BRPI0713572A2

BRPI0713572A2 - meios livres de soro e seus usos para expansão de condrócitos

Info

Publication number: BRPI0713572A2
Application number: BRPI0713572-6A
Authority: BR
Inventors: Stephen Duguay; Barbara Seymour
Original assignee: Stephen Duguay
Priority date: 2006-06-20
Filing date: 2007-06-15
Publication date: 2012-10-23
Also published as: EP2032689A1; US20130273010A1; MX2008016429A; CN101490245A; AU2007261530A1; AU2007261530B2; IL196025A0; WO2007149328A1; CN101490245B; JP2009540826A; IL196025A; US20120213745A1; US20070292949A1

Abstract

MEIOS LIVRES DE SORO E SEUS USOS PARA EXPANSãO DE CONDRóCITOS. A presente invenção refere-se a meios de cultura de célula livres de soro definidos úteis no cultivo de fibroblastros, especialmente condrócitos articulares, que evitam problemas inerentes no uso de meios contendo soro. Os meios definidos compreendem fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), lipídios quimicamente definidos, oncostatina M (OSM), interleucina-6 (IL-6), fator inibidor de leucemia (LIF), ou combinações destes compostos. Em outro aspecto, a presente invenção também fornece métodos de cultura de tecido que compreendem incubar os condrócitos nos meios livres de soro definidos. Os métodos otimizam a ligação e expansão proliferativa dos condrócitos semeados em baixa densidade ao mesmo tempo mantendo seu potencial de rediferenciação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEIOS LI- VRES DE SORO E SEUS USOS PARA EXPANSÃO DE CONDRÓCITOS".

Este pedido de patente reivindica prioridade ao pedido de paten- te dos Estados Unidos No. 60/805.307, depositado em 20 de junho de 2006, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de cultura de célula e tecido. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos e composi- ções para propagação de células ex vivo capazes de formar tecido cartilagi- noso destinado ao tratamento ou reparo de defeitos de cartilagem.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Cartilagem articular é composta de condrócitos encaixados den- tro da matriz extracelular complexa produzida por aqueles condrócitos. A única composição bioquímica desta matriz provê o movimento suave, quase sem atrito, das superfícies articulares das juntas. Com a idade, as proprie- dades elásticas da cartilagem articular humana mudam como resultado das alterações bioquímicas. Após a terceira década de vida, a resistência à tra- ção da cartilagem articular diminui notoriamente. Dano à cartilagem produzi- do por trauma ou doença, por exemplo, reumatóide e osteoartrite, pode levar à debilitação física séria.

A inabilidade da cartilagem para autorreparar levou ao desenvol- vimento de várias estratégias cirúrgicas para aliviar os sintomas clínicos as- sociados ao dano de cartilagem. Mais de 500.000 procedimentos artroplásti- cos e substituições de juntas são executados anualmente só nos Estados Unidos. Implante autólogo de condrócito é um procedimento que foi aprova- do para o tratamento de defeitos de cartilagem articular. O procedimento envolve colher um pedaço da cartilagem de uma parte sem suportar peso do côndilo femoral e propagar os condrócitos isolados ex vivo para reimplante subsequente no mesmo paciente. Brittberg et al., New Engl. J. Med. 331:889-895(1994).

Condrócitos articulares expressam componentes de matrizes extracelulares específicos para cartilagem articular. Uma vez os condrócitos articulares são colhidos e separados do tecido através de digestão enzimáti- ca, eles podem ser cultivados em monocamadas para expansão proliferati- va. Porém, durante a cultura de tecido, estas células adotam uma morfologia fibroblástica e deixam de produzir colágeno do tipo Il e proteoglicanos carac- terísticos de cartilagem articular do tipo hialina. Tais células "dediferencia- das" proliferam-se rapidamente e produzem colágeno do tipo I que é carac- terístico de tecido fibroso. Não obstante, quando colocados em um ambiente apropriado tal como meio de cultura de suspensão in vitro (Aulthouse et al., In vitro Cell. & Devei. Biology 25:659-668 (1989)) ou no ambiente de um de- feito de cartilagem in vivo (Shortkroff et al., Biomaterials 17:147-154 (1996)), as células rediferenciam-se, isto é, novamente expressam moléculas de ma- trizes específicas para cartilagem articular. A reversibilidade da dediferencia- ção é fundamental para o reparo com sucesso de cartilagem articular usan- do condrócitos autólogos cultivados.

Condrócitos humanos são tipicamente cultivados em Meio Modi- ficado Eagle da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de soro bo- vino fetal (FBS). Aulthouse et al., In vitro Cell. & Devei. Biology, 25:659-668 (1989); Bonaventure et al., Exp. Cell Res., 212:97-104 (1994). Porém, embo- ra o soro seja extensamente usado para cultura de célula mamífera, há vá- rios problemas associados a seu uso: (1) o soro contém muitos componen- tes não identificados ou não quantificados e, portanto não é "definido"; (2) a composição de soro varia de lote para lote, tornando a padronização difícil para experimentação ou outros usos de cultura de célula; (3) muitos dos componentes do soro afetam a ligação, proliferação, e diferenciação celula- res, que o torna difícil controlar estes parâmetros; (4) alguns componentes do soro são inibidores para a proliferação de tipos específicos de células e até certo ponto podem opor-se a seu efeito proliferativo, resultando em cres- cimento subótimo; e (5) o soro pode conter vírus e outros patógenos que podem afetar o resultado dos experimentos ou podem fornecer uma pericu- Iosidade potencial se as células cultivadas forem destinadas à para implan- tação em seres humanos. Freshney (1994) Serum-free media. Em: Culture of Animal Cells, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 91-99. Desse modo, o uso de meios livres de soro definidos é particu- larmente vantajoso na expansão de condrócitos ex vivo para tratamento de defeitos de cartilagem. Porém, tais meios livres de soro definidos devem ser suficientes para ligação de condrócitos articulares humanos adultos semea- dos em proliferação sustentada de densidade baixa até que culturas conflu- entes sejam atingidas, e mantenham a capacidade dos condrócitos para re- expressar o fenótipo de cartilagem articular.

Houve algum esforço para desenvolver meios bioquimicamente definidos (DM) para cultura de célula. DM em geral incluem nutrientes, fato- res de crescimento, hormônios, fatores de ligação, e lipídios. A composição precisa deve ser trabalhada para o tipo específico de célula para o qual o meio é projetado. Crescimento bem-sucedidas de alguns tipos de célula, incluindo fibroblastos, ceratinócitos, e células epiteliais, foram alcançados em vários DM. Freshney, 1994 e Butler M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:283-91 (2005).

As quantidades de material celular de partida disponível para implante autólogo de condrócito são em geral limitadas. Portanto, é desejá- vel semear condrócitos articulares a uma densidade subconfluente mínima. Tentativas para cultivar condrócitos articulares em densidades subconfluen- tes em DM foram apenas parcialmente com sucesso. Embora DM que po- dem sustentar a capacidade proliferativa dos condrócitos semeados em bai- xa densidade tenham sido desenvolvidos, o uso destes meios ainda requer soro para a ligação inicial das células ao vaso de cultura de tecido após se- meadura. Adolphe et al., Exp. Cell Res. 155:527-536 (1984), e patente U. S. No. 6.150.163.

Por conseguinte, uma necessidade existe para otimizar, padro- nizar, e controlar as condições para ligação, proliferação e manutenção de condrócitos capazes de rediferenciação para o uso em aplicações médicas, especialmente, em seres humanos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção fornece composições de meios de cultura quimi- camente definidos (DMs), métodos de fazer tais meios, e métodos de usar tais meios, por exemplo, para cultivar células, em particular, condrócitos arti- culares humanos para reparo de defeitos de cartilagem. Uma das caracterís- ticas distintivas dos DMs da invenção é a presença de uma ou mais citocinas substancialmente puras da família IL-6, tais como, por exemplo, oncostatina M (OSM), interleucina-6 (IL-6), e fator inibidor de leucemia (LIF).

Entre outras vantagens, a invenção permite evitar o uso de soro em culturas de condrócitos, intensificar a ligação e proliferação das células sob condições livres de soro, e/ou manter a capacidade dos condrócitos pa- ra reexpressar fenótipo cartilagem-específico. Em um aspecto, a invenção fornece DM que é suficiente para a ligação inicial das células a um substrato de cultura, assim eliminando uma necessidade por um meio contendo soro no estágio inicial da cultura de célula. Outro aspecto da invenção fornece meios de cultura de célula livres de soro definidos que promovem prolifera- ção das células tais como condrócitos sem uso de soro em qualquer estágio durante a cultura de célula. Ainda, outro aspecto da invenção fornece meios de cultura de célula que podem ser usados para preparar condrócitos antes do implante em um sujeito ou podem ser incluídos como um meio de susten- tação de rediferenciação para condrócitos embebidos em uma matriz inten- cionada para implante em defeitos de cartilagem. Outro aspecto da invenção fornece um método de cultivar um condrócito em um estado que é adequado para tratar um paciente que sofre de um defeito de cartilagem. Vantagens adicionais da invenção estarão em parte expostas na descrição que segue, e em parte serão óbvias da descrição, ou podem ser aprendidas pela prática da invenção.

O DM da invenção compreende um meio basal suplementado com um ou mais suplementos, incluindo uma ou mais citocinas da família IL- .6, tais como, por exemplo, OSM, IL-6, e LIF.

O meio basal pode ser qualquer meio adequado. Em modalida- des preferidas, o meio basal é cDRF (Tabela 3) ou cDRFm (Tabela 4). cDRF e cDRFm são feitos misturando DMEM, RPMI-1640, e F-12 de Ham a uma razão de 1:1:1 ou apropriadamente combinando meios pré-misturados e adi- cionando certos suplementos de crescimento para chegar aos meios basais como definidos nas Tabelas 3 e 4 respectivamente.

Em outras modalidades preferidas, o meio basal é adicionalmen- te suplementado com fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e/ou um ou mais lipídios. Em algumas modalidades, os lipídios são uma mis- tura de lipídios quimicamente definidos (CDLM; Tabela 5) ou um ou mais lipídios de CDLM (por exemplo, ácido esteárico, ácido mirístico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido araquidônico, ácido linolênico, colesterol, e acetato de alfa-tocoferol). Em algumas modalidades, um DM da invenção pode incluir um meio basal (por exemplo, cDRF ou c- DRFm) suplementado com:

(a) um ou ambos de PDGF e CDLM substancialmente pu- ros; e

(b) uma ou mais de OSM substancialmente pura, IL-6 subs- tancialmente pura, e LIF substancialmente puro.

Por exemplo, em modalidades preferidas, DM da invenção pode incluir: (a) um meio basal; (b) 0,1-100 ng/ml de PDGF; (c) 0,05-5% de C- DLM; (d) 0,01-10 ng/ml de OSM; e/ou (e) 0,01-10 ng/ml de IL-6.

Será entendido que a descrição geral anterior e a descrição de- talhada a seguir são exemplares e explicativas apenas e não são restritivas da invenção, como reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIGURA 1 descreve uma comparação em crescimento de con- drócitos humanos primários cultivados em (1) DMEM + 10% de FBS ou (2) o meio de E93 (cDRFm, como definido na Tabela 4, suplementado com C- DLM, PDGF, IL-6, e OSM) em três passagens.

FIGURA 2 descreve uma comparação em rendimento celular de condrócitos humanos primários cultivados em (1) DMEM + 10% de FBS ou (2) o meio de E93 (cDRFm, como definido na Tabela 4, suplementado com CDLM, PDGF, IL-6, e OSM) em três passagens.

FIGURA 3 mostra um RPA de célula Iisada de condrócitos cres- cidos em E93 (linhas 2, 3, 4) ou DMEM + 10% de FBS (linhas 5, 6, 7). Os marcadores de cartilagem, colágeno 2 e "aggrecan" são expressas em todas as amostras.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção fornece composições de meios de cultura quimi- camente definidos (DMs), métodos de fazer tais meios, e métodos de usar tais meios, por exemplo, para cultivar células, tais como condrócitos articula- res humanos, para reparo de defeitos cartilaginosos. A invenção é com ba- se, pelo menos em parte, na descoberta de que o meio basal referido como cDRFm suplementado com PDGF e CDLM e uma ou mais citocinas da famí- lia IL-6 é suficiente para ligação, proliferação e manutenção de condrócitos capazes de rediferenciação em cultura e podem substituir um meio contendo soro em todos os estágios de cultura de célula. As citocinas da família IL-6 de citocinas incluem, por exemplo, OSM1 IL-6, e LIF.

Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um meio de cultura que compreende um meio basal suplementado com um ou mais suplementos, que inclui uma ou mais citocinas da família IL-6, tais co- mo, por exemplo, OSM, IL-6, e LIF.

O termo "suplementado com" indica que um suplemento foi a- crescentado a um material de partida para chegar a um material final. A me- nos que especificamente indicado, o suplemento ou suplementos não ne- cessitam ser adicionados em um momento específico ou em uma ordem es- pecífica. O termo "suplementado com" não impede que o material de partida seja adicionalmente suplementado com outros suplementos, a qualquer momento, antes ou após ter sido suplementado com o suplemento presente. A menos que especificamente indicado, os suplementos são acrescentados ao meio em uma forma "substancialmente pura". O termo "substancialmente pura" indica que um suplemento é substancialmente livre de componentes com os quais ocorrem naturalmente na natureza. Por exemplo, uma citocina substancialmente pura poderia ser uma citocina purificada ou uma citocina que é recombinantemente produzida.

I. PREPARAÇÃO DO MEIO BASAL

A primeira etapa na preparação dos meios definidos, livres de soro (DM) da invenção é obter um meio basal. O meio basal pode ser qual- quer meio adequado. Em modalidades ilustrativas, o meio basal é cDRF co- mo definido na Tabela 3. cDRF pode estar preparado dos componentes de partida comercialmente disponíveis como descritos abaixo. cDRF é uma modificação do DM desenvolvido por Adolphe et al. (Exp. Cell Res. 155:527- 536 (1984)) e por McPherson et al. (Patente U. S. No. 6.150.163).

Os três componentes de partida de cDRF são DMEM, RPMI-1640, e F12 de Ham (Invitrogen; Carlsbad1 CA). Os componentes de partida são combinados a uma razão de 1:1:1. Todos os três meios podem ser combinados imediatamente, ou quaisquer dois dos meios podem ser pré- misturados e depois combinados com uma quantidade apropriada de um terceiro meio. A composição precisa dos componentes de partida é exposta na Tabela 1. O meio resultante (definido na Tabela 2 e referido como DRF) é depois suplementado com ITS (10 pg/ml de insulina, 5,5 pg/ml de transferri- na, 7 ng/ml de selênio, e, opcionalmente, 2,0 pg/ml de etanolamina; Invitro- gen, Carlsbad, CA), fibronectina humano (BD Biosciences; San Jose, CA), albumina de soro humano (HSA) (Grifols; Los Angeles, CA; ou Baxter; Wes- tlake Village, CA), ácido Iinoleico (Sigma-AIdrich; St. Louis, MO), fator de crescimento humano fetal .básico (bFGF) (R&D Systems, Mineápolis, MN), gentamicina (Invitrogen; Carlsbad, CA), e hidrocortisona (Sigma-AIdrich; St. Louis, MO) para criar cDRF. Todos os materiais são reconstituídos, diluídos, e armazenados como pelas recomendações do fornecedor. A ordem exata de combinar os componentes para chegar a um meio final não é essencial. O meio completo pode ser preparado usando técnicas de laboratório padrão e armazenado preferivelmente a 2-8°C até o uso. Em uma modalidade prefe- rida, o meio basal é preparado essencialmente como descrito acima com ajustes para a quantidade de albumina de soro humano, ácido linoleico, e hidrocortisona para chegar em cDRF modificado (cDRFm) como definido na Tabela 4.

Em algumas modalidades, o meio basal é um meio compreen- dendo todos os componentes essenciais de cDRF listados na Tabela 3. Um componente ou um subconjunto de componentes listados na Tabela 3 são não-essenciais se, quando sua concentração for reduzida, ou o componente for eliminado, as propriedades do meio relacionadas à ligação, proliferação, e/ou rediferenciação de condrócitos permanecem substancialmente as mesmas. As concentrações declaradas de componentes individuais podem ser ajustadas às condições específicas da cultura de célula. Tais ajustes po- dem ser facilmente feitos por uma pessoa versada na técnica usando técni- cas rotineiras.

Componentes adicionais podem ser acrescentados ao meio se tais componentes forem desejáveis e não causarem impacto negativo na ligação, proliferação, e rediferenciação de condrócitos. Tais componentes incluem, mas não são limitados a, fatores de crescimento, lipídios, proteínas de soro, vitaminas, minerais, e carboidratos. Por exemplo, pode ser vantajo- so suplementar o meio com fatores de crescimento ou hormônios que pro- movem rediferenciação de condrócito tais como TGF-β (TGF-βΙ, β2, β3), IGF, e insulina, como descritos na patente U. S. No. 6.150.163. Tais fatores de crescimento e hormônios estão comercialmente disponíveis. Exemplos adicionais de suplementos incluem, mas não são limitados a, proteínas mor- fogenéticas ósseas (BMPs) das quais há pelo menos 15 proteínas estrutural e funcionalmente relacionadas. BMPs foram mostradas estar envolvidas no crescimento, diferenciação, quimiotaxia, e apoptose de vários tipos de célu- Ias. BMP-4 e BMP-6 recombinantes, por exemplo, podem ser comprados de R&D System (Mineápolis, MN). A concentração de vários tais suplementos em DM da invenção pode ser determinada com experimentação mínima. Por exemplo, a concentração de BMP em DM da invenção é escolhida de 0,01- 0,1 n g/ml, 0,1-1 ng/ml, 1-10 ng/ml, 100 ng/ml, 10-50 ng/ml, 50-100 ng/ml, e 0,1-1 μ g/ml.

Um versadona técnica apreciará que DM da invenção tem van- tagens além de evitar o uso de soro. Porém, pode ser desejável utilizar o DM da invenção em aplicações onde o uso de componentes indefinidos seja a- ceitável. Por conseguinte, o DM da invenção pode ser suplementado com soro por exemplo, soro de bezerro fetal, ou outros componentes quimica- mente indefinidos tais como, por exemplo, extratos de tecido animal ou ve- getal. Desse modo, em certas modalidades, o DM da invenção pode ser su- plementado com 10% ou menos, por exemplo, 8% ou menos, 6% ou menos, 4% ou menos, 2% ou menos, ou 1% ou menos de soro.

cDRF podem ser preparados de uma variedade de meios conhecidos, por exemplo, meio Basal Médium Eagle (Eagle, Science, 122:501 (1955)), meio essencial mínimo (Dulbecco et al., Virology, 8:396 (1959)), meio de Ham (Ham, Exp. Cell Res. 29:515 (1963)), meio de L-15 (Leibvitz, Amer. J. Hyg. 78:173 (1963)), meio de McCoy 5A (McCoy et al., Proc. Exp. Biol. Med. 100:115 (1959)), meio de RPMI (Moore et al., J. A. M. A. 199:519 (1967)), meio de Williams (Williams, Exp. Cell Res. 69:106-112 (1971)), meio de NCTC 135 (Evans et al., Exp. Cell Res. 36:439 (1968)), meio de Waymouth MB752/1 (Waymouth, Nat. Câncer Inst. 22:1003 (1959)), etc. Estes meios podem ser usados singularmente ou como misturas em proporções adequa- das para preparar um meio equivalente basal para cDRF. Alternativamente, cDRF ou seu equivalente pode ser preparado de químicas individuais ou de outros meios e suplementos de crescimento. A invenção não é limitada a meios de qualquer consistência particular e abrange o uso de meios que va- riam de líquido para semissólido e incluem meios solidificados e composi- ções sólidas adequados para reconstituição.

Tabela 1. Composições do Meio de Partida

Um versado na técnica também apreciará que equivalentes de

<table>table see original document page 10</column></row><table> NaHCO3 1200 2000 NaH2PO4-H2O 62,5 — Na2HPO4 (anid.) 71,02 800 ZnS04-7H20 0,432 ~ Outros Componentes: D-Glicose 3151 2000 Glutationa (reduzida) — 1 Hipoxantina Na 2,39 — Ácido Linoleico 0,42 — Ácido Lipoico 0,105 — Vermelho de Fenol 8,1 5 Putreseina 2HCI 0,081 5 Piruvato de Sódio 55 ~ Timidina 0,365 — HEPES -- 5300 Aminoácidos: L-Alanina 4,45 -- L-Arginina -- 200 L-Arginina-HCI 147,5 — L-Asparagina-H2O 7,5 — L-Asparagina (base — 50 livre) Ácido L-aspártico 6,65 20

TABELA 1. Composições do Meio de Partida

L-Cistina-2HCI 31,29 65

L-CisteinaHCI-H2O 17,56 --

Ácido L-glutâmico 7,35 20

L-Glutamina 365 300

Glicina 18,75 10

L-HistidinaHCI-H2O 31,48 --

L-histidina (base livre) - 5 <table>table see original document page 12</column></row><table> <table>table see original document page 13</column></row><table> L-Asparagina-H2O 5,0000 L-asparagina (base livre) 16,6667

Ácido L-Aspártico 11,1000

L-Cistina-2HCI 42,5267

L-Cisteina-HCI-H2O 11,7067

Ácido L-Glutâmico 11,5667

L-Glutamina 343,3333

Glicina 15,8333

L-Histidina-HCI-H2O 20,9867

L-Histidina (base livre) 1,6667

L-Hidroxiprolina 6,6667

L-Isoleucina 52,9800

L-Leucina 56,0333

L-Lisina-HCI 74,1667

L-Metionina 16,4933

L-Fenilalanina 28,6533

L-Prolina 18,1667

L-Serina 27,5000

L-Treonina 42,3000

L-Triptofano 7,6800

L-Tirosina-2Na2H20 46,8600

L-Valina 41,9000 Vitaminas:

Biotina 0,0690

Pantotenato de D-Ca 1,5767

Cloreto de colina 6,9867

Ácido Fólico 2,1000

I-Inositol 20,0667

Niacinamida 1,6800 Ácido Para-aminobenzóico 0,3333

HCI de Piridoxina 1,6873 HCI de Piridoxal -- <table>table see original document page 15</column></row><table>

TABELA 3. Composição de cDRF

<table>table see original document page 15</column></row><table> 15

Fator de Crescimento de 10ng/ml Fibroblasto Básico (bFGF) Albumina de Soro Humano 0,5 mg/ml

<table>table see original document page 16</column></row><table> modalidades, cDRF é suplementado com 1-25 ng/ml, mais preferivelmente,5-15 ng/ml e, o mais preferivelmente, cerca de 10 ng/ml de PDGF. Em uma modalidade particular, o PDGF é PDGF-BB. Alternativamente, PDGF pode- ria ser de outro tipo, por exemplo, PDGF-AB, PDGF-BB, ou uma mistura de qualquer tipo de PDGF. Em modalidades relacionadas, o DM da invenção também ou alternativamente compreende suplementos adicionais como descritos abaixo. B. LIPÍDIOS

Em algumas modalidades, o meio basal é suplementado com CDLM (Tabela 5) ou, alternadamente, um ou mais lipídios de CDLM.

Lipídios são importantes como componentes estruturais como também fontes de energia potenciais em células vivas. In vitro, a maioria das células pode sintetizar lipídios e aminoácidos de glicose presentes no meio de cultura. Porém, se lipídio extracelular estiver disponível, a biossíntese de lipídio é inibida e as células utilizam ácidos graxos livres, ésteres de lipídio, e colesterol no meio. Soro é rico em lipídios e foi a fonte principal de lipídio extracelular para as células cultivadas. As preparações de lipídios quimica- mente indefinidas com base em óleos marinhos foram observadas ser efica- zes em promover o crescimento de células em meios livres de soro em vá- rios sistemas. Vide, por exemplo, Weiss et al., In vitro 26:30A (1990); Gorfien et al., In vitro 26:37A (1990); Fike et al., In vitro 26:54A (1990). Desse modo, suplementação de meios livres de soro com vários lipídios para substituir aqueles normalmente providos através de soro pode ser desejável.

Lipídios adequados para o uso no DM desta invenção incluem ácido esteárico, ácido mirístico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido araquidônico, ácido linolênico, colesterol, e acetato de alfa-tocoferol. Em uma modalidade, o meio basal é suplementado com a mistura de lipídios quimicamente definidos (CDLM), mostrados na Tabela 5. CDLM está disponível de Invitrogen. Como provido por Invitrogen, além dos componentes de lipídio, CDLM contém etanol (100 g/l) e emulsificantes Plu- ronic F68® (100 g/l) e Tween 80® (2,2 g/l).

Praticando os métodos da invenção, as concentrações de com- ponentes de lipídio individuais de CDLM mostradas na Tabela 5 podem ser ajustadas às condições específicas da cultura de célula. Tais ajustes podem ser facilmente feitos por uma pessoa versada na técnica usando técnicas rotineiras. Além disso, nem todos os componentes de CDLM podem ser es- senciais. Um componente ou um subconjunto de componentes é não- essencial se, quando sua concentração estiver reduzida, ou o componente for eliminado, as propriedades do meio relacionadas à ligação, proliferação, e rediferenciação de condrócitos permanecerem substancialmente as mes- mas.

Em certas modalidades, o DM da invenção compreende pelo menos um, dois, quatro, seis, oito, ou todos os componentes lipídicos de CDLM. Em uma modalidade, o DM compreende PDGF e CDLM como defi- nidos na Tabela 5. Em outras modalidades não-limitativas, o DM compreen- de PDGF e combinações de lipídios como expostos na Tabela 6.

TABELA 5. Composição da mistura de lipídios quimicamente definidos (CDLM)_

<table>table see original document page 18</column></row><table> TABELA 6. Combinações de Lipídio Ilustrativas_

<table>table see original document page 19</column></row><table> ácido mirístico

17 ácido araquidônico, ácido linoleico, ácido linolênico, acetato, ácido es- teárico

18 ácido araquidônico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido esteárico 19 ácido araquidônico, ácido linoleico, ácido linolênico 20 ácido araquidônico, ácido linoleico 21 ácido araquidônico 22 colesterol, ácido linoleico 23 colesterol, ácido linoleico, ácido linolênico 24 colesterol, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido esteárico 25 colesterol, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido esteárico, ácido mirís- tico

26 colesterol, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido esteárico, ácido mirís- tico, ácido oleico

27 colesterol, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido esteárico, ácido mirís- tico, ácido oleico, ácido palmítico

28 colesterol, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido esteárico, ácido mirís- tico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico colesterol, ácido linoleico, ácido linolênico, acetato de alfa-tocoferol, 29 ácido esteárico, ácido mirístico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico 30 ácido linoleico 31 colesterol, ácido linoleico 32 colesterol, ácido araquidônico, ácido linoleico 33 colesterol, ácido araquidônico, ácido linoleico, ácido linolênico 34 colesterol, ácido araquidônico, ácido linoleico, ácido linolênico, acetato de alfa-tocoferol

35 colesterol, ácido araquidônico, ácido linoleico, ácido linolênico, acetato de alfa-tocoferol, ácido esteárico

36 colesterol, ácido araquidônico, ácido linoleico, ácido linolênico, acetato de alfa-tocoferol, ácido esteárico, ácido mirístico

37 colesterol, ácido araquidônico, ácido linoleico, ácido linolênico, acetato <table>table see original document page 21</column></row><table>

Em certas modalidades, a concentração (v/v) de lipídios no meio de cultura é escolhida de 0,05-0,1%, 0,1-0,5%, 0,5%, 0,5-1%, 1-2%, e 2-5%. Em certas outras modalidades, o DM é adicionalmente suplementado com 1 a 25 ng/ml, mais preferivelmente, 5 a 15 ng/ml, e, o mais preferivelmente, cerca de 10 ng/ml de PDGF. Em uma modalidade particular, o DM compre- ende 0,5% cerca de (v/v) CDLM e 10 ng/ml de PDGF. C. CITOCINAS DA FAMÍLIA IL-6

Membros da família de citocinas IL-6 cada podem utilizar uma subunidade de receptor de transdução de sinal compartilhada, gp130, que é encontrado em uma faixa extensiva de tipos de célula. Vide, por exemplo, Hirano et al. (2001) 1L-6 Ligand and Receptor Family. Em: Cytokine Referen- ce, Academic Press, San Diego, 523-535. Exemplos de citocinas da família 1L-6 incluem, mas não são limitadas a, oncostatina M (OSM), interleucina-6 (1L-6), fator inibidor de leucemia (LIF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), inter- leucina-11 (1L-11), cardiotrofina 1 (CT-1), e neurotrofina 1 / fator 3 estimulan- te de célula B (NNT-1/BSF-3). Citocinas da família 1L-6 foram observadas regular o crescimento e diferenciação celulares em uma ampla variedade de sistemas biológicos, incluindo hematopoiese, neurogênese, e osteogênese. Bruce et al., Prog. Growth Factor Res. 4:157-170 (1992). .1. ONCOSTATINA M (OSM)

OSM humana é uma glicoproteína segregada que é inicialmente transladada como um polipeptídeo de 252 aminoácidos com uma seqüência de sinal hidrofóbica de 25 resíduos no N-término que é removido durante o processo de secreção. Um evento de clivagem pós-translacional adicional remove 31 resíduos C-terminais, deixando uma proteína madura ligada a dissulfeto de 192 aminoácidos. Rose et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 88:8641-8645 (1991); Robinson et al., Cell 77:1101-1116 (1994). Em seres humanos, OSM liga e sinaliza através de dois complexos de receptores dife- rentes - o receptor de LIF (LIFR) / heterodímero de gp130 e o receptor de OSM (OSMR) / heterodímero de gp130. A ligação a qualquer complexo de receptor leva à ativação da Janus cinase / transdutores de sinal e ativadores de transcrição (JAK/STAT) e vias de sinalização de proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK). Heinrich et al., Biochem. J. 374:1-20 (2003).

Relatou-se que OSM inibe o crescimento de algumas, mas não todas, linhagens de células tumorais humanas. Em contraste, OSM tem também sido relatada estimular o crescimento de alguns fibroblastos nor- mais, tais como fibroblastos de prepúcio humano ou células de WI-38. Zar- Iing et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 83:9739-9743 (1986). Desse modo, OSM pode ser útil para estimular o crescimento de certas células in vitro. Uma descrição mais detalhada de OSM pode ser encontrada nas patentes U. S. Nos. 5.202.116 e 5.814.307.

OSM está facilmente disponível de fontes comerciais. Nos E- xemplos abaixo, uma OSM recombinante de 196 aminoácidos produzida em E. coli foi obtida de R&D Systems (Mineápolis, MN) (catálogo No.295-OM, vide também Linsley et al., Mol. Cell. Biol. 10:1882-1890 (1990)). A atividade biológica de OSM pode ser avaliada testando em um ensaio de proliferação de linhagem celular eritroleucêmica humana, como descrito, por exemplo, em Kitamura et al., J. Cell Physiol. 140:323-334 (1989). Em uma modalidade preferida, OSM humana, é usada para produzir os meios da invenção. Po- rém, alguém versado na técnica reconheceria que OSM de outras espécies, mutantes de ocorrência natural, e mutantes engenheirados podem também ser eficazes.

.2. INTERLEUCINA-6 (IL-6)

IL-6 tem muitos nomes alternativos, incluindo: interferona β2; fator de diferenciação de célula B; fator 2 estimulante de célula B; fator esti- mulante de hepatócito; fator de crescimento de hibridoma; e fator de diferen- ciação de CTL. IL-6 humana é uma glicoproteína segregada de 186 aminoá- cidos que é sintetizada como uma proteína precursora de 212 aminoácidos. Matsuda et al., (2001) IL-6. Em: Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, 538-563. Em ser humanos, IL-6 liga e sinaliza através de um comple- xo do receptor de IL-6 (IL-6R) e um homodímero de gp130. Ligação de IL-6 ao receptor de IL-6R leva à ativação da Janus cinase / transdutores e ativa- dores de sinal de transcrição (JAK/STAT) e vias de sinalização de proteína cinase ativada por mitógeno (MAPK). Heinrich et al., Biochem. J. 374:1-20 (2003).

Relatou-se que IL-6 induz diferenciação de células neuronais de PC12, induz maturação clonogênica de células progenitoras de medula ós- sea, e induz o crescimento de células T. Em contraste, IL-6 tem também sido mostrada inibir o crescimento de células de leucemia mielóide e células de câncer de mama. Desse modo, IL-6 pode ser útil para estimular o crescimen- to de certas células in vitro. Uma descrição mais detalhada da biologia de IL- 6 pode ser encontrada na patente U. S. No. 5.188.828. IL-6 está disponível de fontes comerciais. Nos Exemplos abaixo, uma IL-6 recombinante de 184 aminoácidos produzida em E. coli foi obtida de R&D Systems (Mineápolis, MN) (catálogo No.206-IL, vide também Hirano et al., Nature 324:73-76 (1986)). A atividade biológica de IL-6 é ensaiada testando em um ensaio de proliferação de plasmacitoma como descrito, por exemplo, em Nordan et al., J. Immunol. 139:813 (1987). Em uma modalidade preferida, IL-6 humana é usada para produzir os meios da invenção. Porém, alguém versado na técnica reconheceria que IL-6 de outras espécies, mu- tantes de ocorrência natural, e mutantes engenheirados podem também ser eficazes.

3. FATOR INIBIDOR DE LEUCEMIA (LIF)

LIF tem vários nomes alternativos, incluindo: fator de diferencia- ção colinérgico; interleucina humana em células de DA; fator estimulante de diferenciação; MLPLI; e Emfilermin. LIF humano é uma glicoproteína segre- gada de 180 aminoácidos. Kondera-Anasz et al., Am. J. Reprod. Immunol. .52:97-105 (2004). Em seres humanos, LIF liga e sinaliza através do receptor de LIF (LIFR) / heterodímero de gp130. Ligação de LIF ao receptor de LIF leva à ativação da Janus cinase / transdutor de sinal e ativadores de trans- crição (JAK/STAT) e vias de sinalização de proteína cinase ativada por mitó- geno (MAPK). Heinrich et al., Biochem. J. 374:1-20 (2003).

Relatou-se que LIF inibe a proliferação de células M1 de leuce- mia mielóide. Vide, por exemplo, Patente U. S. No. 5.443.825. Em contraste, LIF tem também sido relatado estimular o crescimento de neurônios como também promover a diferenciação de neurônios de um fenótipo medular ad- renal para um fenótipo acetilcolinérgico. Vide, por exemplo, Patente U. S. No. 5.968.905. A adição de LIF a nervos cortados pode também intensificar a regeneração dos nervos. Vide, por exemplo, Patente U. S. No. 6.156.729. Desse modo, LIF pode ser útil para promover o crescimento de certas célu- las in vitro.

LIF está disponível de fontes comerciais. Nos Exemplos abaixo, um LIF humano recombinante de 181 aminoácidos produzido em E. coli foi obtido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) (catálogo No. L 5283, vide também Gearing et al., EMBO J. 6:3995 (1987)). A atividade biológica de LIF é avali- ada testando quanto a sua habilidade de estimular a diferenciação de células M1 de leucemia mielóide de camundongo como descrito, por exemplo, em Gearing et al., EMBO J. 6:3995 (1987). Em uma modalidade preferida, LIF humano é usado para produzir os meios da invenção. Porém, alguém versa- do na técnica reconheceria que LIF de outras espécies, mutantes de ocor- rência natural, e mutantes engenheirados podem também ser eficazes.

Em certas modalidades, o DM da invenção é cDRF suplementa- do com PDGF, um ou mais lipídios selecionados do grupo que consiste em ácido esteárico, ácido mirístico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido araquidônico, ácido linolênico, colesterol, e acetato de alfa-tocoferol, e uma ou mais citocinas. Em modalidades particulares, DM da invenção é cDRF suplementado com PDGF, um ou mais lipídios selecio- nados do grupo que consiste em ácido esteárico, ácido mirístico, ácido olei- co, ácido linoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido araquidônico, ácido linolênico, colesterol, e acetato de alfa-tocoferol, e um ou mais do gru- po que consiste em OSM, IL-6, e LlF. A concentração de citocina é escolhida de 0,01-0,1 ng/ml, 0,1-1 ng/ml, 1-5 ng/ml, 5-10 ng/ml, 10-15 ng/ml, 15-50 ng/ml, e 50-100 ng/ml. Em certas modalidades, cDRF é suplementado com 0,01-10 ng/ml, mais preferivelmente, 0,1-2 ng/ml e, o mais preferivelmente,0,5-1 ng/ml de OSM, 1L-6, e/ou LIF. Em uma modalidade preferida, cDRF é suplementado com cerca de 10 ng/ml de PDGF, 0,5% de CDLM, 1 ng/ml de 1L-6, e 0,5 ng/ml de OSM. Em modalidades relacionadas, o DM da invenção também compreende suplementos adicionais como descritos abaixo. Em certas modalidades, o DM da invenção compreende pelo

menos um, dois, ou todos os três de OSM, 1L-6, e LIF. Em outras modalida- des não-limitativas, o DM compreende combinações de OSM, 1L-6, e LIF como expostas na Tabela 7. Em modalidades não-limitativas adicionais, o DM compreende qualquer combinação de OSM, 1L-6, e LIF exposta na Ta- bela 7, PDGF, e CDLM como definidos na Tabela 5. Em modalidades não- limitativas adicionais, o DM compreende qualquer combinação de OSM, 1L-6, LIF, PDGF, e lipídios expostos na Tabela 7. Em uma modalidade preferida, o DM compreende OSM1 IL-6, PDGF e CDLM como definidos na Tabela 5. Em uma modalidade preferida também, o DM é cDRFm como definido na Tabela 4. Por exemplo, o meio pode compreender cDRFm, OSM, IL-6, PDGF e C- DLM.

TABELA 7. Combinações Ilustrativas de OSM, IL-6, e LIF

<table>table see original document page 26</column></row><table> TABELA 7. Combinações Ilustrativas de OSM1 IL-6, e LIF

<table>table see original document page 27</column></row><table>

D. SUPLEMENTOS ADICIONAIS

O DM da invenção pode opcionalmente ser suplementado com qualquer número de suplementos adicionais necessários para promover o crescimento das células na cultura. Tais suplementos podem incluir, mas não são limitados a, membros da família de BMP, membros da família de TGF-β, IGF, e insulina.

O meio da invenção pode ser usado para semear, crescer, e manter condrócitos capazes de rediferenciação em cultura sem o uso de soro. As faixas declaradas de concentrações de PDGF, lipídios, OSM, IL-6, e LIF podem necessitar ser ajustadas às condições específicas da cultura de célula. Tais ajustes podem ser facilmente feitos por uma pessoa versada na técnica usando técnicas rotineiras.

Em algumas modalidades, o meio de cultura da invenção não é suplementado com jagged 1 (JAG1) substancialmente puro e/ou interleuci- na-13 (IL-13) substancialmente pura.

Em algumas modalidades, o meio de cultura da invenção não é suplementado com quaisquer das combinações específicas de suplementos expostos nas Publicações de Pedido de Patente U. S. No. US 2005/0265980 A1 (por exemplo, nos parágrafos 59 a 68) e U. S. 2005/0090002 A1 (por e- xemplo, nos parágrafos 10 a 14), embora possam ser suplementados com um subconjunto de qualquer combinação descrita nas mesmas contanto que o meio exclua pelo menos um ou mais dos suplementos daquela combina- ção. Por exemplo, em algumas modalidades, o meio de cultura da invenção não é suplementado ou com um, dois, três, quatro ou mais suplementos es- pecíficos selecionados do grupo que consiste em fator de crescimento epi- dérmico substancialmente puro (EGF)1 fator de células-tronco substancial- mente puro (SCF), fator 1 de crescimento do tipo insulina substancialmente puro (IGF-1), fator neurotrófico derivado do cérebro substancialmente puro (BDNF), eritropoetina substancialmente pura (EPO)1 Iigante de tirosina cina- se-3 relacionada a FMS substancialmente pura (Flt-3/Flk-2), e/ou um mem- bro substancialmente puro da família do sítio de integração de MMTV do tipo áptero (WNT). Em algumas modalidades, o meio da invenção não contém dexametasona.

III. CONDRÓCITOS E OUTRAS CÉLULAS ADEQUADAS

Os métodos da invenção podem ser usados com qualquer célula adequada. Os métodos são particularmente adequados para propagação de células ex vivo capazes de produzir tecido cartilaginoso, tal como condróci- tos.

Condrócitos são células encontradas em vários tipos de cartila- gem, por exemplo, cartilagem de hialina, cartilagem elástica, e fibrocartila- gem. Condrócitos são células mesenquimais que têm um fenótipo caracterís- tico primariamente com base no tipo de matriz extracelular que eles produ- zem. Células precursoras produzem colágeno do tipo I, mas quando elas se tornam confinadas à linhagem de condrócitos, elas param de produzir colá- geno do tipo I e começam a sintetizar colágeno do tipo II, que constitui uma porção substancial da matriz extracelular. Além disso, condrócitos compro- metidos produzem agregados de proteoglicano, chamados "aggrecan", ten- do glicosaminoglicanos que são altamente sulfatados.

O termo "condrócito", como aqui usado, refere-se a uma célula diferenciada obtida da cartilagem, incluindo um condrócito dediferenciado quando crescido em cultura, que retém a capacidade para diferenciar em um condrócito. O termo "condrócito" refere-se a um condrócito independente se é primário ou passado, autólogo, heterólogo, alogenéico, xenólogo, etc. Condrócitos usados na presente invenção podem ser isolados por qualquer método adequado. Vários materiais de partida e métodos para isolamento de condrócitos são bem-conhecidos na técnica. Freshney, Cultu- re of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 2d ed. A. R. Liss, Inc., Nova Iorque, págs. 137-168 (1987); Klagsburn, Methods Enzymol. 58:560- .564 (1979); R. Tubo e L. Brown, Articular Cartilage. Em: Human Cell Culture; Volume V, Koller et al. (eds.) (2001); e Kandel et al., Art. Cells, Blood Subs., e Immob. Biotech. 25(5), 565-577 (1995). Por via de exemplo, a cartilagem articular pode ser colhida de côndilos femorais de doadores humanos, e os condrócitos podem ser liberados da cartilagem por digestão durante a noite em 0,1% de colagenase/DMEM. As células liberadas se expandem como células primárias em um meio adequado tal como o DM desta invenção ou DMEM contendo 10% de FBS.

Pode ser desejável em certas circunstâncias cultivar células- tronco de progenitor de condrócitos tais como células-tronco mesenquimais ao invés de células de biópsias de cartilagem que já são diferenciadas em condrócitos. Condrócitos podem ser obtidos sob diferenciação de tais células em condrócitos. Exemplos de tecidos dos quais tais células-tronco podem ser isoladas incluem sinóvia, placenta, cordão umbilical, medula óssea, adi- poso, pele, muscular, periósteo, ou pericôndrio.

Além dos condrócitos e células-tronco de progenitor de condróci- tos, pode ser desejável em certas circunstâncias utilizar outras células com potencial condrocítico, tais como células de linhagem mesenquimal que po- dem ser trans-diferenciadas em condrócitos. Condrócitos podem ser obtidos induzindo diferenciação de tais células em condrócitos in vitro. Exemplos de tais outras células com potencial condrocítico incluem osteoblastos, miócitos, adipócitos, fibroblastos, células epiteliais, ceratinócitos, e células neuronais.

Condrócitos, células progenitoras de condrócitos, e outras célu- las podem ser cultivados com potencial condrocítico em um estado que é adequado para tratar um paciente que sofre de um defeito de cartilagem. Tais condrócitos terapeuticamente úteis deveriam expressar componentes de matrizes extracelulares específicos para cartilagem articular, incluindo, mas não limitados a, colágeno do tipo Il e proteoglicanos característicos de cartilagem articular semelhante a hialina. Ensaios para determinar o estado de diferenciação de condrócitos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em R. Tubo e L. Brown, Articular Cartilage. Em: Human Cell Cultu- re; Volume V, Koller et al., eds. (2001) e nos Exemplos.

Outras células para as quais o DM da presente invenção pode ser usado incluem quaisquer células primárias ou em passagens, ou células como parte de tecidos cultivados, que são capazes de crescer em DM. E- xemplos de outras células incluem hepatócitos, células beta, e células da ilhota.

Condrócitos e outras células podem ser isolados de qualquer mamífero, incluindo, sem limitação, ser humano, orangotango, macaco, chimpanzé, cachorro, gato, rato, coelho, camundongo, cavalo, vaca, porco, elefante, etc. Células para as quais o DM da presente invenção pode ser usado incluem quaisquer células primárias ou em passagens, ou células como parte de tecidos cultivados que são capazes de crescer no DM. IV. MÉTODOS DE CULTURA DE CÉLULA

A célula pode ser cultivada usando qualquer método de cultura de célula adequado apropriado para um tipo de célula e aplicação particula- res. Métodos de cultura de células são bem-conhecidos na técnica e descri- tos, por exemplo, em J. M. Davis, Basic Cell Culture, 2- ed. Oxford U. Press,2002.

Por exemplo, condrócitos podem ser passados em 80-90% de confluência usando 0,05% de tripsina-EDTA, diluídos para subcultura, e res- semeados para segunda passagem e subsequentes para permitir mais ex- pansão. Tripsina e EDTA são ambos facilmente disponíveis de Invitrogen (Carlsbad, CA). Alternativamente, células podem ser passadas através de incubação com uma solução contendo um agente quelante tal como EDTA. O uso de tais agentes quelantes para a separação não-enzimática das célu- Ias é bem-conhecido na técnica. Em uma modalidade particular, as células desenvolvidas no DM da invenção são passadas usando 0,1 mM a 1 mM de EDTA. Em uma modalidade preferida, células desenvolvidas no DM da in- venção são passadas usando menos que 0,0025% (ou 325 unidades/ml), preferivelmente 0,00025% (ou 32,5 unidades/ml), tripsina recombinante em .0,1 mM a 1 mM de EDTA. A qualquer hora, células podem ser colhidas e congeladas em DMEM contendo 10% de DMSO e 40% de HSA ou em ou- tras composições conhecidas na técnica, por exemplo, como descritas na patente U. S. No. 6.365.405.

Em algumas modalidades, as células podem ser inicialmente cultivadas em baixa densidade. O termo "baixa densidade" refere-se a den- sidades de semeadura de menos de 20.000 células/cm2.

Os métodos desta invenção são adequados para células que crescem em culturas sob várias condições incluindo, mas não limitadas a, monocamadas, multicamadas, em suporte sólido, em suspensão, e em cul- turas 3D.

V. MÉTODOS DE AVALIAR OS MEIOS

Em algumas modalidades, um meio da invenção pode ser testa- do quanto à capacidade para manter células em um estado competente de diferenciação, e em particular, para diferenciação/rediferenciação em con- drócitos quando as células forem colocadas em um ambiente permissivo. Proteoglicano, "aggrecan" e colágeno Il são exemplos de componentes da matriz extracelular normalmente segregados através dos condrócitos in vivo e podem servir como marcadores de função dos condrócitos. A capacidade do meio para manter o potencial de diferenciação dos condrócitos pode ser determinada através de ensaios de agarose e/ou alginato. O ensaio de aga- rose identifica a formação de proteoglican por células desenvolvidas em uma matriz de agarose tridimensional e é descrito, por exemplo, em Benya et al., Cell 30:215-224 (1982). O ensaio de alginato mede a expressão de genes de "aggrecan" e colágeno Il em células cultivadas em uma suspensão de algi- nato e é descrito, por exemplo, em Yaeger et al., Exp. Cell. Res. 237(2):318- .25 (1997); e Gagne et al., J. Orthop Res. 18(6):882-890 (2000). VI. MÉTODOS DE USAR AS CÉLULAS

A invenção também fornece células cultivadas usando os méto- dos da invenção e métodos de usar tais células, por exemplo, em terapia, por exemplo, para tratar um sujeito administrando ao sujeito tais células. Por exemplo, os métodos incluem reparo de defeitos de cartilagem (por exemplo, devido a trauma ou osteoartrite) administrando condrócitos (por exemplo, condrócitos autólogos) cultivados de acordo com os métodos da invenção.

EXEMPLOS

Vários aspectos da invenção são também descritos e ilustrados nos Exemplos apresentados abaixo.

EXEMPLO 1: IL-6 AUMENTA O RENDIMENTO E PROLIFERAÇÃO CELU- LARES DE CONDRÓCITOS HUMANOS PRIMÁRIOS

Condrócitos humanos primários foram isolados de biópsias de cartilagem articular mediante corte da amostra seguido por digestão enzimá- tica com 0,25% de protease do tipo XIV (Streptomyces griseus) durante uma hora e depois 0,1% de colagenase durante a noite a 37 °C. Células foram restabelecidas através de centrifugação durante cinco minutos a 1.000 χ g e ressuspensas no meio de teste apropriado. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram banhadas a uma densidade de 3.000 células por cm2 e as células desenvolvidas em meio livre de soro foram banhadas a uma densidade de 5.000 células por cm2. Frascos T75 foram usados para todos os experimentos. Os meios a seguir foram testados: .1) DMEM + 10% de FBS

.2) cDRF/P/L como definido na Tabela 8

.3) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 0,2 ng/ml de IL-6

.4) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 1,0 ng/ml de IL-6

Células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluência. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS, colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das, e ressemeadas. As células desenvolvidas em meios livres de soro fo- ram enxaguadas com PBS, colhidas através de exposição a 0,00025% de Trypzean™ (0,1 χ tripsina recombinante; Sigma-AIdrich, St., Louis, MO) em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. Rendimento celular foi determi- nado e dobramentos da população calculados ao término de cada passa- gem. Rendimento celular foi maior para células desenvolvidas em cDRF/P/L + IL-6 em todas as passagens examinadas (Tabela 9). O índice de cresci- mento para células desenvolvidas em cDRF/P/L + IL-6 foi aproximadamente igual ao índice de crescimento para células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS e excedeu ao das células desenvolvidas sozinhas em cDRF/P/L (Tabela 10). Estes resultados indicam que cDRF/P/L suplementado com IL-6 é uma substituição eficaz para meios contendo soro.

TABELA 8. Hnmnosican rte nDRF/P/l-

<table>table see original document page 33</column></row><table>

TABELA 9.

<table>table see original document page 33</column></row><table> TABELA 10 <table>table see original document page 34</column></row><table> EXEMPLO 2:OSM AUMENTA RENDIMENTO E PROLIFERAÇÃO CELU- LARES DE CONDRÓCITOS HUMANOS PRIMÁRIOS Condrócitos humanos primários foram isolados de biópsias de

cartilagem articular cortando a amostra seguido por digestão enzimática com 0,25% de protease do tipo XIV (Streptomyces griseus) durante uma hora e depois 0,1% de colagenase durante a noite a 37 °C. Células foram restabe- lecidas através de centrifugação durante cinco minutos a 1.000 χ g e ressus- pensas no meio de teste apropriado. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram banhadas a uma densidade de 3.000 células por cm2 e as células desenvolvidas em meio livre de soro foram banhadas a uma den- sidade de 5.000 células por cm2. Frascos T75 foram usados para todos os experimentos. Os meios a seguir foram testados: .1) DMEM+ 10% de FBS

.2) cDRF/P/L como definido na Tabela 8

.3) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 0,1 ng/ml de OSM

.4) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 0,5

ng/ml de OSM

5) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 1.0

ng/ml de OSM

Células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluência. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS, colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das e semeadas. As células desenvolvidas em meios livres de soro foram enxaguadas com PBS1 colhidas através de exposição a 0,00025% de Tryp- zean® (0,1 χ tripsina recombinante; Sigma-AIdrich, St., Louis, MO) em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. Rendimento celular foi determinado e dobramentos da população calculados ao término de cada passagem. Os dados na Tabela 11 indicam que o rendimento celular foi maior para células desenvolvidas em cDRF/P/L + OSM em todas as passagens examinadas. O índice de crescimento para células em cDRF/P/L + OSM foi cerca de igual ao índice de crescimento para células em DMEM + 10% de FBS e excedeu ao das células em cDRF/P/L sozinho (Tabela 12). Estes resultados indicam que cDRF/P/L suplementado com OSM é uma substituição eficaz para mei- os contendo soro.

TABELA 11.

<table>table see original document page 35</column></row><table>

TABELA 12.

<table>table see original document page 35</column></row><table> EXEMPLO 3:LIF AUMENTA RENDIMENTO E PROLIFERAÇÃO CELULA- RES DE CONDRÓCITOS HUMANOS PRIMÁRIOS

Condrócitos humanos primários foram isolados de biópsias de cartilagem articular cortando a amostra seguido por digestão enzimática com .0,25% de protease do tipo XIV (Streptomyces griseus) durante uma hora e depois 0,1% de colagenase durante a noite a 37 °C. Células foram restabe- lecidas através de centrifugação durante cinco minutos a 1.000 χ g e ressus- pensas no meio de teste apropriado. Células desenvolvidas em DMEM + .10% de FBS foram banhadas a uma densidade de 3.000 células por cm2 e as células desenvolvidas em meio livre de soro foram banhadas a uma den- sidade de 5.000 células por cm2. Frascos T75 foram usados para todos os experimentos. Os meios a seguir foram testados:

1) DMEM+ 10% de FBS

2) cDRF/P/L como definido na Tabela 8

3) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 0,1

η g/ml LIF 4) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 0,5 η g/ml LIF

5) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 2,0 η g/ml LIF

Células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluência. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS, colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das e semeadas. As células desenvolvidas em meios livres de soro foram enxaguadas com PBS, colhidas através de exposição a 0,00025% de tryp- zean® (0,1x tripsina recombinante; Sigma-AIdrich, St., Louis, MO) em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. Rendimento celular foi determinado e dobramentos da população calculados ao término de cada passagem. Os dados na Tabela 13 indicam que, após a primeira passagem, o rendimento de célula foi maior para células desenvolvidas em cDRF/P/L + LIF. O índice de crescimento para células em cDRF/P/L + LIF foi sozinho maior que o ín- dice de crescimento para células em cDRF/P/L na segunda passagem (Ta- bela 14). Estes resultados indicam que cDRF/P/L suplementado com LIF é uma substituição eficaz para meios contendo soro.

TABELA 13.

<table>table see original document page 37</column></row><table>TABELA 14.

EXEMPLO 4:IL-6 E OSM JUNTOS AUMENTAM RENDIMENTO CELULAR DE CONDRÓCITOS HUMANOS PRIMÁRIOS

Condrócitos humanos primários foram isolados de biópsias de cartilagem articular cortando a amostra seguido por digestão enzimática com 0,25% de Protease do tipo XIV (Streptomyces griseus) durante uma hora e depois 0,1% de colagenase durante a noite a 37 °C. Células foram restabe- lecidas através de centrifugação durante cinco minutos a 1.000 χ g e ressus- pensas no meio de teste apropriado. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram banhadas a uma densidade de 3.000 células por cm2 e as células desenvolvidas em meio livre de soro foram banhadas a uma den- sidade de 5.000 células por cm2. Frascos T75 foram usados para todos os experimentos. Os meios a seguir foram testados:

1) DMEM + 10% de FBS

2) cDRF/P/L como definido na Tabela 8

3) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 1,0 η g/m I de IL-6

4) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 0,5 η g/m I de OSM

5) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 1,0 η g/ml de IL-6 + 0,5 ng/ml de OSM

As células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluên- cia. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS1 colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das e semeadas. As células desenvolvidas em meios livres de soro foram enxaguadas com PBS, colhidas através de exposição a 0,00025% de tryp- zean® (0,1 χ tripsina recombinante; Sigma-AIdrich, St., Louis, MO) em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. Rendimento celular foi determinado e dobramentos da população calculados ao término de cada passagem. Os dados na Tabela 15 indicam que o rendimento celular foi maior para células desenvolvidas em cDRF/P/L + IL-6, cDRF/P/L + OSM, ou cDRF/P/L + IL-6 + OSM. Estes resultados indicam que cDRF/P/L suplementado com IL-6 e OSM é uma substituição eficaz para meios contendo soro.

TABELA 15.

<table>table see original document page 38</column></row><table> EXEMPLO 5:JAG-1 INIBE CRESCIMENTO DE CONDRÓCITOS EM MEIO

LIVRE DE SORO

1) DMEM + 10% de FBS

2) cDRF/P/L como definido na Tabela 8

3) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 2,0 μg/m I JAG-1

As células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluên- cia. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS, colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das e semeadas. As células desenvolvidas em meios livres de soro foram enxaguadas com PBS, colhidas através de exposição a 0,00025% de tryp- zean® (0,1 χ tripsina recombinante; Sigma-AIdrich, St., Louis, MO) em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. Rendimento celular foi determinado e dobramentos da população calculados ao término de cada passagem. Os dados na Tabela 16 indicam que o rendimento de célula em cDRF/P/L foi aproximadamente 2 vezes maior que o rendimento em DMEM + 10% de FBS. Porém, quando JAG-1 foi acrescentado a cDRF/P/L, o rendimento ce- lular diminuiu cerca de 16 vezes comparado a cDRF/P/L sozinho. Igualmen- te, o índice de crescimento para células desenvolvidas na presença de JAG- 1 foi apenas 0,004, comparado a 0,24 para células em cDRF/P/L sem JAG- 1. Estes resultados indicam que, sob as condições testadas, cDRF/P/L su- plementado com JAG-1 não é uma substituição eficaz para meios contendo soro.

TABELA 16.

<table>table see original document page 40</column></row><table>

EXEMPLO 6:IL-13 INIBE CRESCIMENTO DE CONDRÓCITOS EM MEIO LIVRE DE SORO

1) DMEM +10% de FBS

2) cDRF/P/L como definido na Tabela 8

3) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 3.0 ng/ml de IL-13

4) cDRF/P/L como definido na Tabela 8, suplementado com 10,0 ng/ml de IL-13

Células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluência. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS1 colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das e semeadas. As células desenvolvidas em meios livres de soro foram enxaguadas com PBS1 colhidas através de exposição a 0,00025% de Tryp- zean® (0,1 χ tripsina recombinante; Sigma-Aldrich1 St., Louis, MO) em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. Rendimento celular foi determinado e dobramentos da população calculados ao término de cada passagem. Os dados na Tabela 17 indicam que o rendimento de célula em cDRF/P/L foi aproximadamente 2 vezes maior que o rendimento em DMEM + 10% de FBS. Porém, quando IL-13 foi acrescentada a cDRF/P/L, o rendimento celu- lar diminuiu de uma maneira dose-dependente. Concentrações de IL-13 de 3 ng/mol e 10 ng/ml diminuíram o rendimento celular em 32% e 46%, respecti- vamente, comparado a cDRF/P/L sozinho. Além disso, o tempo em cultura requerido para alcançar 50% a 80% de confluência foi aumentado na pre- sença de IL-13, resultando em um índice de crescimento de apenas 0,07 ou 0,06. Estes resultados indicam que, sob as condições testadas, cDRF/P/L suplementado com 1L-13 não é uma substituição eficaz para meios contendo soro.

TABELA 17.

<table>table see original document page 41</column></row><table> EXEMPLO 7:0 MEIO DE E93 AUMENTA RENDIMENTO E PROLIFERA- ÇÃO CELULARES DE CONDRÓCITOS

Condrócitos humanos primários foram isolados de biópsias de cartilagem articular cortando a amostra seguido por digestão enzimática com 0,25% de protease do tipo XIV (Streptomyces griseus) durante uma hora e depois 0,1% de colagenase durante a noite a 37°C. Células foram restabele- cidas através de centrifugação durante cinco minutos a 1.000 χ g e ressus- pensas no meio de teste apropriado. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram banhadas a uma densidade de 3.000 células por cm2 e as células desenvolvidas em meio livre de soro foram banhadas a uma den- sidade de 5.000 células por cm2. Frascos T75 foram usados para todos os experimentos. Os meios a seguir foram testados:

1) DMEM + 10% de FBS

2) cDRFm como definido na Tabela 4, suplementado com 5 μΙ/ml de CDLM como definido na Tabela 5, 10 ng/ml de PDGF, 1 ng/ml de IL-6 e 0,5 ng/ml de OSM (referido aqui como Έ93").

Células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluência. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS1 colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das e semeadas. Células desenvolvidas no meio de E93 foram enxaguadas com PBS, colhidas através de exposição a 0,00025% de trypzean® em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. Rendimento celular foi determinado e dobramentos da população calculados ao término de cada passagem. O índice de crescimento para células em E93 foi igual ou maior que o índice de crescimento para células em DMEM + 10% de FBS (Tabela 18, Figura 1). O rendimento celular para células desenvolvidas em E93 foi grandemente au- mentado comparado às células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS (Tabela 19, Figura 2). Estes resultados indicam que cDRFm suplementado com CDLM, PDGF, IL-6 e OSM é uma substituição eficaz para meios con- tendo soro.

<table>table see original document page 42</column></row><table>

TABELA 19.

<table>table see original document page 42</column></row><table> EXEMPLO 8:MEI0 SUPLEMENTADO COM IL-6 E OSM MANTÉM CAPA- CIDADE DE REDIFERENCIAÇÃO DE CONDRÓCITOS EM CULTURA TRI- DIMENSIONAL

Condrócitos humanos primários foram isolados de biópsias de cartilagem articular cortando a amostra seguido por digestão enzimática com 0,25% de protease do tipo XIV (Streptomyces griseus) durante uma hora e depois 0,1% de colagenase durante a noite a 37°C. Células foram restabele- cidas através de centrifugação durante cinco minutos a 1.000 χ g e ressus- pensas no meio de teste apropriado. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram banhadas a uma densidade de 3.000 células por cm2 e as células desenvolvidas em meio livre de soro foram banhadas a uma den- sidade de 5.000 células por cm2. Frascos T75 foram usados para todos os experimentos. Os meios a seguir eram usados:

.1) DMEM +10% de FBS

.2) Meio de E93 livre de soro como descrito no Exemplo 7

Células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluência. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS, colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das e semeadas. Células desenvolvidas foram enxaguadas em meio livre de soro com PBS, colhidas através de exposição a 0,00025% de Trypzean® em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas.

Após a terceira passagem, as células foram testadas quanto à habilidade para se rediferenciar quando medidas por formação de colônias e a produção de proteoglicano em agarose (Benya et al., Cell 30:215-224 (1982)). Cinqüenta mil células foram ressuspensas em 2% de agarose e ba- nhadas em placas de 60 mm. Células em agarose foram cultivadas em DMEM + 10% de FBS a 37 °C, e realimentadas 24 horas após colocação na placa, e cada 2 a 3 dias depois disso. Após 21 dias em cultura, as placas foram fixadas com 10% de formalina, enxaguadas, tingidas com 0,2% de safranina, e enxaguadas para remover coloração de antecedentes extensi- vamente. O número de colônias, que tingiram positivo para proteoglicano, e foi igual ou maior que 50 mícrons em tamanho, foi determinado. Placas nas quais mais que 6,8% das células formaram colônias proteoglican-positivas e satisfizeram os critérios de tamanho mínimo foram registradas como "apro- vada". Todas as cepas foram testadas em triplicata. Cepas de célula de seis biópsias foram examinadas. Como mostrado na Tabela 17, todas as seis cepas foram aprovadas no ensaio de agarose se elas fossem crescidas em meios contendo soro ou livres de soro. Estes resultados também indicam que cDRFm suplementado com CDLM1 PDGF, IL-6 e OSM é uma substitui- ção eficaz para meios contendo soro.

TABELA 20

<table>table see original document page 44</column></row><table>

EXEMPLO 9: RENDIMENTO CELULAR MÉDIO PARA DEZ CEPAS DE CONDRÓCITOS É MAIOR EM MEIO SUPLEMENTADO COM IL6 E OSM QUE EM DMEM SUPLEMENTADO COM SORO

Condrócitos humanos primários foram isolados de biópsias de cartilagem articular cortando a amostra seguido por digestão enzimática com 0,25% de protease do tipo XIV (Streptomyces griseus) durante uma hora e depois 0,1% de colagenase durante a noite a 37°C. Células foram restabele- cidas através de centrifugação durante cinco minutos a 1.000 χ g e ressus- pensas no meio de teste apropriado. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram banhadas a uma densidade de 3.000 células por cm2. Células desenvolvidas em meio livre de soro foram banhadas em 5.000 célu- las por cm2 (E93 alto) ou 3.000 células por cm2 (E93 baixo). Frascos T75 foram usados para todos os experimentos. Os meios a seguir foram testa- dos:

1) DMEM + 10% de FBS; 2) meios de E93, como descrito no Exemplo 7.

Células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluência. Células desenvolvidas em DMEM suplementado com 10% de FBS foram enxaguadas com PBS, colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA1 contadas e semeadas. Células desenvolvidas em meios de E93 foram enxaguadas com PBS1 colhidas através de exposição a 0,00025% de trypzean® (0,1 χ tripsina recombinante; Sigma-AIdrich, St., Louis, MO) em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. Um total de dez biópsias foi pro- cessado para gerar dez cepas diferentes. Rendimento de célula por frasco foi determinado ao término de cada passagem e normalizado ao rendimento celular P1 em DMEM suplementado com 10% de FBS. O rendimento celular médio para células desenvolvidas em E93 na placa de densidade alta ou baixa foi grandemente aumentado comparado às células desenvolvidas em DMEM suplementado com 10% de FBS (Tabela 21). Estes resultados indi- cam que E93 é uma substituição eficaz para meios contendo soro.

TABELA 21.

<table>table see original document page 45</column></row><table>

EXEMPLO 10: MEIO SUPLEMENTADO COM IL6 E OSM MANTÉM CAPA- CIDADE DOS CONDRÓCITOS DE REEXPRESSAR COLÁGENO DO TIPO 2 E AGGRECAN EM CULTURA DE SUSPENSÃO DE ALGINATO

Condrócitos humanos primários foram preparados como descrito no Exemplo 9. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS ou E93 fo- ram colhidas na terceira passagem para cultura de alginato. Culturas de al- ginato foram fixadas através de semeadura 1 χ 106 células em uma solução a 1,2% de alginato. Culturas de alginato foram alimentadas a cada 3-5 dias com EGHIC (DMEM, 20 ng/mL de rhlGF-1, 25 pg/ml de ácido ascórbico, e 1 mM de piruvato de sódio). Após 21 dias de cultura, os condrócitos foram ex- traídos das contas de alginato e mRNA para colágeno do tipo I, colágeno do tipo Il e "aggrecan" foram detectados usando um ensaio de proteção de ri- bonuclease (RPA). Neste ensaio, colágeno do tipo Il é detectado como uma banda de 310 pares de base (bp) em um gel, colágeno do tipo I é uma ban- da de 260 bp, e "aggrecan" é uma banda de 210 bp. Figura 3 mostra que quantidades crescentes de células Iisadas de células desenvolvidas em E93 (linhas 2, 3 e 4) ou DMEM suplementado com 10% soro (linhas 5, 6 e 7) con- têm mRNA para colágeno do tipo Il e "aggrecan". Isto indica que condrócitos humanos crescidos em meios de E93 são capazes de re-expressão destes marcadores de cartilagem importantes.

EXEMPLO 11: CARIÓTIPO E SENESCÊNCIA DOS CONDRÓCITOS CRESCIDOS EM MEIO SUPLEMENTADO COM IL6 E OSM

Pode ser importante que as células mantenham um cariótipo normal e entrem na senescência durante a cultura, por exemplo, se as célu- las forem usadas para terapia humana. Condrócitos crescidos em E93 exibi- ram um cariótipo normal através de pelo menos dez passagens e entraram em senescência após cerca de trinta dobramentos da população. EXEMPLO 12: NÍVEIS BAIXOS DE CITOCINAS ESTIMULAM CRESCI- MENTO DE CONDRÓCITOS

Condrócitos humanos primários foram isolados de biópsias de cartilagem articular cortando a amostra seguido por digestão enzimática com 0,25% de protease do tipo XIV (Streptomyces griseus) durante uma hora e depois 0,1% de colagenase durante a noite a 37 °C. Células foram restabe- lecidas através de centrifugação durante cinco minutos a 1.000 χ g e ressus- pensas no meio de teste apropriado. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram banhadas a uma densidade de 3.000 células por cm2. Células desenvolvidas em meio livre de soro foram banhadas em cada 5.000 células por cm2. Frascos T75 foram usados para todos os experimentos. Os meios a seguir foram testados:

1) DMEM + 10% de FBS

2) meios de E93, como descrito no exemplo 7

3) meios de E93 com 0,5 ng/ml de IL-6 e 0,25 ng/ml de OSM

4) meios de E93 com 0,1 ng/nl de IL-6 e 0,05 ng/ml de OSM

Células foram passadas ao alcançar 50% a 80% de confluência. Células desenvolvidas em DMEM + 10% de FBS foram enxaguadas com PBS, colhidas por exposição a 325 unidades/ml de tripsina em EDTA, conta- das e semeadas. Células desenvolvidas em meios de E93 foram enxagua- das com PBS, colhidas através de exposição a 0,00025% de trypzean® (0,1x tripsina recombinante; Sigma-AIdrich, St., Louis, MO) em 0,5 mM de EDTA, contadas e ressemeadas. A taxa de crescimento, expressa como do- bramentos da população por dia, foi calculada ao término de cada passagem (Tabela 22). Estes resultados indicam que níveis baixos de IL-6 e OSM em E93 suportam crescimento de condrócitos humanos primários.

TABELA 22 <table>table see original document page 47</column></row><table>

Todas as referências citadas dentro do relatório descritivo são incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims

1. Meio de cultura compreendendo um meio basal suplementa- do com oncostatina M substancialmente pura (OSM).

2. Meio de cultura da reivindicação 1, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com interleucina-6 substancialmente pura (IL-6).

3. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com fator inibidor de leucemia substancialmente puro (LIF).

4. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com IL-6 substancialmente pura e LIF substancialmente puro.

5. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio basal é cDRF.

6. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com fator de crescimento deri- vado de plaquetas substancialmente puro (PDGF).

7. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com um ou mais lipídios selecio- nados do grupo que consiste em ácido esteárico, ácido mirístico, ácido ólei- co, ácido linoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido araquidônico, ácido linolênico, colesterol, e acetato de alfa-tocoferol.

8. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio basal é cDRF e é adicionalmente suplementado com PDGF e uma mis- tura de lipídios quimicamente definidos (CDLM).

9. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio basal é cDRFm e é adicionalmente suplementado com PDGF e CDLM.

10. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 2, em que o meio basal é cDRFm e é adicionalmente suplementado com PDGF e CDLM.

11. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio de cultura não é suplementado com jaggedl substancialmente puro (JAG1) e/ou interleucina-13 substancialmente pura (IL-13).

12. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que OSM está presente em uma concentração de 0,01 ng/ml a 10 ng/ml no meio de cultura.

13. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 2, em que cada um de OSM e IL-6 está presente em uma concentração de 0,01 ng/ml a 10 ng/ml no meio de cultura.

14. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 3, em que cada um de OSM e LIF está presente em uma concentração de 0,01 ng/ml a 10 ng/ml no meio de cultura.

15. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 4, em que cada um de OSM, IL-6, e LIF está presente em uma concentração de 0,01 ng/ml a 10 ng/ml no meio de cultura.

16. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio de cultura é livre de soro.

17. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, em que o meio de cultura também compreende soro.

18. Meio de cultura compreendendo: (a) cDRFm; (b) 0,1 - 100 ng/ml de PDGF; (c) 0,05 - 5% de CDLM; (d) 0,01 -10 ng/ml de OSM; e (e) 0,01 -10 ng/ml de IL-6.

19. Método de cultivar células, compreendendo a etapa de incu- bar a célula com um meio de cultura compreendendo um meio basal suple- mentado com OSM substancialmente pura.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com IL-6 substancialmente pura.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com LIF substancialmente puro.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com IL-6 substancialmente pura e LIF substancialmente puro.

23. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio basal é cDRF.

24. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com PDGF substancialmente puro.

25. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio basal é adicionalmente suplementado com um ou mais lipídios selecionados do grupo que consiste em ácido esteárico, ácido mirístico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido araquidônico, ácido Iino- lênico, colesterol, e acetato de alfa-tocoferol.

26. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio basal é cDRF e é adicionalmente suplementado com PDGF e CDLM.

27. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio basal é cDRFm e é adicionalmente suplementado com PDGF e CDLM.

28. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o meio basal é cDRFm e é adicionalmente suplementado com PDGF e CDLM.

29. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio de cultura não é suplementado com JAG1 substancialmente puro e/ou IL-13 substancialmente pura.

30. Método de acordo com a reivindicação 19, em que OSM está presente em uma concentração de 0,01 ng/ml a 10 ng/ml no meio de cultura.

31. Método de acordo com a reivindicação 20, em que cada um de OSM e IL-6 está presente em uma concentração de 0,01 ng/ml a 10 ng/ml no meio de cultura.

32. Método de acordo com a reivindicação 21, em que cada um de OSM e LIF está presente em uma concentração de 0,01 ng/ml a 10 ng/ml no meio de cultura.

33. Método de acordo com a reivindicação 22, em que cada um de OSM, IL-6, e LIF está presente em uma concentração de 0,01 ng/ml a 10 ng/ml no meio de cultura.

34. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio de cultura é livre de soro.

35. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o meio de cultura também compreende soro.

36. Método de acordo com a reivindicação 19, em que as células são condrócitos.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que os con- drócitos são dediferenciados.

38. Método de acordo com a reivindicação 36, em que os con- drócitos são derivados de células-tronco mesenquimais.

39. Método de acordo com a reivindicação 36, em que os con- drócitos são condrócitos humanos.

40. Método de acordo com a reivindicação 36, em que os con- drócitos são condrócitos articulares humanos.

41. Método de acordo com a reivindicação 36, em que os con- drócitos são primários.

42. Método de acordo com a reivindicação 19, também compre- endendo a etapa de passar as células.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, em que a célula é passada incubando as células com uma solução compreendendo um agente quelante.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o agente quelante é EDTA.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que EDTA está presente na solução em uma concentração de 0,1 mM a 1 mM.

46. Método de acordo com a reivindicação 42, em que as células são passadas incubando as células com uma solução contendo menos de -325 unidades/ml de tripsina.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que a solução contém de 0,1 mM a 1 mM de EDTA.

48. Método de acordo com a reivindicação 19, em que as células são semeadas a uma densidade de menos do que 20.000 células/cm2.

49. Método para cultivar um condrócito, compreendendo a etapa de incubar o condrócito com um meio de cultura compreendendo: (a) cDRFm; (b) 0,1 -100 ng/ml de PDG F; (c) 0,05 - 5% de CDLM; (d) 0,01 -10 ng/ml de OSM; e (e) 0,01 -10 ng/ml de IL-6.

50. Condrócito cultivado usando o meio de cultura como dfinido na reivindicação 1.

51. Condrócito cultivado usando o método como definido na rei- vindicação 19.

52. Condrócito cultivado usando o método como definido na rei- vindicação 49.

53. Método de tratar um defeito de cartilagem em um sujeito, compreendendo: (a) cultivar um condrócito usando o Método de acordo com a reivindicação 1; e (b) administrar o condrócito ao sujeito.

54. Método de tratar um defeito de cartilagem em um sujeito, compreendendo: (a) cultivar um condrócito usando o método como definido na reivindicação 19; e (b) administrar o condrócito ao sujeito.

55. Método de tratar um defeito de cartilagem em um sujeito, compreendendo: (a) cultivar um condrócito usando o método como definido na reivindicação 49; e (b) administrar o condrócito ao sujeito.

56. Composição compreendendo um condrócito e o meio de cul- tura como definido na reivindicação 1.

57. Composição compreendendo um condrócito e um meio de cultura compreendendo: (a) cDRFm; (b) 0,1 - 100 ng/ml de PDGF; (c) 0,05 - 5% de CDLM; (d) 0,01 -10 ng/ml de OSM; e (e) 0,01 -10 ng/ml de IL-6.

58. Meio de cultura compreendendo um meio basal suplementa- do com: (a) um ou ambos de PDGF e CDLM substancialmente puros; e (b) um ou mais de OSM substancialmente pura, IL-6 substanci- almente pura, e LIF substancialmente puro.

59. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 58, em que o meio basal é cDRF.

60. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 58, em que o meio basal é cDRFm.

61. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 58, em que o meio basal é suplementado com PDGF e CDLM substancialmente puros.