BRPI0713206A2

BRPI0713206A2 - métodos de análise das interações das ligações

Info

Publication number: BRPI0713206A2
Application number: BRPI0713206-9A
Authority: BR
Inventors: Hongye Sun; Kenneth J Livak
Original assignee: Applera Corp
Priority date: 2006-06-30
Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2012-04-17
Also published as: JP2009543058A; WO2008005674A3; EP2035831A4; CN101490551A; CA2656529A1; EP2035831A2; EP2035831B1; US20080050752A1; RU2009102155A; WO2008005674A2

Abstract

MéTODOS DE ANáLISE DAS INTERAçõES DAS LIGAçõES. A presente invenção revela métodos para a análise de interações de ligações entre um componente de ligação e um componente receptor pelo deslocamento de componentes ligados e livres através de um poro e detectando os componentes ligados e livres.

Description

"MÉTODOS DE ANÁLISE DAS INTERAÇÕES DAS LIGAÇÕES"

Interações de ligações entre um ligando e um parceiro de ligação cognato são críticas entre muitos processos químicos e biológicos. Por exemplo, interações entre macro-moléculas biológicas como entre uma proteína e um DNA ou entre uma proteína e outra proteína, formam críticas redes em cadeia reguladoras para controlar o desenvolvimento e atividade da célula. Para algumas interações de ligações, como a interação entre um ligando (molécula orgânica fixada à um íon metálico central por múltiplas uniões de coordenação) e seu correspondente receptor celular, sendo ele desejável para determinar a resistência da interação entre o receptor e o ligando uma vez que o tempo de ocupação do receptor poderá regular a resistência da correspondente resposta biológica. Interações de ligações mais complexas, como cooperativamente entre locais de ligação, poderão apuradamente regular o seguimento do evento biológico. Por exemplo, a decisão entre as fases lítica e lisogênica de bacteriófago λ depende de em parte na atividade da proteína repressora λ c/, que liga cooperativamente à um local de ligação repressora tripartite. Face à natureza cooperativa da ligação repressora c/ ao seu local operador, menores chances no nível da proteína repressora poderá precipitar o fago no modo lítico à partir do modo lisogênico e vice versa. Conseqüentemente, complexo entendimento do fenômeno de ligação, como interações cooperativas e de ligações alostéricas poderão assistir no estudo de como os sistemas biológicos regulam determinados processos.

Um número de diferentes métodos são viáveis para determinar as características de ligação entre moléculas interativas. Uma solução comum baseada nesse caminho, é o equilíbrio de diálise, uma técnica na qual um componente receptor é armado por uma membrana que é impermeável ao receptor mas permeável ao ligando. Ligando rotulado é usado para determinar a quantidade do ligando ligado ao receptor em diferentes concentrações do ligando, que poderão prover suficiente informação para estimar o equilíbrio constante da ligação, o número de locais de interação para o ligando, e a presença ou ausência de interações cooperativas. Outros experimentos para estudar as interações das ligações incluem cromatografia e análise de sedimentação. Os experimentos com cromatografia examinam a eluição do comportamento da mistura interativa quando a mistura é separada em um meio de cromatografia (como por exemplo, em uma peneira molecular) enquanto a análise da sedimentação examina o comportamento do equilíbrio da sedimentação das misturas quando sujeitas à altas forças centrífugas. Em algumas instâncias, técnicas espectroscópicas nas quais a absorção e/ou as características de emissão dos componentes de ligação e livres são providos distintivamente de outro experimento para análise.

Exemplo usando técnicas espectroscópicas são alterações hipercrômicas usadas para detectar o temperamento/desnaturação de um polinucleotídeo à um outro polinucleotídeo e transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET) entre o doador e o receptor dos cromóforos anexados às moléculas interativas. Apesar das técnica acima citadas poderem gerar adequadas medidas de interação entre moléculas, essas técnicas poderão requerer significante quantidade de amostras para análises, que poderão não serem apropriadas para o estudo das interações onde a ligação e os componentes receptores não são propriamente viáveis ou onde um grande número de interações de ligações deverão ser acessadas. Técnicas espectroscópicas são também limitadas à moléculas que tem o requisito de propriedades espectral. Se as técnicas espectroscópicas usar alvos detectáveis, os componentes de interação deverão ser apropriadamente rotulados, o que poderá ser problemático se a atividade de ligação do componente rotulado for sensitiva à modificação. Técnicas mais sensitivas para a averiguação das características de ligação de duas moléculas interativas empregam a fixação de uma das moléculas interativas à uma superfície e a detecção de um sinal associado com a ligação de um ligando à superfície da molécula ligada. Apesar do ligando ou receptor poder ser identificado com um rótulo detectável para a detecção de ligações complexas, rótulos podendo ser evitados onde a detecção do evento de ligação confia na alteração à uma propriedade de medição do material da superfície. Exemplos das referidas propriedades incluem, entre outras, a reflexão da luz polarizada circularmente de uma camada de ouro ( ou seja, ressonância da superfície do plasmônio) ou condutividade elétrica de uma superfície de um eletrodo (ver por exemplo, Myszka, D., 2000, Methods Enzymol. 323: 325-340). Apesar da análise das interações das ligações em uma superfície ser uma técnica sensitiva, e podendo simplificar a medição dos parâmetros de ligação, e onde apropriada, evitar o uso de rótulos detectáveis, os efeitos da superfície nos eventos de ligação poderá complicar a análise das ligações das interações. Por exemplo, se o transporte da massa do ligando à superfície for lenta em relação à proporção de ligação, o desvio das típicas características de ligação observadas na solução poderão ocorrer. Além disso, o receptor ligado poderá afetar a cinética da interação com o ligando uma vez que ele não é livre para se difundir, e dessa forma adicionar outro fator para o desvio do comportamento da solução. Assim, será desejável encontrar técnicas alternativas adequadas para examinar a ligação das interações que ignorem o uso de rótulos e evitem os efeitos de ligação da superfície enquanto mantendo alta sensitividade. Deverá ser entendido que a seguinte detalhada descrição são somente exemplares e explanatórias e não restritivas à esta revelação. Nesta revelação, o uso do singular inclui o plural a menos que contrariamente especificado. Também o uso de "ou" significa "e/ou" a menos que contrariamente estabelecido. Similarmente, "compreende", "compreendendo" "inclui", "incluem" e "incluindo" são alternativas e não pretendem ser limitativas. Deverá ainda ser entendido que nas descrições das várias configurações usam o termo "compreendendo", uma pessoa especialista na matéria conhecedora do estado da técnica entenderá que em algumas específicas instâncias, uma incorporação poderá alternativamente ser descrita usando a linguagem "consistindo essencialmente de" ou "consistindo de". As seções com cabeçalho usadas aqui são para propósitos organizacionais e não para serem construídas como limitativas ao assunto da matéria descrita.

2.1 Ligação das Interações e Métodos para Análise da Ligação das Interações.

A presente revelação provê métodos de análise de ligação de interações entre ao menos dois componentes em uma solução. Os métodos ora citados são baseados na habilidade para detectar e distinguir os vários componentes em um mistura de ligação pela passagem da mistura através de uma região de detecção e quantitativamente as várias formas ligadas e livres presentes na mistura. Nas presentes configurações , a região de detecção é parte de um poro ou canal através do qual os componentes interativos são deslocados. Baseado nas diferenças das propriedades detectáveis dos componentes ligados e livres, o número de componentes de ligação ligados pelo número de componentes receptores poderá ser determinado. Esta medição provê suficiente informação para acessar os vários parâmetros de uma interaçao da ligação, como a ligação de equilíbrios constantes, proporções de associação de dissociação, bem como de interação entre múltiplos locais no componente receptor. Em função da ligação das interações ser efetuada em solução preferivelmente que em uma superfície, os métodos evitam complicações associadas com reações na ligação realizadas na superfície.

Geralmente, o método para análise de ligação de interações compreende o contato de um ou mais componentes de ligação e um componente receptor em solução, onde os componentes ligados e livres são capazes de serem deslocados através de um poro. Após a formação da mistura, os componentes na mistura são deslocados através de um adequado poro de certo tamanho e detectado usando uma apropriada técnica de detecção, como será descrito a seguir. Em várias configurações , o poro, compreende uma região de detecção para detectar componentes deslocados através do poro. Diferentes componentes na mistura poderão ser quantificados se o sinal padrão associado com cada componente for distinto dos sinais padrões observados para outros componentes na mistura da ligação. Vários parâmetros refletindo a ligação das interações poderão ser acessados pela determinação do número de componentes de ligação ligados pelo número do componente receptor.

Como aqui referido "a ligação da interação" se refere à qualquer associação física entre um componente e outro componente. As interações poderão incluir interações covalentes e interações não covalentes. As interações covalentes poderão envolver, entre outros, interações hidrofóbicas, interações dipólo-dipólo, forças van der Waals, interações iônicas, ligações de hidrogênio, e combinações das mesmas. Os componentes interativos poderão ser qualquer molécula ou composição. "Específica" ligação de interações se refere à ligação de um componente de ligação à um específico local de interação em uma molécula receptora de modo que a interação mostre comportamento de ligação saturável.

Geralmente a concentração do componente de ligação nos quais os locais de interação são 50% saturados sendo referida como a constante do equilíbrio da ligação Keq. O inverso da constante do equilíbrio da ligação é a constante da dissociação do equilíbrio (Kdiss ou Kds). Kds para específicas interações poderão atingir de aproximadamente 10^2M ou menos, aproximadamente IO4M ou menos, 10^7M ou menos, ou 10^10M ou menos ou aproximadamente 10^14M ou menos. Em adição à específica ligação de interações, alguma ligação de interações são de natureza não específicas. Como usado na presente, interações "não específicas" se referem à ligação de interações nas quais a ligação de um componente de ligação à um componente receptor é linearmente proporcional à concentração do componente de ligação, e dessa forma não mostra ligação saturável sob condições onde a saturação de específicos locais são observados. A ligação de interações poderá compreender uma mistura de interações específicas e não específicas.

O termo "componente de ligação" se refere à qualquer composto ou composição que seja capaz de associação com um componente receptor em uma interaçao da ligação. O componente de ligação poderá compreender, por meio de exemplo e não de limitação, uma pequena molécula orgânica ligando, polipeptídeos e polipeptídeos análogos, carboidratos, como mono-sacarídeos, oligo-sacarídeos, e poli-sacarideos, e lipídios e ácidos gordurosos relativos. Em algumas configurações , o componente de ligação poderá ser uma única molécula, como uma única proteína ou oligonucleotídeo, ou compreendendo um complexo de moléculas que juntas formam um componente de ligação. Exemplos de componente de ligação incluem, entre outros, proteína-proteína, pequena molécula-proteína, proteína carboidrato, proteína-polinucleotídeo, e complexos de polímero de núcleo-base de pequena molécula. Por exemplo, proteínas de ligação DNA são conhecidas para dimerizar e formar um ativo complexo de ligação DNA capaz de ligar à uma específica seqüência em um poíinucleotídeo. O termo "componente receptor" se refere a qualquer composto ou composição que seja capaz de associação com um componente de ligação, em uma interaçao da ligação. O componente receptor poderá compreender uma pequena molécula orgânica; polipeptídeos, e polipeptídeos análogos, polímeros de núcleo-base, como poíinucleotídeo e polinucleotídeos análogos; carboidratos, como mono-sacarídeos, oligo-sacarídeos e poli-sacarídeos; lipídios e ácidos gordurosos relativos. Em algumas configurações , o componente receptor poderá ser uma única molécula, como uma única proteína ou oligonucleotídeo; ou compreendendo um complexo de moléculas que juntas formam um componente receptor. Exemplos de um componente receptor incluem, entre outros, proteína- proteína; pequena molécula-proteína; proteína-carboidrato; proteína polinucleotídeo, e complexos de polinucleotídeo de pequena molécula. Por exemplo, o receptor estrogênio compreende dímero de sub-unidade de α e β, e assim podendo formar vários subtipos de receptores, incluindo dímeros αα, ββ, e αβ. Vários componentes receptores e de ligação serão descritos a seguir.

O termo "local de interação" se refere à qualquer local no componente receptor que seja capaz de interagir com o componente de ligação. Em algumas configurações, o local de interação poderá ser na superfície, ou na parte interna do componente receptor, acessível ou inacessível à solução. Apesar de em algumas configurações a ligação das interações necessite acessar o local de interação à solução, um local de interação inacessível poderá se tornar acessível para a solução pela ação de outros componentes de ligação (por exemplo, compostos alostéricos).Os locais de interação poderão estar presentes em um único componente receptor ou ser gerado através da formação de complexos de componente receptor. Em várias configurações , o número de locais de interação presentes no componente receptor poderá ser um ou mais de um, como ainda descrito a seguir.

Deverá ser entendido que a descrição de um componente como um componente de ligação ou receptor não significa que sejam limitativos, uma vez que em algumas instâncias, um componente de ligação poderá ser descrito como um componente receptor e vice versa.

No contato dos componentes de ligação com o componente receptor, a mistura poderá compreender componentes livres, onde a ligação de interações ocorrem, como componentes ligados. "Componente livre" se refere à um componente de ligação ou componente receptor que não seja ligado à outro componente. Assim, o componente livre é o componente de ligação e componente receptor existente livre na solução. "Componente ligado" se refere à um componente de ligação que esteja fisicamente interagindo com um componente receptor, e assim sendo na forma de um complexo.

Diferentes tipos de ligação de interações tem sido caracterizadas e descritas. A ligação das interações entre um componente de ligação (L) e um componente receptor (M), onde um único local de interação esteja presente no componente receptor, podendo ser descrito pela seguinte reação: M + L = ML

Na ligação da interação acima, MeL representam os componentes livres enquanto ML representa o componente de ligação. A ligação do equilíbrio constante para a reação é representada por:

Keq = [ML] [M][L]

A dissociação constante, Kds é o inverso de Keq, Para um componente receptor com um único local de interação, a saturação fracionada, Y1 é a fração do componente receptor saturado com o componente de ligação:

Y = [ML] [M] + [ML]

A saturação fracionada poderá ser expressada com relação à dissociação constante como se segue:

Y = [L] Kds + [L]

Assim, a determinação da concentração do componente ligado, ou a concentração do componente de ligação livre e/ou componente receptor livre poderá prover suficiente informação para determinar a dissociação constante para a interaçao da ligação envolvendo um único local de interação. O tipo de reação é geralmente referido como Langmuir isotherm. Quando o componente receptor é meio saturado com o componente de ligação, a concentração do componente de ligação será igual à dissociação constante Kds.

Para a ligação de interações nas qual mais de um local de interação está presente no componente receptor, e os locais de interação não influenciam a ligação em outros locais de interação, a ligação da interação poderá ser descrita com referência à v, que representa os nevos do componente de ligação ligado pelo nevo do componente receptor. Para um componente receptor com η números de locais de interação como o mesmo Kds para cada local, a ligação da interação poderá ser generalizada como se segue:

v = n [L] Kds + [L]

A equação acima não conta para interações nas quais a ligação do primeiro componente de ligação à um local do componente receptor altera a ligação de um segundo componente de ligação à um segundo local de interação. Referida comunicação entre os locais de interação, incluem, entre outros, interação cooperativa e regulagem alostérica.

Como usado aqui "interação cooperativa" e "regulagem alostérica" se referem à ligação de um primeiro componente de ligação à um primeiro local de interação em um componente receptor e seu efeito na ligação de um segundo componente de ligação à um segundo local de interação.

A interação cooperativa é uma forma especial de regulagem alostérica e se refere à alterações na afinidade de um componente receptor para um componente de ligação, onde a alteração na afinidade é dependente na quantidade do componente de ligação já ligado ao componente receptor. Positiva cooperação está presente onde a ligação do primeiro componente de ligação resulta em uma maior afinidade do segundo local de interação para a ligação ao segundo componente de ligação. A cooperação negativa está presente onde a ligação do primeiro componente de ligação resulta em menor afinidade do segundo local de interação para a ligação do segundo componente de ligação. Em algumas configurações, as interações cooperativas poderão ser representadas pela seguinte reação:

M + nL = MLn

Onde η é o número de locais de interações no componente receptor Μ. A média do equilíbrio da ligação constante para a reação é:

Kn= [MLn] [M][L]n

Para a reação na qual há infinita cooperação, o valor v, os moles do componente de ligação unidos por mole do componente receptor, poderão ser expressados como se segue:

ν = η Kn [L]n 1 + Kn[L]n

Uma vez que saturação fracionada de Y = v/n, a fórmula acima será reduzida para:

Y = Mn Kd + [L]n onde Kds = VKn. Como notado acima, a equação acima mencionada pe baseada na infinita cooperação. Para menores sistemas cooperativos, as interações das ligações poderão ser descritas empiricamente pela seguinte fórmula:

Y = Kn[L]n^h 1 + Kn[L]n^h

Onde nh é conhecido como coeficiente Hill. O coeficiente Hill descreve o grau de cooperação onde um valor de 1 indica a não-cooperação e um valor nh de N (o total do número de ligando ligados) indicam infinita cooperação. Um valor de nh > 1 indica a cooperação negativa enquanto um valor de nh < 1 indica cooperação positiva. Como sugerido das descrições das várias ligações das interações, os parâmetros de ligação poderão ser obtidos pela determinação do número de componentes de ligação ligados pelo número de componentes receptores. Isto poderá ser feito pela determinação da concentração de ligando livre, componente receptor livre, e/ou componentes ligados na mistura da reação. Em algumas configurações, a determinação do número dos componentes de ligação ligados pelo número do componente receptor é realizada em diferentes concentrações do componente de ligação e do componente receptor. Em outras configurações, a determinação do número de componentes de ligação pelo número de componentes receptores é realizada em diferentes concentrações dos componentes de ligação e constante (ou seja, a mesma) concentração do componente receptor. Por exemplo, o aumento das concentrações do componente de ligação poderá ser adicionado ao sistema para determinar o equilíbrio da ligação constante. Baixas concentrações são na abrangência de Kds enquanto altas concentrações são muito maiores e se aproximam da saturação do local de ligação. Dessa forma, a abrangência das medições da concentração de ligação é freqüentemente sobre várias ordens de magnitude. Um método exemplar de determinação do Kds usando diferentes concentrações de um dos componentes na reação é representado pela seguinte equação:

<formula>formula see original document page 10</formula>

Como acima, [ML] é a concentração dos componentes ligados em diferentes concentrações do componente de ligação [L]T à uma concentração fixada do componente receptor [M]T. Pela determinação do número de componentes de ligação ligados pelo número do componente receptor, é permitido o cálculo do Kds- Em algumas configurações, os cinéticos de ligação, como a associação da taxa constante (kon) e a dissociação da taxa constante (koff), poderá também ser examinada usando os métodos citados. Por exemplo, a fase associada de uma reação de ligação poderá ser acessada pela rápida mistura do componente de ligação e do componente receptor, como pela injeção dos componentes separadamente em uma câmara misturadora em comunicação fluída com a região de detecção. A mistura é então deslocada através do poro e a região de detecção para determinar o número de componentes de ligação ligados pelo número do componente receptor. Contando o número de complexos formados todo o tempo até alcançar o equilíbrio poderá ser usado para determinar a taxa de associação constante. Para o envolvimento de uma reação de um componente receptor com um único local de interação, a associação cinética poderá ser expressada como:

<formula>formula see original document page 11</formula>

onde d[ML]/dt é a mudança no número de componentes ligados como uma função de tempo. No tempo t, [M] é dado por [Mtotal]-[ML]. A taxa de associação poderá então ser expressada como se segue:

<formula>formula see original document page 11</formula>

A medição do tempo requerida à partir da mistura à um ponto próximo do valor de equilíbrio de [ML] poderá ser usada para determinar a associação da taxa constante. Para simplificar a medição e reduzir o efeito de dissociação, as medições poderão ser realizadas sob condições onde a dissociação for desprezível, como antes da formação de significante quantidade de complexos [ML]. Onde M e L representam componentes não idênticos, determinando a associação de taxas constantes podendo ser simplificada por (1) misturando M e L e estimando a taxa inicial em diferentes concentrações de M e L, (2), realizando os experimentos sob condições nas quais [M] = [L], e dessa forma imitando uma reação de dimerização homogênea, ou (3) medindo a taxa onde [L] se encontra em vasto excesso de [M] não significantemente se altera sobre o tempo. Em algumas configurações, os métodos ora citados poderão ser usados para determinar a dissociação das taxas constantes. Por exemplo, os componentes de ligação e os componentes receptores poderão ser misturados para permitir interações de ligações para ocorrerem e então rapidamente se diluírem causando a dissociação dos componentes de ligação ligados ao componente receptor. Realizados os experimentos sob condições nas quais a associação da reação é desprezível, como a medição da dissociação da reação antes de significante re-associação de complexos dissociados ou quando a final concentração diluída é muito abaixo do Keq, a taxa da equação simplifica para o seguinte:

<formula>formula see original document page 12</formula>

Assim, o decréscimo no número de componentes de ligação ligados pelo número de componentes receptores como uma função de tempo poderá ser usado para estimar a taxa de dissociação constante. Outros métodos de determinação das taxas constantes serão aparentes para um especialista na matéria conhecedor do estado da técnica e não sendo limitada pelas configurações ora reveladas.

De acordo com o acima, uma variação de interações de ligações é responsável pela análise usando os métodos ora descritos. Em algumas configurações , os métodos poderão ser usados para examinar interações de ligações nas quais o componente receptor tem um único local interativo (isto é, o número η de local interativo onde η = 1), as equações básicas das quais tem sido descritas acima.

Em outras configurações , as interações das ligações poderão envolver os componentes receptores nos quais o número η de locais de interação será maior que 1. Em algumas configurações , as interações de ligação examinadas poderão envolver um componente receptor nas quais o número η de locais de interação é 2 ou mais, 4 ou mais, 8 ou mais, 10 ou mais, e 20 ou mais.

Em algumas configurações , as interações da ligação poderão envolver o componente receptor no qual o número η de locais interativos é superior à 20, de modo que a ligação das pequenas moléculas para polímeros, por exemplo, interações intercaladas com polinucleotídeos.

Em algumas configurações , as interações da ligação poderá envolver componentes receptores com η números de locais interativos de 2 até 10. Em algumas configurações onde o número de locais interativos for maior a 1, cada um dos locais interativos poderá compreender idêntico equilíbrio de ligação constante.

Em outras configurações onde o número de locais interativos seja superior a 1, ao menos dois dos locais interativos poderão compreender diferente equilíbrio de ligação constante. Exemplos dessas interações, incluem, entre outras, enzimas reguladas alostericamente e proteínas. Em algumas instâncias, todos os locais interativos poderão ter diferente equilíbrio de ligação constante, particularmente em sistemas envolvendo interações cooperativas. Interações cooperativas são vistas em muitas interações de ligação biológica, como por exemplo, ligação de hemoglobina ao seu oxigênio ligando cognato e ligando o repressor c/ de fago λ ao seus locais operadores.

Em algumas configurações onde o componente receptor compreende mais que um local interativo, o componente receptor poderá compreender ao menos primeiro e segundo locais de interação, onde os primeiro e segundo locais de interação são diferentes. Locais de interação diferente referem-se à diferentes partes do componente receptor que interage com o primeiro componente de ligação quando comparado à interação com o segundo componente de ligação, configurações nas quais o componente receptor compreende diferentes locais interativos incluem, entre outros, proteínas que são alostericamente reguladas e proteínas que ligam um ligando regulado no sentido de ligar à outro componente de ligação. Vários exemplos deste tipo de ligação serão aparentes para um especialista na matéria, conhecedor do estado da técnica.

Em algumas configurações, os métodos poderão ser usados para examinar as interações da ligação nas quais o componente de ligação e o componente receptor são os mesmos componentes. Essas interações de ligação são interações de ligação homogêneas. Exemplos de interações homogêneas incluem, a título de exemplo, e não de limitação, a dimerização de sub-unidades de proteínas ou o amolecimento das seqüências de polinucleotídeo palindrômico.

Em outras configurações, os métodos poderão ser usados para examinar interações de ligação nas quais o componente de ligação e os componentes receptores são diferentes. Essa interação de ligação são heterogêneas ou interações heterólogas. Exemplos de interações de ligação destes tipos incluem, como exemplos, interações de proteínas-DNA, interações de moléculas de pequenas proteínas, interações de moléculas de pequeno DNA1 e amolecimento de seqüências de DNA não palindrômico.

Em algumas configurações, os métodos poderão ser usados para examinar interações de ligação nas quais os componentes de ligação compreendem ao menos primeiro e segundo componentes de ligação, onde os primeiro e segundo componentes de ligação são diferentes. Em várias configurações, os diferentes primeiro e segundo componentes de ligação podem ligar os mesmos locais de ligação, sobrepondo os locais de ligação, ou não sobrepondo os locais de ligação. Em configurações onde a ligação do primeiro e do segundo componentes de ligação ocorre ao mesmo ou sobrepondo locais interativos, os primeiro e segundo componentes de ligação poderão ligar o componente receptor competitivamente. Como usado aqui "ligação competitiva" se refere ao menos primeiro e segundo componentes de ligação nos quais seus correspondentes locais de interação sobrepõem de modo que a ligação do segundo componente de ligação interfere com a ligação do primeiro componente de ligação. O aumento da concentração de um dos componentes de ligação competitivos atenua ou elimina a ligação de outro componente de ligação competitivo. Por exemplo, no contexto de interações de substrato de enzima, um inibidor competitivo liga o local ativo da enzima e inibe a ligação do substrato. O aumento da concentração do substrato, entretanto, compete fora do inibidor competitivo, de modo que o parâmetro da enzima de velocidade de enzima máxima Vm não é afetada enquanto a aparente afinidade para o substrato Km é afetada dependendo da concentração do inibidor competitivo.

Em algumas configurações, os primeiro e segundo componentes de ligação poderão ligar o componente receptor não competitivamente. Como usado aqui, "ligação não competitiva" se refere ao menos primeiro e segundo componentes de ligação que se ligam ao componente receptor em outra de que em competitiva maneira. Geralmente, em interações não competitivas, o primeiro componente de ligação se liga em um local interativo que não se sobreponha com o local interativo do segundo componente de ligação de modo que a ligação do segundo componente de ligação não interfira diretamente com a ligação do primeiro componente de ligação. Assim, nenhum efeito na ligação do primeiro componente de ligação pela ligação do segundo componente de ligação ocorrerá através de um mecanismo outro que tenha direta interferência com a ligação do primeiro componente de ligação. Por exemplo, no contexto das iterações do substrato de enzima, um inibidor não competitivo liga à um local outro que o local ativo da enzima. Dessa forma, o aumento da concentração do substrato poderá não apropriadamente afetar os parâmetros da enzima de Vm e/ou Km exibidos na presença do inibidor não competitivo. A ligação não competitiva inclui interação do tipo misturadas ou mistas nas quais os primeiro e segundo componentes de ligação se ligam ao componente receptor com características de ambas as ligação competitivas e não competitivas, e também incluem interações de ligação não competitiva nas quais um segundo componente de ligação se liga em um local interativo que não se sobreponha com a ligação do primeiro componente de ligação mas se ligue ao segundo local interativo quando o primeiro local interativo estiver ocupado pelo primeiro componente de ligação. Por exemplo, no contexto das interações do substrato da enzima, um inibidor não competitivo geralmente liga o complexo de substrato de enzima, e dessa forma aumentando a aparente afinidade do substrato Km (ou seja, o substrato ou produto permanece ligado à enzima por mais tempo) enquanto diminui a máxima atividade da enzima Vm.

Em algumas configurações, o componente de ligação compreende um agonista que se liga à um componente receptor. Um "agonista" se refere à um substrato que se liga ao componente receptor sendo habilitado de disparar uma ação fisiológica do componente receptor ao qual ele se liga. Assim, a ligação de um agonista produz uma ação biológica, enquanto um antagonista, como ainda a ser descrito abaixo, bloqueia a ação do agonista. Por exemplo, muitas drogas imitam os efeitos de um componente de ligação endógeno pela ligação do componente receptor cognato e ativando os sistemas de transmissão de sinal normalmente disparados pelo componente de ligação endógeno.

Em algumas configurações , o componente de ligação compreende um antagonista que se liga ao componente receptor. Um "antagonista" se refere à uma substância que se liga ao componente receptor sendo capaz de inibir ou atenuar a ação fisiológica do componente receptor ao qual ele é ligado. Muitas drogas trabalham para bloquear a ação dos agonistas receptores endógenos, como por exemplo os hormônios e os neuro-transmissores. Antagonistas farmacocinéticos se referem à drogas que alteram o caminho de uma célula ou reage o organismo à outra droga. Antagonistas que competem com um agonista para um receptor são antagonistas competitivos enquanto antagonistas que antagonizam por outros meios são antagonistas não competitivos.

Em algumas configurações, o componente de ligação compreende um agonista inverso. Um "agonista inverso" se refere à um componente de ligação que se liga ao mesmo local de interação do componente receptor como um agonista para que o componente receptor possa mostrar o oponente biológico ou efeito farmacológico. Uma característica do agonista inverso é a inibição pelo antagonista que também bloqueia a atividade agonista. Deverá ser entendido que as interações de ligação outras que aquelas expressamente aqui descritas poderão também serem examinadas usando os métodos citados. A aplicação dos métodos para as referidas interações de ligação serão aparentes para um técnico na matéria, conhecedor do estado da técnica.

2.2 Detecção de Componentes Ligados e Livres

Para determinar o número de componente de ligação ligado pelo número de componente receptor nos métodos aqui descritos, os componentes ligados e livres na mistura são deslocados através de um poro. O termo "poro" se refere à qualquer contração ou limitação do volume que restrinja a passagem da ligação e dos componentes receptores. O poro inclui aberturas, orifícios e ranhuras. As ranhuras incluem, entre outros, depressão, sulco, ou qualquer condutor para a passagem dos componentes na mistura a ser detectada na região de detecção.

As dimensões do poro ou ranhura poderão depender do modo de detecção usado. Entretanto, o tamanho do poro é ao menos para que ele permita a deslocação dos componentes ligados e livres para detecção. Assim, em algumas configurações , o poro ou ranhura poderá ser um nanoporo tendo um diâmetro ou dimensão de ranhura de aproximadamente 100 nm ou menos, aproximadamente 50 nm ou menos, aproximadamente 20 nm ou menos, aproximadamente 10 nm ou menos, aproximadamente 5 nm ou menos, ou aproximadamente 2 nm ou menos. Em algumas configurações , o poro é de uma dimensão suficiente para limitar a deslocação através do poro à um único componente de ligação, componente receptor e/ou componente ligado. O termo "deslocação" se refere ao movimento do componente através do poro para detecção na região de detecção. Em algumas configurações , a deslocação é uma deslocação dirigida onde uma força é aplicada para mover o componente preferencialmente em uma especificada direção. A força poderá ser qualquer força, como gradientes eletro-motivos, gradientes de pressão, gradientes de concentração, gradientes de temperatura, gradientes osmóticos, ou qualquer força adequada que possa direcionar o transporte dos componentes na mistura através do poro. Vários modos para o transporte direcional serão ainda descritos a seguir.

O termo "região de detecção" se refere à uma região na qual os componentes ligados e/ou livres são detectados. A região de detecção poderá ser no interior do poro, justaposta ao poro, na entrada ou saída do poro, ou presente através de uma parte ou na integralidade do poro. Várias configurações dependerão do modo de detecção usado para detectar os componentes na mistura da ligação.

Na deslocação através do poro, os componente livres ou qualquer componente ligado são interrogados na região de detecção para detectar uma propriedade associada com os componentes ligados e livres. Adequados modos de detecção incluem, para fins de exemplo, e não de limitação, corrente bloqueio, corrente de túnel elétron, efeito de campo de carga induzida, e/ou tempo de transição de poro, com ainda descrito a seguir.

A detecção da propriedade dos componentes ligados e livres gera um sinal padrão que identifica o componente detectado. Este sinal padrão associado com o componente detectado poderá ser comparado à um conjunto de sinal de referência padrões para assistir na relação do sinal padrão à um específico componente na mistura. Os sinais padrões de referência poderão ser obtidos pela análise do componente de ligação e do componente receptor separadamente e então uma mistura para determinar a característica ou assinatura dos sinais padrões associados com cada componente na reação de ligação.

Vários modos de detecção capazes de gerar distinguíveis sinais padrões para cada espécie de componente livre (ou seja, componente de ligação e componente receptor), bem como cada espécie de componente ligado poderá ser usado. Onde o componente receptor compreender mais do que um local de interação, um modo de detecção poderá ser selecionado que possa gerar diferentes sinais padrões para cada espécie de componente ligado, por exemplo um componente receptor com um componente de ligação limitado e um componente receptor com um componente de ligação limitado ligado e um componente receptor com dois componentes de ligação limitados ligados. Além disso, dependendo da sensitividade da detecção, o sinal padrão gerado poderá permitir distinguir entre a ligação de um primeiro local de interação quando comparado à ligação de um segundo local de interação. Isto poderá ser possível em algumas configurações onde o primeiro componente de ligação é diferente do segundo componente de ligação de modo que a eventos de independente ligação possam ser distinguidos bem como os complexos nos quais os componentes de ligação são ligados ao componente receptor. Entretanto, deverá ser entendido que a análise da interação da ligação não necessita requerer a distinção entre cada espécie de componentes livres ou de componentes ligados.

Como um exemplo, para a interação envolvendo um receptor com dois locais interativos para o mesmo componente de ligação, um equilíbrio médio de ligação constante poderá ser obtido pela determinação do número total de componentes ligados sem a necessidade de distinção entre cada espécie do componente ligado.

Uma variedade de modos de detecção são aplicados aos métodos aqui citados. Em algumas configurações , a propriedade detectada é o efeito do componente deslocado nas propriedades elétricas do poro. As propriedades elétricas do poro incluem, entre outras, amplitude de corrente, impedância, duração e freqüência. Dispositivos para a detecção das propriedades elétricas do poro tipicamente compreendem um poro incorporado em uma película fina ou uma membrana, onde a película ou membrana separa uma câmara eis e uma câmara trans conectadas por uma ponte condutora. A mistura a ser analisada é colocada na lateral eis do poro em uma solução aquosa, tipicamente compreendendo um ou mais sais dissolvidos como cloreto de potássio. A aplicação de um campo elétrico através do poro usando eletrodos posicionados na lateral eis e trans poderá ser usada para direcionar o deslocação dos componentes através do poro. O tamanho e a geometria do componente poderá afetar a migração de íons através do poro, e assim alterando as propriedades elétricas do poro. A corrente é medida em uma freqüência de tempo adequada para obter suficiente pontos de dados para detectar um sinal de corrente padrão. O sinal gerado padrão poderá então ser comparado à um conjunto de referências padrão para identificar o componente sendo detectado. Alterações na amplitude da corrente, duração da corrente, e magnitude da corrente definem um sinal padrão para o específico componente na mistura. A medição das propriedades da corrente de um poro, como as técnicas de correção de voltagem, é descrita em vários trabalhos de referência, por exemplo, Hille, B, 2001, Ion Channels of Excitable Membranes, 3rd Ed., Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.

Em algumas configurações , a propriedade detectada é quantidade de túneis de passagem de elétrons.

A quantidade de túneis é o efeito mecânico quantitativo da transição através de uma energia estabelecida classificadamente proibida através das propriedades das ondas quantitativas da particular. O túnel de elétron geralmente ocorre onde um potencial obstáculo existe para o movimento dos elétrons entre um doador e um receptor. Para detectar o túnel de passagem do elétron um eletrodo extremo micro-fabricado é posicionado à aproximadamente 2 nanômetros do componente a ser detectado. Em uma apropriada distância de separação, a passagem dos elétrons através da região entre o extremo e o componente, e se uma voltagem é aplicada entre o extremo e o componente, uma rede corrente de elétrons (ou seja passagem de corrente) fluindo através da fenda na direção da voltagem polarizada. Onde o dispositivo usa eletrodos de detecção para medir a passagem da corrente, os eletrodos poderão ser posicionados proximamente à deslocação dos componentes de modo a haver passagem do elétron entre os eletrodos de detecção e os componentes deslocados da mistura.

Como ainda discutido a seguir, a harmonia dos eletrodos relativos à direção da deslocação poderá ordenar o tipo de passagem de elétron detectado. Em algumas configurações , a análise das interações da ligação poderão envolver a detecção do fluxo de corrente através da deslocação do componente (por exemplo, longitudinalmente ao longo da cadeia de ácido nucléico)(Murphy et al., 1994 m Proc Matl Acad Sci USA 91 (12):5315-9). Para a detecção de cada túnel de passagem de elétron, os eletrodos de detecção são posicionados longitudinalmente para a direção da deslocação de modo que haja u ma fenda entre os eletrodos paralelos à direção da deslocação.

Em várias configurações, os eletrodos de detecção poderão ser colocados em lados opostos de uma camada (s)(por exemplo, uma membrana) separando os dois lados do poro enquanto em outras configurações, os eletrodos de detecção poderão ser posicionados no interior da camada (s) que separa os dois lados do poro.

Outro modo de passagem do elétron é que ocorra através do componente, ou seja, em uma direção transversal à direção de deslocação através do poro. Diferenças nas composições químicas, estruturas de hidratação, interações com íons carregados, orientação espacial dos grupos químicos no componente poderão alterar as características de transporte do elétron transverso, e assim prover uma base para distinguir um componente de outro componente na mistura da combinação. Para a detecção do túnel de passagem do elétron através do poro (por exemplo, transversal à uma cadeia de ácido nucléico estendida), os eletrodos de detecção poderão ser posicionados em uma lateral do nanoporo para interrogar o componente deslocado. Para a detecção transversa dos extremos dos eletrodos de detecção poderão ser dimensionados para interrogarem um único componente.

Em outras configurações , as dimensões dos eletrodos de detecção poderão ser harmonizados para interrogar maiores ou mais um componente. Por exemplo, para a detecção de nucleotídeos, os eletrodos poderão ser dimensionados para interrogarem aproximadamente 2 ou mais, aproximadamente 5 ou mais, aproximadamente 10 ou mais, ou aproximadamente 20 ou mais dependendo da resolução requerida para detectar e distinguir o polinucleotídeo de outros componentes na mistura da ligação.

Em algumas configurações , a técnica de detecção poderá ser baseada nos campos induzidos de carga de imagem, como descrito na patente e Norte- Americana No. 6.413.792 e no Pedido de patente e Norte-Americano Publicado No. 2003/0211502, cujas revelações são incorporadas ao presente pedido para referência. Dispositivos semicondutores para detecção baseados nos campos de indução de carga são também descritos nessas referências. A aplicação de uma voltagem entre a região da fonte e uma região de drenagem que resulta no fluxo de corrente da fonte ao dreno se um canal para a corrente fluir ser formado no semicondutor. Devido ao fato que cada componente na mistura da ligação poder ter uma carga associada, a passagem de um componente através do poro semicondutor poderá induzir uma alteração na condutividade do material semicondutor de revestimento do poro, e dessa forma induzindo uma corrente de uma magnitude especificada e forma de onda.Correntes de diferentes magnitude e forma de onda poderão ser produzidas por diferentes componentes face às diferenças na carga, distribuição da carga, e tamanho das moléculas. Nas configurações reveladas na patente e Norte-Americana No. 6.413.792, um componente passa através de um poro formado de uma camada de silicone tipo-p. A deslocação dos componentes poderá ser alcançada como aqui descrito.

A magnitude da corrente induzida por carga é esperada para ser na ordem de abrangência de micro-ampére, que é maior do que as correntes de pico-ampére esperadas para a detecção baseada nba passagem dos túneis de elétrons. Deverá ser entendido que apesar das descrições acima relatarem uma individual técnica de detecção, em algumas configurações , uma pluralidade de diferentes técnicas poderão ser usadas para examinar a mistura da ligação. Exemplos de modos de detecção múltipla incluem, entre outros, bloqueio de corrente em combinação com a corrente de passagem de elétron, o bloqueio de corrente em combinação com os campos de indução de carga de imagem. A detecção de corrente com diferentes modos de detecção poderão ser usados para identificar um componente na reação de ligação pela correlação do tempo de detecção do sinal resultante obtido de diferentes modos de detecção. Na detecção dos componentes ligados e nos componentes livres na mistura, os relevantes parâmetros de ligação poderão ser determinados como acima descrito. Vários dispositivos empregando vários modos de detecção poderãq.ser usados para análise da mistura da ligação. Esses, incluem, entre outros, sistemas baseados em biologia, que empregam um poro biológico ou uma ranhura embutida em uma membrana e sistema de estado sólido nos quais a ranhura ou o poro é feito inteiramente ou em parte à partir de um componente em estado sólido esculpido ou fabricado, como silicone. Dispositivos usando poros biológicos, como hemolisina-α e porina, como descrito em Kasianowiscz et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93: 13770-13773: howorka et al, 2001, Nature Biotech nol. 18: 1091-5; Szabo et al, 1998, FASEB J. 12:495-502; e as patente es Norte- Americanas Nos. 5.795.7682; 6.015.714; 6.267.872 e 6.428.959; todas publicações incorporadas aqui para referência. Em algumas configurações , a análise da reação da ligação é realizada pela deslocação dos componentes na mistura da ligação através de um poro fabricado por materiais não biológicos. Poros, incluindo ranhuras, poderão ser feitos de uma variedade de materiais em estado sólido usando um número de diferentes técnicas, incluindo entre outras, deposição química, deposição eletro-química, eletro-galvanização, modelação de feixe de elétron, modelação de feixe de íon, nanolitografia, estampagem química, ablação à laser, e outros métodos muito conhecidos pelo estado da técnica (ver por exemplo, Li et al., 2001, Nature 412:166-169; e WO 2004/085609). Materiais em estado sólido incluem, para fins de exemplo e não de limitação, quaisquer materiais semicondutivos conhecidos. Matérias isolantes e metais. Assim, os poros em estado sólido poderão compreender sem limitação silicone, nitrato de silicone, germânio, arsenieto de gálio, metais ( como por exemplo, ouro, prata, platina), óxidos metálicos, e colóides metálicos. Para preparar um poro de apropriadas dimensões, vários procedimentos de regeneração poderão ser empregados nos processos de fabricação. Nas configurações onde o íon passa através de um orifício, a detecção do fluxo de íon através do material em estado sólido provê um caminho de medição do tamanho do poro gerado durante a fabricação (ver por exemplo, o Pedido de patente e Norte-Americano Publicado No. 2005/0126905). Em outras configurações, onde os eletrodos definem o tamanho do poro, a corrente de passagem de elétron entre os eletrodos poderá prover informação do tamanho da fenda. O aumento na passagem da corrente indica uma diminuição na distância da fenda entre os eletrodos. Outras técnicas de regeneração serão aparentes para um técnico no assunto, conhecedor do estado da técnica. Em algumas configurações , o poro poderá ser fabricado usando modelagem do feixe de íon, como descrito em Li et al, Nature Materials 2:611-615. No processo descrito, uma camada de película de nitrato de silicone de baixa tensão é depositado em um substrato de silicone através da deposição de vapor químico de baixa pressão. Uma combinação de fotolitografia e estampagem química poderão ser usadas para remover o substrato de silicone para deixa-lo atrás da camada de nitrato de silicone. Para formar o poro, um feixe de íon focado (por exemplo, feixe de íon de argônio de energia de 0.5 à 5.0 KeV e diâmetro de 0.1 à 0.5 mm), é usado para gerar um orifício na membrana de nitrato de silicone. Pelo adequado ajuste dos parâmetros do feixe de íon (por exemplo, o tempo total do nitrato de silicone que é exposto ao feixe de íon e a exposição do ciclo devido) e a temperatura da amostra, o material poderá ser removido para aumentar o orifício, ou adicionar material para diminuir o tamanho do orifício. O bombardeamento do feixe de íon em temperatura ambiente e baixo ciclo devido resulta na migração do material no orifício enquanto o bombardeamento à 5°C a maiores ciclos devidos resultam no aumento do orifício. A medição da quantidade de íons transmitidos através do poro provê um mecanismo de regeneração para precisamente controlar o tamanho do poro final (Li et al, supra). Para formar um poro de apropriadas dimensões, um orifício maior do que as dimensões do poro final desejado poderá ser feito usando parâmetros de modelagem que resulta na perda do substrato de silicone. Subseqüentemente, o tamanho do poro poderá ser ajustado à uma apropriada dimensão usando parâmetros de modelagem que resultam no movimento do material no orifício inicialmente formado.

Em outras configurações , os poros poderão ser feitos por uma combinação de litografia de feixes de elétron e a modelagem de feixes de elétron de alta energia (ver por exemplo, Storm et al., 2003, Nature Materials 2:537:540). Um isolador em silicone, fabricado de acordo com métodos conhecidos, poderá ser usado para formar uma membrana de silicone, que é então oxidada para formar a camada de óxido de silicone. Usando uma combinação de litografia de feixes de elétron e a estampagem anisotrópica, o óxido de silicone é removido para expor a camada de silicone. Orifícios são feitos de silicone por estampagem umedecida KOH e o silicone oxidado para formar uma camada de óxido de silicone de suficiente espessura, como por exemplo uma camada de aproximadamente 40 nm. A exposição da dióxido de silicone à um feixe de elétron de alta energia (por exemplo, de uma transmissão de microscópio de elétron) deforma a camada de dióxido de silicone em volta do orifício. Se os orifícios inicias forem aumentados ou diminuídos, de pende do tamanho inicial. Orifícios de 50 nm ou menores surgem para diminuir em tamanho enquanto os orifícios de aproximadamente 80 nm ou maiores aumentam no tamanho. Um similar experimento para gerar um adequado poro pela técnica de precipitação do feixe de íon é descrita em Heng et at., 2004, Biophy J87:2905-2911. Nesta técnica, os poros são formados usando litografia com feixe de elétron de alta energia focado no semicondutor de óxido metálico (CMOS) combinado com técnicas gerais para a produção de películas ultra-finas.

Em outras configurações , o poro poderá ser construído como descrito nas patente es Norte-Americanas Nos. 6.627.067; 6.464.842; 6.783.643; e no Pedido de patente e Norte-Americano Publicado No. 2005/0006224 pela modelagem de nitrato de silicone. Inicialmente, uma camada de nitrato de silicone é depositada em ambas laterais de uma camada de silicone por deposição de vapor químico. Seguindo a adição de um foto-resistor de maneira que deixe uma parte da camada de nitrato de silicone exposta, a camada de nitrato de silicone exposta em uma lateral é removida por convencionais técnicas de estampagem de íon para levar para trás de uma camada revestida com silicone e com nitrato de silicone do outro lado. O silicone poderá ser removido por um grande número de técnicas de estampagem, como estampagem anisotrópica KOH, e assim levando para trás uma membrana de nitrato de silicone. A espessura da membrana do nitrato de silicone poderá ser controlada pelo ajuste da espessura depositada no silicone. Pelo uso da litografia do feixe de elétron ou foto-litografia, uma cavidade é produzida em uma lateral da camada de nitrato de silicone seguida pelo afinamento da membrana na outra lateral da cavidade. Apropriados processos de afinamento incluem, entre outros, precipitação do feixe de íon, estampagem assistida do feixe de íon, estampagem do feixe de elétron, e estampagem reativa de plasma. Numerosas variações no processo de fabricação, por exemplo, usam a camada de nitrato de silicone imprensada entre duas camadas de silicone, podendo ser usada para gerar diferentes tamanhos de poros. Como notado acima, um mecanismo de regeneração baseado na medição da taxa e/ou intensidade de íons passando através do poro provê um método para controle do tamanho do poro durante o processo de fabricação.

Em outras configurações , o poro poderá ser construído como um nanotubo de ouro ou prata. Em algumas configurações , esses poros são formados usando um molde de material poroso, como filtros de policarbonato preparados usando um método de gravação concêntrica, e depositando outro ou outro metal adequado na superfície do material poroso. As membranas de policarbonato gravadas de forma concêntrica são tipicamente formadas pela exposição de um sólido material de membrana para partículas nucleares de alta energia que criam trilhas no material da membrana. A estampagem ou gravação química é então empregada para converter as trilhas gravadas em poros. Os poros formados tem um diâmetro de aproximadamente 10 nm e maiores. Ajustando a intensidade das partículas nucleares se controla a densidade dos poros formados na membrana. Nanotubos poderão ser formados na membrana gravada pelo depósito de um metal, tipicamente ouro ou prata, nos poros gravados através de um método de galvanização sem elétron (Menon et al., Anal Chem 67: 1920- 1928). Este método de deposição de metal usa um catalisador depositado na superfície do material do poro, que então imerso em uma solução contendo Au(I) e um agente redutor. A redução do Au(I) para Au metálico ocorre nas superfícies contendo o catalisador. A quantidade de ouro depositada depende do tempo de incubação que aumenta o tempo de incubação e diminui o diâmetro interno dos poros no material do filtro. Assim, o tamanho do poro poderá ser controlado pelo ajuste da quantidade do metal depositado no poro. A dimensão do poro resultante é medida usando várias técnicas, por exemplo, usando propriedades de transporte de gás por única difusão, ou medido o fluxo de íon através dos poros usando sistemas do tipo correção do ajuste. O material de suporte é deixado intacto, ou removido para deixar ouro nos nanotubos. A técnica de galvanização sem elétrons é capaz de formar tamanhos de poros menores que aproximadamente 1 nm à aproximadamente 5 nm em diâmetro, ou maiores se requerido. Nanotubos de ouro tendo diâmetro de poro de aproximadamente 0.6 nm surgem para distinguir entre Ru(bpy)2+2 e viologeno de metila, demonstrando seletividade dos nanoporos de ouro (Jirage et al., 1997, Science 278:655-658). Modificações na superfície de um nanotubo de ouro é prontamente acompanhada pela anexação de compostos contendo tiol para a superfície do ouro ou pela derivação do ouro com outros grupos funcionais. Este recurso permite a fixação de compostos modificadores do poro. Dispositivos, como aparelhos cis/trans usados com poros biológicos aqui descritos, poderão também ser usados com nanotubos de ouro para analisar as reações da ligação. Onde o modo de detecção envolver fluxo de corrente o componente deslocado (por exemplo, corrente da passagem de elétron), a membrana em estado sólido poderá ser metalizada por várias técnicas. Uma camada condutiva poderá ser depositadas em ambas as laterais da membrana para gerar eletrodos adequados para interrogar os componentes através da corrente de passagem de elétron.

Em algumas configurações , a camada condutiva poderá ser depositada em uma superfície da membrana para formar eletrodos apropriados para interrogarem os componentes através do poro, por exemplo corrente de passagem de elétron transversa. Vários métodos para o depósito de materiais condutivos são conhecidos, incluindo deposição precipitada (ou seja deposição de vapor físico), deposição não eletrolítica (como por exemplo suspensões coloidais) e deposição eletrolítica. Outras técnicas de disposição de metal incluem, entre outras, evaporação do filamento, evaporação da camada metálica, evaporação do feixe de elétron, evaporação do flash, e evaporação por indução. Em algumas configurações , a detecção de eletrodos poderá ser formada pela disposição precipitada, onde o feixe de íon bombardeia um bloco de metal e vaporiza átomos metálicos, que são então depositados em um material delgado na forma de uma película fina. Dependendo do método de litografia usado, as películas metálicas são então gravadas por meio de estampagem de íon reativo o u polido usando polimento mecânico-químico. Películas metálicas poderão ser depositadas nos poros pré-formados ou depositados antes da fabricação do poro.

Em algumas configurações , a detecção dos eletrodos poderá ser fabricada pela eletro-deposição (ver por exemplo, Xiang et al., 2005, Angew. Chem. Int. Ed. 44:1265-1268; Li et al., Applied Physics Lett. 77(24)-.3995-3997; e no Pedido de patente e Norte-Americano Publicado No. 2003/041189). Esses processos de fabricação são apropriados para a geração de um poro e correspondente detecção dos eletrodos posicionados em uma face da película em estado sólido, como para detectar a passagem de elétron transverso. Inicialmente, um convencional processo de litográfico é usado para formar um par de eletrodos revestidos em uma camada de dióxido de silicone, que é apoiada em um silicone delgado. Uma solução de eletrólito reveste os eletrodos, e os íons metálicos são depositados em um dos eletrodos pela corrente passando através do par de eletrodos. O depósito do metal nos eletrodos todo o tempo aumenta a distância da tenda entre os eletrodos, criando não somente a detecção dos eletrodos mas uma tenda dimensionada para a deslocação dos componentes na reação da ligação. A distância da fenda entre os eletrodos poderá ser controlada por um número de processos de regeneração. Em algumas configurações, a resposta para controlar a distância entre os dois eletrodos poderá contar na diferença potencial entre os dois eletrodos. Como a fenda entre os eletrodos diminui, as potências diferenças aumentam. Em outras configurações, o controle da distância entre os dois eletrodos usa a corrente de passagem do elétron através do par de eletrodos (Li et al., supra). Como a distância entre os eletrodos diminui, a corrente de passagem do elétron aumenta. O controle de regeneração usando a passagem de elétron é apropriado para a fabricação de eletrodos com distâncias de fenda de aproximadamente 1 nm ou menos, enquanto o controle de regeneração baseado no eletrodo da fenda potencial permite a fabricação de eletrodos tendo distâncias de fenda de aproximadamente 1 nm à aproximadamente 10 nm. A taxa de eletro-deposição depende da concentração do eletrólito e a corrente fluindo através dos eletrodos. Constante corrente poderá ser usada para formar camadas de metais nos eletrodos.

Em outras configurações , pulsos de corrente poderão ser usados para depositar um conhecido número de átomos metálicos nos eletrodos para cada ciclo de pulso, e dessa formar prover preciso controle sobre o processo de fabricação do eletrodo. Onde a detecção for baseada em efeitos de campo induzindo a carta de imagem, um dispositivo semicondutor poderá ser fabricado como descrito na patente e Norte-Americana No. 6.413.792 e no Pedido de patente e Norte- Americano Publicado No. 2003/0211502. Os métodos de fabricação desses dispositivos de detecção poderão usar similar técnicas daquelas empregadas para fabricar outros poros em estado sólido.

Em algumas configurações , o detector efeito de campo é feito usando um isolador em silicone que compreende um substrato de silicone com uma camada de dióxido de silicone e uma camada de silicone tipo-p (silicone lubrificante no qual a maioria dos condutores de carga são orifícios positivamente carregados). Um silicone raso tipo-n (silicone lubrificante no qual a maioria dos condutores de carga são orifícios negativamente carregados) a camada sendo formada na camada de silicone tipo-n que se estende através da camada tipo-n sendo formada em outra região do isolador em silicone. A remoção do substrato de silicone e das camadas de dióxido de silicone pela estampagem expõe o silicone tipo-p na face oposta à primeira camada rasa do tipo-n. Na face novamente exposta do silicone tipo-p, uma segunda camada rasa do tipo-n é formada, que conecta a camada de silicone do tipo-n que se estende através das camadas rasas do tipo-n e da camada de silicone do tipo-p sendo geraras por várias técnicas, por exemplo pela estampagem do íon ou litografia (por exemplo, feixe ótico ou elétron). Para diminuir o tamanho do poro, uma camada de dióxido de silicone poderá ser formada pela oxidação do silicone. As camadas metálicas são anexadas à primeira camada de silicone tipo-n formada e na camada de silicone tipo-n que se estende através do silicone tipo-p, formando a fonte de regiões de drenagem.

Em várias configurações aqui citadas para análise dos componentes na mistura, o poro poderá ser configurado em vários formatos. Em algumas configurações , o dispositivo compreende uma membrana, ou biológica ou em estado sólido, contendo o poro mantido entre dois reservatórios, também referidos como câmaras eis e trans (ver por exemplo a patente e Norte-Americana No. 6.627.067). Um condutor para a migração do elétron entre as duas câmaras permite o contato elétrico das duas câmaras, e uma voltagem polarizada entre as duas câmaras poderá dirigir a deslocação do componente de ligação através do poro. Uma variação desta configuração é usada na análise da corrente fluindo através dos nanoporos biológicos , como descrito na patente e Norte-Americana No; 6.015.714 e 6.428.959; e Kasianowiscz et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:13770-13773, cujas inteiras revelações são incorporadas ao presente pedido para referência. Variações do dispositivo acima são ainda reveladas no Pedido de patente e Norte-Americano No. 2003/04118 9. Nessas configurações , um par de nanoeletrodos fabricados por eletro-deposição é posicionado em uma superfície do substrato. Os eletrodos parelhados um ao outro e tem uma distância de fenda suficiente para a passagem do componente a ser analisado. Um material isolante protege os nanoeletrodos, expondo somente os extremos dos eletrodos para finalidades de detecção. O material isolante e os nanoeletrodos separam uma câmara servindo com um reservatório de amostra e uma câmara para a qual o componente a ser analisado é liberado para deslocação. O cátodo e os eletrodos anodos provêm um campo elétrico para direcionar a deslocação da câmara de amostra para a câmara de liberação. A corrente polarizada usada para direcionar a deslocação através do poro poderá ser gerada pela aplicação de um campo elétrico através do poro. Em algumas configurações, o campo elétrico é uma voltagem constante ou corrente polarizada constante. Em outras configurações , a deslocação dos componentes poderão ser controlados através de uma operação pulsada dos parâmetros campo elétrico eletroforese (ver por exemplo, o Pedido de patente e Norte- Americano No; 2003/141189 e a patente e Norte-Americana No. 6.627.067). Os pulsos da corrente poderão prover um método de precisa deslocação para um definido período de tempo através do poro e em algumas instâncias, para sumariamente manter o componente no interior do poro, e dessa forma prover maior resolução da propriedade elétrica do componente sendo analisado.

Os dispositivos de poro poderão ainda compreender uma campo elétrico ou eletromagnético para restringir a orientação do componente quando ele passar através do poro. Este campo de retenção poderá ser usado para diminuir o movimento das moléculas no interior do poro. O movimento do componente na região de detecção poderá aumentar o ruído de fundo do sinal detectado. Por exemplo, quando a corrente bloqueada é medida, o movimento de um polímero no interior do poro é semelhante ao resultado nas variações do fluxo da corrente. Similarmente, onde a detecção mede a corrente de passagem de elétron, o sinal da corrente é similar para ser sensitiva à orientação espacial do componente detectado relativo aos eletrodos de detecção. Pela retenção ou restrição da orientação das moléculas como são deslocadas através do nanoporo, variações no sinal detectado poderá ser minimizado.

Em algumas configurações, um campo elétrico que é ortogonal à direção da deslocação poderá ser usado para restringir o movimento dos componentes, como os polímeros, no interior do poro. Isto é ilustrado na Publicação do Pedido de patente e Norte-Americano No. 2003/014189 através do uso de duas placas condutivas paralelas acima e abaixo da placa de mostra. Esses eletrodos geram um campo elétrico ortogonal à direção da deslocação, e assim mantendo o componente em uma das placas da amostra. Por exemplo, uma coluna vertebral negativamente carregada de um DNA, ou ácido nucléico modificado para ter cargas negativas em um filamento, poderá ser orientada na placa anódico e assim limitando o movimento do polinucleotídeo. O uso análogo de uma campo elétrico ortogonal para manter um componente em uma limitada orientação para detecção é descrito na patente e Norte-Americana No. 6.627.067. Nesta incorporação, os eletrodos posicionados para gerar um campo elétrico ortogonal à direção de deslocação são usados para manter o componente em uma ranhura, onde a amostra é interrogada com uma sonda (por exemplo, sonda da passagem do eletrodo). Similar ao controle do campo elétrico para direcionar o transporte através de um poro, o campo elétrico ortogonal poderá ser controlado em relação à duração e amplitude do campo retido. O campo elétrico usado para a deslocação é coordenado com o campo elétrico usado para manter o componente a ser detectado em uma restrita orientação para precisamente controlar a deslocação através do poro.

Em algumas configurações , o controle da posição do componente no poro poderá ser realizado pelo método descrito na Publicação do Pedido de patente e Norte-Americano No. 2004/0149580, que emprega um campo eletromagnético criado no poro através de uma série de eletrodos posicionados próximos do ou no poro. Nessas configurações um conjunto de eletrodos aplica uma corrente de voltagem direta e radio freqüência potencial enquanto um segundo conjunto de eletrodos aplica uma voltagem de corrente direta oposta e uma rádio freqüência potencial que é fase alterada por 180 graus com relação à rádio freqüência potencial gerada pelo primeiro conjunto de eletrodos. Esta rádio freqüência quádrupla é esperada para reter uma partícula carregada (por exemplo, um receptor de célula) no centro do campo (ou seja, no centro do poro). A retenção da deslocação do componente no meio do poro é prognosticada para reduzir a variação do fluxo do eletrodo através de um poro e ainda poderá prover consistência na corrente medida pela passagem do elétron. É sugerido que alterando-se a amplitude da rádio freqüência quádrupla poderá também ser usada para forçar um componente à uma lateral do poro e assim vagarosamente a taxa de deslocação.

2.3 Usos dos Métodos de Análise das Interações de Ligação Como aqui descrito, os métodos poderão ser usados na análise da interação da ligação envolvendo uma variedade de componentes. Assim o componente receptor poderá ser qualquer agente que possa ligar um componente de ligação e vice versa.

Em algumas configurações , o componente de ligação, componente receptor, ou ambos componentes de ligação e receptor poderão compreender uma pequena molécula orgânica. Em várias configurações , uma pequena molécula orgânica poderá compreender qualquer componente orgânico, incluindo entre outros, alcilas, heteroalcilas, cicloalcilas, heterocicloalcilas, arilas, heteroarilas, ari-arilas, arila policíclicos, sistemas de anéis fundidos, e sistemas de anéis construídos. Exemplares compostos cicloalcila incluem, mas não se limitam à, ciclopropila, ciclobutila, como ciclobutanila e ciclobutenila, ciclopentilas como ciclopentanila e ciclopentenila; ciclohexila como ciclohexanila e e compostos baseados em ciclohexenila. Exemplares compostos heterocicloalcilas poderão incluir, mas não limitar, tetrahidrofuranila (por exemplo, tetrahidrofuran-2-ila, tetrahidrofuran-3-ila, etc.), piperidinila (por exemplo, piperidina-1-ila, piperidina-2-ila,etc.), morfolinila, (por exemplo, morfolina-3-ila, morfolina-4-ila, etc.), compostos baseados em piperazinila (por exemplo, piperazina-1-ila, piperazina-2-ila, etc.). Exemplares arilas incluem, mas não se limitam à, compostos baseados em acenatileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benzeno, criseno, coroneno, fluorateno, floureno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, indaceno-as, indaceno-s, indano, indeno, naftalina, octaceno, octafeno, octaleno, penta-2,4-dieno, pentacenom pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftalina, e outros, bem como vários hidro isômeros dos mesmos. Em algumas configurações , o composto arila compreende uma arila (C5-Ci5), ou arila (C5-Ci0). Exemplares compostos arila poderão compreender ciclopentadienila, fenila e naftila. Exemplares compostos heteroaromáticos poderão compreender composto baseados entre outros, acridina, benzimidazola, benzisoxazola, benzodioxano, benzofurano, benzopirona, benzotiadiazola, benzotiazola, benzotriazola, benzoxaxina, benzozazola, benzoxazolina, carbazola, carbolina-β, cromano, cinolina, furano, imidazole, indazole, índole, indolina, indolizina, isobenzofurano, isocromeno, isoindolina, isoquinolina, isotiazole, isoxazole, naftridina, oxadiazole, isoindole, isoindolina, isoquinolina, isotiazole, isoxazole, naftiridina, oxadiazoel, oxazole, perimidina, fenantridina, fenantrolina, ftalazina, purina, pirana, pirazina, pirazole, pirazidina, piridina, pirimidina, pirole, pirolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxaüna, tetrazole, tiadiazole, tiazole, e xantene.

Em várias configurações , a pequena molécula orgânica poderá compreender um composto orgânico de aproximadamente 100 à aproximadamente 4000 Daltons, ou aproximadamente 500 à 3000 Daltons. A molécula poderá ser de qualquer tipo ou classe de compostos, incluindo entre eles, pesticidas, hormônios, vitaminas, antibióticos, compostos antivirais, compostos e drogas farmacêuticas, e inibidores de enzimas. Outras pequenas moléculas orgânicas adequadas para a finalidade aqui proposta serão aparentes para um especialista no assunto, conhecedor do estado da técnica.

Em algumas configurações , o componente de ligação, o componente receptor, ou ambos, poderão compreender um carboidrato. Como usado aqui, "carboidrato" refere-se à compostos que contém oxigênio, hidrogênio, e átomos de carbono e são relativos à fórmula química genérica Cn(H2O)n ou derivados dos mesmos.

Em várias configurações , o carboidrato poderá ser independente de outros compostos ou associado à outros compostos, como lipídios, poliptídeos, e ácido nucléicos. Os carboidratos poderão ser monosacarídeos, disacarídeos, oligasacarídeos e polisacarídeos. Os monosacarídeos poderão compreender aldoses, que tem um grupo aldeído no primeiro átomo de carbono e cetoses que tipicamente tem o grupo cetona no segundo carbono. Eles poderão ainda ser classificados nos trioses, tetroses, pentoses, hexoses, e outros, dependendo do número de átomos de carbono que eles contém. Exemplares monosacarídeos incluem gliceraldeído, eritose, treose, ribose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, glicose, manose, gulose, idose, galactose, e talose. Em algumas configurações , os carboidratos poderão compreender disacarídeos, que são compostos de duas unidades de monosacarídeos ligados juntos por um Iigador glicosídico covalente. Comum disacarídeos incluem, entre outros, celobiose, maltose, gentobiose, trealose, sacarose.

Em outras configurações , o carboidrato poderá compreender oligosacarídeos e polisacarídeos, que são compostos de grandes cadeias de unidades de monosacarídeos ligadas juntas pelos Iigadores glicosídicos. A distinção entre os dois é baseada no número de unidade de monosacarídeos presentes na cadeia.

Os oligosacarídeos tipicamente contém entre três e nove unidades monosarídeos, e os polisacarídeos contém mais do que dez unidades de monosacarídeos Os oligosacarídeos são encontrados como forma comum de modificação de proteína pós-translacional. Os polisacarídeos incluem, entre outros, amido, celulose, quitina e glicogênio. Vários componentes receptores que ligam carboidratos são conhecidos pelo estado da técnica, e serão ainda descritos a seguir.

Em algumas configurações , o componente de ligação, o componente receptor, ou ambos, o componente de ligação e receptor poderão compreender um lipídio ou ácido gorduroso. Como usado aqui um "lipídio" se refere à um hidrocarbono baseado em moléculas que são não polares ou hidrofóbicas e sendo geralmente solúveis a solventes não polares. Os lipídios ainda incluem moléculas antipáticas ou anfifílicas, que são caracterizadas pela presença tando de partes hidrofóbicas como hidrofílicas. Os lipídios poderão ser acíclicos ou cíclicos, planos ou ramificados, saturados ou não saturados. As classes dos lipídios incluem, como exemplo, ácidos gordurosos, glicerídeos, e não glicerídeos.

Ácidos gordurosos referem-se à um ácido orgânico com uma parte hidrofóbica, como uma cadeia alifática, podendo ser saturado ou não saturado. Exemplares ácidos gorduroso saturados incluem entre outros, butírico, láurico, (ácido dodecanóico) mirístico (ácido tetradecanóico), palmítico (ácido hexadecanóico) esteárico (ácido octadecanóico) e aracídico (ácido eicosanóico) e ácidos gordurosos. Exemplares ácidos gordurosos incluem entre outros, ácido linoléico, ácido docosahexaénico, ácido eicosatenaenóico, ácido linoléico, ácido oléico e ácido erúcico. Ácidos gordurosos não saturados poderão ter configuração eis ou trans.

Os glicerídeos ou glicerolipídios se referem à ésteres formados do glicerol e ácidos gordurosos. Os glicerídeos podem ser na forma de monoglicerídedos, diglicerídeos, ou triglicerídios. Os glicerídeos também incluem fosfoglicerídeos, ou glicerofosfolipídios, que compreendem ácido fosfórico 3-glicero-sn que contém ao menos acila-O, alcila-O, resíduo de alca-0-1'enila anexado ao quinhão de glicrol e uma cabeça polar feira de uma base de nitrogêncio, um glicerol, ou um uma unidade de inositol. Os não glicerídeos incluem, entre ou tros, esfingolipídios, esteróis (por exemplo, colesterol, estrógeno e testosterona), prenóis, (por exemplo, terpenóides) e policetidas. Os lipídios poderão estar presentes independentemente de outras moléculas, ou não covalente ou covalentemente anexados à outras moléculas. Por exemplo, os lipídio s poderão se apresentar na forma de micelas ou anexados covalentemente à uma proteína carboidrato.

Em algumas configurações , o componente de ligação, o componente receptor, ou ambos, poderão compreender polipeptídio. Como usado aqui "polipeptídio" é usado permutável com os termos "peptídeo", "oligopeptídio" e "proteína" e se refere a ao menos dois aminoácidos conectados por uma ligação de amido. O polipeptídio poderá de qualquer comprimento, linear o u circular, ou compreender estruturas ramificadas, como por exemplo, polipeptídios ubiquinatados. Os termos "polipeptídio", "peptídeo", "oligopeptídio" e "proteína" incluem aqueles com aminoácidos L e D, e misturas de aminoácidos L e D. Os aminoácidos no polipeptídio poderão compreender geneticamente aminoácidos codificados, mas também compreendem ou inteiramente ou em parte, a natural ocorrência de aminoácidos não codificados e/ou sintéticos. Comumente encontrados os aminoácidos não codificados incluem, mas não se limitam à ácido diaminopropiônico-2,3; ornitina, citrulina, homolisina, fosfoserina, fosfotreonina, ácido homoaspártico, ácido homoglutânico. Homoalanina , norvalina, homoleucina, homovalina, homoisolencina, homoarginia, homocisteina, homoserina, hidroxiprolina e homoprolina. Adicionais aminoácidos serão aparentes para um especialista no assunto conhecedor do estado da técnica (ver por exemplo, os vários aminoácidos providos em Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Boca Raton, FL, at pp. 3-70 e as referências aqui citadas que são incorporadas para referência.

Em algumas configurações , o componente de ligação, o componente receptor, ou ambos poderão compreender vários polipeptídios análogos.

Como aqui usado o termo "polipeptídio análogos" se referem à quaisquer polipeptídios nos quais a ligação de amido é substituída com um isóstere de uma ligação de amido ou ligações de amido substitutas. Em várias configurações , os substituintes das ligações de amido, incluem, mas não se limitam à grupos da fórmula -C(O)NR2, onde R2 é (C1-C6) alcila, (C5-C10) arila, substituído (C5-C10) arila, substituído (C5-C10) arila, (C6-C16) arilaalcila, substituído (C6-C16) arilalcila, 5-10 heteroarila membrada, substituída heteroarila 5-10 membrada, heteroarilalcila membrada 6-16 ou h eteroarilalcida membrada 6-16 substituída. Em uma específica configuração, R2 é (C1-C6) alcanila, (C2-C6) alcenila, (C2-C6) alcinila ou fenila. Isósteres de amidas geralmente incluem, mas não se limitam à, -NR3-SO-, -NR3-S(O)2-, -CH2-CH2-, -CH=CH (eis e trans), -CH2- NH- , -CH2-S-,-CH2-O-, -C(O)-CH2-, -CH(OH)-CH2-e -CH2-S(O)2-, onde R3 é hidrogênio ou R2 e R2 é como acima definido. Essas interligações poderão ser incluídas nos polipeptídios em uma polaridade ou na reversa polaridade.

O peptídio análogo inclui ligações não amido, como métodos de sintetizar os referidos análogos que são bem conhecidos (ver por exemplo, Spatola, 1983, "Peptides and Proteins, Weinsten, Ed. Mareei Dekker, New York, pp. 267- 357;Morley , 1980, Trends Pharm. Sei. 1:463-468; Hudson et al; 1979, Int. J. Prot. Res. 14:177-185 (-CH2-NH-, -CH2-NH-, CH2-CH2); Spatola et al., 1986 , Life Sei: 38:1243-1249; Spatola, 1983, "Peptide Backbone Modifications: the Ψ [CH2S] Moiety as an Amide Bond Replacemente", In: Peptides: Structure and Function V, J. Hruby and D.H. Rich, Eds, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Pp341 -344 (-CH2 -S-); Hann. 1982, J. Chem. Soe. Parkin Trans. /. 1:307-314 (- CH =CH eis and trans); Almquist et al., 1980, J. Med. Chem . 23:1392-1398 (- C(O)-CH2-) ; European patente Application EP 45665; Chemical Abstracts CA 97:39405 (-CH(OH)-CH 2; Holladay et al., Tetra hedron Lett. 24:4401-4404 (-CH (OH)-CH2-); and Hruby, 1982, Life Sei. 31:189-199(-CH2-S-). Alternativamente, uma ou mais ligações de amido poderão ser substituídas com peprodomimético e/ou quinhões de amido mimético. Exemplo não Iimitativos desses quinhões são descritos em detalhes em Olson et al., 1993, J. Med. Chem. 36:3039-3049; Ripka & Rich, 1998, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:441-452; Borchardt et al., 1997, Adv. Drug. Deliv. Rev. 27:235-256 e várias outras referências aqui citadas.

Em algumas administrações, os polipeptídios poderão compreender um retro peptídio ou retro peptídio análogo. Um "retro peptídio" ou "retro peptídio análogo" se referem à um peptídio ou peptídio análogo tendo uma primária seqüência que o seu reverso (na direção N + C) da primária seqüência de um peptídio parente ou peptídio análogo.

Em algumas configurações , os polipeptídios compreendem um peptídio reverso ou um peptídio reverso análogo. Um "peptídio inverso" ou "peptídio inverso análogo" se refere à um peptídio ou peptídio análogo tendo uma primária seqüência que seja idêntica à de um correspondente peptídio parente ou peptídio análogo, mas no qual todos carbonos quiral-α que se encontram na configuração oposta. Em algumas configurações , os polipeptídios poderão compreender u m peptídio retro-inverso ou peptídio retro inverso análogo.

Um "peptídio retro inverso" ou "peptídio retro infverso análogo" se referem à um peptídio o u peptídio análogo tendo características combinadas de um retro peptídio ou de um retro peptídio análogo e um peptídio inverso ou peptídio inverso análogo, como acima definido. Os peptídios retro análogos se ligam à um correspondente peptídio parente ou um peptídio análogo por pela inversão da ordem da seqüência primária (na direção N + C) e a alteração d quiralidade de um carbono-ade um correspondente peptídio parente ou peptídio análogo. Classes de polipeptídios adequados nos métodos ora incluídos, entre outros, enzimas, receptores celulares, proteínas de ligação de DNA, proteínas de ligação de DNA, anticorpos , proteínas de ligação de lipídios, proteínas de transformação de sinais, hormônios peptídios e antibióticos peptídios. Outras classes de polipeptídios adequados como componente receptor ou de ligação, ou ambos, poderão compreender um polímero núcleo-base. Como usado aqui "polímero núcleo-base" ou "oligômero núcleo-base" se referem à dois ou mais núcleos-base que são conectados por ligações que permitem um polímero núcleo-base resultante ou oligômero para mestiçar um polinucleotídeo tendo uma seqüência núcleo-base complementar. Os polímeros núcleo-base ou oligômeros incluem, mas não se limitam à poli e oligonucleótidos (por exemplo polímeros e oligômeros DNA e RNA), poli e oligonucleótidos análogos e poli e oligonucleótidos mímicos, como polamida ou ácidos nucléicos peptídios. Os poímeros núcleo-base ou oligômeros poderão variar em tamanho à partir de pequenos núcleo-base de 2 à 40 núcleos-base, 10 à 25 núcleos-base, 12 à 30 núcleos-base, ou 12 à 20 núcleos-base, para várias centenas de núcleos-base, para vários milhares de núcleos-base, ou mais. "Núcleo-base" ou "base" se referem àqueles que naturalmente ocorrem e quinhões heterocíclicos sintéticos, comumente conhecidos para aqueles que utilizam o ácido nucléico ou tecnologia polinucleótida ou utilizam poliamida ou ácido nucléico peptídio para então gerar polímeros que possam mestiçar os polinucleótidos de uma maneira específica seqüencial. Exemplos não Iimitativos de adequados ácidos nucléicos incluem, adenina, citosina, guanina, timina, uracil , uricil-propinil-5, uracil-propinil-5-2-tio, metilcitosina-5, pseudoisocitosina, tiou racil-2 e tiotimina-2, aminopurina-2, N9(amino-2, cloropurina-6), N9-(diaminipurina-2-6), hipoxantina, isoguanina (iG), N9-7 (deaza-guanina), N9-(7-deaza-8-aza-guanina),e N8-(7-deaza-8-aza- adenina). Outros exemplos não Iimitativos de adequados núcleos-base incluem aqueles núcleos-base ilustrados nas Figuras 2(A) e 2(B) de Buchardt et al. (WO 92/20702 e WO 92/20703).

Em algumas configurações , o polímero núcleo-base compreende um polinucleótido ou oligonucleótido. Como usado aqui, "polinucleótido" ou "oligonucleótido" se referem à um polímero núcleo-base ou oligômero nos quais os núcleos-base são conectados por ligações de fosfato de açúcar (suporte principal de fosfato de açúcar). Exemplares poli e oligonucleótidos incluem polímeros de deoxiribubucleótidos-2' (DNA) e polímeros de ribonucleótidos (RNA). Um polinucleótido poderá ser composto inteiramente de ribobucleótidos, inteiramente de deoxibonucleótidos-2' ou combinações dos mesmos. Em algumas configurações , o polímero núcleo-base poderá compreender u m polinucleótido ou oligonucleótido análogo. Como aqui usado "polinucleótido ou oligonucleótido análogo" se referem à um polímero núcleo-base ou oligômero nos quais os núcleos-base são conectados por um suporte principal de fosfato de açúcar compreendendo um ou mais fosfatos de açúcar análogos. Típicos fosfatos de açúcar análogos, incluem mas não se limitam à, um ou mais fosfatos de açúcar análogos. Típicos fosfatos análogos, não se limitam à, alcilafosfonatos de açúcar, fosforamiditas análogos, alcila de açúcar ou alcilafosfotriesteres substituídos, fosforotiatos de açúcar, sendo outros como deoxiribose-2', ou ribose, polímeros núcleo-base tendo interligações de guanidila de açúcar carregadas positivamente, como aquelas descritas nas patente es Norte- Americanas No. 6.013.785 e No. 5.969.253 (ver também, Dagani 1995, Chem Eng Newa 4-5:1153; Dempey et al., 1995, J Am Chem Soc 117:6140-6141). Referidos análogos carregados positivamente, nos quais o açúcar é deoxiribose- 2' são referidas como "DNGs", onde aqueles nos quais o açúcar é ribose sendo referidos como "RNGs". Especificamente incluídos na definição de poli- e oligonucleótidos análogos são ácidos nucléicos bloqueados (LNAs, ver por exemplo Elayadi et al., 2002, Biochemistry 41:9973-9981; Koshkin et al., 1998, J Am Chem Soc 120:132-52-3; Koshkin et al., 1998, Tetrahedron Letters 39:4381- 4384, Jumar et al., 1998, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8:2219:2222; Singh and Wengel, 1998. Chem Commun 12:1247-1248; WO 00/56746; WO 02/28875 ; e WO 01/48190. todos os quais aqui incorporados para referência).

Em algumas configurações , o polímero núcleo-base poderá compreender um polinucleótido ou oligonucleótido mímico. Como usado aqui, "polinucleótido ou oligonucleótido mímico" se referem à um polímero núcleo-base ou oligômero no qual uma ou mais ligações de suportes principais de fosfato de açúcar são substituídas por um fosfato de açúcar análogo. Referidos mímicos são capazes de mestiçar completamente os polinucleótidos ou oligonucleótidos, ou polinucleotídeos ou oligonucleotídeos análogos ou para outros polinucleótidos ou oligonucleotídeos mímicos e que poderão incluir suportes principas (espinhas dorsais) compreendendo uma ou mais das seguintes ligações: suporte principal de poliamida positivamente carregada com cadeias laterais de alcilamida como descrito nas patente es Norte-Americanas No. 5.786.461; No.5.776.855; No. 5.719 .262; No. 5.539.082 e WO 98/03542 (ver também Haaima et al, 1996, Angewandte Chemie lnt'l Ed. In English 35:1939-1942; Lesnick et al., 1997, Nucleosid. Nucleotid, 16:1775-1779; DOosta et al., 1999, Org Lett 1: 1513-1516, ver também Nielsen 1999, Curr Opin Biotechnol 10:71- 75); suportes principais (espinhas dorsais poliamidas não carregadas como descrito em WO 92/20702 e na patente e Norte-Americana No. 5.539.082; suportes principais de fosforamidato-morfolino não carregado como descrito nas patente es Norte-Americanas No. 5.698.685; No. 5.470.974. No. 5.378.841 e No. 5.185.144 (ver também, Wages et al., 1998, BioTechniques 23:1116-1121); suportes principais (espinhas dorsais) de ácido nucléico mímico baseados em peptídio (ver por exemplo a patente e Norte-Americana No. 5.698.685), suportes principais de carbamato (ver por exemplo, Stirchak & Summerton, 1987, J Org Chem 52:4202), suportes principais (espinhas dorsais) de amido (ver por exemplo, Lebreton, 1994, Synlett. 1994:137); suportes principais de amina metilahidroxila (ver por exemplo, Vasseur et al., 1992, J Am Chem Soc 114:4006); suportes principais de tioformacetal-3' (ver por exemplo, Jones et al., J Org Chem 58:2983) e suportes principais de sulfamato (ver por exemplo a patente e Norte-Americana No. 5.470.967). Todas as precedentes publicações são incorporadas ao presente pedido para referência.

Em algumas incorporação, os polímeros núcleo-base poderão compreender um polímero núcleo-base quimérico. Um "polímero núcleo-base quimérico" ou "oligonucleótido quimérico" se referem à um polímero núcleo-base ou oligômero compreendendo uma pluralidade de diferentes polinucleótidos, polinucleótidos análogos, e polinucleótidos mímicos. Por exemplo, um oligo quimérico poderá compreender uma seqüência DNA ligada à uma seqüência RNA. Outros exemplos de Iigos quiméricos incluem uma seqüência de DNA ligada à uma seqüência PNA, e/ou uma seqüência RNA ligada à uma seqüência PNA.

Uma vez que quaisquer tipos dos compostos acima poderão ser parte de uma interação de ligação, vários tipos de interações de ligações poderão ser examinadas usando os métodos aqui citados. Essas incluem interações, entre outras, pequena molécula - pequena molécula; pequena molécula - polipeptídio, pequena molécula - polímero núcleo-base, polipeptídio - polipeptídio, polipeptídio - polímero núcleo-base, polímero núcleo base - polímero núcleo- base, proteína lipídio - ácido nucléico lipídio. Exemplos de interações de pequena molécula - pequena molécula, incluem entre outras, a interação de clatratos com suas correspondentes moléculas hóspedes. Um exemplar clatrato é ciclodextrina, que são oligosacarídios cíclicos geralmente compostos de 5 ou mais unidades de glucopiranisida. Em algumas configurações , as ciclodextrinas poderão conter monômeros de glicose abrangendo de seis à oito unidades, como ciclo-dextrina-α, uma molécula anelar de seis membros , ciclodextrina-β, uma molécula anelar de sete membros,; e ciclodextrina-y , e uma molécula anelar de oito membros. As ciclodextrinas poderão ligar outras pequenas moléculas orgânicas, incluindo entre outras, triclorfone inseticida, colesterol e outros esteróis, e várias drogas lipofílicas (por exemplo, albendazole, mebendazole, digitoxina, ibuproxam, piroxicam, levenopamil, sulindac e danazol). Outro exemplar clatrato éter de copa, que geralmente são oligômero cíclico de óxido de etileno, ou seja, -CH2CH2O- e caracterizado por sua habilidade para cátions de solvato através de átomos de oxigênio que coordenam com o cátion a parte interna do anel. O tamanho do interior da copa poderá determinar o tamanho do cátion que ele poderá solver, como uma copa- 18-6 ligando um cátion de potássio, uma copa-15-5 ligando um cátion de potássio e uma copai 2-4 ligando um cátion de lítio.

Em algumas configurações , os métodos poderão ser usados para analisar as interações da ligação entre uma pequena molécula e uma proteína. Exemplos de interações de pequena molécula - proteína incluem entre outras, interações de ésteres forbol com ésteres receptores forbol; interações de estrógeno e estrógeno análogo com estrógenos análogos, interações de testosterona com receptores andrógenos, interações opiata com receptores opiata, interações de tetraciclina ou doxiclina com transativador controlado Tet (tTAO, interações de manose com proteína de ligação manose, interações de glicano ligados com conconavalina A; interação de galactosida-β com galectinas, interações de maltose com proteína de ligação de maltose (MalE); interações de arabinose com proteína de ligação arabinose, interações dopamina com receptor dopamina, e interações de serotonina com receptor 5-H.

Em algumas configurações, os métodos poderão ser usados para analisar as interações de ligação entre uma pequena molécula e um polímero núcleo-base. Exemplos de pequenas moléculas que interagem com os polímeros núcleo-base incluem, entre outras, intercaladores de DNA (como por exemplo brometo de etídio, DAPY, aminoacridina, laranja acridina, proflavina, daunocina, actinomicina, YO, e YOYO, etc.); drogas cis-platina (por exemplo, cis- diaminedicloroplatina), benzipireno, topotecano, canfotecina, netropsina, pirole- imidazole (Py-Im) poliamidas, e clorambucil. Outras pequenas moléculas capazes de interagirem com polímeros núcleo- base se tornarão aparentes para um especialista no assunto, conhecedor do estado da técnica. Uma variedade de polipeptídios são conhecidos para se ligarem à outros polipeptídios, incluindo a ligação à polipeptídios modificados, como polipeptídios fosforilatados ou lipidatados.

Em algumas configurações , as interações polipeptídio - polipeptídio poderão ocorrer através da interação do campo da interação da proteína. Assim, os métodos poderão ser usados para examinar interações entre polipeptídios com várias proteínas - interação dos domínios e seus campos receptores cognatos. Exemplar interação do campo da proteína - proteína inclui e não inclui limitação, domínios SH2 (domínio da homologia src), domínio SH3 (domínio da homologia 3 src), domínio PTB (domínio da ligação de fosfotirosina). Domínio FHA (domínio associado bifurcado), domínio WW, domínio 14-3-3, domínio da homologia pleckstrin, domínio Cl, domínio C2, domínio FYVE ( Fab-1, YGL023, Vps27, e EEA1), domínio decadente, domínio do efeito decadente, domínio do recrutamento da caspase, domínio da hmologia Bc1-2, domínio do bromo, domínio modificador da organização da cromatina, domínio caixa F, domínio hect., domínio anel (Zn+ domínio de ligação do dedo), domínio PDZ (grandes discos PSD-95 e domínio dos absorvedores de zona), domínio de motivo estéril) domínio da ancrina, domínio do braço, (motivo repetido do tatu), domínio W40 e manual-EF, (calretinina) e domínio PUB (Suzuki T et al., 2001, Biochem Biophys Commun 287: 1083-87).

Em algumas configurações , os métodos poderão ser usados para analisar as interações de polipeptídio - polímero núcleo-base. Exemplos de polipeptídios que poderão interagir com polímeros núcleo-base, incluem, entre outros, peptídio distamicina A, peptídios anfipáticos sintéticos Ac-(Leu-Ala-Arg-Leu)3-NH- ligador, e o 3^10-Helix Ac-(Aib-Leu-Arg)4-NH contendo o ligador (beta) construtor de procedimentos [alfa] ácido aminoisobutírico (Aib). Em outras configurações , as proteínas que interagem com os polímeros núcleo-base compreendem vários polipeptídios envolvidos em metabolismo de ácido nucléico, como por exemplo, ativadores de transcrição, acentuadores de ligação de proteínas, inibidores de transcrição, proteína de modelagem de cromossoma, proteínas replicadoras de DNA, etc. Similar ao domínio das interações proteína - proteína, muitas proteína de ligação de polímeros núcleo-base interagindo com o polímero através de específicos domínios de comum estrutura e função. Exemplares domínios de interação incluem, por exemplo, domínio de hélice rotação de hélice, hélice procedimento de hélice, domínio de zíper leucina, domínio de caixa homeo, domínio de dedo Zn+2, domínio parelho, domínio LIM, domínio ETS, e domínio de caixa T. Exemplares proteínas de ligação de nucleotídeo, incluem, entre outros, G AL-4, λ Cro-proteína, complexo Jun/Fos. GCN-4, CREB, receptor-X-retinóide, receptor retinóide, receptor de Vitamina D, proteínas krupple TFIIA, antp, Ubx, myc, NH-K, Stat (por exemplo, Stat 1, Stat 2, Stat 3, Stat 4, Stat 5, etc.), proteínas caixa MADS, proteínas de ligação TATA, proteína retinoblastoma, histones (por exemplo, H1, (H5), H2A, H2B, H3 e H4), proteína de ligação de desacordo (por exemplo Cel I), topoismerases, endonuclease ABCuvr, enzima foto-reativante, proteína de ligação de filamento único (ssb), e recA.Outras proteínas de ligação aplicados aos métodos da invenção serão aparentes para um especialista, conhecedor do estado da técnica.

Em algumas configurações , os métodos poderão ser usados para analisar as interações de polímero núcleo-base - polímero núcleo base. Como acima discutido, os polímeros núcleo-base incluem polinucleotídeos, polinucleotídeos análogos,e polinucleotídeos miméticos.

Em algumas configurações , onde o componente receptor recebver um polinucleotídeo, como um oligonucleotídeo, o componente de ligação compreenderá um substancialmente complementar oligonicleotídeo ou polinucleotídeo. Como usado aqui, o termo "substancialmente complementar" se refere à uma seqüência de polímero núcleo-base capaz de especificamente mestiçar uma complementar seqüência sob condições usadas para fortalecer ou mestiçar o polímero núcleo-base. Como usado aqui, "fortalecimento" e "mistificação" se referem à interações de base parelhas de um polímero núcleo- base com outro resultando na formação de uma estrutura de duplo filamento, uma estrutura triplex ou outras estruturas formadas entre os polímeros núcleo- base através das interações parelhas. O fortalecimento ou mistificação poderão ocorrer através da interações de base parelhas Watson-Crick, mas poderão ser mediadas por outras interações de ligação de hidrogênio, como parelhas baseadas em Hoogsteen. Em algumas configurações , as características do fortalecimento de um polímero núcleo-base poderão ser determinadas pelo complexo híbrido Tm. O maior valor Tm, o mais estável dos híbridos. Tm é a temperatura na qual 50% de um oligômero núcleo-base e seu perfeito complemento formam uma estrutura de oligômero de duplo filamento. ) Tm para polímero núcleo-base selecionado também varia com fatores que influenciam o efeito de mistificação. Por exemplo, os referidos fatores incluem, mas não se limitam à, fatores comumente usados para impor ou controlar a severidade da mistificação (ou seja a concentração de formamida (ou outro desnaturante reagente químico) concentração de sal, (ou seja resistência iônica), temperatura da mistificação, concentração de detergente, pH e a presença ou ausência de caotropes. A severidade ideal para formar uma combinação híbrida poderá ser encontrada pela técnica muito conhecida de várias fixações das severidades dos fatores acima mencionados e então determinando o efeito de variação de da severidade de um único fator. A mesma severidade dos fatores poderá ser modulada para controlar a severidade da mistificação de um PNA à um esqueleto, exceto que a mistificação de um PNA for razoavelmente independente da resistência iônica. As condições ideais ou adequadas da severidade poderão ser experimentalmente determinadas pelo exame de cada fator de severidade até o grau desejado de descriminação tiver sido alcançado.

Os valores Tm para os oligômeros núcleo-base poderão ser calculados usando métodos conhecidos para as temperaturas de fundição prognosticadas (ver por exemplo, Baldino et al., Methods Enzymology 168:761-777; Bolton et ai., 1962, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:1390; Bresslauer et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:8893-8897; Freier et al., 1986, Proc. Natl. Acad. USA 83: 9373-9377; Kierzek et al., Biochemistry 25:7840-7846; Rychlik et al., Nucleic Acids Res Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Suggs et al., 1981, In Developmental Biology Using Purified Genes (Brown et al, eds.), pp 683-693, Academic Press; and Wetmur, 1991, Crit Rev Biochem Mol Biol 26:227-259, todas publicações incorporadas ao presente pedido para referência).

Em algumas configurações, o substancialmente complementar oligunueleotídeo ou polinucleotídeo poderá compreender ao menos um nucleotídeo não emparelhado como oligonucleotídeo ou polinucleotídeo receptor. Os métodos aqui poderão ser usados para examinar o fortalecimento do substancialmente complementar polinucleotídeo com o nucleotídeo não emparelhado ao polinucleotídeo receptor.

Em algumas configurações, dependendo do comprimento da região substancialmente complementar, o número de nucleotídeos não emparelhados examinados poderá compreender 2 ou mais nucleotídeos não parelhos, aproximadamente 5 nucleotídeos não parelhos, aproximadamente 10 ou mais nucleotídeos não parelhos, ou 20 nucleotídeos não parelhos ou mais. O número de nucleotídeos não parelhos poderá compreender até ao menos, 0.5%, aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, até aproximadamente 30% de resíduos de nucleotídeos na região substancialmente complementar. Em algumas configurações, as características do fortalecimento de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo substancialmente complementar à um correspondente oligonucleotídeo ou polinucleotídeo receptor poderá ser examinado em várias condições de fortalecimento. Parâmetros, como por exemplo, a resistência iônica, agentes caotrópicos, interruptores de ligação de hidrogênio (por exemplo, formamida, uréia), pH, conteúdo G/C, e a temperatura poderão ser variados para determinar o comportamento do fortalecimento, como para determinar a condições ideais para detectar o não emparelhamento. Referida análise poderá ser adequada na escolha de um particular oligonucleotídeo como uma sonda para detectar uma doença geneticamente herdada atribuída à uma específica alteração de seqüência do nucleotídeo em um específico gene.

Em algumas configurações , os métodos poderão ser usados para analisar as interações de ligação envolvendo lipídios, e proteínas que ligam o lipídio. Exemplares interações de lipídio-proteína incluem entre outras, a interação do lipídio monoi-acilatado com proteínas de transferência de lipídio ( Douliez et al.,2001, Eur J Biochem 268, 384-388). Ácidos gordurosos, retiníodes, e outra interação de ligando hidrofóbicos com proteínas de ligação de lipídio adipócito (ALBP), a interação de ácidos gordurosos e eicosanóides, a interação de ácidos gordurosos e proteínas de ligação (FABP); interação de ácido gorduroso éster CoA com proteínas de ligação acila-CoA (ACBP), a interação de fosfolipídios com proteínas de ligação de fosfolipídios (por exemplo, copina), e a interação de fosfatidilinositol com proteínas de transferência de fosfatidilinositol.

Em algumas configurações, os métodos poderão ser usados para analisar interações de ácido nucléico-lipídio. Geralmente, essas incluem lipídios catiônicos na forma de Iipossomos ou micelas que atuam como condutores para polinucleotídeos. Os Iipossomos poderão ser formados de várias combinações de lipídios e lipídios, incluindo entre outros, fofatidilinositol, fosfatidelatanolamina, fosfatidilserina, brometo de amônia de dioctadecil dimetila, fosfatideiletanolamina diolóilo, dioleilfosfatidilcolina, colina de dipalmitoilfosfatidinila, e colesterol. Outros lipídios para a formação de lipossomas incluem, por exemplo, lipídios catiônicos, D282, D378, D383, D3886, D3897 e D3899 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA).

Em outras configurações , os métodos poderão ser usados para analisar interações de ligação envolvendo um anticorpo e uma antígeno ligado pelo anticorpo. Um "antígeno" se refere à qualquer molecular ou grupo molecular e polímeros núcleo-base reconhecidos por ao menos um anticorpo. Um antígeno compreende ao menos um epítope ou determinante capaz de ser reconhecido pelo anticorpo. Um "anticorpo" se refere à um agente de ligação imunológica. Um "anticorpo" se refere à uma glicoproteína compreendendo ao menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas pelas ligações bissulfeto, ou uma parte de ligação antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variada de cadeia pesada (abreviada como VH) e uma região de cadeia pesada constante. A região de cadeia constante IgV é compreendida por quatro domínios, CH1, articulação CH2 e CH3- Cada cadeia leve é compreendida de uma região variada de cadeia leve (abreviada como CL) e uma região de cadeia leve constante. A região de cadeia leve constante é compreendida de um domínio CL. As regiões Vh e Vl poderão ainda serem sub- divididas em regiões de hiper-variedade, denominada como regiões de determinação complementar (CDR), interpassadas com regiões que são mais conservadas, denominada de regiões estruturais (FR). Cada Vh e Vl é composta de três CDRs e para quatro FRs1 harmonizadas em terminais de amina para terminais de carboxil na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos poderão mediar a ligação de imunoglobulina para hospedar tecidos e fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo células de efeito) e o primeiro componente (C1q) do sistema complementar clássico. O anticorpo inclui anticorpos do fragmento de ligação (ou seja, "parte de ligação antígeno), ou uma única cadeia da mesma, e fragmentos como Fab e (Fab)2.

Os anticorpos poderão ser policlonal ou monoclonal. Como usado aqui "anticorpo monoclonal" ou " composição anticorpo monoclonal" se referem à uma preparação de moléculas de um anticorpo de uma única composição molecular. Uma composição anticorpo monoclonal geralmente exibe uma única especificidade ou afinidade de ligação para um particular epítope. O termo "anticorpo monoclonal humano" se refere à anticorpos exibindo uma única especificidade de ligação que tem regiões variáveis e constantes derivadas das seqüências de imunoglobina da linha de germe humano. Os anticorpos poderão também ser uma única cadeia Fv("sFv")m que é um heterodímero Vh :: VL covalentemente ligado. Essa única cadeia de anticorpos poderá ser expressada à partir de uma fusão de gene incluindo genes codificados VH. e Vl- ligados por um peptídio codificado aglutinador (ver por exemplo, Huston et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci USA 85 (16): 5879-5883). Um número de métodos tem sido descritos para discernir estruturas químicas para converter as cadeias de anticorpo pesada de leve naturalmente agregadas de uma região de anticorpo V em uma molécula sFv que será dobradas em uma estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um local de ligação antígeno (ver por exemplo, as patente es Norte Americanas No. 5.091.513; No. 5.132.405 e No. 4.946.778).

O exame das interações de ligação de anticorpo-antígeno usando os métodos aqui citados, poderão prover informação como a resistência da ligação, e em algumas instâncias, a parte do antígeno ligado. Em algumas configurações , o anticorpo analisado poderá ser direcionado para qualquer molécula celular, como para finalidades de diagnósticos ou tratamento de uma doença (por exemplo, anti-TNF-α, e anti-Her-2, anti-CTLA-4, etc.).

Em outras configurações , os métodos poderão ser usados para examinar uma enzima e sua interação com um componente de ligação, como um substrato, inibidor ou ativador. O termo "enzima" se refere à moléculas ou agregados de moléculas que são capazes de reações químicas catalisadoras e reações biológicas, e incluem, sem limitação, polipeptídios, peptídios, RNAs, DNAs, ribozimas, anticorpos e outras moléculas que podem promover a catálise de um produto químico ou reação biológica. Exemplares enzimas adequadas para análise poderão incluir, por meio de exemplo, e não de limitação, enzima de conversão angiotensina, polimerases de DNA, reprodução reversa, esterases , cinases, (por exemplo, tirosina, serina, treonina), helicases, topoisomerases, telomerases, nucleases, fosfatases, isomerases, e oxidodectases. Vários substratos, inibidores e ativadores para as referidas enzimas serão aparentes para um especialista, baseado da enzima escolhida para análise.

Em algumas configurações, o componente de ligação poderá ser um membro de uma coleção de componentes de ligação, e os métodos poderão ser usados para examinar as interações da ligação de diferentes componentes de ligação que poderão ser separados para a habilidade de interagirem com um componente receptor. Pela identificação dos componentes de ligação exibindo ideal características de ligação, por exemplo, dissociação de equilíbrio constante, taxa de associação, e taxa de dissociação, um componente de ligação adequado no efeito das propriedades do componente receptor poderá ser identificado.

A preparação da coleção de compostos é muito conhecida para um especialista, conhecedor do estado da técnica. Referidas coleções químicas combinatórias, incluem, mas não se limitam à coleções de peptídios (ver, por exemplo a patente e Norte-Americana No. 5.010.175, Furka, 1991, Pept. Prot. Res. 37:487-493, Houghton et al., 1991, Nature, 354:84-88, peptoids (PCT Publication WO 91/19735) peptídios codificados (PCT Publication WO 93/20242) bio-oligomeros aleatórios (PCT Publication WO 92/000891), benzodiazepinas (U.S. patente No. 5.288.514), diversomers such as hydantoins, benzodiazepinas e dipeptidios (Hobbs et al., 1993, Proc Nat Acad Sci USA 9010:6909-6913, vinilogos polipeptides (Hagihara et al., 1992, J. Amer. Chem. Soe. 114:6568), peptidomimeticos não peptidal (Hirschamann et al., 1992, J Amer Chem Soc 11415: 9217-9218), oligocarbamatos (Cho et al., '993, Science 261:1303) peptidil fosfonatos (Campbell et al., 1994, J. Org Chem 59:658; Gordon et al., 1994 J Med Chem 37:1385), biblioteca de ácidos nucleicos, (Sambrook et al, supra) biblioteca de ácidos nucleico pepetídios (see, e.g. U.S. patente 5.539.083), (see, e.g. Vaughn et al, 1996, Nature Biotechnology 14(3)20:309-314); and PCT/US96/10287, biblioteca de carbohidratos (see, e.g. Liang et al., 1996, Science 274:1520-1522, e U.S. patente e No. 5.593.853, e bibliotecas de anticorpo orgânico pequeno, biblioteca de moléculas (veja, por exemplo., isoprenoides, U.S. patente No. 5.569.588; tiazolidinonas e metatiazonas, U.S. patente No. 5.549.974, pirrolidinas, U.S. patente Nos. 5. 525.735 e 5.519.134, compostos de morfolina, U.S. patente e No. 5.506.337, benzodiazepinas, U.S. patente No. 5.288.514).

Todas publicações, patente esm pedidos de patente es e outros documentos citados neste pedido são aqui incorporados para referência em suas totalidades para todos propósitos e para a mesma extensão como se cada individual publicação, patente e, pedido de patente e ou outros documento individualmente indicado para ser incorporado aqui por referência para todos os propósitos. No evento de que qualquer definição ou uso de uma palavra ou frase usada aqui estiver em conflito com a definição e/ou uso do que a palavra ou frase em qualquer outro documento, incluindo qualquer documento aqui incorporado para referência, a definição e/ou uso da referida palavra e/ou frase deverá sempre ser o controle.

Enquanto os presentes ensinamentos são aqui descritos em conjunto com várias configurações, não se pretende que os presentes ensinamentos limitem as referidas configurações. Ao contrário, os presentes ensinamentos incluem várias alternativas, modificações e equivalentes, que serão apreciados por um especialista no assunto, conhecedor do estado da técnica.

Claims

1. "MÉTODO DE ANÁLISE DE INTERAÇÕES DE LIGAÇÕES EM SOLUÇÃO", caracterizado por compreender: (a) o contato de um ou mais componente de ligação com um componente receptor, onde os componentes ligados e livres são habilitados para se deslocarem através de um poro; (b) a detecção de quaisquer componentes ligados e livres pela deslocamento dos componentes ligados e livres através do poro, onde a detecção é feita pela imagem da carga induzida pelo efeito de campo; e (c) a determinação do número de componentes de ligação pelo número dos componentes receptores.

2. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o poro compreender um nanoporo.

3. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os componentes ligados e livres serem calculados.

4. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o número de componentes de ligação ligados pelo número de componentes receptores ser determinado em diferentes concentrações de ligação e de componentes receptores.

5. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o número de componentes de ligação ligados pelo número de componentes receptores ser determinados em diferentes concentrações de componentes de ligação e uma constante concentração do componente receptor.

6. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o componente receptor ter η locais de interação com o componente de ligação.

7. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a interação de ligação na qual η é 1.

8. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a interação de ligação na qual η é 2 à 10.

9. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 6, para a interação de ligação caracterizado por os locais de interação terem o mesmo equilíbrio de ligação constante.

10. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 6, para a interação de ligação, caracterizado por ao menos dois dos locais de interação terem diferente equilíbrio de ligação constante.

11. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 6, para a interação de ligação, caracterizado por ao menos dois dos locais de interação exibirem interações cooperativas.

12. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os locais de interação compreenderem ao menos um primeiro e segundo locais de interação, onde os primeiro de segundo locais de interação são diferentes.

13. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, para a interação de ligação, caracterizado por o componente de ligação e o componente receptor serem o mesmo.

14. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, para a interação de ligação, caracterizado por o componente de ligação e o componente receptor serem diferentes.

15. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os componentes de ligação compreenderem ao menos um primeiro e segundo componentes de ligação, onde o primeiro e segundo componentes de ligação são diferentes.

16. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os primeiro e segundo componentes de ligação ligarem o componente receptor competitivamente.

17. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por os primeiro e segundo componentes de ligação ligarem o componente receptor de forma não competitivamente.

18. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o componente de ligação ser um membro de uma coleção de componentes de ligação, e as interações de ligação de cada membro da coleção ser analisado.

19. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o componente receptor compreender uma proteína que liga o componente de ligação.

20. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a proteína compreender uma enzima.

21. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a proteína compreender um receptor celular.

22. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o receptor celular compreender um receptor de superfície de célula.

23. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o componente de ligação compreender um agonista de proteína:

24. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por os componentes de ligação compreenderem um antagonista de proteína.

25. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o componente de ligação compreender uma pequena molécula orgânica de aproximadamente 500 à 3000 Daltons.

26. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a proteína compreender um anticorpo.

27. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o componente de ligação compreender um antígeno ligado ao anticorpo.

28. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o componente receptor compreender um oligonucleotídeo.

29. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o componente de ligação compreender uma pequena molécula orgânica de aproximadamente 500 à 3000 Daltons que liga o oligonucleotídeo.

30 . "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o componente de ligação compreender uma proteína que liga o oligonucleotídeo.

31. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o componente de ligação compreender um oligonucleotídeo substancialmente complementar.

32. "MÉTODO", de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o oligonucleotídeo substancialmente complementar ter ao menos um único nucleotídeo mal combinado.