BRPI0713112A2 - produção de hidrocarboneto volátil de cadeia curta usando microalgas, cianobactérias ou bactérias geneticamente manipuladas - Google Patents

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Abstract

PRODUçãO DE HIDROCARBONETO VOLáTIL DE CADEIA CURTA USANDO MICROALGAS, CIANOBACTéRIAS OU BACTéRIAS GENETICAMENTE MANIPULADAS. A presente invenção fornece métodos e composições para a produção de hidrocarbonetos de isopreno a partir de microalgas, cianobactérias e bactérias fotossintéticas e não-fotossintéticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRODUÇÃO DE HIDROCARBONETO VOLÁTIL DE CADEIA CURTA USANDO Ml- CROALGAS, CIANOBACTÉRIAS OU BACTÉRIAS GENETICAMENTE MANIPULADAS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. Nq 60/806.244, depositado em 29 de Junho de 2006, pedido o qual é aqui incorporado por referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Uma variedade de plantas coníferas, decíduas e herbáceas são conhecidas por possuir a capacidade genética e enzimática para a síntese e liberação de isoprenóides de cadeia curta (por exemplo, isopreno (C5H8) e metil-butenol (C5HioOi)) no ambiente circundante. Tais isoprenóides de ca- deia curta são derivados dos produtos do ciclo de Calvin precoce de fotos- síntese e podem ser sintetizados no cloroplasto de plantas herbáceas, decí- duas e coníferas através da assim denominada via de DXP-MEP em taxas substanciais sob determinadas condições de estresse ambiental. Estresse térmico do organismo é particularmente importante para a indução desse processo em plantas e a poluição por hidrocarboneto resultante da atmosfe- ra tem sido o foco da técnica anterior nesse campo.
A emissão de isopreno de plantas herbáceas, decíduas e conífe- ras é em virtude da presença de um gene de isopreno sintase (IspS), um gene nuclear que codifica uma proteína localizada no cloroplasto que catali- sa a conversão de dimetilalil difosfato (DMAPP) em isopreno. Conforme mencionado acima, isoprenóides são sintetizados no cloroplasto a partir dos produtos precoces do ciclo de Calvin (fixação e redução de carbono, veja figura 1). Isoprenóides com 5 carbonos, por exemplo, isopreno (C5H8) e me- til-butenol (C5HioOi) são moléculas hidrofóbicas relativamente pequenas, sintetizadas diretamente a partir de DMAPP (figura 2). Esses isoprenóides são moléculas voláteis que passam facilmente através das membranas celu- lares e, desse modo, são emitidas das folhas para a atmosfera. O processo de indução de estresse térmico e emissão de hidrocarbonetos de cadeia cur- ta pelas plantas tem sido discutido como poluição indesejável da atmosfera na literatura. Não há descrição da geração em massa, coleta e captura des- ses hidrocarbonetos a partir de folhas de plantas herbáceas, decíduas e co- níferas.
Há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de bio- combustíveis renováveis que ajudam a atingir as demandas globais por e- nergia, mas sem contribuir para alterações climáticas. A presente invenção se dirige a essa necessidade proporcionando métodos e composições para gerar hidrocarbonetos voláteis de cadeia curta que são derivados totalmente da luz do sol, dióxido de carbono (CO2) e água (H2O). Esses hidrocarbone- tos podem servir como biocombustível ou estoque de alimentação na indús- tria de química sintética.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção é baseada, em parte, na descoberta de que microal- gas, cianobactérias e fotossíntese procariota podem ser empregadas, medi- ante modificação adequada, para produzir isoprenóides com 5 carbonos (por exemplo, figura 3). A via biossintética de isoprenóide DXP-MEP é absoluta- mente requerida em plantas e algas, uma vez que ela leva à síntese de mui- tos compostos celulares de cadeia mais longa essenciais. Algas verdes uni- celulares expressam especificamente essa via em seu cloroplasto e utilizam as enzimas correspondentes para a biossíntese de uma grande variedade de moléculas (carotenóides, tocoferóis, fitol, esteróis, hormônios, dentre mui- tos outros). A presente invenção se refere a métodos e composições para o uso de microalgas, cianobactérias e bactérias fotossintéticas e não fotossin- téticas geneticamente modificadas na produção e coleta de compostos de isoprenóide voláteis com 5 carbonos, por exemplo, isopreno e metil-butenol. Tais organismos geneticamente modificados podem ser usados comercial- mente em um sistema de cultura em massa fechado, por exemplo, para pro- porcionar uma fonte de combustível renovável para motores de combustão interna ou, quando de reforma "on-board", em motores operados com célula de combustível; ou proporcionar uma fonte de isopreno para usos em outros processos químicos, tais como síntese química. Microalgas, cianobactérias e bactérias fotossintéticas e não fo- tossintéticas não possuem um gene de isopreno sintase ou de metil-butenol sintase, o qual catalisa a última etapa obrigatória na biossíntese de isopreno (C5H8) e metil-butenol (C5H10O1), respectivamente. A presente invenção, por- tanto, proporciona métodos e composições para modificar geneticamente microorganismos para expressar um gene de isopreno sintase, por exemplo, um gene de isopreno sintase de álamo códon-ajustado, de modo a conferir produção de isopreno (C5H8) ao organismo.
Em aspectos adicionais, a invenção também proporciona um método e composições para a modificação genética de microalgas, ciano- bactérias e bactérias fotossintéticas e não fotossintéticas para conferir a es- ses microorganismos superexpressão de genes endógenos e proteínas que codificam a primeira etapa obrigatória na biossíntese de isoprenóide. A in- venção pode, assim, ainda compreender expressão crescente dos genes Dxs e Dxr nativos no microorganismo, por exemplo, algas verdes, tais como Chlamydomonas reinhardtii; cianobactérias, tais como Synechocystis sp.; ou bactérias fotossintéticas, tais como Rhodospirillum rubrum ou bactérias não fotossintéticas, tais como Escherichia coli. Dxs e Dxr codificam enzimas que catalisam as primeiras etapas obrigatórias na biossíntese de isoprenóide.
Em algumas modalidades, microalgas são empregadas. Micro- algas são fábricas de fotossíntese, com o cloroplasto ocupando -70% do volume da célula; o cloroplasto de algas verdes contém mais de 3 milhões de circuitos de transporte de elétrons, cada um sendo capaz de distribuir 100 elétrons por segundo ao ciclo de Calvin para conversão de CO2 em GA-3-P; microalgas não têm raízes, caules, folhas ou flores sobre os quais investir recursos fotossintéticos, assim, uma maior fração do produto fotossintético pode ser dirigida à geração de isoprenóide volátil; microalgas crescem e se reproduzem mais rápido do que qualquer outra planta terrestre ou aquática, duplicando de biomassa por dia; e microalgas são a tóxicas e não poluentes, assim, ambientalmente seguras para a cultura e exploração comercial em massa. Consequentemente, em algumas modalidades, a invenção propor- ciona um processo para modificar o processo altamente eficiente de fotos- síntese de microalgas para gerar, em alto volume, hidrocarbonetos de iso- prenóide de cadeia curta (por exemplo, C5H8) a partir da luz do sol, CO2 e H2O. Tais microalgas modificadas podem ser cultivadas, por exemplo, em fotorreatores totalmente fechados de grande capacidade (por exemplo, 1.000-1.000.000 litros) para a produção e coleta de hidrocarbonetos de iso- prenóide de cadeia curta voláteis.
A invenção ajudará a eliminar uma série de barreiras atuais na produção comercial, armazenamento e utilização de energia renovável inclu- indo, mas não limitado a: (a) diminuição do custo de produção e armazena- mento de combustível, (b) melhora das proporções de peso/volume de com- bustível, (c) melhora da eficiência de produção/armazenamento de combus- tível, (d) aumento da durabilidade de armazenamento de combustível, (e) minimização do tempo de auto-reabastecimento, (f) oferta de armazenamen- to de combustível suficiente para uma gama de veículos aceitável, (g) pro- dução de um combustível passível de um processo de regeneração, (h) o combustível não está sujeito à interferência pelo oxigênio, quer no estágio de produção ou armazenamento.
Em um aspecto, a invenção proporciona um método de produ- ção de hidrocarbonetos de isopreno em um microorganismo selecionado do grupo consistindo em microalgas, cianobactérias ou bactérias fotossintéticas, o método compreendendo: introdução de um cassete de expressão que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica isopreno sintase no microorganismo; e cultura do microorganismo sob condições nas quais o ácido nucleico que codifica isopreno sintase é expresso. Em algumas moda- lidades, o microorganismo é uma microalga, tal como alga verde, por exem- plo, Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus obliquous, Chlorella vulgaris ou Dunaliella salina. Em modalidades alternativas, o microorganismo é uma cianobactéria, tal como uma Synechocystis sp. Em outras modalidades, o microorganismo é uma bactérias fotossintética, tal como Rhodospirillum ru- brum. Alternativamente, em algumas modalidades, o microorganismo pode ser uma bactéria não fotossintética, tal como Eseheriehia eoli.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico introduzido no mi- croorganismo compreende uma seqüência que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase que tem a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 2 ou tem a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 2, mas carece de uma região de peptídeo de trânsito. O polipeptídeo de isopreno sintase pode, por exemplo, compreender os resíduos de aminoácido 53 a 595 de SEQ ID NO: 2 ou resí- duos 38 a 595 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 1. Em outras modali- dades, o ácido nucleico compreende a seqüência de nucleotídeo de codifi- cação de isopreno sintase apresentada em SEQ ID NO: 3 ou o ácido nuclei- co compreende a seqüência de codificação de isopreno conforme apresen- tado em SEQ ID NO: 5.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um microorganismo selecionado do grupo consistindo em uma célula de microalga, uma célula de cianobactéria e uma célula bacteriana fotossintética ou célula bacteriana não fotossintética, em que o microorganismo compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica isopreno sintase e é operavelmente ligado a um promotor. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Em algumas modalidades, o microorganismo é uma alga verde, tal como Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus obliquous, Chlorella vulga- ris ou Dunaliella salina. Em outras modalidades, o microorganismo é uma bactéria fotossintética, tal como Rhodospirillum rubrum. Em algumas modali- dades, o ácido nucleico heterólogo compreende uma seqüência que codifica um gene de isopreno sintase que tem a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 2 ou tem a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 2, mas carece do peptídeo de trânsito. O polipeptídeo de isopreno sintase pode, por exemplo, compreender os resíduos de aminoácido 53 a 595 de SEQ ID NO: 2 ou os resíduos 38 a 595 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico compreende a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o ácido nucleico compreende a seqüência de nucleotídeo de codificação para isopreno sintase apresentada em SEQ ID NO: 3 ou o ácido nucleico compreende a seqüência de codificação de isopreno conforme a- presentado em SEQ ID NO: 5. Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método de produção de hidrocarbonetos de isopreno em um microorganismo que com- preende um gene heterólogo que codifica isopreno sintase e que é selecio- nado do grupo consistindo em microalgas, cianobactérias, bactérias fotossin- téticas e bactérias não fotossintéticas, o método compreendendo: cultura em massa do microorganismo em um bioreator fechado sob condições nas quais o gene de isopreno sintase é expresso; e coleta dos hidrocarbonetos de isopreno produzidos pelo microorganismo. Em algumas modalidades, o microorganismo é uma microalga que é uma microalga verde, tal como C- hlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus obliquous, Chlorella vulgaris ou Dunaliella salina. Alternativamente, o microorganismo pode ser uma ciano- bactéria, tal como Synechocystis sp. Em outras modalidades, o microorga- nismo é uma bactéria fotossintética, tal como Rhodospirillum rubrum. Em ainda outras modalidades, o microorganismo é uma bactéria não fotossinté- tica, tal como Escherichia coli.
Em algumas modalidades dos métodos de cultura em massa da invenção, o gene heterólogo que codifica isopreno sintase compreende uma seqüência que codifica um gene de isopreno sintase que tem a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 2 ou tem a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 2, mas carece do peptídeo de trânsito. O polipeptídeo de isopreno sin- tase pode, por exemplo, compreender os resíduos de aminoácido 53 a 595 de SEQ ID NO: 2 ou resíduos 38 a 595 de SEQ ID NO: 2. O ácido nucleico pode, por exemplo, compreender a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o ácido nucleico compreende a seqüência de nucleotídeo de codificação para isopreno sintase apresentada em SEQ ID NO: 3 ou a seqüência de codificação de isopreno conforme apresentado em SEQ ID NO: 5.
Em algumas modalidades dos métodos e composições da in- venção, o ácido nucleico de IspS codifica uma proteína que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 ou que compreende os aminoá- cidos 46 a 608 de SEQ ID NO: 8.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1. Via esquemática de fixação e redução de dióxido de carbono no ciclo de Calvin de fotossíntese e de canalização de carbono or- gânico a partir do gliceraldeído-3-fosfato (GA-3-P) abundante através da via biossintética de deóxi-xilulose/metil-erititol (DXP/MEP) em isoprenóides.
Figura 2. (Painel esquerdo). Reação enzimática em uma única etapa para a biossíntese de isopreno e metil-butenol no cloroplasto de árvo- res herbáceas/decíduas e pinheiros americanos, respectivamente. (Painel direito). Fórmula química do isopreno (C5H8) e metil-butenol (C5H10Oi).
Figura 3. A via biossintética de DXP/MEP que leva à formação de isoprenóides voláteis a partir dos metabólitos de cloroplasto GA-3-P (gli- ceraldeído-3-fosfato) e piruvato. Sete reações enzimáticas distintas são ne- cessárias para sintetizar isopreno a partir de GA-3-P e piruvato. Algas ver- des unicelulares, cianobactérias, bactérias fotossintéticas e determinadas bactérias não fotossintéticas possuem os primeiros seis desses genes, mas carecem dos genes de isopreno sintase ou metil-butenol sintase.
Figura 4. Co-transformação e recombinação homóloga de DNA de cloroplasto de algas verdes, por exemplo, Chlamydomonas reinhardtii, com o novo gene Cr-IspS. Este construto contém o promotor atpA (PatpA), fundido à extremidade 5' UTR de um DNA com sinalizador de epítopo de hemaglutinina (HA) com três cópias códon-otimizado. A seqüência de DNA é seguida pela região de codificação de Cr-IspS, seguido pela 3' UTR de atpA.
Figura 5. Seleção de transformantes de IspS de C. reinhardtii (Cr-IspS) através de PCR do DNA genômico. Iniciadores NeC representam o conjunto de iniciadores usado para amplificação e seus locais de anela- mento são mostrados na figura 4.
Figura 6. A. Integridade do transgene Cr-IspS testado através de análise de Southern blot do DNA genômico. Filtros hibridizados com a sonda de DNA Cr-IspS. Hibridização com um fragmento de Ndel/Xbal radio-mar- cado da região de codificação de Cr-IspS identificou uma banda de 3,0 kbp exclusivamente na linhagem N9 9 de transformante Cr-IspS, enquanto que nenhuma banda detectável pôde ser observada na fileira da linhagem de controle N9 7. B. Coloração com brometo de etídio para testar quantidades iguais de aplicação de DNA em A.
Figura 7. A Representação esquemática do gene Cr-IspS sinali- zado com 3X HA códon-otimizado. B. Validação de expressão do gene Cr- IspS. Frações de proteína solúvel, as quais correspondem a 10 ou 20 μg de clorofila, foram submetidas a SDS-PAGE e análise por Western blot com anticorpos policlonais anti-HA específicos.
Figura 8. Componentes e estrutura do plasmídeo plspS. O novo gene de isopreno sintase (Ss-IspS) com uso de códon desenhado para ex- pressão em cianobactérias, por exemplo, Synechocystis, o qual inclui um gene de resistência à ampicilina. A nova seqüência de DNA de Ss-IspS foi desenhada com base no molde da seqüência de aminoácido da proteína de isopreno sintase de álamo, com critérios projetados para se conformar às preferências de códon de Synechocystis. Sítios de restrição foram introduzi- dos para facilitar clonagem. A nova seqüência de DNA de Ss-IspS foi sinteti- zada e clonada no plasmídeo plspS para propagação em E. coli.
Figura 9. Construção do plasmídeo pAIGA para transformação de cianobactérias, por exemplo, Synechocystis. Seqüências de flanquea- mento do gene psbA3 de Synechocystis foram usadas para recombinação homóloga do plasmídeo e subseqüentemente direcionar a expressão do ge- ne Ss-IspS com um promotor forte. Um cassete de resistência à gentamicina foi introduzido no plasmídeo na extremidade 3' do gene Ss-IspS para servir como um marcador selecionável. O gene Ss-IspS foi clonado entre os sítios de restrição de Ncol e Pstl.
Figura 10. Recombinação homóloga dupla. Esquema mostrando o princípio de transformação de Synechocystis sp. através de recombinação homóloga dupla e substituição do gene psbA3 nativo pela estrutura de resis- tência à Gm Ss-IspS.
Figura 11. Estrutura de um plasmídeo contendo Ss-IspS sinali- zado com His para superexpressão de proteína recombinante em bactérias, por exemplo, Escherichia coli. O sinalizador de histidina N-terminal foi intro- duzido para facilitar purificação da proteína recombinante. Expressão em Escherichia coli foi induzida pela adição de IPTG à cultura celular líquida. Figura 12. Evidência de expressão da proteína recombinante Ss- IspS sinalizada comHis em bactérias, por exemplo, E. coli. SDS-PAGE cora- do com Coomassie da proteína total separada eletroforeticamente de extra- tos de células de E. coli trazendo o piasmídeo pETIspS. Fileira 1: Cultura de controle não induzida. Fileiras 2 a 4 e 6 a 10: Culturas de E. coli induzidas. Fileira 5: Marcadores de tamanho de peso molecular de proteína.
Figura 13. Alinhamento pelo Clustal de quatro proteínas de iso- preno sintase conhecidas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
"Microalgas", "algas" ou semelhante se refere à plantas que per- tencem ao subfilo Algae do filo Thallophyta. As algas são algas unicelulares, fotossintéticas, oxigênicas e são plantas não parasíticas sem raízes, caules ou folhas; elas contêm clorofila e têm uma grande variedade de tamanho, de microscópicas a grandes algas marinhas. Algas verdes, pertencendo ao Eu- karyota-Viridiplantae-Chlorophyta-Chlorophyceae, podem ser usadas na invenção. Contudo, algas úteis na invenção também podem ser azuis- verdes, vermelhas ou marrons, contanto que as algas sejam capazes de de- sempenhar as etapas necessárias para fornecer um substrato para produzir isopreno.
Um "hidrocarboneto de isopreno volátil", no contexto da presente invenção, se refere a um isoprenóide com 5 carbonos de cadeia curta, por exemplo, isopreno ou metil-butenol.
Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados como sinônimos e se referem a um polímero fita simples ou dupla de bases de de- soxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo lidas da extremidade 5' para 3'. Um ácido nucleico da presente invenção geralmente conterá ligações fosfodiés- ter embora, em alguns casos, análogos de ácido nucleico possam ser usa- dos os quais podem ter estruturas alternativas compreendendo, por exem- plo, ligações de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato ou O-metilfosfo- roamidita (vide Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Ap- proach, Oxford University Press); e estruturas e ligações de ácido peptídeo nucleico. Outros ácidos nucleicos análogos incluem aqueles com estruturas positivas; estruturas não-iônicas e estruturas de não-ribose. Assim, ácidos nucleicos ou polinucleotídeos podem também incluir nucleotídeos modifica- dos, que permitem leitura correta através de uma polimerase. "Seqüência polinucleotídeo" ou "seqüência de ácido nucleico" inclui as fitas senso e an- tissenso de um ácido nucleico, quer como fitas simples ou em uma dupla. Conforme será apreciado por aqueles na técnica, a representação de uma fita simples também define a seqüência da fita complementar; assim, as se- qüências descritas aqui também proporcionam o complemento da sequên- cia. A menos que de outro modo indicado, uma seqüência de ácido nucleico particular também abrange, implicitamente, variantes da mesma (por exem- plo, substituições de códon degenerado) e seqüências complementares, bem como a seqüência explicitamente indicada. O ácido nucleico pode ser DNA, genômico e cDNA, RNA ou um híbrido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de desoxirribo- e ribonucleotídeos e combinações de bases, incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina, isoguanina, etc.
A expressão "uma seqüência de ácido nucleico que codifica" se refere a um ácido nucleico o qual contém informação de seqüência para um RNA estrutural, tal como rRNA, um tRNA ou a seqüência de aminoácido primária de uma proteína ou peptídeo específico ou um sítio de ligação para um agente regulatório de trans-atuante. Essa expressão abrange especifi- camente códons degenerados (isto é, diferentes códons que codificam um único aminoácido) da seqüência nativa ou seqüências que podem ser intro- duzidas para se conformar à preferência de códon em uma célula hospedei- ra. No contexto da invenção, o termo "região de codificação de IspS", quan- do usada com referência a uma seqüência de ácido nucleico de referência, tal como SEQ ID NOs: 3, 5 ou 7, se refere à região do ácido nucleico que codifica a proteína.
Um "gene" IspS, no contexto da presente invenção, se refere a um ácido nucleico que codifica uma proteína IspS ou fragmento da mesma. Assim, tal gene é, freqüentemente, uma seqüência de cDNA que codifica IspS. Em outras modalidades, um gene IspS pode incluir seqüências, tais como íntrons, que não estão presentes em um cDNA.
O termo "promotor" ou "elemento regulatório" se refere a uma região ou determinantes de seqüência localizados à montante ou à jusante do início de transcrição que dirige a transcrição. Conforme usado aqui, um promotor inclui seqüências de ácido nucleico necessárias próximas do sítio de início de transcrição tal como, no caso de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também inclui, opcionalmente, elemen- tos distais, os quais podem estar localizados a centenas de milhares pares de base a partir do início de transcrição. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvol- vimento. Um promotor "induzível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. O termo "operavelmente ligado" se refere a uma ligação funcional entre uma seqüência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor) e uma segunda seqüência de ácido nucleico, tal como um gene IspS1 em que a seqüência de controle de ex- pressão dirige a transcrição do ácido nucleico correspondendo à segunda seqüência. Um "promotor de alga" ou "promotor bacteriano" é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de alga e/ou bactérias, respectiva- mente. Tal promotor é, portanto, ativo em células de microalgas, cianobácté- rias ou bactérias, mas não precisa se originar desse organismo. Deve ser entendido que modificações limitadas podem ser feitas sem destruir a função biológica de um elemento regulatório e que tais modificações limitadas po- dem resultar em elementos regulatórios de algas que têm função substanci- almente equivalente ou intensificada quando comparado com um elemento regulatório de alga do tipo selvagem. Essas modificações podem ser delibe- radas, como através de mutagênese sítio-dirigida ou podem ser acidentais, tal como através de mutação em hospedeiros abrigando o elemento regula- tório. Todas as tais seqüências de nucleotídeo modificadas são incluídas na definição de um elemento regulatório de alga, contanto que a capacidade de conferir expressão em algas verdes unicelulares seja substancialmente reti- da. Atividade ou expressão "aumentada" ou "intensificada" de um gene Dxs ou Dxr se refere a uma alteração na atividade de Dxs ou Dxr. E- xemplos de tal atividade ou expressão aumentada incluem os seguintes. Ati- vidade ou expressão de Dxs ou Dxr de um gene Dxs ou Dxr está aumentada acima do nível daquele do microorganismo de controle não-transgênico do tipo selvagem (isto é, a quantidade de atividade de Dxs ou Dxr ou expressão do gene Dxs ou Dxr está aumentada). Atividade de Dxs ou Dxr ou expressão de um gene Dxs ou Dxr é em uma célula onde normalmente ela não é detec- tada em células não-transgênicas do tipo selvagem (isto é, expressão do gene Dxs ou Dxr está aumentada). Atividade ou expressão de Dxs ou Dxr também está aumentada quando atividade de Dxs ou Dxr ou expressão do gene Dxs ou Dxr está presente em uma célula durante um período de tempo mais longo do que em um controle não-transgênico do tipo selvagem (isto é, duração de atividade de Dxs ou Dxr ou expressão do gene Dxs ou Dxr está aumentada).
"Expressão" de um gene IspS, no contexto da presente inven- ção, se refere, tipicamente, à introdução de um gene IspS em uma célula, por exemplo, microalga, tal como microalga verde, cianobactérias ou bacté- rias fotossintéticas ou não-fotossintéticas, na qual normalmente ele não é expresso. Consequentemente, um "aumento" na atividade ou expressão de IspS é geralmente determinado com relação à células do tipo selvagem, por exemplo, microalgas, cianobactérias ou bactérias fotossintéticas ou não- fotossintéticas, que não têm atividade de IspS.
Uma seqüência de polinucleotídeo é "heteróloga" a uma segun- da seqüência de polinucleotídeo se ela se origina de uma espécie estranha ou, se da mesma espécie, é modificada pela ação humana com relação à sua forma original. Por exemplo, um promotor operavelmente ligado a uma seqüência de codificação heteróloga se refere a uma seqüência de codifica- ção de uma espécie diferente daquela da qual o promotor foi derivado ou, se da mesma espécie, uma seqüência de codificação que é diferente de quais- quer variantes alélicas que ocorrem naturalmente.
Um "polinucleotídeo de IspS" é uma seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou as regiões de codificação de IspS de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou uma seqüência de ácido nucleico que é substancialmente similar à SEQ ID NO: 1 ou as regiões de codificação de IspS de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou uma seqüência de ácido nuclei- co que codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8 ou um polipeptídeo que é substancialmente similar à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8 ou um fragmento ou domínio do mesmo. Assim, um polinucleotídeo de IspS: 1) compreende uma região de cerca de 15 a cerca de 50, 100, 150, 200, 300, 500, 1,000, 1500 ou 2.000 ou mais nucleotídeos, algumas vezes de cerca de 20 ou cerca de 50 a cerca de 1800 nucleotídeos e, algumas ve- zes, de cerca de 200 a cerca de 600 ou cerca de 1500 nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou a região de codificação de IspS de SEQ ID NOs: 3 ou 5; ou 2) hibridiza à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou à região de codificação de IspS de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 ou aos complemen- tos das mesmas, sob condições estringentes ou 3) codifica um polipeptídeo ou fragmento de IspS de pelo menos 50 aminoácidos contínuos, tipicamente de pelo menos 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou 550 ou mais resíduos contínuos de um polipeptídeo de IspS, por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8; ou 4) codifica um polipeptídeo ou fragmento de IspS que tem pelo menos 55%, freqüentemente pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de identidade à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8 ou ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 100, 200, 300, 400, 500 ou 550 resíduos de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8; ou 5) tem uma seqüência de ácido nucleico que tem mais do que cerca de 60%, 65% , 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência de nucleotídeo à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7, pelo menos 80%, 85%, 90% ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ao longo de uma janela de comparação de pelo me- nos cerca de 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou a região de codificação de IspS de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou 6) é amplificada por iniciadores para SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou a região de codificação de IspS de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5. O termo "polinucleotídeo de IspS" se refere a ácidos nucleicos fita simples ou fita dupla. Os ácidos nucleicos de IspS para uso na invenção co- dificam uma IspS ativa que catalisa a conversão de um substrato dimetilalil difosfato em isopreno.
Um "polipeptídeo de IspS" é uma seqüência de aminoácido que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8 ou é substancialmente similar à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8 ou um fragmento ou domínio do mesmo. Assim, um polipeptídeo de IspS pode: 1) ter pelo menos 55% de identidade, tipicamente pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de identidade à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8 ou ao longo de uma janela de comparação de pelo menos 100, tipicamente pelo menos 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8; ou 2) compreender pelo menos 100, tipi- camente pelo menos 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 aminoácidos contínuos de SEQ ID NOs: 2 ou 8; ou 3) se ligar a anticorpos criados contra um imunógeno compreendendo uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2 ou 8 e variantes conservativamente modificadas das mesmas. Um polipeptídeo de IspS, no contexto da presente invenção, é uma proteína fun- cional que catalisa a conversão do substrato dimetilalil fosfato em isopreno.
Conforme usado aqui, um homólogo ou ortólogo de um gene IspS (por exemplo, SEQ ID NO: 1) é um segundo gene no mesmo tipo de planta ou em um tipo de planta diferente que é substancialmente idêntico (determinado conforme descrito abaixo) a uma seqüência no primeiro gene.
Os termos ácidos nucleicos e polipeptídeo de "Dxs" e "Dxr" se referem a fragmentos, variantes e semelhantes. Seqüências de Dxs e Dxr exemplares incluem as seqüências de ácido nucleico e polipeptídeo de Dxs e Dxr reveladas na Publicação de Pedido de Patente U.S. Ng 20030219798, por exemplo, seqüências de Chlamydomonas. As seqüências de Dxs e Dxr da Publicação de Pedido de Patente U.S. NQ 20030219798 são aqui incorpo- radas por referência.
Um "cassete de expressão" se refere a um construto de ácido nucleico o qual, quando introduzido em uma célula hospedeira, resulta em transcrição e/ou tradução de um RNA ou polipeptídeo, respectivamente.
No caso da expressão de transgenes, aqueles versados na téc- nica reconhecerão que a seqüência de polinucleotídeo inserida pode não ser idêntica e pode ser "substancialmente idêntica" a uma seqüência do gene do qual ela foi derivada. Conforme explicado abaixo, essas variantes são espe- cificamente abrangidas pelo termo.
No caso onde a seqüência de polinucleotídeo inserida é transcri- ta e traduzida para produzir um polipeptídeo funcional, aqueles versados na técnica reconhecerão que, em virtude de degeneração de códon, uma série de seqüências de polinucleotídeo codificarão o mesmo polipeptídeo. Essas variantes são especificamente abrangidas pelo termo "seqüência de polinu- cleotídeo de IspS" ou "gene IspS'.
Duas seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeos são men- cionados como sendo "idênticos" se a seqüência de nucleotídeo ou resíduos de aminoácido, respectivamente, nas duas seqüências for a mesma quando alinhada para correspondência máxima, conforme descrito abaixo. O termo "complementar a" é usado aqui para significar que a seqüência é comple- mentar a toda ou uma porção de uma seqüência de polinucleotídeo de refe- rência.
Alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido através do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Add. Apl. Math. 2: 482 (1981), através do algoritmo de alinhamento por ho- mologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), através do método de busca por similaridade de Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), através de implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl) ou através de inspeção.
"Percentual de identidade de seqüência" é determinado compa- rando duas seqüências otimamente alinhadas ao longo uma janela de com- paração, em que a porção da seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) quan- do comparada com a seqüência de referência (a qual não compreende adi- ções ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. O percen- tual é calculado determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as se- quências para proporcionar o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para proporcionar o percen- tual de identidade de seqüência. Uma "janela de comparação", conforme usado aqui, inclui referência a um segmento de qualquer um da série de po- sições contíguas, por exemplo, 20 a 600, usualmente cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150, na qual uma seqüência pode ser comparada com uma seqüência de referência do mesmo número de posições contínuas após as duas seqüências serem otimamente alinha- das.
O termo "identidade substancial", no contexto de seqüências de polinucleotídeo ou aminoácido, significa que um polinucleotídeo ou polipep- tídeo compreende uma seqüência que tem pelo menos 50% de identidade de seqüência a uma seqüência de referência. Alternativamente, o percentual de identidade pode ser qualquer número inteiro de 50% a 100%. Modalida- des exemplares incluem pelo menos: 55%, 57%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade comparado com uma seqüência de referência usando os programas descritos aqui; de preferência, BLAST usando parâmetros predeterminados, conforme descrito abaixo. Consequen- temente, as seqüências de IspS da invenção incluem seqüências de ácido nucleico que têm identidade substancial à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 ou às regiões de codificação de IspS de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5. Conforme mencionado acima, as seqüências de polipeptídeo de IspS da in- venção incluem seqüências de polipeptídeo tendo identidade substancial à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8.
Polipeptídeos que são "substancialmente similares" comparti- lham seqüências conforme mencionado acima, exceto que posições de resí- duo que não são idênticas podem diferir por alterações de aminoácido con- servativas. Substituições de aminoácido conservativas se referem à capaci- dade de permuta de resíduos tendo cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, Ieucina e isoieucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais de hidroxila alifática é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo ca- deias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de ami- noácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofa- no; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é Iisina1 argini- na e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos con- servativos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutâmico e asparagina-glutamina.
Outra indicação de que seqüências de nucleotídeo são substan- cialmente idênticas é se duas moléculas hibridizam uma a outra ou a um terceiro ácido nucleico, sob condições estringentes. A expressão "condições de hibridização estringentes" se refere à condições sob as quais uma sonda hibridizará à sua sub-sequência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácido nucleico, mas não a outras seqüências. Condições estringentes são dependentes da seqüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias.
Seqüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas maio- res. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, condições estringentes são se- lecionadas para ser cerca de 5 a 100C menor do que o ponto de fusão térmi- ca (Tm) para a seqüência específica em um pH e força iônica definidos. A Tm é a temperatura (sob força iônica, pH e concentração de sal definidos) na qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à seqüência alvo em equilíbrio (uma vez que as seqüências alvo estão presentes em ex- cesso, na Tm, 50% das sondas são ocupadas em equilíbrio). Condições es- tringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,0 M de íon de sódio, tipicamente uma concentração de íons de sódio de 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) em um pH de 7,0 a 8,3 e a temperatu- ra é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nu- cleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, mais de 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser obti- das com a adição de agentes de desestabilização, tais como formamida. Para hibridização seletiva e específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes a hibridização de base, opcionalmente 10 vezes a hibridização de ba- se. Condições de hibridização estringentes exemplares podem ser como segue: formamida a 50%, 5X SSC e SDS a 1%, incubação a 42°C ou 5X SSC, SDS a 1%, incubação a 65°C, com lavagem em 0,2X SSC e SDS a 0,1% a 55°C, 60°C ou 65°C. Tais lavagens podem ser realizadas durante 5, 15, 30, 60, 120 ou mais minutos.
Ácidos nucleicos que não hibridizam uns aos outros sob condi- ções estringentes ainda são substancialmente idênticos se os polipeptídeos que eles codificam são substancialmente idênticos. Isso ocorre, por exem- plo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos nucleicos, tipicamente, hibridizam sob condições de hibridização moderada- mente estringentes. Por exemplo, um polinucleotídeo de IspS também pode ser identificado por sua capacidade de hibridizar, sob condições estringentes (por exemplo, Tm ~40°C) às sondas de ácido nucleico tendo a seqüência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7. Tal seqüência de ácido nucleico de IspS pode ter, por exemplo, cerca de 25 a 30% pareamentos errôneos de par de base ou menos com relação à sonda de ácido nucleico selecionada. SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de polinucleotídeo de IspS exemplar. "Condições de hibridização moderadamente estringentes" exemplares incluem uma hibridi- zação em um tampão de formamida a 40%, NaCI a 1 M, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em SSC 1X a 45°C. Tais lavagens podem ser realizadas du- rante 5, 15, 30, 60, 120 ou mais minutos. Uma hibridização positiva é pelo menos duas vezes a de base. Aqueles versados na técnica reconhecerão que condições alternativas de hibridização e lavagem podem ser utilizadas para proporcionar condições de estringência similar. O termo "isolado", quando aplicado a um ácido nucleico ou pro- teína, denota que o ácido nucleico ou proteína é essencialmente isento de outros componentes celulares com os quais ela está associada no estado naturai. Ela está, de preferência, em um estado homogêneo e pode estar seca ou em uma solução aquosa. A pureza e homogeneidade são, tipica- mente, determinadas usando técnicas de química analítica, tais como eletro- forese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em um preparado é substancialmente purificada. Em particular, um gene isolado é separado de fases abertas de leitura que flanqueiam o gene e codificam uma outra proteína que não o gene de interesse.
Conforme usado aqui, "cultura em massa" se refere ao cresci- mento de grandes quantidades de microalgas, cianobactérias ou bactérias fotossintéticas ou não-fotossintéticas que tenham sido modificadas para ex- pressar um gene IspS. Uma "grande quantidade" está, geralmente, na faixa de cerca de 100 litros a cerca de 1.500.000 litros ou mais. Em algumas mo- dalidades, os organismos são cultivados em grandes quantidades em bio- reatores modulares, cada um tendo uma capacidade de cerca de 1.000 a cerca de 1.000.000 litros.
Um "bioreator", no contexto da presente invenção, é qualquer recipiente de grande capacidade fechado no qual microalgas, cianobactérias ou bactérias fotossintéticas ou não-fotossintéticas são cultivadas. Um "reci- piente de grande capacidade", no contexto da presente invenção, pode con- ter cerca de 100 litros, freqüentemente cerca de 500 litros ou cerca de 1.000 litros a cerca de 1.000.000 litros ou mais.
Conforme usado aqui, "coleta" de hidrocarbonetos de isopreno voláteis se refere à captura e seqüestro de tais hidrocarbonetos em um am- biente fechado ou contido.
Seqüências de ácido nucleico de IspS, Dxrou Dxs
A invenção emprega várias técnicas de ácido nucleico recombi- nante de rotina. Geralmente, a nomenclatura e os procedimentos de labora- tório na tecnologia de DNA recombinante descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Muitos manuais que for- necem orientação para realização de manipulações de DNA recombinante estão disponíveis, por exemplo, Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ê Ed, 2001); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel e colaboradores, eds., 1994-1999).
Seqüências de polipeptídeo e ácido nucleico de IspS são conhe- cidas na técnica. Genes de IspS foram isolados e sequenciados de álamo e aspen (duas árvores relacionadas) e kudzu (uma uva). As espécies envolvi- das e as seqüências disponíveis no banco de dados do NCBI são fornecidas abaixo pelo número de acesso, cada uma das quais é incorporada por refe- rência:
mRNA de IspS para isopreno sintase de Populus alba (álamo branco): ACESSO Nq AB198180;
isopreno sintase (IspS) de Populus tremuloides (quaking aspen): ACESSO N5 AY341431 (cds completa);
mRNA de IspS de Populus alba χ Populus tremula: ACESSO NQ AJ294819;
mRNA para isopreno sintase (gene IspS) de Populus nigra (ála- mo Lombardy): ACESSO N9 AM410988;
isopreno sintase (IspS) de Pueraria montaria var. Iobata (uva kudzu): ACESSO Nq AY316691 (cds completa).
O exame dessas seqüências de IspS revela um alto grau de i- dentidades de seqüência de nucleotídeo e aminoácido, por exemplo, se- qüências de cDNA de álamo e aspen híbridas são 98% idênticas a nível de polipeptídeo e nucleotídeo (vide, por exemplo, Sharkey et al., Plant Physiol. 137: 700-712, 1995). A seqüência de nucleotídeo de codificação de isopreno sintase de aspen é 65% idêntica ao gene de kudzu, enquanto que as se- qüências de proteína (sem o peptídeo de trânsito de cloroplasto) são 57% idênticas.
A proteína de IspS de álamo tem uma alta densidade de amino- ácidos cisteína e histidina na metade carbóxi-terminal da proteína. Por e- xemplo, considerando a seqüência de 591 aminoácidos da proteína Cr-IspS (SEQ ID NO: 4), porções de cisteína são encontradas nas posições 34, 326, 378, 413, 484, 505 e 559, isto é, seis das sete cisteínas são encontradas nos 45% inferiores da proteína. Agrupamento adicional de histidinas em várias posições da metade C-terminal da proteína é também observado. Aminoáci- dos cisteína e histidina são conhecidos por participar no enovelamento apro- priado e na estrutura do sítio catalítico de proteínas e podem ser componen- tes importantes para a atividade enzimática. Um alinhamento de quatro pro- teínas de IspS conhecidas mostrando alta conservação de Cys na parte C- terminal da molécula é fornecido na figura 13. Em um caso, a proteína de kudzu tem substituiu uma seqüência de Cys de outra forma conservada por Ser (Cys-509-Ser de Alba ou nigra ou tremuloides) no alinhamento pelo Clustal na figura 13. Serina é uma substituição altamente conservativa para cisteína, uma vez que a única diferença entre os dois aminoácidos é um grupo -OH no lugar do grupo -SH. O fato, o exame das quatro seqüências de IspS revela a propriedade adicional de muitas Serinas conservadas na me- tade C-terminal da proteína. Consequentemente, em algumas modalidades, um ácido nucleico para uso na invenção codifica um polipeptídeo de IspS que compreende os 45% carbóxi-terminais de SEQ ID NO: 2 e retém a ativi- dade cataiítica na conversão de DMAPP em isopreno. Existem outros exem- plos onde uma proteína relacionada em um microorganismo, tal como uma microalga verde, carece de uma porção substancial da porção N-terminal da proteína (com relação à forma da proteína presente em outro microorganis- mo, tal como bactérias) sem efeito adverso sobre a atividade (vide, por e- xemplo, Melis e Happe, Plant Physiol. 127: 740-748, 2001). Consequente- mente, em algumas modalidades, um ácido nucleico de IspS para uso na invenção codifica um polipeptídeo que compreende de cerca do resíduo de aminoácido 330 até a terminação-C de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de IspS codificado pelo ácido nucleico de IspS compreende de cerca do resíduo de aminoácido 300 à terminação-C de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a seqüência de IspS pode, adicionalmente, carecer dos últimos 10, 15 ou 20 resíduos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8. O peptídeo de trânsito da proteína de IspS inclui, minimamente, os aminoácidos 1 a 37 para álamo e aspen e 1 a 45 para kudzu. Com base nessa análise, a proteína madura começa com a seqüência de aminoácido CSVSTEN...", etc. Seqüências de ácido nucleico de IspS para uso na inven- ção não precisam incluir seqüências que codificam um polipeptídeo de trân- sito e ainda omitem a seqüência N-terminal adicional. Por exemplo, o cons- tructo Ss-IspS apresentado na seção EXEMPLOS carece de 52 aminoácidos a partir do DNA do gene sintético de codificação. Isso não teve efeito sobre a síntese e acúmulo de proteína de IspS.
Em algumas modalidades da invenção, uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de IspS de álamo ou aspen (por e- xemplo, SEQ ID NO: 2) é usada. Em outras modalidades, uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de IspS de kudzu (por exemplo, SEQ ID NO: 8) é usada. Os polipeptídeos de IspS codificados pelos ácidos nucleicos empregados nos métodos da invenção têm a atividade catalítica de conversão de DMAPP em isopreno. Tipicamente, o nível de atividade é equivalente à atividade exibida por um polipeptídeo de IspS de álamo ou aspen (por exemplo, codificado por SEQ ID NO: 1) ou um polipeptídeo de IspS de kudzu natural (por exemplo, codificado por SEQ ID NO: 7).
Seqüências de Dxs e Dxr exemplares incluem as seqüências de ácido nucleico e polipeptídeo de Dxs e Dxr reveladas na Publicação de Pe- dido de Patente U.S. N- 20030219798, por exemplo, seqüências de C- hlamydomonas. As seqüências de Dxs e Dxr da Publicação de Pedido de Patente U.S. Nq 20030219798 são aqui incorporadas por referência.
Isolamento ou geração de seqüências de polinucleotídeo de IspS, Dxr ou Dxs pode ser obtida através de uma série de técnicas. Clona- gem e expressão de tal técnica será dirigida ao contexto de genes de IspS. Contudo, as mesmas técnicas podem ser usadas para isolar e expressar polinucleotídeos de Dxr ou Dxs. Por exemplo, sondas de oligonucleotídeo baseadas nas seqüências divulgadas aqui podem ser usadas para identificar o polinucleotídeo desejado em uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico a partir de uma espécie de planta desejada. Talm biblioteca de cDNA ou ge- nômica pode então ser pesquisada usando uma sonda baseada na seqüên- cia de um gene de IspS clonado, por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7. Sondas podem ser usadas para hibridizar com seqüências de DNA genômico ou cDNA para isolar genes homólogos na mesma ou diferentes espécies de planta.
Alternativamente, os ácidos nucleicos de interesse podem ser amplificados a partir de amostras de ácido nucleico usando técnicas de am- plificação. Por exemplo, PCR pode ser usada para amplificar as seqüências dos genes diretamente a partir de mRNA, de cDNA, de bibliotecas genômi- cas ou bibliotecas de cDNA. PCR e outros métodos de amplificação in vitro também podem ser úteis, por exemplo, para clonar seqüências de ácido nu- cleico que codificam proteínas a serem expressas, para fazer ácidos nuclei- cos para uso como sondas para detecção da presença do mRNA desejado em amostras, para sequenciamento de ácido nucleico ou para outras finali- dades.
Iniciadores e sondas apropriadas para identificação de um gene de IspS de células de planta, por exemplo, álamo ou outra árvore decídua, podem ser gerados a partir de comparações das seqüências fornecidas aqui. Para uma visão geral de PCR veja PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (lnnis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. e White, T., eds.), Acadèmic Press, San Diego (1990). Uma PCR exemplar para amplificação de uma se- qüência de ácido nucleico de IspS é fornecida nos exemplos.
O gênero das seqüências de ácido nucleico de IspS para uso na invenção inclui genes e produtos genéticos identificados e caracterizados através de técnicas tais como hibridização e/ou análise de seqüência usando seqüências de ácido nucleico exemplares, por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 e seqüências de proteína, por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 8.
Preparo de vetores recombinantes
Para usar seqüências isoladas nas técnicas acima, vetores de DNA recombinantes adequados para transformação de células de microal- gas verdes, cianobactérias e bactérias fotossintéticas ou não fotossintéticas são preparados. Técnicas para transformação são bem conhecidas e descri- tas na literatura técnica e científica. Por exemplo, uma seqüência de DNA que codifica um gene IspS (descrito em maiores detalhes abaixo) pode ser combinada com seqüências regulatórias de transcrição e outras as que diri- girão a transcrição da seqüência a partir do gene nas células pretendidas das algas, cianobactérias ou bactérias transformadas. Em algumas modali- dades, um vetor de expressão que compreende um cassete de expressão que compreende o gene IspS ainda compreende um promotor operavelmen- te ligado ao gene IspS. Em outras modalidades, um promotor e/ou outros elementos regulatórios que dirigem a transcrição do gene IspS são endóge- nos ao microorganismo e o cassete de expressão compreendendo o gene IspS é introduzido, por exemplo, através de recombinação homóloga, de modo que o gene IspS heterólogo esteja operavelmente ligado a um promo- tor endógeno e a expressão é dirigida pelo promotor endógeno.
Seqüências regulatórias incluem promotores, os quais podem ser constitutivos ou induzíveis. Em algumas modalidades, um promotor pode ser usado para dirigir a expressão de ácidos nucleicos de IspS sob a influên- cia de condições ambientais capazes de modificação. Exemplos de condi- ções ambientais que podem realizar transcrição através de promotores indu- zíveis incluem condições anaeróbicas, temperatura elevada ou a presença de luz. Promotores que são induzíveis pela exposição a reagentes químicos também são usados para expressar ácidos nucleicos de IspS. Outros ele- mentos regulatórios induzíveis incluem elementos regulatórios induzíveis por cobre (Mett et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 90: 4567-4571 (1993); Furst et al., Cell 55: 705-717 (1988)); elementos regulatórios tetraciclina- e chlor- tetraciclina-induzíveis (Gatz et al., Plant J. 2: 397-404 (1992); Roder et al., Mol. Gen. Genet. 243: 32-38 (1994); Gatz, Meth. Cell BioL 50: 411- 424(1995)); elementos regulatórios induzíveis por eedisona (Christopherson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 6314-6318 (1992); Kreutzweiser et al., 30 Ecotoxicoi Environ. Safety 28: 14-24 (1994)); elementos regulatórios induzí- veis por choque térmico (Takahashi et al., Plant Physioi 99: 383-390 (1992); Yabe et al., Plant Cell Physioi 35: 1207-1219 (1994); Ueda et al., Mol. Gen. Genet. 250: 533-539 (1996)); e elementos do óperon lac, os quais são usa- dos em combinação com um repressor Iac constitutivamente expresso para conferir, por exemplo, expressão induzível por IPTG (Wilde e colaboradores, EMBO J. 11: 1251-1259 (1992)). Um elemento regulatório induzível também pode ser, por exemplo, um promotor induzível por nitrato, por exemplo, deri- vado do gene de nitrito redutase de espinafre (Back et al., Plant Mol. Biol. 17: 9 (1991)) ou um promotor induzível pela luz, tal como aquele associado à pequena subunidade da RuBP carboxilase ou famílias do gene de LHCP (Feinbaum et al., Mol. Geri. Genet. 226: 449 (1991); Lam e Chua, Science 248: 471 (1990)) ou luz.
Em um exemplo, uma seqüência promotora que é responsiva à luz pode ser usada para direcionar a expressão de um constructo de ácido nucleico de IspS que é introduzido em Chlamydomonas que é exposto à luz (por exemplo Hahn, Curr Genet 34: 459-66, 1999; Loppes, Plant Mol Biol 45: 215-27, 2001; Villand, Biochem J., 327: 51-7, 1997). Outros sistemas de promotor induzível pela luz também podem ser usados, tal como o sistema de fitocromo/PIF3 (Shimizu-Sato, Nat Biotechnol 20:1041-4, 2002). Ainda, pode ser usado um promotor que é também responsivo ao calor para dire- cionar a expressão em algas, tal como Chlamydomonas (Muller, Gene 111: 165-73, 1992; von Gromoff, Mol Cell Biol 9: 3911-8, 1989). Promotores adi- cionais, por exemplo, para expressão em algas, tais como microalgas ver- des, incluem os promotores de RbcS2 e PsaD (veja, por exemplo, Stevens et al., Mol. Gen. Genet. 251: 23-30, 1996; Fischer & Rochaix, Mol Genet Ge- nomics 265: 888-94, 2001).
Em algumas modalidades, o promotor pode ser de um gene as- sociado à fotossíntese na espécie a ser transformada ou outra espécie. Por exemplo, tal promotor de uma espécie pode ser usado para dirigir a expres- são de uma proteína em células de alga transformadas ou células de outro organismo marinho fotossintético. Promotores adequados podem ser isola- dos de ou sintetizados com base em seqüências conhecidas de outros orga- nismos fotossintéticos. Promotores preferidos são aqueles para genes de outras espécies fotossintéticas que são homólogos aos genes fotossintéticos do hospedeiro de alga a ser transformado. Por exemplo, uma série de pro- motores de coleta leve de proteína de ligação à clorofila de fucoxantina fo- ram identificados em Phaeodactylum tricornutum (veja, por exemplo, Apt et ai., Mol Geri. Genet. 252: 572-579, 1996). Em outras modalidades, um pro- motor da proteína de ligação à clorofila de carotenóide, tal como aquele da proteína de ligação à clorofila de peridinina, pode ser usado.
Em algumas modalidades, um promotor usado para direcionar a expressão de um gene IspS heterólogo é um promotor constitutivo. Exem- plos de promotores fortes constitutivos para uso em microalgas incluem, por exemplo, os promotores dos genes atpA, atpB e rbcL. Vários promotores que são ativos em cianobactérias também são conhecidos. Esses incluem promotores tais como o promotor (constitutivo) do gene psbA3 em cianobac- térias e promotores tais como aqueles apresentados na Publicação de Pedi- do de Patente U.S. N9 20020164706, a qual é incorporada por referência. Outros promotores que são operativos em plantas, por exemplo, promotores derivados de vírus de planta, tais como os promotores CaMV35S, também podem ser empregados em algas.
Em algumas modalidades, promotores são identificados através de análise das seqüências 5' de um clone genômico correspondendo a um gene IspS. Características de seqüência das seqüências do promotor podem ser usadas para identificar o promotor.
Um promotor pode ser avaliado, por exemplo, testando a capa- cidade do promotor de acionar expressão em células de planta, por exemplo, algas verdes, nas quais se deseja introduzir uma estrutura de expressão de IspS.
Um vetor compreendendo seqüências de ácido nucleico de IspS compreenderão, tipicamente, um gene marcador que confere um fenotipo selecionável à algas ou células bacterianas. Tais marcadores são conheci- dos. Por exemplo, o marcador pode codificar resistência a antibiótico, tal como resistência à canamicina, G418, bleomicina, higromicina e semelhan- tes. Em algumas modalidades, marcadores selecionáveis para uso em C- hlamydomonas podem ser marcadores que proporcionam resistência à es- pectinomicina (Fargo, Mol Cell Biol 19: 6980-90, 1999), resistência à cana- micina e amicacina (Bateman, Mol Gen Genet 263: 404-10, 2000), resistên- cia à zeomicina e fleomicina (Stevens, Mol Gen Genet 251: 23-30, 1996) e resistência à paramomicina e neomicina (Sizova, Gene 277: 221-9, 2001).
Seqüências de ácido nucleico de IspS da invenção são expres- sas recombinantemente em microorganismos, por exemplo, microalgas, cia- nobactérias ou bactérias fotossintéticas ou não fotossintéticas. Conforme apreciado por aqueles versados na técnica, estruturas de expressão podem ser desenhados levando-se em contra propriedades, tais como freqüências de uso de códon do organismo no qual o ácido nucleico de IspS tem de ser expresso. As freqüências de uso de códon podem ser calculadas usando métodos conhecidos (vide, por exemplo, Nakamura e colaboradores, Nuci Acids Res. 28: 292, 2000). Tabelas de freqüência de uso de códon, incluindo aquelas para microalgas e cianobactéria, também estado disponíveis na téc- nica (por exemplo, em bancos de dados de uso de códon do Department of Plant Genome Research, Kazusa DNA Research Institute (www.kazusa.or jp/codon).
Métodos de transformação de célula e marcadores selecionáveis para bactérias e cianobactérias são bem conhecidos na técnica (Wirth, Mol Gen Genet, Março de 1989; 216(1): 175-7; Koksharova, Appl Microbioi Bio- technol, Fevereiro de 2002; 58(2): 123-37; Thelwell). Métodos de transfor- mação e marcadores selecionáveis para uso em bactérias são bem conheci- dos (vide, por exemplo, Sambrook et al., supra).
Em microalgas, por exemplo, microalgas verdes, os genomas nuclear, mitocondrial e de cloroplasto são transformados através de uma variedade de métodos conhecidos, incluindo através de bombardeamento de partícula ou usando um método com pérolas vidro (veja, por exemplo, Kin- dle, J. Cell Biol 109: 2589-601, 1989; Kindle, Proc. NatL Acad. Sei. USA 87: 1228-32, 1990; Kindle, Proc. Nati Acad. Sci USA 88: 1721-5, 1991; Shimo- gawara, Genetics 148: 1821-8, 1998; Boynton, Science 240: 1534-8, 1988; Boynton, Methods Enzymol 264: 279-96, 1996; Randolph-Anderson, Mol Gen Genet 236: 235-44, 1993). Em algumas modalidades, um gene IspS é introduzido no cloroplasto de uma microalga. Em outras modalidades, um gene IspS é introduzido no núcleo.
As técnicas descritas aqui para obtenção e expressão de se- qüências de ácido nucleico de IspS em microalgas, cianobactérias ou bacté- rias fotossintéticas ou não fotossintéticas também podem ser empregadas para expressar seqüências de ácido nucleico de Dxrou Dxs. Microorganismos que podem ser atingidos
IspS pode ser expresso em uma série de microalgas, por exem- plo, algas verdes, ou cianobactérias ou bactérias fotossintéticas ou não fo- tossintéticas onde é desejável produzir isopreno. Microalgas, cianobactérias ou bactérias (bactérias fotossintéticas ou bactérias não fotossintéticas) que expressam um gene IspS heterólogo são crescidas sob condições de cultura em massa para a produção de hidrocarbonetos, por exemplo, a serem usa- dos como uma fonte de combustível ou como estoque de alimentação em química sintética. Os organismos transformados são crescidos em bioreato- res ou fermentadores que proporcionam um ambiente fechado para conter os hidrocarbonetos. Em modalidades típicas para cultura em massa, as mi- croalgas, cianobactérias ou bactérias são crescidas em bioreatores fechados em quantidades de pelo menos cerca de 500 litros, freqüentemente de pelo menos cerca de 1000 litros ou mais e, em algumas modalidades, em quanti- dades de cerca de 1.000.000 litros ou mais.
Em algumas modalidades, IspS é expressa em microalgas. Al- gas, algae ou semelhante se referem às plantas pertencendo ao subfilo Al- gae do filo Thallophyta. As algas são algas plantas unicelulares, fotossintéti- cas, oxigênicas e são não parasíticas sem raízes, caules ou folhas; elas con- têm clorofila e têm uma grande variedade de tamanho, de microscópicas a grandes algas marinhas. Algas verdes, as quais são organismos eucariotas unicelulares de fotossíntese oxigênica dotada de clorofila a e clorofila b per- tencendo a Eukaryota --Viridiplantae--Chlorophyta-ChIorophyceae, são fre- quentemente um alvo preferido. Por exemplo, IspS pode ser expresso em C. reinhardtli, a qual é classificada como Volvocales--Chlamydomonadaceae. Gêneros de algas que podem ser usados na presente invenção incluem, por exemplo, Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus obliquous, Chlorella vulgaris, Botryococcus braunii, Botryococcus sudetieus, Dunaliella salina e Haematocoeeus pluvialis.
Métodos de cultura em massa de algas são conhecidos. Por e- xemplo, algas podem ser crescidas em fotobioreatores de alta densidade (veja, por exemplo, Lee et al., Bioteeh. Bioengineering 44: 1161-1167, 1994; Chaumont, J. AppI. Phyeology 5: 593-604, 1990), bioreatores tais como a- queles para tratamento de águas potáveis e água residual (por exemplo, Sawayama et al., AppI. Micro. Bioteeh., 41: 729-731, 1994; Lincoln, Bulletin
De Uinstitut Oeeangraphique (Mônaco), 12: 109-115, 1993), cultura em massa para eliminação de metais pesados de água contaminada (por exem- plo, Wilkinson, Bioteeh. Letters, 11: 861-864, 1989), cultura em massa para a produção de β-caroteno (por exemplo, Yamaoka, Seibutsu-Kogaku Kaishi, 72: 111-114, 1994), hidrogênio (por exemplo, Publicação de Pedido de Pa- tente U.S. Ne 20030162273) e compostos farmacêuticos (por exemplo, Can- nell, 1990), bem como suplementos nutricionais para seres humanos e ani- mais (Becker, 1993, Bulletin De Uinstitut Oceanographique (Mônaco), 12, 141-155) e para a produção de outros compostos de valor nutricional.
Condições para crescimento de algas ou bactérias expressando IspS para as finalidades exemplificativas ilustradas acima são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, referências exemplares citadas aqui). Hidrocar- bonetos de isopreno voláteis produzidos pelos microorganismos modificados podem ser coletados usando técnicas conhecidas. Hidrocarbonetos de iso- preno são não miscíveis em água e eles se elevam e flutuam na superfície do meio de crescimento de microorganismo. Eles são drenados da superfície e capturados em recipientes adequados. Além disso e, dependendo da tem- peratura que prevalece durante a cultura em massa dos microorganismos, isopreno pode existir na forma de vapor acima do meio aquoso no recipiente do bioreator (temperatura de ebulição do isopreno, T = 34°C). Vapor de iso- preno é canalizado do recipiente do bioreator e condensado na forma de combustível líquido por resfriamento ou compressão em baixo nível.
EXEMPLOS Os exemplos descritos aqui são fornecidos como forma de ilus- tração apenas e não como forma de limitação. Aqueles versados na técnica reconhecerão prontamente uma variedade de parâmetros não críticos que poderiam ser alterados ou modificados para proporcionar resultados essen- cialmente similares.
Exemplo 1. Desenho e expressão do novo gene de Cr-IspS para produção de hidrocarboneto de isopreno em microalqas
Um constructo de DNA sintético códon-ajustado foi gerado ba- seado na seqüência de proteína de isopreno sintase (IspS) nuclear- codificada conhecida de Populus alba (álamo). Essa seqüência de aminoá- cido (SEQ ID NO: 2) foi usada como um molde para o desenho de novo de uma seqüência de DNA de IspS para expressão do gene no cloroplasto da microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii. Para fins da presente inven- ção, esse gene foi denominado Cr-IspS. Características desse gene incluí- am: (1) Uso de códon era diferente daquele do álamo e especificamente se- lecionado para se adaptar ao uso de códon do cloroplasto de Chlamydomo- nas reinhardtir, (2) A seqüência de direcionamento de cloroplasto de álamo da proteína foi omitida do desenho do novo gene Cr-IspS; (3) Três cópias de um gene códon-otimizado que codifica o sinalizador de epítopo de hemaglu- tinina (HA) foram fundidas a montante do gene IspS.
A seqüência de DNA de Cr-IspS (SEQ ID NO:3) foi desenhada para codificar a proteína de isopreno sintase (SEQ ID NO: 4) especificamen- te no cloroplasto de microalgas, por exemplo, Chlamydomonas reinhardtii. Ajustes de uso de códon para expressão do gene no cloroplasto de Chlamy- domonas foram feitos com base na tabela de uso de códon para o cloroplas- to 6803 de Chlamydomonas reinhardtii, listada na seguinte URL: http://www.bio.net/bionet/mm/chlamv/1997-March/000843.html.
SEQ ID NO:4 também contém três cópias do sinalizador de he- maglutinina, as quais estão sublinhadas no lado N-terminal da seqüência. Sítios de reconhecimento de enzima de restrição foram introduzidos nas ex- tremidades da seqüência de DNA de Cr-IspS para facilitar a clonagem do gene e a seqüência toda foi sintetizada e clonada em um plasmídeo trans- portador.
Um cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii transgênico foi gerado, o qual expressa o gene de isopreno sintase recombinante códon- otimizado (Cr-IspS). Isso foi obtido construindo um gene quimérico (figura 4 superior, Cr-IspS) contendo o promotor de atpA (PatpA), fundido à extremi- dade 5'UTR de um DNA sinalizado com epítopo de hemaglutinina (HA) có- don-otimizado com três cópias (figura 4). Essa seqüência de DNA foi segui- da pela região de codificação de Cr-IspS (figura 4), seguido pela 3'UTR de atpA (figura 4, TatpA). Integração do gene quimérico construído no genoma de cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii foi obtida usando transforma- ção biolística e recombinação homóloga, requerendo homologia de seqüên- cia entre o vetor de transformação e o genoma do cloroplasto (Boynton e colaboradores, Science, 240: 1534-1538, 1988). Para essa finalidade, o ve- tor p322 foi empregado, o qual contém um genoma de cloroplasto de C. rei- nhardtii parcial para o alvo de recombinação homóloga (Franklin et al., Plant J., 30: 733-744, 2002). Conforme mostrado no diagrama da figura 4, o gene Cr-IspS quimérico foi ligado ao sítio de Bamlll de p322 para gerar o plasmí- deo pApISAt. O constructo pApISAt foi co-transformado no cloroplasto da cepa CC503 de C. reinhardtii por meio de bombardeamento de partícula (Boynton et al., Science, 240: 1534-1538, 1988), junto com o plasmídeo p228, contendo um gene ribossômico 16S modificado que confere resistên- cia à espectinomicina (Franklin et al., PIantJ., 30: 733-744, 2002). Os inicia- dores N e C na figura 4 marcam o local de anelamento dos iniciadores que foram usados para a subsequente seleção por PCR entre transformantes resistentes à espectinomicina isolados.
A figura 5 proporciona um exemplo da análise através de sele- ção por PCR genômica de transformantes primários que foram selecionados em meio contendo espectinomicina com relação à presença de regiões Ν- ου C-terminais do gene quimérico Cr-IspS de forma a selecionar transfor- mantes de Cr-IspS de C. reinhardtii. Mais de cem colônias de transformantes resistentes à espectinomicina de Chlamydomonas reinhardtii foram isoladas e testadas, dentre as quais descobriu-se que duas linhagens independentes (N5 9 e Nq 20) contêm inequivocadamente o gene Cr-IspS estavelmente in- tegrado em seu DNA de cloroplasto. Um transformante resistente à especti- nomicina (N9 7, não mostrado) foi usado como controle negativo para a aná- lise por PCR e o piasmídeo pApISAt serviu como um molde para o controle positivo. Os iniciadores NeC representam o conjunto de primer usado para amplificação e seus locais de anelamento são mostrados na figura 4.
DNA genômico do controle Chlamydomonas reinhardtii (N9 7) e a linhagem transformante de Cr-IspS putativa N9 9 foram digeridos com Bamll- I, separados em um gel de Agarose e submetidos à análise por Southern blot de forma a testar a integridade do transgene Cr-IspS. Hibridização com um fragmento de Ndel/Xbal radio marcado da região de codificação de Cr- IspS identificou uma banda de ~ 3,0 kbp exclusivamente na linhagem de transformante N9 9 de Cr-IspS, enquanto que nenhuma banda detectável pôde ser observada na fileira da linhagem de controle N9 7 (figura 6A). Es- ses resultados validaram a integração estável de Cr-IspS no genoma de clo- roplasto da linhagem de transformante N9 9 de Chlamydomonas reinhardtii e são consistentes com os resultados da análise por PCR (figura 5). Coloração com brometo de etídio do gel de agarose (figura 6B) testou a quantidade igual de aplicação de DNA. Resultados similares foram obtidos com a Iinha- gem transformante N9 20 de Cr-IspS (não mostrado).
Acúmulo de proteína Cr-IspS na linhagem transgênica de C- hlamydomonas reinhardtii N9 9 foi verificado através de análise por Western blot (figura 7) de forma a demonstrar expressão do gene Cr-IspS. Anticorpo anti-sinalizador HA (a-HA) foi usado para avaliar a presença da proteína Cr- IspS recombinante e sua concentração celular. Três cópias de tag de hema- glutinina (HA) foram introduzidas em uma posição precedendo o gene Cr- IspS que codifica a proteína madura (figura 7A), para servir como um epíto- po conveniente para a detecção de acúmulo de proteína Cr-IspS. Células de Chlamydomonas reinhardtii foram concentradas para 500 χ 106 células/ml em tampão HEPES a 50 mM (pH de 7,0) e rompidas através de agitação com glóbulos de vidro durante 5 min para liberar a fração solúvel de cloro- plasto. Frações de proteína solúvel, as quais correspondem a 10 ou 20 μg de clorofila, foram submetidas a SDS-PAGE e análise por Western blot com anticorpos policlonais anti-HA específicos. Uma reação cruzada de anticor- po-proteína clara foi observada na banda de cerca de 67 kD nas fileiras apli- cadas com amostra da linhagem Nq 9 do transformante de Chlamydomonas reinhardtii, mas não no controle (C N9 7) (figura 7B). Além disso, reações cruzadas de anticorpo-proteína foram observadas em aproximadamente 38 kD, indicado por um asterisco na figura 5B. Acúmulo de proteína Cr-IspS como uma banda de 38 kD poderia indicar um término prematuro de tradu- ção de mRNA de Cr-IspS ou uma atividade de degradação específica sobre a proteína recombinante. Não havia bandas de 67 kD ou 38 kD detectáveis na fileira de controle (C N9 7). A aparente reação cruzada correspondendo a uma proteína de 34 kD provavelmente é uma ligação inespecífica do anti- corpo primário ou secundário a uma proteína de Chlamydomonas reinhardtii. Expressão da proteína Cr-IspS também foi detectada na linhagem de trans- formante N9 20 (não mostrado).
Exemplo 2. Desenho e expressão de um gene Ss-IspS para produção de hidrocarboneto isopreno em cianobactérias
De forma a expressar produção de hidrocarboneto isopreno em cianobactérias, uma estrutura de DNA sintética códon-ajustada foi gerada, com base na seqüência de proteína de isopreno sintase IspS conhecida de Populus alba (álamo). Essa seqüência de aminoácido foi usada como um molde para o desenho de novo de uma seqüência de DNA de IspS para ex- pressão do gene em cianobactérias, por exemplo, Synechocystis sp. Ajustes de uso de códon para expressão do gene em cianobactérias foram feitos com base na Tabela de uso de códon para Synechocystis PCC 6803, listada na seguinte URL: http://qib.qenes.niq.ac.ip/sinqle/codon/main.php7spid= Sv- ne PCC6803.
O gene códon-ajustado é referido aqui como Ss-IspS. Caracte- rísticas desse gene incluem: (1) Uso de códon era diferente daquele do ála- mo e especificamente selecionado para se adaptar ao uso de códon de Sy- nechocystis; (2) A seqüência de direcionamento de cloroplasto de álamo da proteína foi omitida do desenho do novo gene Ss-IspS. A seqüência de DNA foi desenhada para codificar a proteína de isopreno sintase especificamente em cianobactérias, por exemplo, Synechocystis. A primeira seqüência subli- nhada de SEQ ID NO: 5 representa o gene de beta-lactamase (o comple- mento reverso), enquanto que a segunda seqüência sublinhada é o DNA de Ss-IspS. Adicionalmente, as seqüências em itálico são códons inicial e ter- minal e as seqüências em negrito são sítios de restrição para clonagem. Sí- tios de reconhecimento de enzima de restrição foram introduzidos nas ex- tremidades da seqüência de DNA de Ss-IspS recentemente desenhada para facilitar a clonagem do gene e toda a seqüência foi sintetizada e clonada em um plasmídeo transportador (figura 8).
O gene Ss-IspS códon-otimizado, com comprimento ajustado e quimicamente sintetizado foi clonado à jusante da região do promotor psbA3 de Synechocystis, em fase com o códon inicial ATG do gene psbA3. O gene Ss-IspS foi seguido por um terminador de transcrição e um cassete de resis- tência à gentamicina e, após, pela seqüência de Synechocystis imediata- mente à jusante do gene psbA3 (figura 8).
Essa novo constructo permitiu recombinação homóloga, isto é, inserção da seqüência de DNA de Ss-IspS no genoma de Synechocystis através de substituição do gene psbA3 endógeno via recombinação homólo- ga (figura 10). Seleção de transformantes de Synechocystis pôde ser feita usando gentamicina (Gm) como o marcador selecionável e o promotor forte psbA3 direciona a expressão do gene Ss-IspS.
De forma a transformar Synechocystis com o constructo de Ss- IspS, células de Synechocystis sp. foram crescidas em um meio de cultiva- das BG11 básico na presença de glicose a 5 mM, até a densidade celular atingir cerca de 50 χ 10^6 células/ml"1 (OD73O = 0,5). As células foram, então, coletadas e concentradas para 1010 células/ml"1, misturadas com o plasmí- deo pAIGA para transformação e incubadas durante 4 a 6 h antes de disper- são da mistura sobre filtros por cima de lâminas de Ágar contendo BG11, também contendo 0,5 μg/ml de Gm, tiossulfato de sódio a 0,3% e TES- NaOH a 10 mM, pH de 8,0.
As placas de Petri foram mantidas sob baixa intensidade de luz durante 1 a 2 dias e, após isso, movidas para condições de crescimento nor- mais. Os filtros foram transferidos para placas contendo Gm fresco uma vez por semana e aquelas formadas na presença do marcador selecionável Gm foram isoladas e reestriadas sobre filtros frescos, seguido por transferência para meio de crescimento líquido BG11 sob condições seletivas contínuas na presença de Gm.
Exemplo 3. Expressão de IsdS His-taaaed em Escherichia coli
De forma a construir o vetor para expressão do gene IspS His- sinalizado em E. coli, DNA de Ss-IspS, códon-otimizado para expressão em cianobactérias, foi amplificado através de PCR usando os iniciadores: lspS_F_Ndel, 5 '-CTGGGTCATATGGAAGCTCGACGAA-3' e lspS_R_Hindlll, 5'-ATGGAAAACCTGAAGCTTTTAACGTTCAA-3'; introduzindo o sítio de Ndel e um sítio de Hindlll nas extremidades 5' e 3' do gene, respectivamente. Esses sítios foram usados para clonar o gene no vetor de expressão pET1529, formando o vetor pETIspS, o qual traz um si- nalizador de His na extremidade N-terminal da proteína (figura 11).
De forma a demonstrar expressão de Ss-IspS His sinalizado re- combinante em Escherichia coli, bactérias E. coli foram transformadas com o plasmídeo pETIspS, o qual contém o gene Ss-IspS e um DNA codificante de sinalizador de His na extremidade 5' do gene Ss-IspS. Expressão com su- cesso desse gene His-Ss-IspS em E. coli foi induzida pela da adição de IPTG a 0,1 mM à cultura celular líquida. As células foram coletadas e seu teor de proteína foi analisado através de SDS-PAGE e coloração com Coo- massie (figura 12). Foi demonstrado que todos os clones trazendo o plasmí- deo pETIspS estavam expressando a proteína His-Ss-IspS de ~65kD (figura 12, banda de -65 kD).
Uma compreensão e demonstração similares de expressão do gene IspS e acúmulo de proteína de IspS recombinante em bactérias, por exemplo, Escherichia coli, foram conduzidas com sucesso com o gene Cr- IspS, códon-otimizado para expressão em algas verdes unicelulares, por exemplo, Chlamydomonas reinhardtii (resultados não mostrados).
Todas as publicações, números de acesso e pedidos de patente citados no presente relatório descritivo são aqui incorporados por referência como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.
Seqüências de IspS Exemplares:
SEQ ID NO: 1 - cDNA de Populus alba para isopreno sintase, N- Acesso AB198180
1 atggcaactg aattattgtg cttgcaccgt ccaatctcac tgacacacaa acttttcaga 61 aatcccttac ctaaagtcat ccaggccact cccttaactt tgaaactcag atgttctgta 121 agcacagaaa acgtcagctt cacagaaaca gaaacagaag ccagacggtc tgccaattat 181 gaaccaaata gctgggatta tgattatttg ctgtcttcag acactgacga atcgattgag 241 gtatacaaag acaaggccaa aaagctggag gctgaggtga gaagagagat taacaatgaa 301 aaggcagagt ttttgactct gcttgaactg atagataatg tccaaaggtt aggattgggt 361 taccggttcg agagtgacat aaggggagcc cttgatagat ttgtttcttc aggaggattt 421 gatgctgtta caaaaactag ccttcatggt actgctctta gcttcaggct tctcagacag 481 catggttttg aggtctctca agaagcgttc agtggattca aggatcaaaa tggcaatttc 541 ttggaaaacc ttaaggagga catcaaggca atactaagcc tatatgaagc ttcatttctt 601 gcattagaag gagaaaatat cttggatgag gccaaggtgt ttgcaatatc acatctaaaa 661 gagctcagcg aagaaaagat tggaaaagag ctggccgaac aggtgaatca tgcattggag 721 cttccattgc atcgcaggac gcaaagacta gaagctgttt ggagcattga agcataccgt 781 aaaaaggaag atgcaaatca agtactgcta gaacttgcta tattggacta caacatgatt 841 caatcagtat accaaagaga tcttcgcgag acatcaaggt ggtggaggcg agtgggtctt 901 gcaacaaagt tgcattttgc tagagacagg ttaattgaaa gcttttactg ggcagttgga 961 gttgcgttcg agcctcaata cagtgattgc cgtaattcag tagcaaaaat gttttcattt 1021 gtaacaatca ttgatgatat ctatgatgtt tatggtactc tggacgagtt ggagctattt
1081 acagatgctg ttgagagatg ggatgttaat gccatcaatg atcttccgga ttatatgaag
1141 ctctgcttcc tagctctcta caacactatc aatgagatag cttatgacaa tctgaaggac
1201 aagggggaaa acattcttcc atacctaaca aaagcgtggg cagatttatg caatgcattc
1261 ctacaagaag caaaatggtt gtacaataag tccacaccaa catttgatga ctatttcgga
1321 aatgcatgga aatcatcctc agggcctctt caactagttt ttgcctactt tgccgtggtt
1381 caaaacatca agaaagagga aattgaaaac ttacaaaagt atcatgatac catcagtagg
1441 ccttcccaca tctttcgtct ttgcaacgac ctggcttcag catcggctga gatagcgaga
1501 ggtgaaacag cgaattctgt atcatgctac atgcgtacaa aaggcatttc tgaggagctt
1561 gctactgaat ccgtaatgaa cttgatcgac gaaacctgga aaaagatgaa caaagaaaag
1621 cttggtggct ctttgtttgc aaaacctttt gtcgaaacag ctattaacct tgcacggcaa
1681 tcccattgca cttatcataa cggagatgcg catacttcac cagacgagct aactaggaaa
1741 cgtgtcctgt cagtaatcac agagcctatt ctaccctttg agagataa
SEQ ID NO: 2 - Seqüência de polipeptídeo de Populus alba para isopreno sintase (do N5 de Acesso AB198180). A porção sublinhada da proteína de- nota um peptídeo de trânsito em cloroplasto.
MATELLCLHRPISLTHKLFRNPLPKVIOATPLTLKLRCSVSTENVSFTETETEARRSAN YEPNSWDYDYIXSSDTDESFFIWKDÍCAKKLEAEVIMEINNEKAEFLTLLELIDNVQR LGLGYRFESDIRGALDRFVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFK DQNGNFLENLKEDIKA1LSLYEASFLALEGENILDEAKVFA1SHLKELSEEKIGKELAE QVNHALELPLHRRTQRLEAVWSIEAYRKKEDANQVLLELAILDYNMIQSVYQRDLR ETSRWWRRVGLATKLHFARDRLIESFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVTNDD IYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNAINDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGE NILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAV VQNIKKEETENLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSVSCYMRTKGISE ELATES VMNLIDETWKXMNKEKIGGSLFAKPFVETAINRLARQSHCTYHNGDAHTSP DELTRKRVLSVITEPILPFER
SEQ ID NO: 3 - Gene Cr-lspS e sinalizador de hemaglutinina para transfor- mação/expressão em algas verdes unicelulares. A seqüência de lspS come- ça com o códon sublinhado "CCA". atgtatccttatgatgttccagactacgcaggitatccttatgatgtaccagactatgca ggttatcctnacgatgt acc1gattacgcrggtccatggtgitctg'rtagtactgaaaatg tttcattractgaaacagaaacagaagcacgtagatcágcáaattatgagccaaatagt tgggattatgactattt attatct agtgatacagalgaatcrattgaagtatat aaagat aaagc aaaaaaattagaagcágaagtacgtcgtgaaattaataacgaaâaagcagaat ttcitacittattagaattaattgataatgtacaacgtitaggttraggt^ atcagacattcgtggtgcattagatcgttttgtatcaagtggtggtittgatgctgttaca aaaact agtttacatggtactgctttaagttttcgttracttcgtcaacatggt^ taagtcaagaagctttttctggttttaaagatcaaaatggtaatttc^ aagaagatattaaago^atmaag-rttatacgaagcatcattitragctltagaaggtg aaaatattttagatga\gctaaagtatttgctatttct
aaaaaatrggtaaagaattagctgaacaagtaaaccatgcattagaattaccattacat cgtcgt acaca^cgtttagaagcagtttggtctattgaagcttatcgtaaaaaagaagat
gctaatcaa gttttatt Agaattagcaattttagati'aiaatatgattcaatcagt atacc aacgtgatltacgtgaaacaagtcgttggtggcgtcgtgtaggtttagctacraaattac attitgctcgtgatcgtttaattgaaagititrattgg^ acaatattcagattgtcgtaatrcagttgcaaaa^
gatatitatgatgtttacggtacattagatcaattagaattattcacioaigcagtagaa
CGTTGGGATGTTAATGCTAlTAATGATTrACCAGATTATATGAAATTATGTm
tatat aacactatt AAlGAAATrGCTTATGATAACTTAAAAGATAAAGGTGAAAATAlTT
taccatatttaacaaaagcttgcksctgat^
ggttatataataaatcaacaccaacatttgatgatratttt
CATCTGGTCCATnrACAATTAGTTTTTGCTTATTTTGCTGTTGrrc
agaaatrgaaaatttacaaaaatatcatgatacaatttcacgtccatcacatatttttcg TTTATGTAATGATTrAGCTTCAGCTTCAGCTGAAATTGCAC
agtrrcatgttatatgcgtacaaaaggtatttctgaagaattagctacagaatcagttat
gaatttaattgatgaaacatggaaaaaaatgaataaagaaaaattaggtggttctttat
TTGCTAAACCATTTGTTGAAACTGCTATTAATrrAGCACGTCAATCACATTGTACTTATCA
TAATGGTGATGCTCATACATCACCAGATGAATTAACACGTAAACGTGTITTATCAGTTAT
TACAGAACCAATTTTACCATTTGAACGTTAA
SEQ ID NO: 4 - Seqüência de polipeptídeo para o gene de isopreno sintase Cr-IspS. As três cópias do sinalizador de hemaglutinina HA estão sublinha- das. A seqüência de isopreno sintase carece de uma seqüência de direcio- namento de cloroplasto da seqüência de proteína de IspS de álamo. A sequência de IspS começa com "CS...", indicado pela alteração na fonte. mypydvpdyagypydvpdyagypydvpdyagpwcsvstenvsftetetearrsanyepnswdydy
LLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREINNEKAEFLTLLELIDNVQIU^
FVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYE
ASFLALEGENTLDEAK VFAISHLKELSEEKIGkELAEQVNH ALELPLHRRTQRLEAVWSIEAY
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VAJFEPQYSDCRNSVAKiWSFVTIIDDIYDVYGTLDELELFrDAVERWD VN AIhroLPDYMKLC
FlJUL YNTINELAYD^KDK^
KSSSGPLQLWA YF A WQMJOKEEIENLQKYro^
SCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAK^^
AHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER
SEQ ID NO: 5 - Seqüência de nucleotídeo de DNA de Ss-IspS e plasmídeo plspS para cianobactéria. A primeira seqüência sublinhada de SEQ ID NO: 5 representa o gene de beta-lactamase (complemento reverso), enquanto que a segunda seqüência sublinhada é o DNA de Ss-IspS. Adicionalmente, as 5 seqüências em itálico são os códons de início e parada e as seqüências em negrito são sítios de restrição para clonagem
>pZspS
aaaaagcattgctcatcaatttgtcgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaataaaatcattatttaaaagggg cccgagcttaagactggccgtcgttttacaacacagaaagagtttgtagaaacgcaaaaaggccatccgtcaggg gccttctgcttagtttgatgcctggcagttccctactctcgccttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgct cggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata acgcaggaaagaacatgfcgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggac tataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggat acctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgt aggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaact atcgtcttgagtccáacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagag cgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtgggctaactacggctacactagaagaacagtatttg gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccg ctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttga tcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgacgcgcgcgtaactcacgttaagggattttggtcatgagctt qcqccqtcccqtcaaqtcaqcqtaatgctctgcttaccaatqcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctg tctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctgg ccccagcgctgcgatgataccgcgagaaccacgctcaccggctccggatttatcagcaataaaccagccagccgg
aaqqqccqagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgccfcccatccagtctattaattgttgccgqgaagctag
agtaagtaqttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccatcgctacaqqcatcqtqqtgtcacqctcqtc
gtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgaqttacatgatcccccatgttgtgcaaaaa
agcggttagetccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggc
agcactqcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtc
attctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatag
cagaactttaaaagtqctcatcattgqaaaacgttcttcqgggcgaaaactctcaaggatcttaccgctqttgag
atccagttcgatgtaacccactcgfcgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtg
agcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatattctt
cctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaa
aaataaacaaataggggtcagtgttacaaccaattaaccaattctgaacattatcgcgagcccatttatacctga
atatggctcataacaccccttgcagtgcgactaacggcatgaagctcgtcggggaaataatgattttattttgac
tgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgctttcttataatgccaactttgtacaagaaagctg
ggtcca tggaagctcgacgaagcgctaattatgaaccaaatagttgggactacgattttctattatcctctgata
cggatgagtccattgaagtttataaggataaagctaagaaattggaagccgaagtgcgccgcgaaattaacaatg
agaaagcggaatttttgaccttattagaactcatcgataatgtgcaacgactgggattgggctatcggtttgaaa
gtgacatccgccgggcactggatcgttttgtatctagtggcggctttgatggcgtcactaaaactaqtttgcacg
cgaccgcactcagttttcggctattacgtcaacacggtttcgaagtgagtcaagaggcgtttagtggcttcaaag
atcaaaatggcaattttctggaaaacttgaaagaagacacaaaagctatcctaaqtttatacgaagctagttt:tc
tcgcgctggaaggtgaaaatattctggatgaggctcgtgtatttgcaatttctcacctgaaagaattatctgaag
aaaagattggcaaagaactcgccgaacaggtaaatcacgccttggaactgcccctccatcgtcgtacecaacgat
fcggaagctgtgtggagtatcgaaqcctatcqcaagaaagaagacgctaaccaagttttgttggaactgqccatct
tggattataacatgattcaatccgtatatcagcgcgatctacgtgaaacgtctcggtggtggcgqcqtgttgggc
tcqctactaaattacattttgcaaaggatcgactcattgaatccttttattgggccgtcggggtggcttttqaac
cccagtacagcgattgccgtaattctgtagcaaaaatgttttctttcgttacaattattgatgacatttatgacg
tttacggcaccctcgacgaactggaattgttcactgacgctgtggaacgttqqqacgtaaatgccattaatgacc
tgccagattacatgaagttgtgttttctcgcgttatataacaccattaatgaaattgcatacgacaatttaaagg
ãtaagggagagaafcattctgccttatttgacgaaagcctgggccgatttgtgtaatgcctttttgcaggaagcta
aatggtbatataacaaatccacccccacttttgatgactattttggcaatgcctggaagágcagcagcggqcctc
tccaactgatttttgcttattttqcqgtagtacaaaacattaagaaagaagagattgaaaatttgcaaaaqtacc
atgacattattagtcggcccagtcatattttccgcttgtgcaacgacctggcatccgctaqtgccgaaattgcgc
gtggcgaaacagctaatagtgtgagttgttacatgcgcacaaagggcatttccgaagaactagctacggaaaqtq
tcatgaacctgattgacgagacttgcaagaaaatgaataaggaaaaattgggcgggtccctatttgccaaaccct
ttgtggaaaccgcgattaatttggctcgccaaagtcattgtacctatcacaatggtgatgctcacaccagtcccg
atgaattaacccgtaaacgagttctgtctgtgattactgaacccattttgccctttgaacgt Caaaagtaacagg
ttttccatgttgtcgtctgcaagaacactgcagagcctgcttttttgtacaaagttggcattata
SEQ ID NO: 6 - seqüência de aminoácido da proteína de Ss-IspS de 65 kD esperada traduzida do plasmídeo de cianobactéria 1 MBAEHSMÍYE PNSWD YDFLIi SSDTDESIEV YKDKAKKLEA EVRREINNEK 51 AEFLTLLELI DNVQRLGLGY RFESDIRRAL DRFVSSGGFD GVTKTSLHAT 101 ALSFRLLRQH GFEVSQEAFS GFKDQNGNFL ENLKEDTKAI LS LYEAS FLA 151 LEGENILDEA RVFAISHLKE LSEEKIGKEL AEQVNHALEL PLHRRTQRLE 201 AVWSIEAYRK KEDANQVLLE LAILDYNMIQ SVYQRDLRET SRWWRRVGLA 251 TKLHFAKDRL XES FYWAVGV AFEPQYSDCR NSVAKMFSFV TIIDDIYDVY 301 GTLDELELFT DAVERWDVKA XNDLPDYMKL CFLALYNTIN EIAYDNLKDK 351 GENILPYLTK AWADLCNAFL QEAKWLYNKS TPTFDDYFGN AWKSSSGPLQ 401 LIFAYFAWQ NIKKEEIENL QKYHDIISRP SHIFRLCNDL ASASAEIARG 451 ETAKSVSCYM RTKGISEELA TESVMNLIDE TCKKMNKEKL GGSLFAKPFV 501 ETAINLARQS HCTYHNGDAH TSPDELTRKR VLSVITEPIL PFER *
SEQ ID NO: 7 - Isopreno sintase (IspS) de Pueraria montana var. Iobata (uva kudzu); Nq de Acesso AY316691 (cds. completa). O códon de início atg está sublinhado e indica o início da região de codificação de proteína do cDNA
1 aatcaatata taatatttac ggaagatttg atgcctttcc tgattttaat ttafcttttat 61 ccctgcataa aataattgtg gtcaccgtac actgttcttg tcacttggac aagaaatttg 121 actagcaagc aaggtataat cattcatcta aacttatggt gatttattgc cccacctcat 181 caattttcgt gtgttttatt ttagtgtcct tggatcctcg ttccaatata aaaggagaac 241 atggcatcgc aattttagag catatcattg aaaagtcatg gcaaccaacc ttttatgctt 301 gtctaataaa ttatcgtccc ccacaccaac accaagtact agatttccac aaagtaagaa 361 cttcatcaca caaaaaacat ctcttgccaa tcccaaacct tggcgagtta tttgtgctac 421 gagctctcaa tttacccaaa taacagaaca taatagtcgg cgttcagcta attaccagcc 481 aaacctctgg aattttgaat ttctgcagtc tctggaaaat gaccttáagg tgattataca 541 tatattccag ttaatttttc tttttttctt ttgtgatttt taaggaatca tttagtttgg 601 gaaagtattt tttttatttg cacttttaat tataaaaatg ttatatcatt ttcacttttt 661 tctattcatt ttcaaaattt tacatagaaa acagtaaatt ttttattttt tttattttct 721 attttcatta tttctcaaat caaacggtat taaagcataa acaaagaaat taatattgtt 781 cttttaattt tattttttta caataatggg aacgattata tattaggctg accttaataa 841 gttatttttt ttttataata ttgttcttat tgtaacctaa cgacaggtgg aaaaactaga 901 agagaaggca acaaagctag aggaggaggt acgatgcatg atcaacagag tagacacaca 961 accattaagc ttactagaat tgatcgacga tgtccagcgt ctaggattga cctacaagtt 1021 tgagaaggac ataatcaaag cccttgagaa tattgttttg ctggatgaga ataagaaaaa 1081 taaaagtgac ctccatgcta ctgctctcag cttccgttta cttagacaac atggctttga 1141 ggtttcccaa ggtatttatg tatatatatg ttacccactt agcaacatat atatatatat 1201 atattatgat tcactgacca tgcatgtggt gcagatgtgt ttgagagatt taaggacaag 1261 gagggaggtt tcagtggtga acttaaaggt gatgtgcaag ggttgctgag tctatatgaa 1321 gcatcctatc ttggctttga gggagaaaat ctcttggagg aggcaaggac attttcaata 13 81 acacatctca agaacaacct aaaagaagga ataaacacca aagtggcaga acaagttagt 1441 catgcactgg aacttcccta tcatcaaaga ttgcatagac tagaagcacg atggttcctt 1501 gacaaatatg aaccaaagga accccaccat cagttactac tcgagcttgc aaagctagat 1561 ttcaatatgg tgcaaacatt gcaccagaaa gaactgcaag acctgtcaag gttagaaatt 1621 tcaattctca agtaattatt acctcataag aaattaaata acaataacaa tattgagtgt 1681 agagatttcc aattaaaaat taacatacga gaggatcaat atatattctt aggtatgtgg 1741 tactaatgaa atatatgcta ggtggtggac ggagatgggg ctagcaagca agçtagactt 1801 tgtccgagac agattaatgg aagtgtattt ttgggcgttg ggaatggcac ctgatcctca 1861 attcggtgaa tgtcgtaaag ctgtcactaa aatgtttgga ttggtcacca tcatcgatga 1921 tgtatatgac gtttatggta ctttggatga gctacaactc ttcactgatg ctgttgagag 1981 gttcgtaatt gatttcagtc tcgattcagt tggaatttaa ttattgctta attaataata 2 041 acttgcgtac atgcatacac acagatggga cgtgaatgcc ataaacacac ttccagacta 2101 catgaagttg tgcttcctag cactttataa caccgtcaat gacacgtctt atagcatcct 2161 taaagaaaaa ggacacaaca acctttccta tttgacaaaa tctgtacata tatactaatt
2221 atctccttgg ttgattaatt agtttagttt agcttagttg gtatgtcaac acaattaatt
2281 aatattatat atggatgttg acagtggcgt gagttatgca aagcattcct tcaagaagca
2341 aaatggtcga acaacaaaat cattccagca tttagcaagt acctggaaaa tgcatcggtg
2401 tcctcctccg gtgtggcttt gcttgctcct tcctacttct cagtgtgcca acaacaagaa
2461 gatatctcag accatgctct tcgttcttta actgatttcc atggccttgt gcgctcctca
2521 tgcgtcattt tcagactctg caatgatttg gctacctcag cggtgtgtaa ttaattacct
2581 taattaattt gtaacacttg ttagactaat atatataggt gtgtctgtta attactacag
2641 gctgagctag agaggggtga gacgacaaat tcaataatat cttatatgca tgagaatgac
2701 ggcacttctg aagagcaagc acgtgaggag ttgagaaaat tgatcgatgc agagtggaag
2761 aagatgaacc gagagcgagt ttcagattct acactactcc caaaagcttt tatggaaata
2821 gctgttaaca tggctcgagt ttcgcattgc acataccaat atggagacgg acttggaagg
2881 ccagactacg ccacagagaa tagaatcaag ttgctactta tagacccctt tccaatcaat
2941 caactaatgt acgtgtaaca acacaatata aacacttttc tacaagtata tatttgttta
3001 atttcggtgt tgaattaggg gtcaacacag ctatatatac ttcaatggac caactcaacc
3061 aatctgataa gagaaaaaaa ataaaaataa ggttaggtta actttgtata aatccaagtt
3121 agatatcaag ttt
SEQ ID NO: 8 - Seqüência de polipeptídeo de isopreno sintase de Pueraria montaria var. lobata (uva kudzu)
MATNLLCLSNKLSSPTPTPSTRFPQSKNFITQKTSLANPKPWRVICATSSQFTQITEHN
SRRSANYQPNLWNFEFLQSLENDLKVEKLEEKATKLEEEVRCM1NRVDTQPLSLLELI
DDVQRLGLTYKFEKDÍIKALENIVLLDENKKNKSDLHATALSFRLLRQHGFEVSQDV
FERFKDKEGGFSGELKGDVQGLLSLYEASYLGFEGENLLEEARTFSrmLKNNLKEGI
NTKVAEQVSHALELPYHQRLHRLEARWFLDKYEPKEPHHQLLLELAKLDFNMVQTL
HQKELQDLSRWWTEMGLASKLDFVRDRLMEVYFWALGMAPDPQFGECRKAVTKM
FGLVTirDDVYDVYGTLD
SYSrLK^KGHNNLSYLTKSWRELCKAFLQEAKWSNNKnPAFSKYLENASVSSSGVAL
LAPSYFSVCQQQEDISDHALRSLTDFHGLVRSSCVIFRLCNDLATSAAELERGETTNSI
ISYMHENDGTSEEQAREELRKLmAE WKKMNRERVSDSTLLPKAFMEIAVNMA^
HCTYQYGDGLGRPDYATENRIKLLLIDPFPINQLMYV LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Melis, Anastasios
The Regents of the University of Califórnia <120> Produção de Hidrocarboneto Volátil de Cadeia Curta Usando Mi- croalgas, Cianobactérias ou Bactérias Geneticamente Manipula- das
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<220>
<223> cDNA de isopreno sintase (IspS) de álamo branco <400> 1
atggcaactg aattattgtg cttgcaecgt ccaatctcac tgacacacaa acttttcaga 60 aatcccttac ctaaagtcat ccaggccact cccttaactt tgaaactcag atgttctgta 120 agcacagaaa acgtcagctt cacagaaaca gaaacagaag ccagacggtc tgccaattat 180 gaaccaaata gctgggatta tgattatttg ctgtcttcag acactgacga atcgattgag 240 gtatacaaag acaaggccaa aaagctggag gctgaggtga gaagagagat taacaatgaa 300 aaggcagagt ttttgactct gcttgaactg atagataatg tccaaaggtt aggattgggt 360 taceggttcg agagtgacat aaggggagcc cttgatagat ttgtttcttc aggaggattt 420 gatgctgtta caaaaactag ccttcatggt actgctctta gcttcaggct tctcagacag 480 catggttttg aggtctctca agaagcgttc agtggattca aggatcaaaa tggcaatttc 540 ttggaaaacc ttaaggagga catcaaggca atactaagcc tatatgaagc ttcatttett 600 gcattagaag gagaaaatat cttggatgag gccaaggtgt ttgcaatatc acatctaaaa 660 gagctcagcg aagaaaagat tggaaaagag ctggccgaac aggtgaatca tgcattggag 720 cttccattgc atcgcaggac gcaaagacta gaagctgttt ggagcattga agcataccgt 780 aaaaaggaag atgcaaatca agtactgcta gaacttgcta tattggacta caacatgatt 840 caatcagtat accaaagaga tcttcgcgag acatcaaggt ggtggaggcg agtgggtctt 900 gcaacaaagt tgcattttgc tagagacagg ttàattgaaa gcttttactg ggcagttgga 960 gttgcgttcg agcctcaata cagtgattgc cgtaattcag tagcaaaaat gttttcattt 1020 gtaacaatca ttgatgatat ctatgatgtt tatggtactc tggacgagtt ggagctattt 1080 acagatgctg ttgagagatg ggatgttaat gccatcaatg atcttccgga ttatatgaag 1140 ctctgcttcc tagctctcta caacactatc aatgagatag cttatgacaa tctgaaggac 1200 aagggggaaa acattcttcc atacctaaca aaagcgtggg cagatttatg caatgcattc 1260 ctacaagaag caaaatggtt gtacaataag tccacaccaa catttgatga ctatttcgga 1320 aatgcatgga aatcatcçtc agggcctctt caactagttt ttgcctactt tgccgtggtt 1380 caaaacatca agaaagagga aattgaaaac ttacaaaagt atcatgatac catcagtagg 1440 ccttcccaca tctttcgtct ttgcaacgac ctggcttcag eatcggctga gatagcgaga 1500 ggtgaaacag cgaattctgt atcatgctac atgcgtacaa aaggcatttc tgaggagctt 1560 gctactgaat ccgtaatgaa cttgatcgac gaaacctgga aaaagatgaa caaagaaaag 1620 Cttggtggct ctttgtttgc aaaacctttt gtcgaaacag ctattaacct tgcacggcaa 1680 tcccattgca cttateataa cggagatgcg catacttcac cagacgagct aactaggaaa 1740 cgtgtcctgt cagtaatcsc agagcctatt ctaccctttg agagataa 1788 <210> 2
<211> 595
<212> PRT
<213> Populusalba
<220>
<223> Isopreno sintase (IspS) a'e álamo branco <220>
<221 > PEPTÍDEO
<222> (1) . . (37)
<223> peptídeo de trânsito de cloroplasto
<400> 2
Met Ala Thr Glu Leu Leu Cys Leu His Arg Pro Ile Ser Leu Thr His 1 5 10 15
Lys Leu Phe Arg Asn Pro Leu Pro Lys Val Ile Gln Ala Thr Pro Leu 20 25 30
Thr Leu Lys Leu Arg Cys Ser Val Ser Thr Glu Asn Val Ser Phe Thr 35 40 45
Glu Thr Glu Thr Glu Ala Axg Arg Ser Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser 50 55 60
Trp Asp Tyr Asp Tyr Leu Leu Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser Ile Glu 65 70 75 80
Val Tyr Lys Asp Lys Ala Lys Lys Leu Glu Ala Glu Val Arg Arg Glu
85 90 95
Ile Asn Asn Glu Lys Ala Glu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ile Asp 100 105 HO
Asn Val Gln Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Glu Ser Asp Ile Arg 1X5 120 125
Gly Ala Leu Asp Arg Phe Val Ser Ser Gly Gly Phe Asp Ala Val Thr 130 135 140
Lvs Thr Ser Leu His Gly Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln U5 150 155 160
His Gly Phe Glu Val Ser Gln Glu Ala Phe Ser Gly Phe Lys Asp Gln
165 1?0 175
Asn Glv Asn Phe Leu Glu Asn Leu Lys Glu Asp Ile Lys Ala Ile Leu 180 185 190
Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Phe Leu Ala Leu Glu Gly Glu Asn Ile Leu 195 200 205
Asp Glu Ala Lys Val Phe Ala Ile Ser His Leu Lys Glu Leu Ser Glu 210 215 220 Glu Lys Ile Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gln Val Asn His Ala Leu Glu 225 230 235 240
Leu Pro Leu His Arg Arg Thr Gln Arg Leu Glu Ala Val Trp Ser Xle 245 250 255
Glu Ala Tyr Arg Lys Lys Glu Asp Ala Asn Gln Val Leu Leu Glu Leu 260 265 270
Ala Ile Leu Asp Tyr Asn Met Ile Gln Ser Val Tyr Gln Arg Asp Leu 275 280 285
Arg Glu Thr Ser Arg Trp Trp Arg Arg Val Gly Leu Ala Thr Lys Leu 290 295 300
His Phe Ala Arg Asp Arg Leu Ile Glu Ser Phe Tyr Trp Ala Val Gly 305 310 315 320
Val Ala Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Asp Cys Arg Asn Ser Val Ala Lys 325 330 335
Met Phe Ser Phe Val Thr Ile Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly 340 345 350
Thr Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp 355 360 365
Val Asn Ala Ile Asn Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu 370 375 380
Ala Leu Tyr hsh Thr Ile Asn Glu Ile Ala Tyr Asp Asn Leu Lys Asp 385 390 395 400
Lys Gly Glu Asn Ile Leu Pro Tyr Leu Thr Lys Ala Trp Ala Asp Leu
* ti X. O
405
410
Cys Asn Ala Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Leu Tyr Asn Lys Ser Thr
425 430
420
Pro Thr Phe Asp Asp Tyr Phe Gly Asn Ala Trp Lys Ser Ser Ser Gly 435 440 445
Pro Leu Gln Leu Val Phe Ala Tyr Phe Ala Val Val Gln Asn Ile Lys 450 455 <60
Lys Glu GlU Ile Glu Asn Leu Gln Lys Tyr His Asp Thr Ile Ser Arg
~ τ Ov
4 65
470
475
Pro Ser His Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ser Ala 485 490 495
Glu Ile Ala Arg Gly Glu Thr Ala Asn Ser Val Ser Cys Tyr Met Arg 500 505 510
Thr Lys Gly Ile Ser Glu Glu Leu Ala Thr Glu Ser Val Met Asn Leu 515 520 525
Ile Asp Glu Thr Trp Lys Lys Met Asn Lys Glu Lys Leu Gly Gly Ser 530 535 540 Leu Phe Ala Lys Pro Phe Val Glu Thr Ala Ile Asn Leu Ala Arg Gln 545 550 555 560 Ser His Cys Thr Tyr HiS Asn Gly Asp Ala His Thr Ser Pro Asp Glu 565 570 575 Leu Thr Arg Lys Arg Val Leu Ser Val Ile Thr Glu Pro Ile Leu Pro 580 585 590
Phe Glu Arg 595
<210> 3
<211> 1776
<212> DNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de seqüência artificial: Constructo de DNA sintético có- don-ajustado para expressão do gene de IspS de Populus alba com seqüência de direcionamento de cloroplasto omitida e sinali- zador de epítopo de hemaglutinina (HA) em microalga Chlamydo- monas reinhardtii (Cr-IspS)
<220>
<221> gene <222> (100)..(1776)
<223> Gene de IspS de Populus alba com seqüência de direcionamento de cloroplasto omitida códon-otimizado para expressão em cloro- plasto de microalga Chlamydomonas reinhardtii (Cr-IspS) <400> 3
atgtatcctt atgatgttcc agactacgca ggttatcctt atgatgtacc agactatgca 60 ggttatcctt acgatgtacc tgattacgct ggtccatggt gttctgttag tactgaaaat 120 gtttcattta ctgaaacaga aacagaagca cgtagatcag caaattatga gccaaatagt 180 tgggattatg actatttatt atctagtgat acagatgaat ctattgaagt atataaagat 240 aaagcaaaaa aattagaagc agaagtacgt cgtgaaatta ataacgaaaa agcagaattt 300 cttactttat tagaattaat tgataatgta caacgtttag gtttaggtta tcgttttgaa 360 tcagacattc gtggtgcatt agatcgtttt gtatcaagtg gtggttttga tgctgttaca 420 aaaactagtt tacatggtac tgctttaagt tttcgtttac ttcgtcaaca tggttttgaa 480 gtaagtcaag aagctttttc tggttttaaa gatcaaaatg gtaatttctt agaaaattta 540 aaagaagata ttaaagctat tttaagttta tacgaagcat catttttagc tttagaaggt 600 gaaaatattt tagatgaagc taaagtattt gctatttctc acttaaaaga attatcagaa 660 gaaaaaattg gtaaagaatt agctgaacaa gtaaaccatg cattagaatt accattacat 720 cgtogtacac aacgtttaga agcagtttgg tctattgaag cttatcgtaa aaaagaagat 780 gctaatcaag ttttattaga attagcaatt ttagattata atatgattca atcagtatac 840 caacgtgatt tacgtgaaac aagtcgttgg tggcgtcgtg taggtttagc tactaaatt.a 900 cattttgctc gtgatcgttt aattgaaagt ttttattggg cagttggtgt agcttttgaa 960 ccacaatatt cagattgtcg taattcagtt gcaaaaatgt tttcatttgt aactattatt 1020 gatgatattt atgatgttta cggtacatta gatgaattag aattattcac tgatgcagta 1080 gaacgttggg atgttaatgc tattaatgat ttaccagatt atatgaaatt atgttttctt 1140 gctttatata acactattaa tgaaattgct tatgataact taaaagataa aggtgaaaat 1200 attttaccat atttaacaaa agcttgggct gatttatgta atgctttttt acaagaagct 1260 aaatggttat ataataaatc aacaccaaca tttgatgatt attttggtaa tgcttggaaa 1320 agttcatctg gtccattaca attagttttt gcttattttg ctgttgttca aaatattaaa 1380 aaagaagaaa ttgaaaattt acaaaaatat catgatacaa tttcacgtcc atcacatatt 1440 tttcgtttat gtaatgattt agcttcagct tcagctgaaa ttgcacgtgg tgaaacagca 1500 aattcagttt catgttatat gcgtacaaaa ggtatttctg aagaattagc tacagaatca 1560 gttatgaatt taattgatga aacatggaaa aaaatgaata aagaaaaatt aggtggttct 1620 ttatttgçta aaccatttgt tgaaactgct attaatttag cacgtcaatc acattgtact 1680 tatcataatg gtgatgctca tacatcacca gatgaattaa cacgtaaacg tgttttatca 1740 gttattacag aaccaatttt accatttgaa cgttaa 1776
<210> 4
<211> 591
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de seqüência artificial: Isopreno sintase (IspS) de Popu- lus alba com seqüência de direcionamento de cloroplasto omitida e proteína de fusão de sinalizador de epítopo de hemaglutinina (HA) para expressão em cloroplasto de microalga Chlamydomo- nas reinhardtii
<220>
<221 > PEPTÍDEO <222> (2).. (10)
<223> peptídeo sinalizador de epítopo de hemaglutinina (HA) <220>
<221 > PEPTÍDEO <222> (12). . (20)
<223> peptídeo sinalizador de epítopo de hemaglutinina (HA) <220>
<221 > PEPTÍDEO <222> (22).. (30)
<223> peptídeo sinalizador de epítopo de hemaglutinina (HA) <220>
<221 > PEPTÍDEO <222> (34)..(591)
<223> Isopreno sintase (IspS) de Populus Alba com seqüência de dire- cionamento de cloroplasto omitida <400> 4
Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 10
Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val 20 25
Trp Cys Ser Val Ser Thr Glu Asn Val Ser 35 40
Glu Ala Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Glu Pro 50 55
Tyr Leu Leu Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser 65 70
Gly Tyr Pro Tyr Asp Val
15
Pro Asp Tyr Ala Gly Pro 30
Phe Thr Glu Thr Glu Thr 45
Asn Ser Trp Asp Tyr Asp 60
Xle Glu Val Tyr Lys Asp 75 80
Lys Ala Lys Lys Leu Glu Ala Glu Val Arg Arg Glu Ile Asn Asn Glu
85 90 95 Lys Ala Glu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ile Asp Asn Val Gln Arg 100 105 110
Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Glu Ser Asp Ile Arg Gly Ala Leu Asp 115 120 125
Arg Phe Val Ser Ser Gly Gly Phe Asp Ala Val Thr Lys Thr Ser Leu 130 135 140
His Gly Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Phe Glu 145 150 155 160
Val Ser Gln Glu Ala Phe Ser Gly Phe Lys Asp Gln Asn Gly Asn Phe 165 170 175
Leu Glu Asn Leu Lys Glu Asp Ile Lys Ala Ile Leu Ser Leu Tyr Glu 180 185 190
Ala Ser Phe Leu Ala Leu Glu Gly Glu Asn Ile Leu Asp Glu Ala Lys 195 200 205
Val Phe Ala Ile Ser His Leu Lys Glu Leu Ser Glu Glu Lys Ile Gly 210 215 220
Lvs Glu Leu Ala Glu Gln Val Asn His Ala Leu Glu Leu Pro Leu His 225 230 235 240
Arg Arg Thr Gln Arg Leu Glu Ala Val Trp Ser Ile Glu Ala Tyr Arg 245 250 255
Lvs Lvs Glu Asp Ala Asn Gln Val Leu Leu Glu Leu Ala Ile Leu Asp 260 265 270
Tvr Asn Met Ile Gln Ser Val Tyr Gln Arg Asp Leu Arg Glu Thr Ser 275 280 285
Arg Trp Trp Arg Arg Val Gly Leu Ala Thr Lys Leu His Phe Ala Arg 290 295 300
Asp Arg Leu Ile Glu Ser Phe Tyr Trp Ala Val Gly Val Ala Phe Glu 305 310 315 320
Pro Gln Tyr Ser Asp Cys Arg Asn Ser Val Ala Lys Met Phe Ser Phe 325 330 335
Val Thr Ile Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp Glu 340 345 350
Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp Val Asn Ala Ile 355 360 365
Asn Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu Ala Leu Tyr Asn 370 375 380
Thr Ile Asn Glu Ile Ala Tyr Asp Asn Leu Lys Asp Lys Gly Glu Asn 385 390 395 400
Ile Leu Pro Tyr Leu Thr Lys Ala Trp Ala Asp Leu Cys Asn Ala Phe 405 410 415
Leu Gln Glu Ala Lys Trp Leu Tyr Asn Lys Ser Thr Pro Thr Phe Asp 420 425 430
Asp Tyr Phe Gly Asn Ala Trp Lys Ser Ser Ser Gly Pro Leu Gln Leu 435 440 445 Val Phe Ala Tyr Phe Ala Val Val Gln Asn Ile Lys Lys Glu Glu Ile 450 455 460
Glu Asn Leu Gln Lys Tyr His Asp Thr Ile Ser Arg Pro Ser His Ile 465 470 475 480
Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ser Ala Glu Ile Ala Arg 485 490 495
Gly Glu Thr Ala Asn Ser Val Ser Cys Tyr Met Arg Thr Lys Gly Ile 500 505 510
Ser Glu Glu Leu Ala Thr Glu Ser Val Met Asn Leu Ile Asp Glu Thr 515 520 525
Trp Lys Lys Met Asn Lys Glu Lys Leu Gly Gly Ser Leu Phe Ala Lys 530 535 540
Pro Phe Val Glu Thr Ala Ile Asn Leu Ala Arg Gln Ser His Cys Thr 545 550 555 560
Tyr His Asn Gly Asp Ala His Thr Ser Pro Aap Glu Leu Thr Arg Lys 565 570 575
Arg Val Leu Ser Val Ile Thr Glu Pro Ile Leu Pro Phe Glu Arg 580 585 590
<210> 5
<211> 3965
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de seqüência artificial: Constructo de DNA sintético có- don-otimizado para expressão do gene de IspS de Populus alba com seqüência de direcionamento de cloroplasto omitida em cia- nobactéria Synechocystis sp. (Ss-IspS) com gene de beta- lactamase (complemento reverso)
<220>
<221> gene
<222> Complemento (1084)..(1944)
<223> Gene de beta-lactamase (complemento reverso)
<220>
<221> gene
<222> (2256)..(3890)
<223> Gene de IspS de Populus Alba com seqüência de direcionamento de cloroplasto omitida códon-otimizado para expressão em ciano- bactéria Synechocystis sp. (Ss-IspS)
<400> 5 aaaaagcatt çctcatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc 60 attatttaaa aggggcccga gcttaagact ggccgtcgtt ttacaacaca gaaagagttt 120 gtagaaacgc aaaaaggcca tccgtcaggg gccttctgct tagtttgatg cctggcagtt 180 ccctactctc gccttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 240 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 300 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 360 cgttgctggc gtttttccat aggotccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 420 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 480 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttao cggatacctg tccgcctttc 540 tcccttcggg sagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 600 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaacccoc cgttcagccc gaccgctgcg 660 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag aeacgactta tcgccactgg 720 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 780 tgaagtggtg ggctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 840 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atcoggcaaa caaacoaccg 900 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 960 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgac gcgcgcgtaa 1020 ctcacgttaa gggattttgg tcatgagctt gcgccgtccc gtcaagtoag cgtaatgctc 1080 tgcttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 1140 catagttgco tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 1200 ccccagcgct gcgatgatac cgcgagaacc acgctcaccg gctccggatt tatcagcaat 1260 aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgoctccat 1320 ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 1380 caacgttgtt gccatcgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 1440 attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 1500 agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 1560 actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 1620 ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 1680 ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 1740 gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 1800 atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatet tcagcatctt ttactttcac 1860 cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 1920 gacacggaaa tgttgaatac teatattctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 1980 gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtàtt tagaaaaata aacaaatagg 2040 ggtcagtgtt acaaccaatt aaccaattct gaacattatc gcgagcccat ttatacctga 2100 atatggctca taacacccct tgcagtgcga ctaacggcat gaagctcgtc ggggaaataa 2160 tgattttatt ttgactgata gtgacctgtt cgttgcaaca aattgataag caatgctttc 2220 ttataatgcc aactttgtac aagaaagctg ggtccatgga agctcgacga agcgctaatt 2260 atgaaccaaa tagttgggac tacgattttc tattatcctc tgatacggat gagtccattg 2340 aagtttataa ggataaagct aagaaattgg aagccgaagt gcgccgcgaa attaacaatg 2400 agaaagcgga atttttgaoc ttattagaac tcatcgataa tgtgcaacga ctgggattgg 2460 gctatcggtt tgaaagtgac atccgccggg cactggatcg ttttgtatct agtggcggot 2520 ttgatggcgt cactaaaact agtttgcacg cgaccgcact cagttttcgg ctattacgtc 2580 aacacggttt cgaagtgagt caagaggcgt ttagtggctt caaagatcaa aatggcaatt 2640 ttctggaaaa cttgaaagaa gacacaaaag ctatcctaag tttatacgaa gctagttttc 2700 tcgcgctgga aggtgaaaat attctggatg aggctcgtgt atttgoaatt totcacctga 2760 aagaattatc tgaagaaaag attggcaaag aactcgccga acaggtaaat cacgccttgg 2820 aactgcccct ccatcgtcgt acccaacgat tggaagctgt gtggagtatc gaagcctatc 2880 gcaagaaaga agacgctaac caagttttgt tggaactggc catcttggat tataacatga 2940 ttcaatccgt atatcagcgc gatctacgtg aaacgtctcg gtggtggcgg cgtgttgggc 300U tcgctactaa attacatttt gcaaaggatc gactcattga atcottttat tgggccgtcg 3060 gggtggcttt tgaaccccag tacagcgatt gccgtaattc tgtagcaaaa atgttttctt 3120 tcgttacaat tattgatgac atttatgacg tttacggcao cctcgacgaa ctggaattgt 3180 tcactgacgc tgtggaacgt tgggacgtaa atgccattaa tgacctgcca gattacatga 3240 agttgtgttt tctcgcgtta tataacacca ttaatgaaat tgcatacgac aatttaaagg 3300 ataagggaga gaatattctg ccttatttga cgaaagcctg ggccgatttg tgtaatgcct 3360 ttttgcagga agctaaatgg ttatataaca aatccacccc cacttttgat gactattttg 3420 gcaatgcctg gaagagcagc agcgggcctc tcoaactgat ttttgcttat tttgcggtag 3480 tacaaaacat taagaaagaa gagattgaaa atttgcaaaa gtaocatgac attattagtc 3540 ggcccagtca tattttccgc ttgtgcaacg acctggcatc cgctagtgcc gaaattgcgc 3600 gtggcgaaac agctaatagt gtgagttgtt acatgcgcac aaagggcatt tccgaagaac 3660 tagctacgga aagtgtcatg aacctgattg acgagacttg caagaaaatg aataaggaaa 3720 aattgggcgg gtccctattt gccaaaccct ttgtggaaac cgcgattaat ttggctcgcc 3780 aaagtcattg tacctatcac aatggtgatg ctcacaccag tcccgatgaa ttaacccgta 3840 aacgagttct gtctgtgatt actgaaccca ttttgccctt tgaacgttaa aagtaacagg 3900 ttttccatgt tgtcgtctgc aagaacactg cagagcctgc ttttttgtac aaagttggca 3960 ttata 3965 <210> 6
<211> 544
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de seqüência artificial: Gene de isopreno sintase (IspS) de 65 kD de Populus alba com proteína de fusão da seqüência de direcionamento de cloroplasto omitida a partir do plasmídeo de expressão plspS de cianobactéria Synechocystis sp. (Ss-IspS) <400> 6
Met Glu Ala Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15
Asp Phe Leu Leu Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser Ile Glu Val Tyr Lys 20 25 30
Asp Lys Ala Lys Lys Leu Glu Ala Glu Val Arg Arg Glu Ile Asn Asn 35 40 45
Glu Lys Ala Glu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ile Asp Asn Val Gln 50 55 60
Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Glu Ser Asp Ile Arg Arg Ala Leu 65 70 75 80
Asp Arg Phe Val Ser Ser Gly Gly Phe Asp Gly Val Thr Lys Thr Ser
85 90 95
Leu His Ala Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Phe 100 105 HO
Glu Val Ser Gln Glu Ala Phe Ser Gly Phe Lys Asp Gln Asn Gly Asn 115 120 125
Phe Leu Glu Asn Leu Lys Glu Asp Thr Lys Ala Ile Leu Ser Leu Tyr 130 135 140
Glu Ala Ser Phe Leu Ala Leu Glu Gly Glu Asn Ile Leu Asp Glu Ala 145 150 155 160
Arg Val Phe Ala Ile Ser His Leu Lys Glu Leu Ser Glu Glu Lys Ile 165 170 175
Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gln Val Asn His Ala Leu Glu Leu Pro Leu 180 185 190
His Arg Arg Thr Gln Arg Leu Glu Ala Val Trp Ser Ile Glu Ala Tyr 195 200 205
Arg Lys Lys Glu Asp Ala Asn Gln Val Leu Leu Glu Leu Ala Ile Leu 210 215 220
Asp Tyr Asn Met Ile Gln Ser Val Tyr Gln Arg Asp Leu Arg Glu Thr 225 230 235 240
Ser Arg Trp Trp Arg Arg Val Gly Leu Ala Thr Lys Leu His Phe Ala 245 250 255 Lys Asp Arg Leu Ile Glu Ser Phe Tyr Trp Ala Val Gly Val Ala Phe 260 265 270
Glu Pro Gln Tyr Ser Asp Cys Arg Asn Ser Val Ala Lys Met Phe Ser 275 280 285
Phe Val Thr Ile Ile Asp Asp lie Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp 290 295 300
Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp Val Asn Ala 305 310 315 320
Ile Asn Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu Ala Leu Tyr 325 330 335
Asn Thr Ile Asn Glu Ile Ala Tyr Asp Asn Leu Lys Asp Lys Gly Glu 340 345 350
Asn Ile Leu Pro Tyr Leu Thr Lys Ala Trp Ala Asp Leu Cys Asn Ala 355 360 365
Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Leu Tyr Asn Lys Ser Thr Pro Thr Phe 370 375 380
Asp Asp Tyr Phe Gly Asn Ala Trp Lys Ser Ser Ser Gly Pro Leu Gln 385 390 395 400
Leu Xle Phe Ala Tyr Phe Ala Val Val Gln Asn Ile Lys Lys Glu Glu 405 410 415
Ile Glu Asn Leu Gln Lys Tyr His Asp Ile Ile Ser Arg Pro Ser His 420 425 430
Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ser Ala Glu Ile Ala 435 440 445
Arg Gly Glu Thr Ala Asn Ser Val Ser Cys Tyr Met Arg Thr Lys Gly 450 455 460
Ile Ser Glu Glu Leu Ala Thr Glu Ser Val Met Asn Leu Ile Asp Glu 465 470 475 480
Thr Cvs Lvs Lvs Met Asn Lys Glu Lys Leu Gly Gly Ser Leu Phe Ala 485 4 90 495
Lvs Pro Phe Val Glu Thr Ala Ile Asn Leu Ala Arg Gln Ser His Cys 500 505 510
Thr Tyr His Asn Gly Asp Ala His Thr Ser Pro Asp Glu Leu Thr Arg 515 520 525
Lys Arg Val Leu Ser Val Ile Thr Glu Pro Ile Leu Pro Phe Glu Arg 530 535 540
<210> 7 <211> 3133 <212> DNA <213> <220> <223> <400>
Pueraria montana var. Iobata
cDNA de Isopreno sintase (IspS) de uva kudzu 7
aatcaatata
ccctgcataa
actagcaagc
caattttcgt
atggcatcgc
gtctaataaa
cttcatcaca
gagctctcaa
aaacctctgg
tatattccag
gaaagtattt
tctattcatt
attttcatta
cttttaattt
gttatttttt
agagaaggca
accattaagc
tgagaaggac
taaaagtgac
ggtttcccaa
atattatgat
gagggaggtt
gcatcctatc
acacatctca
catgcactgg
gacaaatatg
ttcaatatgg
tcaattctca
agagatttcc
tactaatgaa
tgtccgagac
attcggtgaa
tgtatatgac
gttcgtaatt
acttgcgtac
catgaagttg
taaagaaaaa
atctccttgg
aafcattatat
aaatggtcga
tcctcctccg
gatatctcag
tgcgtcattt
taattaattt
gctgagctag
ggcacttctg
aagatgaacc
gctgttaaca
ccagactacg
caactaatgt
atttcggtgt
aatctgataa
agatatcaag
taatatttac
aataattgtg
aaggtataat
gtgttttatt
aattttagag
ttatcgtccc
caaaaaacat
tttacccaaa
aattttgaat
ttaatttttc
tttttatttg
ttcaaaattt
tttctcaaat
tattttttta
ttttataata
acaaagctag
ttactagaat
ataatcaaag
ctccatgcta
ggtatttatg
tcactgacca
tçagtggtga
ttggctttga
agaacaacct
aacttcccta
aaccaaagga
tgcaaacatt
agtaattatt
aattaaaaat
atatatgcta
agattaatgg
tgtcgtaaag
gtttatggta
gatttcagtc
atgcatacac
tgcttcctag
^gacacaaea
ttgattaatt
atggatgttg
acaacaaaat
gtgtggcttt
accatgctct
tcagactctg
gtaacacttg
agaggggtga
aagagcaagc
gagagcgagt
tggctcgagt
ccacagagaa
acgtgtaaca
tgaattaggg
gagaaaaaaa
ttt
ggaagatttg
gtcaccgtac
cattcatcta
ttagtgtcct
catatcattg
ccacaccaac
ctcttgccaa
taacagaaca
ttctgcagtc
tttttttctt
cacttttaat
tacatagaaa
caaacggtat
caataatggg
ttgttcttat
aggaggaggt
tgatcgacga
cccttgagaa
ctgctctcag
tatatatatg
tgcatgtggt
acttaaaggt
gggagaaaat
aaaagaagga
tcatcaaaga
accccaccat
gcaccagaaa
acctcataag
taacatacga
ggtggtggac
aagtgtattt
ctgtcactaa
ctttggatga
tcgattcagt
acagatggga
cactttataa
acctttccta
agtttagttt
acagtggcgt
cattccagca
gcttgctcct
tcgttcttta
caatgatttg
ttagactaat
gacgacaaat
acgtgaggag
ttcagattct
ttcgcattgc
tagaatcaag
acacaatata
gtcaacacag
ataaaaataa
atgcctttcc
actgttcttg
aacttatggt
tggatcctcg
aaaagtcatg
accaagtact
tcccaaacct
taatagtcgg
tctggaaaat
ttgtgatttt
tataaaaatg
acagtaaatt
taaagcataa
aacgattata
tgtaacctaa
açgatgcatg
tgtccagcgt
tattgttttg
cttccgttta
ttacccaçtt
gcagatgtgt
gatgtgcaag
ctcttggagg
ataaacacca
ttgcatagac
cagttactac
gaactgcaag
aaattaaata
gaggatcaat
ggagatgggg
ttgggcgttg
aatgtttgga
gctacaactc
tggaatttaa
cgtgaatgcc
caccgtcaat
tttgacaaaa'
agtttagttg
gagttatgca
tttagcaagt
tcctacttct
actgatttcc
gctacctcag
atatataggt
tcaataatat
ttgagaaaat
acactactcc
acataccaat
ttgctactta
aacacttttc
ctatatatac
ggttaggtta
tgattttaat tcacttggac gatttattgc ttccaatata
gcaaccaacc
agatttccac
tggcgagtta
cgttcagcta
gaccttaagg
taaggaatca
ttatatcatt
ttttattttt
acaaagaaat
tattaggctg
cgacaggtgg
atcaacagag
ctaggattga
ctggatgaga
cttagacaac
agcaacatat
ttgagagatt
ggttgctgag
aggcaaggac
aagtggcaga
tagaagcacg
tcgagcttgc
acctgtcaag
acaataacaa
atatattctt
ctagcaagca
ggaatggcac
ttggtcacca
ttcactgatg
ttattgctta
ataaacacac
gacacgtctt
tctgtacata
gtatgtcaac
aagcattcct
acctggaaaa
cagtgtgcca
atggccttgt
cggtgtgtaa
gtgtctgtta
cttatatgca
tgatcgatgc
caaaagcttt
atggagacgg
tagacccctt
tacaagtata
ttcaatggac
actttgtata
ttatttttat 60 aagaaatttg 120 cccacctcat 180 aaaggagaac 240 ttttatgctt 300 aaagtaagaa 360 tttgtgctac 420 attaccagcc 480 tgattataca 540 tttagtttgg 600 ttcacttttt 660 tttattttct 720 taatattgtt 780 accttaataa 840 aaaaactaga 900 tagacacaca 960 cctacaagtt 1020 ataagaaaaa 1080 atggctttga 1140 atatatatat 1200 taaggacaag 1260 tctatatgaa 1320 attttcaata 1380 acaagttagt 1440 atggttcctt 1500 aaagctagat 1560 gttagaaatt 1620 tattgagtgt 1680 aggtatgtgg 1740 agctagactt 1800 ctgatcctca 1860 tcatcgatga 1920 ctgttgagag 1980 attaataata 2040 ttccagacta 2100 atagcatcct 2160 tatactaatt 2220 acaattaatt 2280 tcaagaagca 2340 tgcatcggtg 2400 acaacaagaa 2460 gcgctcctca 2520 ttaattacct 2580 attactacag 2640 tgagaatgac 2700 agagtggaag 2760 tatggaaata 2820 acttggaagg 2880 tccaatcaat 2940 tatttgttta 3000 caactcaacc 3060 aatccaagtt 3120 3133
<210> 8 <211> 608 <212> PRT <213> Pueraria montana var. Iobata <220>
<223> Isopreno sintase (IspS) de uva kudzu
<400> 8
Met Ala Thr Asn Leu Leu Cys Leu Ser Asn Lys Leu Ser Ser Pro Thr 1 $ 10 15
Pro Thr Pro Ser Thr Arg Phe Pro Gln Ser Lys Asn Phe Ile Thr Gln 20 25 30
Lys Thr Ser Leu Ala Asn Pro Lys Pro Trp Arg Val Ile Cys Ala Thr 35 40 45
Ser Ser Gln Phe Thr Gln Ile Thr Glu His Asn Ser Arg Arg Ser Ala 50 55 60
Asn Tyr Gln Pro Asn Leu Trp Asn Phe Glu Phe Leu Gln Ser Leu Glu 65 70 75 80
Asn Asp Leu Lys Val Glu Lys Leu Glu Glu Lys Ala Thr Lys Leu Glu
85 90 95
Glu Glu Val Arg Cys Met He Asn Arg Val Asp Thr Gln Pro Leu Ser 100 105 HO
Leu Leu Glu Leu Ile Asp Asp Val Gln Arg Leu Gly Leu Thr Tyr Lys 115 120 125
Phe Glu Lys Asp Ile Ile Lys Ala Leu Glu Asn Ile Val Leu Leu Asp 130 135 140
Glu Asn Lys Lys Asn Lys Ser Asp Leu His Ala Thr Ala Leu Ser Phe 145 150 155 160
Ara Leu Leu Arg Gln His Gly Phe Glu Val Ser Gln Asp Val Phe Glu 165 170 175
Arg Phe Lys Asp Lys Glu Gly Gly Phe Ser Gly Glu Leu Lys Gly Asp 180 185 190
Val Gln Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Tyr Leu Gly Phe Glu 195 200 205
Gly Glu Asn Leu Leu Glu Glu Ala Arg Thr Phe Ser Ile Thr His Leu 210 215 220
Lys Asn Asn Leu Lys Glu Gly Ile Asn Thr Lys Val Ala Glu Gln Val 225 230 235 240
Ser His Ala Leu Glu Leu Pro Tyr His Gln Arg Leu His Arg Leu Glu 245 250 255
Ala Arg Trp Phe Leu Asp Lys Tyr Glu Pro Lys Glu Pro His His Gln 260 265 270 Leu Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Met Val Gln Thr Leu 275 280 285
His Gln Lys Glu Leu Gln Asp Leu Ser Arg Trp Trp Thr Glu Met Gly 290 295 300
Leu Ala Ser Lys Leu Asp Phe Val Arg Asp Arg Leu Met Glu Val Tyr 305 310 315 320
Phe Trp Ala Leu Gly Met Ala Pro Asp Pro Gln Phe Gly Glu Cys Arg 325 330 335
Lys Ala Val Thr Lys Met Phe Gly Leu Val Thr Ile Ile Asp Asp Val 340 345 350
Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Thr Asp Ala 355 360 365
Val Glu Arg Trp Asp Val Asn Ala lie Asn Thr Leu Pro Asp Tyr Met 370 375 380
Lys Leu Cys Phe Leu Ala Leu Tyr Asn Thr Val Asn Asp Thr Ser Tyr 385 390 395 400
Ser Ile Leu Lys Glu Lys Gly His Asn Asn Leu Ser Tyr Leu Thr Lys 405 410 415
Ser Trp Arg Glu Leu Cys Lys Ala Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Ser 420 425 430
Asn Asn Lys Ile Ile Pro Ala Phe Ser Lys Tyr Leu Glu Asn Ala Ser 435 440 4 45
Val Ser Ser Ser Gly Val Ala Leu Leu Ala Pro Ser Tyr Phe Ser Val 450 455 460
Cys Gln Gln Gln Glu Asp Ile Ser Asp His Ala Leu Arg Ser Leu Thr 465 470 475 480
Asp Phe His Gly Leu Val Arg Ser Ser Cys Val Ile Phe Arg Leu Cys 485 490 495
Asn Asp Leu Ala Thr Ser Ala Ala Glu Leu Glu Arg Gly Glu Thr Thr 500 505 510
Asn Ser Ile Ile Ser Tyr Met His Glu Asn Asp Gly Thr Ser Glu Glu 515 520 525
Gln Ala Arg Glu Glu Leu Arg Lys Leu Ile Asp Ala Glu Trp Lys Lys 530 535 540
Met Asn Arg Glu Arg Val Ser Asp Ser Thr Leu Leu Pro Lys Ala Phe 545 550 555 560
Met Glu Ile Ala Val Asn Met Ala Arg Val Ser His Cys Thr Tyr Gln 565 570 575
Tyr Gly Asp Gly Leu Gly Arg Pro Asp Tyr Ala Thr Glu Asn Arg Ile 580 585 590 Lys Leu Leu Leu Ile Asp Pro Phe Pro Ile Asn Gln Leu Met Tyr Val 595 600 605
<210> 9 <211> 595 <212> PRT
<213> Populustremuloides <220>
<223> Isopreno sintase de (IspS) quaking aspen <400> 9
Met Ala Thr Glu Leu Leu Cys Leu His Arg Pro Ile Ser Leu Thr His 1 5 10 15
Lys Leu Phe Arg Asn Pro Leu Pro Lys Val Ile Gln Ala Thr Pro Leu 20 25 30
Thr Leu Lys Leu Arg Cys Ser Val Ser Thr Glu Asn Val Ser Phe Ser 35 40 45
Glu Thr Glu Thr Glu Thr Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser 50 55 60
Trp Asp Tyr Asp Tyr Leu Leu Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser Ile Glu 65 70 75 80
Val His Lys Asp Lys Ala Lys Lys Leu Glu Ala Glu Val Arg Arg Glu 85 90 95
Ile Asn Asn Glu Lys Ala Glu Phe Leu Thr Leu Leu Glu Leu Ile Asp 100 105 110
Asn Val Gln Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Glu Ser Asp Ile Arg 115 120 125
Arg Ala Leu Asp Arg Phe Val Ser Ser Gly Gly Phe Asp Gly Val Thr 130 135 140
Lys Thr Ser Leu His Gly Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln 145 150 155 160
His Gly Phe Glu Val Ser Gln Glu Ala Phe Ser Gly Phe Lys Asp Gln 165 170 175
Asn Gly Asn Phe Leu Glu Asn Leu Lys Glu Asp Ile Lys Ala Ile Leu 180 185 190
Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Phe Leu Ala Leu Glu Gly Glu Asn Ile Leu 195 200 205
Asp Glu Ala Lys Val Phe Ala Ile Ser His Leu Lys Glu Leu Ser Glu 210 215 220
Glu Lys Ile Gly Lys Glu Leu Ala Glu Gln Val Ser His Ala Leu Glu 225 230 235 240
Leu Pro Leu His Arg Arg Thr Gln Arg Leu Glu Ala Val Trp Ser Ile 245 250 255 Glti Ala Tyr Arg Lys Lys Glu Asp Ala Asn Gln Val Leu Leu Glu Leu 260 265 270
Ala Ile Leu Asp Tyr Asn Met Ile Gln Ser Val Tyr Gln Arg Asp Leu 275 280 285
Arg Glu Thr Ser Arg Trp Trp Arg Arg Val Gly Leu Ala Thr Lys Leu 290 295 300
His Phe Ala Arg Asp Arg Leu Ile Glu Ser Phe Tyr Trp Ala Val Gly 305 310 315 320
Val Ala Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Asp Cys Arg Asn Ser Val Ala Lys 325 330 335
Met Phe Ser Phe Val Thr Ile Ile Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly 34 0 345 350
Thr Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Glu Arg Trp Asp 355 360 365
Val Asn Ala Ile Asn Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu 370 375 380
Ala Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Glu Ile Ala Tyr Asp Asn Leu Lys Asp 385 390 395 400
Lys Gly Glu Asn Ile Leu Pro Tyr Leu Thr Lys Ala Trp Ala Asp Leu 405 410 415
Cys Asn Ala Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Leu Tyr Asn Lys Ser Thr 420 425 430
Pro Thr Phe Asp Asp Tyr Phe Gly Asn Ala Trp Lys Ser Ser Ser Gly 435 440 445
Pro Leu Gln Leu Ile Phe Ala Tyr Phe Ala Val Val Gln Asn Ile Lys 450 455 460
Lys Glu Glu Ile Glu Asn Leu Gln Lys Tyr His Asp Ile Ile Ser Arg 465 470 475 480
Pro Ser His Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ser Ala 485 490 495
Glu Ile Ala Arg Gly Glu Thr Ala Asn Ser Val Ser Cys Tyr Met Arg 500 505 510
Thr Lys Gly Ile Ser Glu Glu Leu Ala Thr Glu Ser Val Met Asn Leu 515 520 525
Ile Asp Glu Thr Trp Lys Lys Met Asn Lys Glu Lys Leu Gly Gly Ser 530 535 540
Leu Phe Ala Lys Pro Phe Val Glu Thr Ala Ile Asn Leu Ala Arg Gln 545 550 555 560
Ser His Cys Thr Tyr His Asn Gly Asp Ala His Thr Ser Pro Asp Glu 565 570 575 Leu Thr Arg Lys Arg Val Leu Ser Val Ile Thr Glu Pro Ile Leu Pro 580 585 590
Phe Glu Arg 595
<210> 10
<211> 595
<212> PRT
<213> Populusnigra
<220>
<223> Isopreno sintase (IspS) de álamo Lombardy <400> 10
Met Ala Thr Glu Leu Leu Cys Leu His Arg Pro Ile Ser Leu Thr His 1 5 10 15
Lys Leu Phe Arg Asn Pro Leu Pro Lys Val Ile Gln Ala Thr Pro Leu 20 25 30
Thr Leu Lys Leu Arg Cys Ser Val Ser Thr Glu Asn Val Ser Phe Thr 35 40 45
Glu Thr Glu Thr Glu Thr Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser 50 55 60
Trp Asp Tyr Asp Tyr Leu Leu Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser Ile Glu 65 70 75 80
Val Tyr Lys Asp Lys Ala Lys Lys Leu Glu Ala Glu Val Arg Arg Glu 85 90 95
Ile Asn Asn Glu Lys Ala Glu Phe Leu Thr Leu Pro Glu Leu Ile Asp 100 105 110
Asn Val Gln Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Glu Ser Asp Ile Arg 115 120 125
Arg Ala Leu Asp Arg Phe Val Ser Ser Gly Gly Phe Asp Ala Val Thr 130 135 140
Lys Thr Ser Leu His Ala Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln 145 150 155 160
His Gly Phe Glu Val Ser Gln Glu Ala Phe Ser Gly Phe Lys Asp Gln 165 170 175
Asn Gly Asn Phe Leu Lys Asn Leu Lys Glu Asp Ile Lys Ala Ile Leu 180 185 190
Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Phe Leu Ala Leu Glu Gly Glu Asn Ile Leu 195 200 205
Asp Glu Ala Lys Val Phe Ala Ile Ser His Leu Lys Glu Leu Ser Glu 210 215 220
Glu Lys Ile Gly Lys Asp Leu Ala Glu Gln Val Asn His Ala Leu Glu 225 230 235 240 Leu Pro Leu His Arg Arg Thr Gln Arg Leu Glu Ala Val Trp Ser Ile 245 250 255
Glu Ala Tyr Arg Lys Lys Glu Asp Ala Asp Gln Val Leu Leu Glu Leu 260 265 270
Ala Ile Leu Asp Tyr Asn Met Ile Gln Ser Val Tyr Gln Arg Asp Leu 275 280 285
Arg Glu Thr Ser Arg Trp Trp Arg Arg Val Gly Leu Ala Thr Lys Leu 290 295 300
His Phe Ala Arg Aâp Arg Leu Ile Glu Ser Phe Tyr Trp Ala Val Gly 305 310 315 320
Val Ala Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Asp Cys Arg Asn Ser Val Ala Lys 325 330 335
Met Phe Ser Phe Val Thr Ile Ile Asp Asp He Tyr Asp Val Tyr Gly 340 345 350
Thr Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Alá Val Glu Arg Trp Asp 355 360 365
Val Asn Ala Ile Asp Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys Leu Cys Phe Leu 370 375 380
Ala Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Glu Ile Ala Tyr Asp Asn Leu Lys Aâp 385 390 395 400
Lys Gly Glu Asn Ile Leu Pro Tyr Leu Thr Lys Ala Trp Ala Asp Leu 405 410 415
Cys Asn Ala Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Leu Tyr Asn Lys Ser Thr 420 425 430
Pro Thr Phe Asp Glu Tyr Phe Gly Asn Ala Trp Lys Ser Ser Ser Gly 435 440 445
Pro Leu Gln Leu Val Phe Ala Tyr Phe Ala Val Val Gln Asn Ile Lys 450 455 460
Lys Glu Glu Ile Asp Asn Leu Gln Lys Tyr His Asp Ile Ile Ser Arg 465 470 475 480
Pro Ser His Ile Phe Arg Leu Cys Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ser Ala 485 490 495
Glu Ile Ala Arg Gly Glu Thr Ala Asn Ser Val Ser Cys Tyr Met Arg 500 505 510
Thr Lys Gly Ile Ser Glu Glu Leu Ala Thr Glu Ser Val Met Asn Leu 515 520 525
Ile Asp Glu Thr Trp Lys Lys Met Asn Lys Glu Lys Leu Gly Gly Ser 530 535 540
Liu Phe Ala Lys Pro Phe Val Giu Thr Ala íle Asn Leu Ala Arg Gln 545 550 555 560 Ser Kis Cys Thr Tyr His Asn Gly Asp Ala His Thr Ser Pro Asp Glu 565 570 575
Leu Thr Arg Lys Arg Val Leu Ser Val Ile Thr Glu Pro Ile Leu Pro 580 585 590
Phe Glu Arg 595
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de seqüência artificial: seqüência inicial de proteína madura de isopreno sintase (IspS) de álamo branco com peptídeo de trânsito de cloroplasto omitido <400> 11
Cys Ser Val Ser Thr Glu Asn i 5
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de seqüência artificial: Iniciador de amplificação por
PCR lspS_F_Ndel <400> 12
ctgggtcata tggaagctcg acgaa 25
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de seqüência artificial: Iniciador de amplificação por
PCR lspS_R_Hindlll <400> 13
atggaaaacc tgaagctttt aacgttcaa 29

Claims (26)

1. Método para a produção de hidrocarbonetos de isopreno em um microorganismo selecionado do grupo consistindo em microalgas, ciano- bactérias ou bactérias fotossintéticas, o método compreendendo: introdução de um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica isopreno sintase, no microorganismo; e cultura do microorganismo sob condições nas quais o ácido nu- cleico que codifica isopreno sintase é expresso.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microor- ganismo é uma microalga que é uma alga verde.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a alga verde é selecionada do grupo consistindo em Chlamydomonas reinhardtii, Scene- desmus obliquus, Chlorella vulgaris ou Dunaliella salina.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microor- ganismo é uma cianobactéria.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a cianobac- téria é Synechocystis sp.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microor- ganismo é uma bactéria fotossintética.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a bactéria fotossintética é Rhodospirillum rubrum.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o ácido nu- cleico codifica uma isopreno sintase que compreende os resíduos de amino- ácido 53 a 595 de SEQ ID NO: 2.
9. Microorganismo selecionado do grupo consistindo em uma célula de microalga, uma célula de cianobactéria e uma célula de bactéria fotossintética, em que o microorganismo compreende um ácido nucleico he- terólogo que codifica isopreno sintase e é operavelmente ligado a um promotor.
10. Microorganismo de acordo com a reivindicação 9, em que o microorganismo é uma microalga que é uma alga verde.
11. Microorganismo de acordo com a reivindicação 10, em que a alga verde é selecionada do grupo consistindo em Chlamydomonas rei- nhardtii, Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris ou Dunaliella salina.
12. Microorganismo de acordo com a reivindicação 9, em que o microorganismo é uma cianobactéria.
13. Microorganismo de acordo com a reivindicação 12, em que a cianobactéria é Synechocystis sp.
14. Microorganismo de acordo com a reivindicação 9, em que o microorganismo é uma bactéria fotossintética.
15. Microorganismo de acordo com a reivindicação 14, em que a bactéria fotossintética é Rhodospirillum rubrum.
16. Microorganismo de acordo com a reivindicação 9, em que o ácido nucleico heterólogo codifica uma isopreno sintase que compreende os resíduos de aminoácido 53-595 de SEQ ID NO: 2.
17. Método de produção de hidrocarbonetos de isopreno em um microorganismo que compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica isopreno sintase e que é selecionado do grupo consistindo em microalgas, cianobactérias, bactérias fotossintéticas e bactérias não-fotossintéticas, o método compreendendo: cultura em massa do microorganismo em um bioreator vedado sob condições nas quais o gene de isopreno sintase é expresso; e coleta dos hidrocarbonetos de isopreno voláteis produzidos pelo microorganismo.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o micro- organismo é uma microalga que é uma alga verde.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a alga verde é selecionada do grupo consistindo em Chlamydomonas reinhardtii, Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris ou Dunaliella salina.
20. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o micro- organismo é uma cianobactéria.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a ciano- bactéria é Synechoeystis sp.
22. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o micro- organismo é uma bactéria fotossintética.
23. Método de acordo com a reivindicação 22 em que a bactéria fotossintética é Rhodospirillum rubrum.
24. Método de acordo com a reivindicação 17 em que o microor- ganismo é uma bactéria não-fotossintética.
25. Método de acordo com a reivindicação 24 em que a bactéria não-fotossintética é Escherichia coli.
26. Método de acordo com a reivindicação 17 em que o ácido nucleico heterólogo codifica uma isopreno sintase que compreende os resí- duos de aminoácido 53 a 595 de SEQ ID NO: 2.
BRPI0713112-7A 2006-06-29 2007-06-29 produção de hidrocarboneto volátil de cadeia curta usando microalgas, cianobactérias ou bactérias geneticamente manipuladas BRPI0713112A2 (pt)

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US11/770,412 2007-06-28
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