BRPI0714306A2 - Análogos do peptídio intestinal vasoativo - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLOGOS DO PEPTÍDIO INTESTINAL VASOATIVO”.

A presente invenção refere-se ao peptídio intestinal vasoativo (VIP) que foi primeiramente descoberto, isolado e purificado a partir do intes- 5 tino porcino, [US 3.879.371], O peptídio tem vinte e oito (28) aminoácidos e carrega uma homologia extensiva para a secretina e o glucagon, [Carlquist et al., Horm. Metab. Res., 14, 28-29 (1982)]. A seqüência de aminoácidos do VIP é tal como se segue:

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys- Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID N0: 1).

O VIP é conhecido por expor uma ampla faixa de variação de atividades biológicas em todas as partes do trato gastrointestinal e do siste- ma circulatório. Sob o ponto de vista de sua semelhança com os hormônios gastrointestinais, foi encontrado que o VIP estimula a secreção pancreática e 15 biliar, a glicogenólise hepática, a secreção de insulina e de glucagon e ativa a liberação do bicarbonato pancreático.

São conhecidos dois tipos de receptores do VIP e foram clona- dos do ser humano, rato, camundongo, frango, peixe e rã. Eles são atual- mente identificados como VPAC1 e VPAC2 e respondem ao VIP nativo com 20 afinidade comparável. O RNAm receptor de VPAC2 é encontrado no trato respiratório humano incluindo o epitélio traqueal e brônquico, as células glandulares e células do sistema imune, as paredes alveolares e os macró- fagos, [Groneberg et al., Lab. Invest. 81:749-755 (2001) e Laburthe et al., Receptors and Channels 8:137-153 (2002)].

Foram localizados por imunoensaio neurônios contendo VIP em

células dos sistemas endócrinos e exócrino, do intestino e da musculatura lisa. Foi encontrado que o VIP é um neuroefector causando a liberação de vários hormônios incluindo a prolactina, tiroxina e a insulina e o glucagon. Também foi encontrado que o VIP estimula a liberação da renina dos rins in 30 vivo e in vitro. Foi encontrado que o VIP está presente nos nervos e termi- nais nervosos nas vias aéreas de várias espécies de animais e do homem. Os efeitos cardiovasculares e broncopulmonares do VIP são de muito interesse já que o VIP foi encontrado como sendo um potente vasodilatador e um potente relaxante da musculatura lisa, agindo sobre os leitos vascula- res periféricos, pulmonares e coronarianos. Foi encontrado que o VIP tem um efeito vasodilatador sobre vasos sanguíneos cerebrais. Estudos in vitro 5 demonstraram que o peptídio intestinal vasoativo, exogenamente aplicado a artérias cerebrais, induziu a vasodilatação, sugerindo a ação do VIP como um transmissor possível da vasodilatação cerebral. Também se mostrou que o VIP é um vasodilatador potente na área dos olhos.

O VIP pode ter efeitos reguladores sobre o sistema imune, por 10 exemplo, O VIP pode modular a proliferação e a migração de linfócitos. Mos- trou-se que o VIP nativo inibe a produção IL-12 em macrófagos estimulados por LPS com efeitos sobre a síntese IFN-γ. O VIP inibe a produção da TGF- β1 em macrófagos de murino e inibe a produção de IL-8 em monócitos hu- manos através da NFkB, [Sun et al., J. Neuroimmunol. 107:88-99 (2000) e 15 Delgado e Ganea, Biochem. Biophys. Res. Commun. 302:275-283 (2003)].

Como foi encontrado que o VIP relaxa o músculo liso e está pre- sente normalmente nos tecidos das vias aéreas, como observado acima, foi suposto que o VIP pode ser um mediador endógeno do relaxamento da musculatura lisa bronquial. Mostrou-se que os tecidos de pacientes asmáti- 20 cos não contêm nenhum VIP imunorreativo, comparando com o tecido de pacientes normais. Isto pode ser indicativo de uma perda do VIP ou fibras nervosas VIPérgicas associadas com a doença da asma. Os testes in vitro e in vivo mostraram o VIP para relaxar a musculatura traqueal lisa e proteger contra agentes broncoconstritores, tais como a histamina e a prostaglandina 25 F2α· Quando administrado intravenosamente, o VIP foi avaliado como prote- gendo contra agentes broncoconstritor, tais como a histamina, a prostaglan- dina F2a, os leucotrienos, o fator de ativação plaquetário bem como a bron- coconstrição induzida por antígenos. Também foi encontrado que o VIP inibe a secreção de muco no tecido das vias aéreas humanas in vitro.

Os distúrbios das vias aéreas possuem diversas causas, mas

compartilham várias características fisiopatológicas e clínicas. A característi- ca desses distúrbios é a limitação do fluxo de ar resultante de obstrução das vias aéreas, engrossamento das paredes das vias aéreas, inflamação ou perda da elasticidade do tecido intersticial. Os co-sintomas podem incluir a hipersecreção de muco, hiperreatividade das vias aéreas e anormalidades das trocas gasosas que podem resultar em tosse, produção de saliva, respi- 5 ração e dispnéia. Os distúrbios comuns das vias aéreas incluem: asma, do- ença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), bronquite crônica, enfisema e a hipertensão pulmonar, [Mayeretal., Respiration Physiol. 128:3-11 (2001)].

A COPD é um grupo de condições crônicas definidas pela obs- trução das vias aéreas dos pulmões. A COPD inclui duas das principais do- 10 enças respiratórias que são a bronquite crônica (obstrutiva) e o enfisema. Ambas essas doenças se associam com a dificuldade respiratória e a apnéia. A COPD pode ser acompanhada pela hipertensão pulmonar. O hábi- to do cigarro por longo prazo é o fator de risco predominante da COPD. A limitação das vias aéreas associada com a COPD é geralmente encontrada 15 como sendo irreversível.

A bronquite crônica é uma doença inflamatória progressiva. Com esta doença está associado um aumento na produção de muco nas vias aé- reas e aumento na ocorrência de infecções bacterianas. Esta condição in- flamatória crônica induz o engrossamento das paredes dos brônquios resul- tando no aumento da congestão e na dispnéia.

O enfisema é uma patologia encoberta da COPD danificando o tecido pulmonar pelo alargamento dos espaços aéreos e perda da área su- perficial alveolar. O dano pulmonar é causado pelo enfraquecimento e rom- pimento dos sacos aéreos dentro dos pulmões. A elasticidade natural do 25 tecido pulmonar também é perdida, levando ao sobre-estiramento e à ruptu- ra. Os menores tubos bronquiais podem ser danificados que pode fazer com que eles colabem e obstruam o fluxo de ar, levando à falta da respiração.

COPD, na sua significação médica substancial, sempre é acom- panhado pela obstrução bronquial. Assim, os sintomas mais comuns de COPD incluem o encurtamento da respiração, tosse crônica, compressão no peito, maior esforço para respirar, aumento da produção de muco e limpeza freqüente da garganta. Os pacientes são incapazes de executar as suas ati- vidades diárias habituais. É possível o desenvolvimento independente de bronquite crônica e de enfisema, mas a maior parte de pessoas com COPD possuem uma combinação desses distúrbios.

A falência do tecido conetivo no parênquima pulmonar, em parti- 5 cular da elastina, resulta na perda da elasticidade encontrada em muitos dis- túrbios das vias aéreas. Evidências da degradação da elastina são mostra- das no enfisema e na COPD. Considera-se que a Elastase neutrofílica é uma protease primária, responsável pela destruição da elastina, [Barnes et al., Eur. Respir. J. 22:672-688 (2003)]. Mostrou-se que a produção de elas- 10 tase neutrofílica é realçada nos pulmões dos pacientes de COPD, [Higashi- moto et al., Respiration 72:629-635 (2005)].

Por causa das atividades biológicas interessantes e de potencial clinicamente útil do VIP, o peptídio tem sido alvo de diversos programas rela- tados de síntese com a intenção de realçar uma ou mais das propriedades 15 dessa molécula. Takeyama et al., informaram sobre um análogo do VIP ten- do um ácido glutâmico substituído pelo ácido aspártico na posição 8. Foi en- contrado que este composto era menos potente do que o VIP nativo, [Chem. Pharm. Buli. 28:2265-2269 (1980)]. Wendlberger et al., divulgaram a prepa- ração de um análogo do VIP que substitui uma norleucina na posição 17 pe- 20 Ia metionina, [Peptide Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290-295 (1980)]. Foi en- contrado que o peptídio era equipotente ao VIP nativo na sua capacidade de deslocar o VIP radioiodado de preparações de membrana de fígado. Watts e Wooton informaram uma série de fragmentos do VIP lineares e cíclicos, con- tendo entre seis e doze resíduos da seqüência nativa, [EP 184.309. EP 25 325.044; US 4.737.487. US 4.866.039], Turner et al., informaram que o fragmento VIP (10-28) é antagonista ao VIP [Peptides 7:849-854 (1986)]. O análogo substituído [4-CI-D-Phe6,Leu17]-VIP também foi relatado como se ligando ao receptor do VIP e antagoniza a atividade do VIP [Pandol et al., Gastrointest. Liver Physiol. 13:G553-G557 (1986)]. Gozes et al., informaram 30 que o análogo [Lysl, Pro2, Arg3, Arg4, Pro5, Tyr6]-VIP é um inibidor competiti- vo do VIP que se liga ao seu receptor nas células gliais, [Endocrinology 125:2945-2949 (1989)]. Robberecht et al., informaram vários análogos do VIP com resíduos D substituídos na terminação N do VIP nativo, [Peptides 9:339-345 (1988)]. Todos destes análogos se ligam menos fixadamente ao receptor do VIP e mostraram uma atividade mais baixa do que o VIP nativo na ativação do AMP-c. Tachibana e Ito informaram vários análogos da molé- 5 cuia precursora do VIP, [em: Peptide Chem. Shiba e Sakakibara (editores). Prot. Res. Fundation, 1988, 481-486, JP 1083012, US 4.822.774]. Estes compostos foram mostrados como sendo broncodilatadores 1 a 3 vezes mais potentes do que o VIP e possuíam um nível de atividade hipotensiva de

1 a 2 vezes mais elevado. Musso et al., também informaram que vários aná- 10 Iogos do VIP possuem substituições nas posições 6-7, 9-13, 15-17 e 19-28, [Biochem. 27:8174-8181 (1988); US 4.835.252], Foi encontrado que estes compostos eram iguais ao ou menos potentes do que o VIP nativo na liga- ção ao receptor do VIP e na resposta biológica. Bartfai e al., informaram uma série de análogos multiplamente substituídos do [Leu17J-VIP, [WO 89/05857]. 15 Gourlet et al., informaram um derivado do [Arg16]-VIP com a afi-

nidade para receptores do VIP [BBA 1314:267-273 (1996)]. Onoue et al., informaram uma série de derivados arginina e truncamentos do VIP [Onoue et al., Life Sei. 74:1465-77 (2004) e Ohmori et al., Regui. Pept. 123:201-207 (2004)]. Também foi informada uma série de derivados polialanínicos [Igara- 20 shi et al., J. Pharm. Exper. Ther. 303:445-460 (2002) e Igarashi et al., J. Pharm. Exper. Ther. 315:370-81 (2005)].

Na US 2005/0203009 são descritos os análogos do VIP possu- indo atividade agonista seletiva para o VPAC1. Os análogos do VIP e os de- rivados “PEG-lados” na terminação C foram informados como sendo de utili- 25 dade do tratamento de distúrbios metabólicas incluindo a diabete [por exem- plo, a WO 2006/042152]. Os peptídios que possuem atividade agonista ao VPAC2 foram identificados, e incluem o PACAP e os análogos do VIP [Gour- Iet et al., Peptides 18:403-408; Xia et al., J. Pharmacoi Exp. Ther. 281:629- 633 (1997)]. Os análogos cíclicos do VIP foram informados como tendo me- 30 Ihoradas a estabilidade e a atividade [Bolin et al., Biopolimers 37:57-66 (1995), US 5.677.419],

No ser humano, quando administrado por infusão intravenosa em pacientes asmáticos, demonstrou-se que o VIP causa um aumento na taxa de fluxo expiratória máxima e protege contra a broncodilatação induzida pela histamina, [Morice et al., Peptides 7:279-280 (1986); Morice et al., The Lancet, Il 1225-1227 (1983)]. Os efeitos pulmonares observados por esta 5 infusão intravenosa do VIP foram, entretanto, acompanhados por efeitos co- laterais cardiovasculares, mais notavelmente a hipotensão e a taquicardia e também rubor facial. Quando dado em doses intravenosas que não causa- ram efeitos cardiovasculares, o VIP falhou em conseguir alterar a condução específica das vias aéreas [Palmer et al., Thorax 41:663-666 (1986)]. A falta 10 da atividade foi explicada como sendo devida à baixa dose administrada e possivelmente devida à degradação rápida do composto. Quando ad- ministrado por aerossol a seres humanos, o VIP nativo foi somente margi- nalmente eficaz na proteção contra a broncoconstrição induzida pela hista- mina, [Altieri et al., Pharmacologist 25:123 (1983)]. O VIP foi encontrada não 15 tendo nenhum efeito significativo sobre os parâmetros das vias aéreas de base mas realmente teve um efeito protetor contra a broncoconstrição indu- zida pela histamina quando administrado por inalação a seres humanos, [Barnes e Dixon, Am. Ver. Respir. Dis., 130:162-166 (1984)]. Informou-se que o VIP, quando administrado por aerossol, não mostra nenhum efeito de 20 taquicardia ou hipotensivo em conjunto com a broncodilatação, [Said et al., em: Vasoactive Intestinal Peptide, Said] Ed.), Raven Press, Nova Iorque, 1928, 185-191],

Informou-se que um derivado do VIP, o RO 25-1553, tem eficá- cia como um broncodilatador tanto pré-clinicamente como clinicamente em 25 asmáticos brandos [Kallstrom e Waldeck, Eur. J. Pharm. 430:335-40 (2001) e Linden et al., Thorax 58:217-21 (2003)]. Informou-se que o VIP nativo é de utilidade para o tratamento da COPD, hipertensão pulmonar e outros distúr- bios das vias aéreas [WO 03061680, WO 0243746 e WO 2005/014030],

Entretanto, existe uma necessidade de novos análogos do pep- tídio intestinal vasoativo possuindo seletividade para o receptor VPAC2, pos- suindo potência, propriedades farmacocinéticas e propriedades farmacológi- cas iguais ou melhores do que os agonistas existentes da VPAC. Preferível- mente, existe uma necessidade para compostos que possuam um prazo maior na duração da atividade do que os compostos anteriormente disponí- veis.

A presente invenção compreende um receptor agonista da VPAC-2 de acordo com a Fórmula (I):

X-His-R2-Asp-Ala-R5-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys- R16-Nle-R18-Ala-Lvs-Lvs21-Tvr-Leu-Asn-Asp25-Leu-R27-R28-Glv-Glv-Thr-Y [X-(SEQ ID N0: 2)-Y],

Em que:

X é um hidrogênio do N da terminação amino da Histidina que

pode ser opcionalmente substituído por um grupo protetor amina hidrolisá- vel, mais preferivelmente por um grupo acetila,

Y é o hidróxi do C da terminação carbóxi da Treonina que pode ser opcionalmente substituído por um grupo protetor carbóxi hidrolisável, mais preferivelmente por NH2,

os resíduos sublinhados indicam uma cadeia lateral à cadeia la- teral covalentemente ligada do primeiro (Lys21) e último (Asp25) aminoácidos dentro do segmento,

R2 é Ser ou Ala,

R5 é Thr, Ser, Asp, Gin, Pro ou CaMeVaI,

R16 é Gin, Ala, ou Arg,

R18 é Ala, Lys ou Glu,

R27 é Lys ou Leu exceto que R27 deve ser Lys quando R5 é CaMeVaI e R16 é Arg,

R28 é Lys ou Asn,

ou um sal farmacêutica mente aceitável da mesma.

Os compostos da presente invenção são agonistas ativos do re- ceptor VPAC2 e possuem estabilidade melhorada em relação à elastase neutrofílica humana. Assim, os compostos, como os análogos estáveis sele- 30 tivos do VIP nativo tendo resistência melhorada aos efeitos da elastase pre- sente no pulmão humano, seriam úteis para o tratamento de distúrbios das vias aéreas, incluindo a COPD. Todas as seqüências de peptídio mencionadas aqui são escritas

de acordo com a convenção habitual pela qual a terminação N do aminoáci- do é à esquerda e a terminação C do aminoácido é à direita, a menos que seja observado de outro modo. Uma linha curta entre dois resíduos de ami- 5 noácidos indica uma ligação de peptídio. Um segmento de aminoácidos com o sublinhado indica uma cadeia lateral à ligação covalente da cadeia lateral do primeiro e do último aminoácidos dentro do segmento. Tipicamente isto é uma ligação amida. Quando o aminoácido possui formas isoméricas, é a forma L do aminoácido que é representada, a menos que seja expressamen- 10 te indicado de outro modo. Para a conveniência na descrição da presente invenção, são usadas as abreviaturas convencionais e não-convencionais de vários aminoácidos. Estas abreviaturas são familiares para os versados na técnica, mas para esclarecimento são listadas abaixo:

30

25

20

15

Asp = D = Ácido Aspártico; Ala = A = Alanina;

Arg = R = Arginina;

Asn = N = Asparagina;

Gly = G = Glicina;

Glu = E = Ácido Glutâmico; Gln = Q = Glutamina;

His = H = Histidina;

Ile = I = Isoleucina;

Leu = L = Leucina;

Lys = K = Lisina;

Met = M = Metionina; MeVaI = MeV = CaMeVaI; Nle = Norleucina;

Phe = F = Fenilalanina;

Pro = P = Prolina;

Ser = S = Serina;

Thr = T = Treonina;

Trp = W = Triptofano; Tyr = Y = Tirosina; e Val = V = Valina.

Em relação aos termos “grupo protetor amino hidrolisável” e “grupo protetor carbóxi hidrolisável”, qualquer grupo de proteção convencio- 5 nal que pode ser retirado pela hidrólise pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Exemplos de tais grupos aparecem daqui por diante. Grupos protetores amino preferidos são grupos acila de acordo com a fórmu- la:

em que X3 é alquila inferior ou halo alquila inferior. Desses gru- . 10 pos de proteção, aqueles em que X3 é alquil CrC3 ou haloalquil Ci-C3 são especialmente preferidos. Grupos protetores carbóxi preferidos são ésteres de alquilas inferiores, NH2 e amidas de alquilas inferiores, com ésteres de alquilas Ci-C3, NH2 e amidas de alquilas CrC3 sendo especialmente preferi- dos.

15 Também por conveniência e rápido conhecimento de uma pes-

soa versada na técnica, são usadas as seguintes abreviaturas ou símbolos para representar as porções, reagentes e assemelhados usados na presente invenção:

O

Nle: norleucina;

20

CaMeVaI: Ca-metil-L-valina; MeVaI: Ca-metil-L-valina; CH2CI2: cloreto de metileno;

Ac:

acetila;

25

Ac2O: AcOH:

anidrido acético; ácido acético;

ACN:

acetonitrila;

DMF:

DMAc:

dimetilacetamida;

dimetilformamida; DIPEA: Ν,Ν-di-isopropil etilamina;

TFA: ácido de trifluoroacético;

HOBT: N-hidroxibenzotriazol;

DIC: N,N’-di-isopropilcarbodiimida;

BOP: benzotriazolil-1-óxi-tris-(dimetilamina)-fosfônio-

hexafluorofosfato;

HBTU: 2-(1 H-benzotriazolil-1 )-1,1,3,3-tetrametilurônio- hexafluorofosfato;

NMP: 1-metil-2-pirrolidinona;

MALDI-TOF: ionização de dessorção de laser de matriz assisti-

da-tempo de varredura;

FAB-MS: espectrometria de massa por bombardeio rápido de átomos;

ES-MS: espectrometria de massa por eletrospray;

RT: temperatura ambiente.

Tal como aqui utilizado, o termo “alquila” significa um radical hi- drocarboneto ramificado ou não-ramificado, cíclico ou acíclico, saturado ou insaturado (por exemplo, alquenila ou alquinila) que pode ser substituído ou não-substituído. Quando for cíclico, o grupo alquila é preferivelmente de C3 a 20 C12, mais preferivelmente de C5 a Ci0, mais preferivelmente de C5 a C7. Quando for acíclico, o grupo alquila é preferivelmente de C1 a Ci0, mais pre- ferivelmente de Ci a C6, mais preferivelmente metila, etila, propila (n-propila ou isopropila), butila (n-butila, isobutila ou terc-butila) ou pentila (incluindo n- pentila e isopentila), mais preferivelmente metila.

Tal como aqui utilizado, 0 termo “alquila inferior” significa um ra-

dical hidrocarboneto ramificado ou não-ramificado, cíclico ou acíclico, satu- rado ou insaturado (por exemplo, alquenila ou alquinila) em que o dito grupo alquila inferior cíclico é C5, Ce ou C7 e em que dito grupo alquila inferior ací- clico é C1, C2, C3 ou C4 e é preferivelmente selecionado de metila, etila, pro- pila (n-propila ou isopropila) ou butila (n-butila, isobutila ou terc-butila).

Tal como aqui utilizado, o termo “acila” significa um alquila, ci- cloaiquila, heterocíclico, arila ou grupo heteroarila opcionalmente substituído ligado via um grupo carbonila e inclui grupos, tais como acetila, propionila, benzoila, 3-piridinilcarbonila, 2-morfolinocarbonila, 4-hidroxibutanoila, 4-fluo- robenzoila, 2-naftoila 2-fenilacetila, 2-metoxiacetila e assim por diante.

Tal como aqui utilizado, o termo “arila” significa um grupo aro- 5 mático carbocíclico substituído ou não-substituído, tal como fenila ou naftila, ou um grupo heteroaromático substituído ou não-substituído contendo uma ou mais, preferivelmente um, heteroátomo.

Os grupos alquila e arila podem ser substituídos ou não- substituídos. Quando for substituído, haverá geralmente 1 a 3 substituintes presentes, preferivelmente 1 substituinte. O substituinte pode incluir: grupos contendo carbono, tais como alquila, arila, arilalquil (fenila por exemplo, substituído e não-substituído, benzila substituído e não-substituído); átomos de halogênio e grupos contendo halogênio, tais como haloalquila (por exem- plo, trifluorometila); grupos contendo oxigênio, tais como álcoois (por exem- pio, hidroxila, hidroxialquila, aril (hidroxil) alquila), éteres (por exemplo, alcó- xi, arilóxi, alcoxialquila, ariloxialquila), aldeídos (por exemplo, carboxaldeído), cetonas (por exemplo, alquilcarbonila, alquilcarbonilalquila, arilcarbonila, ari- lalquilcarbonila, aricarbonilalquila), ácidos (por exemplo, carbóxi, carboxial- quila), derivados ácidos, tais como ésteres (por exemplo, alcoxicarbonila, alcoxicarbonilalquila, alquilcarbonilóxi, alquilcarboniloxialquila), amidas (por exemplo, aminocarbonila, monoalquil aminocarbonila ou dialquil aminocar- bonila, aminocarbonilalquila, monoalquil aminocarbonilalquila ou dialquil aminocarbonilalquila, arilaminocarbonila), carbamatos (por exemplo, alcoxi- carbonilamino, ariloxicarbonilamino, aminocarbonilóxi, monoalquil aminocar- bonilóxi ou dialquil aminocarbonilóxi, arilaminocarbonilóxi) e uréia (por exemplo, monoalquil aminocarbonilamino ou dialquil aminocarbonilamino ou arilaminocarbonilamino); grupos contendo nitrogênio, tais como aminas (por exemplo, amino, monoalquilamino ou dialquilamino, aminoalquila, monoalquil aminoalquila ou dialquil aminoalquila), azidas, nitrilas (por exemplo, ciano, cianoalquila), nitro; grupos contendo enxofre tal como tióis, tioéteres, sulfoxi- das e sulfonas (por exemplo, alquiltio, alquilsulfinila, alquilsulfonila, alquiltio- alquila, alquilsulfinilalquila, alquilsulfonilalquila, ariltio, arilsulfinila, arilsulfoni- Ia, ariltioalquila, arilsulfinilalquila, arilsulfonilalquila); e grupos heterocíclicos contendo um ou mais, preferivelmente um, heteroátomo.

Tal como aqui utilizado, o termo “halogênio” significa um radical flúor, cloro, bromo ou iodo, preferivelmente um radical flúor, cloro ou bromo e 5 mais preferivelmente um radical flúor ou cloro.

O “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a sais de adição ácida ou sais de adição básica, convencionais -que conservam a eficácia biológica e as propriedades dos compostos de acordo com a Fórmula I e são formados de ácidos orgânicos ou inorgânicos não-tóxicos ou bases orgâni- 10 cas ou inorgânicas adequadas. Amostras de sais de adição ácida incluem os derivados de ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídri- co, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfâmico, -ácido nítrico e ácido fosfórico e os derivados de ácidos orgânicos, tais como ácido p- toluenossulfônico, ácido salicílico, ácido metanossulfônico, ácido oxálico, 15 ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fumárico e assim por diante. Amostras de sais de adição básica incluem os derivados de amônio, potássio, sódio e hidróxido de amônio quaternário, tal como por exemplo, hidróxido de tetrametilamônio. A modificação química de um com- posto farmacêutico (isto é, o fármaco) em um sal é uma técnica bem- 20 conhecida que é usada como tentativa melhorar as propriedades envolvendo a estabilidade física ou química, por exemplo, higroscopicidade, fluidez ou solubilidade dos compostos. Vide, por exemplo, Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6aedição 1995) nas páginas 196 e 1456-1457.

O termo “éster farmaceuticamente aceitável” se refere conven-

cionalmente a um composto esterificado de acordo com a Fórmula I tendo um grupo carboxila, cujos ésteres conservam a eficácia biológica e as pro- priedades dos compostos de acordo com a Fórmula I, e que são clivados in vivo (no organismo) ao ácido carboxílico ativo correspondente. Os exemplos 30 de grupos éster que são clivados (neste caso, hidrolisados) in vivo aos áci- dos carboxílicos correspondentes são aqueles nos quais o hidrogênio cliva- do é substituído com uma alquila inferior que é opcionalmente substituído, por exemplo, com heterociclo, cicloalquila, etc. Os exemplos dos ésteres de alquila inferior substituídos são aqueles nos quais a alquila inferior é substi- tuída com pirrolidina, piperidina, morfolina, N-metilpiperazina, etc. O grupo que é clivado in vivo pode ser, por exemplo, etila, etil morfolina e etil dietila- 5 mina. Com relação à presente invenção, o grupo -CONH2 também é consi- derado um éster, já que o grupo -NH2 é clivado in vivo e substituído com um grupo hidróxi, para formar o ácido carboxílico correspondente.

Informação adicional acerca de exemplos e do uso de ésteres para a liberação de compostos farmacêuticos está disponível no Design of 10 Prodrugs, Bundgaard (editores) (Elsevier, 1985). Vide também, Ansel et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6a Ed. 1995) nas páginas 108 a 109; Krogsgaard-Larsen et. al., Textbook of Drug Design and Development (2a Ed. 1996) nas páginas 152 a 191.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for- 15 necido um composto de acordo com a Fórmula I em que X é um hidrogênio do N da terminação amino da Histidina ou em que o dito hidrogênio é substi- tuído por um grupo acetila. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de acordo com a Fórmula I em que X é um hidrogênio do N da terminação amino da Histidina.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for-

necido um composto de acordo com a Fórmula I em que Y é o hidróxi do C da terminação carbóxi da Treonina ou em que o dito hidróxi é substituído por NH2. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de acordo com a Fórmula I em que o Y é o hidróxi do C da terminação carbóxi da Treonina.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um composto de acordo com a Fórmula I em que R2 é Ser. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de acordo com a Fórmula I em que R2 é Ala.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for-

necido um composto de acordo com a Fórmula I em que R5 é Tr, Ser ou CaMeVaI. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um composto de acordo com a Fórmula I em que R5 é Tr. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de acordo com a Fórmula I em que R5 é Ser. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de acordo com a Fórmu- Ia I em que R5 é CaMeVaI.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um composto de acordo com a Fórmula I em que R16 é Gln ou Arg. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de acordo com a Fórmula I em que R16 é Gin. Em outra modalida- 10 de de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de acordo com a Fórmula I em que R16 é Arg.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um composto de acordo com a Fórmula I em que R18 é Ala. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de 15 acordo com a Fórmula I em que R18 é Lys. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecido um composto de acordo com a Fórmu- la I em que R18 é Glu.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um composto de acordo com a Fórmula I em que R27 é Lys.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for-

necido um composto de acordo com a Fórmula I em que R28 é Lys.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um composto de acordo com a Fórmula I em que

X é um hidrogênio do N da terminação amino da Histidina ou o dito hidrogênio substituído por um grupo acetila,

Y é o hidróxi do C da terminação carbóxi da Treonina ou o dito hidróxi substituído por NH2,

R2 é Ser ou Ala1 R5 é Tr, Ser ou CaMeVaI1 R16 é Gln ou Arg,

R18 é Ala1 Lys ou Glu1

R27 é Lys ou Leu exceto que R27 deve ser Lys quando R5 é CaMeVaI e R16 é Arg, e R28 é Lys.

Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um composto de acordo com a Fórmula I em que:

X é um hidrogênio do N da terminação amino da Histidina ou o

dito hidrogênio substituído por um grupo acetila,

Y é o hidróxi do C da terminação carbóxi da Treonina ou o dito hidróxi substituído por NH2,

R2 é Ser ou Ala,

R5 é Tr1 Ser ou CaMeVaI1

R16 é Gln ou Arg1 R18 é Ala1 Lys ou Glu1

R27 é Lys ou Leu exceto que R27 deve ser Lys quando R5 é CaMeVaI e R16 é Arg1 e R28 é Lys.

Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um composto de acordo com a Fórmula I em que:

X ê um hidrogênio do N da terminação amino da Histidina ou o dito hidrogênio substituído por um grupo acetila,

Y é o hidróxi do C da terminação carbóxi da Treonina ou o dito

hidróxi substituído por NH2,

R2 é Ser ou Ala,

R5 é Ser ou CaMeVaI,

R16 é Gin,

R18 é Ala,

R27 é Lys ou Leu, e R28 é Lys.

Os compostos representativos presentes podem ser prontamen- te sintetizados por qualquer procedimento convencional conhecido da for- mação de uma ligação de peptídio entre aminoácidos. Tais procedimentos convencionais incluem, por exemplo, qualquer procedimento na fase de so- lução que permite uma condensação entre a o grupo alfa amino livre de um aminoácido ou resíduo do mesmo possuindo o seu grupo carboxila e outros grupos reativos protegidos e o grupo carboxila primário livre de outro amino- ácido ou resíduo do mesmo possuindo o seu grupo amino ou outros grupos reativos protegidos.

5 Tais procedimentos convencionais para sintetizar os novos com-

postos da presente invenção incluem por exemplo, qualquer método de sín- tese de peptídio em fase sólida. Em tal método a síntese dos novos compos- tos pode ser realizada incorporando em seqüência os resíduos dos aminoá- cidos desejados um após o outro na cadeia crescente de peptídio segundo 10 os princípios gerais dos métodos em fase sólida. Tais métodos são descri- tos, por exemplo, em Merrifield, J. Amer. Chem. Soe. 85:2149-2154 (1963); Barany et al., The Peptides, Anaiysis, Synthesis and Biology, Volume 2, Gross e Meienhofer, (Editores) Academic Press 1-284 (1980), que são aqui incorporados pela referência. A síntese de peptídio pode ser realizada ma- 15 nualmente ou com a instrumentação automatizada. A síntese auxiliada por micro-onda também pode ser utilizada.

A proteção de grupos reativos das cadeias laterais de várias porções de aminoácidos com grupos de proteção adequados é comum na síntese química de peptídios e impedirão que uma reação química ocorra 20 naquele sítio até que o grupo de proteção seja posteriormente retirado. Nor- malmente também é comum a proteção do grupo alfa amino ou um aminoá- cido ou um fragmento enquanto aquela entidade reage no grupo carboxila, seguido pela remoção seletiva do grupo protetor alfa amino e permitem que uma reação subsequente se realize naquele sítio. Enquanto os grupos de 25 proteção específicos foram descritos em relação ao método de síntese em fase sólida, deve se observar que cada aminoácido pode ser protegido por um grupo protetor convencionalmente usado para o respectivo aminoácido na síntese em fase de solução.

Os grupos alfa amino podem ser protegidos por um grupo de proteção adequado selecionado de grupos de proteção de aromáticos do tipo uretano, tais como aliloxicarbonila, benzilóxi carbonila (Z) e benzilóxi carbonila substituído, tal como p-clorobenzilóxi carbonila, p-nitrobenzilóxi carbonila, p-bromobenzilóxi carbonila, p-bifenil-isopropilóxi carbonila, 9- fluorenilmetilóxi carbonila (Fmoc) e p-metoxibenzilóxi carbonila (Moz); gru- pos de proteção alifáticos do tipo uretano, tais como t-butilóxi carbonila (Boc), di-isopropilmetilóxi carbonila, isopropilóxi carbonila e alilóxi carbonila.

Aqui, Fmoc é mais preferido para a proteção do grupo alfa amino.

Os grupos Guanidina podem ser protegidos por um grupo de proteção adequado selecionado de nitro, p-toluenossulfonila (Tos), (Z), 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonila (Pmc); 4-metóxi-2,3,6,-trimetilbenze- nossulfonila (Mtr). Pmc e Mtr são os mais preferidos para a arginina (Arg).

Os grupos ε-amino podem ser protegidos por um grupo de pro-

teção adequado selecionado de 2-cloro-benzilóxi carbonila (2-CI-Z), 2-bro- mo-benzilóxi carbonila (2-Br-Z) e Boc. Boc é o mais preferido para a (Lys).

Os grupos Hidroxila (OH) podem ser protegidos por um grupo de proteção adequado selecionado de benzila (Bzl), 2,6-diclorobenzila (2,6-diCI- Bzl) e terc-butila (t-Bu). O tBu sendo mais preferido para os (Tyr), (Ser) e (Tr).

Os grupos (3amida e yamida podem ser protegidos por um grupo de proteção adequado selecionado de 4-metiltritila (Mtt)1 2,4,6-trimetoxiben- zila (Tmob), 4,4-dimetoxiditil/bis-(4-metoxifenil)-metila (Dod) e tritila (Trt). Trt é o mais preferido para (Asn) e (Gin).

O grupo indol pode ser protegido por um grupo de proteção a- dequado selecionado de formila (For)1 mesitil-2-sulfonila (Mts) e Boc. Boc é o mais preferido para (Trp).

Os grupos (3carboxila e ycarboxila podem ser protegidos por um grupo de proteção adequado selecionado de t-butila (tBu) e éster 2-feniliso- propila (2Pip). O tBu é o mais preferido para (GIu) e o 2Pip é mais preferido para (Asp).

O grupo imidazol pode ser protegido por um grupo de proteção adequado selecionado de benzila (Bzl), Boc e tritila (Trt). Trt é o mais prefe- rido para (His).

Todos os solventes, isopropanol (iPrOH), cloreto de metileno (CH2CI2)1 DMF e NMP foram comprados da Fisher1 JT Baker ou Burdick & Jackson e foram usados sem destilação adicional. O TFA foi comprado da Halocarbon, Aldrich ou Fluka e usado sem purificação adicional.

O DIC e a DIPEA foram comprados de Fluka ou Aldrich e usa- dos sem purificação adicional. O HOBT, dimetilsulfeto (DMS) e 1,2- 5 etanoditiol (EDT) foram comprados da Aldrich, Sigma Chemical Co ou da Anaspec e usados sem purificação adicional. Os aminoácidos protegidos estavam geralmente da configuração L e foram obtidos comercialmente da Bachem, Advanced ChemTech, CEM ou Neosystem. A pureza destes rea- gentes foi confirmada por cromatografia em camada fina, NMR e ponto de 10 fusão antes do uso. A resina de Benzidrilamina (BHA) era um copolímero de estireno a 1% em divinilbenzeno (100 a 200 mesh ou 200 a 400 mesh) obti- do da Bachem, Anaspec ou Advanced ChemTech. O teor de nitrogênio total destas resinas estava geralmente entre 0,3 meq/g e 1,2 meq/g.

A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) foi condu- 15 zida em um aparelho LDC consistindo em bombas Constametric I e III, um programador de solvente da Gradiente Master e um misturador e um Spec- tromonitor Ill de comprimento de onda variável e um detector de UV. A H- PLC analítica foi realizada no modo de fase reversa usando colunas Pursuit C18 (4,5 mm x 50 mm). As separações HPLC preparativas foram corridas em 20 colunas Pursuit (50 mm x 250 mm).

Em uma modalidade preferida, os peptídios foram preparados usando a síntese em fase sólida geralmente pelo método descrito por Merri- field (J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963)), embora outra síntese química equivalente conhecida na técnica possa ser usada, tal como anteriormente 25 mencionado. A síntese em fase sólida é iniciada na extremidade do C termi- nal do peptídio pela ligação um alfa aminoácido protegido a uma resina ade- quada. Tal material de partida pode estar preparado anexando um aminoá- cido alfa amino protegido por uma ligação éster com uma resina do álcool p-benziloxibenzila (Wang), ou por uma ligação amida entre um Ligante 30 Fmoc, tal como o ácido p-((R,S)-a(1-(9H-fluorenil-9)-metoxiformamida)-2,4- dimetiloxibenzil)-fenoxiacético (ligante Rink) a uma resina benzidrilamina (BHA). A preparação da resina de hidroximetila é bem-conhecida na técnica. Os suportes das resinas Fmoc-Ligante-BHA estão comercialmente disponí- veis e são geralmente usados quando o peptídio desejado que é sintetizado tem uma amida não-substituída na terminação C.

Tipicamente, os aminoácidos ou os miméticos são ligados na 5 resina Fmoc-Ligante-BHA usando a forma protegida Fmoc do aminoácido ou o mimético, com 1 a 5 equivalentes de aminoácidos e um reagente de liga- ção adequado. Depois das ligações, a resina pode ser lavada e seca sob vácuo. O carregamento do aminoácido sobre a resina pode ser determinado pela análise de aminoácidos de uma alíquota da resina Fmoc-aminoácido ou 10 pela determinação de grupos Fmoc por análise UV. Quaisquer grupos amino não-reagidos podem ser cobertos tratando a resina com o anidrido acético e di-ispropiletilamina em cloreto de metileno ou em DMF.

As resinas são transportadas por vários ciclos repetitivos para acrescentar os aminoácidos em seqüência. Os grupos protetores alfa amino Fmoc são removidos sob as condições básicas. A piperidina, piperazina ou morfolina (20 a 40% v/v) em DMF podem ser usadas com essa finalidade. Preferivelmente a piperidina a 40% em DMF é tipicamente utilizada.

Depois da remoção do grupo protetor alfa amino, os aminoáci- dos protegidos subsequentes são ligados gradualmente na ordem desejada para obter uma resina intermediária do peptídio protegida. Os reagentes de ativação usados para a ligação dos aminoácidos na síntese em fase sólida dos peptídios são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, os reagentes adequados para tal síntese são BOP, bromo-tris-pirrolidin-fosfônio hexafluo- ro fosfato (PyBroP)1 HBTU e DIC. Preferidos aqui são o HBTU e o DIC. Outros agentes de ativação descritos por Barany e Merrifield (em: The Pep- tides, Vol. 2, Meienhofer (ed.), Academic Press, 1979, páginas 1 a 284) po- dem ser utilizados. Vários reagentes, tais como HOBT1 N-hidroxisuccinimida (HOSu) e 3,4-di-hidro-3-hidróxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HOOBT) podem ser acrescentados às misturas de ligação para otimizar os ciclos de síntese. Aqui o preferido é o HOBT.

O protocolo para um ciclo típico de síntese é tal como se segue: Protocolo 1 Etapa Reagente Tempo 1 DMF 2 x 30 s 2 20% piperidina/DMF 1 min 3 20% piperidina/DMF 15 min 4 DMF 2 x 30 s 5 iPrOH 2 x 30 s 6 DMF 3 x 30 s 7 Ligação 60 min a 18 h 8 DMF 2 x 30 s 9 iPrOH 1 x 30 s 10 DMF 1 x 30 s 11 CH2CI2 2 x 30 s Os solventes para todas as lavagens e ligações foram medidos

para volumes de 10 ml_/g resina a 20 mL/g resina. As reações de ligação em todas as partes da síntese foram controladas pelo teste de niidrina Kaiser 5 para determinar o ponto de terminação [Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595- 598 (1970)]. Qualquer reação de ligação incompleta foi ou religada com ami- noácido ativo recentemente preparado ou encapada tratando a resina de peptídio com o anidrido acético tal como descrito acima. As resinas de pep- tídio totalmente ligadas foram secas a vácuo durante várias horas.

A síntese de peptídio pode ser realizada usando um sintetizador

433A da Applied Biosystem (Foster City, CA), os ciclos de FastMoc 0,25 mmol foram usados ou com cada amostragem de resina ou sem amostragem de resina, em um vaso reacional de 41 ml_. A resina Fmoc-aminoácido foi dissol- vida com 2,1 g de NMP, 2g de 0,45M HOBT/HBTU em DMF e 2M DlEA, e 15 depois transferida para o vaso de reação. O ciclo básico de ligação FastMoc foi representado pelo módulo “BADEIFD", em que cada letra representa um módulo. Por exemplo: o B representa o módulo para a desproteção do Fmoc utilizando piperidina/NMP a 20% e as lavagens e leituras relacionadas por 30 minutos (ou monitorização por uv ou condutividade); o A representa o módulo 20 para ativação de aminoácido em cartuchos com HBTU/HOBt a 0,45 M e DIEA a 2,0 M e misturando-se com borbulhamento de N2; o D representa o módulo para lavagem com NMP da resina no vaso de reação; o E representa o módu- lo de transferência do aminoácido ativado para o vaso de reação para ligação;

I representa o módulo para um período de espera de 10 minutos com agitação em vortex no e fora do vaso de reação; e F representa o módulo para limpeza do cartucho, a ligação por aproximadamente 10 minutos e a drenagem do va- so de reação. As ligações foram tipicamente estendidas pela adição do módu- lo T uma vez ou em múltiplas etapas. Por exemplo, as ligações duplas foram corridas executando o procedimento “BADEIIADEIFD”. Outros módulos foram disponíveis, tais como c para a lavagem com cloreto de metileno e “C” para a encapagem com anidrido acético. Os módulos individuais foram também mo- dificáveis por, por exemplo, modificando o tempo de várias funções, tais como tempo de transferência, de modo a alterar a quantidade de solvente ou de reagentes transferidos. Os ciclos acima foram tipicamente usados para a Iiga- ção de um aminoácido. Para sintetizar tetra peptídios, entretanto, os ciclos foram repetidos e expandidos em conjunto. Por exemplo, o BADEIIADEIFD foi usado para ligar o primeiro aminoácido, seguido por BADEIIADEIFD para ligar o segundo aminoácido, seguido por BADEIIADEIFD para ligar o terceiro ami- noácido, seguido por BADEIIADEIFD para ligar o quarto aminoácido, seguido por BIDDcc para a desproteção final e a lavagem.

A síntese de peptídios pode ser realizada usando um Sintetiza- dor de Peptídio por Micro-onda, Liberty (CEM Corporation, Matthews, NC).

O sintetizador foi programado para dupla ligação e encapar pela modificação do ciclo de pré-carregamento de 0,25 mmol. O editor de micro-onda foi usa- 25 do para programar os métodos de potência das micro-ondas para uso duran- te a desproteção do Fmoc, ligação do aminoácido e o encapando com o ani- drido acético. Este tipo do controle por micro-onda leva em conta os méto- dos a serem criados que controlam uma reação em um conjunto de tempera- turas para um período de tempo ajustado. O Liberty regula automaticamente 30 a quantidade de potência liberada para a reação de manter a temperatura no ponto de referência. Os ciclos de referência para adição de aminoácido e para desproteção final foram selecionados no editor de ciclo e foram auto- 10

15

maticamente carregados durante a criação de um peptídio.

A síntese foi realizada em uma escala de 0,25 mmol usando re- sina de Fmoc-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol). A resina foi acrescentada ao vaso reacional de 30 mL com 10 mL de DMF. A desproteção Fmoc foi realizada com solução de piperidina a 20% em DMF. Para cada ligação de aminoácido, o aminoácido protegido pelo Fmoc foi dissolvido em DMF para fazer uma solução a 0,2 M e foi acrescentado ao vaso de reação. Todas as reações de ligação foram realizadas com HOBT/HBTU a 0,5 M e DIEA/NMP a 2 M. Qualquer reação de ligação incompleta foi religada com aminoácido ativo recentemente preparado ou encapada tratando a resina de peptídio com o anidrido acético a 25% em DMF. Cada reação de desproteção, de ligação e de encapamento foi feita usando micro-ondas a 70°C por 300 se- gundos em potência de 50 watts e borbulhando nitrogênio.

Para cada aminoácido foi usada uma ligação seguindo um ciclo de ligação de 0,25 mmol:_

Protocolo 2

Transferência de resina para o vaso Acrescentar piperidina para desproteção (10 mL)

Método de micro-ondas para desproteção (50 watts; 70°C; 300 segundos) Lavar a resina com DMF (10 mL)

Acrescentar o aminoácido (5 mL)

Acrescentar o ativador (HOBT/HBTU) (2 mL)

Acrescentar o ativador básico (DIEA) (1 mL)

Método de micro-onda para Ligação (50 watts; 70°C; 300 segundos)

Lavar a resina com DMF (10 mL)

Acrescentar o aminoácaido (5 mL)

Acrescentar o ativador (HOBT/HBTU) (2 mL)

Acrescentar o ativador básico (DIEA) (1 mL)

Método de micro-onda para ligação (50 watts; 70°C; 300 segundos)

Lavar a resina com DMF (10 mL)

Acrescentar o encador (Anidrido Acético 10 mL)

Método de micro-onda (encapar) (50 watts; 70°C; 300 segundos)

Lavar a resina com DMF (10 mL)______ Para a síntese de compostos apresentados aqui, um procedi- mento de síntese preferido é mostrado no Esquema 1.

Esquema 1

Fmoc-Rink-MBHA- Resina

1

1) Piperidina/DMF

2) Fmoc-AA(P)iVDIC, BOP ou HBTU

Fmoe-AA(P)31-Rink-MBHA- Resina

2

Repetir as etapas 1 e 2 acima

Ac-AAlPy-AAiPy-AAíPyt-AAiPf-AAiPF-AAiPf-AAiPf-bAiPf-AAiPf-AAiPyo-AAlPy1- AA{F)rí-AA(P)13-AA{P)1Jí-AA{P)15-AA(P)1K-AA(P)'!7-AA{P)'!a-AA(P)"9-AA(P):?c-AA(Pp1-AAiP)22- AA(P)*’3-AA(P)2',-AA(P);’5-AA{P)J’B-AA(P);’7-AA(Pp-AA{P)»)-AA(P)30-AA(P)3,-Rink-MBHA-Resina

1)2% TFAZCh2CI;,

2) PdCI2ZBu3SnH

3) BOP/NMM

Ac-AA(P)'-AA(P)?-AA(P)3-AA(P)‘,-AA(P)5-AA(P)6-AA(P)7-AA(P)8-AA(P)9-AA(P)10-AA(P)

AA{P)1^-AA(P)i:,-AA(P)l',-AA{P)15-AA(P)1B-AA(P)!7-AA(P),»-AA(P)!e-AA(PP-AA?'-AA{PP- AA(P)23-AA(P)24-AA25-AA(P)26-AA{P)27-AA(P)2a-AA(Pp-AA(P)30-AA(P);,,-Rink-MBHA-Resina

4

97% TFA/H/5/TIPS

Ac AA' M*1-AA3 AA4 AA3-AAs AA7-AA9-AA9 AA1c-AAi1-AAlr-AA13 M'"1-AA15-AAle-AAi7-AAto

τ--------------------------------------------------"I

-AA1a-AA2e-AA21-AA22-AA23-AA24-M25-AA26-AAi7-AA28-AA29-AA3c-AA31-NH2

O tratamento da resina Fmoc-Rink-MBHA1 1, com piperidi- 5 na/DMF seguido pela ligação com Fmoc-AA (P)31 com um reagente tal como DIC, BOP ou HBTU, onde AA31 representa o 31° resíduo aminoácido e P representa um grupo de proteção apropriado, produz o Fmoc-AA(P)31 -Rink- Resina, 2. A repetição das etapas 1 e 2 por 30 ciclos acrescentando o ami- noácido protegido adequado em cada ciclo, fornece a resina de peptídio 3.

Os grupos de proteção da cadeia lateral AA25 e AA21 são removidos pelo tratamento com TFA a 2% em CH2CI2 e PdCI2/nBu3SnH, respectivamente. A cadeia lateral amina e carboxila da AA21 e AA25 são ciclizadas pelo trata- mento com BOP e NMM em DMF para formar o composto 4.

Para cada composto, os grupos bloqueadores são removidos e o peptídio é clivado da resina na mesma etapa. Por exemplo, as resinas do pep- 5 tídio podem ser tratadas com 100 μΙ_ de etanoditiol, 100 pL de dimetilsulfeto, 300 pL de anisol e 9,5 mL de TFA1 por grama da resina,na temperatura ambi- ente por 180 minutos. Ou alternadamente, as resinas do peptídio podem ser tratadas com 1,0 mL triisopropil silano e 9,5 mL de TFA, por grama da resi- na,na temperatura ambiente por 180 minutos. A resina é separada por filtra- 10 ção e os filtrados são precipitados em éter de etila gelado. O precipitado é centrifugado e a camada de éter é decantada. O resíduo é lavado com dois ou três volumes de Et2O e recentrifugado. O produto bruto 5 é seco sob vácuo.

As purificações dos peptídios brutos são realizadas em um sis- tema Shimadzu LC-8A de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) em uma Coluna Pursuit C-18 (50 mm x 250 mm, 300 Â, 10 μητι) de fase re- versa. Os peptídios são dissolvidos em uma quantidade mínima de água e acetonitrila e são injetados em uma coluna. O gradiente de eluição é geral- mente iniciado em 2% tampão B, de 2% a 70% B durante 70 minutos, (tam- pão A: TFA/H20 a 0,1%, tampão B: TFA/CH3CN a 0,1%), com uma taxa de fluxo de 50 mL/min. A detecção por UV é feita a 220 nm/280 nm. As frações contendo os produtos são separadas e a sua pureza é avaliada em um sis- tema analítico Shimadzu LC-10AT usando coluna Pursuit C18 de fase rever- sa (4,6 mm x 50 mm) com uma taxa de fluxo de 2,5 mL/min, o gradiente (de 2% a 70%) durante 10 minutos [tampão A: TFA/H20 a 0,1%, tampão B: TFA/CH3CN a 0,1%)]. As frações avaliadas com pureza suficiente são reuni- das e liofilizadas.

A pureza dos produtos finais é verificada por HPLC analítico em uma coluna de fase reversa tal como declarado acima. Todos os produtos finais também são submetidos à espectrometria de massa por bombardeio 30 de átomos rápidos (FAB-MS) ou espectrometria de massa por eletrospray (ES-MS). Nos Exemplos, todos os produtos produziram os íons M+H precur- sores esperados dentro de limites aceitáveis. Os análogos do VIP descritos na presente invenção são agonis- tas do receptor VPAC2 como demonstrado no Exemplo 25. Segundo os ex- perimentos de estabilidade da elastase no Exemplo 25, tais compostos real- çaram a estabilidade da elastase neutrofílica humana. Por isso, a adminis- 5 tração desse agonistas do receptor da VPAC2 seria de utilidade no trata- mento de distúrbios das vias aéreas, tais como a COPD.

Os compostos da presente invenção podem ser fornecidos na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplos de sais preferen- ciais são os formados com ácidos orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, 10 por exemplo, acético, láctico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzóico, salicílico, metanosulfônico, toluenossulfônico, trifluoroacético, ou ácido pamóico, bem como ácidos poliméricos, tais como ácido tânico ou car- boximetil celulose e sais com ácidos inorgânicos, tais como ácidos de hi- droaletos (por exemplo, ácido clorídrico), ácido sulfúrico, ou ácido fosfórico e 15 assim por diante. Qualquer procedimento para obter um sal farmaceutica- mente aceitável conhecido a um técnico versado pode estar usado.

Na prática do método de acordo com a presente invenção, uma quantidade eficaz de qualquer um dos peptídios da presente invenção ou uma combinação de qualquer um dos peptídios da presente invenção ou um 20 sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, é administrada via quaisquer dos métodos habituais e aceitáveis conhecidos na técnica, isoladamente ou em combinação. Os compostos ou as composições podem ser assim admi- nistrados oralmente (por exemplo, na cavidade bucal), sublingualmente, pa- renteralmente (por exemplo, intramuscularmente, intravenosamente, ou sub- 25 cutaneamente), retalmente (por exemplo, por supositórios ou lavagens), transdermicamente (por exemplo, eletroporação da pele) ou por inalação (por exemplo, por aerossol) e na forma de dosagens sólidas, líquidas ou ga- sosas, incluindo comprimidos e suspensão. A administração pode ser con- duzida em uma forma de uma unidade de dosagem para uma terapia contí- 30 nua ou em uma forma de dose única a vontade. A composição terapêutica também pode estar na forma de uma emulsão de óleo ou dispersão em con- junto com um sal lipofílico, tal como ácido pamóico, ou na forma de uma composição de liberação sustentada biodegradável para administração sub- cutânea ou intramuscular.

Assim, o método de acordo com a presente invenção é pratica- do quando a ajuda de sintomas é especificamente necessária ou possivel- 5 mente de emergência. Alternativamente, o método de acordo com a presen- te invenção é eficazmente praticado como um tratamento contínuo ou profi- lático.

Veículos farmacêuticos úteis para a preparação das composi- ções dos mesmos, podem ser sólidos, líquidos ou gases; assim, as compo- sições podem tomar a forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, supositórios, pó, formulações entéricas ou outras formulações protegidas revestidas (por exemplo, ligando sobre resinas trocadoras de íon ou empacotando em vesí- culas de proteína-lipídio), formulações de liberação sustentada, soluções, suspensões, elixires, aerossóis e assim por diante. O veículo pode ser sele- cionado de vários óleos incluindo aqueles de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e assim por diante. A água, a solução salina, a dextrose aquosa e os glicóis são veículos líquidos preferidos, particularmente (quando isotônicos com o sangue) para soluções injetáveis. Por exemplo, as formula- ções para administração intravenosa compreendem soluções aquosas esté- reis dos ingredientes ativos que são preparadas dissolvendo os ingredientes ativos sólidos em água para a produção de uma solução aquosa e produzin- do uma solução estéril. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem o amido, a celulose, o talco, a glicose, a lactose, a gelatina, o malte, o arroz, a farinha, o giz, a sílica, estearato de magnésio, estearato de sódio, monoes- tearato de glicerol, cloreto de sódio, leite desnatado, glicerol, propileno glicol, água, etanol e assim por diante. As composições podem ser submetidas a aditivos farmacêuticos convencionais, tais como conservantes, agentes es- tabilizadores, agentes umectantes ou agentes emulsificantes, sais para ajus- tar a pressão osmótica, tampões e assim por diante. Veículos farmacêuticos adequados e as suas formulações estão descritos no Remington1S Pharma- ceutical Sciences por E. W. Martin. Tais composições conterão, em todo o caso, uma quantidade eficaz do composto ativo em conjunto com um veículo adequado para preparar a forma de dosagem própria para a administração apropriada ao receptor.

A dose de um composto da presente invenção depende de di- 5 versos fatores, tais como, por exemplo, o modo de administração, a idade e o peso corporal do paciente e a condição do paciente a ser tratado e no final será decidida pelo médico ou pelo veterinário atendente. Tal quantidade do composto ativo como determinada pelo médico ou pelo veterinário atendente é aqui e também nas reivindicações, referida como uma “quantidade eficaz”. 10 Por exemplo, a dose para administração por inalação varia tipicamente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal. Pre- ferivelmente, o composto da presente invenção é administrado a uma taxa de dosagem de aproximadamente 1 pg/kg/dia a aproximadamente 50 pg/kg/dia.

Os regimes de liberação representativos incluem o oral, parente-

ral (incluindo subcutâneo, intramuscular e intravenoso), retal, bucal (incluin- do sublingual), transdérmico, pulmonar e intranasal. Avia preferida para ad- ministração é a administração pulmonar pela inalação oral. Os métodos da administração pulmonar podem incluir formação de aerossol de uma solução 20 aquosa dos peptídios cíclicos da presente invenção ou a inspiração de for- mulações secas em pó micronizado. As composições de aerossol podem incluir o composto empacotado em micelas reversas ou lipossomas. A prepa- ração em pó micronizado com tamanho de partícula apropriadamente con- trolado para fornecer efetivamente a liberação alveolar é bem-conhecida. Os 25 inaladores para a liberação de doses especificadas de tais formulações dire- tamente nos pulmões (Inaladores de Dose Medida ou “MDIs”) são bem- conhecidos na técnica.

Assim, a presente invenção também abrange composições far- macêuticas contendo tal agonistas e o uso de tal agonistas para o tratamen- to de doenças pulmonares incluindo a COPD.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for- necida uma composição farmacêutica para administração por inalação com- preendendo um composto de acordo com a Fórmula I e pelo menos um veí- culo farmaceuticamente aceitável ou excipiente em solução ou micronizado na forma de pó seco em que o composto está presente em uma concentra- ção farmacologicamente eficaz para a liberação pulmonar da dita composi- 5 ção. Em outra modalidade de acordo com a presente invenção é fornecida uma composição farmacêutica para administração por inalação compreen- dendo um composto de acordo com a Fórmula I e pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável em solução ou na forma seca de pó micronizado em que a concentração do composto é suficiente para a Iibera- 10 ção de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 50 pg/kg do composto em uma dose inalada única.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção é for- necido um método de tratar distúrbios obstrutivos pulmonares, por exemplo, a COPD, compreendendo administração por inalação uma quantidade efi- 15 caz, por exemplo, de aproximadamente 1 pg/kg/dia a aproximadamente 50 μ os g/kg/dia, de uma composição farmacêutica para administração por inala- ção compreendendo um composto de acordo com a Fórmula I e pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável em solução ou seco na forma de pó micronizado em que o composto está presente em uma con- 20 centração farmacologicamente eficaz para a liberação pulmonar da compo- sição dita, por exemplo, a uma pessoa que esteja sofrendo de tal distúrbio.

A presente invenção será também descrita agora pelos seguin- tes Exemplos, que são destinados a servirem somente como ilustração e não limitam o alcance da presente invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Tr-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr-Lys- Leu-Ara-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Glv- Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:3)-NH2], isto é, o composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Tr1 R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys. O peptídio acima mencionado foi sintetizado usando a química de Fmoc em um equipamento Applied Biosystem 433A ou um sintetizador de peptídio por micro-onda. O sintetizador foi programado para a dupla ligação usando os módulos descritos nos Protocolos 1 ou 2 acima. A síntese foi rea- 5 Iizada em uma escala de 0,25 mmol usando a resina Fmoc-Rink Ligante- BHA (450 mg, 0,25 mmol). Ao final da síntese, a resina foi transferida para um vaso de reação com um agitador. A resina de peptídio em DMF foi filtra- da e lavada com CH2CI2. A resina foi tratada cinco vezes com TFA a 2% em CH2CI2 por 3 minutos cada vez. A resina foi imediatamente tratada duas ve- 10 zes com DIPEA/CH2CI2 a 5% e lavada com CH2CI2 e DMF. A resina de pep- tídio foi suspensa em DMF em um vaso com um agitador com segurança adequada por um septo de borracha. Ao mesmo foi acrescentado 60 mg de PdCI2(Ph3P)2, 150 pL de morfolina e 300 pL de AcOH. O vaso foi bastante purgado com Ar. O nBu3SnH foi então acrescentado via uma seringa. A so- 15 lução negra foi agitada por 30 a 45 minutos, lavada com DMF e repetida. Depois do segundo tratamento com Pd, a resina foi lavada com DMF, 2 x iPrOH, DMF, DIPEA/DMF a 5% e DMF. Em DMF, a resina de peptídio foi ciclizada pelo tratamento com BOP e NMM durante a noite. A resina foi la- vada com DMF e CH2CI2 e depois seca sob vácuo.

O peptídio foi clivado da resina usando 13,5 mL 97% TFA/3%

H2O e 1,5 mL tri-isopropilsilano por 180 minutos na temperatura ambiente. A solução de desproteção foi acrescentada a 100 mL de Et2O gelado e lava- da com 1 mL TFA e 30 mL de Et2O gelado para precipitar o peptídio. O pep- tídio foi centrifugado em dois tubos de polipropileno de 50 mL. Os precipita- dos dos tubos individuais foi reunido em um único tubo e lavado 3 vezes com Et2O gelado e seco em um dessecador sob vácuo próprio.

O material bruto foi purificado por HPLC preparativa em uma co- luna Pursuit C18 (250 mm x 50 mm, tamanho de partícula de 10 μιη) e eluído 5 com um gradiente linear de 2% a 7% de B (tampão A: TFA/H20 a 0,1%; tam- pão B: TFA/CH3CN a 0,1%) por 90 minutos, com taxa de fluxo de 60 mL/min e detecção a 220 nm/280 nm. As frações foram reunidas e foram verificadas por HPLC analítica. As frações contendo produto puro foram combinadas e Iiofili- zadas para a produção de 106 mg (9,7%) de um pó amorfo branco. (ES) +- 10 LCM m/e calculado para Ci59H256N46047 = 3565,05; encontrado = 3563,7. Exemplo 2:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arq-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:4)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 28 mg (2,5%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci5SH254N46O4? = 3551,02; encontrado =

3548.7.

Exemplo 3:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Asp-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arq-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:5)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Asp, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 9,2 mg (1%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para CisgH254N46O4B = 3579,03; encontrado =

3577.8. Exemplo 4:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Gln-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arg-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:6)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Gin, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 9,8 mg (1%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para C160H257N47O47 = 3592,07; encontrado = 3589,5.

Exemplo 5:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Pro-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arq-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:7)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Pro, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 15,2 mg (1,4%) de pó amorfo bran- co. (ES) +-LCM m/e calculado para CieoH2SeN46O46 = 3561,06; encontrado =

3560,0.

Exemplo 6:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-AIa-MeVaI-Fe-Tr-GIu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Ara-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:8)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é MeVaI, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys. N

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 40 mg (3,6%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para C161H260N46O46 = 3577,10 encontrado = 3576,8.

Exemplo 7:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arq-Lvs-Gln-Nle-Glu-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:9)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Gin, R18 é Glu, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 126 mg (11,4%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci6OH2SeN46O4g = 3609,06 encontra- do = 3609,2.

Exemplo 8:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Ara-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:10)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Leu e R28 é Lys.

A resina de Fmoe-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 77 mg (7,3%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para C158H253N45O47 = 3536,00 encontrado = 3534,95.

Exemplo 9:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lys-Leu-Arg-Lvs-Gln-Nle-Lvs-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:11)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Gin, R18 é Lys, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 79 mg (7,5%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para C161H26IN47O4Z = 3608,11; encontrado = 3607,6.

Exemplo 10:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arq-Lvs-Ala-Nle-Glu-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:12)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Ala, R18 é Glu, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 65 mg (6%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci58H253N45048 = 3552,00; encontrado = 3551,2.

Exemplo 11:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Ara-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Asn- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:13)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Leu e R28 é Asn. A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 109 mg (10,6%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci56H24TN4SO48 3521,93; encontrado = 3520,5.

Exemplo 12:

Preparação de Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arg-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:14)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ala, R5 é Ser, R16 é Gln1 R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 20 mg (1,8%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para CiseH254N46O46 = 3535,02; encontrado =

3533,4.

Exemplo 13:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr-Lys- Leu-Arq-Lvs-Arg-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Glv-Tr- NH2 [Ac-(SEQ ID N°:15)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac,

Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Arg, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoe-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 60 mg (5,3%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci5QH2SeN46O46 = 3579,08; encontrado =

3577,8.

Exemplo 14:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lys-Leu-Arg-Lvs-Arg-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Asn- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:16)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Arg, R18 é Ala, R27 é Leu e R28 é Asn. A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 40 mg (3,7%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para C157H251N47O47 = 3549,99; encontrado = 3549,2.

Exemplo 15:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arg-Lvs-Arg-Nle-Glu-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:17)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Arg, R18 é Glu, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 36 mg (3,6%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci6iH26oN48048 = 3637,11; encontrado =

3636,4.

Exemplo 16:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arg-Lvs-Arg-Nle-Lvs-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:18)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Arg, R18 é Lys, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi sub- metida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedimento do Exemplo 1 para a produção de 51 mg (4,4%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci62H265N49O46 = 3636,17; encontrado = 3634,8.

Exemplo 17:

Preparação de Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lys-Leu-Ara-Lvs-Arg-Nle-Glu-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:19)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ala, R5 é Ser, R16 é Arg, R18 é Glu1 R27 é Lys e R28 é Lys. A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 27 mg (2,7%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para C161H260N48O47 = 3621,11; encontrado = 3620,4.

Exemplo 18:

Preparação de Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arg-Lvs-Arg-Nle-Lvs-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:20)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ala1 R5 é Ser, R16 é Arg, R18 é Lys, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi sub- metida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedimento do Exemplo 1 para a produção de 53,5 mg (4,6%) de pó amorfo branco. (ES) +- LCM m/e calculado para Ci62H26sN49045 = 3620,17; encontrado = 3618,8. Exemplo 19:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Ara-Lvs-Arq-Nle-Glu-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:21)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2l R2 é Ser, R5 é Ser, R16 é Arg, R18 é Glu, R27 é Leu e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 33 mg (3,3%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci6iH259N47048 = 3622,10; encontrado =

3620,8.

Exemplo 20:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-AIa-MeVaI-Fe-Tr-GIu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Ara-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:22)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é MeVaI1 R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Leu e R28 é Lys. A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 55 mg (5,2%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para C1SiH2SgN45O4S = 3562,09; encontrado = 3561,09.

Exemplo 21:

Preparação de Ac-His-Ala-Asp-AIa-MeVaI-Fe-Tr-GIu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arg-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:23)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ala, R5 é MeVaI, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 49 mg (4,5%) de pó amorfo branco. (ES) +-LCM m/e calculado para Ci6iH26oN4604s = 3561,10; encontrado =

3560,0.

Exemplo 22:

Preparação de Ac-His-Ser-Asp-AIa-MeVaI-Fe-Tr-GIu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Arq-Lvs-Arq-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv- GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:24)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ser, R5 é MeVaI, R16 é Arg, R18 é Ala, R27 é Lys e R28 é Lys.

A resina de Fmoe-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi sub- metida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedimento do Exemplo 1 para a produção de 13,8 mg (1,2%) de pó amorfo branco. (ES) +- LCM m/e calculado para Cie2H2S4N48O45 = 3605,16; encontrado = 3604,0. Exemplo 23:

Preparação de Ac-His-Ala-Asp-AIa-MeVaI-Fe-Tr-GIu-Asn-Tyr-Tr- Lvs-Leu-Ara-Lvs-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs- GIy-GIy-Tr-NH2 [Ac-(SEQ ID N°:25)-NH2], isto é do composto da Fórmula I em que X é Ac, Y é NH2, R2 é Ala, R5 é MeVaI, R16 é Gin, R18 é Ala, R27 é Leu e R28 é Lys. A resina de Fmoc-Rink-Ligante-BHA (450 mg, 0,25 mmol) foi submetida à síntese em fase sólida e purificação de acordo com o procedi- mento do Exemplo 1 para a produção de 30,2 mg (2,8%) de pó amorfo bran- co. (ES) +-LCM m/e calculado para C161H259N47O45 = 3546,09; encontrado = 5 3544,8.

Exemplo 24:

Ensaio para 0 Agonista Sup-Tl AMP-c.

A linhagem de células humanas Sup-Tl do linfóide-T, que ex- pressa o receptor VPAC2, foi obtida da Coleção Americana de Cultura de 10 Tipos (ATCC, CRL-1942) e mantida no meio de crescimento em densidades entre 0,2 e 2 x 106 células/mL em uma incubadora a 37°C em CO2. O meio de crescimento foi 1640 RPMI (Invitrogen) complementado com tampão de HEPES a 25 mM e soro fetal bovino a 10% (Gemini Bioproducts).

Para avaliar atividade agonista do composto VPAC2, as células com crescimento na fase Iog foram lavadas uma vez com o meio de cresci- mento na temperatura ambiente e distribuídas em microplacas de 96 poços em uma densidade de 4 x 104 células por poço em 150 pL de meio de cres- cimento. 50 pL dos compostos a serem testados, preparados em concentra- ções apropriadas no meio de crescimento, foram então acrescentados aos poços indicados. Depois de 5 minutos na temperatura ambiente, as células foram Iisadas acrescentando 25 pL do reagente de Iise 1A (AMP-c sistema Biotrak EIA, Amersham Biosciences, RPN225) a cada poço. As placas de 96 poços foram guardadas na temperatura ambiente por 10 minutos com agita- ção e depois guardadas a 4°C até a análise por AMP-c (dentro de duas ho- ras).

Os níveis de AMP cíclicos foram determinados em 100 pL de cada Iisado utilizando o kit AMP-c Biotrak Enzima Imunoensaio (EIA) de a- cordo com as instruções do fabricante (Amersham Biosciences, RPN225). A atividade de cada composto agonista VPAC2 (valor de EC50) foi prevista 30 ajustando os dados de resposta de dose de 7 concentrações a uma equação de resposta da dose sigmoidal fornecida pelo programa GrafPad Prism (GrafPad Software, Inc). Tabela 1:

Composto no Exemplo Sup-Tl AMP-c EC50 (nM) 1 38 2 69,7 3 98 4 85 1206 6 2,35 7 632 8 11,4 9 1200 447 11 16,8 12 7,4 13 17,6 14 94,1 116,7 16 1030 17 23,3 18 276 19 68,4 9,45 21 4,75 22 10,54 23 4,07 Exemplo 25:

Estabilidade do peptídio para a elastase neutrofílica.

A estabilidade proteolítica dos análogos do peptídio foram esta- belecidas com a cromatografia líquida de alta pressão em fase reversa (RP HPLC) e espectrometria de massa por ionização de eletrospray (ESI MS). Os análogos do peptídio foram incubados com elastase neutrofílica humana e a quantidade de análogos não digeridos foi determinada por ESI MS em espaços de tempo adequados. Múltiplos análogos do peptídio poderiam ser incluídos em um experimento enquanto eles pudessem ser diferenciados pelo tempo de retenção da HPLC e/ou pelo peso molecular. Ac-His Ac-His- Ser-Asp-Ala-Val-Fe-Tr-Glu-Asn-Tyr-Tr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys- 5 Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Gly-Gly-Tr-NH? foi usado em todos os experimentos como um controle e como um padrão de referência. O uso si- multâneo de múltiplos análogos do peptídio em conjunto com um padrão de referência levou em conta a compensação por variações na fidelidade proteolítica da enzima durante múltiplos experimentos. As correntes iônicas 10 integradas obtidas para o peptídio individual não digerido foram usadas para quantificação. Para o cálculo do tempo médio foi assumido o comportamento cinético de primeira ordem e todos os cálculos foram normalizados ao tempo médio do padrão de referência.

As soluções de armazenamento de peptídio foram preparadas em água a uma concentração de 2,5 mg/mL. Exceto quando em uso, todas as soluções de armazenamento foram guardadas a -20°C. Para determinar o teor de peptídio relativo nas soluções de armazenamento preparadas foi fei- ta a HPLC de fase reversa com uma alíquota e a absorvância observada de UV foi comparada com uma alíquota do padrão de referência de compara- ção. As concentrações dos análogos do peptídio foram consequentemente ajustadas. Para fazer a digestão proteolítica, os peptídios foram dissolvidos na solução tampão de fosfato salino (PBS) a uma concentração de 0,1 mg/mL. Não menos que seis análogos do peptídio diferentes foram mistura- dos em 50 pL de volume de reação. O padrão de referência foi acrescentado a todos os experimentos como uma referência e como padrão interno. A e- Iastase (Neutrófilos Humanos, Calbiochem, Catálogo n° 324681) foi acres- centada de uma solução de armazenamento de elastase até uma concentra- ção de 1 pg/mL a 2 pg/mL. Quantidades diferentes da enzima foram escolhi- das para compensar as diferenças nas estabilidades proteolíticas dos análo- gos do peptídio. Anteriormente, uma solução de armazenamento de elastase foi preparada em água em uma concentração de 1 mg/mL. As pequenas alí- quotas da solução de armazenamento da enzima foram guardadas a -20°C para manter uma melhor atividade da enzima limitando o número de ciclos de congelamento e de degelo.

A digestão foi feita na temperatura ambiente em um tubo de au- toamostragem dentro do autoamostrador do sistema HPLC (Agilent Série 1100). Durante o curso do tempo, alíquotas de 5 pL foram injetadas em in- tervalos de 70 minutos na coluna de HPLC de fase reversa (Fenomenex, Luna C18, 3μ, 100 Â, 150 mm x 2,00 mm). Para o ponto do tempo de partida uma alíquota foi injetada imediatamente antes da adição da enzima proteolí- tica. Um total de oito pontos de tempos diferentes foi registrado em um expe- rimento, incluindo o ponto de partida. Os peptídios foram separados na colu- na de fase reversa com um gradiente de 50 minutos de 5% a 30% de fase orgânica. A fase aquosa foi de 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético na água e a orgânica foi de 0,045% (v/v) de ácido trifluoroacético em acetonitrila. As absorvâncias foram registradas 214 nm e 280 nm respectivamente. Todo o efluente da coluna foi introduzido no turbo V como fonte do espectrômetro de massa de ionização de electrospray (Sistema ABI 4000 QTrap LC/MS/MS). Os espectros de massa foram adquiridos no modo Q3MS em uma faixa de variação de massa para incluir todos os íons triplamente carregados dos a- nálogos não degradados do peptídio. Foi tomado cuidado para assegurar que os análogos do peptídio pudesse ser claramente diferenciado pelo tem- po cromatográfico de retenção ou pela diferença de pesos moleculares. As quantidades relativas dos respectivos análogos de peptídio não digeridos foram calculadas do fluxo total de íon integrado. Uma janela de 2,5 Da foi escolhida e o software do fabricante foi usado para integrar as correntes iô- nicas individuais. O tempo médio total de um análogo de peptídio individual foi calculado assumindo um comportamento cinético de primeira ordem e foi normalizado em relação ao tempo médio do padrão de referência. Tabela 2:

Composto no Exemplo Estabilidade Realtiva de Elastase 1 3,9 2 5,2 3 4,5 4 3,9 4,9 6 6 7 16,4 8 3,5 9 12,0 7,4 11 2,4 12 5,2 13 1,7 14 4,5 4,8 16 4,4 17 4,6 18 5,1 19 3,3 3,4 21 5,7 22 1,8 23 3,6 Exemplo 26:

Efeito dos Compostos sobre a inflamação pulmonar induzida por LPS em ratos machos C57BL/6.

Aerossol LPS: os ratos C57bl/6 são pré-tratados com o veículo

ou com o fármaco antes de uma exposição de aerossol para os Iipopolissa- carídio (LPS, 500 Mg/mL em solução salina estéril) durante 15 a 30 minutos. O aerossol é gerado por um nebulizador Pari Ultra Ned gerador de jato, o ponto de saída do qual é conectado a uma pequena câmara plástica clara [A x L x P = 10,7 x 25,7 x11 cmx(4x10x 4,5 polegadas)] contendo os ani- mais. A lavagem broncoalveolar (BAL) é realizada 24 horas depois para de- terminar a intensidade da inflamação da célula. O procedimento da BAL é 5 realizado tal como descrito abaixo.

Administração intranasal de LPS: os Ratos são pré-tratados com o veículo ou o fármaco antes de uma administração intranasal de Iipopolis- sacarídio (0,05 a 0,3 mg/kg em solução salina estéril; 50 pL de volume total, 25 μΙ/nostril). A administração intranasal é realizada pela apresentação das 10 pequenas gotículas na solução de dosagem nasal usando uma pipeta Ep- pendorff de 25 a 50 pL. O BAL é realizado de 3 horas a 24 horas após a ex- posição ao LPS tal como descrito acima para determinar a intensidade da inflamação da célula.

Lavagem Broncoalveolar: 24 horas depois da exposição ao LPS, os animais são anestesiados com pentobarbital (80 mg/kg a 100 mg/kg, i.p.), cetamina/xizalina (80 mg/kg a 120 mg/kg/2 mg/kg a 4 mg/kg, i.p.) ou uretano (1,5 g/kg a 2,4 g/kg, i.p.); e por uma pequena incisão na linha mediana do pescoço (15 mm a 20 mm), a traquéia é exposta e colocada cânula com o adaptador de tubo de 20 G. Os pulmões são lavados com 2 x com 1 ml da solução salina balanceada de Hank sem Ca++ e Mg++ (HBSS). O fluido de la- vagem é recuperado depois de 30 segundos por aspiração branda e coletado para cada animal. As amostras são depois centrifugadas a 2.000 rpm por 10 minutos a 5°C. O sobrenadante é aspirado e as células vermelhas do sangue são Iisadas a partir da pílula resultante com 0,5 mL de água destilada por 30 segundos antes de restaurar osmolaridade para as células restantes pela adi- ção de 5 mL de HBSS. As amostras são recentrifugadas a 2.000 rpm por 10 minutos a 5°C e o sobrenadante foi aspirado. A pílula resultante é ressuspen- sa em 1 mL de HBSS. O número total de células é determinado por Trypan Blue (Sigma Chemical, St.Louis, MO) pela exclusão de uma alíquota da sus- pensão de células usando contador coulter ou um hemocitometro. Para con- tagem de célula diferenciais, uma alíquota da suspensão de células é centri- fugada em um aparelho Cytospin (5 minutos, 1.300 rpm; Shandon Southern Instruments, Sewickley, PA) e as lâminas são fixadas e coradas com corante de Wright modificado (kit de coloração Hema 3, Fisher Scientific). Os critérios morfológicos padrão são usados na classificação de pelo menos 300 células sob microscopia com luz. Os dados na Tabela 3 são expressos como células 5 de BAL x 104/animal para células neutrofílicas e totais, ou a inibição percen- tual do fluido de resposta neutrofílica BAL induzido por LPS.

Tabela 3:

Composto no Dose Inibição da neutrofilia induzida por LPS Exemplo (+ 10% a 30%, ++ > 30%) 1 0,1% + 2 0,1% + 6 0,01% ++ 7 0,01% ++ 8 0,1% ++ 9 0,01% + 0,01% ++ 11 0,01% ++ 12 0,01% + 13 0,01% ++ 0,01% + 17 0,01% + 19 0,01% + Exemplo 27:

Efeito dos Compostos sobre o Broncoespasmo Induzido por Metacolina em

Camundonqos.

A função respiratória é medida em camundongos conscientes, com liberdade de movimentos usando pletismógrafos de corpo inteiro (WBP) da BUXCO Electronics, Inc (Troy, NY). As câmaras de WBP permitem aos animais moverem-se livremente dentro da câmara enquanto a função respira- 15 tória é medida. Oito câmaras são usadas simultaneamente para que oito ca- mundongos possam ser medidos ao mesmo tempo. Cada câmara WBP é u- nida a um regulador de fluxo de erro sistemático para fornecer a um fluxo Ia- minar, constante, de ar fresco durante a prova. Um transformador anexado a cada câmara detecta as modificações de pressão que ocorrem enquanto o animal respira. Os sinais de pressão são amplificados por um pré-amplificador MAX Il Strain Gauge e analisados pelo Biosystem XA software fornecido com o sistema (BUXCO Electronics, lnc). As modificações de pressão dentro de cada câmara são calibradas antes da prova injetando exatamente 1 mL de ar pela porta de injeção e ajustando o sinal do computador de modo concordan- te. Os camundongos são colocados nas câmaras WBP e deixados aclimatar por 10 minutos antes da prova. A prova é conduzida deixando os animais se moverem e respirarem livremente por 15 minutos enquanto os seguintes pa- râmetros são medidos: Volume da Respiração (mL), Taxa Respiratória (respi- rações por minuto), Volume por Minuto (volume da respiração multiplicado pela taxa respiratória, mL/min), Tempo de Inspiração (segundos), Tempo de Expiração (segundos), Pico do Fluxo de Inspiração (mL/s) e Fluxo Máximo de Expiração (mL/s). Os dados brutos de cada um dos parâmetros listadas acima são capturados no banco de dados do software e é calculada a média uma vez por minuto para fornecer um total de 15 pontos de dados por cada parâ- metro. A média dos 15 pontos dos dados é informada. O Volume Acumulado (mL) é um valor cumulativo (não calculado a média) e representa a soma de todos os volumes da respiração pelos 15 minutos de sessão de experiência.

O protocolo é construído para incluir as medições antes, durante e depois de um teste de exposição de geração de espasmo para determinar o Penh. Efeitos de resposta da dose de um determinado gerador de espasmo (isto é metacolina (MCh), acetilcolina, etc.) são obtidos produzindo um ae- 25 rossol nebulizado (exposição por 30 segundos a 60 segundos) em intervalos de aproximadamente 5 min a 10 min.

Os camundongos (balb/c) são tratados com o veículo (DMSO a 2% em H2O) ou com o fármaco dissolvido em 4 mL de veículo durante 20 minutos pelo aerossol, tal como descrito acima, antes da exposição ao gera- 30 dor de espasmo. O Penh é determinado em 5, 30 e 60 minutos após a expo- sição. Os dados são informados como percentagem de inibição de Penh em relação ao veículo. Tabela 4:

Composto no Exem¬ Inibição de Penh em 5 minutos após exposição (+ > plo 50%, ++ < 50%) 6 ++ 12 + 18 + 19 + Listagem de Seqüência

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<i20> Análogos do peptídio intestinal vasoativo

<130> 23410 <140>

<141>

<160> 2 5

<170> Patente em versão 3.3 10 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

His Ser Asp Ala vai Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25

<210> 2 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo <220>

<221> MOD_RES

<222> (2)

<223> Ser ou Ala

<220>

<221> M0D_RES

<222> (5)

<223> Thr, ser, Asp1 Gln1 pro, ou c-alfa-MetiI-L-Valina <220>

<221> MOD_RES

<222> (16)

<223> Gln1 Ala, ou Arg <220>

<221> MOD_RES

<222> (17)

<223> Nle <220>

<221> MOD_RES

<222> (18)

<223> Ala, Lys, ou Glu <220>

<221> M0D_RES

<222> (27)

<223> Lys ou Leu, e mas ser Lys quando a posição 5 é c-alfa-MetiI-L-valina

e posição 16 é Arg <220>

<221> MOD_RES

<222> (28)

<223> Lys ou Asn

<220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 2

His Xaa Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Xaa Xaa Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 3 <211> 31 <212> PRT

<213> seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 3

His Ser Asp Ala Thr Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 4 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo <220>

<221> MOD_RES

<222> (17)

<223> Nle

<220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 4

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 5 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 5

His Ser Asp Ala Asp Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 2 5 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 6

His ser Asp Ala Gln Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 7 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

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<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220> <223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 7

His Ser Asp Ala Pro Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 8 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)

<223> c-alfa-Metil-L-valina <220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 8

His ser Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 9 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

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<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

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<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação lateral à cadeia lateral

<400> 9

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg 1 5 10

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly 20 25 30

<210> 10 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 10

covalente de cadeia

Lys Gln 15 Thr His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 11 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 11

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Lys Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 12 <211> 31

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in-

testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 12

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Ala 15 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 13 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

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<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

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<221> MOD_RES

<222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 13

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Asn Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> Seqüência artificial

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<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in-

testinal vasoativo

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<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 14

His Ala Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 15 His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 16

<211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

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<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 16

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Asn Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 17 <211> 31

<212> PRT

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<223> Descrição de seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in-

testinal vasoativo

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<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral

<400> 17

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 18 <211> 31 <212> PRT

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<223> Nle <220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 18

His ser Asp Ala ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Lys Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 19 <211> 31 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in-

testinal vasoativo

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<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 19

His Ala Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 20 <211> 31 <212> PRT

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<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Residuos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 20 His Ala Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Lys Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 21

<211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 21

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 22 <211> 31

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in-

testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)

<223> C-alfa-Metil-L-valina <220>

<221> MOD_RES

<222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 22

His Ser Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 23 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES <222> (5)

<223> C-alfa-MetiI-L-Valina <220>

<221> MOD_RES <222> (17)

<223> Nle

<220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 23

His Ala Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 24 <211> 31 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in- testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)

<223> C-alfa-Metil-L-Valina <220>

<221> MOD_RES <222> C17)

<223> Nle <220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 24

His Ser Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 25 <211> 31

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Descrição de Seqüência artificial: análogo sintético de peptideo in-

testinal vasoativo

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)

<223> c-alfa-Metil-L-valina <220>

<221> MOD_RES

<222> (17)

<223> Nle <220>

<223> Resíduos 21 e 25 são conectados por uma ligação covalente de cadeia lateral à cadeia lateral <400> 25

His Ala Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gln 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Lys Gly Gly Thr 20 25 30

Claims (10)

1. Análogo do peptídio cíclico intestinal vasoativo de acordo com a fórmula I: <formula>formula see original document page 64</formula> em que: X é um hidrogênio da amina N-terminal da histidina que pode ser opcionalmente substituído por um grupo protetor amino hidrolisável, mais preferivelmente por um grupo acetila, Y é o hidróxi do carbóxi C-terminal da treonina que pode ser opcionalmente substituído por um grupo protetor carbóxi hidrolisável, mais preferivelmente por um grupo NH2, os resíduos sublinhados significando uma ligação covalente de cadeia lateral para cadeia lateral do primeiro (Lys21) e do último (Asp25) aminoácido dentro do segmento, R2 é Ser ou Ala, R5 é Thr, Ser, Asp, Gin, Pro ou CaMeVaI, R16 é Gin, Ala, ou Arg, R18 é Ala, Lys ou Glu, R27 é Lys ou Leu exceto que R27 deve ser Lys quando R5 é CaMeVaI e R16 é Arg, R28 é Lys ou Asn, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto como definido na reivindicação 1, em que R5 é Ser ou CaMeVaI.

3. Composto de acordo com a reivindicação 2, em que R27 é Lys.

4. Composto selecionado de um grupo consistindo em His-Ser-Asp-Ala-Thr-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys- Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Glv-Thr (SEQ ID N0: 3), His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys- Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Glv-Thr (SEQ ID N0: 4), His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys- Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Glv-Thr (SEQ ID N0: 8), His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gin-Nle- Lys-Ala-Lys-Lvs-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-GIv-GIv-Thr (SEQ ID N0: 11). His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle- Glu-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Glv-Thr (SEQ ID N0: 19), His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-GIn- Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Glv-Thr (SEQ ID N0: 23), e His-Ala-Asp-AIa-MeVaI-Phe-Thr-GIu-Asn-T yr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys- Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs-Glv-Glv-Thr (SEQ ID N0: 25).

5. Composto como definido na reivindicação 1, que é X-(SEQ ID N0: 8)-Y.

6. Composição farmacêutica compreendendo um composto co- mo definido na reivindicação 1, e pelo menos um veículo ou excipiente far- maceuticamente aceitável.

7. Método para tratamento dos distúrbios pulmonares obstruti- vos compreendendo a administração por inalação de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um composto como definido na reivin- dicação 1, e pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente acei- tável a uma pessoa que esteja sofrendo de tal distúrbio.

8. Uso de um composto como definido na reivindicação 1, para o preparo de um medicamento para o tratamento dos distúrbios pulmonares obstrutivos.

9. Processo para a preparação de um composto como definido na reivindicação 1.

10. Invenção tal como anteriormente descrita.