizada por impregnação da estrutura de suporte com o ácido, com o segundo de preferência sendo posto em contato com o primeiro em uma quantidade em uma faixa de 10 a70% em peso, especialmente de preferência na faixa de 20 a 60% em peso e mais preferivelmente em uma faixa de 30 a 50% em peso, com base no peso da estrutura de suporte, seguida por secagem. Depois de secagem, a estrutura de suporte é aquecida a fim de fixar o ácido inorgânico, de prefe- rência em uma temperatura em uma faixa de 300 a 600°C, mais preferivel- mente em uma faixa de 400 a 500°C.
De acordo com uma modalidade especial do método de acordo com a invenção, a reação de desidratação é realizada na fase de gás. Aqui, é possível empregar aparatos convencionais como são conhecidos ao traba- lhador versado no campo de reação de fase de gás, por exemplo, reatores tubulares. É especialmente preferido empregar permutadores de calor de casca-e-tubo e reatores que compreendem termoplacas como permutadores de calor.
De acordo com uma modalidade da reação de desidratação de
fase de gás, ácido 3-hidroxiisobutírico puro é introduzido em um reator com- preendendo um dos catalisadores de leito fixo acima mencionados. De acor- do com outra modalidade, o ácido 3-hidroxiisobutírico é introduzido no reator na forma de uma solução aquosa compreendendo 2 a 80% em peso, espe- cialmente de preferência 5 a 50% em peso e mais preferivelmente 10 a 25% em peso de ácido 3-hidroxiisobutírico, em cada caso com base no peso total da solução aquosa. As condições de pressão e temperatura dentro do reator são escolhidas de modo que o ácido 3-hidroxiisobutírico, ou a solução aquo- sa, esteja presente em forma gasosa quando entrar no reator. A desidrata- ção na fase de gás é de preferência realizada na faixa de temperatura de entre 200 e 400°C, especialmente de preferência entre 250 e 350°C. A pres- são dentro do reator durante a reação de desidratação de fase de gás é de preferência em uma faixa de 10 kPa a 5000 kPa (0,1 a 50 bar), especialmen- te de preferência em uma faixa de 20 kPa a 10000 kPa (0,2 a 10 bar) e mais preferivelmente em uma faixa de 50 kPa a 500 kPa (0,5 a 5 bar).
A quantidade de ácido 3-hidroxiisobutírico introduzido no reator na reação de desidratação de fase de gás é de preferência em uma faixa de10 a 100% em volume, especialmente de preferência em uma faixa de 20 a100% em volume e mais preferivelmente em uma faixa de 30 a 100% em volume.
De acordo com outra modalidade especial do método de acordo com a invenção, a reação de desidratação é desempenhada na fase líquida. A reação de desidratação de fase líquida pode também ser realizada em todos os aparatos que são conhecidos ao trabalhador versado e nos quais um fluido pode ser aquecido a uma temperatura de reação desejada, duran- te cujo processo, uma pressão pode ser aplicada ao aparelho que é suficien- te para manutenção dos componentes de reação no estado líquido sob as condições de temperatura desejadas.
De acordo com uma modalidade especial do método de acordo com a invenção, o método de desidratação de fase líquida compreende uma primeira etapa do método, na qual ácido 3-hidroxiisobutírico puro ou uma solução aquosa compreendendo 5 a 100% em peso, especialmente de pre- ferência 20 a 100% em peso e mais preferivelmente 50 a 100% em peso de ácido 3-hidroxiisobutírico, com base no peso total da solução aquosa, é in- troduzido em um reator. As condições de pressão e temperatura dentro do reator são escolhidas de modo que o ácido 3-hidroxiisobutírico, ou a solução aquosa, esteja presente em forma líquida quando entrar no reator. De acor- do com uma modalidade especial do método de acordo com a invenção em que a reação de desidratação é realizada na fase líquida, o ácido 3- hidroxiisobutírico, ou a solução aquosa, é passado de um tal modo sobre um leito de catalisador fixo dentro do reator de desidratação que a fase líquida escorre sobre a superfície das partículas de catalisador. Um tal procedimen- to pode ser realizado, por exemplo, em um reator de leito de escoamento.
A desidratação na fase líquida é de preferência realizada em uma faixa de temperatura de entre 200 e 350°C, especialmente de preferên- cia entre 250 e 300°C. A pressão dentro do reator no caso de desidratação de fase líquida é de preferência em uma faixa de 100 kPa (1 a 50 bar), es- pecialmente de preferência em uma faixa de 200kPa a 2500 kPa (2 a 25 bar) 5 e mais preferivelmente em uma faixa de 300 kPa a 1000 kPa (3 a 10 bar).
A catálise da reação de desidratação pode ser homogênea ou heterogênea, ambas no caso de desidratação de fase de gás e no caso de desidratação de fase líquida.
No caso de catálise homogênea, o catalisador, que neste caso de preferência toma a forma de um ácido inorgânico tal como, por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, é primeiro posto em contato com o ácido 3-hidroxiisobutírico puro ou com a solução aquosa compreendendo o ácido 3-hidroxiisobutírico. Depois disso, a composição resultante é introduzida no reator e convertida em ácido metacrílico sob as condições de pressão e temperatura desejadas. É também praticável introduzir o ácido inorgânico independentemente do ácido 3-hidroxiisobutírico ou da solução aquosa no reator. Neste caso, o reator caracteriza pelo menos duas linhagens de ali- mentação, uma para o ácido 3-hidroxiisobutírico, ou a solução aquosa com- preendendo ácido 3-hidroxiisobutírico, e um para o catalisador. Se a reação de desidratação é realizada em fase líquida em um reator de leito de escoa- mento, é preferido introduzir o catalisador juntos com o ácido 3- hidroxiisobutírico, ou a solução aquosa compreendendo o ácido 3- hidroxiisobutírico, no topo do reator.
No caso de catálise heterogênea, o catalisador está na forma de um substrato sólido localizado no espaço de reação, por exemplo, na forma de um leito fixo, na forma de placas revestidas por catalisador, de preferên- cia termoplacas, que são dispostas dentro do reator, ou então na forma de paredes de reator revestido por catalisador. Reatores que são possíveis são descritos por exemplo em DE-A-198 48 208, DE-A-100 19 381 e EP-A-I 234 612. No caso de catálise heterogênea, catalisadores preferidos são estrutu- ras de suporte que foram postas em contato com ácidos inorgânicos, de pre- ferência estruturas de suporte porosas impregnadas. O ácido 3- hidroxiisobutírico, ou a solução aquosa compreendendo o ácido 3- hidroxiisobutírico, é em seguida posto em contato com a superfície do mate- rial de catalisador sólido na forma de um vapor, ou em forma líquida.
De acordo com uma modalidade especialmente preferida do mé- todo de acordo com a invenção, a desidratação do ácido 3-hidroxiisobutírico é realizada em fase líquida em uma pressão na faixa de 20 a 50 MPa (200 a 500 mbar), em uma temperatura em uma faixa de 200 a 230°C e na presen- ça de íons de metal de álcali como o catalisador.
A mistura de reação que é obtida depois da reação de desidra- tação é ou uma solução de ácido metacrílico aquosa que não contém quais- quer componentes catalisadores (tais uma solução é obtida no caso de desi- dratação heterogeneamente catalisada) ou então uma solução de ácido me- tacrílico aquosa que compreende catalisadores (tal solução é obtida no caso de desidratação homogeneamente catalisada). Além disso, a solução de ácido metacrílico aquosa pode estar em forma líquida (se a reação de desi- dratação foi efetuada na fase líquida) ou em forma gasosa (se a reação de desidratação foi realizada na fase de gás).
Se apropriado, a solução de ácido metacrílico resultante pode, de acordo com uma modalidade especial do método de acordo com a inven- ção, ser esterificada sem processamento adicional. Em tal caso, a solução de ácido metacrílico é posta em contato com álcoois adequados tais como, por exemplo, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol ou 1-butanol e catali- sadores de esterificação adequados conhecidos ao trabalhador versado tais como, por exemplo, ácidos concentrados, com aquecimento, e o ácido me- tacrílico é desse modo convertido nos ésteres correspondentes. No entanto, pode ser vantajoso adicionalmente purificar o ácido metacrílico antes de es- terificação, sendo possível empregar, em princípio, qualquer método de puri- ficação que seja conhecido ao trabalhador versado e que seja convencio- nalmente empregado para a purificação de ácido (met)acrílico contaminado obtido por oxidação de fase de gás catalítica de propileno.
Se a reação de desidratação foi realizada na fase de gás, é pre- ferido que o ácido metacrílico seja primeiro condensado, gerando uma solu- ção de ácido metacrílico aquosa. Aqui, qualquer método de condensação conhecido ao trabalhador versado pode ser empregado em princípio, por exemplo uma condensação fracional tal como descrito em WO-A-2004/035514, WO-A-03/014172 ou EP-A-EP 1 163 201 ou por condensação total tal como descrito em EP-A-O 695 736. É também praticável adicionar solventes adicionais, em particular água, durante o processo de condensa- ção a fim de absorver o ácido metacrílico tão completamente quanto possí- vel.
A solução de ácido metacrílico aquosa obtida depois de conden- sação, ou então a solução de ácido metacrílico aquosa obtida no evento de desidratação de fase líquida, pode em seguida ser livrada de água e outros contaminantes em etapas de purificação adicionais. Aqui, é possível primeiro remover a água por destilação azeótropa na presença de um transportador tal como descrito, por exemplo, em DE-A-198 53 064. É também praticável empregar solventes orgânicos de ebulição elevada para absorção do ácido metacrílico, tal como é descrito por exemplo em EP-A-O 974 574. Além des- tes métodos de destilação, membranas para desidratação podem também ser empregadas, tal como proposto por exemplo em DE-A-44 01 405. Em- prego de métodos de cristalização para purificação da solução de ácido me- tacrílico aquosa, que foi gerado no caso de desidratação de fase líquida ou que foi obtido por condensação, é além disso praticável.
O ácido metacrílico obtido depois de desidratação pode ser puri- ficado também além disso em etapas adicionais do método. Desta forma, contaminantes de ebulição elevada que estão ainda presentes podem ser removidos por etapas de destilação adicionais. No entanto, é especialmente preferido também purificar o ácido metacrílico obtido por desidratação usan- do métodos de cristalização tal como descrito por exemplo em DE-A-101 49353.
O ácido metacrílico purificado resultante pode então ser esterifi- cado, se apropriado.
Uma contribuição a solução dos problemas mencionados no iní- cio é além disso fornecida por um método de preparo de ácido metacrílico ou ésteres metacrílicos, compreendendo as etapas do método
I IA) preparação de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico pelo método descrito acima,
IB) clivagem dos polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico com formação de ácido 3-hidroxiisobutírico e, se apropria- do, neutralização do ácido 3-hidroxiisobutírico e/ou isolamento do ácido 3- hidroxiisobutírico,
IIC) desidratação do ácido 3-hidroxiisobutírico com formação de ácido metacrílico e, se apropriado, esterificação do metacrilato ou ácido me-
tacrílico.
Uma contribuição ta solução dos problemas mencionados no início é também fornecida por um método de preparo de ácido polimetacríli- co ou ésteres polimetacrílico, compreendendo as etapas do método
MIA) preparação de ácido metacrílico pelo método descrito aci-
ma,
IIIB) polimerização de radical livre do ácido metacrílico, sendo possível, se apropriado, esterificar pelo menos em parte os grupos de carboxila do ácido metacrílico antes ou depois da reação de polimerização de radical livre.
Uma contribuição a solução do problema mencionado no início é
além disso fornecida por um DNA isolado, que é selecionado das seguintes seqüências:
a) uma seqüência tal como mostrado em SEQ ID Nq 03,
b) uma seqüência livre de íntron que é derivada de uma sequên-
cia tal como especificado em a) e que codifica a mesma proteína ou peptí-
deo como a seqüência tal como mostrado em SEQ ID Ne 03,
c) uma seqüência que codifica uma proteína ou peptídeo que compreende a seqüência de aminoácido tal como mostrado em SEQ ID Ne04,
d) uma seqüência com pelo menos 80%, especialmente de pre-
ferência pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% e mais pre- ferivelmente 99% de identidade com uma seqüência tal como especificado em um dos grupos a) até c), especialmente de preferência tal como especifi- cado em grupo a), esta seqüência de preferência codificando uma proteína ou peptídeo que é capaz de conversão de tanto S- ou R-metilmalonil- coenzima A quanto malonil-coenzima A nos correspondentes semialdeídos (semialdeído de (S)- ou (R)-metilmalonato e semialdeído de malonato, res- pectivamente),
e) uma seqüência que hibridiza, ou, levando em consideração a degeneração do código genético, hibridizaria, com a cepa contrária de uma seqüência tal como especificado em quaisquer dos grupos a) até d), especi- almente de preferência tal como especificado em grupo a), esta seqüência de preferência codificando uma proteína ou peptídeo que é capaz de con- versão de tanto S- ou R-metilmalonil-coenzima A quanto malonil-coenzima A nos correspondentes semialdeídos (semialdeído de (S)- ou (R)- metilmalona- to e semialdeído de malonato, respectivamente), f) um derivado de uma seqüência tal como especificado em
quaisquer dos grupos a) até e), especialmente de preferência tal como es- pecificado em grupo a), este derivado de preferência codificando uma prote- ína ou peptídeo que é capaz de conversão de both S- ou R-metilmalonil- coenzima A e malonil-coenzima A nos correspondentes semialdeídos ((S)- ou (R)-semialdeído de metilmalonato e semialdeído de malonato, respecti- vamente), obtidos por substituição, adição, inversão e/ou deleção de pelo menos uma base, de preferência de pelo menos 2 bases, mais preferivel- mente de pelo menos 5 bases e mais preferivelmente pelo menos 10 bases, mas de preferência de não mais do que 100 bases, especialmente de prefe- rência de não mais do que 50 bases e mais preferivelmente de não mais do que 25 bases, e
g) uma seqüência que é complementar a uma seqüência tal co- mo especificado em quaisquer dos grupos a) até f), especialmente de prefe- rência tal como especificado em grupo a). Surpreendentemente, foi constatado que um DNA que foi isolado
de bactérias da cepa Sulfolobus tokodaii (no Deutsche Sammlung von Mi- kroorganismen German collection of microorganisms, deposit number DSM 16993) e que possui uma seqüência de DNA tal como mostrado em SEQ ID Ns 03 codifica um polipeptídeo (SEQ ID Nq 04) que é capaz até em tempera- turas de até 75°C de conversão de tanto S- ou R-metilmalonil-coenzima A quanto malonil-coenzima A nos correspondentes semialdeídos (semialdeído de (S)- ou (R)-metilmalonato e semialdeído de malonato, respectivamente). Uma vez que semialdeído de (S)- ou (R)-metilmalonato e semialdeído de malonato são metabólitos naturais que são formados por exemplo durante a degradação de valina, de Ieucina ou de isoleucina, durante o metabolismo de propanoato ou durante o metabolismo de piruvato, e porque os semialde- idos formados são capazes de serem reduzidos também no decorrer das trilhas metabólicas acima mencionadas para produzir os 3-hidroxialcanoatos correspondentes, o DNA isolado de acordo com a invenção pode ser utiliza- do para geração de bactérias recombinantes que são capazes de formação diretamente de grandes quantidades de ácido 3-hidroxiisobutírico (ou ácido 3-hidroxipropiônico). Se as células são além disso capazes de polimerização dos 3-hidroxialcanoatos formados com formação de polihidroxialcanoatos, este DNA além disso seria adequado para geração de bactérias recombinan- tes capazes de produção de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico (ou em ácido 3-hidroxipropiônico).
A "identidade de nucleotídeo" em relação a SEQ ID N5 03, que é definida em alternativa d), é determinada com a ajuda de métodos conheci- dos aqui. Em geral, programas de computador especialistas com algoritmos levando em consideração requerimentos específicos são usados.
Métodos preferidos de determinação da identidade primeiramen- te geram a concordância máxima entre as seqüências a serem comparadas. Programas de computador para determinação da identidade compreendem o pacote de programa GCG1 incluindo mas não limitado a isto
- GAP (Deveroy, J. e outros, Nucleic Acid Research 12 (1984), página 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi)), e
- BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul. S. e outros, Journal of Molecular Biology 215 (1990), páginas 403-410). O programa BLAST pode ser obtido do Centro Para Informação de Biotecnologia (NCBI) e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul S. e outros, NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. e outros, acima).
O algoritmo Smith-Waterman, que é conhecido, pode também ser usado para determinação da identidade de nucleotídeo.
Parâmetros preferidos para o alinhamento de nucleotídeo com- preendem o seguinte:
- Algoritmo Needleman e Wunsch, Journal de Molecular Biology 48 (1970), páginas 443-453 - matriz de alinhamento
Iguais = +10
Faltas de correspondência = 0
Penalidade de Gap = 50
Penalidade de comprimento de Gap = 3
O programa GAP é também adequado para uso com os parâme-
tros acima. Os parâmetros acima são os parâmetros básicos no alinhamento de seqüência de nucleotídeo.
Uma identidade de 80% de acordo com o algoritmo acima quer dizer 80% de identidade no contexto da presente invenção. O mesmo aplica- se a maiores identidades.
A característica "seqüência que hibridiza, ou, levando em consi- deração a degeneração do código genético, hibridizaria, com a cepa contrá- ria de uma seqüência tal como especificado em um dos grupos a) até d), especialmente de preferência tal como especificado em grupo a)," de acordo com alternativa e) indica uma seqüência que hibridiza, ou hibridizaria levan- do em consideração a degeneração do código genético, com o filamento contrário de uma seqüência tal como especificado em um dos grupos a) até d), especialmente de preferência tal como especificado em grupo a), sob de preferência condições rigorosas. Por exemplo, as reações de hibridizaçâo podem ser realizadas em 68°C em 2 χ SSC, ou tal como descrito no protoco- lo do kit de rotulação de didioxigenina de Boehringer (Mannheim). Exemplos de condições de hibridizaçâo preferidas são incubação durante a noite em .65°C em SDS a 7%, BSA a 1%, EDTA a 1 mM, tampão de fosfato de sódio a250 mM (pH 7,2), seguido por lavagem em 65°C com 2 χ SSC; SDS a 0,1%.
Os derivados, do DNA isolado de acordo com a invenção, que podem ser obtidos de acordo com alternativa f) por substituição, adição, in- versão e/ou deleção de uma ou mais bases de uma seqüência tal como es- pecificado em quaisquer dos grupos a) até e) incluem em particular aquelas seqüências que, na proteína que elas codificam, levam a substituições de aminoácido conservadoras tais como, por exemplo, a substituição de glicina para alanina ou de aspartato para ácido glutâmico. Tais mutações neutras por função são referidas como mutações de sentido e não levam a qualquer modificação de princípio da atividade do polipeptídeo. É além disso conheci- do que modificações no terminal N e/ou C de um polipeptídeo não possuem um efeito adverso considerável em sua função; realmente, elas são até ca- pazes de estabilizá-la, de modo que, como uma conseqüência, a presente invenção também compreende seqüências de DNA onde bases são adicio- nadas no terminal 3' ou no terminal 5' da seqüência com a SEQ ID Ns 03. O trabalhador versado encontrará informação a esse respeito em Ben Bassat e outros (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), no'Regan e outros (Ge- ne 77:237-251 (1989)), em Sahin-Toth e outros (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), em Hochuli e outros (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) entre outros, e em livros didáticos conhecidos de Genéticas e Biologia Molecular.
Para isolar o DNA de acordo com a invenção, uma malonil- coenzima A redutase dependente de NADPH foi primeiro isolada de um ex- trato celular de Metallosphaera sedula e purificada. Os primeiros 20 aminoá- cidos do terminal N do polipeptídeo da enzima purificada resultante foram sequenciados. O gene para a malonil-coenzima A redutase foi subseqüen- temente determinado no genoma de Sulfolobus tokodaii, que já foi comple- tamente sequenciado (Kawarabayasi e outros, "Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7.", DNA Research 8:123-40), por identificação da seqüência de proteína deriva- da que é idêntica com os primeiros 20 aminoácidos do polipeptídeo isolado de Metallosphaera sedula. A seqüência de DNA de acordo com a invenção foi em seguida amplificada por meio de PCR, usando iniciadores adequados (veja exemplo 2).
Uma contribuição a solução dos problemas mencionados no iní- cio é além disso contribuída por um vetor, de preferência um vetor de ex- pressão, compreendendo um DNA com uma seqüência tal como especifica- do em um dos grupos a) até f) tal como definido acima. Vetores adequados são todos os vetores que são conhecidos ao trabalhador versado e que são tradicionalmente empregados para introdução de DNA em uma célula hos- pedeiro. Vetores preferidos são selecionados do grupo consistindo em plas- mídeos, tais como, por exemplo, os plasmídeos de E. coli pTrc99A, pBR345 e pBR322, vírus tais como, por exemplo, bacteriófagos, adenoviroses, vírus da vacínia, baculoviroses, vírus de sarampo e retroviroses, cosmídeos ou YACs, com plasmídeos sendo mais preferidos como vetores.
De acordo com uma modalidade preferida do vetor de acordo com a invenção, o DNA com uma seqüência tal como especificado em quaisquer dos grupos a) até f) está sob o controle de um promotor capaz de ser regulado, cujo promotor é adequado para expressão do polipeptídeo co- dificado por estas seqüências de DNA na célula de um microorganismo, de preferência em uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula fúngica, especialmente de preferência em uma célula bacteriana, mais prefe- rivelmente em uma célula de E. Coli. Exemplos de tais promotores são o promotor trp ou o promotor tac.
Além de um promotor, o vetor de acordo com a invenção deveria de preferência compreender um sítio de ligação ribossômico e terminador. Aqui, é especialmente preferido que o DNA de acordo com a invenção seja incorporado em um cassete de expressão do vetor compreendendo o pro- motor, o sítio de ligação ribossômico e terminador. Além dos elementos es- truturais acima mencionados, o vetor pode além disso compreender genes de seleção conhecidos ao trabalhador versado. Uma contribuição a solução dos problemas mencionados no iní-
cio é além disso fornecida pelo uso do vetor acima descrito para transforma- ção de uma célula e pela célula obtida por transformação deste vetor. As células que podem ser transformadas com o vetor de acordo com a invenção podem ser procariotas ou eucariotas. Elas podem tomar a forma de células mamíferas (tais como, por exemplo, células de humanas), de células de planta ou de microorganismos tais como leveduras, fungos ou bactérias, com microorganismos sendo especialmente preferido e bactérias e levedu- ras sendo mais preferidas.
Uma contribuição a solução dos problemas mencionados no iní- cio é também fornecida por um polipeptídeo que caracteriza a seqüência de aminoácido com a SEQ ID Ng 04 ou uma seqüência de aminoácido que é obtida quando não mais do que 40 aminoácidos, de preferência não mais do que 20 aminoácidos, até mais preferivelmente não mais do que 10 aminoá- cidos e mais preferivelmente não mais do que 5 aminoácidos em SEQ ID Ne .04 são deletados, inseridos, substituídos ou então adicionados ao terminal C e/ou N da seqüência de aminoácido com a SEQ ID Ne 04. O polipeptídeo toma a forma de uma enzima que é capaz de catalisação tanto da conversão de (S)- ou (R)-metilmalonil-coenzima A em (S)- ou (R)-semialdeído de me- tilmalonato quanto da conversão de malonil-coenzima A em semialdeído de malonato. Tal polipeptídeo pode ser obtido por exemplo por meio da rotina sintética, partindo da seqüência de DNA com a SEQ ID N6 03, ou por trans- formação de uma célula adequada com um vetor adequado compreendendo este seqüência de ácido nucléico, expressão, na célula, da proteína codifi- cada por esta seqüência de ácido nucléico, Iise da célula, geração de um extrato celular, e subsequente purificação da enzima por meio de técnicas de purificação conhecidas ao trabalhador versado, por exemplo por meio de HPLC ou outros métodos cromatográficos. Além de purificação cromatográ- fica do polipeptídeo de extratos celulares, alguém pode também explorar a vantagem de que o polipeptídeo com a seqüência de aminoácido SEQ ID Np .04 é resistente a calor até uma temperatura de pelo menos 75°C. O extrato celular pode por esse motivo ser aquecido a uma temperatura de, por exem- pie, 75°C, que resulta na coagulação, e desta forma precipitação, no extrato celular daqueles polipeptídeos que não são resistentes ao calor. O polipeptí- deo com a seqüência de aminoácido SEQ ID Ne 04 é retido no extrato celu- lar em forma não desnaturada.
A presente invenção agora será ilustrada em maior detalhe com referência a figuras e exemplos não limitantes.
A figura 1 mostra a conversão de sucinil-coenzima A em metil- malonil-coenzima A com catálise pela enzima E1.
A figura 2 mostra a conversão de metilmalonil-coenzima A em ácido 3-hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E2 até E4 de acordo com a primeira alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil- coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxi- alcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico.
A figura 3 mostra a conversão de (R)-metilmalonil-coenzima A em ácido 3-hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E4, E6 e E7 de a- cordo com a segunda alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilma- lonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de poli- hidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico.
A figura 4 mostra a conversão de metilmalonil-coenzima A em ácido 3-hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E4, E5 e E7 de acordo com a terceira alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil- coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxi- alcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico.
A figura 5 mostra a conversão de ácido 3-hidroxiisobutírico em um polihidroxialcanoato com catálise pelas enzimas E8 e E9.
A figura 6 mostra a conversão de fosfoenolpiruvato ou piruvato em oxalacetato com catálise pelas enzimas E10 ou En de acordo com uma modalidade especial da primeira, segunda ou terceira alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como inter- mediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico. A figura 7 mostra a conversão de oxalacetato em sucinil- coenzima A com catálise pelas enzimas E12 até E15 de acordo com uma pri- meira modalidade especial da primeira, segunda ou terceira alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxíisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido .3-hidroxiisobutírico.
A figura 8 mostra a conversão de oxalacetato em sucinil- coenzima A com catálise pelas enzimas Ei3 até E16 e E24 to E26 de acordo com uma segunda modalidade especial da primeira, segunda ou terceira alternativa da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico. A figura 9 mostra a conversão de oxalacetato em sucinil- coenzima A com catálise pelas enzimas E16, E24, E27 e E28 de acordo com uma terceira modalidade especial da primeira, segunda ou terceira alternati- va da célula de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na pro- dução de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico.
A figura 10 mostra a conversão de L-glutamato em sucinil- coenzima A com catálise pelas enzimas E46 e E28 de acordo com uma moda- lidade especial adicional da primeira, segunda ou terceira alternativa da célu- Ia de acordo com a invenção, onde sucinil-coenzima A é formada como in- termediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico.
A figura 11 mostra a conversão de acetil-coenzima A em ácido .3-hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E4, E5 e E47 até E52 de acor- do com uma primeira alternativa da segunda modalidade especial da célula de acordo com a invenção, onde propionil-coenzima A é formada como in- termediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico.
A figura 12 mostra a conversão de propionil-coenzima A em áci- do 3-hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E2 até E4, E6, E7 e E47 até E52 de acordo com uma segunda alternativa da segunda modalidade especi- al da célula de acordo com a invenção, onde propionil-coenzima A é formada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na pro- dução de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico.
A figura 13 mostra a conversão de propionil-coenzima A em áci- do 3-hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E2 até E4, E7 e E47 até E52 de acordo com uma terceira alternativa da segunda modalidade especial da célula de acordo com a invenção, onde propionil-coenzima A é formada co- mo intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produ- ção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico.
A figura 14 mostra a conversão de propionil-coenzima A em áci- do 3-hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E2 até E4, E7 e E47 até E52 de acordo com uma quarta, quinta alternativa da segunda modalidade espe- cial da célula de acordo com a invenção, onde propionil-coenzima A é for- mada como intermediário e semialdeído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico. A figura 15 mostra a conversão de β-alanina em ácido 3-
hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas Ei0 até Ei2, E56, E72 e E73 de acordo com uma terceira modalidade especial da célula de acordo com a invenção, onde acrilil-coenzima A é formada como intermediário e semialde- ído de metilmalonato como precursor na produção de ácido 3- hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico.
A figura 16 mostra a conversão de piruvato em ácido 3- hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E76 até E79, Εβο, Εβι e Ee de acordo com uma primeira alternativa da primeira modalidade especial da segunda variante da célula de acordo com a invenção, onde isobutiril- coenzima A é formada como intermediário e 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxi- alcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico.
A figura 17 mostra a conversão de L-valina em ácido 3- hidroxiisobutírico com catálise pelas enzimas E8, E6o, E6-I, E79 e E8O de acor- do com uma segunda alternativa da primeira modalidade especial da segun- da variante da célula de acordo com a invenção, onde isobutiril-coenzima A é formada como intermediário e 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como precur- sor na produção de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de polihidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico. Exemplos Exemplo 1
A presente invenção é agora ilustrada em Exemplo 1 com refe- rência a uma célula recombinante que é capaz de produção de ácido 3- hidroxiisobutírico por meio de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como precursor e isobutiril-coenzima A como intermediário, partindo de L-valina como fonte de carbono. Para esta finalidade, as enzimas EC 2.6.1.42 e EC 1.2.4.4 (em cada caso de Pseudomonas aeruginosa) e um grupo compreendendo as três enzimas EC 1.3.99.12, EC 4.2.1.17 e EC 3.1.2.4 (de Acinetobacter cal- coaceticus) foram superexpressos em E. coli BL21 (DE3).
Aqui, a enzima EC 1.2.4.4 é codificada por um gene com a se- quência de DNA tal como mostrado em SEO ID Ne 07 e 08 (subunidade α e β), enquanto a enzima EC 2.6.1.42 é codificada por um gene com a seqüên- cia de DNA tal como mostrado em SEQ ID Ne 09. A enzima EC 1.3.99.12 é codificada por um gene com a seqüência de DNA com a SEQ ID Nb 10, a enzima EC 4.2.1.17 por um gene com a seqüência de DNA tal como mostra- do em SEQ ID N5 11, e a enzima EC 3.1.2.4 por um gene com a seqüência de DNA tal como mostrado em SEQ ID Nq 12 .1. Organismos, plasmídeos e oligonucleotídeos As seguintes cepas bacterianas, vetores, DNA genômico e oli- gonucleotídeos foram usados para preparo desta célula recombinante:
Tabela 1: <table>table see original document page 81</column></row><table> Tabela 2:<table>table see original document page 81</column></row><table> Tabela 3: <table>table see original document page 81</column></row><table> Tabela 4: Oliaonucleotídeos usados <table>table see original document page 81</column></row><table> <table>table see original document page 82</column></row><table>
.2. Amolificacão dos fraqmentos de PCR 1.2.4.4 (2313 kb) e 2.6.1.42 (958
m
Primeiramente, os fragmentos de 1.2.4.4 e 2.6.1.42 foram ampli- ficados por meio de PCR partindo do DNA total de Pseudomonas aerugino- sa, usando os iniciadores tal como mostrado em SEQ ID Ne 15 até SEQ ID Nq 18, que são detalhados na Tabela 4.
.3. Digestão do vetor pCDF-Duet-1 e do fragmento de PCR 2.6.1.42 (958 bp)
O vetor pCDFDuet-1 (caracterizando uma resistência de estrep- tomicina/espectinomicina) é clivado por meio de EcoRI / SalI, tal como é o fragmento de PCR 2.6.1.42, e as restrições desta forma obtidas são ligadas durante a noite com T4 ligase. Isto dá origem ao vetor pCDFDuet::2.6.1.42.
.4. Clonagem dos fragmentos de PCR no vetor pCR2.1-T0P0
A preparação de um vetor de clonagem compreendendo o frag- mento 2.6.1.42 ou o fragmento 1.2.4.4, usando o vetor pCR2.1-TOPO, foi desempenhada tal como especificado nas instruções de fabricante. Células de E. coli DH5a foram transformadas com os vetores de clonagem pCR2.1- TOPO::1.2.4.4 e pCR2.1-TOPO::2.6.1.42 resultantes. Uma vez que os veto- res pCR2.1-T0P0 caracterizam uma resistência a canamicina e uma resis- tência a ampicilina, os transformantes foram semeados em 2 placas de AXI e KXI (20 e 40 μΙ). Os plasmídeos dos clones resultantes foram isolados e digeridos:
pCR2.1-T0P0::1.2.4.4 Bgrlll + Kpnl
tamanho de fragmento 2313 bp pCR2.1-TOPO::2.6.1.42 EcoR I + Sa/I
tamanho de fragmento 958 bp Cada um dos fragmentos foi eluído do gel e purificado com o kit QIAquick de Qiagen (seguindo instruções).
.5. Preparação do vetor pCDFDuet:2.6.1.42-1.2.4.4
O vetor pCDFDuet::2.6.1.42 e o vetor pCR2.1-T0P0::1.2.4.4 são digeridos com Bg\\\/Kpn\.
Isto é seguido pela ligação de pCDFDuet::2.6.1.42 (BgWVKpnl) com pCR2.1- TOPO::1.2.4.4, dando origem ao vetor pCDFDuet::2.6.1.42-1.2.4.4. Mais uma vez, células de E. coli
DH5a foram transformadas por mecanismos deste vetor de clonagem. Os plasmídeos foram isolados. O plasmídeo pCDFDuet::2.6.1.42-1.2.4.4 carac- teriza a seqüência de DNA tal como mostrado em SEQ ID Nq 19. .6. Clonagem do grupo de valina de Acinetobacter calcoaceticus (V-GrupoAna) Cepa ATCC 33304 Acinetobacter calcoaceticus foi cultivada pa-
ra o isolamento de DNA total (HH ágar ou meio). DNA total foi isolado por meio do kit DNEasy de Qiagen (L1 e L2) e por um método compreendendo as etapas do método i) centrifugação de 1 ml de cultura, ii) adição de 200 μΙ de H2O à pelota, iii) aquecimento durante 10 min em 95°C, iv) centrifugação (10 min, 13 000 rpm), e v) remoção do sobrenadante para uma PCR.
Para amplificar o grupo de valina de A. calcoaceticus, uma PCR foi realizada usando os iniciadores tal como mostrado em SEQ ID Ne 13 e SEQ ID Ne 14, que foram detalhados na Tabela 4 (seguindo as instruções de fabricante usando as polimerases Pfue Taq, respectivamente). Os produtos de PCR foram purificados e, seguindo as instru-
ções, ligados ao plasmídeo pETIOl/D-TOPO e transferidos em E. coli DH5a. Isto dá origem ao plasmídeo pET101/D-TOPO::V-GrupoAca· Plasmídeo pET101/D-TOPO::V-GrupoAca caracteriza a seqüência de DNA tal como mostrado em SEQ ID Ns 20. . 7. Preparação de uma célula recombinante que é capaz de formação de áci- do 3-hidroxiisobutírico a partir de L-valina
E coli BL21 (DE3) foi transformada com os plasmídeos pET101/D-TOPO::V-GrupoAca e pCDF-Duet::2.6.1.42-1.2.4.4 (semeados em meio de LB spec./amp). As células resultantes foram capazes de conversão, em um meio de nutriente compreendendo L-valina, da L-valina em ácido 3- hidroxiisobutírico. Em contraste, o tipo selvagem do células (E. coli BL21 (DE3)) não foi capaz de lormação de quantidades detectáveis de ácido 3- hidroxiisobutírico em um tal meio de nutriente. Exemplo 2
Neste exemplo, o DNA de acordo com a invenção é isolado e o gene é superexpresso em E. Coli.
1. Cultivo e colheita de Sulfolobus tokodaii
Sulfolobus tokodaii foi desenvolvido em um volume de cultura pequeno (40 a 200 ml) em 75°C e um pH de 3,0, com agitação (150 rpm). O desenvolvimento foi monitorado fotometricamente por meio de medição da densidade óptica em 578 nm (OD578 nm)· Um meio de Sulfolobus modificado foi usado (modificado tal como descrito por Brock e outros, Archives of Mi- crobiology 84, páginas 54-68, 1972; Suzuki e outros, Extremophiles, 6, pági- nas 39-44, 2002). A fonte de energia e carboidrato usada foi extrato de leve- dura, ácidos de casamino e glicose. O meio consistiu dos seguintes compo- nentes: meio basal, solução de matéria-prima de glicose, solução de maté- ria-prima de ferro e solução de matéria-prima de elemento de traço. Em um OD578nm de 0,3 a 0,5 (fase exponencial), as células foram colhidas. A centri- fugação foi realizada em uma centrífuga Sorvall (rotor SS34) durante 15 min em 9000 rpm. A pelota de células foi empregada diretamente para a extra- ção de DNA.
Meio basal. KH2PO4 (0,28 g/l), (NH4)2SO4 (1,3 g/l), MgSO4 x 7 H2O (0,25 g/l), CaCI2 χ 6 H2O (0,07 g/l), extrato de levedura (1 g/l) e ácidos de casamino (1 g/l). Antes de autoclavagem, o pH foi levado a 3,0 usando H2SO4.
Solução de matéria-prima de glicose (100x). Glicose (100 g/l).
A solução foi esterilizada por filtro.
Solução de matéria-prima de ferro (1000x). FeCI3 x 6 H2O (20 g/l). A solução foi esterilizada por filtro.
Solução de matéria-prima de elemento de traço (1000x ). MnCI2 χ 4 H2O (1,8 g/l), Na2B4O7 x 10 H2O (4,5 g/l), ZnSO4 χ 7 H2O (220 mg/l), Cu- Cl2 χ 2 H2O (50 mg/l), Na2MoO4 χ 2 H2O (30 mg/l), VOSO4 χ 5 H2O (30 mg/l), CoCI2 χ 6 H2O (8,4 mg/l). Os componentes individuais foram dissolvidos em sucessão em H2O destilada, o pH foi levado a 3.0 usando HCI, e a solução foi esterilizada por filtro.
2. Isolamento de DNA genômico de S. tokodaii
DNA genômico foi isolado pelo método de Murray e Thompson {Nucleic Acid Research, 8, páginas 4321-4325, 1980). Para esta finalidade, 10 a 50 mg (peso recente) de células frescamente colhidas são pesados em um vaso de reação de Eppendorf de 1,5 ml e resuspensos em 570 ml de tampão de TE (Tris/HCI a 10 mM (pH 8,0), NaEDTA a mM). 30 μΙ de uma solução de SDS a 10% (p/v)(solução de dodecil-sulfato de sódio) e 3 μΙ de proteinase K (20 μ9/μΙ) foram adicionados e a mistura foi incubada durante 1 h em 52°C. Depois disso, 100 μΙ de solução de NaCI a 5 M e 80 μΙ de solu- ção de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) a 10% (p/v) pré-aquecido (CTAB a 10% (p/v) em NaCI a 0,7 M) foram adicionados. Depois de incuba- ção durante 10 min em 65°C, os complexos de CTAB, fragmentos de parede celular e proteínas foram extraídos com 780 μΙ de clorofórmio/álcool de iso- amila (24:1 (v/v)) e centrifugado durante 15 min em 14 000 rpm. A fase de po aquosa foi transferida em um vaso de reação de Eppendorf fresco e a extração foi repetida. Depois que a fase aquosa estava livre de pigmentos, ela foi coberta com uma camada de 400 μΙ de isopropanol a 100%. Por mis- tura cuidadosamente das duas fases, o DNA cromossômico precipitado na interface. Então, foi possível pescar o DNA com uma pipeta de Pasteur ex- traída e lavada em 200 μΙ de etanol a 70%. Depois de re-centrifugação (5 min, 14 000 rpm), o sobrenadante foi pipetado e o DNA foi secado durante 2 h em temperatura ambiente e finalmente dissolvido em 100 μΙ de tampão de TE.
3. Amplificação do gene de malonil-coenzima A redutase
A reação de cadeia de polímero (PCR) (Mullis e outros, Cold S- pring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, páginas 263-273, 1986) foi empregado para amplificar o gene de malonil-CoA redutase de um modo alvejado, do DNA de Sulfolobus tokodaii genômico obtido no Exemplo 2. Foi realizado em um termociclizador (Biometra, Gõttingen).
Uma PCR preparativa em que Pfu polimerase (Pfunds. Genax- xon) foi usada, foi empregada. A Pfu polimerase contém uma função de 3'-5' exonuclease ("correção").
Os seguintes iniciadores foram usados:
.5'-ATTATCCCATGGGGAGAACATTAAAAGC-3' ("iniciador dian- teiro"; sítio de clivagem de Nco\ está grifado;
SEQ ID N- 21) e
.5'-CGGGATCCTTACTTTTCAATATATCC-3' ("iniciador reverso"; sítio de clivagem de BamYW está grifado;
SEQ ID NQ 22)
A mistura de reação detalhada na Tabela 1 a seguir foi empre- gada para as reações de PCR. A PCR foi realizada como uma PCR de co- meço quente, isto é, a mistura de reação foi incubada durante 2 min em .95°C antes de adição da Pfu polimerase. Isto foi seguido por 30 ciclos de em cada caso 1 minuto em 95°C, 1 minuto em 45°C e 5 minutos em 72°C, se- guido por uma última etapa de 30 segundos em 45°C, 15 minutos em 72°C e, finalmente, uma pausa em 6°C. Tabela 1 Misturas de reação padrões (50 μΙ) para correção de PCR com Pfu polimerase <table>table see original document page 86</column></row><table>
Um fragmento de gene com um comprimento de 1,1 kb foi obti- do.
.4. Clonagem do gene de malonil-coenzima A redutase
Para clonar o gene de malonil-coenzima A redutase de Sulfolo- bus tokodaii, o gene amplificado no Exemplo 3 foi clonaòo inespecificamente com o vetor pCR T7/CT-Topo (Invitrogen, Karlsruhe), usando o "Kit de Ex- pressão de pCR T7 Topo TA" (Invitrogen, Karlsruhe). Islo foi feito seguindo as instruções do fabricante.
Para isolar o DNA de plasmídeo, o DNA de plasmídeo foi prepa- rado usando o "Kit de Mini prep de Plasmídeo de QIAprep Spin" de Qiagen (HiIden) seguindo as instruções do fabricante, partindo de culturas noturnas de 5 ml de células de E. coliTOPIOF' transformadas.
5. Geração de um vetor de expressão Para gerar um vetor de expressão compreendendo o gene de malonil-coenzima A redutase, o vetor de clonagem isolado obtido no Exem- plo 4 é submetido à digestão de restrição com as enzimas de restrição Nco\ e BamH\. Para esta finalidade, 25 a 27 μΙ de DNA de plasmídeo (vetor de expressão pTrc99A e pCR T7/CT-Topo vetor, respectivamente, com o gene de malonil-coenzima A redutase incorporado) são misturados completamen- te com 5 μΙ de um tampão de reação (10x) e 2 a 3 μΙ de enzima de restrição (10 U/μΙ; Fermentas, St. Leon-Rot). A mistura de reação foi feita até 50 μΙ com H2O destilada e incubada durante 5 h na temperatura especificada pelo fabricante. Uma precipitação de etanol foi realizada antes de uso adicional. Para esta finalidade, o DNA foi misturado com 3 volumes de etanol a100% e .0,1 volumes de tampão de acetato de sódio a 3 M (pH 5,3) e incubado du- rante 2 h ou durante a noite em -80°C. Depois de uma etapa de centrifuga- ção (20 min, 14 000 rpm, A°C, centrífuga de topo de tabela de Eppendorf), o sobrenadante é removido cuidadosamente, e o DNA foi lavado com 3 volu- mes de etanol a 70% (v/v). Depois de incubação de 10 min em temperatura ambiente, a mistura foi recentrifugada (10 min, 14 000 rpm, 4°C, centrífuga de topo de tabela de Eppendorf) e o sobrenadante foi descartado. O DNA foi em seguida secado durante 1 hora em temperatura ambiente e subseqüen- temente absorvido no volume desejado de H2O ou tampão de TE (Tris/HCI a mM (pH 8,0), NaEDTA a mM).
Em seguida, fosfatase alcalina é usada para remoção dos gru- pos de 5'-fosfato do vetor de filamento duplo linearizado. Desta maneira, a eficiência de clonagem é aumentada uma vez que a religação do vetor é im- pedida. Fosfatase alcalina intestinal de bezerro foi usada para desfosforila- ção do vetor digerido. A desfosforilação foi realizada no mesmo tampão como a diges- tão de restrição. 50 μΙ de mistura de restrição foram misturados com 1,5 μΙ de CIAP (Fosfatase Alcalina de Intestino de Bezerro (1 U/μΙ; Fermentas, St. Leon-Rot) e a mistura foi incubada durante 30 min em 37°C. Antes de uso adicional do vetor clivado e desfosforilado, uma precipitação de etanol foi realizada tal como descrito acima.
T4 DNA Iigase foi usado na ligação do DNA de inserção com o vetor de expressão, DNA de plasmídeo e DNA de inserção sendo emprega- do em uma relação molar de 1:3 a 1:6. Soluções de matéria-prima:
Tampão de ligação (1 Ox): Tris/HCI a 0,5 M, pH 7,6
MgCI2 a 100 mM 0,5 mg/ml de BSA esterilizado por filtro, armazenagem em temperatura
ambiente
ATPa 5 mM (trifosfato de adenosina) Sempre preparado
frescamente em H2O destilada estéril
DTE a 50 mM (ditioeritritol) Sempre preparado
recentemente em tampão de ligação
As misturas de ligação tinham um volume de 50 μΙ-de DNA de plasmídeo (2 a 10 μΙ), DNA de inserção (2 a 20 μΙ), 5 μΙ de tampão de Iiga- ção com DTE (50 mM) e a correspondente quantidade de H2O destilada es- téril foram pipetados juntos, turbilhonados, centrifugados brevemente e sub- seqüentemente incubados durante 5 min em 45°C. A mistura foi resfriada em gelo. 5 μΙ de ATP a 5 mM e 1,5 μΙ de T 4 DNA Iigase (1 U/μΙ; Fermentas; St. Leon-Rot) foram adicionados, e tudo foi misturado. Ligação foi desempenha- da durante a noite em 16°C.
A mistura de ligação foi empregada diretamente para transfor- mação de células quimicamente competentes.
6. Transformação de células de E. Coli com o vetor de expressão
Uma cultura noturna de 5 ml foi desenvolvida partindo de uma única colônia de células Rosetta 2 de E. coli. Na manhã seguinte, 50 ml de meio de LB (Sambrook e outros, "Molecular Cloning: a Laboratory Manuaf, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) foram inoculados com 0,5 a 1,0 ml desta cultura. Depois de incubação du- rante 1,5 a 2 h (37°C, agitação (180 rpm)), um OD57Snm de 0,6 foi alcançado. As células foram resfriadas em gelo durante 10 min e subseqüentemente centrifugadas durante 5 min em 5000 rpm e 4°C (rotor GSA, centrífuga Sor- vali). O sobrenadante foi descartado e a pelota de células foi re-suspensa em 2,7 ml de solução de CaCI2 a 0,1 M gelada. Depois de adição de 2,3 ml de glicerol a 50% (v/v) estéril, a suspensão de célula foi dividida em porções (em cada caso 300 μΙ) em vasos de reação de Eppendorf a 1,5 ml. As célu- las competentes foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e subseqüentemente armazenadas em-80°C.
Para transformar as células, uma alíquota das células quimica- mente competentes (300 μΙ) foi descongelada em gelo e tratada com 25 μΙ de uma mistura de ligação. Tudo foi misturado cuidadosamente e incubado durante 30 min em gelo. Depois de um choque térmico (42°C, 1 min) a mis- tura foi reincubada em gelo durante 5 min. Depois disso, 800 μΙ de meio de LB (Sambrook e outros, 1989) foram adicionados, e as células foram agita- das durante 1 h em 37°C (Termomisturador, Eppendorf 5436). A mistura foi concentrada e finalmente colocada em meio de LB. Para esta finalidade, a mistura foi centrifugada durante 1 min em 10 000 rpm, 750 μιτι do sobrena- dante foram descartados, e a pelota de células foi ressuspensa. 50 μΙ, 100 μΙ e 200 μΙ desta mistura concentrada foram colocada em placas de LB (Sam- brook e outros, 1989), suplementados com 100 μg/ml de ampicilina e incu- bados durante a noite na incubadora em 37°C. As placas foram lavadas com 1 ml de meio de LB. Esta suspensão de célula foi usada para subsequente- mente inoculaçâo de 150 ml de meio de LB (suplementados com 100 pg/ml ampicilina) em 500 ml de frascos de Erlenmeyer com defletores. As culturas desenvolveram em 37°C e 180 rpm. Superexpressão foi desempenhada por indução do promotor em pTrc99A por adição de IPTG (isopropil-3-D- tiogalactopiranosídeo) a 0,5 M em uma OD578nm de 0,6. As culturas induzidas foram incubadas durante 3 h sob as condições acima mencionadas e subse- qüentemente colhidas em uma OD578nm = 2,7.
. 7. Detecção da atividade enzimática
A cepa de E. coli obtida no Exemplo 6 foi rompida por meio de uma moagem de célula. As células rompidas foram aquecidas durante 15 min em 85°C. Durante esta precipitação por calor, enzimas resistentes a não calor coagulam e são precipitadas. Uma vez que a proteína alvo é resistente a calor, ela é retida no sobrenadante. Para medir a atividade de malonil- coenzima A redutase, o sobrenadante foi diluído 1:50 em tampão de TM (Tris/CI a 50 mM, MgCI2 a 1 mM, pH 8,1). 30 μΙ do sobrenadante diluído ou não diluído (para detecção da atividade de metilmalonil-coenzima A reduta- se) foram pipetados a 500 μΙ de tampão de HIPS (HEPES a 100 mM/NaOH, MgCI2 a 5 mM, ditioeritritol a 1 mM, contendo NADPH a 0,5 mM).
Em uma primeira batelada, a reação foi iniciada por adição de malonil-coenzima A, a concentração final sendo 0,5 mM. A queda na absor- ção de NADPH em 365 nm foi determinada. A atividade de enzima determi- nada foi 15,5 pmol/min/mg de proteína (15,5 U/mg). Em uma segunda batelada, a reação foi iniciada por adição de
metilmalonil-coenzima A (de Fluka, Artigo nQ 67767), a concentração final sendo 2,0 mM. A queda na absorção de NADPH em 365 nm foi determina- da. A atividade de enzima determinada foi 0,24 pmol/min/mg de proteína (0,24 U/mg).
Pode ser visto destes resultados que o polipeptídeo que codifica
a seqüência de DNA com a SEQ ID Ng 03 catalisa tanto a conversão de ma- IoniI-CoA quanto de metilmalonil-coenzima A.
.1 mol de NADPH foi oxidado por mole de malonil-CoA ou metil- malonil-Coa empregado. Disto pode ser concluído que a reação enzimática leva ao correspondente semialdeído. Listagem de Seqüência
<110> Degussa AG
<120> "PRODUÇÃO MICROBILÓGICA DE ÁCIDO 3-HIDROXIISOBUTÍRICO".
<130> DR82387
<160> 22
<170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 2214 <212> DNA
<213> ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum <400> 1
atgacgtcga tccctaattt ttcagacatc ccattgactg ctgagacacg tgcatcggag 60
tcacacaacg ttgacgccgg caaggtgtgg aacactcccg aaggcattga tgtcaagcgc 120
gtattcacgc aggctgaccg cgacgaggcg caagcggcgg gacatccggt ggattctttg 180
ccaggtcaaa agccatttat gcgcgggccg tacccaacta tgtacaccaa tcagccgtgg 240
acgattcgcc agtacgcagg cttttcaacc gccgcggaat ccaatgcgtt ttatcggagg ' 300
aaccttgctg cgggtcaaaa aggtttgtcg gttgcgttcg atctagcgac ccaccgcggt 360
tatgactcgg ataatgagcg cgtggtcggc gatgtgggta tggccggcgt ggcgattgat 420
tcgattttgg atatgcgtca gctgtttgat ggcattgatt tgtccagcgt gtcggtgtcg 480
atgaccatga atggcgctgt gctgccgatt cttgcgttct atatcgtggc ggctgaggaa 540
caaggtgtgg gtccggagca gcttgcgggc acgatccaga atgacatctt gaaagaattt 600
atggtgcgca acacctatat ttatccgccg aagccgtcga tgcgcatcat ttccaacatc 660
tttgagtaca cctccttgaa gatgccacgt tttaactcca tttcgatttc tggctatcac 720
atccaggaag cgggagcgac tgccgatttg gagctggcct acactctggc ggatggtatt 78C
gaatacatcc gtgcaggtaa agaggtaggc cttgacgtgg ataagttcgc gcctcgtctg 84(
tccttcttct ggggtatttc tatgtacacc ttcatggaga tcgcaaagct gcgtgcggga 900
cgactgctgt ggagcgagtt ggtggcaaaa ttcgatccga aaaacaccaa gtcccagtcg 960
ctgcgcacgc actcgcagac ctctggttgg tcgttgaccg cacaaaatgt gtacaacaac 102(
gtcgcccgca ccgcgattga gacgatggct gcaacccagg gccacaccca gtcgctgcac 108C
accaatgcac ttgaigagac aitagcgctg cccaccgatt tctciucLcg tatcgcccga 114Í
aacacccagc tgttactgca acaggaatct ggcacggtgc gtccacttga tccatgggcg 120(
cgctcctatt acgtaaagtç gttcaccaat gagctggcta accacccgcç caagcacatc 126; gatgaggtgg aggaagccgg cggaatggcg caggccaccg cgcagggaat tcctaagctg 1320
cgcattgagg aatcagcggc acgcacccag gctcgcattg attccggccg ccaggcgctg 1380
atcggcgtga atcgctacgt ggcggaagaa gatgaggaaa ttgaagtcct caaggttgac 1440
aacaccaagg ttcgcgcaga acagttggct aaactcgcgc aactgaaagc agagcgcaac 1500
gatgcggaag tcaagactgc gctggatgcg ttgacagctg ctgcccgcaa cgagcataaa 1560
gagccagggg atttagatca gaacctgctc aaacttgccg tcgatgctgc gcgcgcaaaa 1620
gctaccattg gagaaatctc cgatgctttg gaagttgtct ttggccgcca cgaagcagaa 1680
atcaggacgc tgtctagcgt gtacaaggat gaggttggaa aggaaggcac agtgagcaac 1740
gtcgaacgcg cgatcgccct ggctgacgcc tttgaggctg aggaaggccg ccgcccacgt 1800
atctttattg ccaaaatggg ccaggatgga catgaccgtg gacagaaggt tgtcgcgtct 1860
gcctatgctg acctgggcat ggacgtggat gttggaccgc tgtttcaaac tccagccgaa 1920
gctgcccgcg ccgccgtgga cgccgatgtt cacgtggtgg gtatgtcttc gctggcagca 1980
ggccacctca ccttactgcc cgagctgaag aaagaacttg cagctcttgg ccgcgatgac 2040
attctggtca ccgtaagcgg cgtcattccg ccgggcgatt tccaggatct ctacgatatg 2100
ggtgccgccg cgatttaccc tccaggaacc gtcatcgcgg agtcggcgat cgatctgatc 2160
acccgactcg ccgcacacct gggctttgac ctggatgtgg atgtgaatga gtga 2214 <210> 2 <211> 737 <212> PRT <213> ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum <400> 2
Met Thr Ser Ile Pro Asn Phe Ser Asp Ile Pro Leu Thr Ala Glu Thr 1 5 10 15 Arg Ala Ser Glu Ser His Asn Val Asp Ala Gly Lys Val Trp Asn Thr 20 25 30 Pro Glu Gly Ile Asp Val Lys Arg Val Phe Thr Gln Ala Asp Arg Asp 35 40 45 Glu Ala Gln Ala Ala Gly His Pro Val Αερ Ser Leu Pro Gly Gln Lys 50 55 60 Pro Phe MeL Arc Gly Pro Tyr Pro Thr Met Tyr Thr Asn Gln Pro Trp 65 70 75 80 Thr Ile Arg Glr Tyr Ala Gly Phe Ser Τπ: Ajo Ala Glu Ser Asn Ala 85 90 95
Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Ala Ala Gly Gln Lys Gly Leu Ser Val Ala
100 105 110
Phe Asp Leu Ala Thr His Arg Gly Tyr Asp Ser Asp Asn Glu Arg Val
115 120 125
Val Gly Asp Val Gly Met Ala Gly Val Ala Ile Asp Ser Ile Leu Asp
130 135 140
Met Arg Gln Leu Phe Asp Gly Ile Asp Leu Ser Ser Val Ser Val Ser 145 150 155 160
Met Thr Met Asn Gly Ala Val Leu Pro Ile Leu Ala Phe Tyr Ile Val
165 17C Ilt
Ala Ala Glu Glu Gln Gly Val Gly Pro Glu Gln Leu Ala Gly Thr Ile
180 185 190
Gln Asn Asp Ile Leu Lys Glu Phe Met Val Arg Asn Thr Tyr Ile Tyr
195 200 205
Pro Pro Lys Pro Ser Met Arg Ile Ile Ser Asn Ile Phe Glu Tyr Thr
210 215 220
Ser Leu Lys Met Pro Arg Phe Asn Ser Ile Ser Ile Ser Gly Tyr Hiε 225 230 235 240
Ile Gln Glu Ala Gly Ala Thr Ala Asp Leu Glu Leu Ala Tyr Thi Leu
245 2 5 C 2 5 L
Ala Asp Gly Ile Glu Tyr Ile Arg Ala Gly Lys Glu Val Gly Leu Asp
260 265 270
Val Asp Lys Phe Ala Pro Arg Leu Ser Phe Phe Trp Gly Ile Ser Met
275 280 285
Tyr Thr Phe Met Glu Ile Ala Lys Leu Ara Ala Gly Arg Leu Leu Trp
290 295 300
Ser Glu Leu Val Ala Lys Phe Asp Pro Lys Asn Ala Lys Ser Gli. Se: 305 310 315 320
Leu Ara Thr His Ser Gln Thr Sei Gly 11 μ Ser Leu Thr Ala Gl
325 330 335
Val Tyr Asn Αεη Val Ala Ara Thr kia Iie Glu Ala Met Ala Al, Tn: 340 345 350 Gln Gly His Thr Gln Ser Leu His Thr Asn Ala Leu Asp Glu Ala Leu 355 360 365
Ala Leu Pro Thr Asp Phe Ser Ala Arg Ile Ala Arg Asn Thr Gln Leu 370 375 380
Leu Leu Gln Gln Glu Ser Gly Thr Val Arg Pro Val Asp Pro Trp Ala 385 390 395 400
Gly Ser Tyr Tyr Val Glu Trp Leu Thr Asn Glu Leu Ala Asn Arg Ala 405 410 415
Arg Lys His Ile Asp Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Met Ala Gln Ala 420 425 430
Thr Ala Gln Gly Ile Pro Lys Leu Arg Ile Glu Glu Ser Ala Ala Arg 435 440 445
Thr Gln Ala Arg Ile Asp Ser Gly Arg Gln Ala Leu Ile Gly Val Asn 450 455 460
Arg Tyr Val Ala Glu Glu Asp Glu Glu Ile Glu Val Leu Lys Val Asp 465 470 475 480
Asn Thr Lys Val Arg Ala Glu Gln Leu Ala Lys Leu Ala Gln Leu Lys 485 490 495
Ala Glu Arg Asn Asp Ala Glu Val Lys Ala Ala Leu Asp Ala Leu Thr 500 505 510
Ala Ala Ala Arg Asn Glu His Lys Glu Pro Gly Asp Leu Asp Gln Asn 515 520 525
Leu Leu Lys Leu Ala Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys Ala Thr Ile Gly 530 535 540
Glu lie Ser Asp Ala Leu Glu Val Val Phe Gly Arg His Glu Ala Glu 545 550 555 560
Ile Arc Thr Leu Ser Gly Val Tyr Lys Asp Glu Val Giy Lye Glu Gly 565 570 575
Thi Yd Ser Asn Val Glu nio AIa Iie Aia Leu Ala Asp Ala Phe Glu 580 585 590
Aia G.u Giu Gly Arg Arc Prc Arc lie Phe Ile Ala Lys Met Giy Gin .595 600 605
Asp Gly His Asp Arg Gly Gln Lys Val Val Ala Ser Ala Tyr Ala Asp
.610 615 620
Leu Gly Met Asp Val Asp Val Gly Pro Leu Phe Gln Thr Pro Ala Glu .625 630 635 640
Ala Ala Arg Ala Ala Val Asp Ala Asp Val His Val Val Gly Met Ser
.645 650 655
Ser Leu Ala Ala Gly His Leu Thr Leu Leu Pro Glu Leu Lys Lys Glu .660 665 670
Leu Ala Ala Leu Gly Arg Asp Asp Ile Leu Val Thr Val Gly Gly Val .675 680 685
Ile Pro Pro Gly Asp Phe Gln Asp Leu Tyr Asp Met Gly Ala Ala Ala
.690 695 700
Ile Tyr Pro Pro Gly Thr Val Ile Ala Glu Ser Ala Ile Asp Leu Ile . 705 710 715 720
Thr Arg Leu Ala Ala His Leu Gly Phe Asp Leu Asp Val Asp Val Asn .725 730 735
Glu
<210> 3 <211> 1071 <212> DNA
<213> Sulfolobus tckodaii <4 0 0> 3
atgaggagaa cattaaaacc cacaatatta ggtgctactg gtttagtagg aatcgaatac 60
gtaagaatgc tatcaaatia tccttatatt aaaccagcat atttaactgg aaaaggttca 12C gtgggtaaac cgtatggtca aatagtaaga tggcaaacag tagaacaagt tcctaaggaa 180 atagctgata tggaaatac.a accaactgat cctaagttaa tgaataatgt agacataata 240 ttttctccat tacctcaacg tgctgctggc ccagtagaaa aacaatttgc aaaagaagga 30C ttccctgtga ttagtaat;c accagatcat agatttgatc ctaatgttcc cttattggtt 36C 30 ccLgaactaa atcctcai. ^ tòttagctta attgatgagc aaag&aaaag aagagaatgg 42l aaaggattta tagtaaci, c accactatgc acagcccagç gtçcagcaat accattaggt 48C actatattta aagattat. o catggataga gcatttatai ctac-tattca atcgctatct b 4 C ggtgccggtt atccaggaat accatcatta gatgtagtag ataatatctt gcctttaggt 600 gatggatacg atgccaagac gataaaagag atcttcagaa ttttaagcga agttaagaga 660 aatgtagatg aacctaaatt agaagatgta agcttagcag caacaactca tagaatagct 720 actatacatg gtcattatga agtactatat gtatcgttca aagaggaaac tgctgctgaa 780 aaagttaagg agactttaga aaactttaga ggggaaccac aagatctaaa attaccaact 840 gcaccttcaa agccaattat cgttatgaat gaggatacaa gacctcaagt ctattttgat 900 agatgggctg gggatattcc aggaatgagt gtagttgtag gtagattaaa gcaagtgaat 960 aagagaatga taaggttagt atcattaatt cataacacgg tcagaggagc cgcaggagga 1020 ggtatattag cagctgaatt acttgtcgaa aaaggatata ttgaaaagta a 1071
<210> 4
<211> 356 <212> PRT
<213> Sulfolobus tokodaii <400> 4
Met Arg Arg Thr Leu Lys Ala Ala Ile Leu Gly Ala Thr Gly Leu Val .1 5 10 15
Gly Ile Glu Tyr Val Arg Met Leu Ser Asn His Pro Tyr Ile Lys Pro
.20 25 30
Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Ser Val Gly Lys Pro Tyr Gly Glu Val .35 40 45
Val Arg Trp Gln Thr Val Gly Gln Val Prc Lys Glu Ile Ala Asp Met
.50 55 60
Glu Ile Lys Prc Thr Asp Pro Lys Leu Met Asp Asp Val Asp Ile Ile .65 70 75 8 0
Phe Ser Pro Lei; Pro Gln Gly Ala Ala Gly Prc Val Glu Glu Gln Phe
.85 9 C 95
Ala Lys Glu Gly Phe Pro Val Ile Ser Αεη Ser Pro Asp His Arg Phe
IO; 105 110
Asp Pro Asp VaI Pro Leu Leu Val Pro Glu Leu Asn Pro His Thr lie
.115 12G 125
Ser Leu Ile Asp GIu Gln Arg Lys Arg Arc Glu Trp Lys Gly Phe IIe .13 C 135 141 Val Thr Thr Pro Leu Cys Thr Ala Gln Gly Ala Ala Ile Pro Leu Gly
Ala Ile Phe Lys Asp Tyr Lys Met Asp Gly Ala Phe Ile Thr Thr Ile
Gln Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Pro Gly Ile Pro Ser Leu Asp Val
Val Asp Asn Ile Leu Pro Leu Gly Asp Gly Tyr Asp Ala Lys Thr Ile
Lys Glu Ile Phe Arg Ile Leu Ser Glu Val Lys Arg Asn Val Asp Glu
Pro Lys Leu Glu Asp Val Ser Leu Ala Ala Thr Thr His Arg Ile Ala Thr Ile His Gly His Tyr Glu Val Leu Tyr Val Ser Phe Lys Glu Glu Thr Ala Ala Glu Lys Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Phe Arg Gly Glu
Pro Gln Asp Leu Lys Leu Pro Thr Ala Pro Ser Lys Pro Ile Ile Val
Met Αεη Glu Asp Thr Arg Pro Gln Val Tyr Phe Asp Arg Trp Ala Gly
Asp Iie Pro Gly Met Ser Val Va] Val Gly Arg Leu Lys Gln Val Asn
Lys Arc Met Ile Arg Leu Val Sei Leu Ile His Asn Thr Val Ara Gly
Ala Aja Gly Gly Gly Ile Leu A1& Ala Glu Leu Leu Val Glu Lys Gly
Tyr Iie Glu Lys 355 <21O>5 <211> 129;- <212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroiãer <4 00> 5
atggccctcg acgtgcagag cgatatcgtc gcctacgacg cgcccaagaa ggacctctac 60
gagatcggcg agatgccgcc tctcggccat gtgccgaagg agatgtatgc ttgggccatc 120
cggcgcgagc gtcatggcga gccggatcag gccatgcaga tcgaggtggt cgagacgccc 180
tcgatcgaca gccacgaggt gctcgttctc gtgatggcgg cgggcgtgaa ctacaacggc 240
atctgggccg gcctcggcgt gcccgtctcg ccgttcgacg gtcacaagca gccctatcac 300
atcgcgggct ccgacgcgtc gggcatcgtc tgggcggtgg gcgacaaggt caagcgctgg 360
aaggtgggcg acgaggtcgt gatccactgc aaccaggacg acggcgacga cgaggaatgc 420
aacggcggcg acccgatgtt ctcacccacc cagcggatct ggggctacga gacgccggac 480
gactccttcg cccagttcac ccgcgtgcag gcgcagcagc tgatgaagcg tccgaagcac 540
ctgacctggg aagaggcggc ctgctacacg ctgaccctcg ccaccgccta ccggatgctc 600
ttcggccaca agccgcacga cctgaagccg gggcagaacg tgctggtctg gggcgcctcg 660
ggcggcctcg gctcctacgc gatccagctc atcaacacgg cgggcgccaa tgccatcggc 720
gtcatctcag aggaagacaa gcgcgacttc gtcatggggc tgggcgccaa gggcgtcatc 780
aaccgcaagg acttcaagtg ctggggccag ctgcccaagg tgaactcgcc cgaatataac 840
gagtggctga aggaggcgcg caagttcggc aaggccatct gggacatcac cggcaagggc 900
atcaacgtcg acatggtgtt cgaacatccg ggcgaggcga ccttcccggt ctcgtcgctg 960
gtggtgaaga agggcggcat ggtcgtgatc tgcgcgggca ccaccggctt caactgcacc 1020
ttcgacgtcc gctacatgtg gatgcaccag aagcgcctgc agggcagcca tttcgccaac 1080
ctcaagcagg cctccgcggc caaccagctg atgatcgagc gccgcctcga tccctgcatg 1140
tccgaggtct tcccctgggc cgaaatcccg gctgcccata cgaagatgCa taagaaccag 1200
cacaagcccg gcaacatggc ggtactggtg caggccccgc gcacggggtt gcgcaccttc 1260
accgacgtgc tcgaggccgg ccacaaggcc tga 1293 <210; 6 <211? 430
<112; PRT
<113> Rhodobacter sphaercides
<400; (
Met Ala Leu Asp Val Gln Ser Asp Ile Val Ala Tyr Αερ Ala. Pro Lys
. 5 10 IL
Lve Asp Leu Tyr Glu Ile Giy Glu Met Pro Pro Leu Giy His Val Pro
.2 0 2 b 3 ί Lys Glu Met Tyr Ala Trp Ala Ile Arg Arg Glu Arg His Gly Glu Pro
.35 40 45
Asp Gln Ala Met Gln Ile Glu Val Val Glu Thr Pro Ser Ile Asp Ser
.50 55 60
His Glu Val Leu Val Leu Val Met Ala Ala Gly Val Asn Tyr Asn Gly .65 70 75 80
Ile Trp Ala Gly Leu Gly Val Pro Val Ser Pro Phe Asp Gly His Lys
.85 90 95
Gln Pro Tyr His Ile Ala Gly Ser Asp Ala Ser Gly Ile Val Trp Ala
.100 105 110
Val Gly Asp Lys Val Lys Arg Trp Lys Val Gly Asp Glu Val Val Ile
.115 120 125
His Cys Asn Gln Asp Asp Gly Asp Asp Glu Glu Cys Asn Gly Gly Asp
.130 135 140
Pro Met Phe Ser Pro Thr Gln Arg Ile Trp Gly Tyr Glu Thr Pro Asp .145 150 155 160
Gly Ser Phe Ala Gln Phe Thr Arg Val Gln Ala Gln Gln Leu Met Lys
.165 170 175
Arg Pro Lys His Leu Thr Trp Glu Glu Ala Ala Cys Tyr Thr Leu Thr
.180 185 190
Leu Ala Thr Ala Tyr Arg Met Leu Phe Gly His Lys Pro His Asp Leu
.195 200 205
Lys Pro Gly Gln Asn Val Leu Val Trp Gly Ala Ser Gly Gly Leu Gly
.210 215 220
Ser Tyr Ala Ile Gln Leu Ile Asn Thr Ala Gly Ala Asn Ala Ile Gly .225 2 3 C 2 3 5 240
Val Ile Ser Glu Giu Asp Lys Arg Asp Phe Val Met Gly Leu Gly Ala
.24· 250 255
Lys Gly Val Ile Asn Arg Lys Asp Phe Lys Cys Trp Giy Gln Leu Prc
.260 265 270
Lys Val Asn Ser Prc Giu Tyr Asn Glu Trp Leu Lys Glu Ala Arg Lys .275 280 '^i: Phe Gly Lys Ala Ile Trp Asp Ile Thr Gly Lys Gly Ile Asn Val Asp
Met Val Phe Glu His Pro Gly Glu Ala Thr Phe Pro Val Ser Ser Leu
Val Val Lys Lys Gly Gly Met Val Val Ile Cys Ala Gly Thr Thr Gly
Phe Asn Cys Thr Phe Asp Val Arg Tyr Met Trp Met His Gln Lys Arg
Leu Gln Gly Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gln Ala Ser Ala Ala Asn
Gln Leu Met Ile Glu Arg Arg Leu Asp Pro Cys Met Ser Glu Val Phe
Pro Trp Ala Glu Ile Pro Ala Ala His Thr Lys Met Tyr Lys Asn Gln
His Lys Pro Gly Asn Met Ala Val Leu Val Gln Ala Pro Arg Thr Gly
Leu Arg Thr Phe Ala Asp Val Leu Glu Ala Gly Arg Lys Ala <210> 7 <211> 123; <212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 7
atgagtgatt acgaaccgtt gcgtctgcat gtcccggagc ccaccgggcg tcctggctgc 60
aagaccgact tttcctatct gcacctgtcc cccgccggcg aggtacgcaa gccgccggtc 120 gatgtcgaac ccaccgagac cagcgacctg gcctacaccc tggtacgtgt gctcgacgac 180
gacggccacg ccgtcggtcc ctggaatccg cagctcagca acgaacaact gctgcgcggc 240 atgcgggcça tgctcaagac ccgcctgttc gacacgcaca tgctcaccgc gcaacgacaç 300 aaaaagcttt ccttctatat gcaatgcctc ggcgagaaag ccatcgccac cgcccacacc 360
ctggccctge gcgacggcga catgtgcttl ccgaccuu gccagcaagg catcctuatc 420 acccgcgaat acccgctagt ggacatgatc tgccagcttc tctccaacga ggccgacccc 480 ctcaagggcc çccaactgcc gatcatgtac tcgaacaaçg aggcaggttt cttctccatc 540 tccggcaacc tcgccaccca gttcatccag gcggtcggct ggggcatggc ctcggcgatc 600
aagggcgaca cgcgcatcgc ctcggcctgg atcggcgacg gcgccaccgc cgagtcggac 660
ttccacaccg ccctcacctt cgcccatgtc taccgcgcgc cggtaatcct caacgtggtc 720
aacaaccagt gggcgatctc caccttccag gccatcgccg gcggcgaagg caccaccttc 780
gccaaccgtg gcgtgggctg cgggatcgcc tcgctgcggg tcgacggcaa tgacttcctg 840
gcggtctacg ccgcctccga gtgggccgcc gagcgcgccc ggcgcaacct cgggccgagc 900
ctgatcgaat gggtcaccta ccgcgccggc ccgcactcga cttcggacaa cccgtccaag 960
taccgccccg ccgacgactg gaccaacttc ccgctgggcg acccgatcac ccgcctgaag 1020
cggcacatga tcggcctcgg catctggtcg gaggaacagc acgaagccac ccacaaggcc 1080
ctcgaagccg aagtactggc cgcgcagaaa caggcggaga gccatggcac cctgatcgac 1140
ggccgggtgc cgagcgccgc cagcatgttc gaggacgtct atgcagaact gccggagcac 1200
ctgcgccggc aacgccagga gctcggggta tga 1233 <210> 8 <211> 1049 <212; DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa < 4 0 0 > 8
atgccatgaa cccgcaacac gagaacgccc agacggtcac cagcatgacc atgatccagg 60
cgctgcgctc ggcgatggac atcatgctcg agcgcgacga cgacgtggte gtattcggcc 120
aggacgtcgg ctacttcggc ggcgtgttcc gctgcaccga aggcctgcac aagaaatacg 180
gcacctcgcg ggtgttcgat gcgccgatct ccgagagcgg catcatcgac gccgcggtcg 240
gcatgggtgc ctacggcctg cgcccggtaa tggagatcca gttcgccgec tacgtctacc 300
cggcctccga ccagttgatc tccgaggcga cgcgcctgcg ctatcgctca gccggcgact 360
tcatcgtgcc gatgaccgta cgcatgccct gtggcggcgg catctacgac gggcaaacgc 420
acagccagag cccggaggcg atgttcaccc aggtctgcgg cctgcgcacc gtgatgccgt 480
ccaaccccta caacgccaag ggcctgctaa tcgcctgcat cgagaacaa: gacccggtga 540
tcttcctcga gcccaagcgc ctctacaacg gcccattcga tggccaccac gaccgcccgg 600 tgacaccctg aiccaagcat ccggccagcc aggtgccgga cggctactac aaggtgccgc tggacaaggc aacgatcgtc cgccccggcg cggcactgac cgtgctgac v tacggcacca
tggtctacgt gucccaggcc gcggccgacg agaccggcct ggacgccgo^ atcatcaacc 780
tgcgcagcct ctggccgctg gacctgaaaa ccatcgtcgc ctcggtgarc aaaaccggcc 840 gctgcatcat cgcccacgag gcgacccaca cctacgggtt cggcgccac,:■ ctaatgtcgc 900 tggtgcagga gcactgcttc caccacctgg aggcgccgat cgagcgcgtc accggttggg 960
acacccccta cccgcatgcc caggagtggg cgtatttccc cggccccgcg cgcgtcggcg 1020
cggcattcaa gcgtgtgatg gaggtctga 1049 <210> 9 <211> 924 <212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 9
atgtcgatgg ccgatcgtga tggcgtgatc tggtatgacg gtgaactggt gcagtggcgc 60
gacgcgacca cgcacgtgct gacccatacc ctgcactatg gaatgggcgt gttcgagggc 120
gtgcgcgcct acgacacccc gcagggcacg gcgatcttcc gcctgcaggc gcataccgac 180
cggctgttcg actccgcgca catcatgaac atgcagatcc cgtacagccg cgacgagatc 240
aacgaggcga cccgcgccgc cgtgcgcgag aacaacctgg aaagcgccta tatccgcccg 300
atggtgttct acggaagcga aggcatgggc ctgcgcgcca gcggcctgaa ggtccatgtg 360
atcatcgccg cctggagctg gggcgcctac atgggcgagg aagccctgca gcaaggcatc 420
aaggtgcgca ccagttcctt cacccgccac cacgtcaaca tctcgatgac ccgcgccaag 480
tccaacggcg cctacatcaa ctcgatgctg gccctccagg aagcgatctc cggcggcgcc 540
gacgaggcca tgatgctcga tccggaaggc tacgtggccg aaggctccgg cgagaacatc 600
ttcatcatca aggatggcgt gatctacacc ccggaagtca ccgcctgcct gaacggcatc 660
actcgtaaca ctatcctgac cctggccgcc gaacacggtC ttaaactggt cgagaagcgc 720
atcacccgcg acgaggtgta catcgccgac gaggccttct tcactggcac tgccgcggaa 78C
gtcacgccga tccgcgaagt ggacggtcgc aagatcggcg ccggccgccg tggcccggtc 840
accgaaaagc tgcagaaagc ctatttcgac ctggtcagcg gcaaaaccga ggcccacgcc 900
gagtggcgta ccctggtcaa gtaa 924
25 <210; 10 <211: 1128 <212; DNA
<213> Acinetobacter caicoaceticus <400; 10
atgcaattta atgaagaacò gciaLtaatL caggatatgg cgaa&agttt tgccaatgaa 6C
cacattaaat ctaatgcaoc aoaatggoat aagcataaca tttttccaaa agacgttttg 12C tcccaaatgg ggcaattggc ittcatggga atgctggtga gtgacaaatc gggcggatca aatacaggaa atttagctta Cgtgctggca cttgaagaaa tcgctgccgc agatggtgcg 240
acttcaacca ttatgagtgt acataattct gttggctgtg tacccattgc taaatttggt 300
acagaggagc aaaagcagaa atatctagtg cctttagcac aaggtgaaat gatcggtgca 360
tttgctttaa cggaaccaca tacaggttcc gatgccgcag ccattaaaac ccgagcaatt 420
aaacaaggtg atgaatggat tattaatggc gctaaacaat ttataacatc aggtcataat 480
gcgggcgtga ttattgtatt tgctgtgaca gatccgaatg cagggaaaaa agggctgagt 540
gcatttattg tgccgcgtga aaccttgggt tatgaggtga ttcgcaccga agaaaaattg 600
ggtttacatg cgtcagatac gtgccaaatt gctttaacgg atgttcgagt acatcacagc 660
ttaatgcttg gtcaggaagg tgagggacta aaaatagcat tgtctaatct ggaaggtggc 720
cgtattggga ttgcagcgca agccgttggt ttggcacgtg ctgcactaga agaagcgaca 780
aaatatgcca aagagcgtgt gacctttgga aagcctattt ttgagcatca ggcgttagcc 840
tttcgtttag ccagtatggc cacagaaatt gaagcaacac gacaattggt tcattacgca 900
gcgcggctta aagaagctgg aaaaccttgt ttaaatgaag catcaatggc gaaattattt 960
tcatctgaaa tggtcgaacg cgtatgttct gctgctttgc aaatctttgg tggctatggc 1020
tatttaaaag actttcccat cgagcgaatt tatcgtaatg cacgtatttg ccagatttat 1080
gaaggtacaa gtgatattca gcgtttagtg atagcaagaa gcctataa 1128 <210> 11 <211> 774 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 11
atgacattcg caacaatttt attggaaaaa cgtaagggtg tgggcttgat tacacttaac 60
catccaaaag cattaaatgc tttaaactca gaattaattt atgaaataaa tttagcctta 120
gacgatttag aaaataatca aacgattggt tgtatcgtcc ttacaggttc agaaaaagcc 180
tttgccgcag gtgcgaatat caaagaaatg gcagaattaa cttttccaaa tatttatttt 240
gatgattttt ttagtcttgc agatcgtatt gcacagcatc gtaagccttt aattgccgca 300
gtgagtggtt atgctttaga tggtggctgt gagttaacac tcatgtgtga ctttatttat 360
tgtgccgaca atgccaaatt tacactacca gaagtaactt taggtgtcat tcctggtatt 420
ggtggaacac agcatctaac acttgcaata ggcaaaacca aaaccatgga aatgtgtttg 480
actgcacggc aaataeagac Lgctgaggca gaacaaaaig aLttggtggc acgcgttttL 540
agtaaagaag aacttttaaa acaaacctta caggctocco aaaaaatagc ggaaaaatca 600
caggtatcta ccataataat taaagagtca attaatcgac cttttgaagt gagtttaaca 660 gagggtttac gttttgagcg ccgaatgttc cattcagttt ttgcgacctt agatcagaaa 720
gaaggcatgc aagcatttat tgataaacgt ccagcccaat ttaaacatca ataa 774 <210> 12 <211> 1029 <212> DNA
<213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 12
atgactacta ctgacaatca tttactcatt gaacataaaa acgctttagg aacaattatt 60
ttaaatcgtc cagcgagtct gaacgcgcta tctctagaaa tgattaatgc gattcgtcaa 120
caagttgagg attggcaagg tgatgtaaat gttcaggcca tattaattaa atcaaatagt 180
cctaaagcat tttgtgcagg tggtgatatt cgctatcttt atgaaagtta taaaagtgga 240
tcagaagagt ataaagatta tttcattgct gaatatgaga tgctcaatag cattcgaacg 300
tctaaaaaaa cagtgattgt tttattggat ggatatgtat tgggtggtgg ttttggttta 360
gcacaggctt gtcatatctt ggtgagtagt gaaaaatcac gattttcaat gccagaaaca 420
gcaataggtt ttttcccaga tgttgcagcg acttatttct tatctcgttt agatgatgtt 480
ggggtatatt tggcactgac tggtgatcaa atcagtagta gtgatgcatt gtatttagat 540
ctgattgatt atcatattcc gagtcagaat tttgagcgac tagaaaatgc attcagccaa 600
tcacagaact tagataaatt tcatattcag aagattattt ctgcttatat ctccagccct 660
gttcagagtg aactcagtct atggcttgaa gccattcgtc agcattttgg tcttaaaaat 720
gtgcaagata tcgaaaaaag tttgaaaaat gaacaagatc ccaactatca agtatggaca 780
agtaaagtgt taaatacttt gcaacaacgt tcctctattg caaaaaaaac cagtttaaaç 840
ttacagctgc tagggcgtgg atggtcatta cagcaatgta tgcgtatcga gcgaaaatta 900 caggatatct ggtttaaaca tggtgatata attgagggtg ttcgagcgtt gattattgat 960
aaaaataaac aaccacaatg gcagcagcat aatgcgactt tagataatat attaggccaa 1020
ttaggttaç 1029 <210> 13 <211> 31 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<22> Iniciadcr <400> 13 atgcaattta atgaagaaca gctattaatt
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 14
cagtctgaaa tgactaacct aattggc
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 15
acggaattct gaaggagctg gcaactata
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 16
ttatcaactt acttgaccag ggtacacc
<210> "
<211> 31
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> ]niciador <400> acagatctgg aggcctgtca tgagtgatta c 31
<210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador <400> 18
atgggtaccc attcagacct ccatc 25
<210> 19
<211> 6960
<212> DNA
<213 > Artificial
<220>
<223> New Plasmid
<400> 19
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
aagatatacc atgggcagca accatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattctga 120
aggagctggc aactatgtcg atggccgatc gtgatggcgt gatctggtat gacggtgaac 180
tggtgcagtg gcgcgacgcg accacgcacg tgctgaccca taccctgcac tatggaatgg 240
gcatgttcga gggcgtgcgc acctacgaca ccccgcaggg cacggcgatc ttccgcctgc 300
aggcgcatac cgaccggctg ttcgactccg cgcacatcat gaacatgcag atcccgtaca 360
accgcgacga gatcaacgag acaacccgcg ccgccgtgcg cgaaaacaac ctggaaagcg 420
cctatatccg cccgatggtg ttctacggaa gcgaaggcat gggcctgcgc gccagcggcc 480
taaaggtcca tgtgatcatc accacctgga gctggggcgc ctacatgggc gaggaagccc 540
tacagcaagg catcaaggtg cacaccagtt ccttcacccg ccaccacgtc aacatctcga 600
tgacccgcgc caagtccaac gacacctaca tcaactcgat gctggccctc caggaagcga 660
tctccggcgg cgccgacgag accatgatgc tcgatccgga aggctacgtg gccgaaggct 720
ccagcgagaa catcttcatc atcaaggatg gcgtgatcta caccccggaa gtcaccgcct 780
acctgaacgg catcacicat aacactatcc tgaccctggc cgccgaacac ggttttaaac 840
tgatcgagaa gcgcatcacc cccaacgagg tgtacatcgc cgacgaagcc ttcttcactg 900
ccõctgccgc ggaaatcacç ccatccgcg aagtggacga tcgcaaaatc ggcgccggcc 960 gccgtggccc ggtcaccgaa aagctgcaga aagcctattt cgacctggtc agcggcaaga 1020
ccgaggccca cgccgagtgg cgtaccctgg tcaagtaagt cgacaagctt gcggccgcat 1080
aatgcttaag tcgaacagaa agtaatcgta ttgtacacgg ccgcataatc gaaattaata 1140
cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc catcttagta tattagttaa 1200
gtataagaag gagatataca tatggcagat ctggaggcct gtcatgagtg attacgagcc 1260
gttgcgtctg catgtcccgg agcccaccgg gcgtcctggc tgcaagaccg acttttccta 1320
tctgcacctg tcccccgccg gcgaggtacg caagccgccg gtggatgtcg agcccgccga 1380
gaccagcgac ctggcctaca gcctggtacg tgtgctcgac gacgacggcc acgccgtcgg 1440
tccctggaat ccgcagctca gcaacgaaca actgctgcgc ggcatgcggg cgatgctcaa 1500
gacccgcctg ttcgacgcgc gcatgctcac cgcgcaacgg cagaaaaagc tttccttcta 1560
tatgcaatgc ctcggcgagg aagccatcgc caccgcccac accctggccc tgcgcgacgg 1620
cgacatgtgc tttccgacct atcgccagca aggcatcctg atcacccgcg aatacccgct 1680
ggtggacatg atctgccagc ttctctccaa cgaggccgac ccgctcaagg gccgccagct 1740
gccgatcatg tactcgagca aggaggcagg tttcttctcc atctccggca acctcgccac 1800
ccagttcatc caggcggtcg gctggggcat ggcctcggcg atcaagggcg acacgcgcat 1860
cgcctcggcc tggatcggcg acggcgccac cgccgaatcg gacttccaca ccgccctcac 1920
cttcgcccat gtctaccgcg cgccggtaat cctcaacgtg gtcaacaacc agtgggcgat 198C
ctccaccttc caggccatcg ccggcggcga aggcaccacc ttcgccaacc gtggcgtggç 204C
ctgcgggatc gcctcgctgc gggtcgacgg caatgacttc ctggcggtct acgccgcctc 2100
cgagtgggcc gccgagcgcg cccggcgcaa cctcgggccg agcctgatcg aatgggtcac 2160
ctaccgcgcc ggcccgcact cgacttcgga cgacccatcc aagtaccgcc ccgccgacge. 222C
ctggaccaac ttcccgctgg gcgacccgat cgcccgcctg aagcggcaca tgatcggcct 2280
cggcatctgg tcggaggaac agcacgaagc cacccacaag gccctcgaag ccgaagtac: 234C
ggccgcgcag aaacaggcgg agagccatgg caccctaatc gacggccggg tgccgagcgc 2400
cgccagcatg ttcgagaaca tctatgcaga actgccçgag cacctgcgcc ggcaacgcc^ 2460
ggagctcggg gtatgaatgc catgaacccg caacacoaga acgcccagac ggtcaccaac 252C
atgaccatga tccaggcgct gcgctcggcg atggacatca tgctcgagcg cgacgacgac 2580
gtggtggtat tcggccagga cgtcggctac ttcggcçgca tattccgctg caccgaaga' 264(
ctgcagaaga aatacgacac ctcgcgggtg ttcgatccac caatctccga gagcggcatc 270C
atcggcgccg cgglcggcai gggtgcctac ggcctgiacc cggtggtgga gatccagtt· 276i
gccgactacg tctacccoac ctccgaccag ttgatcrcca aggcggcgcg cctgcgcta: 2 82(
cgctcggccg acgacticat cgtgccgatg accgtacaca taccctgtgg cggcggcat· 28K tacggcgggc cgcacggtga aacgacgacc caccacgacc tactacaagg ctgacctacg gccgagatca gtgaagaaga gccgagctga cgcgtcaccg cccgcgcgcg tctggtaaag gcagcttaat gcctctaaac gtcacactgc taacgaccct cttgaacgaa tggacaaatt taagcctgtc cagtcggcag gacaacgtaa gttaaggttt tccgccgctg agatcaatgt tctccaaa 11 acaatggtaa aaaaggtcat agcaaatcaa acggccagca gtcgatãctt atttatcacc caaataact í.
aaacgcacag tgccgtccaa cggtgatctt gcccggtgac tgccgctgga gcaccatggt tcgacctgcg ccggccgctg tgtcgctggt gttgggacac tcggcgcggc aaaccgctgc taacctaggc gggtcttgag ttccggtagt gccctgaacc ttgttagaca cttccaactg tagcttcaag cgacatcctt gcactacatt catttagcgc gacctaccaa cgatcgtggc acagttcgcg cttctacagc tgatcaaagc tatcactgtg acgtcggttc cggcgatcac et tattgtct gctcactcgg
ccagagcccg cccctacgac cctcgagccc gccctggtcc caaggcggcg ctacgtggcc cagcctctgg cgtcatcgcc gcaggagcac cccctacccg attcaagcgt tgcgaaattt tgctgccacc gggttttttg caataaaccg gacgaccggg ttatttgccg atctgcgcgc tatgacgggc cggcgcgatt tcgctcatcg ctcaaataga ggcaacgcta tggctcgaag cttagctgga gcggagaatc tcgccgcgt t tggcttcaga gagatggcgc cgcttccctc catgagcgga tcactacact
gaggcgatgt gccaagggcc aagcgcctct aagcatccgg atcgtccgcc caggccgcgg ccgctggacc cacgaggcga tgcttccacc catgcccagg gtgatggagg gaacgccagc gctgagcaat ctgaaacctc gtaaaccagc tcatcgtggc actaccttgg gaggccaagc tgatactggg ttgccggtta ccagcccagt tcctgttcag tgttctcttg atacctgcaa taacgccacg tcgctctctc gt t tcatcaa ccoccatcca tcaataacgc atactctt.cc tscatatttg ccoggcatga
tcacccaggt ctgcggcctg 2940
tgctgatcgc ctgcatcgag 3000
acaacggccc gttcgatggc 3060
ccagccaggt gccggacggc 312 0
ccggcgcggc gctgaccgtg 3180
ccgacgagac cggcctggac 3240
tggaaaccat cgtcgcctcg 3300
cccgcacctg cgggttcggc 3360
acctggaggc gccgatcgag 3420
agtgggcgta tttccccggc 3480
tctgaatggg taccctcgag 3540
acatggactc gtctactagc 3600
aactagcata accccttggg 3660
aggcatttga gaagcacacg 3720
aatagacata agcggctatt 3780
cggatcttgc ggcccctcgg 3840
tgatctcgcc tttcacgtag 3900
gatcttcttc ttgtccaaga 3960
ccggcaggcg ctccattgcc 4020
ctgcgctgta ccaaatgcgg 4080
cgggcggcga gttccatagc 4140
gaaccggatc aaagagttcc 4200
cttttgtcag caagatagcc 4260
gaatgtcatt gcgctgccat 4320
gaatgatgtc gtcatgcaca 4380
caggggaagc cgaagtttcc 4440
gccttacggt caccgtaacc 4500
ctgcggagcc gtacaaatot 4560
caactacctc tgatagttas 4620
tttttcaata ttattgaaat 4680
aatgtattta gaaaaataaa 4740
gactgcggcg ggccctacaç 4800 acacatacaa agttacccac agattccgtg gataagcagg ggactaacat gtgaggcaaa 4860
acagcagggc cgcgccggtg gcgtttttcc ataggctccg ccctcctgcc agagttcaca 4920
taaacagacg cttttccggt gcatctgtgg gagccgtgag gctcaaccat gaatctgaca 4980
gtacgggcga aacccgacag gacttaaaga tccccaccgt ttccggcggg tcgctccctc 5040
ttgcgctctc ctgttccgac cctgccgttt accggatacc tgttccgcct ttctccctta 5100
cgggaagtgt ggcgctttct catagctcac acactggtat ctcggctcgg tgtaggtcgt 5160
tcgctccaag ctgggctgta agcaagaact ccccgttcag cccgactgct gcgccttatc 5220
cggtaactgt tcacttgagt ccaacccgga aaagcacggt aaaacgccac tggcagcagc 5280
cattggtaac tgggagttcg cagaggattt gtttagctaa acacgcggtt gctcttgaag 5340
tgcgcgccaa agtccggcta cactggaagg acagatttgg ttgctgtgct ctgcgaaagc 5400
cagttaccac ggttaagcag ttccccaact gacttaacct tcgatcaaac cacctcccca 5460
ggtggttttt tcgtttacag ggcaaaagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 5520
tcctttgatc ttttctactg aaccgctcta gatttcagtg caatttatct cttcaaatgt 5580
agcacctgaa gtcagcccca tacgatataa gttgtaattc tcatgttagt catgccccgc 5640
gcccaccgga aggagctgac tgggttaaag gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt 5700
gcctaatgag tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 5760
ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 5820
cgtattgggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc 5880
cttcaccgcc tggccctgag agagttacag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag 5940
gcgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa catgagctgt cttcggtatc 6000
gtcgtatccc actaccgaga tgtccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg 6060
cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc 6120
attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cctcccgttc 6180
cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtaaa atatttatgc cagccagcca aacgcagacg 6240
cgccgagaca gaacttaatg ggcccactaa cagcgcgatt tgctggtaac ccaatgcgac 6300
cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg 6360
tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcaa cttccacagc 6420
aatggcatcc tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc ccactgacac gttgcgcgag 6480
aagattgtgc accgccgctt tacaaacttc gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac 6540
cacgctggca cccagttgat cggcgcoaga tttaatcgcc gcgacastti gcgacggcgc 6600
gtacagggcc agactggagg tgacaacacc aateagcaac gactatttcc ccaccagttg 6660
ttgtgccaca cggttgggaa Cgtaaticaa ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg 6720 cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac 6780
accggcatac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg 6840
actctcttcc gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt ttgcgccatt cgatggtgtc 6900
cgggatctcg acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaaattaata cgactcacta 6960
<210> 20
<211> 8757 <212> DNA <213> Artificia] <220>
<223> New Plasmid <400> 20
caaggagatg gcgcccaaca gtccccCggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa 60
acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat 120
ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta 180
gaggatcgag atctcgatcc cgcgaaatta atacgactca ctatagggga attgtgagcg 240
gataacaatt cccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggaatt caggagccct 300
tatgcaattt aatgaagaac agctattaat tcaggatatg gcgaaaagtt ttgccaatga 360
acagattaaa tctaatgcag cagaatggga taagcatagc atttttccaa aagacgtttt 420
gtcccaaatg gggcaattgg gttttatggg aatgctggtg agtgagaaat ggggcggatc 480
aaatacagga aatttagctt atgtgctggc acttgaagaa atcgctgccg cagatggtgc 540
gacttcaacc attatgagta tacataattc tgttggctgt gtacccattg ctaaatttgg 600
tacagaggag caaaagcaga aatatctagt gcctttagca caaggtgaaa tgatcggtgc 660
atttgcttta acggaaccac atacaggttc cgatgccgca gccattaaaa cccgagcaat 720
taaacaaggt gatgaatgga ttattaatgg cgctaaacaa tttataacat caggtcataa 78C
tgcgggcgtg attattgtat ttactgtgac agatccgaat gcagggaaaa aagggctgag 84C
tgcatttatt gtgccçcgtc aaaccttggg ttatgaggtc attcgcaccg aagaaaaatt 90C
gggtttacat gcgtcagata cgtgccaaat tgctttaacg gatgttcgag tacatcacag 96C
cttaatgctt ggtcaggaac gtgagggact aaaaatagca ttatctaatc tggaaggtgg 102C
ccgtattggg attgcagcpc aagccgttgg tttggcacat actacactag aagaagcgac IOf-C
aaaatatgcc aaagagcgtc taacctttgg aaagcctatt LtLgagcatc aggcgttagc ±I4v.
ctttcgttta gccagtatac ccacagaaat tgaagcagca caacaattgg ttcattacgc 120C
agcgcggctt aaagaaactc: aaaaaccttg tttaaatgaà gcatcaatgg cgaaattatt Iltí <formula>formula see original document page 111</formula> ttgaacatgg tgatatgatt gagggtgttc gagcgttgat tattgataaa gataaacaac 3240
cgcaatggca gcagcataat gcgactttag ataatatatt aggccaatta ggttagtcat 3300
ttcagactga agggcgagct caattcgaag cttgaaggta agcctatccc taaccctctc 3360
ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt ttgatccggc 3420
tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc 3480
ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat 3540
atccggatat cccgcaagag gcccggcagt accggcataa ccaagcctat gcctacagca 3600
tccagggtga cggtgccgag gatgacgatg agcgcattgt tagatttcat acacggtgcc 3660
tgactgcgtt agcaatttaa ctgtgataaa ctaccgcatt aaagcttatc gatgataagc 3720
tgtcaaacat gagaattaat tcttgaagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 3780
aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg 3840
tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 3900
gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac 3960
atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc 4020
cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca 4080
tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc 4140
caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt gttgacgccg 4200
ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac 4260
cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca 4320
taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg 4380
agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac 4440
cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg 4500
caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggca aactacttac tctagcttcc cggcaacaat 4560
taataaactg gatggaggcg gataaagtta caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg 4620
ctggctggtt tattgctgat aaatctgaaa ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg 4680
cagcacLggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc 4740
aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc 4800
attgataact atcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt 4860
tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt 4920
aacgtuagtt itcgttccac tgagcgtcaç accccgtaga aaagatcaaa agaLcitctL 49S0
gaaatccttt ttttctgcgc gtaatctact ccttgcaaac aaaaaaacca ccoctaccao 5040
cgatcctttç tttgccggat caagaactac caactctttt tccgaaggta actgacttca 5100 112
gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 5160
agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 5220
ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 5280
cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 5340
acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 5400
gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 5460
ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 5520
agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 5580
cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 5640
tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 5700
gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc 5760
ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg caatggtgca ctctcagtac 5820
aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg 5880
gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 5940
ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 6000
ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagctgcggt aaagctcatc agcgtggtcg 6060
tgaagcgatt cacagatgtc tgcctgttca tccgcgtcca gctcgttgag tttctccaga 6120
agcgttaatg tctggcttct gataaagcgg gccatgttaa gggcggtttt ttcctgtttg 6180
gtcactgatg cctccgtgta agggggattt ctgttcatgg gggtaatgat accgatgaaa 6240
cgagagagga tgctcacgat acgggttact gatgatgaac atgcccggtt actggaacgt 6300
tgtgagggta aacaactggc gatatggatg cggcgggacc agagaaaaat cactcagggt 6360
caatgccagc gcttcgttaa tacagatgta ggtgttccac agggtagcca gcagcatcct 6420
gcgatgcaga tccggaacat aatggtgcag ggcgctgact tccgcgtttc cagactttac 6480
gaaacacgga aaccgaagac cattcatgtt gttgctcagg tcgcagacgt tttgcagcag 6540
caatcgcttc acgttcgctc acgtatcggt gattcattct gctaaccaat aaggcaaccc 6600
cgccagccta gccgggtcct caacaacagg agcacgatca tgcgcacccg tggccaggac 6660
ccaacgctgc ccgagatgcg ccgcgtgcgg ctgctggaga tggcggacac gatggatatg 6720
ttctgccaag ggttggtttg cgcattcaca gttctccgca agaattgatt ggctccaatt 6780
cttgaagtgg tgaatccgtt agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc 6840
gaciccatgc accgcgacgc aacgcgggga ggcagacaag gtatagggca gcgcctacaa 6900
tccatgccaa cccgttccat atactcaccg aggcggcata aatcgccata acgatcagcg 696C
çtccaatgat cgaagttagg ctoctaagag ccgcgagcga tccttaaagc· tgtccctgat 702( ggtcgtcatc tacctgcctg gacagcatgg cctgcaacgc gggcatcccg atgccgccgg 7080
aagcgagaag aatcataatg gggaaggcca tccagcctcg cgtcgcgaac gccagcaaga 7140
cgtagcccag cgcgtcggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt 7200
tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa 7260
gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga 7320
gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga 7380
cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca 7440
tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac 7500
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca tCaatgaatc ggccaacgcg 7560
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg 7620
ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg 7680
ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat 7740
gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg 7800
gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca 7860
gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc 7920
cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag 7980
ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc 8040
tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa 8100
ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg 8160
caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg aatagttaat gatcagccca 8220
ctgacgcgtt gcgcgagaaa attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt 8280
tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg 8340
acaatttgcg acggcgcqta cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 8400
tgtttgcccg ccagttatto tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 8460
gcttccactt tttcccacat tttcgcagaa acgtggctga cctggttcac cacgcgggaa 8520
acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgCCac tggtttcaca 8580
ttcaccaccc tgaattaact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttc 864C
cgccattcga tggtgtccgc gatctcgacg ctctccctta tgcaactcct gcattaggaa 870C
gcagcccagt agtagattga aaccgttgag caccgccgcc acaaggaatg gtgcatg 8757
<210> 21 <211> 28 <212 > DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 21
attatcccat ggggagaaca ttaaaagc
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 22
cgggatcctt acttttcaat atat

Claims (39)

1. Célula que foi geneticamente modificada em comparação com seu tipo selvagem de um tal modo que seja capaz de formar mais ácido 3- hidroxiisobutírico com base em ácido 3-hidroxiisobutírico em comparação com seu tipo selvagem.
2. Célula de acordo com a reivindicação 1, onde a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou de poliidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico ocorre por meio de semialdeído de metilmalonato como precursor.
3. Célula de acordo com a reivindicação 2, onde a célula é capaz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico por meio da sucinil-coenzima A como intermediá- rio.
4.Célula de acordo com a reivindicação 3, onde a célula repre- senta uma atividade de uma enzima E1, que catalisa a conversão de sucinil- coenzima A na metilmalonil-coenzima A, que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem.
5.Célula de acordo com a reivindicação 4, em que a enzima Ei é uma metilmalonil-coenzima A mutase (EC 5.4.99.2).
6. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 5, em que a célula representa uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E2 a E4 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem: - de uma enzima E2, que catalisa a conversão de metilmalonil- coenzima A em metil malonato; - de uma enzima E3, que catalisa a conversão de metil malonato em semialdeído de metilmalonato; - de uma enzima E4 que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em 3-hidroxiisobutirato.
7. Célula de acordo com a reivindicação 6, em que a enzima E2 é uma metilmalonil-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.17), E3 é um aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.3) ou um aldeído oxi- dase (EC 1.2.3.1) e E4 uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou uma 3 hidroxiacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35).
8. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 5, onde a célula representa uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzi- mas E4, E5, E4 e E7 que é aumentada em comparação com seu tipo selva- gem: - de uma enzima E6, que catalisa a conversão de (R) metilmalo- nil-coenzima A em (S) metilmalonil-coenzima A; - de uma enzima E7, que catalisa a conversão de (S) metilmalo- nil-coenzima A em propionil-coenzima A; - de uma enzima E5, que catalisa a conversão de propionil- coenzima A semialdeído de metilmalonato; - de uma enzima E4, que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em ácido 3-hidroxiisobutírico.
9. Célula de acordo com a reivindicação 8, em que a enzima E6 é uma metilmalonil-coenzima A epimerase (EC 5.1.99.1) E7 é uma metilmalonil-coenzima A descarboxilase (EC 4.1.1.41), E5 é uma semialdeído de metilmalonato desidrogenase (EC 1.2.1.27), e E4 é uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou uma 3-hidroxiacila-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35).
10. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 5, on- de a célula representa uma atividade de pelo menos uma das seguintes en- zimas E4, E5 e E7 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem: - de uma enzima E7, que catalisa a conversão de metilmalonil- coenzima A em propionil-coenzima A; - de uma enzima E5, que catalisa a conversão de propionil- coenzima A semialdeído de metilmalonato; - de uma enzima E4, que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em ácido 3-hidroxiisobutírico.
11. Célula de acordo com a reivindicação 10, em que a enzima E7 é uma metilmalonil-coenzima A descarboxilase (EC 4.1.1.41). E5 é uma semialdeído de metilmalonato desidrogenase (EC .1.2.1.27), e E4 é uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou uma 3-hidroxiacila-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35).
12. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 5, on- de a célula representa uma atividade de pelo menos uma das seguintes en- zimas E28 e E46 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem: - de uma enzima E46, que catalisa a conversão de L-glutamato em 2-oxoglutarato; - de uma enzima E28, que catalisa a conversão de .2-octoglutarato em sucinil-coenzima A.
13. Célula de acordo com a reivindicação 12, em que a enzima E46 é umaglutamato sintase (EC 1.4.1.13 ou EC 1.4.1.14), uma glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3 ou EC 1.4.1.4) ou uma as- partato transaminase (EC 2.6.1.1 ou EC 2.6.1.2) e E28 é uma 2-oxoglutarato sintase (EC 1.2.7.3).
14. Célula de acordo com a reivindicação 2, onde a célula é ca- paz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico por meio de propionil-coenzima A como intermediá- rio.
15. Célula de acordo com a reivindicação 14, onde a célula re- presenta uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E4, E5 and E47 a E52 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem: - de uma enzima E47, que catalisa a conversão de acetil- coenzima A em malonil-coenzima A ; - de uma enzima E48, que catalisa a conversão de malonil- coenzima A em semialdeído de malonato ; - de uma enzima E49, que catalisa a conversão de semialdeído de malonato em 3-hidroxipropionato; - de uma enzima E50, que catalisa a conversão de 3- hidroxipropionato em 3-hidroxipropionil-coenzima A; - de uma enzima E51, que catalisa a conversão de 3- hidroxipropionil-coenzima A em acriloil-coenzima A; - de uma enzima E52, que catalisa a conversão de acriloil- coenzima A em propionil-coenzima A; - de uma enzima E5, que catalisa a conversão de propionil- coenzima A semialdeído de metilmalonato; - de uma enzima E4, que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em 3-hidroxiisobutirato.
16. Célula de acordo com a reivindicação 15, em que a enzima E4 é uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou uma 3-hidroxiacila-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35), E5 é uma semialdeído de metilmalonato desidrogenase (EC 1.2.1.27), E47 é uma malonil-coenzima A descarboxilase (EC 4.1.1.9), uma malonato-coenzima A transferase (EC 2.8.3.3), a metilmalonil-coenzima A carbóxitransferase (EC 2.1.3.1) ou uma acetil-coenzima A carboxilase (EC 6.4.1.2), E48 é uma malonato-semialdeído desidrogenase (EC 1.2.1.18), E49 é uma 3-hidroxipropionato desidrogenase (EC 1.1.1.59), E50 é uma 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.4), E51 é uma enoil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.17) e E52 é uma acil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.3).
17. Célula de acordo com a reivindicação 2, onde a célula é ca- paz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico por meio de acriloil-coenzima A como intermediá- rio.
18. Célula de acordo com a reivindicação 17, onde a célula re- presenta uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E10 até E-I2, E56, E72 e E73 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem: - de uma enzima E72, que catalisa a conversão de beta-alanina em beta-alanil-coenzima A, - de uma enzima E73, que catalisa a conversão de beta-alanil- coenzima A em acrilil-coenzima A, - de uma enzima E56, que catalisa a conversão de acrilil- coenzima A na metilmalonil-coenzima A, - de uma enzima E10, que catalisa a conversão de metilmalonil- coenzima A em metil malonato; - de uma enzima En, que catalisa a conversão de metil malonato semialdeído de metilmalonato; - de uma enzima E12, que catalisa a conversão de semialdeído de metilmalonato em ácido 3-hidroxiisobutírico.
19. Célula de acordo com a reivindicação 18, em que a enzima E72 é uma coenzima A transferase (EC 2.8.3.1) ou coenzima A sintetase, preferivelmente uma coenzima A transferase, E73 é uma beta-alanil-coenzima A amônia-liase (EC 4.3.1.6), E56 é uma crotonil-coenzima A descarboxilase E10 é uma metilmalonil-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.17), E11 é um aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.3) ou um aldeído oxi- dase (EC 1.2.3.1) e E12 é uma 3-hidroxiisobutirato desidrogenase (EC 1.1.1.31) ou uma 3 hidroxiacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.1.1.35).
20. Célula de acordo com a reivindicação 1, onde a formação de ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico ocorre por meio de 3-hidroxibutiril-coenzima A como pre- cursor.
21. Célula de acordo com a reivindicação 20, onde a célula é capaz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico por meio de isobutiril-coenzima A como inter- mediário.
22. Célula de acordo com a reivindicação 21, onde a célula re- presenta uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E76 to E79, E60, E61 e E8 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem: - de uma enzima E76, que catalisa a conversão de piruvato em 2- acetolactato; - de uma enzima E77, que catalisa a conversão de 2-acetolactato em 2,3-dihidroxiisovalerato; - de uma enzima E78, que catalisa a conversão de 2,3- diidroxiisolvalerato em 2-oxoisovalerato; - de uma enzima E79, que catalisa a conversão de 2- oxoisovalerato em isobutiril-coenzima A; - de uma enzima E60, que catalisa a conversão de isobutiril- coenzima A em metacrilil-coenzima A; - de uma enzima E61, que catalisa a conversão de metacrilil- coenzima A em 3-hidroxiisobutiril-coenzima A; - de uma enzima E8, que catalisa a conversão de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutirato.
23. Célula de acordo com a reivindicação 22, em que a enzima E8 é uma 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.4), E76 é uma acetolactato sintase (EC 2.2.1.6), E77 é uma diidroxiisovalerato desidrogenase (EC 1.1.1.86), E78 é uma 2,3-diidroxiisovalerato desidratase (EC 4.2.1.9), E79 é uma 2-oxoisovalerato desidrogenase (EC 1.2.1.25 ou EC 1.2.4.4), E6O é uma acil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.3), uma butiril-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.2) ou uma 2-metilacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.12), e E61 é uma enoil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.17).
24. Célula de acordo com a reivindicação 21 ou 22, onde a célu- la representa uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E8, E60 to E6I e E79 a E80 que é aumentada em comparação com seu tipo selva- gem: - de uma enzima E80, que catalisa a conversão de L-valina em 2- oxoisovalerato; - de uma enzima E79, que catalisa a conversão de 2- oxoisovalerato em isobutiril-coenzima A; - de uma enzima E60, que catalisa a conversão de isobutiril- coenzima A em metacrilil-coenzima A; - de uma enzima E6i, que catalisa a conversão de metacrilil- coenzima A em 3-hidroxiisobutiril-coenzima A; - de uma enzima E8, que catalisa a conversão de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutirato.
25. Célula de acordo com a reivindicação 24, em que a enzima E8 é uma 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.4), E6O é uma enoil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.17), E6I é uma acil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.3), uma butiril-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.2) ou uma 2-metilacil-coenzima A desidrogenase (EC 1.3.99.12), E79 é uma 2-oxoisovalerato desidrogenase (EC 1.2.1.25 ou EC .1.2.4.4), e E80 é uma aminoácido transferase (EC 2.6.1.42).
26. Célula de acordo com a reivindicação 20, onde a célula é capaz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico por meio de 3-hidroxibutiril-coenzima A como intermediário.
27. Célula de acordo com a reivindicação 26, onde a célula tem uma atividade de pelo menos uma das seguintes enzimas E8, E53, E54 e E82 que é aumentada em comparação com seu tipo selvagem: - de uma enzima E53, que catalisa a conversão de acetil- coenzima A em acetoacetil-coenzima A; - de uma enzima E54, que catalisa a conversão de acetoacetil- coenzima A em 3-hidroxibutiril-coenzima A; - de uma enzima E8i, que catalisa a conversão de 3- hidroxibutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutiril-coenzima A; - de uma enzima E8, que catalisa a conversão de 3- hidroxiisobutiril-coenzima A em 3-hidroxiisobutirato.
28. Célula de acordo com a reivindicação 27, em que a enzima E8 é uma 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolase (EC 3.1.2.4) E53 é uma β-cetotiolase (EC 2.3.1.9), E54 é uma acetoacetil-coenzima A redutase (EC 1.1.1.36), e E82 é uma isobutiril-coenzima mutase (EC 5.4.99.13).
29. Método de preparar uma célula geneticamente modificada que é capaz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico por meio de semialdeído de metilmalona- to ou 3-hidroxibutiril-coenzima A, como precursores, compreendendo a etapa do método de aumentar, na célula, a atividade de pelo menos uma das en- zimas mencionadas como definido nas reivindicações 2 a 28.
30. Célula obtenível por um método como definido na reivindica- ção 29.
31. Método de produzir ácido 3-hidroxiisobutírico ou poliidroxial- canoatos com base em ácido 3-hidroxiisobutírico, compreendendo a etapa de método de trazer uma célula como definido em qualquer das reivindica- ções 1 a 28 ou 30, em contato com um meio nutriente compreendendo, co- mo fonte de carbono, carboidratos, glicerol, dióxido de carbono, metane, me- tanol, L-valina ou L-glutamato sob condições sob as quais ácido 3- hidroxiisobutírico ou poliidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico são formados das fonte de carbono, e, se apropriado, puri- ficação do ácido 3-hidroxiisobutírico do meio nutriente.
32. Método de preparar ácido metacrílico ou ésteres metacríli- cos, compreendendo as etapas de método IA) preparação de ácido 3-hidroxiisobutírico por um método de acordo com a reivindicação 31 e, se apropriado, neutralização do ácido 3- hidroxiisobutírico, IB) desidratação do ácido 3-hidroxiisobutírico com formação de ácido metacrílico e, se apropriado, esterificação de ácido metacrílico.
33. Método de preparar ácido metacrílico ou ésteres metacríli- cos, compreendendo as etapas de método IIA) preparação de poliidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxibutírico por um método de acordo com a reivindicação 31, MB) clevagem dos poliidroxialcanoatos com base em ácido 3- hidroxiisobutírico com formação de ácido 3-hidroxiisobutírico e, se apropria- do, neutralização do ácido 3-hidroxiisobutírico, IIC) desidratação do ácido 3-hidroxiisobutírico com formação de ácido metacrílico e, se apropriado, esterificação do ácido metacrílico.
34. Método de preparar ácido polimetacrílico e ésteres polimeta- crílicos, compreendendo as etapas de método IIIA) preparação de ácido metacrílico por um método de acordo com a reivindicação 32 ou 33, IIIB) polimerização de radical livre do ácido metacrílico, sendo possível, se apropriado, para esterificar pelo menos em parte os grupos carboxila do ácido metacrílico ou o grupo carboxilato do me- tacrilato antes ou após a polimerização de reação de radical livre.
35. DNA isolado, que é selecionado das seguintes seqüências: a) uma seqüência como mostrada na SEQ ID Ns 03, b) uma seqüência livre de íntrom que é derivada de uma se- quência e como especificado em a) e que codifica para a mesma proteína ou peptídeo como a seqüência como mostrado na SEQ ID Ne 03, c) uma seqüência que codifica para uma proteína ou peptide que compreende a seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nq 04, d) uma seqüência com pelo menos 80% de identidade com uma seqüência como especificado em a) a c), e) uma seqüência que hibridiza, ou, leva em consideração a de- generação do código genético, hibridizaria, com uma cepa contrária de uma seqüência como especificado em qualquer dos grupos a) a d), f) um derivado de uma seqüência como especificado em qual- quer dos grupos a) ao e), obtida por substituição, adição, inversão e/ou dele- ção de uma ou mais bases, e g) uma seqüência que é complementar a uma seqüência como especificado em qualquer dos grupos a) a f).
36. Vetor, compreendendo uma seqüência de DNA como especi- ficado em qualquer dos grupos a) a f), como definido na reivindicação 35.
37. Uso do vetor de acordo com a reivindicação 36 para trans- formação de uma célula.
38. Célula transformada, obtenível por transformação com um vector como definido na reivindicação 36.
39. Polipeptídeo isolado que representa a seqüência de aminoá- cido com a SEQ ID Ne 04 ou uma seqüência de aminoácido obtida quando não mais do que 10 aminoácidos na SEQ ID Ns 04 são deletados, inseridos, substituídos ou então adicionados na terminação C e/ou N da seqüência de aminoácido com a SEQ ID Ns 04.
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