BRPI0713792A2 - uso de derivados de estilbeno para tratamento e prevenção de infecções por fungos aquáticos - Google Patents

Abstract

USO DE DERIVADOS DE ESTILBENO PARA O TRATAMENTO E PREVENçãO DE INFECçõES POR FUNGOS AQUáTICOS. A invenção refere-se aos método de tratamento e prevenção de infecções por fungos quáticos em organismos aquáticos e métodos de desinfetar equipamento empregado em organismos aquáticos aumentado. Os método compreendendo o uso de um ou mais derivado de estilbeno, incluindo derivados de ácidos 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2'-dissulfónico.

Description

"USO DE DERIVADOS DE ESTILBENO PARA TRATAMENTO E PREVENÇÃO DE INFECÇÕES POR FUNGOS AQUÁTICOS"

Campo da Invenção

A invenção refere-se a composições de derivados de estilbeno úteis em métodos de tratamento e prevenção de infecções por fungos aquáticos tal como peixes e ovas de peixe.

Antecedente da Invenção

Oomicetos (fungos de água) tal como Saprolegnia, Branchiomyces e Aphanomyces são responsáveis por infecções devastadoras de peixe em aquacultura, tanques e viveiros de peixe de passatempo.

Os membros do gênero Saprolegnia causam saprolegniose, uma doença que é ca- racterizada por branco visível ou emplastros cinzentos de micélio filamentoso no corpo ou barbatanas de peixe de água doce. Se não tratado, infecção com espécies de Saprolegnia (spp.) leva a morte através de haemodiluição. Saprolegnia spp. também infecta ovas de pei- xe por adesão a e penetração da membrana do ovo. Saprolegnia spp. são considerados patógenos oportunísticos que são saprofitos. A infecção freqüentemente ocorre durante o inverno, freqüentemente resultando em grande escala epidemias "matança de inverno". As condições que promovem proliferação de Saprolegnia spp. e seus zoosporos infeccioso in- cluem diminuições abruptas em temperaturas da água e atividades de viveiro de densidade elevada, e também parece fazer peixe vulnerável para infecção devido a tensão fisiológica aumentada e supressão de sistema imune.

Saprolegnia parasitica é um dos patógenos de peixe danificando economicamente, causando perdas de milhões de dólares anualmente por todo mundo, particularmente nos mercados de salmão e truta. Além de ser um patógeno oportunístico, algumas linhagens de S. parasitica são altamente vírulentas e causa infecções primárias.

Branchiomicose é outra infecção ocorrendo em peixe de água doce, principalmente em carpa e enguia. É causado por Branchiomyces sanguinis e B. demigrans, com necrose de guelra de peixe proeminente de mostra de peixe afetado e angústia respiratória. A doen- ça mais comum ocorre em lagos com matéria orgânica abundante, e níveis de amônia ele- vados.

As infecções parasitárias são freqüentemente simultâneas com ou acompanhado por infecções de oomiceto em determinados viveiros comerciais. Tais infecções parasitárias incluem esses causados por Iehthyophthirius multifllis, Triehodina spp. Daetylogyrus Spp. e Gyrodaetylus spp.

Os oomicetos, incluem Saprolegnia spp. e Branehiomyees spp. são microorganis- mos de eucariótico filamentosos que têm muitas características tipo fungos, porém não são fungos verdadeiros. Como os fungos verdadeiros, eles alimentam em matéria deteriorando e crescem como filamentos ramificados com hifa não septado. Entretanto, sua parede celular não é composta de quitina (como nos fungos verdadeiros) porém é composto de uma mistu- ra de compostos de celulósica e outro β-glucans. Além disso, oomicetos têm várias fases desenvolventes claramente definidas que não são encontradas em fungos. Os estudos mo- leculares recentes tem mostrado entretanto, que rigorosamente relacionado a componentes de virulência são compartilhados entre oomicetos e fungos.

Os métodos das técnicas anteriores para tratamento de infecções de oomiceto pa- togênicas, incluindo saprolegniose e branchiomicose sofre várias desvantagens. As subs- tâncias químicas Diquat (um herbicida), cloreto de benzalcônio, sulfato de cobre e perman- ganato de potássio tem sido todas descritas para ser útil para tratamento de branchiomico- se. Nenhum destes entretanto, são aprovados pela U.S. Food e Drug Administration para controle de doença em alimento de peixe.

US 6,160,023 descreve uso de bronopol (2-bromo-nitropropano-1,3-diol) para tra- tamento e profilaxia de infecções de S. parasitica em peixe, e para equipamento desinfetado empregado em aumento de peixe. Este composto é principalmente efetiva contra presente de infecção em ovas de peixe, porém não que ocorrendo em peixe. Além disso, é relativa- mente tóxico a espécies de peixe comercialmente importantes.

Malachite verde (4 - [(4-dimetilaminofenil)-fenil-metil] - Ν,Ν-dimetil-anilina) foi previ- amente amplamente empregado foi para controlar saprolegniose. Ao mesmo tempo em que esta tintura orgânica é muito eficiente em S. parasitica mortal, seu uso foi proibido desde .2002 ao redor do mundo, devido a suas propriedades carcinogênicas, teratogênicas e toxi- cológicas. Isto tem resultado em um aumento dramático de infecções de Saprolegnia em colocações comerciais. Portanto, há uma necessidade urgente por métodos de alternativa modernos de administração de saprolegniose.

Os métodos são também conhecidos para controlar infecções parasitárias em pei- xe. US 5,464,837 e US 5,188,832 descreve uso compostos de dionade triazina; US .5,313,911 descreve uso de peróxido de hidrogênio; US 6,054,454 descreve uso de deriva- dos de oxadiazina; US 6,982,285 descreve uso de derivado de benzoiluréia; US 6,117,457 descreve uso de ácido de peracético; US 5,593,678 descreve uso de sais de ortovanadato; US 5,504,081 descreve uso de derivado de nitrometileno. Nenhum destes métodos são co- nhecidos para ser útil para controle simultâneo de oomiceto e infecções parasitárias.

Derivado de Estilbeno, incluindo derivado de ácidos 4,4'-bis-(1,3,5- triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico, são agentes de clareamento fluorescentes conhe- cidos que liga-se a polissacarídeos tendo ligações de β-glicosídico, incluindo celulose e qui- tina. Tais compostos mostram atividade antifúngica, presumivelmente devido à interação com e interrupção de microfibrilas de quitina que constitui um elemento estrutural principal na parede celular fúngica (Roncero e outros (1985) J. Bacteriol. 163:1180-1185). Os efeitos antifúngicos de clareadores fluorescente têm sido demonstrados em fungos verdadeiros que contêm quitina em suas paredes celular, incluindo fungos patogênicos de planta (Seppanen e outros (2004) Plant Cell. Rep. 22:584-593), fungos patogênicos humano como leveduras (Roncero e outros (1988) J. Bacteriol. 170:1950-54), dermatofitos (lnamori e outros (1985) Chem. Pharm. Buli. (Tóquio) 33:2904-9) e alga vermelha (Belliveau e outros (1990) Stain Technol. 65:303-311), porém não em modos aquáticos que contêm celulose em vez de qui- tina nas suas paredes celular.

US 4,723,034 descreve derivado de estilbeno de 2-vinil útil como fungicidas para proteção de planta e preservação de madeira.

US 5,359,131 e US 5,852,015 descrevem derivados de estilbeno tendo efeitos anti- viróticos.

US 5,879,674 descreve métodos de semeia planta protegeda de ataque de inseto empregando-se derivado de estilbeno para induzir infecções viróticas epizoóticas.

US 6,919,452 e publicação de pedido de patente US No. 2005/0230662 descrevem derivados de ácidos 4,4'-bis(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico e seu uso como agentes de clreamento fluorescentes.

Em parte alguma na técnica anterior é ensinada ou sugerida que derivados de estil- beno podem ser empregados para tratar infecções de modo aquático.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece métodos que são efetivos em prevenção e tratamento de infecções de oomiceto em organismos aquáticos. Vantajosamente, os métodos da inven- ção envolvem uso de composições compreendendo compostos conhecidos que têm efeitos tóxicos desprezíveis e são aceitáveis para uso até mesmo em espécies aquáticas pretendi- do para consumo humano. Em particular, a presente invenção fornece métodos novos em- pregando derivados de estilbeno para tratamento e prevenção de infecções de oomiceto. A invenção é baseada, em parte, na descoberta inesperada que derivados de estilbeno, inclu- indo derivados de ácidos 4,4'-bis-(1,3s5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico, são efeti- vos para prevenção e tratamento de infecções de oomiceto, tal como saprolegniose, que ocorre em organismos aquáticos incluindo peixes e ovas de peixe. O método da invenção é efetivo para aplicação em ambos uma fase inicial de infecção, quando nenhum sinal clínico pode ser evidente, bem como nas fases posteriores de infecção quando infecção é estabe- lecida. Sem desejar ser ligado por qualquer teoria particular ou mecanismo de ação, esta atividade pode ser devido à capacidade de tais compostos para interferir com síntese de parede celular em oomicetos.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método de prevenir ou tratar uma infecção de oomiceto em um organismo aquático, o método compre- endendo a etapa de contactar o organismo aquático com uma quantidade efetiva de pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico da Fór- mula (I):

<formula>formula see original document page 5</formula>

Fórmula (I)

Onde R1 e R2 são os mesmos ou diferentes e são cada independentemente sele- cionado do grupo consistindo em SO3H, SO3Na,SO3K1 SO3NH4 e H; e onde R3 a Ri0 são os mesmos ou diferentes e são selecionados do grupo consistindo em H; C1-C6 alquila linear ou ramificada; C2-C6 alquenila linear ou se ramificada, onde a referida alquila ou alquenila são cada independentemente não substituído ou substituída com um grupo hidroxila, carboxila, ou carboxamida; fenila; e fenila substituída com R1 ou R2 onde R1 e R2 são como definido acima; ou um ou mais de R3 e R4, R5 e R6, R7 e R8 ou Rg e R10, junto com o nitrogênio para o qual eles são ligados, formam um anel heterocíclico que pode também compreende um ou mais heteroátomos adicional selecionado de N, O e S; e sais, hidrato, solvatos e polimorfos destes.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece um método de equipa- mento desinfetado empregado para aumenta para um organismo aquático, onde o equipa- mento é contaminado com um oomiceto, o método compreende a etapa de contata o equi- pamento com uma quantidade efetiva de pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5- triazinilaminojestilbeno-2,2’-dissulfônico da Fórmula (I).

Em particular modalidade dos métodos da invenção, dois ou mais de R3, R4, R7 e R8 são os mesmos e são selecionados do grupo consistindo em CH2CH2OH, CH2CHOHCH3, CH2CH2CONH2, CH3 e H; ou um ou mais de R3 e R4, R7 e R8 junto com o nitrogênio para o qual eles são ligados, forma um anel de morfolinila. Em outras modalidades, dois ou mais de R5, R6, R9 e R10 são os mesmos e são selecionados do grupo consistindo em fenila e fenila substituída com SO3Na. Em outras modalidades, R1 e R2 são os mesmos e são seleciona- dos de SO3H e SO3Na. Ainda em outras modalidades, R1 e R2 são diferentes e são selecio- nados de SO3H, SO3Na, SO3K, SO3NH4 e H.

Em modalidades específicas dos métodos da invenção, o derivado de ácido 4,4'- bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico é selecionado de ácido 4,4'-bis-(6-anilino- .1,4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)estilbeno-2,2'-dissulfônico; .4,4'-bis-(6-anilino-1,4-bis)2-hidroxietil)amino)-1 ^,S-tnazin^-iOaminoJestilbeno^^'- dissulfonato de dissódico;

.4,4'-bis-(6-anilino-4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)esti dissulfonato de sódio de potássio;

ácido 2,2'-estilbenodissulfônico, 4,4,-bis-(4-anilino-6-((2-hidroxietil)metilamino)-s- triazin-2-il)amino)-, sal de dissódico;

dissódico 4,4,-bis[(4-anilino-6-morfolino-1,3,5-triazin-2-il)amino]estilbeno-2,2'- dissulfonato;

tetrasódio 4,4,-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-(4-sulfonatoanilino)-1,3,5-triazin-2- il]amino] estilbeno-2,2'-dissulfonato;

tetrasódio 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxipropil)amino]-6-[(4-sulfonatofenil)amino]-1,3,5- triazm-2-il]amino]-estilbeno-2,2'-dissulfonato;

e ácido 2,2'-estilbenodissulfônico,4,4,-bis-[[4-[(2-carbamoiletil)(2-hidroxiletil)amino]-6- (p-sulfoanilino)-s-triazin-2-il]amino]-,sal de tetrasódio.

Em modalidades específicas dos métodos da invenção, o oomiceto é selecionado de Saprolegnia spp., Aphanomyces spp. e Branchiomyces spp. Em uma modalidade mais específica, o oomiceto é Saprolegnia parasitica.

Em modalidades específicas dos métodos da invenção, o pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico é fornecido como uma solu- ção. Em outras modalidades específicas, o pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5- triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico está presente na solução em uma concentração de cerca de 20 cerca de 200 mg/L. De acordo com as modalidades preferidas, o pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico está presente na solução em uma concentração de cerca de 25 mg/L.

Em modalidades específicas dos métodos da invenção, o organismo aquático é se- lecionado de peixe, ovas de peixe e molusco. Em modalidades específicas, os peixes são selecionados de perca-gigante, baixo, brema, carpa, bagre, chub, enguia, enguia jovem, linguado, dourado, peixe de aquário, linguado gigante, carpa chinesa, labrax, tainha, peixe- espatula, linguado europeu, pompom, peixe vermelho, red-drum, salmão, sola, esturjão, tilá- pia, truta, atum e baleia branca.

Em modalidades específicas dos métodos da invenção, a etapa contatada é duran- te um período de cerca de 2 a cerca de 16 horas. Em modalidades preferidas, o passo con- tatando é durante um período de cerca de 8 horas. Em outras modalidades, a etapa conta- tada é repetida em intervalos de 48 hora.

Em uma modalidade do método de prevenir ou tratar uma infecção de oomiceto em um organismo aquático, a infecção de oomiceto é simultânea com ou acompanhado por uma infecção parasitária. Em outra modalidade, a infecção parasitária é causada por pelo menos um parasita selecionado do grupo consistindo em Amyloodinium spp., Argulus Spp., Ascocotyle Spp., Bothricephalus Spp., Camallanus Spp., Capilaria Spp., Centrocestus Spp., Chilodonella Spp., Coeeidia Spp., Contraeaeeum Spp., Cryptobia Spp., Cryptoearyon Spp., Daetylogyrus Spp., Dermoeystidium Spp., Ergasilus Spp., Euclinostomum Spp., Gyrodaet- ylus Spp., Hexamita Spp., Iehtyobodo Spp., Iehtyophtirius Spp., Lernaea Spp., Metaeerearius Spp., Mierosporidia Spp., Myxosporea Spp., Oodinium Spp., Sanguinieola Spp., Sessiline Spp., Spironucleus Spp., Tetrahymena Spp., Triehodina Spp., Triehodinella Spp. e Tripartiel- Ia spp.

Em uma modalidade do método de equipamento desinfetado empregado para au- mentar um organismo aquático, o equipamento é também contaminado com pelo menos um parasita. Em outra modalidade, o pelo menos um parasita é selecionado do grupo consistin- do em Amyloodinium spp., Argulus Spp., Ascocotyle Spp., Bothricephalus Spp., Camallanus Spp., Capilaria Spp., Centroeestus Spp., Chilodonella Spp., Coeeidia Spp., Contraeaeeum Spp., Cryptobia Spp., Cryptoearyon Spp., Daetylogyrus Spp., Dermoeystidium Spp., Ergasi- lus Spp., Euclinostomum Spp., Gyrodaetylus Spp., Hexamita Spp., Iehtyobodo Spp., Iehtyo- phtirius Spp., Lernaea Spp., Metaeerearius Spp., Mierosporidia Spp., Myxosporea Spp., Oo- dinium Spp., Sanguinieola Spp., Sessiline Spp., Spironucleus Spp., Tetrahymena Spp., Tri- ehodina Spp., Triehodinella Spp. e Tripartiella spp.

Será entendido explicitamente que o escopo da presente invenção abrange varian- tes de derivado de ácidos 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico, tal como sais, hidrato, solvatos e polimorfos destes, como são conhecido na técnica, com a estipula- ção que estes variantes deve preservar a capacidade para prevenir e tratar infecções de oomiceto em organismos aquáticos no contexto da presente invenção.

Outros objetos, características e vantagens da presente invenção desse modo fica- rá claro na descrição seguinte e desenhos. Entretanto, deveria ser entendido que a descri- ção detalhada e exemplos específicos, ao mesmo tempo em que indicando modalidades preferidas da invenção, são determinados por via de ilustração somente, desde então várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção ficará aparente para al- guém versado na técnica desta descrição detalhada.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 ilustra a toxicidade de vários compostos em peixe de tilápia. MG, Malachite Green; AmB, formulações de Amphotericin B; En, enilconazole; Det, detergentes e desinfe- tantes; CS, sulfato de cobre; Py, Pyceze®; FA, formaldeído; SPC, percarbonato de sódio; o HP, peróxido de hidrogênio; BA, Blankophor® BA.

Figura 2 ilustra a eficácia terapêutica de Blankophor® BA (compreendendo sódio de potássio 4,4,-bis-(6-anilino-4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)estilbeno-2,2'- dissulfonato) e Malachite Green (4-[(4-dimetilaminofenil)-fenila-metil]-N,N-dimetil-anilina) em um sistema modelo de infecção inicial tilápia-saprolegniose. Os peixes tilápia foram tratados com Blankophor® BA 100 mg / L (♦) ou 200 mg/L (·), ou com Malachite Green 0,25 mg/ L (A) nos 2°, 4° e 6° dia após exposição para Saprolegnia. Controle, (■).

Figura 3 ilustra a eficácia terapêutica de Blankophor® BA, formaldeído e Malachite Green em um sistema modelo de infecção inicial de tilápia-saprolegniose. Os peixes tilápia foram tratados com Blankophor® BA 25 mg / L (A) ou 50 mg/L (♦), Malachite Green 0,25 mg / L (□) ou formaldeído 50 mg/L (·) nos 2°, 4° e 6° dia após exposição para Saprolegnia. Em experiências adicionais, peixes tilápia foram tratados com Blankophor® BA 50 mg/L nos 2° e 9° dia após exposição (Δ), ou 100 mg/ L nos 2o dia após exposição (0). Controle, (■).

Figura 4 ilustra a eficácia terapêutica de Blankophor® BA, em um sistema modelo estabelecendo tilápia-saprolegniose. Os peixes Tilápia foram tratados com Blankophor® BA 100 mg/ L (Δ), 50 mg/L (o) ou 25 mg/L (A) nos 3° e 8° dia após exposição para Saprolegnia. Controle, (♦).

Figura 5 mostra varredura microscopia de elétron de paredes celular de Saproleg- nia tratados com (painel A) e sem (painel B) Blankophor® BA. Ampliação: 3000x.

Figura 6 ilustra o efeito de exposição a Blankophor® BA (100 mg/L) (□) em atividade de fotosintético em culturas puras de Chlorella (C), Microcystis (M), Peridinium (P) e Melosi- ra (I), e em amostras de Lake Kinneret (LK), como determinado por 14C-captação. Controle, (■).

Descrição Detalhada da Invenção

De acordo com a presente invenção, são fornecidos métodos para prevenção e tra- tamento de infecções de oomiceto que ocorre em organismos aquáticos incluindo peixes e ovas de peixe, e métodos de equipamento desinfetado empregado para aumentar organis- mos aquáticos, onde o equipamento é contaminado com um oomiceto.

Os métodos da invenção compreende uma etapa de contatar ou o organismo aquá- tico, ou o equipamento empregado para aumentar o organismo aquático, com uma quanti- dade efetiva de pelo menos um derivado de estilbeno, particularmente um derivado de ácido 4,4, -bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico da Fórmula (I): <formula>formula see original document page 8</formula> Fórmula (I)

Na Fórmula I, R1 e R2 são os mesmos ou diferentes e são cada independentemente selecionado do grupo consistindo em SO3H, SO3Na1 SO3K1 SO3NH4 e H. Além disso na Fórmula I, R3 a R10 são os mesmos ou diferentes, e R3 a Ri0 são selecionados do grupo consistindo em H; C1-C6 alquila linear ou ramificada; C2-C6 alquenila linear ou se ramificada, onde a referida alquila ou alquenila são cada independentemente não substituída ou substi- tuída com um grupo hidroxila, carboxila, ou carboxamida; fenila; e fenila substituída com R1 ou R2 onde Ri e R2 são como definido acima; ou, um ou mais de R3 e R4, R5 e R6, R7 e R8 ou R9 e R10, junto com o nitrogênio para o qual eles são ligados, formar um anel heterocíclico que pode também compreende um ou mais heteroátomos adicional selecionado Ν, O e S.

Em particular modalidades dos métodos da invenção, dois ou mais de R3, R4, R7 e R8 são os mesmos e são selecionados do grupo consistindo em CH2CH2OH1 CH2CHOHCH3, CH2CH2CONH2, CH3 e H; ou um ou mais de R3 e R4, R7 e R8 junto com o nitrogênio para o qual eles são ligados, forma um anel de morfolinila.

Em outras modalidades, dois ou mais de R5, R6, R9 e R10 são os mesmos e são se- lecionados do grupo consistindo em fenila e fenila substituída com SO3Na. Em outras moda- lidades, R1 e R2 o mesmo e são selecionado de SO3H e SO3Na. Ainda em outras modalida- des, R1 e R2 são diferentes e são selecionados de SO3H, SO3Na, SO3K, SO3NH4 e H.

Exemplos de derivado de ácidos 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'- dissulfônico útil na invenção incluir, porém não são limitados a ácido 4,4'-bis-(6-anilino-1,4- bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)estilbeno-2,2'-dissulfônico; dissódico 4,4'-bis- (6-anilino-1,4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)estilbeno-2,2'-dissulfonato; só- dio de potássio 4,4'-bis-(6-anilino-4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)ammo)estilbeno- .2,2-dissulfonato; ácido 2,2'-estilbenodissulfônico, 4,4'-bis-(4-anilino-6-((2- hidroxietil)metilamino)-s-triazin-2-il)amino) -, sal de dissódico; dissódico 4,4'-bis[(4-anilino-6- morfolino-1,3,5-triazin-2-il)amino]estilbeno-2,2'-dissulfonato; tetrasódio 4,4'-bis[[4-[bis(2- hidroxietil)amino]-6-(4-sulfonatoanilino)-1,3,5-triazin-2-il]amino]estilbeno-2,2'-dissulfonato; tetrasódio 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxipropil)amino]-6-[(4-sulfonatofenil)amino]-1,3,5-triazin-2- il]amino]-estilbeno-2,2'-dissulfonato; e ácido 2,2'-estilbenodissulfônico,4,4'-bis-[[4-[(2- carbamoiletil)(2-hidroxiletil)amino]-6-(p-sulfoanilino)-s-triazin-2-il]amino]-, sal de tetrasódio.

Quando os compostos descritos acima incluem um ou mais centros de quiral, o es- tereoquímico de tais centros de quiral pode ser independentemente na configuração de R ou S, ou uma mistura dos dois. Os centros de quiral podem ser também designados como R ou S ou R1S ou d,D, I1L ou d,1, D,L.

Definições

O termo "C1 a C6 alquila" como empregado aqui refere-se a radicais saturados tal como metil, etil, n-propil, isopropil, n-butil, iso-butil, sec-butil, terc-butil, amil, terc-amil, hexil e outros. Os grupos C1 a C6 alquila preferido são metil, etil e propil. Os grupos C1 a C6 alquila são independentemente opcionalmente substituídos com um grupo hidroxil, carboxila ou carboxamida. Os substituintes preferidos são hidroxila e grupos de carboxamida. Os grupos de C1 a C6 alquil substituído exemplar são hidroxietil, hidroxipropil e etilcarboxamido. Em modalidades específicas do derivado ácidos 4,4,-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'- dissulfônico da invenção, cada um de R5, R6, R7 e R8 são hidroxietil. Em outras modalidades específicas, dois de R5 ou R6, e R7 ou R8 são hidroxietil e dois são o H. Ainda em outras mo- dalidades, cada de R5, R6, R7 e R8 são hidroxipropil. Ainda em outras modalidades, dois de R5 ou R6, e R7 ou R8 são etilcarboxamido e dois são hidroxietil.

O termo "C2 a C6 alquenila" como empregado aqui refere-se a radicais não satura- dos tal como radicais de vinil, alila, 2-butenil, 3-butenil, 2-pentenil, 3-pentenil, 4-pentenil, 2- hexenil, 3-hexenil, 4-hexenil, 5-hexenil ligados em qualquer posição de carbono apropriada e outros, bem como dienos e trienos de cadeia linear ou ramificada. Os grupos C1 a C6 alque- nila são opcionalmente substituídos com grupos de hidroxila, carboxila, ou carboxamida. O derivado de ácidos 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico podem ser opcionalmente substituídos em qualquer um ou mais de R3 a R10 com grupo fenila ou com grupos de fenila substituídos com R1 ou R2, onde R1 e R2 são definidos acima. Em mo- dalidades específicas, dois de R3 ou R4, e R9 ou R10 são fenila e dois são H.

O termo "fenila substituída com R1 ou R2" como empregado aqui se refere a um grupo de fenila substituído com um ou mais porções selecionado do grupo consistindo em SO3H, SO3Na, SO3K, SO3NH4 e H. Em modalidades específicas, dois de R3 ou R4, e R9 ou R10 são fenila substituídas com SO3Na e dois são H.

O termo "anel heterocíclico que pode também compreende um ou mais heteroáto- mos selecionado de Ν, O e S" como empregado aqui se refere à anéis opcionalmente de cinco membros a oito membros substituídos que podem ter 1 a 4 heteroátomos, tal como nitrogênio, enxofre e/ou oxigênio, em particular oxigênio, junto com um átomo de anel de nitrogênio. Estes anéis de cinco membros a oito membros podem ser saturados, completa- mente não saturado, parcialmente não saturado ou aromático, com anéis completamente saturados sendo preferidos. Os anéis heterocíclicos de acordo com a invenção incluir, po- rém não são limitados a, morfolino, piperidinil, piperazinil, imidazolil, 2-amino-imidazoil, pirro- lo, heptilametilenoimino, tiazol, triazol, pirrolidina de tetrazol, pirazol, imidazol, piridina, tio- morfolina, oxazol e pirimidina.

O termo "quantidade efetiva" como empregado aqui se refere a uma quantidade de pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico da invenção que é efetivo a trata, prevenir, proteger, reparar, desintoxicar ou desinfetar um or- ganismo aquático contra uma infecção de oomiceto ou para tratar, prevenir, proteger, repa- rar, desintoxicar ou desinfetar equipamento contra contaminação de oomiceto, em contato com pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'- dissulfônico durante algum período de tempo.

Derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazmilamino)estilbeno dissulfônico-2.2'- dissulfô- nico

Os derivados de ácido util 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico para os métodos da presente invenção incluem agentes de branqueamento conhecidos nos quais foram empregados no têxtil, detergente e indústrias de papel. Tais compostos são geralmente conhecidos como C.l. Clareadores Fluorescente (tendo vários sufixos numéri- cos), e inclui, por exemplo, C.l. Clareador 28 Fluorescente, C.l. Clareador 113 Fluorescente, C.l. Clareador 28/113 Fluorescente, C.l. Clareador 220 Fluorescente, C.l. Clareador 235 Fluorescente, C.l. Clareador 260 Fluorescente e C.l. Clareador 263 Fluorescente. C.l. Cla- readores fluorescente possuem uma estrutura molecular de cadeia principal comum, e difere com respeito aos substituintes ligado a qualquer ou ambos anéis de benzeno e triazina, e com respeito à natureza do derivado de ácido ou sal. Além disso, C.l. Clareadores Fluores- cente são vendidos sob várias marcas comerciais e um composto pode ter vários sinônimos diferentes. Por exemplo, dissódico 4,4'-bis-(6-anilino-1,4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3 5- triazin-2-il)amino)estilbeno-2,2'-dissulfonato é conhecido pelo nome comum C.l. Clareador 28 Fluorescente e foi vendido sob as marcas comérciais Calcofluor® White, Cellufluor® e Phorwite®, entre outros. C.l. Clareadores fluorescente são fornecido como solução aquosa ou formulações de pó. Por exemplo, Blankophore® BA Liquid (Lanxess) é uma solução a- quosa compreendendo a mistura de sal de sódio de potássio 4,4'-bis-(6-anilino-4-bis)2- hidroxietil)amino)-1,3,5-triazin-2-il)amino)estilbeno-2,2'-dissulfonato.

Outros derivados de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico são também pretendido, e pode ser criado alterando-se os substituintes ligados a qualquer ou ambos anéis de benzeno e triazina, e/ou o derivado de sal. Eles podem estar na forma de sais, sais misturados, ácidos livres e misturas destes. Tais derivados podem ser facil- mente designados e sintetizados por aquele versado na técnica.

Os derivados de ácido 4,4,-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico útil para os métodos da presente invenção pode ser fornecida em várias formulações, por e- xemplo, soluções aquosas, ou formulações de pó que são reconstituídas com água. As for- mulações aquosas podem conter agentes que auxilia em solubilidade. As formulações de pó podem conter agentes dispersantes ou agentes de remoção de pó. Tais excipientes devem ser apreciavelmente solúveis em água e não devem ser tóxico a organismos vivos e o ambi- ente.

Os derivados de ácido 4,4,-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico útil para os métodos da presente invenção são apreciavelmente solúvel em água. A solubilidade de água pode em geral, seja aumentado aumentando-se os números de substituintes hidró- filos tal como grupos de sulfonato e hidroxila, como é conhecido por alguém versado na téc- nica.

Os derivados de ácido 4,4,-bis-(1,3,5~triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico útil para os métodos da presente invenção são estáveis a hidrólise, porém pode ser sujeito a fotodegradação na hidroesfera, devido a ter absorção UV máximos entre 340 a 360 nm em água. Eles podem ou não podem ser facilmente biodegradável; no caso posterior, eles são preferivelmente absorvidos sobre barro em sistemas de tratamento de água residual.

Os derivados de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico útil para os métodos da presente invenção tem impacto mínimo em criaturas vivas e no ambien- te. Por exemplo, a segurança relativa global de C.l Clareadores 28 Fluorescente, 220, 235, .260 e 263 foram documentados. Estes compostos são relatados a ter baixa toxicidade a peixe, anelídeos e bactérias e baixa toxicidade moderada a invertebrados aquáticos e algas. Com respeito a mamíferos, eles têm dose aguda baixa ou repetida toxicidade oral, não são mutagênico ou clastogênico, não são toxicantes reprodutivos ou desenvolventes, e não são geralmente irritando ou sensibilizando para pele e olhos (Stilbene Fluorescent Whitening Agents Category, submetida à Agencia de Proteção da do ambiente US pelo Forte tarefa do Agente de Branqueamento Fluorescente ETAD, em 6 de outubro de 2005).

Mecanismo putativo de ação

Sem desejar ser ligado a qualquer teoria particular ou mecanismo de ação, a eficá- cia terapêutica e profiláctica dos derivados de ácidos 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno- .2,2'-dissulfônico da invenção contra oomicetos podem ser atribuídos a capacidade de tais compostos para romper paredes celular de oomiceto.

Vários derivados de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico são conhecidos para ligar a polissacarídeos tendo ligações de β-glicosídico, tal como ocorre em celulose (a β-(1,4) polímero ligado de unidades de D-glicose). As paredes celulares oo- miceto em geral, contem celulose e outros polímeros β-glucan, por exemplo, β-(1,2) ligado e (β-(1,6) polímeros ligado de unidades de D-glicose, como os elementos estruturais princi- pais. Ao mesmo tempo em que as proporções e ligado destes polímeros varias entre gêne- ros de oomiceto diferentes e espécies, estes macromoléculas são os alvos prováveis dos derivados de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico da invenção. A inserção de tais compostos com compromisso de polímero β-glicosídico nascente e/ou for- mado completamente a integridade da parede celular, ultimamente principal a Iise celular.

O mecanismo de ação pode ser similar ou análogo a isso exercido pelos derivados de ácido 4,4'-bis-(1,335-triazinilamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico contra fungos verdadeiros em qual quitina (a β-(1,4) polímero ligado de unidades de N-acetil-D-glicosamina) é o com- ponente estrutural principal de paredes celular.

Patóqenos de Oomiceto e doenças de organismos aquáticos Os métodos da invenção são efetivos contra doença causando oomicetos que ata- cam organismos aquáticos, incluindo peixe e molusco. Os oomicetos incluem, porém não são limitados a Achyla spp., Aphanomyces spp., Branchiomyces spp., Brevilegnia Spp., Dermocystidium Spp., Dictyuehus Spp., Ichthyophonus Spp., Isoaehyla Spp., Leptolegnia Spp., Leptomitus Spp., Protoaehyla Spp., Pythium Spp., Saprolegnia spp., e Thraustotheea spp.

Os organismos do gênero Saprolegnia, e especialmente S. parasitiea, são respon- sável por saprolegniose, uma das infecções de oomiceto mais comuns e significantes que ocorre em peixe. Em comum com todo o oomicetos de saprofílico, Saprolegnia spp. alimen- tos segregando-se a enzimas de degradante sobre a superfície para a qual é ligado, desse modo permitindo absorção de nutrientes tal como proteínas e carboidrato. Saprolegniose freqüentemente ocorre como uma infecção secundária seguinte dano para o integumento de peixe (pele e brânquias) causado por parasitas, vírus, infecções bacterianas e abrasão. Ou- tros fatores predispondo incluem superpopulação, manipulação intensiva e poluição de á- gua. Menos comum, Saprolegnia spp. pode agir como uma infecção patógeno primário de peixe que não tem causado dano de integumento. Tais ataques são dependentes de tempe- ratura, normalmente ocorre em baixas temperaturas, possivelmente como uma conseqüên- cia de uma resposta imune reduzida. Bem como sendo uma ameaça para peixe, Saproleg- nia spp. também infeta ovas de peixe.

Saprolegniose aparece como emplastros cinza/branco na pele ou brânquias que se parece a moita de lã de algodão. Em uma fase posterior eles podem ficar marrons ou verdes como eles capturam sedimento ou algas. Se o peixe é removido da água, o fungo aparece como uma massa de material viscoso. Saprolegnia spp. normalmente estabelece como in- fecções pequenas, focais que então dispersar rapidamente sob o corpo ou brânquias. Como dispersar, tecido saudável é destruído. Freqüentemente inflamação pequena a menos que uma infecção bacteriana fundamental. O exame microscópico mostra amplo, hifae não sep- tado, típico de oomietes.

Aehyla Spp. causa uma doença similar a saprolegniose, e sob condições similar.

Branchiomicose ou "doença parasitária de brânquia" é causada por Branehiomyees sanguinis e B. demigrans. As ambas espécies são encontradas em sofrimento de peixe de tensão ambiental, tal como pH inferior, oxigênio dissolvido inferior, flor de algas elevada ou níveis de amônia elevados. Os peixes afetados se aparecem letárgicos e as brânquias são estriadas ou marmóreas com as áreas pálidas representam tecido infetado e agonizante.

As infecções de oomiceto são transmitidas entre peixe por zoosporos infeccioso que são libertados de tecidos infetados.

Organismos aquáticos

De acordo com a invenção, o método de prevenir ou tratar uma infecção de oomice- to pode ser aplicado a uma variedade ampla de organismos aquáticos que são infetados com ou em risco de infecção através de patógenos de oomiceto. Os organismos aquáticos incluem, porém não são limitados a peixe e ovas. Os peixes incluem peixe economicamente útil elevado em colocações de viveiro de peixe comercial, peixes cultivado, peixes de aquá- rio e peixes decorativos de todas as idades que vivem livre em água doce e água do mar. Os peixes incluem porém não são limitados perca-gigante, baixo, brema, carpa, bagre, chub, enguia, enguia jovem, linguado, dourado, peixe de aquário, linguado gigante, carpa chinesa, labrax, tainha, peixe-espatula, linguado europeu, pompom, peixe vermelho, red- drum, salmão, sola, esturjão, tilápia, truta, atum e baleia branca. Os organismos aquáticos também incluir, porém não são limitados a molusco, moluscos e crustáceos, por exemplo, molusco comestível, mexilhão, caranguejo, geoduck, mexilhão, lagosta, ostra, camarão, ca- marão e ouriço do mar.

Equipamento empregado para elevar organismos aquáticos

De acordo com a invenção, o método de equipamento desinfetado empregado para elevar organismos aquáticos estar voltado a equipamento que é empregado para conter, elevar, manipular e tratar os organismos aquáticos, por exemplo, peixe. A descrição de do- ença de oomiceto nos organismos aquáticos é um indicador suficiente que o equipamento é contaminado, ou por contato direto com os organismos aquáticos infetados abrigando micé- Iio de hifa ou por contato com o zoosporos dispersado. Tal equipamento requer desinfecção, para eliminar a possibilidade de infecção recorrente, por exemplo, em peixe maduro que tem uma doença de oomiceto e foi tratado de acordo com a invenção, ou infecção nova em pei- xes jovens ou ovas introduzidas ou expostas ao equipamento. O equipamento inclui aquá- rios, bacias, banhos, gaiolas, filtros, malhas, redes, lagoas, piscinas, tanques, aparelho de transferência, cubas, termômetros e outros.

Infeccões parasitárias

As infecções parasitárias são freqüentemente simultâneas com ou acompanham in- fecções de oomiceto, por exemplo, em colocações de viveiro comerciais e em aquários de passatempo. Os peixes sujeitaram para tensão e/ou condições ambientais adversas podem ser vulneráveis a tais infecções simultâneas devido a supressão de sistema imune. As infec- ções parasitárias incluem esses causas por Amyloodinium spp., Argulus spp., Ascocotyle spp., Bothricephalus spp., Camallanus spp., Capilaria spp., Centroeestus spp., Chilodonella spp., Coeeidia spp., Contraeaeeum spp., Cryptobia spp., Cryptoearyon spp., Daetylogyrus spp., Dermoeystidium spp., Ergasilus spp., Euclinostomum spp., Gyrodaetylus spp., Hexami- ta spp., Iehtyobodo spp., Iehtyophtirius spp., Lernaea spp., Metaeerearius spp., Mierosporidia spp., Myxosporea spp., Oodinium spp., Sanguinicola spp., Sessiline spp., Spironucleus spp., Tetrahymena spp., Triehodina spp., Triehodinella spp. e Tripartiella spp.

Os inventores da presente invenção tem surpreendentemente encontrado aquele tratamento com pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'- dissulfônico de acordo com a invenção é efetivo para tratar pelo menos uma infecção parasitária que é simultâneo com uma infecção de oomiceto em peixe.

Aplicações da invenção

O método de prevenir ou tratar uma infecção de oomiceto descrito aqui pode ser a- plicado em uma variedade de situações, incluindo: (1) prevenção profiláctica de erupções de doença periódica em colocações de viveiro comercial; (2) intervenção e tratamento terapêu- tico de peixe infetado; (3) tratamento após condições de tensão antecipadas, por exemplo alterações em qualidade de água incluindo diminuição de temperatura; (4) pré-tratamento e tratamento após transferir e/ou transporta peixe; (5) tratamento de peixe "doente" para pas- satempo de casa; e (6) manutenção de saúde em peixe para escala pequena e grande, crescimento doméstico e comercial e para experiências científicas. O método da invenção é efetivo para aplicação em ambos uma fase inicial de infecção, quando nenhum sinal clínico pode ser aparente, bem como em fases posteriores de infecção quando a infecção de oomi- ceto é estabelecida e causas uma taxa elevada de mortalidade.

Por prevenir ou tratar uma infecção de oomiceto, organismos aquáticos são conta- tados com uma quantidade efetiva de pelo menos um derivado ácido 4,4'-bis-(1,3,5- triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico. A etapa contatando pode ser realizada transferin- do-se organismos aquáticos, por exemplo, peixe ou molusco em uma colocação comercial, da sua facilidade de retenção original, por exemplo, uma lagoa ou tanque, para uma facili- dade de retenção fresca contendo uma quantidade efetiva de pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico. Este método é preferível quan- do infecção de oomiceto foi descrita, por exemplo, nos corpos de peixe, requerendo inter- venção apropriada e tratamento terapêutico. Para tal tratamento terapêutico, a densidade de peixe na facilidade de retenção fresca pode ser mantida à mesma relação como na facilida- de de retenção original, ou pode ser preferivelmente diminuído para aliviar condições de tensão.

Alternadamente, os organismos podem ser mantidos na facilidade de retenção ori- ginal, para qual é adicionado uma quantidade efetiva de pelo menos um derivado de ácido 4,4' -bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico. Este método pode ser preferido por razões econômicas quando o método da invenção é aplicado para prevenção de infecção de oomiceto, ou como um procedimento de rotina ou em antecipação de condições de tensão esperadas.

Nos métodos descritos aqui para prevenir ou tratar uma infecção de oomiceto e pa- ra equipamento desinfetado, a etapa contatada é realizada com pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico que pode ser fornecido em uma variedade de formas. Uma solução é geralmente preferida, porém outras formas são tam- bém pretendidas, por exemplo, comprimidos dissolvidos, géis, e materiais impregnados que libertam o material ativo em exposição a água, ou que são adequados para aplicação direta para equipamento contaminado.

Quando uma solução é empregada, uma concentração na faixa de cerca de 20 a cerca de 200 mg/litro de água podem ser adequadas para a maioria das aplicações. A con- centração mais baixa que obtém eficácia de prevenção, terapêutica, ou desinfetada contra infecção de oomiceto ou contaminação é preferível, para minimizar custos e a quantidade de compostos libertados em sistemas de água residual. A concentração preferida pode também depender da duração do tratamento e na idade e condição dos organismos aquáticos trata- dos. Por exemplo, contatando peixe de tilápia com 25 mg/litro de Blankophor® BA durante 8 horas foi encontrado para ser efetivo para prevenir e tratar saprolegniose em peixe de tilá- pia.

Uma quantidade efetiva do pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5- triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico é que obtém eficácia de prevenção (profiláctico), terapêutica, ou desinfetada, como apropriado. A quantidade efetiva pode ser determinada em experiências de piloto. Uma quantidade efetiva para prevenir infecção de oomiceto se refere à quantidade ou concentração induzida em contato com um organismo aquático tal que o organismo aquático é prevenido de ficar infetado na presença de um patógeno de oomiceto para qual o organismo aquático é suscetível. Por exemplo, um tratamento profilác- tico é julgado a ser efetivo em uma situação onde a taxa de mortalidade devido ao desafio de patógeno de oomiceto em pré-tratamento de peixe com um derivado de ácido 4,4-bis- (1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico após o desafio está reduzido por uma porcen- tagem significante, por exemplo, 25 a 100%, da taxa observada em peixe não pré- tratamento. Uma quantidade efetiva para tratar uma infecção de oomiceto se refere à quan- tidade ou concentração induzida em contato com um organismo aquático infetado com um patógeno de oomiceto tal que o organismo aquático é protegido contra o desenvolvimento ou progressão de uma infecção, doença, ou mortalidade associado com o patógeno de oo- miceto. Por exemplo, um tratamento terapêutico é julgado para ser efetivo em uma situação onde a taxa de mortalidade em peixe desafio primeiro com um patógeno de oomiceto e tra- tado subseqüentemente com um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno- .2,2'-dissulfônico é reduzido por uma porcentagem significante, por exemplo, 25 a 100%, da taxa observada em peixe infetado, não tratado. Uma quantidade efetiva para equipamento desinfetado contaminado com um oomiceto se refere à quantidade ou concentração induzi- da em contato com o equipamento tal que o equipamento nenhum abrigo por mais tempo de micélio de oomiceto ou zoosporos. Por exemplo, um tratamento desinfetando é julgado a ser efetivo em uma situação onde o equipamento desinfetado é monitorado para a presença de micélio e/ou zoosporos de oomiceto após o tratamento desinfetado e encontrado para ser reduzido por uma porcentagem significante, por exemplo, 25 a 100%, observado antes do tratamento desinfetado.

Contatado de organismos aquático e/ou equipamento contaminado com pelo me- nos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico pode ser realizado durante um período de tempo de cerca de 2 horas a cerca de 16 horas. Por exem- plo, um período de cerca de oito horas foi achado para ser encontrado para ser efetivo em peixe infetado. Se tempo é uma limitação, períodos relativamente mais curtos podem ser empregados, opcionalmente com concentrações mais elevadas de pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazmilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico. O tempo não é um fator limitando, períodos mais longos podem ser empregados e podem ser preferível para equi- pamento desinfetado. Além disso, os períodos de contato podem ser repetidos em intervalos regulares, por exemplo, 48 horas após conclusão do primeiro período de contato, assegurar erradicação completa da infecção de oomiceto ou contaminação.

A descrição precedente das modalidades específicas revelará completamente a na- tureza geral da invenção que outros podem, aplicando-se conhecimento atual, facilmente modificado e/ou adaptada para várias aplicações tais modalidades específicas sem experi- mentação imprópria e sem partir do conceito de marca, e, portanto, tais adaptações e modi- ficações devem e são pretendidos a ser compreendido dentro do significado e faixa de equi- valentes das modalidades descritas. Será entendido que a fraseologia ou terminologia em- pregada aqui para o propósito de descrição e não de limitação. Os meios, materiais, e eta- pas para realizar várias funções descritas podem levar uma variedade de formas alternati- vas sem partir da invenção.

Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar completamente certas mo- dalidades da invenção. Eles devem de nenhuma maneira, entretanto, ser interpretado como limitando o escopo amplo da invenção. Alguém versado na técnica pode facilmente planeja muitas variações e modificação das descrições principal aqui sem partir do escopo da in- venção.

Exemplos

Exemplo 1

A suscetibilidade in vitro de Saprolegnia parasitica T-I e S. parasitica CBS 540,67 para vários compostos foi determinado pela diluição de ágar e ambos métodos de macrodi- lução.

Material e Métodos

Saprolegnia parasitica isolados

Saprolegnia parasitica T-I isolados foram obtidos de lesões de pele em tilápia mori- bundo exibindo sinais de saprolegniose. Para o propósito de isolamento, uma parte pequena da pele e escalas revestida com hifaefoi secada, e corte com uma lâmina de escalpelo esté- ril, então colocada sobre placas de Glicose-Peptona- Penicilina-Estreptomicina (GP-PS) contendo 3 g/l glicose, 1 g/l peptona, micronutrientes de traço e 250 mg/l cada Penicilina-G e Sulfato de Estreptomicina, e incubado às 18°C.

Após a incubação durante 3-4 dias, um bloco de ágar da borda da colônia de fungo foi cortado e colocado em placa de Petri estéreis, contendo água destilada dupla e semente de Trevo estéril, para obter novas colônias de bactéria livre. A identificação molecular foi feita pelo Dr. Alexandra Riethmueller (University of Kassel, Alemanha) através de seqüenci- amento das regiões ITS do 18S rDNA.

Os isolantes foram mantidos em 18°C em placas de GP-PS, e foram transferidos todos os meses.

S. parasitica CBS 540,67 é uma tensão disponível publicamente.

Reaqentes

Os compostos testados para atividade contra S. parasitica são resumidos na Tabela 1.

Teste de suscetibilidade

Dois métodos foram empregados, cada adequado para uma fase diferente do ciclo de vida assexual de Saprolegnia spp.: i) os ambos método de macrodiluição, para determi- nação de suscetibilidade de zoosporos e cistos; e ii) o método de diluição de ágar para de- terminação de suscetibilidade de hifae filamentoso. Cada composto foi testado três vezes em cada método. Malachite Green foi empregado como controle positivo.

Ambos método de macrodiluição

Este método é uma modificação do método empregado para modos de acordo com EUCAST 7,1 (European Committee on antibiotic Susceptibility Testing) e CLSI/NCCLS M27- A2 (Clinicai Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinicai Laboratory Stan- dards). Para preparação de inóculo, S. parasitica isolado foram cultivados em GP-PS duran- te 7 dias com sementes de trevo estéreis às 18°C. As sementes de trevo (~20) revestido com micélio foram removidos e adicionados a 40 ml de RPMI-1640 ambos médio (Sigma; preparado de acordo com instruções de NCCLS) e incuado às 18°C durante 4-7 dias. Cistos e zoosporos livres de hifae foram coletados, e um inóculo de ~103 CFU/ml como medido por contagem de hemocitômetro, foi preparado em RPMI. Soluções de matéria prima dos com- postos testados foram preparados em água ou em DMSO, como indicado na Tabela 2. A solução de matéria prima do clareador 28 fluorescente foi preparado adicionando-se 40% KOH gradualmente a uma solução de 10 mg/ml em água, até for claro, então foi filtrado du- as vezes através de um filtro estéril não pirogênico de 0,2 μηη (Schleicher & Schuell, Dassel, a Alemanha).

As diluições em série de duas vezes das soluções de matéria prima resultantes fo- ram fixas em RPMI-1640 médio em um volume de 0,1 ml. As concentrações de droga final nos tubos de teste variados 1x104 a 0,01 mg/L. O inóculo de 0,9 ml foi adicionado a cada de um tubo estéril contendo 0,1 ml da droga diluída consecutivamente. Dois tubos contendo droga livre médio e dois tubos contendo inóculo de droga livre foram empregados como con- troles. Os tubos inoculados foram incubados em temperatura ambientes (15-20°C) durante 24 h. O crescimento em cada tubo foi então avaliado visualmente. O MIC-O foi definido como a concentração mais baixa de droga que resulta em inibição completa de crescimento visí- vel.

Método de diluição agar

Este método é uma modificação do método apresentada por Bailey (Bailey, T.A. (1983) Prog. Fish Cult. 45:24-27), e foi empregado para o teste de suscetibilidade de hifae de Saprolegnia. As diluições de de série de duas vezes foram preparadas em água estéril destilada dupla com concentrações de droga final variando de 10,000 a 0,01 mg/L em um volume final de 1,0 ml. Dissolvido (56°C) RPMI-1640 médio de ágar (Sigma) foi preparado de acordo com instruções de NCCLS, e então adicionado a cada tubo contendo droga ou controle de água. A mistura foi vortexado e despejado em placas pequenas. Após de solidi- ficação de ágar um pedaço medido pequeno, levado de uma cultura 7-10 dia velha de S. parasitica T-I em médio de GP-PS foi colocado na parte superior em cada prato. As placas foram incubadas em temperatura ambiente (15-20°C) durante 24 h. O crescimento em cada placa foi então estimada visualmente, e os valores de MIC foram definidos como a concen- tração mínima que resulta em inibição completa de crescimento visível comparada a um controle de droga necessitada.

Tabela 1. Compostos de teste contra S. parasitica

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Resultados

Os dois métodos para determinar em suscetibilidade in vitro de S. parasitica foram altamente reproduzíveis (98 e 95% respectivamente). Os valores de MIC obtidos empregan- do os dois S. parasitica isolados foram similares para cada compostos testados, e a diferen- ça entre então foi estatisticamente insignificante. Os valores de MIC dos compostos testados são apresentados na Tabela 2, com cada resultado representa a média geométrica de três testes independentes. Os valores de MIC mais baixos foram constantemente obtidos com Malachite Green (0,06 mg/L). Outros compostos que exibindo elevada atividade in vitro (MIC ≤10 mg/L) contra S. parasitica foram como segue: Clareador 28 Fluorescente, todos os de- tergentes catiônicos testados, Digitonin (um detergente não iônico), percarbonato de sódio e peróxido de hidrogênio. A atividade mais baixa foi descrito com óleos naturais, Tween-20 e cloreto de sódio (MIC >200 mg/L). A despeito da atividade in vitro elevada observada com Clareador 28 Fluorescente (valores de MIC de 1 e 5 mg/L em ambos métodos), foi eliminado de estudos subseqüentes em atividade in vivo, toxicidade e eficácia terapêutica, devido a seu custo extremamente elevado.

Tabela 2. Valores de MIC (mg/L) de vário compostos

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Exemplo 2

Teste de toxicidade em Tilápia

Os compostos avaliados no Exemplo 1 foram também avaliados para seus efeitos tóxicos em peixe de tilápia.

Material e Métodos

Os valores de LC50 foram determinados através de testes de curto prazo estáticos como uma medida da toxicidade letal aguda relativo para tilápia (Standard methods for the evaluation of water and wastewater (1985) 16° ed. American Public Health Association, Wa- shington, D. C. pág. 689-819).

Tilápia híbrido (Oreochromis niloticus X Oreochromis aureus) tendo um peso co- mum de 20 g, foi mantido em tanque de 100 litro de polietileno em uma densidade de 1 pei- xe por 10 litros, em uma temperatura constante de 210C durante três semanas antes da ini- ciação da experiência por adição de um composto teste para cada tanque. As toxicidades de peróxido de hidrogênio, percabonate de sódio e Blankophore® BA foram também avaliados em temperaturas de 18°C e 15°C. Para experiências posteriores, peixes foram aclimatado à temperatura requerida durante três semanas antes da adição do composto teste para o tan- que. Os peixes foram tratados com 5 diferentes concentrações de cada composto teste, determinado de acordo com os valores de MIC de cada composto.

A mortalidade de peixe foi registrada até 96 h. A água parâmetro (O2, NH4+, NO2", pH e Cl") foi monitorado ao longo da experiência e foram mantidos dentro dos limites aceitá- veis. Os resultados apresentados são a média de duas experiências separadas.

Todos os procedimentos para cuidado e tratamento de peixe foram de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animais (Hebrew University of Jerusalém, Israel) e foram aprovados pelo Committe for Ethical Conduct in the Care and Use of Laboratory Animais.

Resultados

Os valores de LC50 determinados para várias compostos são apresentados na Figu- ra 1. Os compostos tendo um valor de LC50 de 5 a 10 vezes elevado mais do que seu res- pectivo MIC foram selecionado para estudo adicional para eficácia terapêutica no modelo de tilápia-saprolegniose.

Os valores de LC50 de sulfato de cobre, Pyceze®, e todos os desinfetantes testados, detergentes e agentes antifungos foram inferiores, similares ou insignificantemente diferen- tes dos valores de MIC respectivos e foram excluídos adequadamente do estudo de eficácia terapêutico. As diferenças elevadas significativamente foram demonstradas para Malachite Green, formaldeído, peróxido de hidrogênio, percarbonato de sódio, e Blankophore® BA isto é a relação entre o valor de LC50 e o valor de MIC foi >20. Alguns dos compostos com baixa toxicidade às 18°C foram também testados a uma mais baixa temperatura (15°C). Os resul- tados são apresentados na Tabela 3 e claramente indicados que a toxicidade de peróxido de hidrogênio, e para uma maior extensão, percarbonato de sódio, aumentando significati- vamente às 15°C. Em contraste, o valor de LC50 de Blankophor® BA permanece elevado, até mesmo à mais baixa temperatura, indicando sua falta relativa de toxicidade pelo peixe.

Tabela 3. Toxicidade de compostos (LC50) em tilápia em várias temperaturas

<table>table see original document page 23</column></row><table> Exemplo 3

Teste de Toxicidade de Blankophor® BA Em Várias Espécies de Peixe Materiais e Métodos

Os valores de LC50 para Blankophor® BA em várias espécies de peixes foram de- terminados como no Exemplo 2, exceto que peixes foram aclimatados a 210C durante três semanas, e então para 15°C durante outras duas semanas antes da iniciação da experiên- cia. A aclimação seguinte a 15°C, Blankophor® BA (100, 200, 500, 1,000 ou 2,000 mg/L) foi adicionado aos tanques, e mortalidade de peixe foi registrada até 96 h. A água parâmetros (O2, NH4+, NO2", pH e Cl") foram monitorados ao longo da experiência e foram mantidos den- tro dos limites aceitáveis. Os resultados apresentados são a média de duas experiências separadas. Os peixes empregados foram: tilápia híbrido (Oreochromis niloticus X O. au- reus), peso comum 20 g; tainha cinzenta (Mugil cephalus), peso comum 70 g; carpa comum (Cyprinuscarpio), peso comum 25 g; robalo listrado híbrido (Morone saxatilis X M. chrysops), peso comum 25 g, e carpa de grama (Ctenopharyngodon idella), peso comum 25 g.

Resultados Os valores de LC50 observados para as espécies de peixes testados foram todos maiores do que 2000 mg/L. Estes resultados são consistentes com os resultados apresen- tados no Exemplo 2 e apóio a conclusão dos compostos da invenção, tal como Blankophor® BA, não são substancialmente tóxico a uma variedade de espécies de peixe, incluindo esses de importância comercial.

Exemplo 4

Eficácia terapêutica de Blankophor® BA em um modo de infeccão facilmente de Ma- terial e Métodos de saproleqniose

A tilápia híbrido (Oreochromis niloticus X Oreochromis aureus), com um peso co- mum de 20 g foram tratados contra ectoparasitos empregando 25 μg/ml de formaldeído (37% v/v) duas semanas antes da experiência, e foram mantidos em uma temperatura cons- tante de 210C em um tanque de 100 litro de polietileno. O tanque de água foi resfriado em uma temperatura inicial de 210C a 14°C durante um período de 10 dias. A água foi mantida em uma temperatura constante de 14°C e os peixes foram aclimados durante 4 dias. A ten- são física de abrasão foi então aplicada agitando-se 40 peixes durante 10 segundos dentro de uma rede de plástico (30 χ 20 cm). Seguindo isto, uma infusão de chá de aço imaculado estéril contendo 60 semente de trevo revestido com hifae de Saprolegnia parasitica T-1 (7 dia de cultura velha em médio de GP-PS às 18°C) foi adicionado a cada tanque, no qual a densidade de peixe foi 20 peixes por 100 litros. Este tratamento permanece 48 h e permitir a dispersão de zoosporos que foram produzidos. A densidade do zoosporos na água foi de- terminada de acordo com o método descrito abaixo, e foi estimado como 5xI02-2xI03 zoospo- ros por litro. Os peixes foram então transferidos a tanques diferentes, e tratado com Blanko- phor® BA (200, 100, 50 ou 25 mg/L) ou Malachite Green (0,25 mg/L) durante 8 h às 13-14°C, com 10 peixes por 100 L de água. Os tratamentos foram aplicados em 2o, 4o e 6o dia seguin- te iniciação da experiência. Os peixes foram monitorados durante 14 dias para a presença de qualquer lesão revestida com hifae, indicativo de infecção de Saprolegnia. A biópsias de pele de peixe doente e moribundo foi conferida microscopicamente (10x e 40x ampliação). A Morbidez e mortalidade foi monitoradas diariamente. Os peixes moribundos e ou mortos foram removidos de todos os tanques durante o período experimental.

A determinação de densidade de zoospore na água foi realizada de acordo com Willoughby, L.G. (1994) Fungi and fish diseases, Pisces Press, Stirling, Scotland pág. 57.

Em resumo, uma amostra de 1 litro de água do tanque de 100 litro foi dividida em 1 e 10 ml alíquotas em discos de Petri estéreis. Cada amostra foi diluída com água para dar um volume final de 20 ml e então uma semente de trevo estéril foi adicionada para atrair e manter o zoosporos. Todas as amostras de água foram incubadas em temperatura ambiente durante 72 h permitindo germinação de esporo. A densidade do zoosporos foi determinada de acordo com o número de sementes revestida com micélio visível.

Resultados

Os peixes infectados de Saprolegnia foram tratados com Blankophor® BA a concen- trações diferentes (100 e 200 mg/L), de acordo com os valores de MIC determinados. Os tratamentos foram realizados nos 2o, 4o e 6o dias após da iniciação da infecção, e cada tra- tamento foi durante um período de 8 h. As peixes tratados com 0.25 mg/L Malachite Green serviu como um controle de tratamento positivo. Os peixes foram monitorados durante 14 dias. Todos os peixes mortos foram avaliados clinicamente, e exibem lesões de Saprolegnia significantes, como determinado microscopicamente e confirmado por cultura positiva de Saprolegnia. Os resultados do tratamento com Blankophor® BA são resumidos na Figura 2, e mostra que Blankophor® BA é tão efetivo quanto Malachite Green em permitir sobrevivên- cia de Saprolegnia seguinte. Todos os peixes tratados com Blankophor BA sobrevivem pelo menos 10 dias de iniciação seguinte da infecção, em contraste com peixe não tratado que progressivamente morrem no 3o dia.

Devido à eficácia elevada do tratamento com 100 mg/L Blankophor® BA, experiên- cias adicionais foram realizadas empregando baixas concentrações de Blankophor® BA (50 e 25 mg/L). Como nas experiências prévias, os peixes infetados foram tratados em tanques contendo concentrações diferentes do composto no 2o, 4o e 6o dias após a iniciação da in- fecção. Além disso, dois regimes de tratamentos adicionais foram adicionados isto é 50 mg/L (administrado nos 2° e 9o dias após iniciação da infecção) e 100 mg/L (administrado nos 2o dia após iniciação da infecção). Os resultados são resumidos na Figura 3 e indicam que Blankophor® BA foi altamente efetivo prevenindo e tratando infecção de saprolegniose de fase inicial em tilápia, até mesmo a uma concentração tão baixo quanto 25 mg/L.

A observação clínica de peixe tratado com dosagens elevadas (50 e 100 mg/L) de Blankophor® BA indicado que os espécimes estavam livre de lesões (um sinal clínico típico) e além disso, foram negativos em cultura para Saprolegnia. Além disso, biópsias de escala e material de barbatana indicar diferenças significantes no hyphae Saprolegnia removido de peixe tratado com Blankophor® BA 25 (mg/L) contra isso removido de peixe não tratado. Especificamente, a forma exibida "normal" estrutura de hifal Saprolegnia, ao mesmo tempo em que o hifae exibido posterior que foram severamente damificado, e consideravelmente magro.

Formalina (37% de formaldeído v/v) foi também testado no modelo de tilápia- saprolegniose. Em uma concentração de 100 mg/L (administrado nos 2o, 4o e 6o dias após a iniciação da infecção) 70% do peixe morreram dentro de 14 dias (dados não mostrados). Em uma concentração de 50 mg/L, a eficácia terapêutica foi observada para ser similar a este Blankophor® BA (Figura 3). Formalina não é um tratamento possível para saprolegniose, entretanto, que formaldeído tem vários efeitos danosos sérios em animais e o ambiente. Por exemplo, é uma neurotoxina e carcinógeno provável para humanos; diminuindo a concen- tração de oxigênio solúvel em água, e é um algaecide. Exemplo 5

Eficácia Terapêutica de Blankophor® BA em um modo de infecção estabelecida de Materiais e métodos de saprolegniose

Tilápia foram expostos a S. parasitica e tratado com Blankophor® BA (100, 50 e 25 mg/L), como descrito no Exemplo 4, com a exceção que Blankophor® BA tratamento foi ini- ciado no 3o dia após iniciação da infecção, e repetido no 8o dia. Pelo ponto de partida do Blankophor® BA tratamento, aproximadamente 50% do peixe tendo estabelecido infecção, como indicado pela presença de lesões de pele brancas e uma taxa de mortalidade de a- proximadamente 30%. Resultados

Figura 4 mostra que neste modelo de saprolegniose estabelecido, tratamento com

Blankophor® BA (50 e 100 mg/L) foi altamente efetivo em promotores de sobrevivência de peixe infetado. A diferença entre o controle não tratado e peixe tratado de Blankophor® foi altamente significante (ρ < 0,01).

Exemplo 6

Campo de tentativa não randomizado de Blankophor® BA tratamento para oomiceto simultâneo e doenças parasitárias

A transferência seguinte de 2000 peixe tilápia híbrido (20-30 g) para uma lagoa de cimento (1x105 L, 21 a 25°C), emplastros brancos de micélio filamentoso foram observados no corpo e barbatanas de peixe, revestimento na maioria dos casos de cerca de 80% da superfície de corpo. O micélio aparece cerca de quatro dias após da transferência, presumi- velmente devido a infecção oportunística através de Saprolegnia sp. tensão de manipulação seguinte. Morte de 20 a 30 peixes por dia foi registrada. Todos os peixes mortos foram re- vestidos com micélio, característica de Saprolegnia sp., e foram também encontrado para ser infetado com os parasitas Gyrodactilus sp. e Trichodina sp.

A capacidade de água na lagoa foi diminuída a 3x104 L, e tratamento com Blanko- phor® BA (50 mg/L) foi iniciado. Um regime de 3 tratamentos (8 h cada) com 48 hora de in- tervalos entre eles foi empregado.

A redução significante na prevalência e intensidade de saprolegniose foi observada após o primeiro tratamento; nenhuma morte adicional foi registrada e os peixes voltaram ao comportamento normal. Os peixes foram visualmente e microscopicamente examinado 2 dias após do fim dos tratamentos, e foram encontrados para ser livre de ambos Saprolegnia sp. e os parasitas Gyrodactilus sp. e Trichodina sp.

Exemplo 7

Análise de microscopia de elétron de levedura do efeito de Blankophor® BA em Ma- teriais e Métodos de S. parasitica

S. parasitica T-1 hifae e cistos de um 5 dia RPMI-1640 cultura de caldo, foram ex- posto a concentrações diferentes de Blankophor® BA (10, 25, 100 ou 1,000 mg/L) durante períodos diferentes de tempo. Os espécimes foram fixados durante a noite em 2% glutaral- deído, então com 1% OsO4 durante 2 h em temperatura ambiente, e desidratado em con- centrações ascendendo de álcool (25-100%) e seco. As amostras foram vistas com um mi- croscópio de elétron de levedura óptica Leo 982 em uma aceleração de 6 kV.

Resultados

Microscópio de elétron de levedura (SEM) de hifae de S. parasitica e cistos mos- tram tratamento com Blankophor® BA (1,000 mg/L) resultado altamente deformado, enruga- do, e paredes celular desfalecida (Figura 5A), considerando o controle sem tratar exibe pa- redes celulares não danificadas (Figura 5B). Estes resultados fortemente apoiam a conclu- são que Blankophor® BA rompe a integridade da parede celular em Saprolegnia. Adequa- damente, o mecanismo de ação de Blankophor® BA pode envolver um ou mais alvos especí- ficos na parede celular de oomiceto. Exemplos 8-10 descrevem uma bateria de toxicidade biológica estuda, realizada para verificar que compostos da invenção são organismos não tóxicos a não alvo.

Exemplo 8

Toxicidade de Blankophor® BA para métodos e Materiais de ratos

Blankophor® BA foi preparado em várias concentrações em 5% dextrose e filtro es- terilizados passando-se por um estéril de 0,2 μίτι do filtro de acetato celuloso (Schleicher & Schuell, Dassel, a Alemanha). Ratos de ICR albinos masculinos (peso -30 g) foram injeta- dos através da veia de rabo com várias doses de Blankophor® BA. Cada forma de dosagem foi administrada intravenosamente como única injeção de bolo de 0,1 ml da mesma dose durante 10 min para um grupo de 10 ratos até a morte foi observada. A sobrevivência de ratos que receberam a dose máxima tolerada (MTD) foi monitorado durante 8 dias.

Resultados

A dose máxima tolerada (MTD) de Blankophor® em ratos de ICR foi encontrada a ser > 1 g/kg, confirmando que é um composto seguro, como previamente determinado (Sf//- bene Fluorescent Whitening Agents Category, submetida à US Environmental Protection Agency by the ETAD Fluorescent Whitening Agent Task Force, em 6 de outubro de 2005).

Exemplo 9

Toxicidade de Blankophor® BA para zooplankton

Daphnia sp. é um crustáceo plâncton pequeno (0,2 a 5 mm em comprimento), ge- ralmente empregado como um modelo para toxicidade aquática.

Materiais e Métodos

Daphnia (~ 1,000 células/L água) foi exposto a Blankophor® BA 100 e 1,000 mg/L). A experiência foi realizada em frascos revestidos (100 frasco de ml/per), equipado com for- mecimento de ar. Os frascos foram incubados em temperatura ambiente durante 48 h, e a motilidade de Daphnia foi registrada.

Resultados

Após 48 h de incubação, nenhuma diferença foi notada entre Daphnia que foi ex- posta a Blankophor® BA, e o grupo de controle não exposto, indicando Blankophor® BA não é tóxico a este organismo.

Exemplo 10

Toxicidade de Blankophor® BA para fitoplancto

O método de Espectroscopia de Excitação Fluorescente prolongada (DFES) foi empregado para avaliação qualitativa e quantitativa da influência de Blankophor® BA na po- pulação natural de fitoplancto, e em tensões de algas específicas. A fluorescência prolonga- da é uma característica única de células ativas de fotosinteticamente, como é um resultado de recombinação que acontece no thylakoids na escuridão (Yacobi Υ. Z., V. Gerhardt, Y., Gonen-Zurgil, e A. Sukenik. 1998. Espectroscopia de excitação de fluorescência prolongada: um método rápido para a avaliação qualitativa e quantitativa de população natural de fito- plancto. Wat. Res. 00:1-6).

Materiais e Métodos:

Amostras de Lago Kinneret e culturas puras de Peridinium sp. e Microcystis sp. foi exposto a Blankophor® BA (100 mg/L), para alguns minutos e a concentração de clorofila-a foi determinado (em duplicata) de acordo com o espectro de excitação examinado (faixa de400 a 730 nm). Além disso, a amostra exposta e não exposta foram avaliadas para captação de carbono com uma técnica 14C.

Resultados

A atividade de Fotosintético em amostra de água do mar da Galiléia não foi afetado

danosamente seguinte exposição a Blankophor® BA (100 mg/L), desde que a concentração de clorofila total foi 9,2 μg/L (média), como comparado a 4,6 μ g/L (média) após a exposição. Similarmente, quando uma cultura pura de Microcystis foi exposta a Blankophor® BA (100 mg/L), nenhuma diferença em atividade de fotosintético foi notada como comparado a amos- tra não tratada.

Os resultados do estudo de captação de 14C-carbono, mostrado na Figura 6, são consistentes com as experiências de DFES, e indica aquela exposição a Blankophor® BA não diminuí a atividade de fotosintético em culturas puras de várias espécie de algas (Chio- reila, Microcystis, Peridinium e Meiosira), nem na população de algas total em no mar da Galiléia. Levado junto, estes resultados preliminares apoiam a conclusão que Blankophor® BA não é tóxico a fitoplancto.

As conclusões para identificar um tratamento efetivo para saprolegniose para subs- tituição perigosa após técnicas de tratamentos, tal como Malachite Green, foram avaliados vários antimicrobial e agentes antifungos, detergentes e desinfetantes (Tabela 4). Com base na combinação de resultados obtidos nos vários sistemas de ensaio, e parâmetros de segu- rança animal, impacto ambiental e custo, cada um dos compostos foi nomeado um índice de utilidade (Ul). Dos compostos completamente avaliados, Blankophor® BA tem o Ul mais ele- vado. Isto sugere fortemente que derivados de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinilamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico, como fornecido por Blankophor® BA, pode servir como alternativas efetivas terapeuticamente, seguras e econômicas para Malachite Green.

Tabela 4. Utilidade de vários compostos contra Saproiegnia

<table>table see original document page 28</column></row><table> <table>table see original document page 29</column></row><table>

1Toxicidade foi definida como: elevado=50ppm; moderado=ppm50-200; e baixo = >1000 ppm.

2Indice de utilidade (Ul): índice de medição a utilidade do composto considerando- se os parâmetros de toxicidade, eficácia terapêutica e custo.

Ao mesmo tempo em que certas modalidades da invenção têm sido ilustradas e descritas, estará claro que a invenção não é limitada às modalidades descritas aqui. Nume- rosas modificações, alterações, variações, substituições e equivalentes serão aparentes por alguém versado na técnica sem partir do espírito e escopo da presente invenção como des- crito pelas reivindicações anexadas.

Claims (36)

1. Método para prevenir ou tratar uma infecção de oomiceto em um organismo a- quático, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de contatar o organismo aquático com uma quantidade efetiva de pelo menos um ácido 4,4'-bis-(1,3,5- triazinailamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico derivado da Fórmula (I): R4 Fórmula (I) onde R1 e R2 são os mesmos ou diferentes e são cada independentemente sele- cionados do grupo consistindo em SO3H1 SO3Na1 SO3K1 SO3NH4 e H; R3 a R-I0 são os mesmos ou diferentes e são selecionados do grupo consistindo em H; Ci-O6 alquila linear ou ramificada; C2-C6 alquenila linear ou ramificada, onde a referida alquila ou alquenila são cada independentemente substituída ou não substituída com um grupo hidroxila, carboxila, ou carboxamida; fenila; e fenila substituída com R1 ou R2 onde R1 e R2 são como definido acima; ou um ou mais de R3 e R4, R5 e R6, R7 e R8 ou R9 e R10, junto com o nitrogênio a qual eles são ligados, forma um anel de heterocíclico que pode também compreende um ou mais heteroátomos adicional selecionado de N, O e S; e sais, hidrato, solvatos e polimorfos destes.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que dois ou mais de R3, R4, R7 e R8 são o mesmo e é selecionado do grupo consistindo em CH2CH2OH, CH2CHOHCH3, CH2CH2CONH2, CH3 e H; ou um ou mais de R3 e R4, R7 e R8 junto com o nitrogênio para o qual eles são ligados, forma um anel de morfolinila.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que dois ou mais de R5, R6, R9 e R10 são os mesmos e são selecionados do grupo consistindo em fenila e fenila substituído com SO3Na.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 são os mesmos e são selecionados do grupo consistindo em SO3H e SO3Na.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 são diferentes e são selecionados do grupo consistindo em SO3H1 SO3Na1 SO3K1 SO3NIUe Η.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico é selecionado do grupo consistindo em ácido 4,4'-bis-(6-anilino-1,4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazina-2- il)amino)estilbeno-2,2'-dissulfônico; dissódico 4,4'-bis-(6-anilino-1,4-bis)2-hidroxietil)amino)- .1,3,5-triazina-2-il)amino)estilbeno-2,2'-disulfonato; sódio de potássio 4,4'-bis-(6-anilino-4- bis)2-hidroxietil)amino)-1 ,S.õ-triazina^-iOaminoJestilbeno^^-disulfonato; ácido 2,2'- estilbenodissulfônico, 4,4'-bis-(4-anilino-6-((2-hidroxietil)metilamino)-s-triazina-2-il)amino) -, sal de dissódico; dissódico 4,4'-bis[(4-anilino-6-morfolino-1,3,5-triazina-2-il)amino]estilbeno- .2,2-disulfonato; tetrasódio 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-(4-sulfonatoanilino)-1,3,5- triazina-2-il]amino] estilbeno-2,2'-disulfonato; tetrasódio 4,4'-bis[[4-[bis(2- hiidroxipropil)amino]-6-[(4-sulfonatofenil)amino]-1,3,5-triazina-2-il]amino]-estilbeno-2,2'- disulfonato; e ácido 2,2,-estilbenodissulfônico,4,4'-bis-[[4-[(2-carbamoiletil)(2- hidroxiletil)amino]-6-(p-sulfoanilino)-s-triazina-2-il]amino]-, sal de tetrasódiol.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o oomiceto é selecionado do grupo consistindo em Saprolegnia spp., Aphanomyces Spp. e Branchiomyces spp.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o oomiceto é Saprolegnia parasitica.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o organismo aquático é selecionado do grupo consistindo em peixe, ovas de peixe e molusco.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o peixe é selecionado do grupo consistindo em perca-gigante, baixo, brema, carpa, bagre, chub, enguia, enguia jovem, linguado, dourado, peixe de aquário, linguado gigante, carpa chinesa, labrax, tainha, peixe-espatula, linguado europeu, pompom, peixe vermelho, red- drum, salmão, sola, esturjão, tilápia, truta, atum e baleia branca.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico é fornecido como uma solução.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico é presente na solução em uma concentração de cerca de 20 a cerca de 200 mg/L.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2,-dissulfônico é presente na solução em uma concentração de cerca de 25 mg/L.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa contatada é durante um período de cerca de 2 a cerca de 16 horas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa contatada é durante um período de cerca de 8 horas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa contatada é repetida a 48 horas de intervalos.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção de oomiceto é simultânea com ou acompanhado por uma infecção parasitária.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção parasitária é causada por pelo menos um parasita selecionado do grupo consis- tindo em Amyloodinium spp., Argulus Spp., Ascocotyle Spp., Bothricephalus Spp., Camalla- nus Spp., Capilaria Spp., Centrocestus Spp., Chilodonella Spp., Coccidia Spp., Contraeae- eum Spp., Cryptobia Spp., Cryptocaryon Spp., Daetylogyrus Spp., Dermoeystidium Spp., Ergasilus Spp., Euclinostomum Spp., Gyrodaetylus Spp., Hexamita Spp., Iehtyobodo Spp., Iehtyophtirius Spp., Lernaea Spp., Metaeerearius Spp., Mierosporidia Spp., Myxosporea Spp., Oodinium Spp., Sanguinieola Spp., Sessiline Spp., Spironucleus Spp., Tetrahymena Spp., Triehodina Spp., Triehodinella Spp. e Tripartiella spp.

19. Método de desinfetar equipamento empregando para aumentar um organismo aquático, o equipamento é contaminado com um oomiceto, o método, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de contatar o equipamento com uma quantidade efeti- va de pelo menos um 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico derivado áci- do da Fórmula (I): <formula>formula see original document page 32</formula> Fórmula (I) onde R1 e R2 são os mesmos ou diferentes e são cada independentemente selecio- nado do grupo consistindo em SO3H, SO3Na, SO3K, SO3NH4 e II; e onde R3 a R1o são os mesmos ou diferentes e são selecionados do grupo consistindo em H; C1-C6 alquila linear ou ramificada; C2-C6 alquenila linear ou ramificada, onde a referida alquila ou alquenila são ca- da independentemente substituída ou não substituída com um grupo hidroxila, carboxila, ou carboxamida; fenila; e fenila substituída com R1 ou R2 onde R1 e R2 são como definido aci- ma; ou um ou mais de R3 e R4, R5 e R6, R7 e R8 ou R9 e R10, junto com o nitrogênio a qual eles são ligados, forma um anel de heterocíclico que pode também compreende um ou mais heteroátomos adicional selecionado de N, O e S; e sais, hidrato, solvatos e polimorfos disso.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que dois ou mais de R3, R4, R7 e R8 são os mesmos e são selecionados do grupo consistindo em CH2CH2OH, CH2CHoHCH3, CH2CH2CONH2, CH3 e II; ou um ou mais de R3 e R4, R7 e R8 junto com o nitrogênio a qual eles são ligados, forma um anel de morfolinila.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que dois ou mais de R5, R6, R9 e R10 são o mesmo e é selecionado do grupo consistindo em em fenila e fenila substituído com S03Na.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 são os mesmos e são selecionados do grupo consistindo em SO3H e SO3Na.

23. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 e R2 são diferentes e são selecionados do grupo consistindo em SO3H, SO3Na, SO3K1 SO3NH4 e II.

24. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o derivado de ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico é selecionado do grupo consistindo em ácido 4,4'-bis-(6-anilino-1,4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazina-2-il) amino)estilbeno-2,2'-dissulfônico; dissódico 4,4'-bis-(6-anilino-1,4-bis)2- hidroxietil)amino)-1,3,5-triazina-2-il)amino)estilbeno-2,2'-disulfonato; ácido de sódio de po- tássio 4,4'-bis-(6-anilino-4-bis)2-hidroxietil)amino)-1,3,5-triazina-2-il)amino)estilbeno-2,2'- disulfonato; 2,2'-estilbenodissulfônico, 4,4'-bis-(4-anilino-6-((2-hidroxietil)metilamino)-s- triazina-2-il)amino)-, sal de dissódico; dissódico 4,4'-bis[(4-anilino-6-morfolino-1,3,5-triazina-2-il) amino]estilbeno-2,2'-disulfonato; tetrasódio 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-(4- sulfonatoanilino)-1,3,5-triazina-2-il]amino] estilbeno-2,2'-disulfonato; ácido tetrasódio 4,4'- bis[[4-[bis(2-hidroxipropil)amino]-6-[(4-sulfonatofenil)amino]-1,3,5-triazina-2-il]amino]- estilbeno-2,2'-disulfonato; e 2,2'-estilbenodissulfônico,4,4'-bis-[[4-[(2-carbamoiletil)(2- hidroxiletil)amino]-6-(p-sulfoanilino)-s-triazina-2-il]amino]-, sal de tetrasódiol.

25. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o oomiceto é selecionado do grupo consistindo em Saprolegnia spp., Aphanomyces Spp. e Branchiomyces spp.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o oomiceto é Saprolegnia parasitica.

27. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o organismo aquático é selecionado do grupo consistindo em peixe, ovas de peixe e molus- co.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o peixe é selecionado do grupo consistindo em perca-gigante, baixo, brema, carpa, ba- gre, chub, enguia, enguia jovem, linguado, dourado, peixe de aquário, linguado gigante, car- pa chinesa, labrax, tainha, peixe-espatula, linguado europeu, pompom, peixe vermelho, red- drum, salmão, sola, esturjão, tilápia, truta, atum e baleia branca.

29. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um derivado ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico é fornecido como uma solução.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um derivado ácido 4,4'-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico está presente na solução em uma concentração de cerca de 20 a cerca de 200 mg/L.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um derivado ácidos 4,4,-bis-(1,3,5-triazinailamino)estilbeno-2,2'-dissulfônico estão presentes na solução em uma concentração de cerca de 25 mg/L.

32. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa contatada é durante um período de cerca de 2 a cerca de 16 horas.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa contatada é durante um período de cerca de 8 horas.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que contatar é repetido a 48 horas de intervalos.

35. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o equipamento é também contaminado com pelo menos um parasita.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um parasita é selecionado do grupo consistindo em Amyloodinium spp., Argulus Spp., Ascocotyle Spp., Bothricephalus Spp., Camallanus Spp., Capilaria Spp., Centrocestus Spp., Chilodonella Spp., Coeeidia Spp., Contraeaeeum Spp., Cryptobia Spp., Cryptoearyon Spp., Daetylogyrus Spp., Dermoeystidium Spp., Ergasilus Spp., Euclinostomum Spp., Gyro- daetylus Spp., Hexamita Spp., Iehtyobodo Spp., Iehtyophtirius Spp., Lernaea Spp., Metaeer- earius Spp., Mierosporidia Spp., Myxosporea Spp., Oodinium Spp., Sanguinieola Spp., Ses- siline Spp., Spironucleus Spp., Tetrahymena Spp., Triehodina Spp., Triehodinella Spp. e Tri- partiella spp.