BRPI0713683A2 - sistemas e métodos para criopreservação de células - Google Patents

Abstract

SISTEMAS E MéTODOS PARA CRIOPRESERVAçãO DE CéLULAS. Um dispositivo de autonucleação inclui um tubo que contém uma matriz de colesterol cristalino. As extremidades do tubo são fechadas por uma membrana que é impermeável ao colesterol, mas permeável a líquidos contidos em um recipiente de criopreservação. O dispositivo de autonucleação propicia um local para nucleação de gelo durante congelamento do líquido dentro do recipiente. Tal recipiente de criopreservação é um frasco flexível que possui uma porta fechada em uma extremidade adaptada para ser perfurada por uma agulha para retirar o líquido de dentro, e uma extremidade oposta que é inicialmente aberta para receber o líquido. Outro recipiente inclui um adaptador montado no recipiente de líquido com uma ramificação tubular fechada por um septo de agulha e outra ramificação tubular munida de um encaixe farpado para engatar um tubo flexível que termina em um septo de agulha. Em outra modalidade, o recipiente inclui uma ramificação de entrada e ventilação no topo do recipiente e um septo de saída em uma abertura inferior.

Description

SISTEMAS E MÉTODOS PARA CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos de armazenamento e dispositivos associados para criopreservação de células, tais como células mamárias, e amostras/espécimes de tecido.

Células e tecidos são freqüentemente criopreservados para estender temporariamente sua viabilidade e utilidade em aplicações biomédicas. 0 processo de criopreservação envolve, em parte, colocar células em soluções aquosas que contenham eletrólitos e compostos químicos que protegem as células durante o processo de congelamento (crioprotetores). Tais crioprotetores são freqüentemente moléculas de pequeno peso molecular tais como glicerol, propileno glicol, etileno glicol ou dimetil sulfóxido (DMSO).

À medida que estas soluções são resfriadas a temperaturas ligeiramente abaixo de seu ponto de congelamento, a solução permanece no estado líquido. Esta condição na qual a solução permanece líquida abaixo de sua temperatura de transição de fase é chamada de superesfriamento. À medida que as soluções aquosas são resfriadas ainda mais abaixo do seu ponto de congelamento, a extensão de superesfriamento aumenta. Na ausência de intervenção, as moléculas de água na solução irão, em um ponto normalmente não mais do que 150C abaixo do ponto de congelamento, espontaneamente cristalizar, e água pura se precipitará como gelo.

Durante esta transição do estado líquido para o sólido, a solução se move de um estado de energia livre mais elevado para um inferior, resultando em uma reação exotérmica. 0 calor produzido durante esta transição de fase provoca um aquecimento transitório da amostra durante o qual a temperatura de amostra aumenta. Enquanto isso o ambiente circundante (por exemplo, o dispositivo no qual a amostra está sendo criopreservada) ou permanece em uma temperatura constante ou continua a resfriar (dependendo da técnica de esfriamento utilizada). Subseqüentemente, à medida que o calor na amostra se dissipa, o desequilíbrio térmico entre a amostra e o dispositivo de esfriamento criado durante este evento faz com que a amostra submeta-se a uma taxa de esfriamento rápida para restabelecer equilíbrio térmico. Em muitos casos esta taxa de esfriamento rápida causa a formação de gelo intracelular, que normalmente resulta em morte celular. Esta formação de gelo intracelular é normalmente dependente da massa da amostra, das propriedades de transferência de calor do recipiente de amostra, do protocolo de esfriamento utilizado e das propriedades criobiológicas fundamentais das células.

A relação entre o estado congelado e sistemas vivos tem fascinado a humanidade por anos. Já em 1683, Robert Boyle observou que alguns peixes e rãs poderiam sobreviver a temperaturas abaixo de congelamento por curtos períodos de tempo se uma fração de sua água corporal permanecesse não congelada. Criopreservação artificialmente induzida foi primeiro observada em 1948 por Polge, Smith e Parkes através da descoberta acidental das propriedades crioprotetoras de glicerol para sêmen de galináceos e touros e, subseqüentemente, para glóbulos vermelhos. Em tempos mais recentes, cientistas interessados nos fenômenos naturais e aplicações biomédicas associados ao congelamento de sistemas biológicos começaram a investigar os processos fundamentais que governam a relação. Para começar, é bem conhecido que temperatura diminuída resulta na supressão de atividade metabólica e, portanto, em uma redução da taxa na qual deterioração de um sistema biológico não-nutrido poderia ocorrer. 0 processo de congelamento, contudo, não é tão benigno quanto se presume; geralmente induz variações extremas em propriedades químicas, térmicas, e elétricas que poderiam ser esperadas para alterar organelas intracelulares, membranas celulares e os delicados sistemas de interação célula-célula associados a tecidos e órgãos. Na verdade, dada a extrema complexidade mesmo das mais simples células biológicas, é, por conseguinte, notável que um estado reversível de animação suspensa por congelamento seja de todo possível.

Desde aquela primeira descoberta dos efeitos crioprotetores de glicerol e da subsequente descoberta de dimetil sulfoxido crioprotetor de permeação amplamente aplicável (DMSO), muitos pesquisadores tentaram a preservação de células ou tecidos, geralmente através de métodos empíricos. A maioria dos protocolos de criopreservação de suspensão de células foi estabelecida utilizando concentrações molares de aditivos crioprotetores de permeação para permitir sobrevivência ao congelamento. Ao utilizar estes crioprotetores artificiais, foi adicionada muita flexibilidade ao processo de criopreservação. Por exemplo, glóbulos vermelhos humanos precisam ser esfriados a uma taxa de aproximadamente .1000°C/min. para sobrevivência ideal sem a adição de um agente crioprotetor (CPA) . Na presença de glicerol 3, 3M (30%), no entanto, a sobrevivência deste tipo de célula permanece aproximadamente em torno de 90% ao longo de uma faixa de 2-3 Iog em taxas de esfriamento. Como pode ser esperado, quanto mais alta a concentração de CPA, maior a probabilidade de dano osmótico durante a adição/remoção da substância e, conseqüentemente, maior o cuidado que é necessário nestes processos.

Durante qualquer processo de criopreservação, as soluções envolvidas irão superesfriar abaixo de seu ponto de congelamento até encontrarem um local aleatório de nucleação para formação de cristais. Ao criopreservar por um método de congelamento-descongelamento, formação de gelo no meio extracelular deveria ser deliberadamente iniciada por nucleação em baixos graus de superesfriamento. Se a formação de gelo não for induzida por nucleação, formar-se- á gelo espontaneamente quando a solução for resfriada suficientemente abaixo de seu ponto de congelamento de equilíbrio. Uma vez que este processo é aleatório por natureza, a formação de gelo ocorrerá a temperaturas imprevisíveis aleatórias; consequentemente, taxas de sobrevivência de amostras serão altamente variáveis entre testes repetidos com o mesmo protocolo de congelamento. Além disso, a cristalização extremamente rápida que resulta quando gelo se forma em uma solução altamente superesfriada causa dano a células e tecidos. Além disso, foi mostrado que se a formação de gelo extracelular é iniciada em altos graus de superesfriamento, a probabilidade de danificar a formação de gelo intracelular é drasticamente aumentada. Este fenômeno resulta do início atrasado da desidratação de célula induzida por congelamento, que resulta em retenção aumentada de água intracelular e, portanto, maior probabilidade de formação de gelo na célula.

Como observado acima, durante a transição do estado líquido para sólido, a solução se move de um estado de energia livre maior para um menor que resulta em desequilíbrio térmico entre a amostra que continua a aquecer e o dispositivo de esfriamento que continua a esfriar. Este desequilíbrio por fim resulta em um desvio severo da taxa de esfriamento prescrita para o tipo de célula específico e potencial para dano celular durante o processo.

Para impedir que estas situações potencialmente danificadoras ocorram, etapas no processo de criopreservação freqüentemente incluem intervenções para introduzir cristais de gelo na solução extracelular próximo ao ponto de congelamento de solução. Este processo chamado "nucleação" é normalmente executado pelo esfriamento das amostras até próximo do ponto de congelamento de solução e em seguida pelo toque da parte externa do recipiente de amostra com um dispositivo de metal (por exemplo, fórceps ou uma haste de metal) pré-resfriada em um fluido criogênico (por exemplo, nitrogênio líquido). Esta etapa da nucleação produz cristais de gelo na solução extracelular e propicia um "molde" no qual moléculas de água superesfriadas na solução se organizam e produzem gelo adicional. No entanto, nuclear amostras desta maneira é demorado e coloca as amostras em risco em casos onde as mesmas são temporariamente removidas dos dispositivos de esfriamento para este procedimento e porque este método de nucleação pode inadvertidamente provocar formação de gelo intracelular.

Existe a necessidade de um sistema de criopreservação que evite os problemas associados às condições de desequilíbrio descritas acima. Existe ainda uma necessidade por tal sistema que não exija a etapa de nucleação auxiliar atualmente conduzida para induzir produção controlada de cristais de gelo. Existe uma necessidade adicional por um dispositivo de criopreservação que facilite a solução dos problemas observados acima. O dispositivo de criopreservação necessário deveria também propiciar meios para simplificar seu uso em adquirir e armazenar células e tecidos a serem criopreservados. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Estas e outras necessidades no campo da criopreservação são preenchidas por diversos aspectos da presente invenção. Em um aspecto da invenção, um dispositivo de autonucleação é propiciado para introdução em um recipiente de criopreservação antes de congelamento de um líquido contido no mesmo. 0 dispositivo compreende um tubo alongado oco dimensionado para introdução no recipiente de criopreservação e um composto de nucleação de gelo colocado dentro do tubo oco. Ambas as extremidades do tubo são vedadas, enquanto pelo menos uma extremidade é vedada com uma membrana que é impermeável à composição de nucleação de gelo, porém permeável ao liquido contido dentro do recipiente de criopreservação. De preferência, ambas as extremidades incluem a membrana para permitir fluxo da amostra líquida dentro e através do dispositivo. Na modalidade preferida, a composição de nucleação de gelo é um esterol, e mais preferivelmente um colesterol. 0 colesterol pode ser um revestimento no interior do tubo oco ou pode ser propiciado como uma matriz sólida dentro do tubo.

Em outro aspecto da invenção, são propiciados recipientes de criopreservação que podem ser utilizados com o dispositivo de autonucleação. Em uma modalidade, o recipiente de criopreservação compreende um corpo tubular flexível que possui uma extremidade inicialmente aberta para a introdução de uma amostra líquida dentro do corpo e uma porta fechada definida em uma extremidade oposta ao corpo. A porta é adaptada para ser perfurada por uma agulha para remoção da amostra líquida. A extremidade aberta é vedada a calor após a amostra líquida ter sido introduzida dentro do recipiente. 0 dispositivo de autonucleação é afixado ao interior do corpo tubular deslocado da entrada de modo que não possa ser tocado por uma agulha que perfura a porta fechada.

Em outra modalidade, o dispositivo de criopreservação compreende um recipiente para receber e armazenar uma amostra líquida, o recipiente possuindo um encaixe de entrada que se abre para dentro do recipiente e um adaptador montado no encaixe. 0 adaptador possui uma primeira ramificação tubular e uma segunda ramificação tubular, com a segunda ramificação tubular terminando em um encaixe de engate de tubo. Um septo fecha a primeira ramificação tubular, na qual o septo é adaptado para ser perfurado por uma agulha. 0 dispositivo de criopreservação é ainda munido de um tubo engatado em uma extremidade ao encaixe de engate de tubo na segunda ramificação tubular e um fechamento na extremidade oposta do tubo.

O fechamento para a segunda ramificação é inicialmente um septo que pode ser perfurado por uma agulha para a introdução da amostra líquida no recipiente. 0 recipiente pode estar inicialmente abaixo da pressão atmosférica para aprimorar a transferência do líquido de amostra de uma seringa para dentro do recipiente. Logo que o líquido de amostra é transferido, o tubo da segunda ramificação é vedado a calor e separado logo acima do encaixe de engate de tubo para formar um fechamento final para a segunda ramificação. 0 dispositivo fechado pode então ser submetido a um protocolo de congelamento e descongelamento. Após descongelamento, uma seringa pode ser usada para retirar um líquido de amostra através do septo na primeira ramificação do adaptador.

Contempla-se que a presente invenção propiciará um sistema simples e reproduzível para indução de gelo e redução de superesfriamento em muitas aplicações diferentes de congelamento de célula. A invenção contempla métodos e dispositivos para a indução controlada de cristais de gelos extracelulares durante criopreservação de células e tecidos via a construção de dispositivos de matriz de estado-sólido onde nucleação de gelo irá ocorrer espontaneamente.

A presente invenção apresenta diversas vantagens em relação a sistemas e métodos anteriores. Atualmente, a maioria dos métodos de indução de nucleação de gelo controlada é incômoda, difícil de reproduzir, e é muitas vezes negligenciada, apesar do vasto corpo de literatura que aponta para a sobrevivência realçada de congelamento- descongelamento de muitas células e tecidos quando a técnica é empregada. Até o momento, os métodos mais comumente usados variaram de simplesmente tocar o lado de um frasco ou palha com um objeto de metal resfriado (normalmente a -196°C) ou uma mecha de algodão, para elaborar dispositivos projetados para pulverizar nitrogênio líquido em uma área pequena da amostra. Contudo, mesmo quando executadas sob condições ideais, nuclear mecanicamente cristais de gelo desta maneira pode resultar em um fracasso para induzir um cristal de gelo grande o suficiente para permitir propagação completa por toda a solução extracelular, ou, em dano celular localizado e perda devidos às enormes taxas de esfriamento observadas na porção da amostra mais próxima para onde o objeto de metal ou pulverização de nitrogênio líquido está sendo direcionado no recipiente.

Um objetivo da invenção é propiciar métodos e dispositivos de criopreservação celular que facilitem significantemente o congelamento de uma amostra líquida. Um benefício da invenção é que a mesma reduz enormemente a quantidade de células que são danificadas durante a criopreservação. Outro benefício é que a mesma permite a criopreservação de amostras de esperma de baixa mobilidade e/ou baixa contagem que não poderiam ser preservadas utilizando técnicas anteriores.

Outro benefício da presente invenção é que a mesma propicia recipientes de criopreservação que são sistemas fechados, mas que estão prontamente acessíveis para armazenamentos múltiplos de amostras submetidas a diferentes regimes de congelamento/descongelamento. Outros benefícios e objetivos da invenção tornar-se-ão evidentes após consideração da descrição escrita que segue e figuras em anexo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A FIG. 1 é uma vista de um Dispositivo de autonucleação, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

A FIG. 2 é uma vista de recipientes de criopreservação conhecidos que incorporam o dispositivo de autonucleação mostrado na FIG. 1.

A FIG. 3a é uma vista de um frasco de sistema fechado flexível para criopreservação de amostras de líquidos de acordo com uma modalidade adicional da invenção, com o frasco mostrado em uma condição inicial para entrega de uma amostra.

A FIG. 3b é uma vista do frasco mostrado na FIG. 3a, mostrado com a extremidade do frasco vedada.

A FIG. 4 é uma vista em perspectiva de um dispositivo de criopreservação celular de acordo com outra modalidade da invenção.

A FIG. 5 é uma vista em perspectiva de um adaptador usado no dispositivo mostrado na FIG. 4.

A FIG. 6 é uma vista explodida do dispositivo mostrado na FIG. 4.

A FIG. 7 é uma vista em perspectiva de um dispositivo de criopreservação celular de acordo com uma modalidade adicional.

A FIG. 8 é uma vista em seção transversal lateral de uma porção superior do dispositivo mostrado na FIG. 7.

A FIG. 9 é uma vista em seção transversal em perspectiva de uma porção inferior do dispositivo mostrado na FIG. 7 .

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRADAS

Com a finalidade de estimular uma compreensão dos princípios da invenção, será feita referência agora às modalidades ilustradas nos desenhos e descritas na especificação escrita que se segue. Entende-se que nenhuma limitação na área da invenção é pretendida deste modo. É ainda compreendido que a presente invenção inclui quaisquer alterações e modificações às modalidades ilustradas e inclui ainda aplicações dos princípios adicionais da invenção como poderiam normalmente ocorrer àquele versado na técnica à qual esta invenção pertence.

Em uma modalidade da invenção, um dispositivo de autonucleação 10 é propiciado, como mostrado na FIG. 1, o qual envolve o uso de composições capazes de nucleação de gelo. De acordo com a presente invenção, uma composição de nucleação de gelo 20 é retida na superfície interna 14 de um tubo oco aberto 12. Em uma modalidade preferida, o tubo é formado de plástico. Uma quantidade suficiente da composição de nucleação é introduzida no tubo para formar uma matriz sólida dentro do tubo enquanto permite fluxo de líquido através do tubo.

Em uma modalidade preferida, a composição de nucleação é colesterol cristalino. 0 uso de composições de esterol, e especialmente colesterol, é conhecido em outros campos, tais como em sistemas de água resfriada, como mostrado na Patente U.S. No. 4.928.493. Nestas outras aplicações, composições pulverizadas são dispostas dentro de um recipiente para exposição à água para ajudar na formação de gelo. Como explicado abaixo, foi determinado após experimentação que colesterol cristalino era não-tóxico para as células de amostra e líquidos sendo preparados para criopreservação, tais como sangue, soluções de células tronco e sêmen.

As extremidades 16 do tudo são vedadas com uma solução de membrana permeável 18. Especificamente, a membrana é permeável ao líquido de criopreservação e impermeável a células ou tecidos a serem preservados. É importante manter separação e impedir contato direto entre as células/tecido e a composição de nucleação de gelo. As membranas em cada extremidade irão também conter quaisquer cristais de colesterol que possam se desalojar do tubo e impedir que os cristais contaminem o líquido circundante. Também é importante que a membrana permita fluxo livre do líquido de criopreservação para dentro do tubo 12. 0 tubo e os interstícios na composição sólida de matriz de nucleação podem também ser inicialmente preenchidos com uma solução tampão isotônica.

Este dispositivo de autonucleação 10 é dimensionado para ser colocado em um recipiente de criopreservação tal como um frasco 30 ou uma bolsa de sangue 40, como mostrado na FIG. 2. 0 dispositivo pode estar livre dentro dos recipientes ou pode estar fixado a uma superfície interior. Uma vez que o dispositivo se destina a um local para formação de gelo, o mesmo não precisa ser muito grande. Em uma modalidade específica, o tubo 12 tem 0,6 cm de comprimento e 0,15 cm de diâmetro. 0 recipiente de criopreservação pode ser preenchido com a amostra ou espécime especifica, e uma solução de criopreservação, onde apropriada, como é conhecida na técnica, enquanto o dispositivo 10 permanece dentro do recipiente. O recipiente30 ou 40 é em seguida submetido a um protocolo de criopreservação. Uma vez que o líquido de criopreservação está em contato com o composto de nucleação de gelo 2 0 dentro do dispositivo, gelo irá se formar espontaneamente dentro do tubo 12 do dispositivo 10 com pouco ou nenhum superesfriamento. Gelo então continua a formar-se fora do tubo para dentro da solução circundante, resultando em congelamento da suspensão celular com pouco ou nenhum superesfriamento e formação de gelo intracelular mínima.

Em uma modalidade específica, um primeiro experimento foi designado para determinar que colesterol fisicamente aglutinado ao interior dos recipientes de crioarmazenamento induzirá nucleação de gelo. Nesta modalidade, a solução de esterol ativa foi preparada ao adicionar 0,025g de colesterol seco a 3ml de metanol. A suspensão resultante foi então colocada em um banho seco a 70°C e agitada intermitentemente até que todo o esterol sólido tivesse dissolvido. Frascos comercialmente disponíveis foram revestidos com ΙΟΟμΙ da solução de esterol e colocados no banho seco a 75°C para permitir que o metanol evaporasse, e para alcançar recristalização e adesão de colesterol. Tubos de ensaios foram em seguida enxaguados com Iml de PBS, 2-3 vezes, para remover quaisquer cristais soltos.

Em seguida, soluções de glicerol a 6% (para reproduzir um meio típico de criopreservação de banco de esperma) e DMSO a 10% (para reproduzir um sistema de criopreservação de linha celular generalizado) foram preparadas em PBS e foram avaliadas ao resfriar a -5°C/minuto em um frasco revestido de esterol e em um frasco não revestido (controle). Para alcançar valor estatístico, 20 tubos de ensaios contendo DMSO e 12 tubos de ensaios contendo glicerol foram avaliados. A temperatura dentro de cada frasco foi monitorada usando um termopar em intervalos de um segundo para permitir resolução do ponto de congelamento da solução e liberação do calor latente de fusão.

Os resultados deste experimento indicaram que tanto em DMSO quanto glicerol o ponto de congelamento foi mais elevado e a mudança de temperatura durante fusão de calor (ΔΤ) foi reduzida para tubos de ensaios revestidos com o esterol. Estes resultados estão resumidos na tabela que segue :

<table>table see original document page 15</column></row><table>

Neste experimento, alguma descamação ou fragmentação dos cristais (e certo grau de dissolução nas amostras DMSO) foi também observada, resultando em contaminação da solução (possivelmente devida em parte à manipulação física inevitável dos recipientes e das soluções) . A fim de abordar este problema, uma modalidade de um dispositivo de autonucleação 10 foi propiciada na qual um tubo oco de 0,6 cm foi revestido no interior com 100 μΐ de solução de esterol e permitido secar durante 4 8 horas. Uma extremidade do tubo foi vedada com um chumaço de algodão permeável, enquanto a outra extremidade do tubo foi fixada ao interior de uma tampa de frasco que utiliza uma resina epóxi e deixada secar por 14-24 horas. 0 stent foi projetado para manter o colesterol aglutinado em um ambiente isolado enquanto ainda permitindo que solução (mas não células) entrasse para fazer contato.

Em um segundo experimento, sêmen humano foi criopreservado utilizando este dispositivo de autonucleação10 e foi especificamente analisado para determinar se as amostras criopreservadas de acordo com a presente invenção possuíam uma viabilidade pós-descongelamento mais elevada que sêmen congelado que usa tubos de ensaios de configuração padrão. Neste experimento, amostras de sêmen humano descartadas (20 amostras provenientes de 4 doadores) foram obtidas e foram colocadas em uma incubadora umedecida a 3 7°C (5% de CO2, 95% de ar) por 30-60 minutos até liquefazerem-se. Uma vez liqüefeitas, as amostras foram ajustadas para 5ml usando isotônico PBS (equilibrado a37°C) e avaliadas utilizando um dispositivo de análise de sêmen assistido por computador para medir e gravar contagem inicial global e mobilidade. As amostras foram em seguida equilibradas para glicerol a 6% em uma solução tampão de gema de ovo de TESTE através de um procedimento de adição por etapas. A seguir ao equilíbrio, cada amostra foi dividida em três alíquotas de 1,5 ml e depositada em (1) um frasco que continha o dispositivo 10; (2) um frasco padrão para ser nucleado manualmente (controle positivo); e (3) um frasco padrão que não recebeu nenhuma nucleação (controle negativo).

Todas as amostras foram colocadas em um congelador de taxa controlada e resfriadas de 22°C a -8 0C a -5 °C/min. Após 3 minutos a -8°C, uma mecha de algodão que foi encharcada em nitrogênio liquido foi utilizada para iniciar nucleação no frasco nucleado manualmente. Após 7 minutos adicionais a -8°C, espécimes foram resfriados de novo a - 10°C/minuto até -40°C. A -40°C a taxa foi aumentada para - 20°C/min, e a -80°C as amostras foram mergulhadas em nitrogênio líquido (LN2) .

A seguir ao congelamento, as amostras foram descongeladas ao serem colocadas em cima da bancada (correspondendo a uma taxa de descongelamento de ~300°C/min) . Logo que o último gelo derreteu, o glicerol foi então diluído gota a gota durante um período de 10 minutos pela adição de PBS; amostras foram então lavadas e re-suspensas em um PBS livre de glicerol. Por fim, as amostras foram incubadas (37°C, atmosfera umedecida, 5% de CO2, 95% de ar) por pelo menos uma hora antes da avaliação da contagem pós-descongelamento e mobilidade.

Os resultados deste segundo experimento indicaram que amostras congeladas que utilizam o dispositivo de autonucleação da presente invenção retiveram mobilidade (66,1 ± 4,7% média ± SEM) significantemente maior (p<0,05) que aquelas congeladas utilizando nucleação manual (56,0 ± 3,8%) . Ambas as técnicas de nucleação foram significantemente mais elevadas (p<0,05) do que as amostras do controle negativo, não semeadas (43.4 ± 3.7%) conforme determinado usando analise de técnicas de variância.

Em um terceiro experimento foi determinado que colesterol retido não produzia efeitos citotóxicos em sêmen inoculado durante um período de tempo longo. Neste experimento, amostras de sêmen liqüefeito foram expostas a placas de cultura que foram revestidas com ΙΟΟμΙ da solução esterol. Avaliações de mobilidade realizadas em 1, 2, 4 e 8 horas de incubação não mostraram qualquer efeito citotóxico significativo de contato direto com colesterol retido em espermatozóide humano em culturas de mais de 8 horas.

Sendo assim, é demonstrado que o dispositivo de autonucleação 10 da presente invenção produz melhor mobilidade pós-descongelamento do que usando tanto nucleação manual quanto nenhuma nucleação em procedimentos de criopreservação de esperma. Estes procedimentos demonstraram que nucleação de gelo induzida por esterol é um método confiável, consistente que pode reduzir superesfriamento e, por conseguinte, reduzir o rápido aumento associado em temperatura que segue o "flash" de formação de cristal de gelo típica do evento de congelamento de solução superesfriada com melhores resultados. 0 dispositivo e método da presente invenção permite que as amostras permaneçam na câmara de resfriamento imperturbáveis durante toda a duração do congelamento porque não existe necessidade de técnicas de nucleação manuais do estado da técnica. Acredita-se que o dispositivo e métodos da presente

invenção são especificamente apropriados para métodos comerciais de armazenamento de esperma padrão. Em um agrupamento de banco de esperma comercial padrão muitas amostras são processadas e restrições de tempo/equipe de funcionários não permitem sempre taxas de refrigeração controladas ou o manuseio cuidadoso que pode ser alcançado no laboratório. Acredita-se que a presente invenção permite criopreservação repetida de amostras com resultados que excedem técnicas atuais. Além disso, a presente invenção pode permitir congelamento e recuperação bem sucedidos de amostras com baixa mobilidade que normalmente seriam excluídas das listas de doadores.

Similarmente, o dispositivo 10 e métodos da presente invenção podem ter impacto significativo na habilidade de armazenar células tronco hematopoiéticas criopreservadas e/ou células progenitoras (PCB HPCs) de uma maneira que permita o armazenamento e tempo suficiente para que seja realizado rastreamento adequado de doenças infecciosas bem como tipificação de HLA. A criopreservação oferece a oportunidade de preservar HPCs derivadas de PCB de pacientes neonatais que podem se beneficiar de terapia genética, ou que estão em risco de perder função hematopoiética normal através de doença ou iatrogeneticamente via radio- e/ou quimioterapia. Recentemente, esforços crescentes foram direcionados para refinar métodos de seleção de células progenitoras. A habilidade em preservar estas populações de células progenitoras relativamente "puras" (por exemplo, células que expressam a glicoproteína de superfície CD34) minimiza potencialmente o volume total da suspensão de células transplantadas. Contudo, em razão do volume de PCB normalmente adquirido ser muito menor do que amostras de medula óssea, números limitados de HPCs por peso de recipiente em quilogramas podem ser obtidos. Isso torna métodos de criopreservação eficientes e ideais para HPCs derivadas de PCB muito mais críticos do que no caso de outras fontes de HPCs (por exemplo medula óssea, sangue periférico). 0 dispositivo de autonucleação da presente invenção produz meios mais eficientes e ideais para criopreservação e recuperação de tais amostras delicadas do que os já disponíveis até o momento. Acredita-se que a integração do dispositivo 10 na pesquisa e desenvolvimento em curso de métodos de criopreservação de célula tronco de sangue placentário aperfeiçoados resultará em uma técnica única para preservar este tipo de célula com maior recuperação e com menos trabalho. Protocolos experimentais foram desenvolvidos para verificar a viabilidade do dispositivo e métodos da presente invenção na criopreservação de PCB e sangue placentário, assim como sêmen de touro usado em instalações de inseminação artificial comercial. Estes protocolos são descritos no pedido de patente provisório referido acima No. 60/814.982, cuja descrição é incorporada aqui mediante referência.

Um aspecto adicional da presente invenção reconhece que criopreservação de diversas células tronco/progenitoras derivadas de sangue placentário pode exigir procedimentos completamente diferentes e, por conseguinte, recipientes de armazenamento diferentes dos que existem nos procedimentos atualmente conhecidos. Para armazenagem e armazenamento de múltiplos tipos de células derivadas de sangue placentário umbilical, pode ser ideal usar protocolos de congelamento muito diferentes que incluem diferentes taxas de resfriamento/aquecimento. A tecnologia atual reside tanto em bolsas criogênicas, algumas com câmaras múltiplas, quanto tubos de ensaios. No entanto ambos estes sistemas possuem desvantagens substanciais. As bolsas de câmaras múltiplas não permitem taxas de resfriamento diferentes ou CPAs serem usados em câmaras diferentes. Tubos de ensaios sozinhos não podem ser considerados sistemas "fechados" em temperaturas criogênicas, a menos que um envoltório vedado a calor seja utilizado, cuja aplicação pode comprometer amostras sensíveis.

Para superar esta limitação, uma modalidade adicional da invenção reside em um recipiente de criopreservação na forma de um sistema fechado flexível 50, ilustrado nas FIGS. 3a, b, que permite que a amostra seja dividida em unidades separadas e congeladas que utilizam protocolos diferentes em um sistema fechado. O frasco 50 inclui um corpo tubular flexível 52 que possui uma porta 54 em uma extremidade. A porta é vedada, de preferência pelo mesmo material que o corpo flexível, porém é adaptada para ser perfurada por uma seringa para retirar assepticamente a amostra após o descongelamento.

Como mostrado na FIG. 3a, a extremidade oposta 56 do frasco é inicialmente aberta para permitir a introdução de uma amostra líquida. Logo que o frasco 50 tenha sido enchido, a extremidade 56 é fechada, por exemplo, por meio de uma tira de vedação a quente 58, como mostrado na FIG.3b. O frasco de sistema fechado 50 é em seguida

disponibilizado para congelamento e armazenamento de uma

única unidade. Opcionalmente, mas de preferência, cada frasco inclui o dispositivo de autonucleação 10 descrito acima. Como mostrado na FIG · 3a, o dispositivo 10 é de preferência aderido à parede interna do corpo 52 de modo

que não seja acessível por uma agulha que passe através da porta 52.

Contempla-se que o frasco 50 da presente modalidade pode ser usado para protocolos de congelamento/descongelamento múltiplos em criorrecipientes discretos. Sendo assim, um conjunto de tubo de ensaios 50 pode ser sustentado em uma posição fixa com a extremidade aberta 56 disponível para introdução de alíquotas múltiplas da amostra líquida. Quando cada frasco é cheio, a extremidade correspondente é vedada para propiciar um sistema de frasco para criopreservação.

Em uma modalidade adicional da invenção, é propiciado um dispositivo de criopreservação 60, conforme mostrado nas FIGS. 4-6, que simplifica ainda mais o processo para obter uma amostra e prepará-la para congelamento. O dispositivo inclui um recipiente 62 dimensionado para receber a amostra líquida. O recipiente 62 inclui um encaixe de entrada 64 em uma extremidade. Conforme mostrado na FIG. 6, um dispositivo de autonucleação 10 pode ser introduzido no recipiente através do encaixe de entrada 64.

O encaixe de entrada recebe um adaptador 65, mostrado em detalhe na FIG. 5. 0 adaptador inclui uma porção tubular inferior 66 que é dimensionada para caber com conforto dentro do encaixe de entrada 64. A porção inferior 66 pode ser vedada até o encaixe de entrada usando um epóxi ou vedação a calor, ou outros meios adequados para propiciar uma vedação hermética a ar e a líquido entre o recipiente 62 e o adaptador 65.

0 adaptador inclui duas ramificações tubulares 67 e 69. A ramificação 67 termina em uma porção de extremidade 68 que é configurada para engatar um septo de agulha 7 2 (FIG. 6) . A segunda ramificação 69 termina em um encaixe farpado 70. Este encaixe farpado 70 está em engate vedado com a extremidade 74a da tubulação 74. A extremidade livre74b da tubulação 74 recebe seu próprio septo de agulha 75.

Ambos os septos de agulha 72 e 75 são configurados para propiciar uma vedação hermética a ar e a liquido na extremidade das duas ramificações 67, 69. Mais ainda, os septos 72, 7 5 são configurados para ser perfurados por uma agulha de uma maneira conhecida e são autovedáveis logo que a agulha seja removida.

Em uma modalidade especifica, um grampo de tubulação80 é propiciado para estabilizar a tubulação 74 quando estiver acoplado ao adaptador 65. O grampo 80 inclui uma porção 80 configurada para deslizar sobre a ramificação 67 do adaptador e uma porção fixada 84 que é configurada para deslizar sobre a tubulação 74, como mostrado na FIG. 4.

0 recipiente 62 do dispositivo de criopreservação 60 é dimensionado para ser recebido no separador "caixa de ovos" padrão usado para transferir e armazenar amostras de células para congelamento e eventual descongelamento. Contempla-se que diversos dispositivos de criopreservação60 que transportam amostras de células de uma fonte comum podem ser abrigados em um separador caixa de ovos comum. Em uso, o dispositivo 60 é inicialmente armazenado na configuração mostrada na Fig. 4 - isto é, com a tubulação74 se projetando para cima a partir do próprio recipiente de células. 0 adaptador 65 é dimensionado de modo que não se estenda além do envelope vertical do recipiente e, por conseguinte, não interfira com o armazenamento de outros dispositivos 60 similares. A tubulação 74 é mostrada com uma dobra que se estende para fora do envelope vertical. Se os dispositivos no recipiente caixa de ovos estiverem adequadamente alinhados, a tubulação 74 não interferirá com os outros recipientes de células. No entanto, de acordo com a modalidade preferida, contempla-se que a tubulação 74 será flexível de modo que possa ser arrumada conforme necessário para evitar que interfira com outros recipientes 62 no mesmo separador caixa de ovos.

A tubulação 74 é de preferência flexível por uma razão adicional. Especificamente, a ramificação 69 e a tubulação 74 fixada são utilizadas para preencher o recipiente 62 do dispositivo 60. Sendo assim, de acordo com a presente invenção, a tubulação 74 flexível pode ser manipulada para permitir introdução de uma recém extraída amostra de célula para dentro do recipiente. Esta introdução ocorre em um aspecto ao perfurar o septo 7 5 com uma agulha de uma seringa que contém a amostra líquida extraída. Alternativamente, o septo 7 5 pode ser removível da extremidade 74b da tubulação flexível de modo que a amostra possa ser injetada diretamente dentro da tubulação sem necessitar perfurar uma membrana. Em ambos os casos, a tubulação flexível 74 facilita esta etapa de preencher o recipiente 62, já que a tubulação pode ser manipulada conforme necessário enquanto o recipiente permanece no recipiente caixa de ovos.

Logo que a amostra tenha sido introduzida no recipiente 62 verifica-se que a ramificação 69 do adaptador está permanentemente vedada. Na modalidade preferida, esta vedação ocorre ao vedar a tubulação flexível logo acima do encaixe farpado 70. Uma vez vedado, o restante da tubulação pode ser removido já que não é mais necessário. Em uma modalidade especifica, uma barra de pinça de vedação conhecida pode ser usada para simultaneamente achatar a tubulação, vedar a calor a porção achatada e separar a porção em excesso. Esta vedação e corte de preferência ocorrem o mais perto possível do encaixe farpado 7 0 de modo que nenhum resto da tubulação flexível 74 caia para fora do envelope do recipiente 62.

É desejável que as etapas de vedação e corte não comprometam a integridade estéril ou o aspecto vedado, fechado do dispositivo de criopreservação 60. Quando a amostra é injetada através do septo 75, a ramificação 69 permanece vedada através do processo, mesmo após a agulha ser removida. Logo que a ramificação 69 é vedada o dispositivo 60 que contém a amostra líquida está pronto para congelar e armazenar na mesma caixa de ovos que abrigou o dispositivo durante a etapa de preenchimento. Quando for desejado reter a amostra, o dispositivo 60 pode ser removido da caixa de ovos para descongelamento individual separado dos outros dispositivos mantidos na caixa. O septo da agulha 72 da ramificação 67 propicia um meio para retirada estéril da amostra. Portanto, uma agulha ou seringa pode ser utilizada para perfurar o septo e retirar a amostra líquida para dentro da seringa. 0 dispositivo vazio 60 pode então ser descartado.

Em uma modalidade alternativa, o dispositivo de criopreservação 100 pode ser propiciado conforme ilustrado nas FIGS. 7-9. 0 dispositivo inclui um recipiente 102 que é similar ao recipiente 62 descrito acima em sua capacidade para crioarmazenamento de uma suspensão de célula, com ou sem um dispositivo de autonucleação 10 disposto dentro do mesmo. Em certas modalidades, o recipiente 100 possui um volume de armazenamento de 2-5mL. O recipiente 102 possui uma porção superior aberta 103 e uma porção inferior 104 que define uma abertura 105. A porção superior 103 é hermeticamente vedada por um tampão 110, como mostrado na vista em seção transversal da FIG. 8. A porção superior define um flange anular 107 sobre o qual é montada uma borda inferior 116 do tampão 110. Esta borda inferior é de preferência vedada a calor até o flange anular de maneira convencional para formar uma junta hermeticamente fechada liquida capaz de suportar temperaturas criogênicas.

0 tampão 110 suporta uma ramificação de entrada 112 e uma ramificação de ventilação 114, cada qual podendo estar na forma de uma tubulação estéril. A ramificação de entrada .112 pode ser propiciada com um septo de agulha padrão, tal como o septo 75 descrito acima. As duas subdivisões 112, .114 são montadas sobre encaixes correspondentes 118, 120, com cada encaixe definindo uma passagem 119, 121 em comunicação com o interior do recipiente 112. Cada ramificação é hermeticamente vedada sobre os correspondentes encaixes, mais uma vez para formar uma junta hermeticamente fechada fluída e capaz de criogenia.

Na modalidade das FIGS. 7-9, a ramificação 114 serve como uma ramificação de ventilação, ao invés de uma ramificação de saída como no dispositivo anterior 60. Um elemento de filtro 125 pode ser disposto dentro da passagem .121 do encaixe 120. Em uma modalidade preferida, este elemento de filtro é um micro-filtro estéril de 3pm. O micro-filtro 125 é permeável a gás, mas geralmente impermeável à amostra líquida ou suspensão celular que é armazenada dentro do recipiente.

Na presente modalidade, o dispositivo 100 propicia a remoção da suspensão armazenada através da porção inferior 104 do recipiente 102, ao invés de através do tampão como na modalidade anterior. Sendo assim, conforme mostrado na vista em seção transversal da FIG. 9, a abertura 105 no recipiente é vedada por um septo de agulha 130. O septo de saída 13 0 é de forma adequada hermeticamente lacrado ao recipiente 102, tal como por vedação a calor. Para proteger o septo, pode ser propiciada uma cobertura removível 132 que seja fixada ao recipiente em volta do septo. A cobertura 132 pode fixar uma porção de rompimento 133 na forma de uma região mais fina ou enfraquecida que permite que a porção central 135 da cobertura seja removida. Uma torneira 135 pode ser propiciada, conforme mostrado na FIG. 7, para facilitar a remoção da porção central 135. A cobertura pode ser uma película de folha que é aderida em volta de seu perímetro na porção inferior 104 do recipiente 102.

0 modo de utilização do dispositivo de criopreservação 100 é similar ao do dispositivo 60 descrito acima. Especificamente, uma suspensão celular é introduzida no recipiente 102 através da ramificação de entrada 112, e especificamente através do septo de agulha descrito acima. De forma alternativa, a ramificação de entrada pode ser munida de uma porta padrão com agulha ou sem agulha. A medida que a suspensão celular é injetada dentro do recipiente, o ar dentro é ventilado através do filtro 125 na ramificação de ventilação 114. Em certas modalidades, o microfiltro 125 é configurado para ser geralmente impermeável à suspensão celular. Sendo assim, logo que o nível da suspensão dentro do recipiente alcança o filtro 12 5, a suspensão não passará através do filtro e o aumento na pressão interromperá o fluxo de líquido para dentro do recipiente.

Logo que o recipiente 102 é preenchido, as duas ramificações podem ser vedadas a calor usando, por exemplo, o vedador de pinça aquecida descrito acima, de modo que o recipiente seja completa e hermeticamente fechado. É claro que se entende que o septo de agulha 130 e a cobertura 132 permanecem intactos enquanto o recipiente 102 é preenchido. O dispositivo preenchido e vedado 100 pode então ser armazenado criogenicamente. 15 Quando for desejado retirar a suspensão celular, o

dispositivo e conteúdos são primeiramente descongelados de uma maneira conhecida. Uma vez descongelados, a cobertura 132 é removida para expor o septo 130. A ramificação de ventilação 113 é separada para abrir a passagem de saída 20 121. A suspensão celular pode então ser retirada por uma seringa ou dispositivo similar que perfura o septo 130. A porção inferior 104 do recipiente pode definir uma série de dentes 106 que são adaptados para engatar o dispositivo de retirada ou seringa. Em algumas modalidades os dentes 106 2 5 são configurados para ancorar o dispositivo de retirada, enquanto em outras modalidades os dentes podem ser propiciados com roscas LUER para engatar os encaixes LUER na seringa de retirada.

Contempla-se em algumas modalidades que os recipientes 30 62 e 102 dos dispositivos 60 e 100 podem ser propiciados com um vácuo inicial. Este vácuo auxilia a retirada da amostra líquida durante a etapa de preenchimento dos recipientes 62, 102 dos dispositivos. Logo que as aberturas de cada ramificação 67, 69 e 112, 114 são vedadas (tanto pelos septos correspondentes 72, 75 quanto por vedação a calor), o vácuo pode ser mantido por um longo período de tempo. Um tampão pode ser propiciado sobre cada ramificação para assegurar uma vedação hermética. Em uma modalidade específica, o vácuo inicial nos recipientes 62, 100 pode estar em uma pressão sub-atmosférica entre 13,33 kPa (absoluto) e aproximadamente 21,33 kPa (absoluto).

Os dispositivos de criopreservação 60 e 100 podem ser formados de materiais padrão usados no campo de bancos de sangue e armazenamento de longo prazo em condições criogênicas padrão (isto é, temperaturas tão baixas quanto -196°C). A fim de caber em recipientes caixa de ovos, o dispositivo 60 (após vedação da tubulação flexível) deveria caber dentro de um diâmetro de IOmm e uma altura de 90mm. A tubulação flexível 74 deve também ser capaz de agüentar

temperaturas criogênicas sem comprometer a capacidade de

vedar a calor e separar a tubulação ao vedar a ramificação do adaptador 65. Em uma modalidade especifica, o tubo flexível é formado de TYGON0 ou um material similar.

Embora a invenção tenha sido ilustrada e descrita em detalhe nos desenhos e na descrição precedente, a mesma deveria ser considerado como ilustrativa e não restritiva em caráter. Entende-se que apenas as modalidades preferidas foram apresentadas e que se deseja que todas as mudanças, modificações e aplicações adicionais que seguem dentro do

espírito da invenção sejam protegidas.

Claims (26)

1. Dispositivo de autonucleação para introdução em um recipiente de criopreservação antes de congelamento de um líquido contido no mesmo caracterizado pelo fato de compreender: um tubo alongado oco dimensionado para introdução no recipiente de criopreservação; uma composição de nucleação de gelo disposta dentro do referido tubo oco; e uma vedação em ambas as extremidades do referido tubo, pelo menos uma extremidade vedada com uma membrana que é impermeável à composição de nucleação de gelo, mas permeável ao liquido contido dentro do recipiente de criopreservação.

2. Dispositivo de autonucleação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do referido composto de nucleação de gelo ser um esterol.

3. Dispositivo de autonucleação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da referida composição de nucleação de gelo ser colesterol.

4. Dispositivo de autonucleação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da referida composição de nucleação de gelo ser um revestimento no interior do referido tubo oco.

5. Dispositivo de autonucleação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da referida composição de nucleação de gelo ser uma matriz sólida posicionada dentro do referido tubo.

6. Dispositivo de autonucleação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da referida vedação em ambas as extremidades do referido tubo ser a referida membrana.

7. Recipiente de criopreservação caracterizado pelo fato de ter o referido dispositivo de autonucleação da reivindicação 1 disposto no mesmo.

8. Recipiente de criopreservação, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do referido dispositivo de autonucleação estar fixado ao interior do recipiente.

9. Recipiente de criopreservação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender ainda: um corpo tubular flexível que possui uma extremidade inicialmente aberta para a introdução de uma amostra líquida dentro do referido corpo; e uma porta fechada definida em uma extremidade oposta do referido corpo, a referida porta adaptada para ser perfurada por uma agulha para a retirada da amostra líquida.

10. Recipiente de criopreservação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do referido dispositivo de autonucleação ser fixado ao interior do referido contrabalanço de corpo tubular a partir da referida entrada.

11. Recipiente de criopreservação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de uma extremidade do referido corpo tubular ser formada de um material vedável a quente.

12. Recipiente de criopreservação caracterizado por compreender: um corpo tubular flexível que possui uma extremidade inicialmente aberta para a introdução de uma amostra líquida dentro do referido corpo; e uma porta fechada definida em uma extremidade oposta do referido corpo, a referida porta adaptada para ser perfurada por uma agulha para a retirada da amostra líquida.

13 . Recipiente de criopreservação, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato da referida uma extremidade do referido corpo tubular ser formada de um material vedável a calor.

14. Dispositivo de criopreservação caracterizado por compreender: um recipiente para receber e armazenar uma amostra líquida, o referido recipiente possuindo uma abertura de encaixe de entrada dentro do referido recipiente; um adaptador montado no referido encaixe, o referido adaptador possuindo uma primeira ramificação tubular e uma segunda ramificação tubular, a referida segunda ramificação tubular terminado em um encaixe em engate de tubo; um septo que fecha a primeira ramificação tubular, o referido septo adaptado para ser perfurado por uma agulha; um tubo engatado em uma extremidade ao referido encaixe de engate de tubo na referida segunda ramificação tubular; e um fechamento na extremidade oposta do referido tubo.

15. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do referido encaixe ser um encaixe farpado.

16. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do referido fechamento ser um septo adaptado para ser perfurado por uma agulha.

17. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do referido tubo ser um tubo flexível que possui um comprimento de modo que a referida extremidade oposta do referido tubo esteja acima do referido septo fechando a referida ramificação quando o referido recipiente estiver elevado.

18. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do referido fechamento ser formado por uma extremidade oposta vedável a calor do referido tubo.

19. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender ainda o referido dispositivo de autonucleação da reivindicação 1 disposto no mesmo.

20. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do referido recipiente ser mantido a uma pressão abaixo da pressão atmosférica.

21. Dispositivo de criopreservação caracterizado por compreender: um recipiente para receber e armazenar uma amostra líquida, o referido recipiente possuindo uma abertura superior e uma abertura inferior; um tampão em engate vedado com o referido recipiente cobrindo a referida abertura superior, o referido tampão incluindo uma primeira ramificação tubular e uma segunda ramificação tubular que se comunica com a referida abertura superior do referido recipiente; e um septo de saída fechando a referida abertura inferior do referido recipiente, o referido septo de salda adaptado para ser perfurado por uma agulha para retirar a amostra líquida do referido recipiente.

22. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de ainda compreender um septo de entrada na referida primeira ramificação tubular, o referido septo de entrada adaptado para ser perfurado por uma agulha para injetar a amostra líquida no referido recipiente.

23. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender ainda um microfiltro disposto dentro da referida segunda ramificação, o referido microfiltro sendo permeável a gás.

24. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato do referido microfiltro ser impermeável à amostra líquida que é armazenada no referido recipiente.

25. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato das referidas primeira e segunda ramificações serem vedadas a calor quando a amostra líquida é disposta dentro do referido recipiente.

26. Dispositivo de criopreservação, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender ainda uma cobertura removível em engate vedado com o referido recipiente circundando referido septo de saída.