BRPI0713123A2 - composição de heparina de baixo peso molecular e uso da mesma - Google Patents

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BRPI0713123A2
BRPI0713123A2 BRPI0713123-2A BRPI0713123A BRPI0713123A2 BR PI0713123 A2 BRPI0713123 A2 BR PI0713123A2 BR PI0713123 A BRPI0713123 A BR PI0713123A BR PI0713123 A2 BRPI0713123 A2 BR PI0713123A2
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Mallik Sundaram
Ganesh Venkataram
Patricia Oliver
Yiming Yao
Zainab Sirajbhai Mamuwala
Ian Fier
Yi We Qi
Zachary Shriver
Ishan Capila
Nur Sibel Gunay
Daniele Beccati
Cuihua Liu
Corinne Bauer
Ying Li
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Momenta Pharmaceutical Inc
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COMPOSIçãO DE HEPARINA DE BAIXO PESO MOLECULAR E USO DA MESMA. A presente invenção refere-se a preparações de heparinas de baixo peso molecular (LMWHs) que tem propriedades aperfeiçoadas, por exemplo, propriedades que proporcionam uma vantagem clínica. Métodos de produção e uso, bem como métodos de análise de materiais de partida, processamento, intermediários e produtos finais na produção de tais preparações de LMWH, são providos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÃO DE HEPARINA DE BAIXO PESO MOLECULAR E USO DA MESMA".
Este pedido de patente reivindica prioridade dos Pedidos Provi- sórios dos Estados Unidos Números de Séries 60/809.136, depositado em 25 de maio de 2006; 60/849.578, depositado em 4 de outubro de 2006; e 60/849.628, depositado em 5 de outubro de 2006, os conteúdos dos quais são incorporados aqui por referência. Antecedentes
A presente invenção refere-se a coagulação que é uma trajetória fisiológica envolvida na manutenção de hemostasia de sangue normal em mamíferos. Sob condições nas quais um dano vascular ocorre, a trajetória de coagulação é estimulada para formar um coágulo de sangue para preve- nir a perda de sangue. Imediatamente após o dano vascular ocorrer, as pla- quetas sangüíneas começam a agregarem-se no local de dano, formando um tampão físico para cessar o vazamento. Em adição, o vaso que sofreu dano suporta vasoconstrição para reduzir o fluxo sangüíneo para a área, e fibrina começa a se agregar, formando uma rede insolúvel ou coágulo, que cobre a área que sofreu ruptura.
Quando um desequilíbrio na trajetória de coagulação altera a coagulação excessiva, o resultado é o desenvolvimento de tendências trom- bóticas que são freqüentemente manifestadas como ataques de coração, derrames cerebrais, trombose de veia profunda, e síndromes coronarianas agudas, tais como enfartos miocardiais, e angina instável. Além disso, um embolismo pode se originar de um trombo, e resultar em um embolismo pulmonar ou embolismo vascular cerebral, incluindo derrame cerebral ou ataque de isquemia transiente. As terapias atuais para tratamento de distúr- bios associadas com desequilíbrios na trajetória de coagulação envolvem muitos riscos, e devem ser cuidadosamente controladas.
A heparina e heparinas de baixo peso molecular (LMWHs), complexo, polissacarídeos sulfatados isolados de fontes endógenas, são moduladores potentes de hemostasia. A heparina, um glicosaminoglican si- milar a heparina altamente sulfatada (HLGAG) produzido por células mastro, é um anticoagulante clínico amplamente usado, e é um dos primeiros fárma- cos biopoliméricos e um dos poucos fármacos de carboidrato. A heparina e moléculas derivadas do mesmo são anticoagulantes potentes que são usa- dos em uma variedade de situações clínicas, especialmente para distúrbios tromboembólicas incluindo a profilaxia e tratamento de trombose venosa pro- funda e embolismo pulmonar, tromboses arteriais, e síndromes coronárias agudas similares a infarto e angina instável. A heparina e LMWHs interagem com componentes múltiplos da cascata de coagulação para inibir o processo de coagulação. A heparina induz principalmente seu efeito através de dois mecanismos, ambos dos quais envolvem ligação de antitrombina III(AT-III) a uma seqüência de pentassacarídeo específica Hnac/s,6sGHns,3s,6sI2sHns,6s contida dentro do polímero. Primeiro, a ligação de AT-III ao pentassacarídeo induz uma mudança conformacional na proteína que intermedia sua inibição de fator Xa. Segundo, a trombina (fator lia) também se liga a heparina em um local próximo ao pentassacarídeo/local de ligação de AT-III. A formação de um complexo ternário entre AT-III, trombina e heparina, resulta em inati- vação de trombina. Diferente de sua atividade de anti-Xa que requer somen- te o local de ligação de AT-III-pentassacarídeo, a atividade anti-lla da hepa- rina é dependente do tamanho, em adição a unidade de pentassacarídeo responsável pela atividade de anti-Xa para a formação eficiente de um AT- III, trombina, e complexo ternário de heparina. A heparina também media a liberação de inibidor de trajetória de fator de tecido (TFPI) de células endote- liais. O TFPI, um co-fator de heparina, é uma serina protease que se liga diretamente a e inibe fator. TFPI é um antitrombótico potente, particularmen- te quando co-administrado com heparina.
Embora a heparina seja altamente eficaz em uma variedade de situações clínicas, e tenha o potencial para ser usada em muitas outras, os efeitos colaterais associados com terapia de heparina são muitos e variados. A anticoagulação tem sido a aplicação clínica principal para heparina não- fracionada por cerca de 65 anos. Devido às suas farmacocinéticas intrave- nosas erráticas e falta de biodisponibilidade subcutânea, a UFH tem sido administrada por injeção intravenosa ao invés. Adicionalmente, a aplicação de UHF como um anticoagulante tem sido prejudicada por muitos efeitos colaterais com ligação de proteína de plasma não-específica com UFH.
Isto tem conduzido a explosão na geração e utilização de hepa- rina de baixo peso molecular (LMWH) como uma alternativa eficaz a UFH.
LMWH proporciona uma ação farmacológica mais prognosticável, efeitos colaterais reduzidos, e melhor biodisponibilidade do que UFH. Desde que as preparações de LMWH comercialmente disponíveis não sejam totalmente neutralizadas por protamina, uma reação inesperada pode ter efeitos extre- mamente adversos; a atividade de anti-Xa de enoxaparina e outra LMWH são neutralizáveis somente para uma extensão de cerca de 40% com ≤ de Protamina/100 IU de anti-Xa LMWH. A atividade de anti-lla é neutralizável somente para a extensão de cerca de 60% com ≤ 2 mg de Protamina/100 IU anti-Xa LMWH. (Por outro lado, a atividade de anti-Xa e anti-lla de UFH é neutralizável quase completamente (>90%) com ≤ 2 mg de Protamina sulfa- to/100 IU anti-Xa UFH).
Preparações farmacêuticas destes polissacarídeos, tipicamente isolados da mucosa intestinal suína, são heterogêneas no comprimento e composição. Como tal, somente uma porção de uma preparação típica pos- sui atividade anticoagulante. Na melhor das hipóteses, a maioria das cadeias de polissacarídeo em uma preparação farmacêutica de heparina ou LMWH são inativas, na pior das hipóteses, estas cadeias interagem não- especificamente com proteínas de plasma para induzir os efeitos colaterais associados com terapia de heparina. Portanto, é importante desenvolver no- vas LMWHs que retêm a atividade anticoagulante e outras atividades dese- jadas de UFH, mas tenham efeitos colaterais reduzidos. As LMWHs, essen- cialmente devido a seus tamanhos de cadeias reduzidos e dispersidade, re- velam ligação de proteína de plasma não-específica menos marcante. Con- tudo, todas as LMWHs que são atualmente clinicamente disponíveis também possuem atividade de anti-lla reduzida conforme comparada a UFH. Devido a esta atividade diminuída, uma grande dose de LMWH é requerida (compa- rada a UFH) de modo a alcançar uma atividade de anti-Xa e anti-lla similar, e os testes padrões para atividade de UFH, tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT), ou tempo de coagulação ativado, não são úteis, visto que eles ocorrem principalmente na atividade de anti-IIa para uma leitura. O teste mais amplamente usado para monitoramento de níveis de LMWH é um teste de atividade de anti-Xa, que depende do indivíduo ter níveis suficientes de antitrombina III (ATUI), que não é sempre o caso. Este teste é muito oneroso (bem acima de $100.000), e não é rotina ou prontamente disponível, visto que as amostras geralmente devem ser enviadas para um laboratório exter- no para análise. Consequentemente, o uso de LMWHs tem sido grandemen- te limitado à prevenção de trombose, e não a seu tratamento, e a população de pacientes a quem ela pode ser administrada tem sido limitado, excluindo, entre outros, pacientes pediátricos, pacientes com função renal anormal con- forme medida por RFI, uréia, creatinina, fósforo, taxa de filtração glomerular (GFR), ou BUN (nível de Uréia Nitrogênio no Sangue) no sangue e urina, e a população de paciente de cardiologia intervencional.
Sumário da Invenção
A invenção é baseada, em parte, no desenvolvimento de prepa- rações de LMWHs tendo, por exemplo, designadas para terem, propriedades aperfeiçoadas, por exemplo, propriedades que proporcionam uma vantagem clínica. Tais propriedades funcionais incluem, por meio de exemplo, uma ou mais de: reversibilidade em resposta a sulfato de protamina, farmacocinéti- cas prognosticáveis ou, de outro modo, aperfeiçoadas, atividade de anti-lla aperfeiçoada, conforme comparada, por exemplo, a enoxaparina; uma razão de atividade de anti-Xa para atividade de anti-lla relativamente constante sobre um período de cerca de 30 a 180 minutos, níveis de atividade monito- ráveis, biodisponibilidade subcutânea, e probabilidade reduzida de causar trombocitopenia induzida por heparina (HIT). As LMWHs aqui descritas tam- bém têm características estruturais que as distinguem de outras LMWHs comercialmente disponíveis. Por exemplo, uma preparação de LMWH aqui provida pode ter uma ou mais das seguintes características: região de Iiga- ção substancialmente não-detectável; uma quantidade aumentada de 3-0 sulfatos, conforme comparada a preparações de LMWH comercialmente disponíveis; um subconjunto das cadeias tem um AU não-sulfatado na ex- tremidade de não-redução; um subconjunto das cadeias, por exemplo, uma maioria, por exemplo, substancialmente todas as cadeias, têm uma hexosa- mina N-acetilada na extremidade de redução; uma razão de AUHNac,6sG Uns,3s,6s Para AU2sHNs,6slHNac,6sGHNs,3s,6s de cerca de 1:1 a 4:1 (por exemplo, cerca de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1), e substancialmente estruturas ter- minais de redução não-modifiçadas. A invenção inclui preparações de LM- WH tendo uma ou mais destas propriedades e características, bem como métodos de produção e uso de tais preparações. A invenção também carac- teriza métodos de análise de materiais de partida, processamento, interme- diários, e produtos finais, na produção de tais preparações de LMWH.
Consequentemente, em um primeiro aspecto, a invenção carac- teriza uma composição de LMWH tendo: um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, por exemplo, cerca de 5000 a 8300 Da, por exemplo, cerca de 5500 a 8000 Da, por exemplo, cerca de 5700 a 7900 Da, por exemplo, cerca de 5800 a 6800 Da; e
uma atividade de anti-lla de cerca de 50 a 300, por exemplo, cerca de 70 a 280, por exemplo, cerca de 90 a 250 lU/mg, por exemplo, cer- ca de 100 a 250 lU/mg, por exemplo, cerca de 100 a 140 lU/mg, por exem- plo, cerca de 150 a 200 lU/mg, cerca de 130 a 190 lU/mg, por exemplo, cer- ca de 155 a 195 lU/mg.
Em um segundo aspecto, a invenção caracteriza uma composi- ção de LMWH tendo:
um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, por exemplo, cerca de 5000 a 8300 Da, por exemplo, cerca de 5000 a 8000 Da, por exemplo, cerca de 5500 a 8000 Da, por exemplo, cerca de 5700 a 7900 Da, por exemplo, cerca de 5800 a 6800 Da; e
uma atividade de anti-lla que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% neutralizável com protamina, por e- xemplo, conforme medida pelo tempo de coagulação ativado (ACT), ou tem- po de tromboplastina parcial ativado (aPTT). Preferivelmente, a atividade de anti-lla da LMWH é neutralizada por pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% dentro de 5, 10, 15, 30 minutos após admi- nistração de protamina.
Em um terceiro aspecto, a invenção caracteriza uma composi- ção de LMWH tendo:
um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, por exemplo, cerca de 5000 a 8300 Da, por exemplo, cerca de 5500 a 8000 Da, por exemplo, cerca de 5700 a 7900 Da, por exemplo, cerca de 5800 a 6800 Da; e
AUHNac,6sGHNS,3s,6s é 5 a 15%, por exemplo, 7 a 14%, 9 a 12% da composição, por exemplo, conforme medido por mol%. Preferivelmente, o AUHNac,6sGHNs,3s,6s na extremidade de não-redução da molécula de cerca de 5 a 15%, por exemplo, 7 a 14%, por exemplo, 9 a 12% das cadeias na composição, por exemplo, conforme medido por mol%.
Em um quarto aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH tendo:
um comprimento de cadeia médio de cerca de 9 a 18 dissacarídeos, ou 8 a 18 dissacarídeos, por exemplo, cerca de 9 a 16, ou 8 a 16 dis- sacarídeos; e
AUHNac,6sGHNs,3s,6s é 5 a 15%, por exemplo, 7 a 14%, por e- xemplo, 9 a 12% da composição, por exemplo, conforme medido por mol%. Preferivelmente, o AUHNac,6sGHns,3s.es na extremidade de não-redução da molécula de cerca de 5 a 15%, por exemplo, 7 a 14%, por exemplo, 9 a 12% das cadeias na composição, por exemplo, conforme medido por mol%.
Em um quinto aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH tendo:
um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, por exemplo, cerca de 5000 a 8300 Da, por exemplo, cerca de 5500 a 8000 Da1 por exemplo, cerca de 5700 a 7900 Da, por exemplo, cerca de 5800 a 6800 Da; e
uma razão de anti-Xa para anti-lla de 3:1 ou menos, por exem- plo, 2:1, por exemplo, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, ou 0,5:1.
Preferivelmente, a razão de anti-Xa para anti-lla permanece rela- tivamente constante sobre o curso de uma administração da preparação de LMWH, por exemplo, a razão de anti-Xa para anti-lla varia não mais do que cerca de ± 1,5, ± 1, ± 0,5, ± 0,2, sobre urn período de cerca de 30, 60, 120, 180, 240, 300 minutos. Por exemplo, se uma razão inicial de atividade anti- Xa para atividade de anti-lla é 2, então a razão medida em um segundo tempo (por exemplo, 30, 60, 120, 180, 240, 300 minutos) após a administra- ção inicial preferivelmente será menor do que 3, e preferivelmente em ou ao redor de 2.
Em um sétimo aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH tendo:
opcionalmente, um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, por exemplo, cerca de 5000 a 8300 Da, por exemplo, cerca de 5500 a 8000 Da, por exemplo, cerca de 5700 a 7900 Da, por exemplo, cerca de 5800 a 6800 Da; e
quando analisado por digestão com heparinase I, heparinase II e heparinase III, e eletroforese capilar, cada um dos picos 1-14 da Tabela 10A está presente.
Em uma concretização preferida: a quantidade de cada pico na composição de LMWH, conforme analisada por digestão com heparinase I, heparinase II e heparinase III, e eletroforese capilar, é cerca daquela encon- trada na Tabela 10A, a quantidade de cada pico está dentro de uma faixa provida na Tabela 10A; a quantidade dos picos 10 e 11 está dentro de uma faixa provida na da Tabela 10A.
Em um oitavo aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH tendo:
opcionalmente, um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, por exemplo, cerca de 5000 a 8300 Da, por exemplo, cerca de 5500 a 8000 Da, por exemplo, cerca de 5700 a 7900 Da, por exemplo, cerca de 5800 a 6800 Da; e
quando analisado por prótons de ressonância magnética nuclear 2D (RMN) para cada uma das estruturas da Tabela 11A estão presentes.
Em uma concretização preferida: a quantidade de cada uma das estruturas na composição de LMWH, conforme analisada por 2D RMN, é cerca daquela encontrada na Tabela 11 A.
Em um nono aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH tendo uma ou mais das seguintes características:
a composição tem substancialmente estruturas terminais de re- dução não-modificadas (por exemplo, pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais das cadeias não têm); pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% das cadeias da composição têm HNac na extremidade de não-redução; me- nos do que 90%, 95%, 98%, 99%, preferivelmente nenhuma das cadeias da composição tem um AU sulfatado na extremidade de não-redução; não exis- te substancialmente região de ligação (por exemplo, menos do que cerca de 0,1% de região de ligação) presente na composição; a composição tem mais cadeias com 3-0 sulfatos do que as LMWHs comercialmente disponíveis, por exemplo, enoxaparina ou dalteparina; e a razão de AUHNac,6sGHNS,3s,6s para AU2sHNs,6slHNac,6sGHNs,3s,6s na composição é cerca de 1:1 a 4:1.
Em uma concretização, a composição tem duas, três, quatro, cinco ou todas destas características.
Em um décimo aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH tendo a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 9</formula>
no qual R é H ou SO3X;
R1 é SO3X ou COCH3;
X é um cátion monovalente ou divalente;
η = 2-50, por exemplo, 2-40; e
a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 9- 16, 8-16, ou 8-15.
Em uma concretização, a composição de LMWH tem a seguinte estrutura: no qual
<formula>formula see original document page 10</formula>
R é H ou SO3X;
R1 é SO3X ou COCH3;
X é um cátion monovalente ou divalente,
η = 2-50, por exemplo, 4-40; e
a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 9-16, 8-16, ou 8-15.
Em um décimo primeiro aspecto, a composição de LMWH tem a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 10</formula>
no qual X é Na ou Ca, R é H ou SO3Na;
R1 é SO3Na ou COCH3;
η = 2-45, por exemplo, 2-35; e
a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 7-13 ou 8-12.
Em uma concretização, a composição de LMWH tem a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 11</formula>
no qual:
<formula>formula see original document page 11</formula>
X é Na ou Ca, R é H ou SO3Na;
R1 é SO3Na ou COCH3;
n = 2-45, por exemplo, 2-35; e
a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 7-11, ou 8-12.
Esta composição pode ocorrer como um intermediário na produ- ção de uma LMWH, por exemplo, como o produto de digestão enzimática da fração de movimento rápido (conforme aqui discutido).
Em um décimo segundo aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH tendo a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 11</formula>
no qual X é Na ou Ca, R é H ou SO3Na;
R1 é SO3Na ou COCH3;
n = 2-50, por exemplo, 2-40; e
a composição preferivelmente tem um valor médio para n de 8 a 15, por e- xemplo, 10 a 15, ou 9 a 16, por exemplo, 11 a 16.
Em uma concretização, a composição de LMWH tem a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 12</formula>
no qual X é Na ou Ca, R é H ou SO3Na;
R1 é SO3Na ou COCH3;
η = 2-50, por exemplo, 2-40; e
a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 8 a 15, por e- xemplo, 10 a 15, ou 9 a 16, por exemplo, 11 a 16.
Esta composição pode ocorrer como um intermediário na produ- ção de uma LMWH, por exemplo, como o produto de precipitações para pro- porcionar uma fração de movimento rápido (conforme aqui discutido).
Qualquer das LMWHs aqui descritas, por exemplo, descritas a- cima, podem ter outras propriedades. Por exemplo, uma das composições acima descritas pode adicionalmente ter uma ou mais das propriedades fun- cionais ou estruturais colocadas abaixo.
Desse modo, em uma concretização, a composição de LMWH tem uma atividade de anti-Xa de cerca de 100 a 400 lU/mg, por exemplo, cerca de 120 a 380 lU/mg, por exemplo, cerca de 150 a 350 lU/mg, por e- xemplo, cerca de 170 a 330 lU/mg, por exemplo, cerca de 180 a 300 lU/mg, por exemplo, cerca de 150 a 200 lU/mg, 130 a 220 lU/mg, 225 a 274IU/mg.
Em uma concretização, a composição de LMWH tem uma ativi- dade de anti-Xa que é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% neutralizável, por exemplo, conforme medido por uma ativida- de de anti-Xa, ACT ou aPTT. Preferivelmente, a atividade de anti-Xa é neu- tralizada por pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% dentro de 5, 10, 15 minutos após administração de protamina. Por e- xemplo, a atividade de anti-Xa pode ser neutralizada por pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% dentro de 5, 10, 15, 30 mi- nutos após administração de protamina a uma dose de cerca de 1, 2, 3 mg da composição de LMWH por 100 anti-Xa IU de plasma. Em outra concretização, a composição de LMWH tem uma ou mais das seguintes propriedades: a atividade da composição pode ser moni- torada por um aPTT e/ou ACT; a polidispersibilidade da composição é menor do que 1,6, por exemplo, a polidispersibilidade é cerca de 1,6 a 1,1, por e- xemplo, 1,5 a 1,1, por exemplo, 1,4 a 1,1, por exemplo, 1,3 a 1,1, por exem- plo, 1,2 a 1,1; menos do que 70%, 60%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30% das ca- deias presentes na composição têm um peso molecular maior do que do que 7500 ou 8000 Da; menos do que 40%, 35%, 25% das cadeias presentes na composição têm um peso molecular menor do que 5500 ou 5000 Da; a com- posição compreende uma mistura de estruturas de AU e l/G nas extremida- des de não-redução das cadeias; e poucas cadeias na composição têm lo- cais de ligação de PF4 do que enoxaparina, dalteparina, UFH.
Em uma concretização, cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45%, 50% das cadeias têm um AU na extremidade de não-redução. Preferi- velmente, cerca de 15% a 50%, por exemplo, 15% a 35% das cadeias, por exemplo, 20% a 35% das cadeias na composição têm um AU na extremida- de de não-redução.
Em uma concretização, a composição de LMWH tem um grau mais alto de sulfatação do que enoxaparina ou dalteparina. Em uma concre- tização, a composição de LMWH tem mais dissacarídeos trisulfatados pre- sentes na composição do que enoxaparina ou dalteparina, por exemplo, a composição de LMWH tem cerca de 50 a 65% de dissacarídeos trissulfata- dos, por exemplo, 55 a 60%, 55 a 58%, 57 a 60% de dissacarídeos trisulfa- tados, conforme determinado por mol%.
Em uma concretização, a composição compreende um nível mais alto de AUHNac,6sGHNs,3s,6s do que enoxaparina, daltaparina e/ou UFH, por exemplo, compreende cerca de 5 a 15 mol%, por exemplo, 7 a 14 mol%, por exemplo, 9 a 12 mol%.
Em uma concretização, a composição de LMWH tem um teor de cálcio menor do que 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1,0%, e/ou um teor de sódio me- nor do que 30%, 25%, 20%, 15%, 10%. Em uma concretização, a composi- ção de LMWH compreende: menos do que 1000 ng/mg, 750 ng/mg, 500 ng/mg, 250 ng/mg de uma enzima heparinase, por exemplo, uma enzima heparinase descrita aqui; menos do que 1,0%, 0,5%, 0,3% peso/peso de metanol; menos do que 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,1% de peso/peso de etanol; menos do que 2,0%, 1,75%, 1,25%, 1,0%, 0,5%, 0,3%, 0,15% de cloreto;
menos do que 15%, 10%, 5%, 2,5% de água por peso; menos do que 2000, 1500, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300 ppm de sulfato livre.
Em uma concretização, a composição de LMWH proporciona liberação aumentada de TFPI comparada a enoxaparina. Em uma concreti- zação, a LMWH proporciona pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 vezes aumento na liberação de TFPI conforme comparada a enoxaparina.
Em uma concretização, a composição de LMWH tem uma meia- vida intravenosa de cerca de 30 minutos a 3 horas, por exemplo, cerca de 1 a 2 horas. Em uma concretização, a composição de LMWH tem uma meia- vida subcutânea de cerca de 30 minutos a 3,0 horas, por exemplo, cerca de 1,5 a 2,5 horas, por exemplo, cerca de 2 horas.
Em uma concretização de qualquer dos primeiro, segundo, ter- ceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono e décimo aspectos, a com- posição de LMWH tem uma ou mais das seguintes características:
a composição tem substancialmente estruturas terminais de re- dução não-modificadas (por exemplo, pelo menos 85%, 90%, 95% ou mais das cadeias não têm); pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% das cadeias da composição têm Hn3C na extremidade de redução; menos do que 90%, 95%, 98%, 99%, preferivelmente nenhuma das cadeias da com- posição tem um AU sulfatado na extremidade de não-redução; não existe substancialmente região de ligação (por exemplo, menos do que 0,1% de região de ligação) presente na composição; a composição tem mais cadeias com 3-0 sulfatos do que as LMWHs comercialmente disponíveis, por exem- plo, enoxaparina ou dalteparina; e a razão de AUHNac,6sGHNs,3s,6s para AU2sHNs,6slHNac,6sGHNs,3s,6s na composição é cerca de 1:1 a 4:1 (por exem- plo, 1:1.2:1, 3:1 ou 4:1). Em uma concretização, a composição de LMWH tem duas, três, quatro, cinco, ou todas destas características.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH tendo as seguintes propriedades:
um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da;
uma atividade de anti-lla de cerca de 50 a 300 lU/mg; atividade de anti-lla que é pelo menos 50% neutralizável com protamina, por exemplo, conforme medida por ACT ou aPTT;
ΔϋHNac,6sGHns,3s.es é 5 a 15% da composição, preferivelmente ΔϋHNac,6sGHNs,3s,6s na extremidade de não-redução de cerca de 5 a 15% da composição;
um comprimento de cadeia médio de cerca de 9 a 16 dissacarí- deos;
uma razão de anti-Xa para anti-lla de 3:1, ou menos; a razão de anti-Xa para anti-lla permanece relativamente cons- tante sobre o curso de uma administração de LMWH1 por exemplo, a razão de anti-Xa para anti-IIa varia não mais do que cerca de ± 1,5, ±1, ± 0,5, ou ± 0,2, sobre um período de cerca de 30, 60, 120, 180, 240, 300 minutos. Por exemplo, se uma razão inicial de atividade de anti-Xa para atividade de anti- IIa é 2, então a razão medida em um segundo tempo (por exemplo, 30, 60, 120, 180, 240, 300 minutos) após a administração inicial preferivelmente se- rá menor do que 3, e, preferivelmente, em ou ao redor de 2.
Em uma concretização preferida, a composição de LMWH tem a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 15</formula>
no qual <formula>formula see original document page 16</formula>
R é H ou SO3Na;
R1 é SO3Na ou COCH3;
η = 2-50, por exemplo, 2-40; e
a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 9 a 16, ou 8 a 15.
Em uma concretização preferida, a composição de LMWH tem as seguintes propriedades:
atividade de anti-Xa de cerca de 100 a 400 lU/mg;
atividade de anti-Xa que é pelo menos 50% neutralizável, por exemplo, conforme medida por atividade de anti-Xa, ACT ou aPTT;
uma polidispersibilidade de menos do que 1,6;
menos do que 70%, 60%, 50% das cadeias presentes na com- posição têm um peso molecular maior do que 7500 Da;
menos do que 40% das cadeias presentes na composição têm 15 um peso molecular menor do que 5000 Da;
inclui uma mistura de estruturas de AU e I/G nas extremidades de não-redução das cadeias;
têm estruturas terminais de redução substancialmente não- modificadas;
poucas cadeias na composição têm locais de ligação de PF4 do que enoxaparina, dalteparina, ou UFH;
pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% das cadeias da composição têm HNAc na extremidade de redução;
cerca de 15% a 35% das cadeias na composição têm um AU nas extremidades de não-redução;
menos do que 90%, 95%, 98%, 99%, preferivelmente nenhuma das cadeias da composição têm um AU sulfatado na extremidade de não-redução. Em uma concretização preferida, a composição de LMWH tem as seguintes propriedades:
tem um grau mais alto de sulfatação do que enoxaparina ou dal- teparina;
tem mais dissacarídeos sulfatados presentes na composição do que enoxaparina ou dalteparina, por exemplo, a composição de LMWH tem cerca de 50 a 65% de dissacarídeos trisulfatados, conforme determinado por mol%;
tem um nível mais alto de AUHNac,6sGHNs,3s,6s do que enoxapa- rina, dalteparina e/ou UFH, por exemplo, AUHNac,6sGHNs,3s,6s está presente a cerca de 5 a 15 mol%.
Em uma concretização preferida, a composição de LMWH tem as seguintes propriedades:
tem um teor de cálcio menor do que 3%, e/ou um teor de sódio menor do que 20%;
inclui menos do que 1000 ng/mg de uma enzima heparinase;
tem menos do que 1,0% p/p de metanol;
tem menos do que 1,0% p/p de etanol;
tem menos do que 2,0% p/p de cloreto;
tem menos do que 15% de água por peso;
tem menos do que 2000 ppm de sulfato livre.
Em uma concretização preferida, a composição de LMWH tem as seguintes propriedades:
proporciona liberação de inibidor de trajetória de fator de tecido (TFPI) aumentada conforme comparada a enoxaparina.
Em uma concretização preferida, a composição de LMWH tem uma meia-vida intravenosa de cerca de 30 minutos a 3 horas.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de produ- ção de uma LMWH. O método inclui:
sujeição da UFH a uma, ou a uma série de etapas de precipita- ções de álcool aquoso (por exemplo, etanol) (pelo menos uma com um sal de sódio (ou um sal outro do que um sal de cálcio)), para extrair fração de peso molecular inferior (por exemplo, fração de movimento rápido), para proporcionar um primeiro intermediário, no qual o primeiro intermediário pre- ferivelmente tem um comprimento de cadeia médio de 10 a 16 dissacarídeos;
digestão do primeiro intermediário usando um agente, por e- xemplo, uma enzima ou químico, que cliva ligações glicosídicas de ácidos urônicos não-sulfatados, por exemplo, uma enzima aqui descrita, por exem- plo, em tampão aquoso, por exemplo, em tampão de sal aquoso, por exem- plo, tampão de acetato de sódio, pH de cerca de 5-9, por exemplo, 7-8 a 25°C a 52°C, por exemplo, 37°C, para produzir um segundo intermediário, no qual o segundo intermediário tem um comprimento de cadeia médio de 8 a 14 dissacarídeos, por exemplo, 8-12 dissacarídeos;
separação dos componentes de antifator Xa e Ila altos de alto peso molecular a partir do segundo intermediário a partir dos materiais de atividade inferior por uma etapa baseada no tamanho, por exemplo, croma- tografia de exclusão de tamanho (SEC), para produzir um terceiro intermedi- ário no qual o terceiro intermediário preferivelmente tem um comprimento de cadeia médio de 9 a 16 dissacarídeos e, opcionalmente
dissolução do terceiro intermediário em água purificada, filtra- gem, por exemplo, através de um filtro de 0,2 pm, e liofilização a substância de fármaco.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza uma composição de LMWH produzida por um método aqui descrito.
Em outro aspecto, o método inclui um intermediário, ou mistura de reação de qualquer dos métodos para produção ou análise de uma LM- WH aqui descrita.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza uma composição far- macêutica que inclui uma composição de LMWH aqui descrita.
Em um aspecto, a composição farmacêutica inclui um transpor- tador farmaceuticamente aceitável.
Em um aspecto, a composição farmacêutica está em uma forma adequada para administração sistêmica. Em uma concretização preferida, a composição farmacêutica é adequada para administração subcutânea, intra- venosa, intra-arterial, intrasinoval, intramuscular, intraperitoneal, intravítrea, epidural, subdural ou intratecal. Em uma concretização, uma composição farmacêutica para administração sistêmica pode ser uma solução isotônica, por exemplo, uma solução isotônica com ou sem conservantes. Exemplos de preservativos incluem, mas não estão limitados a, benzil álcool, manitol e leucina. Uma quantidade de dosagem unitária de uma composição farma- cêutica da invenção pode estar disposta dentro de um acondicionamento, ou de um dispositivo adequado para administração. Por exemplo, uma compo- sição adequada para distribuição subcutânea pode estar disposta dentro de uma seringa configurada para distribuição subcutânea, uma composição a- dequada para distribuição intravenosa pode estar disposta dentro de uma seringa configurada para distribuição intravenosa, ou dentro de outro dispo- sitivo para distribuição intravenosa, por exemplo, um saco ou garrafa de go- tejamento intravenoso.
Em uma concretização, a composição farmacêutica está em uma forma adequada para administração invasiva local, por exemplo, reves- timento, ou dentro de um dispositivo adequado para implantação. Exemplos de dispositivos adequados incluem, mas não estão limitados a, um stent, e um circuito ex-corpóreo. Em uma concretização, a composição farmacêutica está em uma forma adequada para implantação subcutânea, implantação em um tecido ou órgão (por exemplo, uma artéria coronária, artéria carótida, artéria renal, outras artérias periféricas, veias, rim, coração, córnea, vítreo, e cérebro), ou implantação em um espaço que circunda um tecido ou órgão (por exemplo, cápsula do rim, pericárdio, espaço torácico ou peritoneal).
Em uma concretização, a composição farmacêutica é adequada para administração não-invasiva, por exemplo, administração tópica, trans- dermal, pulmonar, nasal, oral, canal auditório, retal ou vaginal. Uma quanti- dade de dosagem unitária de uma composição farmacêutica da invenção pode estar disposta dentro de um acondicionamento, ou de um dispositivo adequado para tal administração.
Em uma concretização, a composição de LMWH é liofilizada. Em outra concretização, a composição de LMWH é um líquido.
Em uma concretização, a invenção caracteriza um recipiente, por exemplo, seringa ou frasco, contendo a composição farmacêutica. Em uma concretização, a composição de LMWH está presente a cerca de 1500IU, 2000IU, 2500IU, 3000IU, 3500IU, 4000IU, 4500IU, 5000IU, 5500IU, 6000IU de atividade de anti-Xa por mL de transportador farmaceuticamente aceitável.
Em uma concretização, a composição farmacêutica tem uma osmolaridade de cerca de 200 a 400 mOsm/L, por exemplo, cerca de 250 a 350 mOsm/L, cerca de 280 a 330 mOsm/L. Em uma concretização, a com- posição farmacêutica compreende adicionalmente cloreto de sódio e água.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de trata- mento de um indivíduo incluindo administrar uma LMWH aqui descrita ao indivíduo. O tratamento pode ser terapêutico, por exemplo, um tratamento que diminui, evita ou melhora uma condição indesejada existente ou sintoma desta, ou profilático, por exemplo, um tratamento que retarda, por exemplo, previne, o começo de uma condição indesejada, ou sistema desta. Uma composição de LMWH aqui descrita pode ser usada para tratar distúrbios que são tratáveis com UFH ou com uma LMWH comercial, por exemplo, e- noxaparina, daltaparina ou tinzaparina. A invenção inclui métodos para tra- tamento de um indivíduo tendo, ou em risco de ter, uma distúrbio ou condi- ção selecionada a partir do grupo consistindo em: uma distúrbio associada com coagulação, por exemplo, trombose de veia profunda (DVT), ou embo- lismo pulmonar, trombose ou doença cardiovascular, por exemplo, síndrome coronária aguda (ACS), angina estável ou não-estável, infarto miocardial, por exemplo, infarto miocardial de ST segmentado elevado (STEMI), ou infarto miocardial de ST não-segmentado elevado (NSTEMI), condições vasculares ou fibrilação atrial; dor de cabeça; aterosclerose; uma distúrbio inflamatória, tal como doença autoimune ou distúrbios atópicas, psoríase, artrite, sepsia; coagulopatia intravascular disseminada (DIC); uma alergia ou uma distúrbio respiratória, tais como asma, enfisema, síndrome de angústia respiratória adulta (ARDS), fibrose cística, ou dano de reperfusão do pulmão; estenose ou restenose; um câncer ou distúrbio metástica; um distúrbio angiogênica; uma distúrbio fibrótrica, tais como fibrose de órgão maior, distúrbios fibropro- liferativas e cicatrização associada com trauma; osteoporose; Alzheimer, fraturas de osso tais como fraturas de bacia. O indivíduo pode estar supor- tanto, ou ter suportado, um procedimento cirúrgico, por exemplo, transplante de órgão, cirurgia ortopédica, reposição de junta, por exemplo, reposição da bacia ou reposição do joelho, intervenção coronária percutânea (PCI), colo- cação de stent, angioplastia, ou cirurgia de enxerto de derivação de artéria coronária (CABG). As composições da invenção são administradas a um indivíduo tendo, ou em risco de, desenvolver uma ou mais das distúrbios em uma quantidade efetiva para tratamento da distúrbio ou condição.
Em uma concretização, o método inclui adicionalmente monito- ramento da atividade da composição de LMWH no indivíduo usando um en- saio de coagulação, por exemplo, usando ACT e/ou aPTT.
Em uma concretização, o método inclui adicionalmente adminis- trar sulfato de protamina após administração da composição de LMWH para neutralizar alguma ou toda da atividade, por exemplo, atividade de anti-Xa e/ou atividade de Ila da composição de LMWH. Em uma concretização, cer- ca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou toda da atividade de anti-lla da composição de LMWH é neutralizada dentro de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 mi- nutos após administração de protamina. Em uma concretização, cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou toda da atividade de anti-lla da compo- sição de LMWH é neutralizada, por exemplo, cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou toda da atividade de anti-lla da composição de LMWH é neutralizada dentro de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 minutos após administração de protamina. Em uma concretização, sulfato de protamina é administrado a uma dose de cerca de 1 mg, 2 mg, 3 mg, 5 mg da composição de LMWH por 100 anti-Xa IU de plasma. A neutralização de atividade de anti-Xa e/ou ativi- dade de anti-lla pode ser determinada, por exemplo, por ACT e/ou aPTT.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de trata- mento (por exemplo, tratamento terapêutico ou profilático) de uma distúrbio, por exemplo, uma distúrbio trombótica, em um indivíduo. O método inclui administrar uma composição de LMWH aqui descrita, para, desse modo, tratar, preferivelmente prevenir, a distúrbio. Em uma concretização, a distúr- bio é uma ou mais de ACS, infarto miocardial, por exemplo, NSTEMI OU STEMI, angina estável e angina instável. Preferivelmente, a distúrbio trom- bótica é trombose arterial, por exemplo, incluindo STEMI. A distúrbio pode estar, por exemplo, associada com intervenção cirúrgica, por exemplo, PCI, colocação de stent, ou angioplastia. Por exemplo, o indivíduo pode ter, ou estar em risco de ter, ou estar se recuperando de, uma intervenção cirúrgica, por exemplo, intervenção de cardiologia (por exemplo, angioplastia, PCI, colocação de stent). Em uma concretização, o indivíduo está em risco (por exemplo, está sendo considerado para) receber intervenção cirúrgica, por exemplo, CABG.
Em uma concretização, a composição de LMWH é administrada ao indivíduo intravenosamente, por exemplo, a uma dose de cerca de 0,03 mg/kg a 0,45 mg/kg, por exemplo, 0,03 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,22 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,27 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,37 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,44 mg/kg. Em concretizações preferidas, a composição de LMWH é administrada intravenosamente a uma dose de cer- ca de 0,1 a 0,3 mg/kg, por exemplo, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,20 mg/kg, 0,22 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,27 mg/kg ou 0,30 mg/kg. Em outra concretização, a composição de LMWH é administrada ao indivíduo subcutaneamente, por exemplo, a uma dose de cerca de 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,44 mg/kg, 0,47 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,60 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1,0 mg/kg. Em outras concretiza- ções, a composição de LMWH é administrada subcutaneamente a uma dose de cerca de 0,15 mg/kg a 1,0 mg/kg, 0,20 a 0,9 mg/kg, 0,25 a 0,9 mg/kg, 0,30 a 0,50 mg/kg, por exemplo, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,42 mg/kg, 0,44 mg/kg, 0,47 mg/kg ou 0,50 mg/kg.
Em uma concretização, o método inclui adicionalmente monito- ramento da atividade da composição de LMWH no indivíduo usando-se um ensaio de coagulação, por exemplo, usando-se ACT e/ou aPTT. Em uma concretização, a atividade de anti-Xa e/ou atividade de anti-IIa é monitorada, por exemplo, com ACT e/ou aPTT, antes de, ou durante, ou após interven- ção cirúrgica, por exemplo, angioplastia, PCI, colocação de stent. Em uma concretização, a atividade de anti-Xa e/ou atividade de anti-lla é monitorada, por exemplo, com ACT e/ou aPTT, antes de, ou durante, e/ou após adminis- tração da composição de LMWH. Em algumas concretizações, a atividade de anti-Xa e/ou atividade de anti-lla é monitorada por ACT, e a dose de LMWH administrada para alcançar um ACT de cerca de 200 a 350 segundos.
Em uma concretização, o método inclui adicionalmente adminis- trar sulfato de protamina após administração da composição de LMWH para neutralizar alguma ou toda da atividade, por exemplo, atividade de anti-Xa e/ou atividade de IIa da composição de LMWH. Em uma concretização, pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou toda da atividade de anti-IIa da composição de LMWH é neutralizada, por exemplo, pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou toda da atividade de anti-lla da composição de LMWH é neutralizada dentro de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 minutos após administração de protamina. Em uma concretização, pelo me- nos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou toda da atividade de anti- IIa da composição de LMWH é neutralizada, por exemplo, pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou toda da atividade de anti-lla da composição de LMWH é neutralizada dentro de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 mi- nutos após administração de protamina. Em uma concretização, sulfato de protamina é administrado a uma dose de cerca de 1,5 mg, por exemplo, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 5 mg da composição de LMWH por 100 anti-Xa IU de plas- ma. A neutralização de atividade de anti-Xa e/ou atividade de anti-lla pode ser determinada, por exemplo, por ACT e/ou aPTT. Em uma concretização, a atividade de anti-Xa e/ou atividade de anti-lla pode ser determinada, por exemplo, por ACT e/ou aPTT, antes de, durante, e/ou após administração de sulfato de protamina. Em uma concretização, a atividade de anti-Xa e/ou atividade de anti-lla é neutralizada antes de, durante ou após intervenção cirúrgica. Por exemplo, em uma concretização, a atividade de anti-Xa e/ou atividade de anti-IIa pode ser neutralizada durante ou após uma intervenção cirúrgica, tais como angioplastia ou PCI. Em outra concretização, a composi- ção de LMWH é neutralizada antes de intervenção cirúrgica, tal como CABG.
Em uma concretização, o método inclui adicionalmente monito- rar o paciente para uma reação negativa, por exemplo, hematoma epidural ou espinal, hemorragia ou sangramento.
Em uma concretização, a composição de LMWH é administrada intravenosamente ou subcutaneamente.
Em uma concretização, a composição de LMWH é administrada em combinação com outro agente terapêutico, por exemplo, um agente anti- coagulante ou antitrombótica, por exemplo, bivalirudin Angiomax, ASA, um inibidor de GPIMbiIIa (por exemplo, eptifibatide ou abciximab), um inibidor de ADP (por exemplo, Plavix), rPA, TNKase, aspirina, um inibidor de P2Y12, um inibidor de plaqueta, warfarin, e combinações destes.
As composições de LMWH reversíveis (neutralizáveis) e monito- ráveis aqui descritas permitem flexibilidade aperfeiçoada no tratamento de pacientes, por exemplo, pacientes admitidos no hospital, e suportando avali- ação de possível tratamento cardiovascular, por exemplo, cirurgia. Conse- quentemente, em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de tra- tamento (por exemplo, tratamento terapêutico ou profilático) de uma distúr- bio, por exemplo, uma distúrbio trombótica ou cardiovascular em um pacien- te. O método inclui:
opcionalmente administrar uma composição de LMWH reversível e monitorável aqui descrita ao paciente;
classificar o paciente (ou a quem a composição foi ou será ad- ministrada) como não em necessidade de intervenção cirúrgica (por exem- plo, classificação do paciente como não em necessidade de intervenção ci- rúrgica antes da liberação do hospital), ou como um candidato para interven- ção cirúrgica antes da liberação do hospital;
opcionalmente, se o paciente é classificado como um candidato à intervenção cirúrgica, em seguida realizando-se um ou ambos de monito- ramento (por exemplo, conforme descrito aqui, por exemplo, com um ensaio de coagulação, usando-se ACT e/ou aPTT) da composição de LMWH rever- sível e monitorável, e neutralização (por exemplo, conforme aqui descrito, por exemplo, por administração de sulfato de protamina) da composição de LMWH reversível e monitorável.
Em uma concretização, a composição de LMWH é administrada ao indivíduo intravenosamente, por exemplo, a uma dose de cerca de 0,03 mg/kg a 0,45 mg/kg, por exemplo, 0,03 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,22 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,27 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,37 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,44 mg/kg. Em concretizações preferidas, a composição de LMWH é administrada intravenosamente a uma dose de cer- ca de 0,1 a 0,3 mg/kg, por exemplo, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,20 mg/kg, 0,22 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,27 mg/kg ou 0,30 mg/kg. Em outra concretização, a composição de LMWH é administrada ao indivíduo subcutaneamente, por exemplo, a uma dose de cerca de 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,44 mg/kg, 0,47 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,60 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg. Em outras concretizações, a composição de LMWH é administrada subcuta- neamente a uma dose de cerca de 0,15 mg/kg a 1,0 mg/kg, 0,20 a 0,8 mg/kg, 0,25 a 0,90 mg/kg, 0,30 a 0,50 mg/kg, por exemplo, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,42 mg/kg, 0,44 mg/kg, 0,47 mg/kg ou 0,50 mg/kg.
Em uma concretização preferida, o paciente é classificado como um candidato à intervenção cirúrgica, por exemplo, PCI, colocação de stent, ou angioplastia, e o efeito da composição de LMWH reversível e monitorável é monitorado. Em uma concretização preferida, a intervenção cirúrgica é realizada, e a composição de LMWH reversível e monitorável é monitorada em uma ou mais, ou toda, de antes, durante e após a cirurgia. Em uma con- cretização, o paciente é monitorado por um ACT de cerca de 200 a 350 an- tes e/ou durante uma intervenção cirúrgica, tal como PCI.
Em uma concretização preferida, o paciente é classificado como um candidato à intervenção cirúrgica, por exemplo, CABG, e o efeito da composição de LMWH reversível e monitorável é um ou ambos de monitora- do e neutralizado. Em uma concretização preferida, a intervenção cirúrgica é realizada, e a composição de LMWH reversível e monitorável monitorada uma ou mais, ou toda, de antes, durante e após a cirurgia. Em uma concreti- zação, o paciente é monitorado por um ACT de cerca de 400 a 600, por e- xemplo, 400 a 500 antes da intervenção cirúrgica, tal como CABG.
Em uma concretização preferida, o indivíduo está sendo tratado para uma distúrbio trombótica. Em uma concretização, a distúrbio é uma ou mais de ACS, infarto miocardial, por exemplo, NSTEMI OU STEMI, angina estável ou instável. Preferivelmente, a distúrbio trombótica é trombose arte- rial, por exemplo, incluindo elevação de ST (STEMI).
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de monito- ramento de um indivíduo tratado com uma composição de LMWH monitorá- vel aqui descrita. O método inclui,
opcionalmente, administrar uma composição de LMWH monito- rável aqui descrita ao indivíduo; e
avaliar aPTT e/ou ACT no indivíduo (que tenha sido administra- do a composição de LMWH monitorável).
Em outro aspecto, um aPTT e/ou ACT de linha de base é deter- minado antes do tratamento do indivíduo com a LMWH. Em uma concretiza- ção, o método inclui comparar aPTT e/ou ACT de um indivíduo que tenha recebido a LMWH ao aPTT e/ou ACT de linha de base.
Em uma concretização, o indivíduo é monitorado em um ou mais, ou todos, dos seguintes estágios: antes, durante ou após recebimento de uma composição de LMWH. Em uma concretização, o indivíduo é monito- rado antes, durante e/ou após intervenção cirúrgica, por exemplo, PCI, colo- cação de stent, ou angioplastia. Em uma concretização, a composição de LMWH é monitorada para um ACT de cerca de 200 a 350 antes e/ou durante uma intervenção cirúrgica, tal como PCI. Em outra concretização, a compo- sição de LMWH é monitorada para um ACT de cerca de 400 a 600, por e- xemplo, cerca de 400 a 500, antes do CABG.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de trata- mento de um indivíduo que tenha sido administrado uma composição de LMWH reversível aqui descrita. O método inclui:
opcionalmente, administrar uma composição de LMWH reversí- vel aqui descrita ao indivíduo; e
neutralizar (por exemplo, conforme aqui descrito, por administra- ção de sulfato de protamina) a composição de LMWH reversível.
Em uma concretização, o indivíduo é monitorado em um ou mais, ou todos dos seguintes estágios: antes de, durante e após administra- ção de sulfato de protamina.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de aconse- lhar ou proporcionar instruções (por exemplo, instruções escritas, orais ou geradas por computador) para o uso de uma LMWH tendo uma atividade de anti-lla alta, por exemplo, uma composição de LMWH aqui descrita. O méto- do inclui proporcionar instruções com relação ao uso, por exemplo, com: pa- cientes tendo função renal anormal ou diabetes, ou trombina ligada a coágu- lo; pacientes que são candidatos a PCI, colocação de stent, CABG, angio- plastia, etc; pacientes de cardiologia intervencional; pacientes em necessi- dade de neutralização de LMWH previamente administrada, por exemplo, neutralização com sulfato de protamina; pacientes em risco de hematoma epidural ou espinal, hemorragia e/ou sangramento. Em uma concretização, as instruções pertencem à administração da composição de LMWH para ACS, infarto miocardial, por exemplo, NSTEMI OU STEMI, angina estável e angina instável, por exemplo, administração em uma sub-população de pa- cientes, tais como pacientes tendo função renal anormal, ou pacientes de idade avançada (por exemplo, acima de 60 anos de idade). Em uma concre- tização, a instrução pertence à administração da composição de LMWH para distúrbios trombóticos, por exemplo, distúrbios trombóticos associadas com intervenção cirúrgica, por exemplo, PCI, colocação de stent, ou angioplastia.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de aconse- lhar o uso de uma LMWH aqui descrita, que inclui proporcionar instruções com relação ao monitoramento de uma atividade de anti-Xa e/ou atividade de anti-lla usando ACT e/ou aPTT.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de fabrica- ção de uma composição de LMWH, por exemplo, uma composição de LM- WH aqui descrita. O método inclui uma ou mais das seguintes etapas: (1) sujeição de uma amostra contendo glicosaminoglican (GAG), por exemplo, UFH, a uma primeira de uma precipitação, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, álcool, por exemplo, etanol), um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), e um sal (por exemplo, um sal de sódio, por exemplo, acetato de sódio, ou sal de cálcio, por exemplo, acetato de cálcio), para proporcionar um primeiro sobrenadante;
(2) sujeição do primeiro sobrenadante a uma segunda de uma precipitação, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol), e um solvente não-orgânico polar, por exemplo, água), para produzir um precipitado (isto pode ser usado para proporcionar uma fração de movimento rápido conforme discutido em outra parte aqui);
(3) solubilização do precipitado, preferivelmente em água, e cli- vagem do precipitado com um agente que cliva ligações glicosídicas de áci- dos urônicos não-sulfatados, por exemplo, adjacentes a um resíduo de N- acetil glucosamina. Um exemplo é uma enzima heparinase Ill aqui descrita, preferivelmente M011, preferivelmente na presença de acetato de sódio, e preferivelmente para completação, por exemplo, conforme indicado por um platô de UV, para proporcionar uma preparação clivada;
(4) precipitação da preparação clivada, por exemplo, com um sal, por exemplo, um sal de sódio, preferivelmente um cloreto de sódio, e um solvente orgânico polar, por exemplo, álcool, por exemplo, metanol, para formar sólidos, tendo sacarídeos com, por exemplo, um comprimento de ca- deia médio de 8-14, por exemplo, 8-12 dissacarídeos;
(5) sujeição do material a partir dos sólidos a uma etapa de puri- ficação, por exemplo, uma etapa de purificação cromatográfica, por exemplo, etapa de seleção de tamanho, por exemplo, cromatografia de exclusão, cromatografia de troca de íon, ou filtração, para proporcionar uma prepara- ção com um peso molecular médio mais alto do que na etapa (4). Em uma concretização preferida, a preparação de peso molecular médio mais alto tem um comprimento de cadeia médio de 9 a 16 dissacarídeos, ou um peso molecular médio de 5000 a 9000 Da.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza métodos de produção de uma composição de LMWH tendo um comprimento de cadeia médio de cerca de 9 a 16 dissacarídeos. O método inclui:
provisão de um precursor de composição de LMWH (por exem- plo, uma composição intermediária de um método aqui descrito) tendo um comprimento de cadeia médio de menos do que 9 a 16 dissacarídeos, prefe- rivelmente cerca de 8 a 14 dissacarídeos, por exemplo, 8 a 12 dissacarí- deos; e
processamento do precursor de composição de LMWH para ob- ter uma LMWH tendo um comprimento de cadeia médio de cerca de 9 a 16 dissacarídeos.
Preferivelmente1 o processamento inclui seleção baseada em tamanho, por exemplo, uma separação dependente do tamanho, por exem- plo, por uma ou mais de cromatografia de exclusão de tamanho, cromatogra- fia de troca de íon, ou filtração.
Em uma concretização, o precursor de composição de LMWH é uma preparação tendo um comprimento de cadeia médio de cerca de 8 a 14 dissacarídeos, por exemplo, 8 a 12 dissacarídeos. Em uma concretização preferida, foi ele obtido por um método incluindo precipitação de sal e diges- tão enzimática de uma preparação de peso molecular mais alto, por exem- plo, UFH. Em uma concretização, o sal é um sal de um cátion monovalente ou divalente. Exemplos de cátions monovalente e divalente que podem ser usados incluem, por exemplo, sódio, potássio, rubídio, césio, bário, cálcio, magnésio, estrôncio, e combinações destes. Em uma concretização, o sal de cátion monovalente e divalente é um acetato de um cátion monovalente ou divalente.
Em uma concretização, a enzima (ou enzimas) usada para di- gestão cliva em uma ou mais ligações glicosídicas de ácidos urônicos não- sulfatados, por exemplo, adjacentes a um resíduo de N-acetil glucosamina. Exemplos de enzimas que podem ser usadas incluem, por exemplo, hepari- nase III, mutantes de heparinase III, por exemplo, mutante de heparinase Ill descrito na Patente dos Estados Unidos Número 5.896.789 (por exemplo, um mutante de heparinase Ill tendo um ou mais resíduo de histidina selecio- nado a partir do grupo consistindo em His1 His105, His110, His139, His152, His225, His 234, His241, His424, His469 e His539 foi substituído com uma alanina), e sulfato de heparina glicosaminoglican Iiase Ill de Bacterioides thetaiotaomicron. Em uma concretização preferida, a enzima usada para digestão é uma heparinase Ill mutada tendo uma alanina no resíduo 225 da seqüência de aminoácido substituída com uma alanina.
Em uma concretização preferida, a composição precursora pode ser obtida por:
(1) sujeição de uma amostra contendo glicosaminoglican, por exemplo, UFH1 a uma primeira de uma precipitação, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol), um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), e um sal (por exemplo, um sal de sódio, por exemplo, acetato de sódio, ou um sal de cálcio, por exem- plo, acetato de cálcio), para proporcionar um primeiro sobrenadante;
(2) sujeição do primeiro sobrenadante a uma segunda precipita- ção, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol), e um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), para produzir um precipitado (isto pode ser usado para proporcionar uma fração de movimento rápido conforme discutido em outra parte aqui);
(3) solubilização do precipitado, e clivagem do precipitado solubi- Iizado com uma enzima heparinase III, preferivelmente M011, preferivelmen- te na presença de acetato de sódio, e preferivelmente para completação, por exemplo, conforme indicado por um absorção de UV de mais do que 9,8, para proporcionar uma preparação clivada.
Em um aspecto, a invenção caracteriza um método de produção de uma composição de LMWH, por exemplo, uma composição de LMWH aqui descrita. O método inclui:
(1) sujeição de uma amostra contendo glicosaminoglican (GAG), por exemplo, UFH, a uma primeira de uma precipitação, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, álcool, por exemplo, etanol), um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), e um sal de sódio (por e- xemplo, acetato de sódio), para proporcionar um primeiro sobrenadante; (2) sujeição do primeiro sobrenadante a uma segunda precipita- ção, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol), e um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), para produzir um precipitado (isto pode ser usado para proporcionar uma fração de movimento rápido conforme discutido em outra parte aqui);
(3) opcionalmente solubilização do precipitado e clivagem do precipitado solubilizado com uma enzima aqui descrita, preferivelmente na presença de acetato de sódio, e preferivelmente para completação como, por exemplo, indicado por absorção de UV de mais do que 9,8, para propor- cionar uma preparação clivada; e
(4) opcionalmente processamento da fração para produzir uma preparação de LMWH.
Em uma concretização, a enzima (ou enzimas) usada para di- gestão cliva em uma ou mais ligações glicosídicas de ácidos urônicos não- sulfatados, por exemplo, adjacentes a um resíduo de N-acetil glucosamina. Exemplos de enzimas que podem ser usadas incluem, por exemplo, hepari- nase III, mutantes de heparinase III, por exemplo, um mutante de heparinase III descrito na Patente dos Estados Unidos Número 5.896.789 (por exemplo, um mutante de heparinase III tendo um ou mais resíduo de histidina selecio- nado a partir do grupo consistindo em His, His105, Hisl 10, His139, His152, His225, His 234, His241, His424, His469 e His539 foi substituído com uma alanina), e sulfato de heparina glicosaminoglican liase III de Bacterioides thetaiotaomicron. Em uma concretização preferida, a enzima usada para digestão é uma heparinase III mutada tendo uma alanina no resíduo 225 da seqüência de aminoácido substituída com uma alanina.
Em uma concretização, a fração digerida é o produto final. Em outras concretizações, o método pode incluir uma ou mais etapas de pro- cessamento adicionais para obter um produto final. Em uma concretização, o método inclui processamento da fração digerida para obter uma composição de LMWH tendo um comprimento médio de cadeia de 9 a 16 dissacarídeos. Em uma concretização, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatogra- fia de troca de íon, e/ou filtração, podem ser usadas para obter uma compo- sição de LMWH tendo um comprimento médio de cadeia de 9 a 16 dissaca- rídeos.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza métodos de avaliação e processamento de um GAG1 tal como UFH1 para determinar a adequabili- dade do GAG para processamento em uma composição de LMWH1 por e- xemplo, uma composição de LMWH aqui descrita. O método inclui determi- nar a quantidade de N-acetil presente em uma preparação de GAG1 compa- rando a quantidade a um critério pré-selecionado, e tomando uma decisão sobre a preparação de GAG baseado se o critério pré-selecionado é encon- trado. Em uma concretização preferida, uma decisão ou etapa é tomada, por exemplo, a preparação de GAG é classificada, aceita ou descartada, pro- cessada em uma substância de fármaco ou produto de fármaco, ou um re- gistro produzido ou alterado para refletir a determinação, dependendo se o critério pré-selecionado é encontrado. Em algumas concretizações, quando o critério pré-selecionado é encontrado, uma decisão pode ser feita sobre alterar uma ou mais etapas no fabricação de uma composição de LMWH.
Em uma concretização, o critério pré-selecionado é N-acetil pre- sente na preparação de GAG em uma quantidade de cerca de 11%, ou mais alta, conforme determinado por mol% relativo ao teor de glucosamina total. Uma preparação de GAG tendo teor de N-acetil dentro desta faixa é indicati- va de uma preparação de GAG adequada para processamento em uma composição de LMWH, por exemplo, uma composição de LMWH aqui des- crita. Em tais concretizações, quando este critério pré-selecionado é encon- trado, a preparação de GAG é aceita e processada em intermediários, subs- tância de fármaco, ou produto de fármaco.
Em uma concretização, a quantidade de N-acetil presente na preparação de GAG pode ser determinada usando-se, por exemplo, resso- nância magnética nuclear (RMN).
Em concretizações preferidas, os métodos aqui descritos são úteis de um ponto de vista de processo, por exemplo, para monitorar ou as- segurar consistência de batelada-para-batelada ou qualidade, ou para avali- ar uma amostra com relação a um critério pré-selecionado. Em um aspecto, a invenção caracteriza um método de avaliar ou processar uma preparação de LMWH intermediária, por exemplo, produzida por um método aqui descrito, para determinar a adequabilidade da prepara- ção intermediária para processamento em uma composição de LMWH. A preparação intermediária de LMWH é uma fração de movimento rápido obti- da, por exemplo, por precipitação de sal com sódio ou acetato de sódio, de uma amostra contendo glicosaminoglican (GAG) em um solvente conforme aqui descrito. O método inclui comparar a quantidade de um ou mais de por- ções estruturais, por exemplo, um ou mais de ácido idurônico sulfatado, he- xosamina N-sulfatada ligada a ácido urônico, epóxido e 6-0 hexosamina sul- fatada, na preparação de LMWH intermediária para a quantidade da mesma porção estrutural em um material de partida de heparina não-fracionada, e tomando uma decisão sobre a preparação de LMWH intermediária baseada se um critério pré-selecionado entre o material de partida e a preparação de LMWH intermediária é encontrado. Em algumas concretizações, quando o critério pré-selecionado não é encontrado, uma decisão pode ser feita sobre alterar uma ou mais etapas no fabricação de uma composição de LMWH.
Em uma concretização, o critério pré-selecionado é uma diminu- ição no ácido idurônico sulfatado na preparação intermediária, conforme comparado ao material de partida. Uma preparação intermediária tendo um teor diminuído de ácido idurônico sulfatado é indicativa de uma preparação intermediária adequada para processamento adicional em uma composição de LMWH, por exemplo, uma composição de LMWH aqui descrita. Em tais concretizações, quando este critério pré-selecionado é encontrado, a prepa- ração intermediária é aceita e processada em intermediários adicionais, substância de fármaco, ou produto de fármaco.
Em uma concretização, o critério pré-selecionado é um aumento na hexosamina N-sulfatada ligada a ácido urônico (por exemplo, ácido idu- rônico e/ou glucorônico), na preparação intermediária, conforme comparado ao material de partida. Uma preparação intermediária tendo uma hexosami- na N-sulfatada ligada a ácido urônico é indicativa de uma preparação inter- mediária adequada para processamento adicional em uma composição de LMWH, por exemplo, uma composição de LMWH aqui descrita. Em tais con- cretizações, quando este critério pré-selecionado é encontrado, a prepara- ção intermediária é aceita e processada em intermediários adicionais, subs- tância de fármaco, ou produto de fármaco.
Em uma concretização, o critério pré-selecionado é uma diminu- ição no epóxido na preparação intermediária, conforme comparado ao mate- rial de partida. Uma preparação intermediária tendo um teor diminuído de epóxido é indicativa de uma preparação intermediária adequada para pro- cessamento adicional em uma composição de LMWH, por exemplo, uma composição de LMWH aqui descrita. Em tais concretizações, quando este critério pré-selecionado é encontrado, a preparação intermediária é aceita e processada em intermediários adicionais, substância de fármaco, ou produto de fármaco.
Em uma concretização, o critério pré-selecionado é um aumento na hexosamina 6-0 sulfatada na preparação intermediária, conforme compa- rado ao material de partida. Uma preparação intermediária tendo hexosami- na 6-0 sulfatada é indicativa de uma preparação intermediária adequada para processamento adicional em uma composição de LMWH1 por exemplo, uma composição de LMWH aqui descrita. Em tais concretizações, quando este critério pré-selecionado é encontrado, a preparação intermediária é a- ceita e processada em intermediários adicionais, substância de fármaco, ou produto de fármaco.
Em uma concretização, a quantidade de uma porção estrutural no material de partida e/ou preparação intermediária é determinada usando- se um ou mais de ressonância magnética nuclear (RMN), eletroforese capi- lar (CE), e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
Em concretizações preferidas, os métodos aqui descritos são úteis de um ponto de vista de processo, por exemplo, para monitorar ou as- segurar consistência de batelada-para-batelada ou qualidade, ou para avali- ar uma amostra com relação a um critério pré-selecionado.
Certas características podem produzir uma amostra de UFH, um material de partida mais preferido para produção de uma LMWH das inven- ções. Consequentemente, em outro aspecto, a invenção proporciona um método de avaliar uma preparação de UFH como um material de partida pa- ra produzir uma composição de LMWH aqui descrita.
O método inclui proporcionar uma avaliação da preparação de UFH para um parâmetro relacionado à adequabilidade da amostra de UFH para uso na produção de uma LMWH aqui descrita; e, opcionalmente, pro- porcionar uma determinação de se um valor (por exemplo, um valor correla- cionado à presença, quantidade, distribuição, ou ausência) determinado para o parâmetro se encontra em um critério pré-selecionado, por exemplo, está presente, ou está presente dentro de uma faixa pré-selecionada, avaliando, desse modo, a amostra de UFH.
Em uma concretização preferida, o critério é satisfeito, e a amos- tra de UFH é selecionada e processada na LMWH.
Em uma concretização preferida, o parâmetro é a presença ou quantidade de uma estrutura listada na Tabela 2, preferivelmente uma rela- cionada à eficiência de uma etapa no método de produção da LMWH, por exemplo, uma estrutura que promove, ou está positivamente correlacionada com clivagem por uma heparinase, por exemplo, HNac(intemo)·
Em uma concretização preferida, o método inclui determinar se a quantidade de HNac(interno) na amostra de UFH tem um relacionamento prede- terminado com uma referência, por exemplo, é igual a ou maior do que um valor de referência pré-selecionado.
Em uma concretização preferida, um valor para o parâmetro em um intermediário usado na produção da LMWH é também determinado e, opcionalmente, este valor deve também encontrar um critério predetermina- do para selecionar a UFH para uso na produção de LMWH.
Em um aspecto, a invenção proporciona um método de avaliar uma preparação de UFH, como um material de partida, para produzir uma composição de LMWH aqui descrita.
O método inclui opcionalmente realizar uma operação, por e- xemplo, uma precipitação, na amostra de UFH para proporcionar um inter- mediário (preferivelmente as etapas usadas para produzir este intermediário e o intermediário são os mesmos conforme as etapas e um intermediário do método usado para produzir a LMWH); provisão de uma avaliação da prepa- ração intermediária para um parâmetro relacionado à adequabilidade da amostra de UFH para uso na produção de uma LMWH aqui descrita; e, op- cionalmente, provisão de uma determinação de se um valor (por exemplo, um valor correlacionado à presença, quantidade, distribuição, ou ausência) determinado para o parâmetro se encontra em um critério pré-selecionado, por exemplo, está presente, ou está presente dentro de uma faixa pré- selecionada, avaliando, desse modo, a preparação de UFH.
Em uma concretização preferida, o critério é satisfeito, e a amos- tra de UFH é selecionada e processada na LMWH.
Em uma concretização preferida, o parâmetro é a presença ou quantidade de uma estrutura listada na Tabela 2, preferivelmente uma rela- cionada à eficiência de uma etapa no método de produção da LMWH, por exemplo, uma estrutura que promove, ou está positivamente correlacionada com clivagem por uma heparinase, por exemplo, HNac(Intemo)-
Em uma concretização preferida, o método inclui determinar se a quantidade de HNac(interno) na amostra de intermediário tem um relacionamen- to predeterminado com uma referência, por exemplo, é igual a ou maior do que um valor de referência pré-selecionado.
Em uma concretização preferida, um valor para o parâmetro na UFH é também determinado e, opcionalmente, este valor também encontra um critério predeterminado para selecionar a UFH para uso na produção de LMWH.
Em concretizações preferidas de qualquer destes métodos, uma decisão ou etapa é tomada, por exemplo, a amostra é classificada, selecio- nada, aceita ou descartada, liberada ou retida, processada em um produto de fármaco, carregada, movida para um local diferente, formulada, rotulada, acondicionada, liberada no comércio, ou vendida ou oferecida para venda, ou registrada ou alterada para refletir a determinação, dependendo se o cri- tério pré-selecionado é encontrado. Por exemplo, baseado no resultado da determinação, ou se uma ou mais entidades objeto está presente, ou após comparação a um padrão de referência, a batelada da qual a amostra é to- mada pode ser processada, por exemplo, conforme imediatamente descrito.
Em qualquer método, uma concretização preferida inclui analisar a amostra com RMN.
Em uma concretização preferida, qualquer método pode incluir provisão de uma comparação do valor determinado para um parâmetro com um valor ou valores de referência, para, desse modo, avaliar a amostra. Em concretizações preferidas, a comparação inclui determinar se o valor de tes- te tem um relacionamento pré-selecionado com o valor de referência, por exemplo, determinar se ele encontra o valor de referência. O valor não ne- cessita ser um valor numérico, mas, por exemplo, pode ser meramente uma indicação de se a entidade objeto está presente.
Uma concretização preferida de qualquer método pode incluir determinar se um valor de teste é igual a ou maior do que um valor de refe- rência, se é menor do que ou igual a um valor de referência, ou se cai dentro de uma faixa (ou inclusive ou exclusive de um ou ambos pontos).
Em concretizações preferidas de qualquer método, o valor de teste, ou uma indicação de se o critério pré-selecionado é encontrado, pode ser memorizado, por exemplo, em um registro de leitura de computador.
Em concretizações preferidas de qualquer método, o intermediá- rio é preparado por uma ou mais, ou todas das seguintes etapas:
(1) sujeição de uma amostra de UFH a uma primeira de uma precipitação, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol), um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), e um sal (por exemplo, um sal de sódio, por exemplo, acetato de só- dio), para proporcionar um primeiro sobrenadante;
(2) sujeição do primeiro sobrenadante a uma segunda precipita- ção, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol), e um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), para produzir um precipitado (isto pode ser usado para proporcionar uma fração de movimento rápido conforme discutido em outra parte aqui);
(3a) solubilização do precipitado, preferivelmente em água; (3b) clivagem do precipitado solubilizado com uma enzima (ou enzimas) que cliva ligações glicosídicas de ácido urônico não-sulfatado, por exemplo, adjacentes a um resíduo de N-acetil glucosamina, por exemplo, enzima heparinase III, preferivelmente M011, preferivelmente na presença de acetato de sódio, e, preferivelmente, para completação, por exemplo, conforme indicado por uma absorção de UV de mais do que 9,8, para pro- porcionar uma preparação clivada.
O intermediário preferido é aquele produzido na etapa (2) ou (3a), embora o método possa usar outros.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de avalia- ção de uma preparação aqui descrita. O método inclui: provisão de uma pre- paração de LMWH aqui descrita; determinação se uma estrutura, atividade ou função aqui descrita está presente em, ou processada pela preparação, avaliando, desse modo, uma preparação de LMWH aqui descrita. Em uma concretização preferida, a determinação inclui determinação se a estrutura, atividade ou função está presente em um nível pré-selecionado, ou em uma faixa pré-selecionada, por exemplo, um nível ou faixa aqui descrita.
Consequentemente, em um aspecto, a invenção proporciona um método de avaliar ou processar uma composição de LMWH aqui descrita. O método inclui: provisão de uma avaliação de um parâmetro relacionado a um pico listado na Tabela 1A. Tais parâmetros podem incluir, ou serem uma função da presença, distribuição relativa, ou quantidade de um pico, e, op- cionalmente, provisão de uma determinação de se um valor (por exemplo, um valor correlacionado à presença, quantidade, ou ausência) determinado para o parâmetro se encontra em um critério pré-selecionado, por exemplo, está presente, ou está presente dentro de uma faixa pré-selecionada, avali- ando, desse modo, ou processando a mistura.
Em uma concretização preferida, o método inclui analisar, por exemplo, separar uma digestão da amostra por digestão com heparinase I, heparinase II, heparinase II, por eletroforese, por exemplo, eletroforese capi- lar.
Em uma concretização preferida, o método inclui avaliar uma amostra para determinar se um ou mais dos picos listados na Tabela 10A está presente.
Em uma concretização preferida, o método inclui provisão de uma comparação do valor determinado para um parâmetro com um valor de referência ou valores, para, desse modo, avaliar a amostra. Em concretiza- ções preferidas, a comparação inclui determinar se o valor de teste tem um relacionamento pré-selecionado com o valor de referência, por exemplo, de- terminando se encontra-se no valor de referência. O valor não necessita ser um valor numérico, mas, por exemplo, pode ser meramente uma indicação de se a entidade objeto está presente.
Em uma concretização preferida, o método inclui determinar se um valor de teste é igual a ou maior do que um valor de referência, se é me- nor do que ou igual a um valor de referência, ou se cai dentro de uma faixa (ou inclusive ou exclusive de um ou ambos pontos). Por meio de exemplo, a quantidade de um pico listada na Tabela 10A pode ser determinada e, op- cionalmente, mostrada para cair dentro de uma faixa pré-selecionada, por exemplo, uma faixa que corresponde a uma faixa da Tabela 10A. Em uma concretização preferida: a quantidade de cada pico é cerca daquela encon- trada na Tabela 10A, a quantidade de cada pico está dentro da faixa provida na Tabela 10A; a quantidade de picos 10 e 11 estão com uma faixa provida na Tabela 10A.
Em concretizações preferidas, o valor de teste, ou uma indica- ção de se o critério pré-selecionado é encontrado, pode ser memorizado, por exemplo, em um registro de leitura de computador.
Em concretizações preferidas, uma decisão ou etapa é tomada, por exemplo, a amostra é classificada, selecionada, aceita ou descartada, liberada ou retida, processada em um produto de fármaco, carregada, movi- da para um local diferente, formulada, rotulada, acondicionada, liberada no comércio, ou vendida ou oferecida para venda, ou registrada ou alterada para refletir a determinação, dependendo se o critério pré-selecionado é en- contrado. Por exemplo, baseado no resultado da determinação, ou se uma ou mais entidades objeto está presente, ou após comparação a um padrão de referência, a batelada da qual a amostra é tomada pode ser processada, por exemplo, conforme imediatamente descrito.
As estruturas na Tabela 10A podem ser determinadas usando- se CE, e quando necessário, por outros métodos analíticos.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de avaliar ou processar uma preparação aqui descrita. O método inclui:
provisão de uma preparação de LMWH que foi digerida com he- parinase I, heparinase II, heparinase III, e separada por uma técnica de se- paração, tal como CE;
determinação se um ou mais dos picos listados na Tabela 10A está presente.
Em uma concretização preferida, o método inclui determinar se um pico listado na Tabela 10A cai dentro de uma faixa pré-selecionada da Tabela 10A. Em uma concretização preferida: a quantidade de cada pico é cerca daquela encontrada na Tabela 10A, a quantidade de cada pico está dentro de uma faixa provida na Tabela 10A; a quantidade de picos 10 e 11 estão com uma faixa provida na Tabela 10A.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de avaliar ou processar uma composição de LMWH aqui descrita.
O método inclui provisão de uma avaliação de um parâmetro relacionado à estrutura ou estruturas da Tabela 11A. Tais parâmetros podem incluir, ou serem uma função da presença, distribuição relativa, ou quantida- de de uma estrutura, e, opcionalmente, provisão de uma determinação de se um valor (por exemplo, um valor correlacionado à presença, quantidade, ou ausência) determinado para o parâmetro se encontra em um critério pré- selecionado, por exemplo, está presente, ou está presente dentro de uma faixa pré-selecionada, avaliando ou processando, desse modo, a mistura.
Em uma concretização preferida, o método inclui analisar a composição usando 2D-RMN.
Em uma concretização preferida, o método inclui avaliar uma amostra para determinar se uma ou mais das estruturas providas na Tabela 11A está presente. Em uma concretização preferida, o método inclui provisão de uma comparação do valor determinado para um parâmetro com um valor de referência ou valores, para, desse modo, avaliar a amostra. Em concretiza- ções preferidas, a comparação inclui determinar se o valor de teste tem um relacionamento pré-selecionado com o valor de referência, por exemplo, de- terminando se encontra-se no valor de referência. O valor não necessita ser um valor numérico, mas, por exemplo, pode ser meramente uma indicação de se a estrutura está presente.
Em uma concretização preferida, o método inclui determinar se um valor de teste é igual a ou maior do que um valor de referência, se é me- nor do que ou igual a um valor de referência, ou se cai dentro de uma faixa (ou inclusive ou exclusive de um ou ambos pontos). Por meio de exemplo, a quantidade de uma estrutura provida na Tabela 11A pode ser determinada e, opcionalmente, mostrada para cair dentro de uma faixa pré-selecionada, por exemplo, uma faixa que corresponde a uma faixa da Tabela 11 A. Em uma concretização preferida: a quantidade de cada estrutura é cerca daquela en- contrada na Tabela 11 A, a quantidade de cada estrutura está dentro da faixa provida na Tabela 11 A.
Em concretizações preferidas, o valor de teste, ou uma indica- ção de se o critério pré-selecionado é encontrado, pode ser memorizado, por exemplo, em um registro de leitura de computador.
Em concretizações preferidas, uma decisão ou etapa é tomada, por exemplo, a amostra é classificada, selecionada, aceita ou descartada, liberada ou retida, processada em um produto de fármaco, carregada, movi- da para um local diferente, formulada, rotulada, acondicionada, liberada no comércio, ou vendida ou oferecida para venda, ou registrada ou alterada para refletir a determinação, dependendo se o critério pré-selecionado é en- contrado. Por exemplo, baseado no resultado da determinação, ou se uma ou mais estruturas está presente, ou após comparação a um padrão de refe- rência, a batelada da qual a amostra é tomada pode ser processada, por exemplo, conforme imediatamente descrito.
As estruturas na Tabela 11A podem ser determinadas usando 2D RMN, e quando necessário, por outros métodos analíticos.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de avaliar ou processar uma preparação de LMWH aqui descrita. O método inclui pro- visão de uma preparação de LMWH que foi analisada usando 2D RMN; de- terminar se uma ou mais da estrutura listada na Tabela 11A está presente.
Em uma concretização preferida, o método inclui determinar se uma estrutura listada na Tabela 11A cai dentro de uma faixa pré- selecionada, por exemplo, uma faixa que corresponde a uma faixa 1 da ta- bela 11 A. Em uma concretização preferida: a quantidade de cada estrutura é cerca daquela encontrada na Tabela 11 A, a quantidade de cada estrutura está dentro de uma faixa provida na Tabela 11 A.
Alguns métodos aqui descritos incluem produção de uma deter- minação de se uma entidade objeto está presente em um nível pré- selecionado, ou dentro de uma faixa pré-selecionada, e que nível ou faixa é expressa em unidades específicas de medição, por exemplo, mol%, por e- xemplo, presente em uma faixa de X-Y mol%. Pode-se realizar o método pela determinação da quantidade de entidade objeto em termos de mol% e, em seguida, comparar aquele com uma referência expressa em mol%, neste exemplo, X-Y mol%. Não se necessita, contudo, fazer a medição em termos de mol% e compará-la com valores de referência expressos em mol%. A amostra tem um nível atual de entidade objeto, que pode ser expresso como X-Y quando descrito em unidades de mol%. O nível atual pode ser expresso em outras unidades, por exemplo, peso%. O nível atual é o mesmo, indife- rente das unidades nas quais ele é expresso. A especificação de mol% no método é meramente para indicar a prevalência atual da entidade objeto. O nível de entidade objeto pode ser medido em termos de outras unidades, e o valor de referência pode ser expresso em termos de outras unidades, consi- derando-se que o valor de referência, conforme expresso em termos de uni- dades alternativas, corresponde à mesma quantidade de entidade objeto conforme o valor de referência expresso em mol%, por exemplo, X-Y mol%, neste exemplo. Desse modo, um método que requer mostrar a entidade ob- jeto está presente em X-Y mol% pode ser realizado mostrando-se que a en- tidade objeto está presente em uma faixa expressa em uma unidade alterna- tiva de medida, por exemplo, peso%, número de cadeia, ou %AUC, no qual a faixa, conforme descrita na unidade alternativa de medida, corresponde à mesma quantidade de entidade objeto que daria o mol% referido a, neste exemplo, X-Y mol%.
Pode-se estabelecer uma faixa equivalente de funcionalidade para uma unidade alternativa de medida pela aplicação de métodos conhe- cidos na técnica em conjunto com esta especificação. Por exemplo, podem- se proporcionar amostras na faixa de X-Y mol%, e, em seguida, estabelecer a faixa correspondente em termos de uma unidade alternativa de medida.
Outras características e vantagens da invenção tornar-se-ão a- parentes a partir da seguinte descrição detalhada, e a partir das reivindicações.
Descrição dos Desenhos
Os desenhos são primeiro brevemente descritos.
A figura 1 é um fluxograma representando as quatro etapas de processo de fabricação de M118-REH.
A figura 2A é um gráfico representando o perfil de eletroforese capilar de enoxaparina digerida com heparinase I, heparinase II, heparinase III. A figura 2B é um gráfico representando o perfil de eletroforese capilar de M118-REH digerido com heparinase I, heparinase Il e heparinase III.
A figura 3 é um gráfico representando uma comparação dos per- fis de UV e de fluorescência gerados por etiquetação pós-coluna para uma digestão de M118-REH analisado por HPLC RP de emparelhamento de íon.
O rastreio superior reflete detecção de UV 232 nm, e o rastreio de fundo re- flete detecção de fluorescência a 410 nm. As espécies etiquetadas por setas aparecem principalmente no perfil de fluorescência, e não são observadas no perfil de UV; elas representam sacarídeos de extremidade de não- redução de cadeias de M118-REH que ocorrem a partir da UFH de partida.
A figura 4 é um gráfico representando uma análise bidimensional de RMN HSQC de M118-REH.
A figura 5 é um diagrama representando formação de extremi- dades de redução e de não-redução.
A figura 6 é um fluxograma do processo de fabricação de M118- REH injetável.
A figura 7 é um gráfico representando neutralização de LMWHs por sulfato de protamina. "M118" (estenografado nesta figura para M118- REH) é representado por um ponto mais claro; enoxaparina sódio é repre- sentada por um ponto mais escuro. O gráfico foi plotado com percentagem de atividade de anti-Xa remanescente contra a razão de protamina para ati- vidade de LMWHs.
A figura 8 é um gráfico representando liberação de TFPI de célu- las endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) por heparinas diferentes a 0,01 mg/ml (cavidades η = 3, média ± STDEM). Existe uma significância es- tatística entre M118 que é estenografado para M118-REH nesta figura) (se- gunda barra a partir da esquerda em cada grupo), e controle (primeira barra a partir da esquerda em cada grupo), e grupos de controle (p<0,01) após ambas 24 e 48 horas de incubação.
A figura 9 é um gráfico representando as farmacodinâmicas de M118-REH pela medição de ACT e aPTT após injeção intravenosa no mode- lo de NHP.
A figura 10 é um gráfico representando comparação de TTO de M118-REH 0,5 (terceira coluna) e 1 mg/kg (sexta coluna) com enoxaparina sódio 2, 3 e 4 mg/kg (segunda, quarta e quinta, respectivamente) intraveno- samente injetado em modelo de trombose induzido por cloreto férrico. Todos os grupos de tratamento têm TTO mais longo significante com Controle (pri- meira coluna). Existe uma diferença estatística significante entre M118-REH (1 mg/kg) e enoxaparina sódio 3 mg/kg (p<0,01).
A figura 11 é um gráfico representando neutralização de ativida- de de anti-Xa em modelo de rato Sprague-Dawley (M118-REH, enoxaparina sódio e UFH) por sulfato de protamina. O gráfico foi plotado com percenta- gem de atividade de anti-Xa remanescente versus tempo em razões de 0,5 ou 1 mg: 100 anti-Xa IU de protamina para heparina (ou 0,5 ou 1 mg: 1 mg em caso de UFH). A figura 12 é um gráfico representando correlação de medição de ACT e atividade de anti-Xa de M118-REH (triângulo e linha), enoxaparina (círculo aberto com linha tracejada), e UFH (quadrado com linha tracejada). Os dados sugerem que o M118-REH em doses especificadas demonstra a melhor correlação de ACT com atividade de anti-Xa quando comparado a enoxaparina ou UFH (r2=O,85).
figura 13. Atividade de Antifator Xa (topo) e Atividade de Antifa- tor IIa versus tempo em um modelo canino de trombose arterial profunda (modelo de Lucchesi). O grupo de controle de veículo mostrado nos gráficos subseqüentemente recebeu M118-REH a 150 IU/kg. As barras de erro são ± SE. UFH, heparina não-fracionada.
figura 14. Correlação de atividades de antifator Xa e IIa em um modelo canino de trombose arterial profunda (modelo de Lucchesi). Os pon- tos individuais representam dados de um animal simples. Todos os animais em todos os grupos de tratamento são mostrados. Os coeficientes de corre- lação (r2) foram 0,890 e 0,465 nos grupos de M118-REH e heparina não- fracionada (UHF), respectivamente.
figura 15. Razão de Antifator Xa:lla sobre o tempo em um mode- lo canino de trombose arterial profunda. As barras de erro são + SE (meta- des de topo somente são mostradas para maximizar clareza). UFH, heparina não-fracionada.
figura 16. Atividade de coagulação versus tempo conforme ava- liada por ensaios de ACT (topo), aPTT (parte intermediária), e PT (fundo) em um modelo canino de trombose arterial profunda. O grupo de controle de veículo mostrado nos gráficos subseqüentemente recebeu M118-REH a 150 IU/kg. As barras de erro são ± SE. UFH, heparina não-fracionada.
figura 17. Percentagem de animais com artérias femorais ocluí- das em um modelo canino de trombose arterial profunda. Os animais foram monitorados por fluxo de Doppler por até 180 minutos pós iniciação corrente. A oclusão foi definida como fluxo de sangue através de artéria prejudicada que foi < 2% de fluxo de linha de base. UFH, heparina não-fracionada. Descrição Detalhada LMWHs Otimizadas
Em muitos cenários clínicos, preparações de LMWH comercial- mente disponíveis são preferidas sobre preparações de UFH porque as LMWHs têm farmacocinéticas mais prognosticáveis, e podem ser adminis- tradas subcutaneamente. Contudo, as preparações de LMWH atualmente disponíveis carecem de muitas propriedades desejáveis de UFH, tais como atividade de anti-lla substancial, reversibilidade (ou neutrabilidade) com sul- fato de protamina, e monitorabilidade. Desse modo, existem cenários clíni- cos onde LMWHs não são uma escolha de tratamento ótima ou prática. A invenção caracteriza preparações de LMWH designadas para terem proprie- dades que são clinicamente vantajosas, por exemplo, sobre outras prepara- ções de LMWH comercialmente disponíveis, e preparações de UFH. Tais propriedades incluem, por exemplo, um ou mais de: reversibilidade com sul- fato de protamina; farmacocinéticas diagnosticáveis, atividade de anti-lla; razão de atividade de anti-Xa substancialmente constante para atividade de anti-lla; níveis de atividade monitoráveis por testes padrões, tais como, por exemplo, ACT ou aPTT; biodisponibilidade subcutânea; e ocorrência reduzi- da de HIT.
Atividade de anti-IIa
As preparações de LMWH são aqui descritas que incluem um número significante de cadeias de comprimento suficiente (que podem ser descritos, por exemplo, em termos de comprimento de cadeia médio da pre- paração, e/ou peso molecular médio de peso da preparação) para propor- cionar atividade de anti-lla, por exemplo, atividade de anti-lla de cerca de 50 a 300 lU/mg, cerca de 70 a 280 IU/kg, cerca de 90 a 250 IU/kg, cerca de 100 a 140 IU/kg, cerca de 150 a cerca de 200 IU/kg, cerca de 130 a 190 IU/kg, cerca de 155 a 195 IU/kg. A atividade de anti-lla é calculada em U- nidades Internacionais de atividade de anti-lla por miligrama usando os mé- todos estatísticos para ensaios de linha paralela. Os níveis de atividade de anti-lla aqui descritos são medidos usando o seguinte princípio:
M118+ ATIII [M118-ATIII] IIa Μ118·ΑΤΙΙΙ -> [M118*ATIIHIa] + IIa(Excesso) IIa(Excesso) + Substrato Peptídeo + pNA(medido espectrofotometrica- mente).
A atividade antifator IIa é determinada pelo efeito de potenciali- zação de amostra no antitrombina (ATIII) na inibição de trombina. O excesso de trombina pode ser indiretamente espectrofotometricamente medido. A atividade de antifator IIa pode ser medida, por exemplo, em um analisador Diagnostica Stago, ou em um sistema de Coagulação ACL Futura™, com reagentes de Chromogenix (substrato S-2238, Thrombin (53nkat/frasco), e Antithrombin), ou em qualquer sistema equivalente. A resposta do analisador é calibrada usando-se o 2Q Padrão Internacional de Heparina de Baixo Peso Molecular.
Comprimento de Cadeia/Peso Molecular
Uma determinação de se uma preparação de LMWH inclui ca- deias de comprimento de cadeia suficiente pode ser feita, por exemplo, pela determinação do comprimento de cadeia médio das cadeias na preparação de LMWH, e/ou pela determinação do peso molecular médio de peso de ca- deias dentro da preparação de LMWH. Quando o comprimento de cadeia médio é determinado, um comprimento de cadeia médio de cerca de 5 a 20, por exemplo, 7 a 18, preferivelmente cerca de 9 a 16, ou 8 a 14 repetições de dissacarídeo, indica que um número significante de cadeias na prepara- ção de LMWH são de comprimento de cadeia suficiente.
"Comprimento de cadeia médio", conforme aqui usado, se refere ao comprimento de cadeia médio de repetições de ácido urôni- co/hexosamina dissacarídeo que ocorrem dentro de uma cadeia. A presença de blocos de construção de ácido urônico e/ou não-hexosamina (por exem- plo, porções de PEG fixadas) não estão incluídas na determinação do com- primento de cadeia médio. O comprimento de cadeia médio é determinado pela divisão do número de peso molecular médio (Mn) pelo número de peso molecular médio para um dissacarídeo (500 Da). Os métodos de determinar o número de peso molecular médio são descritos abaixo usando-se SEC MALS. Exemplos de tais preparações de LMWH incluem o seguinte:
<formula>formula see original document page 48</formula>
no qual R é H ou SO3X;
R1 é SO3X ou COCH3, e X é um cátion monovalente ou divalen- te (por exemplo, Na ou Ca);
e η médio é cerca de 9 a 16, ou 8 a 15;
<formula>formula see original document page 48</formula>
no qual
<formula>formula see original document page 48</formula>
no qual R é H ou SO3X;
R1 é SO3X ou COCH3, e X é um cátion monovalente ou divalen- te (por exemplo, Na ou Ca);
e η médio é cerca de 9 a 16, ou 8 a 15;
<formula>formula see original document page 48</formula>
X é um cátion monovalente ou divalente (por exemplo, Na ou
R é H ou SO3X,
R1 é SO3X ou COCH3, e
η médio é cerca de 8 a 12, ou 7 a 11; e <formula>formula see original document page 49</formula>
no qual
determinado, um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, cerca de 5000 a 8300 Da, preferivelmente cerca de 5500 a 8000 Da, cerca de 5700 a 7900, ou cerca de 5800 a 6800 Da, indica que um número significante de cadeias na preparação é de comprimento de cadeia suficiente.
"Peso molecular médio de peso", conforme aqui usado, se refere à média de peso em dáltons de cadeias de repetições de ácido urôni- co/hexosamina dissacarídeo. A presença de blocos de construção de ácido não-urônico e/ou não-hexosamina não está incluída na determinação do pe- so molecular médio de peso. Desse modo, o peso molecular médio de blo- cos de construção de ácido não-urônico e não-hexosamina dentro de uma cadeia ou cadeias na preparação, não deve estar incluído na determinação do peso molecular médio de peso. O peso molecular médio de peso (Mw) é calculado a partir da seguinte equação: Mw = £(cíitií)/xcí. a variável ci é a concentração do polímero na porção i e Mi é o peso molecular do polímero
X é um cátion monovalente ou divalente (por exemplo, Na ou
R é H ou SO3X,
R1 é SO3X ou COCH3, e
η médio é cerca de 8 a 12, ou 7 a 11; e
Quando o peso molecular médio de peso de uma preparação é na porção i. As somas são tomadas sobre um pico cromatográfico, que con- tém muitas porções de dados. Uma porção de dados pode ser representada como uma linha vertical em um gráfico de picos cromatográficos versus tem- po. O pico de eluição pode, portanto, ser dividido em muitas porções. O cál- culo do peso molecular médio de peso é dependente da média da soma de todas as porções da concentração e peso molecular. O peso molecular mé- dio de peso pode ser medido, por exemplo, usando-se o software Wyatt As- tra, ou qualquer software apropriado. O peso molecular médio de peso aqui descrito é determinado pela cromatografia líquida alta com duas colunas em série, por exemplo, um TSK G3000 SWXL e um G2000 SWXL, acoplado com um detector de difusão de luz de multi-ângulo e um detector refratomé- trico em série. O eluente usado é um sulfato de sódio 0,2, pH 5,0, e uma ta- xa de fluxo de 0,5 mL/min.
Estrutura Terminal de Não-Reducão
Em adição ao comprimento de cadeia, cerca de 5 a 15 mol%, 7 a 14 mol%, ou 9 a 12 mol% das cadeias em uma preparação podem ter AUHNac,6sGHNs,3s,6s em, ou dentro de cerca de dois, quatro ou seis monos- sacarídeos a partir da extremidade de não-redução da cadeia. Os métodos que podem ser usados para quantificar esta estrutura incluem, por exemplo, eletroforese capilar (CE) e cromatografia líquida de alto desempenho (H- PLC), por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho de fase rever- sa (RPHPLC). Para quantificar o mol% de AUHNac,6sGHNs,3s,6s em uma pre- paração de LMWH, um fator de resposta (RF) para AUHNac,6sGHNs,3s,6s pode ser determinado. A determinação pode também incluir o RF para todas as espécies obtidas, por exemplo, usando-se CE ou HPLC, por exemplo, um método de CE aqui descrito. Para obter o RF para uma espécie ou todas as espécies obtidas por CE, por exemplo, um método de CE aqui descrito, con- centrações conhecidas de um padrão para a espécie ou uma ou mais das espécies podem ser injetadas no CE e usadas para determinar um RF para cada. O RF pode, em seguida, ser usado para determinar o mol%. Conforme aqui descrito, a amostra tem um nível atual de uma estrutura, que pode ser expressa, por exemplo, como 5 a 15 quando descrita em unidades de mol%. O nível atual pode também ser expresso em outras unidades, por exemplo, peso%. O nível atuai é o mesmo, indiferente das unidades em que ele é ex- presso. A especificação de mol% no método é meramente para indicar a prevalência atual da estrutura. O nível de estrutura pode ser medido em ter- mos de outras unidades, e o valor de referência pode ser expresso em ter- mos de outras unidades, considerando-se que o valor de referência confor- me expresso em termos de unidades alternativas corresponde à mesma quantidade de estrutura conforme o valor de referência expresso em mol%, 5 a 15 mol% neste exemplo. Desse modo, um método que requer mostrar a estrutura estar presente em 5 a 15 mol% pode ser realizado mostrando-se que a estrutura está presente em uma faixa expressa em uma unidade alter- nativa de medida, por exemplo, peso%, número de cadeia, ou AUC%, no qual a faixa, conforme descrito na unidade alternativa de medida, correspon- de à mesma quantidade da estrutura que daria o mol% referido a, neste e- xemplo, 5 a 15 mol%.
Uma operação de LMWH aqui descrita pode ter uma mistura de ΔU e ácido idurônico (l)/ácido glucurônico (G), e a extremidade de não- redução das cadeias na preparação. A nomenclatura "ΔΙΙ" se refere a ácido urônico insaturado (ácido idurônico (I), ácido glucurônico (G) ou ácido galac- turônico) que tem uma ligação dupla introduzida na posição 4-5 como um resultado, por exemplo, da ação de liase de uma heparinase, uma liase HS- GAG, ou outra enzima tendo especificidade de substrato similar. Preferivel- mente, cerca de 15% a 35%, 20 a 30% (por exemplo, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%) do número total de cadeias na preparação tem um ΔU na extremidade de não-redução da cadeia. A quantidade de ΔU na extremidade de não- redução de cadeias dentro da amostra pode ser determinada usando-se, por exemplo, 2D-RMN. Em tais métodos, o número total de cadeias tendo uma hexosamina acetilatada (HNac) na extremidade de redução e/ou o número de confirmações de anel aberto na extremidade de redução pode ser usado para determinar o número total de cadeias dentro da preparação. A percen- tagem total de cadeias tendo um ΔU e/ou I/G na extremidade de redução pode ser comparada ao número total de cadeias na preparação. Preferível- mente, nas preparações de LMWH aqui descritas, menos do que 90%, 95%, 98%, 99%, ou nenhuma das cadeias na preparação, têm um AU sulfatado na extremidade de não-redução. Estruturas de Extremidade de Redução
Em alguns exemplos, uma preparação de LMWH aqui provida não tem substancialmente estruturas de extremidade de redução modifica- das. Em concretizações preferidas, pelo menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou todas as cadeias na preparação de LMWH, têm uma estrutura de extre- midade de redução não-modificada.
Uma "estrutura de extremidade de redução modificada" se refere a uma estrutura que ocorre na extremidade de redução de cadeias na prepa- ração devido ao processo de isolar ou preparar a preparação de fontes natu- rais. Por exemplo, muitas preparações de LMWH comercialmente disponí- veis são derivadas de heparina não-fracionada, principalmente através de despolimerização química ou enzimática das cadeias de polissacarídeos. Um processo usado para produzir uma LMWH pode causar uma ou mais modificações estruturais únicas à extremidade de redução de cadeias de polissacarídeos de material de partida de uma fonte natural. Por exemplo, a despolimerização de ácido nitroso de heparina resulta na formação de uma 2,5-anidromanose na extremidade de redução, que pode ser reduzida para formar um álcool, e despolimerização através de esterificação do grupo fun- cional carboxilato no ácido urônico, seguido por β-eliminação, resulta na formação de estruturas 1,6-anidro na extremidade de redução de algumas cadeias. Desse modo, 2,5-anidromanose e estruturas 1,6-anidro são exem- plos de estruturas de extremidade reduzidas modificadas que podem ser encontradas em algumas cadeias de LHWHs. As cadeias em uma prepara- ção de LMWH providas aqui podem incluir, por exemplo, pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou todas as cadeias tendo uma hexosamina acetilatada na extremidade de redução. Atividade Anti-Xa
A atividade anti-Xa de uma preparação de LMWH desempenha um papel na atividade biológica de preparação de LMWH. Preferivelmente, uma preparação de LMWH aqui provida tem uma atividade de anti-Xa de cerca de 100 a 400 IU/mg, por exemplo, cerca de 120 a 380 IU/mg, por e- xemplo, cerca de 150 a 350 IU/mg, por exemplo, cerca de 170 a 330 IU/mg, por exemplo, cerca de 180 a 300 IU/mg, por exemplo, cerca de 150 a 200 IU/mg, 200 a 300 IU/mg. A atividade anti-Xa de uma preparação de LMWH é calculada em Unidades Internacionais de atividade de antifator Xa por mili- grama usando-se os métodos estatísticos para ensaios de linha paralela. A atividade de antifator Xa de preparações de LMWH aqui descrita é medida usando-se o seguinte princípio:
<formula>formula see original document page 53</formula>
A atividade antifator Xa é determinada pelo efeito de potenciali- zação de amostra no antitrombina (ATIII) na inibição de Fator Xa ativado (FXa). O excesso de Fator Xa pode ser indiretamente espectrofotometrica- mente medido. A atividade de antifator Xa pode ser medida, por exemplo, em um analisador Diagnostica Stago com um kit de Teste de Heparaina Sta- chrom®, ou em um sistema de Coagulação ACL Futura™, com o Lit de He- parina Costest® de Chromogenix, ou em qualquer sistema equivalente. A resposta do analisador pode ser calibrada usando-se o Padrão Internacional de NIBSC para Heparina de Baixo Peso Molecular.
Razão de Anti-Xa/IIa
Em alguns aspectos, as preparações de LMWH aqui providas têm uma razão de atividade anti-Xa para atividade anti-lla de 3:1, ou menos, por exemplo, 2,1, 1,6:1, 1,5:1, 1,4:1, 1,3:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1. Os métodos de determinação de atividade de antifator Xa e atividade de antifator IIa foram descritos acima. A razão de atividade de antifator Xa para atividade de anti- fator IIa é calculada pela divisão da atividade de antifator Xa (base seca) pela atividade de antifator IIa (base seca).
Ambas a atividade de anti-Xa e atividade anti-lla de heparina e preparações de LMWH envolvem ligação de antitrombina Ill (ATIII) a uma seqüência específica, representada pela estrutura âUHNac,6sGHNs,3s,6s, den- tro de cadeias presentes na preparação. A ligação de ATIII a esta seqüência media a atividade anti-Xa. Em adição, trombina (fator lia) liga heparinas em um local próximo ao local de ligação de ATUI. Diferente da atividade anti-Xa que requer somente o local de ligação de ATUI, a atividade anti-lla requer a presença de um local de ligação de ATUI, bem como uma cadeia de com- primento suficiente distai ao local de ligação de ATUI. A atividade anti-lla de preparações de LMWH aqui provida pode ser atribuída, pelo menos em par- te, à presença de AUHNac,6sGHNS,3s,6s, ou perto da extremidade de não- redução de cadeias dentro das preparações de LMWH, bem como o com- primento de muitas das cadeias presentes na preparação. Esta combinação pode resultar em cadeias dentro da preparação que contribuem a ambas a atividade anti-Xa e atividade anti-lla. Quando ambas a atividade anti-Xa e atividade anti-lla são providas pela mesma cadeia ou cadeias, a folga da- quela cadeia ou cadeias pode resultar em ambas uma diminuição na ativida- de anti-Xa e atividade anti-lla. Como tal, a atividade anti-Xa e a atividade anti-lla podem permanecer relativamente constante sobre o curso de admi- nistraçao. Portanto, em alguns aspectos, as preparações de LMWH aqui providas têm uma atividade anti-Xa para atividade anti-lla permanecidas re- lativamente constantes sobre o curso de uma administração de LMWH, por exemplo, a razão de atividade anti-Xa para atividade anti-lla varia cerca de ±1,5, ±1, ±0,5, ou ±0,2, sobre um período de cerca de 30, 60, 120, 180, 240, 300 minutos. Por exemplo, se uma razão inicial de atividade anti-Xa para atividade anti-lla é 2, então a razão medida em um tempo em segundo (por exemplo, 30, 60, 120, 180, 240, 300 minutos), após a administração inicial, será preferivelmente 3, e, preferivelmente em ou ao redor de 2.
Neutralização
As preparações de LMWH aqui providas podem ser neutraliza- das por sulfato de protamina. Por exemplo, atividade anti-Xa e atividade anti- lla podem ser neutralizadas por pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100% por administração de protamina. Sulfato de prota- mina é comercialmente disponível, por exemplo, de Eli Lilly and Company. A neutralização de atividade anti-Xa e atividade anti-lla pode ser medida, por exemplo, por ensaios de coagulação padrões, tais como ACT e aPTT, am- bos dos quais são descritos adicionalmente aqui. Sulfato de protamina pode ser administrado intravenosamente, por exemplo, em dose de cerca de 1, 2, 3 mg por 100 anti-Xa IU da preparação de LMWH em plasma. Preferivel- mente, a neutralização de protamina de atividade anti-Xa e/ou atividade anti- lla ocorre dentro de 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 minutos após administração do sulfato de protamina.
Polidispersidade
A polidispersidade de preparações de LMWH aqui provida é cer- ca de 1,6 ou menos, por exemplo, cerca de 1,6 ou 1,5 a 1,1, e números en- tre.
O termo "polidisperso" ou "polidispersidade" se referem ao peso molecular médio de peso de uma composição (Mw) dividido pelo número de peso molecular médio (Mn). O número de peso molecular médio (Mn) é cal- culado a partir da seguinte equação: Mn: £ci(Xci/mi). A ci variável é a con- centração do polissacarídeo na seção i, e Mi é o peso molecular do polissa- carídeo na seção i. As somas são tomadas sobre um pico cromatográfico, que contém muitas seções de dados. Uma seção de dados pode ser ilustra- da como uma linha vertical em um gráfico de pico cromatográfico versus tempo. O pico de eluição pode, portanto, ser dividido em muitas seções. O número de peso molecular médio é um cálculo dependente do peso molecu- lar e concentração de cada seção de dados. Os métodos de determinar peso molecular médio de peso são descritos aqui, e foram usados para determi- nar polidispersidade também.
Para muitas das faixas aqui descritas, por exemplo, para uma dada estrutura ou atividade, as faixas podem ser aquelas faixas descritas, bem como outras faixas. Por exemplo, uma faixa construída de um ponto final inferior de uma faixa, por exemplo, para um dado bloco de construção ou atividade, pode ser combinada com o ponto final superior de outra faixa, por exemplo, para o dado bloco de construção ou atividade, para dar uma faixa.
Uma preparação de LMWH "isolada" ou "purificada" é substanci- almente livre de material celular, ou outras proteínas contaminantes a partir da célula ou fonte de tecido do qual a LMWH é derivada, ou substancialmen- te livre de precursores químicos, ou outros químicos quando quimicamente sintetizada. "Substancialmente livre" significa que uma preparação de LMWH é pelo menos 50% (peso/peso). Em uma concretização preferida, as prepa- rações de LMWH têm menos do que cerca de 30%, 20%, 10% e, mais prefe- rivelmente, 5% (por peso seco), de polissacarídeos de não-heparina, proteí- nas ou precursores químicos, ou outros químicos, por exemplo, de manufa- tura. Estes também referidos aqui como "contaminantes". Exemplos de con- taminantes que podem estar presentes em uma preparação de LMWH aqui provida incluem, mas não estão limitados a, cálcio, sódio, enzima heparinase (ou outra enzima tendo especificidade de substrato similar), metanol, etanol, cloreto, sulfato, dermatan sulfato, e condrotin sulfato.
Métodos e Atividade de Monitoramento de uma Preparação de LMWH
A atividade de uma preparação de LMWH aqui provida pode ser monitorada por ensaios de anticoagulação padrões. Tais ensaios incluem, por exemplo, ACT e aPTT, ambos dos quais são rotineiramente praticados em hospitais e especificamente ambientes de operação de hospitais.
Um ACT é um teste que é usado para monitorar a eficiência da terapia de heparina. O ACT pode ser feito na beira da cama, por exemplo, em pacientes com êmbolo pulmonar, oxigenação de membrana extra corpó- rea (ECMO) e hemodiálise. O ACT é mais freqüentemente usado antes, du- rante e após intervenção cirúrgica, tal como cirurgia de bypass cardiopulmo- nar (CPB), PCI e colocação de stent. O valor de referência para o ACT pode variar de entre 70-180 segundos. Contudo, para certos procedimentos, tal como CPB, a faixa desejada pode exceder 400-500 segundos. O ACT utiliza partículas carregadas negativamente para uma determinação de tempo para formação de coágulo. Exemplos de várias partículas que podem ser usadas incluem celite, que tem um comprimento normal de ACT sendo cerca de 100 a 700 segundos; caulim, que tem um comprimento normal de ACT sendo cerca de 90 a 150 segundos; e partículas de vidro, que têm um comprimento normal de ACT sendo 190 a 300 segundos. Máquinas adequadas para me- dição de ACT incluem, por exemplo, Hemochron e Medtronic HemoTec.
No teste de aPTT (também referido como "tempo de tromboplas- tina parcial", ou "PTT"), um ativador de contato é usado para estimular a produção de Fator Xlla pela provisão de uma superfície para a função de kininogen de alto peso molecular, kallikrein e Fator XlIa. Esta ativação de contato é permitida proceder por um período específico de tempo. O cálcio é, em seguida, adicionado para disparar reações adicionais, e o tempo re- querido para formação de coágulo é medido. Fosfolipídios são requeridos para formarem complexos, que ativam Fator X e Protrombina. APTT pode ser medido por IL TestTM APTT-SP(líquido). Os valores de referência para um aPTT é cerca de 25 a 35 segundos. Um aPTT prolongado indica que a coagulação está mais longa do que esperado, por exemplo, devido à hepari- na ou tratamento de LMWH.
Métodos de Produção de Preparações de LMWH
Vários métodos de fabricação de LMWH, por exemplo, uma pre- paração de LMWH aqui descrita também são contemplados. Por exemplo, tais métodos incluem um método de produção de uma preparação de LMWH tendo um comprimento de cadeia médio de cerca de 8 a 16 ou 9 a 16 dissa- carídeos. O método inclui provisão de um precursor de preparação de LM- WH tendo um comprimento de cadeia de menos do que 8 a 16 ou 9 a 16 dissacarídeos, e processamento do precursor de preparação de LMWH para obter uma preparação de LMWH tendo um comprimento de cadeia médio de cerca de 8 a 16 ou 9 a 16 dissacarídeos. Preferivelmente, o precursor tem um comprimento de cadeia médio de cerca de 8 a 14, por exemplo, 8 a 12 dissacarídeos. Por exemplo, o precursor de preparação de LMWH pode ter a seguinte estrutura: no qual,
X é um cátion monovalente ou divalente (por exemplo, Na ou Ca)
R é H ou SO3X,
R1 é SO3X ou COCH3, e
η = 2-45, por exemplo, 2-35;
e a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 7 a 13, por exemplo, 7 a 11, ou 8 a 12.
Um precursor de preparação de LMWH usado neste método po- de ser obtido por um método que inclui precipitação de sal, seguida por (e) digestão enzimática. Um sal de um cátion monovalente ou divalente pode ser usado no método para obtenção do precursor de preparação de LMWH. Exemplos de cátions monovalente e divalente que podem ser usados inclu- em, por exemplo, sódio, potássio, rubídio, césio, bário, cálcio, magnésio, estrôncio, e combinações destes. O sal pode ser, por exemplo, um acetato de cátion monovalente ou divalente. A digestão enzimática para obter um precursor de LMWH pode incluir o uso de uma ou mais enzimas que clivam em uma ou mais ligações glicosídicas de ácidos urônicos não-sulfatados. Enzimas exemplares incluem heparinase III, mutantes de heparinase III e HSGAG Iiase III de Bacterioides thetaiotaomicron. A heparinase III é descri- ta, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Números 5.681.733 e 5.919.693. Os mutantes de heparinase III são descritos na Patente dos Es- tados Unidos N0 5.896.789. Mutantes de heparinase III preferidos são aque- les tendo uma ou mais histidina em His36, His105, Hisl 10, His139, His152, His225, His 234, His424, His469 e His539 substituído com uma alanina.
O precursor de preparação de LMWH pode ser processado por separação dependente do tamanho, tal como, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca de íon, e filtração. Etapas adi- cionais de processamento podem ser usadas antes ou após a separação dependente do tamanho, por exemplo, para obter produto de fármaco.
O termo "produto de fármaco" se refere a uma preparação de LMWH tendo a pureza requerida para e sendo formulada para uso farma- cêutico.
O termo "substância de fármaco" se refere a uma preparação de LMWH tendo os constituintes de polissacarídeo para uso farmacêutico, mas não necessariamente em sua formulação final, e/ou compreende um ou mais contaminante de não-produto (por exemplo, um ou mais produto inorgânico, tais como sulfato, cloreto, contaminante de proteína, subproduto de proces- so, tais como heparinase, cálcio, sódio).
Outros métodos de produção de uma preparação de LMWH con- forme aqui provida inclui provisão de uma "fração de movimento rápido" de uma amostra contendo glicosaminoglican (GAG), por exemplo, UFH. A fra- ção de movimento rápido pode ser feita conforme segue:
(1) sujeição de uma amostra contendo glicosaminoglican (GAG), por exemplo, UFH, a uma primeira de uma precipitação, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol), um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), e um sal (preferivel- mente, um sal de sódio, por exemplo, acetato de sódio), para proporcionar um primeiro sobrenadante;
(2) sujeição do primeiro sobrenadante a uma segunda precipita- ção, por exemplo, com um solvente orgânico polar (por exemplo, um álcool, por exemplo, etanol), e um solvente não-orgânico polar (por exemplo, água), para produzir um precipitado (este precipitado contém a fração de movimen- to rápido);
(3) e, preferivelmente, solubilização do precipitado.
As frações de amostra contendo (GAG), por exemplo, UFH, pro- duzidas por outros métodos, mas que produzem uma fração substancial- mente equivalente, por exemplo, uma tendo um comprimento de cadeia mé- dio de 9-16 dissacarídeos, podem também serem usadas como a fração de movimento rápido.
Em algumas concretizações, a fração de movimento rápido tem a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 60</formula>no qual,
X a Na ou Ca;
R é H ou SO3Na1
R1 é SO3Na ou COCH3, e
n = 2-50, por exemplo, 2-40; e a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 9 a 16, ou 8 a 15.
Esta composição pode ocorrer como um intermediário na produ- ção de uma LMWH, por exemplo, como o produto de precipitação para pro- porcionar uma fração de movimento rápido (conforme discutido aqui).
A fração de movimento rápido pode ser processada adicional- mente para proporcionar uma LMWH da invenção. O processamento da fra- ção de movimento rápido pode incluir digestão da fração de movimento rápi- do com um químico ou enzima que cliva uma ou mais ligações glicosídicas de ácido urônico não-sulfatado, por exemplo, uma ou mais ligações glicosí- dicas de ácido urônico não-sulfatado adjacentes a um resíduo de N-acetil glucosamina, por exemplo, para dar ocorrência a uma preparação com as qualidades e características aqui descritas. As enzimas podem ser avaliadas para especificidade de substrato pelas seguintes etapas: 1) classificação funcional de atividade de enzima contra dois substratos de HSGAG tendo densidades de sulfatação diferentes, por exemplo, heparina e sulfato de he- parina, pelo que as enzimas tendo uma preferência para sultato de heparina sobre heparina são selecionadas; 2) mapeamento do fragmento de substra- tos clivados da etapa 1 para avaliar a especificidade do substrato; 3) cliva- gem de uma LMWH, tal como intermediário de etapa 1 M118-REH, ou dalte- parina, usando a enzima, seguido por; 4) avaliação de atividade anti-Xa e atividade anti-lla do substrato clivado usando um ensaio in vitro; e 5) avalia- ção da distribuição de peso molecular (ou comprimento de cadeia médio) de substrato clivado usando cromatografia de permeação de gel (GPC) e/ou cromatografia de exclusão de tamanho interfaceada com difusão de luz mul- tiângulo (SEC-MALS).
A etapa 1 avalia uma capacidade da enzima agir como um HS- GAG liase identificada pela capacidade de gerar uma ligação C4-C5 insatu- rada nas extremidades de não-redução de produtos de clivagem, bem como a preferência de enzimas para substratos não-sulfatados, tal como sulfato de heparina. A atividade de enzima pode ser seguida espectrofotometricamente pelo monitoramento de absorvância de UV em 232 nm. Uma absorvância neste comprimento de onda indica formação de ácidos urônicos insaturados nas extremidades de não-redução do produto de clivagem. A atividade de enzima é monitorada ambos cineticamente (taxa inicial de formação de pro- duto), e em termos de formação de produto total seguindo digestão exausti- va (cerca de 12 a 15 horas). Enzimas preferidas têm cerca de duas vezes preferência para sulfato de heparina sobre heparina, e mais do que duas vezes (por exemplo, 3 a 5 vezes) diferença na atividade total.
A segunda etapa avalia a especificidade de clivagem da enzima. Enzimas adequadas para produção das composições de LMWH acima des- critas clivam preferencialmente regiões subssulfatadas de heparina ou sulfa- to de heparina. Se UFH é o substrato usado, esta preferência é demonstrada por uma subdigestão óbvia de substrato (conforme indicado pela presença de oligossacarídeos mais longos) com qualquer dissacarídeo sendo produzi- do tendo uma baixa densidade de sulfato. Em contraste, quando o substrato é sulfato de heparina, a digestão resulta em um número maior de dissacarí- deos que indica uma freqüência de corte mais alta.
As etapas remanescentes 3-5 podem ser formadas conforme descrito em outra parte aqui.
Exemplos de enzimas incluem heparinase III, mutantes de hepa- rinase Ill e HSGAG Iiase de Bacterioides thetaiotaomicron. Em algumas con- cretizações, a fração de movimento rápido é processada, pelo menos em parte, com uma heparinase Ill mutada tendo uma alanina no resíduo 225 da seqüência de aminoácido de heparinase III, ao invés de uma histidina. Estas enzimas são também referidas aqui como "M011".
A preparação de LMWH digerida pode ser o produto final, por exemplo, a substância de fármaco ou produto de fármaco, ou pode adicio- nalmente ser processada para obter o produto final, por exemplo, substância de fármaco ou produto de fármaco. A preparação de LMWH concentrada pode ser adicionalmente processada, por exemplo, por um ou mais de sepa- ração dependente do tamanho (por exemplo, por cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca de íon) e filtração. Preferivelmente, a preparação de LMWH concentrada é adicionalmente processada por uma separação dependente do tamanho, e a preparação de LMWH obtida a partir desta etapa tem um comprimento de cadeia médio de cerca de 9 a 16 dissa- carídeos.
Métodos de Avaliação ou Processamento de Preparações de LMWH Eletroforese Capilar
Enzimas
Análise de uma preparação de LMWH, tal como preparação de M118-REH usando CE inclui, por exemplo, digestão da preparação com uma ou mais enzimas de degradação de heparina. A(s) enzima(s) de degradação de heparina pode(m) ser uma ou mais heparinase, heparina liase, HSGAG liase, uma liase descrita como uma GAG liase que pode também degradar heparina, e/ou qualquer polipeptídeo descrito como uma hidrolase, sulfata- se/sulfohidrolase, ou glicerol hidrolase/glicosidase. Por exemplo, a prepara- ção de LMWH pode ser digerida com um ou mais de: uma glucoronil hidrola- se insaturada (por exemplo, F. Heparinum A4,5-glicoronidase, B. thetaiota- omicron A4,5-glicoronidase,); uma glucoronil hidrolase (por exemplo, a- iduronidase de mamífero, β-glucoronidase); uma sulfohidrolase (por exem- plo, F. heparimum 2-O-sulfatase, 6-O-sulfatase, 3-O-sulfatase, B. thetaiota- omicron 6-O-sulfatase, uma enzima de desulfatação de mucina, N- acetilglucosamina-6-sulfatase de mamífero, ácido idurônico-2-sulfatase de mamífero); uma N-sulfamidase (por exemplo, F. heparinum N-sulfamidase, heparina-N-sulfatase de mamífero); uma arilsulfatase; uma hexosaminidase; uma glicosil hidrolase (por exemplo, endo-N-acetilglucosaminidase); uma heparinase (por exemplo, Flavobacterium heparinium heparinase I, Flavo- bacterium heparinium heparinase II, Flavobacterium heparinium heparinase III, Flavobacterium heparinium heparinase IV); uma endoglucoronidase (por exemplo, heparanase de mamífero); uma heparina/heparan sulfato Iiase (por exemplo, Bacteróides thetaiotaomicron HSGAG Iiase I, Bacteróides thetaita- omicron HSGAG liase II, Bacteróides thetaiotaomicron HSGAG Iiase III, Bac- teróides thetaiotaomicron GAG Iiase IV; e fragmentos funcionais e variantes destes. Ela pode também incluir um polipeptídeo descrito conforme acima (por exemplo, uma heparinase ou uma heparina/sulfato de heparina liase) derivada de microorganismos outros do que Flavobacterium heparinium (a;k.a. Pedobacter heparinus) ou Bacteróides thetaiotaomicron. Por exemplo, Haloarcula marismortui, Agrobacterium tumefaciens, Streptrococcus pneu- moniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococ- cus agalactoae, Streptococcus intermedius, Streptococcus suis, Enterococ- cus faecalis, Rhodopseudomonas palustris, Nitrobacter winogradskyi, Nitro- bacter hamburgensis, Bradyhizobium japonicum, Rhizoboum meloliti, Meso- rhizobium loti, Spinghobacterium sp., Brucella abortus biovar, Brucella meli- tensis, Solibacter usitatus, Acidobacterium eapsulatum, Microbubifer degra- dans, Psudomonasaeruginosa, Burkholderia pseudomonascepacia, Geobac- ter metallireducens, Prevotella sp., Serrata marcescens, Cornybacterium sp., Anaeromyxobacter dehalogenans, Rhodopirellula baltica, Pirellula marina, e/ou Gemmata abscuriglobus.
Preferivelmente, pelo menos uma enzima usada na digestão é selecionada porque ela se cliva em ligações específicas dentro da heparina. Por exemplo, a enzima pode ser heparinase I e/ou HSGAG liase I. Em uma concretização, a preparação de LMWH é digerida com Flavobacterium hepa- rinium heparinase I. Em outras concretizações, a preparação de heparina é digerida com Bacteróides thataiotaomicron HSGAG liase L.
Outras enzimas podem ser selecionadas para uso na digestão que se decompõe somente com o uso de heparinase I, II e III. Quaisquer das enzimas aqui descritas podem ser substituídas com uma enzima com ativi- dade funcionalmente equivalente.
Em uma concretização preferida, a digestão está ocorrendo para completação, ou pelo menos suficientemente para proporcionar uma diges- tão tendo todos os produtos encontrados na Tabela 10A, e preferivelmente, substancialmente livre de material não-digerido.
Antes da digestão, a amostra pode ser liofilizada. Por exemplo, a amostra pode ser secada em um forno a vácuo, por exemplo, a cerca de 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 43°C, 46°C, 49°C, 52°C, ou 55°C, por cerca de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24 horas. Por exemplo, a amostra pode ser liofilizada e/ou secada sob uma das seguintes condições: 40°C por 12 horas; 46°C por 8 horas; 49°C por 6 horas; 52°C por 4 horas. Uma amos- tra pode ser suspensa em água ou um tampão solúvel (por exemplo, 1 mM de acetato de cálcio, 25 mM de acetato de sódio, pH 7,0, e 5% de glicina) a uma concentração de cerca de 1,2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ou 500 mg/ml. Uma ou mais enzima de degradação de heparina pode ser adicionada à a- mostra. Em algumas concretizações, heparinase I ou HSGAG Iiase I (ou combinações destas enzimas), heparinase Il ou HSGAG Iiase Il (ou combi- nações destas enzimas), e heparinase Ill ou HSGAG Iiase Ill (ou combina- ções destas enzimas), são adicionadas à amostra. A amostra é digerida a uma temperatura de cerca de 18°C, 25°C, 30°C, 37°C, ou 45°C por cerca de 6, 12, 16, 18, 20 ou 24 horas, por exemplo, a cerca de 25°C por 24 horas; a 30°C por cerca de 18 horas; a cerca de 37°C por 12 horas.
Em seguida a digestão, a enzima ou enzimas são removidas a partir da mistura de amostra, por exemplo, usando uma coluna de Ni2+, uma coluna de exclusão de tamanho, diálise, ultrafiltração, ou similar. A enzima ou enzimas pode ser inativada por aquecimento (por exemplo, a 65°C por 20 minutos), seguindo digestão. A amostra pode ser armazenada, por exemplo, a -85°C, -70°C, -20°C, 4°C, 18°C, ou 25°C por um período de tempo antes da análise.
Espécies separadas pelos métodos aqui descritos podem ser detectadas por numerosos meios, por exemplo, absorvância de ultravioleta (por exemplo, a um comprimento de onda de cerca de 232 nm), difusão de luz evaporativa, fluorescência, detecção amperométrica pulsada, e espec- trometria de massa. Em algumas concretizações, dois ou mais meios de de- tecção podem ser utilizados na mesma amostra, por exemplo, em série ou em paralelo.
Digestões de enzima adicionais podem ser usadas para digerir a amostra. Por exemplo, uma combinação de heparinase I ou HSGAG Iiase I (ou combinações destas enzimas), heparinase II ou HSGAG Iiase II (ou combinações destas enzimas), heparinase III ou HSGAG liase III (ou combi- nações destas enzimas), e 2-0 sulfatase, Δ4,5 glucoronidase, e/ou hepari- nase I ou HSGAG Iiase I (ou combinações destas enzimas), heparinase II ou HSGAG Iiase II (ou combinações destas enzimas), ou heparinase III ou HS- GAG liase III (ou combinações destas enzimas), pode ser usada para diges- tão, e, por exemplo, detectada pelos métodos descritos acima.
Os produtos de digestão são analisados usando-se um instru- mento de Eletroforese Capilar Agilent 3D. O capilar é um capilar de sílica fundida exposta à trajetória de luz extendida de 75 μm de diâmetro interno, comprimento efetivo de 72 cm. Tris (50 mM), 10 μm de dextran sulfato a pH 2,5 é usado como tampão de CE. As amostras são injetadas a uma pressão de 3Pa (30 mbar) por 20 segundos. A separação é realizada em polaridade negativa, e o analito é monitorado a 232 nm com 310 nm como o compri- mento de onda de referência. Novos capilares são pré-tratados com uma seqüência de água, hidróxido de sódio 1N, água, e tampão de separação. Para cada análise de amostra, o capilar é pré-condicionado com tampão por 5 minutos.
Informação adicional útil para os métodos aqui descritos pode ser encontrada em, por exemplo, Linhardt et al(1998) Biochem. J., 254:781- 787; Chuang et al. (2001) J. Chromatogr. A, 932:65-74, e Yates et al., (2004) J. Med. Chem., 47:277-280, e Rhomberg et al. (1988) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95(8):4176-81.
Eletroforese Capilar
CE, usando-se, por exemplo, um capilar de sílica fundida não- revestido, pode ser usado para analisar LMWH, por exemplo, preparações de LMWH aqui descritas. Sob condições de baixo pH, a separação é ditada por mobilidade eletroforética de analito quase exclusivamente. Devido ao fato que todos os sacarídeos relacionados à LMWH têm uma carga negativa de rede devido às porções de carboxilato e sulfato, a separação é conduzida sob polaridade reversa. Em adição, a suplementação do tampão de baixo pH (pH 2,5) com dextran sulfato previne absorção não-específica de material similar a heparina aniônica, capacitando formas de picos simétricas e quanti- ficação precisa.
As espécies na preparação de LMWH podem ser decompostas com uma série de cinco digestões (discutidas em detalhe em qualquer parte aqui); cada digestão é submetida à eletroforese capilar após adição de um naftaleno monosulfonato de padrão interno.
14 componentes individuais (vide, por exemplo, Tabela 10, aqui) são decompostos na CE. A recuperação de massa na metodologia de análi- se composicional foi avaliada conforme segue. Esta análise ocorreu em dois níveis: (1) recuperação de massa após digestão enzimática, e (2) recupera- ção de massa após separação com eletroforese capilar.
RMN
Dois espectroscópios de ressonância magnética nuclear dimen- sional (2D RMN) podem ser usados como um meio de decompor parcial- mente e identificar sinais com sobreposição de sinal mínima. Integração dos sinais de 2D RMN, seguida por cálculos simples podem facilitar um análise composicional quantitativa de monossacarídeo de uma mistura de polissaca- rídeo tal como análise de uma preparação de LMWH tal como aquela aqui provida.
Além disso, 2D RMN pode proporcionar informação nos ambien- tes de ligação de um constituinte de dissacarídeo, por exemplo, um dissaca- rídeo H-U, proporcionando análise de ligações de dissacarídeo, incluindo ambas análise qualitativa e quantitativa. Em algumas concretizações, a aná- lise de 2D RMN pode proporcionar informação sobre o estado de epimeriza- ção de uma ligação de H-U, por exemplo, proporcionando informação a se o estado de epimerização é um resíduo de ácido idurônico ou um resíduo de ácido glucurônico (isto é, I ou U).
Em algumas concretizações, um experimento de espectroscopia de correlação de 2D próton-carbono (HSQC) pode proporcionar análise composicional quantitativa em uma ou mais glicosaminoglican. Por exemplo, em algumas concretizações, a análise de 2D RMN pode proporcionar infor- mação sobre o vizinho mais próximo na extremidade de redução de um mo- nossacarídeo. Esta informação pode proporcionar, por exemplo, o contexto de seqüência no qual um monossacarídeo particular está presente em uma mistura de polissacarídeo, por exemplo, uma LMWH, tal como uma prepara- ção de LMWH aqui descrita.
Em algumas concretizações, o método de 2D RMN permite dis- criminar entre resíduos de extremidade interna e de redução. Em particular, a identificação de quantidades mensuráveis de redução de N-acetil gluco- samina é peculiar daquela LMWH aqui descrita.
Em algumas concretizações, a análise de 2D RMN pode propor- cionar informação sobre a extremidade de não-redução de cadeias de LM- WH, isto é, a quantidade de AUAp2-OH gerada pela digestão enzimática.
Em algumas concretizações, o 2D RMN pode ser usado para avaliar uma mistura de polissacarídeo para a presença de uma ou mais im- purezas, tal como sulfato de dermatan. Por exemplo, a ausência de um sinal no próton RMN a 2,06 ppm pode ser usada para confirmar que sulfato de dermatan não está presente em níveis maiores do que o nível de detecção do instrumento (isto é, em um nível maior do que 1%).
Em uma concretização preferida, a estrutura de sacarídeo é ava- liada usando 2D RMN, por exemplo, amostra de uma mistura de polissacarí- deo trocada com D20, liofilizada durante toda a noite, e redissolvida em D20. A amostra é, em seguida, colocada em um tubo de RMN para análise e curso a 303 K com um espectrômetro Bruker Avance de 600 MHz equipa- do com uma sonda TXI de 5 mm. O espectro de HSQC de gradiente aumen- tado é registrado com desacoplamento de carbono durante aquisição. Os dados são, em seguida, adquiridos com 16 escaneamentos para cada um dos 256 instrumentos na dimensão 13C indireta. O retardo de transferência de polarização é ajustado para 2.941 ms para uma transferência opcional com acoplamentos escalares IJCH de 155 Hz.
Os dados são geralmente, em seguida, processados, por exem- plo, o tamanho da matriz 1K χ 256 é zero preenchido para 2K χ 1K pela apli- cação de uma função de co-seno quadrado antes da transformação de Fou- rier. Os picos cruzados são integrados, por exemplo, usando-se o software MestreC 4.5, e somente picos positivos são usados para integração. As inte- grais são normalizadas ao pico H2/C2 de glucosamina N-sulfatada (3.26/60.5 ppm). Os picos são geralmente designados usando-se alterações químicas publicadas e designações experimentais via experimentos COSY e TOCSY.
A percentagem de composição é calculada usando-se os volu- mes de pico cruzado anomérico, para qual todos os resíduos de ácido urôni- co têm acoplamentos 1JCH similares, como fazem todos os resíduos de glu- cosamina. Para picos anoméricos de glucosamina onde sobreposição impe- de quantificação precisa, sinais de H2/C2 são, ao invés, integrados. A quan- tidade de todo monossacarídeo é expressa como percentagem do teor de glucosamina ou ácido urônico total. A razão de 6-0-sulfatação versus 6-0- desulfatação é calculada de integração de sinal de H6/C6.
Os dados de percentagem de composição são providos na Ta- bela 11 A.
Informação adicional útil para os métodos aqui encontrados po- de ser verificada em, por exemplo, Guerrini et al (2005) Anal. Biochem., 337- 35-47.
Composições Farmacêuticas
As composições, por exemplo, composições farmaceuticamente aceitáveis, que incluem uma preparação de LMWH aqui descrita, formuladas junto com uma transportador farmaceuticamente aceitável, são providas. Conforme aqui usado, "adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis" incluem quaisquer e todos os solventes, meio de dispersão, agentes de retardamento isotônicos e de absorção, e similares, que são fisiologicamente compatíveis. O transportador pode ser adequado para administração intravenosa, intra- muscular, subcutânea, parenteral, retal, cervical ou epidermal (por exemplo, por injeção ou infusão).
As composições desta invenção podem estar em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquida, semis- sólida e sólida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infundíveis), dispersões ou suspensões, Iipossomas e supositórios. A for- ma preferida depende do modo pretendido de administração e aplicação te- rapêutica. Composições preferidas típicas estão na forma de soluções inje- táveis ou infundíveis. O modo preferido de administração é parenteral (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Em uma concretização preferida, a preparação de LMWH é administrada por infusão ou injeção intravenosa. Em outra concretização preferida, a preparação de LMWH é administrada por injeção intramuscular ou subcutânea.
As frases "administração terapêutica" e "parenteralmente admi- nistrado", conforme aqui usadas, significam modos de administração outros do que administração enteral ou tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intravítrea, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtra- queal, subcutânea, subcutilar, intra-articular, subcapsular, subaraquinóide, intracervical, epidural e injeção intasternal e infusão.
As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. As composições podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersão, Iipos- soma, ou outra estrutura ordenada adequada à alta concentração. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ati- vo (isto é, LMWH na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme re- querido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são pre- paradas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que con- tém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos da- queles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são seca- gem a vácuo e congelamento-secagem, que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previa- mente estéril-filtrada desta. A fluidez correta de uma solução pode ser man- tida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lectin, pela manu- tenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão, e pelo uso de tensoativos. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser provida pela inclusão na composição de um agente que retarda absorção, por exemplo, vários polímeros, sais de monoestearato, e gelatina.
As preparações de LMWH podem ser administradas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplica- ções terapêuticas, a rota/modo preferido de administração é injeção intrave- nosa ou infusão. Conforme será apreciado por aqueles técnicos no assunto, a rota e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados dese- jados. Em certas concretizações, o composto ativo pode ser preparado com um transportador que protegerá o composto contra liberação rápida, tal co- mo uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdermais, e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros bio- degradáveis, biocompatíveis, podem ser usados, tais como etileno vinil ace- tato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poli- láctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patente- ados ou geralmente conhecidos aos versados na técnica. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinsin, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.
Formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de dose múl- tipla, por exemplo, com um conservante adicionado. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos o- leosos e aquosos, e podem conter agentes formulatórios, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.
Em certas concretizações, uma preparação de LMWH aqui pro- vida pode ser administrada oralmente, por exemplo, com um diluente inter- no, ou um transportador comestível assimilável. O composto (e outros ingre- dientes, se desejado) pode ser também encerrado em uma cápsula de gela- tina de invólucro duro ou macio, comprimido em tabletes, ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers, e similares. Para administrar um composto da invenção por outro do que administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para impedir sua inativação.
Núcleos de drágea são providos com revestimentos adequados. Para esta proposta, soluções de açúcar concentrado podem ser usadas, que podem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e sol- ventes orgânicos adequados, ou misturas de solvente. Corantes ou pigmen- tos podem ser adicionados aos tabletes ou revestimentos de drágea para identificação, ou para caracterizar combinações diferentes de doses de composto ativo. Composições farmacêuticas que podem ser usadas oral- mente incluem cápsulas de ajuste produzidas de gelatina, bem como cápsu- las vedadas macias produzidas de gelatina, e um plastificante, tal como gli- cerol ou sorbitol. As cápsulas de ajuste podem conter os ingredientes ativos em mistura com carga tal como lactose, ligantes, tais como amidos, e/ou lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dis- solvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, pa- rafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Em adição, estabilizadores po- dem ser adicionados. Microesferas formuladas para administração oral po- dem também serem usadas. Tais microesferas foram bem definidas na téc- nica. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens adequadas para tal administração.
Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de tabletes ou pastilhas formuladas na maneira convencional.
Para administração por inalação, a preparação de LMWH pode ser convenientemente distribuída na forma de uma apresentação de pulveri- zação de aerossol de acondicionamentos pressurizados, ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono, ou outro gás adequado. No caso de um aerosol pressurizado, a unidade de dosagem po- de ser determinada pela provisão de uma válvula para distribuir uma quanti- dade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina, para uso em um inalador ou insuflador, podem ser formuladas contendo uma mistura de pó do composto, e uma base de pó adequada, tal como Iactose ou amido. Em adição, formações de pó seco para terapia de inalação estão dentro do escopo da invenção. Tais formulações de pó seco podem ser preparadas conforme descrito em W002/32406.
A composição pode também ser formulada em composições re- tal ou vaginal, tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases de supositórios convencionais, tais como manteiga de ca- cau, ou outros glicerídeos.
Em adição às composições anteriormente descritas, os compos- tos podem também ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de ação longa podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável), ou resinas de troca de íon, ou derivados frugalmente solúveis, por exemplo, como um sal frugalmente solúvel.
As composições farmacêuticas também podem compreender transportadores ou excipientes sólidos ou de fase de gel adequados. Exem- plos de tais transportadores ou excipientes incluem, mas não estão limitados a, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina, e polímeros, tais como polietileno glicóis.
Exemplos de composições que podem ser usadas para distribui- ção não-parenteral (por exemplo, distribuição não-invasiva) incluem: quanti- dades medidas de uma composição a ser administrada de um inalador para distribuição pulmonar; tabletes tendo uma unidade de dosagem prescrita para administração oral; emplastros transdermais para distribuição de uma unidade de dosagem através da pele; e supositórios para distribuir unidade de dosagem retalmente ou vaginalmente. As composições podem ser incluí- das em um recipiente, um acondicionamento, ou dispensador junto com ins- truções para administração.
A preparação de LMWH pode também ser administrada com dispositivos de implantação de curto e longo prazo. As preparações podem ser implantadas subcutaneamente, podem ser implantadas em tecidos ou órgãos (por exemplo, a artéria coronária, artéria carótida, artéria renal, e ou- tras artérias periféricas, veias, rim, córnea do coração, vítreo, cérebro, etc), ou podem ser implantadas em espaços fisiológicos ao redor dos tecidos e órgãos (por exemplo, cápsula do rim, pericárdio, espaço torácico ou peritoneal).
A preparação de LMWH pode também ser usada para revestir vários dispositivos médicos. Por exemplo, a preparação de LMWH pode ser usada para revestir um stent ou circuito extra corpóreo. Tais formulações das preparações de LMWH podem incluir usando-se, por exemplo, gotas de liberação controlada, gel ou microesferas, bem como polímeros, tais como PLGA, celulose, alginato e outros polissacarídeos.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a res- posta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo simples pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas sobre o tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzi- da ou aumentada, conforme indicado pelas exigências da solução terapêuti- ca. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em unida- de de dosagem para caso de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, conforme aqui usada, se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em as- sociação com o transportador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas por e diretamen- te dependente de (a) as características únicas do composto ativo, e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técni- ca de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
É para ser notado que valores de dosagem podem variar com o tipo e severidade da condição a ser aliviada. É para ser adicionalmente compreendido que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados sobre o tempo de acordo com a necessida- de individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou super- visiona a administração das composições.
As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente efetiva" ou uma "quantidade profilaticamente efetiva" de uma preparação de LMWH. Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" se refere a uma quantidade efetiva, em dosagens, e por períodos de tempo necessário, para alcançar um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente efetiva da preparação de LMWH pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a preparação de LMWH para induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou danosos da preparação de LMWH são sobre- carregados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "dosagem tera- peuticamente efetiva" inibe preferivelmente um parâmetro mensurável, por exemplo, coagulação ou trombose, por exemplo, conforme medido por ACT e aPTT, por pelo menos cerca de 20%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferivelmente por pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferivelmente por pelo menos cerca de 80% em relação aos indivíduos não-tratados. A capacidade de um composto inibir um parâmetro mensurável, por exemplo, coagulação ou trombose, pode ser avaliada em um sistema de modelo de animal prognosticado de eficiência em humanos.
Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada pelo exame da capacidade do composto em um ensaio in vitro. Doses e- xemplares para administração intravenosa da preparação de LMWH são cerca de lU/kg a 200 IU/kg, por exemplo, 1 lU/kg; 2 lU/kg; 3 lU/kg; 4 lU/kg; 5 IU/kg; 6 lU/kg; 7 lU/kg; 8 lU/kg; 9 lU/kg; 10 lU/kg; 11 lU/kg; 12 lU/kg; 13 IU/kg; 14 IU/kg; 15 IU/kg; 16 IU/kg; 17 IU/kg; 18 IU/kg; 19 IU/kg; 20 IU/kg; 21 IU/kg; 22 IU/kg; 25 IU/kg; 30 IU/kg; 40 IU/kg; 50 IU/kg; 70 IU/kg; 100 IU/kg; 125 IU/kg; 150 IU/kg; 175 IU/kg; 200 IU/kg. Outras doses exemplares para administração intravenosa da preparação de LMWH são cerca de 0,03 mg/kg a 0,45 mg/kg, por exemplo, 0,03 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,22 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,27 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,33 mg/kg, 0,37 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,44 mg/kg, preferivelmente cerca de 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,44 mg/kg, 0,47 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,60 mg/kg, 0,7 mg/kg, preferivelmente cerca de 0,30 mg/kg a 0,50 mg/kg, por exemplo, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,42 mg/kg, 0,44 mg/kg, 0,47 mg/kg ou 0,50 mg/kg.
Uma "quantidade profilaticamente efetiva" se refere a uma quan- tidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para al- cançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, desde que a dose profi- lática é usada em indivíduos antes ou em um estágio anterior de doença, a quantidade profilaticamente efetiva será menor do que a quantidade terapeu- ticamente efetiva.
Também dentro do escopo da invenção estão kits compreen- dendo uma preparação de LMWH aqui provida. O kit pode incluir um ou mais outros elementos incluindo: instruções para uso; outros reagentes, por e- xemplo, um agente terapêutico ou sulfato de protamina; dispositivos ou ou- tros materiais para preparar a preparação de LMWH para administração; transportadores farmaceuticamente aceitáveis; e dispositivos ou outros ma- teriais para administração a um indivíduo. Instruções para uso podem incluir instruções para monitoramento de atividade anti-Xa e/ou atividade anti-lla usando-se ensaios de coagulação, tais como ACT e aPTT. As instruções podem incluir instruções para aplicação terapêutica incluindo dosagens su- geridas e/ou modos de administração, por exemplo, em um paciente tendo uma distúrbio, por exemplo, uma distúrbio aqui descrita. Outras instruções podem incluir instruções na reversão da atividade anti-Xa e/ou atividade anti- lla usando-se sulfato de protamina. O kit pode adicionalmente conter pelo menos um reagente adicional, tal como um agente de diagnóstico ou tera- pêutico, por exemplo, um agente de diagnóstico ou terapêutico conforme aqui descrito, formulado conforme apropriado, em uma ou mais preparações farmacêuticas separadas.
Usos Profiláticos e Terapêuticos
As preparações de LNWH podem ser usadas para tratar um in- divíduo. Conforme aqui usado, o termo "tratar" ou "tratamento" é definido como a aplicação ou administração de uma preparação de LMWH a um indi- víduo, por exemplo, um paciente, ou aplicação ou administração a um tecido isolado ou célula de um indivíduo, por exemplo, um paciente, que é retorna- do ao paciente. O indivíduo pode ser um paciente tendo uma distúrbio (por exemplo, uma distúrbio conforme aqui descrita), um sintoma de uma distúr- bio, ou uma predisposição a uma distúrbio. O tratamento pode ser para cu- rar, remediar, aliviar, alterar, melhorar, paliar, ou afetar a distúrbio, os sinto- mas da distúrbio ou a predisposição a distúrbio. Conforme aqui usado, um indivíduo é um vertebrado, tal como um ser humano, primata não-humano, vaca, cavalo, porco, ovelha, cabra, cão, gato, ou roedor. O indivíduo pode ser, por exemplo, um animal experimental, um animal veterinário, ou um in- divíduo humano. Um tratamento pode ser terapêutico, por exemplo, um tra- tamento que cura, remedia, alivia, melhora, palia ou afeta a distúrbio ou um sintoma da distúrbio, por exemplo, diminui, alivia ou melhora uma condição indesejada existente ou sintoma desta, ou profilática, por exemplo, um tra- tamento que retarda, por exemplo, previne o início de uma condição indese- jada ou sintoma desta.
As heparinas e LMWHs têm muitas utilidades terapêuticas. As preparações de LMWH aqui providas podem ser usadas para o tratamento de qualquer tipo de condição na qual terapia de heparina ou LMWH é útil. Desse modo, as preparações e métodos são úteis em uma variedade de métodos in vitro, in vivo e ex vivo. Por exemplo, é conhecido que heparinas e LMWHs são úteis para prevenir e tratar demência, tais como doença de Al- zheimer, distúrbios associadas com coagulação (por exemplo, DTV e PE), distúrbios fibróticas (por exemplo, fibrose de órgão maior, distúrbios fibropro- liferativas e cicatrização associada com trauma), distúrbios trombóticos (por exemplo, ACS, angina estável ou instável, Ml (por exemplo, STEMI e NS- TEMI)), ou doença cardiovascular (aterosclerose), condições vasculares ou fibrilação arterial, alergia ou doenças respiratórias (por exemplo, asma, enfi- sema, síndrome de angústia respiratória adulta (ARDS), fibrose cística, e dano de reperfusão de pulmão), choque circulatório e distúrbios relaciona- das, distúrbios angiogênicas, câncer e distúrbios metastáticas, sepsia, este- nose e restenose, e osteoporose. As preparações de LMWH aqui providas podem ser também usadas em indivíduos tendo uma fratura (por exemplo, uma fratura de bacia) ou a um indivíduo antes, durante ou após uma inter- venção cirúrgica (por exemplo, transplante de órgão, cirurgia ortopédica, re- posição de bacia, reposição de joelho, PCI, reposição de stent, angioplastia e CABG). Cada uma destas distúrbios é bem-conhecida na técnica, e é des- crita, por exemplo, em Harrisons's Principies of Internai Medicine (McGraw Hill, Inc., New York), que é aqui incorporado por referência. O uso de com- posições de HLGAG em vários métodos terapêuticos é descrito e resumido em Huang, J. e Shimamura, A., Coagulation Disorders, 12, 1251-1281 (1998).
Desse modo, as preparações de LMWH são úteis para tratamen- to ou prevenção de distúrbios associadas com coagulação. Quando um de- sequilíbrio na trajetória de coagulação altera a coagulação excessiva, o re- sultado é o desenvolvimento de tendências trombóticas, que são freqüente- mente manifestadas como ataques de coração, derrames cerebrais, DVT, ACS, angina estável e instável, e infartos miocardiais. Uma "doença associ- ada com coagulação", conforme aqui usado, se refere a uma condição ca- racterizada por inflamação local que pode resultar de uma interrupção ou redução no suprimento de sangue a um tecido que pode ocorrer, por exem- plo, como um resultado de bloqueio de um vaso sangüíneo responsável pelo suprimento de sangue ao tecido, tal como é visto em infarto miocardial ou cerebral, ou doença vascular periférica, ou como um resultado de formação embólica associada com condições, tais como fibrilação arterial, DVT ou PE. As pessoas que suportam cirurgia, anestesia e períodos prolongados de lei- to, ou outra ínatividade, são freqüentemente susceptíveis a uma condição conhecida como trombose venosa profunda, ou DVT, que é uma coagulação de sangue venoso nas extremidades inferiores e/ou pélvis. Esta coagulação ocorre devido à ausência de atividade muscular nas extremidades inferiores requeridas para bombear o sangue venoso (estase), dano vascular local, ou um estado hipercoagulável. A condição pode ser ameaçadora à vida se um coágulo de sangue migra para o pulmão, resultando em uma "embolia pul- monar", ou, de outro modo, interfere com a circulação cardiovascular. Um método de tratamento envolve administração de um anti-coagulante.
Os métodos são úteis para tratar distúrbios trombóticos e doen- ça cardiovascular. A doença cardiovascular inclui, mas não está limitada a, aterosclerose e fibrilação arterial. Fibrilação arterial é uma forma comum de arritmia geralmente ocorrendo como um resultado de estresse emocional ou em seguida a cirurgia, exercício, ou intoxicação alcoólica aguda. A fibrilação arterial é caracterizada por atividade arterial desorganizada sem ondas P discretas no ECG de superfície. Esta atividade desorganizada pode conduzir a fluxo de sangue impróprio e formação de trombina. Estas trombinas podem embolizar, resultando em isquemia cerebral, e outras distúrbios.
Os distúrbios trombóticos incluem, mas não estão limitadOs a, ACS1 por exemplo, MI, angina estável e instável. O infarto miocardial é uma doença que às vezes ocorre com uma diminuição abrupta no fluxo de san- gue coronário que segue uma oclusão trombótica de uma artéria coronária anteriormente estreitada por aterosclerose. Tal dano pode ser produzido ou facilitado por fatores, tais como cigarros, hipertensão, e acúmulo de lipídeo. A angina é devido à isquemia miocardial transiente. Esta distúrbio é usual- mente associada com peso, pressão, aperto, abafamento, ou sentimento de choque abaixo do esterno. Episódios são usualmente causados por esforço ou emoção, mas podem ocorrer em repouso. STEMI, também referido como "infarto miocardial de onda Q", se refere a MI com um ecocardiograma a- normal. NSTEMI, ou "infarto miocardial sem onda Q", não está associado a uma anormalidade de ecocardiograma. A angina estável ocorre em tempos prognosticáveis com uma quantidade específica de esforço ou atividade. A angina instável pode ocorrer como uma mudança no modelo usual de angina estável. Inclui-se ainda dor no peito que ocorre em repouso, ou com menos e menos esforço, que pode ser mais severa e mais longa, ou que é menos responsiva a nitroglicerina. Angina instável significa que o fluxo sangüíneo adquiriu pior potencialidade por um estreitamento aumentado ou coágulos de sangue pequenos na artéria coronária. A angina instável é um sinal aler- tando que infarto miocardial pode ocorrer logo.
A preparação de LMWH pode ser usada para o tratamento de distúrbios trombóticas e cardiovasculares sozinhas ou em combinação com outros agentes terapêuticos para reduzir o risco de uma distúrbio cardiovas- cular, ou para tratamento da doença cardiovascular. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma preparação de LMWH co-formulada com, e/ou co-administrada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos aqui descritos. Administrada "em combinação", conforme aqui usado, significa que dois (ou mais) tratamentos diferentes são distribuídos ao indivíduo durante o curso da aflição do indiví- duo com a distúrbio, por exemplo, os dois ou mais tratamentos são distribuí- dos após o indivíduo tiver sido diagnosticado com a distúrbio, ou identificado como um risco para a distúrbio e antes da distúrbio tiver sido prevenida, cu- rada ou eliminada. Em algumas concretizações, a distribuição de um trata- mento está ainda ocorrendo quando a distribuição do segundo começa, de modo que existe sobreposição. Isto é, às vezes, referido aqui como "distribu- ição "simultânea" ou "concorrente". Em outras concretizações, a distribuição de um tratamento termina antes da distribuição do outro tratamento come- çar. A distribuição pode ser tal que um efeito do primeiro tratamento distribu- ído é ainda detectável quando o segundo é distribuído. Outros agentes tera- pêuticos incluem, mas não estão limitados a, agentes anti-inflamatórios, a- gentes antitrombóticos, agentes antiplaqueta, agentes fibrinolíticos, trombolí- ticos, agentes de redução de lipídeo, inibidores de trombina direta, inibidores de anti-Xa, inibidores de anti-lla, inibidores de receptor de glicoproteína I- Ib/lla, e inibidores de trombina direta. Exemplos de agentes que podem ser administrados em combinação com as preparações de LMWH aqui providas incluem bivalirudin, hirudin, hirugen, Angíomax, agatroban, PPACK, thrombin aptamers, aspirina, inibidores de GPIIIb/llla (por exemplo, Integrelin), inibido- res de P2Y12, tienopiridina, ticlopidina, e clopidogrel.
A monitorabilidade por ensaios de anticoagulação padrões, tais como ACT e aPTT, bem como a reversibilidade das preparações de LMWH aqui providas, aperfeiçoam a flexibilidade no tratamento de pacientes, tais como aqueles pacientes admitidos ao hospital e suportando avaliação para possível cirurgia cardiovascular. Tais benefícios são realçados pelo seguinte cenário. Um paciente vai para o hospital queixando-se de sintomas que po- dem estar associados com várias distúrbios trombóticas, tais como ACS, incluindo angina estável, angina instável e Ml. A monitorabilidade e reversibi- lidade das preparações de LMWH aqui providas permitem o uso de tais pre- parações enquanto o paciente está sendo avaliado para cirurgia cardiovas- cular potencial. Se é determinado que o paciente receberá intervenção cirúr- gica, tais como PCI ou reposição de stent, a monitorabilidade das prepara- ções de LMWH, a atividade anti-Xa e a atividade anti-lla da preparação de LMWH podem ser monitorados durante o procedimento, e, se necessário, uma ou mais doses adicionais da preparação de LMWH podem ser dadas durante ou após o procedimento para manter estas atividades. Se é deter- minado que o paciente receberá uma intervenção cirúrgica tal como CABG, a atividade anti-Xa e atividade anti-lla da preparação de LMWH podem ser neutralizadas com sulfato de protamina antes da intervenção cirúrgica. Em adição, a atividade anti-Xa e atividade anti-lla podem ser monitoradas no paciente para assegurar que a atividade é suficientemente diminuída antes da cirurgia.
As preparações de LMWH aqui providas são também úteis para tratamento de condições vasculares. Condições vasculares incluem, mas não estão limitadas a, distúrbios tais como DVT, doença vascular periférica, isquemia cerebral, incluindo derrame cerebral, e PE. Um ataque isquêmico cerebral ou isquemia cerebral é uma forma de condição isquêmica na qual o suprimento de sangue ao cérebro é bloqueado. Esta interrupção ou redução no suprimento de sangue ao cérebro pode resultar de uma variedade de causas, incluindo um bloqueio intrínseco ou oclusão do próprio vaso sangüí- neo, uma fonte remotamente originada de oclusão, pressão de perfusão di- minuída, ou viscosidade de sangue aumentada, resultando em fluxo de san- gue cerebral inadequado, ou um vaso de sangue rompido no espaço suba- racnóide ou tecido intracerebral. Os métodos são úteis para tratamento de isquemia cerebral. A isquemia cerebral pode resultar em déficits transientes ou permanentes e a seriedade do dano neurológico em um paciente que experimentou isquemia cerebral depende da intensidade e duração do even- to isquêmico. Um ataque isquêmico transiente é um em que o fluxo de san- gue para o cérebro é interrompido somente brevemente, e causa déficits neurológicos temporários, que freqüentemente são claros em menos do que 24 horas. Os sintomas de TIA incluem torpor ou fraqueza de face e mem- bros, perda da capacidade de falar claramente e/ou compreender a fala de outros, uma perda de visão ou obscuridade de visão, e um sentimento de vertigem. Ataques isquêmicos cerebrais permanentes, também denomina- dos derrame cerebral, são causados por uma interrupção ou redução mais longa no fluxo de sangue resultante de ou uma trombina ou embolismo. Um derrame cerebral causa uma perda de neurônios tipicamente resultando em um déficit neurológico que pode melhorar, mas que não dissolve totalmente.
O derrame cerebral tromboembólico é devido à oclusão de um vaso sangüíneo extracranial ou intracranial por um trombo ou êmbolo. Devi- do a ser freqüentemente difícil discernir se um derrame cerebral é causado por uma trombose ou embolismo, o termo "tromboembolismo" é usado para cobrir derrames cerebrais causados por qualquer destes mecanismos.
Os métodos são também dirigidos ao tratamento de derrame cerebral tromboembólico agudo usando-se uma preparação de LMWH aqui provida. Um derrame cerebral agudo é uma síndrome médica envolvendo dano neurológico resultante de um evento isquêmico, que é uma interrupção ou redução no suprimento de sangue ao cérebro.
Uma quantidade efetiva de uma preparação de LMWH sozinha ou em combinação com outro terapêutico para o tratamento de derrame ce- rebral é aquela quantidade suficiente para reduzir dano de cérebro in vivo resultante de derrame cerebral. Uma redução de dano cerebral é qualquer prevenção de dano ao cérebro que, de outro modo, teria ocorrido em um indivíduo que experimenta um derrame cerebral tromboembólico ausente de tratamento aqui descrito. Vários parâmetros fisiológicos podem ser usados para avaliar a redução de dano cerebral, incluindo tamanho de infarto menor, fluxo de sangue cerebral regional aperfeiçoado, e pressão intracranial dimi- nuída, por exemplo, conforme comparado a parâmetros de paciente de pré- tratamento, pacientes de derrame cerebral não-tratados, ou pacientes com derrame cerebral tratado com agentes trombolíticos apenas.
A preparação de LMWH pode ser usada sozinha ou em combi- nação com um agente terapêutico para tratar uma doença associada com coagulação. Exemplos de terapêuticos úteis no tratamento de doenças as- sociadas com coagulação incluem agentes de anticoagulação, agentes anti- plaquetas, e agentes trombolíticos.
Agentes de anticoagulação previnem a coagulação de compo- nentes de sangue e, desse modo, previnem formação de coágulo. Anticoa- gulantes incluem, mas não estão limitados a, varfarina, Coumadin, dicuma- rol, fenprocoumon, acenocoumarol, biscoumacetato de etila, e derivados de indandiona. "Inibidores de trombina direta" incluem hirudin, hirugen, Angio- max, agatroban, PPACK, aptameros de trombina. Agentes anti-plaquetas inibem agregação de plaqueta, e são freqüentemente usados para prevenir derrame cerebral tromboembólico em pacientes que tenham experimentado um ataque isquêmico transiente, ou derrame cerebral. Agentes trombolíticos lisam coágulos que causam o derrame cerebral tromboembólico. Agentes trombolíticos têm sido usados no tratamento de tromboembolismo venoso agudo e embolia pulmonar, e são conhecidos na técnica (por exemplo, vide Hennekens et al., J Am Coll Cardiol; v. 25 (7 supp), p. 18S-22S (1995); Hol- mes, et al, J Am Coll Cardiol; v. 25 (7 suppl), p. 10S-17S(1995)).
Embolismo pulmonar, conforme aqui usado, se refere a uma dis- túrbio associada com o aprisionamento de coágulo de sangue no lúmen de uma artéria pulmonar, causando disfunção respiratória severa. Embolia pul- monar freqüentemente se origina nas veias das extremidades inferiores on- de coágulos se formam na veia da perna profunda e, em seguida, se deslo- cam para os pulmões, via a circulação venosa. Desse modo, embolismo pulmonar freqüentemente ocorre como uma complicação de trombose veno- sa profunda nas veias de extremidade inferior. Os sintomas de embolismo pulmonar incluem ataque agudo de brevidade de respiração, dor no peito (piora com respiração), e taxa de coração e taxa respiratória rápidas. Alguns indivíduos podem experimentar hemoptise.
As preparações e métodos são também úteis para tratamento ou prevenção de aterosclerose. A heparina tem se mostrado ser benéfica na prevenção de aterosclerose em vários modelos experimentais. A ateroscle- rose é uma forma de aterosclerose que é acreditada ser a causa de muitas doenças de artéria coronária, aneurisma aórtico e doença atrial das extremi- dades inferiores, bem como contribuindo pata doença cerebrovascular.
As preparações de LMWH são também úteis antes, durante e após cirurgia e procedimentos de diálise. Pacientes cirúrgicos, especialmen- te aqueles acima da idade de 40 anos, têm um risco aumentado de desen- volver DVT. Desse modo, o uso das preparações de LMWH aqui providas para prevenção do desenvolvimento de trombose associada com procedi- mentos cirúrgicos é contemplado. Em adição aos procedimentos cirúrgicos gerais, tais como intervenção percutânea (por exemplo, intervenção coroná- ria percutânea (PCI), stents e outras aproximações similares, reposição de bacia e joelho, cirurgia de by-pass cardíaca-pulmonar, cirurgia de revascula- rização coronária, cirurgia ortopédica, e cirurgia de reposição de prótese, os métodos são também úteis em indivíduos suportando um procedimento de transplante de tecido ou órgão, ou tratamento de fraturas, tais como fraturas de bacia.
Em adição, as preparações de LMWH aqui providas são úteis para tratamento de doenças respiratórias, tais como fibrose cística, asma, alergia, enfisema, síndrome de angústia respiratória adulta (ARDS), dano de reperfusão de pulmão, e dano de isquemia-reperfusão do pulmão.
A fibrose cística é uma doença progressiva crônica que afeta o sistema respiratório. Uma seqüência séria de fibrose cística é infecção de pulmão por Paseudomonas aeruginosa, que por si monta em quase 90% da morbidez e mortalidade na íibrose cística. Terapêuticos para tratamento de fibrose cística incluem antimicrobiais para tratamento da infecção patogênica.
A asma é uma distúrbio do sistema respiratório caracterizada por inflamação, estreitamento das vias aéreas e reatividade aumentada das vias aéreas a agentes inalados. A asma é freqüentemente, embora não exclusi- vamente, associada com sintomas atópicos e alérgicos. A asma pode tam- bém incluir asma induzida por exercício, resposta a broncoestimulantes, hi- persensibilidade tipo retardada, encefalomielite auto imune e distúrbios rela- cionadas. As alergias são geralmente causadas por geração de anticorpo IgE contra alérgenos. O enfisema é uma distensão dos espaços de ar distais ao bronquíolo terminal com destruição do septo alveolar. O enfisema ocorre de dano do pulmão induzido por elastase. A síndrome de angústia respirató- ria adulta é um termo que envolve muitas lesões de pulmão infiltrativas difu- sas agudas de ideologias diversas que são acompanhadas por hipoxemia atrial severa. Uma das causas mais freqüentes de ARDS é sepsia.
Doenças inflamatórias incluem, mas não estão limitadas a, do- enças autoimune e distúrbios atópicas. Outros tipos de doenças inflamató- rias que são tratáveis com as preparações de LMWH aqui providas são coli- te ulcerativa refratária. Doença de Crohn, esclerose múltipla, doença auto- imune, colite ulcerativa não-específica, sepsia e cistite intersticial.
As preparações de LMWH podem ser usadas para tratar distúr- bio fibróticas, tal como fibrose de órgão maior, distúrbios fibroproliferativas, e cicatrização associada com trauma. Fibroses de órgão maior incluem, mas não estão limitados a, doença de pulmão intersticial (ILD), cirrose do fígado, doença do rim (por exemplo, diabete e doença hipertensiva não-tratada), doença do coração e distúrbios do olho (por exemplo, degeneração macular, retinopatia retinal ou vítrea). Exemplos de distúrbios Fibroproliferativas inclu- em escleroderma sistêmica e local, quelióides e cicatrizes hipertróficas, ate- rosclerose, restenose, fibrosarcoma, e artrite reumatóide. Exemplos de cica- trização associada com trauma incluem cicatrização devido à cirurgia, fibro- se induzida por quimioterapêutico, fibrose induzida por radiação, cicatrização associada com dano ou queimas.
Em uma concretização, as preparações de LMWH são usadas para inibir angiogênese. A angiogênese conforme aqui usada é a formação inapropriada de novos vasos sangüíneos. "Angiogênese" freqüentemente ocorre em tumores quando células endoteliais secretam um grupo de fatores de crescimento que são mitogênicos para endotélio, causando o alongamen- to e proliferação de células endoteliais que resultam na geração de novos vasos sangüíneos. Vários dos mitogênios angiogênicos são peptídeos de ligação de heparina que estão relacionados a fatores de crescimento de cé- lula endotelial. A inibição de angiogênese pode causar regressão de tumor em modelos de animal, sugerindo um uso como um agente anticâncer tera- pêutico. As distúrbios angiogênicas incluem, mas não estão limitadas a, dis- túrbios neovasculares do olho, osteoporose, psoríase, artrite, câncer, e dis- túrbios cardiovasculares.
As preparações de LMWH podem também serem usadas para inibir crescimento celular e metástase. Desse modo, os métodos são úteis para tratamento e/ou prevenção de proliferação de célula de tumor ou me- tástase em um indivíduo. O câncer pode ser um câncer maligno ou não- maligno. Cânceres ou tumores incluem, mas não estão limitados a, câncer do trato biliar; câncer do cérebro; câncer do seio; câncer cervical; coriocarci- noma; câncer de cólon, câncer endometrial; câncer esofageal; câncer gástri- co; câncer intraepitelial; leucemia, linfomas; câncer de fígado; câncer de pulmão (por exemplo, célula pequena e não-pequena); melanoma; neuro- blastomas; câncer oral; câncer ovariano; câncer pancreático; câncer de prós- tata; câncer retal; sarcomas; câncer de pele; câncer testicular; câncer de tiróide; e câncer renal, bem como outros carcinomas e sarcomas.
Um indivíduo em necessidade de tratamento de câncer pode ser um indivíduo que tem alta probabilidade de desenvolver câncer. Estes indi- víduos incluem, por exemplo, indivíduos tendo uma anormalidade genética, a presença da qual foi demonstrada ter uma relação correlativa a uma pro- babilidade mais alta de desenvolver um câncer, e indivíduos expostos a a- gentes que causam câncer, tais como, tabaco, asbestos, ou outras toxinas químicas, ou um indivíduo que tenha sido anteriormente tratado para câncer e está em remissão aparente.
Quando administrada a um paciente suportando tratamento de câncer, a preparação de LMWH pode ser administrada em coquetéis con- tendo outros agentes anticâncer. A preparação de LMWH pode também ser administrada em coquetéis contendo agentes que tratam os efeitos colate- rais de terapia de radiação, tais como antieméticos, protetores de radiação, etc.
Os tratamentos aqui providos podem adicionalmente incluir ad- ministração de sulfato de protamina para neutralizar a atividade anti-Xa e atividade anti-lla da preparação de LMWH, por exemplo, uma vez que ativi- dade de anticoagulação ou anti-trombótica não é mais necessária. O sulfato de protamina pode ser administrado, por exemplo, por administração intra- venosa, a uma dose de cerca de 1, 2, 3 mg de sulfato de protamina por 100 IU de atividade anti-Xa. As IUs de atividade anti-Xa podem ser determinadas usando-se, por exemplo, os ensaios de coagulação aqui descritos. Outras Concretizações
A fabricação é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser interpretados como limitantes. O conteúdo de todas as refe- rências, patentes e pedidos de patente publicados citados no decorrer deste pedido estão aqui incorporados pela referência.
Métodos de Fabricação de M118-MEH
Processo de Fabricação
A descrição do processo usado para produzir M118-REH é mos- trada na figura 1. Brevemente, na Etapa 1 do processo, Heparina Não- Fracionada comercialmente disponível, USP (UFH), foi submetida a um série gradual de precipitações de etanol aquoso com acetato de cálcio em uma razão de massa para massa de 3:1 de acetato de cálcio para UFH para ex- trair a porção do UFH que é de peso molecular inferior (também referido co- mo a porção que é substancialmente a fração de movimento rápido). O pro- duto resultante do fracionamento da Etapa 1 foi designado Intermediário 1. A Etapa 2 envolve a digestão do intermediário 1 usando uma enzima heparinase III modificada tendo uma substituição de uma alanina por histidina no resíduo de aminoácido 225 (M011) no tampão de acetato de sódio aquoso, pH 7,2 a 37°C, para produzir o intermediário 2. M011 clivado por β-eliminação entre resíduos N-acetilglucosamina e sob ácidos urônicos sulfatados produzindo cadeias tendo um grupo Δ4,5 ácido urônicona extre- midade de não-redução e uma N-acetil glucosamina na extremidade de re- dução. Quando a digestão estava completa, calor foi retirado e cloreto de sódio foi adicionado para alcançar uma concentração de solução final de aproximadamente 2% p/v.
Na Etapa 3, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) foi usada para separar os componentes de antifator Xa e Ila altos de Intermedi- ário 2 para fora dos materiais de atividade inferiores. O produto desta etapa foi designado Intermediário 3.
Na Etapa 4, materiais de Intermediário 3 individuais ou combina- dos foram dissolvidos em água purificada, filtrados através de um filtro de 0,2 pm, e Iiofilizados para produzir substância de fármaco M118-REH.
Material de Partida na Fabricação de M118-REH
Especificações de Materiais de Partida
O material de partida para produção de M118-REH, UFH sódio (USP) é origem de mucosa intestinal de suíno. Em adição aos testes de USP, controles adicionais foram postos no lugar. Estes controles estão lista- dos na Tabela 1.
Tabela 1. Ensaios de UFH e Especificações em Adição a DMF
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A Eletroforese de Gel de Agarose (AGE) separa semi- quantitativamente os vários componentes de materiais baseados em hepari- na, como sulfato de dermatan e sulfato de condroitana na base de sua mobi- lidade eletroforética. Uma separação horizontal em 0,5% de gel de agarose foi conduzida em tampão de acetato de bário pH 5,8, seguido por tampão de acetato de 1,3-diaminopropano pH 9. Um tanque de eletroforese especial foi empregado, pelo que as câmaras de eletrodo contendo tampão líquido foram assentadas com um solvente orgânico de baixa densidade imiscível em á- gua (por exemplo, éter de petróleo ou heptano). Este desenho proporciona transferência de calor eficiente entre a placa de gel de agarose e uma ban- deja de arrefecimento de metal preenchida com gelo.
Heparinas de baixo peso molecular são tradicionalmente prepa- radas de UFH de grau USP. Para alcançar uma substância de fármaco de heparina de peso molecular baixo de potência mais alta, o material de parti- da de UFH para o processo de M118-REH foi restringido àqueles com po- tências em excesso de 160 lU/mg. Para controlar os níveis de sulfato de dermatan e sulfato de condroitin, estes foram medidos no material de partida de UFH, e controlados na Etapa 1 do processo de fabricação de M118-REH.
Análise Estrutural de Intermediários
As etapas no processo de fabricação de M118-REH são esbo- çadas acima e mostradas na figura 1. A tecnologia de caracterização para estudo de estrutura de açúcar proporciona uma compreensão dos atributos estruturais que mudam quando UFH é submetido a este processo em cada etapa. Esta informação permite controle e reprodutibilidade a partir do pro- cesso, incluindo seleção de material de partida.
A análise dos materiais da Etapa 2 diferentes (ou amostras de Intermediário 1) e as amostras de UFH de partida usadas para prepará-los quando efetuada usando-se análise de 2D-RMN (HSQ), e eletroforese capilar.
Os blocos de construção que constituem o material de partida, bem como o intermediário, foram identificados e quantificados. Alguns dos materiais da Etapa 2 estudados não eram substratos ideais para a próxima etapa (digestão enzimática), e atributos foram identificados, que indicam o material preferido da etapa 2.
Mostrados na Tabela 2 e Tabela 3 abaixo estão dados de análi- se de 2D RMN que ilustram as diferenças entre o material de UFH de partida e da etapa 2. Esta análise permite determinação das diferenças totais em atributos estruturais quando indo através da Etapa 1 do processo de fabrica- ção de M118-REH. Baseado em todos os dados obtidos a partir de análises diferentes, certas conclusões sobre o material de partida, intermediários e processo de fabricação, foram feitas.
Tabela 2: Análise de 2D RMN de UFH e os materiais da etapa 2 obtidos dos mesmos. Estes materiais representam o material preferido da etapa 2.
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O material da etapa 2 tem teor de l2s relativo inferior quando comparado ao material de partida, e isto foi refletido pela diminuição na es- trutura HNS-(l2s), conforme mostrado na tabela. Isto foi acompanhado por um aumento concomitante nas estruturas de Hns-(I) e Hns-(G) conforme espera- do. Interessantemente, também existiu um aumento relativo na quantidade de hexosamina 6-O-sulfatada (H6s).
Tabela 3: Análise de 2D RMN de UFH e os materiais da etapa 2 obtidos dos mesmos. Estes materiais representam o material menos preferido da etapa 2.
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Materiais da etapa 2 "preferidos" são aqueles que são bons substratos para a próxima etapa no processo, isto é, digestão enzimática por M011, pelo que materiais da etapa 2 "menos preferidos" são substâncias mais pobres. Quando se compara as quantidades relativas do Hns (interno), foi observado que nos materiais da etapa 2 "preferidos", o teor de Hnac au- menta após a etapa 1, pelo que em materiais da etapa 2 "menos preferidos", ele é reduzido (vide Tabela 2 e 3). Outra observação foi que a quantidade relativa da unidade de G-Hnac foi reduzida a uma extensão muito maior na etapa 2 "menos preferida" conforme comparado ao material da etapa 2 "pre- ferido". Estas observações foram justificadas no contexto de especificidade de substrato de M011 que preferem agir na ligação adjacente a ácido glucu- rônico não-sulfatado (isto é, Hnac-G).
Através da análise, atributos estruturais que mudam durante a primeira etapa (precipitação) do processo de fabricação que vai da UFH para o material da etapa 2 foram idênticos. Desde que o teor de N-acetil no mate- rial da etapa 2 pareça ser importante para a etapa de digestão enzimática subsequente, é desejável usar uma UFH de partida com teor de N-acetil mais alto que pode permitir melhor produção de material da etapa 2 após precipitação. Portanto, baseado nesta análise, um critério pré-selecionado para UFH de partida foi identificado, que permite melhor controle e avaliação do processo de fabricação de M118-REH.
Outros ensaios e especificações para intermediários de proces- so são mostrados na Tabela 4, e descritos em detalhes abaixo.
Tabela 4: Ensaios e Especificações para Intermediários
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O processo de Eletroforese de Gel de Agarose foi descrito aci- ma.
A atividade de antifator Xa foi medida conforme aqui descrito. A atividade de antifator Xa foi medida, ou em um analisador Diagnostica Stago com o kit Stachrom® Heparin Test, ou em um sistema de Coagulação ACL Futura® com o Kit Coastest® Heparin de Chromogenix. A resposta do anali- sador foi calibrada usando-se o Padrão Internacional para Heparina de Baixo Peso Molecular, lote 01/608, ou lote atual. A potência de Substância de Fármaco de M118-REH foi calculada em Unidades Internacionais de ativida- de de antifator Xa por miligrama, usando-se os métodos estatísticos para ensaios de linha paralelos.
A atividade de antifator Ila foi medida conforme aqui descrito, usando-se o seguinte princípio. A atividade de antifator Ila foi medida, ou em um analisador Diagnostica Stago, ou em um sistema de Coagulação ACL Futura®, com reagentes de Chromogenix (substrato S-2238, trombina (53nkat/frasco), e antitrombina). A resposta do analisador foi calibrada usan- do-se o Segundo Padrão Internacional para Heparina de Baixo Peso Mole- cular, lote 01/608, ou equivalente. A potência de Substância de Fármaco de M118-REH foi calculada em Unidades Internacionais de atividade de antifa- tor Ila por miligrama, usando-se os métodos estatísticos para ensaios de linha paralelos.
A massa molar média de peso, a polidispersidade e a distribui- ção de massa molar de Intermediários de M118-REH foram medidas usan- do-se um sistema de Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) fixado a um detector de Difusão de Luz Multiângulo Wyatt miniDAWN, ou qualquer outro detector LALS adequado, e um refratômetro interferométrico Optilab rEX (RID), ou outro RID adequado de acordo com USP <621 >, versão atual. O conjunto de colunas de SEC consiste em colunas acondicionadas com um acondicionamento de alta resolução L20, por exemplo, uma coluna de prote- ção Tosoh SWXL acoplada com um Tosoh TSKgeI G3000SWXL e um Tosoh TSKgeI G2000WXL em série. O sistema foi equilibrado a 0,5 mUmin com uma fase móvel de sulfato de sódio a 0,2M cujo pH foi ajustado para 5,0 com ácido sulfúrico. Sódio azida foi adicionada a 0,05% na fase móvel. O inter- mediário de M118-REH foi dissolvido na fase móvel para obter 10mg/mL de solução antes da injeção. A massa molar média de peso, a polidispersidade e os parâmetros de distribuição foram medidos usando-se software Wyatt Astra1 ou qualquer software apropriado. A distribuição foi caracterizada pela percentagem de cadeias com uma massa molar mais baixa do que 5.500 Da (M5500), e a percentagem de cadeias com uma massa molar mais alta do que 8.000 Da (Meooo), ou pela percentagem de cadeias com uma massa molar mais baixa do que 5.000 Da (M5000)1 e a percentagem de cadeias com uma massa molar mais alta do que 7.500 Da (M8ooo)·
Na etapa 2 do processo de M118-REH, o Intermediário 1 foi di- gerido com enzima M011. Conforme a enzima digere o substrato de Inter- mediário 1, é gerado Intermediário 2 contendo resíduos de Δ4,5 ácido urôni- co possuindo uma absorvância UV232 característica. Para monitorar o pro- gresso da digestão, a solução de reação foi amostrada periodicamente, e a absorvância em 232 nm foi medida. A digestão da etapa 2 foi considerada completa quando a absorvância em 232 nm não tinha mudado mais do que 2 AU em 1 hora.
A Tabela 5 mostra o peso molecular médio de peso e distribui- ção de várias preparações de LMWH de M118-REH. A Tabela 6 mostra uma comparação de produtos de M118-REH, LMW e UFH.
Tabela 5: Peso molecular, polidispersidade e comprimento de cadeia carac- terístico de 5 lotes diferentes de M118-REH
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*MW calculado com dn/dc medido no material M118-REH. Tabela 6: Comparação de Produtos M118. LMWH e UFH
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1 Valores para lote usado em formulação de Produto de Fármaco M118- REH; MW médio processado com dn/dc estimado de dados de literatura em UFH
2 Inserto de acondicionamento de Lovenox
3 Monografia de heparina USP
Caracterização estrutural de M118-REH: Identificação de características es- truturais de M118-REH
Uma aproximação para a caracterização de M118-REH foi de- senvolvida, que envolve várias técnicas analíticas diferentes que proporcio- nam conjuntos complementares de dados.
Isto proporciona caracterização de M118-REH, e permite uma compreensão do o que torna o M118-REH único quando comparado a ou- tras LMWHs. Os resumos de descobertas a partir destas técnicas de carac- terização ajudam a definir o M118-REH como uma mistura única.
Uma caracterização de heparina não-fracionada (UFH) e produ- tos de LMWH foi completada usando-se uma série de técnicas analíticas que conduzem a identificação de estruturas químicas únicas para uma dada LMWH, estruturas que estão presentes em várias LMWH diferentes, mas em quantidades variantes, e estruturas que são responsáveis pelas proprieda- des biológicas de heparinas.
A análise de uma mistura de LMWH complexa similar a M118- REH necessita contar não somente a variabilidade estrutural inerente que ocorre a partir da biosíntese de heparina, mas também as estruturas que ocorrem a partir da clivagem enzimática e processos de fabricação. Isto po- de ser determinado pela decomposição de assinaturas naturais, bem como de extremidades de redução e não-redução (se houverem) presentes na mistura. Ao mesmo tempo, é também necessário ser confirmado que a "or- dem" relativa das unidades de dissacarídeos, conforme definido pela molé- cula de UFH de origem, não é afetada pelo processo de fabricação. Portan- to, é necessário proporcionar um contexto de seqüência no qual estes blo- cos de construção modificados ou naturais estão presentes nas cadeias de M118-REH. Para contar com estes fatores, uma aproximação para a carac- terização de M118-REH foi desenvolvida, que envolve usar dados obtidos de técnicas analíticas diferentes que proporcionam conjuntos únicos e comple- mentares de dados.
A análise de composição foi realizada com CE para identificar e quantificar blocos de construção individuais que compreendem as cadeias de M118-REH. Estes métodos também identificam estrutura de bloco de construção que é responsável pela atividade anti-Xa, referida como "Bloco de Construção Anti-Xa".
Análise de Bloco de Construção/Análise Composicional Análise Composicional por Eletroforese Capilar (CE)
Brevemente, este método envolve a digestão enzimática de M118-REH em seus blocos de construção constituintes, seguido por separa- ção usando-se CE (figuras 2A e 2B).
CE é uma técnica de separação de alta resolução e tem sido usada extensivamente na análise de UFH e outras glicosaminoglicans. O método atual usa eletroforese de zona capilar em um capilar de sílica fundi- da não-revestida. Com eletroforese capilar, as muitas espécies altamente sulfatadas migram através do capilar mais rápido, e são detectadas primeiro. Dados Representativos
O perfil de digestão de enzima para M118-REH, conforme ob- servado por CE, é mostrado na figura 2. Notavelmente, blocos de construção não-modificados além daqueles presentes em UFH foram observados em M118-REH (indicado pelas estruturas 1,6 observadas para enoxaparina). Outra observação interessante foi que a quantidade de espécies 3-0- sulfatadas foi quase dobrada em M118-REH, conforme comparada a enoxa- parina (indicado pelo pico AT-III tetra). Isto se correlaciona bem com a ativi- dade anti-Xa mais alta observada para esta mistura, e estava consistente com a metodologia para produção de M118-REH. A extensão de sulfatação total foi também mostrada ser levemente mais alta para M118-REH do que enoxaparina baseado nesta técnica.
Esta técnica foi também usada para determinar a presença e quantidade de cada um dos componentes de sacarídeo de bloco de constru- ção de M118-REH (Tabela 12).
Tabela 7. Sacarídeo de bloco de construção observado em análise de CE de M118-REH
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Quantitativamente, nenhum bloco de construção 1,6-anidro (ob- servado em enoxaparina), ou estrutura 2,5-anidro (vista em daltaparina) fo- ram observadas no perfil de M118-REH. Algumas observações interessantes ocorreram a partir da análise quantitativa destas estruturas. Quando compa- rando a % de mol relativa de pico (AUHNac,6sGHNS, 3s,6s) entre enoxaparina e M118-REH, uma quantidade mais alta do pico estava presente em M118- REH (Tabela 6), confirmando que o processo de fabricação de M118-REH enriquecido para as seqüências de anticoagulante ativo em heparina. A quantidade de trissacarídeo (AU2sHNs,6sl2s) foi relativamente baixa em M118-REH comparada a enoxaparina. Isto é uma reflexão do processo para manufatura. O processo químico usado para produzir enoxaparina resulta em "cascas" a partir da extremidade de redução de oligossacarídeos, au- mentando, desse modo, o número de cadeias de número ímpar. Este não é o caso para M118-REH e, desse modo, o nível de trissacarídeo foi uma con- seqüência direta de o que foi observado na UFH de partida. Esta análise indica que a metodologia de CE foi sensível bastante para captar atualmente estas mudanças que são indicativas de processos diferentes usados para fabricação de LMWHs e, desse modo, pode ser muito discriminatória.
Tabela 8: Comparação quantitativa de estruturas selecionadas: M118-REH e enoxaparina
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Análise Composicional por 2D RMN
A espectroscopia de RMN foi bem sucedidamente usada para detecção e quantificação de sinais associados com características estrutu- rais maiores ou menores em polissacarídeos. A espectroscopia de RMN é também uma das únicas técnicas que permitem uma determinação efetiva dos componentes de ácido idurônico e glucurônico na mistura. Espectrosco- pia bidimensional (2D)RMN foram usadas como um meio de decompor e identificar sinais distintos que correspondem a uma certa população de resí- duos de monossacarídeos. Esta aproximação capacita uma, ou não somente quantifica os constituintes de monossacarídeo básicos da mistura, mas para também avaliar seus ambientes de ligação em uma maneira quantitativa.
Dois RMN bidimensionais proporciona uma técnica complemen- tar à análise composicional de M118-REH por CE. 2D RMN proporciona in- formação em dissacarídeos H-U ligados, proporcionando, desse modo, aná- lise complementar de ligações de dissacarídeo. Metodologia recente usan- do-se experimentos de espectroscopia de correlação 2D próton- carbono(HSQC) tem demonstrado a capacidade de obter esta análise com- posicionai quantitativa nas glicosaminoglicans.
Os espectros da região anomérica de M118-REH, conforme me- dido usando-se espectroscopia de correlação 2D próton-carbono(HSQC), são apresentados na figura 4. Os picos cruzados na região anomérica são mostrados na figura.
Uma análise da região anomérica de M118-REH proporcionou alguma informação muito interessante com relação ao o que torna o M118- REH único comparado a outras LMWHs. Primeiro, a região anomérica é mui- to mais simples quando comparada a outras LMWHs, similar a enoxaparina. Segundo, quando se analisa a redução de resíduos terminais das cadeias, foi observado que uma maioria das cadeias termina em N-acetilglucosamina, e somente uma quantidade menor das cadeias termina em N- sulfoglucosamina. Isto ocorre como um resultado da especificidade da enzi- ma usada para preparar M118-REH. Terceiro, os dados de RMN indicam que ~30%das cadeias têm um resíduo AU na extremidade de não-redução, que é, novamente, um resultado da especificidade da enzima. Quarto, ne- nhum G-Hisiac dissacarídeo foi observado em M118-REH. Finalmente, ne- nhuma região de ligação de sacarídeo foi observada no espectro de RMN. A percentagem de composição de monossacarídeos em M118-REH e seus ambientes de ligação são reportados na Tabela 7. A análise de RMN tam- bém capacita à determinação da razão de ácido idurônico/ácido glucurônico para M118-REH.
Tabela 9. Percentagem de composição de resíduos de qlucosamina e ácido urônico em M-118 (resultados de dois experimentos)
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Conclusões
Os seguintes foram identificados como atributos estruturais de M118-REH:
• Enriquecimento de cadeias de sacarídeo contendo 3-O-sulfato (tetrassacarídeo de ligação de AT-III) baseado no % mol relativo conforme comparado as LMWHs e material de partida de UFH existentes;
• Geração de uma estrutura de extremidade de redução predo- minante (HrMac);
• A única estrutura de extremidade de redução modificada ob- servada é AU;
• Manutenção da estrutura de suporte principal de dissacarídeo natural de UFH com introdução limitada de mudanças relacionadas a pro- cesso em outras LMWHs;
• Remoção de componentes de UFH a partir da mistura que não requereu ligação de anti-Xa ou anti-lla (trombina), criando, desse modo, uma heparina mais definida;
A especificidade do processo de despolimerização de M118- REH retém o comprimento de cadeia requerido e separação proximal dos locais de ligação de modo a reter atividade anti-lla.
Um atributo chave de todos os produtos de LMWH é que cadei- as de polissacarídeo mais longas são clivadas em fragmentos menores, via uma variedade de métodos de despolimerização, conforme representado na figura 5. Este evento de clivagem, que pode ser causado ou por reações químicas ou por reações enzimáticas, resulta em assinaturas características em ambas extremidades de redução e de não-redução da molécula. Os gru- pos terminais característicos presentes é M118-REH, conforme descrito abaixo.
Estrutura na Extremidade de Não-Reducão
A especificidade da clivagem enzimática que resultou na forma- ção de uma nova extremidade de não-redução (abreviada como AU), capaci- ta o posicionamento do local de ligação de AT-III dentro da cadeia de polissacarídeo.
Estrutura na Extremidade de Redução
As estruturas de glucosamina nas novas extremidades de redu- ção nas cadeias de M118-REH foram refletivas da especificidade da enzima usada no processo. Como um resultado, a maioria das estruturas de extre- midade de redução em M118-REH eram resíduos de hexosamina N- acetilatada (HNac).
Diferenças Estruturais Entre M118-REH e Heparina Não-Fracionada
1) M118-REH tem uma %mol mais alta da seqüência de sacarí- deo de ligação de antitrombina, conforme comparada à heparina não- fracionada de partida (UFH).
2) M118-REH tem quantidade desprezível de região de ligação conforme comparada a UFH de partida.
3) M118-REH tem uma certa percentagem no ácido Δ4,5 glucu- rônico na extremidade de não-redução de cadeias, pelo que UFH não con- tém este resíduo modificado na extremidade de não-redução.
Em resumo, M118-REH é um produto de heparina tendo atribu- tos físicos e funcionais únicos.
Muitos dos atributos estruturais discutidos acima foram uma conseqüência direta das propriedades da enzima usada para preparar M118-REH. Estes incluem a estrutura de extremidade de redução predomi- nante (HNac), a única estrutura de extremidade de não-redução modificada (AU)1 bem como a remoção de região de ligação. Também, visto que a en- zima preferencialmente cliva os domínios inferiores ou não-sulfatados na mistura de heparina, ela não afeta a seqüência de ligação de AT-III, que, como um resultado, é enriquecida em M118-REH.
O protocolo de caracterização acima definido foi usado para analisar 4 bateladas de M118-REH. Esta análise confirma a consistência na manufatura de o que é definido como M118-REH.
Tabela 10. Análise de CE de várias bateladas de M118-REH
<table>table see original document page 101</column></row><table> Tabela 10A. Faixas Preferidas para picos
<table>table see original document page 102</column></row><table>
Tabela 11. Percentagem de composição de resíduos de M118-REH qluco- samina e ácido urônico
<table>table see original document page 102</column></row><table> <table>table see original document page 103</column></row><table>
Tabela 11 A. Faixas Preferidas para estruturas
<table>table see original document page 103</column></row><table> Descrição e Composição de Produto de Fármaco de Injeção M118-REH
O produto de fármaco de injeção de M118-REH é uma solução clara, incolor, levemente amarela em um uso simples de 3 mL, frasco de vi- dro Tipo 1, vedado com um cessador de clorobutila e sobre-vedado com uma dobra de alumínio. Cada frasco contém nominalmente 5000 IU de ativi- dade de antifator Xa em 2 mL.
A composição quantitativa de injeção de M118-REH é dada na Tabela 11. A composição é dada para o volume rotulado de 2 mL. Os fracos foram enchi- dos com 2,15 mL, consistente com o volume em excesso recomendado de USP.
Tabela 12. Composição de injeção de M118-REH
<table>table see original document page 104</column></row><table>
1 A quantidade de substância de fármaco é calculada baseada na atividade de antifator Xa (em uma base seca) e a Perda na Secagem. Assumindo-se a atividade de antifator Xa de 200 lU/mg, a quantidade de substância de fármaco de M118-REH é 25 mg por frasco.
2 A quantidade de Cloreto de Sódio requerida para alcançar uma osmolaridade de 280-330 mOsm/L é aproximadamente 8 mg/mL, ou 16 mg por frasco.
Nenhum diluente foi requerido para uso com injeção de M118-REH.
Componentes de Injeção de M118-REH
A injeção de M118-REH foi fabricada por dissolvimento de Subs- tância de Fármaco de M118-REH em Água para Injeção. A Substância de Fármaco de M118-REH é muito solúvel em solução aquosa, e a distribuição de tamanho de partícula de fármaco, portanto, não tinha efeito no desempe- nho do produto de fármaco.
Cloreto de Sódio, USP foi o único excipiente usado na injeção de M118-REH (a uma concentração de aproximadamente 8 mg/mL). Cloreto de sódio foi selecionado como um agente de ajuste de osmolaridade para evitar desconforto de local de injeção, e hemólise após administração. Desenvolvimento do Processo de Fabricação de Injeção de M118-REH
O processo de fabricação de Injeção de M118-REH consiste de dissolvimento da substância de fármaco M118-REH em Água para Injeção, USP, e ajuste da osmolaridade com Cloreto de sódio, USP. A solução formu- lada foi filtrada através de dois filtros de 0,2 pm em série e assepticamente preenchida em frascos. Produtos de heparina sódio são submetidos à de- gradação em temperaturas muito altas e, portanto, não podem ser terminal- mente esterilizados. O diagrama de fluxo do processo para Injeção de M118- REH é apresentado na figura 6 (descrito abaixo).
A figura 6 mostra um diagrama de fluxo de processo para Inje- ção de M18-REH. A quantidade de substância de fármaco de M118-REH a ser adicionada a cada batelada foi calculada baseada no Ensaio (atividade de antifator Xa) e Perda nos valore de Secagem a partir do Certificado de Análise de acordo com o seguinte cálculo:
25001 U/m L/Ensaio (IU/mg) x 100(100 - Perda na Secagem %) x Tamanho da batelada (mL)÷1000 mg/g = Quantidade de Substância de Fármaco a adicionar (g)
Água para Injeção equivalente a aproximadamente 75% do peso de batelada final foi adicionada ao vaso de formulação, e a mistura foi inicia- da. A quantidade calculada de substância de fármaco de M118-REH foi va- garosamente adicionada ao vaso, e misturada até que todo sólido fosse dis- solvido. Uma quantidade inicial de Cloreto de Sódio USP foi adicionada, e a solução foi misturada até que todo sólido fosse dissolvido. Água para Injeção foi adicionada ao peso de batelada final, e a solução foi misturada por uns 5- 15 minutos adicionais. A osmolaridade foi medida, e Cloreto de Sódio USP adicional foi adicionado, se requerido, para alcançar uma osmolaridade de 280-330 mOsm/L. Dois filtros pré-esterilizados Millipak 20 PVDF (fluoreto de polivi- nilideno) de 0,22 μητι em série foram usados para esterilizar o produto de fármaco de massa de M118-REH. O produto foi filtrado em um reservatório de enchimento, e, no final da filtração, os filtros foram testados para integri- dade.
Propriedades biológicas e farmacológicas de M118-REH
M118-REH é o produto de uma digestão enzimática que resulta em uma heparina de baixo peso molecular despolimerizada. A porção des- polimerizada é enriquecida para anticoagulação ativa e frações antitrombóti- cas, que podem ser uma conseqüência da digestão específica local por uma liase glucosaminoglican específica. O local específico e despolimerização de orientação, via a enzima, capacitou M118-REH a ser uma molécula altamen- te eficiente na proteção de dano de artéria. Além disso, M118-REH tem o atributo de ser reversível e facilmente monitorado por ensaios de coagulação de leito lateral.
Estudos de M118-REH têm sido feitos para revelar as proprie- dades farmacológicas e biológicas de M118-REH, e através deste processo, seus modos de ações têm sido explorados ambos in vitro e in vivo. O meca- nismo de função de anti-coagulação e anti-trombótico foi investigado. O Re- lacionamento preliminar de Estrutura e Atividade (SAR) foi determinado nes- tes estudos. Estes estudos e seus resultados são descritos conforme em seguida, que são análises iniciais para geração do perfil de atividades bio- farmacológicas de M118-REH.
Análise In vitro de atividade de coagulação:
A atividade de anti-Xa in vitro de M118-REH varia de 180-300 IU/mg, baseado nos segundos padrões internacionais de heparina de baixo peso molecular. A preparação de M118-REH mais alta em atividades de an- ti-Xa/IIa in vitro é proporcional a suas frações como
∆UHNac,6sGHNS,3s,6sContendo porção de 3-O-sulfatação.
A atividade de anti-IIa in vitro de M118-REH varia de 100-250 IU/mg, baseado nos segundos padrões internacionais de heparina de baixo peso molecular. M118-REH pode prolongar o aPTT in vitro de 40 segundos a 80 segundos a 2,4 pg/ml, e mudança de aPTT é proposicional à atividade de anti-Xa e anti-IIa.
Neutralização in vitro por sulfato de protamina e medida por atividade anti- Xa:
A protamina pode reverter totalmente à atividade de anti-Xa de M118-REH a razão de 1 mg:100 anti-Xa IU em plasma humano. Isto pode ser comparado a outras preparações de LMWH. Por exemplo, protamina pode apenas neutralizar 60% da atividade de anti-Xa de enoxaparina a ra- zão de 3 mg: 100 anti-Xa IU em plasma humano. Estes resultados são mos- trados na figura 7.
Inibidor de trajetória de fator de tecido de liberação de células endoteliais de veia umbilical humana in vitro (HUVECs) (TFPI):
HUVECs de ATCC foram crescidas em 2% de meio modificado de FBS F12K sem ECGS. M118-REH, Lovenox, e UFH foram preparados no mesmo meio com a concentração final de 0,01 mg/ml e 0,005 mg/ml. Três cavidades de células para cada grupo foram incubadas sob 37°C, 5% de CO2, e 95% de O2 por 24 e 48 horas. O sobrenadante foi retirado para teste de liberação de TFPI usando-se kit ELISA de ADI.
M118-REH a 0,005 mg/ml e 0,01 mg/ml aumentou significante- mente a liberação de TFPI de HUVECs a 24 e 48 horas e, conforme mostra- do na figura 8. M118-REH resultou em mais liberação de TFPI de HUVECs em meio de célula do que heparina. Lovenox não causou uma liberação de TFPI significantemente mais alta quando comparada com o controle. Farmacocinéticas de M118-REH in vivo:
Em modelos de roedores, tais como ratos Sprague-Dawley e camundongos B16M16, M118-REH tinha meia vida de eliminação mais lon- ga do que UFH, e comparável àquela da enoxaparina após injeção intrave- nosa. M118-REH é rapidamente absorvido após injeção subcutânea com Tmáx variada de 1 hora a 3 horas.
No modelo de coelho, tal como coelho branco da Nova Zelândia, injeção subcutânea de M118-REH produziu biodisponibilidade mais alta em termos de ambas atividade anti-Xa e anti-IIa do que de UFH, a biodisponibi- Iidade variada de 50% a 100% comparada com injeção intravenosa. As far- macocinéticas de M118-REH são comparáveis àquelas de enoxaparina com meia vida de eliminação variada de 3-5 horas, e o mecanismo maior de eli- minação é através de excreção renal.
Tabela 13. Parâmetros farmacocinéticos de M118-REH, enoxaparina e UFH após injeção intravenosa em um modelo de coelho e rato.
<table>table see original document page 108</column></row><table>
Em NHP, tal como macaco Citomólogo, a meia vida de elimina- ção de M118-REH variou de 20 minutos a 50 minutos. A razão de anti-Xa/IIa após injeção intravenosa foi mantida consistente durante o curso de PK que variou de 0,5 a 2, e M118-REH foi distribuído no sistema de circulação e eli- minado através de rota renal baseada na análise de parâmetros farmacoci- néticos. A Tabela 14 representa farmacocinéticas de M118-REH em modelo de NHP.
Tabela 14. Farmacocinéticas de M118-REH em NHP
<table>table see original document page 108</column></row><table>
As farmacocinéticas de M118-REH representam a primeira ordem de eliminação.
A concentração de TFPI in vivo permaneceu em altos níveis a- cima de 24 horas após dosagem de M118-REH. ACT e aPTT ambos se cor- relacionam muito bem com a atividade anti-Xa.
Estudo farmacodinâmico de M118-REH in vivo:
Em modelos de roedores, tais como ratos Sprague-Dawley1 M118-REH e UFH foram intravenosamente injetados em 1 ou 2 mg/kg, via veia jugular, enquanto enoxaparina foi dosada a 0,5 ou 1 mg/kg. ACT (tempo de coagulação ativado) foi medido com Hemochron Jr. Neste modelo, o tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e tempo de coagulação ati- vada apresentaram resposta de dose para dosagens de escala de M118- REH. ACT aumentou 1,5-3 vezes após distribuição de M118-REH a 0,5 mg/kg, enquanto 2-4 vezes a 1 mg/kg após injeção intravenosa. O perfil far- macodinâmico foi similar àquele das farmacocinéticas em termos de medi- ção de anti-Xa/lla; a meia vida de eliminação varia de 0,15 a 0,5 hora.
Em um modelo de coelho, tal como coelho branco da Nova Ze- lândia, aPTT e ACT foram medidos após distribuição de M118-REH intrave- nosamente. aPTT e ACT aumentaram proporcional a dose de R118-REH. As razões de anti-Xa/lla foram consistentes após ambas administrações intra- venosas e subcutâneas a 1,5 mg/kg. Em contraste àqueles de M18-REH, as razões de Xa/lla de ambos enoxaparina e UFH após administração intrave- nosa flutuaram significantemente durante o curso.
Conforme mostrado na figura 9, em modelos de NHP, tal como macaco Cinomólogo, os resultados mostraram que aPTT e ACT aumenta- ram significantemente 2-4 vezes e 1,5-3 vezes após injeção intravenosa de M-118-REH a 150 anti-Xa lU/kg.
Injeção de bolo intravenosa de M118-REH aumentou a liberação de TFPI na corrente sangüínea por 2-20 vezes, e tais efeitos duraram mais do que 24 horas.
Os efeitos de injeção de bolo intravenosa de R118-REH, segui- dos por infusão contínua, foram também estudados em um modelo canino de trombose arterial profunda induzida por dano eletrolítico severo. Mais de- talhes com relação a este estudo são providos abaixo no Exemplo intitulado "Modelo de dano de artéria femoral induzido por eletrolítico de Beagle". Estudo de eficiência de M118-REH em modelos pré-clínicos Dano de artéria carótida induzido por cloreto férrico
Estudos de comparação de M118-REH e enoxaparina produzi- ram inibição dependente da dose de trombose oclusiva. M118-REH em uma dose de 0,5 mg/kg prolongou significantemente (p<0,05) o tempo para oclu- são (TTO) comparado a salina (28,5 ± 7,1 minutos versus 11,1 ±0,9 minu- tos, respectivamente). Vinte e cinco por cento (2/8) da artéria carótida com dano injetada com 0,5mg/kg de M118-REH permaneceu evidente pelo perí- odo de observação total de 60 minutos. Em contraste, todas as artérias caró- tidas com dano (9/9) ocluíram em ratos injetados com salina dentro de um período de observação de 60 minutos. A administração de 1 mg/kg de M118- REH aumentou adicionalmente TTO (55,3 ± 3,6 minutos) com 83% (10,12) dos vasos evidentes no final do período de observação de 60 minutos. Ratos administrados com 2, 3 ou 4 mg/kg de enoxaparina todos tinham TTO signi- ficantemente mais longos do que animais injetados com salina (19,1 ± 1,4, 36,0 ± 5,6 e 40,2 ± 6,3 minutos, respectivamente). Todas (7/7) das artérias carótidas ocluíram dentro de período de tempo de 60 minutos na dose de 2 mg/kg, enquanto 62% (7/13) e 55% (6/11) de vasos ocluíram em ratos admi- nistrados com 3 e 4 mg/kg de enoxaparina, respectivamente. M118-REH (1 mg/kg) produziu o grau maior de proteção de trombose, apesar de atividade anti-Xa inferior do que aquela nas doses de 3 e 4 mg/kg de enoxaparina. Os resultados são representados na figura 10 e Tabela 15.
<formula>formula see original document page 110</formula>
*p<0,05 comparado ao grupo de controle; **p<0,01 comparado ao grupo de controle; N° p<0,01 comparado a enoxaparina sódio 3 mg/kg. Modelo de dano de artéria femoral induzido por eletrolítico de Beaqle
Os efeitos antitrombóticos e anticoagulantes de M118-REH fo- ram estudados em um modelo canino de trombose arterial profunda induzida por dano eletrolítico severo.
Procedimentos Cirúrgicos
Animais foram pré-medicados com sulfato de atropina intramus- cular (IM) (0,02 mg/kg) e acepromazina 1M (0,2mg/kg, < mg/kg por animal) pelo menos 10-15 minutos antes da indução de anestesia com IV propofol (4-8 mg/kg). Os animais foram entubados e mantidos em anestesia via iso- flurano inalante, para efeito, através de um respirador de volume regulado.
Uma incisão longitudinal foi feita na superfície médio-ventral do pescoço para ganhar acesso aos tecidos que sobrepõem as artérias caróti- das. Uma artéria carótida e ambas veias jugulares (uma para realimentação) foram subseqüentemente expostas por aproximadamente 2 cm por disseca- ção moderada e suportadas por retenção de ligaduras nas extremidades proximal e distai. Duas outras incisões foram feitas que se iniciaram no ab- dome e prolongadas distalmente ao longo do pectineus por uma distância que cobre 66%-75% de cada fêmur. A fáscia foi aberta em cada incisão, e a artéria femoral subjacente foi exposta por uma distância de aproximadamen- te 2-3 cm.
Instrumentação de Animal
Vinte e quatro cães beagle foram instrumentados com eletrodos intravasculares através das paredes de artéria femoral esquerda e direita, e posicionados em contato direto com a membrana interna do vaso sangüíneo. Cada eletrodo foi conectado a uma fonte de energia de amperagem constan- te, com o catodo colocado em um local subcutâneo distante. Um dispositivo estenítico foi posicionado imediatamente distai ao eletrodo, uma sonda de fluxo Doppler pervascular foi posicionada proximal ao eletrodo, e um cateter foi inserido na artéria carótida, todos dos quais foram conectados a uma Pla- taforma Fisiológica Gould Ponemah (Linton Instrumentation, Norfolk, UK) para monitoramento contínuo de pressão sangüínea arterial, fluxo sanguí- neo, e taxa do coração. Um segundo cateter foi inserido na veia jugular para coleta de amostra de sangue. Finalmente, uma linha intravenosa foi inserida em uma veia periférica para infusões de tratamento de estudo, e fios condu- tores foram colocados para eletrocardiografia (medida em Fio Condutor II).
Modelo de Dano Eletrolítico de Artéria Femoral
Após instrumentação, cada animal recebeu uma infusão IV con- tínua de veículo (0,9% de salina estéril) por 90 minutos. Quinze minutos a- pós a infusão iniciada, corrente elétrica (300μΑ) foi aplicada à artéria femoral direita (controle) através do eletrodo intravascular, e administrada continua- mente até formação de trombose total, definida como uma redução no fluxo Doppler para < 2% de valores de linha de base, ou até o final do período de observação em 180 minutos após iniciação de dano eletrolítico se o vaso permaneceu evidente. Em seguida a isto, o vaso foi ligado proximalmente e distalmente ao local de dano eletrolítico, o segmento foi colhido, e qualquer trombo, se presente, foi pesado.
Neste modelo, trombos intravasculares ricos em plaquetas se formam em proximidade a uma estenose arterial distai. Consequentemente, o dispositivo estenótico foi ajustado para limitar hiperemia reativa induzida por hipoxia para < 80% da resposta de linha de base a oclusão física (hipe- remia reativa de linha de base foi determinada em cada artéria femoral ime- diatamente antes ao veículo, ou infusões de tratamento ativo). Para assegu- rar que propriedades hemodinâmicas no local de fluxo de sangue normal aproximado de dano através da veia femoral, pressão arterial média e taxa de coração foram alcançadas a aproximadamente 70 mm de Hg e 100 bati- das por minuto, respectivamente, via controle anestésico de isofurano.
Após completar o experimento precedente para avaliar os parâ- metros trombóticos de linha de base em cada animal na artéria femoral direi- ta, procedimentos idênticos foram efetuados na artéria femoral esquerda (ativa-tratada) na presença de infusões de M118-REH ou UFH. Os animais foram colocados em 4 grupos de tratamento (n = 6). Três grupos receberam bolos IV de M118-REH a 37,5, 75 e 150 anti-Xa IU/kg, respectivamente, se- guido por infusões contínuas de M118-REH a 1,0 anti-Xa IU/kg/minuto por 90 minutos. O quarto grupo recebeu uma massa IV de UFH a 75 U/kg, se- guido por uma infusão contínua de UFHa 1,0 U/kg/minuto por 90 minutos. Dano eletrolítico contínuo foi iniciado 15 minutos após tratamento de massa, e análises subsequentes foram efetuadas identicamente ao grupo de veículo.
Ensaios para tempo de hemorragia cutânea (CBT) e coleta de sangue foram efetuados em pontos de tempo especificados de protocolo (vide abaixo). Parâmetros fisiológicos monitorados através de todo o proce- dimento incluíam taxa de pulso, taxa de respiração, pressão sangüínea dire- ta, temperatura retal, volume tidal, níveis de dióxido de carbono terminal- tidal, e saturação de O2.
Determinações de Hematologia e Coagulação
Para determinação de hematologia e coagulação, amostras de sangue totais (aproximadamente 100 pL) foram coletadas a 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165 e 180 minutos para determinação de ACT. ACT foi avaliado em um Sistema de Assinatura + Microcoagulação HEMO- CHRON® Jr. (ITC, Edison, NJ, USA) de acordo com as instruções do fabri- cante. Duas alíquotas (aproximadamente 1,3 ml_ cada) de sangue total fo- ram coletadas a 15 minutos, 60 minutos, e ou 180 minutos, ou o tempo de oclusão, se aplicável, para ensaios de hematologia e coagulação adicional. Parâmetros hematológicos (WBC, RBC, HGB, CHT, MCV, MCH, MCHC, PLT, RTC, ARTC e WBC diferenciais) foram ensaiados usando-se um Sis- tema de Hematologia Advia 120 (Bayer Diagnostics Norden, Lyngby, Dina- marca) seguindo as instruções do fabricante. Ensaios de coagulação (tempo de protrombina [PT], tempo de tromboplastina parcial ativada [aPTT], e ní- veis de fibrinogênio [FBI] foram conduzidos usando-se um Analisador de Coagulação MLA Electra 1400C (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) se- guindo instruções do fabricante.
Para determinar níveis de antifator Xa e antifator lia, amostras de sangue citratadas totais coletadas a 0,15 e 60 minutos após iniciação de tratamento foram centrifugadas a 3,000 g por aproximadamente 10 minutos em centrífuga refrigerada. Plasma foi coletado, congelado a -20°C, e arma- zenado a -80°C até que pronto para teste por ensaio cromogênico. Kit de Heparina Anti-Xa Stachrome (Diagnostica Stago, Asnieres sur Seine, Fran- ça), e um conjunto de reagente consistindo em substrato S2238, trombina bovina, e antitrombina III humana (Chromogenix, Milano, Itália) foram usados para ensaios de antifator Xa e antifator lia. Todos os ensaios cromogênicos foram quantificados em um analisador STA-R (Diagnostic Stago) seguindo Momenta Pharmaceuticals, Inc., SOP para medições de atividade de antifa- tor Xa e antifator lia. CBT foi determinado a 15 minutos, 60 minutos, e ou 180 minutos, ou a oclusão de tempo, se aplicável. Avaliações de CBT foram efetuadas em um membro anterior pelo Método de Mielke usando-se SOP de facilidade de teste.
Estatísticas
Os valores foram reportados como desvio padrão ± médio (SD) a menos que, de outro modo, notado. Meios foram comparados usando-se o teste-t Student assumindo-se variança igual em grupos de tratamento dife- rentes. A incidência de oclusão foi comparada entre grupos de tratamento pelo cálculo da razão ímpar relativa ao controle, e usando-se um teste ζ para acionar o valor P. Níveis significantes para todos os testes foram ajustados em 0,05.
Atividade de Plasma de Antifator Xa e Antifator Ila
Várias doses de M118-REH foram comparadas a uma dose pa- drão de UFH (75 U/kg). M118-REH exibiu inibição dependente da dose de ambos Fator Xa e IIa, com a dose mais alta de M18-REH (150 lU/kg) de- monstrando atividade similar de antifator Xa relativa a UFH (figura 13 e Ta- bela 16). A atividade de antifator IIa aumentou proporcionalmente com a ati- vidade de antifator Xa para ambos M118-REH e UFH, embora o coeficiente de correlação fosse maior para M118-REH (r2 = 0,890) do que UFH (r2= 0,465) (figura 14). Finalmente, a razão de atividade de antifator Xa para ati- vidade de plasma de antifator IIa com o tempo foi geralmente mais constante com M118-REH do que UFH, consistente com o metabolismo variável co- nhecido das moléculas de UFH grandes e polidispersas (figura 15). Tabela 16. Sumário de Pontos Finais Hematolóqicos Selecionados
<table>table see original document page 115</column></row><table>
ACT, tempo de coagulação ativada; IU, unidade internacional;
SD, desvio padrão; UFH1 heparina não-fracionada
*Registrado a 60 minutos após iniciação de infusão de artigo de teste; tDose de massa; φΡ<0,05, M118-REH vs. UFH, §P<0,01, M118-REH vs. controle; ||P<0,01, UHF vs. controle.
Ensaios de Coagulação
Em seguida, a atividade anticoagulante de M118-REH foi com- parada a uma dose padrão de UFH. A inibição dependente da dose de M118-REH de coagulação foi observada dentro de 15 minutos em todos os ensaios de coagulação, e foi mantida durante o curso do período de obser- vação de 60 minutos (figura 16). Em 60 minutos, tempos de coagulação sig- nificantemente mais longos no ensaio de ACT foram observados após trata- mento de UFH do que M118-REH em 37,5 ou 75IU/kg de anti-Xa (Tabela 16). A diferença entre UFH e M118-REH no ensaio de CT foi não-significante quando M118-REH foi administrado em 150 lU/kg de anti-Xa (Tabela 16). Experimentos de controle demonstraram que diferenças entre grupos de tra- tamento nos ensaios de coagulação não eram atribuíveis a alterações nas concentrações do substrato de fibrinogênio (dados não mostrados).
Efeitos Antibióticos
Baseado na observação que M118-REH em uma dose de 150 IU/kg de anti-Xa tinha propriedades anticoagulantes similares a heparina a uma dose padrão de 75 U/kg, a eficiência antritrombótica de M118-REH de M118-REH a 150 lU/kg de anti-Xa, bem como em doses inferiores, foi com- parada a UFH no modelo canino de trombose arterial profunda. Durante in- fusão de veículo, oclusão total da artéria de controle ocorreu em 24/24 [100%] de animais dentro do período de observação de 180 minutos (figura 17). No grupo de tratamento de UFH1 5/6 (83,3%) de animais alcançaram a diminuição de modelo definido em fluxo Doppler. Por comparação, oclusões totais ocorreram em 3/6 (50%), 2/6 (33,3%) e 1/6 (16,7%) de animais rece- bendo doses de bolo de M118-REH de 37,5, 75 e 150 anti-Xa IU/kg, respec- tivamente, consistentes com um relacionamento de resposta de dose. As diferenças de tratamento entre artérias tratadas com M118-REH e com veí- culo para taxas de oclusão foram estatisticamente significantes em todas as doses de bolo de M118-REH (P<0,05). A diferença entre M118-REH em uma dose de bolo de 150 anti-Xa IU/kg e UFH foi significante (P<0,05). Des- se modo, M118-REH em 150 anti-Xa IU/kg mostrou eficiência superior para UFH a 75U/kg, apesar do fato que as atividades anticoagulante de M118- REH e UFH foram comparáveis nestas doses. M118-REH nas doses testa- das mais baixas (37,5 e 75 IU/kg de anti-Xa), que foram associadas com atividades anticoagulantes inferiores, tinham efeitos antitrombóticos que fo- ram mais geralmente similares a UFH.
Tempos médios para oclusão foram 59 ± 25, 132 ± 42, 165 ± 23, 161 ± 41, e 165 ± 36 minutos em animais tratados com veículo, UFH, M118- REH (37,5 IU/kg de anti-Xa), M118-REH (75 IU/kg de anti-Xa), e M118-REH (150 IU/kg de anti-Xa), respectivamente. Deve ser notado que tempos de oclusão médios nas artérias tratadas ativas foram sub-estimados de seus valores verdadeiros, visto que muitas artérias, particularmente nos grupos de tratamento de M118-REH, não ocluem totalmente pelo ponto final pré- especificado de 180 minutos (tais artérias foram arbitrariamente marcadas a um tempo de oclusão de 180 minutos para a análise). Os pesos médios de trombo foram 24,0 ±9,15 mg nas artérias tratadas com veículo, 19,4 ± 9,47 mg nas artérias tratadas com UFH, e 24,5 ±12,17 mg, 19,8 ± 6,24 mg,e 12,8 ± 5,99 mg nos artigos tratados com M118-REH a 37,5, 75 e 150 IU/kg de anti-Xa, respectivamente. As diferenças entre grupos tratados para tempo médio para oclusão e peso médio de trombo não alcançaram significância estatística. Tempos de Hemorragia Cutânea
CBT variou de 15,5 ± 15,5 a 160 ± 52,5 segundos durante admi- nistração de veículo nos pontos de tempo de protocolo especificados em todos os grupos (Tabela 17). O tratamento de UFH e M118-REH resultou em aumentos mínimos no CBT, e os efeitos foram altamente variáveis. A média de grupo variou de 135 ±90,5 a 275 ± 306,8 segundos após tratamento de UFH, e 110 ±36,3 a 190 ±86,3 segundos após administração de M118-REH em todos os pontos de tempo.
Tabela 17. Tempos de Hemorragia Cutânea
<table>table see original document page 117</column></row><table>
UFH, heparina não-fracionada, SD, desvio padrão, IU, unidades internacionais, U, unidades.
Parâmetros Hemodinâmicos
Nenhuma mudança clinicamente significativa foi observada em parâmetros cardiovasculares ou químicos clínicos durante o curso dos expe- rimentos. Através da população de estudos, diferenças entre respostas hipe- rêmicas pós-estenótica nas artérias tratadas com veículo ou ativas foram ^ 13mUminuto em todos os animais. O objetivo de limitar resposta hiperêmica induzida por hipoxia a ^ 80% da resposta bovina a oclusão física foi encon- trada em todas, mas 2 artérias: 1 na qual a resposta foi 81% (M118-REH [75 IU/kg de anti-Xa]; artéria de controle); e 1 na qual a resposta foi 88% (M118- REH [75 IU/kg de anti-Xa]; artéria de tratamento ativo). A pressão arterial média e taxa de coração durante o curso do procedimento em todos os gru- pos de tratamento foram 68-78 mm de Hg e 96-111 bpm, respectivamente, perto de 70mm de Hg e 100 bpm de alvos especificados no protocolo. A dife- rença máxima nas pressões arteriais médias entre artérias tratadas com veí- culos e ativas em qualquer dado animal foi 6 mm de Hg por minuto, respecti- vamente (valores P para diferenças foram não-significantes).
Sumário
M118-REH em 150 lU/kg de anti-Xa mostrou estatisticamente eficiência antitrombótica superior a uma dose padrão de UFH (75 U/kg), a- pesar do fato que M118-REH e UFH mostraram atividade comparável em ensaios de ACT, aPTT e PT nestas concentrações. Desse modo, a incidên- cia de oclusão induzida por trombose total da artéria femoral foi significan- temente mais baixa no M118-REH tratado do que animais tratados com UFH (1/6 [16,7%] versus 5/6 [83,3%], respectivamente; P<0,05).
Os efeitos antitrombóticos observados nos grupos de tratamento de M118-REH foram alcançados sem evidência de complicações. Nenhum exemplo de hemorragia espontânea foi documentado, e somente aumento mínimo no CBT foi observado em todas as concentrações de M118-REH e pontos de tempo experimentais. Adicionalmente, não existem mortalidades inesperadas ou mudanças clinicamente significativas nos parâmetros cardio- vasculares e químicos clínicos.
Duas características dos dados de coagulação foram notáveis. Primeiro, M118-REH foi mensurável em um modo dependente da dose por ensaios de ACT de ponto de cuidado. Sua resposta de ACT estava bem cor- relacionada a atividade de antifator Xa comparada com UHF. Esta caracte- rística pode simplificar a administração de LMWHs em ajustes intervencio- nais e cirúrgicas. Segundo, M118-REH exibiu não somente atividade de anti- fator Xa, mas também atividade de antifator Ila significante, uma característi- ca que distingue adicionalmente M118-REH de opções atualmente disponí- veis (J. Hirsh et aí, "Heparina e heparina de baixo peso molecular: mecanis- mos de ação, farmacocinéticas, dosagem, monitoramento, e segurança", Chest. 2000; 119:64S-94S). Enoxaparina, por exemplo, é caracterizada por uma razão de atividade de antifator Xa para atividade de Ila de 17,2; por comparação, a razão análoga para UFH é 3,3(U. Cornelli and J. Fareed. "Farmacocinéticas humanas de heparinas de baixo peso molecular", Semin Thromb Hemost. 1999; 25 Suppl 3:57-61). Neste estudo, M118-REH tinha uma razão de antifator Xa para atividade de Ila que foi aproximadamente 2- 2,5 (figura 15), demonstrando atividade de antifator Xa aumentada relativa a outras LMWHs. A razão foi geralmente mais consistente sobre o tempo do que UFH, conforme prognosticado pelo metabolismo variável conhecido das moléculas de UFH grandes e polidispersas.
Tabela 18: Tabela de Sumário de Pontos Finais Trombóticos e Hematológi- cos Selecionados
<table>table see original document page 119</column></row><table>
TTO = Tempo para oclusão; ACT = Tempo de coagulação ativada; RFA = Artéria femoral direita;
UFH = heparina não-fracionada; Grp = Grupo.
a TTO > 180 minutos foi ajustado em 180 minutos.
b Valor registrado a 60 minutos após iniciação de infusão de artigo de teste.
c P<0,05 vs. controle.
d P<0,05vs. UFH.
e P<0,01 vs. controle.
Neutralização in vivo
Estudos in vivo foram realizados empregando-se ratos Sprague- Dawley e coelhos da Nova Zelândia. M118-REH, enoxaparina ou duas hepa- rinas não-fracionadas (UFH) foram administradas intravenosamente em do- ses diferentes em t = 0. A neutralização dos efeitos farmacológicos de cada um destes tratamentos foi avaliada por injeção de veia terminal de sulfato de protamina 5 minutos após tO em razões de 0,5 a 1 mg para 100 IU de anti- Xa (ou 100 Unidades USP1 ou 1 mg no caso de UHF). Amostras de sangue foram obtidas e testadas para atividade de anti-Xa e anti-lla na linha de base (imediatamente antes da injeção de protamina) 5, 30 e 60 minutos pós- administração de sulfato de protamina.
Neutralização completa e rápida de atividade anti-Xa de M118- REH por sulfato de protamina in vivo foi alcançada em razões de 0,5 mg: 100 IU de anti-Xa (>98%) em ratos, e 1 mg:100 IU de anti-Xa (mais do que 99% em ratos e 95% em coelhos) em 5 minutos pós-distribuição de sulfato de protamina intravenoso. Não existem "religação" de atividade anti-Xa ob- servada dentro de 1 hora pós-administraçção de sulfato de protamina.
Neutralização de atividade anti-Xa foi comparável entre M118- REH e UFH em razões de 0,5 mg e 1 mg para 100 Ul de anti-Xa (ou 100 USP ou 1 mg de UFH). Mais do que 40% e 20% da atividade anti-Xa perma- neceu 5 minutos após injeção de sulfato de protamina em ratos dosados com enoxaparina em razões de 0,5 e 1 mg: 100 IU de anti-Xa, respectiva- mente. Aproximadamente 38% da atividade de anti-Xa permaneceu em coe- lhos administrados com enoxaparina em 1 mg: 100 IU de anti-Xa de sulfato de protamina. Mais do que 90% da atividade de anti-lla seguindo cada uma das heparinas foi neutralizada em razões de 0,5 e 1 mg a 100 IU de anti-Xa. A grandeza de reversão de atividade anti-lla por sulfato de protamina foi e- quivalente entre os três tratamentos, isto é, M118-REH, enoxaparina ou U- FH. Os resultados são representados na Figura 11.
Em macacos Cinomólogos, sulfato de protramina (PS) inverteu ambos atividade anti-Xa e atividade anti-lla de M118-REH em uma extensão similar em um modo dependente de dose. M118-REH foi administrado intra- venosamente em macacos cinomólogos cônscios, em alguns casos seguido por administração de PS. Amostras de sangue foram obtidas e avaliadas para concentração de M118-REH conforme medida por atividade anti-Xa e atividade anti-lla, e perfil de coagulação. Hematologia, tempos de hemorra- gia cutânea e sinais de toxicidade clínica foram monitorados por 24 horas. Atividade de M118-REH foi detectável imediatamente seguindo iv administração a uma dose de 150 lü/kg de anti-Xa. Cinética de eliminação de primeira ordem para M118-REH foi observada com t1/2 de 0,50 ± 0,04 hora (anti-Xa) e 0,68 ± 0,05 hora (anti-lla). Além disso, PS rapidamente re- verteu atividade de anti-Xa e atividade de anti-lla de M118-REH em maneira dependente da dose. A maioria de atividade de anti-Xa (93,6 ± 1,2%) e ativi- dade de anti-lla (90,14 ± 1,2%) foi rapidamente por Ps em uma razão de 1,5 mg de PS por 100 IU de atividade anti-Xa, a dose mais alta estudada. Medi- ções de ACT e aPTT proximamente se relacionaram com a atividade de anti- Xa (r2=0,95 e 0,99, respectivamente). M118-REH aumentou ACT 2-3 vezes, e foi invertido para valores de linha de base dentro de 5 minutos seguindo administração intravenosa de PS. Nenhum sinal de toxicidade clínica ou he- morragia adversa foi observado.
A administração de M118-REH causa um efeito anticoagulante consistente e rápido que pode ser rapidamente invertido por injeção de PS. Anticoagulação de M118-REH é facilmente medida e monitorada por ACT e aPTT. A reversibilidade e monitorabilidade de M118-REH são únicas compa- radas com outras LMWHs comercialmente disponíveis.
Os resultados de estudos de neutralização de M118-REH e mo- delo de NHP são apresentados nas Tabelas 19-21 abaixo.
Tabela 19. Neutralização de M118-REH no Modelo NHP-Muitos aPTT e ACT Voltam ao Normal Após Dosagem.
<table>table see original document page 121</column></row><table> <table>table see original document page 122</column></row><table>
NS: nenhuma diferença significante comparada a UFH
*aPTT>212 seg em algumas amostras; f1/2 mais baixo do a linha de base após dosagem de UFH
ΛΜ118-REH dosado a 150 lU/kgi.v. ™M118-REH dosado a 75 lU/kg, UFH dosado a 75 IH/kg
Tabela 20. Neutralização de M118-REH no Modelo NHP-Atividades de Anti- Xa-IIa Siqnificantes Permaneceram
<table>table see original document page 122</column></row><table> Tabela 21. Neutralização de M118-REH no Modelo NHP-PercentaQem de Redução para Parâmetros Diferentes Após Protamina
<table>table see original document page 123</column></row><table>
fequação: (pós-M118-REH - pós-protamina)*100/pós-M118-REH
*ensaio instável
Estudo de monitoramento de leito lateral in vivo em modelos pré-clínicos:
M118-REH, enoxaparina e heparina não-fracionada foram admi- nistrados intravenosamente em doses diferentes em ratos e coelhos. Amos- tras de sangue foram obtidas para medição de ACT e teste de anti-Xa. He- machron Júnior e ACT mais cubeta foram usados para medição de anti-Xa, enquanto anti-Xa foi medido com Coag-A-Mate MTX II. A correlação entre anti-Xa e ACT foi comparada entre estas três heparinas. Em coelhos Bran- cos da Nova Zelândia, 1 mg/kg de M118-REH e UFH foram injetados, via veia marginal da orelha. Amostras de sangue foram coletadas a 5', 15', 30', 1, 2, 3, 4 horas após distribuição de heparina. Em ratos Sprague-Dawley, M 18-REH e UFH foram dosados a 0,5 a 1 mg/kg, enquanto enoxaparina do- sada a 1 mg/kg e 2 mg/kg. Estas doses alcançaram elevação significante de anti-Xa e ACT ambos em ratos e coelhos. Para M118-REH, o fator de corre- lação (r2) de anti-Xa para ACT foi 0,79 em coelhos e 0,85 em ratos. Os fato- res de correlação (r2) entre anti-Xa e ACT foram 0,31 em coelhos e 0,79 em ratos, enquanto para enoxaparina, foi somente 0,66 em ratos. Os resultados são mostrados na Figura 12.
Em modelos de NPH, após injeção intravenosa, M118-REH a- presentou primeira ordem de eliminação com meia vida como 0,50 ± 0,04 ou 0,68 ± 0,05 hora por medição de anti-Xa e anti-lla, respectivamente. Volu- mes de distribuição (Vd) são 32,01 ± 2,21 (anti-Xa) ou 48,58 ± 0,95 mUkg (anti-IIa), respectivamente. As folgas (Cl) são 37,24 ± 4,65 (anti-Xa) e 43,92 ± 5,38 (anti-IIa) mLVkg. Os resultados de ACT e aPTT estão proximamente relacionados a atividade de anti-Xa (razão de correlação r = 0,95 e 0,99, respectivamente).
Teste de hemorragia in vivo:
Heparina de baixo peso molecular é gerada por despolimeriza- ção de heparina não-fracionada com processos químicos e enzimáticos dife- rentes. As medições de tempo de hemorragia foram freqüentemente empre- gadas no desenvolvimento de novos antitrombóticos como uma indicação para risco de hemorragia. Este objetivo deste estudo foi investigar o risco de hemorragia por medição de tempo de hemorragia padrão para M118-REH, e comparar o risco a que atribui por tratamentos comparáveis, tais como eno- xaparina e heparina não-fracionada.
M118-REH, enoxaparina e heparina não-fracionada foram admi- nistrados intravenosamente como uma dose de massa simples de 0,5 mg/kg, via veia de orelha marginal em coelhos. Medições de tempo de he- morragia (BT) foram feitas na orelha na linha de base e 5, 15, 30, 60, 120 e 180 minutos após administração de artigo de teste. M118-REH causou um aumento de 3-4 vezes no BT em 5 minutos a 60 minutos de pós- administração (p<0,05). Uma resposta similar em BT foi observada por tra- tamento com enoxaparina e UFH. Os tempos de hemorragia retornaram pa- ra dentro da faixa normal por 120 minutos, e permaneceram perto dos valo- res de linha de base para os pontos de tempo remanescentes. Nenhuma outra descoberta clínica adversa foi observada em qualquer dos grupos de tratamento na dose testada.
Conforme mostrado na Tabela 22, nos modelos de NHP, M118- REH causou prolongamento de tempo de hemorragia de Curtis (CBT) após injeção intravenosa, não existe diferença estatisticamente significante da linha de base (p<0,05). Tabela 22: CBT de M118-REH após injeção intravenosa a 150 anti-Xa lU/kg no modelo NHP.
<table>table see original document page 125</column></row><table>
Em beagles, UFH produziu CBT mais longos do que M118-REH após injeção de massa e infusão contínua.
Sistema de coagulação in vivo:
Interação de Plaqueta
Em modelos de NHP1 não existe observação na influência na agregação de plaqueta disparada por ADP após administração intravenosa de massa de M118-REH.
Intervenção de trajetória fibronolítica:
Em modelos de NHP1 conforme mostrado na Tabela 18 abaixo, após injeção de massa intravenosa de M118-REH, o nível de fibrinogênio foi consistente, e não existe diferença significante estatística da linha de base.
Tabela 23. Tempo de Fibrinoqen e Protrombina (PT) após injeção intraveno- sa de M118-REH a 150 anti-Xa lU/kq no modelo NHP.
<table>table see original document page 125</column></row><table>
Estudos de Dose Ascendente Múltipla
Em estudos IV de dose repetida no rato, aumento na exposição a Μ118 pareceu ser proporcional ao aumento na dosagem no estudo nos Dias 0 e 13. Em ratos machos, exposição a M118 em termos de atividade de anti-Xa total aumentou do Dia 0 para o Dia 13, mas permaneceu similar em termos de atividade de anti-Xa total. Em ratos fêmeas, exposição a M118 aumentou do Dia 0 para o Dia 13. As fêmeas pareceram ter exposição mais alta a M118 do que ratos machos no Dia 0, mas no Dia 13 exposições a M118 foram similares entre gêneros. Em estudos IV de dose repetida no cão, exposição sistêmica como dosagem aumentou acima de 5 a 50 mg/kg/faixa de dia. Contudo, exposição a M118 geralmente não aumentou proporcionalmente com aumento de M118. Não existe evidência de acúmulo acima do período de 14 dias. Meias vidas para atividade de anti-Xa e anti-IIa em plasma de cão variou de 1,0 a 3,2 horas com nenhuma tendência parti- cular relacionada a dosagem ou gênero. As meias vidas tendem a serem mais curtas no Dia 13 do que no Dia 0. Não existe tendência consistente relacionada a dosagem de M118 com relação a folga sistêmica aparente, ou ao volume aparente de distribuição de atividades de anti-Xa e anti-lla.

Claims (57)

1. Composição de LMWH tendo um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, e tendo uma atividade de anti-lla de cerca de 70 a 280.
2. Composição de LMWH, de acordo com a reivindicação 1, ten- do uma atividade de anti-lla de cerca de 100 a 250 lU/mg.
3. Composição de LMWH tendo um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da1 e tendo uma atividade de anti-lla que é pelo menos 70% neutrali- zável com protamina conforme medida por ACT ou aPTT.
4. Composição de LMWH, de acordo com a reivindicação 3, no qual a atividade de anti-lla é neutralizada por pelo menos 70% dentro de cerca de 30 minutos após administração de protamina.
5. Composição de LMWH tendo um um peso molecular médio de peso de cerca de 5000 a 9000 Da, e tendo AUHNac,6sGHNs,3s,6s a 5 a 15% da composição.
6. Composição de LMWH tendo um comprimento de cadeia médio de cerca de 9 a 16 dissacarídeos, e tendo ΔUHNac,6sGHns,3s,6s a 5 a 15% da composição.
7. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1, 3 e 5, no qual o peso molecular médio de peso é cerca de -5500 a 8500 Da.
8. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1, 3, 5 e 6, compreendendo adicionalmente uma atividade de anti-Xa de cerca de 100 a 400 lU/mg.
9. Composição de LMWH, de acordo com a reivindicação 8, ten- do uma atividade de anti-Xa de cerca de 150 a 300 lU/mg.
10. Composição de LMWH, de acordo com a reivindicação 8, no qual a atividade de anti-Xa é pelo menos 70% neutralizável conforme medi- da por ACT ou aPTT.
11. Composição de LMWH, de acordo com a reivindicação 10, no qual a atividade de anti-Xa é neutralizada por pelo menos 70% dentro de 30 minutos após administração de protamina.
12. Composição de LMWH, de acordo com a reivindicação 11, no qual a atividade de anti-Xa pode ser neutralizada por pelo menos 70% dentro de 30 minutos após administração de protamina a uma dose de cerca de 1 a 2 mg da composição de LMWH por 100 anti-Xa IU de plasma.
13. Composição de LMWH tendo um peso molecular médio de peso de 5000 a 9000, e compreen- dendo uma razão de anti-Xa para anti-lla de 2:1, ou menos.
14. Composição de LMWA, de acordo com a reivindicação 13, no qual o peso molecular médio de peso é cerca de 5500 a 8500 Da.
15. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 e 12, na qual a atividade da composição pode ser monitorada por aPTT e ACT.
16. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 e 12, no qual a composição compreende uma mistu- ra de estruturas de AU e 1/G nas extremidades de não-redução das cadeias.
17. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 e 12, no qual cerca de 15% a 35% do número total de cadeias na composição um AU na extremidade de não-redução.
18. Composição de LMWH, de acordo com a reivindicação 17, no qual 80% ou mais do número total de cadeias na composição tem um AU não-sulfatado na extremidade de não-redução.
19. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 e 12, menos do que 5% do número total de cadeias na composição tem uma estrutura terminal de redução modificada.
20. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 e 12, no qual pelo menos 60% ou mais do número total de cadeias na composição compreende HNAc na extremidade de redu- ção.
21. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 12, tendo um ou mais dos seguintes: um teor de cálcio menor do que 3%; um teor de sódio menor do que 30%; enzima hepa- rinase a menos do que 1000 ng/mg; metanol a menos do que 1,0% pe- so/peso; etanol menor do que 1,0% peso/peso; menos do que 2,0% de clo- reto; menos do que 10% de água por peso; e menos do que 2000 ppm de sulfato livre.
22. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 12, no qual a LMWH proporciona pelo menos um aumento de 2 vezes na liberação de TFPI conforme comparado a enoxapa- rina.
23. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 12, tendo uma meia-vida intravenosa de cerca de -30 minutos a 3 horas.
24. Composição de LMWH, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 12, tendo uma meia-vida subcutânea de cerca de -1,5 a 2,5 horas.
25. Composição de LMWH, tendo a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 129</formula> no qual <formula>formula see original document page 129</formula> R é H ou SO3Na; R1 é SO3Na ou COCH3; η = 2-50; e a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 9-16 ou 8-15.
26. Composição de LMWH tendo a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 130</formula> no qual X é Na ou Ca, R é H ou SO3Na; R1 é SO3Na ou COCH3; η = 2-45; e a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 7-13 ou 8-12.
27. Composição de LMWH1 tendo a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 130</formula> no qual X é Na ou Ca, R é H ou SO3Na; R1 é SO3Na ou COCH3; η = 2-50; e a composição preferivelmente tem um valor médio para η de 9-16 ou 8-15.
28. Composição de LMWH compreendendo uma ou mais das seguintes características: a composição tem estruturas terminais de redução substancial- mente não modificadas, pelo menos 60% das cadeias da composição tem Hnac na extremidade de redução; menos do que 90% das cadeias da com- posição tem um AU sulfatado na extremidade de não-redução; não existe substancialmente região de ligação presente na composição; a composição tem mais cadeias com 3-0 sulfatos do que enoxaparina ou dalteparina; e a razão de AU2sHNac,6sGHNs,3s,6s na composição é cerca de 4:1, ou menos.
29. Composição de LMWH, de acordo com a reivindicação 28, no qual a composição tem todas das características.
30. Composição farmacêutica compreendendo uma composição de LMWH de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5, 6, 12 ou 25, e veículo farmaceuticamente aceitável.
31. Método de tratamento de um indivíduo tendo ou em risco de ter uma distúrbio trombótica, compreendendo administrar uma composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5, 6, 12 ou 25 a um indivíduo, para, desse modo, tratar a distúrbio.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, no qual a distúr- bio é síndrome coronária aguda (ACS).
33. Método, de acordo com a reivindicação 31, no qual a distúr- bio é infarto miocardial.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, no qual a distúr- bio é infarto miocardial de ST elevado ou infarto miocardial de ST não- elevado.
35. Método, de acordo com a reivindicação 31, no qual a distúr- bio é associada com intervenção cirúrgica.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, no qual a inter- venção cirúrgica é selecionada a partir do grupo consistindo em angioplastia, intervenções coronárias percutâneas (PCI) e colocação de stent.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35, no qual o indiví- duo pode ter, estar em risco, ou tendo, ou estar se recuperando de uma in- tervenção cirúrgica.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, no qual o indiví- duo está em risco de enxerto de derivação de artéria coronária (CABG).
39. Método, de acordo com a reivindicação 31, no qual a distúr- bio é angina estável ou instável.
40. Método, de acordo com a reivindicação 31, compreendendo adicionalmente a atividade da composição de LMWH usando ensaio de coa- gulação.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, no qual o ensaio de coagulação é tempo de coágulo ativado (ACT) ou tempo de tromboplas- ma parcial ativado (aPTT).
42. Método, de acordo com a reivindicação 31, compreendendo adicionalmente administrar sulfato de protamina após a administração da composição de LMWH para neutralizar alguma ou toda da atividade de anti- Xa ou atividade de anti-IIA da composição de LMWH.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, no qual a com- posição de LMWH é neutralizada antes do CABG.
44. Método para manter um valor de ACT alvo pela administra- ção de injeções de bolus múltiplos da composição de LMWH como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 25 a um indivíduo em ne- cessidade de manutenção do valor de ACT alvo.
45. Método de tratamento de uma distúrbio trombótica em um paciente, compreendendo: administrar uma composição de LMWH como definido em qual- quer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 25 ao paciente; classificação do paciente como não em necessidade de inter- venção cirúrgica, ou como um candidato à intervenção cirúrgica antes da liberação do hospital; e opcionalmente, se o paciente é classificado como um candidato à intervenção cirúrgica, em seguida realiza-se um ou ambos de monitora- mento da composição de LMWH e neutralização da composição de LMWH.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, no qual o pacien- te é classificado como um candidato à intervenção cirúrgica, e o método compreende adicionalmente monitorar a atividade da composição de LMWH em uma ou mais, ou toda, ou antes, durante ou após a cirurgia.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45, no qual o pacien- te é classificado como um candidato a CABG, e o método compreende adi- cionalmente um ou ambos de monitoramento da atividade da composição de LMWH1 e neutralização de alguma ou toda da atividade de anti-Xa, da ativi- dade de anti-lla, ou ambas, antes do CABG.
48. Método de monitoramento de um indivíduo tratado com uma composição de LMWH como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5, 6 ou 25, compreendendo: avaliação do tempo de coágulo ativado (ACT), ou tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT) em um indivíduo que tenha sido admi- nistrada um composição de LMWH como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1, 3, 5, 6 ou 25.
49. Método de tratamento de um indivíduo que tenha sido admi- nistrada uma composição de LMWH como defindo em qualquer uma das reivindicação 1, 3, 5, 6 ou 25, compreendendo: administrar sulfato de protamina ao indivíduo para neutralizar alguma ou toda da atividade de anti-Xa, atividade de anti-lla, ou ambas de uma composição de LMWH no indivíduo.
50. Método de fabricação de uma composição de LMWH, compreendendo: (1) sujeição de uma amostra de heparina não-fracionada (UFH) a uma primeira de uma precipitação com um solvente orgânico polar, um solvente não-orgânico polar, e um sal, para proporcionar um primeiro sobre- nadante; (2) sujeição do primeiro sobrenadante a uma segunda de uma precipitação com um solvente orgânico polar, e um solvente não-orgânico polar, para produzir um precipitado; (3) solubilização do precipitado e clivagem do precipitado com uma enzima que cliva em ligações ácidas urônicas não-sulfatadas; (4) precipitação da preparação clivada com um sal e um solvente orgânico polar para formar sólido tendo um comprimento de cadeia médio de 8-14 dissacarídeos; (5) sujeição do material a partir do sólido a uma etapa de sele- ção de tamanho para proporcionar uma preparação com um comprimento de cadeia médio de 9 a 16 dissacarídeos para, desse modo, produzir a compo- sição de LMWH.
51. Método de produção de uma composição de LMWH tendo um comprimento de cadeia médio de cerca de 9 a 16 dissacarídeos, com- preendendo provisão de um precursor de composição de LMWH tendo um comprimento de cadeia médio de 8-14 dissacarídeos; e processamento do precursor de composição de LMWH tendo um comprimento de cadeia médio de cerca de 9 a 16 dissacarídeos.
52. Método de produção de uma composição de LMWH, com- preendendo: (1) sujeição de uma amostra de heparina não-fracionada (UFH) a uma primeira de uma precipitação com um solvente orgânico polar, um solvente não-orgânico polar, e um sal de sódio, para proporcionar um primei- ro sobrenadante; e (2) sujeição do primeiro sobrenadante a uma segunda precipita- ção com um solvente orgânico polar, e um solvente não-orgânico polar, para produzir um precipitado; para, desse modo, produzir a composição de LMWH.
53. Método de avaliar uma preparação de heparina não- fracionada (UFH) para determinar a adequabilidade da preparação de UFH para processamento em uma composição de LMWH, compreendendo: determinação da quantidade de um ou mais de N-acetila e epó- xido presentes em uma preparação de UFH; comparação da quantidade a um critério pré-selecionado, e to- mada de uma decisão sobre a preparação de UFH baseado se o critério pré- selecionado é encontrado; para, desse modo, avaliar ou processar a preparação de UFH.
54. Método de avaliar ou processar uma preparação de LMWH intermediária para determinar a adequabilidade da preparação intermediária para processamento em uma composição de LMWH, compreendendo: comparação da quantidade de um ou mais de ácido idurônico sulfatado, hexosamina N-sulfatada ligada a ácido urônico, epóxido e 6-0 hexosamina sulfatada, na preparação de LMWH intermediária para a quanti- dade da mesma porção estrutural em um material de partida de heparina não-fracionada (UFH); e tomada de uma decisão sobre a preparação de LMWH interme- diária baseado se um critério pré-selecionado entre o material de partida e a preparação de LMWH intermediária é encontrado; para, desse modo, avaliar ou processar a preparação de LMWH intermediária.
55. Método de avaliar ou processar uma preparação de LMWH, compreendendo: proporcionar uma composição de LMWH; e determinar se uma estrutura da Tabela 10A está presente em uma faixa provida na Tabela 10A, para, desse modo, avaliar uma prepara- ção de LMWH.
56. Método de avaliar ou processar uma preparação de LMWH, compreendendo: proporcionar uma composição de LMWH; e determinar se uma estrutura da Tabela 11A está presente em uma faixa provida na Tabela 11 A, para, desse modo, avaliar uma prepara- ção de LMWH.
57. Método de avaliar uma preparação de LMWH, compreendendo: analisar uma composição de LMWH por 2D RMN; e determinar se um ou mais dos picos listados na Tabela 11A está presente em uma faixa descrita na Tabela 11 A, para, desse modo, avaliar a preparação de LMWH.
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