BRPI0713711A2 - vacina viral recombinante, kit para vacinação, e, método para usar pelo menos um composto - Google Patents

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Abstract

VACINA VIRAL RECOMBINANTE, KIT PARA VACINAçãO, E, MéTODO PARA USAR PELO MENOS UM COMPOSTO. A presente invenção concerne às novas vacinas virais recombinantes. Em particular a presente invenção proporciona produtos de combinação que compreendem vetores virais recombinantes e compostos específicos capazes de aperfeiçoarem a resposta imune produzida in vivo pelos citados vetores virais recombinantes.

Description

"VACINA VIRAL RECOMBINANTE, KIT PARA VACINAÇÃO, E, MÉTODO PARA USAR PELO MENOS UM COMPOSTO"
RELATÓRIO DESCRITIVO
A presente invenção proporciona novas vacinas virais recombinantes. Em particular a presente invenção proporciona produtos de combinação que compreendem vetores virais recombinantes e compostos específicos capazes de aperfeiçoarem a resposta imune produzida in vivo pelos citados vetores virais recombinantes.
As técnicas de vacinação tradicionais envolvendo a introdução em um sistema animal de um antígeno que pode induzir uma resposta imune, e deste modo proteger dito animal contra infecção, têm sido conhecidas há muitos anos. Estas técnicas têm incluído o desenvolvimento de vacinas tanto vivas quanto inativadas. As vacinas vivas são tipicamente versões não- patogênicas atenuadas que são capazes de proporcionar uma resposta imune dirigida contra uma versão patogênica do agente infeccioso. Em anos recentes tem havido avanços no desenvolvimento de vacinas recombinantes, especialmente de vacinas vivas recombinantes, nas quais antígenos estranhos de interesse são codificados e expressados de um vetor. Dentre eles, vetores baseados em vírus recombinantes têm-se mostrado uma grande promessa e desempenham um papel importante no desenvolvimento de vacinas novas. Muitos vírus têm sido investigados por causa de sua capacidade para expressarem proteínas a partir de patógenos estranhos ou de tecido tumoral, e para induzirem respostas imunológicas específicas contra estes antígenos in vivo. Geralmente, estas vacinas baseadas em gene podem estimular respostas imunes celulares e humorais potentes e vetores virais podem ser uma estratégia efetiva tanto para a liberação de genes codificadores de antígeno quanto para a facilitação e a intensificação de apresentação de antígeno. Com o propósito de ser utilizado com um veículo de vacina, o vetor viral ideal deve ser seguro e permitir apresentação eficiente ao sistema imune de antígenos específicos de patógeno requeridos. Também deve exibir imunogenicidade intrínseca baixa para permitir sua re-administração com o objetivo de reforçar as respostas imunes específicas relevantes. Ademais, o sistema de vetor precisa atender aos critérios que permitem sua introdução em uma base de escala grande. Vários vetores de vacina viral têm portanto emergido até o presente, todos eles tendo vantagens e limites relativos dependendo da aplicação proposta, e assim nenhum deles tem se mostrado em ser veículos de vacina ideal.
Vetores de poxvírus recombinantes são exemplos de vetores de vacina viral. Eles têm sido usados como indutores de respostas imunes tanto humorais quanto celulares, incluindo ambas células T CD4+ e CD8+, e portanto representam um sistema de liberação de escolha especialmente em imunoterapia antiviral ou de câncer (veja Arlen et al., 2005, Semin Oncol., 32, 549-555 ou Essajee e Kaufman, 2004, Expert Opin Biol Ther., 4, 575-588). A despeito das vantagens associadas com a vacinação de poxvírus em relação às outras técnicas de vacinação (veja por exemplo Souza et al, 2005, Braz J Med Biol Res, 38, 509-522), há contudo um desejo de desenvolvimento de compostos adjuvantes adaptados para este vetor viral que servirá para aumentar a resposta imune induzida pela citada vacina.
Tem havido um esforço maior em anos recentes, com sucesso significativo, para descobrir compostos de droga novos que atuam por estimulação de certos aspectos chave do sistema imune. Estes compostos, chamados de modificadores de resposta imune (IRMs) ou adjuvantes, parecem atuar através de mecanismos de sistema imune básicos via receptores semelhantes a Toll (TLRs) para induzirem várias biossínteses de citocinas importantes (e.g., interferons, interleucinas, fator de necrose tumoral r, etc.). Tem sido mostrado que tais compostos estimulam uma liberação rápida de citocinas derivadas de macrófago/monócito e também são capazes de estimularem células B para secretarem anticorpos que desempenham um papel importante nas atividades antivirais e antitumorais de compostos IRM. Uma das respostas imunoestimulantes predominantes induzidas por IRMs é a indução de produção de interferon IFN-alfa, que é crido em ser muito importante nas atividades antitumorais e antivirais agudas vistas. Além disso, supra-regulação de outras citocinas tais como, por exemplo, fator de necrose tumoral (TNF), IL-I e IL-6 também tem atividades potencialmente benéficas e são cridas em contribuir para as propriedades antitumorais e antivirais destes compostos. Modificadores de resposta imune (IRMs) têm sido descritos como úteis para tratar uma ampla variedade de doenças e condições, incluindo doenças virais (e.g., papilomavírus humano, hepatite, herpes), neoplasias (e.g., carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, ceratose actínica, melanoma), e doenças mediadas por TH2 (e.g., asma, rinite alérgica, dermatite atópica).
Exemplos de tais modificadores de resposta imune (IRMs), incluem os oligonucleotídeos (veja US 6.194.388; US2006094683; WO 2004039829 por exemplo), lipopolissacarídeos, complexos de ácidos poliinósicoipolicitidílico (Kadowaki, et al., 2001, J. Immunol. 166, 2291-2295), e polipeptídeos e proteínas conhecidos em induzirem produção de citocina a partir de células dendríticas e/ou monócito/macrófagos. Outros exemplos de tais modificadores de resposta imune (IRMs) são moléculas orgânicas pequenas tais como imidazoquinolinaminas, imidazopiridinaaminas, ciclo-alquil-imidazopiridina-aminas 6,7-fusionadas, imidazonaftiridina-aminas, oxazoloquinolina-aminas, tiazoloquinolina-aminas e imidazoquinolina-aminas ligadas por ponte-1,2 (veja por exemplo US 4.689.338; US 5.389.640; US 6.110.929; e US 6.331.539).
Em particular, as imidazoquinolina-amina têm demonstrado potência forte como indutores de interferon-alfa (IFN), fator-alfa de necrose tumoral (TNF), antagonista de receptor de interleucina IL-I beta, IL-6, IL-I alfa, IL-1, fator estimulante de colônia de macrófagos-granulócitos (GM- CSF), CSF de granulócitos (G-CSF), e proteína-lalfa inflamatória de macrófago in vitro e in vivo (Gibson et al., 1995, J Interferon Cytokine Res.,15, 537-545; Tomai et al, 1995, Antiviral Res., 28, 253-264; Testerman et al., 1995, J Leukoc Biol., 58, 365-372), e têm mostrado em causar funções biológicas diversas, envolvendo, atividades antivirais, antiproliferativa e antitumorais (para revisão, veaj Syed, 2001, Expert Opin Pharmacother., 2, 877-882 ou Li et al, 2005, J Drugs Dermatol., 4, 708-717). Mais particularmente, inventores do pedido de patente WO 93/20847 têm mostrado que imidazoquinolina-aminas foram capazes de intensificarem a resposta imune para certos antígenos tais como imunógenos bacterianos e virais vivos, imunógenos derivados de tumor, imunógenos de protozoário, imunógenos derivados de organismo, imunógenos bacterianos e fiíngicos, toxóides, toxinas, polissacarídeos, proteínas, glicoproteínas, peptídeo e semelhantes quando estes antígenos foram co-administrados com esta categoria de compostos. A atividade antiviral de compostos de imidazoquinolina-amina tem sido adicionalmente demonstrada contra uma variedade de vírus, especialmente poxvírus (Bikowski, 2004, Cutis., 73, 202-206; US 20050048072), e sua eficácia clínica tem sido demonstrada contra verrugas genitais (Scheinfeld e Lehman, 2006, Dermatol Online J., 12, 5), herpes genitalis (Miller et al, 2002, Int Immunopharmacol., 2, 443-451) e molluscum contagiosum (Stulberg e Galbraith Hutchinson, 2003, Am. Fam. Physician, 67, 1233-1240).
Após a observação nos 1990's iniciais que vetores de DNA plasmídeo poderiam diretamente transfectar células de animal in vivo, esforços de pesquisa significativos têm sido empreendidos para desenvolver técnicas de vacinação baseadas no uso de plasmídeos de DNA para induzir resposta imune, por introdução direta em animais de DNA que codifica peptídeos antigênicos. Tais técnicas que são amplamente chamadas de vacinação de DNA agora têm sido usadas para produzir respostas imunes protetoras em um grande número de modelos de doença. Mais recentemente, imidazoquinolina-aminas têm sido propostas como adjuvantes em vacinação de DNA (WO 02/24225), especialmente em imunoterapia do câncer (WO 2006/042254; Smorlesi et al, 2005, Gene Therapy, 12, 1324-1332). Para uma revisão sobre vacinas de DNA, veja Reyes-Sandoval and Ertl, 2001 (Current MolecularMedicine, 1, 217-243).
A presente invenção refere-se a um aperfeiçoamento de vacinas virais recombinantes expressando ín vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos heteróloga, especialmente uma seqüência de nucleotídeos codificadora de um antígeno. Ela se refere em particular a uma vacina viral recombinante contendo pelo menos um vetor viral recombinante expressando pelo menos um antígeno e pelo menos um adjuvante que é capaz de notavelmente aumentar a imunidade conferida contra dito antígeno em relação à mesma vacina viral recombinante e sem adjuvante e que é perfeitamente adequado para este tipo de vacina. Adicionalmente se refere aos métodos de vacinação referentes à mesma.
O Requerente agora tem verificado de modo surpreendente que certos compostos de imidazoquinolina-amina embora apresentem potência antiviral forte foram capazes de aperfeiçoarem a resposta imune produzida pelas vacinas virais recombinantes para o antígeno por um vetor viral recombinante, e mais especificamente para a vacina baseada em vetor de poxvírus recombinante, e isto em proporções surpreendentes.
O tema da presente invenção é portanto uma vacina viral recombinante contendo (i) pelo menos um vetor viral recombinante expressando in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos heteróloga, especialmente uma seqüência de nucleotídeos heteróloga codificadora de um antígeno, e (ii) pelo menos um derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4- amina.
De acordo com uma modalidade da presente invenção, dito derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina intensifica as respostas imunes em um paciente ao dito antígeno onde a dita vacina viral recombinante é administrada ao dito paciente.
Como aqui usados no pedido inteiro, os termos "um" e "uma" são utilizados no sentido de que significam "pelo menos um(a)", "pelo menos um(a) primeiro(a)", "um(a) ou mais" ou "uma pluralidade" dos compostos ou etapas preferidas(os), a não ser que o contexto dite o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células incluindo uma mistura das mesmas. Mais especificamente, "pelo menos um(a)" e "um(a) ou mais" significam um número que é um ou maior do que um, com uma preferência especial por um, dois ou três.
O termo "e/ou" sempre que aqui usado inclui o significado de "e", "ou" e "todos ou qualquer combinação dos elementos ligados ao citado termo ".
O termo "cerca de" ou "aproximadamente" como aqui utilizado significa dentro de 20%, preferivelmente dentro de 10%, e mais preferivelmente dentro de 5% de um dado valor ou de uma dada faixa.
Como aqui usado, o termo "compreendendo", "contendo" onde utilizado para definir produtos, composições e métodos, é intencionado para significar que os produtos, as composições e os métodos incluem os compostos ou etapas referidos, mas não exclui outros.
O termo "paciente" refere-se a um vertebrado, particularmente um membro da espécie mamífero e inclui, mas não se limita a, animais domésticos, animais de esporte, primatas incluindo humanos. O termo "paciente" não de modo nenhum limitado a um estado doentio especial, ele inclui tanto pacientes que já têm desenvolvido uma doença de interesse quanto pacientes que não estão doentes.
Como aqui usado, o termo "tratamento" ou "tratar" inclui profilaxia e/ou terapia. Conseqüentemente as vacinas virais recombinantes da presente invenção não são limitadas às aplicações terapêuticas e podem ser usadas naquelas de profilaxia.
De acordo com uma modalidade preferida, o vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção é um vetor de poxvírus (veja por exemplo Cox et al. em "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press). De acordo com outra modalidade preferida é selecionado do grupo consistindo de vírus da vacínia, vírus da vacínia adequados incluem sem limitação a cepa Copenhagem (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 e 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401), a cepa Wyeth e o vírus elevadamente atenuado derivado do mesmo incluindo MVA (para revisão veja Mayr, A., et al., 1975, Infection 3, 6-14) e seus derivados tal como a cepa 575 de vacínia MVA (ECACC VOO120707 - US6,913,752), NYVAC (veja WO 92/15672 - Tartaglia et al., 1992, Virology,188, 217-232). Também pode ser obtido de qualquer outro membro de poxviridae, em particular epitelioma contagioso (e.g. TROVAC, veja Paoletti et al, 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163); varíola de canário (e.g. ALVAC, WO 95/27780, Paoletti et al, 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163); varíola de pombo; varíola suína e semelhante. Por meio de exemplo, pessoas experientes na arte podem se referir a WO 92 15672 (aqui incorporada como referência) que descreve a produção de vetores de expressão baseados em poxvírus capazes de expressarem tal seqüência de ácido nucleico heteróloga, especialmente seqüência de nucleotídeos codificadora de antígeno.
Como aqui usado, o termo "antígeno" refere-se a qualquer substância que é capaz de ser o alvo de uma resposta imune. Um antígeno pode ser o alvo de, por exemplo, uma resposta humoral e/ou imune mediada por célula produzida por um paciente. O termo "antígeno" inclui por exemplo antígenos virais, antígenos relacionados com ou específicos de tumor, antígenos bacterianos, antígenos parasíticos, alérgenos e semelhantes:
Antígenos virais incluem por exemplo antígenos de vírus das hepatites A, B, C, D & E, HIV, vírus do herpes, citomegalovírus, varicela zoster, papilomavírus, vírus Epstein Barr, vírus da influenza, vírus da para- influenza, adenovírus, vírus coxsakie, picornavírus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, poxvírus, rinovírus, vírus da rubéola, papovírus, vírus da caxumba, vírus do sarampo; alguns exemplos não limitantes de antígenos virais incluem os seguintes: antígenos derivados de HIV-I tais como tat, nef, gpl20 ou gplóO, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev ou part e/ou suas combinações; antígenos derivados de vírus do herpes de humano tais como gH, gL gM gB gC gK gE ou gD ou parte e/ou suas combinações ou proteína Precoce Imediata tal como ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 de HSVl ou HSV2; antígenos derivados de citomegalovírus, especialmente citomegalovírus de humano tal como gB ou seus derivados; antígenos derivados de vírus Epstein Barr tal como gp350 ou seus derivados; antígenos derivados de Vírus de varicela zoster tais como gpl, 11, 111 e IE63; antígenos derivados de um vírus da hepatite tal como antígeno do vírus de hepatite B, hepatite C ou hepatite E (e.g. proteína env El ou E2, proteína de núcleo, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7, ou parte e/ou suas combinações de HCV); antígenos derivados de papilomavírus de humano (por exemplo HPV6,11,16,18, e.g. LI, L2, El, E2, E3, E4, E5, E6, E7, ou parte e/ou suas combinações); antígenos derivados de outros patógenos virais, tais como vírus sincicial respiratório (e.g proteínas F e G ou seus derivados), vírus de para-influenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, flavivírus (e. g. Vírus da Febre Amarela, Vírus da Dengue, Vírus da encefalite proveniente de carrapato, Vírus da Encefalite Japonesa) ou células com vírus da Influenza (e.g. proteínas HA, NP, NA, ou M, ou parte e/ou suas combinações);
- antígenos relacionados com ou específicos de tumor incluem por exemplo antígenos do câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer de cabeça e pescoço, câncer renal, melanoma maligno, câncer laringeal, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de próstata. Antígenos de câncer são antígenos que podem potencialmente estimular respostas imunes aparentemente específicas de tumor. Alguns destes antígenos são codificados, embora não necessariamente expressados, por células normais. Estes antígenos podem ser caracterizados como aqueles que são normalmente silenciosos (i.e., não expressados) em células normais, aqueles que são expressados apenas em certos estágios de diferenciação e aqueles que são temporariamente expressados tais como antígenos embriônicos e fetais. Outros antígenos de câncer são codificados por genes celulares mutantes, tais como oncogenes (e.g., oncogene ras ativado), genes supressores (e.g., mutante p53), proteínas de fusão resultantes de translocações cromossômicas ou deleções internas. Ainda outros antígenos de câncer podem ser codificados por genes virais tais como aqueles transportados em vírus de tumor de RNA e DNA. Alguns exemplos não limitantes de antígenos relacionados com ou específicos de tumor incluem MART-I/Melan-A, gplOO, Dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), proteína ligante de adenosina-deaminase (ADAbp), ciclofilina b, antígeno associado coloretal (CRC)-CO 17-1A/GA733, Antígeno Carcinoembriônico (CEA) e seus epitopos imunogênicos CAP-I e CAP-2, etvó, amll, Antígeno Específico de Próstata (PSA) e seus epitopos imunogênicos PSA-1, PSA-2, e PSA-3, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor de célula-T /cadeia CD3-zeta, família-MAGE de antígenos de tumor (e.g., MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-Al0, MAGE-Al 1, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE- B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE- C4, MAGE-C5), família-GAGE-de antígenos de tumor (e.g., GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC (e.g. MUC-1), HER2/neu, p21ras, RCAS1, alfa- fetoproteína, E-caderina, alfa-catenina, beta-catenina e gama-catenina, pl20ctn, gp 100.sup.Pmel 117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína da polipose adenomatosa do cólon (APC), fodrina, Conexina 37, Ig-idiótipo, p15, gp75, gangliosídeos GM2 e GD2, produtos virais tais como proteínas de papilomavírus de humano, família Smad de antígenos de tumor, Imp-1, PIA, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-I, glicogênio-fosforilase de cérebro, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-I, SSX-4, SSX-5, SCP-I e CT-7, e c-erbB-2.;
antígenos bacterianos incluem por exemplo antígenos de Micobactérias causadores de TB e lepra, pneumococos, bacilos gram- negativos aeróbicos, micoplasma, infecções estafilococais, infecções estreptococais, salmonelas, clamídias, neisserias;
- outros antígenos incluem por exemplo antígenos de malária, leishmaniose, tripanossomíase, toxoplasmose, esquistossomíase, filaríase;
- alérgenos referem-se a uma substância que pode induzir uma resposta alérgica ou asmática em um sujeito suscetível. A lista de alérgenos é enorme e pode incluir pólens, venenos de insetos, animal eflúvio de pêlo de animal, esporos fúngicos, e drogas (e.g. penicilina). Exemplos de alérgenos naturais, animais e de planta incluem mas não são limitados às proteínas específicas dos seguintes gêneros: Canino (Canis familiaris); Dermatofagóides (e.g. Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (e.g. Lolium perenne ou Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (e.g. Plantago lanceolata); Parietaria (e.g. Parietaria officinalis ou Parietaria judaica); Blattella (e.g. Blattella germanica); Apis (e.g. Apis multiflorum); Cupressus (e.g. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica and Cupressus macrocarpa); Juniperus (e.g. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis e Juniperus ashei); Thuya (e.g. Thuya orientalis); Chamaecyparis (e.g. Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (e.g. Periplaneta americana); Agropyron (e.g. Agropyron repens); Secale (e.g. Secale cereale); Triticum (e.g. Tritieum aestivum); Daetylis (e.g. Daetylis glomerata); Festuca (e.g. Festuca elatior); Poa (e.g. Poa pratensis ou Poa compressa); Avena (e.g. Avena sativa); Holcus (e.g. Holcus lanatus); Anthoxanthum (e.g. Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (e.g. Arrhenatherum elatius); Agrostis (e.g. Agrostis alba); Phleum (e.g. Phleum pratense); Phalaris (e.g. Phalaris arundinacea); Paspalum (e.g. Paspalum notatum); Sorghum (e.g. Sorghum halepensis); e Bromus (e.g. Bromus inermis).
Em uma modalidade particularmente preferida a seqüência de nucleotídeos heteróloga da presente invenção, codifica um ou mais de todos ou de parte dos seguintes antígenos HBV-PreSl PreS2 e proteínas env de Superfície, de núcleo e polHIV-gpl20 gp40,gpl60, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef; HPV-El, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, LI, L2 (veja por exemplo WO 90/10459, WO 98/04705, WO 99/03885); proteína env El ou E2 de HCV, proteína de núcleo, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7; Muc-I (veja por exemplo US 5.861.381; US6.054.438; W098/04727; W098/37095).
O ácido nucleico codificador de antígeno é operativamente ligada em uma seqüência de expressão de gene que dirige a expressão do ácido nucleico de antígeno dentro de uma célula eucariótica. A seqüência de expressão de gene é qualquer seqüência de nucleotídeos regulatória, tal como uma seqüência de promotor ou uma combinação de intensificador-promotor, que facilita a transcrição e a tradução eficientes do ácido nucleico de antígeno no qual está operativamente ligada. A seqüência de expressão de gene pode ser, por exemplo, um promotor de vírus ou de mamífero, tal como um promotor constitutivo ou induzível. Promotores constitutivos de mamífero incluem, mas não são limitados aos, promotores para os seguintes genes: hipoxantina-fosfo-ribosil-transferase (HPRT), adenosina-deaminase, piruvato- quinase, promotor de b-actina e outros promotores constitutivos. Promotores virais exemplares que funcional constitutivamente em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores do citomegalovírus (CMV), vírus simiano (e.g., SV40), papilomavírus, adenovírus, vírus de imunodeficiência de humano (HIV), vírus do sarcoma de Rous, citomegalovírus, repetições terminais longas (LTR) de vírus da leucemia de Moloney e outros retrovírus, e o promotor de timidina quinase do vírus do herpes simples. Outros promotores constitutivos são conhecidos por aqueles pessoas ordinariamente experientes na arte. Os promotores úteis como seqüências de expressão de gene da invenção também incluem promotores induzíveis. Promotores induzíveis são expressados na presença de um agente indutor. Por exemplo, o promotor de metalotioneína é induzido para promover transcrição e tradução na presença de certos íons de metal. Outros promotores induzíveis são conhecidos pelas pessoas ordinariamente experientes na arte. Em geral, a seqüência de expressão de gene deve incluir, se necessárias, as seqüências de não-transcrição 5' e de não-tradução 5' envolvidas com a iniciação da transcrição e da tradução, respectivamente, tais como um box TATA, seqüência bloqueadora, seqüências CAAT, e semelhante. Especialmente, tais seqüências de não-transcrição 5' incluirão uma região de promotor que inclui uma seqüência de promotor para controle de transcrição do ácido nucleico de antígeno operativamente ligado. As seqüências de expressão de gene opcionalmente incluem seqüências intensificadoras ou seqüências ativadoras a montante conforme desejado. Promotores preferidos para uso em um vetor de poxvírus (veja abaixo) incluem sem limitação promotores da vacínia 7.5K, H5R, TK, p28, pl 1 e KlL, promotores quiméricos entre promotores precoces e tardios do poxvírus bem como promotores sintéticos tais como aqueles descritos em Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) e Kumar e Boyle (1990, Virology 179, 151-158).
De acordo com outra modalidade especial, dita seqüência de nucleotídeos heteróloga da presente invenção, codifica todos ou parte dos antígeno(s) d HPV selecionados do grupo consistindo de região codificadora precoce E6 de HPV, região codificadora precoce E7 de HPV e seus derivados ou sua combinação
O antígeno de HPV codificado pelo vetor viral recombinante de acordo com a invenção é selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo de HPV E6, um polipeptídeo de HPV E7 ou ambos um polipeptídeo de HPV E6 e um polipeptídeo de HPV E7. A presente invenção inclui o uso de qualquer polipeptídeo de HPV E6 que ligando em p53 é alterado ou pelo menos significativamente reduzido e/ou o uso de qualquer polipeptídeo de HPV E7 que ligando em Rb é alterado ou significativamente reduzido (Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556; Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 4442-4446; Phelps et al., 1992, J. Virol. 66, 2148-2427). Uma variante de E6 de HPV-16 não-oncogênica que é adequada para o propósito da presente invenção é deletada de um ou mais resíduos de aminoácido localizados de aproximadamente posição 118 a até aproximadamente posição 122 (+1 representando o primeiro resíduo de metionina do polipeptídeo E6 de HPV-16 nativo), com uma preferência especial para a deleção completa de resíduos 118 a 122 (CPEEK). Uma variante E7 de HPV-16 não oncogênica que é adequada para o propósito da presente invenção é deletada de um ou mais resíduos de aminoácido localizados de aproximadamente a posição 21 a até aproximadamente a posição 26 (+1 representando o primeiro aminoácido do polipeptídeo E7 de HPV-16 E7 nativo, com uma preferência especial para a deleção completa de resíduos 21 a 26 (DLYCYE). De acordo com uma modalidade preferida, o um ou mais polipeptídeo(s) precoce(s) de HPV-16 em uso na invenção é/são adicionalmente modificado(s) de modo a aperfeiçoar a apresentação de MHC classe I e/ou de MHC classe II, e/ou para estimular imunidade anti-HPV. Polipeptídeos E6 e E7 de HPV são proteínas nucleares e tem sido previamente mostrado que apresentação em membrana permite aperfeiçoar sua eficácia terapêutica (veja por exemplo W099/03885). Assim, pode ser aconselhável modificar pelo menos um do(s) polipeptídeo(s) precoce(s) de HPV de modo a ser ancorado na membrana celular. Ancoragem em membrana pode ser facilmente realizada pela incorporação no polipeptídeo precoce de HPV de uma seqüência de ancoragem em membrana e se o polipeptídeo nativo for faltante dela de uma seqüência secretória (i.e. um peptídeo de sinal). Seqüências secretórias e de ancoragem em membrana são conhecidas na arte. Resumidamente, seqüências secretórias estão presentes na terminação-N da membrana apresentada ou em polipeptídeos secretados e iniciam sua passagem para dentro do retículo endoplasmático (ER). Normalmente compreendem 15 a 35 aminoácidos essencialmente hidrofóbicos que são então removidos por uma endopeptidase localizada em ER específica para dar o polipeptídeo maduro. As seqüências de ancoragem de membrana são de natureza normalmente elevadamente hidrofóbicas e servem para ancorar os polipeptídeos na membrana celular (veja por exemplo Branden e Tooze, 1991, em Introduction to Protein Structure p. 202-214, NY Garland).
A escolha das seqüências secretórias e de ancoragem em membrana que podem ser usadas no contexto da presente invenção é vasta. Podem ser obtidas de qualquer polipeptídeo secretado e/ou ancorado em membrana compreendendo-a (e.g. polipeptídeos celulares ou virais) tais como glicoproteína de raiva, a glicoproteína de envelope de vírus HIV ou da proteína F do vírus do sarampo ou podem ser sintéticas. As seqüências secretórias e/ou de ancoragem em membrana inseridas em cada um dos polipeptídeos E6 de HPV-16 precoces usadas de acordo com a invenção podem ter uma origem comum ou diferente. O sítio de inserção preferido da seqüência secretória é a terminação-N a jusante do códon de iniciação de tradução e aqueles da seqüência de ancoragem em membrana é a terminação- C, por exemplo imediatamente a montante do códon de terminação.
O polipeptídeo E6 de HPV em uso na presente invenção é preferivelmente modificado pela inserção dos sinais secretórios e/ou de ancoragem em membrana da proteína F do sarampo. Opcionalmente ou em combinação, o polipeptídeo E7 de HPV E7 em uso na presente invenção é preferivelmente modificado pela inserção dos sinais secretórios e de ancoragem em membrana da glicoproteína da raiva.
A eficácia terapêutica do vetor viral recombinante também pode ser aperfeiçoada pelo uso de um ou mais ácido nucleico codificador de polipeptídeo(s) imunopotencializador(es). Por exemplo, Pode ser vantajoso ligar o(s) polipeptídeo(s) precoce(s) de HPV em um polipeptídeo tais como calreticulina (Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108, 669-678), proteína 70 de choque calorífico de Mycobacterium tuberculosis (HSP70) (Chen et al., 2000, Câncer Res. 60, 1035-1042), ubiquitina (Rodriguez et al., 1997, J. Virol. 71, 8497-8503) ou o domínio de translocação de uma toxina bacteriana tal como exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA(dlII)) (Hung et al., 2001 Câncer Res. 61, 3698-3703).
De acordo com outra modalidade preferida, o vetor viral recombinante de acordo com a invenção compreende um ácido nucleico codificador de um ou mais polipeptídeo(s) precoce(s) como definido acima, e mais particularmente de polipeptídeos E6 e E7 de HPV-16 e/ou HPV-18.
De acordo com outra modalidade especial, a dita seqüência de nucleotídeos heteróloga da presente invenção, codifica todo ou parte do antígeno MUC 1 ou seus derivados.
Se necessária, a molécula de ácido nucleico em uso na invenção pode ser otimizada para estabelecer expressão em nível alto do antígeno (e.g. polipeptídeo(s) precoce(s) de HPV) em um organismo ou uma célula hospedeira particular, e.g. um organismo ou célula hospedeira de humano. Tipicamente, a otimização de códon é realizada pela substituição de um ou mais códon "nativo" (e.g. HPV) correspondendo a um códon não freqüentemente usado na célula hospedeira de mamífero por um ou mais códon codificador de mesmo aminoácido que é mais freqüentemente usado. Isto pode ser realizado por mutagênese convencional ou por técnicas de síntese química (e.g. resultando em um ácido nucleico sintético). Não é necessário substituir todos os códons nativos correspondendo aos códons não freqüentemente usados porque expressão aumentada pode ser realizada até mesmo com substituição parcial. Além disso, alguns desvios do aderência estrita ao uso de códon otimizado pode ser feitos para acomodar a introdução de sítio(s) de restrição.
Como mencionado acima, vetor de poxvírus é preferido, e mais especificamente cepas de vírus da vacínia elevadamente atenuadas. Determinação da seqüência completa do genoma de MVA e comparação com o genoma de vírus da vacínia Copenhagen têm permitido a identificação de sete deleções (I a VII) que ocorreram no genoma de MVA (Antoine et al., .1998, Virology 244, 365-396), cada uma das quais pode ser usada para inserir o ácido nucleico codificador de antígeno (e.g. peptídeo precoce de HPV ou MUC1).
A técnica básica para inserir o ácido nucleico e os elementos regulatórios associados requerida para a expressão em um genoma de poxvírus é descrita em numerosos documentos acessíveis para um homem experiente na arte (Paul et al., 2002, Câncer gene Ther. 9, 470-477; Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4,769,330; US .4.772.848; US 4.603.112; US 5.100.587 e US 5.179.993). Normalmente, pode-se proceder através de recombinação homóloga entre seqüências de sobreposição (i.e. sítio de inserção desejado) presentes em ambos o genoma viral e um plasmídeo trazendo o ácido nucleico para inserir.
O ácido nucleico codificador de antígeno da invenção é preferivelmente inserido em um locus não essencial do genoma do poxvírus, com o objetivo de que o poxvírus recombinante permaneça viável e infeccioso. Regiões não essenciais são regiões intergênicas não codificadoras ou qualquer gene para o qual inativação ou deleção não confere significativamente infecção, replicação ou crescimento viral. Pode-se também considerar inserção em um locus viral essencial desde que a função i defectiva seja fornecida em trans durante produção de partículas virais, por exemplo pelo uso de uma linhagem celular auxiliadora trazendo seqüências complementares correspondendo àquelas deletadas no genoma de poxvírus.
Quando se usa o vírus da vacínia Copenhagen, o ácido nucleico codificador de antígeno é preferivelmente inserido no gene de timidina-quinase (tk) (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537). Contudo, outros sítios de inserção também são apropriados, e.g. no gene de hemaglutinina (Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), no locus KlL, no gene u (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190) ou na extremidade esquerda do genoma do vírus da vacínia onde uma variedade de deleções espontâneas ou engenhadas têm sido relatadas na literatura (Altenburger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15- 27; Moss et al. 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et al, 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus et al, 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus etal, 1991, Virol. 180, 406-410).
Quando se usa MVA, o ácido nucleico codificador de antígeno pode ser inserido em qualquer uma das deleções identificadas I a VII bem como no locus D4R, mas inserção em deleção II ou III é preferida (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032- 1040).
Quando se usa vírus do epitelioma contagioso, embora inserção dentro do gene de timidina-quinase pode ser considerada, o ácido nucleico codificador de antígeno é preferivelmente introduzido na região intergênica entre ORFs 7 e 9 (veja por exemplo EP 314 569 e US 5.180.675).
Preferivelmente, o ácido nucleico codificador de antígeno em uso na invenção está em uma forma adequada para sua expressão em um organismo ou uma célula hospedeira, o que significa que a seqüência de ácido nucleico codificadora do antígeno (e.g. polipeptídeo E6 e/ou a seqüência de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo E7) está sob o controle de uma ou mais seqüência regulatórias necessárias para expressão no organismo ou na célula hospedeira. Como aqui usado, o termo "seqüência regulatória" refere- se a qualquer seqüência que permite, contribui ou modula a expressão de um ácido nucleico em uma dada célula hospedeira, incluindo replicação, duplicação, transcrição, editoração, tradução, estabilidade e/ou transporte do ácido nucleico ou um seu derivado (i.e. mRNA) para dentro da célula hospedeira. Será reconhecido por aqueles pessoas experientes na arte que a escolha das seqüências regulatórias pode depender de fatores tais como a célula hospedeira, o vetor e o nível de expressão desejado.
O promotor é de uma importância essencial e a presente invenção inclui o uso de promotores constitutivos que dirigem a expressão do ácido nucleico em muitos tipos de célula hospedeira e aqueles que dirigem a expressão em certas células hospedeiras ou em resposta a eventos específicos ou fatores exógenos (e.g. por temperatura, aditivo nutriente, hormônio ou outro ligante). Promotores adequados são amplamente descritos em literatura e pode-se citar mais de um promotor especificamente viral tais como promotores RSV, SV40, CMV e MLP. Promotores preferidos para uso em um vetor de poxvírus incluem sem limitação promotores da vacínia 7.5K, H5R, TK, p28, p11 e KlL, promotores quiméricos entre promotores precoces e tardios do poxvírus bem como promotores sintéticos tais como aqueles descritos em Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond et al. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) e Kumar and Boyle (1990, Virology 179, 151-158).
Aqueles pessoas experientes na arte reconhecerão que os elementos regulatórios controladores da expressão da molécula de ácido nucleico da invenção podem adicionalmente compreender elementos adicionais para iniciação, regulação e/ou terminação apropriadas de transcrição (e.g. seqüências de terminação de transcrição poliA), transporte de mRNA (e.g. seqüências de sinal de localização nuclear), processamento (e.g. sinais de editoração), e estabilidade (e.g. íntrons e seqüências 5' e 3' não- codificadoras), tradução (e.g. sinal de peptídeo, propeptídeo, seqüências líder tripartite, sítios de ligação de ribossomo, seqüências de Shine-Dalgamo, etc.) no organismo ou na célula hospedeira.
Alternativamente, o vetor viral recombinante em uso na presente invenção pode adicionalmente compreender pelo menos um ácido nucleico codificando pelo menos uma citocina. Citocinas adequadas incluem sem limitação IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL-21 e IFNg, com uma preferência especial por IL-2. Quando a vacina viral recombinante da invenção compreende um ácido nucleico expressando citocina, o dito ácido nucleico pode ser transportado pelo vetor viral recombinante codificador de um ou mais polipeptídeo(s) precoce(s) de HPV ou por um vetor recombinante independente que pode ser de mesma origem ou de uma origem diferente.
Uma modalidade preferida da invenção é direcionada ao uso de uma vacina viral recombinante compreendendo um vetor MVA codificador de polipeptídeo E6 de HPV posto sob o promotor 7.5K, o polipeptídeo E7 de HPV posto sob o promotor 7.5K e o gene posto sob o controle do promotor H5R. Preferivelmente, os ácidos nucleicos codificadores do polipeptídeo E6 de HPV, do polipeptídeo E7 de HPV da L-2 de humano são inseridos em deleção III do genoma de MVA.
Outra modalidade preferida da invenção é direcionada ao uso de uma vacina viral recombinante compreendendo um vetor MVA codificador de um polipeptídeo MUC 1 posto sob o promotor 7.5K, e o gene de IL-2 de humano posto sob o controle do promotor H5R.
Partículas virais infecciosas compreendendo o vetor viral recombinante descrito acima podem ser produzidas por processo rotineiro. Um processo exemplar compreende as etapas de:
a. introduzir o vetor viral em uma linhagem celular adequada,
b. cultivar dita linhagem celular sob condições adequadas de modo a permitir a produção de dita partícula viral infecciosa,
c. recuperar a partícula viral infecciosa produzida da cultura de dita linhagem celular, e
d. opcionalmente purificar dita partícula viral infecciosa recuperada.
Células apropriadas para propagar vetores de poxvírus são células de ave, e mais preferivelmente fibroblastos de embrião de galinha primários (CEF) preparados de embriões de galinha obtidos de ovos fertilizados.
As partículas virais infecciosas podem ser recuperadas do sobrenadante de cultura ou das células após Iise (e.g. por meio químico, congelamento/descongelamento, choque osmótico, choque mecânico, sonicação e semelhante). As partículas virais podem ser isoladas por rodadas consecutivas de purificação de placa e então purificadas usando as técnicas da arte (métodos cromatográficos, ultracentrifugação sob gradiente de sacarose ou de cloreto de césio).
De acordo com outra modalidade, o derivado de IH- imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina da presente invenção é um composto definido pelas seguintes fórmulas gerais I-V: <formula>formula see original document page 22</formula>
ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que
R11 é selecionado do grupo consistindo de alquila de cadeia linear ou ramificada, hidróxi-alquila, acil-óxi-alquila, benzila, (fenil)etila e fenila, dito substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila, grupo C1-4 alcoxila e halogênio, com a condição de que se dito anel benzeno está substituído com dois dos ditos grupos, então ditos grupos juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono;
R21 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-8 alquila, benzila, (fenil)etila e fenila, o substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo Cm alquila, grupo C1-4alcoxila e halogênio, com a condição de que quando o anel benzeno está substituído com dois de ditos grupos, então ditos grupos juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono;
e cada R1 é selecionado, independentemente um do outro, do grupo consistindo de hidrogênio, grupo Cm alcoxila, halogênio e grupo C1-4 alquila, e η é um número inteiro de O a 2, com a condição de que se η é 2, então ditos grupos Ri juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; II- <formula>formula see original document page 23</formula>
ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que R12 é selecionado do grupo consistindo de C2-10 alquenila linear
ou ramificada e C2-10 alquenila linear ou ramificada substituída, sendo que o substituinte é selecionado do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila linear ou ramificado e grupo C3-6 ciclo-alquila; e grupo C3-6 ciclo-alquila substituído com grupo Cm alquila linear ou ramificado; e
R22 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-8 alquila linear ou ramificado, benzila, (fenil)etila e fenila, o substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C 1-4 alquila linear ou ramificado, grupo C 1-4 alcoxila linear ou ramificado, e halogênio, com a condição de que quando o anel benzeno está substituído com dois tais grupos, então ditos grupos juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono;
e cada R2 é selecionado, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C 1.4 alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e grupo Cm alquila linear ou ramificado, e n é um número inteiro de zero a 2, com a condição de que se n é 2, então ditos grupos R2 juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono;
<formula>formula see original document page 24</formula>
ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que
R23 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-8 alquila linear ou ramificado, benzila, (fenil)etila e fenila, o substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila linear ou ramificado, grupo C1-4alcoxila linear ou ramificado, e halogênio, com a condição de que quando o anel benzeno está substituído com dois tais grupos, então ditos grupos juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono;
e cada R3 é selecionado, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e grupo C1-4 alquila linear ou ramificado, e η é um número inteiro de zero a 2, com a condição de que se η é 2, então ditos grupos R3 juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; <formula>formula see original document page 25</formula>
ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que
Rh é -CHR34R44 sendo que R44 é hidrogênio ou uma ligação carbono-carbono, com a condição de que quando R44 é hidrogênio R34 é grupo Cm alcoxila, grupo Cm hidróxi-alcoxila, grupo C2-10 1-alquinila, tetra-hidro- piranila, alcóxi-alquila sendo que o grupo alcoxila contém um a quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a quatro átomos de carbono, .2-, 3-, ou 4-piridila, e com a condição de que quando R44 é uma ligação carbono-carbono R44 e R34 juntos formam um grupo tetra-hidro-furanila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupos hidroxila e C1-4 hidróxi-alquila;
R24 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, C 1.4 alquila, fenila, sendo que a fenila está opcionalmente substituída com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C 1.4 alquila linear ou ramificado, grupo C 1.4 alcoxila linear ou ramificado, e halogênio;
e R4 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-4 alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e grupo Ci_4 alquila linear ou ramificado; <formula>formula see original document page 26</formula> ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que
R15 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio; grupo C1-10 alquila linear ou ramificado e grupo Ci_i0 alquila linear ou ramificado substituído, sendo que o substituinte é selecionado do grupo consistindo de C3-6 ciclo-alquila e C3-6 ciclo-alquila substituído com grupo C1-4 alquila linear ou ramificado; C2-10 alquenila linear ou ramificada e grupo C2.\o alquenila linear ou ramificada substituída, sendo que o substituinte é selecionado do grupo consistindo de C3_6 ciclo-alquila e C3-6 ciclo-alquila substituído com grupo C1-4 alquila linear ou ramificado; C1_6 hidróxi-alquila; alcóxi-alquila sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a cerca de seis átomos de carbono; acil-óxi-alquila sendo que o grupo acil-oxila é alcanoil-oxila de dois a cerca de quatro átomos de carbono ou benzoil-oxila, e o grupo alquila contém um a cerca de seis átomos de carbono; benzila; (fenil)etila; e fenila; dito substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila, grupo C1-4 alcoxila, e halogênio, com a condição de que quando dito anel benzeno está substituído com dois de ditos grupos, então os grupos juntos não contêm mais do que seis átomos de carbono;
R25 é
<formula>formula see original document page 27</formula>
sendo que
R35 é selecionado do grupo consistindo de grupo C1-4 alcoxila, alcóxi-alquila sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono; grupo C1-4 haloalquila; alquil-amido sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono; amino; amino substituído com C1-4 alquila ou C1-4 hidróxi-alquila; azido; C1-4 alquil-tio;
R55 e R45 são selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-4 alquila, fenila, sendo que dita fenila está opcionalmente substituída com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila linear ou ramificado, grupo C1-4 alcoxila linear ou ramificado, e halogênio; e
R5 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-4 alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e grupo contendo C1-4 alquila linear ou ramificada.
De acordo com modalidade especial, o grupo C1-4 alquila é por exemplo metila, etila, propila, 2-metil-propila e butila. De acordo com modalidade preferida, o grupo C1-4 alquila é selecionado do grupo consistindo de metila, etila e 2-metil-propila.
De acordo com modalidade especial, o grupo alcoxila é selecionado do grupo consistindo de metoxila, etoxila e etóxi-metila. De acordo com modalidade preferida, n é zero ou um.
De acordo com modalidade preferida, grupos R1-R5 são hidrogênio.
De acordo com modalidade preferida, grupos R11-R15 são selecionados do grupo consistindo de 2-metil-propila e 2-hidróxi-2-metil- propila.
De acordo com modalidade preferida, grupos R21-R25 são selecionados do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-6 alquila, alcóxi- alquila sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono. Grupos R21-R25 mais preferidos são selecionados do grupo consistindo de hidrogênio, metila, ou etóxi-metila.
De acordo com uma modalidade preferida, o derivado da 1H- imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina da presente invenção é um composto definido pela seguinte fórmula geral VI:
<formula>formula see original document page 28</formula>
(VI}
ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que
Rt é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1- 4 alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e C1-4 alquila linear ou ramificada;
Ru é 2-metil-propila ou 2-hidróxi-2-metil-propila; e Rv é hidrogênio, C1-6 alquila, ou alcóxi-alquila sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono.
De acordo com modalidade preferida, em fórmula VI, Rt é hidrogênio, Ru é 2-metil-propila ou 2-hidróxi-2-metil-propila, e Rv é hidrogênio, metila ou etóxi-metila.
De acordo com outra modalidade preferida, o derivado de 1H- imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina da presente invenção é um composto selecionado do seguinte grupo:
1-(2-metil-propil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (um composto de fórmula VI sendo que Rt é hidrogênio, Ru é 2-metil-propila e Rv é hidrogênio);
1 -(2-hidróxi-2-metil-propil)-2-metil- lH-imidazo[4,5- c]quinolin-4-amina (um composto de fórmula VI sendo que Rt é hidrogênio, Ru é 2-hidróxi-2-metil-propila, e Rv é metila;
1-(2-hidróxi-2-metil-propil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4- amina (um composto de fórmula VI sendo que Rt é hidrogênio, Ru é 2- hidróxi-2-metil-propila, e Rv é hidrogênio);
1-(2-hidróxi-2-metil-propil-2-etóxi-metil-1-H-imidazo[4,5- c]quinolin-4-amina (um composto de fórmula VI sendo que Rt é hidrogênio, Ru é 2-hidróxi-2-metil-propila e Rv é etóxi-metila);
ou seus análogos, solvatos ou sais.
Pessoas experientes na arte podem se referir por exemplo a US 4.689.338, US 4.929.624, EP 0385630 ou WO 94/17043 (aqui incorporadas como referências) que descreve os compostos citados acima e os métodos para a sua preparação.
Mais especificamente, a 1-(2-metil-propil)-1H-imidazo[4,5- c]quinolin-4-amina (também conhecida pelo termo imiquimod ou Aldara) tem sido amplamente descrita, referência pode ser feita a Buck, 1998, Infect. Dis. Obstet. Gynecol., 6, 49-51; Doekrell e Kinghorn, 2001, J. Antimierob. Chemother., 48, 751-755 ou Garland, 2003, Curr. Opin. Infect. Dis.,16, 85- 89; a 1-(2-hidróxi-2-metil-propil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-e]quinolin-4-amina e a 1-(2-hidróxi-2-metil-propil)-1H-imidazo[4,5-e]quinolin-4-amina têm sido descritas em US 2004/0076633, e 1-(2-hidróxi-2-metil-propil)-2-etóxi-metil- 1-H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (também conhecida pelo termo resiquimod) em Dockrell e Kinghorn, 2001, J. Antimierob. Chemother. 48, 751-755 ou Jones, Curr. Opin. Investig. Drugs., 2003, 4,214-218.
A não ser que seja indicado de outro modo, referência a um derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina pode incluir o composto em qualquer forma farmaceuticamente aceitável incluindo qualquer monômero (e. g., diastereômero ou enantiômero), sal, solvato, forma polimorfa, e semelhante. Em particular, se um composto é opticamente ativo, referência ao composto pode incluir cada um dos enantiômeros do composto bem como misturas racêmicas dos enantiômeros.
De acordo com uma modalidade preferida, a vacina viral recombinante e mais particularmente o vetor viral recombinante não compreende uma estrutura principal ou motivo imunoestimulante que induz por si mesmo uma reposta imune especialmente uma seqüência de nucleotídeos que possui estrutura principal ou motivo imunoestimulante tais como CpG, poliG, poliT, TG, CpG metilado, CpI e motivo rico em T ou estruturas principais de fosforotioato (veja US 2003/0139364, US 6.207.646 ou WO 01/22972 cujo conteúdo é aqui incorporado como referência.
De acordo com uma modalidade, a concentração de derivado de 1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina na vacina viral recombinante final será de cerca de 0,0001% a cerca de 10% (a não ser que seja indicado de outro modo, todas as percentagens aqui mencionadas são em peso/peso com respeito à formulação total), de cerca de 0,01% a cerca de 2%, mais particularmente de cerca de 0,06 a cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,1a cerca de 0,6%.
De acordo com outra modalidade, a dosagem apropriada de vetor viral recombinante pode ser adaptada como uma função de vários parâmetros, em particular o modo de administração; a composição empregada; a idade, a saúde, e o peso do organismo hospedeiro; a natureza e a extensão dos sintomas; o tipo de tratamento concorrente; a freqüência de tratamento; e/ou a necessidade de prevenção ou terapia. Refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para tratamento é rotineiramente feito por um médico, à luz das circunstâncias 10 relevantes. Para orientação geral, dosagem adequada de uma composição contendo MVA varia de cerca de IO4 a IO10 pfu (unidades de formação de placa), desejavelmente de cerca de IO5 a IO8 pfu enquanto que composição compreendendo adenovírus varia de cerca de 10 a 10 iu (unidades infecciosas), desejavelmente de cerca de IO7 a IO12 iu. Uma composição baseada em plasmídeos vetores pode ser administrada em doses entre 10 μg e 20 mg, vantajosamente entre 100 μg e 2 mg. Preferivelmente a composição é administrada em dose(s) compreendendo de 5x105 pfu a 5x107 pfu de vetor de vacínia MVA.
O regime de dosagem pode depender pelo menos em parte de muitos fatores conhecidos na arte incluindo mas não limitados à natureza do derivado de imidazo[4,5-c] quinolin-4-amina e do vetor viral recombinante usados, a natureza do veículo, a quantidade de derivado de imidazo[4,5-c] quinolin-4-amina e de vetor viral recombinante sendo administrados, o estado do sistema imune do sujeito (e.g., suprimido, comprometido, estimulado), e o processo de administração dos compostos derivado de imidazo[4,5- c]quinolin-4-amina e/ou vetor viral recombinante. Conseqüentemente não é prático anunciar geralmente o regime de dosagem efetivo para aumentar a eficácia de uma vacina viral recombinante para todas as aplicações possíveis. Aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte, contudo, podem prontamente determinar um regime de dosagem apropriado com devida consideração de tais fatores. Em algumas modalidades da invenção, os compostos derivado de imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina e/ou vetor viral recombinante podem ser administrados, por exemplo, uma vez ao dia, embora em algumas modalidades os compostos derivado de imidazo[4,5-c]quinolin-4- amina e/ou vetor viral recombinante possam ser administrados em uma freqüência fora desta faixa. Em certas modalidades, os compostos imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina e/ou vetor viral recombinante podem ser administrados cerca de uma vez por semana a cerca de uma vez ao dia. Em uma modalidade particular, os compostos derivado de imidazo[4,5- c]quinolin-4-amina e/ou vetor viral recombinante são administrados uma vez todas as semanas. Desejavelmente, o derivado de imidazo[4,5-c]quinolin-4- amina e vetor viral recombinante são administrados 1 a 10 vezes em intervalos semanais. Preferivelmente, o derivado de imidazo[4,5-c] quinolin- 4-amina e vetor viral recombinante, ou qualquer composição contendo-o, são administrados 3 vezes em intervalos semanais por rota subcutânea.
Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método de aumentar uma resposta imune a um antígeno em um paciente, dito método compreendendo administração, quer seqüencial quer simultaneamente, de (i) um vetor viral recombinante expressando in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos heteróloga, especialmente uma seqüência de nucleotídeos heteróloga codificadora de um antígeno e (ii) um derivado de imidazo[4,5- c]quinolin-4-amina.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de prevenir ocorrência de e/ou de tratar câncer em um paciente, dito método compreendendo administração, quer seqüencial quer simultaneamente, de (i) um vetor viral recombinante expressando in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos heteróloga, especialmente uma seqüência de nucleotídeos heteróloga codificadora de um antígeno e (ii) um derivado de imidazo[4,5- c]quinolin-4-amina.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de prevenir ocorrência de e/ou de tratar doença infecciosa em um paciente, dito método compreendendo administração, quer seqüencial quer simultaneamente, de (i) um vetor viral recombinante expressando in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos heteróloga, especialmente uma seqüência de nucleotídeos heteróloga codificadora de um antígeno e (ii) um derivado de imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina. De acordo com uma modalidade preferida, dita doença infecciosa é uma doença induzida por vírus, tal como por exemplo doença induzida por HIV, HCV, HBV, HPV, e semelhante.
Em uma outra modalidade é proporcionado o uso de um derivado de imidazo[4,5-c]quinolin4-amina na manufatura de uma vacina viral recombinante para aumentar uma resposta imune a um antígeno codificado por um vetor viral recombinante, dito vetor viral recombinante sendo administrado quer seqüencial quer simultaneamente com dito derivado.
"Administrado seqüencialmente" significa que o vetor viral recombinante [composto (i)] e o derivado de imidazo[4,5-c]quinolin4-amina [composto (ii)] da presente vacina viral recombinante são administrados independentemente um do outro; e.g. uma primeira administração de um de dito composto e uma segunda administração separada consistindo de administração do segundo composto. De acordo com a presente invenção, a primeira administração pode ser feita antes da, concorrentemente com ou subseqüente à segunda administração, e vice-versa. Administração e segunda administração de composição terapêutica podem ser realizadas por rotas de liberação idênticas ou diferentes (liberação sistêmica e liberação direcionada, ou liberações direcionadas por exemplo). Em uma modalidade preferida, cada uma deve ser feita no mesmo tecido alvo e mais preferivelmente pela rota parenteral.
Em modalidade preferida, as administrações do vetor viral recombinante e do derivado de imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina são substancialmente simultâneas. E mais preferivelmente, ambos os compostos são co-administrados.
Em outra modalidade, o derivado de imidazo[4,5-c]quinolin-4- amina é administrado antes do viral recombinante. Nesta modalidade especial, "antes" significa cerca de 5 min a cerca de 2 semanas, mais particularmente de cerca de 1 hora a cerca de 1 semana, muito mais particularmente de cerca de 6 horas a cerca de 48 horas.
A vacina viral recombinante da invenção é administrada ao paciente como uma solução farmaceuticamente aceitável, que pode rotineiramente conter concentrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes de tamponamento, conservantes, veículos compatíveis, e adjuvantes (e.g. alume, BCG, modificadores de resposta imune), e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.
O termo veículo farmaceuticamente aceitável significa um ou mais substâncias encapsulantes, diluentes ou cargas líquidos ou sólidos compatíveis que são adequados para administração a um humano ou outro animal vertebrado. O termo veículo denota um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o ingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas também são capazes de serem misturados com os compostos da presente invenção, e uns com os outros, em uma maneira tal que não há interação que substancialmente prejudicaria a eficiência farmacêutica desejada.
A vacina viral recombinante pode ser administrada por qualquer rota ordinária para administração de medicamentos. Uma variedade de rotas de administração está disponível. Claro que o modo particular selecionado dependerá do teor particular da vacina viral recombinante, da condição particular sendo tratada e da dosagem exigida para eficácia terapêutica. Os métodos desta invenção, geralmente falando, podem ser praticados usando qualquer modo de administração que é medicamente aceitável, significando qualquer modo que produz níveis efetivos de uma resposta imune sem causar efeitos adversos quimicamente inaceitáveis. Modos de administração preferidos são aqui discutidos. Para uso em terapia, uma quantidade efetiva do derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina pode ser administrada a um sujeito por qualquer modo que libera o agente na superfície desejada, e.g., mucosal, sistêmica e sob qualquer forma, e.g. creme, solução.
A vacina viral recombinante, ou seus compostos separados (i) e (ii), podem ser usados de acordo com a invenção por uma variedade de modos de administração, incluindo administração sistêmica, tópica e localizada. Injeção pode ser realizada por qualquer meio, por exemplo por injeção subcutânea, intradermal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intravascular, intraarterial ou por injeção direta em uma artéria (e.g. por infusão em artéria hepática) ou uma veia alimentando fígado (e.g. injeção para dentro da veia portal). Injeções podem ser feitas com seringas e agulhas convencionais, ou qualquer outros dispositivos apropriados disponíveis na arte. Alternativamente o composto ativo, ou qualquer composição contendo-o, pode ser administrado via uma rota mucosal, tal como rota oral / alimentar, nasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal ou intra-retal. Administração tópica também pode ser realizada usando meio transdermal (e.g. emplastro, creme e semelhante). No contexto da invenção, administrações intramuscular e subcutânea constituem as rotas preferidas.
Para administração oral, a vacina viral recombinante pode ser formulada pela combinação do(s) composto(s) ativo com veículos farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na arte. Tais veículos permitem que os compostos da invenção sejam formulados como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, pastas, suspensões e semelhante, para ingestão oral por um sujeito a ser tratado. Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas como excipiente sólido, opcionalmente moendo uma mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejados, para obter núcleos de drágea. Excipientes adequados, são, em particular, cargas tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil-celulose, hidróxi-propil-metil-celulose, sódio-carbóxi-metil-celulose, e/ou poli(vinil-pirrolidona) (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, tais como a poli(vinil- pirrolidona) reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um seu sal tal como alginato de sódio. Opcionalmente as formulações orais também podem ser formuladas em solução salina ou tampões para neutralizar condições ácidas internas ou podem ser administradas sem quaisquer veículos. Vacina viral recombinante que pode ser usada oralmente incluem cápsulas empurra- encaixa feitas de gelatina, bem como cápsulas moles, vedadas feitas de gelatina e um plastificante, tais como glicerol ou sorbitol. As cápsulas empurra-encaixa podem conter os ingredientes ativos misturados com carga tal como lactose, aglutinantes tais como amidos, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem estar dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida, ou poli(etileno-glicóis) líquidos. Em adição, estabilizadores podem ser adicionados. Microesferas formuladas para administração oral também podem ser usadas. Tais microesferas têm sido bem definidas na arte. Todas as formulações para administração oral devem estar em dosagens adequadas para tal administração.
A vacina viral recombinante, quando é desejável liberá-la sistemicamente, pode ser formulada para administração parenteral por injeção, e.g., por injeção de bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, e.g., em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado. A vacina viral recombinante pode tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões e veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão. Vacina viral recombinante para administração parenteral inclui soluções aquosas dos compostos ativos na forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos (i) e/ou (ii) podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Veículos ou solventes lipofílicos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomos. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como sódio-carbóxi-metil-celulose, sorbitol, ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções elevadamente concentradas.
Alternativamente, os compostos ativos (i) e/ou (ii) podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, e.g., água estéril livre de pirogênio, antes do uso. A vacina viral recombinante também pode ser formulada em composições retais ou vaginais tais como supositórios ou enemas de retenção, e.g., contendo bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos. Em adição a vacina viral recombinante também pode ser formulada como uma preparação de deposição. Tais formulações de ação longa podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo como uma emulsão em um óleo aceitável) ou em resinas de troca iônica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal fracamente solúvel. A vacina viral recombinante também pode compreender veículos ou excipientes de fase de gel ou sólida Exemplos de tais veículos ou excipientes incluem mas não são limitados a carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina, e polímeros tais como poli(etileno-glicóis).
Formas sólidas ou líquidas adequadas de vacina viral recombinante são, por exemplo, soluções aquosas ou salinas para inalação, partículas microencapsuladas, como cocleatos, revestidas sobre partículas de ouro microscópicas, contidas em lipossomos, nebulizadas, aerossóis, pelotas para implante na pele, ou secas sobre um objeto pontudo para ser inserido na pele. As composições farmacêuticas também incluem grânulos, pós, tabletes, tabletes revestidos, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, supositórios, cremes, gotas ou preparações com liberação prolongada de compostos ativos, em cuja preparação desintegrantes, aglutinantes, agentes de revestimento, agentes de inchamento, lubrificantes, aromatizantes, edulcorantes ou agentes de solubilização são costumeiramente usados como descrito acima.
O derivado de 1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina pode ser administrado per se na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando usados em medicina os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não-farmaceuticamente aceitáveis podem ser convenientemente usados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Tais sais incluem, mas não são limitados a, àqueles preparados dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfurico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p- tolueno-sulfônico, tartárico, cítrico, metano-sulfônico, fórmico, malônico, succínico, naftaleno-2-sulfônico, e benzeno-sulfônico. Também, tais sais podem ser preparados como sais de metal alcalino ou metal alcalino-terroso, tais como sais de sódio, de potássio ou de cálcio do grupo ácido carboxílico.
Agentes de tamponamento adequados incluem: ácido acético e um sal (1-2% p/v); ácido cítrico e um sal (1-3% p/v); ácido bórico e um sal (0,5-2,5% p/v); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2% p/v). Conservantes adequados incluem cloreto de benzalcônio (0,003-0,03% p/v); cloro-butanol (0,3-0,9% p/v); parabenos (0,01-0,25% p/v) e timerosal (0,004-0,02% p/v).
A vacina viral recombinante pode ser convenientemente apresentada em forma de dosagem unitária e pode ser preparada por qualquer um dos métodos bem conhecidos na arte da farmácia. Todos os métodos incluem a etapa de associar os compostos (i) e (ii) com um veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas por associação uniforme e íntima dos compostos com um veículo líquido, um veículo sólido finamente dividido, ou ambos, e então, se necessário, moldagem do produto. Unidades de dosagem líquidas são frascos ou ampolas. Unidades de dosagem sólidas são tabletes, cápsulas e supositórios. Para tratamento de um paciente, dependendo da atividade do composto, da maneira de administração, do propósito da imunização (i.e. profilática ou terapêutica), da natureza e da severidade do distúrbio, da idade e do peso corporal do paciente, doses diferentes podem ser necessárias. A administração de uma dose dada pode ser realizada por administração única na forma de uma unidade de dosagem individual ou então por várias unidades de dosagem menores. Administrações múltiplas de doses em intervalos separados de semana ou meses específicos são normais para reforçar as respostas específicas ao antígeno.
Outros sistemas de liberação incluem sistemas de liberação de liberação no tempo, de liberação retardada ou de liberação prolongada. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas dos compostos da vacina viral recombinante, aumentando o conforto para o sujeito e o médico. Muitos tipos de sistemas de liberação controlada estão disponíveis e são conhecidos por aqueles pessoas experientes na arte. Incluem sistemas de base polimérica tais como poli(lactídeo-glicolídeo), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, poli(ácido hidróxi-butírico), e polianidridos. Microcápsulas de polímeros acima contendo drogas são descritas, por exemplo, em US 5.075.109. Sistemas de liberação também incluem sistemas não-poliméricos que são: lipídeos incluindo esteróis tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos ou gorduras naturais tais como mono-, di-, e tri-glicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas baseados em peptídeo; revestimentos de cera; tabletes comprimidos usando excipientes e aglutinantes convencionais; implantes parcialmente fundidos; e semelhante. Exemplos específicos incluem, mas não são limitados a: (a) sistemas erodíveis nos quais um agente da invenção está contido em uma forma dentro de uma matriz tais como aquelas descritas em US 4.452.775, 4.675.189, e 5.736.152, e (b) sistemas difusíveis nos quais um componente ativo permeia em uma velocidade controlada de um polímero tal como descrito em US 3.854.480, 5.133.974 e 5.407.686. Em adição, sistemas de liberação de dispositivo baseado em bomba podem ser usados, alguns dos quais estão adaptados para implantação.
A forma de administração do vetor viral recombinante [composto (i)] e do derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina [composto (ii)] pode ser idêntica ou diferente para uma dita vacina viral recombinante de acordo com a invenção (e.g. composto (i) administrado como uma solução e composto (ii) administrado como um creme).
Em outros aspectos, a invenção refere-se a kits. Um kit da invenção inclui um recipiente contendo (i) pelo menos um vetor viral recombinante da invenção e um recipiente contendo (ii) pelo menos um derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina e instruções para tempo de administração dos compostos. O recipiente pode ser um recipiente único alojando ambos (i) pelo menos uma vacina viral recombinante e (ii) pelo menos um derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina juntos ou pode ser de câmaras ou recipientes múltiplos alojando dosagens individuais dos compostos (i) e (ii), tais como uma embalagem de blister. O kit também tem instruções para tempo de administração da vacina viral recombinante. As instruções orientariam o sujeito para tomar a vacina viral recombinante na hora apropriada. Por exemplo, a hora apropriada para liberação da vacina viral recombinante pode ser quando ocorre o sintoma. Alternativamente, o hora de administração apropriada da vacina viral recombinante pode estar em um horário de rotina tal como mensal ou anualmente. Os compostos (i) e (ii) podem ser administrados simultânea ou separadamente desde que sejam administrados suficientemente próximos em tempo para produzir uma resposta imune sinérgica.
Se desejado, o método ou uso da invenção pode ser realizado conjuntamente com uma ou mais modalidades terapêuticas convencionais (e.g. radiação, quimioterapia e/ou cirurgia). O uso de múltiplas abordagens terapêuticas proporciona o paciente com uma intervenção de base mais ampla.Em uma modalidade, o método da invenção pode ser precedido ou seguido por uma intervenção cirúrgica. Em outra modalidade, pode ser precedido ou seguido por radioterapia (e.g. radiação gama). Aqueles pessoas experientes na arte podem prontamente formular parâmetros e protocolos de terapia de radiação apropriados que podem ser usados (veja por exemplo Perez e Brady, 1992, Principies and Practice of Radiation Oncology, 2nd Ed. JB Lippincott Co; usando adaptações e modificações adequadas que serão prontamente evidentes para aqueles pessoas experientes no campo). Em ainda outra modalidade, o método ou uso da invenção está associado à quimioterapia com uma ou mais drogas (e.g. drogas que são convencionalmente usadas para tratar ou prevenir infecções por HPV, condições patológicas associadas ao HPV).
A presente invenção adicionalmente concerne a um método para aperfeiçoar o tratamento de um paciente com câncer que está sofrendo tratamento quimioterapêutico com um agente quimioterapêutico, que compreende co-tratamento de dito paciente juntamente com uma vacina viral recombinante como descrito acima. A presente invenção adicionalmente concerne a um método de aperfeiçoar efetividade citotóxica de drogas citotóxicas ou radioterapia que compreende co-tratar um paciente em necessidade de tal tratamento junto com uma vacina viral recombinante como descrito acima.
Em outra modalidade, o método ou uso da invenção é realizado de acordo com uma modalidade terapêutica de reforço inicial que compreende administração seqüencial de uma ou mais composições iniciadoras e uma ou mais composições reforçadoras. Tipicamente, as composições iniciadora e reforçadora usam veículos diferentes que compreendem ou codificam pelo menos um domínio antigênico comum. A composição iniciadora é inicialmente administrada ao organismo hospedeiro e a composição reforçadora é subseqüentemente administrada ao mesmo organismo hospedeiro após um período variando de um dia a doze meses. O método da invenção pode compreender uma a dez administrações seqüenciais da composição iniciadora seguida por uma a dez administrações da composição reforçadora. Desejavelmente, intervalos de injeção são uma questão de uma semana a seis meses. Além disso, as composições iniciadora e reforçadora podem ser administradas no mesmo sítio ou em sítios alternativos pela mesma rota ou por rotas de administração diferentes. Por exemplo, composições baseadas em polipeptídeo precoce de HPV podem ser administradas por uma rota mucosal enquanto que vacina viral recombinante é preferivelmente injetada, e.g. injeção subcutânea para um vetor MVA.
A capacidade para induzir ou estimular uma resposta imune anti-HPV sob administração em um organismo animal ou humano pode ser avaliada quer in vitro quer in vivo usando uma variedade de ensaios que são padrão na arte. Para uma descrição geral de técnicas disponíveis para avaliar o início e a ativação de uma resposta imune, veja por exemplo Coligan et al. (1992 e 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health). Medição de imunidade celular pode ser realizada pela medição de perfis de citocina secretada pelas células efetoras ativadas incluindo aquelas derivadas de células-T CD4+ e CD8+ (e.g. quantificação de células produzindo IL-IO ou IFN gama por ELIspot), pela determinação do estado de ativação de células efetoras imunes (e.g. ensaios de proliferação de célula T por uma captação de [3H] timidina clássica), pelo ensaio para linfócitos T específicos para antígeno em um sujeito sensibilizado (e.g. Iise específica de peptídeo em um ensaio de citotoxicidade). A capacidade para estimular uma resposta humoral pode ser determinada por ligação de anticorpo e/ou competição em ligação (veja por exemplo Harlow, .1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press). O método da invenção também pode ser adicionalmente avaliado em modelos animais desafiados com um agente indutor de tumor apropriado (e.g. células TCl expressando E6 e E7 de HPV) para determinar atividade antitumoral, refletindo uma indução ou uma intensificação de uma resposta imune anti-HPV.
Condições doentias que podem ser especialmente tratadas de acordo com a presente invenção são por exemplo câncer cervical ou lesões precursoras desta neoplasia maligna, que são chamadas de neoplasia intra- epitelial cervical (CIN) ou lesões intra-epiteliais escamosas (SIL). A vacina viral recombinante da invenção também pode ser útil no tratamento de infecções assintomáticas da cerviz em pacientes identificados por diagnose de DNA, ou infecções assintomáticas que são assumidas em permanecer após tratamento cirúrgico de câncer cervical, CIN ou SIL, ou infecções assintomáticas presumidas em existir após raciocínio epidemiológico. As condições doentias a serem tratadas também incluem verrugas genitais, e verrugas comuns e verrugas plantares. Todas estas condições também são causadas por um número grande de outros tipos de HPV, e os agentes, compostos e métodos da invenção também podem ser utilmente direcionados contra estes vírus. Todas estas lesões presumivelmente derivam de infecções assintomáticas, que são mais freqüentemente não diagnosticadas. A presente invenção também pode ser utilmente direcionada contra todas estas infecções assintomáticas.
A invenção tem sido descrita em uma maneira ilustrativa, e é para ser entendido que a terminologia que tem sido usada é intencionada para ser de natureza de palavras de descrição em vez de limitação. Obviamente, muitas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima. Portanto é para ser entendido que dentro do escopo das reivindicações apendidas, a invenção pode ser praticada em uma maneira diferente daquela que é aqui especificamente descrita.
Todas as descrições de patente, publicações e entradas de bancos de dados são especificamente aqui incorporadas em sua totalidade na mesma extensão se cada uma tal patente, publicação ou entrada individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada como referência.
Legenda das figuras:
Figuras la/b/c/d: Efeito terapêutico de uma combinação entre administração tópica de Imiquimod com injeção subcutânea de MVATG8042. Figura lb: Experimento 1: 2.IO5 TCI sc. 3 injeções sc com 5.IO6 pfu. 15 camundongos por grupo; Figura lc: Experimento 2: 2.IO5 TCI sc. 3 injeções sc com 5.IO6 ou 5.IO5 pfu. 15 camundongos por grupo; Figura ld: Experimento 3: 2. IO5 TCI sc, 3 injeções sc com 5, IO6, 15 camundongos por grupo
Figuras 2a/2b: Medição da freqüência de linfócitos secretando IFNy específico para E7/E6. Figura 2b: Resposta Thl Elispot/IFNgama específica para E6/E7.
Figura 3: Ensaio de IL-4 em ELISPOT. Resposta Th2 Elispot/IL-4 específica para E7.
Figura 4a/4b: Análise por citometria de fluxo de células T CD8+ específicas para R9F. Medição da freqüência de células T CD8+ específicas para Tet_R9F+ E7.
Figura 5a/5b: Resposta imune humoral específica para E7. Medição de mudança de isótipo de IgG Thl/Th2.
Figura 6: Título de anticorpo neutralizador específico para MVA (NAT50).
Figura 7: Efeito terapêutico de combinação de Aldara + MVATG9931 em um modelo de tumor RenCa-Muc 1.
Figura 8: Efeito de imiquimod sobre respostas de célula T de tipo Thl específica para MUCl-contra epitopos curtos ou longos.
Figura 9: Ensaio de IL-4 em Elispot: Efeito de respostas de célula T de tipo Th2 específica para MUC-1.
Figura 10: Resposta imune humoral específica para MUCl (Mudança de Isótipo): Efeito de imiquimod sobre resposta humoral específica para MUC1.
Exemplos
A - Vetor viral recombinante expressando antígenos de
HPV.
1. Materiais e Métodos
1.1 Artigo de Teste
Denominação e Descrição Breve de cada construção de vetor recombinante (baseado em MVA)
<table>table see original document page 45</column></row><table>
Condições de armazenagem:
Vírus foram mantidos a -80°C até o dia de injeção. A suspensão viral foi rapidamente descongelada imediatamente antes das diluição e administração.
Vírus foram diluídos em tampão Tris/HCl 10 mM, sacarose 5% (p/v), NaGlu 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8,0 com o propósito de obter a dose requerida em um volume de 100 μΐ.
1.2. Modelo Animal
Espécie/Cepa/Fornecedor:
Camundongos fêmeas C57B1/6 saudáveis SPF foram obtidos de Charles River (Les Oncins, França).
Os animais eram de 6 semanas de idade na chegada. No início da experimentação, eram de 7 semanas de idade.
Os animais foram alojados em uma sala única, exclusiva, com ar condicionado para obter um mínimo de 11 mudanças de ar por hora. As faixas de temperatura e umidade relativa estiveram dentro de 20°C e 24°C e 40 a 70 % respectivamente. Iluminação foi controlada automaticamente para dar um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Estado livre de patógeno foi checado por controle regular de animais sentinela.
Durante todo o estudo os animais tinham acesso ad libitum à dieta esterilizada de tipo RMl (Dietex France, Saint Gratien). Água estéril foi fornecida ad libitum via garrafas.
Todos os animais foram aclimatizados por uma semana antes do início do experimento.
1.3 Descrição das células
Células de tumor TCl obtidas de pulmão de camundongo C57B16, têm sido transduzidas com dois retrovírus: LXSNl 6E6E7 expressando E6 e E7 de HPV16 e pVEJB expressando o gene ras. As células foram cultivadas em DMEM contendo 0,5 mg/ml de G418 e 0,2 mg/ml de Higromicina. Células aderentes foram removidas por tratamento com tripsina e após 3 lavagens, desafios de tumor foram realizados subcutaneamente com 2.10 células TCl viáveis. 1.4. Aldara™ (3M Pharmaceuticals)
Aldara™ é a marca para imiquimod. Cada grama do creme 5% contém 50 mg de imiquimod em uma base de creme hidratante de óleo-em- água quase branco consistindo de ácido isoesteárico, cetil-álcool, estearil- álcool, petrolato branco, polissorbato 60, monoestearato de sorbitana, glicerina, goma xantana, água purificada, benzil-álcool, metil-parabeno e propil-parabeno.
1.5. Protocolo
Planejamento de Imunizações:
Para os experimentos imunoterapêuticos, 15 camundongos fêmeas C57B16 foram desafiados subcutaneamente no flanco direito com 2. IO5 células TCl em Dl. Camundongos foram tratados três vezes, subcutaneamente em três sítios distantes, com 5. IO6 pfu OU 5.10 pfu de vírus da vacínia em D8, D15 e D22. Imiquimod (creme Aldara 5%; 3M Pharmaceuticals) foi aplicado topicamente imediatamente antes de cada imunização sobre os sítios de injeção na pele raspada de camundongos (aproximadamente 1 cm2). Cada camundongo recebeu aproximadamente 0,8 mg ou 1,6 mg/camundongo de imiquimod ativo per imunização. Crescimento de tumor foi monitorado, duas vezes por semana durante 80 dias, com um compasso de calibre. Camundongos foram mortos por razões éticas quando seu tamanho de tumor foi superior a 25 mm de diâmetro ou quando mostraram dor até mesmo se tumor era menor.
Para estudo de imunogenicidade, 3 camundongos fêmeas C57B16 livres de tumor foram vacinados subcutaneamente em três sítios distantes com 5.10 pfu ou 5.10 pfu de vírus da vacínia em Dl, D8 e Dl5. Esta dose foi usada para otimizar a detecção de imunidade celular contra antígenos específicos de HPV. Imiquimod foi aplicado topicamente imediatamente antes de cada imunização sobre os sítios de injeção na pele raspada de camundongos (aprox. 1 cm2). Cada camundongo recebeu aproximadamente 0,8 mg ou 1,6 mg /camundongo de imiquimod ativo por imunização. Baço e soro foram removidos em D22 para análise imunológica.
Parâmetros de monitoração:
*Medição por Elispot de número/freqüência de células secretoras de IFNsama (Thl) ou IL-4 (Th2)
Células de baço frescas foram preparadas usando um Cell Strainer (BD Falcon). Todos os peptídeos foram sintetizados por Neosystem no nível de imunograu (10 mg). Cada peptídeo foi dissolvido em DMSO a 10 mg/ml e armazenado a 4°C. Elispot foi realizado usando o kit Mabtech AB mouse IFNgamma ELISPOTplus ou o kit mouse DE IL-4 EM ELISPOTplus (Mabtech, França) de acordo com as instruções do fabricante. Uma placa de nitrocelulose de 96 cavidades foi revestida com 3μg/ml de anticorpo monoclonal de rato anti- IFNgama de camundongo (Clone R4-6A2; Pharmingen, cat. nr551216, Lote M072862; ΙΟΟμΙ/cavidade) em Tampão Carbonato de Sódio. As placas foram incubadas durante a noite a 4°C ou Ih a .37°C. Placas foram lavadas três vezes com DMEM 10% FCS e saturadas 2 horas a 37°C com ΙΟΟμΙ de DMEM 10% FCS/ cavidade. Esplenócitos foram plaqueados em uma concentração de IO6 células/ΙΟΟμΙ. Interleucina 2 foi adicionada em todas as cavidades em uma concentração de 6U/50μl/cavidade (R&D Systems) lOng/ml). Concanavalina A foi usada como controle positivo (5μg/ml). Peptídeos específicos de HPV foram usados em uma concentração de 5μg/ml. As placas foram incubadas 48 horas a 37°C, CO2 5%. A placa foi lavada uma vez com PBS IX e 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Anticorpo Anti-IFNgama de camundongo biotinilado (clone XMG1.2, Pharmingen) foi adicionado na concentração de 0,3μg/100μl/cavidade e incubado 2 horas na temperatura ambiente sob agitação lenta. A placa foi lavada 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Extravidina AKP (Sigma, St. Louis, MO) diluída a .1/5.000 em PBS-Tween 0,05%-FCSl% também foi adicionada nas cavidades (ΙΟΟμΙ/cavidade). A placa foi incubada 45 minutos na temperatura ambiente e então lavada 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Secreção de IFNgama foi revelada com Kit Biorad. ΙΟΟμΙ de substrato (NBT+BCIP) foram adicionados por cavidade e a placa foi deixada na temperatura ambiente por 1A hora. A placa foi lavada com água e posta para secar durante a noite na temperatura ambiente. Manchas foram contadas usando um microscópio de dissecação. Manchas foram contadas usando o Elispot reader Bioreader 4000 Pro-X (BIOSYS-Gmbh; Serlabo France).
Lista de peptídeos testados:
SCVYCKKEL (E6; Db): Peptídeo S9L
RCIICQRPL (E6; Db): Peptídeo R9L
SEYRHYQYS (E6; Kb): Peptídeo S9S
ECVYCKQQL (E6; Db): Peptídeo E9L
TDLHCYEQL (E7; Kb): Peptídeo T9L
RAHYNIVTF (E7; Db): Peptídeo R9F
Peptídeo Irrelevante (específico de MUC1)
D38L (E7; Db) é um peptídeo específico de E7 longo de 38
aminoácidos.
Proteína E7 recombinante purificada também tem sido usada nos diferentes ensaios ELISPOT.
*Medição da freqüência de células T CD8+ específicas para
tetrâmero R9F
Células de baço frescas foram colhidas e preparadas usando uma peneira específica BD (Cell Strainer). Esplenócitos foram estimulados durante 5 dias com peptídeo R9F (5μg/ml) em placas de 24 cavidades ou usados diretamente para marcação específica. 1.106 Células foram coradas com 1μl de um anticorpo específico para CD8 de camundongo copulado em APC (BD Pharmingen 553035; clone 53-6.7; lote n° 32567) e 1Ομl de tetrâmero H-2Db específico para R9F (Beckman Coulter T20071; H-2Db/PE; peptídeo RAHYNIVTF; lote C507117; C602110) durante 30 min a 4°C. Células foram lavadas então diluídas em PBS/0,5% PFA.
*Medição de mudança de isótipo de IsG relacionado com Thl/Th2 contra antísenos de E7
* Placas de 96 cavidades foram revestidas durante a noite a 4°C com 3 μg/ml de proteína E7 purificada (P#2101 caderno PCOOOO1; página 157; 0ct.2002). A proteína foi diluída em tampão de revestimento (NaHCO3 200mM, Na2CO3 80mM, pH 9,5) e ΙΟΟμΙ foram adicionados por cavidade.
* Cavidades foram lavadas cinco vezes com uma lavadora de placas (PBS, Tween 20 0,1%, EDTA IOmM) e saturadas por 1 hora na temperatura ambiente com 300μ1 de PBS + BSA 3%.
* Cavidades foram lavadas 5 vezes e incubadas com diluições seriais de 1/2 de soro de camundongo (1/25 a 1/1.600 em PBS + BSA 1%) por 2 horas na temperatura ambiente.
* A placa foi lavada 5 times. Um anticorpo de rato anti-IgG2a de camundongo conjugado com peroxidase (BD Pharmingen 553391) ou um anticorpo de rato anti-IgGl de camundongo (BD Pharmingen 559626) diluído a 1/1000 em PBS+ BSA 1% foi adicionado (ΙΟΟμΙ/cavidade) e incubado por 1 hora na temperatura ambiente.
* Cavidades foram lavadas cinco vezes e reveladas com 100 μΐ de solução de substrato (ácido cítrico 0,05M, acetato de sódio 0,05M, tetrametil-benzidina 1%, H2O2 0,015%)/cavidade.
Solução de TMB (10 ml)= 140μ1 de TMB + 2μ1 de H2O2 + 5ml de Acetato de Na (0,1M) + 5ml de Citrato (0,1M)
* A reação foi interrompida pela adição del00μl de H2SO4 0,8M /cavidade. Absorbância foi medida em 450nm (Genesys system).
*Análise de anticorpo neutralizador de MVA induzido pela vacinação
Células: BHK-21 (fibroblasto de hamster, Ref ATCC: CCL- 10) MVA-GFP (MVATG15938): Proteína fluorescente verde repórter foi inserida em deleção III de MVA sob o controle do promotor p11K7.5.
Etapa 1: Soro neutralizante:
Todos os soros foram decomplementados por aquecimento por 30 min a 56°C antes do uso.
Controle positivo: soro de rato imunizado com Poxvírus (cepa WR) (Ref. Ac WRIMVQC34)
Etapa 2: Ensaio de soroneutralização (Medição SOP de título de anticorpos neutralizadores anti-MVA)
- Plasmas foram serialmente diluídos em meio de cultura (faixa de diluição de 50x a 3.200x) e incubados em uma microplaca de 96 cavidades com MVA-GFP (5x10^3 pfu/cavidade) por Ih a 37°C (etapa de neutralização). Células BHK-21 (10^5 células/cavidade) foram então semeadas e incubadas por um adicional de 16-18 horas a 37°C, CO2 5%.
- No dia seguinte, a microplaca de 96 cavidades foi lavada com 250μL de PBS e 100μL de PBS foram adicionados em cada cavidade antes da leitura de intensidade de fluorescência com uma leitora Fluorescence Microplate (VICTOR™ PerkinElmer®). O título de anticorpo neutralizador é o título no qual 50% de atividade viral é inibida. Títulos de Anticorpo Neutralizador (NAT50) foram calculados usando o método de Spearman- Kárber.
2- Resultados
Três experimentos terapêuticos independentes têm sido realizados seguindo o modelo descrito na seção de Material e Método.
Em todos os experimentos, temos consistentemente observado que aplicação tópica de creme Aldara™ (5%) no sítio de vacinação aumenta significativamente a eficácia terapêutica de MVATG8042 (veja Figura la, b, c e d). Neste cenário, vacinação com 5.10^6 pfu de MVATG8042 induziu em média 45% de camundongos livres de tumor pelo final de cada experimento enquanto que 75% e 95% de animais livres de tumor foram vistos quando MVATG8042 foi usado em combinação com 0,8 mg ou 1,6 mg de imiquimod, respectivamente.
Em uma série de experimentos (veja Figura lc), também temos observado que a adição de Aldara™ permite alcançar a mesma eficácia terapêutica com uma dose de vírus mais baixa um Iog (5.105pfu).
A diferença estatística nos experimentos sobreviventes in vivo entre os grupos diferentes foi avaliada usando uma aplicação de Log Rank (programa de computador Statistica 5.1, Statsoft Inc.) das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier. Em p<0,05 é considerado estatisticamente significativo.
Em paralelo, dois estudos independentes foram realizados para avaliar a indução de ambas as respostas celular e humoral contra antígenos E6 e E7 de HPV. Camundongos foram vacinados como descrito na seção de protocolo. Em ambos os experimentos, o número de células secretoras de IFNgama específico para E6 ou E7 foi enumerado usando um ensaio ELISPOT. Estes resultados mostram que administração tópica de Aldara™ resulta em um aumento significativo no número de células T CD8+ restritas em MHC classe I para um obtido com apenas MVATG8042 (Figuras 2a e b). Respostas baixas para uma variedade mais ampla de epítopos estão presentes no grupo Aldara™ + MVATG8042 (peptídeos S9S e T9L). Em paralelo, em um experimento separado, o número de células secretoras de IL-4 específica para E7 foi menor em MVATG8042 + Aldara™ do que no grupo MVA sozinho (Figura 3). Tomados juntos, estes dados indicam que a combinação de MVATG8042 + Aldara™ melhora a resposta imune celular baseada em Thl contra os antígenos E6 e E7.
A freqüência de esplenócitos CD8+/R9F Tetrâmero+ tem sido adicionalmente analisada por citometria de fluxo antes ou após estimulação in vitro com o epitopo imunodominante R9F específico de E7 (Figura 4a). Estes resultados indicam que o reconhecimento do epitopo imunodominante R9F é claramente mediado por células T específicas para CD8+. A freqüência da população de CD8+ restrita em R9F-Db é baixa no baço e esta população é melhor detectada após uma estimulação in vitro com o peptídeo. Pré- tratamento com Aldara™ melhorou significativamente o número de células T CD8+ específicas para R9F-Db em experimento mostrado em Figura 4b.
Finalmente a medição da resposta humoral contra o antígeno E7 também foi realizada por ELISA. Com o objetivo de melhor caracterizar o tipo de resposta induzida pela combinação Aldara™ + MVATG8042, o isótipo de IgG foi analisado. IgGl e IgG2a específicas para E7 foram detectadas. Os dados (Figura 5) mostram que aplicação tópica de Aldara™ induz um perfil Thl típico (título de IgG2a mais alto do que IgGl, Fig. 5a) que poderia ter implicações na eficácia do tratamento combinado. Estes resultados são confirmados em um segundo experimento (Fig. 5b).
Finalmente o nível de anticorpo neutralizador específico para MVA foi medido para analisar o impacto de combinação de Aldara com MVATG8042 (Figura 6). Os resultados indicam que a combinação de MVATG8042 e Aldara™ reduz o título de anticorpo neutralizador específico para MYA obtido quando comparado com apenas MVA similarmente injetado. Isto poderia ser explicado pelo ambiente criado pela administração tópica do creme Aldara™ que pode proteger contra a neutralização por anticorpos específicos.
B - Vetor viral recombinante expressando antígeno tumoral MUC1.
2.1. Artigo de Teste
Denominação e Descrição Breve de cada construção de vetor recombinante (baseado em MVA) <table>table see original document page 54</column></row><table> Condições de armazenagem:
Vírus foram recebidos do Departamento de Imunologia
Molecular e então foram mantidos a -80°C até o dia de injeção. A suspensão viral foi rapidamente descongelada imediatamente antes das diluição e administração.
Condições de diluição antes do uso:
Vírus foram diluídos em tampão TG0008 (Tris/HCl 10 mM, sacarose 5% (p/v), NaGlu 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8,0) com o propósito de obter a dose exigida em um volume de ΙΟΟμΙ.
2.2. Modelo Animal
Espécie/Cepa/Fornecedor:
Camundongos fêmeas B6D2 e C57B1/6 saudáveis SPF foram obtidos de Charles River (Les Oncins, França). Os animais eram de 6 semanas de idade na chegada. No início
da experimentação, eram de 7 semanas de idade. Os animais foram alojados em uma sala única, exclusiva, com ar condicionado para obter um mínimo de 11 mudanças de ar por hora. As faixas de temperatura e umidade relativa estiveram dentro de 20°C e 24°C e 40 a 70 % respectivamente. Iluminação foi controlada automaticamente para dar um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Durante todo o estudo os animais tinham acesso ad libitum à dieta esterilizada de tipo RMl (Dietex France, Saint Gratien). Água estéril foi fornecida ad libitum via garrafas.
.2.3. Descrição de Células
Células de tumor RenCa-MUC 1: RenCa é um modelo de
câncer de rim murino experimental. Células RenCa foram transfectadas com pHMG-ETAtm (MUC-I) e pY3 (resistência à higromicina B) usando o método clássico de transfecção em fosfato de Ca2+. Clones foram selecionados após diluição clonal em DMEM (Modificado por Dulbecco) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado, L-glutamina (2 mM), gentamicina (0,04 g/l) e higromicina (600 μg/ml, Roche Diagnostic). Análise de expressão de MUC-I foi feita por análise de citofluometria (usando um FACScan, Becton Dickinson) com anticorpo monoclonal H23. Células aderentes foram removidas pelo tratamento com PBS/EDTA e após 3 lavagens, desafios de tumor foram realizados subcutaneamente com 3.IO5 de células viáveis RenCa-MUCl (clone 4).
.2.4. Protocolo
Planejamento de Imunizações:
Para os experimentos imunoterapêuticos, 15 camundongos fêmeas B6D2 foram desafiados subcutaneamente no flanco direito com 3.IO5 células RenCa-MUCl em Dl. Camundongos foram tratados três vezes, subcutaneamente em três sítios distantes, com 5.IO6 pfu OU 5.IO5 pfu de poxvírus (cepa MVA) em D4, 11 e 18. Imiquimod foi aplicado topicamente imediatamente antes de cada imunização sobre os sítios de injeção na pele raspada de camundongos (aproximadamente 10 cm ). Cada camundongo recebeu aproximadamente 1 mg /camundongo de imiquimod ativo per imunização. Crescimento de tumor foi monitorado, duas vezes por semana durante 80 dias, com um compasso de calibre. Camundongos foram mortos por razões éticas quando seu tamanho de tumor foi superior a 25 mm de diâmetro ou quando mostraram dor até mesmo se tumor era menor.
Para estudo de imunogenicidade, 3 camundongos fêmeas C57B16 foram vacinados subcutaneamente em três sítios distantes com 5.10 pfu de poxvírus (cepa MVA) em Dl, 8 e 15. Esta dose foi usada para otimizar a detecção de imunidade celular contra antígenos específicos de MUC1. Imiquimod foi aplicado topicamente imediatamente antes de cada imunização sobre os sítios de injeção na pele raspada de camundongos (aprox. 10 cm ). Cada camundongo recebeu aproximadamente 1 mg /camundongo de imiquimod ativo por imunização. Baço e soro foram removidos em D22 para análise imunológica.
Parâmetros de monitoração:
*Medição por Elispor de número/freqüência de células secretoras de IFNgama
Células de baço foram preparadas usando tampão de purificação de Linfócitos. todos os peptídeos foram sintetizados por Neosystem no nível de imunograu (10 mg). Cada peptídeo foi dissolvido em DMSO a 10 mg/ml e armazenado a 4°C. Uma placa de nitrocelulose de 96 cavidades foi revestida com 3μg/ml de anticorpo monoclonal de rato anti- IFNgama de camundongo (Clone R4-6A2; Pharmingen, cat. nr551216, Lote M072862; ΙΟΟμΙ/cavidade) em Tampão Carbonato de Sódio. As placas foram incubadas durante a noite a 4°C ou Ih a 37°C. As placas foram lavadas três vezes com DMEM 10% FCS e saturadas 2 horas a 37°C com ΙΟΟμΙ de DMEM 10% FCS/ cavidade. Esplenócitos foram plaqueados em uma concentração de IO6 células/lΟΟμΙ. Interleucina 2 foi adicionada em todas as cavidades em uma concentração de 6U/50μl/cavidade (R&D Systems) 10 ng/ml). Concanavalina A foi usada como controle positivo (5μg/ml). Peptídeos específicos para MUC foram usados em uma concentração de 5μg/ml. As placas foram incubadas 48 horas a 37°C, CO2 5%. A placa foi lavada uma vez com PBS IX e 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Anticorpo anti-IFNgama de camundongo biotinilado (clone XMG1.2, Pharmingen) foi adicionado na concentração de 0,3μg/100μl/cavidade e incubado 2 horas na temperatura ambiente sob agitação lenta. A placa foi lavada 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Extravidina AKP (Sigma, St. Louis, MO) diluída a 1/5.000 em PBS-Tween0,05%-FCSl% também foi adicionada nas cavidades (ΙΟΟμΙ/cavidade). A placa foi incubada 45 minutos na temperatura ambiente e então lavada 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Secreção de IFNgama foi revelada com Kit Biorad. ΙΟΟμΙ de substrato (NBT+BCIP) foram adicionados por cavidade e a placa foi deixada na temperatura ambiente por 1A hora. A placa foi lavada com água e posta para secar durante a noite na temperatura ambiente. Manchas foram contadas usando microscópio de dissecação.
*Medição por Elispot de número/freqüência de células secretoras de IL-4
Células de baço foram preparadas usando tampão de purificação de Linfócitos. Todos os peptídeos foram sintetizados por Neosystem no nível de imunograu (10 mg). Cada peptídeo foi dissolvido em DMSO a 10 mg/ml e armazenado a 4°C. Uma placa de nitrocelulose de 96 cavidades foi revestida com 3μg/ml de anticorpo monoclonal anti-IL-4 de camundongo (Pharmingen, cat. nr551878, Lote 27401; ΙΟΟμΙ/cavidade) em Tampão Carbonato de Sódio. As placas foram incubadas durante a noite a 4°C ou Ih a 37°C. As placas foram lavadas três vezes com DMEM 10% FCS e saturadas 2 horas a 37°C com ΙΟΟμΙ de DMEM 10% FCS/ cavidade. Esplenócitos foram plaqueados em uma concentração de IO6 células/ΙΟΟμΙ. Interleucina 2 foi adicionada em todas as cavidades em uma concentração de 6U/50μl/cavidade (R&D Systems 10 ng/ml). Concanavalina A foi usada como controle positivo (5μg/ml). Peptídeos específicos para MUC foram usados em uma concentração de 5μg/ml. As placas foram incubadas 48 horas a 37°C, CO2 5%. A placa foi lavada uma vez com PBS IX e 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Anticorpo anti-IL-4 de camundongo biotinilado (Pharmingen) foi adicionado na concentração de 0,2μg/100μl/cavidade e incubado 2 horas na temperatura ambiente sob agitação lenta. A placa foi lavada 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Extravidina AKP (Sigma, St. Louis, MO) diluída a 1/5.000 em PBS-Tween 0,05%-FCSl% também foi adicionada nas cavidades (ΙΟΟμΙ/cavidade). A placa foi incubada 45 minutos na temperatura ambiente e então lavada 5 vezes com PBS-Tween 0,05%. Secreção de IFNgama foi revelada com Kit Biorad. ΙΟΟμΙ de substrato (NBT+BCIP) foram adicionados por cavidade e a placa foi deixada na temperatura ambiente por 1/2 hora. A placa foi lavada com água e posta para secar durante a noite na temperatura ambiente. Manchas foram contadas usando microscópio de dissecação.
Lista de peptídeos testados:
F9L FLSFHISNL (H-2Kb; Heukamp, 2001) A9A APGSTAPPA (H-2Db) T24P TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP G23D GQDVTLAPATEPASGSAATWGQD V23S VTGSGHASSTPGGEKETSATQRS
Peptídeo Irrelevante/R9F RAHYNIVTF (E7; Db) Medição de mudança de isótipo IgGl relacionado com Thl/Th2 contra antíseno MUCl antígeno
* Placas de 96 cavidades foram revestidas durante a noite a 4°C com 3μg/ml de peptídeo específico de T24P MUCl (P#2101 caderno PC00001; página 157; 0ct.2002). O peptídeo foi diluído em tampão de revestimento (NaHCO3 200mM, Na2CO3 80mM, pH 9,5) e ΙΟΟμΙ foram adicionados por cavidade.
* Cavidades foram lavadas cinco vezes com uma lavadora de placas (PBS, Tween 20 0,1%, EDTA 1OmM) e saturadas por 1 hora na temperatura ambiente com 300μ1 de PBS + BSA 3%.
* Cavidades foram lavadas 5 vezes e incubadas com diluições seriais de 1/2 de soro de camundongo (1/25 a 1/1.600 em PBS + BSA 1%) por 2 horas na temperatura ambiente.
* A placa foi lavada 5 times. Um anticorpo de rato anti-IgG2a de camundongo conjugado com peroxidase (BD Pharmingen 553391) ou um anticorpo de rato anti-IgGl de camundongo (BD Pharmingen 559626) diluído a 1/1000 em PBS+ BSA 1% foi adicionado (ΙΟΟμΙ/cavidade) e incubado por 1 hora na temperatura ambiente. * Cavidades foram lavadas cinco vezes e reveladas com 100 μΐ de solução de substrato (ácido cítrico 0,05M, acetato de sódio 0,05M, tetrametil-benzidina 1%, H2O2 0,015%)/cavidade.
Solução de TMB (10 ml)- 140μ1 de TMB + 2μ1 de H2O2 + 5ml de Acetato de Na (0,1M) + 5ml de Citrato (0,1M)
* A reação foi interrompida pela adição del00μl de H2S04 0,8M /cavidade. Absorbância foi medida em 450nm (Genesys system).
3- Resultados
Foi realizado um experimento terapêutico em modelo subcutâneo de RenCa-MUCl como descrito na seção de protocolo. Temos observado que um pré-tratamento por uma administração tópica de creme Aldara™ 5% aumenta significativamente a eficácia terapêutica de MVATG9931 em 5% a 35% de camundongos livres de tumor no final do experimento. Neste experimento, camundongos não foram tratados com aplicação tópica de Aldara™ só. Contudo, de acordo com informação publicada sobre um modelo de câncer diferente (tumor expressando OVA), é descrito que aplicação tópica de Aldara™ em um sítio distinto do tumor não tem efeito terapêutico (Craft et ai, 2005). A diferença estatística em experimento de sobrevivência in vivo entre os grupos diferentes foi avaliada usando aplicação de Log Rank (programa de computador Statistica 5.1, Statsoft Inc.) das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier. Um P<0,05 é considerado estatisticamente significativo.
Figura 7 ilustra o efeito terapêutico de combinação Aldara + MVATG9931 em um modelo de tumor renCa-Mucl.
Um estudo de imunogenicidade também foi realizado em paralelo para ver a indução de ambas as resposta celular e humoral contra antígeno MUC1. Camundongos foram vacinados como descrito na seção de protocolo.
Em um primeiro conjunto de experimentos, o número de células secretoras de IFNgama específico para MUCl foi enumerado usando um ensaio ELISPOT. MUCl H-2Db, H-2Kb e peptídeos restritos longos foram usados para monitorar ambas respostas de células T CD4 e CD8 após imunização. Temos observado que pré-tratamento com uma administração tópica de Aldara não melhora significativamente o número de células T CD4 e CD8 restritas em MHC classe I e classe II obtidas com MVATG9931 apenas (Figura 8).
Em outro conjunto de experimentos, o número de células secretoras de IL-4 específica para MUCl foi enumerado usando um ensaio ELISPOT. Peptídeos restritos em MUC1 foram usados para monitorar ambas respostas de células T CD4 e CD8 T após imunização. Temos observado que pré-tratamento com uma administração tópica de Aldara reduz significativamente o número de respostas de célula T baseada em Th2 obtidas com MVATG9931 apenas (Figura 9).
Finalmente a medição da resposta humoral contra o antígeno MUCl também foi realizada por ELISA. Com o propósito de melhor caracterizar o tipo de resposta induzida pela combinação Aldara™ + MVATG9931, o isótipo de IgG foi analisado. IgGl e IgG2a específicas para MUCl foram detectadas (Figura 10). Temos observado que pré-tratamento por uma administração tópica de Aldara™ induz uma resposta de tipo Thl típica (título de IgG2a mais alto do que IgGl) que poderia estar implicado na eficácia do tratamento.
C - Conclusões e Discussões
Estes experimentos demonstram pela primeira vez que aplicação de Aldara™ pode melhorar a eficácia (melhorar a resposta imune) de uma vacina baseada em MVA para antígenos.

Claims (12)

1. Vacina viral recombinante, caracterizada pelo fato de compreender (i) pelo menos um vetor viral recombinante expressando in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos heteróloga, especialmente uma seqüência de nucleotídeos heteróloga codificadora de um antígeno, e (ii) pelo menos um derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina.
2. Kit para vacinação, caracterizado pelo fato de incluir um recipiente contendo (i) pelo menos um vetor poxviral recombinante expressando in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos heteróloga, especialmente uma seqüência de nucleotídeos heteróloga codificadora de um antígeno, e (ii) um recipiente contendo pelo menos um derivado de IH- imidazo [4,5 -c] quinolin-4-amina.
3. Vacina viral recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou kit de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que dito vetor poxviral é uma cepa de vírus da vacínia altamente atenuada.
4. Vacina viral recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que dita cepa de vírus de vacínia altamente atenuada é uma cepa de vírus de vacínia altamente atenuada derivada da cepa Copenhagen ou Wyeth.
5. Vacina viral recombinante ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que dito derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina é um composto definido por qualquer uma das fórmulas gerais I-V: <formula>formula see original document page 61</formula> <formula>formula see original document page 62</formula> ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que R11 é selecionado do grupo consistindo de alquila de cadeia linear ou ramificada, hidróxi-alquila, acil-óxi-alquila, benzila, (fenil)etila e fenila, dito substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila, grupo C1-4 alcoxila e halogênio, com a condição de que se dito anel benzeno está substituído com dois dos ditos grupos, então ditos grupos juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; R21 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-8 alquila, benzila, (fenil)etila e fenila, o substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila, grupo C1-4 alcoxila e halogênio, com a condição de que quando o anel benzeno está substituído com dois de ditos grupos, então ditos grupos juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; e cada R1 é selecionado, independentemente um do outro, do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-4 alcoxila, halogênio e grupo C1-4 alquila, e n é um número inteiro de 0 a 2, com a condição de que se n é 2, então ditos grupos Ri juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; <formula>formula see original document page 63</formula> <formula>formula see original document page 63</formula> ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que R12 é selecionado do grupo consistindo de C2-10 alquenila linear ou ramificada C2-10 alquenila linear ou ramificada substituída, sendo que o substituinte é selecionado do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila linear ou ramificado e grupo C3-6 ciclo-alquila; e grupo C3-6 ciclo-alquila substituído com grupo Cm alquila linear ou ramificado; e R22 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-8 alquila linear ou ramificado, benzila, (fenil)etila e fenila, o substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo Cm alquila linear ou ramificado, grupo C1-4 alcoxila linear ou ramificado, e halogênio, com a condição de que quando o anel benzeno está substituído com dois tais grupos, então ditos grupos juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; e cada R2 é selecionado, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo Cm alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e grupo C1-4 alquila linear ou ramificado, e n é um número inteiro de zero a 2, com a condição de que se n é 2, então ditos grupos R2 juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; <formula>formula see original document page 64</formula> ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que R23 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-8 alquila linear ou ramificado, benzila, (fenil)etila e fenila, o substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C 1.4 alquila linear ou ramificado, grupo C1-4 alcoxila linear ou ramificado, e halogênio, com a condição de que quando o anel benzeno está substituído com dois tais grupos, então ditos grupos juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; e cada R3 é selecionado, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e grupo C1-4 alquila linear ou ramificado, e n é um número inteiro de zero a 2, com a condição de que se n é 2, então ditos grupos R3 juntos não contêm mais do que 6 átomos de carbono; IV- <formula>formula see original document page 65</formula> ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que R14 é -CHR34R44 sendo que R44 é hidrogênio ou uma ligação carbono-carbono, com a condição de que quando R44 é hidrogênio R34 é grupo C1-4 alcoxila, grupo Cm hidróxi-alcoxila, grupo C2.io 1-alquinila, tetra-hidro- piranila, alcóxi-alquila sendo que o grupo alcoxila contém um a quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a quatro átomos de carbono,2-, 3-, ou 4-piridila, e com a condição de que quando R44 é uma ligação carbono-carbono R44 e R34 juntos formam um grupo tetra-hidro-furanila opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupos hidroxila e Cm hidróxi-alquila; R24 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, Cm alquila, fenila, sendo que a fenila está opcionalmente substituída com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo Cm alquila linear ou ramificado, grupo Cm alcoxila linear ou ramificado, e halogênio; e R4 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo Cm alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e grupo Cm alquila linear ou ramificado; <formula>formula see original document page 66</formula> ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que R15 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio; grupo C1-10 alquila linear ou ramificado e grupo C1-10 alquila linear ou ramificado substituído, sendo que o substituinte é selecionado do grupo consistindo de C3-6 ciclo-alquila e C3-6 ciclo-alquila substituído com grupo C1-4 alquila linear ou ramificado; C2-10 alquenila linear ou ramificada grupo C2-10 alquenila linear ou ramificada substituído, sendo que o substituinte é selecionado do grupo consistindo de C3-6 ciclo-alquila e C3-6 ciclo-alquila substituído com grupo C1-4 alquila linear ou ramificado; C1-6 hidróxi-alquila; alcóxi-alquila sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a cerca de seis átomos de carbono; acil-óxi-alquila sendo que o grupo acil-oxila é alcanoil-oxila de dois a cerca de quatro átomos de carbono ou benzoil-oxila, e o grupo alquila contém um a cerca de seis átomos de carbono; benzila; (fenil)etila; e fenila; dito substituinte benzila, (fenil)etila ou fenila estando opcionalmente substituído no anel benzeno com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo C1-4 alquila, grupo C1-4 alcoxila, e halogênio, com a condição de que quando dito anel benzeno está substituído com dois de ditos grupos, então os grupos juntos não contêm mais do que seis átomos de carbono; <formula>formula see original document page 67</formula> sendo que R35 é selecionado do grupo consistindo de grupo Cm alcoxila, alcóxi-alquila sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono; grupo Cm haloalquila; alquil-amido sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono; amino; amino substituído com Ci^alquila ou C1-4 hidróxi-alquila; azido; Cm alquil-tio; R55 e R45 são selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de hidrogênio, grupo Cm alquila, fenila, sendo que dita fenila está opcionalmente substituída com um ou dois grupos selecionados, independentemente um do outro, do grupo consistindo de grupo Cm alquila linear ou ramificado, grupo Ci_4 alcoxila linear ou ramificado, e halogênio; e R5 é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo Cm alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e grupo contendo Cm alquila linear ou ramificada.
6. Vacina viral recombinante ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que dito derivado de lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina é um composto definido pela seguinte fórmula geral VI: <formula>formula see original document page 68</formula> ou seus análogos, solvatos ou sais, sendo que Rt é selecionado do grupo consistindo de hidrogênio, grupo C1-4 alcoxila linear ou ramificado, halogênio, e uma modalidade; Ru é 2-metil-propila ou 2-hidróxi-2-metil-propila; e Rv é hidrogênio, C 1.6 alquila, ou alcóxi-alquila sendo que o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono e o grupo alquila contém um a cerca de quatro átomos de carbono.
7. Vacina viral recombinante ou kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que dita seqüência de nucleotídeo heteróloga (i) codifica um ou mais de todo ou parte dos antígenos HPV-El, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, LI, L2.
8. Método para usar pelo menos um composto sendo derivado de 1Η-imidazo [4,5-c][quinolin-4-amina, caracterizado pelo fato de que compreende preparar uma vacina viral recombinante incluindo (i) pelo menos um vetor viral recombinante que expressa in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo heteróloga que codifica um antígeno, e (ii) dito derivado de I-H- imidazo [4,5-c]quinolin-4-amina para a intensificação de uma resposta imune ao dito antígeno em um paciente, em que a administração de dito derivado de IH- imidazo [4,5-c][quinolin-4-amina é realizado simultaneamente a uma segunda administração consistindo em administrar o dito vetor viral recombinante, e é realizado antes da dita segunda administração.
9. Método para usar pelo menos um composto sendo derivado de lH-imidazo [4,5-c][quinolin-4-amina, caracterizado pelo fato de que compreende preparar uma vacina viral recombinante incluindo (i) pelo menos um vetor viral recombinante que expressa in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo heteróloga que codifica um antígeno, e (ii) dito derivado de 1-H-imidazo [4,5- c]quinolin-4-amina para a intensificação de uma resposta imune ao dito antígeno em um paciente, em que a administração de dito derivado de lH-imidazo [4,5- c][quinolin-4-amina é realizado simultaneamente a uma segunda administração consistindo em administrar o dito vetor viral recombinante.
10. Método para usar pelo menos um composto sendo derivado de lH-imidazo [4,5-c][quinolin-4-amina, caracterizado pelo fato de que compreende preparar uma vacina viral recombinante incluindo (i) um recipiente contendo pelo menos um vetor viral recombinante que expressa in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo heteróloga que codifica um antígeno, e (ii) um recipiente contendo dito derivado de 1-H-imidazo [4,5- c]quinolin-4-amina para a intensificação de uma resposta imune ao dito antígeno em um paciente, em que a administração de dito derivado de IH- imidazo [4,5-c][quinolin-4-amina é realizado simultaneamente a uma segunda administração consistindo em administrar o dito vetor viral recombinante.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que dito vetor viral recombinante que expressa in vivo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo heteróloga que codifica um antígeno é um vetor poxviral recombinante.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ali, caracterizado pelo fato de que dita seqüência de nucleotídeo heteróloga (i) codifica um ou mais de todo ou parte dos antígenos HPV-E1, E2, E3, E4, E5,E6, E7, E8,L1,L2.
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