BRPI0715017A2 - composiÇÕes e mÉtodos relativos aos anticorpos receptores de glucagon - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RELATIVOS AOS ANTICORPOS RECEOPTORES DE GLUCAGON. A presente revelação fornece as composições e métodos relacionados às proteinas de ligação ao antígeno, em particular os anticorpos que especificamente se ligam ao receptor de glucagon humano. A revelação fornece os ácidos nucléicos que codificam tais proteínas de ligação ao antígeno e anticorpo e os métodos para produzir e utilizar tais anticorpos, incluindo os métodos para tratar e prevenir o diabetes tipo 2 e distúrbios associados, administrando tais anticorpos a um sujeito que necessite de tal tratamento.

Description

"COMPOSigOES E METODOS RE IiATIVOS AOS ANTICORPOS RECEPTORES DE GLUCAGON"
REFERENCIA AOS PEDIDOS ASSOCIADOS
Este pedido reivindica ο beneficio do Servigo de Pedidos Provis0rios dos Estados Unidos N2 60/846.202, depositado em 20 de setembro de 2006, e ο Servigo de Pedidos Provisorios dos Estados Unidos N5 60/968.977, depositado em 30 de agosto de 2007, cuja descrigao completa se baseia e e aqui incorporada por referencia.
CAMPO DA INVENgAO
O campο desta invengao se refere a composigoes e metodos relativos aos anticorpos receptores de glucagon.
ANTECEDENTES DA INVENgAO
〇 glucagon e um hormonio de 29 aminoacidos processado a partir de sua pro forma nas celulas alfa pancreaticas pela expressao celular especifica da pr0-horm0nio convertase 2 (Furuta et al. , J. Biol. Chem. 276: 27197-27202 (2001)) . Durante ο jejum, a secregao de glucagon aumenta em resposta a queda dos niveis de glicose. O aumento da secregao de glucagon estimula a produgao de glicose promovendo a glicogenolise hepatica e a gliconeogenese. Assim, ο glucagon contrabalanga os efeitos da insulina na manutengao dos niveis normais de glicose em animais.
O receptor de glucagon (GCGR) e um membro da subfamilia de secretinas (familia B) dos receptores acoplados a proteina G (GCGR).〇 receptor de glucagon e predominantemente expresso no figado, onde regula a produgao de glicose hepatica, e nos rins, refletindo seu papel na gliconeogenese. A ativagao dos receptores de glucagon no figado estimula a atividade da adenil ciclase e ο giro de fosfoinositol que subsequentemente resulta em aumento da expressao de enzimas gliconeogenicas, incluindo a fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK), a frutose-1,6— bisfosfatase (FBPase-I) e a glicose-6-fosfatase (G-6-Pase)· Alem disso, a sinalizagao do glucagon ativa a glicogenio fosfor土Iase e inibe a glicogenio sintase·
Estudos mostraram que niveis basais mais altos de glucagon e ausencia de supressao da secregao de glucagon pos- prandial contribuem para as condi<?5es diabeticas em humanos (Muller et al·, N Eng J Med 283: 109-115 (1970)). Visar a produgao ou fungao do glucagon pode ser um metodo para controlar e reduzir a glicemia. Ha uma necessidade continua de fornecer tratamentos efetivos para ο diabetes tipo 2· A presente invengao aborda esta necessidade fornecendo novas composigoes e metodos para tratar ο diabetes tipo 2 e doengas associadas.
RESUMO DA INVENgAO
Em um aspecto, a presente invengao prove uma proteina de ligagao a antigeno isolacla consistindo em: a. uma CDR3 da cadeia Ieve consistindo em uma sequencia selecionacia do grupo consistindo em: i. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve que difere em nao mais que um total de tres adigoes, substitu 土 goes e/ou eliminacoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 selecionada do grupo consistindo nas sequencias da CDR3 da cadeia Ieve de L1-L23, N-s de ID das SEQ: 72; 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 100; ii. L Q X21 N S X22 P L T (N^ de 工DA DA SEQ: 208〉，iii. Q A W D S X23 T V X24 (N^ de ID da SEQ: 209) ； e b. uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada consistindo em uma sequencia selecionacia do grupo consistindo em: i.uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada que difere em nao mais que um total de quatro adigdes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 selecionada de um grupo consistindo nas sequencias da CDR3 da cadeia pesada de H1-H2 3, N^ de ID das SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 111 f 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199; ii. E X25 X26 X27 Y D I L T G Y X28 X29 Y Y G X30 D V (N^ de ID da SEQ: 210) iii. X31 G G G F D Y (N^ de ID da SEQ: 211) ； ou c. a sequencia da CDR3 da cadeia Ieve de (a) e a sequencia da CDR3 da cadeia pesada de (b) ； onde, X21 e um residuo de histidina, ou um residuo de glutamina, X22 e um residuo de asparagina, um residuo de aspartato, ou um residuo de tirosina, X23 e um residuo de asparagina ou residuo de serine, X24 e um residuo de 土soleucina ou um residuo de valina, X25 e um residuo de lisina, um residuo de glutamato, ou um residuo de prolina, X26 e um residuo de aspartato, um residuo de treonina, um residuo de glutamina, ou um residuo de prolina, X27 e um residuo de histidina ou um residuo de tirosina, X28 e um residuo de aspargina, um residuo de histidina, um residuo de aspartato, ou um residuo de fenilalanina, X29 e um residuo de tirosina, um residuo de histidina, ou um residuo de asparagina, X30 e um residuo de leucina ou um residuo de metionina, X31 e um residuo de leucina ou um residuo de metionina, onde a dita proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outro aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste ainda em uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve selecionada do grupo consistindo em: i. uma CDRl da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigoes, substituigdes e/ou elimmagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; ii. R S Xi Q S L L D X2 X3 D G T Y T L D (N- de ID da SEQ: 200)； iii. R A S Q X4 I R N D X5 G de ID da SEQ: 201)； e
iv. Sgdklgdkyx6C (炉 de id da SEQ: 202); onde X1 e um residuo de serina ou um residuo de treonina, X2 e um residuo de arginina ou um residuo de serina, X3 e um residuo de aspartato ou um residuo de alanina, X4 e um residuo de glicina ou um residuo de aspartato, X5 e um residuo de leucine ou um residuo de fenilalanina, X6 e um residuo de valina ou um residuo de alanina, b. uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve selecionada do grupo consistindo em: i. uma CDR2 da cadeia Ieve que difere em nao mais que duas adig5es, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de Li-L23, N2S de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56； 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; ii· A A S S L X9 S (N^ de ID da SEQ: 204) ； e iii· Q X10 X11 K R P S (N^ de ID da SEQ: 205); onde X9 e um residuo de glutamina ou um residuo de glutamato, X10 e um residuo de serina ou um residuo de treonina, X11 e um residuo de treonina, ou um residuo de serina; c. uma sequencia da CDRl da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: i · uma CDRl da cadeia pesada que difere em nao mais que duas adig:0es, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 e 122, ii. X7 Y X8 M H (N^ de ID da SEQ: 203) onde X7 e um residuo de serina ou um residuo de treonina, X8 e um residuo de glicina ou um residuo de aspartato; e d. uma CDR2 da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: i. uma
sequencia pesada que difere em nao mais que tres adig5es, substituigoes e/ou eliminag0es de aminoacidos cie uma sequencia de CDR2 de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; ii. X12 I W X13 D G S X14 K Y Y X15 D S V K G (N^ de ID da SEQ: 206) ； e iii. X16 I S X17 D G S X18 K Y X19 X20 D S V K G (N^ de ID da SEQ: 207) ； onde X12 e um residuo de serina, um residuo de fenilalanina, um residuo de valina, ou um residuo de glutamato, X13 e um residuo de tirosina ou um residuo de asparagina, X14 e um residuo de aspargina ou um residuo de glutamato, X15 e um residuo de valina ou um residuo de alanina, X16 e um residuo de valine ou um residuo de fenilalanina, X17 e um residuo de histidina, um residuo de aspartato, ou um residuo de tirosina, X18 e um residuo de aspartato, um residuo de asparagina, ou um residuo de histidina, X19 e um residuo de tirosina, ou um residuo de serina, X20 e um residuo de alanina ou um residuo de glicina, onde a dita proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano. Em um outro aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste em uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve que difere em nao mais que duas adigdes, substituigoes e/ou adigoes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de Ll—L23, N2S de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24r 26, 28, 30, 32, 34, 367 38 e 41; b. uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve que difere em nao mais que uma adigao, substituigao e/ou eliminagao de aminoacido de uma sequencia de CDR2 de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; c. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve que difere em nao mais que duas adigdes, substituigoes
e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de Ll- L23, N2S de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; d. uma sequencia da CDRl da cadeia pesada que difere em nao ma is que uma adigao, substituigao e/ou e liminagao de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de H1-H23, N2S de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 e 122; e. uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada que difere em nao mais que duas adigoes, substituig5es e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de H1-H23, N-s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e f. uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada que difere em nao mais que tres adigoes, substituigdes e/ou eliminag5es de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de H1—H23, N-s de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outro aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste em uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consist土ndo em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve que difere em nao mais que uma adigao, substituigao e/ou eliminagao de aminoacido de uma sequencia da CDRl de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; b. uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve de L1-L23, N2S de . ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; c. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve que difere em nao mais que uma adigao, substituigao e/ou eliminagao de aminoacido de uma sequencia da CDR3 de L1-L23, N^s de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80,
83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; d. uma sequencia da CDRl da cadeia pesada de Hl—H23, N-s de ID da SEQ: 102, 1〇4, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 e 122; e. uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada que difere em nao mais que uma adigao, substituigao e/ou eliminagao de aminoacido de uma sequencia de CDR2 de Hl—H23, N^s de ID da SEQ: 124, 12 6, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e f. uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada que difere em nao mais que duas adigoes f substituigdes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outrο aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste em uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo consistindo em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve de Li-L23, N^s de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; b. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve de L1-L23, N^s de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; c. uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e d. uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada que difere em nao mais que uma adigao, substituigao e/ou eliminapao de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de Hl_H23, N^s de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em ainda outro aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste em uma sequencia de aminoacidos selecionada do grupo cons i stindo em: uma sequencia da CDR3 da cade i a pesada de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 111r 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outrο aspectο, a proteina de ligagao isolada consiste em duas sequ§ncias de aminoacidos selecionadas do grupo consistindo em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigoes, substituigoes e/ou eliminaG0es de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de L1-L23, N2S de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22’ 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41 ； b. uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve de CDR2 de L1-L23, N^s de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; c. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigdes, substituigSes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 72, IAf 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; d. uma sequencia da CDRl da cadeia pesada que difere em nao mais que duas adigoes, substituigoes e/ou eliminade aminoacidos de uma sequencia da CDRl de Hl—H23, N-s de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 e 122; e uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada que difere em nao mais que tres adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e f. uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada que
difere em nao mais que quatro adig:5es, substituigoes e/ou elimmagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de Hl — H23, N-s de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 111 t 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outro aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste em tres sequencias de aminoacidos selecionadas do grupo consistindo em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigdes, substituig:des e/ou eliminagOes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22· 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; b. uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve que difere em nao mais que duas adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; c. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigioes, substituig5es e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de L1-L23, N^s de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; d. uma sequencia da CDRl da cadeia pesada que difere em nao mais que duas adig0es, substituigdes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 e 122; e. uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada que difere em nao mais que tres adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de Hl—H23, N-s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e f. uma
sequencia da CDR3 da cadeia pesada que difere em nao mais que quatro adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de H1-H23, N2S de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de liga^ao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outro aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste em quatro sequencias de aminoacidos selecionadas do grupo consistindo em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adig;6es, substituig5es e/ou eliminagOes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de L1-L23, N2S de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; b. uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve que difere em nao mais que duas adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de L1-L23, N2S de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; c. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de LI-L23, N-s de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; d. uma sequencia da CDRl da cadeia pesada que difere em nao mais que duas adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de H1-H23, N5S de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 e 122; e. uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada que difere em nao mais que tres adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de H1-H23, N-s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e f. uma
sequencia da CDR3 da cadeia pesada que difere em nao mais que quatro adigoes, substituigoes e/ou elimina <?5es de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de H1-H23, N2S de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 111 r 119, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de ligapao a antigeno especificanaente se Iiga ao receptor de glucagon humano· Em um outro aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste em cinco sequencias de aminoacidos selecioriadas do grupo consistindo em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigoes, substituiQ5es e/ou eliminagdes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de L1-L23, N^s de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; b. uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve que difere em nao mais que duas adigdes, substituig0es e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de Ll- L23, N^s de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; c. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigoes, substituigdes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; d. uma sequencia da CDRl da cadeia pesada que difere em nao mais que duas adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 e 122; e. uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada que difere em nao mais que tres adi<?6es, substituig«5es e/ou eliminag:0es de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de H1-H23, N^s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e f. uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada que difere em nao
mais que quatro adigoes, substituigdes e/ou eliminag;0es de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de H1-H23, N5S de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outro aspecto, a proteina de ligagao isolada consiste em: a. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; b. uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve que difere em nao mais que duas adigoes, substituigoes e/ou eliminacdes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; c. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve que difere em nao mais que tres adigoes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de uma sequencia da CDR3 de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; d. uma sequencia da CDRl da cadeia pesada que difere em nao mais que duas adigoes, substituigoes e/ou eliminatjoes de aminoacidos de uma sequencia da CDRl de H1-H23, N5S de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111, 113,115, 117, 118, 120 e 122; e. uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada que difere em nao mais que tres adigoes, substituigoes e/ou eliminatpoes de aminoacidos de uma sequencia de CDR2 de H1-H23, N-s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e f. uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada que difere em nao mais que quatro adigSes, substituigoes e/ou eliminagoes de aminoacidos de
uma sequencia da CDR3 de H1-H23, N-s de ID da SEQ: 165, 167, 169, 15
20
25
171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199, onde a proteina de liga$ao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outro aspecto, a proteina de ligagao a antigeno isolada consiste em tambem: a. um dominio variavel da cadeia Ieve consistindo em i. uma sequencia da CDRl da cadeia Ieve selecionada dos N-s de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; ii uma sequencia de CDR2 da cadeia Ieve selecionada dos N-s de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; e iii. uma sequencia da CDR3 da cadeia Ieve selecionada dos N2S de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; b. um dominio variavel da cadeia pesada consistindo em: i. uma sequencia da CDRl da cadeia pesacla selecionada dos N-s de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 e 122; ii. uma sequencia de CDR2 da cadeia pesada selecionada dos N-s de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149,151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e iii. uma sequencia da CDR3 da cadeia pesada selecionada dos N-s de ID da SEQ: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199; ou c. ο dominio variavel da cadeia Ieve de (a) e ο dominio variavel da cadeia pesada de (b〉， onde a proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em um outro aspecto, a proteina de ligagao a antigeno isolada consiste em tambem: a. uma sequencia do dominio variavel da cadeia Ieve selecionada do grupo consistindo em: i. aminoacidos com uma sequencia pelo menos 80% identica a uma
sequencia do dominio variavel da cadeia Ieve selecionada de Ll- L23, N2S de ID da SEQ: 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 221, 229, 231, 233, 235, 231 f 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255 e 2 57; ii· uma sequencia de aminoacidos codif icados por uma sequencia de polinucleotideos que e pelo menos 80% identica a uma sequencia de polinucleotideos que codificam a sequencia do clominio variavel da cadeia Ieve de L1-L23, N2S de ID da SEQ: 212, 214, 216, 218,. 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254 e 256; iii· uma sequencia de aminoacidos codificados por uma sequencia de polinucleotideos que hibridiza sob condiq;5es moderaclamente rigidas para ο complemente de um polinucleotideo consistindo em uma sequencia do dominio variavel da cadeia Ieve de L1-L23 dos N-s de ID da SEQ: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254 e 256; b. uma sequencia do dominio variavel da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: i · uma sequencia de aminoacidos que e pelo menos 80% identica a uma sequencia do dominio variavel da cadeia pesada de H1-H23 dos N-s de ID da SEQ: 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301 e 303; ii. uma sequencia de aminoacidos codificados por uma sequencia de polinucleotideos que e pelo menos 80% identica a uma sequencia de polinucleotideos que codificam a sequencia do dominio variavel da cadeia pesada de Hl — H23, N-s de ID da SEQ: 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300 e 302; iii. uma sequencia de aminoacidos codificados por uma sequencia de polinucleotideos que hibridizam sob condigoes moderadamente rigidas para ο complemento
de um polinucleotideo consistindo em uma sequencia do dominio variavel da cadeia pesada de H1—H23, N2S de ID da SEQ: 258, 2 60, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300 e 302; ou c. ο dominio variavel da cadeia Ieve de (a) e ο dominio variavel da cadeia pesada de (b) , onde a dita proteina de ligagao ao antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano.
Em uma configuragao, a proteina de ligagao a antigeno isolada consiste temberu em: a. uma sequencia do dominio variavel da cadeia Ieve selecionada do grupo consistindo em: Ll- L23 dos N^s de ID da SEQ: 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 22 9, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255 e 257; b. uma sequencia do dominio variavel da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: H1-H23 dos N2S de ID da SEQ: 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301 e 303; ou c. ο dominio variavel da cadeia Ieve de (a) e ο dominio variavel da cadeia pesada de (b) , onde a proteina cle ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao glucagon humano.
Em uma outra configuragao a proteina de ligagao a antigeno consiste em uma combinagao do dominio variavel da cadeia Ieve e de um dominio variavel da cadeia pesada selecionado do grupo de combinagoes consistindo em: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LlOHlO, LllHll, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 e L23H23 onde a proteina de ligagao a antigeno especificamente se Iiga ao receptor de glucagon humano. Em uma configuragao, a proteina de ligagao a antigeno isolada consiste ainda em: a sequencia constante da cadeia Ieve do N- de ID da SEQ: 305; a seqüência constante da cadeia leve do N- de ID da SEQ: 307; a seqüência constante da cadeia pesada do N- de ID da SEQ: 309; a seqüência constante da cadeia leve do N- de ID da SEQ: 305 e a seqüência constante da cadeia pesada do N- de ID da SEQ: 309; ou a seqüência constante da cadeia leve do N- de ID da SEQ: 307 e a seqüência constante da cadeia pesada do N- de ID da SEQ: 309.
Em um aspecto, a proteína de ligação a antígeno isolada é selecionada do grupo consistindo em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação a antígeno, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um fragmento Fab, um fragmento F(fa')x, um anticorpo de domínio, um anticorpo IgD, um anticorpo IgE e o anticorpo IgM, o anticorpo IgGl, o anticorpo IgG2, o anticorpo IgG3, o anticorpo IgG4, com o anticorpo IgG4 tendo pelo menos uma mutação no ponto de junção para aliviar a tendência a formar ligações dissulfídicas entre as cadeias H. Em uma configuração, a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo humano.
Em um outro aspecto, a proteína de ligação a antígeno isolada, quando ligada ao receptor de glucagon humano: a. se liga ao receptor de glucagon humano com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo de referência; b. inibe a estimulação do glucagon do receptor de glucagon humano com substancialmente a mesma CI50 que o dito anticorpo de referência, ou c. compete pela ligação com o dito anticorpo de referência, onde o dito anticorpo de referência consiste em uma combinação das seqüências do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LllHll, L12H12, L13H13, L15H15, L21H21,e L22H22 .
Em um outro aspecto, é provido um anticorpo humano isolado que, quando ligado ao receptor de glucagon humano: a. se liga ao receptor de glucagon humano com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo de referência; b. inibe a estimulação de glucagon do receptor de glucagon humano com substancialmente a mesma CI50 do dito anticorpo de referência, ou c. compete pela ligação com o dito anticorpo de referência, onde o dito anticorpo de referência consiste em uma combinação de seqüências do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo na A-l, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A-7, A-8, A-9, A-ll, A-12, A-13, A-15, A-21 e A-22.
Em um outro aspecto, é provido um anticorpo humano isolado que, quando ligado ao receptor de glucagon humano: a. especificamente se liga à região Ser80 a Serll9 do receptor de glucagon humano; b. reduz a sinalização do glucagon com um valor de CI50 de 90 nM ou menos; c. reduz a glicemia em um modelo animal; d. tanto a como b, ou e. tanto a, como b e c. Em uma configuração, o modelo animal é o modelo animal ob/ob.
Em um outro aspecto, é provida uma composição farmacêutica consistindo nas proteínas de ligação a antígeno em admistura com um transportador farmaceuticamente aceitável. Em uma outra configuração, a composição farmacêutica consiste em um anticorpo humano isolado em admistura com um transportador farmaceuticamente aceitável.
Em um outro aspecto, é provida uma molécula de ácido nucléico isolada consistindo na seqüência de polinucleotídeos que codifica o domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada, ou ambos, de uma proteína de ligação a antígeno da invenção. Em uma configuração, o polinucleotídeo consiste em uma seqüência de polinucleotídeos do domínio variável da cadeia leve L1-L23, N-s de ID da SEQ: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254 e 256, uma seqüência de polinucleotídeos do domínio variável da cadeia pesada H1-H23, N-s de ID da SEQ: 258, 260, 262, 264, 266, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, ou ambas.
Também providos são os vetores consistindo nos polinucleotídeos da presente invenção. Em uma configuração o vetor é um vetor de expressão. Também é provida uma célula hospedeira consistindo no vetor. Também é provido um hibridoma capaz de produzir a proteína de ligação a antígeno da invenção. Adicionalmente é provido um método para produzir a proteína de ligação a antígeno da presente invenção que compreende a cultura da célula hospedeira sob condições que permitem que a célula expresse a proteína de ligação a antígeno da invenção.
Também é provido um método para reduzir a glicemia em um sujeito com necessidade disto, que consiste na administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de composições farmacêuticas ao sujeito. Também é provido um método para melhorar a tolerância à glicose em um sujeito com necessidade disto, que consiste na administração de dosagem terapeuticamente eficaz de composições farmacêuticas ao sujeito. Também é provido um método para prevenir ou tratar o diabetes tipo 2 ou distúrbios associados em um sujeito com necessidade disto, pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de composições farmacêuticas ao sujeito. Em uma configuração, o sujeito é um ser humano. Em uma outra configuração, o distúrbio associado é selecionado entre hiperglicemia, glicemia de jejum comprometida, tolerância à glicose diminuída, dislipidemia e síndrome metabólica. Também é provido o uso das composições farmacêuticas da invenção na preparação de um medicamento útil para reduzir a glicemia, prevenir e tratar o diabetes tipo 2 e distúrbios associados, incluindo hiperglicemia, glicose de jejum comprometida, tolerância à glicose diminuída, dislipidemia e síndrome metabólica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 mostra os níveis glicêmicos de camundongos ob/ob machos de 14 semanas após uma injeção única de anticorpo A-3 ou anticorpo A-4 comparados com solução tampão, a uma dose de 1 ou 3 mg/kg (n = 10 animais/grupo) . A glicemia foi medida no momento 0 e 24, 48, 96, 120, 144, 192 e 240 horas após a inj eção.
A Figura 2 mostra os níveis glicêmicos de
camundongos ob/ob machos de 14 semanas após uma injeção única de anticorpo A-3, ou anticorpo A-9 comparados com solução tampão a uma dose de 1 ou 3 mg/kg (n = 10 animais/grupo) . A glicemia foi medida no momento 0 e 24, 72, 120, 192 e 240 horas após a injeção. A Figura 3 mostra os resultados de um teste de
tolerância à glicose oral (GTT) mostrando os níveis de glicose sob a curva (AUC) antes (GTT1 e GTT2) e após (GTT3, 4 e 5) uma injeção subcutânea única de veículo ou anticorpo 9 (A9) . A Figura 4 mostra anticorpos não-marcados capazes de competir pela ligação com o anticorpo A-3 marcado (anticorpos superponiveis).
A Figura 5 mostra os anticorpos não-marcados capazes de competir parcialmente pela ligação com anticorpo A-3 marcado (anticorpos parcialmente superponiveis).
A Figura 6 mostra anticorpos não-marcados capazes de competir pela ligação com o anticorpo A-3 marcado (anticorpos não-superponiveis).
A Figura 7 mostra os resultados dos estudos da ligação de quatro anticorpos anti-GCGR a receptores quiméricos construídos a partir de receptores GCGR e GLP-I humanos conforme indicado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a proteínas de ligação a antígeno tal como os anticorpos que especificamente se ligam ao receptor de glucagon humano (GCGR). Estes incluem proteínas de ligação a antígeno que inibem ou bloqueiam a ligação do glucagon ao GCGR humano e reduzem a sinalização do glucagon através do receptor. Em uma configuração, são providos anticorpos humanos, incluindo anticorpos antagonistas capazes de reduzir a glicemia em modelos animais. As proteínas de ligação a antígeno são úteis para tratar o diabetes e doenças associadas.
A presente invenção provê ainda composições, kits e métodos relacionados às proteínas de ligação a antígeno que especificamente se ligam ao receptor de glucagon humano. Também são providas moléculas de ácido nucléico e derivados e fragmentos do mesmo, consistindo em uma seqüência de polinucleotídeos que codificam todo ou parte de um polipeptidio que se liga ao receptor de glucagon, tal como um ácido nucléico que codifica todo ou parte de um anticorpo anti-receptor de glucagon, um fragmento de anticorpo ou derivado de anticorpo. A presente invenção provê vetores e plasmideos que consistem em tais ácidos nucléicos e células ou linhagens celulares que consistem em tais ácidos nucléicos e/ou vetores e plasmideos. Os métodos providos incluem, por exemplo, métodos para preparar, identificar ou isolar proteínas de ligação a antígenos que se ligam ao GCGR humano, tal como os anticorpos anti-GCGR, métodos para determinar se uma proteína de ligação a antígeno se liga ao GCGR, métodos para preparar composições, tal como as composições farmacêuticas, consistindo em uma proteína de ligação a anticorpos que se liga ao GCGR humano e métodos para administrar uma proteína de ligação a antígeno que se liga ao GCGR a um sujeito, por exemplo, métodos para tratar uma condição mediada pelo GCGR e para modular uma atividade biológica associada á sinalização do glucagon in vivo ou in vitro.
DEFINIÇÕES
As seqüências de polinucleotídeos e polipeptídios são indicadas usando abreviações padrões de uma ou três letras. A menos que indicado de outra forma, as seqüências de polipeptídios têm terminações amino à esquerda e suas terminações carboxi à direita, e as seqüências de ácido nucléico de filamento único e o filamento superior das seqüências de ácido nucléico de filamento duplo têm suas terminações 5' à esquerda e suas terminações 3' à direita. Uma seção particular de um polipeptidio pode ser designada pelo número de resíduos de aminoácidos, tal como os aminoácidos 80 a 119, ou pelo resíduo real naquele sitio, tal como Ser80 a Serll9. Uma seqüência particular de polipeptidios ou polinucleotídeos pode também ser descrita explicando-se como ela difere de uma seqüência de referência. As seqüências de polinucleotídeos e polipeptídios de domínios variáveis particulares da cadeia leve ou da cadeia pesada são designadas como Ll ("domínio variável da cadeia leve 1"), Hl ("domínio variável da cadeia pesada 1") . As proteínas de ligação a antígeno ou anticorpos que consistem em uma cadeia leve e uma cadeia pesada são indicadas combinando-se o nome dos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. Por exemplo, "L4H7," indica um anticorpo que consiste no domínio variável da cadeia leve L4 e o domínio variável da cadeia pesada H7.
A menos que definido de outra forma aqui, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção terão os significados comumente compreendidos por pessoas com habilidades comuns nessa técnica. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos no singular incluirão o plural e os termos no plural incluirão o singular. Em geral, as nomenclaturas utilizadas em conexão com as técnicas de cultura celular e de tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química protéica e de ácido nucléico e hibridização descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na área. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizadas de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na área e conforme descrito nas várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas em toda a presente especificação a menos que indicado de outra forma. Vide, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) e Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990), que estão incorporados aqui por referência. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, conforme comumente realizadas nessa técnica ou conforme descritas aqui. A terminologia e os procedimentos laboratoriais e técnicas da química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica usados e descritos aqui são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados nessa técnica. As técnicas padrão podem ser utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e entrega e tratamento dos pacientes.
Os seguintes termos, a menos que indicado de outra forma, deverão ser compreendidos como tendo os seguintes significados: o termo "molécula isolada" (onde a molécula é, por exemplo, um polipeptídio, um polinucleotídeo ou um anticorpo) é uma molécula que em virtude de sua origem ou fonte de derivação (1) não está associada a componentes naturalmente associados que a acompanham em seu estado nativo, (2) é substancialmente isenta de outras moléculas da mesma espécie (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza. Assim, uma molécula que é quimicamente sintetizada, ou expressa em um sistema celular diferente da célula do qual ela se origina naturalmente, estará "isolada" de seus componentes naturalmente associados. Uma molécula pode também ser tornada substancialmente isenta dos componentes naturalmente associados através do isolamento, usando técnicas de purificação bem conhecidas nessa área. A pureza ou homogeneidade da molécula pode ser analisada por uma série de meios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a pureza da amostra de polipeptidio pode ser analisada usando eletroforese de gel de poliacrilamida e coloração do gel para visualizar o polipeptidio usando técnicas bem conhecidas nessa área. Para certos propósitos, pode ser fornecida uma resolução mais alta usando HPLC ou outros meios de purificação bem conhecidos nessa técnica.
Os termos "inibidor de glucagon" e "antagonista de glucagon" são utilizados intercambiavelmente. Cada um deles é uma molécula que detectavelmente inibe a sinalização do glucagon. A inibição causada por um inibidor não precisa ser completa desde que seja detectável usando uma análise. Por exemplo, a análise em células descrita no Exemplo 4 abaixo, demonstra uma análise útil para determinar a inibição da sinalização do glucagon.
Cada um dos termos "peptídeo", "polipeptidio" e "proteína" se refere a uma molécula que consiste em dois ou mais resíduos de aminoácido ligados uns aos outros por ligações de peptídeos. Esses termos englobam, por exemplo, proteínas nativas e artificiais, fragmentos de proteína e análogos de polipeptídios (tais como as muteínas, variantes e proteínas de fusão) de uma seqüência protéica, assim como proteínas pós-translacionalmente ou então co-valentemente ou não-covalentemente modificadas. Um peptídeo, polipeptidio ou proteína pode ser monomérico ou polimérico.
0 termo "fragmento de polipeptidio" usado aqui se refere a um polipeptídio com um terminal amino e/ou uma eliminação do terminal carboxi comparado com uma proteína no comprimento total correspondente. Os fragmentos podem ter, por exemplo, pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento. Os fragmentos podem também ter, por exemplo, no máximo 1.000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, ou 10 aminoácidos de comprimento. Um fragmento pode ainda consistir, em uma ou ambas as suas extremidades, em um ou mais aminoácidos adicionais, por exemplo, uma seqüência de aminoácidos de uma proteína diferente que ocorra naturalmente (por exemplo, um domínio Fc ou domínio do zíper de leucina) ou uma seqüência de aminoácidos artificial (por exemplo, a seqüência de um ligador (Iinker) artificial). Os polipeptídios da invenção incluem
polipeptídios que foram modificados de alguma forma e por algum motivo, por exemplo, para: (1) reduzir a susceptibilidade á proteólise, (2) reduzir a susceptibilidade à oxidação, (3) alterar a afinidade de ligação para formar complexos protéicos, (4) alterar as afinidades de ligação e (4) conferir ou modificar outras propriedades físico-químicas ou funcionais. Os análogos incluem muteínas de um polipeptídio. Por exemplo, substituições simples ou múltiplas de aminoácidos (por exemplo, substituições conservadoras dos aminoácidos) podem ser feitas na seqüência que ocorre naturalmente (por exemplo, na porção do polipeptídio fora do(s) domínio(s) que forma(s) os contatos intermoleculares). Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é aquela que não altera substancialmente as características estruturais da seqüência original (por exemplo, a substituição de um aminoácido não deve tender a quebrar a espiral que ocorre na seqüência original ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracterizam a seqüência original ou que sejam necessários para sua funcionalidade) . Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptidios reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); e em Thornton et al. Nature 354:105 (1991), cada uma delas incorporada aqui por referência.
A presente invenção também provê análogos não- peptideos das proteínas de ligação a antígeno GCGR. Os análogos não-peptídeos são comumente utilizados para fornecer medicamentos com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Esses tipos de composto não-peptídeo são denominados "miméticos de peptídeo" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que são incorporados aqui por referência. Os miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares aos peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Em geral, os peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídio paradigma (isto é, um polipeptídio que tem uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica desejada) tal como um anticorpo humano, mas que têm uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada do grupo consistindo em: —CH2NH—, —CH2S —, —CH2— CH2 —, —CH=CH-(eis e trans ) , —COCH2—, —CH(OH)CH2— e —CH2SO—, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma seqüência consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-Iisina em lugar de L-lisina) pode também ser usada para gerar peptideos mais estáveis. Além disso, peptideos compelidos que consistem em uma seqüência consenso ou uma variação substancialmente idênti ca da seqüência consenso podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporado aqui por referência), por exempl o, adicionando resíduos de cisteina internos capazes de formar pontes dissulfidicas intramoleculares que efetuam a ciclização do peptídeo.
Uma "variante" de um polipeptídio (por exemplo, um anticorpo) consiste em uma seqüência de aminoácidos onde um ou mais resíduos de aminoácido é inserido, eliminado e/ou substituído na seqüência de aminoácidos em relação a uma outra seqüência de polipeptídios. Variantes da invenção incluem as proteínas de fusão.
Um "derivado" de um polipeptídio é um polipeptídio (por exemplo, um anticorpo) que foi quimicamente modificado, por exemplo, através de conjugação com outra metade química tal como, por exemplo, polietilenoglicol, albumina (por exemplo, albumina de soro humano), fosforilação e glicosilação. A menos que indicado de outra forma, o termo "anticorpo" inclui, além dos anticorpos que consistem em duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total, derivados, variantes, fragmentos e muteínas do mesmo, exemplos dos quais são descritos abaixo. Uma "proteína de ligação a antígeno" é uma proteína que consiste em uma parte que se liga a um antígeno e, opcionalmente, uma parte de "esqueleto" ou estrutura que permite que a parte de ligação ao antígeno adote uma conformação que promove a ligação dessa proteína ao antígeno. Exemplos de proteínas de ligação a antígeno incluem os anticorpos, fragmentos de anticorpo (por exemplo, uma porção de ligação ao antígeno de um anticorpo), derivados de anticorpo e análogos de anticorpo. A proteína de ligação a antígeno consiste em, por exemplo, um esqueleto de proteína alternativa ou esqueleto artificial com CDRs enxertadas ou derivadas da CDR. Esses esqueletos incluem, sem limitação, esqueletos derivados de anticorpo que consistem em mutações introduzidas, por exemplo, para estabilizar as estruturas tridimensionais da proteína de ligação a antígeno, assim como esqueletos totalmente sintéticos que consistem em, por exemplo, um polímero biocompatível. Vide, por exemplo, Komdorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function e Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al. , 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Além disso, podem ser utilizadas imitações dos anticorpos peptídeos ("PAMs"), assim como esqueletos baseados em imitações de anticorpo utilizando componentes de fibronectina como esqueleto.
Uma proteína de ligação a antígeno pode ter, por exemplo, a estrutura de uma imunoglobulina que ocorre naturalmente. Uma "imunoglobulina" é uma molécula tetramérica. Em uma imunoglobulina que ocorre naturalmente, cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (aproximadamente 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos responsáveis primariamente pelo reconhecimento do antigeno. A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante responsável primariamente pela função efetora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou épsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são ligadas por uma região "J" de aproximadamente 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de aproximadamente mais 10 aminoácidos. Vide, em geral, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades) . As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sitio de ligação do anticorpo e, portanto, uma imunoglobulina intacta tem dois sítios de ligação. As cadeias da imunoglobulina que ocorre naturalmente exibem a mesma estrutura geral de regiões estruturais (FR) relativamente conservadas ligadas por três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes da complementaridade ou CDRs. Do terminal N ao terminal C, tanto as cadeias leves como as pesadas consistem nos domínios FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 . A atribuição de aminoácidos a cada domínio segue as definições de Kabat et al. em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991.
Um "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina intacta ou a uma porção de ligação a antigeno da mesma que compete com o anticorpo intacto pela ligação especifica, a menos que especificado de outra forma. As porções de ligação ao antigeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. As porções de ligação ao antigeno incluem, entre outros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, fragmentos de anticorpos de domínio (dAbs), incluindo as regiões determinantes de complementaridade (CDRs), anticorpos de cadeia simples (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e polipeptídios que contenham pelo menos uma porção de imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação específica a antigeno ao polipeptídio.
Um fragmento Fab é um fragmento monovalente com os domínios VL, VH, Cl e ChI ; um fragmento F(ab')2 é um fragmento bivalente com dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfídica na região de junção; um fragmento Fd tem os domínios Vh e ChI; um fragmento Fv tem os domínios Vl e Vh de um ramo único de um anticorpo; e um fragmento dAb tem um domínio Vh, um domínio Vt., ou um fragmento de ligação a antigeno de um domínio Vh ou Vl (Patente Norte-americana N-. 6.846.634, 6.696.245, US App. Pub. N- 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).
Um anticorpo de cadeia simples (scFv) é um anticorpo no qual a região Vl e a região Vh são ligadas através de um ligador (por exemplo, uma seqüência sintética de resíduos de aminoácidos) formando uma cadeia de proteína contínua onde o ligador é suficientemente longo para permitir que a cadeia de proteína se dobre sobre si mesma e forme um sítio de ligação a antígeno monovalente (vide exemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423-26 e Huston et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-83). Diacorpos são anticorpos bivalentes que consistem em duas cadeias polipeptidicas, onde cada cadeia de polipeptidio consiste nos domínios Vh e Vl ligados por um ligador que é muito curto para permitir o pareamento entre dois domínios da mesma cadeia, permitindo assim que cada domínio faça par com um domínio complementar ou uma outra cadeia de polipeptidio (vide, por exemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-48 e Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23). Se as duas cadeias polipeptidicas de um diacorpo são idênticas, então o diacorpo resultante de seu pareamento terá dois sítios idênticos de ligação a antígeno. As cadeias polipeptidicas com diferentes seqüências podem ser usadas para produzir um diacorpo com dois sítios diferentes de ligação a antígeno. Similarmente, os tricorpos e tetracorpos são anticorpos que consistem em três ou quatro cadeias polipeptidicas, respectivamente, e que formam três e quatro sítios de ligação a antígeno, respectivamente, que podem ser os mesmos ou diferentes. As regiões determinantes de complementaridade
(CDRs) e as regiões estruturais (FR) de um determinado anticorpo podem ser identificadas usando o sistema descrito por Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991. Um ou mais CDRs podem ser incorporados covalentemente ou não-covalentemente a uma molécula para torná-la uma proteína de ligação a antígeno. Uma proteína de ligação a antígeno pode incorporar CDR(s) como parte de uma cadeia polipeptídica maior, pode ligar covalentemente a(s) CDR(s) a uma outra cadeia polipeptídica, ou pode incorporar a(s) CDR(s) não- covalentemente. As CDRs permitem que a proteína de ligação a antígeno se ligue especificamente a um antígeno particular de interesse.
Uma proteína de ligação a antígeno pode ter um ou mais sítios de ligação. Se houver mais de um sítio de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos a um outro ou podem ser diferentes. Por exemplo, uma imunoglobulina humana que ocorre naturalmente normalmente tem dois sítios de ligação idênticos, enquanto que um anticorpo "bi-específico" ou "bi-funcional" tem dois sítios de ligação diferentes.
0 termo "anticorpo humano" inclui todos os anticorpos que têm uma ou mais regiões variáveis e constantes derivadas das seqüências de imunoglobulina humana. Em uma configuração, todos esses domínios variáveis e constantes são derivados das seqüências de imunoglobulina humana (um anticorpo totalmente humano). Esses anticorpos podem ser preparados de vários modos, cujos exemplos são descritos abaixo, incluindo através de imunização com um antígeno de interesse de um camundongo, que seja geneticamente modificado para expressar anticorpos derivados de genes codificadores de cadeia pesada e/ou leve.
Um anticorpo humanizado tem uma seqüência que difere da seqüência de um anticorpo derivado de uma espécie não- humana por uma ou mais substituições, eliminações e/ou adições de aminoácidos, de modo que o anticorpo humanizado é menos provável de induzir uma resposta imunológica e/ou induz uma resposta imunológica menos grave, comparado ao anticorpo de espécies não- humanas, quando administrado a um indivíduo. Em uma configuração, certos aminoácidos dos domínios estruturais e constantes das cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo das espécies não-humanas são mutados para produzir o anticorpo humanizado. Em uma outra configuração, o(s) domínio(s) constante (s) de um anticorpo humano são fundidos ao(s) domínio(s) variável (eis) de uma espécie não- humana. Em uma outra configuração, um ou mais resíduos de aminoácido em uma ou mais seqüências de CDR de um anticorpo não- humano são alterados para reduzir a provável imunogenicidade do anticorpo não-humano quando administrado a um ser humano, onde os resíduos de aminoácido alterados não são críticos para a ligação imunoespecífica do anticorpo a seu antígeno, e as alterações feitas na seqüência de aminoácidos não são alterações conservadoras e assim a ligação do anticorpo humanizado ao antígeno não é significativamente pior do que a ligação do anticorpo não-humano ao antígeno. Exemplos de como preparar anticorpos humanizados podem ser encontrados nas Patentes Norte- americanas N2S 6.054,297, 5.886.152 e 5.877.293. O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um
anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos. Em uma configuração, uma ou mais das CDRs são derivadas de um anticorpo anti-GCGR humano. Em uma outra configuração, todas as CDRs são derivadas de um anticorpo anti-GCGR humano. Em uma outra configuração, as CDRs de mais de um anticorpo anti-GCGR humano são mescladas e combinadas em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode consistir em uma CDRl da cadeia leve de um primeiro anticorpo anti-GCGR humano, uma CDR2 e uma CDR3 da cadeia leve de um segundo anticorpo anti-GCGR humano e as CDRs da cadeia pesada de um terceiro anticorpo anti-GCGR. Adicionalmente, as regiões estruturais podem ser derivadas de um dos mesmos anticorpos anti- GCGR, de um ou mais anticorpos diferentes, tal como um anticorpo humano, ou de um anticorpo humanizado. Em um exemplo de anticorpo quimérico, uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica, homóloga ou derivada de um anticorpo de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto os restantes da(s) cadeia (s) são idênticos, homólogos ou derivados de um anticorpo ou anticorpos de uma outra espécie ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse de anticorpo. Também incluídos estão os fragmentos de anticorpos que exibem a atividade biológica desejada (ou seja, a habilidade de ligar-se especificamente ao receptor de glucagon humano).
Um "anticorpo neutralizante" ou "anticorpo inibidor" se refere a um anticorpo que inibe a ligação do glucagon ao receptor de glucagon humano, e/ou inibe ou reduz a sinalização do glucagon, determinada, por exemplo, pelo ensaio em células descrito no Exemplo 4 abaixo. A inibição não precisa ser completa e pode ser, em uma configuração, uma redução da ligação ou da sinalização de pelo menos 20%. Em configurações adicionais, a redução na ligação ou na sinalização é de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% e 99.9%. Fragmentos ou análogos de anticorpos podem ser
prontamente preparados por pessoas com habilidades comuns na técnica. Os terminais amino e carboxi preferidos dos fragmentos ou análogos ocorrem perto dos limites dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados dos nucleotideos e/ou da seqüência de aminoácidos com os bancos de dados públicos ou proprietários das seqüências. Os métodos de comparação computadorizada podem ser utilizados para identificar os motivos da seqüência ou domínios de conformação da proteína previstos que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecida. Os métodos para identificar as seqüências protéicas que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Vide, por exemplo, Bowie et al., 1991, Science 253:164.
Um "anticorpo enxertado em C DR" é um anticorpo que consiste em uma ou mais CDRs derivadas de um anticorpo de uma espécie ou isótipo particular e a estrutura de um outro anticorpo da mesma espécie ou isótipo ou de espécie ou isótipo diferente.
Um "anticorpo multiespecífico" é um anticorpo que reconhece mais de um epítopo em um ou mais antígenos. Uma subclasse deste tipo de anticorpo é um "anticorpo bi-específico" que reconhece dois epítopos distintos no mesmo antígeno ou em diferentes antígenos.
Uma proteína de ligação a antígeno que inclui um anticorpo "se liga especificamente" a um antígeno, tal como o receptor de glucagon humano se ela se ligar ao antígeno com uma alta afinidade de ligação, determinada por um valor de constante de dissociação (Kd, ou Kb correspondente, conforme definido abaixo) de IO"7 M ou menos (100 nM ou menos) . Uma proteína de ligação a antígeno que especificamente se liga ao receptor de glucagon humano pode ser capaz de se ligar também a receptores de glucagons de outras espécies com as mesmas afinidades ou afinidades diferentes.
"Domínio de ligação a antígeno", "região de ligação a antígeno" ou "sítio de ligação a antígeno" é uma parte de uma proteína de ligação a antígeno que contém resíduos de aminoácidos (ou outros componentes) que interagem com um antígeno e contribuem para a especificidade e afinidade da proteína de ligação para o antígeno. Para um anticorpo que se liga especificamente a seu antígeno, isto incluirá pelo menos parte de pelo menos um de seus domínios da CDR. Um "epítopo" é a parte de uma molécula que é
ligada por uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, por um anticorpo). Um epítopo pode consistir em partes não-contíguas da molécula (por exemplo, em um polipeptídio, os resíduos de aminoácidos que não são contíguos na seqüência primária do polipeptídio, mas que, no contexto da estrutura terciária e quaternária do polipeptídio, estão suficientemente perto uns dos outros para serem ligados por uma proteína de ligação a antígeno).
A "identidade percentual" de duas seqüências de polinucleótídeos ou duas seqüências de polipeptídios é determinada comparando as seqüências através do programa de computador GAP (uma parte do GCG Wisconsin Package, versão 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) usando seus parâmetros padrão.
Os termos "polinucleotídeo" "oligonucleotídeo" e "ácido nucléico" são usados intercambiavelmente em toda parte e incluem moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) , moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) , análogos do DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeo (por exemplo, ácidos nucléicos peptídicos e análogos de nucleotídeo que ocorrem naturalmente) e híbridos dos mesmos. A molécula de ácido nucléico pode ser de filamento simples ou duplo. Em uma configuração, as moléculas de ácido nucléico da invenção consistem em uma estrutura de leitura aberta contígua que codifica um anticorpo, ou um fragmento, derivado, muteína ou variantes destes, da invenção.
Dois polinucleotídeos de filamento simples são "o complemento" um do outro se suas seqüências puderem ser alinhadas em um sentido antiparalelo de tal modo que cada polinucleotídeo fique em oposição a seu nucleotídeo complementar no outro polinucleotídeo, sem a introdução de espaços e sem nucleotídeos desparelhados na extremidade 5' ou 3' de qualquer uma das seqüências. Um polinucleotídeo é "complementar" a outro se os dois polinucleotídeos puderem hibridizar um ao outro sob condições moderadamente rígidas. Assim, um polinucleotídeo pode ser complementar a outro sem ser seu complemento.
Um "vetor" é um ácido nucléico que pode ser usado para introduzir um outro ácido nucléico ligado a ele em uma célula. Um tipo de vetor é um "plasmídeo" que se refere a uma molécula de DNA de filamento duplo linear ou circular à qual segmentos de ácido nucléico adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adeno-associados), onde segmentos de DNA adicionais podem ser introduzidos no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos consistindo em uma origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não-epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e são assim replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Um "vetor de expressão" é um tipo de vetor que pode dirigir a expressão de um polinucleotideo escolhido.
Uma seqüência de nucleotideos é "operacionalmente
vinculada" a uma seqüência reguladora se esta afetar a expressão (por exemplo, o nivel, o tempo ou o local da expressão) da seqüência de nucleotideos. Uma "seqüência reguladora" é um ácido nucléico que afeta a expressão (por exemplo, o nivel, o tempo ou o local da expressão) de um ácido nucléico ao qual está operacionalmente vinculado. A seqüência reguladora pode, por exemplo, exercer seus efeitos diretamente sobre o ácido nucléico regulado, ou através da ação de uma ou mais outras moléculas (por exemplo, polipeptidios que se ligam à seqüência reguladora e/ou ao ácido nucléi co) . Exemplos de seqüências reguladoras incluem elementos promotores, intensificadores e outros elementos de controle da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Mais exemplos de seqüências reguladoras são descritos em, por exemplo, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA e Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.
Uma "célula hospedeira" é uma célula que pode ser usada para expressar um ácido nucléico, por exemplo, um ácido nucléico da invenção. Uma célula hospedeira pode ser um procariota, por exemplo, E. coli, ou um eucariota, por exemplo, um eucariota unicelular (por exemplo, uma levedura ou outro fungo), uma célula vegetal (por exemplo, uma célula da planta de fumo ou de tomate), uma célula animal (por exemplo, uma célula humana, uma célula de macaco, uma célula de hamster, uma célula de rato, uma célula de camundongo ou uma célula de inseto) ou um hibridoma. Normalmente, uma célula hospedeira é uma célula cultivada que pode ser transformada ou transfectada com um ácido nucléico codificador de polipeptidio, que pode então ser expresso na célula hospedeira. A expressão "célula hospedeira recombinante" pode ser usada para denotar uma célula hospedeira que foi transformada ou transfectada com um ácido nucléico para ser expressa. Uma célula hospedeira pode também ser uma célula que compreende o ácido nucléico, mas não o expressa em um nivel desejado a menos que seja introduzida uma seqüência reguladora na célula hospedeira para que ela se torne operacionalmente vinculada ao ácido nucléico. Entende-se que o termo célula hospedeira se refere não só à célula objeto particular, mas à progênie ou progênie potencial dessa célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações sucessoras devido a, por exemplo, mutação ou influência ambiental, essa progênie não pode, na verdade, ser idêntica à célula original, mas ainda assim é incluída no escopo do termo conforme usado aqui.
RECEPTORES DE GLUCAGON O receptor de glucagon (GCGR) pertence à família
7-transmembrana de receptores que são acoplados a uma ou mais vias de sinalização intracelulares através de proteínas de ligação heterotriméricas de nucleotídeo de guanina (proteínas G) (Jelinek et al., Science 259: 1614-1616 (1993), Segre et al., Trends Endocrinol. Metab 4:309-314 (1993)). Aqui, "receptor de glucagon" e "GCGR" são usados intercambiavelmente. Outros membros deste grupo incluem os receptores para secretina, o peptídeo semelhante à glucagon (GLP-I), a proteína intestinal vasoativa (VIP) e o fator de liberação do hormônio de crescimento. Esses receptores têm recursos estruturais altamente homólogos, incluindo um domínio N-terminal extracelular relativamente grande e uma série de domínios transmembrana, intracelulares e extracelulares.
Em uma configuração, os agentes de ligação a antígeno da presente invenção podem ser selecionados para ligar-se a receptores de glucagon ligados à membrana expressos nas células e inibir ou bloquear a sinalização do glucagon através do receptor de glucagon. Em uma configuração, os agentes de ligação a antígeno da presente invenção especificamente se ligam ao receptor de glucagon humano. Em uma configuração adicional, as proteínas de ligação a antígeno que se ligam ao receptor de glucagon humano podem também ligar-se aos receptores de glucagon de outras espécies. Os Exemplos abaixo fornecem um método para gerar anticorpos totalmente humanos que se ligam aos receptores de glucagon humanos ligados à membrana e em uma configuração adicional, se ligam a receptores de glucagon de outras espécies.
As seqüências de polinucleotídeos e polipeptídios de várias espécies de receptores de glucagons são conhecidas. A Tabela 1 apresenta as seqüências para o homem, o camundongo e o rato. As seqüências dos receptores de glucagon dos cynomolgus são identificadas aqui e apresentadas abaixo.
TABELA 1
Polinucleotídeos humanos (Homo sapiens) (N° de ID da SEQ: 1) número de adesão BC104854
1 gtgcagcccc tgccagatgt gggaggcagc tagctgccca gaggcatgcc cccctgccag 61 ccacagcgac ccctgctgct gttgctgctg ctgctggcct gccagccaca ggtcccctcc 121 gctcaggtga tggacttcct gtttgagaag tggaagctct acggtgacca gtgtcaccac 181 aacctgagcc tgctgccccc tcccacggag ctggtgtgca acagaacctt cgacaagtat 241 tcctgctggc cggacacccc cgccaatacc acggccaaca tctcctgccc ctggtacctg 301 ccttggcacc acaaagtgca acaccgcttc gtgttcaaga gatgcgggcc cgacggtcag 361 tgggtgcgtg gaccccgggg gcagccttgg cgtgatgcct cccagtgcca gatggatggc 421 gaggagattg aggtccagaa ggaggtggcc aagatgtaca gcagcttcca ggtgatgtac 481 acagtgggct acagcctgtc cctgggggcc ctgctcctcg ccttggccat cctggggggc 541 ctcagcaagc tgcactgcac ccgcaatgcc atccacgcga atctgtttgc gtccttcgtg 601 ctgaaagcca gctccgtgct ggtcattgat gggctgctca ggacccgcta cagccagaaa 661 attggcgacg acctcagtgt cagcacctgg ctcagtgatg gagcggtggc tggctgccgt 721 gtggccgcgg tgttcatgca atatggcatc gtggccaact actgctggct gctggtggag 781 ggcctgtacc tgcacaacct gctgggcctg gccaccctcc ccgagaggag cttcttcagc 841 ctctacctgg gcatcggctg gggtgccccc atgctgttcg tcgtcccctg ggcagtggtc 901 aagtgtctgt tcgagaacgt ccagtgctgg accagcaatg acaacatggg cttctggtgg 961 atcctgcggt tccccgtctt cctggccatc ctgatcaact tcttcatctt cgtccgcatc 1021 gttcagctgc tcgtggccaa gctgcgggca cggcagatgc accacacaga ctacaagttc 1081 cggctggcca agtccacgct gaccctcatc cctctgctgg gcgtccacga agtggtcttc 1141 gccttcgtga cggacgagca cgcccagggc accctgcgct ccgccaagct cttcttcgac 1201 ctcttcctca gctccttcca gggcctgctg gtggctgtcc tctactgctt cctcaacaag 1261 gaggtgcagt cggagctgcg gcggcgttgg caccgctggc gcctgggcaa agtgctatgg 1321 gaggagcgga acaccagcaa ccacagggcc tcatcttcgc ccggccacgg ccctcccagc 1381 aaggagctgc agtttgggag gggtggtggc agccaggatt catctgcgga gacccccttg 1441 gctggtggcc tccctagatt ggctgagagc cccttctgaa ccctgctggg accccagcta 1501 gggctggact ctggcaccc Aminoácido humano (Homo sapiens) (N° de ID da SEQ: 2) 477 aa; adesão nc EAW89684 Met Pro Pro Cys Gln Pro Gln Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Gln Pro Gln Val Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn He Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gln His Arg Phe Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly Gln Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Gly Glu Glu lie Glu Val Gln Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ala He : Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala lie His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu Val He Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gln Lys He Gly Asp Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gln Tyr Gly He Val Ala Asn Tyr Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly He Gly Trp Gly Ala Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys Cys Leu Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp Trp He : Leu . A.rg Phe : Pro Val : Phe Leu Ala He Leu He Asn Phe Phe He Phe Val Arg He Val Gln Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg Gln Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu Thr Leu He Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Ala Lys Leu Phe Phe Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp His Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Trp Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn His Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly His Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu Gln Phe Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu Thr Pro Leu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala ι Glu Ser Pro Phe
Polinucleotideos de camundongos (Mus musculus) (N° de ID da SEQ: 3)
número de adesão BC5057988 1 cgcgaggagc gcagccctag ccccggcgac tgagcacacc tgaggagagg tgcacacact 61 ctgaggacct aggtgtgcaa cctctgccag atgtggggcg tggctaccca gaggcatgcc 121 cctcacccag ctccactgtc cccacctgct gctgctgctg ttggtgctgt catgtctgcc 181 agaggcaccc tctgcccagg taatggactt tttgtttgag aagtggaagc tctatagtga 241 ccaatgccac cacaacctaa gcctgctgcc cccacctact gagctggtct gtaacagaac 301 cttcgacaag tactcctgct ggcctgacac ccctcccaac accactgcca acatttcctg 361 cccctggtac ctaccttggt accacaaagt gcagcaccgc ctagtgttca agaggtgtgg 421 gcccgatggg cagtgggttc gagggccacg ggggcagccg tggcgcaacg cctcccaatg 481 tcagttggat gatgaagaga tcgaggtcca gaagggggtg gccaagatgt atagcagcca 541 gcaggtgatg tacaccgtgg gctacagtct gtccctgggg gccttgctcc ttgcgctggt 601 catcctgctg ggcctcagga agctgcactg cacccgaaac tacatccatg ggaacctgtt 661 tgcgtccttt gtgctcaagg ctggctctgt gttggtcatc gattggctgc tgaagacacg 721 gtacagccag aagattggcg atgacctcag tgtgagcgtc tggctcagtg acggggcgat 781 ggccggctgc agagtggcca cagtgatcat gcagtacggc atcatagcca actattgctg 841 gttgctggta gagggcgtgt acctgtacag cctgctgagc cttgccacct tctctgagag 901 gagcttcttt tccctctacc tgggcattgg ctggggtgcg cccctgctgt ttgtcatccc 961 ctgggtggtg gtcaagtgtc tgtttgagaa tgttcagtgc tggaccagca atgacaacat 1021 gggattctgg tggatcctgc gtattcctgt cttcctggcc ttactgatca attttttcat 1081 ctttgtccac atcattcacc ttcttgtggc caagctgcgt gcccatcaga tgcactatgc 1141 tgactataag ttccggctgg ccaggtccac gctgaccctc atccctctgc tgggggtcca 1201 cgaggtggtc tttgcctttg tgactgacga gcatgcccaa ggcaccctgc gctccaccaa 1261 gctctttttt gacctgttcc tcagctcctt ccagggtctg ctggtggctg ttctctactg 1321 tttcctcaac aaggaggtgc aggcagagct gatgcggcgt tggaggcaat ggcaagaagg 1381 caaagctctt caggaggaaa ggttggccag cagccatggc agccacatgg ccccagcagg 1441 gccttgtcat ggtgatccct gtgagaaact tcagcttatg agtgcaggca gcagcagtgg 1501 gactggctgt gtgccctcta tggagacctc gctggccagt agtctcccaa ggttggctga 1561 cagccccacc tgaatctcca ctggagccta gccaggctgc gttcagaaag ggcctcagag 1621 gacaacccag agccagatgc ccggccaagg ctgaagagac aaagcagcaa gacagcagct 1681 tgtactgtgc acactcccct aacctgtcct agcctggcac aggccacagt gacagagtag
1741 gggttggata tgatggagaa gccatgttat ctatgaactc tgagtgttcc catgtgtgtt
1801 gacatggtcc ctgtacccag atatgtcctt cagtaaaaag ctcgagtggg agctgctgca
1861 caaaaaaaaa aaaaaaaaaa
Aminoácido de camundongo (Mus musculus) (N° de ID da SEQ: 4) 485 aa adesão número AAH57988
Met Pro Leu Thr Gln Leu His Cys Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Ser Cys Leu Pro Glu Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Ala Asn He Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gln His Arg Leu Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly Gln Pro Trp Arg Asn Ala Ser Gln Cys Gln Leu Asp Asp Glu Glu He Glu Val Gln Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Gln Gln Val Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Val He Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr He His Gly AsnLeu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Gly Ser Val Leu Val He Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln Lys He Gly Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp Gly Ala Met Ala Gly Cys Arg Val Ala Thr Val He Met Gln Tyr Gly He He Ala Asn Tyr Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Leu Ala Thr Phe Ser Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Glylle Gly Trp Gly Ala Pro Leu Leu Phe Val He Pro Trp Val Val Val Lys Cys Leu Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp Trp He Leu Arg He Pro Val Phe Leu Ala Leu Leu He Asn Phe Phe He Phe Val His He He His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala His Gln Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr Leu Thr Leu He Pro Leu Leu GlyVal His Glu Val Val Phe Ala Phe Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe Phe Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ala Glu Leu Met Arg Arg Trp Arg Gln Trp Gln Glu Gly Lys Ala Leu Gln Glu Glu Arg Leu Ala Ser Ser His Gly Ser His Met Ala Pro Ala Gly Pro Cys His Gly Asp Pro Cys GluLys Leu Gln Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly Cys Val Pro Ser Met Glu Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu Ala Asp Ser Pro Thr Polinucleotideos de ratos (Rattus norvegicus) (N° de ID da SEQ: Adesão n° NM 172092 1 gaattcgcgg ccgccgccgg gccccagatc ccagtgcgcg aggagcccag tcctagaccc 61 agcaacctga ggagaggtgc acacaccccc aaggacccag gcacccaacc tctgccagat 121 gtgggggggt ggctacccag aggcatgctc ctcacccagc tccactgtcc ctacctgctg 181 ctgctgctgg tggtgctgtc atgtctgcca aaggcaccct ctgcccaggt aatggacttt 241 ttgtttgaga agtggaagct ctatagtgac cagtgccacc acaacctaag cctgctgccc 301 ccacctactg agctggtctg caacagaact ttcgacaagt actcctgctg gcctgacacc 361 cctcccaaca ccactgccaa catttcctgc ccctggtacc taccttggta ccacaaagtg 421 cagcaccgcc tagtgttcaa gaggtgtggg cctgatgggc agtgggttcg agggccacgg 481 gggcagtcat ggcgcgacgc ctcccaatgt cagatggatg atgacgagat cgaggtccag 541 aagggggtag ccaagatgta tagcagctac caggtgatgt acactgtggg ctacagtctg 601 tccctggggg ccttgctcct ggcgctggtc atcctgctgg gcctcaggaa gctgcactgc 661 acccggaact acatccacgg gaacctgttc gcgtccttcg tgctcaaggc tggctctgtg 721 ctggtcattg attggctgct caagacacgc tatagccaga agattggaga tgacctcagt 781 gtgagcgtct ggctcagtga tggggcggtg gctggctgca gagtggccac agtgatcatg 841 cagtacggca tcatagccaa ctactgctgg ttgctggtgg agggtgtgta cctgtacagc 901 ctgctgagca tcaccacctt ctcggagaag agcttcttct ccctctatct gtgcatcggc 961 tggggatctc ccctgctgtt tgtcatcccc tgggtggtgg tcaagtgtct gtttgagaat 1021 gtccagtgct ggaccagcaa tgacaatatg ggattctggt ggatcctgcg tatccctgta 1081 ctcctggcca tactgatcaa ttttttcatc tttgtccgca tcattcatct tcttgtggcc 1141 aagctgcgtg cccatcagat gcactatgct gattacaagt tccggctagc caggtccacg 1201 ctgaccctca ttcctctgct gggagtccac gaagtggtct ttgcctttgt gactgatgag 1261 catgcccagg gcaccctgcg ctccaccaag ctcttttttg acctgttctt cagctccttt 1321 cagggtctgc tggtggctgt tctctactgt ttcctcaaca aggaggtgca ggcagagcta 1381 ctgcggcgtt ggaggcgatg gcaagaaggc aaagctcttc aggaggaaag gatggccagc 1441 agccatggca gccacatggc cccagcaggg acttgtcatg gtgatccctg tgagaaactt 1501 cagcttatga gtgcaggcag cagcagtggg actggctgtg agccctctgc gaagacctca 1561 ttggccagta gtctcccaag gctggctgac agccccacct gaatctccac tggactccag 1621 ccaagttgga ttcagaaagg gcctcacaag acaacccaga aacagatgcc tggccaaggc 1681 tgaagaggca aagcagcaag acagcagctt gtactatcca cactccccta acctgtcctg 1741 gccgggtaca ggccacattg atggagtagg ggctggatat gatggagtag ccatgctatg 1801 aactatgggt gttcccatga gtgttgccat gttccatgca cacagatatg accttcagta 1861 aagagctccc gtagg Aminoácido de rato (Rattus norvegicus) (N ° de ID da SEQ: 6) 489 aa, adesão n° NM 172092 Met Leu Leu Thr Gln Leu His Cys Pro TyrLeu Leu Leu Leu Leu Val Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Ala Asn He Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gln His Arg Leu Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly Gln Ser Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Asp Asp Glu He Glu Val Gln Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Tyr Gln Val Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Val He Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr He His Gly Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Gly Ser Val Leu Val lie Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln Lys He Gly Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys Arg Val Ala Thr Val He Met Gln Tyr Gly He He Ala Asn Tyr Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser He Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Cys He Gly Trp Gly Ser Pro Leu Leu Phe Val He Pro Trp Val Val Val Lys Cys Leu Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp Trp He Leu Arg He Pro Val Leu Leu Ala He Leu He Asn Phe Phe He Phe Val Arg lie He His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala His Gln Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr Leu Thr Leu He Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ala Glu Leu Leu Arg Arg Trp Arg Arg Trp Gln Glu Gly Lys Ala Leu Gln Glu Glu Arg Met Ala Ser Ser His Gly Ser His Met Ala Pro Ala Gly Thr Cys His Gly Asp Pro Cys Glu Lys Leu Gln Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly Cys Glu Pro Ser Ala Lys Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu Ala Asp Ser Pro Thr
Polinucleotideos de Cynomolgus (Macaca fascicularis) (N° de ID da SEQ: 7)
>ciano-20042028 417-contigl (32bp - 1465bp, direto) 1434bp atgcccccctgtcagccacgtcgacccctgctactgttgctgctgctgctggcctgccagccac
ag
gccccctccgctcaggtgatggacttcctgtttgagaagtggaaactctacggtgaccagtgtc ac
cacaacctgagcctgctgcccccccccacggagctggtctgtaacagaaccttcgacaagtatt cc
tgctggccagacacccccgccaataccacagccaacatctcctgcccctggtacctgccttggc ac
cacaaagtgcaacaccgcttcgtgttcaagagatgcgggcccgatggtcagtgggtgcgtggac cc
cgggggcagccttggcgtgacgcctctcagtgccagatggacggcgaggagcttgaggtccaga ag
gaggtggctaagatgtacagcagcttccaggtgatgtacacggtgggctacagcctgtccctgg
gg
gccctgctcctcgccttggccatcctggggggcatcagcaagctgcactgcacccgcaacgcca tc
cacgcgaacctgtttgtgtccttcgtgctgaaggccagctccgtgctggtcatcgatgggctgc tc
aggacccgctacagccagaagattggcgacgacctcagtgtcagcatctggctcagtgatggag cg
gtggccggctgccgtgtggccgcggtgttcatgcaatatggcgtcgtggccaactactgctggc tg
ctggtggagggcctgtacctgcacaacctgctgggcctggccaccctccctgagaggagcttct tc
agcctctacctgggcatcggctggggtgcccccatgctgttcatcatcccctgggtggtggtca
gg tgtctgttcgagaacatccagtgctggaccagcaatgacaacatgggcttctggtggatcctgc
gg
ttccccgtcttcctggccatcctgatcaacttcttcatcttcatccgcattgttcacctgcttg tg
gccaagctgcgggcgcgggagatgcaccacacagactacaagttccgactggccaagtccacac tg
accctcatccccctgctgggtgtccacgaagtgatcttcgccttcgtgacggacgagcacgccc ag
ggcaccctgcgcttcgccaagctcttcttcgacctcttcctcagctccttccagggcctgctgg tg
gctgtcctctactgcttcctcaacaaggaggtgcagtcggaacttcggcggcattggcaccgct
gg
cgcctgggcaaagtgctgcaggaggagcggggcaccagcaaccacaagaccccatctgcgcctg gc
caaggccttcctggcaagaagctgcagtctgggaggggtggtggcagccaggactcatctgcgg ag
atccccttggctggtggcctccctaggttggctgagagccccttctga
Aminoácidos de Cynomolgus (Macaca fascicularis) (N° de ID da SEQ: 8) 478 aa
Met Pro Pro Cys Gln Pro Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Cys Gln Pro Gln Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu Phe Glu Lys Tip Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys Tyr Ser Cys Trp Pro AspThr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn He Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gln His Arg Phe Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly ProArg Gly Gln Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Gly Glu Glu Leu Glu ValGln Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met Tyr Thr Val Gly Tyr SerLeu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ala He Leu Gly Gly lie Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala lie His Ala Asn Leu Phe Val Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser SerVal Leu Val He Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gln Lys He Gly Asp Asp Leu Ser Val Ser He Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gln Tyr Gly Val Val Ala Asn Tyr Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly He Gly Trp Gly Ala Pro Met Leu Phe He He Pro Trp Val Val Val Arg Cys Leu Phe Glu Asn He Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp Trp He Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Ala He Leu He Asn Phe Phe He Phe lie Arg He Val His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg Glu Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu Thr Leu He Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val He Phe Ala Phe Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Phe Ala Lys Leu Phe Phe Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Leu Arg Arg His Trp His Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Gln Glu Glu Arg Gly Thr Ser Asn His Lys Thr Pro Ser Ala Pro Gly Gln Gly Leu Pro Gly Lys Lys Leu Gln Ser Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu He Pro Leu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala Glu Ser Pro Phe
Proteínas de ligação a antígeno
Em um aspecto, a presente invenção provê
proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo, derivados de anticorpo, muteínas de anticorpo e variantes de anticorpo), que especificamente se ligam ao receptor de glucagon humano. Em uma configuração, a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo humano. As proteínas de ligação a antígeno, de acordo com a presente invenção, incluem proteínas de ligação a antígeno que especificamente se ligam ao receptor de glucagon humano e inibem a sinalização do glucagon através do receptor de glucagon. Em uma configuração, o valor da CI50 da proteína de ligação a antígeno é 90 nM ou menos. Em um outro aspecto, as proteínas de ligação a antígeno especificamente se ligam ao receptor de glucagon, inibem a sinalização e exibem efeitos biológicos terapêuticos, tais como a redução da glicemia em modelos animais, ou a melhora da eliminação da glicose (tolerância) em modelos animais. Em uma configuração, as proteínas de ligação a antígeno são anticorpos humanos que especificamente se ligam ao receptor de glucagon e inibem a sinalização através do receptor de glucagon. Em uma outra configuração, as proteínas de ligação a antígeno são anticorpos humanos que especificamente se ligam ao receptor de glucagon humano, inibem a sinalização através do receptor de glucagon e são capazes de reduzir a glicemia ou melhorar a eliminação da glicose (tolerância) em modelos animais.
Em uma configuração, a proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo) consiste em seqüências que diferem cada uma independentemente em 5, 4, 3, 2, 1, ou 0 adições, substituições e/ou eliminações simples de aminoácido de uma seqüência de CDR de A1-A23 na Tabela 2 abaixo. Aqui, uma seqüência de CDR que difira em não mais que um total de, por exemplo, quatro adições, substituições e/ou eliminações de aminoácidos de uma seqüência de CDR mostrada na Tabela 2 abaixo se refere a uma seqüência com 4, 3, 2, 1 ou 0 adições, substituições e/ou eliminações simples de aminoácidos comparada às seqüências mostradas na Tabela 2.
Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em uma ou mais seqüências consenso de CDR mostradas abaixo. Seqüências consenso são fornecidas para CDRl, CDR2, CDR3 de cadeia leve e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada abaixo.
As CDRs de cadeia leve das proteínas de ligação a antígeno (anticorpos) A1-A23 e as CDRs de cadeia pesada de proteínas de ligação a antígeno exemplares (anticorpos) A1-A23 são mostradas abaixo na Tabela 2. A-I a A-23 correspondem a Ll a L23 abaixo e Hl a H23 abaixo. Também são mostradas as seqüências de polinucleotídeos que codificam as seqüências de aminoácidos das CDRs .
TABELA 2
CADEIAS LEVES Ll a L23
Ab CDRl CDR 2 CDR 3 A-I aggtctagtcagagcctcttg acgctttcctatcgggc atgcaacgtataga NA gatagagatgatggagacacc CtCt gtttccattcact tatttggac (N° de ID da SEQ: (N° de ID da (N° de ID da SEQ: 9) 42) SEQ: 71) AA RSSQSLLDRDDGDTYLD TLSYRAS MQRTEFPFT (N° de ID da SEQ: 10) (N° de ID da SEQ: 43) (N° de ID da SEQ: 72) A-2 aggtctagtcagagcctcttg acgctttcctatcgggc atgcaacgtataga NA gatagtgctgatggagacacc CtCt gtttccattcact tatttggac (N° de ID da SEQ: (N° de ID da (N° de ID da SEQ: 11) 42) SEQ: 71) AA RSSQSLLDSADGDTYLD TLSYRAS MQRIEFPFT (N° de ID da SEQ: 12) (N° de ID da SEQ: 43) (N° de ID da SEQ: 72) A-3 cgggcaagtcagggcattaga gctgcatccagtttgca ctacagcataatag NA aatgatttaggc aagt taaccctctcact (N° de ID da SEQ: 13) (N° de ID da SEQ: 44) (N° de ID da SEQ: 73) AA RASQG1RNDLG AASSLQS LQHNSNPLT (N° de ID da SEQ: 14) (N° de ID da SEQ: 45) (N° de ID da SEQ: 74) A-4 cgggcaagtcagggcattaga gctgcatccagtttgca ctacagcataatag NA aatgatttaggc aagt taaccctctcact (N° de ID da SEQ: 13) (N° de ID da SEQ: 44) (N° de ID da SEQ: 73) AA RASQGIRNDLG AASSLQS LQHNSNPLT (N° de ID da SEQ: 14) (N° de ID da SEQ: 45) (N° de ID da SEQ: 74) A-5 cgggcaagtcagggcattaga gctgcctccagtttgca ctacagcataatag NA aatgatttaggc aagt tgacccgctcacc (N° de ID da SEQ: 13) (N° de ID da SEQ: 46) (N° de ID da SEQ: 75) AA RASQGIRNDLG AASSLQS LQHNSDPLT (N° de ID da SEQ: 14) (N° de ID da SEQ: 45) (N° de ID da SEQ: 76) A-6 agggccagtcagagtgttagc ggtgcatccagcagggc caacaatatggtaa NA agcaactacttagcc cact ctcaccattcact (N° de ID da SEQ: 15) (N° de ID da SEQ: 47) (N° de ID da SEQ: 77) AA RASQSVSSNYLA GASSRAT QQYGNSPFT (Ν° de ID da SEQ: 16) (N° de ID da SEQ: 48) (N° de ID da SEQ: 78) Α-7 cgggcaagtcaggacattaga gctgcatccagtttaca ctacagcaaaatag NA aatgattttggc aagt ttacccgctcact (N° de ID da SEQ: 17) (N° de ID da SEQ: 44) (N° de ID da SEQ: 79) AA RASQDBRNDFG AASSLQS LQQNSYPLT (N° de ID da SEQ: 18) (N° de ID da SEQ: 45) (N° de ID da SEQ: 80) A-8 gggtctactcagagcctcttg acgctttcctatcgggc atgcaacgtataga NA gatagtgatgatggagacacc ctct gtttccattcact tatttggac (N° de ID da SEQ: (N° de ID da (N° de ID da SEQ: 19) 42) SEQ: 71) AA RSTQSLLDSDDGDTYLD TLSYRAS MQRIEFPFT (N° de ID da SEQ: 20) (N° de ID da SEQ: 43) (N° de ID da SEQ: 72) A-9 cgggcaagtcagggcattaga gctgcatccagtttgga ctacagcataatag NA aatgatttaggc aagt taaccctctcact (N° de ID da SEQ: 13) (N° de ID da SEQ: 49) (N° de ID da SEQ: 73) AA RASQGIRNDLG AASSLES LQHNSNPLT (N° de ID da SEQ: 14) (N° de ID da SEQ: 50) (N° de ID da SEQ: 74) A-IO caggcgagtcaggacattagt gatgcatccaatttgga caacagtatggtaa NA aagtatttaaat aaca tctcccgatcacc (N° de ID da SEQ: 21) (N° de ID da SEQ: 51) (N° de ID da SEQ: 75) AA QASQDISKYLN (Ν° de ID da SEQ: 22) DASNLET (N° de ID da SEQ: 52) QQYGNLPIT (N° de ID da SEQ: 76) A-Il NA tctggagataaattgggggat aaatatgtttgc (N° de ID da SEQ: 23) caaacttccaagcggcc ctca (N° de ID da SEQ: 53) caggcgtgggacag caacactgtgatt (N° de ID da SEQ: 77) AA SGDKLGDKYVC (N° de ID da SEQ: 24) QTSKRPS (N° de ID da SEQ: 54) QAWDSNTVI (N° de ID da SEQ: 78) Α-12 NA tctggagataaattgggggat aaatatgtttgc (N° de ID da SEQ: 23) Caaacttccaagcggcc ctca (N° de ID da SEQ: 53) caggcgtgggacag cagcactgtggtt (N° de ID da SEQ: 79) AA SGDKLGDKYVC (N° de ID da SEQ: 24) QTSKRPS (N° de ID da SEQ: 54) QAWDSSTVV (N° de ID da SEQ: 80) Α-13 NA tctggagataaattgggggat aaatatgcttgc (N° de ID da SEQ: 25) caatctaccaagcggcc ctca (N° de ID da SEQ: 55) caggcgtgggacag cagcactgtggta (N° de ID da SEQ: 81) AA SGDKLGDKYAC (N° de ID da SEQ: 26) QSTKRPS (N° de ID da SEQ: 56) QAWDSSTVV (N° de ID da SEQ: 80) Α-14 NA acccgcagcagtggcagcatt gtcagcaactttgtgcaa (N° de ID da SEQ: 27) gaggataaccaaagacc ctct (N° de ID da SEQ: 57) cagtcttatgatac cagcaatcaggtg (N° de ID da SEQ: 82) AA TRSSGSIVSNFVQ (Ν° de ID da SEQ: 28) EDNQRPS (N° de ID da SEQ: 58) QSYDTSNQV (N° de ID da SEQ: 83) Α-15 NA actggaatcacctccaacatc ggaagcaatactgtacac (N° de ID da SEQ: 29) agtaataatcagcggcc ctca (N° de ID da SEQ: 59) gcagcatgggatga cagcctgaatggtc cggtg (N° de ID da SEQ: 84) AA TGITSNIGSNTVH (N° de ID da SEQ: 30) SNNQRPS (N° de ID da SEQ: 60) AAWDDSLNGPV (N° de ID da SEQ: 85) A-16 NA tctggaagcaggtccaacatc ggaagtaattatgtatac (N° de ID da SEQ: 31) aggaataatcagcggcc ctca (N° de ID da SEQ: 61) gcagcatgggatga cagcctgagtaggc cggta (N° de ID da SEQ: 86) AA SGSRSNIGSNYVY (N° de ID da SEQ: 32) RNNQRPS (N° de ID da SEQ: 62) AAWDDSLSRPV (N° de ID da SEQ: 87) Α-17 NA actgggagcagctccaacatc ggggcaggttatgctgtacac (N° de ID da SEQ: 33) gataacaacaatcggcc ctca (N° de ID da SEQ: 63) cagtcctatgacag cagcctgagtgcta ta (N° de ID da SEQ: 88) AA TGSSSNIGAGYAVH (N° de ID da SEQ: 34) DNNNRP (N° de ID da SEQ: 64) QSYDSSLSAI (N° de ID da SEQ: 89) Α-18 aagtctagtcagagcctcctg gaagtttcctaccggtt atgcaaaatataca NA catagtgatggaaagaactat ctct gcctcctctcacc ttgttt (N° de ID da SEQ: (N° de ID da (Ν° de ID da SEQ: 35) 65) SEQ: 90) AA KSSQSLLHSDGKNYLF EVSYRFS MQNIQPPLT (Ν° de ID da SEQ: 36) (N° de ID da SEQ: 66) (N° de ID da SEQ: 91) Α-19 aggtctagtcagagcctcctg ttgggttctaatcgggc atggaagctcttca NA catagtaatggatacaactat ctcc aactatgtgcagt ttggat (N° de ID da SEQ: (N° de ID da (N° de ID da SEQ: 37) 67) SEQ: 92) AA RSSQSLLHSNGYNYLD LGSNRAS MEALQTMCS (N° de ID da SEQ: 38) (N° de ID da SEQ: 68) (N° de ID da SEQ: 93) Α-20 cgggcaagtcagggcattaga gctgcatccagtttgca ctacagcataatag NA aatgatttaggc aagt ttaccctcgcagt (N° de ID da SEQ: 39) (N° de ID da SEQ: 44) (N° de ID da SEQ: 94) AA RASQGIRNDLG AASSLQS LQHNSYPRS (N° de ID da SEQ: 14) (N° de ID da SEQ: 45) (N° de ID da SEQ: 95) Α-21 cgggcgagtcagggtattagc gctgcatccagtttgca caacaggctaacag NA agctggttagcc aagt tttcccgctcact (N° de ID da SEQ: 40) (N° de ID da SEQ: 44) (N° de ID da SEQ: 96) AA RASQGISSWLA AASSLQS QQANSFPLT (N° de ID da SEQ: 41) (N° de ID da SEQ: 45) (N° de ID da SEQ: 97) A-22 NA aggtctagtcagagcctcttg gatagagatgatggagacacc tatttggac (N° de ID da SEQ: 9) acgctttcctatcgggc ctct (N° de ID da SEQ: 42) atgcaacgtataga gtttccattcactt (N° de ID da SEQ: 98) AA RSSQSLLDRDDGDTYLD (N° de ID da SEQ: 10) TLSYRAS (N° de ID da SEQ: 43) MQRIEFPFT (N° de ID da SEQ: 72) A-23 NA cgggcgagtcagggtattagc agctggttagcc (N° de ID da SEQ: 40) actgcatccactttgca aagt (N° de ID da SEQ: 69) caacagtctaacag tttcccgctcact (N° de ID da SEQ: 99) AA RASQGISSWLA (N° de ID da SEQ: 41) TASTLQS (N° de ID da SEQ: 70) QQSNSFPLT (N° de ID da SEQ: 100)
CADEIAS PESADAS Ll a L23
Ab CDRl CDR2 CDR3 A-I NA agctatggcatgcac (N° de ID da SEQ: 101) tctatatggtatgatgga agtaataaatattatgta gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 123) cttggtggtggttttgactac (N° de ID da SEQ: 164) AA SYGMH (N° de ID da SEQ: 102) SIWYDGSNKYYVDSVKG (N° de ID da SEQ: 124) LGGGFDY (N° de ID da SEQ: 165) A-2 agctatggcatgcac tttatatggtatgatgga atgggaggcggctttgactac NA (Ν° de ID da agtgaaaaatattatgta (N° de ID da SEQ: SEQ: 101) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 125) 166) AA SYGMH FIWYDGSEKYYVDSVKG MGGGFDY (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 102) 126) 167) Α-3 agctatggcatgcac gttatgtggtatgatgga gaaaaagatcattacgacatt NA ('N0 de ID da agtaataaagactatgta ttgactggttataactactac SEQ: 101) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 127) tacggtctggacgtc (N° de ID da SEQ: 168) AA SYGMH VMWYDGSNKDYVDSVKG EKDHYDILTGYNYYYGLDV (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 102) 128) 169) A- 4 agctatggcatgcac gttatgtggtatgatgga gaaaaagatcattacgacatt NA (N° de ID da agtaataaagactatgta ttgactggttataactactac SEQ: 101) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 127) tacggtctggacgtc (N° de ID da SEQ: 168) AA SYGMH VMWYDGSNKDYVDSVKG EKDHYDILTGYNYYYGLDV (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 102) 128) 169) Α-5 acctatgggatgcac gttatatcagatgatgga gaggagacgtattacgatatt NA (N° de ID da agtcataaatactctgca ttgactggctatcatcactac SEQ: 103) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 129) tacggtatggacgtc (N° de ID da SEQ: 170) AA TYGMH VISDDGSHKYSADSVKG EETYYDILTGYHHYYGMDV (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 104) 130) 171) A-6 agctatggcatgcac gaaatatggaatgatgga gagcctcagtattacgatatt NA (N° de ID da agtaataaatactatgca ttgactggttatgataactac SEQ: 101) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 131) tacggtatggacgtc (N° de ID da SEQ: 172) AA SYGMH EIWNDGSNKYYADSVKG EPQYYDILTGYDNYYGMDV (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 102) 132) 173) A-7 NA agctatggcatgcac gtgatatcacatgatgga gaaaaaccgtattacgatatt (N° de ID da agtgataaatactatgca ttgactggttatttctactac SEQ: 105) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 133) tatggtatggacgtc (N° de ID da SEQ: 174) AA SYDMH VISHDGSDKYYADSVKG EKPYYDILTGYFYYYGMDV (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 106) 134) 175) A-8 agctatggcatgcac ggtatatggtatgatgga ttagcagtggcctttgactac NA (N° de ID da aggaataaata (N° de ID da SEQ: SEQ: 101) ctatgtagactccgtgaa gggc (N° de ID da SEQ: 135) 176) AA SYGMH GIWYDGRNKYYVDSVKG LAVAFDY (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 102) 136) 177) Α-9 agctatggcatgcac gttatgtggtatgatgga gaaaaagatcattacgacatt NA (Ν° de ID da agtaataaagactatgta ttgactggttataactactac SEQ: 101) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 127) tacggtctggacgtc (N° de ID da SEQ: 168) AA SYGMH VMWYDGSNKDYVDSVKG EKDHYDILTGYNYYYGLDV (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 102) 128) 169) A-IO agcaactatgctgct aggacatactacaggtcc gaagatggcagtggctggtac NA tggaac aagtggtataatgattat ggtgcttttgacatc (N° de ID da gcagtatctgtgagaagt (N° de ID da SEQ: SEQ: 107) (N° de ID da SEQ: 137) 178) AA SNYAAWN RTYYRSKWYNDYAVSVRS EDGSGWYGAFDI (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 108) 138) 179) A-Il agctatgacatgcac tttatatcagatgatgga gatcaatacgatattttgact NA (N° de ID da agtaataaatactatgga ggttattcttctgatgctttt SEQ: 109) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 139) gatatc (N° de ID da SEQ: 180) AA SYDMH FISDDGSNKYYGDSVKG DQYDILTGYSSDAFDI (N° (N° de ID da (N° de ID da SEQ: de ID da SEQ: 181) SEQ: 106) 140) A-12 agctatgacatgcac tttatatcagatgatgga gatcaatacgatattttgact NA (N° de ID da agtaataaatattatgga ggttattcttctgatgctttt SEQ: 109) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 141) gatatc (N° de ID da SEQ: 180) AA SYDMH FISDDGSNKYYGDSVKG DQYDILTGYSSDAFDI (Ν° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 106) 140) 181) Α-13 agctatgacatgcac gttatatcatatgatgga gatcaatacgatattttgact NA (N° de ID da agtaataaatactatgga ggttattcttctgatgctttt SEQ: 109) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 142) gatatc (N° de ID da SEQ: 180) AA SYDMH VISYDGSNKYYGDSVKG DQYDILTGYSSDAFDI (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 106) 143) 181) Α-14 aactatggcatgcac gttatatggtatgatgga gcctattacgatattttgact NA (N° de ID da agtaataaatactatgca gattacccccagtatgactac SEQ: 110) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 144) tactacggtatggacgtc (N° de ID da SEQ: 182) AA NYGMH VIWYDGSNKYYADSVKG AYYDHTDYPQYDYYYGMDV (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 111) 145) 183) Α-15 agctatggcatgcac cttatatcatttgatgga gatgggtattacgatattttg NA (N° de ID da agtaataaatactatgca actggttatgaggatgatgct SEQ: 101) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 146) tttgatatc (N° de ID da SEQ: 184) AA SYGMH LISFDGSNKYYADSVKG DGYYDILTGYEDDAFDI (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 102) 147) 185) Α-16 ggctactatttgcac tggatcatccctgacagt gaagggtttcattacgatatt NA (Ν° de ID da ggtggcacaaagtatgca ttgactggttcctacttctac SEQ: 112) cagaagtttcagggc (N° de ID da SEQ: 148) tactacggtatggacgtc (N° de ID da SEQ: 186) AA GYYLH WIIPDSGGTKYAQKFQG EGFHYDILTGSYFYYYGMDV (Ν° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 113) 149) 187) Α-17 agctatggtatcagt tggatcggcgtttacaat agggtagcagtggctgggtac NA (N° de ID da ggtcacacaaaatatgca tttgactac SEQ: 114) cagaagttccagggc (N° de ID da SEQ: 150) (N° de ID da SEQ: 188) AA SYGIS WIGVYNGHTKYAQKFQG RVAVAGYFDY (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 115) 151) 189) Α-18 aagtctagtcagagc gaagtttcctaccggttc atgcaaaatatacagcctcct NA ctcctgcatagtgat tct ctcacc ggaaagaactatttg (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: ttt 152) 190) (N° de ID da SEQ: 116) AA KSSQSLLHSDGK VIWYDGSHKYYEDSVKG VGYGSGWYEYYYHYGMDV NYLF (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: (N° de ID da 153) 191) SEQ: 117) Α-19 agctatggcatgcac attatatggtctgatgga gagagaggcctctacgatatt NA (Ν° de ID da attaacaaatactatgca ttgactggttattataactac SEQ: 101) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 154) tacggtattgacgtc (N° de ID da SEQ: 192) AA SYGMH HWSDGINKYYADSVKG ERGLYDILTGYYNYYGIDV (Ν° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 102) 155) 193) Α-20 ggctataccttgaac aacattaatagtaggagt gatcagtataactggaactac NA (N° de ID da agtctcatatactacaca tactacggtatggacgtc SEQ: 117) gactctgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 156) (N° de ID da SEQ: 194) AA GYTLN NINSRSSLIYYTDSVKG DQYNWNYYYGMDV (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 118) 157) 195) Α-21 agctatgccatgaac tacattggtagtagtagt tatagaagtggctggtccccc NA (N° de ID da agtgccatatactacgga ctctttgacttc SEQ: 119) gactctgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 158) (N° de ID da SEQ: 196) AA SYAMN YIGSSSSAIYYGDSVKG YRSGWSPLFDF (N° de ID da (N° de ID da SEQ: (N° de ID da SEQ: SEQ: 120) 159) 197) Α-22 agctatggcatgcac tctatatggtatgatgga cttggtggtggttttgactac NA (N° de ID da agtaataaatattatgta (N° de ID da SEQ: SEQ: 101) gactccgtgaagggc (N° de ID da SEQ: 160) 164) AA SYGMH (N° de ID da SEQ: 102) SIWYDGSNKYYVDSVKG (N° de ID da SEQ: 161) LGGGFDY (N° de ID da SEQ: 165) A-23 NA agatatgccatgaac (N° de ID da SEQ: 121) tacattggtagtagtagt agtgccatatactacgca gactctgtgaagggc (Nr de ID da SEQ:: 162) Tatagcagtggctggtccccc ctctttgactac (N- de ID da SEQ:: 198) AA RYAMN (N° de ID da SEQ: 122) YIGSSSSAIYYADSVKG (N° de ID da SEQ: 163) YSSGWSPLFDY (N° de ID da SEQ: 199)
Seqüências Consenso de CDR Cadeia Leve CDRl
Grupo 1
RSSQSLLDRDDGDTYLD (N° de ID da SEQ: 10) RSSQSLLDSADGDTYLD (N° de ID da SEQ: 12) RSTQSLLDSDDGDTYLD (N° de ID da SEQ: 20)
Χχ X2 X 3
RSSQSLLDRDDGTYTLD T SA
i. R S Xi Q S L L D X2 X3 D G T Y T L D (N° de ID da SEQ: 200) Xx é um resíduo de serina ou um resíduo de treonina, X2 é um resíduo de arginina ou um resíduo de serina, X3 é um resíduo de aspartato ou um resíduo de alanina, Grupo 2
RASQDIRNDFG (N° de ID da SEQ: 18) RASQGIRNDLG (N° de ID da SEQ: 14)
X4 X5
RASQGIRNDLG 10
15
D F
ii. R A S Q X4 I R N D X5 G (N° de ID da SEQ: 201)
X4 é um resíduo de glicina ou um resíduo de aspartato, X5 é um resíduo de leucina ou um resíduo de fenilalanina Grupo 3
SGDKLGDKYVC (N° de ID da SEQ: 24) SGDKLGDKYAC (N° de ID da SEQ: 2 6)
X6
SGDKLGDKYVC
A
iii. S G D K L G D K Y X6 C (N° de ID da SEQ: 202) X6 é um resíduo de valína ou um resíduo de alanina
Cadeia pesada de CDRl
Grupo 1
TYGMH- (N° de ID da SEQ: 104) SYGMH- (N° de ID da SEQ: 102) SYDMH- (N° de ID da SEQ: 106)
X7 X8 S Y G M H T D
i. X7Y X8M H (N° de ID da SEQ: 203) X7 é um resíduo de serina ou um resíduo de treonina X8 is um resíduo de glicina, ou um resíduo de aspartato,
Cadeia leve de CDR2
Grupo 1
AASSLQS (N° de ID da SEQ: 45) AASSLES (N° de ID da SEQ: 50) X9 AASSLQS E
i. A A S S L X9 S (N° de ID da SEQ: 204)
X9 is um resíduo de glutamina ou um resíduo de glutamato, Grupo 2
QTSKRPS (SEQ ED NO: 54) QSTKRPS (SEQ ED NO: 56)
Xio Xu QTSKRPS ST
ii. Q X10 Xu K R P S (N° de ID da SEQ: 205)
Xi0 é um resíduo de serína ou um resíduo de treonina, Xn é um resíduo de treonina ou um resíduo de serína,
Cadeia pesada de CDR2
Grupo 1
SIWYDGSNKYYVDSVKG (N° de ID da SEQ: 124) FIWYDGSEKYYVDSVKG (N° de ID da SEQ: 126) VIWYDGSNKYYADSVKG (N° de ID da SEQ: 145) EIWNDGSNKYYADSVKG (N° de ID da SEQ: 132) Xi2 Xl3 Xl4 Xl5
SIWYDGSNKYYVDSVKG FN E A
V E
i. Xi2 I W X13 D G S Xi4 K Y Y X15 D S V K G (N° de ID da SEQ: 206)
X12 é um resíduo de serína, um resíduo de fenilalanina, um resíduo de valina, ou um resíduo de glutamato,
X13 é um resíduo de tirosina ou um resíduo de asparagina, Xi4 é um resíduo de aspargina ou um resíduo de glutamato, Xi5 é um resíduo de valina ou um resíduo de alanina, Grupo 2
VISHDGSDKYYADSVKG (N° de ID da SEQ: 134) FISDDGSNKYYGDSVKG (N° de ID da SEQ: 140) VISYDGSNKYYGDSVKG (N° de ID da SEQ: 143) VISDDGSHKYSADSVKG (N° de ID da SEQ: 130)
Xi6 X17 Xis Xig X20
VISHDGSDKYY ADSVKG F D N SG
Y H
ii. Xi6 I S Xi7 D G S Xi8 K Y Xi9 X20 D S V K G (N° de ID da SEQ: 207)
Xi6 é um resíduo de valina ou um resíduo de fenilalanina, Xi7 é um resíduo de histidina, um resíduo de aspartato, ou um resíduo de tirosina,
Xi8 é um resíduo de aspartato, um resíduo de asparagina, ou um resíduo de histidina,
Xi9 é um resíduo de tirosina ou um resíduo de serina, X20 é um resíduo de alanina ou um resíduo de glicina,
Cadeia leve de CDR3
Grupo 1
LQHNSDPLT (N° de ID da SEQ: 76) LQQNSYPLT (N° de ID da SEQ: 80) LQHNSNPLT (N° de ID da SEQ: 74) X21 X22
LQHNSNPLT Q D Y
i. L Q X21 N S X22 P L T (N° de ID da SEQ: 208)
X2i é um resíduo de histidina, ou um resíduo de glutamina, X22 é um resíduo de aspargína, um resíduo de aspartato, ou um resíduo de tirosina, Grupo 2
QAWDSNTVI (N° de ID da SEQ: 78) QAWDSSTVV (N° de ID da SEQ: 80)
X23 X24
QAWDSNTVI
S V
ii. Q A W D S X23 TV X24 (N° de ID da SEQ: 209)
X23 é um resíduo de aspargína ou um resíduo de serina, X24 é um resíduo de isoleucina ou um resíduo de valina, Cadeia pesada de CDR3
Grupo 1
EKDHYDILTGYNYYYGLDV (N° de ID da SEQ: 169) EETYYDHTGYHHYYGMDV (N° de ID da SEQ: 171) EPQYYDELTGYDNYYGMDV (N° de ID da SEQ: 173) EKPYYDILTGYFYYYGMDV (N° de ID da SEQ: 175)
^25 ^26 ^27 X28 X29 X30
EKDHYDILTGYNYYYGLDV ETY HH M
PQ DN
P F
i. E X25 X26 X27 Y D I L T G Y X28 X29 Y Y G X30 D V (N° de ID da SEQ: 210)
X25 é um resíduo de lisina, um resíduo de glutamato, ou um resíduo de prolina,
X26 é um resíduo de aspartato, um resíduo de treonina, um resíduo de glutamína, ou um resíduo de prolina,
X27 é um resíduo de histidina ou um resíduo de tirosina, X28 é um resíduo de aspargina, um resíduo de histidina, um resíduo de aspartato, ou um resíduo de a fenilalanina,
X29 é um resíduo de tirosina, um resíduo de histidina, ou um resíduo de asparagina,
X30 é um resíduo de leucina ou um resíduo de metionina, Grupo 2
LGGGFDY (N° de ID da SEQ: 165) MGGGFDY (N° de ID da SEQ: 167) X31
LGGGFDY M
ii. X3I G G G F D Y (N° de ID da SEQ: 211)
X31 é um resíduo de leucina ou um resíduo de metionina.
Em um outro aspecto, a presente invenção provê proteínas de ligação a antígeno que consistem em uma região variável da cadeia leve selecionada do grupo consistindo em L1-L23 ou uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em H1-H23 e fragmentos, derivados, muteínas e variantes dos mesmos. Essa proteína de ligação a antígeno pode ser denotada usando a nomenclatura "LxHy", onde "x" corresponde ao número da região variável da cadeia leve e "y" corresponde ao número da região variável da cadeia pesada. Por exemplo, L2H1 refere-se a uma proteína de ligação a antígeno com uma região variável da cadeia leve consistindo na seqüência de aminoácidos de L2 e uma região variável da cadeia pesada consistindo na seqüência de aminoácidos de Hl como mostra a Tabela 3 abaixo. As regiões CDR e estruturais de cada uma dessas seqüências de domínios variáveis são também identificadas na Tabela 3 abaixo. As proteínas de ligação a antígeno da invenção incluem, por exemplo, anticorpos com uma combinação de domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada selecionados do grupo de combinações consistindo em LlHl, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, LllHl1, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, H17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 e L23H23. Em uma configuração, os anticorpos são os anticorpos humanos.
A Tabela 3 abaixo também provê as seqüências de polinucleotídeos (DNA) que codificam as seqüências de aminoácidos do domínio variável leve e domínio variável pesado para os anticorpos anti-GCGR exemplares.
TABELA 3
Seqüências de Polinucleotídeos de Regiões Variáveis Anti-GCGGR e Seqüências de Aminoácidos.
Polinucleotídeos de Região Variável de Cadeia Leve e Seqüência de Aminoácido Ll (A-I)
gatattgtgctgacccagactccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcc tgcaggtctagtcaqagcctcttggatagagatgatqgagacacctatttggactqqtacctgcaq aagccagggcagtctccacagctcctgatctatacgctttcctatcgggcctctqqaqtcccaqac aggttcagtggcagtgggtcaggcactgatttctcactgaaaatcagcagggtggaggctgaggat gttggagtttattactgcatgcaacgtatagagtttccattcactttccattcactttcqqcccta
ggaccaaagtggatatcaaa (N° de ID da SEQ: 212)
DIVLTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDRDDGDTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPD RFSGSGSGTDFSLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFPFTFGPGTKVDIK (N° de ID da SEQ: 213)
L2 (A-2)
agactccacctctcctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctaqtcaqa
gcctcttggatagtgctgatggagacacctatttggactqqtacctqcaqaaqccaqqgcagtctc
cacagct cctgat cta tacgcttt ccta tcgggcct ctqqaqt cccaqacaqqttcaatqacagt.g
ggtcagacactgatttctcactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggagtttattact
gcatgcaacgtatagagtttccattcactttcqqccctqqqaccaaaqtqgatatcaaa
(N° de ID da SEQ: 214)
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSADGDTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPD RFSGSGSDTDFSLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFPFTFGPGTKVDIK (N° de ID da SEQ: 215)
L3 (A-3)
gcatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcactt
gccgggcaagtcagqgcattagaaatgatttaqqctqqtatcaqcaqaaaccaqqqaaagcccnfa
agcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtqqqqtcccatcaaqqttcaacqqcagtggat
ctgggacagaattcactctcacaatcagcagtgtgcagcctgaagattttgtaacttattactgtc
tacagcataataqtaaccctctcactttcqqcqqaqqqaccaaqqtqqaaatcaaa
(N° de ID da SEQ: 216)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK (N° de ID da SEQ: 217) L4 (A-4)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcact
tgccgggcaagtcaqggcattagaaatgatttaqqctqqtatcaqcaqaaaccaqqqaaagcccct
aagcgcctgatctatgctgcatccagtttqcaaagtggqqtcccatcaaqqttcaqcqqcagtgqa
tctgggacagaattcactctcacaatcagcagtctgcagcctgaagattttgcaacttattactgt
ctacagcataatagtaaccctctcactttcqqcqqaqqqaccaaqqtqqaqatcaaa
(N° de ID da SEQ: 218) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK (N° de ID da SEQ: 219) L5 (A-5)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatttgtaggagacagagtcaccatcact tqccqggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccagggaaagcccct aaqcqcctgctctatgctgcctccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcaqcqgcagtggg tctgggtcagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgt ctacagcataatagtgacccgctcaccttcggccaagggacacgactggagattaaa (N° de ID da SEQ: 220) DIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLLYAASSLQSGVPSRFSGSG SGSEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSDPLTFGQGTRLEIK (N° de ID da SEQ: 221) L6 (A-6)
gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtttccaggggaaagagccaccctctcc tgcagggccagtcagagtgttagcagcaactacttagcctggtaccagcagaaatctggccaggct cccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaqgttcagtggcagt gggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattac tgtcaacaatatggtaactcaccattcactttcggccctgggaccaatgtggatatcaaa (N° de ID da SEQ: 222)
EIVLTQSPGTLSLFPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKSGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGS GSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGNSPFTFGPGTNVDIK (N° de ID da SEQ: 223) L7 (A-7)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccgtcact tgccgggcaagtcaggacattagaaatgattttggctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccct aagcgcctgatctatgctgcatccagtttacaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtgga tctgggacagaattcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgt ctacagaaatagttacccgctcactttcgggggagggaccaaggtggaaatcaaa (N° de ID da SEQ: 224)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCRASQDIRNDFGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQQNSYPLTFGGGTKVEIK (N° de ID da SEQ: 225) L8 (A-8)
gatattgtgatgacccagactccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcc tgcaggtctactcagagcctcttggatagtgatgatggagacacctatttggactggtacctgcag aagccggggcagtctccacagctcctgatctatacgctttcctatcgggcctctggagtcccagac aggttcagtggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggat gttggagtttattactgcatgcaacgtatagagtttccattcactttcggccctgggaccaaagtg
gatatcaaa (N° de ID da SEQ: 226)
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSTQSLLDSDDGDTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFPFTFGPGTKVDIK (N° de ID da SEQ: 227)
L9 (A-9)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcact tgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcaqcaqaaaccaqqqaaaqcccct aagcgcctgatctatgctgcatccagtttggaaagtggggtcccatcaaqqttcaq£qqcaqtqga tctgggacagaattcactctcacaatcagcagtgtgcagcctgaagattttgtaacttattactgt ctacagcataataqtaaccctctcactttcggcqqaqqqaccaaqqtqqaqatcaaa
(N° de ID da SEQ: 228
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLESGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEIK (N° de ID da SEQ: 229) LlO (A-IO)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggagacagagtcaccatcact
tgccaggcgagtcaggacattagtaagtatttaaattggtatcaqcaqaaaccagqqaaaqcccct
aagctcctcatctacgatgcatccaatttggaaacaggggtcccatcaaqqttcaqtqqaaqtqqa
tctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgt
caacaqtatggtaatctcccgatcaccttcgqccaaggqacacqactqqaqaqtaaa
(N° de ID da SEQ: 230)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSG SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPITFGQGTRLESK (N° de ID da SEQ: 231) Lll (A-Il)
tcctatgagctgactcagccaccctcagtgtccgtgtccccaggacagacagccagcatcacctgc
tctqgagataaattgggggataaatatgtttgctggtatcagcagaaqccaqqccaqtcccctqtq
ctggtcatctatcaaacttccaagcggccctcagggatccctgaqcqqttctctqqctccaactct
gggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggctatggatgaggctgactattactgtcag
gcgtgggacagcaacactgtgattttcggcggagggaccaaqctqaccqtccta
(N° de ID da SEQ: 232)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVLVIYQTSKRPSGIPERFSGSNS GNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSNTVIFGGGTKLTVL (N° de ID da SEQ: 233) L12 (A- 12)
tcctatgagctgactcagccaccctcagtgtccgtgtccccaggacagacagccagcatcacctgc
tctggagataaattgggggataaatatgtttgctggtatcagcaqaaqccaqqccaqtcccctqtq
ctggtcatctatcaaacttccaagcggccctcagggatccctgagcggttctctggctccaactct
gggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggctatggatgaggctgactattactgtcag
gcgtgggacagcagcactgtggttttcggcggagggaccaaqctqaccqtccta
(N° de ID da SEQ: 234)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVLVI YQTSKRPSGI PERFSGSNS GNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL (N° de ID da SEQ: 235) L13 (A- 13)
tcctatgagctgactcagccaccctcagtgtccgtgtccccaggacagacagccagcatcacctgc
tcteeaeataaattgegggataaatatgcttgctggtatcagcaqaaqccaqqccaqtcccctqta
ctggtcatctatcaatctaccaagcggccctcagggatccctqaqcgtttctctqqctccaactct
gggaacacagccactctgaccatcagcgggacccaggctatggatgaggctgactattactgtcag
gcgtgggacagcagcactgtggtattcggcggagqqaccaaqctqaccqtccta
(N° de ID da SEQ: 236)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQSTKRPSGIPERFSGSNS GNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL (N° de ID da SEQ: 237) Ll4 (Α- 14)
attttatgctgactcagccccactctgtgtcggagtctccggggaagacggtaaccatctcctgca cccgcagcagtggcagcattgtcagcaactttgtgcaatggtaccagcaqcgcccqqgcagttccc ccaccactgtgatctatgaggataaccaaagaccctctggqqtccctgatcgqttctctqqctcca tcgacagctcctccaactctgcctccctcaccatctctggactgaagactgaggacgaggctgact actactgtcagtcttatgataccagcaatcaggtqttcqqcqqaqqqaccaaqctqaccqtcctq (N° de ID da SEQ: 238)
nfmltqphsvsespgktvtisctrssgsivsnfvqwyqqrpgsspttviye dnqrps gvpdrfsgs Idsssnsasltisglktedeadyycqsydtsnqvfgggtkltvl (n° de id da seq: 239)
Ll5 (A-15)
cagtctgtcctgactcagccacccccagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcgtgt actggaatcacctccaacatcggaagcaatactgtacactggtaccaqcaqttcccaqqaacqqcc cccaaactcctcatctatagtaataatcagcggccctcaggggtccctqaccqattctctqqctcc aagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattattac tgtgcagcatqqqatgacagcctgaatggtccggtgttcggcqqaqqqaccaaqctqaccqtccta
(N° de ID da SEQ: 240)
qsvltqpppasgtpgqrvtisctgitsnigsntvhwyqqfpgtapklliysnnqrpsgvpdrfsgs ksgtsaslaisglqsedeadyycaawddslngpvfgggtkltvl (n° de id da seq: 241)
Ll6 (A-16)
cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgt tcggaagcaggtccaacatcggaagtaattatgtatactqqtaccaacaqctcccaqqaacqqccc ccaaactcctcatctataggaataatcagcggccctcagqqqtccctqaccqattctctqqctcca agtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctgattattact gtgcagcatgggatgacagcctgagtaggccggtattcggcqqaqqqaccaaqctqaccqtccta
(N° de ID da SEQ: 242)
qsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsrsnigsnyvywyqqlpgtapklliyrnnqrpsgvpdrfsgs 10
KSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSRPVFGGGTKLTVL (N° de ID da SEQ:
243)
L17 (A-17)
cagtctgtgctgacgcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgc actgggagcagctccaacatcggggcaggttatgctgtacactqqtaccaqcaqcttccaaaaaca gcccccaaactcctcatctatgataacaacaatcggccctcagqqqtccctqaccqattctctqqc tccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattat tactgccagtcctatgacagcagcctgagtqctatattcggcqqaqqqaccaaqctqaccqtccta
(N° de ID da SEQ: 244)
Qsvltqppsvsgapgqrvtisctgsssnigagyavhwyqqlpgtapklliydnnnrpsgvpdrfsg
SKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSAIFGGGTKLTVL (N° de ID da SEQ:
244)
Ll8 (A-18)
aatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcc tgcaagtctagtcagagcctcctgcatagtgatggaaagaactatttgttttqqtacctacaqaaq ccaggccagtctccacagctcctgatctatgaagtttcctaccggttctctqqatqccaqataqqt tcagtggcagcgggtcagggacagatttctcattgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttg gggtttattactgcatgcaaaatatacagcctcctctcaccttcqqccaaqqqacacqactqqaaa
ttaaa (N° de ID da SEQ: 246) NIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKNYLFWYLQKPGQSPQLLIYEVSYRFSGVPDR FSGSGSGTDFSLKIS RVEAE DVGVYYCMQNJQPPLTFGQGT RL EIK (N° de ID da SEQ: 247)
Ll9 (A-19)
ggtattgtgctgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcc tgcaggtctaetcagagcctcctgcatagtaatggatacaactatttgqattqqtacttqcaqaaq ccagggcagtctccgcagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccqqqqtccctqacaqq ttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgtt ggggtttattactgcatggaagctcttcaaactatgtgcagttttqqccaqqqqaccaaqctqqaq atcaag (N° de ID da SEQ: 248)
GIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDR FSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMEALQTMCSFGQGTKLEIK (N° de ID da SEQ: 249) L20 (A-20)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcact tgccgggcaagtcagggcattagaaatgatttaggctggtatcagcagaaaccaqqgaaaqcccct aagcgcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatctaqqttcaqcqqcaqtqqa tctgggacagaattcactctcacaatcagcaacctgcagcctgaagattttgcaacttattactgt ctacagcataatagttaccctcgcagttttggccaggggaccaaqctqqaqatcaaa (N° de ID da SEQ: 250)
DIMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS GTEFTLTISNLQPEDFATYYCLQHNSYPRSFGQGTKLEIK (N° de ID da SEQ: 251) L21 (A-21)
gacatccagatgacccagtctccatcttccgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcact tgtcgggcgagtcagggtattagcagctggttagcctggtatcagcaqaaaccaqqqaaaqcccct aagctcctaatctatgctgcatccagtttgcaaagtgggqtcccatcacqqttcaqcqqcaqtqqq tctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttactattgt caacaggctaacagtttcccgctcactttcggcgqaqqgaccaaqqtqqaqatcaaa (N° de ID da SEQ: 252)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK (N° de ID da SEQ: 253) L22 (A-22)
gatattgtgctgacccagactccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcc tgcaggtctagtcagagcctcttggatagagatgatggagacacctatttggactggtacctgcag aagccagggcagtctccacagctcctgatctatacgctttcctatcgggcctctggagtcccagac aggttcagtggcagtgggtcaggcactgatttctcactgaaaatcagcagggtggaggctgaggat gttggagtttattactgcatgcaacgtatagagtttccattcactttcggccctqqqaccaaaqtq gatatcaaa (N° de ID da SEQ: 254)
Divltqtplslpvtpgepasiscrssqslldrddgdtyldwylqkpgqspqlliytlsyrasgvpd
RFSGSGSGTDFSLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFPFTFGPGTKVDIK (N° de ID da SEQ: 255) L23 (A-23)
gacatccagatgacccagtctccatcttccgtgtctgcgtctgtaggggacagagtcaccatcact tgtcgggcgagtcagggtattagcagctggttagcctggtatcagcaqaaaccaqqqaaaqcccct aagctcctgatctatactgcatccactttgcaaagtggggtcccatcaaqqttcaqcqqcaqtqqa tctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttactattgt caacagtctaacagtttcccgctcactttcggcggaggqaccaaqqtqqaqatcaaa (N° de ID da SEQ: 256)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYTASTLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNSFPLTFGGGTKVEIK (N° de ID da SEQ: 257) Polinucleotídeos de Região Variável de Cadeia Pesada e Seqüência de Aminoácido Hl (A-I)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcgtctggaatcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccqccaqgctccagqcaaqqqq ctggagtgggtggcatctatatggtatgatggaagtaataaatattatgtagactccgtgaagggc cgattcaccatcttcagagacaattccaagaaaacgctgtatctgcaaatgaacaggctgagagcc gaggacacggctgtgtattactgtgcgagacttggtggtggttttgactactggggccagggaacc ctggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 258)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGITFSS YGMHWVRQAPGKGLEWVASIWYDGSNKYYVDSVKG RFTIFRDNSKKTLYLQMNRLRAEDTAVYYCARLGGGFDYWGQGTLVTVSS (N° de ID da SEQ: 259) H2 (A-2)
caggtgcaactggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcgtctggaatcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaqqqtccaqqcaaqqqq ctggagtgggtggcatttatatggtatgatggaagtgaaaaatattatgtagactccgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagtctgagagcc gaggacacggctgtgtattactgtgcgagaatgggaggcggctttgactactggggccagggaacc ctggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 260)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGITFSSYGMHWVRQGPGKGLEWVAFIWYDGSEKYYVDSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGGGFDYWGQGTLVTVSS (N° de ID da SEQ: 261) H3 (A-3)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt
gcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg
ctggagtgggtggcagttatgtggtatgatggaagtaataaagactatgtagactccgtgaagggc
cgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaaccgcctgagagcc
gagqacacggctgtgtattactgtgcgagagaaaaagatcattacgacattttgactggttataac
tactactacggtctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
(N° de ID da SEQ: 262)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 263) H4 (A-4)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg ctggagtgggtggcagttatgtggtatgatggaagtaataaagactatgtagactccgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaaccgcctgagagcc gagqacacggctgtgtattactgtgcgagagaaaaagatcattacgacattttgactggttataac tactactacggtctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagcctccaccaag ggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggc tgcct (N° de ID da SEQ: 264)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVDSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNlYYYGLDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 265) H5 (A-5)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcctctggattcaccttcagtacctatgggatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggt ctggagtgggtggcagttatatcagatgatggaagtcataaatactctgcagactccgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagaact gaggactcggctgtgtattactgtgcgagagaggagacgtattacgatattttgactggctatcat cactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 266)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISDDGSHKYSADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRTEDSAVYYCAREETYYDILTGYHHYYGMDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 267) H6 (A-6)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg ctggagtgggtggcagaaatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaatcccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagcc gaggacacggctgtgtattattgtgcgagagagcctcagtattacgatattttgactggttatgat aactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 268)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAEIWNDGSNKYYADSVKG RFTISRDNPKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPQYYDILTGYDNYYGMDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 269) H7 (A-7)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcaqcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg ctggaqtgggtggcagaaatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaatcccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagcc gaggacacggctgtgtattattgtgcgagagagcctcagtattacgatattttgactggttatgat aactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 270)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAEIWNDGSNKYYADSVKG RFTISRDNPKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPQYYDILTGYDNYYGMDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 271) H8 (A-8)
caggtgcagttggcggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt acagcgtctggaatcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg ctggagtgggtggcaggtatatggtatgatggaaggaataaatactatgtagactccgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaattccaagaaaacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagcc gaggacacggctgtgtattactgtgcgaggttagcagtggcctttgactactggggccagggaact ttggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 272)
QVQLAESGGGVVQPGRSLRLSCTASGITFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAGIWYDGRNKYYVDSVKG RFTISRDNSKKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAVAFDYWGQGTLVTVSS (N° de ID da SEQ: 273) H9 (A-9)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt
gcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg
ctggagtgggtggcagttatgtggtatgatggaagtaataaagactatgtagactccgtgaagggc
cgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaaccgcctgagagcc
gaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaaaaagatcattacgacattttgactggttataac
tactactacggtctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
(N° de ID da SEQ: 274)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVMWYDGSNKDYVPSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYGLDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 275) HlO (A-IO)
caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaggccctcgcagaccctctcactcacctgt gccatctecggggacagtgtctctagcaactatgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcg agaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgattatgcagtatct gtgagaagtcgaacaaccatcaacccagacacatccaagaaccaqttctccctqcaqttqaactct gtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtacaagagaagatggcagtggctggtacggtgct tttgacatctggggccaagggacaatggtcaccqtctcttca (N° de ID da SEQ: 276) QVQLQQS GPGLVRPSQTLSLTCAISGDS VS SN YAAWNWIRQS PSRGLEWLGRT YYRSKW YND YAVS VRSRTTINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCTREDGSGWYGAFDIWGQGTMVTVSS (N° de ID da SEQ: 277) Hll (A-Il)
caggtgcaactggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcctctgggagcaccttcagaagctatgacatgcactgggtccgccaggctccagqcaaqqqq ctggagtgggtggcatttatatcagatgatggaagtaataaatactatggagactccgtgaagggc cgattgaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagct gaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatcaatacgatattttgactggttattcttctgat gcttttgatatctggqqccaaqqqacaatqqtcaccqtctcttc (N° de ID da SEQ: 278)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFRSYDMHWVRQAPGKGLEWVAFISDDGSNKYYGDSVKG RLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQYDILTGYSSDAEDIWGQGTMVTVSS (N° de ID da SEQ: 279) H12 (A-12)
caggtgcaactggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcctctgggagcaccttcagaagctatgacatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg ctggagtgggtggcatttatatcagatgatggaagtaataaatattatggagactccgtgaagggc cgattgaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagct gaggacacggctgtgtattattgtgcgagagatcaatacgatattttgacggttattcttctgatg cttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca (N° de ID da SEQ: 280)
VQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFRSYDMHWVRQAPGKGLEWVAFISDDGSNKYYGDSVKGR LTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQYDILTGYSSDAFDIWGQGTMVTVSS (N° de ID da SEQ: 281) H13 (A-13)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcctctggaagcaccttcagaagctatgacatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg ctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatggagactccgtgaagggc cgattgaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagct gagg.acacggctgtgtattactgtgcgagagatcaatacgatattttgactggttatt ctt ctgat gcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca (N° de ID da SEQ: 282)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFRSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIS YDGSNKYYGDSVKG RLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQYDILTGYSSDAFDIWGQGTMVTVSS (N° de ID da SEQ: 283) Hl4 (A-14)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt
gcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg
ctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggc
cgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagcc
gaggacacggctgtgtattactgtgcgagagcctattacgatattttgactgattacccccagtat
gactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
(N° de ID da SEQ: 284)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAYYDILTDYPQYDYYYGMDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 285) H15 (A-15)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaagtccctgagactctcctgt gcagtctctggattcatcttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg ctggagtgggtggcacttatatcatttgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagct gaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatgggtattacgatattttgactggttatgaggat gatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca (N° de ID da SEQ: 286)
QVQLVESGGGVVQPGKSLRLSCAVSGFIFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALISFDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYYDILTGYEDDAFDIWGQGTMVTVSS (N° de ID da SEQ: 287) Hl6 (A-16)
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgc
aaggcttctggatacaccttcaccggctactatttgcactgggtgcgacaggcccctggacaaggg
cttgagtggatgggatggatcatccctgacagtggtggcacaaagtatgcacagaagtttcagggc
agggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcctacttggagctgagcaggctgagatct
gacgacacggccgtgtattactgtgcgagagaagggtttcattacgatattttgactggttcctac
ttctactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
(N° de ID da SEQ: 288)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIIPDSGGTKYAQKFQG RVTMTRDTSISTAYLELSRLRSDDTAVYYCAREGFHYDILTGSYFYYYGMDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 289) H17 (A-17)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgc aaggcttctggttacacctttaccagctatggtatcagttgggcgcgacaggcccctggacaaggg cttgagtggatgggatggatcggcgtttacaatggtcacacaaaatatgcacagaagttccagggc agagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatct gacgacacggccatattttactgtgcgagaagggtagcagtggctgggtactttgactactggggc cagggaaccctggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 290)
QVQLVQS GAE VKKPGAS VKVS CKAS GYT FTSYGISWARQAPGQGLEWMGWIGVYNGHTKYAQKFQG RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAIFYCARRVAVAGYFDYWGQGTLVTVSS (N° de ID da
SEQ: 291) H18 (A-18)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt
qcagcgtctggattcaccttcaqtagatatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg
ctqqaqtqqqtqqcagttatatggtatgatggaagtcataaatactatgaagactccgtgaagggc
cgattcaccatctccagagacaattctaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagcc
qacqacacqqqtqtqtattactqtgcgagagtcgggtatggcagtggctggtacgagtactattac
cactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
(N° de ID da SEQ: 292)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSHKYYEDSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRADDTGVYYCARVGYGSGWYEYYYHYGMDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 293) Hl9 (A-I9)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt
qcagcgtctqqattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg
ctgqaqtqqqtgacaattatatggtctgatggaattaacaaatactatgcagactccgtgaagggc
cgattcaccatatccagagacaattccaagaacacgctgaatctgcaaatgaacagtttgagagcc
gagqacacqqctqtqtattactqtqcqagagagagaggcctctacgatattttgactggttattat
aactactacggtattgacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca
(N° de ID da SEQ: 294)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVTIIWSDGINKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARERGLYDILTGYYNYYGIDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 295) H20 (A-2 O)
gaggtgcagctggtggagtctgggggagacttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgt qcaqcctctggattcaccttcagtggctataccttgaactgggtccgccaggctccagggaagggg ctggaqtqggtttcaaacattaatagtaggagtagtctcatatactacacagactctgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagac gaggacacggctgtgtatttctgtgcgagagatcagtataactggaactactactacggtatggac gtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 296) EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYTLNWVRQAPGKGLEWVSNINSRSSLIYYTDSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYFCARDQYNWNYYYGMDVWGQGTTVTVSS (N° de ID da SEQ: 297) H21 (A-21)
gaggt gcggctggtggagt ct gggggagacttggtacagcctggggggt ccct gagact ct cctgt gcaqcctctggattcaccttcagtagctatgccatgaactgggtccgccaggctccagggaagggg ctgqaqtqgatttcatacattggtagtagtagtagtgccatatactacggagactctgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagac qagqacacggctgtgtattactgtgcgagatatagaagtggctggtcccccctctttgacttctgg ggccagggaagcctggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 298) EVRLVESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWISYIGSSSSAIYYGDSVKG RFTIS RDNAKNS L YLQMNS LRDE DTAV Y YCARYRS GWS PL FD FWGQGS L VT VS S (N° de ID da SEQ: 299) H22 (A-22)
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgt gcagcgtctggaatcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggg ctggagtgggtggcatctatatggtatgatggaagtaataaatattatgtagactccgtgaagggc cgattcaccatcttcagagacaattccaagaaaacgctgtatctgcaaatgaacaggctgagagcc gaggacacggctgtgtattactgtgcgagacttggtggtggttttgactactggggccagggaacc ctggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 300)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGITFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVASIWYDGSNKYYVDSVKG RFTIFRDNSKKTLYLQMNRLRAEDTAVYYCARLGGGFDYWGQGTLVTVSS (N° de ID da SEQ: 301) H23 (A-23)
gaggtgcggctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgt acaqcctctggattccccttcaatagatatgccatgaactgggtccgccaggctccagggaagggg ctqqaqtqqgtttcatacattggtagtagtagtagtgccatatactacgcagactctgtgaagggc cgattcaccatctccagagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagat qaaqacacqqctqtqtattactgtgcgagatatagcagtggctggtcccccctctttgactactgg ggccagggaaccctggtcaccgtctcctca (N° de ID da SEQ: 302)
EVRLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFPFNRYAMNWVRQAPGKGLEWVS YIGSSSSAIYYADSVKG RFTIS RDNAKN S L YLQMNS LRDE DTAV Y YCARYS S GWS PL FD YWGQGT L VT VS S (N° de ID da SEQ: 303)
As configurações particulares de proteínas de ligação a antigeno da presente invenção consistem em uma ou mais seqüências de aminoácidos que são idênticas às seqüências de aminoácidos de uma ou mais das CDRs e/ou FRs (regiões estruturais) ilustradas acima. Em uma configuração, a proteína de ligação a antigeno consiste em uma seqüência da CDRl da cadeia leve ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antigeno consiste em uma seqüência da CDR2 da cadeia leve ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antigeno consiste em uma seqüência da CDR3 da cadeia leve ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antigeno consiste em uma seqüência da CDRl da cadeia pesada ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antigeno consiste em uma seqüência da CDR2 da cadeia pesada ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antigeno consiste em uma seqüência da CDR3 da cadeia pesada ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antigeno consiste em uma seqüência FRl da cadeia leve ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antigeno consiste em uma seqüência FR2 da cadeia leve ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em uma seqüência FR3 da cadeia leve ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em uma seqüência FR4 da cadeia leve ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em uma seqüência FRl da cadeia pesada ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em uma seqüência FR2 da cadeia pesada ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em uma seqüência FR3 da cadeia pesada ilustrada acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em uma seqüência FR4 da cadeia pesada ilustrada acima.
Em uma outra configuração, pelo menos uma das seqüências da CDR3 da proteína de ligação a antígeno difere em não mais que 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 adições, substituições e/ou eliminações de um único aminoácido de uma seqüência da CDR3 de Al- A23, como é mostrado nas Tabelas 2 e 3 acima. Em uma outra configuração, a seqüência da CDR3 da cadeia leve da proteína de ligação a antígeno difere em não mais que 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 adições, substituições e/ou eliminações de um único aminoácido de uma seqüência da CDR3 da cadeia leve de A1-A23 como é mostrado acima e a seqüência da CDR3 da cadeia pesada da proteína de ligação a antígeno difere em não mais que 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 adições, substituições e/ou eliminações de um único aminoácido de uma seqüência da CDR3 da cadeia pesada de A1-A23 como é mostrado acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em ainda 1, 2, 3, 4, ou 5 seqüências de CDR cada uma diferindo independentemente em 6, 5, 4, 3, 2, 1, ou 0 adições, substituições e/ou eliminações de um único aminoácido de uma seqüência de CDR de A1-A23. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em as CDRs da região variável da cadeia leve e as CDRs da região variável da cadeia pesada estabelecidas acima. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em 1, 2, 3, 4, 5, e/ou 6 seqüências consenso de CDR mostradas acima. Em ainda uma configuração, a proteína de ligação a antígeno consiste em as CDRs de qualquer uma entre LlHl, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, LllHll, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 e L23H23. Em uma configuração, a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo humano.
Em uma configuração, a proteína de ligação a antígeno (tal como um anticorpo ou um fragmento de anticorpo) consiste em um domínio variável da cadeia leve que consiste na seqüência de aminoácidos que difere da seqüência de um domínio variável da cadeia leve selecionado do grupo consistindo em Ll a L23 somente nos resíduos 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0, onde a diferença de cada uma dessas seqüências é independentemente uma eliminação, inserção ou substituição de um resíduo de aminoácido. Em uma outra configuração, o domínio variável da cadeia leve consiste em uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% idêntica à seqüência de um domínio variável da cadeia leve selecionado do grupo consistindo em L1-L23. Em uma outra configuração, o domínio variável da cadeia leve consiste em uma seqüência de aminoácidos que é codificada por uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% idêntica à seqüência de polinucleotideos L1-L23 relacionada abaixo. Em uma outra configuração, o domínio variável da cadeia leve consiste em uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições moderadamente rígidas para o complemento de um polinucleotídeo que codifica um domínio variável da cadeia leve selecionado do grupo consistindo em L1-L23. Em uma outra configuração, o domínio variável da cadeia leve consiste em uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rígidas para o complemento de um polinucleotídeo que codifica um domínio variável da cadeia leve selecionado do grupo consistindo em L1-L23.
Em uma outra configuração, a presente invenção provê uma proteína de ligação a antígeno que consiste em um domínio variável da cadeia pesada consistindo em seqüência de aminoácidos que difere da seqüência de um domínio variável da cadeia pesada selecionado do grupo consistindo em H1-H23 somente no (s) resíduo (s) 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0, onde a diferença de cada seqüência é independentemente uma eliminação, inserção ou substituição de um resíduo de aminoácido. Em uma outra configuração, o domínio variável da cadeia pesada consiste em uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% idêntica à seqüência de um domínio variável da cadeia pesada selecionado do grupo consistindo em H1-H23. Em uma outra configuração, o domínio variável da cadeia pesada consiste em uma seqüência de aminoácidos que é codificada por uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% idêntica a uma seqüência de nucleotídeos que codifica um domínio variável da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em H1-H23. Em uma outra configuração, o domínio variável da cadeia pesada consiste em uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições moderadamente rígidas para o complemento de um polinucleotídeo que codifica um domínio variável da cadeia pesada selecionado do grupo consistindo em H1-H23. Em uma outra configuração, o domínio variável da cadeia pesada consiste em uma seqüência de aminoácidos que é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rígidas para o complemento de um polinucleotídeo que codifica um domínio variável da cadeia pesada selecionado do grupo consistindo em H1-H23.
Configurações adicionais incluem proteínas de ligação a antígeno que consistem nas combinações L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, LllHll, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 e L23H23.
As proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo e derivados de anticorpo) da invenção podem consistir em qualquer região constante conhecida na técnica. A região constante da cadeia leve pode ser, por exemplo, uma região constante da cadeia leve tipo kappa ou lambda, por exemplo, uma região constante da cadeia leve tipo kappa ou lambda humana. A região constante da cadeia pesada pode ser, por exemplo, regiões constantes da cadeia pesada tipo alfa, delta, épsilon, gama ou mu, por exemplo, uma região constante da cadeia pesada tipo alfa, delta, épsilon, gama ou mu humana. Em uma configuração, a região constante da cadeia leve ou pesada é um fragmento, um derivado, uma variante ou uma muteina de uma região constante que ocorre naturalmente.
As técnicas para derivar um anticorpo de uma subclasse ou isótipo diferente de um anticorpo de interesse, isto é, troca de subclasse, são conhecidas. Assim, os anticorpos IgG podem ser derivados de um anticorpo IgM, por exemplo e vice-versa. Essas técnicas permitem a preparação de novos anticorpos que possuem as propriedades de ligação ao antigeno de um determinado anticorpo (o anticorpo original), mas que também exibem propriedades biológicas associadas a um isótipo ou subclasse do anticorpo diferente do anticorpo original. As técnicas de DNA recombinante podem ser empregadas. 0 DNA clonado que codifica polipeptidios particulares de anticorpo pode ser empregado nesses procedimentos, por exemplo, DNA que codifica o domínio constante de um anticorpo do isótipo desejado. Vide também Lanitto et al., Methods Mol. Biol. 178:303-16 (2002).
Em uma configuração, a proteína de ligação a antigeno da invenção consiste ainda nos domínios constantes kappa ou lambda da cadeia leve ou um fragmento destes. As seqüências das regiões constantes da cadeia leve e os polinucleotídeos que as codificam são fornecidos na Tabela 4 abaixo. Em uma outra configuração, a proteína de ligação a antigeno da invenção consiste em ainda um domínio constante da cadeia pesada, ou um fragmento do mesmo, tal como a região constante da cadeia pesada do IgG2 fornecida na Tabela 4.
Em uma configuração, uma forma de IgG2 das seqüências de aminoácidos das cadeias leve e pesada humanas para o anticorpo A-9 e A-3 são apresentadas no N- de ID da SEQ: 310, N2 de ID da SEQ: 311, N- de ID da SEQ: 312 e N- de ID da SEQ: 311 abaixo.
TABELA 4
Polinucleotideo de região constante de cadeia
leve (kappa)
Cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagc agttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaag tacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggaca gcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacaca aagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggg gagagtgt (N° de ID da SEQ: 304)
Aminoácido (kappa)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (N° de ID da SEQ: 305)
Polinucleotideos (Iambda) ggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaac aaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggca gatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtac gcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccag gtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca (N° de ID da SEQ: 306)
Aminoácido (Iambda)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPV KAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (N° de ID da SEQ: 307)
Polinucleotideo de região constante de cadeia
pesada
Gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccagga gcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacgg tgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcag gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacct gcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcg agtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaag accccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccac gggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggc tgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaacca tctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggaga tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtgg agtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacg gctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg gtaaa (N° de ID da SEQ: 308)
Aminoácido
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHT FPAVLQS SGL YSLS S VVT VPS SNFGTQT YTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVEC P PC PAPPVA GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK (N° de ID da SEQ: 309)
Estrutura IgG2 para cadeia leve A-9 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAP KRLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEDCRTV AAPS VFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (N° de ID da SEQ: 310)
Estrutura IgG2 para cadeia pesada A-9 MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSS YGMHWVRQAPGKGLEW VAVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYY GLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH T FPAVLQS SGL YSLS SWT VPS SNFGTQT YTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVEC PPC PAP PVAGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLT VVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (N° de ID da SEQ: 311)
Estrutura IgG2 para cadeia leve A-3 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARCDIQMTQS PS SLSAS VGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAP KRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDFVTYYCLQHNSNPLTFGGGTKVEnCRTV AAPSVFIFPPS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLS S TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (N° de ID da SEQ: 312)
Estrutura IgG2 para cadeia pesada A-3 MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSS YGMHWVRQAPGKGLEWV AVMWYDGSNKDYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNRLRAEDTAVYYCAREKDHYDILTGYNYYYG LDVWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKD YFPE PVTVS WNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST FRWS VLT WHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK (N° de ID da SEQ: 311)
As proteínas de ligação a antigeno (por exemplo, anticorpos) da presente invenção incluem aquelas que consistem, por exemplo, nas combinações de domínios variáveis LlHl, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, LllHll, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H15, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 e L23H23 que têm um isótipo desejado (por exemplo, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE e IgD) assim como fragmentos Fab ou F(ab')2 do mesmo. Além disso, se for desejada uma IgG4, pode ser também desejado introduzir uma mutação pontual na região da junção conforme descrito em Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407, (incorporado aqui por referência) para minorar a tendência a formar ligações dissulfidicas da cadeia intra-H que possam levar à heterogeneidade nos anticorpos IgG4.
Anticorpos e Fragmentos de Anticorpo Em uma configuração, as proteínas de ligação a antígeno são anticorpos. 0 termo "anticorpo" refere-se a um anticorpo intacto, ou a um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme descrito extensivamente na seção de definições. Um anticorpo pode consistir em uma molécula de anticorpo completa (incluindo as versões policlonais, monoclonais, quiméricas, humanizadas ou humanas com cadeias pesadas e/ou leves no comprimento total), ou consistir em um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Os fragmentos de anticorpo incluem fragmentos F(ab')2f Fab, Fab', Fv, Fc e Fd e podem ser incorporados nos anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia única, maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (vide por exemplo, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Também incluídos estão os polipeptídios de anticorpo tais como aqueles divulgados na Patente Norte-americana N2 6.703.199, incluindo monocorpos de polipeptídio fibronectina. Outros polipeptídios de anticorpo são divulgados na Publicação de Patentes Norte-americana 2005/0238646, os quais são polipeptídios de cadeia única. Em uma configuração, os anticorpos da presente invenção consistem em pelo menos uma CDR ou CDR consenso estabelecida na Tabela 2 acima.
Os anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados são definidos na seção de definições e podem ser preparados através das técnicas conhecidas. Em uma configuração, um anticorpo monoclonal humanizado consiste no domínio variável de um anticorpo murino (ou todo ou parte do sítio de ligação a antígeno do mesmo) e um domínio constante derivado de um anticorpo humano. Alternativamente, um fragmento de anticorpo humanizado pode consistir no sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo monoclonal murino e um fragmento do domínio variável (destituído do sítio de ligação ao antígeno) derivado de um anticorpo humano. Os procedimentos para a produção de anticorpos monoclonais modificados incluem aqueles descritos em Riechmann et al, 1988, Nature 332:323, Liu et al. , 1987, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:3439, Larrick et al, 1989, Bio/Technology 7:934 e Winter et al, 1993, TIPS 14:139. Em uma configuração, o anticorpo quimérico é um anticorpo enxertado em CDR. As técnicas para humanizar anticorpos são discutidas em, por exemplo, Patentes Norte-americanas N-s 5.869.619; 5.225.539; 5.821.337; 5.859.205; 6.881.557. Padlan et al, 1995, FASEB J. 9:133-39, Tamura et al, 2000, J. Immunol. 164:1432-41, Zhang, W, et al. Molecular Imitiunology. 42(12):1445- 1451, 2005; Hwang W. et al. Methods. 36(l):35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al. Methods 36(l):43-60, 2005; e Clark, M, Immunology Today. 21 (8) :397-402, 2000.
Um anticorpo da presente invenção pode também ser um anticorpo monoclonal totalmente humano. Os anticorpos monoclonais totalmente humanos podem ser gerados através de inúmeras técnicas com as quais aqueles com habilidade comum na técnica estarão familiarizados. Esses métodos incluem, sem limitação, Virus Epstein Barr (EBV), transformação de células do sangue periférico humano (por exemplo, contendo linfócitos Β) , imunização in vitro de células B humanas, fusão de células do baço de camundongos transgênicos imunizados portando genes de imunoglobulina humana, isolamento das bibliotecas de fagos da região V da imunoglobulina humana, ou outros procedimentos conhecidos na técnica e baseados nesta revelação.
Foram desenvolvidos procedimentos para gerar anticorpos monoclonais humanos em animais não-humanos. Por exemplo, foram preparados camundongos nos quais um ou mais genes de imunoglobulina endógena foram inativados por vários meios. Genes de imunoglobulina humana foram introduzidos nos camundongos para substituir os genes de camundongo inativados. Nesta técnica, os elementos dos lócus humanos das cadeias pesada e leve são introduzidos em cepas de camundongos derivadas de linhagens celulares de tronco embriônico contendo as rupturas visadas dos lócus das cadeias leves e pesadas endógenas (vide também Bruggemann et al, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por exemplo, transgenes de imunoglobulina humana podem ser construções de mini-genes, ou translocus em cromossomos artificiais de levedura, que sofrem rearranjo e hipermutação do DNA especifico das células B no tecido Iinfóide do camundongo.
Os anticorpos produzidos no animal incorporam as cadeias de polipeptidios de imunoglobulina humana codificados pelo material genético humano introduzido no animal. Em uma configuração, um animal não-humano, tal como um camundongo transgênico, é imunizado com um imunogênio de GCGR adequado. Um exemplo de imunogênio de GCGR adequado são as frações da membrana celular enriquecidas do receptor tal como é descrito nos Exemplos abaixo. Um outro exemplo é o domínio extracelular do N- de ID da SEQ: 2.
Os exemplos de técnicas para a produção e uso de animais transgênicos para a produção de anticorpos humanos ou parcialmente humanos são descritos nas Patentes Norte-americanas 5.814.318, 5.569.825 e 5.545.806, Davis et al., Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ: 191-200 (2003), Kellermann et al. , 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al. , 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al. , 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis et al. , 1999, Câncer Metastasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green et al. , 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda et al. , 1997, Genomics. 42:413-21, Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al. , 1994, Immunity. 1:247-60, Green et al. , 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature. 362:255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90:2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. "Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus." International Immunology 5 (1993): 647-656, Choi et al. , 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-51, Harding et al. , 1995, Annals of the New York Academy of Sciences, Lonberg et al. , 1994, Nature 368: 856- 59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmaeology 113: 49-101, Lonberg et al. , 1995, Internai Review of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Bioteehnology 14: 826, Taylor et al.,
1992, Nueleie Aeids Research 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, International Immunology 6: 579-91, Tomizuka et al. , 1997, Nature Geneties 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Proeeedings of the National Aeademy of Sciences USA 97: 722-27, Tuaillon et al.,
1993, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90: 3720-24 e Tuaillon et al., 1994, Journal of Immunology 152: 2912- 20.; Lonberg et al. , Nature 368:856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994; Patente Norte-americana N5 5.877.397; Bruggemann et al. , 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al. , 1995 Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 764:525-35. Além disso, os protocolos envolvendo o XenoMouse® (Abgenix, agora Amgen, Inc.) são descritos, por exemplo no U.S. 05/0118643 e WO 05/694879, WO 98/24838, WO 00/76310 e Patente Norte-americana 7.064.244.
As células linfóides dos camundongos transgênicos imunizados são fundidas com células de mieloma, por exemplo, para produzir hibridomas. As células de mieloma para uso em procedimentos de fusão para produção de hibridoma são preferivelmente não-produtoras de anticorpos, têm alta eficiência de fusão e deficiências enzimáticas que as tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que suportam o crescimento apenas das células fundidas desejadas (hibridomas). Os exemplos de linhagens celulares adequadas para uso em tais fusões incluem Sp- 20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, 10
15
20
25
NSO/U, MPC-Il, MPClI-X4 5-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bui; os exemplos de linhagens celulares usadas nas fusões em ratos incluem R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhagens celulares úteis para fusões celulares são U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6.
As células linfóides (por exemplo, baço) e as células de mieloma podem ser combinadas por alguns minutos com um agente promotor de fusão de membrana, tal como o polietilenoglicol ou um detergente não-iônico e então plaqueadas em baixa densidade em meio seletivo que suporte o crescimento de células de hibridoma mas não das células de mieloma infundidas. Um meio de seleção é o HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) . Após um tempo suficiente, geralmente cerca de duas semanas, são observadas colônias de células. As colônias individuais são isoladas e os anticorpos produzidos pelas células podem ser testados para a atividade de ligação ao GCGR humano usando qualquer um entre os variados imunoensaios conhecidos na técnica e aqui descritos. Os hibridomas são clonados (por exemplo, por clonagem por diluição limitada ou por isolamento em placa de ágar mole) e os clones positivos que produzirem um anticorpo especifico para o GCGR humano são selecionados e cultivados. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados dos sobrenadantes das culturas de hibridoma.
Um outro método para gerar anticorpos humanos da invenção inclui a imortalização das células do sangue periférico humano por transformação do EBV. Vide, por exemplo, a Patente Norte-americana N^ 4.464.456. Essa linhagem de células B imortalizada (ou linhagem celular linfoblastóide) que produz um anticorpo monoclonal que especificamente se liga a um GCGR humano pode ser identificada por métodos de imunodetecção como os fornecidos aqui, por exemplo, um ELISA, e então isolada através de técnicas de clonagem padrão. A estabilidade da linhagem celular Iinfoblastóide que produz um anticorpo anti-GCGR pode ser melhorada fundindo a linhagem celular transformada com um mieloma murino para produzir uma linhagem celular híbrida camundongo- humana de acordo com os métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Ainda um outro método para gerar anticorpos monoclonais humanos é a imunização in vitro, a qual inclui a preparação de células B esplênicas humanas com GCGR humano, seguida de fusão das células B preparadas com um parceiro de fusão hetero-hibrido. Vide, por exemplo, Boerner et
al., 1991 J. Immunol. 147:86-95.
Em certas configurações, uma célula B que está produzindo um anticorpo anti-GCGR humano é selecionada e as regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada são clonadas da célula B de acordo com as técnicas de biologia celular conhecidas na técnica (WO 92/02551; Patente Norte-americana 5.627.052; Babcook et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843-48 (1996)) e descritas aqui. As células B de um animal imunizado podem ser isoladas do baço, nódulos linfáticos ou amostra de sangue periférico selecionando-se uma célula que esteja produzindo um anticorpo que especificamente se ligue ao GCGR. As células B podem também ser isoladas de humanos, por exemplo, de uma amostra de sangue periférico. Os métodos para detectar células B isoladas que estejam produzindo um anticorpo com a especificidade desejada são bem conhecidos na técnica, por exemplo, por formação de placa, classificação de células ativadas por fluorescência, estimulação in vitro seguida de detecção do anticorpo específico e similares. Os métodos para a seleção de células B especificas produtoras de anticorpo incluem, por exemplo, a preparação de uma única suspensão celular de células B em ágar mole que contenha GCGR humano. A ligação do anticorpo especifico produzido pela célula B ao antigeno resulta na formação de um complexo, que pode ser visível na forma de um imunoprecipitado. Após serem selecionadas as células B produtoras de anticorpo, os genes do anticorpo específico podem ser clonados isolando e amplificando o DNA ou mRNA de acordo com os métodos conhecidos na técnica e aqui
descritos.
Um método adicional para obter anticorpos da invenção é pela exibição do fago. Vide, por exemplo, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al. , 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Bibliotecas combinatórias de genes da região variável da imunoglobulina humana ou murina podem ser criadas nos vetores do fago que podem ser filtrados para selecionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv, ou multímeros destes) que se liguem especificamente à proteína de ligação TGF-beta ou uma variante ou fragmento da mesma. Vide, por exemplo, a Patente Norte-americana N5 5.223.409; Huse et al. , 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al. , 1991 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al, 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al, 1997 Hybridoma 16:47-52 e as referências citadas ali. Por exemplo, uma biblioteca contendo uma pluralidade de seqüências de polinucleotídeos que codificam fragmentos da região variável da Ig pode ser inserida no genoma de um bacteriófago filamentoso, tal como o M13 ou uma variante deste, enquadrado com a seqüência que codifica uma proteína de revestimento do fago. Uma proteína de fusão pode ser uma fusão da proteína de revestimento com o domínio da região variável da cadeia leve e/ou o domínio da região variável da cadeia pesada. De acordo com certas configurações, fragmentos Fab da imunoglobulina podem também ser exibidos em uma partícula do fago (Vide, por exemplo, a Patente Norte-americana N- 5,698,426).
Bibliotecas de expressão de cDNA da imunoglobulina das cadeias pesada e leve podem também ser preparadas no fago lambda, por exemplo, usando os vetores XlmmunoZap™ (H) e XlmmunoZap™ (L) (Stratagene, La Jolla, Califórnia) . Resumidamente, o mRNA é isolado de uma população de células B e usado para criar bibliotecas de expressão de cDNA de imunoglobulina das cadeias pesada e leve nos vetores XlmmunoZap™ (H) e XlmmunoZap™ (L) . Esses vetores podem ser filtrados individualmente ou co-expressos para formar fragmentos Fab ou anticorpos (vide Huse et al, supra; vide também Sastry et al, supra). Placas positivas podem subseqüentemente ser convertidas para um plasmídeo não-lítico que permite um alto nível de expressão de fragmentos de anticorpo monoclonal de E. coli.
Em uma configuração, em hibridoma, as regiões variáveis de um gene que expressam um anticorpo monoclonal de interesse são amplificadas usando preparadores de nucleotídeo. Esses preparadores podem ser sintetizados por pessoa com habilidade comum na técnica, ou podem ser adquiridos de fornecedores disponíveis. (Vide, por exemplo, Stratagene (La Jolla, Califórnia), que vende preparadores de regiões variáveis de camundongo e humanas incluindo, entre outros, preparadores para as regiões VHa, VHb, VHc, VHd, CHI/ Vl e CL) . Esses preparadores podem ser usados para amplificar regiões variáveis de cadeia pesada ou leve, que podem então ser inseridas nos vetores tais como o ImmunoZAP™H ou ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. Esses vetores podem então ser introduzidos em E. coli, levedura, ou sistemas de mamíferos para a expressão. Grandes quantidades de proteína de cadeia única contendo uma fusão dos domínios Vh e Vl podem ser produzidas usando esses métodos (vide Bird et al., Science 242:423-426, 1988) . Após as células produtoras de anticorpos de
acordo com a invenção terem sido obtidas usando qualquer uma das técnicas de imunização descritas acima e outras técnicas, os genes de anticorpo específicos podem ser clonados isolando e amplificando seus DNA ou mRNA de acordo com os procedimentos padrão aqui descritos. Os anticorpos produzidos podem ser seqüenciados e as CDRs identificadas e a codificação do DNA para as CDRs pode ser manipulada conforme descrito previamente para gerar outros anticorpos de acordo com a invenção.
As proteínas de ligação a antígeno da presente invenção modulam preferencialmente a sinalização do glucagons no ensaio em células e/ou no ensaio in vivo aqui descritos e/ou fazem o bloqueio cruzado de um dos anticorpos descritos nesta aplicação e/ou são impedidas por bloqueio cruzado de ligar-se ao GCGR por um dos anticorpos descritos neste pedido. Consequentemente esses agentes de ligação podem ser identificados usando os ensaios aqui descritos.
Em certas configurações, os anticorpos são gerados primeiramente identificando-se os anticorpos que se ligam a células que superexpressam GCGRs e/ou são neutralizados nos ensaios em células e/ou in vivo aqui descritos e/ou fazem o bloqueio cruzado dos anticorpos descritos neste pedido e/ou são impedidos por bloqueio cruzado de ligar-se aos GCGRs por um dos anticorpos descritos neste pedido.
Será compreendido por uma pessoa habilitada na técnica que algumas proteínas, tal como os anticorpos, podem sofrer uma variedade de modificações pós-translacionais. O tipo e extensão dessas modificações geralmente dependem da linhagem de célula hospedeira usada para expressar a proteína, assim como das condições da cultura. Tais modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação freqüente é a perda de um resíduo básico carboxi- terminal (tal como a lisina ou a arginina) devido à ação das carboxipeptidases (conforme descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).
Um método alternativo para a produção de um anticorpo monoclonal murino é injetar as células de hibridoma na cavidade peritoneal de um camundongo singênico, por exemplo, um camundongo que tenha sido tratado (por exemplo, preparado com pristane) para promover a formação de líquido de ascite contendo o anticorpo monoclonal. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados através de uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Essas técnicas de isolamento incluem a cromatografia de afinidade com Proteína A Sepharose, cromatografia de exclusão do tamanho e cromatografia de troca iônica (Vide, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al. , "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Os anticorpos monoclonais podem ser purificados por cromatografia de afinidade usando um ligando apropriado selecionado com base nas propriedades particulares do anticorpo (por exemplo, isótipo de cadeia leve ou pesada, especificidade da ligação, etc.). Os exemplos de um ligando adequado, imobilizado em um suporte sólido, incluem a Proteína A, a Proteína G, um anticorpo de região anti-constante (cadeia leve ou cadeia pesada), um anticorpo anti-idiotipo e uma proteína de ligação a TGF-beta, ou fragmento ou variante dos mesmos.
A evolução molecular das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) no centro do sítio de ligação do anticorpo foi também utilizada para isolar anticorpos com afinidade aumentada, por exemplo, anticorpos com afinidade maior para c-erbB-2, conforme descrito por Schier et al. , 1996, J. Mol. Biol. 263:551. Consequentemente, tais técnicas são úteis para preparar anticorpos para o receptor de glucagon humano.
As proteínas de ligação a antígeno direcionadas contra o receptor de glucagon humano podem ser usadas, por exemplo, em ensaios para detectar a presença do receptor de glucagon, seja in vitro ou in vivo.
Embora os anticorpos humanos, parcialmente humanos ou humanizados vão ser adequados para várias aplicações, particularmente aquelas envolvendo a administração do anticorpo a um ser humano, outros tipos de proteínas de ligação a antígeno serão adequados para certas aplicações. Os anticorpos não-humanos da invenção podem ser, por exemplo, derivados de qualquer animal que produza anticorpos, tal como o camundongo, o rato, o coelho, a cabra, o asno ou o primata não humano (por exemplo, macacos como o cynomologus ou o rhesus) ou o chimpanzé. Os anticorpos não-humanos da invenção podem ser usados, por exemplo, em aplicações in vitro e de cultura celular, ou em qualquer outra aplicação onde uma resposta imunológica ao anticorpo da invenção, não ocorra, seja insignificante, possa ser prevenida, não seja preocupante, ou seja desejada. 0 Exemplo 2 abaixo descreve a geração de um anticorpo de camundongo. Em uma configuração, um anticorpo não-humano da invenção é administrado a um ser não-humano. Em uma outra configuração, o anticorpo não-humano não provoca uma resposta imune no ser não-humano. Em uma outra configuração, o anticorpo não-humano é da mesma espécie que o ser não-humano, por exemplo, um anticorpo de camundongo da invenção é administrado a um camundongo. Um anticorpo de uma espécie particular pode ser preparado, por exemplo, imunizando um animal daquela espécie com o imunogênio desejado ou usando um sistema artificial para gerar anticorpos daquela espécie (por exemplo, um sistema bacteriano ou baseado em exibição de fago para gerar anticorpos de uma espécie particular), ou convertendo um anticorpo de uma espécie em um anticorpo de uma outra espécie substituindo, por exemplo, a região constante do anticorpo por uma região constante da outra espécie, ou substituindo um ou mais resíduos de aminoácido do anticorpo de modo que ele se assemelhe mais estreitamente à seqüência de um anticorpo da outra espécie. Em uma configuração, o anticorpo é um anticorpo quimérico consistindo em seqüências de aminoácido derivadas dos anticorpos de duas ou mais espécies diferentes.
Os anticorpos podem também ser preparados por qualquer das inúmeras técnicas convencionais. Por exemplo, eles podem ser purificados de células que os expressam naturalmente (por exemplo, um anticorpo pode ser purificado de um hibridoma que o produz), ou produzidos em sistemas de expressão recombinante, usando qualquer técnica conhecida na área. Vide, por exemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring,Harbor, NY, (1988). Isto é discutido na seção do ácido nucléico abaixo.
Proteínas de ligação a antigeno podem ser preparadas e filtradas para as propriedades desejadas usando umas das inúmeras técnicas conhecidas. Certas técnicas envolvem o isolamento de um ácido nucléico que codifica uma cadeia polipeptídica (ou parte da mesma) de uma proteína de ligação a antigeno de interesse (por exemplo, um anticorpo anti-receptor de glucagon) e manipulação do ácido nucléico através de tecnologia de DNA recombinante. O ácido nucléico pode ser fundido a um outro ácido nucléico de interesse, ou alterado (por exemplo, por mutagênese ou outra técnica convencional) para adicionar, eliminar ou substituir um ou mais resíduos de aminoácidos, por exemplo.
Onde for desejado melhorar a afinidade dos anticorpos de acordo com a invenção contendo uma ou mais das CDRs mencionadas acima, isso pode ser obtido através de inúmeros protocolos de maturação da afinidade, incluindo a manutenção das CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), embaralhamento das cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779- 783, 1992), uso de cepas de mutação de E. coli. (Low et al. , J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), embaralhamento de DNA (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), exibição de fago (Thompson et al. , J. Mol! Biol., 256, 7-88, 1996) e técnicas adicionais de PCR (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998).
Todos esses métodos de maturação da afinidade são discutidos por Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
Fragmentos de anticorpo
Em um outro aspecto, a presente invenção provê fragmentos de um anticorpo anti-receptor de glucagon da invenção. Esses fragmentos podem consistir inteiramente em seqüências derivadas de anticorpo ou podem consistir em seqüências adicionais. Os exemplos de fragmentos de ligação a antigeno incluem os anticorpos de cadeia simples Fab, F(ab')2/ diacorpos, triacorpos, tetracorpos e anticorpos de domínio. Outros exemplos são fornecidos em Lunde et al., 2002, Biochem. Soe. Trans. 30:500- 06.
Os anticorpos de cadeia simples podem ser formados ligando-se fragmentos do domínio variável da cadeia leve e pesada (região Fv) através de uma ponte de aminoácido (ligador de peptídeo curto), resultando em uma única cadeia polipeptídica. Esses Fvs de cadeia simples (scFvs) foram preparados fundindo-se DNA que codifica um ligador de peptídeo entre os DNAs que codificam os dois polipeptídios do domínio variável (VL e Vh) . Os polipeptídios resultantes podem dobrar-se sobre si mesmos formando manômeros de ligação a antigeno, ou podem formar multímeros (por exemplo, dímeros, trímeros, ou tetrâmeros), dependendo da extensão de um ligador flexível entre os dois domínios variáveis (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Combinando diferentes polipeptidios que contenham Vl e VH, pode-se formar scFvs multiméricos que se ligam a diferentes epitopos (Kriangkum et al. , 2001, Biomol. Eng. 18:31 -40). As técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos de cadeia simples incluem aquelas descritas na Patente Norte-americana N2 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879; Ward et al. , 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Os anticorpos de cadeia simples derivados dos anticorpos fornecidos aqui incluem, sem limitação, scFvs que consistem nas combinações de domínio variável LlHl, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LlOHlO, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 e L23H23 e são englobados pela presente invenção. Os fragmentos de ligação a antígeno derivados de
um anticorpo podem também ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica do anticorpo, por exemplo, digestão em pepsina ou papaína de anticorpos inteiros de acordo com métodos convencionais. Como exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por clivagem enzimática dos anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento 5S denominado F(ab')2· Esse fragmento pode ser ainda clivado usando um agente redutor tiol para produzir fragmentos 3. 5S Fab' monovalentes. Opcionalmente, a reação de clivagem pode ser realizada usando um grupo bloqueador para os grupos sulfidril que resultam da clivagem das ligações dissulfidicas. Como alternativa, uma clivagem enzimática usando papaína produz dois fragmentos Fab monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Esses métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, Patente Norte-americana N- 4.331.647, Nisonoff et al. , Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); e por Andrews, S.M. and Titus, J.A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al. , eds), John Wiley & Sons, New York (2003), páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10A.1-2.10A.5. Outros métodos para clivar anticorpos, tal como a separação das cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve-pesada monovalentes (Fd), clivando ainda os fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas podem também ser utilizados, desde que os fragmentos se liguem ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto. Uma outra forma de fragmento de anticorpo é um peptídeo consistindo em uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de um anticorpo. As CDRs podem ser obtidas construindo-se polinucleotídeos que codificam a CDR de interesse. Esses polinucleotídeos são preparados, por exemplo, utilizando a reação em cadeia de polimerase para sintetizar a região variável usando mRNA de células produtoras de anticorpo como modelo (Vide, por exemplo, Larrick et al. , Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106,1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinicai Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); e Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). O fragmento de anticorpo pode ainda consistir em pelo menos um domínio de região variável de um anticorpo aqui descrito. Assim, por exemplo, o domínio da região V pode ser monomérico e ser um domínio Vh ou Vl, que é capaz de ligar-se independentemente ao receptor de glucagon humano com uma afinidade pelo menos igual a 1 χ IO-7M ou menos conforme descrito abaixo.
O domínio da região variável pode ser qualquer
domínio variável que ocorra naturalmente ou uma versão manipulada do mesmo. Uma versão manipulada significa um domínio da região variável que foi criado usando técnicas de manipulação de DNA recombinante. Essas versões manipuladas incluem aquelas criadas, por exemplo, de uma região variável de anticorpo específica por inserções, eliminações ou alterações nas seqüências de aminoácidos do anticorpo específico. Os exemplos particulares incluem domínios da região variável manipulados contendo pelo menos uma CDR e opcionalmente um ou mais aminoácidos estruturais de um primeiro anticorpo e o restante do domínio da região variável de um segundo anticorpo.
0 domínio da região variável pode ser covalentemente anexado em um aminoácido C-terminal a pelo menos um outro domínio do anticorpo ou um fragmento do mesmo. Assim, por exemplo, um domínio VH que esteja presente no domínio da região variável pode ser ligado a um domínio CHI da imunoglobulina, ou a um fragmento do mesmo. Similarmente, um domínio Vl pode ser ligado a um domínio Ck ou a um fragmento do mesmo. Deste modo, por exemplo, o anticorpo pode ser um fragmento Fab onde o domínio de ligação ao antígeno contém domínios Vh e Vl associados ligados covalentemente em seus C-terminais a um domínio CHI e Ck, respectivamente. 0 domínio CHI pode ser estendido com mais aminoácidos, por exemplo, para fornecer uma região de junção ou uma parte de um domínio da região de junção como é encontrado no fragmento Fab', ou fornecer mais domínios, tal como os domínios CH2 e CH3 do anticorpo.
Derivados e variantes das proteínas de ligação a
antígeno
As seqüências de nucleotídeos de L1-L23 e H1-H23, que codificam as seqüências correspondentes de aminoácidos de Al- A23, podem ser alteradas, por exemplo, por mutagênese aleatória ou por mutagênese dirigida ao sítio (por exemplo, mutagênese específica do sítio direcionada ao oligonucleotídeo) para criar um polinucleotídeo alterado consistindo em uma ou mais substituições, eliminações ou inserções particulares de nucleotídeo, comparado ao polinucleotídeo não-mutado. Os exemplos de técnicas para fazer tais alterações são descritos em Walder et al., 1986, Gene 42:133; Bauer et al. 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, January 1985, 12-19; Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press; e nas Patentes Norte-americanas N-s 4.518.584 e 4.737.462. Esses e outros métodos podem ser utilizados para, por exemplo, derivados de anticorpos anti-receptor de glucagon que tenham uma propriedade desejada, por exemplo, elevada afinidade, avidez ou especificidade para o receptor de glucagon, elevada atividade ou estabilidade in vivo ou in vitro, ou reduzidos efeitos colaterais in vivo comparados ao anticorpo não- derivado.
Outros derivados de anticorpos anti-receptor de glucagon no escopo desta invenção incluem conjugados covalentes ou agregativos de anticorpos anti-receptor de glucagon, ou fragmentos dos mesmos, com outras proteínas ou polipeptídios, tal como pela expressão de proteínas de fusão recombinantes consistindo em polipeptídios heterólogos fundidos ao N-terminal ou C-terminal de um polipeptídios de anticorpo anti-receptor de glucagon. Por exemplo, o peptídeo conjugado pode ser um polipeptídio com sinal heterólogo (ou líder) , por exemplo, o fator alfa líder da levedura, ou um peptídeo como um apêndice do epítopo. As proteínas de fusão contendo proteína de ligação a antígeno podem consistir em peptídeos adicionados para facilitar a purificação ou a identificação da proteína de ligação a antígeno (por exemplo, poli-His). Uma proteína de ligação a antígeno pode também ser ligada ao peptídeo FLAG conforme descrito em Hopp et al., Bio/Technology 6:1204,1988 e a Patente Norte-americana 5.011.912. 0 peptídeo FLAG é altamente antigênico e fornece um epítopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal específico (mAb), permitindo uma rápida dosagem e fácil purificação da proteína recombinante expressa. Os reagentes úteis para preparar as proteínas de fusão nas quais o peptídeo FLAG é fundido a um determinado polipeptídio estão disponíveis no comércio (Sigma, St. Louis, MO). Em uma outra configuração, oligômeros contendo uma ou mais proteínas de ligação a antígeno podem ser empregados como antagonistas do receptor de glucagon. Os oligômeros podem estar na forma de dímeros, trímeros ou oligômeros mais altos ligados covalentemente ou não-covalentemente. Os oligômeros consistindo em duas ou mais proteínas de ligação a antígeno são contemplados para uso, sendo um exemplo o homodímero. Outros oligômeros incluem os heterodímeros, os homotrímeros, os homotetrâmeros, os
heterotetrâmeros, etc.
Uma configuração é direcionada aos oligômeros que consistem em múltiplas proteínas de ligação a antigeno reunidos através de interações covalentes ou não-covalentes entre as metades do peptídeo fundidas às proteínas de ligação a antigeno. Tais peptídeos podem ser ligadores de peptídeo (espaçadores) ou peptídeos que têm a propriedade de promover a oligomerização. Os zíperes de leucina e certos polipeptídios derivados de anticorpos estão entre aqueles que podem promover a oligomerização das proteínas de ligação a antigeno anexadas ali, conforme descrito
mais detalhadamente abaixo. Em configurações particulares, os oligômeros
consistem em duas a quatro proteínas de ligação a antigeno. As proteínas de ligação a antigeno do oligômero podem estar em qualquer forma, tal como qualquer uma das formas descritas acima, por exemplo, variantes ou fragmentos. Preferivelmente, os oligômeros consistem em proteínas de ligação a antigeno com atividade de ligação a receptor de glucagon .
Em uma configuração, um oligômero é preparado usando polipeptídios derivados de imunoglobulinas. A preparação das proteínas de fusão contendo certos polipeptídios heterólogos fundidos a várias partes dos polipeptídios derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; e Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in lmmunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 -10.19.11. Uma configuração da presente invenção é dirigida a um dímero consistindo em duas proteínas de fusão criadas pela fusão de um fragmento de ligação a receptor de glucagon do anticorpo anti-receptor de glucagon à região Fc de um anticorpo. 0 dimero pode ser obtido, por exemplo, inserindo-se uma fusão de genes que codificam a proteína de fusão em um vetor de expressão apropriado, expressando a fusão do gene nas células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e permitindo que a proteína de fusão expressa se reúna de modo muito similar às moléculas de anticorpo, nas quais ligações dissulfídicas inter-cadeias se formam entre as metades Fc para produzir o dimero.
0 termo "polipeptídio Fc" usado aqui inclui formas naturais e muteína de polipeptídios derivados da região Fc de um anticorpo. Formas truncadas de polipeptídios contendo a região de junção que promove a dimerização são também incluídas. As proteínas de fusão que consistem em metades Fc (e oligômeros formados destas) oferecem a vantagem de fácil purificação por cromatografia de afinidade em colunas de Proteína A ou Proteína G.
Um polipeptídio Fc adequado, descrito no pedido de PCT WO 93/10151 (incorporado aqui por referência), é um polipeptídio de cadeia simples que se estende da região de junção N-terminal até o C-terminal nativo da região Fc de um anticorpo IgGl humano. Um outro polipeptídio Fc útil é a muteína Fc descrita na Patente Norte-americana 5.457.035 e em Baum et al. , 1994, EMBO J. 13:3992-4001. A seqüência de aminoácidos dessa muteína é idêntica à da seqüência Fc nativa apresentada no WO 93/10151, exceto que o aminoácido 19 foi alterado de Leu para Ala, o aminoácido 20 foi alterado de Leu para Glu e o aminoácido 22 foi alterado de Gly para Ala. A muteína exibe reduzida afinidade para receptores Fe. Em outras configurações, a porção variável da cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo anti-receptor de glucagon pode ser substituída pela porção variável da cadeia leve e/ou
pesada de um anticorpo.
Alternativamente, o oligômero é uma proteína de
fusão consistindo em múltiplas proteínas de ligação a antígeno, com ou sem ligadores de peptídeo (peptídeos espaçadores) . Entre os ligadores de peptídeo adequados estão aqueles descritos nas Patentes Norte-americanas 4.751.180 e 4.935.233.
Um outro método para preparar proteínas oligoméricas de ligação a antígeno envolve o uso de um zíper de leucina. Os domínios do zíper de leucina são peptídeos que promovem oligomerização das proteínas nas quais são encontrados. Os zíperes de leucina foram originalmente identificados em várias proteínas de ligação de DNA (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759) e têm sido desde então encontrados em uma variedade de proteínas diferentes. Entre os zíperes de leucina conhecidos estão os peptídeos que ocorrem naturalmente e derivados destes que dimerizam ou trimerizam. Os exemplos de domínios de zíper de leucina adequados para produzir proteínas oligoméricas solúveis são descritos no pedido de PCT WO 94/10308 e o zíper de leucina derivado da proteína D surfactante pulmonar (SPD) é descrito em Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191, incorporados aqui por referência. 0 uso de um zíper de leucina modificado que permite a trimerização estável de uma proteína heteróloga fundida a ele é descrito em Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. Em uma abordagem, as proteínas de fusão recombinantes que compreendem um fragmento ou derivado de anticorpo anti-receptor de glucagon fundido a um peptídeo do zíper de leucina são expressas em células hospedeiras adequadas e os fragmentos ou derivados de anticorpo anti-receptor de glucagon oligoméricos que se formam são recuperados do sobrenadante da cultura.
Em uma outra configuração, os derivados de anticorpo podem consistir em pelo menos uma das CDRs reveladas aqui. Por exemplo, uma ou mais CDRs podem ser incorporadas nas regiões da estrutura do anticorpo conhecidas (IgGl, IgG2, etc.), ou conjugadas a um veiculo adequado para aumentar sua meia-vida. Os veículos adequados incluem, sem limitação Fc, albumina, transferrina e similares. Esses e outros veículos adequados são conhecidos na técnica. Esses peptídeos de CDR conjugados podem estar na forma monomérica, dimérica, tetramérica ou outra forma. Em uma configuração, um ou mais polímeros solúveis em água são ligados em uma ou mais posições específicas, por exemplo no terminal amino de um agente de ligação. Em um exemplo, um derivado de anticorpo consiste em uma ou mais anexações de polímero solúvel em água, incluindo, sem limitação, polietilenoglicol, polioxietilenoglicol, ou polipropilenoglicol. Vide, por exemplo, as Patentes Norte-americanas N^s 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 e 4.179.337. Em certas configurações, um derivado consiste em um ou mais polímeros de monometoxi- polietilenoglicol, dextran, celulose ou outros polímeros baseados em carboidrato, homopolímeros de poli-(N-vinil pirrolidona)- polietilenoglicol, propilenoglicol, um co-polímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, assim como misturas de tais polímeros. Em certas configurações, um ou mais polímeros solúveis em água são aleatoriamente anexados a uma ou mais cadeias laterais. Em certas configurações, o PEG pode agir para melhorar a capacidade terapêutica de um agente de ligação, tal como um anticorpo. Alguns desses métodos são discutidos, por exemplo, na Patente Norte-americana N^ 6.133.426, a qual é aqui incorporada por referência para qualquer finalidade. Será observado que um anticorpo da presente
invenção pode ter pelo menos uma substituição de aminoácido, desde que o anticorpo retenha a especificidade da ligação. Portanto, as modificações nas estruturas do anticorpo estão englobadas no escopo da invenção. Essas podem incluir substituições de aminoácidos que podem ser conservadoras ou não-conservadoras, que não destroem a capacidade de ligação ao receptor de glucagon
humano de um anticorpo.
As substituições conservadoras de aminoácido
podem englobar resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente, os quais são normalmente incorporados por síntese química de peptídeo ao invés de por síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomimética e outras formas revertidas ou invertidas de partes de aminoácidos. Uma substituição conservadora de aminoácido pode também envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo normativo de tal modo que haja pouco ou nenhum efeito sobre a polaridade ou a carga do resíduo de aminoácido naquela posição. As substituições não-conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma classe ou mimetização de aminoácido para um membro de uma outra classe com diferentes propriedades físicas (por exemplo, tamanho, polaridade, hidrofobicidade, carga). Esses resíduos substituídos podem ser introduzidos nas regiões do anticorpo humano que são homólogas a outros anticorpos não-humanos ou nas regiões não-homólogas da molécula.
Além do mais, uma pessoa habilitada na técnica pode gerar variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. As variantes podem então ser filtradas usando ensaios de atividade conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Tais variantes podem ser usadas para reunir informações sobre variantes adequadas. Por exemplo, se alguém descobriu que uma alteração em um resíduo de aminoácido particular resultou em destruição, redução indesejada ou inadequação da atividade, as variantes com essa alteração podem ser evitadas. Em outras palavras, com base nas informações reunidas nesses experimentos de rotina, uma pessoa habilitada na técnica poderá prontamente determinar os aminoácidos onde mais substituições devem ser evitadas isoladamente ou em combinação com outras mutações.
Um técnico habilitado será capaz de determinar variantes adequadas do polipeptídio conforme estabelecido aqui usando técnicas bem conhecidas. Em certas configurações, uma pessoa habilitada na técnica poderá identificar áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas sem destruir a atividade, visando regiões que se crê não sejam importantes para a atividade. Em certas configurações, pode-se identificar resíduos e partes das moléculas que são conservadas entre polipeptídios similares Em certas configurações, mesmo áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para a estrutura podem ser submetidas a substituições de aminoácido conservadoras sem destruir a atividade biológica ou sem afetar adversamente a estrutura do polipeptídio. Adicionalmente, uma pessoa habilitada na técnica poderá revisar estudos da função da estrutura identificando resíduos em polipeptidios similares que são importantes para a atividade ou para a estrutura. Em vista dessa comparação, pode-se prever a importância dos resíduos de aminoácidos em uma proteína que corresponda aos resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade ou a estrutura em proteínas similares. Uma pessoa habilitada na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente similares para esses resíduos de aminoácido previstos como importantes.
Uma pessoa habilitada na técnica pode também analisar a estrutura tridimensional e a seqüência de aminoácidos em relação àquela estrutura em polipeptidios similares. Em vista dessa informação, uma pessoa habilitada na técnica pode prever o alinhamento dos resíduos de aminoácido de um anticorpo com relação à sua estrutura tridimensional. Em certas configurações, uma pessoa habilitada na técnica pode optar por não fazer alterações radicais em resíduos de aminoácido cuja presença é prevista na superfície da proteína, uma vez que tais resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Inúmeras publicações científicas foram devotadas à previsão da estrutura secundária. Vide Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4) :422-427 (1996), Chou et al. , Biochemistry, 13 (2):222-245 (1974); Chou et al. Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem, 47:251-276 e Chou et al, Biophys. J, 26:367-384 (1979). Além do mais, existem atualmente programas de computador para auxiliar na previsão da estrutura secundária. Um método para prever a estrutura secundária é baseado em modelamento da homologia. Por exemplo, dois polipeptidios ou proteínas que tenham uma identidade da seqüência acima de 30%, ou similaridade acima de 40%, geralmente têm topologias estruturais similares. 0 recente crescimento do banco de dados estrutural das proteínas (PDB) forneceu maior previsibilidade da estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras dentro da estrutura de um polipeptídio ou proteína. Vide Holm et al, Nucl. Acid. Res, 27(1):244-247 (1999). Foi sugerido (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol, 7(3):369-376 (1997)) que existe um número limitado de dobras em um determinado polipeptídio ou proteína e que uma vez que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a previsão estrutural se tornará dramaticamente mais acurada.
Métodos adicionais para prever a estrutura secundária incluem o "encadeamento" (Jones, D, Curr. Opin. Struct. Biol, 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al. Structure, 4(1): 15-19 (1996)), a "análise do perfil" (Bowie et al. Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al, Meth. Enzym, 183:146-159 (1990); Gribskov et al, Proc. Nat. Acad. Sei, 84 (13) :4355-4358 (1987)) e a "ligação evolucionária" (Vide Holm, supra (1999) e Brenner, supra (1997)). Em certas configurações, as variantes de anticorpos incluem variantes de glicosilação onde o número e/ou tipo de sítio de glicosilação foi alterado comparado às seqüências de aminoácido de um polipeptídio original. Em certas configurações, as variantes consistem em um número maior ou menor de sítios de glicosilação N- ligados do que a proteína nativa. Alternativamente, as substituições que eliminam esta seqüência removerão uma cadeia de carboidrato N-Iigado existente. Também é provido um rearranjo das cadeias de carboidratos N-Iigados onde um ou mais sítios de glicosilação N-Iigados (normalmente aqueles que ocorrem naturalmente) são eliminados e um ou mais novos sítios N-Iigados são criados. Variantes de anticorpo adicionais preferidas incluem as variantes de cisteína onde um ou mais resíduos de cisteína são eliminados ou substituídos por um outro aminoácido (por exemplo, serina) em comparação com a seqüência de aminoácidos original. As variantes de cisteína podem ser úteis quando os anticorpos precisam ser dobrados novamente para uma conformação biologicamente ativa tal como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. As variantes de cisteína em geral têm menos resíduos de cisteína do que a proteína nativa e normalmente têm um número par para minimizar as interações resultantes de cisteínas desparelhadas.
As substituições de aminoácidos desejadas (sejam conservadoras ou não-conservadoras) podem ser determinadas por pessoas habilitadas na técnica no momento em que tais substituições forem desejadas. Em certas configurações, as substituições de aminoácidos podem ser usadas para identificar resíduos importantes de anticorpos anti-receptor de glucagon humano, ou para aumentar ou diminuir a afinidade dos anticorpos anti-receptor de glucagon humano aqui descritos.
De acordo com certas configurações, as substituições de aminoácidos preferidas são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos protéicos, (4) alteram as afinidades de ligação, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais nesses polipeptídios. De acordo com certas configurações, substituições simples ou múltiplas de aminoácidos (em certas configurações, substituições de aminoácidos conservadoras) podem ser feitas na seqüência que ocorre naturalmente (em certas configurações, na porção do polipeptidio fora do(s) domínio(s) que forma(m) contatos intermoleculares). Em certas configurações, uma substituição de aminoácido conservadora normalmente pode não alterar substancialmente as características estruturais da seqüência original (por exemplo, uma substituição de aminoácido não deve tender a quebrar a hélice que ocorre na seqüência original, ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracterizam a seqüência original). Exemplos de estruturas polipeptídicas secundárias e terciárias reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991), cada um deles incorporado aqui por referência.
Em certas configurações, os anticorpos da invenção podem ser quimicamente ligados a polímeros, lipídios ou outras partes.
Os agentes de ligação a antígeno podem consistir em pelo menos uma das CDRs aqui descritas incorporadas em uma estrutura biocompatível. Em um exemplo, a estrutura biocompatível consiste em um polipeptidio ou parte dele que é suficiente para formar um suporte estrutural, ou estrutura, ou esqueleto conformacionalmente estável, que é capaz de exibir uma ou mais seqüências de aminoácidos que se ligam a um antígeno (por exemplo, CDRs, uma região variável, etc.) em uma região com superfície localizável. Essas estruturas podem ser um polipeptídio que ocorra naturalmente ou uma "dobra" de polipeptídio (um motivo estrutural), ou pode ter uma ou mais modificações, tal como adições, eliminações ou substituições de aminoácidos, em relação ao polipeptídio ou dobra que ocorre naturalmente. Esses esqueletos podem ser derivados de um polipeptídio de qualquer espécie (ou de mais de uma espécie), tal como a humana, outros mamíferos, outros vertebrados, invertebrados, plantas, bactérias ou vírus. Normalmente, as estruturas biocompatíveis são
baseadas em esqueletos diferentes dos domínios da imunoglobulina. Por exemplo, aquelas baseadas em fibronectina, ancirina, lipocalina, neocarzinostatina, citocromo b, CPl zinc finger, PSTl, coiled coil, LACI-D1, domínio Z e domínios tendamistat podem ser usadas (Vide por exemplo, Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).
Adicionalmente, uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que os agentes de ligação adequados incluem porções desses anticorpos tais como uma ou mais CDR1, CDR2, CDR3 da cadeia pesada, CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve conforme especificamente revelado aqui. Pelo menos uma das regiões de CDRl, CDR2, CDR3, da cadeia pesada, CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve podem ter pelo menos uma substituição de aminoácido, desde que o anticorpo retenha a especificidade de ligação da CDR não-substituída. A porção não-CDR do anticorpo pode ser uma molécula não-protéica, onde o agente de ligação faz o bloqueio cruzado da ligação de um anticorpo revelado aqui para o GCGR humano e/ou inibe a atividade de sinalização do glucagon através do receptor. A porção não-CDR do anticorpo pode ser uma molécula não-protéica na qual o anticorpo exibe um padrão de ligação similar aos peptideos do GCGR humano em um ensaio da ligação competitiva como aquele exibido por pelo menos um dos anticorpos A1-A23, e/ou neutraliza a atividade do glucagon. A porção não-CDR do anticorpo pode ser composta de aminoácidos, onde o anticorpo é uma proteína de ligação recombinante ou um peptídeo sintético e a proteína de ligação recombinante fazem o bloqueio cruzado da ligação de um anticorpo revelado aqui para o GCGR humano e/ou neutraliza a atividade do glucagon in vitro ou in vivo. A porção não-CDR do anticorpo pode ser composta de aminoácidos, onde o anticorpo é um anticorpo recombinante e o anticorpo recombinante exibe um padrão de ligação similar aos peptideos do GCGR humano em um ensaio de ligação competitiva conforme exibido por pelo menos um dos anticorpos Al- A23, e/ou neutraliza a sinalização do glucagon.
Ácidos nucléicos
Em um aspecto, a presente invenção provê moléculas de ácido nucléico isoladas. Os ácidos nucléicos consistem em, por exemplo, polinucleotídeos que codificam toda ou parte de uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, uma ou ambas as cadeias de um anticorpo da invenção, ou um fragmento, derivado, muteína ou variante do mesmo, polinucleotídeos suficientes para uso como sondas de hibridização, preparadores de PCR ou preparadores de sequenciamento para identificar, analisar, mutar ou amplificar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio, ácidos nucléicos anti-sentido para inibir a expressão de um polinucleotídeo e seqüências complementares dos precedentes. Os ácidos nucléicos podem ter qualquer comprimento. Eles podem ter, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000 ou mais nucleotídeos de comprimento, e/ou podem consistir em uma ou mais seqüências adicionais, por exemplo, seqüências reguladoras, e/ou fazer parte de um ácido nucléico maior, por exemplo, um vetor.
Os ácidos nucléicos podem ser de filamento simples ou filamento duplo e podem consistir em nucleotídeos de RNA e/ou DNA e variantes artificiais dos mesmos (por exemplo,
ácidos nucléicos peptídicos).
Os ácidos nucléicos que codificam os polipeptídios do anticorpo (por exemplo, cadeia leve ou pesada, somente domínio variável, ou de comprimento total) podem ser isolados de células B de camundongos que foram imunizados com antígeno de GCGR. O ácido nucléico pode ser isolado através de procedimentos convencionais tais como a reação em cadeia de polimerase (PCR).
As seqüências de ácido nucléico que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas são mostradas acima. O técnico habilitado observará que, devido à degeneração do código genético, cada uma das seqüências de polipeptídios reveladas aqui é codificada por um grande número de outras seqüências de ácido nucléico. A presente invenção provê cada seqüência de nucleotídeos degenerada que codifica cada proteína de ligação a antígeno da invenção.
A invenção provê ainda ácidos nucléicos que hibridizam para outros ácidos nucléicos (por exemplo, ácidos nucléicos que consistem em uma seqüência de nucleotídeos de um entre Al-Al4) sob condições particulares de hibridização. Os métodos para hibridizar ácidos nucléicos são bem conhecidos na área. Vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Conforme definido aqui, por exemplo, uma condição de hibridização moderadamente rígida utiliza uma solução de pré-lavagem contendo 5X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) , SDS a 0,5%, 1,0 rnM de EDTA (pH 8,0), tampão de hibridização de cerca de 50% de formamida, 6X SSC e uma temperatura de hibridização de 55°C (ou outras soluções de hibridização similares tais como aquela contendo cerca de 50% de formamida, com uma temperatura de hibridização de 42°C) e condições de lavagem de 60°C, em 0,5X SSC, SDS a 0,1%. Uma condição de hibridização rígida hibridiza em 6X SSC a 45°C, seguida de uma ou mais lavagens em 0,1X SSC, SDS a 0,2% a 68°C. Além disso, uma pessoa com habilidade na técnica pode manipular as condições de hibridização e/ou de lavagem para aumentar ou diminuir a rigidez da hibridização de modo que os ácidos nucléicos que compreendem seqüências de nucleotídeos que sejam pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% idênticas umas às outras normalmente permaneçam hibridizadas entre si. Os parâmetros básicos que afetam a escolha das condições de hibridização e a orientação para delinear condições adequadas são estabelecidos por, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 e 11; e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3-6.4) e podem ser prontamente determinados por aqueles com habilidade comum na técnica, com base, por 10
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exemplo, no comprimento e/ou composição básica do DNA. As alterações podem ser introduzidas por mutação para um ácido nucléico, levando assim a alterações na seqüência de aminoácidos de um polipeptidio (por exemplo, uma proteína de ligação a antígeno) que ele codifica. As mutações podem ser introduzidas usando qualquer técnica conhecida na área. Em uma configuração, um ou mais resíduos de aminoácidos particulares são alterados usando, por exemplo, um protocolo de mutagênese direcionada para o sítio. Em uma outra configuração, um ou mais resíduos selecionados aleatoriamente são alterados usando, por exemplo, um protocolo de mutagênese aleatório. Como quer que seja feito, um polipeptidio mutante pode ser expresso e filtrado para a propriedade desejada.
Mutações podem ser introduzidas em um ácido nucléico sem alterar significativamente a atividade biológica de um polipeptidio que ele codifique. Por exemplo, pode-se fazer substituições de nucleotídeos que levem a substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácidos não-essenciais. Em uma configuração, uma seqüência de mucleotídeo fornecida aqui para L- l-L-23 e H-I a H-23, ou um fragmento, variante ou derivado desejado da mesma, é mutada de forma a codificar uma seqüência de aminoácidos consistindo em uma ou mais eliminações ou substituições de resíduos de aminoácidos que são mostrados aqui para L-I a L-23 e H-I a H-23 como sendo resíduos onde duas ou mais seqüências diferem. Em uma outra configuração, a mutagênese insere um aminoácido adjacente a um ou mais resíduos de aminoácidos mostrados aqui para L-I a L-23 e H-I a H-23 como sendo resíduos onde duas ou mais seqüências diferem. Alternativamente, uma ou mais mutações podem ser introduzidas em um ácido nucléico que seletivamente alterem a atividade biológica (por exemplo, a ligação ao GCGR) de um polipeptídio que ele codifique. Por exemplo, a mutação pode quantitativa ou qualitativamente alterar a atividade biológica. Os exemplos de alterações quantitativas incluem o aumento, a redução ou a eliminação da atividade. Os exemplos de alterações qualitativas incluem a alteração da especificidade para um antígeno de uma proteína de ligação a antígeno.
Em um outro aspecto, a presente invenção provê moléculas de ácido nucléico que são adequadas para uso como preparadoras ou sondas de hibridização para a detecção das seqüências de ácido nucléico da invenção. Uma molécula de ácido nucléico da invenção pode consistir em apenas uma parte da seqüência de ácido nucléico que codifique um polipeptídio de comprimento total da invenção, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como sonda ou preparador ou um fragmento que codifica uma parte ativa (por exemplo, uma parte de ligação ao GCGR) de um
polipeptídio da invenção.
As sondas baseadas na seqüência de um ácido
nucléico da invenção podem ser usadas para detectar o ácido nucléico ou ácidos nucléicos similares, por exemplo, transcriptos que codificam um polipeptídio da invenção. A sonda pode consistir em um grupo de marcação, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator enzimático. Tais sondas podem ser usadas para identificar uma célula que expresse o polipeptídio.
Em um outro aspecto, a presente invenção provê vetores que consistem em um ácido nucléico que codifica um polipeptidio da invenção, ou uma parte do mesmo. Os exemplos de
vetores incluem, sem limitação, plasmídeos, vetores virais,
vetores não-episômicos de mamíferos e vetores de expressão, por
exemplo, vetores de expressão recombinantes. Os vetores de expressão recombinantes da invenção
podem consistir em um ácido nucléico da invenção em uma forma adequada para a expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira. Os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, a qual é operacionalmente vinculada à seqüência de ácido nucléico a ser expressa. As seqüências reguladoras incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos em vários tipos de células hospedeiras (por exemplo, o intensificador inicial de gene SV40, o promotor do vírus de sarcoma de Rous e o promotor do citomegalovírus), aquelas que dirigem a expressão da seqüência de nucleotídeos somente em certas células hospedeiras (por exemplo, seqüências reguladoras específicas de tecido, vide Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sei. 11:287, Maniatis et al. , 1987, Science 236:1237, incorporados em sua totalidade por referência aqui) e aquelas que dirigem a expressão induzível de uma seqüência de nucleotídeos em resposta a um tratamento ou condição particular (por exemplo, o promotor de metalotionina em células de mamífero e o promotor tet-responsivo e/ou responsivo a estreptomicina tanto no sistema procariótico como no eucariótico (vide id.)). Será observado pelas pessoas habilitadas na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para então produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados pelos ácidos nucléicos aqui descritos.
Em um outro aspecto, a presente invenção provê células hospedeiras nas quais foi introduzido um vetor de expressão recombinante da invenção. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. As células hospedeiras procarióticas incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, E. coli ou bacilos. Células eucarióticas superiores incluem células de insetos, células de levedura e linhagens celulares estabelecidas de origem mamífera. Os exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) ou seus derivados, tal como a linhagem CHO Veggie e as linhagens celulares associadas que crescem em meios isentos de soro (vide Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) ou células CHO cepa DXB-Il, que são deficientes em DHFR (vide Urlaub et al. , 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-20). Linhagens adicionais de células CHO incluem CHO-Kl (ATCC#CCL-61) , EM9 (ATCC# CRL-18 61) e UV20 (ATCC# CRL-1862) . As células hospedeiras adicionais incluem a linhagem COS-7 de células de rim de macaco (ATCC CRL 1651) (vide Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L , células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células AM-l/D (descritas na Patente Norte-americana N- 6.210.924), células HeLa, linhagens celulares BHK (ATCC CRL 10), a linhagem celular CV1/EBNA derivada da linhagem celular CVl de rim de macaco-verde africano (ATCC CCL 70) (vide McMahan et al. , 1991, EMBO J. 10:2821), células renais embriônicas humanas tal como a 293, 293 EBNA ou MSR 293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, outras linhagens celulares de primata transformadas, células diplóides normais, cepas de células derivadas de cultura in vitro de tecido primário, explantes primários, HL-60, U937, células HaK ou Jurkat. Os vetores de clonagem e expressão apropriados para uso com os hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e de mamíferos são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) .
O DNA do vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através das técnicas convencionais de transformação ou transfecção. Para a transfecção estável de células mamíferas, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção utilizada, somente uma pequena fração de células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. Para identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifique um marcador selecionável (por exemplo, para resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a drogas, tal como o G418, a hidromicina e o metotrexato. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucléico introduzido podem ser identificadas por seleção da droga (por exemplo, as células que incorporaram o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto que as outras células morrerão), entre outros métodos.
As células transformadas podem ser cultivadas sob condições que promovam a expressão do polipeptídio e o polipeptídio recuperado por procedimentos convencionais de purificação de proteína. Um desses procedimentos de purificação é descrito nos Exemplos abaixo. Os polipeptídios contemplados para uso aqui incluem polipeptídios substancialmente homogêneos de anticorpo anti-receptor de glucagon recombinante substancialmente isentos de materiais endógenos contaminantes.
Atividade das Proteínas de Ligação a antígeno Em um aspecto, a presente invenção provê proteínas de ligação a antígeno, em particular anticorpos humanos, humanizados ou quiméricos, que especificamente se ligam ao receptor de glucagon humano. Esses anticorpos incluem anticorpos antagonizantes ou neutralizantes capazes de reduzir ou neutralizar a sinalização do glucagon, conforme determinado, por exemplo, pelo ensaio funcional em células descrito no Exemplo 4. Em uma configuração, as proteínas de ligação a antígeno, tais como os anticorpos humanos da presente invenção têm um valor de CI50 de 90 nM ou menos, em uma outra configuração, um valor de C 1.50 de 80 nM ou menos, em uma outra configuração, 7 0 nM ou menos, em uma outra configuração, 60 nM ou menos, em uma outra configuração, 50 nM ou menos, em uma outra configuração, 40 nM ou menos, em uma outra configuração, 30 nM ou menos, em uma outra configuração 25 nM ou menos. Em uma outra configuração, as proteínas de ligação a antígeno tais como os anticorpos humanos da presente invenção são capazes de especificamente ligar-se ao receptor de glucagon humano e têm um valor de CI50 que é substancialmente similar ao de um anticorpo de referência. Em uma outra configuração, as proteínas de ligação a antígeno têm um Kb (ou Kd) medido pelo ensaio descrito nos Exemplos abaixo (ou ensaios similares), que é substancialmente similar ao do anticorpo de referência. 0 termo "substancialmente similar" usado aqui significa comparável a, ou aproximadamente 100%, 99%, 98%, 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% ou 50% idêntico ao valor de CI50 ou Kb (ou Kd) do anticorpo de referência. Os anticorpos de referência incluem, por exemplo, os anticorpos com uma combinação das cadeias leve e pesada LlHl, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L11H11, L12H12, L13H13, L15H15, L21H21 e L22H22. Em uma configuração, os anticorpos de referência incluem A-l, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A- 7, A-8, A-9, A-Il, A-12, A-13, A-15, A-21 e A-22. Em uma outra configuração, as proteínas de ligação a antígeno tais como os anticorpos humanos da presente invenção são capazes de especificamente ligar-se ao receptor de glucagon humano e reduzir a glicemia em um modelo animal. Em uma configuração, a glicemia é reduzida em 2% comprada aos animais não tratados, em uma outra configuração a glicemia é reduzida em 5% comparada aos animais não tratados, em uma outra configuração, a glicemia é reduzida em 10% comparada aos animais não tratados, em uma outra configuração, a glicemia é reduzida em 15%, em uma outra configuração, em 20%, em uma outra configuração, em 25% ou mais, comparada aos animais não tratados. A quantidade de redução da glicemia é controlada pela dosagem. Uma dosagem terapeuticamente eficaz é a dosagem necessária para reduzir a glicemia para a faixa normal para o paciente animal ou humano. Um modelo animal exemplar é o camundongo ob/ob, conforme descrito no Exemplo 6 abaixo. Em uma outra configuração, os anticorpos humanos da presente invenção são capazes de especificamente ligar-se ao receptor de glucagon humano, e melhorar a eliminação da glicose em um modelo animal. Um modelo animal exemplar é o macaco cynomolgus, conforme descrito no Exemplo 7 abaixo. Melhorar a eliminação da glicose refere-se à quantidade de tempo levado para reduzir a glicemia após uma provocação de glicose oral administrada ao paciente animal ou humano, sendo uma medida da tolerância à glicose. Esta é medida por testes padrão tal como o teste de tolerância à glicose oral (OGTT), conforme descrito no exemplo abaixo. As proteínas de ligação a antígeno da presente invenção podem melhorar a tolerância à glicose no modelo animal. Além disso, as proteínas de ligação a antígeno podem melhorar outros indicadores in vivo associados ao diabetes tipo 2 e hiperglicemia, incluindo, sem limitação, a tolerância à glicose em jejum, dislipidemia e síndrome metabólica.
Ligação ao Receptor de Glucagon Humano Em uma configuração, a presente invenção provê proteínas de ligação a antígeno que competem pela ligação com o anticorpo de referência, onde o anticorpo de referência consiste em uma combinação de seqüências do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em LlHl, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LllHll, L12H12, L13H13, L15H15, L17H17, L21H21 e L22H22 . Em uma outra configuração, a presente invenção provê anticorpos humanos que competem pela ligação com um anticorpo de referência, onde o anticorpo de referência é o A-I, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A-I, A- 8, A-9, A-I 1, A-12, A-13, A-15, A-21 e A-22. Em um outro aspecto, a presente invenção provê anticorpos humanos que se ligam à região Ser80 a Serll9 do receptor de glucagon humano. Em uma outra configuração, a presente invenção provê anticorpos humanos que competem pela ligação com o anticorpo de referência, onde o anticorpo de referência se liga à região Ser80 a Serll9 do receptor de glucagon humano. Em uma outra configuração, a presente invenção provê anticorpos humanos que se ligam à região Ser80 a Serll9 do receptor de glucagon e têm um valor de CI50 de 90 nM ou menos, em uma outra configuração 8 0 nM ou menos, em uma outra configuração, 70 nM ou menos, em uma outra configuração, 60 nM ou menos, em uma outra configuração, 50 nM ou menos, em uma outra configuração, 40 nM ou menos, em uma outra configuração, 30 nM ou menos, em uma outra configuração, 25 nM ou menos, conforme determinado, por exemplo, no ensaio estabelecido no Exemplo 4. Em uma outra configuração, a presente invenção provê anticorpos humanos que competem pela ligação ao receptor de glucagon humano com um anticorpo de referência, onde o anticorpo de referência é o A-3 .
Em uma configuração adicional, as proteínas de ligação a antígeno, quando ligadas ao receptor de glucagon humano se ligam a este com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo de referência; inibem a estimulação de glucagon do receptor de glucagon humano com substancialmente a mesma CI50 do dito anticorpo de referência; e/ou competem pela ligação com o dito anticorpo de referência no receptor de glucagon humano, onde o dito anticorpo de referência consiste em uma combinação de seqüências do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LllHll, L12H12, L13H13, L15H15, L21H21 e L22H22.
Em uma configuração adicional, é provido um anticorpo humano isolado que, quando ligado ao receptor de glucagon humano: se liga ao receptor de glucagon humano com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo de referência; inibe a estimulação do glucagon do receptor de glucagon humano com substancialmente a mesma CI50 que o dito anticorpo de referência; e/ou compete pela ligação com o dito anticorpo de referência no receptor de glucagon humano, onde o dito anticorpo de referência é selecionado do grupo consistindo na-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A- 7, A-8, A-9, A-I 1, A-12, A-13, A-15, A-21 e A-22 .
Em uma configuração adicional, é provido um anticorpo humano isolado que, quando ligado ao receptor de glucagon humano: a. especificamente se liga à porção Ser80 a Serll9 do aminoácido do receptor de glucagon humano; b. reduz a sinalização do glucagon com um valor de CI50 de 90 nM ou menos; c. reduz a glicemia em um modelo animal; ou (a) e (b) , ou (a), (b) e (c) .
A habilidade de competir com um anticorpo é determinada como segue. O Exemplo 8 abaixo descreve um exemplo de ensaio da ligação competitiva usando o A-3 como o anticorpo de referência.
Os anticorpos testados foram sobreponiveis,
aqueles que podiam competir pela ligação com o A-3, parcialmente sobreponiveis, aqueles que podiam competir apenas parcialmente pela ligação e anticorpos não-sobreponiveis, aqueles que não competiam pela ligação com o A-3. Os resultados são mostrados nas Figuras 4-6.
Além disso, o sitio de ligação do anticorpo humano A-3 e outros anticorpos humanos foi determinado pela construção dos receptores quiméricos do GCGR humano e dos receptores do GLP-I humano, conforme descrito no Exemplo 9 abaixo. Usando os receptores quiméricos, conforme descrito abaixo, e como é mostrado na Figura 7, foi determinado que para o anticorpo A-3, a região dos aminoácidos Ser80 a Serll7 do receptor de glucagon humano foi necessária e suficiente para a ligação. Além disso, o GCGR humano contém 3 pares de cisteinas. Para o anticorpo A-3, o segundo e o terceiro pares de cisteinas, mas não o primeiro par, foram necessários para a ligação. Isto contrasta com os anticorpos A-18, A-21 e A-IO, que se ligaram somente quando os 3 pares de cisteinas estavam intactos.
Indicações
O diabetes, em particular o diabetes tipo 2 e suas complicações são um problema crescente para as populações no mundo todo. Em geral, essa doença resulta da produção comprometida de insulina pelas células P pancreáticas. No diabetes tipo 2, a forma mais comum da doença, acredita-se que uma combinação de fatores genéticos e ambientais ocasione falha da célula p, que resulta em comprometimento da secreção e atividade da insulina e resistência à insulina em muitos indivíduos. A obesidade é uma condição que se acredita contribua para o aumento do diabetes tipo 2 em adultos e mesmo em crianças. Sabe-se também que a dislipidemia, ou HDL (lipoproteina de alta densidade) e LDL (lipoproteina de baixa densidade) anormais, está relacionada ao diabetes tipo 2.
O diabetes tipo 2 é caracterizado pela falha dos músculos e outros órgãos em responder às concentrações circulantes normais de insulina. Isto é seguido por um aumento da secreção de insulina pelas células beta pancreáticas, uma condição conhecida como hiperinsulinemia. Finalmente, as células beta não conseguem mais compensar, levando à diminuição da tolerância à glicose, comprometimento dos níveis de glicose em jejum, hiperglicemia crônica e danos ao tecido. Além disso, sabe-se que o pré-diabetes tipo 2 está relacionado à dislipidemia, ou HLD (lipoproteina de alta densidade) e LDL (lipoproteina de baixa densidade) anormais. Tanto a dislipidemia como a hiperglicemia estão presentes nos pacientes que sofrem de síndrome metabólica.
A presente invenção provê proteínas de ligação a antígeno, em particular, anticorpos humanos que podem ligar-se ao receptor de glucagon in vivo e reduzir os níveis glicêmicos em modelos animais. As proteínas de ligação a antígeno podem também melhorar a tolerância à glicose. Em uma configuração, a presente invenção provê anticorpos totalmente humanos com eficácia in vivo. 0 efeito de uma única injeção de anticorpos no camundongo ob/ob, por exemplo, reduz a glicemia por vários dias após a injeção, fornecendo um tratamento eficaz, duradouro para a hiperglicemia, o diabetes tipo 2 e os distúrbios associados. Uma única injeção de anticorpo também melhorou a eliminação da glicose (melhora da tolerância à glicose) do sangue nos testes de tolerância à glicose (GTT) realizados em macacos cynomolgus conforme descrito abaixo. As proteínas de ligação a antígeno e em particular, os anticorpos humanos da presente invenção são úteis para reduzir a glicose do sangue e soro, melhorando a tolerância à glicose diminuída, melhorando os níveis glicêmicos em jejum e melhorando a dislipidemia. Assim, as proteínas de ligação a antígeno, em particular os anticorpos humanos da presente invenção são úteis para tratar a hiperglicemia, o diabetes tipo 2, a síndrome metabólica e outras condições associadas, incluindo a dislipidemia. Além disso, foi mostrado que a redução da glicemia é útil em determinadas circunstâncias na prevenção e tratamento de certos tipos de câncer tal como o câncer colorretal, conforme discutido em Richardson et al, Nature Clin Pract Oncol 2: 48-53 (2005), Giovannucci et al. Gastroenterology 132: 2208-2225 (2007), Krone et al, Integrative Câncer Ther 4(1): 25-31 (2005), Chang et al., Diabetologia 46(5): 595-607 (2003), Jee et al, Yonsei Med J 46(4): 449-55 (2005). Métodos de Tratamento
Em um outro aspecto, é provido um método para tratar um sujeito, consistindo na administração de uma dosagem terapêutica de proteínas de ligação a antigeno da presente invenção. Em uma configuração, as proteínas de ligação a antigeno são anticorpos humanos. 0 termo "sujeito" usado aqui se refere a um mamífero, incluindo humanos, sendo usado intercambiavelmente com o termo "paciente". Os anticorpos humanos podem ser usados para tratar, controlar ou prevenir um distúrbio ou condição caracterizada por níveis excessivos de glucagon e/ou glicêmicos em um sujeito e melhorar a tolerância à glicose. Esses distúrbios incluem a hiperglicemia, a síndrome metabólica e o diabetes tipo 2. 0 termo "tratamento" engloba o alívio ou prevenção de pelo menos um sintoma ou outro aspecto de um distúrbio, ou redução da gravidade da doença e assim por diante. Uma proteína de ligação a antigeno, em particular um anticorpo humano de acordo com a presente invenção, não precisa efetuar uma cura completa, ou erradicar todos os sintomas ou manifestações de uma doença, para constituir um agente terapêutico viável. Como é reconhecido no campo pertinente, as drogas empregadas como agentes terapêuticos podem reduzir a gravidade de uma determinada doença, mas não precisam abolir cada manifestação da doença para serem consideradas como agentes terapêuticos úteis. Similarmente, um tratamento administrado profilaticamente não precisa ser completamente eficaz na prevenção do inicio de uma condição para constituir um agente profilático viável. Simplesmente reduzir o impacto de uma doença (por exemplo, reduzindo o número ou a gravidade de seus sintomas, ou aumentando a eficácia de um outro tratamento, ou produzindo um outro efeito benéfico), ou reduzir a probabilidade de a doença ocorrer ou piorar em um sujeito, é suficiente. Uma configuração da invenção é dirigida a um método que consiste na administração a um paciente de uma proteína de ligação a antígeno tal como um anticorpo humano, em uma quantidade e por tempo suficiente para induzir uma melhora sustentada sobre o valor basal de um indicador que reflita a gravidade do distúrbio particular.
Como é entendido no campo pertinente, as composições farmacêuticas contendo as proteínas de ligação a antígeno da invenção são administrada a um sujeito do modo apropriado à indicação. Em uma configuração, as composições farmacêuticas consistem nos anticorpos humanos da presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser administradas através de qualquer técnica adequada, incluindo, sem limitação, parenteralmente, topicamente ou por inalação. Se injetada, a composição farmacêutica pode ser administrada, por exemplo, por via intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal ou subcutânea, por injeção de bolus, ou infusão contínua. A administração localizada, por exemplo, em um local da doença ou ferimento é contemplada, assim como a entrega transdérmica e a liberação lenta dos implantes. A entrega por inalação inclui, por exemplo, a inalação nasal ou oral, o uso de um nebulizador, a inalação da proteína de ligação a antígeno em forma de aerossol e similares. Outras alternativas incluem as preparações orais incluindo pílulas, xaropes ou cápsulas.
Vantajosamente, as proteínas de ligação a antígeno da invenção são administradas na forma de uma composição consistindo em um ou mais componentes adicionais tal como um transportador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável. Opcionalmente, a composição adicionalmente consiste em um ou mais agentes fisiologicamente ativos, por exemplo, conforme descrito abaixo. Em várias configurações particulares, a composição consiste em um, dois, três, quatro, cinco ou seis agentes fisiologicamente ativos, além de uma ou mais proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos humanos) da presente invenção.
Em uma configuração, a composição farmacêutica consiste em um anticorpo humano da invenção juntamente com uma ou mais substâncias selecionadas do grupo consistindo em um tampão adequado para anticorpos a um pH adequado, um antioxidante tal como o ácido ascórbico, um polipeptídio de baixo peso molecular (tal como aqueles com menos de 10 aminoácidos) , uma proteína, um aminoácido, um carboidrato tal como a dextrina, um agente quelante tal como o EDTA, a glutationa, um estabilizante e um excipiente. De acordo com os padrões apropriados da indústria, podem também ser adicionados preservativos. A composição pode ser formulada como um liofilizato usando as soluções de excipientes apropriadas como diluentes. Os componentes adequados são não-tóxicos para aqueles que os recebem nas dosagens e concentrações empregadas. Mais exemplos de componentes que podem ser empregados nas formulações farmacêuticas são apresentados no Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. (1980) e 20th Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA.
Os kits para uso por profissionais médicos são fornecidos, e incluem uma ou mais proteínas de ligação a antígeno da invenção e um rótulo ou outras instruções para uso no tratamento de qualquer uma das condições aqui discutidas. Em uma configuração, o kit inclui uma preparação estéril de um ou mais anticorpos humanos, que pode ser na forma de uma composição conforme revelado acima e pode ser em um ou mais frascos.
As dopagens e a freqüência da administração podem variar de acordo com fatores tais como a via de administração, os anticorpos particulares empregados, a natureza e gravidade da doença a ser tratada, se a condição é aguda ou crônica, e o tamanho e condição geral do sujeito. Dosagens apropriadas podem ser determinadas por procedimentos conhecidos na técnica pertinente, como por exemplo, em estudos clínicos que envolvam estudos de escalonamento da dose.
Uma proteína de ligação a antígeno, em particular, os anticorpos humanos, da invenção pode ser administrada, por exemplo, uma ou mais de uma vez, por exemplo, em intervalos regulares durante um período de tempo. Em configurações particulares, o anticorpo humano é administrado durante um período de pelo menos um mês ou mais, por exemplo, por um, dois ou três meses ou mesmo indefinidamente. Para tratar condições crônicas, o tratamento por longo prazo é geralmente o mais eficaz. Entretanto, para tratar condições agudas, a administração por períodos mais curtos, por exemplo, de um a seis meses, pode ser suficiente. Em geral, o anticorpo humano é administrado até que o paciente manifeste um grau relevante do ponto de vista médico de melhora sobre o valor basal do indicador ou indicadores escolhidos.
Um exemplo de regime terapêutico fornecido aqui compreende a injeção subcutânea de uma proteína de ligação a antígeno tal como um anticorpo humano uma vez por semana, em uma dose apropriada, para tratar uma condição na qual os níveis glicêmicos exerçam um papel. Exemplos de tais condições são fornecidos aqui e incluem, por exemplo, hiperglicemia, diabetes tipo 2, tolerância à glicose em jejum comprometida, Tolerância à glicose diminuída e dislipidemia. A administração semanal ou mensal da proteína de ligação a antígeno continuaria até que o resultado desejado fosse obtido, por exemplo, os sintomas do sujeito cedessem. 0 tratamento pode ser retomado se necessário ou, alternativamente, doses de manutenção podem ser administradas.
Os níveis glicêmicos de um sujeito podem ser monitorados antes, durante e/ou após o tratamento com uma proteína de ligação a antígeno tal como um anticorpo humano, para detectar alterações, se houver, em seus níveis. Para alguns distúrbios, a incidência de glicemia elevada pode variar de acordo com fatores tais como o estágio da doença. As técnicas conhecidas podem ser empregadas para medir os níveis glicêmicos. Os níveis de glucagon podem também ser medidos no sangue do paciente usando as técnicas conhecidas, por exemplo, ELISA.
As configurações particulares dos métodos e composições da invenção envolvem o uso de uma proteína de ligação a antigeno tal como um anticorpo humano e um ou mais antagonistas ao glucagon, por exemplo, duas ou mais proteínas de ligação a antigeno da invenção, ou uma proteína de ligação a antigeno e um ou mais antagonistas ao glucagon. Em configurações adicionais, a as proteínas de ligação a antigeno são administradas isoladamente ou em combinação com outros agentes úteis para o tratamento da condição que aflige o paciente. Exemplos de tais agentes incluem tanto medicamentos proteináceos como não-proteináceos. Quando múltiplos agentes terapêuticos são administrados, as dosagens podem ser ajustadas de forma adequada, como é reconhecido na técnica pertinente. "Co-administração" e terapia de combinação não são limitadas à administração simultânea, mas também incluem regimes nos quais uma proteína de ligação a antigeno é administrada pelo menos uma vez no decorrer do tratamento que envolve a administração de pelo menos um outro agente terapêutico ao paciente.
Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para preparar um medicamento para o tratamento do diabetes tipo 2, hiperglicemia, síndrome metabólica, dislipidemia e distúrbios associados consistindo na admistura de uma proteína de ligação a antigeno da presente invenção, por exemplo, um anticorpo humano, em um excipiente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento do diabetes tipo 2 e distúrbios associados. Os métodos para preparar medicamentos são descritos acima.
Terapias de combinação
Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para tratar um sujeito com diabetes com uma proteína de ligação a um método para tratar um sujeito com diabetes com um antigeno terapêutico da presente invenção, tal como os anticorpos terapêuticos totalmente humanos aqui descritos, juntamente com um ou mais outros tratamentos.
Em uma configuração, essa terapia de combinação consegue um efeito sinérgico. As proteínas de ligação a antigeno podem ser combinadas com um ou mais dos seguintes tratamentos para o diabetes tipo 2 atualmente disponíveis. Estes incluem biguanida (metaformina) e sulfoniluréias (tal como a gliburida, glipizida). Os tratamentos adicionais dirigidos à manutenção da homeostasia, incluem os antagonistas PPAR gama (pioglitazona, rosiglitazona); e inibidores da alfa glicosidase (acarbose, voglibose). Tratamentos adicionais incluem tratamentos injetáveis tal como Exenatide® (peptídeo similar ao glucagon) e Symlin® (pramlintida).
Tendo sido descrita a invenção, os seguintes exemplos são oferecidos como ilustração e não como limitação.
Exemplos
Exemplo 1: preparação do antigeno
O cDNA do GCGR que codifica o receptor de glucagon de 477 aminoácidos de comprimento total (N- de ID da SEQ: 2) foi subclonado em um vetor de expressão pDC312 e transfectado em células AMID. Após a seleção e clonagem de uma única célula, um único clone (clone 1004) foi escolhido para caracterização adicional baseada na expressão da superfície celular do receptor. 0 nível de expressão do receptor (Braax) determinado por análise da ligação por saturação foi 11,4 pmole de receptor de glucagon/mg de proteína de membrana.
Além disso, uma seqüência de cDNA que codifica um GCGR N-terminal (aminoácido 1 a 142 do N- de ID da SEQ: 2) foi fundida na estrutura com o cDNA de IgGl Fc humana e subclonada no vetor pDsRa21 (descrito no U.S. 2005/0118 643). Um grupo estável de células foi selecionado após a transfecção em células AMID. O Fc do GCGR N-terminal foi purificado do meio condicionado concentrado através de coluna de Proteína A Fast flow recombinante (GE Healthcare) seguida de coluna de troca aniônica Source 30Q (GE Healthcare).
Exemplo 2: Geração de Hibridoma de Camundongo
anti-Humano
Frações de membrana celular natural do clone 1004 descrito acima foram usadas como antigeno para imunização tanto convencional como por RIMMS (Imunização rápida com Injeção em Múltiplos Sítios) de camundongo C57BL/6 ou DBFl (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Após várias sucessões de imunização, os linfócitos foram liberados dos nódulos linfáticos (imunização por RIMMS) ou do baço (imunização convencional) e foram fundidos com células de mieloma de camundongo, Sp2/0-Agl4 (ATCC) por eletrofusão. As células fundidas foram semeadas em placas de 96 poços na densidade de 2x10" células/poço em 100 μΐ de meio BD suplementado com FBS a 10 %, Origen Cloning Factor a 5% (BioVeris™), Ix Penicilina-Estreptocmicina-Glutamina (Gibco) e IxOPI (oxaloacetato, piruvato e insulina, Sigma) . Após 24 h em cultura, foram adicionados 100 μΐ de 2x HAT (0,1 mM de hipoxantina, 0,16 mM de timidina, 4 mM de aminopterina, Sigma) a cada poço. 0 meio foi trocado 7 dias e 10 dias após a fusão, respectivamente, e os meios condicionados foram coletados dois dias após a 2- troca dos meios e enviados para seleção primária conforme descrito abaixo.
Os sobrenadantes do hibridoma foram submetidos ao ELISA (Ensaio Imunoenzimático) ou ao FMAT (Fluorimetria de Microvolume) com a célula 1004 e paralelamente com células AMID originais. Os clones de hibridoma contendo anticorpos específicos para GCGR foram selecionados com base na ligação específica à 1004 mas não à AMID.
Os anticorpos monoclonais foram parcialmente purificados das culturas de hibridoma expandidas conforme descrito abaixo e dosados usando ensaios tanto de ligação em células (ELISA ou FMAT) como funcionais para neutralização da produção de cAMP induzida pelo glucagon, conforme descrito abaixo. Os clones positivos foram expandidos, clonados em uma única célula e adicionalmente confirmados por múltiplos ensaios.
Exemplo 3: Geração de anticorpos Totalmente
Humanos
A preparação de membrana celular natural derivada da linhagem celular 1004 de maior expressão do GCGR humano foi utilizada como antígeno para imunizar IgG2 e IgG4 XenoMouse® (Abgenix, agora Amgen, Inc.) de acordo com os protocolos descritos, por exemplo no U.S. 05/0118643 e WO 05/694879, WO 98/24838, WO 00/76310 e na Patente Norte-americana 7.064.244, todos aqui incorporados por referência. Foi conduzido um total de duas campanhas. Após a imunização inicial, sucessões subsequentes de imunizações de reforço foram administradas até ser obtido um título de anticorpos adequado. Os animais exibindo um título adequado foram identificados e os linfócitos foram obtidos da drenagem dos nódulos linfáticos e, se necessário, agrupados de cada coorte. Em alguns casos, os linfócitos foram dissociados do tecido linfóide por desgaste com meio adequado (por exemplo, DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar as células do tecido. Células B foram selecionadas e fundidas com parceiros de fusão adequados, por exemplo, células P3X63Ag8.653 de mieloma não- secretórias (American Type Culture Collection CRL 1580, Kerney et al, J. Immunol. 123, 1548-1550 (1979)), conforme descrito nas referências acima. Outros parceiros de fusão adequados incluem as células Sp2/0-Agl4 (ATCC). As células fundidas foram granuladas e ressuspensas em meios de seleção (normalmente, DMEM contendo azaserina e hipoxantina e outros materiais suplementares), incubadas por 20-30 minutos e então ressuspensas em meios de seleção e cultivadas antes do plaqueamento. As células foram então distribuídas nos poços para maximizar a clonicidade e cultivadas usando as técnicas padrão. Após a cultura, os sobrenadantes do hibridoma foram selecionados em comparação com o clone celular 1004 de receptor de glucagon enriquecido e as linhagens celulares originais AMID usando o FMAT. Os ligadores específicos ao GCGR foram subseqüentemente confirmados por análise em FACS com o anticorpo anti-IgG humano marcado com FITC (conjugado de isotiocinato de fluoresceína). Os clones do hibridoma contendo anticorpos monoclonais específicos para o receptor foram expandidos de acordo com os protocolos descritos no U.S 2005/0118643 e outras referências citadas acima. Os sobrenadantes foram testados para a inibição da produção de cAMP induzida pelo glucagon conforme descrito abaixo. Os clones de hibridoma contendo o anticorpo antagonista foram clonados em uma única célula e expandidos para mais testes. Os anticorpos foram então purificados conforme descrito abaixo e os anticorpos purificados desses clones únicos foram então testados novamente para a atividade neutralizante.
Os anticorpos foram purificados dos meios condicionados dos hibridomas usando resina Mab Select (GE Healthcare). 100 μΐ de uma pasta 1:2 de resina Mab Select equilibrada em PBS foram adicionados entre 7 e 10 ml de meio condicionado (CM). Os tubos foram colocados em rotatores a 4-8 0C durante a noite. Os tubos foram centrifugados a 1.000 X g por 5 minutos e a fração não-ligada foi decantada. A resina foi lavada com 5 ml de PBS e centrifugada e decantada conforme acima. A resina foi então transferida para um tubo SPIN-X, de 0,45 μιτι, 2 ml. A resina foi lavada mais duas vezes com 0, 5ml de PBS e centrifugada. Os anticorpos monoclonais foram eluidos com 0,2ml de ácido acético 0,1M incubando à temperatura ambiente com mistura ocasional por 10 minutos. Os tubos foram centrifugados e 30 μΐ de tampão Tris IM pH 8,0 foram adicionados ao eluato. Os anticorpos purificados foram armazenados a 4-80C.
Exemplo 4: Caracterização in vitro dos Ensaios de Ligação Anticorpo/Receptor dos Anticorpos: ELISA em Células Inteiras
Células CHO com superexpressão de GCGR (clone 1004) e células originais (AMID) foram semeadas em microplacas com até 90% de confluência. As células foram bloqueadas com BSA e incubadas com os sobrenadantes dos hibridomas a 4 0C por 90 minutos. Após lavagem intensa, as células foram incubadas com Fc- HRP de detecção de IgG de anticorpo anti-murina de cabra (Pierce) e lavadas por três vezes. 50 ul/poço de substrato de TMB (KPL) foram adicionados e deixados incubar à temperatura ambiente por 5- min. A reação foi interrompida com a adição de 50 ul de H2S04 0, 5N e a placa foi lida a 450 nm em um SpectraMax (Molecular Devices). Os soros dos camundongos imunizados com membrana de GCGR foram usados como controles positivos e os meios isoladamente como controle de fundo.
Ensaios de Ligação Anticorpo/Receptor: FMAT
As células CHO com super-expressão de GCGR (clone 1004) foram semeadas em microplacas de 96 poços com parede preta e fundo transparente (Applied Biosystems) em densidade sub- confluente (50-60%) e incubadas com os sobrenadantes do hibridoma à temperatura ambiente por 60 minutos. As imagens das células e a quantidade de fluorescência da ligação das células foram registradas com o FMAT após a incubação com anticorpo secundário marcado em azul (anti-IgG humano de cabra, Applied Biosystems) usando o 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems).
Ensaio Funcional em Célula
Os anticorpos anti-receptor de glucagon foram testados quanto à sua atividade neutralizante em um ensaio funcional em célula usando linhagens celulares funcionais estáveis. Construções de expressão (pcDNA3.1, Invitrogen) contendo cDNAs de GCGR de rato, cynomolgus, camundongo ou humanos (cDNAs codificando os N-s de ID da SEQ: 2, 4, 6, 8 respectivamente) foram transfectadas em células CHO Kl respectivamente, estabelecendo linhagens celulares estáveis. As linhagens celulares funcionais finais expressando GCGR das espécies mencionadas acima foram clonadas em uma única célula dos grupos transfectados e testadas para a produção de cAMP estimulada por glucagon. Com base na CE50 de cada linhagem individual, as linhagens celulares finais do ensaio foram selecionadas e guardadas em banco para uso futuro.
0 seguinte protocolo foi usado para determinar o Kb, ou a constante de dissociação da ligação do anticorpo calculada pela análise de Schild com base no deslocamento da curva dose-resposta na presença de um antagonista, em um ensaio da competição da ligação. O uso da análise de Schild é descrito por Lazaeno et al, Br. J. Pharmacol. 109 (4): 1110-9 (1993), que é aqui incorporado por referência. Esse ensaio é adaptado do uso para moléculas pequenas para uso com os anticorpos deste. Tanto o sobrenadante dos hibridomas como os anticorpos purificados foram testados usando o protocolo abaixo.
0 kit HTRF (Homogeneous Time-Resolved
Fluorescence)-cAMP Dynamic da Cisbio foi utilizado para o ensaio funcional. Os sobrenadantes dos hibridomas dos clones que mostraram ligação especifica ao GCGR humano no ensaio de ligação foram primeiro selecionados usando o ensaio funcional. Os anticorpos foram então purificados dos meios condicionados dos hibridomas e testados novamente para os valores de Kb e CI50. Os anticorpos antagonistas do glucagon, capazes de inibir a produção de c AM P após a estimulação com glucagon podem ser identificados usando este processo.
A linhagem celular funcional estável selecionada conforme descrito acima foi semeada em meia placa de 96 poços. 0 anticorpo anti GCGR foi adicionado aos poços e incubado a 370C por minutos seguido da adição de glucagon (Calbiochem) e incubação a 370C por mais 15 minutos. Após a adição de conjugado de cAMP em tampão de Iise e então anti-cAMP-criptato (anticorpo contra conjugado de cAMP para criptato) aos poços, a placa foi incubada à temperatura ambiente por 1 hora antes de ser lida com RubyStar (leitora de microplaca por fluorescência da BMG Labtech).
Os anticorpos purificados foram inicialmente testados na concentração de 2 uM com a linhagem celular funcional de GCGR humano. As células foram estimuladas com 50 pM de glucagon e os anticorpos que mostraram forte atividade inibitória foram selecionados para a determinação da CI50, que é definida como a concentração de anticorpos necessária para inibir metade da resposta máxima na linha basal. Os anticorpos foram testados a partir da concentração de 1 uM seguida de diluição seriada seqüencial de 2 vezes. A curva dose-resposta foi representada graficamente e a CI50 foi determinada usando o software GraphPad Prism. Os anticorpos com baixa CI50 para o GCGR humano foram selecionados e testados ainda para as atividades de receptor entre espécies usando as linhagens celulares apropriadas.
CI50 dos anticorpos humanos nos ensaios
funcionais
CI50(HM) Anticorpo Humano Macaco Cynomolgus Murino Rato A-3 99,1 222, 5 44,9 113,5 A-4 118,1 552, 1 110,1 117,2 A-9 77,4 226, 6 44,1 99, 9
Para determinar a potência relativa dos
anticorpos anti-GCGR humanos entre as diferentes espécies, foi realizada a análise de Schild para cada um dos anticorpos humanos selecionados. Resumidamente, os anticorpos em diferentes concentrações foram testados na presença de uma diluição seriada de glucagons, de 100 nM a 10 fM. As curvas de dose-resposta do glucagon em diferentes concentrações de anticorpos foram representadas em gráfico usando o software GraphPad Prism. O pA2, que é um logaritmo negativo da concentração de anticorpos necessária para causar um deslocamento de 2 vezes para a direita da curva dose-resposta do glucagon, foi calculado para o anticorpo. Quando a inclinação de Schild é igual a 1, o pA2 é igual ao pKb, a constante de dissociação da ligação do anticorpo. Em seguida, o Kb é derivado por anti-log de pKb e pode ser usado diretamente para comparar a potência relativa do anticorpo individual entre as espécies.
Anticorpos adicionais foram testados para a
atividade contra o GCGR humano.
Anticorpo IC50 (nM) A-I 5,0 A-2 10,1 A-5 13,3 A-6 32, 2 A-7 8,8 A-8 0,4 A-IO Nenhuma atividade A-Il 16, 7 A-12 21,3 A-13 72, 6 A-14 457, 5 A-15 11,3 A-16 Nenhuma atividade A-17 Nenhuma atividade A-18 203,7 A-19 Nenhuma atividade A-20 Nenhuma atividade A-21 47,2 A-22 7,2 A-23 Nenhuma atividade
Valores de Kb determinados pela Análise de Schild
Kb (nM) Humano Macaco Cynomolgus Murino Rato A-3 1,6 5,0 0,5 3,2 A-4 1,76 5,7 0,88 ND
Exemplo 5: Expressão Recombinante e Purificação
dos Anticorpos
Desenvolvimento de Anticorpos Expressando Linhagem Celular Estável
Primers [Preparadores] PCR foram designados para capturar a estrutura completa de leitura aberta da cadeia leve e o peptideo do sinal e a região variável da estrutura de leitura aberta da cadeia pesada com base nas seqüências de DNA de cada anticorpo fornecido pela Abgenix. 0 peptideo de sinal e a região variável completa da cadeia leve e da cadeia pesada mais a região constante da IgG2 humana foram ligados nos vetores de expressão pDC323 e pDC324 respectivamente.
Como exemplo dos conjuntos de primers PCR, o primer da cadeia leve 5' A-9 foi o 4337-12 (5'-AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG-3') (N- de ID da SEQ: 313) que contém o sitio da enzima de restrição SalI, um códon de terminação na estrutura, a seqüência de Kozak e os códigos dos aminoácidos MDMRVPAQLL (N- de ID da SEQ: 314) e o primer 3' 3250-80 (5'-AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA-3' ) (N- de ID da SEQ: 315) que contém o sitio da enzima de restrição Notl, o códon de terminação e os códigos para os aminoácidos FNRGEC (N- de ID da SEQ: 316) . 0 primer da cadeia pesada 5' A-9 foi o 3444-34 (5'-AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC-3') (N- de ID da SEQ: 317) que contém o sitio da enzima de restrição SalI, um códon de terminação na estrutura, a seqüência de Kozak e os códigos para os aminoácidos MEFGLSWVF (N2 de ID da SEQ: 318), o preparador de filamento ( + ) 4341-29 (5'-GAC CAC GGT CAC CGT CTC CTC AGC CTC CAC CAA GGG CCC ATC GGT CTT-3') (N- de ID da SEQ: 319) da junção da região variável da cadeia pesada A-9/IgG2 e seu preparador de filamento (-) complementar 4341-30 (5'-AAG ACC GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACC GTG GTC-3') (N5 de ID da SEQ: 320) que codificam os aminoácidos GTTVTVSSASTKGPSVF (N5 de ID da SEQ: 321) e o preparador 3' 3250-79 (5'-AAC CGT TTA AAC GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GA-3') (N- de ID da SEQ: 322) que contém o sitio da enzima de restrição Notl, o códon de terminação e os códigos para os aminoácidos SLSPGK (N- de ID da SEQ: 323).
As células hospedeiras CHO usadas para a transfecção do(s) plasmídeo(s) anti-expressão de GCGR são linhagens celulares CHO derivadas das células DXB-Il (Urlaub et al, PNAS US 77:4126-4220,(1980)) através de adaptação para meio isento de soro (Rasmussen et al, Cytotechnology 28:31-42, 1998).
As linhagens celulares anti-GCGR foram criadas transferindo-se células hospedeiras com os plasmideos de expressão pDC323-anti-GCGR kappa e pDC324- [anti-GCGR-IgG2] usando um procedimento de eletroporação padrão. Após a transfecção da linhagem celular hospedeira com os plasmideos de expressão as células foram cultivadas em meio de seleção (sem GHT) contendo 4% de soro bovino fetal dializado (ds ou dfFBS) por 2-3 semanas para permitir a seleção do plasmideo e a recuperação das células. 0 soro foi então removido do meio e as células foram cultivadas em meio -GHT até atingirem viabilidade de >85%. Esse grupo de células transfectadas foi então cultivado em meio contendo 150 nM de MTX.
Clonagem da Linhagem Celular
Um banco de células foi feito com os clones selecionados de acordo com o seguinte procedimento. A etapa de clonagem assegura que foram geradas populações clonais e bancos de células que permitam um desempenho reprodutivel na fabricação comercial. Um grupo amplificado de células expressando anticorpos foi semeado sob diluição limitada em placas de 96 poços e os clones candidatos foram avaliados quanto ao crescimento e desempenho da produtividade em estudos em pequena escala.
Exemplo 6: Atividade In vivo em Camundongos ob/ob
Camundongos ob/ob machos de 12 semanas (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) foram injetados IP com um tampão ou o anticorpo 3 ou 4 na dose de 1 ou 3 mg/kg (n=8-10/grupo) . A glicemia foi medida no momento O e em 24, 48, 72, 96, 120, 144, 192 e 240 horas após uma injeção única de anticorpo. A glicemia foi reduzida com o anticorpo 3 por 8 dias a uma dose de 3 mg/kg de
anticorpo como é mostrado na Figura 1.
Similarmente, camundongos ob/ob machos de 12 semanas (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) foram injetados IP com um tampão ou o anticorpo 3 ou 9 na dose de 1 ou 3 mg/kg (n=8-10/grupo) . A glicose foi medida no momento 0 e 24, 72, 120, 192 e 240 horas após uma injeção única de anticorpo. A glicemia foi reduzida com o anticorpo 3 e 9 por 8 dias a uma dose de 3 mg/kg de anticorpo como é mostrado na Figura 2.
Exemplo 7: Eficácia in vivo em macacos cynomolgus
machos normais
A eficácia de uma dose subcutânea (SC) única de anticorpo A-9 foi avaliada em 35 macacos cynomolgus machos no Yunnan Primate Center (Yunnan, China). Testes de tolerância à glicose (GTT) foram realizados nos macacos testando a eliminação da glicose do sangue após provocação com uma dose oral de glicose. Os dados do GTT são apresentados como AUC (área sob a curva) , como é mostrado na Figura 3, representando a eliminação da glicose medida pela quantidade de glicose sangüínea em 0, 30 e 90 minutos após a provocação. Como mostra a Figura 3, o GTTl pré-dose foi administrado de modo escalonado iniciando 24 dias antes da administração do anticorpo, o GTT2 pré-dose foi administrado de modo escalonado iniciando 17 dias antes de uma dose única. O anticorpo foi administrado em injeção subcutânea (SC) única de um total de 3 ou 30 mg/kg de anticorpo A-9 ou um controle a 30 macacos cynomolgus machos. O GTT3 foi administrado aos macacos 3 dias após a injeção, o GTT4 foi administrado 8 dias após a injeção e o GTT5 foi administrado 17 dias após a injeção. Os resultados, mostrados na Figura 3, foram que uma injeção SC única de 3 ou 30 mg/kg de anticorpo 9 melhorou a eliminação da glicose durante um
teste de tolerância à glicose. Exemplo 8: Ensaios de ligação competitiva
Vários dos anticorpos da presente invenção foram isolados em compartimentos ["binned"] usando um ensaio de ligação competitiva para determinar quais anticorpos competiam entre si pela ligação com um anticorpo anti-GCGR de referência marcado. 0 anticorpo A-3 foi marcado com corante fluorescente Alexa (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) como tracer [rastreável] , preparado de acordo com as instruções do fabricante. Cada anticorpo foi analisado em uma faixa de dose quanto à sua habilidade de competir com o anticorpo A-3 fixo em uma concentração de 1 nM para a ligação ao receptor de GCGR humano expresso nas células CHO (conforme descrito acima). A intensidade fluorescente foi medida por FMAT conforme descrito no Exemplo 4 e foi calculada a extensão da inibição da ligação do A-3 com Alexa ao receptor. Três grupos de anticorpos podem ser categorizados com base nessas análises. Eles são os anticorpos sobreponiveis, parcialmente sobreponiveis ou não-sobreponíveis ao competir com o A-3 com Alexa. Os anticorpos sobreponiveis são capazes de competir pela ligação com o A-3, enquanto que os anticorpos não- sobreponíveis não conseguem competir e parecem ter diferentes sítios de ligação no GCGR humano. Os anticorpos parcialmente sobreponiveis têm alguma sobreposição do sítio de ligação com o A- 3. Esses são mostrados nas Figuras 4-6. Foi concluído que os anticorpos testados que são capazes de competir pela ligação com o A-3 com Alexa A-3 (sobreponiveis) são A-ll, A-2, A-7, A 12, A 17, A-6, A-8, A-15 e A-5. Os anticorpos testados e considerados como somente parcialmente capazes de competir pela ligação com o A-3 com Alexa (parcialmente sobreponiveis) são A-16, A-14, A-20 e A- 23. Os anticorpos testados e considerados como não capazes de competir pela ligação com o A-3 com Alexa são o A-19 e o A-IO. Foi observado que todos ou a maioria dos anticorpos sobreponiveis mostram atividade inibitória no ensaio em célula (CI50), enquanto que os anticorpos parcialmente sobreponiveis e os não- sobreponiveis não mostraram atividade usando este ensaio.
Exemplo 9: Construção de Receptores Quiméricos 0 GCGR humano é principalmente homólogo ao receptor de GLP-I humano e ambos pertencem à família B de GPCR com 3 pares de cisteínas na seção N-terminal dos receptores. Para determinar a região ou sítio no GCGR humano ao qual os anticorpos humanos que estão sendo testados se ligam e determinar a importância da conformação mantida pelos três pares de cisteínas que formam as ligações dissulfídicas umas com as outras, múltiplas construções de receptor quimérico entre o GCGR humano e o GLP-IR humano (GLP-1R, número da autorização NP_002053) foram geradas e expressas nas células. Estas são mostradas na Figura 7. As seqüências de quimeras do GCGR humano são indicadas na Figura 7. Por exemplo, ma quimera 4 mostrada na parte superior da Figura, os aminoácidos 1-142 são do GCGR humano e o restante do receptor de GLP-I. A quimera 4 contém os três pares de cisteínas intactas. Mutações pontuais em pares de cisteínas (Cys 1-3, Cys 2-5 ou Cys 4-6) foram introduzidas na quimera 4 e, portanto, as três quimeras subsequentes, quimera-4 ICA, 3CA; 4 2CA, 5CA e 4 4CA, 6CA têm cada uma os pares de cisteina rompidos. A quimera-7 tem os aminoácidos 1-79 do GCGR humano; a quimera-8 tem os aminoácidos 80-477 do GCGR humano; a quimera-10 tem os aminoácidos 80-142 do GCGR humano; a quimera-15 tem os aminoácidos 80-119 do GCGR humano; a quimera-19 tem os aminoácidos 1-119 e 143-477 do GCGR humano. A expressão dos receptores da superfície da célula foi monitorada pela fusão da proteína fluorescente no C-terminal da estrutura. A ligação do anticorpo ao receptor da quimera específica foi medida diretamente pelo FMAT com o anticorpo A-3 de referência marcado com Alexa. Como é mostrado na Fig 7, todos os anticorpos testados aqui requerem N-terminais do GCGR humano (aminoácido 1-142) para a ligação. Os anticorpos A-18, A-21 e A-IO se comportaram similarmente visto que exibiram ligar somente a quimera-4 com os três pares de cisteina intactos. Isto indica um epítopo conformacional para esses anticorpos. Para o anticorpo A-3, a seqüência de aminoácidos de 80 a 119 do GCGR humano é necessária e suficiente para a ligação do anticorpo. Além disso, foi demonstrado que os aminoácidos 120-142 do GCGR humano não são necessários para a ligação do A-3. Além do mais, para o anticorpo A-3, a conformação é mantida pelo 2- e 32 pares (Cys 2-5, Cys 4-6) , mas não pelo I2 par de cisteínas. Portanto, a área do receptor em que o anticorpo A-3 e todos os anticorpos que têm reação cruzada com o A-3 se ligam ao GCGR humano é dentro dos aminoácidos Ser80 a Ser 119 do GCGR humano.
Cada referência citada aqui é incorporada por referência na sua totalidade para tudo que ela instrui e para todas as finalidades.
A presente invenção não é limitada em escopo pelas configurações específicas aqui descritas, cujo propósito é a ilustração simples dos aspectos individuais da invenção e métodos e componentes funcionalmente equivalentes da invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes para aqueles habilitados na técnica através da descrição precedente e desenhos que a acompanham. Tais modificações têm o propósito de cair dentro do escopo das reivindicações anexadas. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> AMGEN INC. YAN, HAI
HU, SHAW-FEN SYLVIA BOONE, THOMAS C. LINDBERG, RICHARD A.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO GLUCAGON RECEPTOR ANTIBODIES
<130> A-1133-WO-PCT
<140> to be assigned <141> 2007-09-19
<150> 60/846,202 <151> 2006-09-20
<150> 60/968,977 <151> 2007-08-30
<160> 324
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1519
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gtgcagcccc tgccagatgt gggaggcagc tagctgccca gaggcatgcc cccctgccag 60
ccacagcgac ccctgctgct gttgctgctg ctgctggcct gccagccaca ggtcccctcc 120
gctcaggtga tggacttcct gtttgagaag tggaagctct acggtgacca gtgtcaccac 180
aacctgagcc tgctgccccc tcccacggag ctggtgtgca acagaacctt cgacaagtat 240
tcctgctggc cggacacccc cgccaatacc acggccaaca tctcctgccc ctggtacctg 300
ccttggcacc acaaagtgca acaccgcttc gtgttcaaga gatgcgggcc cgacggtcag 360
tgggtgcgtg gaccccgggg gcagccttgg cgtgatgcct cccagtgcca gatggatggc 420
gaggagattg aggtccagaa ggaggtggcc aagatgtaca gcagcttcca ggtgatgtac 480 acagtgggct acagcctgtc cctgggggcc 540
ctcagcaagc tgcactgcac ccgcaatgcc 600
ctgaaagcca gctccgtgct ggtcattgat 660
attggcgacg acctcagtgt cagcacctgg 720
gtggccgcgg tgttcatgca atatggcatc 780
ggcctgtacc tgcacaacct gctgggcctg 840
ctctacctgg gcatcggctg gggtgccccc 900
aagtgtctgt tcgagaacgt ccagtgctgg 960
atcctgcggt tccccgtctt cctggccatc 1020
gttcagctgc tcgtggccaa gctgcgggca 1080
cggctggcca agtccacgct gaccctcatc 1140
gccttcgtga cggacgagca cgcccagggc 1200
ctcttcctca gctccttcca gggcctgctg 1260
gaggtgcagt cggagctgcg gcggcgttgg 1320
gaggagcgga acaccagcaa ccacagggcc 1380
aaggagctgc agtttgggag gggtggtggc 1440
gctggtggcc tccctagatt ggctgagagc 1500
ctgctcctcg ccttggccat cctggggggc atccacgcga atctgtttgc gtccttcgtg gggctgctca ggacccgcta cagccagaaa ctcagtgatg gagcggtggc tggctgccgt gtggccaact actgctggct gctggtggag gccaccctcc ccgagaggag cttcttcagc atgctgttcg tcgtcccctg ggcagtggtc accagcaatg acaacatggg cttctggtgg ctgatcaact tcttcatctt cgtccgcatc cggcagatgc accacacaga ctacaagttc cctctgctgg gcgtccacga agtggtcttc accctgcgct ccgccaagct cttcttcgac gtggctgtcc tctactgctt cctcaacaag caccgctggc gcctgggcaa agtgctatgg tcatcttcgc ccggccacgg ccctcccagc agccaggatt catctgcgga gacccccttg cccttctgaa ccctgctggg accccagcta
gggctggact ctggcaccc 1519 <210> 2 <211> 477 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2
Met Pro Pro Cys Gln Pro Gln Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 10 15
Leu Ala Cys Gln Pro Gln Val Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu 25 30
Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser 40 45
Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys 50 55 60
Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser 65 70 75 80
Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gln His Arg Phe Val
85 90 95
Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly 100 105 110
Gln Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Gly Glu Glu Ile 115 120 125
Glu Val Gln Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met 130 135 140
Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu 145 150 155 160
Ala Ile Leu Gly Gly Leu Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile
165 170 175
His Ala Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu 180 185 190 Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly Asp 195 200 205
Asp Leu Ser Val Ser Thr Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys 210 215 220
Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gln Tyr Gly Ile Val Ala Asn Tyr Cys 225 230 235 240
Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala
245 250 255
Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp 260 265 270
Gly Ala Pro Met Leu Phe Val Val Pro Trp Ala Val Val Lys Cys Leu 275 280 285
Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp 290 295 300
Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe 305 310 315 320
Ile Phe Val Arg Ile Val Gln Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg
325 330 335
Gln Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu 340 345 350
Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe Val 355 360 365
Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Ala Lys Leu Phe Phe 370 375 380
Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr 385 390 395 400
Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Leu Arg Arg Arg Trp His
405 410 415 Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Trp Glu Glu Arg Asn Thr Ser Asn
His Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly His Gly Pro Pro Ser Lys Glu Leu 435 440 445
Gln Phe Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu Thr Pro 450 455 460
Leu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala Glu Ser Pro Phe 465 470 475
<210> 3 <211> 1880 <212> DNA <213> Mus musculus
<400> 3
cgcgaggagc gcagccctag ccccggcgac tgagcacacc tgaggagagg tgcacacact 60
ctgaggacct aggtgtgcaa cctctgccag atgtggggcg tggctaccca gaggcatgcc 120
cctcacccag ctccactgtc cccacctgct gctgctgctg ttggtgctgt catgtctgcc 180
agaggcaccc tctgcccagg taatggactt tttgtttgag aagtggaagc tctatagtga 240
ccaatgccac cacaacctaa gcctgctgcc cccacctact gagctggtct gtaacagaac 300
cttcgacaag tactcctgct ggcctgacac ccctcccaac accactgcca acatttcctg 360
cccctggtac ctaccttggt accacaaagt gcagcaccgc ctagtgttca agaggtgtgg 420
gcccgatggg cagtgggttc gagggccacg ggggcagccg tggcgcaacg cctcccaatg 480
tcagttggat gatgaagaga tcgaggtcca gaagggggtg gccaagatgt atagcagcca 540
gcaggtgatg tacaccgtgg gctacagtct gtccctgggg gccttgctcc ttgcgctggt 600
catcctgctg ggcctcagga agctgcactg cacccgaaac tacatccatg ggaacctgtt 660 tgcgtccttt gtgctcaagg
gtacagccag aagattggcg 780
ggccggctgc agagtggcca 840
gttgctggta gagggcgtgt 900
gagcttcttt tccctctacc 960
ctgggtggtg gtcaagtgtc 1020
gggattctgg tggatcctgc 1080
ctttgtccac atcattcacc 1140
tgactataag ttccggctgg 1200
cgaggtggtc tttgcctttg 1260
gctctttttt gacctgttcc 1320
tttcctcaac aaggaggtgc 1380
caaagctctt caggaggaaa 1440
gccttgtcat ggtgatccct 1500
gactggctgt gtgccctcta 1560
cagccccacc tgaatctcca 1620
gacaacccag agccagatgc 1680
tgtactgtgc acactcccct 1740
ctggctctgt gttggtcatc atgacctcag tgtgagcgtc cagtgatcat gcagtacggc acctgtacag cctgctgagc tgggcattgg ctggggtgcg tgtttgagaa tgttcagtgc gtattcctgt cttcctggcc ttcttgtggc caagctgcgt ccaggtccac gctgaccctc tgactgacga gcatgcccaa tcagctcctt ccagggtctg aggcagagct gatgcggcgt ggttggccag cagccatggc gtgagaaact tcagcttatg tggagacctc gctggccagt ctggagccta gccaggctgc ccggccaagg ctgaagagac aacctgtcct agcctggcac
gattggctgc tgaagacacg
tggctcagtg acggggcgat
atcatagcca actattgctg
cttgccacct tctctgagag
cccctgctgt ttgtcatccc
tggaccagca atgacaacat
ttactgatca attttttcat
gcccatcaga tgcactatgc
atccctctgc tgggggtcca
ggcaccctgc gctccaccaa
ctggtggctg ttctctactg
tggaggcaat ggcaagaagg
agccacatgg ccccagcagg
agtgcaggca gcagcagtgg
agtctcccaa ggttggctga
gttcagaaag ggcctcagag
aaagcagcaa gacagcagct
aggccacagt gacagagtag gggttggata tgatggagaa gccatgttat ctatgaactc tgagtgttcc catgtgtgtt 1800
gacatggtcc ctgtacccag atatgtcctt cagtaaaaag ctcgagtggg agctgctgca 1860
caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1880
<210> 4 <211> 485 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Met Pro Leu Thr Gln Leu His Cys Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu 10 15
Val Leu Ser Cys Leu Pro Glu Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe 25 30
Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gln Cys His His Asn Leu 40 45
Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp 50 55 60
Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Ala Asn Ile 65 70 75 80
Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gln His Arg Leu
85 90 95
Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg 100 105 110
Gly Gln Pro Trp Arg Asn Ala Ser Gln Cys Gln Leu Asp Asp Glu Glu 115 120 125
Ile Glu Val Gln Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Gln Gln Val 130 135 140
Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala 145 150 155 160 Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr
165 170 175
Ile His Gly Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Gly Ser Val 180 185 190
Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly 195 200 205
Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp Gly Ala Met Ala Gly 210 215 220
Cys Arg Val Ala Thr Val Ile Met Gln Tyr Gly Ile Ile Ala Asn Tyr 225 230 235 240
Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Leu
245 250 255
Ala Thr Phe Ser Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly 260 265 270
Trp Gly Ala Pro Leu Leu Phe Val Ile Pro Trp Val Val Val Lys Cys 275 280 285
Leu Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe 290 295 300
Trp Trp Ile Leu Arg Ile Pro Val Phe Leu Ala Leu Leu Ile Asn Phe 305 310 315 320
Phe Ile Phe Val His Ile Ile His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala
325 330 335
His Gln Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr 340 345 350
Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe 355 360 365
Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe 370 375 380 Phe Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu 385 390 395 400
Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ala Glu Leu Met Arg Arg Trp
405 410 415
Arg Gln Trp Gln Glu Gly Lys Ala Leu Gln Glu Glu Arg Leu Ala Ser 420 425 430
Ser His Gly Ser His Met Ala Pro Ala Gly Pro Cys His Gly Asp Pro 435 440 445
Cys Glu Lys Leu Gln Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly 450 455 460
Cys Val Pro Ser Met Glu Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu 465 470 475 480
Ala Asp Ser Pro Thr
485
<210> 5 <211> 1875 <212> DNA
<213> Rattus norvegicus <400> 5
gaattcgcgg ccgccgccgg gccccagatc ccagtgcgcg aggagcccag tcctagaccc 60
agcaacctga ggagaggtgc acacaccccc aaggacccag gcacccaacc tctgccagat 120
gtgggggggt ggctacccag aggcatgctc ctcacccagc tccactgtcc ctacctgctg 180
ctgctgctgg tggtgctgtc atgtctgcca aaggcaccct ctgcccaggt aatggacttt 240
ttgtttgaga agtggaagct ctatagtgac cagtgccacc acaacctaag cctgctgccc 300
ccacctactg agctggtctg caacagaact ttcgacaagt actcctgctg gcctgacacc 360 cctcccaaca ccactgccaa catttcctgc 420
cagcaccgcc tagtgttcaa gaggtgtggg 480
gggcagtcat ggcgcgacgc ctcccaatgt 540
aagggggtag ccaagatgta tagcagctac 600
tccctggggg ccttgctcct ggcgctggtc 660
acccggaact acatccacgg gaacctgttc 720
ctggtcattg attggctgct caagacacgc 780
gtgagcgtct ggctcagtga tggggcggtg 840
cagtacggca tcatagccaa ctactgctgg 900
ctgctgagca tcaccacctt ctcggagaag 960
tggggatctc ccctgctgtt tgtcatcccc 1020
gtccagtgct ggaccagcaa tgacaatatg 1080
ctcctggcca tactgatcaa ttttttcatc 1140
aagctgcgtg cccatcagat gcactatgct 1200
ctgaccctca ttcctctgct gggagtccac 1260
catgcccagg gcaccctgcg ctccaccaag 1320
cagggtctgc tggtggctgt tctctactgt 1380
ctgcggcgtt ggaggcgatg gcaagaaggc 1440
ccctggtacc taccttggta ccacaaagtg cctgatgggc agtgggttcg agggccacgg cagatggatg atgacgagat cgaggtccag caggtgatgt acactgtggg ctacagtctg atcctgctgg gcctcaggaa gctgcactgc gcgtccttcg tgctcaaggc tggctctgtg tatagccaga agattggaga tgacctcagt gctggctgca gagtggccac agtgatcatg ttgctggtgg agggtgtgta cctgtacagc agcttcttct ccctctatct gtgcatcggc tgggtggtgg tcaagtgtct gtttgagaat ggattctggt ggatcctgcg tatccctgta tttgtccgca tcattcatct tcttgtggcc gattacaagt tccggctagc caggtccacg gaagtggtct ttgcctttgt gactgatgag ctcttttttg acctgttctt cagctccttt ttcctcaaca aggaggtgca ggcagagcta aaagctcttc aggaggaaag gatggccagc agccatggca gccacatggc cccagcaggg acttgtcatg gtgatccctg tgagaaactt 1500
cagcttatga gtgcaggcag cagcagtggg actggctgtg agccctctgc gaagacctca 1560
ttggccagta gtctcccaag gctggctgac agccccacct gaatctccac tggactccag 1620
ccaagttgga ttcagaaagg gcctcacaag acaacccaga aacagatgcc tggccaaggc 1680
tgaagaggca aagcagcaag acagcagctt gtactatcca cactccccta acctgtcctg 1740
gccgggtaca ggccacattg atggagtagg ggctggatat gatggagtag ccatgctatg 1800
aactatgggt gttcccatga gtgttgccat gttccatgca cacagatatg accttcagta 1860
aagagctccc gtagg 1875
<210> 6 <211> 485 <212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 6
Met Leu Leu Thr Gln Leu His Cys Pro Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Val 10 15
Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe 25 30
Leu Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Asp Gln Cys His His Asn Leu 40 45
Ser Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp 50 55 60
Lys Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Pro Asn Thr Thr Ala Asn Ile 65 70 75 80
Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Tyr His Lys Val Gln His Arg Leu
85 90 95 Val Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg 100 105 110
Gly Gln Ser Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Asp Asp Glu 115 120 125
Ile Glu Val Gln Lys Gly Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Tyr Gln Val 130 135 140
Met Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala 145 150 155 160
Leu Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Tyr
165 170 175
Ile His Gly Asn Leu Phe Ala Ser Phe Val Leu Lys Ala Gly Ser Val 180 185 190
Leu Val Ile Asp Trp Leu Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly 195 200 205
Asp Asp Leu Ser Val Ser Val Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly 210 215 220
Cys Arg Val Ala Thr Val Ile Met Gln Tyr Gly Ile Ile Ala Asn Tyr 225 230 235 240
Cys Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Ser Ile
245 250 255
Thr Thr Phe Ser Glu Lys Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Cys Ile Gly 260 265 270
Trp Gly Ser Pro Leu Leu Phe Val Ile Pro Trp Val Val Val Lys Cys 275 280 285
Leu Phe Glu Asn Val Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe 290 295 300
Trp Trp Ile Leu Arg Ile Pro Val Leu Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe 305 310 315 320 Phe Ile Phe Val Arg Ile Ile His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala
325 330 335
His Gln Met His Tyr Ala Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Arg Ser Thr 340 345 350
Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Val Phe Ala Phe 355 360 365
Val Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Ser Thr Lys Leu Phe 370 375 380
Phe Asp Leu Phe Phe Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu 385 390 395 400
Tyr Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ala Glu Leu Leu Arg Arg Trp
405 410 415
Arg Arg Trp Gln Glu Gly Lys Ala Leu Gln Glu Glu Arg Met Ala Ser 420 425 430
Ser His Gly Ser His Met Ala Pro Ala Gly Thr Cys His Gly Asp Pro 435 440 445
Cys Glu Lys Leu Gln Leu Met Ser Ala Gly Ser Ser Ser Gly Thr Gly 450 455 460
Cys Glu Pro Ser Ala Lys Thr Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Arg Leu 465 470 475 480
Ala Asp Ser Pro Thr
485
<210> 7 <211> 1434 <212> DNA
<213> Macaca fascicularis <400> 7
atgcccccct gtcagccacg tcgacccctg ctactgttgc tgctgctgct ggcctgccag 60 ccacaggccc cctccgctca ggtgatggac 120
gaccagtgtc accacaacct gagcctgctg 180
accttcgaca agtattcctg ctggccagac 240
tgcccctggt acctgccttg gcaccacaaa 300
gggcccgatg gtcagtgggt gcgtggaccc 360
tgccagatgg acggcgagga gcttgaggtc 420
ttccaggtga tgtacacggt gggctacagc 480
gccatcctgg ggggcatcag caagctgcac 540
tttgtgtcct tcgtgctgaa ggccagctcc 600
cgctacagcc agaagattgg cgacgacctc 660
gtggccggct gccgtgtggc cgcggtgttc 720
tggctgctgg tggagggcct gtacctgcac 780
aggagcttct tcagcctcta cctgggcatc 840
ccctgggtgg tggtcaggtg tctgttcgag 900
atgggcttct ggtggatcct gcggttcccc 960
atcttcatcc gcattgttca cctgcttgtg 1020
acagactaca agttccgact ggccaagtcc 1080
cacgaagtga tcttcgcctt cgtgacggac 1140
ttcctgtttg agaagtggaa actctacggt
ccccccccca cggagctggt ctgtaacaga
acccccgcca ataccacagc caacatctcc
gtgcaacacc gcttcgtgtt caagagatgc
cgggggcagc cttggcgtga cgcctctcag
cagaaggagg tggctaagat gtacagcagc
ctgtccctgg gggccctgct cctcgccttg
tgcacccgca acgccatcca cgcgaacctg
gtgctggtca tcgatgggct gctcaggacc
agtgtcagca tctggctcag tgatggagcg
atgcaatatg gcgtcgtggc caactactgc
aacctgctgg gcctggccac cctccctgag
ggctggggtg cccccatgct gttcatcatc
aacatccagt gctggaccag caatgacaac
gtcttcctgg ccatcctgat caacttcttc
gccaagctgc gggcgcggga gatgcaccac
acactgaccc tcatccccct gctgggtgtc
gagcacgccc agggcaccct gcgcttcgcc aagctcttct tcgacctctt cctcagctcc 1200
tgcttcctca acaaggaggt gcagtcggaa 1260
ggcaaagtgc tgcaggagga gcggggcacc 1320
caaggccttc ctggcaagaa gctgcagtct 1380
gcggagatcc ccttggctgg tggcctccct 1434
ttccagggcc tgctggtggc tgtcctctac cttcggcggc attggcaccg ctggcgcctg agcaaccaca agaccccatc tgcgcctggc gggaggggtg gtggcagcca ggactcatct aggttggctg agagcccctt ctga
<210> 8 <211> 477 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 8
Met Pro Pro Cys Gln Pro Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 10 15
Leu Ala Cys Gln Pro Gln Ala Pro Ser Ala Gln Val Met Asp Phe Leu 25 30
Phe Glu Lys Trp Lys Leu Tyr Gly Asp Gln Cys His His Asn Leu Ser 40 45
Leu Leu Pro Pro Pro Thr Glu Leu Val Cys Asn Arg Thr Phe Asp Lys 50 55 60
Tyr Ser Cys Trp Pro Asp Thr Pro Ala Asn Thr Thr Ala Asn Ile Ser 65 70 75 80
Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp His His Lys Val Gln His Arg Phe Val
85 90 95
Phe Lys Arg Cys Gly Pro Asp Gly Gln Trp Val Arg Gly Pro Arg Gly 100 105 110
Gln Pro Trp Arg Asp Ala Ser Gln Cys Gln Met Asp Gly Glu Glu Leu 115 120 125
Glu Val Gln Lys Glu Val Ala Lys Met Tyr Ser Ser Phe Gln Val Met 130 135 140
Tyr Thr Val Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu 145 150 155 160
Ala Ile Leu Gly Gly Ile Ser Lys Leu His Cys Thr Arg Asn Ala Ile
165 170 175
His Ala Asn Leu Phe Val Ser Phe Val Leu Lys Ala Ser Ser Val Leu 180 185 190
Val Ile Asp Gly Leu Leu Arg Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Ile Gly Asp 195 200 205
Asp Leu Ser Val Ser Ile Trp Leu Ser Asp Gly Ala Val Ala Gly Cys 210 215 220
Arg Val Ala Ala Val Phe Met Gln Tyr Gly Val Val Ala Asn Tyr Cys 225 230 235 240
Trp Leu Leu Val Glu Gly Leu Tyr Leu His Asn Leu Leu Gly Leu Ala
245 250 255
Thr Leu Pro Glu Arg Ser Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Gly Trp 260 265 270
Gly Ala Pro Met Leu Phe Ile Ile Pro Trp Val Val Val Arg Cys Leu 275 280 285
Phe Glu Asn Ile Gln Cys Trp Thr Ser Asn Asp Asn Met Gly Phe Trp 290 295 300
Trp Ile Leu Arg Phe Pro Val Phe Leu Ala Ile Leu Ile Asn Phe Phe 305 310 315 320
Ile Phe Ile Arg Ile Val His Leu Leu Val Ala Lys Leu Arg Ala Arg
325 330 335
Glu Met His His Thr Asp Tyr Lys Phe Arg Leu Ala Lys Ser Thr Leu 340 345 350 Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Val His Glu Val Ile Phe Ala Phe Val 355 360 365
Thr Asp Glu His Ala Gln Gly Thr Leu Arg Phe Ala Lys Leu Phe Phe 370 375 380
Asp Leu Phe Leu Ser Ser Phe Gln Gly Leu Leu Val Ala Val Leu Tyr 385 390 395 400
Cys Phe Leu Asn Lys Glu Val Gln Ser Glu Leu Arg Arg His Trp His
405 410 415
Arg Trp Arg Leu Gly Lys Val Leu Gln Glu Glu Arg Gly Thr Ser Asn 420 425 430
His Lys Thr Pro Ser Ala Pro Gly Gln Gly Leu Pro Gly Lys Lys Leu 435 440 445
Gln Ser Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Ser Ala Glu Ile Pro 450 455 460
Leu Ala Gly Gly Leu Pro Arg Leu Ala Glu Ser Pro Phe 465 470 475
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
aggtctagtc agagcctctt ggatagagat gatggagaca cctatttgga c 51
<210> 10 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 10
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg Asp Asp Gly Asp Thr Tyr Leu 10 15
Asp <210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
aggtctagtc agagcctctt ggatagtgct gatggagaca cctatttgga c 51
<210> 12 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 12
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Ala Asp Gly Asp Thr Tyr Leu 10 15
Asp
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
cgggcaagtc agggcattag aaatgattta ggc 33
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 14
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly 10
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
agggccagtc agagtgttag cagcaactac ttagcc 36 <210> 16 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 16
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala 10
<210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
sapiens
<400> 17
cgggcaagtc aggacattag aaatgatttt ggc 33
<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<4 00> 18
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp Phe Gly 10
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 19
gggtctactc agagcctctt ggatagtgat gatggagaca cctatttgga c 51
<210> 20 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 20
Arg Ser Thr Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asp Thr Tyr Leu 10 15
Asp
<210> 21 <211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
caggcgagtc aggacattag taagtattta aat
<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<400> 22
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn 10
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
tctggagata aattggggga taaatatgtt tgc 33
<210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<400> 24
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val Cys 1 5 10
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
tctggagata aattggggga taaatatgct tgc 33
<210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<400> 26 Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Cys 10
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
acccgcagca gtggcagcat tgtcagcaac tttgtgcaa 39
<210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<400> 28
Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Val Ser Asn Phe Val Gln 10
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
actggaatca cctccaacat cggaagcaat actgtacac 39
<210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<400> 30
Thr Gly Ile Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val His 10
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
tctggaagca ggtccaacat cggaagtaat tatgtatac 39
<210> 32 <211> 13 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 32
Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr 10
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
actgggagca gctccaacat cggggcaggt tatgctgtac ac 42
<210> 34 <211> 14 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 34
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ala Val His 10
<210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
aagtctagtc agagcctcct gcatagtgat ggaaagaact atttgttt 48
<210> 36 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 36
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Asn Tyr Leu Phe 10 15
<210> 37
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37 aggtctagtc agagcctcct gcatagtaat ggatacaact atttggat 48
<210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<400> 38
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 10 15
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
cgggcaagtc agggcattag aaatgattta ggc 33
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
cgggcgagtc agggtattag cagctggtta gcc 33
<210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<400> 41
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
acgctttcct atcgggcctc t 21
<210> 43 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 43
Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser 1 5
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
gctgcatcca gtttgcaaag t 21
<210> 45 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
gctgcctcca gtttgcaaag t 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
ggtgcatcca gcagggccac t 21
<210> 48 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
gctgcatcca gtttggaaag t 21
<210> 50 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5
<210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Homo
sapiens
<400> 51
gatgcatcca atttggaaac a 21
<210> 52 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
caaacttcca agcggccctc a 21
<210> 54 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Gln Thr Ser Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
caatctacca agcggccctc a 21
<210> 56 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Gln Ser Thr Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
gaggataacc aaagaccctc t 21
<210> 58 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 59 agtaataatc agcggccctc a
<210> 60 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Se 1 5
<210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 61
aggaataatc agcggccctc a 21
<210> 62 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Se 1 5
<210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Homo
sapiens
<400> 63
gataacaaca atcggccctc a 21
<210> 64 <211> 6 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 64
Asp Asn Asn Asn Arg Pro 1 5
<210> 65 <211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
gaagtttcct accggttctc t 21
<210> 66 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 66
Glu Val Ser Tyr Arg Phe Ser 1 5
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 67
ttgggttcta atcgggcctc c 21
<210> 68 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 68
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 69
actgcatcca ctttgcaaag t 21
<210> 70 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70 Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 71
atgcaacgta tagagtttcc attcact 27
<210> 72 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 72
Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr 1 5
<210> 73
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 73
ctacagcata atagtaaccc tctcact 27
<210> 74 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 74
Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu Thr 1 5
<210> 75
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 75
ctacagcata atagtgaccc gctcacc 27
<210> 76 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Leu Gln His Asn Ser Asp Pro Leu Thr 1 5
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 77
caacaatatg gtaactcacc attcact 27
<210> 78 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Phe Thr 1 5
<210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Homo
sapiens
<400> 79
ctacagcaaa atagttaccc gctcact 27
<210> 80 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
Leu Gln Gln Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 81 caggcgtggg acagcagcac tgtggta 27
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 82
cagtcttatg ataccagcaa tcaggtg 27
<210> 83 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 83
Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Asn Gln Val 1 5
<210> 84 <211> 33 <212> DNA <213> Homo
sapiens
<400> 84
gcagcatggg atgacagcct gaatggtccg gtg 33
<210> 85 <211> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 85
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val 10
<210> 86
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 86
gcagcatggg atgacagcct gagtaggccg gta 33
<210> 87 <211> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 87
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Arg Pro Val 10
<210> 88
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 88
cagtcctatg acagcagcct gagtgctata 30
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ala Ile 10
<210> 90
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 90
atgcaaaata tacagcctcc tctcacc 27
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 91
Met Gln Asn Ile Gln Pro Pro Leu Thr 1 5
<210> 92
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 92 atggaagctc ttcaaactat gtgcagt 27
<210> 93 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 93
Met Glu Ala Leu Gln Thr Met Cys Ser 1 5
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 94
ctacagcata atagttaccc tcgcagt 27
<210> 95 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 95
Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Arg Ser 1 5
<210> 96
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 96
caacaggcta acagtttccc gctcact 27
<210> 97 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr 1 5
<210> 98 <211> 28
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 98
atgcaacgta tagagtttcc attcactt 28
<210> 99
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 99
caacagtcta acagtttccc gctcact 27
<210> 100 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 100
Gln Gln Ser Asn Ser Phe Pro Leu Thr 1 5
<210> 101
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 101 agctatggca tgcac 15
<210> 102 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 102
Ser Tyr Gly Met His 1 5
<210> 103
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 103 acctatggga tgcac 15
<210> 104 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 104
Thr Tyr Gly Met His 1 5
<210> 105
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 105 agctatggca tgcac 15
<210> 106 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 106
Ser Tyr Asp Met His 1 5
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 107
agcaactatg ctgcttggaa c 21
<210> 108 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Ser Asn Tyr Ala Ala Trp Asn 1 5
<210> 109 <211> 15 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 109 agctatgaca tgcac 15
<210> 110
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 110 aactatggca tgcac 15
<210> 111 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 111
Asn Tyr Gly Met His 1 5
<210> 112
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 112 ggctactatt tgcac 15
<210> 113 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 113
Gly Tyr Tyr Leu His 1 5
<210> 114 <211> 15 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 114 agctatggta tcagt 15
<210> 115 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 115
Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5
<210> 116
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 116
aagtctagtc agagcctcct gcatagtgat ggaaagaact atttgttt 48
<210> 117 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 117
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Asn Tyr Leu Phe 10 15
<210> 118 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 118
Gly Tyr Thr Leu Asn 1 . 5
<210> 119
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 119 agctatgcca tgaac 15
<210> 120 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 120
Ser Tyr Ala Met Asn 1 5
<210> 121
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 121 agatatgcca tgaac 15
<210> 122 <211> 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 122
Arg Tyr Ala Met Asn 1 5
<210> 123
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 123
tctatatggt atgatggaag taataaatat tatgtagact ccgtgaaggg c 51
<210> 124 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 124
Ser Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 125 <211> 51 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 125
tttatatggt atgatggaag tgaaaaatat tatgtagact ccgtgaaggg c 51
<210> 126 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 126
Phe Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 127
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 127
gttatgtggt atgatggaag taataaagac tatgtagact ccgtgaaggg c 51
<210> 128 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 128
Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 129
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 129
gttatatcag atgatggaag tcataaatac tctgcagact ccgtgaaggg c 51 <210> 130 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 130
Val Ile Ser Asp Asp Gly Ser His Lys Tyr Ser Ala Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 131
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 131
gaaatatgga atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
Glu Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 133
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 133
gtgatatcac atgatggaag tgataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134 Val Ile Ser His Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 135
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 135
ggtatatggt atgatggaag gaataaatac tatgtagact ccgtgaaggg c 51
<210> 136 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 136
Gly Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 137
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 137
aggacatact acaggtccaa gtggtataat gattatgcag tatctgtgag aagt 54
<210> 138 <211> 18 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 138
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 10 15
Arg Ser <210> 139
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 139
tttatatcag atgatggaag taataaatac tatggagact ccgtgaaggg c 51
<210> 140 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 140
Phe Ile Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 141
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 141
tttatatcag atgatggaag taataaatat tatggagact ccgtgaaggg c 51
<210> 142
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 142
gttatatcat atgatggaag taataaatac tatggagact ccgtgaaggg c 51
<210> 143 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 143
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 10 15 Gly
<210> 144
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 144
gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 145 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 145
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 146
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 146
cttatatcat ttgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 147 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 147
Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 148 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <4 00> 148
tggatcatcc ctgacagtgg tggcacaaag tatgcacaga agtttcaggg c 51
<210> 149 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 149
Trp Ile Ile Pro Asp Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 10 15
Gly
<210> 150
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 150
tggatcggcg tttacaatgg tcacacaaaa tatgcacaga agttccaggg c 51
<210> 151 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 151
Trp Ile Gly Val Tyr Asn Gly His Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 10 15
Gly
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 152
gaagtttcct accggttctc t 21 <210> 153 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 153
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Lys Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 154
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 154
attatatggt ctgatggaat taacaaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51
<210> 155 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 155
Ile Ile Trp Ser Asp Gly Ile Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 156
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 156
aacattaata gtaggagtag tctcatatac tacacagact ctgtgaaggg c 51
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
Asn Ile Asn Ser Arg Ser Ser Leu Ile Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly
10
15
<210> 158
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 158
tacattggta gtagtagtag tgccatatac tacggagact ctgtgaaggg c 51
<210> 159 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 159
Tyr Ile Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 160
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 160
tctatatggt atgatggaag taataaatat tatgtagact ccgtgaaggg c 51
<210> 161 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 161
Ser Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 10 15
Gly <210> 162
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 162
tacattggta gtagtagtag tgccatatac tacgcagact ctgtgaaggg c 51
<210> 163 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 163
Tyr Ile Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 164
cttggtggtg gttttgacta c 21
<210> 165 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 165
Leu Gly Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 166
atgggaggcg gctttgacta c 21
<210> 167 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 167
Met Gly Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5
<210> 168
<211> 57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 168
gaaaaagatc attacgacat tttgactggt tataactact actacggtct ggacgtc 57
<210> 169 <211> 19 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 169
Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr Tyr Gly 10 15
Leu Asp Val
<210> 170
<211> 57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 170
gaggagacgt attacgatat tttgactggc tatcatcact actacggtat ggacgtc 57
<210> 171 <211> 19 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 171
Glu Glu Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr His His Tyr Tyr Gly 10 15
Met Asp Val <210> 172
<211> 57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 172
gagcctcagt attacgatat tttgactggt tatgataact actacggtat ggacgtc 57
<210> 173 <211> 19 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 173
Glu Pro Gln Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asp Asn Tyr Tyr Gly 10 15
Met Asp Val
<210> 174
<211> 57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 174
gaaaaaccgt attacgatat tttgactggt tatttctact actatggtat ggacgtc 57
<210> 175 <211> 19 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 175
Glu Lys Pro Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Phe Tyr Tyr Tyr Gly 10 15
Met Asp Val
<210> 176
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 176
ttagcagtgg cctttgacta c 21
<210> 177 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 177
Leu Ala Val Ala Phe Asp Tyr 1 5
<210> 178
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 178
gaagatggca gtggctggta cggtgctttt gacatc 36
<210> 179 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 179
Glu Asp Gly Ser Gly Trp Tyr Gly Ala Phe Asp Ile 10
<210> 180
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 180
gatcaatacg atattttgac tggttattct tctgatgctt ttgatatc 48
<210> 181 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 181
Asp Gln Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Asp Ala Phe Asp Ile 10 15 <210> 182
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 182
gcctattacg atattttgac tgattacccc cagtatgact actactacgg tatggacgtc 60
<210> 183 <211> 20 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 183
Ala Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Pro Gln Tyr Asp Tyr Tyr Tyr 10 15
Gly Met Asp Val 20
<210> 184
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 184
gatgggtatt acgatatttt gactggttat gaggatgatg cttttgatat c 51
<210> 185 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 185
Asp Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Glu Asp Asp Ala Phe Asp 10 15
Ile
<210> 186
<211> 60
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 186 gaagggtttc attacgatat tttgactggt tcctacttct actactacgg tatggacgtc 60
<210> 187 <211> 20 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 187
Glu Gly Phe His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ser Tyr Phe Tyr Tyr Tyr 10 15
Gly Met Asp Val 20
<210> 188
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<4 00> 188
agggtagcag tggctgggta ctttgactac 30
<210> 189 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 189
Arg Val Ala Val Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr 10
<210> 190
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 190
atgcaaaata tacagcctcc tctcacc 27
<210> 191 <211> 18 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 191
Val Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Tyr Glu Tyr Tyr Tyr His Tyr Gly Met 10
15
Asp Val
<210> 192
<211> 57
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 192
gagagaggcc tctacgatat tttgactggt tattataact actacggtat tgacgtc 57
<210> 193 <211> 19 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<4 00> 193
Glu Arg Gly Leu Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Asn Tyr Tyr Gly 10 15
Ile Asp Val
<210> 194
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 194
gatcagtata actggaacta ctactacggt atggacgtc 39
<210> 195 <211> 13 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 195
Asp Gln Tyr Asn Trp Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 10
<210> 196
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 196
tatagaagtg gctggtcccc cctctttgac ttc 33
<210> 197 <211> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 197
Tyr Arg Ser Gly Trp Ser Pro Leu Phe Asp Phe 1 5 10
<210> 198
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 198
tatagcagtg gctggtcccc cctctttgac tac 33
<210> 199 <211> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 199
Tyr Ser Ser Gly Trp Ser Pro Leu Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 200 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES <222> (3)..(3) <223> Ser or Thr
<220>
<221> M0D_RES <222> (9)..(9) <223> Arg or Ser <220>
<221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Asp or Ala
<400> 200
Arg Ser Xaa Gln Ser Leu Leu Asp Xaa Xaa Asp Gly Thr Tyr Thr Leu 10 15
Asp
<210> 201 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES <222> (5) .. (5) <223> Gly or Asp
<220>
<221> MOD_RES <222> (10) .. (10) <223> Leu or Phe
<400> 201
Arg Ala Ser Gln Xaa Ile Arg Asn Asp Xaa Gly 10
<210> 202 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES <222> (10) .. (10) <223> Val or Ala
<400> 202
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Xaa Cys 10
<210> 203 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<22 0>
<221> M0D_RES <222> (1) .. (1) <223> Ser or Thr
<220>
<221> M0D_RES <222> (3)..(3) <223> Gly or Asp
<400> 203
Xaa Tyr Xaa Met His 1 5
<210> 204 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES <222> (6)..(6) <223> Glu or Gln
<400> 204
Ala Ala Ser Ser Leu Xaa Ser 1 5
<210> 205 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> MOD_RES <222> (2) .. (2) <223> Ser or Thr
<220>
<221> MOD_RES <222> (3) . . (3) <223> Thr or Ser
<400> 205
Gln Xaa Xaa Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 206 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1) . . (1)
<223> Ser, Phe, Val or Gln
<22 0>
<221> M0D_RES <222> (4) . . (4) <223> Tyr or Asn
<22 0>
<221> M0D_RES <222> (8) . . (8) <223> Asn or Gln
<220>
<221> M0D_RES <222> (12) .. (12) <223> Val or Ala
<400> 206
Xaa Ile Trp Xaa Asp Gly Ser Xaa Lys Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val Lys 10 15
Gly <210> 207 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES <222> (1) . . (1) <223> Val or Phe
<22 0>
<221> M0D_RES
<222> (4) . . (4)
<223> His, Asp or Tyr
<220>
<221> M0D_RES
<222> (8) . . (8)
<223> Asp, Asn or His
<220>
<221> M0D_RES <222> (11) .. (11) <223> Tyr or Ser
<220>
<221> M0D_RES <222> (12) . . (12) <223> Ala or Gly
<400> 207
Xaa Ile Ser Xaa Asp Gly Ser Xaa Lys Tyr Xaa Xaa Asp Ser Val Lys 10 15
Gly
<210> 208 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <22 0>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220>
<221> MOD_RES <222> (3) .. (3) <223> His or Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6) . . (6)
<223> Asn, Asp or Tyr
<400> 208
Leu Gln Xaa Asn Ser Xaa Pro Leu Thr 1 5
<210> 209 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES <222> (6)..(6) <223> Asn or Ser
<220>
<221> M0D_RES <222> (9)..(9) <223> Ile or Val
<400> 209
Gln Ala Trp Asp Ser Xaa Thr Val Xaa 1 5
<210> 210 <211> 19 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES <222> (2)..(2) <223> Lys, Glu or Pro <220>
<221> M0D_RES
<222> (3) . . (3)
<223> Asp, Thr, Gln or Pro
<220>
<221> M0D_RES <222> (4) .. (4) <223> His or Tyr
<220>
<221> M0D_RES
<222> (12) .. (12)
<223> Asn, His, Asp or Phe
<220>
<221> M0D_RES <222> (13) .. (13) <223> Tyr, His or Asn
<22 0>
<221> M0D_RES <222> (17) . . (17) <223> Leu or Met
<400> 210
Glu Xaa Xaa Xaa Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Xaa Xaa Tyr Tyr Gly 10 15
Xaa Asp Val
<210> 211 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence
<220>
<221> M0D_RES <222> (1) . . (1) <223> Leu or Met
<400> 211
Xaa Gly Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 212 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 212
gatattgtgc tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcttg gatagagatg atggagacac ctatttggac 120
tggtacctgc agaagccagg gcagtctcca cagctcctga tctatacgct ttcctatcgg 180
gcctctggag tcccagacag gttcagtggc agtgggtcag gcactgattt ctcactgaaa 240
atcagcaggg tggaggctga ggatgttgga gtttattact gcatgcaacg tatagagttt 300
ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 339
<210> 213 <211> 113 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 213
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg 25 30
Asp Asp Gly Asp Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Lys 65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95 Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110
Lys
<210> 214 <211> 323 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 214
agactccact ctccctgccc gtcacccctg gagagccggc ctccatctcc tgcaggtcta 60
gtcagagcct cttggatagt gctgatggag acacctattt ggactggtac ctgcagaagc 120
cagggcagtc tccacagctc ctgatctata cgctttccta tcgggcctct ggagtcccag 180
acaggttcag tggcagtggg tcagacactg atttctcact gaaaatcagc agggtggagg 240
ctgaggatgt tggagtttat tactgcatgc aacgtataga gtttccattc actttcggcc 300
ctgggaccaa agtggatatc aaa 323
<210> 215 <211> 113 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 215
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 25 30
Ala Asp Gly Asp Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Asp Phe Ser Leu Lys 65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 HO
Lys
<210> 216 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 216
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag tgtgcagcct 240
gaagattttg taacttatta ctgtctacag cataatagta accctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 217 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 217
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 I5
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Glv Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 218 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 218
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag tctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagta accctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 219 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 219
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 220 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 220
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ttgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gctctatgct gcctccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtgggtc tgggtcagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtg acccgctcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 221 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 221
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Leu 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 222 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 222
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ttccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa 120
tctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcaa caatatggta actcaccatt cactttcggc 300
cctgggacca atgtggatat caaa 324
<210> 223 <211> 108 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 223
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Phe Pro Gly 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys 100 105
<210> 224 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 224
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
gtcacttgcc gggcaagtca ggacattaga aatgattttg gctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag caaaatagtt acccgctcac tttcggggga 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 225 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 225
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asp 25 30
Phe Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gln Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 226 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 226
gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctactca gagcctcttg gatagtgatg atggagacac ctatttggac 120
tggtacctgc agaagccggg gcagtctcca cagctcctga tctatacgct ttcctatcgg 180
gcctctggag tcccagacag gttcagtggc agtgggtcag gcactgattt cacactgaaa 240 atcagcaggg tggaggctga ggatgttgga gtttattact gcatgcaacg tatagagttt 300
ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 339
<210> 227 <211> 113 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 227
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Gln Ser Leu Leu Asp Ser 25 30
Asp Asp Gly Asp Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 110
Lys
<210> 228 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 228
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag tgtgcagcct 240
gaagattttg taacttatta ctgtctacag cataatagta accctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 229 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 229
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 230 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 230
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattagt aagtatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct catctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatggtaatc tcccgatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagagtaa a 321
<210> 231 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 231
Asd Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ser Lys 100 105
<210> 232 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 232
tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa 120
cagtcccctg tgctggtcat ctatcaaact 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg 300
accaagctga ccgtccta 318
tccgtgtccc caggacagac agccagcatc tatgtttgct ggtatcagca gaagccaggc tccaagcggc cctcagggat ccctgagcgg actctgacca tcagcgggac ccaggctatg gacagcaaca ctgtgatttt cggcggaggg
<210> 233 <211> 106 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 233
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 40 45
Gln Thr Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Asn Thr Val Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100
105
<210> 234 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 234
tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa tatgtttgct ggtatcagca gaagccaggc 120
cagtcccctg tgctggtcat ctatcaaact tccaagcggc cctcagggat ccctgagcgg 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagca ctgtggtttt cggcggaggg 300
accaagctga ccgtccta 318
<210> 235 <211> 106 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 235
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 40 45
Gln Thr Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
<210> 236 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 236
tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agccagcatc 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa tatgcttgct ggtatcagca gaagccaggc 120
cagtcccctg tactggtcat ctatcaatct accaagcggc cctcagggat ccctgagcgt 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagca ctgtggtatt cggcggaggg 300
accaagctga ccgtccta 318
<210> 237 <211> 106 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 237
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 40 45
Gln Ser Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65
70
75
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
<210> 238 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 238
aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg cagcattgtc agcaactttg tgcaatggta ccagcagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaggataacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagctcc tccaactctg cctccctcac catctctgga 240
ctgaagactg aggacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccag caatcaggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtcctg 330
<210> 239 <211> HO <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 239
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Val Ser Asn 25 30
Phe Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50
55
60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
85 90 95
Ser Asn Gln Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 HO
<210> 240 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 240
cagtctgtcc tgactcagcc acccccagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcgtgtactg gaatcacctc caacatcgga agcaatactg tacactggta ccagcagttc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtccggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 241 <211> 110 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 241
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Pro Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ile Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn 25 30
Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35
40
45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110
<210> 242 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 242
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcaggtc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccaacagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag taggccggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 243 <211> 110 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 243
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Arg Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110
<210> 244 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 244
cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg ctgtacactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatgataaca acaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgctata 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 245 <211> 110 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 245
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 10
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 25 30
Tyr Ala Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Ala Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110
<210> 246 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 246
aatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 60
atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaacta tttgttttgg 120
tacctacaga agccaggcca gtctccacag ctcctgatct atgaagtttc ctaccggttc 180
tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttctc attgaaaatc 240
agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaaatat acagcctcct 300
ctcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaa 336
<210> <211> <212>
247 112 PRT <213> Homo sapiens <400> 247
Asn Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 25 30
Asp Gly Lys Asn Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arq Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Ara Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Asn
85 90 95
Ile Gln Pro Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 HO
<210> 248 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 248
ggtattgtgc tgactcagtc 60
atctcctgca ggtctagtca 120
tacttgcaga agccagggca 180
tccggggtcc ctgacaggtt 240
agcagagtgg aggctgagga 300
tgcagttttg gccaggggac 336
tccactctcc ctgcccgtca gagcctcctg catagtaatg gtctccgcag ctcctgatct cagtggcagt ggatcaggca tgttggggtt tattactgca caagctggag atcaag
cccctggaga gccggcctcc gatacaacta tttggattgg atttgggttc taatcgggcc cagattttac actgaaaatc tggaagctct tcaaactatg <210> 249 <211> 112 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 249
Glv Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Glu Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Met Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 HO
<210> 250 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 250
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatct 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcaa cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctcgcag ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 251 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 251
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 252 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 252
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct aatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cggttcagcg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 253 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 253
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 254 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 254
gatattgtgc tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcttg gatagagatg atggagacac ctatttggac 120 tggtacctgc agaagccagg gcagtctcca cagctcctga tctatacgct ttcctatcgg 180
gcctctggag tcccagacag gttcagtggc agtgggtcag gcactgattt ctcactgaaa 240
atcagcaggg tggaggctga ggatgttgga gtttattact gcatgcaacg tatagagttt 300
ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 339
<210> 255 <211> 113 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 255
Asd Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg 25 30
Asp Asp Gly Asp Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Lys 65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 100 105 HO
Lys
<210> 256 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 256
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcgt ctgtagggga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatact gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag tctaacagtt tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 257 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 257
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 258 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 258
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggaat caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcatct atatggtatg atggaagtaa taaatattat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc ttcagagaca attccaagaa aacgctgtat 240
ctgcaaatga acaggctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacttggt 300
ggtggttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 259 <211> 116 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 259
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Ser Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lvs Glv Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 HO
Thr Val Ser Ser 115
<210> 260 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 260
caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc 60
tcctgtgcag cgtctggaat caccttcagt 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcattt 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac 300
ggcggctttg actactgggg ccagggaacc 348
gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc agctatggca tgcactgggt ccgccagggt atatggtatg atggaagtga aaaatattat tccagagaca attccaagaa cacgctgtat acggctgtgt attactgtgc gagaatggga ctggtcaccg tctcctca
<210> 261 <211> 116 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 261
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Phe Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Met Gly Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 262 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 262
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atgtggtatg atggaagtaa taaagactat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga accgcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaaaaa 300
gatcattacg acattttgac tggttataac tactactacg gtctggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 263 <211> 128 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 263
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45 Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr 100 105 HO
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 264 <211> 467 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 264
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atgtggtatg atggaagtaa taaagactat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga accgcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaaaaa 300
gatcattacg acattttgac tggttataac tactactacg gtctggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggcg 420
ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gcggccctgg gctgcct 467
<210> 265 <211> 128 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 265
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5
Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr 100 105 HO
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 266 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 266
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acctatggga tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gtctggagtg ggtggcagtt atatcagatg atggaagtca taaatactct 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag aactgaggac tcggctgtgt attactgtgc gagagaggag 300
acgtattacg atattttgac tggctatcat cactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 267 <211> 128 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 267
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Val Ile Ser Asp Asp Gly Ser His Lys Tyr Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr His His Tyr 100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 268 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 268 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagaa atatggaatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attattgtgc gagagagcct 300
cagtattacg atattttgac tggttatgat aactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 269 <211> 128 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 269
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Glu Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Gln Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asp Asn Tyr 100 105 110 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 270 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 270
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg atatcacatg atggaagtga taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga gcagtttgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaaaaa 300
ccgtattacg atattttgac tggttatttc tactactatg gtatggacgt ctggggccaa 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 271 <211> 128 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 271
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Val Ile Ser His Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Phe Tyr Tyr 100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 272 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 272
caggtgcagt tggcggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cgtctggaat caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaggt atatggtatg atggaaggaa taaatactat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa aacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggttagca 300
gtggcctttg actactgggg ccagggaact ttggtcaccg tctcctca 348
<210> 273 <211> 116 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 273
Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr
20
25
30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Gly Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lvs Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Val Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 HO
Thr Val Ser Ser 115
<210> 274 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 274
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc 240
ctgcaaatga accgcctgag agccgaggac 300
gatcattacg acattttgac tggttataac 360
gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc agctatggca tgcactgggt ccgccaggct atgtggtatg atggaagtaa taaagactat tccagagaca attccaagaa cacgctgtat acggctgtgt attactgtgc gagagaaaaa tactactacg gtctggacgt ctggggccaa
<210> 275 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5
Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val 50 55 βΟ
Lvs Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Asn Tyr Tyr 100 105 110
Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 276 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 276
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaggc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaactatg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gagaagtcga acaaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagttgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtaca 300 agagaagatg gcagtggctg gtacggtgct tttgacatct ggggccaagg gacaatggtc 360
accgtctctt ca 372
<210> 277 <211> 124 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 277
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 25 30
Tyr Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60
Val Ser Val Arg Ser Arg Thr Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Asp Gly Ser Gly Trp Tyr Gly Ala Phe Asp 100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 278 <211> 374 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 278
caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggag caccttcaga agctatgaca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcattt atatcagatg atggaagtaa taaatactat 180
ggagactccg tgaagggccg attgaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcaa 300
tacgatattt tgactggtta ttcttctgat gcttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct cttc 374
<210> 279 <211> 125 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 279
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ser Tyr 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Phe Ile Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Asp Ala Phe 100 105 HO
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 280 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 280
caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc 60
tcctgtgcag cctctgggag caccttcaga 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcattt 180
ggagactccg tgaagggccg attgaccatc 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac 300
tacgatattt tgactggtta ttcttctgat 360
gtcaccgtct cttca 375
gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc agctatgaca tgcactgggt ccgccaggct atatcagatg atggaagtaa taaatattat tccagagaca attccaagaa cacgctgtat acggctgtgt attattgtgc gagagatcaa gcttttgata tctggggcca agggacaatg
<210> 281 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 281
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ser Tyr 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Phe Ile Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60
Lvs Glv Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Asp Ala Phe 100 105 HO
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 282 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 282
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc 60
tcctgtgcag cctctggaag caccttcaga 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt 180
ggagactccg tgaagggccg attgaccatc 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac 300
tacgatattt tgactggtta ttcttctgat 360
gtcaccgtct cttca 375
gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc agctatgaca tgcactgggt ccgccaggct atatcatatg atggaagtaa taaatactat tccagagaca attccaagaa cacgctgtat acggctgtgt attactgtgc gagagatcaa gcttttgata tctggggcca agggacaatg
<210> 283 <211> 125 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 283
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Arg Ser Tyr 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Ser Asp Ala Phe 100 105 HO
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 284 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 284
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagcctat 300
tacgatattt tgactgatta cccccagtat gactactact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 285 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 285
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg ι S 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lvs Glv Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Asp Tyr Pro Gln Tyr Asp Tyr 100 105 HO
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
Ser
<210> 286 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 286
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaagtc cctgagactc 60
tcctgtgcag tctctggatt catcttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcatttg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg 240
ctgcaaatga acagcctgag 300
tattacgata ttttgactgg 360
attcaccatc tccagagaca agctgaggac acggctgtgt ttatgaggat gatgcttttg
attccaagaa cacgctgtat attactgtgc gagagatggg atatctgggg ccaagggaca
atggtcaccg tctcttca 378
<210> 287 <211> 126 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 287
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lvs Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Glu Asp Asp Ala 100 105 HO
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 288 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 288
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactatt tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcatccctg acagtggtgg cacaaagtat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
ttggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggg 300
tttcattacg atattttgac tggttcctac ttctactact acggtatgga cgtctggggc 360
caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387
<210> 289 <211> 129 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 289
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 40 45
Gly Trp Ile Ile Pro Asp Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Phe His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ser Tyr Phe Tyr 100
105
110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 125
Ser
<210> 290 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 290
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag 60
tcetgcaagg cttctggtta cacctttacc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac 300
gcagtggctg ggtactttga ctactggggc 357
gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc agctatggta tcagttgggc gcgacaggcc atcggcgttt acaatggtca cacaaaatat accacagaca catccacgag cacagcctac acggccatat tttactgtgc gagaagggta cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca
<210> 291 <211> 119 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 291
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Gly Ile Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 40 45
Gly Trp Ile Gly Val Tyr Asn Gly His Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Glv Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Ala Val Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 HO
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 292 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 292
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agatatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtca taaatactat 180
gaagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attctaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acgggtgtgt attactgtgc gagagtcggg 300
tatggcagtg gctggtacga gtactattac cactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360
accacggtca ccgtctcctc a 381
<210> 293 <211> 127 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 293 ^
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Lys Tyr Tyr Glu Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Tyr Glu Tyr Tyr Tyr His Tyr 100 105 HO
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 294 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 294
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacaatt atatggtctg atggaattaa caaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccata tccagagaca attccaagaa cacgctgaat 240
ctgcaaatga acagtttgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagaga 300
ggcctctacg atattttgac tggttattat aactactacg gtattgacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 295 <211> 128 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 295
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg χ 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Thr Ile Ile Trp Ser Asp Gly Ile Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lvs Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90
Ala Arg Glu Arg Gly Leu Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Asn Tyr 100 105 HO
Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 296 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 296
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt ggctatacct tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcaaac attaatagta ggagtagtct catatactac 180
acagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt atttctgtgc gagagatcag 300
tataactgga actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 297 <211> 122 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 297
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 25 30
Thr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ser Asn Ile Asn Ser Arg Ser Ser Leu Ile Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Tyr Asn Trp Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 298 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 298
gaggtgcggc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gatttcatac attggtagta gtagtagtgc catatactac 180
ggagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agacgaggac acggctgtgt attactgtgc gagatataga 300
agtggctggt cccccctctt tgacttctgg ggccagggaa gcctggtcac cgtctcctca 360
<210> 299 <211> 120 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 299 π
Glu Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
R 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
Ser Tyr Ile Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60
Lvs Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Arg Ser Gly Trp Ser Pro Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100
105
110
Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 300 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 300
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggaat caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcatct atatggtatg atggaagtaa taaatattat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc ttcagagaca attccaagaa aacgctgtat 240
ctgcaaatga acaggctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacttggt 300
ggtggttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 301 <211> 116 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 301
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Ser Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala
85
Ala Arg Leu Gly Gly Gly Phe Asp 100
Thr Val Ser Ser 115
112
75 80
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 105 HO
<210> 302 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 302
gaggtgcggc tggtggagtc 60
tcctgtacag cctctggatt 120
ccagggaagg ggctggagtg 180
gcagactctg tgaagggccg 240
ctgcaaatga acagcctgag 300
agtggctggt cccccctctt 360
tgggggaggc ttggtacagc ccccttcaat agatatgcca ggtttcatac attggtagta attcaccatc tccagagaca agatgaagac acggctgtgt tgactactgg ggccagggaa
ctggggggtc cctgagactc tgaactgggt ccgccaggct gtagtagtgc catatactac atgccaagaa ctcactgtat attactgtgc gagatatagc ccctggtcac cgtctcctca
<210> 303 <211> 120 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 303
Glu Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asn Arg Tyr 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35
40
45
Ser Tyr Ile Gly Ser Ser Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Ser Gly Trp Ser Pro Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 HO
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 304 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 304
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 305 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 305
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 10
15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lvs His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 306 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 306
ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa 60
gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120
gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180
caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tatctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240
tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300
gcccctacag aatgttca 318
<210> 307 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 307
Glv Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60
Lys Tvr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105
<210> 308 <211> 978 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 308
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300
aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540
gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960
tccctgtctc cgggtaaa 978
<210> 309 <211> 326 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 309
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80
Tvr Thr Cvs Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 HO
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 310 <211> 236 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 310
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 40 45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 HO
His Asn Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
<210> 311 <211> 473 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 311
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Met Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 HO
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Lys Asp His Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr 115 120 125
Asn Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160
Cvs Ser Ara Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
165 110 175
Lvs Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 210 215 220
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235 240
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
οι η 315 320
305 310 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470
<210> 312 <211> 236 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 312
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 40 45
Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110
His Asn Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
<210> 313 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 313
aagctcgagg tcgactagac caccatggac atgagggtcc ccgctcagct cctg 54
<210> 314 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 314
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu 1 5 10
<210> 315 <211> 41 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Deseription of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 315
aaccgtttaa acgcggccgc tcaacactct cccetgttga a 41
<210> 316 <211> 6 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Deseription of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 316
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5
<210> 317 <211> 51 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 317
aagctcgagg tcgactagac caccatggag tttgggctga gctgggtttt c 51
<210> 318 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 318
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe 1 5
<210> 319 <211> 48 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <22 0>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 319
gaccacggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtctt 48
<210> 320 <211> 48 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 320
aagaccgatg ggcccttggt ggaggctgag gagacggtga ccgtggtc 48
<210> 321 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial
Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 321 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 10 15
Phe
<210> 322 <211> 41 <212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetie primer <400> 322
aaeegtttaa acgcggecge tcatttaeee ggagaeaggg a 41
<210> 323 <211> 6 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 323
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5
<210> 324
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 324 ggctatacct tgaac 15

Claims (35)

1. Uma proteína de ligação a antigeno isolada consistindo em uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo caracterizada pelo fato de que consiste em: a. uma CDR3 da cadeia leve consistindo em uma seqüência selecionada do grupo consistindo em: i. uma seqüência da CDR3 da cadeia leve que difere em não mais que um total de três adições, substituições e/ou eliminações de aminoácido de uma seqüência da CDR3 selecionada do grupo consistindo nas seqüências da CDR3 da cadeia leve de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 72; 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97,100; ii. L Q X2i N S X22 P L T (N5 de ID da SEQ: 208); iii. Q A W D S X23 T V X24 (N5 de ID da SEQ: 209); b. uma seqüência da CDR3 da cadeia pesada consistindo em uma seqüência selecionada do grupo consistindo em: i. uma seqüência da CDR3 da cadeia pesada que difere em não mais que um total de quatro adições, substituições e/ou eliminações de aminoácido de uma seqüência da CDR3 selecionada do grupo consistindo nas seqüências da CDR3 da cadeia pesada de H1-H23, N2S de ID da SEQ: 165, 167, 169,171, 173, 175, 177, 17 9, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199; ii. E X25 X2ς X27 Y D I L T G Y X2e ^29 YYG X30 D V (N° de ID da SEQ: 210) iii. X31 G G G F D Y (N- de ID da SEQ: 211); ou c. a seqüência da CDR3 da cadeia leve de (a) e a seqüência da CEDR3 da cadeia pesada de (b); onde, X21 é um resíduo de histidina, ou um resíduo de glutamina, X22 é um resíduo de aspargina, um resíduo de aspartato, ou um resíduo de tirosina, X23 é um resíduo de aspargina ou um resíduo de serina, X24 é um resíduo de ísoleucína ou um resíduo de valina, X25 é um resíduo de lisina, um resíduo de glutamato, ou um resíduo de prolina, X26 é um resíduo de aspartato, um resíduo de treonina, um resíduo de glutamina, ou um resíduo de prolina, X27 é um resíduo de histidina ou um resíduo de tirosina, X28 é um resíduo de aspargina, um resíduo de histidina, um resíduo de aspartato, ou um resíduo de fenilalanina, X29 é um resíduo de tirosina, um resíduo de histidina, ou um resíduo de asparagina, X30 é um resíduo de leucina ou um resíduo de metionina, X3i é um resíduo de leucina ou um resíduo de metionina, e onde a mencionada proteína de ligação ao antígeno especificamente se liga ao receptor de glucagon humano.
2. A proteína de ligação a antígeno isolada da reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que consiste em uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: a. uma seqüência da CDRl da cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: i. uma CDRl da cadeia leve que difere em não mais que três adições, substituições e/ou eliminações de aminoácidos de uma seqüência da CDRl de L1-L23, N2S de ID da SEQ: 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; ii. R S Xi Q S L L D X2 X3 D G T Y T L D (N5 de ID da SEQ: 200) iii. R A S Q X4 I R N D X5 G (N5 de ID da SEQ:1); e iv. S G D K L G D K Y X6 C (N- de ID da SEQ: 202) ; onde Xi é um resíduo de serina ou um resíduo de treonina, X2 é um resíduo de arginina ou um resíduo de serina, X3 é um resíduo de aspartato ou um resíduo de alanina, X4 é um resíduo de glicina ou um resíduo de aspartato, X5 é um resíduo de leucina ou um resíduo de fenilalanina, X6 é um resíduo de valina ou um resíduo de alanina, b. uma seqüência de CDR2 da cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: i. uma CDR2 da cadeia leve que difere em não mais que duas adições, substituições e/ou eliminações de aminoácidos de uma seqüência de CDR2 de L1-L23, N2S de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50,52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; ii. A A S S L X9 S (Ν- de ID da SEQ: 204); e iii. Q Xi0 Xu K R P S (N5 de ID da SEQ: 205); onde X9 é um resíduo de glutamina ou um resíduo de glutamato, Xio é um resíduo de serína ou um resíduo de treonina, Xn é um resíduo de treonina, ou um resíduo de serína, c. uma seqüência da CDRl da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: i. uma CDRl da cadeia pesada que difere em não mais que duas adições, substituições e/ou eliminações de aminoácidos de uma seqüência da CDRl de H1-H23, N2S de ID da SEQ:102,104,106,108, 111, 113,115, 117, 118, 120 e 122; ii. X7 Y X8 M H (N- de ID da SEQ: 203) onde X7 é um resíduo de serina ou um resíduo de treonina, X8 é um resíduo de glicina ou um resíduo de aspartato; e d. uma CDR2 da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: i. uma seqüência pesada que difere em não mais que três adições, substituições e/ou eliminações de aminoácidos de uma seqüência de CDR2 de H1-H23, N-s de ID da SEQ: 124, 126, 128,,25 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155,157, 159, 161 e 163; ii. Xi2 I W X13 D G S Xi4 K Y Y Xi5 D S V K G (N5 de ID da SEQ: 206) ; iii. Xi6 I S Xi7 D G S Xi8 K Y Xi9 X20 D S V K G (N5 de ID da SEQ: 2 07); onde X12 is um resíduo de serina, um resíduo de fenilalanína, um resíduo de valína, ou um resíduo de glutamato, X13 é um resíduo de tirosina ou um resíduo de asparagina, X14 é um resíduo de aspargina ou um resíduo de glutamato, X15 é um resíduo de valína ou um resíduo de alanína, X16 é um resíduo de valína ou um resíduo de fenilalanína, X17 é um resíduo de histidina, um resíduo de aspartato, ou um resíduo de tirosina X18 é um resíduo de aspartato, um resíduo de asparagina, ou um resíduo de histidina, X19 é um resíduo de tirosina, ou um resíduo de serina, X20 é um resíduo de alanína ou um resíduo de glicina, onde a dita proteína de ligação ao antígeno especificamente se liga ao receptor de glucagon humano.
3. A proteína de ligação a antígeno isolada da reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que consiste em: a. um domínio variável da cadeia leve consistindo em; i. uma seqüência da CDRl da cadeia leve selecionada entre os N2S de ID da SEQ: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, ,24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 41; ii. uma seqüência da CDR2 da cadeia leve selecionada entre os N5S de ID da SEQ: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56,58, 60, 62, 64, 66, 68 e 70; iii. uma seqüência da CDR3 da cadeia leve selecionada entre os N5S de ID da SEQ: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85,87, 89, 91, 93, 95, 97 e 100; e b. um domínio variável da cadeia pesada consistindo em: i. uma seqüência da CDRl da cadeia pesada selecionada entre os N5S de ID da SEQ: 102, 104, 106, 108, 111,113, 115, 117, 118, 120,e 122; ii. uma seqüência de CDR2 da cadeia pesada selecionada entre os N5S de ID da SEQ: 124, 126, 128, 130, 132,134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, ,151, 153, 155, 157, 159, 161 e 163; e iii. uma seqüência da CDR3 da cadeia pesada selecionada entre os N-s de ID da SEQ: 165, 167, 169, 169, 171,173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, ,191, 193, 195, 197 e 199; ou c. o domínio variável da cadeia leve de (a) e o domínio variável da cadeia pesada de (b) , onde a proteína de ligação a antígeno especificamente se liga ao receptor de glucagon humano.
4. Uma proteína de ligação a antígeno isolada caracterizada pelo fato de que consiste em: a. uma seqüência do domínio variável da cadeia leve selecionada do grupo consistindo em; i. aminoácidos com uma seqüência pelo menos 80% idêntica a uma seqüência do domínio variável da cadeia leve selecionada de L1-L23, N-s de ID da SEQ: 213, 215, 217, 219, 221,223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247,249, 251, 253, 255 e 257; ii. uma seqüência de aminoácidos codificados por uma seqüência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma seqüência do domínio variável da cadeia leve de L1-L23, N2S de ID da SEQ: 212,214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232,234,236, 238,240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254 e 256; iii. uma seqüência de aminoácidos codificados por uma seqüência de polinucleotídeos que hibridiza sob condições moderadamente rígidas para o complemento de um polinucleotídeo consistindo em uma seqüência do domínio variável da cadeia leve de L1-L23 dos N^s de ID da SEQ: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224,226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246,248, 250,252, 254 e 256; b. uma seqüência do domínio variável da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: i. uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos80% idêntica a uma seqüência do domínio variável da cadeia pesada de H1-H23 dos N5S de ID da SEQ: 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271,273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293,295, 297,299, 301 e 303; ii. uma seqüência de aminoácidos codificados por uma seqüência de polinucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a uma seqüência de polinucleotídeos que codifica a seqüência do domínio variável da cadeia pesada de H1-H23, N-s de ID da SEQ: ,258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, ,284, 286, 288, 292, 294, 296, 298, 300 e 302; iii. uma seqüência de aminoácidos codificados por uma seqüência de polinucleotídeos que hibridiza sob condições moderadamente rígidas para o complemento de um polinucleotídeo consistindo em uma seqüência do domínio variável da cadeia pesada de H1-H23, N2S de ID da SEQ: 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, ,272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 292, 294, 296, 298, ,300 e 302; ou c. o domínio variável da cadeia leve de (a) e o domínio variável da cadeia pesada de (b) , onde a proteína de ligação a antígeno se liga ao receptor de glucagon humano.
5. A proteína de ligação a antígeno isolada da reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que consiste em: a. uma seqüência do domínio variável da cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: L1-L23 dos N-s de ID da SEQ: 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, ,237, 239, 241. 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255 e 257; b. uma seqüência do domínio variável da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: H1-H23 dos N2S de ID da SEQ: 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, ,281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301 e 303; ou c. o domínio variável da cadeia leve de (a) e o domínio variável da cadeia pesada de (b) , onde a proteína de ligação a antígeno especificamente se liga ao receptor de glucagon humano.
6. A proteína de ligação a antígeno da reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve e um domínio variável da cadeia pesada são selecionados do grupo de combinações consistindo em: LlHl, LlHl, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, LllHl1, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 e L23H23, onde a proteína de ligação a antígeno especificamente se liga ao receptor de glucagon humano.
7. A proteína de ligação a antígeno da reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que consiste ainda em: a. a seqüência constante da cadeia leve do N2 de ID da SEQ: 305; b. a seqüência constante da cadeia leve do N- de ID da SEQ: 307; c. a seqüência constante da cadeia pesada do N- de ID da SEQ: 309; d. a seqüência constante da cadeia leve do N- de ID da SEQ: 305 e a seqüência constante da cadeia pesada do N- de ID da SEQ: 309, ou e. a seqüência constante da cadeia leve do N- de ID da SEQ: 307 e a seqüência constante da cadeia pesada do N- de ID da SEQ: 309.
8. A proteína de ligação isolada da reivindicação 1 ou 4, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno é selecionada do grupo consistindo em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um fragmento de anticorpo de ligação a antígeno, um anticorpo de cadeia simples, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um fragmento Fab, um fragmento F(fa')x, um anticorpo de domínio, um anticorpo IgD, um anticorpo IgE e um anticorpo IgM, um anticorpo IgGl, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3, um anticorpo IgG4, com o anticorpo IgG4 tendo pelo menos uma mutação na região de junção.
9. A proteína de ligação a antígeno da reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo humano.
10. A proteína de ligação a antígeno da reivindicação 1 ou 4, caracterizada pelo fato de que quando ligada ao receptor de glucagon humano: a. se liga ao receptor de glucagon humano com substancialmente o mesmo Kd que um anticorpo de referência; b. inibe a estimulação do glucagon do receptor de glucagon humano com substancialmente a mesma CI50 que o dito anticorpo de referência; ou c. compete pela ligação com o dito anticorpo de referência no receptor de glucagon humano, onde o dito anticorpo de referência consiste em uma combinação de seqüências do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, LllHll, L12H12, L13H13, L15H15, L21H21 e L22H22.
11. Um anticorpo humano isolado caracterizado pelo fato de que, quando ligado ao receptor de glucagon humano: a. se liga ao receptor de glucagon humano com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo de referência; b. inibe a estimulação do glucagon do receptor de glucagon humano com substancialmente a mesma CI50 que o dito anticorpo de referência; ou c. compete pela ligação com o dito anticorpo de referência no receptor de glucagon humano, onde o dito anticorpo de referência é selecionado do grupo consistindo na-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A-7, A-8, A-9, A-ll, A-12, A-13, A-15, A-21 e A-22.
12. 0 anticorpo humano isolado da reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que quando ligado ao receptor de glucagon humano: a. especificamente se liga aos aminoácidos Ser80 a Serll9 do receptor de glucagon humano; b. reduz a sinalização do glucagon com um valor de CI50 de 90 nM ou menos; c. reduz a glicemia em um modelo animal; ou d. tanto (a) como (b), ou e. (a) , (b) e (c) .
13. O anticorpo da reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o animal é um modelo de camundongo ob/ob.
14. Uma composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que consiste na proteína de ligação a antígeno da reivindicação 1 ou 4 em admistura com um transportador farmaceuticamente aceitável da mesma.
15. Uma composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que consiste no anticorpo humano das reivindicações 11 ou 12 em admistura com um transportador farmaceuticamente aceitável da mesma.
16. Um ácido nucléico isolado caracterizado pelo fato de que consiste em uma seqüência de polinucleotideos que codifica o domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada, ou ambos, do agente de ligação a antígeno da reivindicação 1 ou 5.
17. 0 ácido nucléico isolado da reivindicação16, caracterizado pelo fato de que a seqüência é selecionada de L1-L23, N2S de ID da SEQ: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226,228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252,254 e 256; H1-H23, N2S de ID da SEQ: 258, 260, 262, 264, 266, 268,270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294,296, 298, 300 e 302, ou ambos.
18. Um vetor de expressão recombinante caracterizado pelo fato de que consiste no ácido nucléico da reivindicação 16.
19. Uma célula hospedeira caracterizada pelo fato de que consiste no vetor da reivindicação 18.
20. Um hibridoma caracterizado pelo fato de que é capaz de produzir o anticorpo da reivindicação 9.
21. Um método caracterizado pelo fato de que é para produzir uma proteína de ligação a antígeno que especificamente se liga ao receptor de glucagon humano que consiste na incubação da célula hospedeira da reivindicação 19 sob condições que permitam que ela expresse a proteína de ligação a antígeno.
22. Um método para reduzir a glicemia em um sujeito com necessidade de tal tratamento, caracterizado pelo fato de que consiste na administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da reivindicação 14 ao suj eito.
23. Um método para melhorar a tolerância á glicose em um sujeito com necessidade de tal tratamento, caracterizado pelo fato de que consiste na administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da reivindicação ao sujeito.
24. Um método para prevenir ou tratar o diabetes tipo 2 ou um distúrbio associado em um sujeito com necessidade de tal tratamento, caracterizado pelo fato de que consiste na administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da reivindicação 14 ao sujeito.
25. O método da reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
26. O método da reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado é hiperglicemia, glicemia de jejum comprometida, tolerância à glicose diminuída, dislipidemia e síndrome metabólica.
27. Um método para reduzir a glicemia em um sujeito com necessidade de tal tratamento, caracterizado pelo fato de que consiste na administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da reivindicação 15 ao suj eito.
28. Um método para melhorar a tolerância à glicose em um sujeito com necessidade de tal tratamento, caracterizado pelo fato de que consiste na administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da reivindicação no indivíduo.
29. Um método para prevenir ou tratar o diabetes tipo 2 ou um distúrbio associado em um sujeito com necessidade de tal tratamento, caracterizado pelo fato de que consiste na administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da reivindicação 15 ao sujeito.
30. 0 método da reivindicação 29 caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.
31. 0 método da reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o distúrbio associado é hiperglicemia, glicemia de jejum comprometida, tolerância à glicose diminuída, dislipidemia e síndrome metabólica.
32. Um kit para o tratamento do diabetes tipo 2 caracterizado pelo fato de que consiste na composição da reivindicação 14.
33. Um kit para o tratamento do diabetes tipo 2 caracterizado pelo fato de que consiste na composição da reivindicação 15.
34. 0 uso da composição farmacêutica das reivindicações 14 e 15 caracterizado pelo fato de que é utilizado na preparação de um medicamento para tratar distúrbios que se beneficiem com a redução da glicemia.
35. 0 uso da reivindicação 32 caracterizado pelo fato de que os distúrbios são selecionados entre diabetes tipo 2, hiperglicemia, glicemia de jejum comprometida, tolerância à glicose diminuída, dislipidemia e síndrome metabólica.
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