BRPI0714697A2

BRPI0714697A2 - mÉtodo para a determinaÇço in vivo da quantidade de Ácidos nucleicos nucleares em pelo menos uma cÉlula de um indivÍduo animal ou humano, e, uso de um dispositivo

Info

Publication number: BRPI0714697A2
Application number: BRPI0714697-3A
Authority: BR
Inventors: Bernardus Hendrikus Wilhelmus Hendriks; Boer Ruth Wilhelmine Ireen De; Gerhard Spekowius; Stein Kuiper; Der Vaart Nijs Cornelis Van
Original assignee: Koninkl Philips Electronics Nv
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-07-11
Publication date: 2013-03-12
Also published as: WO2008015599A2; CN101517395A; US20090326359A1; WO2008015599A3; JP2009545737A; RU2009107692A; EP2059786A2

Abstract

MÉTODO PARA A DETERMINAÇçO IN VIVO DA QUANTIDADE DE ÁCIDOS NUCLEICOS NUCLEARES EM PELO MENOS UMA CÉLULA DE UM INDIVÍDUO ANIMAL OU HUMANO, E, USO DE UM DISPOSITIVO. A invenção refere-se a um método de determinação in vivo em um indivíduo animal ou humano, da quantidade de DNA nuclear, através primeiramente da localização dos núcleos celulares de tecido vivo e subsequentemente através da absorção de UV nuclear usando microscopia por escaneamento confical. A invenção refere-se também a um método para a detecção de células cancerosas in vivo em um indivíduo humano ou animal, primeiramente através da identificação da localização dos núcleos celulares em tecido vivo e subsequentemente determinado a absorção de UV nuclear através de microscopia confocal de escaneamento a laser. Além disso, a invenção refere-se a um método para o diagnóstico de câncer em um indivíduo humano ou animal in vivo, baseada em uma combinação de identificação de núcleos celulares no tecido vivo e através da medição da absorção de UV nuclear através de microscopia confocal de escaneamento a laser.

Description

"MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO IN VIVO DA QUANTIDADE DE ÁCIDOS NUCLEICOS NUCLEARES EM PELO MENOS UMA CÉLULA DE UM INDIVÍDUO ANIMAL OU HUMANO, E, USO DE UM DISPOSITIVO"

A invenção refere-se a um método de determinação in vivo da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em células de um indivíduo humano ou animal, através da localização dos núcleos da célula in vivo e medição da absorção nuclear de luz ultravioleta.

A invenção refere-se também a um método de detecção de células cancerosas in vivo em um indivíduo animal ou humano, através da localização dos núcleos celulares in vivo e medição da absorção nuclear de luz ultravioleta.

De um modo similar, a invenção refere-se a um método de diagnóstico e/ou previsão de câncer em um indivíduo animal ou humano, que é executado in vivo e que é baseado na localização dos núcleos celulares e na medição da absorção de UV nuclear.

A detecção precoce do câncer é uma característica chave no tratamento de pacientes com câncer. Existem várias possibilidades de que sejam detectadas células cancerosas em uma amostra biológica e que, deste modo seja diagnosticado um câncer existente ou, pelo menos, que seja estimada a probabilidade de desenvolvimento de um câncer futuro. Estas abordagens diferentes compreendem o exame físico do tecido canceroso, a caracterização morfológica de células cancerosas, o manchamento imuno- histoquímico e a caracterização de estruturas celulares, tais que as membranas e o núcleo, medindo a expressão de fatores específicos do tumor, etc.

Uma possibilidade de detecção de células cancerosas é a assim denominada citometria de DNA, que mede a quantidade de DNA nuclear, de modo a detectar desvios a partir do conteúdo de DNA normal. É assumido que, se uma célula, como uma conseqüência de eventos mutagênicos, compreender menos ou mais DNA do que um padrão conhecido, que é conhecido como sendo não-canceroso, isto é, do tipo "saudável " ou "normal", este desvio no conteúdo de DNA será indicativo de rearranjos cromossômicos maiores e, deste modo, de desenvolvimento de câncer em andamento.

A quantificação de DNA nuclear através de manchas específicas de ácidos nucleicos está, deste modo, se tornando uma prática, tanto em aplicações de pesquisa, quanto clínicas, no contexto do diagnóstico do câncer.

A medição do conteúdo de DNA nuclear através ou de citometria de fluxo ou de imagem, é baseada, inter alia, no pressuposto de que (i) a quantidade de mancha ligada ao DNA é proporcional à quantidade de DNA presente e (ii) o sinal óptico gerado a partir da mancha através de emissão, absorção ou transmissão, é proporcional à quantidade de mancha.

Um procedimento de manchamento específico para DNA, que é usado, de um modo típico, com o propósito de medir o DNA nuclear através de citometria de imagem de DNA é uma reação baseada em ácido, denominada de Feulgen e Rossenbeck, freqüentemente simplesmente referida como a reação de Feulgen. De fato, a reação de Feulgen é uma reação cromogênica, na qual o DNA é hidrolisado através de um ácido, de modo a criar um DNA isento de purina (isto é, um assim denominado ácido apurínico, ΑΡΑ) com grupos aldeído livres. Estes são então reagidos com um reagente de Schiff, contendo um corante, que é ligado, de um modo covalente, aos grupos aldeído livres.

Embora a reação de Feulgen seja específica para DNA, ela apresenta várias desvantagens. Ela é muito demorada e é uma reação bastante elaborada, que precisa ser cuidadosamente controlada e validada, de um modo a fornecer resultados reprodutíveis e significativos. Um problema decorre do fato de que o APA é hidrolisado em fragmentos menores através de HCl, que é usualmente empregado para a remoção de bases de purina. No entanto, a fragmentação das moléculas de APA conduz à remoção destes fragmentos a partir do núcleo da célula e, deste modo, à perda de material de DNA que pode ser manchado.

Além destas desvantagens, que são inerentes ao método de manchamento de Feulgen, não é possível colorir o DNA nuclear através do método de Feulgen in vivo, pois o manchamento de Feulgen em si mesmo pode ser mutagênico e, deste modo, dar origem ao desenvolvimento de câncer.

Ainda uma outra característica dos métodos de citometria por imagem de DNA é a de que estes métodos requerem um modo de operação, no qual as células são espalhadas, por exemplo, sobre lâminas de vidro, de um modo a permitir a medição de células individuais. No entanto, a execução de medições de citometria de DNA in vivo são, naturalmente, complicadas pelo fato de que não é possível isolar as amostras, mas que a medição de DNA tem que ser executada em uma situação, em que não é possível isolar uma célula individual a partir de seu ambiente fisiológico.

De um modo preferido, quando da execução da citometria por imagem de DNA in vivo, isto é, em um indivíduo animal ou humano, será necessário encontrar um modo de medir a quantidade de uma célula individual, sem que seja necessário separá-la fisicamente a partir de seu ambiente natural.

Foram realizadas tentativas na técnica, de um modo a permitir a visualização de células individuais em seu ambiente natural, através do provimento de novos dispositivos microscópicos.

A WO 2004/113962 A2 expõe um sistema microscópico confocal miniaturizado, que permite visualizar as células dentro de amostras em camadas espessas.

No entanto, um dos requisitos prévios de citometria por imagem de DNA in vivo, que não foi solucionado até a presente data, é que é possível determinar a quantidade de DNA nuclear no tecido vivo. Deste modo, existe uma necessidade contínua quanto a métodos, que permitam um modo confiável, rápido e eficiente de medir a quantidade de DNA nuclear e a detecção de células cancerosas e de cânceres in vivo em indivíduos animais e humanos.

Constitui um objeto da presente invenção prover um método para a determinação in vivo da quantidade de ácido nucleico nuclear de filamento duplo, tal que o DNA no núcleo de uma célula.

Constitui também um objeto da presente invenção prover um método de detecção in vivo em um indivíduo animal ou humano, da presença de células cancerosas.

Constitui um objeto adicional da presente invenção prover um método, que permita o diagnóstico in vivo da presença ou da possibilidade de desenvolvimento de câncer.

De um modo a que os objetos acima mencionados sejam alcançados, métodos como definidos na reivindicação 1 independente, são providos.

De acordo com a invenção, um método de determinação in vivo da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em pelo menos uma célula de um indivíduo animal ou humano é provido, em que o referido método compreende os estágios de:

a) localização do núcleo da referida pelo menos uma célula in vivo, em um indivíduo animal ou humano;

b) medir a absorção de luz ultravioleta (UV) pelo núcleo, in

vivo.

Em uma modalidade exemplar da presente invenção, os métodos acima mencionados para determinar in vivo a quantidade de ácidos nucleicos nucleares no interior de uma célula, podem ser usados para detectar pelo menos uma célula cancerosa no interior de um indivíduo animal ou humano. Em uma outra modalidade dos métodos precedentemente mencionados de absorção de UV nuclear obtidos no estágio b) podem ser usados para calcular o estado de (aneu)ploidia da célula.

Isto pode ser executado através de referência à absorção de UV nuclear obtida em relação a uma absorção de UV nuclear obtida sob condições substancialmente idênticas para uma célula, a qual é conhecida como sendo não-cancerosa e para a qual o conteúdo de DNA nuclear é conhecido. Em uma modalidade preferida, este cálculo é executado externamente ao corpo animal ou humano.

Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, um estado de aneuploidia, que é desviado em pelo menos 10% a partir dos valores de 2, será considerado como indicativo de uma célula cancerosa. No caso de uma célula, na qual o estado saudável poderia ser a proliferação de um desvio de aneuploidia em pelo menos 10% dos valores de 2 e 4, seria considerado como sendo indicativo de um desenvolvimento de câncer inicial.

Em uma modalidade da presente invenção, métodos de determinação da quantidade de DNA nuclear no interior de uma célula, como acima descrito, são usados para detectar pelo menos uma célula cancerosa, que está associada com um câncer, a partir do grupo que compreende leucemia, linfoma, câncer cerebral, câncer cerebroespinhal, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, câncer cervical, câncer de útero, câncer ovariano, câncer renal, câncer oral e câncer da garganta, câncer esofágico, câncer pulmonar, câncer retal do cólon, câncer pancreático e melanoma.

Em uma destas modalidades, o método de acordo com a invenção utiliza a microscopia por escaneamento a laser confocal, formação de imagem com dois fótons, tomografia de coerência óptica de escaneamento, ultra-som de alta resolução ou endomiscroscopia por UV para a localização do núcleo no estágio a) do método acima descrito. Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, a medição de absorção de luz UV nuclear no estágio b), é executada através da calibração do sinal de absorção de luz UV e determinação do volume do núcleo.

Em uma modalidade preferida, a determinação de absorção de UV nuclear é efetuada através de microscopia por escaneamento a laser confocal. Uma modalidade particularmente preferida utiliza a luz UV para este propósito, a qual possui um comprimento de onda de entre aproximadamente 240 nm a aproximadamente 280 nm.

Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, é provido um método de diagnóstico in vivo e/ou previsão de câncer em um indivíduo animal ou humano, que compreende os estágios de:

a) localização do núcleo da referida pelo menos uma célula in vivo em um indivíduo animal ou humano;

b) medição da absorção de luz ultravioleta pelo núcleo in

vivo;

c) determinação da quantidade de ácidos nucleicos nucleares através de comparação de UV; absorção do núcleo conforme determinado no estágio b) com a absorção de UV de um núcleo de uma célula não-cancerosa, que foi também obtida usando os estágios a) a b);

d) decisão quanto à presença ou à probabilidade futura de ocorrência de um câncer, dependendo da quantidade de ácidos nucleicos nucleares.

No estágio c), a comparação pode ser efetuada externamente ao corpo animal ou humano.

Ainda uma outra modalidade deste aspecto da invenção refere- se a um método de diagnóstico e/ou de previsão de câncer em um indivíduo animal ou humano, o método compreendendo as características acima mencionadas, e em que um estado de ploidia, que se desvia em pelo menos 10% a partir dos valores de 2, é indicativo de uma célula cancerosa, e, deste modo, quanto à presença ou ao desenvolvimento provável de câncer (futuro). No caso de uma célula, que em estado estável, estaria se proliferando em um desvio de aneuploidia em pelo menos 10% a partir dos valores de 2 e 4, seria considerada como sendo indicativa de desenvolvimento de câncer inicial.

Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, que se refere ao método de diagnóstico e/ou previsão de câncer em um indivíduo animal ou humano com as características antes mencionadas, o método é usado para detectar um câncer selecionado a partir do grupo, que compreende leucemia, linfoma, câncer cerebral, câncer cerebroespinhal, câncer de bexiga, câncer da próstata, câncer de mama, câncer cervical, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer oral e da garganta, câncer esofágico, câncer pulmonar, câncer retal do cólon, câncer pancreático, e melanoma.

Em ainda outras modalidades da presente invenção, relacionadas ao aspecto de diagnóstico e de previsão, a localização do núcleo no estágio a) e a medição de absorção de luz UV nuclear no estágio b) pode ser executada como acima descrito.

Deste modo, em uma modalidade preferida, pode-se usar microscopia por escaneamento a laser confocal, de modo a medir a absorção de UY nuclear, de um modo preferido com luz UV de um comprimento de onda entre aproximadamente 240 nm e aproximadamente 280 nm.

A Figura 1 apresenta um histograma, tal como obtido, de um modo típico, se o conteúdo de DNA nuclear de uma população de células não- cancerosas for determinado. As células estão em um estado não-proliferativo. A Figura 2 apresente um histograma, conforme obtido, de um

modo típico, se o conteúdo de DNA nuclear de células cancerosas for determinado. Neste caso, o pico que corresponde a 4 é indicativo de um câncer, pois são examinadas células, que são tipicamente não-proliferativas.

A Figura 3 mostra o fator de absorção de DNA dissolvido e da proteína na mesma concentração para a faixa de comprimento de onda de luz ultravioleta.

A Figura 4 mostra, de um modo esquemático, como a quantidade de luz refletida e deste modo as alterações de absorção se um ponto de luz de luz ultravioelta for movido dentro de um plano de uma célula a partir do citoplasma, através do núcleo, a outras partes do citoplasma.

A identificação de células cancerosas por citometria de DNA é executada, de um modo típico, usando citometria de fluxo ou citometria de imagem.

No caso de citometria de imagem de DNA, que pode ser também designada como ICM, o DNA é manchado com um marcador, de um modo a visualizar o DNA. Subseqüentemente, as alterações na quantidade de DNA, que são usualmente designadas como aneuploidia, são usadas de um modo a detectar a presença cancerosa como aneuploidia, que é considerada como sendo característica ou de um estado canceroso já existente ou de um estado canceroso em desenvolvimento. Deste modo, a aneuploidia de DNA permite um diagnóstico precoce e sensível do câncer através da detecção de células cancerosas, muito à frente da caracterização morfológica e histológica de biópsias de tecido.

No entanto, como acima mencionado, reações de coloração de DNA estabelecidas, tais que o método de manchamento de Feulgen, são laboriosas e demoradas. Além disso, não é possível usar reações de coloração de DNA, tais que o método de manchamento de Feulgen in vivo, pois elas são mutagênicas em si mesmas, e deste modo dão origem ao desenvolvimento de câncer.

Verificou-se, de um modo surpreendente, que é possível determinar a quantidade de ácidos nucleicos nucleares de células, que estão embutidas em seu ambiente natural in vivo, em um indivíduo animal ou humano, primeiramente pela localização dos núcleos de tais células e, em segundo lugar, pela medição da absorção de luz ultravioleta pelo núcleo. Deste modo, a presente invenção, em uma modalidade, é dirigida a um método de determinação in vivo em um indivíduo animal ou humano, a quantidade de ácidos nucleicos em pelo menos uma célula compreendendo os estágios de:

b) medição da absorção de luz ultravioleta (UV) pelo núcleo

in vivo.

Tais métodos podem ser usados, inter alia, de modo a determinar o tamanho do genoma de um indivíduo ou espécie. Naturalmente, tais métodos podem ser também usados para detectar pelo menos uma célula cancerosa no interior, por exemplo, de um tecido vivo.

Para o estágio b), o uso de luz UV de um comprimento de onda de aproximadamente 240 nm a aproximadamente 280 nm, é preferido. Pode ser em particular preferida a luz UV de um comprimento de onda de 250 nm, 255 nm ou 260 nm. O mesmo aplica-se ao estágio a) se a localização do núcleo foi efetuada através do uso de luz UV. Deste modo, em uma modalidade preferida, é possível usar, para os estágios a) e b), luz UV do comprimento de onda antes mencionado.

Para os propósitos da presente invenção, o termo "célula cancerosa" refere-se a qualquer célula, tecido celular ou órgão produzido a partir de células, com algumas ou todas as células compreendendo uma quantidade de DNA nuclear, que se desvia a partir da quantidade de DNA nuclear, tal com determinado para uma célula não-cancerosa como uma conseqüência de duplicações cromossômicas, deleções, inserções, translocações, etc.

É bem conhecido que inserções, duplicações, deleções e translocações de DNA cromossômico são, em uma grande extensão, responsáveis pelo desenvolvimento de câncer e podem ser assim consideradas como sendo características de células cancerosas.

As células, que podem ser investigadas através dos métodos de acordo com a invenção, podem ser selecionadas a partir do grupo, que compreende células da medula óssea, células do nodo linfático, linfócitos, eritrócitos, células neurais, células musculares, fibroblastros, queratinócitos, células de mucosa, etc.

De um modo similar, os métodos de acordo com a invenção, podem ser usados para a análise, in vivo, de vários tecidos no corpo animal ou humano. Um tal tecido pode constituir parte de órgãos, tais que o fígado, coração, os rins, etc. e/ou abrigar os tipos de célula antes mencionados.

O método acima especificado de determinação in vivo, em um indivíduo animal ou humano, da quantidade de ácidos nucleicos nucleares, de um modo preferido para a detecção de pelo menos uma célula cancerosa, será agora descrito, em maiores detalhes, com relação aos estágios únicos a) e b).

Em um primeiro estágio, que foi designado como estágio a), pelo menos uma célula dentro do indivíduo animal ou humano será analisada in vivo, no que se refere à posição de seu núcleo. Em uma modalidade preferida, a referida pelo menos uma célula pode ser uma célula cancerosa ou suspeita de ser cancerosa, isto é, uma célula cancerosa putativa.

De um modo típico, a localização dos núcleos celulares deverá ser efetuada para células em seu ambiente natural, isto é, no tecido vivo. A localização dos núcleos celulares pode ser alcançada, por exemplo, através do uso de microscopia por escaneamento a laser confocal, tomogramografia de coerência óptica por escaneamento, formação de imagem com 2 fótons, ultra- som de alta resolução ou endomicroscopia por UV.

Se a morfologia do tecido for conhecida, e portanto a posição do núcleo, é possível iniciar a medição da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em cada célula, tal que o conteúdo de DNA (Estágio b). Embora isto possa ser preferido em uma modalidade, a posição e, deste modo, a localização do núcleo não precisa ser determinada de um modo exato, mas uma aproximação pode ser suficiente antes que seja iniciada a medição, por exemplo, do DNA nuclear. Até mesmo o conhecimento dos limites celulares pode ser suficiente. Por esta razão, pode não ser necessário usar luz UV para determinar a localização do núcleo, mesmo que isto possa constituir uma modalidade preferida.

Microscopia por escaneamento a laser Confocal Uma das modalidades preferidas de localização do núcleo em uma célula in vivo é baseada no uso de microscopia por escaneamento a laser confocal, que, em uma modalidade adicional preferida, usa fontes de luz UV. A microscopia confocal oferece várias vantagens em relação à microscopia óptica convencional, uma das mais importantes sendo a eliminação da informação fora de foco que distorce a imagem, a profundidade controlável do campo e a resolução submicrônica. Uma outra vantagem da microscopia confocal consiste em que a fluorescência de várias porções da amostra, que estejam fora de foco, podem ser filtradas e, deste modo, não interferem com ou poções ou seções que estão em foco, deste modo fornecendo uma imagem, que é muito mais aguda e que apresenta uma melhor resolução do que uma imagem comparável, obtida através de microscopia de luz clássica.

O princípio básico da microscopia por escaneamento confocal consiste no uso de uma tela com um orifício no ponto focai do sistema de lente de microscópio, que é " conjugado" ao ponto, no qual a lente objetiva está focalizada. Uma luz, proveniente a partir do ponto focai da objetiva, é focalizada no orifício e pode passar através do detector, que pode, por exemplo, ser um dispositivo de acoplamento de carga (CCD). A luz proveniente da seção fora de foco da amostra será quase totalmente filtrada.

Deste modo, um microscópio confocal possui uma resolução significativamente melhor do que um microscópio convencional para a direção χ e y . Além disso, ele possui uma menor profundidade no campo da direção ζ . Através do escaneamento do ponto focai através da amostra, é, deste modo, possível visualizar diferentes planos de uma amostra e então reconstruir uma imagem tridimensional da amostra. Além disso, a microscopia confocal é compatível com diferentes comprimentos de onda da luz.

Um microscópio de escaneamento a laser confocal é integrado em, por exemplo, um dispositivo endoscópico. Um atuador podendo ser usado para o escaneamento do microscópio confocal sobre o tecido de interesse. Um primeiro escaneamento, a grosso modo, pode ser então usado, de modo a determinar a morfologia do tecido e núcleos de interesse podem ser identificados a partir desta tela. Neste estágio, em que o núcleo foi localizado, é possível então proceder ao estágio b) de modo a medir a absorção nuclear de luz UV.

Para a localização do núcleo, a microscopia por escaneamento confocal pode usar luz monocromática ou policromática, a luz monocromática com um comprimento de onda de entre 240 nm e 280 nm sendo preferida. E preferida, de um modo particular, uma luz UV com um comprimento de onda de 250 nm, 255 nm ou 260 nm.

Como um microscópio de escaneamento a laser confocal, é possível usar um microscópio, tal que um LEICA DMLM e tendo uma unidade de câmara de 12 bits QImaging Retiga 2000R FAST Cooled Mono (Qlmaging, Burnaby, BC, Canadá) para a medição da intensidade de sinal do sinal de fluorescência. Uma Leica DM 6000 pode ser, de um modo particular, preferida.

Para os propósitos da presente invenção, em que as células devem ser visualizadas em seu ambiente de tecido natural, o microscópio de escaneamento a laser confocal pode ser integrado a um endoscópio. Sistemas, que são conhecidos para este propósito, diferem principalmente pelo modo pelo qual a imagem é escaneada. Dois sistemas comerciais bastante avançados estão disponíveis, por exemplo, de Optiscan e de Mauna Kir Technology. O instrumento Mauna Kir é um sistema de escaneamento próximo, em que a imagem é transferida ao endoscópio com um de feixe óptico de fibra coerente. É formada a imagem de um ponto ou fibra selecionado no interior da amostra de tecido na extremidade distai. Este endomicroscópio confocal pode ser fornecido junto com o canal operacional de um endoscópio. Como o campo de visualização do endomicroscópio é pequeno, a colocação da sonda é guiada através de endoscopia de vídeo convencional. Deste modo, a plataforma do endoscópio precisa incluir tanto um formador de imagem de vídeo, como o microscópio confocal. Naturalmente, a unidade do endoscópio pode também compreender ou ser acoplada a dispositivos de computador e pacotes de software, que permitam o processamento das imagens obtidas. As unidades de detecção podem ser, por exemplo, uma câmara

CCD de três chips Optronics DEI- 700, através de uma placa de captura de imagens a um computador. De um modo alternativo, é possível usar uma câmara CCD de três chips Hitachi HV-C20. Pacotes de software para a análise por imagem podem ser, por exemplo, o pacote de software de análise por imagem Bioquant True Color Windows 98 ν 3.50.6 (R & M, Biometrics, Nashville, TN) ou o software de análise por imagem Image-Pro Plus 3. 0. Um outro sistema, que pode ser usado, é o sistema Bio View Duet (Bio View Ltd., Rehovot, Israel, que é baseado em um microscópio inteiramente automatizado, de modo duplo (Axioplan 2, Carl Zeiss, Jena, Alemanha), uma câmara colorida de escaneamento progressivo 3 CCD, estágio de 8-fotos motorizada XY e um computador para o controle e a análise do sistema e dos dados.

Optiscan desenvolveu um endomicroscópio que emprega o escaneamento distai. Neste sistema, uma fibra única transmite a luz ao endoscópio e a extremidade da fibra da cabeça distai é escaneada de um modo espacial e a imagem é formada, através de óptica, no interior do tecido. Optiscan desenvolveu, em conjunto com Pentax, um endoscópio com um microscópio confocal, integrado no instrumento, deste modo liberando o canal operacional. As imagens dos tecidos, que são obtidas através deste sistema, são de uma resolução e permitem a identificação da localização dos núcleos celulares.

Outros dispositivos ópticos confocais em miniatura são descritos na WO 2004/113962 A2, que é incorporada a este, a título referencial. Sistemas para a formação de imagem confocal de tecido vivo são também descritos na WO 02/073246, assim como na US 2005/00366567, sendo ambas incorporadas a título referencial.

Tomografia de Coerência Óptica

Ainda uma outra possibilidade de localizar núcleos celulares in vivo no tecido vivo de um indivíduo animal ou humano é o uso de tomografia de coerência óptica (OCT).

OCT é uma tecnologia de formação de imagem, que alcança até alguns milímetros de profundidade de penetração (de um modo típico de 1,5 a 2 mm) em resolução ultra alta (vários mícrons) gerando imagens de tecido em 3-D, em tempo real. A OCT provê imagens estruturais em 3-D (camadas de tecido, alterações de densidade), de um modo a prover uma informação espectroscópica e de modo a que seja alcançada uma formação de imagem funcional e molecular, à vontade. A OCT é uma tecnologia baseada em interferometria, que é capaz de medir sinais tão pequenos quando de -90 dB. Um ajuste de OCT à base de fibra convencional é mostrado na Figura 5.

Um acoplador divide a luz proveniente de uma fonte de luz. Embora um braço sirva como um braço de referência do interferômetro, o outro fornece luz à amostra e é, portanto, determinado o braço da amostra. A óptica de escaneamento provê capacidades de escaneamento lateral, de tal modo que OCT seja ajustado de modo a obter um escaneamento axial (escaneamento-A) para cada posição lateral. Todos os escaneamentos-A combinadas formam uma imagem estrutural 3-D.

Quando da obtenção de cada escaneamento-A, o deslocamento do espelho de referência provê informação de profundidade. E também possível obter a informação de profundidade através dos comprimentos de onda de escaneamento. Várias outras técnicas de avanço foram desenvolvidas, de modo a que sejam alcançadas informações de profundidade mais altas em períodos de tempo mais curtos. O OCT espectroscópico é o mais avançado dentre aqueles, que fornecem dados de escaneamento de profundidade em quaisquer partes móveis.

Correntemente, o sistema de OCT mais rápido pode produzir imagens em cerca de 30 quadros por segundo, com mais do que 1.000 escaneamentos-A por quadro. Uma resolução lateral apenas é limitada pela óptica de escaneamento e pelo sistema de focalização de luz. A resolução axial é, por sua vez, dependente da fonte de luz. Uma resolução axial é, por sua vez, dependente da fonte de luz. Uma resolução axial típica correntemente acessível com diodos de super luminescência comerciais, tendo uma largura de banda de cerca de 0 nm a 930 nm, é de aproximadamente 5 μπι. Uma das resoluções melhor demonstradas de cerca de 1, 5 μιη foi alcançada usando um laser Ti: safira fs.

Para os propósitos da presente invenção, os dispositivos OCT acima descritos e em particular os dispositivos OCT espectrocóspicos podem ser miniaturizados de tal modo que eles possam ser usados, isto é, em um sistema de endoscópio. Para a miniaturização da tecnologia de OCT, é possível fazer referência, por exemplo, às propostas produzidas na publicação em Optics Letters 29, 2261 (2004). De um modo típico, um dispositivo OCT miniaturizado, que é capaz de ser usado em um sistema endoscópico, irá prover: - Uma fonte de luz. Ela determina a resolução axial, que é proporcional à largura de banda da fonte. SLDs comercialmente disponíveis (diodos de super luminescência) obtêm cerca de 5 μιτι de resolução axial. Uma melhor resolução está disponível se o laser Ti:Safira fs ou lâmpada de tungstênio(potência muito baixa) for usado (resolução próxima 1 μηι). O laser ajustável é requerido para OCT de domínio Fourier.

- Um componente de fibra óptica, de modo a prover a distribuição da luz, um acoplador de fibra e/ou circulador, de modo a realizar o interferômetro de Michelson.

- Um componente de detecção. Este será dependente do tipo OCT. Os fotodiodos serão usados, de um modo típico, mas no caso do OCT espectral a detecção resolvida de um modo espectral será necessária (analisador de espectro em combinação com um conjunto CCD de forro).

- No caso de OCT de fase ou polarização, o motor e os componentes da sonda têm que estar aptos a manter as propriedades de polarização da luz.

Ultra-som de Alta Resolução

Como acima mencionado, a localização dos núcleos celulares pode ser também executada usando ultra-som de alta resolução.

Formação de Imagem com 2 Fótons

Naturalmente, os núcleos celulares podem ser também localizados usando tecnologias de formação de imagem com 2 fótons. O método de dois fótons permite a formação de imagem in vivo tridimensional em tempo real do tecido. O princípio subjacente básico é de que nesta técnica, um fluoróforo no tecido é excitado através da absorção de dois fótons de baixa energia, resultando na emissão de fluorescência. Isto está em oposição à microscopia (confocal) convencional, em que um fóton de energia mais alta único coloca o fluoróforo em excitação.

Para que ocorra o processo de dois fótons, um fluxo de fóton relativamente alto é necessário, o qual é obtido, de um modo geral, no ponto focai de um microscópio confocal. Como uma conseqüência, as vantagens da microscopia confocal também aplicam-se à formação de imagem de dois fótons, tal como à formação de imagem tridimensional e uma alta resolução 0,2 mícrons lateral e ~ 0,5 mícrons axial).

Devido à baixa energia dos fótons de excitação, a absorção do fóton único pelo tecido é relativamente baixa, o que minimiza a quantidade do dano fotoinduzido no tecido. Isto constitui uma vantagem significativa para aplicações in vivo. Além disso, a baixa taxa de absorção conduz a uma penetração mais profunda dos fótons no interior do tecido, resultando uma profundidade de formação de imagem de até 0,5 mm.

Em conclusão, a formação de imagem de dois fótons combina as vantagens de microscopia confocal de alta resolução com uma profundidade de imagem grande e com uma pequena quantidade de dano fotoinduzido. Ela permite a caracterização de tecido in vivo em tempo real, a nível celular, e foi comprovada como sendo adequada para o diagnóstico de doenças.

Retornando ao estágio b) do método acima descrito, a medição da absorção de luz ultravioleta (UV) in vivo pode ser alcançada através de diversas abordagens.

Usando um ajuste de microscópio confocal, é possível focar um sonda, que esteja no interior do núcleo da célula. De um modo típico, será possível deixar que o ponto da sonda do ajuste confocal seja menor do que o núcleo.

A quantidade de luz UV refletida de volta a partir do núcleo, conforme medida pelo ajuste confocal, está inversamente relacionada à quantidade de luz absorvida pela área formada pela sonda pelo ponto. Assumindo-se que a absorção seja quase igual através de todo o núcleo, a única coisa possível é calibrar a medição e determinar o tamanho do núcleo. Calibração

A calibração consiste de determinar a absorção de luz UV por um núcleo e pelas regiões fora do núcleo, dentro do mesmo plano de escaneamento confocal. Para ambas as medições dentro e fora do núcleo, a luz atravessou quase que através da mesma quantidade e distância de tecido, antes de alcançar a célula de interesse, resultando em sinais de fundo comparáveis e similares em ambas as medições. Portanto, a razão entre as medições para as absorções nucleares contra a absorção não-nuclear podem ser tomadas como uma medição absoluta pára a absorção do núcleo celular.

Em uma modalidade preferida, ser possível usar luz UV de um comprimento de onda de entre aproximadamente 240 nm e aproximadamente 280 nm. Em uma modalidade particularmente preferida, será possível usar luz UV com um comprimento de onda de aproximadamente 250 nm, 255 nm, ou 260 nm. O termo " aproximadamente " no contexto do comprimento de onda refere-se a desvios de 1,5%, de modo preferido de 1 %, e de um modo mais preferido de 0, 5%. A razão para o uso de luz UV e em particular de Luz UV com um comprimento de onda de entre 240 nm e 280 nm é a de que o DNA, que é encontrado nos núcleos das células, apresenta uma absorção muito mais rápida nesta faixa de comprimento de onda do que para as proteínas de (vide Figura 3).

O núcleo, contendo ambas as proteínas e o DNA, irá portanto absorver mais luz do que o resto da célula, que contém principalmente proteínas, mas de preferência nenhum DNA.

Usando-se, de um modo preferido, um microscópio de escaneamento a laser confocal, é possível medir a reflexão de luz UV pelo material no interior do núcleo e compará-la ao reflexo pelo material celular exterior ao núcleo. Através do cálculo da razão de luz UV absorvida pelo núcleo para a luz UV absorvida pelas regiões externas ao núcleo, é possível obter um sinal, que constitui uma medição quanto à densidade de DNA no interior de um plano único, conforme obtido com um escaneamento confocal.

Determinação do volume do núcleo

No segundo estágio de determinação da quantidade de ácidos nucleicos nucleares no interior do núcleo, é possível determinar o volume total do núcleo celular. Isto pode ser executado do modo que se segue.

Através do escaneamento de um ponto de luz em 3-D através do núcleo, é possível determinar a intensidade da luz refletida, tal como acima descrito, quando da calibração da medição. A intensidade da luz refletida irá relatar se a pessoa ainda está no interior do núcleo, se foi alcançado o limite do núcleo, ou se já está no exterior do núcleo, isto é refletido na Figura 4.

O sinal de luz UV que pode ser refletido difere quando o ponto de luz do microscópio é focalizado no interior do núcleo, a partir de quando ele é externo ao núcleo, como já explicado acima. Quando o ponto de luz focalizado é externo ao núcleo, a absorção UV é relativamente baixa e uma alta intensidade de luz refletida é medida. Quando o foco do ponto de luz se move através da célula e passa a extremidade do núcleo, a intensidade da luz refletida diminui gradualmente devido ao fato de que mais luz é absorvida no núcleo. Desde que o ponto de luz esteja inteiramente no interior do núcleo, o sinal de luz refletido é constante e comparativamente baixo, até que a extremidade externa do núcleo seja novamente alcançada. Então, o sinal irá ser aumentado, de um modo contínuo, a seu alto valor precedente. A distância na direção do movimento, no qual o sinal é comparativamente baixo, mede a espessura local do núcleo.

Como a Figura 4 ilustra um escaneamento único dentro de um plano único d núcleo, estes escaneamentos I-D podem ser estendidos a 3 dimensões, de modo a que seja obtida a configuração total do núcleo, através da execução da mesma medição para diferentes planos. Em coordenadas diferentes (xy), a espessura local do núcleo é medida na direção z. Deste modo, através da reconstrução de uma imagem 3-D a partir de diferentes imagens 1-D de vários planos, é possível reconstruir e calcular a aparência e o volume do núcleo.

Deste modo, a medição da absorção de UV nuclear é, de acordo com a invenção, obtenível através da calibração do sinal de absorção UV no núcleo e a determinação do volume do núcleo. Para a calibração, e razão ente a absorção de luz UV de regiões no interior do núcleo para a absorção de luz UV para regiões exteriores ao núcleo deve ser considerada para um plano único.

A determinação do volume do núcleo é então obtida através da totalização da absorção de UV calibrada, conforme obtida para cada plano do núcleo.

Todo isto é executado, de um modo preferido, através do uso de microscopia por escaneamento a laser confocal com luz UV de um comprimento de onda de entre aproximadamente 240 nm e entre aproximadamente 280 nm. Em uma modalidade particularmente preferida, será possível usar luz UV com um comprimento de onda de aproximadamente 250 nm, 255 nm ou 260 nm.

Deste modo, através da determinação de absorção de UV usando microscopia por escaneamento confocal para diferentes planos de um núcleo, é possível determinar a absorção de luz ultravioleta por um núcleo celular. Como a quantidade de luz absorvida nuclear e a quantidade de DNA é proporcional, é possível determinar a quantidade de DNA no núcleo, conforme é requerido para a citometria de imagem por DNA.

A correlação do sinal de absorção nuclear com a quantidade de DNA no interior de um núcleo celular pode ser executada de acordo com procedimentos de citologia de imagem de DNA, conforme descrito, por exemplo, por Hardie et al. (The Journal of Histochemistry and Cytochemistru (2002), 50 (6), (735- 749), vide também abaixo).

Uma vez determinada e medida a absorção nuclear de luz ultravioleta e que este processo tenha sido repetido para várias células, é possível, por exemplo, calcular a estatística da quantidade de DNA contida nas várias células. A partir destas estatísticas, as conclusões referentes ao estado canceroso ou não - canceroso do tecido podem ser extraídas, conforme é realizado, de um modo típico, em citometria por imagem de DNA clássica.

Aquele versado na técnica estará, naturalmente, bem relacionado com métodos de registro de sinais de absorção de UY, assim como quanto a uso destes sinais para calcular imagens, por exemplo, do núcleo celular.

A determinação de intensidades de sinal, isto é, a quantidade de luz absorvida ou transmitida, será executada usando instrumentos, tal como usado, de um modo típico, para aqueles propósitos.

Deste modo, é possível, por exemplo, usar um dispositivo acoplado a carga ou uma câmara digital, que esteja ligada à abertura do microscópio, que é usado para visualizar as células, quando expostas às fontes de luz acima mencionadas. É possível também usar filmes, etc.

As medições de fluorescência podem ser efetuada com qualquer cubo de filtro padrão (que consista de um filtro de barreira, um filtro de excitação, e o espelho dicróico) ou qualquer cubo de filtro para aplicações especiais, contanto que o espectro de emissão esteja dentro da faixa espectral de sensibilidade do sistema. A formação de bioimagem espectral pode ser também usada em conjunção com quaisquer métodos de filtração espaciais convencionais, tais que o contraste de fase e campo escuro, mesmo com microscopia de luz polarizada.

As unidades de detecção podem ser, por exemplo, uma câmara CCD de três chips Optronics DEI- 700, conectada através de uma placa de captura imagens, ao computador. Em alternativa, é possível usar uma câmara de três chips Hitachi HV -C20 de três chips. Pacotes de software para a análise por imagem podem ser, por exemplo, o pacote de software de análise por imagem Bioquant True Color Windows 98 ν 3. 50. 6 (R & M Biometrics, Nashville, YN), ou o software de análise por imagem Image-Pro Plus 3. 0. Um outro sistema, que pode ser usado, é o sistema BioView Duet (Bio View Ltd., Rehovot, Israel, que é baseado em um microscópio inteiramente automatizado, de modo duplo (Axioplan 2, Carl Zeiss, Jena, Alemanha), um estágio de 8 fotos motorizado XY (Marzhauser, Wetzler, Alemanha) uma câmara colorida de escaneamento progressivo 3 CCD (DXC 9000, Sony, Tóquio, Japão) e um computador para o controle e análise do sistema e dos dados.

Antes do cálculo do conteúdo de DNA e da correlação do conteúdo de DNA ao estado canceroso ou não-canceroso de uma célula ser descrito em maiores detalhes, modalidades adicionais da invenção são descritas. Estas modalidades fornecem exemplos diferentes, com tecnologias e abordagens, que podem ser suadas para localizar o núcleo em células de tecido vivo, de modo a medir a absorção de luz ultravioleta por tais núcleos.

Em uma modalidade, a localização nuclear, assim como a medição da absorção de UV nuclear, pode ser realizada através do uso de microscopia por escaneamento a laser confocal.

Nesta modalidade, um microscópio confocal será integrado ao interior de, por exemplo, um dispositivo endoscópico. O dispositivo possui, além disso, semelhança com um dispositivo de registro óptico. Um atuador deverá ser usado para efetuar o escaneamento do microscópio confocal através do tecido de interesse. Um escaneamento de primeiro curso será usada para determinar a morfologia. A partir deste escaneamento, os núcleos de interesse são identificados. De um modo subseqüente, a medição da absorção de UV nuclear e, deste modo, a medição de citometria de DNA nos núcleos são executadas conforme acima descrito.

A presente invenção, em uma modalidade, refere-se também ao uso de um dispositivo óptico de microscopia por escaneamento a laser confocal para a determinação in vivo da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em um indivíduo animal ou humano. Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se ao uso de um dispositivo óptico de microscopia por escaneamento a laser confocal para a identificação in vivo de células cancerosas em um ser animal ou humano. A quantidade de ácidos nucleicos nucleares pode ser determinada, conforme acima descrito, através da localização do núcleo celular e da medição da absorção de UV nuclear. O dispositivo pode ser um dispositivo de escaneamento a laser confocal em miniatura, que é, por exemplo, incorporado ao interior de um dispositivo endoscópico, tal que descrito na WO 02 /073246, US 2005/0036667 e WO 2004/113962 A2.

Em ainda uma outra modalidade, a morfologia do tecido pode ser determinada através de um endomicroscópio, cujo microscópio é integrado à ponta de um endoscópio. O endomicroscópio, em uma modalidade preferida, pode operar com luz UV. O endomicroscópio, tal que aquele que é descrito na WO 02/073246, será usado para localizar os núcleos celulares. A medição de citometria de DNA pode ser então executada usando microscopia confocal de escaneamento. Uma vantagem da adição do endomicroscópio é a de que a imagem da morfologia das células pode ser obtida em tempo real, pois não é requerido escaneamento, como no caso da microscopia confocal.

A presente invenção, em uma modalidade, também refere-se ao uso de um dispositivo, que incorpora o equipamento para um endomicroscópio, tal como descrito na WO 02/073246, que pode ser operado com luz UV e microscopia por escaneamento a laser confocal, de um modo a determinar in vivo, a quantidade de ácidos nucleicos em um indivíduo animal ou humano. Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se ao uso de um tal dispositivo para a identificação de células cancerosas in vivo em um ser humano ou animal. A quantidade de ácidos nucleicos nucleares pode ser determinada, como acima descrito, através da localização do núcleo celular e medição da absorção de UV nuclear.

Como uma conseqüência da formação de imagem em tempo real, o escaneamento do núcleo com um microscópio confocal para a determinação de UV nuclear pode ser executada de um modo altamente acurado. Naturalmente, o microscópio confocal, que é usado para medir a absorção de UV nuclear, terá que se alinhada com o endomicroscópio, de um modo a assegurar com que os mesmos núcleos sejam medidos.

Em uma terceira modalidade, a morfologia e, deste modo, a localização do núcleo, é terminada através de tomografia de coerência óptica e a microscopia confocal de escaneamento efetua a sondagem do núcleo, e deste modo, a medição da absorção de UV nuclear. Se estas duas abordagens diferentes forem usadas para a localização dos núcleos e a determinação da absorção nuclear, a precisão da citometria de DNA é aumentada.

A presente invenção, em uma modalidade, refere-se deste modo ao uso de um dispositivo, que incorpora o equipamento para a tomografia de coerência óptica e a microscopia por escaneamento a laser confocal para a determinação, in vivo, da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em um indivíduo humano ou animal. Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se ao uso de um tal dispositivo para a identificação de células cancerosas in vivo em um ser humano ou animal. A quantidade de ácidos nucleicos nucleares pode ser determinada, como acima descrito, através da localização do núcleo celular e da medição da absorção do UV nuclear.

Em uma quarta modalidade, um transdutor acima de 100 MHz utiliza ultra-som de alta resolução, de modo a determinar a localização dos núcleos no interior de um tecido. Sob estas condições, será possível obter uma resolução, que pode resolver células no tecido. O escaneamento do núcleo e a medição da absorção do UV nuclear é novamente efetuada com a microscopia por escaneamento a laser confocal.

A presente invenção, em uma modalidade, refere-se deste modo também ao uso de um dispositivo, quer incorpora o equipamento para a aplicação de ultra-som de alta resolução e microscopia por escaneamento a laser confocal para a determinação in vivo, da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em um indivíduo animal ou humano. Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se ao uso de um tal dispositivo para a identificação in vivo de células cancerosas em um ser humano ou animal. A quantidade de ácidos nucleicos nucleares pode ser determinada, como acima descrito, através da localização do núcleo celular e da medição de absorção de UV nuclear.

Em uma quinta modalidade, a morfologia, e, deste modo, a localização dos núcleos celulares, pode ser alcançada através dos métodos acima descritos, por exemplo, através de microscopia por escaneamento a laser, através de endomicroscopia, através de tomografia de coerência óptica e através de ultra-som de alta resolução. No entanto, a medição da absorção nuclear de luz UY não será efetuada usando a microscopia por escaneamento confocal, mas de um modo preferido em um processo de formação de imagem de dois fótons.

A presente invenção, em uma modalidade, refere-se deste modo ao uso de um dispositivo, que incorpora o equipamento para a microscopia por escaneamento a laser confocal, endomicroscopia, tomografia de coerência óptica e/ou ultra-som de alta resolução e formação de imagem de 2 fótons para a determinação, in vivo, da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em um indivíduo animal ou humano. Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se ao uso de um tal dispositivo para a identificação de células cancerosas in vivo, em um ser humano ou animal. A quantidade de ácidos nucleicos nucleares pode ser determinada, tal como acima descrito, através da localização do núcleo celular e medição da absorção de UY nuclear.

No caso de processos de formação de imagem de dois fótons, o feixe de laser é colocado em foco com uma célula de interesse. Um módulo detector detecta a fluorescência induzida pela absorção de dois fótons. Em um tal caso, é possível se basear na auto- fluorescência do DNA. É possível, quando do uso de tecnologia de formação de imagem de dois fótons, implementar, em princípio, o mesmo ajuste que descrito para a microscopia por escaneamento a laser confocal. No entanto, como o que se está buscando agora é a fluorescência produzida pela absorção de dois fótons, deverá ser colocado um filtro em frente do detector, de modo a filtrar qualquer luz tendo um comprimento de onda diferente daquele da fluorescência de dois fótons. Usando esta abordagem, a precisão de citometria de DNA pode ser aumentada.

Na maioria das modalidades antes descritas, o primeiro estágio de identificação da morfologia do tecido investigado, e deste modo, a localização dos núcleos nas células do referido tecido, foi alcançada através da execução de um escaneamento, a grosso modo, seguida por um escaneamento refinado com um microscópio de escaneamento a laser confocal, de um modo a medir a absorção de UV nuclear. No entanto, é também possível efetuar apenas um escaneamento de alta resolução, na qual a microscopia por escaneamento a laser confocal é usada de modo a localizar os núcleos celulares e de modo a medir a absorção nuclear.

Os métodos acima descritos podem ser usados para a medição de citometria de DNA in vivo, em indivíduos humanos ou animais, de um modo a permitir, por exemplo, a detecção de câncer em tempo real, in vivo. O método pode, deste modo, ser aplicado, por exemplo, para a detecção de câncer de pele, câncer de superfícies da mucosa, tais que as da cavidade oral, dos pulmões, da laringe, da tireóide, e do cérvix uterino. Os métodos podem ser também usados para a detecção de cânceres internos se procedimentos invasivos mínimos, tais que os procedimentos endoscópicos forem aplicados.

Como os métodos de acordo com a invenção permitem a detecção em tempo real de células cancerosas, a citometria de imagem de DNA é acelerada, de um modo significativo, quando comparada a métodos previamente conhecidos, que são baseados principalmente na citometria de imagem de DNA em populações de célula isoladas.

Apenas considerando a absorção nuclear, isto é, a luz UY que é absorvida pelos núcleos celulares, o método de acordo com a invenção permite uma determinação mais rápida e precisa da quantidade de ácidos nucleicos celulares no interior de um núcleo celular, como será explicado a seguir.

É do conhecimento comum, que a maioria das células dos mamíferos compreendem um conjunto duplo de cada cromossomo. Deste modo, o número de cromossomos pode ser calculado como 2 n, com η sendo o número de cromossomos. No entanto, quando as células são replicadas, elas duplicam o número de cromosssomos antes que ocorra a separação em suas células filhas.

Durante a replicação do DNA e antes da divisão celular, as células de mamíferos irão, deste modo, compreender um número de cromossomos, que pode ser calculado como 4 n, com η sendo novamente o número de cromossomos.

Se a quantidade de DNA de uma célula de mamífero se referir ao número de cromossomos, o conteúdo de DNA de uma célula não- cancerosa, que pode ser também designada como uma célula "saudável " ou "normal", pode ser atribuído como apresentando valores de 2 ou 4, dependendo do estado de replicação celular.

O termo "estado de ploidia", no contexto da presente invenção, refere-se ao conteúdo de DNA de uma célula não-cancerosa, normal, e pode apresentar os valores de 2 e 4, tal como acima explicado. É de conhecimento usual na técnica determinar o estado de ploidia de uma célula não-cancerosa através, por exemplo, do uso do método de manchamento de Feulgen, precedentemente mencionado. Neste contexto, a publicação de Hardie et al. (The Journal of Histochemistry & Cytochemistry (2002), 50 (6), 735- 749) é incorporado a este, a título referencial, no âmbito em que ele descreve a determinação do conteúdo de DNA de uma célula, usando métodos de manchamento de DNA .

Na seção "Densitometria de Análise por imagem", na página 738 de Hardie et al., a referência é explicada como as intensidades de sinal obtidas, por exemplo, através do método de manchamento de Feulgen, ou os marcadores fluorescentes podem ser convertidos em valores densitométricos. O mesmo aplica-se a sinais de absorção, medidos através de métodos de acordo com a invenção. Como acima explicado, uma célula não - cancerosa, saudável, deverá compreender 2n ou 4n cromossomos, com η sendo obtido a partir do método de manchamento de Feulgen ou com sinais de absorção, conforme usada na presente invenção, irá conduzir a um perfil densitométrico com duas áreas de pico.

A estas duas áreas de pico serão atribuídos os valores de 2 ou 4, respectivamente. Um exemplo de um tal perfil densitométrico é provido na Figura 1. Em um caso específico, foi analisada uma célula não-proliferante, o que explica porque não existe pico correspondendo a 4.

Em resumo, para a densitometria de análise por imagem, o campo do microscópio, que é utilizado para a visualização das células e a medição do sinal de absorção, é capturado por um dispositivo de detecção ou câmara digital CCD (dispositivo acoplado a carga) montado em um microscópio, que são conectados a um computador. As figuras, que são imagens digitalizadas, sendo registradas em uma série de pixéis, a cada pixel sendo atribuída uma cor e intensidade. As intensidades são então convertidas, de um modo típico, através de algoritmos à base de computador, em valores de absorção, os quais, por sua vez, são exibidos através de um software de análise por imagem, tal como os densitogramas antes mencionados.

Aquele versado na técnica está, de fato, consciente, de que um densitograma significativo e confiável, de células normais, não-cancerosas, deveria ser calculado, de um modo preferido, a partir de uma população de células numerosas, com um número de 25- 100 células sendo suficiente. Em uma modalidade preferida da invenção, a quantidade de DNA nuclear deverá ser, deste modo, determinada através da medição da absorção de UY nuclear, como acima descrito, para aproximadamente pelo menos 30, 40, 50 ou 60 células.

A determinação do conteúdo de DNA nuclear ou estado de ploidia das células cancerosas putativas, usando os métodos acima descritos de acordo com a invenção, pode alcançar a determinação quanto à presença de células cancerosas. O estado de ploidia determinado é então comparado com o estado de ploidia de células não-cancerosas, cujo estado de ploidia foi determinado a partir de intensidade s de absorção nucleares, obtidas através do método idêntico . Em uma modalidade da invenção, todos estes cálculos podem ser executados externamente ao corpo animal ou humano.

Para a determinação de se uma célula cancerosa putativa é, de fato, uma célula propensa ao câncer, será necessário então determinar um densitograma, tal como acima descrito. O densitograma observado para células não-cancerosas será designado como o densitograma " padrão" ou de "referência".

De um modo preferido, tais densitogramas de referência serão medidos usando o mesmo método que para a detecção de células cancerosas, mas será assegurado que apenas células não-cancerosas sejam usadas. Isto pode ser alcançado usando células do mesmo indivíduo, mas de outros sítios de tecido, diferentes daqueles que são suspeitos de serem cancerosos. De um modo alternativo ou adicional, é possível usar tipos de célula idênticos ou comparáveis, a partir do mesmo tecido para o qual a morfologia indica um estado não-canceroso. Deveriam ser usados, de um modo preferido, tipos de célula comparáveis, desde que seja assegurado que estas células sejam não- cancerosas. O número e o tipo de células a serem estudados, de modo a que seja obtido um densitograma padrão, estão bastante dentro do conhecido daquele versados na técnica, e irão variar entre 25 e 100 células, e de um modo preferido, entre cerca de 30, 40, 50 ou 60 células.

Para os propósitos da presente invenção, o termo " tipo de célula comparável " refere-se deste modo a um tipo de célula, que é de origem comparável e que possui características comparáveis à célula cancerosa suspeita. Se, por exemplo, uma célula de mucosa for testada quanto ao desenvolvimento de câncer, a célula de referência padrão deve também ser de origem da mucosa. Se, por outro lado, as células linfóides forem testadas quanto a desenvolvimentos de câncer, a célula de referência padrão deve ser também de origem linfóide, de um modo a que seja um tipo de célula comparável.

A absorção de UV nuclear do tipo de célula comparável, que é conhecido como sendo não-canceroso, e que é usado como um padrão de referência para a absorção de UV nuclear, obtido a partir da célula cancerosa putativa, deve ser medido sob condições altamente similares, se não idênticas, se possível.

Se em um tecido canceroso putativo, um número suficientemente grande de núcleos celulares for analisado, a "amplitude" dos picos correspondendo a 2 e 4 e a ocorrência de picos adicionais pode já ser indicativa de desenvolvimento de câncer.

Se para uma determinada célula, for determinado um estado de ploidia, que se desvia a partir dos valores antes mencionados de 2 ou 4, este é indicativo ou de duplicações substanciais, inserções, deleções ou rearranjos cromossômicos e, deste modo, de células cancerosas. Como neste caso, o estado de ploidia de uma tal célula se desvia a partir dos valores de 2 e 4, podendo-se também falar do estado de aneuplidia. Este, de fato, assume que é considerado um tipo de célula, que é, de um modo típico, proliferativo, mesmo em seu estado normal.

Deste modo, um estado de ploidia de 4 pode ser indicativo de desenvolvimento de câncer, se foram examinadas células que são usualmente conhecidas como sendo não-proliferativas.

Se forem examinadas células, que são conhecidas como sendo proliferativas em seu estado normal, um valor de 4 não será considerado como indicativo de desenvolvimento de câncer. Neste caso, desvios a partir dos valores de 2 e/ou 4 serão indicativos do desenvolvimento de câncer.

O termo "estado de aneuploidia", no contexto da presente invenção, refere-se deste modo a uma quantidade anormal de DNA nuclear no interior de uma célula.

De fato, a absorção de V nuclear e, deste modo, o densitograma de células putativamente cancerosas, serão também calculados a partir de uma população de células e será possível, de um modo típico, medir aproximadamente de 100 a 700 e de modo preferido em torno de 100 a 300 células.

Se, por exemplo, forem examinadas células cancerosas a partir do tecido do fígado, é possível obter um densitograma com dois picos principais, aos quais são atribuídos os valores de 2 e/ou 4. No entanto, diferentemente do caso de células não-cancerosas, o densitograma de dois picos principais não será tão agudo e estreito, mas preferivelmente amplo. De um modo adicional, serão observados picos e sinais no densitograma, que estão abaixo de 2, acima de 2, abaixo de 4, e acima de 4. Um exemplo é provido na Figura 2.

Como a maioria das células em qualquer amostra deverá ter um conteúdo de DNA de 2, o desvio a partir da maioria poderia ser também considerado como anormal ou suspeito. No caso de um tecido canceroso, em que as células normais estão em minoria, haverá ainda uma ampla variação η conteúdo do DNA, que pode ser usado para rotular a amostra como suspeita.

Uma célula será, portanto, considerada como cancerosa se o densitograma, que é calculado com base na absorção de UV nuclear, que é obtido de acordo com a invenção como acima descrita, apresentar sinais de pico fora dos picos que correspondem aos valores 2 (e 4 no caso de uma célula, que em seu estado normal é proliferativa).

No entanto, os picos que correspondem aos valores de 2 (e 4) podem, em si mesmos, ser indicativos quanto ao potencial cancerogênico de uma célula, ser eles apresentarem uma curvatura bastante ampla. De um modo a decidir se um densitograma é, de fato, indicativo quanto ao desenvolvimento de câncer ou não, tendo em vista a forma de pico correspondendo aos valores 2 (e 4), será superposto o densitograma de uma amostra celular cancerosa putativa, com um densitograma de referência ou padrão conforme acima descrito.

As áreas sob a curva (AUC) dos picos dos densitogramas sendo indicativas dos valores 2 e 4 do densitograma padrão sendo tomadas como sendo indicativas de uma célula não-cancerosa e quaisquer desvios dos AUCs dos picos correspondentes do densitograma da célula cancerosa putativa em pelo menos 10% sendo considerado como sendo indicativo de um estado ou de uma célula cancerosa. Em uma modalidade preferida, o desvio será de pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50%. E possível também aplicar os padrões expostos na publicação

de Haroske et al. " 1997 ESACP consensus report on diagnostic DNA image cytometry", Analytical Cellular Pathology 17 (1998) 189- 200, em que é explicado, de um modo detalhado, quando uma célula deverá ser considerada normal ou cancerosa. Deste modo, um desvio significativo da absorção de UV nuclear de uma célula cancerosa suspeita, em comparação com a absorção de UV nuclear obtida para um tipo de célula não-canceroso comparável, é indicativo quanto ao início ou quanto à probabilidade de desenvolvimento de um câncer futuro.

Para os propósitos da presente invenção, uma aberração significativa no conteúdo de DNA será considerada como indicativa do desenvolvimento de câncer se o estado de ploidia da célula cancerosa suspeita se desviar dos valores de ploidia de 2 (ou 4) em pelo menos 10%. Em uma modalidade preferida, o desvio deverá ser de pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50%. Um pico em um densitograma terá atribuído um valor de 2 ou 4 para esta parte do pico, que é idêntica aos picos correspondentes em um densitograma de referência.

De acordo com a prática estabelecida, é possível designar o conteúdo de DNA de uma célula como peridiplóide se o pico, que corresponde ao valor de pico 2 do densitograma de referência estiver em uma faixa de 1,8 a 2,2.

O conteúdo de DNA de uma célula será considerado como peritetraplóide ser o pico, que corresponde ao valor de pico 4 do densitograma de referência estiver em uma faixa de 3,6 a 4,4.

Células ou tecidos com valores peridiplóides, peritetraplóides e X-plóides serão consideradas como células cancerosas para os propósitos da presente invenção.

Deste modo, o método acima descrito pode ser usado para calcular o estado de ploidia (aneuploidia) de uma célula cancerosa putativa, por referência à absorção de UV nuclear, conforme obtida de acordo com o método da invenção para a célula cancerosa putativa, com uma absorção de UV nuclear usando a mesma abordagem para um tipo de célula comparável, que é conhecido com o sendo não-canceroso.

Para os propósitos da presente invenção, o termo "não- canceroso" refere-se a uma célula, que é conhecida como apresentando indicações de desenvolvimento de câncer.

Em uma modalidade da presente invenção, as células podem ser associadas com um câncer selecionado a partir do grupo, que compreende leucemia, linfoma, câncer cerebral, câncer cerebroespinhal câncer de bexiga, câncer da próstata, câncer de mama, câncer cervical, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer oral e da garganta, câncer esofágico, câncer do pulmão, câncer retal do cólon, câncer pancreático, e melanoma.

Em uma outra modalidade da presente invenção, um método para o diagnóstico e/ou a previsão de câncer in vivo, em um indivíduo humano ou animal, é provido, o qual compreende os estágios de:

a) localização do núcleo da referida pelo menos uma célula in vivo em um indivíduo humano ou animal;

b) medir a absorção de luz ultravioleta pelo núcleo in vivo',

c) determinar a quantidade de ácidos nucleicos nucleares através da comparação da absorção de UV do núcleo, conforme determinado no estágio b) com a absorção de UV de um núcleo de uma célula não- cancerosa, que foi também obtida usando os estágios a) a b);

d) decidir quanto à presença ou à provável ocorrência futura de um câncer, dependendo da quantidade de ácidos nucleicos nucleares.

A comparação no estágio c) pode ser efetuada fora do corpo humano ou animal.

Os estágios a) a c) podem ser executados conforme acima descrito para o método de determinação in vivo de um indivíduo animal ou humano, da quantidade de ácidos nucleicos nucleares.

Deste modo, para o estágio b), usando a luz UV de um comprimento de onda de aproximadamente 240 nm a aproximadamente 280 nm, é preferido. E preferido, de um modo particular, que a luz UY possua um comprimento de onda de 250 nm, 255 nm ou 260 nm. O mesmo aplica-se ao estágio a), se a localização do núcleo for executada usando luz UV. Deste modo, em uma modalidade preferida, é usada para os estágios a ) e b) a luz UV do comprimento de onda antes mencionado.

De fato, as aplicações acima fornecidas quanto à determinação de densitogramas para a célula cancerosa putativa e quanto a densitogramas de referência ou convencionais, o significado de termos, tais que " célula cancerosa", célula não-cancerosa", "ploidia", "aneuploidia", periplóide", peritetraplóide", X-plóide, "AUC", etc., aplica-se igualmente no contexto do método de diagnóstico in vivo e/ou prevenção de câncer, de acordo com a invenção.

Em um último estágio, que foi designado acima como estágio d), é decidido quanto à presença ou quanto à ocorrência provável futura de câncer, dependendo do conteúdo de DNA ou do estado de ploidia das células sob exame.

Um diagnóstico de câncer pode ser considerado como positivo se o conteúdo de DNA nuclear ou os valores de ploidia, conforme determinado para as células cancerosas putativas, se desviar em pelo menos 10% a partir do conteúdo de DNA nuclear ou dos valores de ploidia de 2 (e 4) de um tipo de célula comparável, para o qual a absorção de UV nuclear foi medida sob uma condição idêntica ou altamente comparável, e que é conhecida como sendo não-cancerosa. Em uma modalidade preferida, o desvio deverá ser de pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50%.

As áreas sob a curva (AUC) dos picos sem indicativas dos valores 2 e (4) de um densitograma padrão sendo tomadas como sendo indicativas de uma célula não-cancerosa e quaisquer desvios dos AUCs dos picos correspondentes do densitograma da célula cancerosa putativa em pelo menos 10% sendo considerados como sendo indicativos de uma célula cancerosa e deverão assim conduzir a um diagnóstico positivo. Em uma modalidade preferida, o desvio deverá ser de pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou de pelo menos 50%.

De acordo com a prática estabelecida, o conteúdo do DNA de uma célula será designado como peridiplóide se o pico correspondente ao valor de pico 2 do densitograma de referência estiver em uma faixa de 1,8 a 2,2.

O conteúdo do DNA de uma célula será considerado como peritetraplóide se o pico correspondente ao valor de pico 4 do densitograma de referência estiver em uma faixa de 3,6 a 4,4.

Quaisquer valores fora destas faixas serão considerados como

X-plóides.

Qualquer célula ou tecido, que tenha sido classificado como peridiplóide, peritetraplóide ou X-plóide, deverá ser considerado como canceroso e irá conduzir a um diagnóstico positivo.

O método de diagnóstico e/ou previsão de câncer pode ser usado para diagnosticar e/ou prever um câncer selecionado a partir do grupo, que compreende leucemia, linfoma, câncer cerebral, câncer cerebroespinhal, câncer de bexiga, câncer da próstata, câncer de mama, câncer cervical, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer oral e da garganta, câncer esofágico, câncer pulmonar, câncer retal do cólon, câncer pancreático, e melanoma.

Claims

1. Método para a determinação in vivo da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em pelo menos uma célula de um indivíduo animal ou humano, caracterizado pelo fato de que compreende os estágios de: a) localizar o núcleo da referida pelo menos uma célula in vivo em um indivíduo humano ou animal; b) medir a absorção de luz ultravioleta (UV) pelo núcleo in vivo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método é usado para detectar pelo menos uma célula cancerosa putativa em um indivíduo humano ou animal.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade de ácidos nucleicos nucleares é determinada através da comparação da absorção de UV do núcleo, conforme determinado no estágio b) da reivindicação 1 com a absorção de UV de um núcleo de pelo menos uma célula não-cancerosa, que foi obtida também usando os estágios a) a b) como definidos na reivindicação 1.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que um desvio em estado de ploidia ou conteúdo de DNA nuclear em pelo menos 10%,a partir dos valores de 2, é indicativo de uma célula cancerosa.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que um estado de ploidia ou conteúdo de DNA nuclear de 1,8 a 2,2 é indicativo de um estado periplóide, um estado de ploidia ou conteúdo de DNA nuclear de 3,6 a 4,4 é indicativo de um estado peritetraplóide e um estado de ploidia ou de conteúdo de DNA nuclear fora destas faixas é indicativo de um estado X-plóide.

6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma célula cancerosa está associada com um câncer selecionado a partir do grupo, que compreende leucemia, linfoma, câncer cerebral, câncer cerebroespinhal, câncer de bexiga, câncer da próstata, câncer de mama, câncer cervical, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer oral e da garganta, câncer esofágico, câncer pulmonar, câncer retal do cólon, câncer pancreático, e melanoma.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a localização do núcleo no estágio a) é efetuada usando microscopia por escaneamento a laser confocal, formação de imagem de dois fótons, tomografia de coerência óptica de escaneamento, ultra-som de alta resolução ou endomicroscopia de UY.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a medição da absorção de luz UV pelo núcleo no estágio b) é efetuada usando microscopia por escaneamento a laser confocal.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a luz UV possui um comprimento de onda de entre aproximadamente 240 nm e aproximadamente 280 nm e, de um modo preferido, de 250 nm, 255 nm ou 260 nm.

10. Uso de um dispositivo, caracterizado pelo fato de ser para a determinação in vivo da quantidade de ácidos nucleicos nucleares em pelo menos uma célula de um indivíduo humano ou animal, em que o dispositivo compreende o equipamento para: a) microscopia por escaneamento a laser confocal, endomicroscopia, tomografia de coerência óptica, e/ou aplicação de ultra-som de alto perfil para a execução do estágio a) como definido na reivindicação 1; e b) microscopia por escaneamento a laser confocal e/ou formação de imagem de dois fótons para a execução do estágio b) como definido na reivindicação 1.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser com um dispositivo para a execução de ambos os estágios a) e b), que compreende o equipamento para a microscopia por escaneamento a laser confocal.