BRPI0714381A2 - composiÇÕes e mÉtodos para inibir crescimento de cÂnceres deficientes em smad4 - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA INIBIR CRESCIMENTO DE CÂNCERES DEFICIENTES EM SMAD4. A presente invenção está nos campos de biologia de células, imunologia e oncologia. A invenção refere-se à descoberta de que há uma relação entre os níveis de expressão do gene supressor de tumor smad4 (também conhecido como dpe4) e integrina <244>~ v~ <225>~ 6~e a capacidade de resposta de populações de pacientes a composições e compostos ativos de <244>~ v~<225>~ 6~ (por exemplo, anticorpos e outros ligantes que ligam <244>~ v~<225>~ 6~), particularmente em células de câncer a partir dessa população de pacientes, mais particularmente em carcinomas como carcinomas pancreáticos. A invenção provê desse modo, métodos para determinar a capacidade de resposta de células de tumor (particularmente aquelas de tumores pancreáticos) a tais composições e compostos ativos de <244>~ v~<225>~ 6~pelo exame da expressão de <244>~ v~<225>~ 6~e smad4 pelas células de tumor, bem como métodos de diagnóstico e tratamento/prevenção de avanço de tumor utilizando ligantes, incluindo anticorpos e drogas de molécula pequena, que se ligam a integrina <244>~ v~<225>~ 6~ nas superfícies das células de tumor e/ou que bloqueiam um ou mais componentes da via de TGF-<225>, particularmente em células de tumor deficientes em 5/<243><244>~ r~<>4.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA INIBIR CRESCIMENTO DE CÂNCERES

DEFICIENTES EM SMAD4

r ANTECEDENTES DA INVENÇÃO k.

> Campo da invenção

A presente invenção se refere aos campos de biologia

de células, imunologia e oncologia. A invenção refere-se à descoberta de que há uma relação entre os níveis de expressão do gene supressor de tumor smad4 (também conhecido como dpc4) e integrina avp6 e a capacidade de resposta de populações de pacientes a composições e compostos ativos de CtvP6 (por exemplo, anticorpos e outros ligantes que ligam OvP6) , particularmente em células de câncer a partir dessa população de pacientes, mais particularmente em carcinomas como carcinomas pancreáticos. A invenção provê desse modo, métodos para determinar a capacidade de resposta de células de tumor (particularmente aquelas de tumores pancreáticos) a tais composições e compostos ativos de Otvp6 pelo exame da expressão de ανβ6 e smad4 pelas células de tumor, bem como métodos de diagnóstico e tratamento/prevenção de avanço de tumor utilizando ligantes, incluindo anticorpos e drogas de molécula pequena, que se ligam à integrina ανβ6 nas superfícies das células de tumor e/ou que bloqueiam um ou mais componentes da via de TGF-P, particularmente em células de tumor deficientes em smad4.

Técnica Relacionada

Integrinas são receptores de glicoproteína de superfície de célula que ligam proteínas de matriz extracelular e mediam interações de matriz extracelular- 3 0 célula e célula-célula (genericamente mencionados como eventos de adesão de células) (Ruoslahti, E., J. Clin. Invest. 87:1-5 (1991); Hynes, R.O., Cell 69:11-25 (1992)). Esses receptores são compostos de cadeias: alfa (a), e beta (β) ; não covalentemente associadas, as quais combinam para fornecer uma variedade de proteínas heterodiméricas, com especificidades, celular e adesiva, distintas, (Albeda, S. M. Lab. Invest. 68:4-14 (1993)). Estudos recentes envolveram certas integrinas na regulação de uma variedade de processos celulares incluindo adesão celular, migração, invasão, diferenciação, proliferação, apoptose e expressão de gene (Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4-14 (1993); Juliano, R., Câncer Met. Rev. 13:25-30 (1994); Ruoslahti, E. e Reed, J.C., Cell 77:477-478 (1994); e Ruoslahti, E. e Giancotti, F.G. Câncer Cells 1:119-126 (1989); Plow, Haas e outros 2 000; van der Flier and Sonnenberg 2001).

0 receptor de ανβ6 é um membro de uma família de integrinas que são expressas como proteínas heterodiméricas de superfície de célula (Busk, M. e outros, J. Biol. Chem. 267(9): 5790-5796 (1992)). Embora a subunidade Ov possa formar um heterodímero com uma variedade de subunidades β (βι,β3,β5,βδ e β8) , a subunidade β6 pode ser expressa somente como um heterodímero com a subunidade Otv. A integrina ανβ6 é conhecida como sendo um receptor de superfície de célula de ligação-C de tenascina e peptídeo associado à latência (LAP) , fibronectina, interagindo com a matriz extracelular através dos sítios de ligação de tripeptídeo RGD (Busk, M. e outros, J. Biol. Chem. 267:5790-5796 (1992); Weinacker, A. e outros, J. Biol. Chem. 269:6940-6948 (1994); Prieto, A. L. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:10154-10158 (1993)). Embora a integrina ανβ6 fosse primeiramente identificada e sequenciada há mais de 10 anos, a significância biológica de ανβ6 especialmente em doença, ainda está sob investigação. A expressão de ανβε é restrita a células epiteliais onde é expressa em níveis relativamente baixos em tecido saudável e regulada ascendentemente de forma significativa durante desenvolvimento, lesão, e cicatrização de ferimento (Breuss, J. M. e outros, J. Histochem. Cytochem. 41:1521- 1527 (1993); Breuss, J.M. e outros, J. Cell Sei. 108:2241- 2251 (1995); Koivisto, L. e outros, Cell. Adhes. Communic. 7:245-257 (1999); Zambruno, G. e outros, J. Cell Biol. 129(3): 853-865 (1995); Hakkinen, L. e outros, J. Histochem. Cytochem. 48(6) :985-998 (2000)). Um número crescente de relatórios recentes demonstra que ανβε é regulado ascendentemente em cânceres de origem epitelial, incluindo carcinoma de cólon (Niu, J. e outros, Int. J. Câncer 92:40-48 (2001); Bates, R.C. e outros, J. Clin. Invest. 115:339-347 (2005)), câncer de ovário (Ahmed, N. e outros, J. Cell. Biochem. 84:675-686 (2002); Ahmed, N. e outros, J. Histochem. Cytochem. 50:1371-1379 (2002); Ahmed, N. e outros, Carcinogen. 23:237-244 (2002)), carcinoma de célula escamosa (Koivisto, L. e outros, Exp. Cell. Res. 255:10-17 (2000); Xue, H. e outros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 288:610-618 (2001); Thomas, G.J. e outros, J. Invest. Dermatol. 117:67-63 (2001); Thomas, G.J. e outros, Int. J. Câncer 92:641-650 (2001); Ramos, D. M. e outros, Matrix Biol. 21:297-307 (2002); (Agrez, M. e outros, Br. J. Câncer 81:90-97 (1999); Hamidi, S. e outros, Br. J. Câncer 82(8) :1433-1440 (2000); Kawashima, A. e outros, Pathol . Res. Pract. 99(2): 57-64 (2003)), e câncer de mama (Arihiro, Κ. e outros, Breast Câncer 7:19-26 (2000)). Foi também reportado que a subunidade av pode estar envolvida em metástase de tumor, e que o bloqueio dessa subunidade pode evitar metástase (para exame, vide ImhofiB.A. e outros, em: "Attempts to Understand metastasis formation 1," U. Gunthert e W. Birchmeier, eds., Berlin: Springer- Verlag, pág. 195-203 (1996)).

A integrina ανβε pode ter múltiplas funções reguladoras em biologia de células de tumor. Estudos recentes demonstraram que os domínios, extracelular e citoplásmica da subunidade β6, mediam diferentes atividades celulares. Os domínios de transmembrana e extracelular foram mostrados como mediando a ativação de TGF-β e adesão (Sheppard, D., Câncer and Metastasis Rev. 24:395-402 (2005); Munger, J.S. e outros, Cell 96:319-328 (1999)). O domínio citoplásmico da subunidade β6 contém uma seqüência de 11 aminoácidos exclusiva que é importante para mediar proliferação de células reguladas ροΓανβ6, produção de MMP, migração e pró-sobrevivência (Li, X. e outros, J. Biol. Chem. 278(43):41646-41653 (2003); ThomaS, G.J. e outros, J. Invest. Derm. 117(1):67-73 (2001); Thomas, G.J. e outros, Br. J. Câncer 87 (8):859-867 (2002); Janes, S.M. e Watt, F.M., J. Cell. Biol. 166(3):419-431 (2004). A subunidade β6 foi clonada, expressa e purificada (Sheppard, e outros, patente dos ESTADOS UNIDOS número 6.787.322 B2, cuja revelação é incorporada aqui a título de referência na íntegra), e anticorpos de bloqueio de função que seletivamente se ligam a integrina ανβ6 foram reportados (Weinreb e outros, J. Biol. Chem. 279:17875-17877 (2004), 3 0 cuja revelação é aqui incorporada a título de referência na íntegra). Antagonistas de ανβ6 (incluindo certos anticorpos monoclonais) foram também sugeridos como tratamentos possíveis para certas formas de fibrose e lesão aguda no pulmão (vide a patente dos ESTADOS UNIDOS número 6.692.741 B2 e WO 99/07405, cujas revelações são aqui incorporadas a título de referência na íntegra).

ανβ6 pode se ligar a vários ligantes incluindo fibronectina, tenascina, e o peptídeo-1 e -3 associado ã latência (LAP1 e LAP3), os 278 aminoácidos terminais-N da forma precursora latente de TGF-βΙ através de uma interação direta com um motivo de arginina-glicina-aspartato ("RGD") (Busk, M. e outros, J. Biol. Chem. 267(9): 5790-5796 (1992); Yokosaki, Y. e outros, J. Biol. Chem. 271(39): 24144-24150 (1996); Huang, X.Z., e outros, J. Cell Sei. 111 ,-2189-2195 (1998); Munger, J.S. e outros, Cell 96:319- 328 (1999)) . A citocina TGF-β é sintetizada como um complexo latente que tem o LAP terminal-N associado não covalentemente com a citocina de TGF-β terminal-C ativa, madura. 0 complexo TGF-β latente não pode se ligar ao seu receptor cognato e desse modo não é biologicamente ativo até ser convertido em uma forma ativa (Barcellos-Hoff, M.H., J. Mamm. Gland Biol. l(4):353-363 (1996); Gleizes, P.E. e outros, Stem cells, 15(3):190-197 (1997): Munger, J.S. e outros, Kid. Int. 51:1376-1382 (1997); Khalil, N., Microbes Infect. 1(15) : 1255-1263 (1999)). A ligação de ανβε e a LAPl ou LAP3 leva à ativação da forma precursora latente de TGF-βΙ e TGF^3 (Munger, J.S. e outros, Cell 96:319-328 (1999)), proposta como resultado de uma alteração de conformação no complexo latente permitindo que TGF-β se ligue ao seu receptor. Desse modo, a expressão regulada ascendentemente de OvP6 e pode levar à ativação local de TGF-β que, por sua vez, pode ativar uma cascata de eventos a jusante.

A citocina TGF-βΙ é um fator de crescimento pleiotrópico que regula respostas imunes, diferenciação e proliferação de células (Wahl, S.M., J. Exp. Med. 180:1587- 1590 (1994); Massague, J., Annu. Rev. Biochem. 67:753-791 (1998); Chen., W. e Wahl, S.M., TGF-β: Receptors, Signaling Pathways and Autoimmunity, Basel: Karerg, pág. 62-91 (2002); Thomas, D.A. e Massague, J., Câncer Cell 8:369-380 (2005)) . 0 papel que TGF-βΙ desempenha em câncer tem dois lados. TGF-β é reconhecido para atividade inibidora de crescimento e supressora de tumor, entretanto, muitos tumores desenvolvem uma resistência a atividades supressivas de crescimento de TGF-βΙ (Yingling, J.M. e outros, Nature Rev. Drug. Discov. 3(12):1011-1022 (2004); Akhurst, R.J. e outros, Trends Cell Biol. 11(11):S44-S51

(2001); Balmain, A. e Akhurst, R.J., Nature 428 (6980) : 271- 272 (2004)). Em tumores estabelecidos, a atividade e

expressão de TGF-βΐ foram envolvidas na promoção de sobrevivência, avanço e metástases de tumor (Akhurst, R.J. e outros, Trends Cell. Biol. 11(11):S44-S51 (2001); Muraoka, R.S. e outros, J. Clin. Invest. 109(12) :1551

(2002); Yang, Y. A. e outros, J. Clin. Invest. 109(12) : 1607- 1615 (2002)). Isso é postulado como sendo mediado por

efeitos tanto autócrino como parácrino no ambiente estromal-tumor local incluindo os efeitos de TGF-β em vigilância imune, angiogênese e pressão intersticial aumentada de tumor. Vários estudos mostraram agora os efeitos antitumor e anti-metastático de inibir TGF-βΙ (Akhurst, R.J., J. Clin. Invest. 109(12): 1533-1536 (2002); Muraoka, R.S. e outros, J. Clin. Invest. 109(12):1551 (2002); Yingling, J.M. e outros, Nat. Rev. Drug. Discov. 3(12) :1011-1022 (2004); Yang, Y. A. e outros, J.Clin.

Invest. 109(12):1607-1615 (2002); Halder, S.K. e outros, Neoplasia 7(5):509-521 (2005); Iyer, S. e outros, Câncer Biol. Ther. 4(3):261-266 (2005)).

A expressão aumentada de θνβ6 em tumores, particularmente na interface estromal-tumor, pode refletir um mecanismo exclusivo para ativação local de TGF-βΙ e a capacidade de promover sobrevivência de tumor, invasão e metástase. O nível elevado de expressão em metástases humanas infere um papel potencial para OCvP6 em estabelecer metástases que é compatível com relatórios anteriores que ανβε pode mediar transição epitelial para mesenquimatosa, invasão de células de tumor in vitro, e expressão correlacionada com metástases em um modelo de camundongo (Bates, R.C. e outros, J. Clin.Invest. 115(2): 339-347 (2005); Thomas, G.J. e outros, Br. J. Câncer 87 (8) :859-867 (2002); Morgan, M.R. e outros, J. Biol. Chem. 279 (25) :25633-26539 (2004)). Os requerentes descreveram anteriormente a geração de anticorpos monoclonais anti-avPe potentes e seletivos (mAbs) que se ligam às formas tanto humana como de murino de (XvP6 e bloqueiam a ligação de Ονβε

2 5 aos seus ligantes e ativação mediada por ανβ6 de TGF-βΐ

(Weinreb, P.H. e outros, J. Biol. Chem. 279(17):17875-17887 (2004) ) .

A geração de anticorpos monoclonais anti-a^6 potentes e seletivos (mAbs) que se ligam a formas tanto humanas como

3 0 de murino de ανβ6 e bloqueiam a ligação de ανβ6 a seus ligantes e ativação mediada por OvP6 de TGF-βΙ foi anteriormente descrita (Weireb, P.H. e outros, J. Biol. Chem 279 (17) :17875-17887 (2004); vide também o pedido de patente dos ESTADOS UNIDOS número 11/483.190 de Violette e outros, intitulado "Anti-CxvPe Antibodies and uses thereof," depositado em 10 de julho de 2 0 06, que é incorporado aqui a título de referência na íntegra). Como também descrito na publicação PCT WO 03/100033, aqui incorporada na íntegra a título de referência, anticorpos com elevada atividade contra ανβ6 incluindo a identificação e análise de resíduos de aminoácidos principais nas regiões de determinação complementares (CDRs) de tais anticorpos, foram descobertos e caracterizados. Em particular, esses anticorpos com afinidade elevada (a) se ligam especificamente a CxvP6; (b) inibem a ligação de ανβ6 a seu ligante como LAP, fibronectina, vitronectina e tenascina com um valor IC50 mais baixo do que aquele de 10D5 (Publicação do pedido de patente internacional W099/07405); (c) bloqueiam ativação de TGF-P; (d) contêm certas seqüências de aminoácidos nas 2 0 CDRs que fornecem especificidade de ligação a CXvP6; (e) se ligam especificamente à subunidade avp6; e/ou (f) reconhecem ανβ6 em procedimentos de imunocoloração, como imunocoloração de tecidos embebidos em parafina.

WO 03/100033 também descreve a descoberta de que

2 5 anticorpos que se ligam a CXvP6 podem ser agrupados em

classes e subclasses biofisicamente distintas. Uma classe de anticorpos apresenta a capacidade de bloquear ligação de um ligante (por exemplo, LAP) a avp6 (bloqueadores) . Essa classe de anticorpos pode ser dividida adicionalmente em

3 0 subclasses de bloqueadores dependentes de cátion e bloqueadores independentes de cátion. Alguns dos bloqueadores dependentes de cátion contêm uma seqüência de peptídeo de arginina-glicina-aspartato (RGD), ao passo que os bloqueadores independentes de cátion não contêm uma seqüência RGD. Outra classe de anticorpos apresenta a capacidade de ligar-se à Ονβε e ainda não bloquear a ligação de θνβ6 a um ligante (não bloqueadores).

Além disso, WO 03/100033 revela anticorpos que compreendem cadeias pesadas e cadeias leves cujas regiões de determinação complementares (CDR) 1, 2 e 3 consistem em certas seqüências de aminoácidos que fornecem especificidade de ligação a OvP6. WO 03/100033 também provê anticorpos que se ligam especificamente a ανβ6, porém não inibem a ligação de OivP6 a peptídeo associado à latência (LAP) bem como anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo.

WO 03/100033 revela ainda células de hibridomas 6.1A8, 6.2B10, 6.3G9, 6.8G6, g.2Bl, 6.2A1, 6.2E5, 7.1G10, Ί.IGS e 7.1G5, ácidos nucléicos isolados compreendendo uma seqüência de codificação e polipeptídeos isolados

2 0 compreendendo seqüências de aminoácido dos anticorpos anti-

ανβ6. Em particular, WO 03/100033 revela anticorpos anti- avp6 compreendendo seqüências de polipeptídeo cadeia pesada e leve como anticorpos produzidos por hibridomas 6.1A8, 6.3G9, 6.8G6, g.2Bl, 6.2B10, 6.2A1, 6.2E5, 7.1G10, 7.7G5 e 7.1G5. Vários dos hibridomas foram depositados no American Type Culture Collection ("ATCC", Caixa Postal 154 9, Manassas, VA 20108, EUA) de acordo com o Tratado de Budapeste. Em particular, clones de hibridoma 6.3G9 e 6.8G6 foram depositados em 16 de agosto de 2001, e têm números de

3 0 acessão ATCC PTA-3649 e PTA-3645, respectivamente. Os anticorpos de murino produzidos por hibridomas 6.3G9 e 6. 8G6 estão sendo adicionalmente explorados no presente pedido por seu desenvolvimento potencial como anticorpos humanizados.

O anticorpo monoclonal de murino 3G9 é um anticorpo

kappa, IgGl de murino isolado do camundongo -/- de integrina β6 (Huang e outros, J. Cell. Biol. 133:921-928 (1996)) imunizado com OvP6 solúvel humano. 0 anticorpo 3G9 reconhece especificamente o epítopo de integrina (Χνβε que é expresso em níveis regulados ascendentemente durante lesão, fibrose e câncer (vide, por exemplo, Thomas e outros, J. Invest. Dermatology 117:67-73 (2001); Brunton e outros, Neoplasia 3:215-226 (2001); Agrez e outros, Int. J. Câncer 81:90-97 (1999); Breuss, J. Cell Science 108:2241- 2251 (1995) ) . Não se liga a outras integrinas av e é reativo-cruzado com moléculas, não somente humanas como de murino. 0 anticorpo monoclonal de murino 3G9 foi descrito para bloquear a ligação de ανβε a LAP como determinado por bloqueio de ligação de ligante a Ονβε solúveis humanas

2 0 purificadas ou a células que expressam β6, desse modo

inibindo a atividade pró-fibrótica de ativação de receptor TGF-β (vide WO 03/100033). Foi mostrado também como inibindo ativação mediada por θνβ6 de TGF-β com um valor de IC50 mais baixo do que um dos anticorpos θνβ6 conhecidos, 10D5 (Huang e outros, J. Cell. Sei. 111:2189-2195 (1998)).

O anticorpo monoclonal de murino 8G6 é um anticorpo kappa, IgGl de murino que também reconhece o epítopo de integrina θνβ6, como descrito em WO 03/100033. 0 anticorpo monoclonal de murino 8G6 é um bloqueador de afinidade

3 0 elevada, dependente de cátion de ανβ6 que exibe a capacidade de inibir ativação mediada por OvP6 de TGF-β com um valor de IC50 mais baixo do que 10D5 (vide WO 03/10033) .

Os anticorpos de murino tanto 3G9 como 8G6 foram eficazes na prevenção de fibrose do rim e pulmão, como descrito em WO 03/100033. Além disso, o anticorpo de murino 3G9 foi capaz de inibir eficazmente crescimento de tumor em um modelo xenoenxerto de tumor humano, sugerindo o papel potencial de ανβ6 em patologia de câncer e a eficácia desse bloqueio utilizando anticorpos dirigidos para θνβ6. Smad4 é um componente da via Smad que está envolvido

em transdução de sinal na via TGF-β (Levy, L. e Hill, C.S., Molec. Cell. Biol. 25:8108-8125 (2005); Fukuchi, M. e outros, Câncer 95:737-743 (2002)). Esse gene, também conhecido como dpc4 (para "carcinoma pancreático diminuído"), parece ser um gene supressor de tumor, e uma diminuição em expressão de smad4 foi observada em uma variedade de carcinomas primários, incluindo carcinomas pancreáticos (Luttges, J. e outros, Am. J. Pathol . 158:1677-1683 (2001); Subramanian, G. e outros, Câncer Res . 64:5200-5211 (2004)), carcinomas de esôfago (Fukuchi, M. e outros, Câncer 95:737-743 (2002), carcinomas cervicais (Maliekal, T.T. e outros, Oncogene 22:4889-4897 (2003), e outros cânceres humanos primários (Iacobuzio-Donahue, C.A. e outros, Clin. Canc. Res. 10:1597-1604 (2004), bem como em modelos de câncer de linhagem de células incluindo cânceres pancreáticos (Lohr, M. e outros, Câncer Res. 61:550-555 (2001) ; Yasutome, M. e outros, Clin. Exp. Metastasis 22:461-473 (2005)), e de cânceres de cólon (Levy, L., e Hill, C.S., Molec. Cell. Biol. 25:8108-8125 (2005)). Uma 3 0 expressão reduzida de smad4 em tumores foi associada a prognóstico ruim para sobrevivência de pacientes, particularmente em pacientes com adenocarcinomas pancreáticos com deficiência de smad4 (Liu, F., Clin. Câncer Res. 7:3853-3856 (2001); Tascilar, M. e outros, Clin. Câncer Res. 7:4115-4121 (2001); Toga, T. e outros, Anticancer Res. 24:1173-1178 (2004)). O mecanismo da atividade supressiva de tumor do produto de gene smad4 é pouco entendido, porém pensa-se que pode atuar como um "interruptor" que regula as atividades supressivas de crescimento e ativação de crescimento de certos componentes da via de sinalização de TGF-β (para exames, vide Akhurst,

A.J., J. Clin. Invest. 109:1533-1536 (2002); Bachman, K.E., e Park, B.H., Curr. Opin. Oncol. 17:49-54 92004); Bierie,

B. e Moses, H.1., Nature Rev. Câncer 6:506-520 (2006)).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos de diagnóstico, tratamento e prevenção de câncer utilizando ligantes de ligação de Ονβδ/ como anticorpos de ligação avp6 · Em particular, a invenção refere-se à descoberta de uma correlação entre expressão reduzida de smad4 e expressão aumentada de integrina ανβ6 em células de tumor, e a propensão de células de tumor com esses padrões de expressão de ser mais provável de responder a compostos ativos de θνβ6 e a ligantes inibidores de TGF-β.

Desse modo, em uma modalidade, a invenção provê métodos de caracterizar um tumor, por exemplo, identificar um tumor que é mais provável de progredir para um tumor metastático ou invasivo, ou identificar um tumor para tratamento com um agente pré-selecionado, por exemplo, um agente anti-a^6 descrito aqui, compreendendo: (a) obter de um paciente uma amostra de tecido canceroso compreendendo um tumor ou uma porção do mesmo, e opcionalmente uma amostra de tecido não canceroso; (b) determinar o nível de expressão de smad4 em células a partir da amostra de tecido canceroso e opcionalmente da amostra de tecido não canceroso; (c) contatar células a partir da amostra ou amostras de tecido com um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina θνβ6; e (d) determinar o nível de expressão de integrina ανβ6 nas células a partir da amostra de tecido canceroso, e opcionalmente a partir das células da amostra de tecido não canceroso, e comparar o nível de expressão na amostra de tecido canceroso com uma amostra de referência, por exemplo, o nível de expressão na amostra de tecido não canceroso, desse modo caracterizando o tumor. Um nível de expressão na amostra cancerosa que atende ou excede um valor de referência indica a presença de um tumor mais provável de progredir para um tumor metastático ou invasivo. Por exemplo, uma diminuição em expressão de smad4 e um aumento concomitante no nível de

2 0 expressão de integrina OtvP6 em células a partir da amostra

de tecido canceroso, em relação aos níveis de expressão de smad4 e integrina ανβ6 na amostra de tecido não canceroso, indica a presença no paciente de um tumor que é mais provável de progredir para um tumor invasivo ou metastático. Em certas dessas modalidades da invenção, a célula de tumor é um carcinoma, como um adenocarcinoma. Em modalidades mais específicas, o carcinoma é um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma cervical, um carcinoma de células escamosas (como um

3 0 carcinoma de esôfago), um carcinoma de cabeça e pescoço, um carcinoma de fígado, um carcinoraa de ovário e um carcinoma de pulmão. Mais particularmente, o carcinoma é um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma cervical, ou um carcinoma de cabeça e pescoço. Modalidades apropriadas de acordo com esse aspecto da invenção utilizam ligantes de ligação de integrina CtvP6 que são anticorpos de ligação de OcvP6 ou fragmentos de ligação de epítopo OtvP6 dos mesmos. De acordo com certas dessas modalidades, os anticorpos são anticorpos monoclonais (que podem ser quiméricos, primatizados, humanos ou humanizados) , incluindo aqueles revelados na publicação de pedido de patente dos ESTADOS UNIDOS 2005/0255102 Al, cuja revelação é aqui incorporada na íntegra. Tais anticorpos apropriados incluem, porém não são limitados a, anticorpos monoclonais de ligação de avp6 designados 1A8, 3G9, 8G6, 2B1, 2B10, 2A1, 2E5, 1G10, 7G5, 1C5, 10D5 (número de depósito ATCC HB123 82) e CSp6, bem como fragmentos, quimeras e híbridos dos mesmos. Particularmente apropriados para uso em tais modalidades da invenção são anticorpos monoclonais 3G9 e 2 0 8G6. São também particularmente apropriados para uso em tais modalidades da invenção são anticorpos monoclonais humanizados, como ao anticorpo 3G9 humanizado designado hu3G9 (BG000111) e o anticorpo 8G6 humanizado designado hu8G6. Em certos desses aspectos da invenção, o ligante é 2 5 conjugado com pelo menos um rótulo detectável, como um rótulo cromogênico (por exemplo, diaminobenzidina ou 4- hidroxiazo-benzeno-2-ácido carboxílico), um rótulo de enzima (por exemplo, desidrogenase malato, nuclease estafilococal, isomerase delta-5-esteróide, desidrogenase de álcool-levedura, desidrogenase de fosfato alfa glicerol, isomerase de fosfato de triose, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glicose, β- galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6- desidrogenase de fosfato, glicoamilase e esterase de acetil colina), um rótulo radioisotópico (por exemplo, 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc e 109Pd) , um rótulo isotópico não radioativo (por exemplo, 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, 56Fe, 99mTc e 112In) , um rótulo fluorescente (por exemplo, um rótulo 152Eu, um rótulo de f luoresceína, um rótulo de isotiocianato, um rótulo de rodamina, um rótulo de ficoeritrina, um rótulo de ficocianina, um rótulo de aloficocianina, um rótulo de Proteína fluorescente verde (GFP) , um rótulo de o-ftaldeído e um rótulo de fluorescamina), um rótulo tóxico (por exemplo, um rótulo de toxina de difteria, um rótulo de ricina e um rótulo de toxina de cólera), um rótulo quimiluminescente (por exemplo, um rótulo de luminol, um rótulo de isoluminol, um rótulo de éster acridínio aromático, um rótulo de imidazol,

2 0 um rótulo de sal acridínio, um rótulo de éster oxalato, um

rótulo de luciferina, um rótulo de luciferase e um rótulo de aequorinaa), um rótulo radiográfico-X (por exemplo, bário ou césio), rótulo de spin (por exemplo, deutério), ou um rótulo de agente de contraste de ressonância magnética nuclear (por exemplo, Gd, Mn e ferro).

Em modalidades relacionadas, a invenção provê métodos terapêuticos para eliminar tumores de pacientes, por exemplo, onde os tumores têm um potencial aumentado para se tornar metastático ou invasivo. Tais métodos compreendem,

3 0 por exemplo, caracterizar uma amostra de tecido como descrito aqui, por exemplo: (a) identificar, em uma amostra de tecido a partir de um paciente, um tumor que é mais provável de progredir para um tumor invasivo ou metastático, de acordo com os métodos para identificar tais tumores que são descritos acima; e (b) administrar a um paciente, no qual tal tumor foi identificado, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se liga a uma ou mais subunidades de integrina ανβ6 em uma ou mais células de tumor metastático positivas de ανβ6,

em que a ligação do ligante à integrina resulta na morte, quimiossensibilização ou capacidade de invasão diminuída da célula de tumor metastático. Em uma modalidade preferida, o mesmo agente, por exemplo, o mesmo anticorpo é utilizado para caracterizar o tumor e tratar o paciente. Em outras

modalidades, agentes ou anticorpos diferentes são utilizados. Por exemplo, a caracterização pode ser realizada com um anticorpo tendo um primeiro rótulo, e o tratamento pode ser executado com um anticorpo tendo um segundo rótulo, por exemplo, um agente terapêutico.

2 0 Em modalidades relacionadas, a invenção provê métodos

de reduzir ou evitar o avanço de um tumor pré-metastático para um tumor metastático em um paciente, compreendendo: (a) caracterizar uma amostra de tecido como descrito acima, por exemplo, identificar em uma amostra de tecido a partir

2 5 de um paciente, um tumor que é mais provável de progredir

para um tumor metastático ou invasivo, de acordo com os métodos para identificar tais tumores que são descritos acima; e (b) administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se liga

3 0 a uma ou mais subunidades de integrina OvP6 em uma ou mais células no tumor pré-metastático ou pré-invasivo, onde a ligação do ligante à integrina resulta na redução ou prevenção de invasão de células do câncer pré-metastático em áreas de tecido que circundam o tumor primário. Em modalidades terapêuticas de acordo com esse aspecto da invenção, os ligantes de ligação de Ονβε (por exemplo, anticorpos de ligação de (Χνβδ) podem ser conjugados com ou ligados a um ou mais compostos ou agentes citotóxicos que levam a ou causam a morte da célula ou tecido após ligação do conjugado de composto tóxico-ligante de ligação de ανβε com uma ou mais integrinas OvP6 na célula ou tecido. Em algumas modalidades, o anticorpo utilizado para caracterizar o tumor não terá o agente ou composto citotóxico. Em modalidades terapêuticas adicionais da invenção, os ligantes de ligação de Ονβε (por exemplo, anticorpos de ligação de ανβ6) são administrados a um paciente em combinação com um ou mais desses agentes ou compostos citotóxicos. Agentes ou compostos citotóxicos que podem ser apropriadamente utilizados de acordo com esses aspectos da invenção incluem, porém não são limitados a, agentes citotóxicos (por exemplo, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, paclitaxel, gemcitabina, adriamicina, melfalan, metotrexato, 5-fluorouracil, etoposide,

mecloroetamina, ciclofosfamida, bleomicina, caliqueamicina, maitansina, tricoteno, CC1065, cadeia de difteria A, cadeia de exotoxina A Pseudomonas aeruginosa, cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleuritesfordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana, inibidores de momordica charantia, curcina, crotina, inibidores de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina,

adriamicina (também conhecido como, e utilizado de forma intercambiável aqui com doxorrubicina) , gemcitabina, fenomicina, enomicina, tricoteceno, ribonuclease, e desoxirribonuclease) , radioisótopos (como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, e isótopos radioativos de Lu) e enzimas de ativação de pró-medicamento (como fosfatase alcalina, arilsulfatase, desaminase citosina, proteases, D-alanilcarbóxi-peptidases, enzimas de clivagem de carboidrato, P-Iactamase e amidase de penicilina. Agentes citotóxicos podem ser também agentes que recrutam células específicas ou aumentam genericamente a resposta imune a um tumor. Em certas modalidades, um ou mais ligantes de ligação de integrina θνβ6 são administrados a um paciente na forma de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um ou mais dos ligantes de ligação de integrina ανβ6 e um ou mais excipientes ou portadores farmaceuticamente aceitáveis. Um ou mais ligantes de ligação de integrina ανβ6 e/ou uma ou mais composições farmacêuticas compreendendo um ou mais ligantes de ligação de integrina OvP6 podem ser administradas ao paciente por qualquer modo apropriado de administrar composições farmacêuticas, incluindo porém não limitado à administração oral, administração parenteral (incluindo, por exemplo, injeção através de uma via intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea), administração intracraniana, administração transdérmica, administração intrapulmonar e administração intranasal.

3 0 Em modalidades adicionais, a presente invenção provê métodos de diagnosticar ou identificar um tumor, como um carcinoma (por exemplo, um adenocarcinoma), que é mais provável de progredir para um carcinoma invasivo, e/ou que é mais provável de responder a tratamento com um ligante que se liga a uma ou mais subunidades de integrina ανβ6· Tais métodos apropriados podem compreender, por exemplo, (a) obter de um paciente uma amostra de tecido epitelial canceroso que compreende um tumor ou uma porção do mesmo, e uma amostra de tecido epitelial não canceroso; (b) determinar o nível de expressão de smad4 em células a partir das amostras de tecido; (c) contatar as amostras de tecido com um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina Ονβε; e (d) determinar o nível de expressão de integrina OtvP6 nas amostras de tecido, onde uma diminuição no nível de expressão de integrina ανβε na amostra de tecido canceroso, em relação aos níveis de expressão de smad4 e integrina ανβ6 na amostra de tecido não canceroso, indica a presença no paciente de um tumor que: (a) tem probabilidade aumentada de progredir de uma forma in situ ou não invasiva, para uma forma metastática, invasiva; e/ou (b) é mais provável de responder a tratamento com um ou mais métodos de tratamento referenciados acima que se baseia na ligação de um ligante de ligação de θνβ6, particularmente um ligante de ligação 2 5 de θνβ6 que é conjugado a ou que é administrado em combinação com um ou mais compostos ou agentes citotóxicos como aqueles descritos acima. Tais métodos são apropriados para diagnosticar ou identificar uma variedade de tumores, incluindo porém não limitado àqueles que envolvem os tecidos epiteliais mencionados acima. Em certas dessas modalidades, o ligante que se liga a uma ou mais subunidades de integrina Ονβε é um anticorpo de ligação de integrina CtvP6 (que pode ser um anticorpo monoclonal como aqueles descritos acima) ou um fragmento de ligação de epitopo ανβ6 do mesmo. São particularmente apropriados para uso em tais métodos de diagnóstico da invenção ligantes de ligação de ανβε (por exemplo, anticorpos) que são rotulados de forma detectável, isto é, que compreendem, são conjugados a, ou são ligados a pelo menos um rótulo detectável como um rótulo cromogênico (por exemplo, diaminobenzidina ou 4-hidroxiazo-benzeno-2-ácido

carboxílico), um rótulo de enzima (por exemplo, desidrogenase malato, nuclease estafilococal, isomerase delta-5-esteróide, desidrogenase de álcool-levedura, desidrogenase de fosfato alfa glicerol, isomerase de fosfato de triose, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glicose, β-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6- desidrogenase de fosfato, glicoamilase e esterase de acetil colina), um rótulo radioisotópico (por exemplo, 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc e 109Pd) , um rótulo isotópico não radioativo (por exemplo, 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, 56Fe, 99mTc e 112In) , um rótulo fluorescente (por exemplo, um rótulo 152Eu, um rótulo de fluoresceína, um rótulo de isotiocianato, um rótulo de rodamina, um rótulo de ficoeritrina, um rótulo de ficocianina, um rótulo de aloficocianina, um rótulo de Proteína fluorescente verde (GFP), um rótulo de o-ftaldeído e um rótulo de fluorescamina), um rótulo tóxico (por 3 0 exemplo, um rótulo de toxina de dif teria, um rótulo de ricina e um rótulo de toxina de cólera), um rótulo quimiluminescente (por exemplo, um rótulo de luminol, um rótulo de isoluminol, um rótulo de éster acridínio aromático, um rótulo de imidazol, um rótulo de sal acridínio, um rótulo de éster oxalato, um rótulo de luciferina, um rótulo de luciferase e um rótulo de aequorina), um rótulo radiográfico-X (por exemplo, bário ou césio) , rótulo de spin (por exemplo, deutério) , ou um rótulo de agente de contraste de ressonância magnética nuclear (por exemplo, Gd, Mn e ferro).

Em um aspecto, a invenção apresenta um método de inibir crescimento de uma célula a partir de um tumor que é deficiente em smad4. 0 método inclui, por exemplo, determinar o nível de expressão de smad4 em uma célula a partir do tumor, e tratar uma célula de tumor que é deficiente em expressão de smad4 com um ou mais agentes que causam inibição de crescimento ou morte da célula de tumor. Um ou mais agentes podem ser, por exemplo, um ligante que se liga a uma ou mais subunidades de integrina ανβ6, como um anticorpo anti-a^6, ou um fragmento de ligação de epítopo de ανβ6 do mesmo. Em outra modalidade, um ou mais agentes inibem a via de sinalização TGF-β na célula. Tais agentes incluem, por exemplo, moléculas de proteína cinase, compostos terapêuticos de molécula pequena, ou polipeptídeos de receptor de TGF-β.

Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de quimiossensibilizar uma célula de tumor deficiente em smad4 para tratamento com um composto quimioterapêutico de inibição de crescimento. 0 método inclui, por exemplo, 3 0 determinar o nível de expressão de smad4 em uma célula a partir do tumor, e tratar uma célula de tumor que é deficiente em expressão smad4 com um ou mais agentes, de tal modo que o tratamento resulta em capacidade de resposta aumentada a um ou mais compostos quimioterapêuticos de inibição de crescimento. Um ou mais agentes podem ser, por exemplo, ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina avps ou agentes que inibem a via de sinalização de TGF-β.

Outras modalidades preferidas da presente invenção serão evidentes para uma pessoa com conhecimentos comuns à luz dos seguintes desenhos e descrição da invenção e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é um compósito de fotomicrografias que representam os níveis de expressão de ανβε (áreas escuras) em certos carcinomas humanos que apresentaram metástase em linfonodo (figuras IA-1D) ou pulmões (figuras 1E-1F), a partir dos sítios de tumor primário indicados.

A figura 2 é um compósito de fotomicrografias que representam os níveis de expressão de OtvP6 (áreas escuras) em certos carcinomas humanos que apresentaram metástase a partir do sítio de tumor primário indicado para o sítio de tumor metastático indicado.

A figura 3 é um compósito de duas fotomicrografias que representam os níveis de expressão de Ονβε (áreas escuras) observadas em seções de tecido de adenocarcinoma ductal no local (DCIS; BrCa 19) (figura 3A) e carcinoma de mama invasivo (BrCa 23) (figura 3B) .

A figura 4 é um compósito de fotomicrografias que 3 0 representam os níveis de expressão de Ονβε (áreas escuras) observadas em amostras casadas de tumores de adenocarcinoma ductal pancreático, primários e metastáticos a partir de três pacientes diferentes. Figuras 4A-4C: expressão em amostras de tumor primário de três pacientes diferentes.

Figuras 4D-4F: expressão em metástases de linfonodo casados desses mesmos três pacientes. Figuras 4G-4H: expressão em tecido pancreático normal obtido de dois dos três pacientes.

A figura 5 é um compósito de fotomicrografias que representam os níveis de expressão de θνβ6 (áreas escuras) observadas em amostras casadas de tumores de adenocarcinoma pancreático primário e metastático a partir de cinco pacientes diferentes.

Figuras 5A-5E: expressão em amostras de tumor primário de cinco pacientes diferentes, três com tumores caracterizados como adenoescamosos (figuras 5A-5C), e dois com tumores caracterizados como pouco diferenciados (figuras 5D-5E). Figuras 5F-5J: expressão em metástase de linfonodo casado desses mesmos cinco pacientes. Figuras 5K- 2 0 5L: expressão em tecido pancreático normal obtido de dois dos cinco pacientes.

A figura 6 demonstra a capacidade de um anticorpo monoclonal anti-avp6 (3G9) em inibir crescimento de tumor no modelo de xenoenxerto de camundongo BxPC-3 de câncer pancreático humano. Figura 6A: fotomicrografia de uma seção de tumor xenoenxerto colorido via imunoistoquímica com um anticorpo monoclonal anti-a^e (3G9) . Figura 6B: curvas de crescimento de tumor xenoenxerto BxPC-3 durante tratamento com 3G9 mAb ανβ6 (Ό, proteína de fusão de TGFbTII-Fc-Ig solúvel, (▼), ou PBS de veículo (■). Figura 6C: diagrama de dispersão de tamanhos de tumor individual ao término do estudo (dia 66) .

A figura 7 é uma série de fotomicrografias de seções de tumor/tecido pancreático a partir de três amostras de pacientes diferentes, sondadas em relação à expressão de integrina OtvP6 (três painéis superiores) ou de smad4 (três painéis inferiores) .

A figura 8 é uma série de fotomicrografias de seções de tumor/tecido pancreático de três amostras de pacientes diferentes (e diferentes daqueles na figura 7), sondadas em relação à expressão de integrina OtvP6 (três painéis superiores) ou de smad4 (três painéis inferiores).

A figura 9 é uma série de fotomicrografias de seções de tumor/tecido pancreático de três amostras de pacientes diferentes (e diferentes daquelas nas figuras 7 e 8) , sondadas em relação à expressão de integrina avp6 (três painéis superiores) de smad4 (três painéis inferiores).

A figura 10 é uma série de fotomicrografias de seções de tumor/tecido pancreático a partir de duas amostras de pacientes diferentes (e diferentes daquelas nas figuras 7- 9) , sondadas em relação à expressão de integrina CtvP6 (dois painéis superiores) ou de smad4 (dois painéis inferiores) .

A figura 11 é uma série de fotomicrografias de seções de tumor/tecido pancreático de duas amostras de pacientes diferentes (e diferentes daquelas nas figuras 7-10), que são heterogêneas ("+/-") com relação à expressão de integrina OtvP6, sondadas em relação à expressão de integrina OtvP6 (dois painéis superiores) ou de smad4 (dois painéis inferiores). A figura 12 é uma série de fotomicrografias de seções de tumor/tecido pancreático a partir de uma única amostra de paciente (diferente daquelas na figura 11) , que são heterogêneas ("+/-") com relação à expressão de integrina ανβ6, sondadas em relação à expressão de integrina OvP6 ou de smad4.

A figura 13 é uma tabela que resume os resultados representados nas figuras 7-12.

A figura 14 é um sumário de níveis de expressão de ανβ6 e smad4 em um painel de linhagens de células de câncer pancreático.

A figura 15 é um compósito de fotomicrografias representando os níveis de expressão de θνβ6 e smad4 em cânceres pancreáticos como ensaiado por conjunto Folio.

A figura 16 é um diagrama esquemático que resume níveis de expressão de (Χνβε e smad4 em 23 amostras de tecido de tumor pancreático diferentes.

A figura 17 é um diagrama esquemático que resume níveis de expressão de Ονβε e smad4 em 7 0 amostras de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) diferentes 2 0 ensaiadas em microconjuntos de tecido Biomax.

A figura 18 é um diagrama esquemático que resume níveis de expressão de Ονβε e smad4 em 5 0 amostras de PDAC diferentes ensaiadas em conjuntos Leiden.

A figura 19 é um diagrama esquemático que resume níveis de expressão de θνβ6 e smad4 em 9 amostras de metástase PDAC diferentes ensaiadas em conjuntos Leiden.

As figuras 20A e B são gráficos de barra, OS QUAIS resumem os resultados de níveis de expressão de Ov^6 e smad4 em PDACs como medido por conjunto Biomax e conjunto Leiden, respectivamente. A figura 21 é ura gráfico de linha demonstrando a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, para mAb 3G9 e gemcitabina, como agentes únicos ou em combinação.

A figura 22 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, para mAb 3G9 e gemcitabina, como agentes únicos ou em combinação, expressando os resultados de animais em teste como percentagem de resultados de controle (veículo).

A figura 23 é um diagrama de dispersão que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, para mAb 3G9 e gemcitabina, como agentes únicos ou em combinação, no 45° dia do regime de tratamento.

A figura 24 é ura gráfico de linha demonstrando alteração em peso corporal de animal hospedeiro em resposta ao tratamento com mAb 3G9 ou gemcitabina.

A figura 25 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas BxPC-3, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, para mAb 3G9 e doxorrubicina, como agentes únicos ou em combinação.

A figura 26 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas BxPC-3, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 e doxorrubicina, como agentes únicos ou em combinação, expressando os resultados de animais em teste como percentagem de resultados de controle (veiculo).

A figura 27 é um diagrama de dispersão que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 e doxorrubicina, como agentes individuais ou em combinação, no 45° dia do regime de tratamento.

A figura 2 8 é um gráfico de linha que demonstra

alteração em peso corporal de animal hospedeiro em resposta a tratamento com mAb 3G9 ou doxorrubicina.

A figura 29A é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humano Su86.86, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 e gemcitabina, como agentes individuais ou em combinação, e a proteína de fusão de receptor ll/Fc TGF-β solúvel (TGF-β Rll-Fc). A figura 29B é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas Su86.86, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 e gemcitabina, como agentes individuais ou em combinação, e a TGF-β Rll-Fc que expressam os resultados de animais de teste como percentagem de resultados de controle (veículo) .

A figura 3OA é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas Panc04, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 e TGF-β RII-Fc, e a qualquer 3 0 agente em combinação com gemcitabina. A figura 3OB é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas Panc04, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 e TGF-β RII-Fc, e a qualquer agente em combinação com gemcitabina, expressando os resultados de animais de teste como uma percentagem de resultados de controle (veículo).

A figura 31A é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas Capan-2, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9, TGF-β RII-Fc, e gemcitabina, e a cada entre mAb 3G9 e TGF-β RII-Fc em combinação com gemcitabina. A figura 3IB é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas Capan-2, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9, TGF-β RII-Fc, e gemcitabina, e a cada entre mAb 3G9 e TGF-β RII-Fc em combinação com gemcitabina, expressando os resultados de animais de teste como uma percentagem de resultados de controle (veículo). 2 0 As figuras 3 2A-32C são gráficos de linha que

demonstram a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas SW1990, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 e gemcitabina, cada um individualmente e em combinação, expressando os resultados de animais de teste como percentagem de resultados de controle (veículo).

A figura 33A é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humano Capan-1, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9, TGF-β RII-Fc, e gemcitabina, e a cada entre mAb 3G9 e TGF-β RII-Fc em combinação com gemcitabina. A figura 33B é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas Capan-I, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atimicos, a mAb 3G9, TGF-β RII-Fc, e gemcitabina, e a cada entre mAb 3G9 e TGF-β RII-Fc em combinação com gemcitabina, expressando os resultados de animais de teste como percentagem de resultados de controle (veículo). A figura 34 é um gráfico de barras que demonstra a

resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas ASPC-I implantadas de forma ortotópica em camundongos sem pêlo atimicos a mAb 3G9, TGF-β RII-Fc, e gemcitabina, e a cada entre mAb 3G9 e TGF-β RII-Fc em combinação com gemcitabina.

A figura 35 é uma tabela que resume os resultados representados nas figuras 29-34.

As figuras 36A-36D são curvas Kaplan-Meier que representam a sobrevivência cumulativa de 26 pacientes do 2 0 Leiden University Medicai Center com adenocarcinoma ductal pancreático em função de retenção de avb6 ou deficiências de expressão de avb6, ou retenção de smad4 ou deficiências de expressão de smad4, e combinações desses fenótipos. Somente dados a partir de tumores primários foram analisados.

A figura 37 é uma curva Kaplan-Meier que representa a sobrevivência cumulativa de pacientes com adenocarcinoma ductal pancreático em função de retenção de smad4 ou deficiências de expressão de smad4. Somente dados a partir de tumores primários foram analisados. Log Rank (Mantel- Cox) .

A figura 3 8 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas SW1990, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos (sitio metastático: baço), a mAb 3G9 e proteína de fusão Fc/receptor II TGF-β solúvel (TGF-β RII- Fc) .

A figura 39 é um gráfico de linha que demonstra a reposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas SW1990, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos (sítio metastático: baço), a mAb 3G9 e TGF-β RII-Fc, expressando os resultados de animais de teste como uma percentagem de resultados de controle (veículo).

A figura 40 é um diagrama de dispersão que demonstra a resposta de células de adenocarcinoma pancreático humanas SW1990, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos (sítio metastático: baço), a mAb S69 e TGF-β RII-Fc solúvel, no 42° dia do regime de tratamento.

A figura 41 é uma figura compósita, mostrando A: uma auto-radiografia de um Western blot mostrando expressão smad4 em subpopulações de células SW1990 separadas com base em expressão de ανβδ; Β: imunoistoquímica de expressão de ανβ6 em tumores de SW1990 implantados; e C-E: separação de células mediada por FACS de populações de células SW1990 por expressão de ανβδ e smad4.

A figura 42 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 murino e proteína de fusão Fc/receptor II TGF-β solúvel (TGF-β RII-Fc). A figura 43 é um diagrama de dispersão que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atimicos, a mAb 3G9 de murino, mAb 4B4, e proteína de fusão Fc/receptor II TGF-β solúvel (TGF-β RII-Fc), no 39° dia do regime de tratamento.

A figura 44 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atimicos, a mAb 3G9 de murino, mAb 4B4, e proteína de fusão Fc/receptor II TGF-β solúvel (TGF-β RII-Fc).

A figura 45 é um gráfico de linha demonstrando a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atimicos, a mAb 3G9 de murino, mAb 4B4, mAb 8G6, e proteína de fusão Fc/receptor II TGF-β solúvel (TGF-β RII- Fc) .

A figura 46 é um gráfico de dispersão que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atimicos, a mAb 3G9 de murino, mAb 4B4, mAb 8G6, e proteína de fusão Fc/receptor II TGF-β solúvel (TGF-β RII- Fc) no 34° dia do regime de tratamento.

A figura 47 é um par de gráficos de linha que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atimicos, a mAb 3G9 de murino (topo) e a mAb 3G9 humanizado (BG00011) (parte inferior).

A figura 48 é um diagrama de dispersão que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humano Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 de murino (topo) e a mAb 3G9 humanizado (BG00011) (parte inferior).

A figura 49 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atimicos, a mAb 3G9 de murino e a mAb 3G9 humanizado (BG00011), expressando os resultados de animais de teste como uma percentagem de resultados de controle (veículo como negativo; TGF-β RIl/Fc como positivo).

A figura 50 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 de murino do tipo selvagem. A figura 51 é um gráfico de linha que demonstra a

resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 de murino aglicosil.

A figura 52 é um diagrama de dispersão que demonstra a 2 0 resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 de murino do tipo selvagem e a mAb 3G9 de murino aglicosil.

A figura 5 3 é um gráfico de linha que demonstra a resposta de células de carcinoma faríngeo humanas Detroit 562, implantadas de forma subcutânea em camundongos sem pêlo atímicos, a mAb 3G9 de murino do tipo selvagem e a mAb 3G9 de murino aglicosil, expressando os resultados de animais de teste como uma percentagem de resultados de controle (veículo). A figura 54 é uma tabela que resume os resultados das figuras 42-52.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm os mesmos significados como comumente entendidos por uma pessoa versada na técnica à qual a presente invenção se refere. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos a seguir.

DEFINIÇÕES

Aproximadamente: como utilizado aqui ao se referir a qualquer valor numérico, o termo "aproximadamente" significa um valor de ± 10% do valor mencionado (por exemplo, "aproximadamente 50°C" abrange uma faixa de temperaturas de 45°C a 55°C, inclusive; similarmente, "aproximadamente 100 mM" abrange uma faixa de concentrações de 90 mM a 110 mM, inclusive). Antagonista: como utilizado aqui, o termo

"antagonista" se refere a um composto, molécula, fração ou complexo que reduz, substancialmente reduz ou totalmente inibe os efeitos biológicos e/ou fisiológicos da integrina ανβ6 em uma célula, tecido ou organismo. Antagonistas, que podem ser ligantes para ανβε podem realizar tais efeitos em uma variedade de modos, incluindo, porém não limitados a competir com outro ligante para ligação com OvP6 na superfície da célula; interagir com θνβ6 de tal modo a reduzir, substancialmente reduzir ou inibir a capacidade da integrina de ligar outros ligantes; ligar-se a e induzir uma alteração de conformação em superfície de célula ανββ de tal modo que a integrina assume uma estrutura à qual os outros ligantes não mais podem se ligar (ou podem se ligar somente com afinidade e/ou eficiência reduzida ou substancialmente reduzida); induzir uma alteração fisiológica (por exemplo, aumento em complexos de sinalização intracelular; aumento em inibidores de transcrição; redução em expressão de ανβ6 de superfície de célula; etc.) em células, tecidos ou organismos de tal modo que a ligação de outros ligantes, ou o sinal fisiológico induzido por tais ligantes após ligação ao ανβε na célula, é reduzido, substancialmente reduzido ou totalmente inibido, e outros mecanismos pelos quais antagonistas podem realizar suas atividades, que serão familiares ao técnico comumente versado. Como o técnico comumente versado entenderá, um antagonista pode ter uma estrutura similar a outra fração de ligação de ανβ6 (por exemplo, um ligante de ligação de ανβ6> que antagoniza (por exemplo, o antagonista pode ser uma muteína, variante, fragmento ou derivado do agonista),ou pode ter uma estrutura totalmente não relacionada.

Ligado: como utilizado aqui, o termo "ligado" se refere à ligação ou fixação que pode ser covalente, por exemplo, por acoplar quimicamente, ou não covalente, por exemplo, interações iônicas, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, etc. Ligações covalentes podem ser, por exemplo, éster, éter, fosfoéster, tioéster, tioéter, uretano, amida, amina, peptídeo, imida, hidrazona, hidrazida, ligações de enxofre-carbono, ligações de fósforo-carbono, e similares. O termo "ligado" é mais amplo e inclui termos como "acoplado", "conjugado" e "fixado".

Conjugado/conjugação: como utilizado aqui, "conjugado" se refere ao produto de fixação covalente de uma fração, por exemplo, um produto químico ou radioisótopo, a um ligante que se liga a OvP6, por exemplo, um anticorpo de ligação de OtvP6 ou fragmento do mesmo. "Conjugação" se refere à formação de um conjugado como definido na sentença anterior. Qualquer método normalmente utilizado por aqueles versados na técnica de conjugação de produtos químicos ou

radioisótopos com materiais biologicamente ativos, como proteínas ou polipeptídeos (incluindo anticorpos) pode ser utilizado na presente invenção.

Doença, distúrbio, condição: como utilizado aqui, o termo "doença" ou "distúrbio" se refere a qualquer condição

adversa de um ser humano ou animal incluindo tumores, câncer, alergias, adicção, autoimunidade, infecção, envenenamento ou dano de função corporal ou mental ótima. "Condições", como utilizado aqui, inclui doenças e distúrbios, porém também se refere a estados fisiológicos.

Por exemplo, fertilidade é um estado fisiológico, porém não uma doença ou distúrbio. Composições da invenção apropriadas para evitar gravidez por diminuir a fertilidade seriam, portanto, descritas como um tratamento de uma condição (fertilidade), porém não um tratamento de um

2 5 distúrbio ou uma doença. Outras condições são entendidas

por aqueles com conhecimentos comuns na técnica.

Quantidade eficaz: Como utilizado aqui, o termo "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade de um composto dado, conjugado ou composição que é necessária ou

3 0 suficiente para realizar um efeito biológico desejado. Uma quantidade eficaz de um composto dado, conjugado ou composição de acordo com os métodos da presente invenção seria a quantidade que obtém esse resultado selecionado, e tal quantidade pode ser determinada como uma questão de rotina por uma pessoa versada na técnica, utilizando ensaios que são conhecidos na técnica e/ou que são descritos acima, sem a necessidade de experimentação indevida. Por exemplo, uma quantidade eficaz para tratar ou evitar metástase de câncer poderia ser aquela quantidade necessária para evitar migração e invasão de uma célula de tumor através da membrana de base ou através de uma camada endotelial in vivo. 0 termo também é sinônimo de "quantidade suficiente." A quantidade suficiente para qualquer aplicação específica pode variar dependendo de tais fatores como a doença, distúrbio ou condição em tratamento, a composição específica sendo administrada, a via de administração, o tamanho do sujeito, e/ou a gravidade da doença ou condição. Uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica pode determinar

2 0 empiricamente a quantidade eficaz de um composto

específico, conjugado ou composição da presente invenção, de acordo com a orientação fornecida aqui, sem necessitar de experimentação indevida.

Um ou uma: quando os termos "um" ou "uma" são utilizados nessa revelação, significam "pelo menos um" ou "um ou mais", a menos que de outro modo indicado. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser utilizados de forma intercambiável aqui.

Peptídeo, polipeptídeo, proteína: como utilizado aqui,

3 0 o termo "polipeptídeo" pretende abranger um "polipeptídeo" singular bem como vários "polipeptídeos", e se refere a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). 0 termo "polipeptídeo" se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Desse modo, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteínas", "cadeia de aminoácido" ou qualquer outro termo utilizado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos na definição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser utilizado em vez de ou de forma intercambiável com quaisquer desses termos. O termo "polipeptídeo" também pretende se referir aos produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de bloqueio/proteção conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica 2 0 natural ou produzido por tecnologia recombinante, porém não é necessariamente traduzido a partir de uma seqüência de ácido nucléico designada. Pode ser gerada em qualquer modo, incluindo por síntese química. De acordo com essa definição, polipeptídeos utilizados na presente invenção podem ser de um tamanho de aproximadamente 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não tenham necessariamente essa estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são mencionados como dobrados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, porém em vez disso podem adotar um grande número de conformações diferentes, e são mencionados como não dobrados. Como utilizado aqui, o termo glicoproteína se refere a uma proteína acoplada a pelo menos uma fração de carboidrato que é ligada à proteína através de uma cadeia lateral contendo oxigênio ou contendo nitrogênio de um resíduo de aminoácidos, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina. Polipeptídeos preferidos utilizados de acordo com a invenção incluem polipeptídeos que são ligantes ou que se ligam a uma integrina θνβ6 na superfície de uma célula, incluindo, porém não limitado a anticorpos (especialmente anticorpos monoclonais) que reconhecem e se ligam a um ou mais epítopos em ανβ6 .

Por um polipeptídeo ou fragmento "isolado", variante ou derivado do mesmo se quer dizer um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Nenhum nível específico de 2 0 purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas produzidas de forma recombinante expressas em células hospedeiras são consideradas isoladas para fins da invenção, como são polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica apropriada.

Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção são fragmentos, derivados, análogos ou variantes dos polipeptídeos acima, e qualquer combinação dos mesmos. Os termos: "fragmento", "variante", "derivado" e análogo" ao se referir a anticorpos anti-OvP6 ou polipeptídeos de anticorpo incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades de ligação de antígeno do polipeptídeo ou anticorpo nativo correspondente, isto é, aqueles polipeptídeos que retêm a capacidade de se ligar a um ou mais epí topos em uma integrina ανβ6. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além de fragmentos de anticorpo específicos discutidos em outra parte da presente invenção. Variantes de anticorpos anti- ανβ6 e polipeptídeos de anticorpo úteis de acordo com a presente invenção incluem fragmentos como descritos acima, e também polipeptídeos com seqüências de aminoácido alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Variantes podem ocorrer naturalmente ou serem de ocorrência não natural. Variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidos utilizando técnicas de mutagênese conhecidas na arte. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácidos conservativas ou não conservativas. Derivados de anticorpos anti-OvP6 e polipeptídeos de anticorpo úteis de acordo com a presente invenção são polipeptídeos que foram alterados de modo a apresentar características adicionais não encontradas no polipeptídeo nativo. Os exemplos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes também podem ser mencionados aqui como "análogos de polipeptídeo." Como utilizado aqui um "derivado" de um anticorpo anti-otvPe ou polipeptídeo de anticorpo se refere a 3 0 um polipeptídeo em questão tendo um ou mais resíduos quimicamente derivatizados por reação de um grupo lateral funcional. São também incluídos como "derivados" aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácido de ocorrência natural dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituído por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituído por lisina; 3-metil histidina pode ser substituído por histidina, homoserina pode ser substituído por serina; e ornitina pode ser substituído por lisina.

Smad4 : como utilizado aqui, o gene supressor de tumor

smad4 é sinônimo de outras designações para o mesmo gene supressor de tumor que são conhecidas por aqueles versados na técnica, incluindo, porém não limitados a smadh4 e dpc4 . Como é convencional, os produtos da expressão desse gene

são designados aqui como SMAD4, que é sinônimo de outras designações correspondentes para o produto de expressão desse gene que são conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo, porém não limitado a MADH4 e DPC4.

Substancialmente, substancial: como utilizado aqui,

2 0 diz-se que a conjugação de uma proteína não interfere

"substancialmente" na capacidade da proteína de ligar-se a seu(s) receptor (es) , se a taxa e/ou quantidade de ligação de uma proteína conjugada com um receptor não for menor do que aproximadamente 4 0%, aproximadamente 50%,

aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 7 0%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%,

aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%,

aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente

3 0 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% ou aproximadamente 100% ou mais, da taxa de ligação e/ou quantidade da citocina correspondente, quimiocine, fator de crescimento ou hormônio de polipeptídeo que não foi conjugado.

Tratamento: como utilizado aqui, os termos

"tratamento", "tratar", "tratado" ou "tratando" se referem à profilaxia e/ou terapia, particularmente onde o objetivo é evitar ou diminuir (reduzir) uma alteração fisiológica ou distúrbio indesejável, como a progressão de esclerose múltipla. Resultados clínicos desejados ou vantajosos incluem, porém não são limitados a, alívio de sintomas, diminuição de extensão da doença, estado estabilizado (isto é, sem piora) de doença, retardo ou diminuição de progressão de doença, melhora ou paliação do estado de doença, e remissão (quer parcial ou total), quer detectável ou não detectável. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência em comparação com sobrevivência esperada se não receber tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a condição ou 2 0 distúrbio bem como aqueles propensos a terem a condição ou distúrbio ou aqueles nos quais a condição ou distúrbio deve ser evitado. Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero", se quer dizer qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para quem se deseja diagnóstico, prognóstico ou terapia. Sujeitos mamíferos incluem seres humanos e outros primatas, animais domésticos, animais de fazenda, e zoológico, de esportes, ou animais de casa como cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas e similares. VISAO GERAL

A presente invenção se baseia pelo menos em parte nas descobertas de que há uma relação inversa entre o nível de expressão do gene supressor de tumor smad4 e a integrina (Χνββ em certas células de tumor, e que os níveis de expressão desses dois marcadores podem ser utilizados para determinar ou prever a suscetibilidade a tratamento com ligantes anti-integrina, e com agentes que antagonizam a via de sinalização de TGF-β, dessas células de tumor. Especificamente, verificou-se que as células de tumor que exibem níveis diminuídos de expressão de smad4 expressam concomitantemente quantidades aumentadas da integrina ανββ ; portanto, células de tumor com deficiência de smad4 têm propensão mais elevada para serem responsivas a ligantes que se ligam à integrina Ονβε, comparado com células de tumor que exibem níveis mais elevados de expressão de smad4 (e concomitantemente níveis mais baixos de integrina superficial ανβε). Em modalidades relacionadas, verificou-se também pelos presentes inventores que células de tumor com deficiência de smad4 são também mais prováveis de serem responsivas a ligantes que antagonizam um ou mais componentes da via de sinalização TGF-β, em comparação com células de tumor que exibem níveis de expressão mais elevados de smad4. Como utilizado aqui, uma célula de tumor que é "responsiva" a um ligante que se liga à integrina α,νβε, ou a um ligante que antagoniza um ou mais componentes da via TGF-β, se refere a uma célula de tumor na qual o crescimento, divisão e/ou outras vias metabólicas são adversamente afetadas de tal modo que a célula seja inibida 3 0 de crescer ou dividir e/ou é submetida à apoptose ou outras formas de morte da célula.

Em outras modalidades, a invenção também provê métodos utilizando identificação dessa expressão diferencial na determinação do potencial invasivo e/ou metastático de células de tumor e na identificação daqueles carcinomas, como certos adenocarcinomas (incluindo carcinomas pancreáticos) que podem provavelmente progredir rapidamente e que devem ser tratados de forma agressiva em um paciente. A invenção também provê métodos de identificar esses tumores nos quais as células que compõem o tumor podem ser mais prováveis de responder a tratamento com ou mais ligantes que se ligam à integrina ανβ6. A invenção também provê métodos de diagnóstico e tratamento/prevenção de metástase de tumor. Determinação de expressão de smad4 e integrina θνβ6

Em uma modalidade, a presente invenção é dirigida a métodos para identificar tumores e células de tumor, particularmente células de carcinoma como células de carcinoma pancreático, que são mais prováveis de serem responsivas a ligantes que se ligam à integrina ανβ6, e/ou a ligantes que antagonizam um ou mais componentes da via de sinalização de TGF-β. Tais métodos incluem, por exemplo, determinar os níveis de expressão do gene supressor de tumor smad4 pelas células de tumor, onde uma expressão reduzida de smad4 indica que as células de tumor são mais prováveis de serem responsivas a ligantes que se ligam a integrina θνβ6 e/ou a ligantes que antagonizam um ou mais componentes da via de sinalização TGF-β. Em certas dessas modalidades, o nível de expressão de smad4 em células de um 3 0 tumor, por exemplo, um carcinoma, é determinado em seções de tecido obtidas a partir de um paciente que sofre de tal tumor, onde uma diminuição na expressão de smad4 nas células de tumor em relação àquela em amostras de tecido não tumor (de forma ideal, a partir do mesmo órgão no mesmo paciente) indica que o tumor é mais provável de ser responsivo a ligantes que se ligam à integrina (Χνβε, e/ou a ligantes que antagonizam um ou mais componentes da via de sinalização de TGF-β. Desse modo, protocolos apropriados e agressivos para tratar tais tumores em um paciente podem ser rapidamente identificados e implementados, desse modo fornecendo probabilidade aumentada de resultados de tratamento positivos para pacientes com câncer.

Em cada tal modalidade, a invenção se baseia na identificação ou exploração da expressão diminuída de smad4, e expressão aumentada concomitante de θνβ6 em certas células de tumor. O nível de expressão de smad4 pode ser prontamente determinado utilizando métodos que são bem conhecidos na arte para medir expressão de gene, incluindo, por exemplo, hibridização ou PCR/RT-PCR utilizando sondas genéticas conhecidas ou iniciadores específicos para o gene smad4 (vide, por exemplo, Maliekal, T.T. e outros, Oncogene 22:4889-4897 (2003); Iacobuzio-Donahue, C.A. e outros, Clin. Câncer Res. 10:1597-1604 (2004)); northern blotting (vide, por exemplo, Yasutome, M. e outros, Clin. Exper. Metast. 22:461-473 (2005)), e análise imunoistoquímica com anticorpos SMAD4 (vide, por exemplo, Luttges, J. e outros, Am. J. Pathol. 158: 1677-1683 (2001); Fukuchi, M. e outros, Câncer 95:737-743 (2002); Subramanian, G. e outros, Câncer Res. 64:5200-5211 (2004); Levy, L. e Hill, C.S., Mol. Cell. Biol. 25:8108-8125 (2005); Toga, T. e outros, Anticancer Res. 24:1173-1178 (2004)). Outros métodos apropriados para detectar o nível de expressão de gene smad4 em uma célula dada, tecido, órgão ou amostra biológica serão familiares para aqueles com conhecimentos comuns na arte.

Similarmente, o nível de expressão de OvP6 pode ser facilmente determinado utilizando métodos que são bem conhecidos na arte para medir expressão de integrina. Em certas dessas modalidades, tais determinações são realizadas pelo contato do tecido, tumor ou células de tumor com um ou mais ligantes que se ligam a integrina ανβ6 no tecido, tumor ou células de tumor.

Em certas dessas modalidades, o tecido, tumor ou células de tumor são tecidos, tumores ou células de tumor de carcinoma, incluindo aqueles a partir de carcinomas como adenocarcinomas. Em modalidades mais específicas, o carcinoma é carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma cervical, carcinoma de célula escamosa (como carcinoma esofágico), um carcinoma de cabeça e pescoço, um carcinoma de fígado, um carcinoma de ovário e um carcinoma 2 0 de pulmão. Mais particularmente, o carcinoma é um carcinoma pancreático, carcinoma colorretal, carcinoma cervical ou um carcinoma de cabeça e pescoço.

Em certas modalidades da invenção, os ligantes que se ligam a Ονβε são antagonistas de OcvP6. Tais antagonistas incluem, porém não são limitados a anticorpos que se ligam especificamente a Ονβε,· anticorpos que se ligam especificamente a β6; anticorpos que se ligam a Ov; anticorpos que se ligam a ligantes para ανβ6; ligantes para οίνβε; ácidos nucléicos anti-sentido; e peptídeo, não peptídeo e análogos peptidomiméticos de tais ligantes. Em certas dessas modalidades da presente invenção, o ligante que se liga à integrina ανβ6 é um anticorpo que se liga à integrina Ονβε, ou fragmentos de ligação de integrina ανβ6, variantes ou derivados dos mesmos. Tais anticorpos podem se ligar a uma subunidade da integrina (por exemplo, anticorpos que se ligam a um epítopo localizado na subunidade av ou a um epítopo que é localizado na subunidade β6>, ou a ambas as subunidades (por exemplo, anticorpos que se ligam a um epítopo que está localizado em uma região do heterodímero de integrina que une ambas as subunidades av e β6). A menos que se referindo

especificamente a anticorpos de tamanho total como anticorpos de ocorrência natural, o termo "anticorpos ανβ6" abrange anticorpos de tamanho total bem como fragmentos de ligação de θνβ6, variantes, análogos ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, anticorpo de ocorrência natural ou moléculas de imunoglobulina ou moléculas de anticorpos construídos ou fragmentos que ligam antígeno em um modo similar a moléculas de anticorpo. Anticorpos podem ser sintéticos, monoclonais ou policlonais e podem ser feitos por técnicas bem conhecidas na arte. Para aplicações terapêuticas, anticorpos monoclonais "humanos" tendo regiões constantes e variáveis humanas são freqüentemente preferidos de modo a minimizar a resposta imune de um paciente contra o anticorpo. Tais anticorpos podem ser gerados por imunizar animais transgênicos que contêm genes de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Jakobovits e outros, Ann. N. Y. Acad. Sei. 764:525-535 (1995)). Com relação a anticorpos sintéticos e semi-sintéticos, tais 3 0 termos pretendem abranger, porém não são limitados a fragmentos de anticorpo, anticorpos comutados por isotipo, anticorpos humanizados (por exemplo, camundongo-humano, humano-camundongo, e similares), híbridos, anticorpos tendo várias especificidades, moléculas semelhantes a anticorpo totalmente sintéticas, e similares.

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são utilizados de forma intercambiável aqui. Um anticorpo ou imunoglubina compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas de imunoglobulina básicas em sistemas de vertebrados são relativamente bem entendidos. Vide, por exemplo, Harlow e outros, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição, 1988) . Como será entendido por aqueles com conhecimentos comuns, os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" compreendem várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidas bioquimicamente. Aqueles versados na técnica reconhecerão que cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, (γ, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre os mesmos (por exemplo, γ1-γ4) . É a natureza dessa cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. são bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma dessas classes e isotipos são prontamente discerníveis para o técnico especializado em vista da presente revelação e, por conseguinte, estão compreendidas 3 0 no escopo da presente invenção. Anticorpos que se ligam a ανβ6 ou fragmentos de ligação de ανβ6; variantes ou derivados dos mesmos, que são apropriados para uso na presente invenção incluem, porém não são limitados a anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação de epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligado por dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo um domínio Vl ou Vh, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, e anticorpos anti- idiotípico (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos anti-OvP6 revelados aqui). Moléculas ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente dos ESTADOS UNIDOS 5.892.019. Moléculas de anticorpo ou imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. 2 0 Fragmentos de anticorpo, incluindo anticorpos de

cadeia única, podem compreender a(s) região(ões) variável(eis) individualmente ou em combinação com toda ou uma porção do que se segue: região de articulação, domínios ChI , Ch2 e CH3. São também incluídos na invenção fragmentos de ligação de antígeno também compreendendo qualquer combinação de região(ões) variável(is) com uma região de articulação, domínios ChI , CH2 e CH3. Anticorpos ou fragmentos imunoespecíficos dos mesmos para uso nos métodos de diagnóstico e terapêutico revelados aqui podem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são anticorpos humanos, murino, de rato, burro, coelho, cabra, porquinho-da-índia, camelo, lhama, cavalo, bovino ou de galinha. Mais preferivelmente, os anticorpos são anticorpos humanos, humanizados ou primatizados, ou anticorpos quiméricos, particularmente anticorpos monoclonais. Como utilizado aqui, anticorpos "humanos" incluem anticorpos tendo a seqüência de aminoácido de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrito infra e, por exemplo, na patente dos ESTADOS UNIDOS número 5.939.598 de Kucherlapati e outros. Como utilizado aqui, o termo "anticorpo quimérico" significará qualquer anticorpo onde a região imunorreativa ou sítio é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente invenção) é obtida a partir de uma segunda espécie. Em

2 0 modalidades preferidas o sítio ou região de ligação alvo

será de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.

Anticorpos particularmente preferidos para uso de acordo com a presente invenção são anticorpos monoclonais anti-OvP6 como aqueles revelados em Weinreb e outros, J. Biol. Chem. 279 (17): 17875-17877 (2004) (cuja revelação é incorporada aqui a título de referência na íntegra), incluindo anticorpos monoclonais 6.8G6 ("8G6") e 6. 3G9 ("3G9") revelados na mesma. Anticorpos adicionais que se

3 0 ligam a ανβ6 e que, portanto, são apropriados para uso de acordo cora a presente invenção incluem anticorpos (ou fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos) que se ligam à subunidade β6 de integrina ανβ6 (e que são, portanto considerados "anticorpos anti-p6") como aqueles revelados em Weinacker e outros, J. Cell. Bio.. 269:1-9 (1994), que é incorporado aqui a título de referência na íntegra; e na patente dos ESTADOS UNIDOS número 6.692.741 B2, que é incorporado aqui a título de referência na íntegra, particularmente nas colunas 2-3 e 7-8 do mesmo, incluindo o anticorpo monoclonal designado 10D5 (depósito ATCC número HB123 82, depositado em 6 de agosto de 1997, American Type Culture Collection, Caixa Postal 1549, Manassas, VA 20108) (vide a patente dos ESTADOS UNIDOS número 6.692.741 na col. 3, linhas 7-13, e nas colunas 7-8) e CSp6 (vide a patente dos ESTADOS UNIDOS número 6.692.741 nas colunas 7-8). Modalidades apropriadas, de acordo com esse aspecto da invenção utilizam ligantes de ligação de integrina-avp6 que são anticorpos de ligação de θνβ6 ou fragmentos de ligação de epítopo de OvP6 dos mesmos. Anticorpos adicionais

2 0 apropriados para uso de acordo com esse aspecto da invenção

incluem, porém não são limitados aos anticorpos monoclonais de ligação de ανβ6 revelados na publicação do pedido de patente dos ESTADOS UNIDOS 2005/0255102 Al, cuja revelação é aqui incorporada na íntegra, incluindo aqueles designados na mesma como 3G9, 8G6, 1A8, 2B1, 2B10, 2A1, 2E5, 1G10, 7G5, 1C5, bem como fragmentos, quimeras e híbridos dos mesmos. Anticorpos particularmente apropriados para uso de acordo com a presente invenção são anticorpos monoclonais 2B1, 3G9 e 8G6.

3 0 Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem as mesmas seqüências de polipeptídeos de cadeia pesada e leve como um anticorpo produzido por hibridoma 6.1A8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 6.2B10, 6.2A1, 6.2E5, 7.IGlO, 7.7G5, ou 7.1C5. Anticorpos particularmente apropriados para uso de acordo com a presente invenção são anticorpos monoclonais que compreendem as mesmas seqüências de polipeptídeo de cadeia pesada e leve como anticorpos 2B1 produzidos por hibridoma 6.2B1 (depósito ATCC número PTA-3646, depositado em 16 de agosto de 2001, American Type Culture Collection, Caixa Postal 1549, Manassas, VA 20108), anticorpos 8G6 produzidos por hibridoma 6.8G6 (ATCC depósito número PTA- 3645, depositado em 16 de agosto de 2001, American Type Culture Collection, Caixa Postal 1549, Manassas, VA 20108) e anticorpos 3G9 produzidos por hibridoma 6.3G9 (depósito ATCC número PTA-3649, depositado em 16 de agosto de 2001, American Type Culture Collection, Caixa Postal 154 9, Manassas, VA 2 0108) (vide o pedido dos ESTADOS UNIDOS publicado número US 2005/0255102 Al, cuja revelação é incorporada aqui a título de referência na íntegra, particularmente na página 1, parágrafo 0008; na página 2, parágrafos 0032 e 0036; e nos exemplos nas páginas 6-14) e o anticorpo designado como 10D5 (o hibridoma secretando cujo anticorpo foi depositado em 6 de agosto de 1997, como ATCC depósito número HB12382, American Type Culture Collection, Caixa Postal 1549, Manassas, VA 20108) (vide a patente dos ESTADOS UNIDOS número 6.692.741, cuja revelação é incorporada aqui a título de referência na íntegra, particularmente na col. 3, linhas 7-13, e nas colunas 7-8).

Em algumas modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada cujas regiões de determinação de

30 complementaridade (CDR) 1, 2 e 3 consistem essencialmente (isto é, com a exceção de algumas variações conservativas) das seqüências mostradas na tabela 1 abaixo. Em certas dessas modalidades, os anticorpos compreendem uma cadeia pesada cujo CDRl consiste essencialmente de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-5, cujo CDR2 consiste essencialmente em qualquer uma das SEQ ID NOS: 6-11, e cujo CDR3 consiste essencialmente em qualquer uma das SEQ ID Nos: 12-17, e/ou uma cadeia leve cujos CDRs 1, 2 e 3 consistem essencialmente em qualquer uma das seqüências de SEQ ID NOS: 18-23, 24-27 e 28-33, respectivamente.

Tabela 1

Anticorpo Seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:

Seqüências CDRl de Cadeia Pesada

8G6 SYTFTDYAMH 1

1A8 SYTFTDYTMH 2

2B1 GFTFSRYVMS 3

3G9 GFTFSRYVMS 3

2A1 GYDFNNDLIE 4

2G2 GYAFTNYLIE 5

Seqüências CDR2 de Cadeia Pesada

8G6 VIS TYYGNTNYNQKFKG 6

1A8 VIDTYYGKTNYNQKFEG 7

2B1 SISSG-GSTYYPDSVKG 8

3G9 SISSG-GRMYYPDTVKG 9

2Al VINPGSGRTNYNEKFKG 10

2G2 VIS PGSGIINYNEKFKG 11

Seqüências CDR3 de Cadeia Pesada

8G6 GGLRRGDRP S LRYAMDY 12

1A8 GGFRRGDRPSLRYAMDS 13 2Β1 GAIYDG---YYVFAY 14

3G9 GSIYDG—YYVFPY 15

2Al IYYGPH—SYAMDY 16

2G2 ID-YSG-----PYAVDD 17

Seqüências CDRl de Cadeia Leve

8G6 RASQSVSTSS-YSYMY 18

1A8 RASQSVSIST-YSYIH 19

2B1 SAS S SVS S S-YLY 2 0

3G9 SANSSVSSS-YLY 21

2A1 KAS LDVRTAVA 22

2G2 KAS QAVNTAVA 23

Seqüências CDR2 de Cadeia Leve

8G6 YASNLES 24

1A8 YASNLES 24

2B1 STSNLAS 25

3G9 STSNLAS 25

2A1 SASYRYT 2 6

2G2 SASYQYT 27

Seqüências CDR3 de Cadeia Leve

8G6 QHNWEEPFT 2 8

1A8 QHSWEIPYT 29

2B1 HQWSSYPPT 3 0

3G9 HQWSTYPPT 31

2Al QQHYGIPWT 32

2G2 QHHYGVPWT 3 3

Em outras modalidades relacionadas, os anticorpos monoclonais utilizados de acordo com a presente invenção são anticorpos quiméricos, isto é, aqueles nos quais um anticorpo cognato a partir de uma espécie (por exemplo, murino rato ou coelho) é alterado por tecnologia de DNA recombinante de tal modo que parte ou todas as regiões de articulação e/ou constantes das cadeias pesada e/ou leve são substituídas cora os componentes correspondentes de um anticorpo a partir de outra espécie (por exemplo, humana). Genericamente, os domínios variáveis do anticorpo construído permanecem idênticos ou substancialmente desse modo para os domínios variáveis do anticorpo cognato. Tal anticorpo construído é denominado um anticorpo quimérico e

é menos antigênico do que o anticorpo cognato quando administrado a um indivíduo da espécie a partir da qual a região de articulação e/ou constante é derivada (por exemplo, um ser humano) . Os métodos de fazer anticorpos quiméricos são bem conhecidos na arte.

Em outras modalidades relacionadas, os anticorpos

monoclonais utilizados de acordo com a presente invenção são anticorpos totalmente humanos. Os métodos para produzir tais anticorpos monoclonais totalmente humanos são bem conhecidos na arte (vide, por exemplo, US 2005/255102 Al na

2 0 página 4, parágrafos 0069-0070, que são incorporados aqui a

título de referência).

Em outras modalidades relacionadas, os anticorpos monoclonais utilizados de acordo com a presente invenção são versões humanizadas de anticorpos anti-OvP6 cognatos

derivados de outras espécies. Um anticorpo humanizado é um anticorpo produzido por tecnologia de DNA recombinante, na qual alguns ou todos os aminoácidos de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina humana que não são necessários para ligação de antígeno (por exemplo, as regiões

3 0 constantes e as regiões de estrutura dos domínios variáveis) são utilizados para substituir os aminoácidos correspondentes a partir da cadeia leve ou pesada do anticor não humano, cognato. Como exemplo, uma versão humanizada de um anticorpo murino a um antígeno dado tem, tanto na sua cadeia pesada como leve: (a) regiões constantes de um anticorpo humano; (b) regiões de estrutura a partir dos domínios variáveis de um anticorpo humano; e (c) CDRs a partir do anticorpo murino. Quando necessário, um ou mais resíduos nas regiões de estrutura humana podem ser alterados para resíduos nas posições correspondentes no anticorpo de murino de modo a preservar a afinidade de ligação do anticorpo humanizado ao antígeno. Essa alteração é às vezes denominada "mutação traseira". Anticorpos humanizados são genericamente menos prováveis de eliciar uma resposta imune em seres humanos como comparado com anticorpos humanos quiméricos porque os primeiros contêm consideravelmente menos componentes não humanos. Os métodos para produzir tais anticorpos monoclonais humanizados são bem conhecidos na arte (vide, por exemplo, US 2005/0255101 Al nas páginas 4-5, parágrafos 0 072-0077, que são incorporados aqui a título de referência).

Em tais modalidades adicionais, os anticorpos humanizados compreendem uma ou mais CDRs na cadeia pesada e/ou leve que são derivadas das CDRs correspondentes na cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo diferente. Um exemplo não limitador apropriado de tal anticorpo é um anticorpo 3G9 humanizado compreendendo uma CDRl de cadeia leve que tem a seqüência da CDRl de cadeia leve derivada do anticorpo 2B1 (SEQ ID NO: 20) em vez da seqüência da CDRl 3 0 de cadeia leve para o anticorpo 3G9 depositado (SEQ ID NO: 21) . Tal anticorpo 3G9 humanizado tendo uma seqüência CDRl de cadeia leve exposta na SEQ ID NO: 20 é designado aqui como bu3G9 (ou BG00011). Outro exemplo não limitador apropriado de tal anticorpo é um anticorpo 8G6 humanizado compreendendo uma CDRl de cadeia leve que tem a seqüência da CDRl de cadeia leve derivada do anticorpo 2B1 (SEQ ID NO: 20) em vez da seqüência da CDRl de cadeia leve para o anticorpo 8G6 depositado (SEQ ID NO: 18). Tal anticorpo 8G6 humanizado tendo uma seqüência de CDRl de cadeia leve exposta na SEQ ID NO: 20 é designada aqui como hu8G9. Exemplos adicionais de tais anticorpos derivativos, nos quais uma ou mais CDRs de cadeia pesada e/ou cadeia leve foram substituídas com uma ou mais CDRs de cadeia pesada e/ou cadeia leve correspondentes a partir de outro anticorpo, e que são apropriadas para uso de acordo com a presente invenção, serão prontamente evidentes para aqueles com conhecimentos comuns em vista das seqüências representadas na Tabela Iea orientação fornecida aqui. Métodos apropriados para preparar tais anticorpos humanizados, incluindo tais anticorpos humanizados derivativos, são familiares para aqueles com conhecimentos comuns e são expostos, por exemplo, no pedido publicado dos ESTADOS UNIDOS número 2005/0255102 Al, cuja revelação é incorporada aqui a título de referência na íntegra. Em certas modalidades, os ligantes, por exemplo, os

anticorpos, que se ligam a θνβ6 podem ser utilizados em forma não conjugada. Em tais modalidades, as células de tumor são contatadas com o ligante que se liga a θνβ6, sob condições que favorecem à ligação do ligante a ανβ6 na superfície da célula. Tais condições apropriadas são bem

30 conhecidas na técnica, e são descritas em detalhe nos exemplos abaixo. Em certas dessas modalidades, a ligação do ligante sensibiliza a célula de tumor à qual o ligante foi ligado à ação de um ou mais compostos tóxicos, isto é a ligação do ligante a ανβ6 na superfície da célula do tumor induz a célula do tumor a se tornar mais sensível às ações de inibir o crescimento, e/ou induzir a morte de uma ou mais toxinas. Desse modo, em modalidades adicionais, a invenção provê métodos de inibir o crescimento de uma célula de tumor, ou de matar uma célula de tumor, compreendendo (a) contatar a célula de tumor com um ou mais ligantes (por exemplo, um ou mais anticorpos ou fragmentos dos mesmos) que se ligam a ανβ6 na superfície da célula, sob condições que favorecem a ligação do ligante ανβε na superfície da célula, e então (b) contatar a célula do tumor com um ou mais compostos tóxicos que inibe o crescimento de e/ou mata a célula de tumor. Compostos tóxicos apropriados para uso de acordo com esse aspecto da invenção, e dosagens apropriadas e regimes de administração para as mesmas, são conhecidos na técnica e são descritos em detalhe em outra parte da presente invenção.

Em modalidades relacionadas, a invenção provê métodos de sensibilizar células de tumor a um ou mais compostos tóxicos por tratar as células de tumor com um ou mais agentes que modulam (por exemplo, inibem ou ativam) um ou mais componentes da via de sinalização de TGF-β. Tais agentes apropriados incluem, por exemplo, TGF-β ou um fragmento do mesmo, um receptor de TGF-β solúvel ou um fragmento do mesmo, ou uma proteína de fusão compreendendo 3 0 um receptor de TGF-β solúvel ou um fragmento do mesmo, ou uma proteína de fusão compreendendo um receptor de TGF-β solúvel ou um fragmento do mesmo (por exemplo, um fragmento de receptor II tipo TGF-β fundido com a região Fc de um anticorpo, para produzir um polipeptídeo "TGF-β RII-Fc" solúvel). Em uso, a ligação ou internalização do agente de modular TGF-β sensibiliza a célula de tumor pela qual o agente foi ligado ou internalizado à ação de um ou mais compostos tóxicos, isto é, induz a célula de tumor a se tornar mais sensível às ações de inibir o crescimento e/ou induzir a morte de uma ou mais toxinas. Desse modo, em modalidades adicionais, a invenção provê métodos de inibir o crescimento de uma célula de tumor, ou de matar uma célula de tumor, compreendendo (a) contatar a célula de tumor com um ou mais agentes que modula (por exemplo, inibe ou ativa) um ou mais componentes da via de sinalização TGF- β, sob condições que favorecem a ligação ou internalização do agente pela célula de tumor, e então (b) contatar a célula de tumor com um ou mais compostos tóxicos que inibe o crescimento de e/ou mata a célula de tumor. Compostos tóxicos apropriados para uso de acordo com esse aspecto da invenção, e dosagens apropriadas e regimes de administração para os mesmos, são conhecidos na arte e são descritos em detalhe em outra parte da presente invenção.

Conjugados e outras modificações de ligantes de

ligação de ανβ6

Como observado acima, em certas modalidades, os ligantes, por exemplo, os anticorpos, que se ligam a ανβ6 podem ser utilizados em forma não conjugada. Em outras modalidades, os ligantes, por exemplo, os anticorpos, que se ligam a θνβ6 podem ser conjugados, por exemplo, a um rótulo detectável, uma droga, um pró-medicamento ou um isótopo.

Em certos métodos da invenção descritos em mais detalhe abaixo, como métodos de detectar expressão de ανβ6 em células ou tecidos em combinação com a detecção de expressão de smad4 como uma medição do potencial de células de tumor serem responsivas a ligantes de ligação de ανβ6 e/ou agentes de bloqueio de TGF-β, os ligantes de ligação de ανβδ (por exemplo, anticorpos) são conjugados com um ou mais rótulos detectáveis. Para tais usos, os ligantes de ligação de Ονβε, por exemplo, anticorpos de ligação de θνβ6, podem ser rotulados de forma detectável por fixação covalente ou não covalente de um agente de contraste cromogênico, enzimático, radioisotópico, isotópico, fluorescente, tóxico, quimiluminescente, de ressonância magnética nuclear ou outro rótulo.

Os exemplos de rótulos cromogênicos apropriados incluem diaminobenzidina e 4-hidroxiazo-benzeno-2-ácido carboxíIico.

2 0 Os exemplos de rótulos de enzima apropriados incluem

desidrogenase malato, nuclease estafilococal, isomerase Δ- 5-esteróide, desidrogenase de álcool-levedura,

desidrogenase de fosfato α glicerol, isomerase de fosfato de triose, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glicose, β-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6- desidrogenase de fosfato, glicoamilase e esterase de acetil colina.

Os exemplos de rótulos radioisotópicos apropriados incluem 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc e 109Pd, etc. 111In é um isótopo preferido onde imageamento in vivo é utilizado uma vez que evita o problema de desalogenação dos ligantes de ligação de ανβ6 rotulados por 125I ou 131I pelo fígado. Além disso, esse radionucleotídeo tem uma energia de emissão gama mais favorável para imageamento (Perkins e outros, Eur. J. Nucl. Med. 10:296-301 (1985), Carasquillo e outros, J. Nucl. Med. 28:281-287 (1987)). Por exemplo, 111In acoplado a anticorpos monoclonais com 1-(P- isotiocianotobenzil)-DPTA mostrou pouca absorção em tecidos não tumorosos, particularmente o fígado, e portanto aumenta a especificidade de localização de tumor (Esteban e outros, J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).

Os exemplos de rótulos isotópicos não radioativos incluem 157Gd, 55Mn, 162Dyf 52Tr e 56Fe.

Os exemplos de rótulos fluorescentes apropriados incluem um rótulo 152Eu, um rótulo de f luoresceína, um rótulo de isotiocianato, um rótulo de rodamina, um rótulo de ficoeritrina, um rótulo de ficocianina, um rótulo de aloficocianina, um rótulo de Proteína fluorescente verde (GFP) , um rótulo de o-ftaldeído e um rótulo de fluorescamina.

Os exemplos de rótulos tóxicos apropriados incluem toxina de difteria, ricina e toxina de cólera.

Os exemplos de rótulos quimiluminescentes incluem um rótulo de luminol, um rótulo de isoluminol, um rótulo de éster acridínio aromático, um rótulo de imidazol, um rótulo de sal acridínio, um rótulo de éster oxalato, um rótulo de luciferina, um rótulo de luciferase e um rótulo de aequorina.

Os exemplos de agentes de contraste de ressonância magnética nuclear incluem núcleos de metal pesado como Gd, Mn e ferro.

Técnicas típicas para ligar os rótulos acima descritos a ligantes de ligação de CtvPe/ por exemplo, anticorpos de ligação de OvP6 são fornecidas por Kennedy e outros, Clin. Chim. Acta. 70:1-33 (1976), e Schurs e outros, Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977). Técnicas de acoplamento mencionadas no último são o método de glutaraldeído, o método periodato, o método dimaleimida, ou método éster de m-maleimidobenzil-N- hidróxi-succinimida, todos os métodos são incorporados aqui a título de referência.

Para uso em certas abordagens terapêuticas da invenção como ablação de células de tumor, ou prevenção de crescimento de célula de tumor, invasão ou metástase, os ligantes de ligação de ανβ6 podem ser conjugados com uma ou mais drogas, pró-medicamentos ou isótopos. Tais conjugados preferidos compreendem um ou mais ligantes, por exemplo, um ou mais anticorpos ou fragmentos, derivados ou variantes dos mesmos, que se ligam a ανβ6 , conjugados com um ou mais agentes citotóxicos, tais conjugados são úteis nos métodos de tratamento e prevenção de metástase de tumor fornecidos pela invenção. De acordo com certas dessas modalidades da invenção, o ligante de ligação de θνβ6, por exemplo, anticorpo, é conjugado com um agente citotóxico. Agentes citotóxicos, por exemplo, quimioterapêuticos, úteis na geração de conjugados de agente citotóxico-ligante de ligação de OvP6, são bem conhecidos na arte, e incluem, porém não são limitados a cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, paclitaxel, gemcitabina, adriamicina (doxorrubicina), melfalan, metotrexato, 5-fluorouracil, etoposide, mecloretamina, ciclofosfamida, bleomicina, um caliqueamicina, uma maitansina, um tricoteno. São particularmente apropriados para uso de acordo com esse aspecto da invenção paclitaxel, gemcitabina e adriamicina (doxorrubicina). Outros agentes quimioterapêuticos apropriados para uso de acordo com esse aspecto da invenção são bem conhecidos e serão familiares para o técnico com conhecimentos comuns.

Desse modo, o uso de conjugados de um ou mais ligante de ligação de θνβ6, por exemplo, um ou mais anticorpos de ligação de ανβ6; e uma ou mais toxinas de molécula pequena, como paclitaxel, adriamicina, (doxorrubicina), gemcitabina, um caliqueamicina, uma maitansina (patente dos ESTADOS UNIDOS número 5.208.020), um tricoteno e CC1065, também é considerado aqui. Em uma modalidade da invenção, o ligante de ligação de θνβ6 é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por ligante de ligação de Ονβδ). Maitansina pode, por exemplo, ser convertido em May-SS-Me que pode ser reduzido para May-SH3 e reagido com ligantes de ligação de ανβ6 modificados (Chari e outros Câncer Research 52:127-131 (1992) para gerar um conjugado de ligante de ligação de θνβ6 -maitansinóide.

Alternativamente, o ligante de ligação de θνβ6 pode ser

2 5 conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A

família de antibióticos de caliqueamicina é capaz de produzir quebras de DNA de fita dupla em concentrações sub- picomolares. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, porém não são limitados a,

3 0 γι1, as1, Ct31, N-acetil-γι1, PSAG e φι1 (Hinman e outros Câncer Research 53:3336-3342 (1993) e Lode e outros Câncer Research 58:2925-2928 (1998)).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser utilizados para produzir conjugados com um ou mais ligantes de ligação de ανβ6, por exemplo, um ou mais anticorpos de ligação de θνβ6, incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos de não ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (a partir de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrin A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleuritesfordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232 publicado no idioma inglês em 18 de outubro de 1993, cuja revelação é incorporada aqui a título de referência na íntegra. Mitansinóides também podem ser conjugados com um ou mais ligantes de ligação de ανβ6, por exemplo, um ou mais anticorpos de ligação de ανβ6. A presente invenção considera ainda ligantes de ligação de ανβ6 conjugados com um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou um endonuclease de DNA como um desoxirribonuclease; Dnase).

Uma variedade de isótopos radioativos também está

2 5 disponível para a produção de ligantes de ligação de ανβ6

radioconjugados para uso em métodos terapêuticos da

~ ~ π · τ 211 -η 131-, 125 η 90v 186p

invenção. Os exemplos incluem At, 1, i, «-β,

188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, e isótopos radioativos de Lu.

Conjugados dos ligantes de ligação de ανβ6 e agentes

3 0 citotóxicos podem ser feitos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional como N- succinimidil-3 -(2-piridil ditiol) propionato (SPDP) , succinimidil-4-(N-maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (como suberato de disuccinimidil), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis (p-azidobenzoíla) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p- diazoniumbenzoíla)-etilenodiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúor bis- ativo (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta e outros, Science 238:1098. (1987) Ácido triaminopentaacético de l-isotiocianatobenzil-3-metil dietileno rotulado com 14Carbono (MX-DTPA) é um agente de quelação exemplar para conjugação de radionucleotídeo com o ligante de ligação de ανβ6. Vide WO 94/11026. 0 ligador pode ser um "ligador clivável" que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligador instável a ácido, ligador sensível a peptidase, ligador de dimetila ou ligador contendo dissulfeto (Chari e outros Câncer Research 52:127-131 (1992)) pode ser utilizado.

Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo o ligante de ligação de ανβ6 e agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo.

Ainda em outra modalidade, o ligante de ligação de ανβ6 pode ser conjugado a um "receptor" (como estreptavidina) para utilização em "pré-alvejar" onde o 3 0 conjugado de receptor-ligante de ligação de ανβ6 é administrado ao paciente, seguido por remoção de conjugado não ligado a partir da circulação utilizando um agente de clarificação e então administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

Os ligantes de ligação de OtvP6 da presente invenção podem ser também conjugados com uma enzima de ativação de pró-medicamento que converte um pró-medicamento (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidila, vide WO

81/0114 5) em uma droga ativa. Vide, por exemplo, WO 88/07378 e patente dos ESTADOS UNIDOS número 4.975.278. O componente de enzima desses conjugados inclui qualquer enzima capaz de atuar sobre um pró-medicamento de tal modo a converter o mesmo em sua forma citotóxica mais ativa.

Enzimas que são úteis no método da presente invenção

incluem, porém não são limitadas a, fosfatase alcalina útil para converter pró-medicamentos contendo fosfato em drogas livres, aril sulfatase útil para converter pró-medicamentos contendo sulfato em drogas livres; citosina desaminase útil

2 0 para converter 5 -fluorocitoxina não tóxica em droga

anticâncer, 5-fluorouracil; proteases, como protease Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas BeL), que são úteis para converter pró-medicamentos contendo peptídeo em drogas

livres; D-alanil carboxipeptidases, úteis para converter pró-medicamentos que contêm substituintes de aminoácido-D ; enzimas de clivar carboidrato como 0-galactosidase e neuraminidase úteis para converter pró-medicamentos glicosilados em drogas livres; P-Iactamase útil para

3 0 converter drogas derivatizadas com P-Iactamas em drogas livres, e amidases de penicilina, como amidase de penicilina V ou amidase de penicilina G, úteis para converter drogas derivatizadas em seus nitrogênios de amina com grupos de fenóxi acetil ou fenil acetil, respectivamente em drogas livres.

Enzimas podem ser covalentemente ligadas ao ligante de ligação de ανβ6 por técnicas bem conhecidas na arte como o uso dos reagentes de reticulação heterobifuncional. Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo

menos a região de ligação de antígeno de ligante de ligação de θνβ6 da invenção ligada a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima podem ser construídas utilizando técnicas de DNA recombinante, bem conhecidas na arte (vide, por exemplo, Neuberger e outros, Nature 312:

604-608 (1984)) .

DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO DE DOENÇA

Como mencionado acima, verificou-se agora que células a partir de certos tumores que exibem níveis significativamente diminuídos de expressão de gene smad4 e

2 0 níveis significativamente aumentados de integrina Ονβε são

mais prováveis de serem responsivas a ligantes que se ligam a ανβ6; e a agentes que bloqueiam um ou mais componentes da via de sinalização de TGF-β, quando comparado com células que exibem níveis mais elevados de expressão de gene smad4 .

Desse modo, em um aspecto, a invenção provê um método útil na determinação da probabilidade de uma célula de tumor de responder a ou ser quimiossensibilizada por tratamento com ligantes anti-oivPe (por exemplo, anticorpos) ou com agentes de bloquear TGF-β, incluindo tumores a partir de carcinomas

3 0 como um adenocarcinoma. Em modalidades mais específicas, o carcinoma é um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma cervical, um carcinoma de célula escamosa (como um carcinoma de esôfago), um carcinoma de cabeça e pescoço, um carcinoma de fígado, um carcinoma de ovário e um carcinoma de pulmão. Mais particularmente, o carcinoma é um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma cervical, ou um carcinoma de cabeça e pescoço.

Os métodos de acordo com esse aspecto da invenção envolvem ensaiar o nível de expressão de smad4 nas células de tumor ou em uma amostra de tecido de tumor, e comparar esses níveis de expressão com um nível de expressão smad4 padrão (por exemplo, em células ou tecidos normais, preferivelmente obtidos a partir do mesmo animal, como um paciente humano), onde uma diminuição na expressão de smad4 em um tumor ou nas células do mesmo indica que o tumor é mais provável de ser responsivo às ações de inibir crescimento de ligantes anti-avp6 (por exemplo, anticorpos) ou com agentes de bloquear TGF-β, ou ser quimiossensibilizado por tais ligantes e agentes para co- tratamento subsequente (ou simultâneo) com uma ou mais composições ou compostos quimioterapêuticos. Como observado acima, a expressão diminuída de smad4 em tumores é freqüentemente associada a um prognóstico ruim de paciente, 2 5 de modo que os métodos da invenção forneçam um modo para rapidamente diagnosticar e tratar agressivamente tais tumores com compostos e composições que são mais prováveis de fornecer uma abordagem terapêutica especificamente alvejada, e desse modo fornecer um resultado clínico mais favorável para o paciente. Por "ensaiar os níveis de expressão de smad4" se quer dizer medir ou estimar qualitativa ou quantitativamente os níveis de smad4 em uma primeira amostra biológica (por exemplo, uma amostra de tumor, um aspirado ou biópsia de tecido, etc.) quer diretamente (por exemplo, por determinar ou estimar nível absoluto de expressão de OvP6 na amostra) ou relativamente (por exemplo, por comparar o nível de expressão de smad4 em uma primeira amostra biológica em relação àquela em uma segunda amostra biológica) . Preferivelmente, o nível de smad4 na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado com aquele em um padrão tirado a partir de uma segunda amostra biológica obtida a partir de um indivíduo não tendo câncer ou lesão pré-cancerosa. Os níveis de smad4 podem ser medidos em uma dada amostra de célula, tecido, órgão ou biológica de acordo com métodos conhecidos na arte de medir expressão de gene, incluindo, por exemplo, hibridização ou detecção PCR/RT-PCR do gene smad4 utilizando iniciadores ou sondas genéticas conhecidas (vide, por exemplo, Maliekal, T. T. e outros, Oncogene 22:4889-4897 (2003); Iacobuzio-Donahue, C.A. e outros, Clin. Câncer Res. 10:1597-1604 (2004)), northern blotting (vide, por exemplo, Yasutome, M. e outros, Clin. Exper. Metast. 22/461-473 (2005)), e análise imunoistoquímica com anticorpos anti-SMAD4 (vide, por exemplo, Luttges, J. e outros, Am. J. Pathol. 158:1677-1683 (2001), Fukuchi, M. e outros, Câncer 95:737-743 (2002); Subramanian, G. e outros, Câncer Res. 64:5200-5211 (2004); Levy, L. e Hill, C.S., Mol . Cell. Biol. 25:8108-8125 (2005)) . Como será reconhecido por uma pessoa versada na arte, após um nível de expressão smad4 padrão ser conhecido para um tecido não canceroso dado, pode ser utilizado repetidamente como padrão para comparação.

Similarmente, por "ensaiar os níveis de expressão de ανβ6" se quer dizer medir ou estimar qualitativa ou quantitativamente os níveis de ανβ6 em uma primeira amostra biológica (por exemplo, uma amostra de tumor, um aspirado ou biópsia de tecido, etc.) quer diretamente (por exemplo, por determinar ou estimar quantidade absoluta de Ονβε na amostra) ou relativamente (por exemplo, por comparar o

nível de expressão de ανβ6 em uma primeira amostra biológica em relação àquela em uma segunda amostra biológica). Preferivelmente, o nível de ανβ6 na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado com aquele em um padrão tirado a partir de uma segunda amostra biológica

obtida a partir de um indivíduo não tendo câncer ou lesão pré-cancerosa. Como será reconhecido por uma pessoa versada na técnica, após um nível de expressão de ανβ6 padrão ser conhecido para um dado tecido não canceroso, pode ser utilizado repetidamente como padrão para comparação.

2 0 Por "amostra biológica" se quer dizer qualquer amostra

biológica obtida a partir de um indivíduo (como paciente), linhagem de célula, cultura de tecido ou outra fonte que pode conter células ou produtos celulares como matriz extracelular. Tais amostras biológicas incluem tecidos de

2 5 corpo de mamíferos e células incluindo leucócito, ovário,

próstata, coração, placenta, pâncreas, fígado, baço, pulmão, mama, tecidos de cabeça e pescoço (por exemplo, tecidos oral, faríngeo, lingual e laríngeo), células escamosas (por exemplo, esôfago), tecidos de endométrio,

3 0 cólon (ou colorretal), cérvix, estômago e umbilical que podem expressar Ονβε. Os métodos para obter biópsias de tecidos e fluidos corpóreos a partir de mamíferos são bem conhecidos na arte. Mamíferos preferidos incluem macacos, bugios, gatos, cães, vacas, porcos, cavalos, coelhos e seres humanos. São particularmente preferidos os seres humanos.

O ensaio de níveis de expressão de θνβε em uma amostra biológica pode ocorrer utilizando qualquer método conhecido na arte. Técnicas imunológicas são preferidas para ensaiar níveis de expressão de OvP6 em uma amostra biológica. Por exemplo, a expressão de OtvP6 em tecidos pode ser estudada com métodos imunoistológicos clássicos. Nesses, o reconhecimento específico é fornecido por um ligante primário, por exemplo, um anticorpo (policlonal ou monoclonal) que se liga a θνβ6. Esse ligante primário pode ser rotulado, por exemplo, com um rótulo fluorescente, quimiluminescente, fosforescente, enzimático ou

radioisotópico. Alternativamente, esses métodos da invenção podem utilizar um sistema de detecção secundário no qual um segundo ligante que reconhece e se liga ao ligante de ligação de O^6, por exemplo, um denominado anticorpo "secundário" que reconhece e se liga a um primeiro anticorpo de ligação θνβ6, é detectavelmente rotulado como descrito acima. Como resultado, uma coloração 2 5 imunoistológica de seção de tecido para exame patológico é obtida. Alternativamente, os tecidos e amostras de células também podem ser extraídos, por exemplo, com uréia e detergente neutro, para a liberação de proteína de ανβ6 para ensaio Western-blot ou dot/slot (Jalkanen, M. e outros, J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, Μ. E outros, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)) para quantização direta, em relação a uma amostra de célula ou tecido padrão conhecida por ter níveis mais baixos de expressão de Ονββ.

Como observado acima, os métodos da presente invenção são úteis para detectar cânceres em mamíferos, para determinar a probabilidade de que uma dada célula de tumor será responsiva ao tratamento e/ou quimiossensibilização com ligantes anti-OvPe e/ou com TGF-β, e para tratar carcinomas de uma variedade de tipos. Em particular, os métodos da invenção são úteis para detectar e/ou tratar cânceres de tecidos epiteliais (isto é, carcinomas), incluindo de pâncreas, cólon/reto, cérvix, esôfago (e outros tecidos epiteliais escamosos), cabeça e pescoço, fígado, ovário e pulmão. São particularmente sensíveis à detecção pelos métodos da presente invenção adenocarcinomas invasivos e/ou metastáticos, incluindo, porém não limitados a carcinomas pancreáticos, carcinomas colorretais, carcinomas cervicais, e carcinomas de cabeça e pescoço. A identificação prematura e o tratamento de tais carcinomas são associados a um melhor prognostico de duração longa para pacientes. Por exemplo, foi reportado que se deixado sem tratamento, uma proporção significativa de tumores de mama não invasivos se tornam invasivos e podem levar a cânceres metastáticos que têm um prognóstico muito pior (vide Sakorafas, G.H. e Tsiotou, A.G.H., Câncer Treatment Rev. 26:103-125 (2000)). Além disso, como mencionado acima, expressão reduzida de smad4 em adenocarcinomas pancreáticos primários foi associada a prognóstico ruim para pacientes tendo tais tumores (Liu, F., Clin. Câncer Res. 7:3853-3856 (2001); Tascilar, M. e outros, Clin. Câncer Res. 7:4115- 4121 (2001); Toga, Τ. e outros, Anticancer Res. 24:1173- 1178 (2004)). Desse modo, diagnóstico prematuro e iniciação de tratamento, preferivelmente de acordo com os métodos descritos aqui, é importante para a sobrevivência de longa duração de pacientes com cânceres com deficiência de smad4 .

Por conseguinte, a presente invenção considera métodos de tratar ou evitar cânceres por identificar lesões pré- cancerosas com deficiência de smad4 ou carcinomas em pacientes, e tratar o paciente para eliminar a lesão pré- cancerosa antes de ter a oportunidade de se desenvolver em uma forma mais avançada de câncer. Tais métodos compreendem, por exemplo, (a) obter uma amostra de tecido que se suspeita tenha câncer ou uma lesão pré-cancerosa, e uma amostra de tecido que não contém câncer ou lesão pré- cancerosa (preferivelmente a partir do mesmo tecido ou órgão que aquele suspeito de ter câncer ou lesão pré- invasiva) ; e (b) determinar o nível de expressão de smad4 nas amostras de tecido ou tumor, ou células a partir dos mesmos, onde uma diminuição no nível de expressão de smad4

2 0 na amostra de tecido contendo uma lesão cancerosa ou pré-

invasiva, em relação aos níveis de expressão de smad4 na amostra de tecido não canceroso (ou células a partir da mesma), é indicativa de câncer ou uma lesão pré-cancerosa que é mais provável de progredir para uma forma mais invasiva ou agressiva de câncer. Em outras modalidades relacionadas, a invenção considera métodos de reduzir ou evitar o avanço de uma lesão pré-cancerosa para um tumor ou em um paciente, compreendendo identificar em um paciente os tumores (ou células dos mesmos) que têm um nível reduzido

3 0 de expressão de smad4 (preferivelmente utilizando os métodos descritos acima), e administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina a^pe em uma ou mais células no pré-câncer, onde a ligação do ligante à integrina resulta na morte ou inibição de crescimento da lesão pré-cancerosa, ou na

quimiossensibilização da lesão pré-cancerosa às ações de induzir morte ou inibir crescimento de um ou mais compostos quimioterapêuticos.

Órgãos e tecidos apropriados a partir dos quais as

amostras podem ser obtidas para uso de acordo com esses métodos da invenção incluem, porém não são limitados a, tecidos epiteliais descritos em outra parte da presente invenção. Cânceres e tumores que podem ser vantajosamente

tratados ou evitados, de acordo com tais métodos da invenção incluem, porém não são limitados necessariamente a carcinomas, particularmente adenocarcinomas, incluindo os carcinomas e adenocarcinomas descritos em detalhe em outra parte da presente invenção. Após tal carcinoma ter sido

2 0 detectado, de acordo cm os métodos da invenção, pode ser

então eliminado a partir do paciente via método cirúrgico, quimioterapêutico, radiológico ou outros métodos de terapia de câncer que são bem conhecidas na técnica e que, portanto serão familiares para aqueles com conhecimentos comuns.

Alternativamente, tal carcinoma pode ser eliminado utilizando os métodos de tratamento da presente invenção, por administrar ao paciente, ou aos órgãos ou tecidos do paciente, um ou mais ligantes de ligação de ανβε , como um ou mais anticorpos de ligação de ανβ6 ou fragmentos dos

3 0 mesmos. Em certos exemplos não limitadores de tais modalidades, um ou mais ligantes de ligação de ανβ6 foram conjugados com um ou mais compostos ou agentes citotóxicos como descrito em detalhe acima. Em exemplos não limitadores adicionais de tais modalidades, um ou mais ligantes de ligação de Ονβε, como um ou mais anticorpos de ligação de θνβ6 ou fragmentos dos mesmos, são administrados a um sujeito, como um paciente, em combinação com um ou mais compostos ou agentes citotóxicos como descrito em detalhe acima. Em outras modalidades relacionadas, tais métodos da

invenção compreendem administrar um ou mais agentes de bloqueio de TGF-β, como aqueles descritos aqui, que inibem o crescimento das células de tumor e/ou quimiossensibilizam as células de tumor às ações de um ou mais compostos quimioterapêuticos tóxicos.

Em modalidades relacionadas, a invenção considera

determinar o potencial metastático de um tumor ou célula de câncer por medir os níveis de expressão de smad4 e ανβε pelo tumor ou célula de câncer. Em tais modalidades, amostras de célula ou tumor são obtidas a partir de um paciente como

2 0 descrito acima e são ensaiados de acordo com os métodos descritos aquis para os níveis de expressão de smad4 e ανβ6 pelo tumor ou célula de câncer. De acordo com esses métodos da invenção, há uma correlação inversa entre o nível de expressão de smad4 pelo tumor ou célula de câncer e o nível

2 5 de expressão de Ονβε pelo tumor ou célula de câncer que

fornece um quadro clínico útil que pode ser utilizado para determinar o potencial metastático de um tumor ou célula de câncer. Especificamente, uma diminuição na expressão de smad4 por um tumor ou célula de câncer e um aumento

3 0 concomitante na expressão de θνβ6 pela correlação direta de tumor ou célula de câncer entre o nível de expressão de ανβε pela célula de câncer ou tumor indica que aquela célula de câncer ou tumor é mais provável de causar metástase em um local secundário a partir do sítio de tumor primário. Consequentemente, os níveis de expressão de smad4 e de ανβ6 por uma célula de câncer ou tumor podem ser utilizados como um indicador de prognóstico do potencial metastático de uma célula de câncer ou tumor, que pode auxiliar pacientes com câncer e seus médicos a tomar decisões de tratamento apropriadas com base na capacidade de invasão e agressividade prevista presente ou futura do câncer.

Além de ensaias níveis de expressão de smad4 e ανββ em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, como uma amostra de célula de tumor ou tecido, o nível e padrão de expressão de ανβε pode ser também detectado in vivo por imageamento. Em tais métodos da invenção, um ou mais ligantes de ligação de SMAD4 e ligantes de ligação de ανβ6, por exemplo, um ou mais anticorpos de ligação de SMAD4, e um ou mais anticorpos de ligação de ανβ6, são rotulados de forma detectável com um ou mais rótulos apropriados para imageamento in vivo. Rótulos ou marcadores apropriados para imageamento in vivo incluem aqueles detectáveis por radiografia-X, NMR ou ESR. Para radiografia-X, rótulos apropriados incluem radioisótopos como bário ou césio, que emitem radiação detectável, porém não são abertamente prejudiciais ao sujeito. Marcadores apropriados para NMR e ESR incluem aqueles com um spin característico detectável, como deutério.

Um ligante que se liga a SMAD4 ou (Χνβε, Por exemplo, um anticorpo de ligação de SMAD4 ou ανβε ou fragmento de anticorpo, que foi rotulado com uma fração de imageamento detectável apropriada, como radioisótopo (por exemplo, 131I, 121In, 99mTc) , uma substância radio-opaca, ou um material detectável por ressonância magnética nuclear, é introduzida (por exemplo, por via parenteral, subcutânea ou intraperitoneal) no mamífero a ser examinado para câncer ou carcinoma no local. Será entendido na arte que o tamanho do sujeito e o sistema de imageamento utilizado determinarão a quantidade de fração de imageamento necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma fração de radioisótopo, para um sujeito humano, a quantidade de radioatividade injetada variará normalmente de aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99mTc. 0 ligante rotulado, por exemplo, anticorpo de ligação de SMAD4 ou ανβ6 ou fragmento de anticorpo, acumulará então preferencialmente no local de células ou tecidos que contêm ou expressam SMAD4 ou integrina ανβ6. Imageamento de tumor in vivo é então realizado como descrito em S.W. Burchiel e outros, "Immunopharmacokinetics of Radiolabelled Antibodies 2 0 and their fragments" (capítulo 13 em Tumor Imaging: The radiochemical detection of Câncer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

Em modalidades adicionais da invenção, os métodos da 2 5 presente invenção podem ser utilizados em regimes terapêuticos para tratar mamíferos que sofrem de certas doenças, particularmente com certos carcinomas como aqueles descritos em outra parte da presente invenção. Tais métodos da invenção são úteis no tratamento de câncer e eventos associados, incluindo crescimento de tumor, metástase e angiogênese. São particularmente sensíveis a essa abordagem aquelas doenças ou cânceres que são caracterizados por níveis diminuídos de expressão de smad4, e níveis concomitantemente aumentados de expressão de ανβ6 , nos tecidos ou células de um mamífero que sofre da doença, e que são responsivos a tratamentos que alvejam os tecidos ou células que expressam níveis aumentados de ανβε e eliminam aqueles tecidos ou células. Os métodos de acordo com esse aspecto da invenção compreendem, por exemplo, (a) identificar tumores ou células de tumor com expressão de smad4 diminuída em um paciente, e (b) tratar o paciente com um ou mais ligantes de ligação de (Χνβε, como um ou mais anticorpos de ligação de ανβε ou fragmentos dos mesmos, ou com um ou mais agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos. Tais métodos alternativos compreendem, por exemplo, (a) identificar tumores ou células de tumor com expressão diminuída de smad4 em um paciente; (b) tratar o paciente com um ou mais ligantes de ligação de ανβε , como um ou mais anticorpos de ligação de ανβε ou fragmentos do mesmo, ou com um ou mais agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos do mesmo, onde a ligação dos ligantes de ligação de Οίνβε ou os agentes de bloqueio de TGF-β para as células de tumor quimiossensibiliza as células de tumor às ações de inibir crescimento e/ou induzir morte de um ou mais compostos quimioterapêuticos; e (c) tratar o paciente com um ou mais compostos quimioterapêuticos que inibe o crescimento de ou mata as células de tumor.

Doenças que são particularmente tratáveis por esses métodos incluem cânceres metastáticos de tecidos epiteliais (isto é, carcinomas metastáticos e/ou adenocarcinomas), incluindo pâncreas, cólon/reto, cérvix, esôfago (e outros tecidos epiteliais escamosos e órgãos), cabeça e pescoço, fígado, ovário e pulmão. São particularmente adequados para tratamento por esses métodos da presente invenção carcinomas do pâncreas, cólon/reto, cérvix, cabeça e pescoço e esôfago. Mamíferos preferidos para tratamento incluem macacos, bugios, gatos, cães, vacas, porcos, cavalos, coelhos e seres humanos. São particularmente preferidos seres humanos. Em modalidades relacionadas, conforme descrito acima,

a invenção provê métodos de reduzir ou evitar a progressão de um tumor pré-metastático para um tumor metastático em um paciente, compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ligantes que se liga a uma ou mais subunidades de integrina ανβ6 em uma ou mais células no tumor pré-metastático, onde a ligação do ligante à integrina resulta na redução ou prevenção de invasão de células do câncer pré-metastático em áreas de tecido que circundam o tumor primário. Na realização desses métodos terapêuticos da invenção,

ligantes de ligação de θνβ6, como anticorpos de ligação de ανβ6 ou fragmentos dos mesmos, ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos, podem ser administrados a pacientes na forma de formulações terapêuticas (que são 2 5 também mencionadas aqui de forma intercambiável e equivalentemente como composições farmacêuticas) . Formulações terapêuticas de ligantes de ligação de θνβ6 ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos utilizados de acordo com a presente invenção, são preparados para armazenagem por mistura de ligante de ligação de OtvP6 ou agente de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente

aceitáveis, opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), por exemplo, na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Além dos compostos farmacologicamente ativos como os ligantes de ligação de θνβ6 ou os agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos, as composições utilizadas nos métodos terapêuticos da invenção podem conter um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, apropriados, compreendendo excipientes e meios auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparados que podem ser utilizados farmaceuticamente. Os preparados farmacêuticos da presente invenção são fabricados em um modo que é, por si conhecido, poro exemplo, por meio de processos de mistura, granulação, fabricação de drágea, dissolução ou liofilização convencionais. Desse modo, preparados farmacêuticos para uso oral podem ser obtidos por combinar os compostos ativos com excipientes sólidos, opcionalmente triturar a mistura resultante e processar a mistura de grânulos, após adicionar meios auxiliares apropriados, se desejado ou necessário, para obter tabletes ou núcleos de drágeas. 2 5 Excipientes apropriados são, em particular, cargas

como sacarídeos, por exemplo, lactose ou sacarose, manitol ou sorbitol, preparados de celulose e/ou fosfatos de cálcio, por exemplo, por exemplo, fosfato de tricálcio ou fosfato de hidrogênio de cálcio, bem como aglutinantes, como pasta de amido, utilizando, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, tragacanto, metil celulose, hidróxi propil metil celulose, carbóxi metil celulose de sódio e/ou polivinil poirrolidona. Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, como os amidos acima mencionados e também carbóxi metil-amido, polivinil poirrolidona reticulado, agar, ou ácido alginico ou um sal do mesmo, como alginato de sódio. Meios auxiliares são, acima de tudo, agentes reguladores de fluxo e lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico ou sais dos mesmos, como estearato de magnésio ou estearato de cálcio, e/ou polietileno glicol. Núcleos de drágea são dotados de revestimentos apropriados, que, se desejado, são resistentes a sucos gástricos. Para essa finalidade, soluções de sacarideo concentradas podem ser utilizadas, que podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinil poirrolidona, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de Iaca e solventes orgânicos apropriados ou misturas de solventes. Para produzir revestimentos resistentes a sucos 2 0 gástricos, soluções de preparados de celulose apropriados, como ftalato de acetil celulose ou ftalato de hidróxi propil metil celulose, são utilizados. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos tabletes ou revestimentos de drágea, por exemplo, para identificação ou para caracterizar combinações de doses de composto ativo.

Outros preparados farmacêuticos que podem ser utilizados por via oral incluem cápsulas encaixadas por pressão feitas de gelatina, bem como cápsulas vedadas, macias feitas de gelatina e um plastificante como glicerol ou sorbitol. As cápsulas encaixadas por pressão podem conter os compostos ativos na forma de grânulos que podem ser misturados com cargas como lactose, aglutinantes como amidos, e/ou lubrificantes como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas moles, os compostos ativos são preferivelmente dissolvidos ou suspensos em líquidos apropriados como óleos graxos ou parafina líquida. Além disso, estabilizadores podem ser adicionados.

Formulações apropriadas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água e soluções alcalinas. Sais alcalinos podem incluir sais de amônio preparados, por exemplo, com Tris, hidróxido de colina, bis-Tris propano, N-metil glucamina ou arginina. Além disso, suspensões dos compostos ativos como suspensões de injeção oleosa apropriadas podem ser administradas. Solventes lipofílicos apropriados ou veículos incluem óleos graxos, por exemplo, óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintético, por exemplo, oleato de etila ou triglicerídeos ou polietileno-glicol 400 (os compostos são solúveis em PEG-400). Suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, por exemplo, carbóxi metil celulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados no olho em animais e seres humanos como uma gota, ou em unguentos, géis, lipossomas, ou discos de polímero biocompatível, pelotas ou contidos em lentes de 3 0 contato. A composição intraocular pode conter também um veículo oftálmico fisiologicamente compatível como aqueles versados na técnica podem selecionar utilizando critérios convencionais. Os veículos podem ser selecionados a partir de veículos oftálmicos conhecidos que incluem, porém não são limitados à água, poliéteres como polietileno glicol 400, polivinilas como álcool de polivinila, povidona, derivados de celulose como carbóxi metil celulose, metil celulose e hidróxi propil metil celulose, derivados de petróleo como óleo mineral e petrolato branco, gorduras animais como lanolina, gorduras vegetais como óleo de amendoim, polímeros de ácido acrílico como gel de carboxil polimetileno, polissacarídeos como dextranos e gliocosaminoglicanos como cloreto de sódio e cloreto de potássio, cloreto de zinco e tampão como bicarbonato de sódio ou lactato de sódio. As moléculas de elevado peso molecular também podem ser utilizadas. Preservativos fisiologicamente compatíveis que não inativam os compostos da presente invenção na composição incluem álcoois como clorobutanol, cloreto de benzalcônio e EDTA, ou qualquer outro preservativo apropriado conhecido por aqueles versados na técnica.

Formulações liofilizadas de anticorpos adaptados para administração subcutânea são descritas na patente dos ESTADOS UNIDOS número 6.267.958, cuja revelação é incorporada aqui a título de referência na íntegra. Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente apropriado em uma concentração de proteína elevada e a formulação reconstituída pode ser administrada por via subcutânea ao paciente a ser tratado na presente invenção. 3 0 Os ligantes de ligação de Ονβε também podem ser retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidróxi metil celulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas poli(metil metacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osal, A.Ed. (1980). Preparados de liberação controlada de ligantes de

ligação de θνβ6 podem ser preparados. Exemplos apropriados de preparados de liberação controlada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o ligante de ligação de ανβ6, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberação controlada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil- metacrilato), ou álcool de polivinila, polilactides (patente dos ESTADOS UNIDOS número 3.773.919), copolímeros de ácido glutâmico-L e γ-etil-L-glutamato, acetato de vinila-etileno não degradável, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradável como LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido glicólico-ácido láctico e acetato de leuprolide) e poli-D- (-)-3-ácido hidróxi butírico.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.

0 ligante de ligação de ανβ6 ou agentes de bloqueio de 3 0 TGF-β ou fragmentos dos mesmos podem ser administrados ao sujeito ou paciente por qualquer meio apropriado, incluindo parenteral, intrapulmonar, intracraniano, transdérmico e intranasal. Infusões paranterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Além disso, o ligante de ligação de ανβε ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos podem ser apropriadamente administrados por infusão de pulso, por exemplo, com doses decrescentes do ligante de ligação de ανβ6 ou agente de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos. Preferivelmente a dosagem é fornecida por injeções, mais preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica.

Em certas modalidades exemplares da invenção, os ligantes de ligação de θνβ6 ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos são administrados ao paciente (por exemplo, por via intravenosa) em uma dosagem entre aproximadamente 1 mg/m2 e aproximadamente 500 mg/m2. Por exemplo, o ligante de ligação de ανβε ou agente de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos pode ser administrado em uma dosagem de aproximadamente 1 mg/m2, 2 mg/m2, 3 mg/m2, 4 mg/m2, 5 mg/m2, 10 mg/m2, 15 mg/m2, 20 mg/m2, 25 mg/m2, 30 mg/m2, 3 5 mg/m2, 4 0 mg/m2, 4 5 mg/m2, 5 0 mg/m2, 55 mg/m2, 6 0 mg/m2, 65 mg/m2, 7 0 mg/m2, 7 5 mg/m2, 8 0 mg/m2, 8 5 mg/m2, 9 0 mg/m2, 95 mg/m2, 100 mg/m2, 105 mg/m2, 110 mg/m2, 115 mg/m2, 120 mg/m2, 125 mg/m2, 130 mg/m2, 135 mg/m2, 140 mg/m2, 145 mg/m2, 150 mg/m2, 155 mg/m2, 160 mg/m2, 165 mg/m2, 170 mg/m2, 175 mg/m2, 180 mg/m2, 185 mg/m2, 190 mg/m2, 195 mg/m2, 200 mg/m2, 205 mg/m2, 210 mg/m2, 215 mg/m2, 220 mg/m2, 225 mg/m2, 230 mg/m2, 235 mg/m2, 240 mg/m2, 245 mg/m2, 250 mg/m2, 255 mg/m2, 260 mg/m2, 265 mg/m2, 270 mg/m2, 275 mg/m2, 280 mg/m2, 285 mg/m2, 290 mg/m2, 295 mg/m2, 300 mg/m2, 305 mg/m2, 310 mg/m2, 315 mg/m2, 320 mg/m2, 325 mg/m2, 330 mg/m2, 335 mg/m2, 340 mg/m2, 345 mg/m2, 350 mg/m2, 355 mg/m2, 360 mg/m2, 365 mg/m2, 370 mg/m2, 375 mg/m2, 380 mg/m2, 385 mg/m2, 390 mg/m2, 3 95 mg/m2 ou 4 00 mg/m2.

O ligante de ligação de θνβ6 ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos pode ser administrado de acordo com uma ampla variedade de programas de dosagem. Por exemplo, o ligante de ligação de ανβ6 ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos pode ser administrado uma vez por dia por um período de tempo predeterminado (por exemplo, quatro a oito semanas ou mais) , ou de acordo com um programa semanal (por exemplo, um dia por semana, seis dias por semanas ou sete dias por semana) por um período de tempo predeterminado (por exemplo, quatro a oito semanas ou mais) . Um exemplo específico de um programa de dosagem de "uma vez por semana" é administração do ligante de ligação de θνβ6 ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos do mesmo nos dias 1, 8, 15 e 22 do período de tratamento. Em modalidades alternativas, o ligante de ligação de ανβ6 ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos podem ser administrados intermitentemente durante um período de meses. Por exemplo, o ligante de ligação de ανβ6 ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos podem ser administrados semanalmente por três semanas consecutivas de forma bi-anual (isto é, repetir o programa de dosagem semanal cada seis meses). Será reconhecido que esses regimes de administração podem ser continuados por períodos 3 0 prolongados (por ordem de anos) para manter efeitos terapêuticos benéficos fornecidos por tratamentos iniciais. Ainda em outras modalidades essa terapia de manutenção pode ser efetuada seguindo um regime de dosagem agudo projetado para reduzir os sintomas imediatos da condição cancerosa, metastática ou carcinoma no local.

A quantidade de ligante de ligação de θνβ6 ou agentes de bloqueio de TGF-β, ou fragmentos dos mesmos, administrada cada vez durante todo o período de tratamento pode ser igual; alternativamente, a quantidade administrada cada vez durante o período de tratamento pode variar (por exemplo, a quantidade administrada em um dado tempo de ser maior ou menor do que a quantidade administrada anteriormente). Por exemplo, doses dadas durante terapia de manutenção podem ser mais baixas do que aquelas administradas durante a fase aguda de tratamento. Programas de dosagem apropriados dependendo das circunstâncias serão evidentes para pessoas com conhecimentos comuns na técnica.

Em certas modalidades da invenção, múltiplos tipos ou espécies de ligantes de ligação de ανβ6 são combinados entre si e administrados a um paciente para tratar uma ou mais condições cancerosas, metastáticas ou de carcinoma no local. Por exemplo, a invenção considera a administração de dois ou mais anticorpos de ligação de θνβ6 diferentes e/ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos em um paciente, como aqueles revelados aqui. Quando múltiplos ligantes de ligação de ανββ e/ou agentes de bloqueio de TGF- β ou fragmentos dos mesmos são administrados a um paciente, os diferentes ligantes de ligação de θνβ6 e/ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos podem ser administrados juntos em uma única composição farmacêutica ou mais pref erivelmente, podem se administrados seqüencialmente em dosagens separadas. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de ligante de ligação de CtvP6 ou e/ou agentes de bloqueio de TGF-β ou fragmentos dos mesmos presentes na formulação, o tipo de doença ou distúrbio ou tratamento e outros fatores.

A presente invenção também inclui métodos para tratar condições cancerosas ou metastáticas que compreendem administrar a um paciente um primeiro agente em combinação com um segundo agente, onde o primeiro agente é um ligante de ligação de ανβε e o segundo agente é um agente que é útil para tratar uma ou mais condições cancerosas, metastáticas ou de carcinoma no local, porém que não é necessariamente um ligante de ligação de OtvP6. Em outros aspectos, a invenção provê métodos para tratar condições cancerosas ou metastáticas que compreendem administrar a um paciente um primeiro agente em combinação com um segundo agente, onde o primeiro agente é um agente de bloqueio de TGF-β ou fragmento do mesmo e o segundo agente é um agente que é útil para tratar uma ou mais condições cancerosas, metastáticas ou de carcinoma no local, porém que não é necessariamente um agente de bloqueio de TGF-β. Por administrar um primeiro agente "em combinação com" um segundo agente se quer dizer que o primeiro agente pode ser administrado ao paciente antes de, simultaneamente a, ou após administrar o segundo agente ao paciente, de tal modo que os dois agentes são administrados ao paciente durante o regime terapêutico. Por exemplo, de acordo com certas modalidades da invenção, um ligante de ligação de ανβ6 é 3 0 administrado a um paciente em combinação (isto é, antes, simultaneamente a, ou após) com a administração de um antagonista de um ou mais outros receptores de integrina (por exemplo, αιβι, α4βι, ανβ8, ανβ5; α5βι etc.) ao paciente, incluindo anticorpos, antagonistas de polipeptideo e/ antagonistas de molécula pequena específicos para um ou mais receptores de integrina (por exemplo, αχβι, α4βχ, Ονββ, «νβδ, α5βι etc.) que são conhecidos na técnica.

Em certas modalidades desse aspecto da invenção, o segundo agente que é administrado em combinação com um ligante de ligação de ανβε ou agentes de bloqueio de TGF- β ou fragmentos dos mesmos é, por exemplo, um esteróide, um composto citotóxico (incluindo aqueles descritos em outra parte aqui, e particularmente, paclitaxel, gemcitabina ou adriamicina (doxorrubicina), um radioisótopo (incluindo aqueles descritos em outra parte aqui), uma enzima de ativação de pró-medicamento (incluindo aquelas descritas em outro lugar na presente invenção), colquicina, oxigênio, um antioxidante (por exemplo, N-acetil cisteína), um quelador de metal (por exemplo, teratiomolibdato), IFN-β, IFN-γ, alfa-antitripsina e similares. Segundos agentes ou compostos adicionais que podem ser administrados a um paciente em combinação com um ou mais primeiros agentes, como um ou mais ligantes de ligação de θνβ6, para fins terapêuticos de acordo com esse aspecto da invenção, serão familiares para aqueles com conhecimentos comuns na técnica; o uso de tais segundos agentes ou compostos adicionais é, portanto considerado como abrangido pela presente invenção.

Kits de Diagnóstico 3 0 Em modalidades adicionais, a presente invenção provê kits, particularmente kits úteis em diagnóstico e/ou prognóstico de doenças ou distúrbios como cânceres. Kits de acordo com esse aspecto da presente invenção podem compreender pelo menos um recipiente que contém um ou mais dos ligantes acima descritos, como anticorpos, que se ligam a ou reconhecem integrina θνβ6. Esses kits da invenção podem compreender opcionalmente ainda pelo menos um recipiente adicional que pode conter, por exemplo, um reagente (como uma solução de sal tamponado) para distribuir o ligante (por exemplo, anticorpo) a uma amostra de teste como um órgão, tecido ou amostra de célula a partir de um paciente; pelo menos um recipiente adicional contendo, por exemplo, um reagente (incluindo, porém não limitado aos reagentes de ácido nucléico descritos acima) apropriado para determinar a expressão de smad4 em uma amostra biológica; TGF-β; um ou mais detergentes, agentes de Iise, ou outras soluções apropriadas para preparação de uma amostra biológica para teste; e similares. Outros componentes adicionais apropriados de tais kits da invenção serão familiares para 2 0 aqueles com conhecimentos comuns na técnica.

Será prontamente evidente para uma pessoa com conhecimentos comuns nas artes relevantes que outras modificações e adaptações apropriadas aos métodos e aplicações descritos aqui são óbvios e podem ser feitos sem se afastar do escopo da invenção ou qualquer modalidade da mesma. Tendo descrito agora a presente invenção em detalhes, a mesma será mais claramente entendida por referência aos seguintes exemplos, que são incluídos aqui para fins de ilustração somente e não pretendem ser limitadores da invenção. EXEMPLOS

Exemplo 1: θνβ6 é altamente expresso em metástases em relação a tumores primários

Nos presentes experimentos, os requerentes começaram a estudar a expressão de ανβ6 em uma variedade de cânceres de origem epitelial e em lesões metastáticas e determinar se o mAbs CXvP6 de bloqueio de função poderia inibir o crescimento de tumores que expressam ανβ6 in vivo. Os requerentes avaliaram a atividade antitumor in vitro e in vivo do presente mAbs de θνβ6 anti-humano em um carcinoma faríngeo humano, Detroit 62, e compararam esse com a atividade antitumor in vivo de TGFpRII:Fc. Os dados dos requerentes apoiam um papel em câncer humano para ανβε e potencial para intervenção terapêutica com um mAb Ονβε de bloqueio de função.

A. Materiais e métodos:

Para imunoistoquímica, seções de tecido foram desparafinizadas em xileno e etanol, reidratadas em água destilada, e então imersas em metanol contendo 0,45% de H2O. Os tecidos foram incubados com pepsina (00-3009, Zymed, San Francisco, CA) e bloqueados com avidina e biotina (SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA). O anticorpo primário foi diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e os tecidos foram incubados durante a noite a 4°C. Para imunocoloração β6 em tecido de xenoenxerto de camundongo, seções foram incubadas com uma forma quimérica de camundongo/humano do mAb anti-a^e, 2A1 (Weinreb, P.H. e outros, J. Biol. Chem. 279(17): 17875-17887 (2004)), e um anticorpo secundário biotinilado anti-humano (PK-6103, Vector Laboratories, Burlingame, CA) . Para imunocoloração β6 em tecido humano, seções foram incubadas com 2A1 de murino e um anticorpo secundário biotinilado-anticamundongo (PK-6102, Vector Laboratories). Peroxidase de raiz forte- completo de avidina-biotina (Vector Kit, PK-6102) foi aplicado em seções, incubadas por 3 0 minutos em temperatura ambiente, e substrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) foi preparado como dirigido (SK-4100, Vector Laboratories) e aplicado a seções por cinco minutos em temperatura ambiente. Seções de tecido foram coloridas com Mayer's Hematoxylin por 1 minuto e enxaguadas em água e PBS.

B. Resultados:

1. Expressão de ανβε em metástases

Imunocoloração de θνβ6 foi avaliada em uma variedade de metástases de tumor. 78% das metástases (43/55) foram imunocoloridas de forma positiva mostrando coloração intensa em uma maior parte de metástases (figuras IA-F; figuras 2A-I). Verificou-se que esse resultado é um aumento em percentagem positiva de imunocoloração em que se verificou que somente tumores de cabeça e pescoço, cervical e pancreático tem um nível equivalente de expressão (Tabela 2) :

Tabela 2. Expressão de θνβ6 em tumores humanos (imunoistoquímica) _

tecido a^6 + /total % Ονβ6 + Oral 4/4 100% Cervical 79/98 81% Pâncreas 31/39 80% Pele 41/53 77% Laringe & faringe 43/64 67% Esôfago 35/56 63% Endométrio 17/32 53% pulmão 28/70 40% Mama 41/101 41% colorretal 181/488 37%

2. Expressão de ανβ6 em amostras de tumor pancreático humano, metástases casadas-paciente e modelo de xenoenxerto de camundongo, de tumor pancreático invasivo

Como mencionado acima na Tabela 2, imunocoloração de ανβε foi positivo em 80% de tumores pancreáticos examinados. Quando amostras de tumores pancreáticos primários de oito pacientes diferentes foram examinadas por imunoistoquímica, a coloração foi proeminente em regiões invasivas de tumores de tipo elevado (figuras 4A-4C; 5A-5E). As amostras de tumor primário também tinham metástases de linfonodo casadas (figuras 4D-4F; 5F-5J), que também demonstraram coloração de OtvPe forte, suportando a noção de que células positivas de OvPe disseminaram a partir do sítio de tumor primário. Em pâncreas normal (figuras 4G-4H; 5K-5L), a coloração foi confirmada em células ocasionais na camada de superfície.

Para examinar adicionalmente a influência de expressão de ανβ6 em invasão de célula de tumor, os requerentes utilizam um xenoenxerto de tumor de camundongo BxPC-3 como um modelo de adenocarcinoma pancreático humano invasivo. Os animais tiveram implantados (dia 0) de forma subcutânea no flanço 5 χ IO6 células/camundongo, suspenso em solução salina estéril, utilizando uma injeção de 0,1 ml/camundongo. No 30° dia, os camundongos com tumores estabelecidos (-60-100 mm3) foram casados em pares com cada um de três grupos de tratamento (PBS; mAb 3G9; proteína de fusão Ig-receptor II TGFP solúvel (solTGFpRII-Fc)) para todos os estudos. Os agentes de teste foram administrados em camundongos por via intraperitoneal em um programa de tratamento 3 vezes por semana. Os camundongos foram injetados com 3G9 em 10 mg/kg, solTGFpRII-Fc em 2 mg/kg ou PBS (controle negativo). 0 crescimento de tumor foi medido duas vezes por semana e o volume de tumor estimado de acordo com a fórmula: [(largura)2 χ comprimento]/2. Os tumores de grupos de tratamento foram excisados, fixos em 10% de paraformaldeído, embebidos em parafina e seccionados para análise imunoistoquímica utilizando mAb quimérico νβ de não bloqueio 6.2A1.

0 tratamento com mAb anti-avp6 3G9 teve um efeito direto sobre o crescimento de tumor (figuras 6B, 6C) , com crescimento de tumor significativamente reduzido observado após aproximadamente 48 dias de tratamento com o anticorpo. 0 nível de inibição de crescimento observado com SolTGFpRII-Fc foi de um certo modo menor do que aquele observado para 3G9. Esses resultados indicam que o mAb antϊ-(Χνβ6 3G9 inibe crescimento de tumor em um modelo de xenoenxerto de câncer pancreático humano, e sugerem que tais anticorpos de bloqueio poderiam ser úteis para inibir crescimento de tumor, e por invasão de tumor de extensão, em adenocarcinomas pancreáticos humanos, primários.

Exemplo 2: relação inversa entre expressão de gene smad4 e expressão de integrina em tumores pancreáticos humanos primários

Para examinar a relação entre expressão de smad4 e 3 0 expressão de avp6 em células de tumor primário, seções de tumores pancreáticos primários humanos foram obtidas e coloridas, via imunoistoquímica para proteína SMAD4 e para ανβε. Quatorze amostras de tumor a partir de pacientes diferentes foram examinadas. Os resultados são mostrados nas figuras 7-13.

Das 14 amostras de tumor, verificou-se que 7 (50%) têm claramente áreas de tumor Ονβε+/ enquanto 5 dessas mostraram heterogeneidade em expressão (isto é, algumas seções do tumor que eram ανβ6+ανβ6 em, outras seções no mesmo tumor que eram θνβ6-; figuras 8-9). Verificou-se que sete dos 14 tumores eram ανβε -negativos.

Nos 11 tumores (excluindo os 3 que eram heterogêneos em expressão de ανβ6) , os seguintes resultados foram observados figuras 7-10, 13: (A) quatro eram ανβ6 +, e desses, três eram smad4- e um

era smad4+; e

(B) sete eram ανβ6 -, e todos os sete desses eram smad4+.

Dos três tumores nos quais a expressão de θνβ6 era heterogênea, os seguintes resultados foram observados (figuras 11-13) :

(A) aquelas áreas dos tumores que eram θνβ6 + eram smad4-; e

(B) aquelas áreas dos tumores que eram θνβ6 - eram

2 5 smad4+.

Esses resultados suportam a conclusão de que há uma relação inversa entre a expressão de smad4 e de integrina ανβ6 por células de tumor pancreático primário.

Exemplo 3: expressão de ανβ6 e smad4 em linhagens de

3 0 células de câncer pancreático. A expressão de ανβ6 e smad4 foi determinada para um painel de linhagens de células pancreáticas. Os resultados são resumidos na figura 14.

Em uma análise preliminar de expressão de ανββ e smad4 em adenocarcinomas ductais pancreáticos primários (PDACs) , três conjuntos de amostra foram examinados. No primeiro conjunto, 10 amostras de PDAC foram testadas por conjunto BioCat, e verificou-se que todas as 10 (100%) expressam ανβ6. No segundo conjunto, 14 amostras de adenocarcinoma pancreático foram testadas por ensaio Cytomix, e 7 (50%) desses eram positivos OvP6. No terceiro conjunto, 11 amostras de PDAC foram testadas por um conjunto Folio (figura 15), e dessas 10 (91%) eram positivas ανβ6.

Para os segundo e terceiro conjuntos de amostras, expressão de smad4 foi também ensaiada. Verificou-se que quinze linhagens eram positivas θνβ6, e 11 das linhagens eram positivas smad4. Doze linhagens eram ανβε +/smad4-; 8 linhagens eram a^6./smad4 +; e 3 linhagens eram ανβ6 +/smad4+. Duas das linhagens eram heterogêneas e tinham áreas que coloriam como θνβ6 +/smad4- e ανβ6 -/smad4+ (figura 16) .

Setenta PDACs foram examinados por imunoistoquímica em Biomax Tissue MicroArray (figura 17) . 89% dessas amostras foram determinados como sendo positivos θνβ6 ; 97% dos quais foram regulados descendentes smad4. No total, 86% tinham um fenótipo θνβ6 +/smad4.

Em um estudo separado de 5 0 PDACs examinados por imunoistoquímica em conjuntos de tecidos preparados na Leiden University Medicai Center (LUMC) (doravante, "conjuntos Leiden"), 88% foram determinados como sendo positivos θνβ6, 59% dos quais eram regulados descendentemente smad4 (figura 18). No total, 52% tiveram um fenótipo de Ονβε +/smad4-.

Em um estudo de 9 metástases de PDAC examinados utilizando os conjuntos Leiden, verificou-se que todos eram positivos θνβ6 (a maioria era fortemente positiva), e 78% tiveram fenótipo ανβ6 +/smad4- (figura 19).

Os resultados acima indicam que um fenótipo de ανβ6 +/smad4- é o fenótipo predominante em cânceres pancreáticos humanos primários.

Uma representação gráfica dos resultados de análise de expressão de ανβ6 e smad4 em PDAC como marcado nos conjuntos Leiden e Biomax é mostrada na figura 20. As diferenças em resultados observados entre os dois métodos diferentes podem ser devido às intensidades mais baixas de expressão smad4 observada utilizando os conjuntos Biomax.

Exemplo 4: resposta de BxPC-3 implantado de forma subcutânea, adenocarcinoma pancreático humano, a mAb ανβ 3G9 e produtos quimioterapêuticos, adriamicina

2 0 (Doxorrubicina) e gemcitabina, ambos como agentes

individuais e em combinação

Como modelo para tratamento de tumor humano, quimioterapia individual ou em combinação foi realizada no modelo de camundongo xenogeneico BxPC-3 de tumores pancreáticos humanos. BxPC-3 é conhecido como sendo deficiente em smad4 devido a uma deleção de homozigoto aparente do gene smad4 nessas células (Subramanian, G. e outros, Câncer Res. 64:5200- 5211 (2004); Yasutome, M. e outros, Clin. Exp. Metastasis 22:461-473 (2005).

3 0 Materiais e métodos: 10

15

1. Animais: 220 camundongos-fêmeas sem pêlo atímicos de Harlan Sprague Dawley (Madison, WI), rec: 13/03/2006, data de nascimento: 30/01/2006. Os camundongos entraram no estudo com 6-7 semanas de idade. Os animais foram aclimatados ao laboratório por pelo menos 5 dias antes da implantação de tumor. Os animais são individualmente marcados com chips de ID implantáveis BioMedic. A coleta de dados executada utilizando Onco Pharmacology Informatics (OPl).

2. Tumor: BXPC-3, a linhagem de célula obtida originalmente a partir da Universidade de Arizona (Tucson, AZ) . A linhagem de célula é um adenocarcinoma pancreático humano. A linhagem doadora foi passada por 5 gerações em camundongos fêmeas sem pêlo atímicos antes da implantação nesse estudo. Os animais implantados com um fragmento de 3 mm3 de tecido via trochar por meio subcutâneo na área do flanço direito. Os tratamentos foram iniciados em um tumor estabelecido com um tamanho mínimo de 100 miligramas e três

No. do grupo Tratamento** No. de camundongos 1 Controle de veículo, PBS sem pirogênio, 10 ml/kg/ini, i.p. 2x/semana mais 0,9% solução salina estéril, 10 ml/kg/ini, i.v., Q4Dx3 18 2 3G9, 10 mg/kg/inj., i.p., 2x/semana 10 3 Gemcitabina, 100 mg/kg/inj., i.p., Q4Dx3 10 4 Gemcitabina, 140 mg/kg/inj., i.p., Q4Dx3 10 Adriamicina (doxorrubicina) , 3mg/kg/inj., i.v., Q4Dx3 10 6 Adriamicina (doxorrubicina) , 6mg/kg/inj., i.v., Q4Dx3 10 7 3G9, 10 mg/kg/inj., i.p., 2x/semana mais Gemcitabina, 100 mg/kg/inj., i.p., Q4Dx3 10 8 3G9, 10 mg/kg/inj., i.p., 2x/semana mais Gemcitabina, 14 0 mg/kg/inj., i.p., Q4Dx3 10 9 3G9, 10 mg/kg/inj., i.p., 2x/semana mais Adriamicina (Dox), 3 mg/kg/inj., i.p., Q4Dx3 10 3G9, 10 mg/kg/inj., i.p., 2x/semana mais Adriamicina (Dox), 6 mg/kg/inj., i.p., Q4Dx3 10

3 . Programa de teste

Dia 1: implantar transponders de ID de forma subcutânea no flanco esquerdo

Dia 0: implantar tumor como descrito acima. Realkiuzar culturas bacterianas no tumor implantado em camundongos. Registrar peso corporal inicial de animais.

Dia 2: começar o registro de medições de peso de corpo e tamanho de tumor e continuar em dias alterados até o dia de apresentação.

Dia de apresentação (dia de tratamento 1)

(aproximadamente dia 11-13 após implantação): selecionar camundongos com tumores que medem um tamanho mínimo de 100 miligramas determinado utilizando calibradores de Venier. Randomizar camundongos em grupos de tratamento e controle e registrar pesos corporais. Administrar doses i.p. no programa listado acima. As doses são feitas às cegas em cada regime de dosagem.

Continuar a registrar tamanho de tumor e pesos corporais em camundongos 2x / semana. Monitorar o estudo diariamente e fazer anotações de qualquer observação incomum nos animais. 0 estudo será secreto até término do estudo.

Sangria de ponto médio: (dia 34/35 após implantação). Antes da primeira dose de 3G9 para a semana coletar soro de animais/grupo a partir de todos os grupos. 24 horas após dosagem, coletar soro dos 5 animais/grupo restantes a partir de todos os grupos. Utilizar os 5 animais/grupo restantes não utilizados para a coleta de soro 24 horas mais cedo.

Semana final de dosagem (dia 44/45 após implantação): antes da dose final de 3G9 coletar soro de 5 animais/grupo a partir de todos os grupos. 24 horas após dosagem, coletar soro dos 5 animais/grupo restantes a partir de todos os grupos. Utilizar os 5 animais/grupos restantes não utilizados para a coleta de soro 24 horas mais cedo.

Pontos finais:

(a) peso corporal inicial

(b) medições de peso corporal e tamanho de tumor duas vezes por semana

(c) níveis de 3G9 de soro no ponto médio e semana de dosagem final

no sacrifício:

7 tumores de cada um dos seguintes grupos são colhidos; 1/2 de cada tumor preservado em 10% NBF, a outra 1/2 congelado em OCT.

Grupo 1: veículo; grupo 2: 3G9; grupo 4: gemeitabina (Gem) @ 140 mg/kg; grupo 6: doxorrubicina (Dox) @ 6 mg/kg; grupo 8: 3G9 mais Dox @ 6 mg/kg; e grupo 10: 3G9 mais Gem em 14 0 mg/kg.

Resultados

Os resultados desses experimentos são representados nas figuras 21-28. Esses resultados demonstram que 3G9 em combinação com gemeitabina leva à inibição de crescimento significativamente aumentada, o que parece ser sinérgico. 0 efeito combinado é ainda maior quando 3G9 é combinado com doxorrubicina (adriamicina), aproximadamente 60% de inibição de crescimento. Essa quimioterapia em combinação foi escolhida porque dados obtidos mais cedo com esse modelo de xenoenxerto por oncofarmacologia (não mostrado) mostraram que BxPC-3 era resistente a gemeitabina. Juntos, esses resultados demonstram que a linhagem de células deficiente em smad4 BxPC-3 é (a) responsiva a tratamento (medido como inibição de crescimento) com mAbs anti-OvP6 como agentes únicos; e (b) é quimiossensibilizado por tratamento com mAbs anti-OvPe para tratamento subsequente (ou simultâneo) com agentes de molécula pequena como gemeitabina e doxorrubicina.

Efeitos sinérgicos similares foram observados em

2 5 camundongos transplantados com as linhagens de célula de

câncer pancreático Su96.6 (figura 29), Pac04 (figura 30) e Capan-2 (figura 31), quando tratados com uma combinação de 6G9 e gemeitabina (14 0 mg/kg). Entretanto, quando camundongos transplantados com a linhagem de célula

3 0 pancreática SW1990 foram tratados com a mesma terapia de combinação, não houve diferença significativa em efeito terapêutico em comparação com tratamento com gemcitabina sozinho (vide a figura 32C) . Quando a concentração de gemcitabina foi diminuído para 100 mg/kg, o tratamento com gemcitabina sozinho foi significativamente melhor do que quando a terapia de combinação (figura 3 2B) . Quando a concentração de gemcitabina foi diminuída ainda mais para 8 0 mg/kg, o tratamento com a terapia de combinação era significativamente melhor do que o tratamento com gemcitabina ou 39G sozinho (figura 32A) , como observado com as outras linhagens de células na concentração de gemcitabina mais elevada de 14 0 mg/kg. Em um modo de xenoenxerto Capan-1, uma terapia de combinação de anticorpo 3G9 e gemcitabina foi somente tão eficaz quanto gemcitabina sozinho, e uma terapia de combinação de TGF-β RII-Fc e gemcitabina (figura 33) .

Gemcitabina e 3G9 diminuíram significativamente o volume do tumor em um modelo ortotópico de câncer pancreático utilizando células a partir da linhagem de célula ASPC-I. 0 tratamento com gemcitabina sozinho ou 3G9 sozinho não teve um efeito significativo sobre o volume de tumor (figura 34).

Estudos de sinalização foram executados em tumores de xenoenxerto tratados de BxPC-3, Panc04 e Capan-2. Tumores foram colhidos em diferentes pontos de tempo após tratamento com 3G9 e gemcitabina para as seguintes análises:

Tabela 3. Sumário de estudos de sinalização

leitura Western IHC Pressão de fluido Fibronectina X intersticial de tumor Colágeno I X SmaI X CD31 X apoptose Caspase X TUNEL X sobrevivência ρ-AKT X proliferação ρ-ERK X Ki67 X via p-smad-2 X FAK X

Os resultados dos estudos acima são resumidos na figura 35.

Exemplo 5: fenótipos de sobrevivência de um grupo de 2 6 pacientes de Leider University Medicai Center.

Dados de sobrevivência para pacientes diagnosticados

com câncer pancreático são mostrados nas figuras 36 e 37. Os quatro painéis na figura 36 e figura 37 expressam os dados em termos de expressão de avb6 e smad4.

Genericamente, os pacientes com tumores que expressam smad4 sobrevivem mais tempo do que pacientes com tumores que não expressam smad4. Além disso, pacientes com um fenótipo de ανβ6 +/smad4- têm uma sobrevivência significativamente reduzida.

Exemplo 6: inverso de inibição de crescimento de células de tumor smad4 + /avPe + por ligantes anti-avp6

A linhagem de célula pancreática humana SW1990 foi testada no mesmo sistema de camundongo xenogeneico como descrito no exemplo 4. Os resultados são representados nas figuras 3 8-41. A linhagem de células SW1990 mostrou heterogeneidade de expressão de ανβε ■ A linhagem de células foi separada e enriquecida para células ανβε positivas e ανβε negativas (figura 41 C-E) . A análise western blot das variantes resultantes mostrou que a população Ονβε positiva era smad4+, enquanto a população θνβ6 negativa era smad4- (figura 41A) . Desse modo, a linhagem de células SW1990 ανβ6 positiva não se adapta no perfil da linhagem BxPC-3 no qual os requerentes viram inibição de crescimento de tumor por mAb de bloqueio de θνβ6 3G9, especialmente em combinações com quimiotratamento (exemplo 4). Uma vez que as seções de tecido do xenoenxerto SW1990 mostraram expressão de θνβ6 (figura 41B), espera-se, portanto que essas células in vivo sejam, na realidade, smad4+. Camundongos implantados com células SW1990 foram então

tratados in vivo com mAb de murino 3G9 ou com TGF-β RII-Fc solúvel como descrito no exemplo 4, e foram avaliados em relação a crescimento de tumor com o passar do tempo. Os resultados são mostrados nas figuras 38-40, que demonstram que ao contrário da linhagem de tumor pancreático BxPC-3, tumores SW1990 não são inibidos de crescimento por tratamento com o mAb anti-a^6 3G9, porém em vez disso demonstram um leve aumento em crescimento de células. 0 efeito inverso de tratamento com 3G9 ou TGF-β RII sol. sobre crescimento em SW1990 pode ser explicado por raciocínio de que na presença de smad4, TGF-β pode induzir um sinal inibidor de crescimento, que anulou quando TGF-β (ativação) é bloqueado por TGF-β RII solúvel e/ou 3G9.

Esses resultados sugerem que para serem responsivos a 3 0 ligantes αΛΛβ6, células de tumor devem ser deficientes em expressão de smad4, uma vez que a linhagem de célula smad4+ SW1990 não era inibida por crescimento por mAbs anti-avP6 , enquanto a linhagem de células smad4- BxPC-3 era. Esses resultados são assim compatíveis com a hipótese de Ονβε /smad4 e suportam a capacidade de resposta em um conjunto selecionado de pacientes com câncer pancreático (smad4- /CXvPe +) , indicando que um marcador clínico útil para prever a sensibilidade ou capacidade de resposta de células de tumor, particularmente células de tumor pancreático, aos ligantes ativos de Ονβε ou quimiossensibilização com as mesmas, seria para determinar o nível de expressão de smad4 naquelas células de tumor.

EXEMPLO 7: inibição de crescimento de células de carcinoma faríngeo humano Detroit 5 62 por mAbs ανβ6 Em um estudo xenogeneico, células de carcinoma

faríngeo humano Detroit 562 foram implantadas por via subcutânea em camundongos de acordo com o protocolo descrito no exemplo 4 . 0 crescimento do tumor foi então avaliado com o passar do tempo como descrito nos exemplos anteriores. Os resultados são mostrados nas figuras 42-54.

Esses resultados indicam que no modelo Detroit 562, mAbs anti-avp6 3G9 de murino e humanizado foram capazes de inibir significativamente o crescimento de tumores, enquanto outro mAb anti-avpe (notavelmente 4B4 de murino) era menos eficaz.

Exemplo 8: relevância de bloqueio de OvPs +em câncer pancreático

Smad4 é inativado em aproximadamente 55% de adenocarcinomas pancreáticos (Tascilar e outros; Clin. Câncer Res. 4:4115-4121, 2001). Lohr e outros (Câncer Res . 61:550-555, 2001) reportaram que TGFp confere potencial desmoplástico em câncer pancreático, que causa fibrosa. Esse potencial desmoplástico, entretanto, correlacionou com expressão de smad4. Os requerentes observaram que linhagens de célula pancreática humana que eram nulas smad4 (AsPC-2, BxPC-3, Capan-I e Capan-2), induziram desmoplasia quando transplantadas em camundongos, enquanto linhagens de células que continham smad4 do tipo selvagem (PaCa-2, PaCa- 3, PaCa-44, e PANC-1) não induziram desmoplasia (vide a tabela 1 de Lohr e outros).

Sumário de resultados. Os requerentes descobriram que ανβ6 é altamente regulado ascendentemente em câncer pancreático. Os requerentes obtiveram também dados de eficácia com mAb ανβ6 (3G9) in vivo, determinando eficácia de agente único em um modelo de câncer faríngeo e em dois modelos de câncer pancreático. Os requerentes também observaram que o tratamento com uma combinação de 3G9 e gemcitabina demonstrou eficácia aumentada em relação a gemcitabina individualmente e 5 de 7 modelos de xenoenxerto pancreático (figura 35) .

Tendo descrito agora plenamente a presente invenção em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para fins de clareza e compreensão, será óbvio para uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica que a mesma pode ser realizada modificando ou alterando a invenção em uma faixa ampla e equivalente de condições, formulações e outros parâmetros sem afetar o escopo da invenção ou qualquer modalidade específica da mesma, e que tais modificações ou alterações pretendem ser abrangidas no escopo das 3 0 reivindicações apensas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo são indicativos do nível de conhecimentos daqueles versados na técnica à qual essa invenção se refere, e são aqui incorporados a título de referência até o mesmo ponto como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado a título de referência. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Violette, Shelia

Koopman, Louise A.

<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA INIBIR CRESCIMENTO DE CÂNCERES DEFICIENTES EM SMAD4

<13 O > 07482.0009.NPUSOO

<14 0 > US 11/822,859 <141> 10/07/2007

<150> US 60/819,359 <151> 10/07/2006

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210 > 1 <211 > 10 <212 > PRT <213 > Seqüência Artificial <22 0 > <223 > Sintética <400> 1

Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His 10

<210 > 2 <211> 10 <212 > PRT <213 > Seqüência Artificial <22 0 > <223> Sintética <4 0 0 > 2

Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met His 10

<210 > 3 <211> 10 <212 > PRT <213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223 > Sintética

<4 0 0 >

3 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Val Met Ser 10

<210> 4 <211> 10 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<22 3 > Sintética <4 0 0 > 4

Gly Tyr Asp Phe Asn Asn Asp Leu Ile Glu 10

<210> 5 <211> 10 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Sintética <4 0 0 > 5

Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu 10

<210> 6 <211> 17 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<22 3 > Sintética <4 0 0 > 6

Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 10 15

Gly

<210> 7 <211> 17 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial

<220> <223> Sintética <4 O O > 7

Val Ile Asp Thr Tyr Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Glu 10 15

Gly

<210 > 8

<211> 16

<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética

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Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 10 15

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<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Synthetic <4 0 0 > 9

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly 10 15

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<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética

<400> 10

Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 10 15

Gly <210 > 11 <211> 17 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética <4 O O > 11

Val Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 10 15

Gly

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética <4 0 0 > 12

Gly Gly Leu Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala Met Asp 10 15

Tyr

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética <4 0 0 > 13

Gly Gly Phe Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala Met Asp 10 15

Ser

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética <4 O O > 14

Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Ala Tyr 10

<210> 15 <211> 12 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética <4 0 0 > 15

Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr 10

<210> 16 <211> 12 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<22 3 > Sintética <4 0 0 > 16

Ile Tyr Tyr Gly Pro His Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 10

<210> 17 <211> 11 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Sintética <4 0 0 > 17

Ile Asp Tyr Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asp Asp 10

<210> 18 <211> 15 <212 > PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética <4 O O > 18

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr 10 15

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética <400> 19

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Thr Tyr Ser Tyr Ile His 10 15

<210 > 20 <211> 12 <212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética <4 0 0 > 20

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr 10

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<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Sintética <400> 21

Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr 10

<210 > 22

<211> 11

<212 > PRT

<213> Seqüência

Arti ficial <220>

<223> Sintética <400> 22

Lys Ala Ser Leu Asp Val Arg Thr Ala Val Ala 10

<210> 23

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<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Sintética

<4 0 0> 23

Lys Ala Ser Gln Ala Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10

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<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0 >

<223> Sintética

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Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5

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<213> Seqüência Artificial <220>

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Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

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<213> Seqüência Artificial <220> <223> Sintética <4 O O > 26

Ser Ala Ser Tyr Arg 1 5

8/9

Tyr Thr

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<211> 7

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<213> Seqüência Artificial <220>

<22 3 > Sintética

<4 O O > 27

Ser Ala Ser Tyr Gln Tyr Thr 1 5

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<211> 9

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<213> Seqüência Artificial <220>

<22 3 > Sintética

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Gln His Asn Trp Glu Ile Pro Phe Thr 1 5

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<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Sintética

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Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr 1 5

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<213> Seqüência Artificial

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His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5

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His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro Pro Thr 1 5

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Gln Gln His Tyr Gly Ile Pro Trp Thr 1 5

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<4 0 0 > 33

Gln His His Tyr Gly Val Pro Trp Thr 1 5

Claims (25)

1. Uso de um ou mais ligarites que se liga a uma ou mais subunidades de integrina ανβ6 em uma célula de tumor deficiente em smad-4 e/ou um ou mais agentes que inibe a via de sinalização de TGF-β em uma célula de tumor deficiente em smad4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para induzir inibição de crescimento ou morte de uma célula de tumor deficiente em smad4.

2. Uso de um ou mais ligantes que se liga a uma ou mais subunidades de integrina ανβ6 em uma célula de tumor deficiente em smad-4 e/ou um ou mais agentes que inibe a via de sinalização de TGF-β em uma célula de tumor deficiente em smad4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para quimissensibilizar uma célula de tumor deficiente em smad4 para tratamento com um, composto quimioterapêutico que inibe crescimento, onde um ou mais ligantes que se ligam a uma ou mais subunidades de integrina 3νβ6 em uma célula de tumor deficiente em smad4 e/ou um ou mais agentes que inibe a via de sinalização de TGF-β aumentam a capacidade de resposta de células de tumor a um ou mais compostos quimioterapêuticos que inibem crescimento.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tumor é um adenocarcinoma ou um carcinoma selecionado do grupo que consiste em um carcinoma pancreático, um carcinoma colorretal, um carcinoma cervical, carcinoma de célula escamosa, um carcinoma de cabeça e pescoço, um carcinoma de fígado, um carcinoma de ovário e um carcinoma de pulmão.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ligante que se liga a uma integrina ανβ6 é um anticorpo ou um fragmento de ligação de epítopo ανβ6 do mesmo.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal quimérico, primatizado, humano ou humanizado.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é selecionado do grupo que consiste em 2A1, 2E5, 1A8, 2B10, 2B1, IGlO, 7G5, 1C5, 8G6, 3G9, 10D5 e CSp6.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é 3G9 ou 8G6.

9.. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal humanizado.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal humanizado é hu3G9 (BG00011) ou hu8G6.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ligante é conjugado com pelo menos um rótulo detectável.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o rótulo detectável é selecionado do grupo que consiste em um rótulo cromogênico, um rótulo de enzima, um rótulo radioisotópico, um rótulo isotópico não radioativo, um rótulo fluorescente, um rótulo tóxico, um rótulo quimiluminescente, um rótulo X- -j radiográfico, um rótulo de spin e um rótulo de agente de contraste de ressonância magnética nuclear. A

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo cromogênico é selecionado do grupo que consiste em diaminobenzidina e 4- hidróxi azo-benzeno-2-ácido carboxílico.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo de enzima é selecionado do grupo que consiste em desidrogenase de malato, nuclease estafilococal, isomerase delta-5- esteróide, desidrogenase de álcool-levedura, desidrogenase de fosfato alfa glicerol, isomerase de fosfato de triose, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glicose, β-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, desidrogenase de fosfato glicose-6-, glicoamilase e esterase de acetil colina.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo radioisotópico é selecionado do grupo que consiste em 3H, 111In, 125I, 131I, 32P, -35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, ,67Cu, ,217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc e 109Pd.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo isotópico não radioativo é selecionado do grupo que consiste em 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr7 56Fe, "mTc e 112In.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo fluorescente é selecionado do grupo que consiste em um rótulo 152Eu, um rótulo de fluoresceina, um rótulo de isotiocianato, um rótulo de rodamina, um rótulo de ficoeritrina, um rótulo de ficocianina, um rótulo de aloficocianina, um rótulo de Proteína fluorescente verde (GFP), um rótulo de o-ftaldeído e um rótulo de fluorescamina.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo tóxico é selecionado do grupo que consiste em um rótulo de toxina de difteria, um rótulo de ricina e um rótulo de toxina de cólera.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo quimiluminescente é selecionado do grupo que consiste em um rótulo de luminol, um rótulo de isoluminol, um rótulo de éster acridínio aromático, um rótulo de imidazol, um rótulo de sal acridxnio, um rótulo de éster oxalato, um rótulo de luciferina, um rótulo de luciferase e um rótulo de aequorina.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo radiográfico-X é bário ou césio.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo de spin é deutério.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rótulo de agente de contraste de ressonância magnética nuclear é selecionado do grupo que consiste em Gd, Mn e ferro.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o agente que inibe a via de sinalização de TGF-β na célula do tumor é selecionado do grupo que consiste em: (a) uma molécula de proteína cinase; (b) um composto terapêutico de molécula pequena; e (c) um peptídeo receptor 'de TGF-β solúvel.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o composto quimioterapêutico de inibição de crescimento é selecionado do grupo que consiste em cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, paclitaxel, gemcitabina, adriamicina, melfalan, metotrexato, 5 -fluorouracil, etoposide, mecloroetamina, ciclofosfamida, bleomicina, caliqueamicina, maitansina, tricoteno, CC1065, cadeia de difteria A, cadeia de exotoxina A Pseudomonas aeruginosa, cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, uma proteína Aleuritesfordii, uma proteína diantina, uma proteína Phytolaca americana, inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricoteceno, ribonuclease, e desoxirribonuclease.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o composto quimioterapêutico de inibição de crescimento é gemcitabina, adriamicina ou paclitaxel.